BRPI0808272A2 - "método para cromatograficamente separar o isômero 1r-cis, 1´r-cis de uma mistura de isômeros de (1r-1'r) - atracúrio, besilato de cisatracúrio e isômero 1r-cis, 1'r-cis do besilato de cisatracúrio" - Google Patents

Description

I "MÉTODO PARA CROMATOGRAFICAMENTE SEPARAR O ISÔMERO IRcis, 1'R-cis DE UMA MISTURA DE ISÔMEROS DE (IR-I'R)ATRACÚRIO, BESILATO DE CISATRACÚRIO E ISÔMERO lR-cis, IiR-Cis DO BESILATO DE CISATRACÚRIO".

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a cromatografia e, mais particularmente, a um método melhorado para separar isômeros- de sais- de (IR, 1' R) -atracúrio por meio de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

Antecedentes da invenção

O besilato de cisatracúrio tem o nome químico de dibenzenossulfonato de (IR,1'R,2R,2’R)-2,2'-[1,5-

pentanodiilbis[oxi93-oxo-3,1-propanodíil]]bis[1-[(3,4- dimetoxifenil)metil]-1,2,3,4-tetrahidro-6.7-dimetoxi-2- metil-isoquinolínio e é representado pela fórmula (I) abaixo:

C6H5SO3' C6H5SO3

Besilato de cisatracúrio (I)

0 besilato de cisatracúrio é o sal benzenossulfonato do isômero lR-cis,1'R-cis do atracúrio (i.é, duas moléculas 20 de benzenossulfonato por uma molécula de diamônio de cisatracúrio). 0 besilato de cisatracúrio é um agente bloqueador neuromuscular não despolarizante indicado para pacientes hospitalizados e pacientes não hospitalizados como um adjunto de anestesias gerais, para facilitar a 25 intubação, e para prover relaxamento muscular esquelético durante cirurgias ou ventilação mecânica na Unidade de Tratamento Intensivo (UTI). 0 besilato de cisatracúrio possui uma atividade que é superior à do besilato de atracúrio, com efeitos colaterais significativamente menores.

0 besilato de cisatracúrio é comercializado nos Estados Unidos e na Europa pela Glaxo Wellcome e Abbott Laboratories sob a designação comercial de Nimbex®, que é 5 uma solução aquosa não pirogênica, estéril que é ajustada em um pH de 3,25 a 3,65 com ácido benzenossulf ônico. 0 fármaco é provido em ampolas de 2,5 mL, 5 mL e 10 mL tendo uma potência de 2 mg/mL de besilato de cisatracúrio. Adicionalmente, um frasco de 30 mL contendo 10 5 mg/mL de besilato de cisatracúrio também está comercialmente disponível.

0 besilato de cisatracúrio lentamente perde sua potência com o tempo a uma taxa de aproximadamente 5% ao ano sob refrigeração (5°C) . 0 Nimbex deverá ser refrigerado a 15 20°C a 8°C (36°F a 46°F) no cartucho para conservar a potência. A taxa de perda de potência aumenta até aproximadamente 5% ao mes a 25°C (77°F).

O besilato de cisatracúrio é divulgado na patente U.S. n° 4.179.507 (daqui por diante U.S. '507), que descreve uma série de seus sais de amônio quaternário de veratril isoquinolinio, incluindo o besilato de atracúrio. A síntese do besilato de atracúrio, conforme ensinada na U.S. '507, envolve o acoplamento de base de ( + ) tetrahidropapaverina, composto (II), com diacrilato de 1,5-pentametileno, composto (III). 0 tratamento da base de amina terciária com ácido oxálico resulta no isolamento de dioxalato de N,N'-4,10-dioxa-3,11- dioxotridecileno-1,13-bis-tetrahidropapaverina, composto (IV). O sal dioxalato, composto (IV) é convertido na base livre, composto (V) , com solução de bicarbonato de sódio e extraído em tolueno. Após a evaporação do tolueno, o resíduo é dissolvido em acetonitrila e tratado com benzenossulfonato de metila. A adição de éter dietílico resulta na precipitação de besilato de atracúrio, composto (VI) , que é subsequentemente filtrado e secado. O esquema 1 abaixo ilustra o trajeto químico descrito acima. Esquema I

NH +

(III)

1. benzeno, refluxo

2. ácido oxálico

(It)

MeOv

9 λ u n

10

C6H5sQ2OCH3

benzenossulfo nato de metila

U.S. '507 ensina que o estereoisomerismo do besilato de atracúrio (VI) pode ser parcialmente controlado pelo uso do composto (II) de uma configuração estereoquímica definida e assim prover a base de amina terciária (V) de uma configuração RR-, SS-, ou RS- (meso) . 0 processo de quaternização introduz outros dois centros de assimetria com a resultante formação de uma mistura de estereoisômeros. Entretanto, a patente '507 não faz nenhuma tentativa de separar a mistura de estereoisômeros.

0 besilato de cisatracúrio é divulgado nas patentes U.S. nos 5.453.510 (daqui por diante U.S. '510) e 5.556.978 (daqui por diante U.S. '978), que descrevem formar (R)5 tetrahidropapaverina a partir do composto (II), e a conversão do composto (II) em uma mistura de sais de diastereoisômeros ReS com o amino ácido quiral, Naceil-L^leucinato, compreendendo 83% do diastereoisômero R e 17% do S. A cristalização da mistura de acetona 10 produz 97% de N-acetil-L-leucinato de (R)tetrahidropapaverina e 3% de N-acetil-L-leucinato de (S)tetrahidropapaverina, que é tratado com amônia aquosa e tolueno para produzir base de (R)-tetrahidropapaverina, que é isolada da camada de tolueno. A (R)15 tetrahidropapaverina é subsequentemente reagida com diacrilato de 1,5-pentametileno seguido de ácido oxálico para produzir o sal dioxalato a base de bis amina terciária, (IR, 1'R)-2, 2'-(3,ll-dioxo-4,10-

dioxatridecametileno)-bis-(1,2,3,4-tetrahidro-6,7- dimetoxiveratril-isoquinolina. A conversão do sal dioxalato na base de bis amina terciária com carbonato de sódio seguido de tratamento com benzenossulfonato de me.ti.la. produz uma solução aquosa de besilato de (1R,1'R)~ atracúrio que é submetido a Iiofilização. 0 sólido amarelo claro resultante consiste de uma mistura de três isômeros, a saber, lR-cis,1'R-cis; lR-cis,1'R-trans; IRtrans,1'R-trans (daqui por diante referida como mistura de isômeros de besilato de (IR,1'R)-atracúrio) a uma proporção de cerca de 58:34:6, respectivamente. A mistura de isômeros de besilato de (IR,1'R)-atracúrio é submetida a cromatografia de coluna de HPLC preparativa sobre silica usando uma mistura de diclorometano, metanol e ácido benzenossulfônico na proporção de 4000:500:0,25 como eluente. As frações contendo o isômero requerido são coletados e lavados com água. A solução em diclorometano é evaporada até a secura, o resíduo dissolvido em água e o pH ajustado em 3,5-4,0 com uma solução aquosa de ácido benzenossulfônico. A solução aquosa é liofilizada para produzir besilato de cisatracúrio possuindo uma pureza isomérica de cerca de 99%. Ambas a U.S. '510 e a U.S. '978 descrevem realizar a separação por cromatografia 5 líquida de alto desempenho.na presença de um ácido forte que inclui ácido benzenossulfônico, ácido

metanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ou ácido fosfórico. Ademais, um álcool, tal como metanol, etanol, ou n-propanol é requerido para a separação de isômeros.

Entretanto, os métodos por HPLC para separar os isômeros do besilato de (IR,1' R)-atracúrio que aplicam ácidos fortes poderão ser insatisfatórios para produções em larga escala, uma vez o aço inoxidável (comumente usado em instrumentos de HPLC) não é compatível com ácidos 15 fortes (tais como o ácido benzenossulfônico) devido à corrosão excessiva de componentes de aço inoxidável resultando na possível contaminação do produto, o que também é indesejável, especialmente em larga escala. Daí, existe uma necessidade de métodos melhorados, que evitem 20 o uso de ácidos fortes, para separar a mistura de isômeros do besilato de (IR,1'R)-atracúrio,

particularmente em uma larga escala. A presente invenção provê tais métodos.

Sumário da invenção A presente invenção provê um método cromatográfico melhorado para separar os isômeros de sais de (IR,IfR)atracúrio (p. ex., o sal besilato), i.é, isômeros (IR— cis,’lR-cis), (lR-cis,1'R-trans), e (lR-trans,1'-Rtrans), que evita o uso de ácidos fortes. Uma boa separação bem como uma estabilidade melhorada do isômero besilato de lR-cis,1' R-cis cisatracúrio poderão ser conseguidas de acordo com a presente invenção. O método para cromatograficamente separar a mistura de sais de isômeros de (IR,1'R)-atracúrio (p. ex., o sal besilato) usa misturas de um solvente orgânico, um co-solvente aprótico polar, e um ácido fraco como eluente. Em uma concretização preferida da presente invenção, o ácido fraco é um ácido orgânico. 0 método cromatográfico melhorado para separar as misturas de sais isômeros de (IR,1' R)-atracúrio (p. ex., o sal besilato) também provê a eliminação de outras substâncias.

0 método para separar os isômeros de sais de (IR, l'R)atracúrio )p.ex., o sal besilato) preferivelmente inclui as etapas de:

(a) dissolver uma mistura de isômeros de sais de (IR,1'R)-atracúrio (p. ex., o sal besilato) em pelo menos

um solvente orgânico;

(b) aplicar à solução de mistura de isômeros a uma coluna de HPLC contendo uma fase estacionária adequada;

(c) eluir a coluna com uma fase móvel contendo um solvente orgânico, um co-solvente polar aprótico e um

ácido fraco;

(d) coletar as frações contendo o isômero lR-cis,1'R-cis;

(e) opcionalmente realizar uma etapa de troca iônica para introduzir o ânion besilato; e

(f) isolar o isômero lR-cis.1'R-cis (p. ex., besilato de cisatracúrio).

A presente invenção adicionalmente provê um método para isolar o isômero lR-cis,1'R-cis do besilato de atracúrio de acordo com o processo de separação da presente invenção. O método para isolar o isômero IR-CisfIfR-Cis 25 do besilato de atracúrio preferivelmente inclui as etapas de:

(a) combinar as frações eluidas, que preferivelmente contêm pelo menos 90% do isômero lR-cis,1'R-cis do besilato de atracúrio;

(b) lavar as frações eluidas combinadas com salmoura ácida e separar as fases;

(c) secar a fase orgânica e evaporar o solvente para obter um óleo residual;

(d) dissolver o óleo em um solvente; e

(e) opcionalmente isolar o produto, p. ex., Iiofilizando a solução ou por precipitação.

0 método para isolar o isômero lR-cis,1'R-cis do besilato de cisatracúrio opcionalmente inclui ainda realizar uma troca iônica, p. ex., através de um cartucho ou coluna de troca iônica forte (daqui por diante SAX).

Uma concretização particularmente preferida inclui realizar uma separação por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) usando uma coluna carregada com sílica, eluindo com uma fase móvel, que inclui uma mistura de um solvente orgânico em combinação com um co-solvente aprótico polar e um ácido fraco, p. ex., diiclorometano, DMSO e ácido fórmico. Preferivelmente, a proporção de diclorometano:DMSO: ácido fórmico na mistura eluente é de cerca de 70-85 (diclorometano):8-20 (DMSO):5-15 (ácido fórmico). Misturas eluentes exemplificativas contêm diclorometano, DMSO e ácido fórmico em proporções de, por exemplo, 75:15:10, 78:13:9 e 80:10:10.

De acordo com a presente invenção, o desejado isômero IRcis,l'R-cis poderá ser obtido com uma alta pureza isomérica, maior que 99,5%.

Breve descrição dos desenhos A figura 1 mostra a estabilidade do isômero lR-cis,l'Rcis na mistura eluente a 25°C como uma função do tempo;

A figura 2 mostra o cromatograma da mistura de isômeros lR-cis,1'R-cis do besilato de atracúrio preparado de acordo com a presente invenção; e 25 A figura 3 mostra o cromatograma da mistura de isômeros lR-cis,1'R-cis do besilato de atracúrio usando N-metil-2- pirrolidona com co-solvente aprótico polar na mistura eluente.

Descrição detalhada da invenção 30 A presente invenção provê um método ccromatográfico melhorado para separar misturas de isômeros de sais de (IR, I'R(-atracúrio (p. ex., sal besilato), que evita o uso de ácidos fortes na mistura eluente. O método da presente invenção permite a separação do isômero IR35 CisiIiR-Cis de uma mistura de isômeros de sais de (IR,

1'R)-atracúrio (p.ex., o sal besilato) e outros compostos presentes. Os inventores da presente invenção descobriram que o isômero lR-cis,1' R-cis, obtido por separação por HPLC conforme descrito em U.S. '510 e U.S. '978, é instável na mistura eluente e conduz à formação de produtos de 5 decomposição. Surpreendentemente, foi descoberto ainda pelos inventores da presente invenção, que uma boa separação bem como estabilidade melhorada do isômero IRcis,l'R-cis poderá ser alcançada quando o eluente contém um co-solvente aprótico polar e um ácido fraco, que é 10 preferivelmente um ácido orgânico, o uso de um ácido forte sendo portanto evitado.

O termo "ácidos fortes" refere-se a ácidos que se dissociam praticamente completamente (>99%) em soluções aquosas em condições normais de temperatura e pressão, 15 tais como o ácido benzenossulfônico, tendo um pKa de 0 e inferior, enquanto que o termo "ácidos fracos refere-se a ácidos que não se dissociam completamente em soluções aquosas, tais como o ácido acético, tendo um valor de pKa de 2,5 ou superior.

0 termo "mistura de isômeros de besilato de (IR,1'R)atracúrio" refere-se a uma mistura de isômeros (lR-cis, 1'R-cis), (IR,1'R-trans) e (lR-trans,1'R-trans), enquanto que o termo "besilato de cisatracúrio" refere-se ao isômero IR-cis,1'R-cis.

0 termo "pureza isomérica", conforme usado aqui, referese à área percentual do pico correspondente ao isômero lR-cis,1'R-cis relativamente à área percentual total dos isômeros (lR-cis, 1'R-cis), (IR,1’R-trans) e (1Rtrans, 1'R-trans) .

Em uma concretização, a presente invenção provê um método para separar isômeros do sal de (IR,1'R)-atracúrio (p.ex., o sal besilato), que inclui as etapas de:

(a) dissolver a mistura de isômeros do sal de (IR, l'R)atracúrio (p.ex., o sal besilato) em pelo menos um

solvente orgânico;

(b) aplicar a mistura de isômeros do sal de (IR,l'R)atracúrio (p.ex., o sal besilato) a uma coluna de HPLC contendo uma fase estacionáriaadqa;

(c) eluir a coluna com uma fase móvel contendo um solvente orgânico, um co-solvente aprótico polar e um ácido fraco;

5 (d) coletar as frações contendo o isômero lR-cis,1'R-cis;

(e) opcionalmente realizar uma etapa de troca iônica conforme necessária para. introduzir o ânion bes-ilato; e isolar o o isômero (IR, 1'R)-atracúrio (p.ex., o sal besilato). Suportes sólidos adequados poderão incluir, por exemplo, sílica gel.

A concentração molar (M) da mistura de isômeros do sal (IR,1'R)-atracúrio (p.ex., o sal besilato) na solução que é aplicada à coluna de HPLC é na faixa de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M, preferivelmente de cerca de 0,1 M a cerca de 0,3 M.

O solvente orgânico usado na etapa (a) preferivelmente inclui diclorometano, clorofórmio, 1,4-dioxano,. ou uma mistura destes. Um solvente orgânico preferido inclui diclorometano.

A fase móvel da etapa (c) preferivelmente inclui uma mistura de um solvente orgânico, um co-solvente aprótico polar, e um ácido fraco. Co-solventes apróticos polares adequados que poderão ser usados na etapa (c) incluem sulfóxido de dimetila (DMSO), N,N-dimetilformamida (DMF), 25 N,N-dimetilacetamida (DMA), N-metil-2-pirrolidona (NMP) ou misturas destes. Preferivelmente, o solvente aprótico polar inclui DMSO.

O solvente orgânico usado na etapa (c) preferivelmente inclui diclorometano, clorofórmio, 1,4-dioxano, ou uma mistura destes. Um solvente orgânico preferido inclui diclorometano.

0 ácido fraco da etapa (c) é preferivelmente um ácido orgânico, que inclui ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ou uma mistura destes. Um ácido orgânico fraco particularmente preferido inclui ácido fórmico.

Os inventores da presente invenção descobriram que uma boa separação poderá ser obtida usando misturas de, p. ex., diclorometano/DMSO/ácido fórmico. De acordo com uma concretização preferida da presente invenção, a coluna é eluida com uma mistura compreendendo diclorometano, ácido fórmico e DMSO. A proporção de diclorometano:DMSO:ácido 5 fórmico na mistura eluente é de cerca de 70-85 (diclorometano), 8-20 (DMSO) e 5-15 (ácido fórmico). Misturas eluentes exemplificativas - - contendo

diclorometano, DMSO e ácido fórmico são em proporções de, p.ex., 75:15:

10, 78:13:9, e 80:10:1, respectivamente.

De acordo com a presente invenção, o teor de isômero IRcis,l'R-cis decresce na mistura eluente empregada em U.S. '978 (diclorometano, metanol, e ácido benzenossulfônico) de mais que 3% após 26 horas à temperatura ambiente (vide exemplo 5, figura 1).

Em uma outra concretização, a presente invenção provê um método para realizar um procedimento de tratamento químico ("chemical work-up procedure") para isolar o isômero lR-cis,1'R-cis, que inclui as etapas de:

(a) combinar frações eluídas, que preferivelmente contnham pelo menos 90% do isômero lR-cis,1'R-cis,

(b) lavar as frações eluídas combinadas com salmoura... ácida e separar as fases;

© secar a fase orgânica e evaporar o solvente para obter um óleo residual;

(d) dissolver o óleo em um solvente; e

(e) opcionalmente isolar o produto, p. ex., Iiofilizando a solução ou por precipitação.

Preferivelmente, a solução usada para lavar a fração 30 eluída combinada é uma solução de salmoura a 10%, que é acidificada a pH 2 com um ácido adequado, p. ex., ácido benzenossulfônico (BSA) ou uma solução aquosa de BSA. O termo 10% de salmoura conforme definido aqui refere-se a uma solução aquosa saturada a 10% de sal (NaCl).

De acordo com a presente invenção, acidificar a fração eluída combinada é realizado usando uma solução de BSA aquosa. A precipitação é preferivelmente realizada pelo menos uma vez em um solvente ou uma mistura de solventes selecionado dentre tetrahidrofurano, (THF), 2-metiltetrahidrofurano (2-Me-THF), éter dietílico, éter 5 diisopropilico, éter metil-ter-butíIico (MTBE), acecona, hexano, heptano, ciclohexano, e misturas destes. Opcionalmente, o solvente ou mistura de solventes poderá conter ácido fórmico ou salmoura acidificada até pH 2 com. p. ex., cerca de 0,6 mM de solução aquosa de BSA 10 (daqui por diante solução ácida aquosa).

Em uma outra concretização, o método para isolar o isômero lR-cis,1'R-cis do besilato de cisatracúrio opcionalmente inclui ainda realizar uma troca iônica, p. ex. , via um cartucho ou coluna de troca aniônica forte (SAX).

A presente invenção provê besilato de cisatracúrio, tendo uma pureza isomérica de mais que cerca de 97%, preferivelmente maior que cerca de 99%, e mais preferivelmente maior que cerca de 99,5%, conforme medida 20 por HPLC, e preferivelmente contendo menos que cerca de 0,5% de outros isômeros.

Referência é_ feita agora aos. seguintes exemplos, que servem para ilustrar a invenção, mas sem de nenhuma maneira limitar a sua abrangência.

2 5 EXEMPLO 1

Este exemplo, demonstra a separação cromatográfica de mistura de isômeros do besilato de (IR,1'R)-atracúrio.

A solução amostra para a separação preparativa foi aplicada à coluna carregada com sílica. A coluna foi 30 eluída com uma mistura de diclorometano, DMSO e ácido fórmico em uma proporção de 78:13:9, respectivamente. Frações do eluato da coluna foram coletadas, e aquelas frações contendo o isômero lR-cis,1'R-cis requerido foram combinadas.

Duas partidas adicionais foram efetuadas usando a mesma mistura de isômeros da primeira partida. A tabela 1 sumariza os resultados para as três partidas. Tabela I

Par¬ Volume de Concentra¬ % de isômero % Pureza tida carre¬ ção de cis-cis na isomérica gamento carrega¬ mistura de obtida do (mL) mento (mL) (IR,l'R)- isômero cisatracúrio cis 1 2 0, 164 58 99,7 2 3 0, 164 58 99, 4 3 3 0,164 58 99, 7 EXEMPLO 2

Este exemplo demonstra a separação do isômero por HPLC usando diferentes ácidos orgânicos fracos na mistura eluente.

Uma mistura de mistura de isômeros de besilato de (IR, If R)- atracúrio contendo 58% de lR-cis,1'R-cis, 36% de lR-cis,1'R-trans e 6% de lR-trans,1'R-trans foi aplicada a uma coluna de sílica (Zorbax Sil-RX, 250 mm x 4,6 mm x 5 μ) . A coluna foi eluída com as seguintes

misturas mostradas na tabela 2 abaixo.

Tabela 2

Parti¬ Fluxo Composição do Eluente Resultado da mL/min % Volume o % Volume Isômero RT Resolução Dicloro¬ O Ácido IR, IfR min. metano Volume DMSO 1 -1,5- 75 20 Acético cis-cis 4,9 3,5 (5) cis- 6, 8 0,9 trans 8,7 transtrans 2 1,2 70 20 Acético cis-cis 5,3 3,5 (10) cis- 6, 8 4,2 trans 10, 2 transtrans 3 1,2 80 10 Fórmico cis-cis 6.7 2,4 (10) cis- 7.8 >5, 0 trans 11, 2 transtrans 4 1,2 60 30 Propiônico cis-cis 3.7 1,8 (10) cis- 4,2 >3, 5 trans 7.8 transtrans min = minutos. Resolução = 2 (t2~ti) / (w2-wi) , onde t2, ti são os tempos de retenção (RT) dos picos eluídos; w2, Wi são larguras de picos.

Um cromatograma do produto preparado de acordo com a tabela 2, partida 2, é mostrado na figura 2. As seguintes condições foram usadas:

Coluna: Zorbax, Sil-RX, 250 mm* 4 ιηιη*5μ, PN 880975-901 Fase móvel: DCM:DMSO:Ácido Acético=70:20:10 Detecção: 280 nm Taxa de fluxo: 1,2 mL/min Volume de injeção: 10 μΐ,

Concentração da amostra: 15 mg/mL (Diluente=DCM).

Com base nos resultados dados acima na tabela 2, o ácido acético e o ácido propiônico mostram boas separações isoméricas semelhantes ao ácido fórmico conforme demonstrado pelos resultados de resolução.

EXEMPLO 3

Este exemplo demonstra a separação de isômeros por HPLC usando diferentes solventes apróticos polares na mistura eluente.

Uma mistura de isômeros de besilato de (IR,1'R)-atracúrio contendo 5.8% de lR-cis, 1'R-cis, 3.6% de lR-cis, 1'R-trans e 6% de lR-trans,1'R-trans foi aplicada a uma coluna de silica (Zorbax Sil-RX, 250 mm x 4,6 mm x 5 μ) . N,N25 dimetilformamida (DMF), NrN-dimetilacetamida (DMA), e Nmetil-2-pirrolidona (NMP) foram usados no lugar do DMSO, conforme detalhado na tabela 3. Tabela 3

Par¬ Fluxo Composição do Eluente Resultado tida mL/min %Volu¬ % Volume % Volu¬ Isômero RT Reso¬ me DCM Solvente me IR,I'R min. lução Aprótico Ácido Polar 1 1,0 75 DMF (15) Fórmico cis-cis 22,3 >4,0 (10) cis-trans 33.7 5,3 trans-trans 53.7 2 1,5 75 DMA (25) Fórmico cis-cis 10.3 >5,5 (10) cis-trans 17,8 6,3 trans-trans 32.3 3 0,8 55 NMP (35) Fórmico cis-cis 7,6 5,1 (10) cis-trans 122,2 >7,0 trans-trans 16,3 4 1,5 58 NMP (32) Acético cis-cis 20,0 3, 6 (10) cis-trans 40,2 >7,0 trans-trans ~ 8 0 DCM=diclorometano

Um cromatograma de uma mistura de isômeros de besilato de (IRiIiR)-Btraciirio separada usando N-metil-2-pirrolidona como co-solvente aprótico polar na mistura eluente é mostrado na figura 3. As seguintes condições foram usadas:

Coluna: ZORBAX RX-SIL, 250*4,6 mm, PN 880975-901 ELuente: diclorometano:N-metil-2-pirolidona:Ácido

fórmico=55:35:10

Detector UV: 280 nm Fluxo: 0,8 mL/min.

Os seguintes dados aplicam-se ao cromatograma mostrado na figura 3:

Tabela 4

Pk# Tempo de Area Area Pratos Resolução Assime¬ Altura Retenção (%) Teóricos (USP) tria 1 4, 503 89811 0, 64 10116 0,0 1,2 13177 2 5, 093 100844 0, 72 2257 1,9 0,0 6379 3 5, 412 36558 0,26 14113 1,0 0,0 5098 4 5, 642 45065 0, 32 21886 1,4 0,0 7539 6, 542 177872 1,27 7748 4,0 0,0 15024 6 7, 588 7774644 56, 56 1780 2,1 1,2 283833 7 12,203 4952618 35, 39 2005 5,1 1,4 120704 8 16,027 35150 0,25 6144 4,0 0,0 1167 9 20,532 780050 5, 57 1898 3, 3 1,2 11177 Tota 13992602 100,00 464098 1 Com base nos resultados acima dados na tabela 3, DMF, DMA e NMP poderão ser usados no lugar do DMSO na mistura eluente, conforme mostrado pelos resultados de resolução.

EXEMPLO 4

Este exemplo demonstra a separação de isômeros por HPLC usando diferentes solventes orgânicos.

Uma mistura de mistura de isômeros de besilato de (IRiIrR)- atracúrio contendo 58% de IR-cis,1'R-cis, 36% de lR-cis,1'R-trans e 6% de lR-trans,1'R-trans foi aplicada a uma coluna de sílica (Zorbax Sil-RX, 250 mm x 4,6 mm x 5 μ). Clorofórmio e 1,4-dioxano foram usados no lugar do diclorometano, conforme detalhado na tabela 5.

Tabela 5

Partida Fluxo Composição do Eluente Resultado mL/min % Volume 0, % Volume Isômero RT Resolu¬ Solvente O Ácido IR, I' R min. ção Orgânico Volu¬ Fraco me DMSO 1 1,0 Cloro¬ 10 Acético cis-cis 9,5 2,8 fórmio (5) cis-trans 11, 5 >4,0 (80) trans- 8,7 trans 2 1,0 Clorofórmi 20 Acético cis-cis 7,4 >2,2 o (70) (10) cis-trans 9,9 >5,6 trans- 13, 8 trans 3 Gradi¬ 1,0 1,4- 5 Fórmico cis-cis 15, 0 3,7 ente dioxano 15 (10) cis-trans 18, 4 3,1 (85) t=0 Fórmico trans- 21, 8 min 1,4- (10) trans dioxano (75) t=20 min Com base nos resultados dados na tabela acima, tanto

clorofórmio quanto 1,4-dioxano podem ser usados no lugar do diclorometano na mistura eluente conforme mostrado pelos resultados de resolução.

EXEMPLO 5

Este exemplo demonstra a estabilidade do sal de cisatracúrio em diferentes misturas de eluentes.

A tabela 6 ilustra como a quantidade do isômero IRcis,l'R-cis muda à temperatura ambiente como uma função do tempo em 3 diferentes misturas de eluentes. A mistura de isômeros de besilato de (IR, 1'R)-atracúrio foi dissolvida no eluente e as soluções resultantes foram deixadas em repouso à temperatura ambiente durante um período de 26 horas. Após certos intervalos de tempo, 5 conforme especificado na tabela 6, amostras foram retiradas de cada uma das 3 soluções e avaliadas por HPLC para determinar a quantidade de isômero IR-CisiIiR-Cis na mistura.

Tabela 6

Condi¬ Tempo % de Isômero IR-CisfIiR-Cis na composição ções (horas) eluente* diclorometano: diclorometano: diclorometano: DMSO:ácido DMSO:ácido metanol:ácido fórmico benze benzenossulfônico 80:10:10 (A) nossulfônico 4000:500:0,5(C) 90:10:0,006(B) Tempe¬ 0 55,1 55, 3 55, 3 2 55, 4 55, 3 54, 9 11 55,2 55, 3 53, 4 12 55,1 55, 3 53, 7 24 55, 3 55, 3 52, 6 26 55, 4 55,2 52, 0 * O erro em reportar o % de isômero IR-CisfIiR-Cis na mistura eluente, conforme medido por HPLC é de cerca de

0,5-1,0%.

A estabilidade do sal de cisatracúrio na mistura eluente a 25°C é apresentada na figura 1 onde duas plotagens são 15 comparadas, isto é, a plotagem descrevendo a estabilidade do isômero IR-CisiIiR-Cis na mistura eluente de 80:10:10 de diclorometano:DMSO:ácido fórmico da presente invenção (coluna A na tabela 6) vs. a plotagem do sistema eluente de diclorometano:MeOH:ácido benzenossulfônico descrito na 20 patente U.S. n° 5.556.978, exemplo 2 (coluna C na tabela 6) .

Com base nos resultados dados na tabela 6 e na figura 1, a quantidade de cisatracúrio permanece inalterada (levando em conta o erro inerente no método por HPLC) 25 após 26 horas na mistura de diclorometano:DMSO:ácido fórmico. Por outro lado, na mistura de diclorometano:MeOH:ácido benzenossulfônico (patente U.S. n° 5.556.978, exemplo 2), verifica-se que a quantidade de cisatracúrio decresce de mais que 3% após 26 horas.

EXEMPLO 6

Este exemplo demonstra a separação cromatográfica da mistura de isômeros de besilato de (IR,1'R)-atracúrio em escala semi-preparativa.

Foi efetuada a separação por HPLC semi-preparativa de uma mistura de isômeros de besilato de (IR,1'R)-atracúrio, conforme segue:

Coluna: Alltech, Altima Silica, 250 mm x 22 mm x 5μ.

Eluente: diclorometano:DMSO:ácido fórmico a uma proporção de 75:15:10, respectivamente.

Detecção: 280 nm

Taxa de fluxo: 7 mL/min

Amostra usada: mistura de isômeros de besilato de R,R'atracúrio (consistindo de cerca de 58% de isômeros lR-cis,1'R-cis, 36% de lR-cis,1'R-trans e 6% de IRtrans,1' R-trans).

490 mg de amostra de mistura isomérica de besilato de (IR,1'R)-atracúrio foram dissolvidos em 3 mL de 20 diclorometano e injetados no sistema de HPLC preparativo. As frações contendo o isômero lR-cis,1'R-cis foram analisadas por HPLC contra- a solução referência de mistura de isômeros de besilato de (IR,1'R)-atracúrio. Os resultados estão sumarizados nas tabelas 7 e 8.

Tabela 7

Fração Fração Área do Teor total Teor de Pureza da Pureza da Volume isômero de cátion isômero fração fração (mL) cis- isômero cis-trans total isomnérica trans cis-cis (%) * (%) ** (%)*** (mg) 2 6,7 17,7 37, 5 0,1 67,5 99, 9 3 6,7 0 53, 0 0 98,5 100,0 4 6,8 0 33, 8 0 99,4 100,0 5 5,5 162,7 16, 5 1,5 96,6 98, 4 Nota: O isômero trans-trans não estava presente nas frasções coletadas

* Teor de isômero cis-trans (%)=[área do isômero lR-cis, 1'R-trans/soma de todas as áreas]xlOO ** Pureza da fração total (%)=[área do isômero lR-cis, 1'R-cis/soma de todas as áreas]xl00

*** Pureza da fração isomérica (%)=[área do isômero IRcis, 1'R-cis/(área do isômero lR-cis,1'R-cis+área do isômero lR-cis, 1'R-trans+área do isômerolR-trans,1'R5 trans)]xlOO

Tabela 8

N0 Pureza Pureza Quantidade de Rendimento... Isomérica Total cisatracúrio como do cátion (%) (%) cátion (mg) cisantracúrio estimado por HPLC (%) Carregamento total de isômero cis-cis (como cátion) - 203 mg 1 100 >98, 5 86, 8 42, 8 2 ?99, 9 >67, 5 37, 5 l·-1 CO ■o» CJi 3 >98 >96, 5 16, 5 8,1 Total 140, 8 69, 4 Rendimento de produto de pureza isomérica de >99,9%=61%. Rendimento de produto de pureza total de >96,5%=51%.

EXEMPLO 7 A

Este exemplo demonstra um método para realizar um procedimento de tratamento para isolar o isômero IRcis,l'R-cis do atracúrio.

As frações de cada uma das três partidas no exemplo 1 foram combinadas e lavadas três vezes com salmoura 15 acidificada (pH 2 com HCl). A solução de diclorometano foi secada com sulfato de magnésio e evaporada até a secura para produzir 680, 8 mg de óleo residual. 0 óleo foi dissolvido em 15 mL de água e o pH foi ajustado em cerca de 3 com uma solução aquosa de ácido 20 benzenossulfônico (BSA). A solução aquosa foi liofilizada para produzir 496, 3 mg de um sólido que foi analisado usando HPLC. O isômero lR-cis,1'R-cis obtido tinha uma pureza de 99,8%.

EXEMPLO 7B

Este exemplo demonstra um método para realizar um procedimento de tratamento para isolar o isômero IRcis,l'R-cis do atracúrio.

A mistura de frações coletada em uma quantidade esperada de 205 mg do isômero lR-cis,1'R-cis e um volume total de 97 mL foi lavada quatro vezes com salmoura a 10% que foi acidificada até pH 2 com uma solução aquosa de BSA e então aplicada a um cartucho SAX de troca iônica prétratado. (0 pré-tratamento consistiu em passar 600 mL de uma solução aquosa 0,1 M de BSA através cartucho de maneira a substituir os ânions cloreto por ânions benzenossulfonato. Subsequentemente, o cartucho foi condicionado passando 300 mL de metanol seguido de 300 mL de diclorometano através do cartucho). 0 produto foi retido pelo cartucho e eluido do cartucho com metanol. A solução de metanol foi secada sobre sulfato de magnésio e evaporada. O óleo residual foi dissolvido em água e o pH foi ajustado a cerca de 3 com uma solução de BSA. A solução aquosa foi liofilizada para produzir 162 mg (rendimento de 79%) de um sólido contendo apenas o isômero IR-cis,1'R-cis.

EXEMPLO 7C

Este exemplo demonstra um método para efetuar um procedimento de tratamento para isolar o isômero IRCisiIiR-Cis do atracúrio.

A mistura de isômeros do besilato de (IR,1'R)-atracúrio foi separado no HPLC preparativo equipado com coluna de sí Iica- usando uma mistura eluente de 80:10:10 de diclorometano:DMSO:ácido fórmico. Frações do eluato da coluna contendo o isômero R-cis,1'R-cis foram coletadas e 25 combinadas para formar a fração principal, conforme detalhado na tabela 9.

Tabela 9

Volume Volume total % do % do % do Quantidade total, de base de isômero isômero isômero esperada de mL cisatracúrio cis-cis cis-trans trans- besilato mL trans mg 95 96,7 99, 6 O O 129, 6 O O Uma quantidade equivalente de BSA foi adicionada à fração principal e uma lavagem de quatro etapas com solução

aquosa ácida (pH=2, BSA) foi efetuada. 0 teor obtido de DMSO na solução de diclorometano foi de 0,05% comparativamente com o teor inicial de DMSO no eluato. A solução de diclorometano foi secada sobre MgSO4 e evaporada até a secura para produzir 150,6 mg de óleo, que foi dissolvido em água e o pH da solução foi ajustado em 3 com BSA. A solução aquosa foi liofilizada para produzir 109,4 mg (84% de rendimento) de um sólido. A 5 pureza do isômero lR-cis,1'R-cis por HPLC foi de 97,1%, contendo 0,2% de laudanosina. Nenhum isômero lR-cis,l'Rtrans e lR-trans,1'R-trans foi detectado na amostra.

EXEMPLO 7D (Experimento 1 nas tabelas 10 e 11)

Este exemplo demonstra um método para efetuar um procedimento de tratamento para isolar o isômero IRcis,l'R-cis do atracúrio.

A fração de cisatracúrio obtida da mistura de isômeros de besilato de (IR,1'R)-atracúrio consistindo de 55% de IRcis, 1'R-cis, 35% de lR-cis, 1'R-trans e 5,6% de IR15 trans,1'R-trans foi lavada quatro vezes com salmoura que foi acidificada até pH 2 com solução aquosa de BSA aproximadamente 0,6 M (daqui por diante (solução ácida aquosa) . Após separar as camadas, a solução de diclorometano obtida foi secada sobre MgSO4 e evaporada 20 sob pressão reduzida para obter um óleo residual. 0 óleo foi misturado com uma mistura de 3 mL de acetona, e 12 mL de uma mistura a-2:1 de 2-metil-tetrahidrofurano (2-MeTHF):hexano foram adicionados. A mistura foi agitada lentamente durante 10 minutos e então foi resfriada 25 durante 15 minutos até uma temperatura de cerca de 10°C. O solvente foi decantado e um óleo espesso foi obtido. O óleo foi dissolvido em 2 mL de acetona, e 15 mL de uma mistura a 1:2 de 2-Me-THF:éter metil-ter-butílico (MTBE) foram adicionados e a mistura foi resfriada da noite para 30 o dia a 4°C. O precipitado assim obtido foi filtrado, lavado com 15 mL de 2-Me-THF e secado sob pressão reduzida para produzir um sólido com 70% de rendimento. O produto foi analisado por HPLC para determinar a sua pureza e os resultados estão detalhados nas tabelas 10 e 35 11. Os produtos de 3 experimentos adicionais (marcados como experimentos 2-4) foram analisados por GC para determinar o teor de DMSO e os resultados estão sumarizados na tabela 11. O produto do experimento 4 foi adicionalmente analisado para determinar a sua densidade não vibrada, e o resultado foi de 0,37 g/mL.

Tabela 10

N0 Descrição Experimento N0 1 2 3 4 1 Volume de 3 mL (sem 5 mL (sem 2,5 mL + 0,2 2 mL + 0,3 acetona (Ia solução solução mL de - mL de adição), mL ácida ácida solução solução aquosa) aquosa) ácida aguosa ácida aquosa 2 Conteúdo da 2-Me-THF: 2-Me-THF: 100 mL de 4 0 mL de primeira hexano MTBE 2-Me-THF 2-Me-THF mistura 2:1 1:1,40 precipitada 12 mL 4 0 mL 3 Tempo de 10 10 10 10 agitação minutos 4 Tempo de 15 minutos 15 minutos 20 minutos 20 minutos resfriamento a IO0C a 10°C a IO0C a IO0C minutos Volume de 2 4 mL + 1 1 mL + 0,2 1 mL + 1 acetona (2a gota de mL de gota de adição), mL ácido solução ácido fórmico ácida aguosa fórmico 6 Conteúdo da 15 mL de 2-Me-THF: 50 mL de 2-Mesegunda Me-2- hexano THF THF: éter mistura THF:MTBE 5:1 dietilico precipitada 1:2 12 mL 1:1 80 mL “7 Segundo tempo Da noite 30 a IOgc Precipitação Precipitação de para o dia imediata imediata resfriamento, a 4°C minutos 8 Volume de 2- 15 15 10 20 ml de Me-THf usado éter para lavagem, dietilico mL foram usados 9 Purexa da 99,4 100 100 100 fração isomérica, %* Teor de 0, 6 0 0 0,2 isômero cis-trans, % 0 isômero trans-trans não estava presente na fração coletada

* Pureza da fração isomérica (%)=[área do isômero lR-cis, 1'R-cis/(área do isômero lR-cis,1'R-cis+área do isômero lR-cis, 1'R-trans+área do isômerolR-trans,1'R-trans)]xlOO Tabela 11

Experi¬ Produto Análise por HPLC Análise Rendimento mento por GC da Pureza Laudano- Ácido DMSO fração sina Fórmico (ppm) total %* ç, o 0 O 1 Inicial 91, 2 3,5 - - 70 Final 93,2 1,2 0,5 324 2 Inicial ■ 99,2 <0, 1 - 6 9 Final 98, 9 0,5 1,3 650 3 Inicial 87,1 0,4 - - 74 Final 90, 0 0 0,2 41 4 Inicial 92, 6 0, 6 - - 77 Final 93, 3 0,4 0,7 459 * Pureza de fração total (%)=[área do isômero lR-cis,l'Rcis/soma de todas as áreas]xlOO

Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de 5 patente, e patentes, citados aqui são aqui incorporadas por referência até como se cada referência estivesse individualmente e especificamente indicada para ser incorporada por referência e estivesse integralmente apresentada aqui.

0 uso dos termos "um" e "uma" e "o" e "a" e referências semelhantes no contexto de descrever a invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) deverão ser entendidos como cobrindo tanto o singular quanto o plural, salvo indicação em contrário aqui ou 15 claramente contradito no texto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" deverão ser entendidos como termos com limites abertos (i.é, significando "incluindo, mas não limitado a"), salvo indicação em contrário. A apresentação de faixas de 20 valores aqui é pretendida meramente para servir como um método abreviado para se referir individualmente a cada valor separado caindo dentro da faixa, salvo indicação em contrário aqui, e cada valor separado é aqui incorporado ao descritivo como se apresentado individualmente. Todos 25 os métodos descritos aqui poderão ser realizados em qualquer ordem adequada salvo indicação em contrário ou caso claramente contradito pelo texto. O uso de qualquer dos ou de todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (p. ex., "tal como") provido aqui, é pretendido meramente para melhor iluminar a invenção e não impõe nenhuma limitação à abrangência da invenção, salvo reivindicação 5 em contrário. Nenhuma linguagem no descritivo deverá ser entendido como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção. Concretizações preferidas da invenção são descritas aqui, incluindo o melhor modo de conhecimento dos inventores 10 para praticar a invenção. Variações dessas concretizações preferidas poderão se tornar aparentes aqueles medianamente entendidos no assunto através da leitura da descrição acima. Os inventores esperam que aqueles entendidos no assunto empreguem tais variações como 15 apropriadas, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada diferentemente do especificamente descrito aqui. Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes desta matéria conforme reivindicada nas reivindicações apensas conforme 20 permitido legalmente. Ademais, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis destes estará englobada pela invenção salvo indicação em contrário ou claramente contradito pelo texto.

Claims (22)

1. Método para cromatograficamente separar o isômero IRcis, 1'R-cis de uma mistura de isômeros de (IR-I'R)atracúrio, caracterizado pelo fato de compreender separar a mistura por HPLC usando um eluente compreendendo um solvente orgânico, um co-solvente aprótico polar e um ácido fraco.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) dissolver uma mistura de isômeros de sais de (IR,1'R)-atracúrio em pelo menos um solvente orgânico; (b) aplicar à solução de mistura de isômeros a uma coluna de HPLC contendo uma fase estacionária; (c) eluir a coluna com uma fase móvel compreendendo um solvente orgânico, um co-solvente polar aprótico e um ácido fraco; (d) coletar uma ou mais frações contendo o isômero IRcis,1'R-cis; (e) opcionalmente realizar uma etapa de troca iônica; e (f) isolar o isômero lR-cis.1'R-cis.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o solvente orgânico da etapa (a) compreender diclorometano, clorofórmio, 1,4-dioxano ou uma mistura destes.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o solvente orgânico da etapa (a) compreender diclorometano.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a concentração da mistura de isômeros do sal (IR,1'R)-atracúrio no solvente orgânico na etapa (a) ser de 0,1 M a 0,5 M.

6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o solvente orgânico da fase móvel da etapa (c) compreender diclorometano, clorofórmio, 1,4-dioxano, ou uma mistura destes.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o solvente orgânico da fase móvel da etapa (c) compreender diclorometano.

8. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o co-solvente aprótico polar da fase móvel da etapa (c) compreender sulfóxido de dimetila (DMSO), N,N-dimetilformamida (DMF), N,N-dimetilacetamida (DMA), N-metil-2-pirrolidona (NMP) ou uma mistura destes.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o co-solvente aprótico polar da fase móvel da etapa (c) compreender DMSO.

10. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o ácido fraco da etapa (c) compreender um ácido orgânico, que é ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ou uma mistura destes.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o ácido orgânico compreender ácido fórmico.

12. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a mistura de solventes para eluir a coluna na etapa (c) compreender diclorometano, DMSO e ácido fórmico em uma proporção variando de 70-85 (diclorometano):8-20 (DMSO): 5-15 (ácido fórmico).

13. —Método, -de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a etapa de troca iônica (e) compreender contatar um material eluído com uma resina de troca iônica.

14. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a etapa de isolamento (f) compreender as etapas de: (a) combinar as frações eluídas, contendo pelo menos 90% do isômero IR-Cis、1'R-Cis; (b) lavar as frações eluídas combinadas com salmoura ácida e separar as fases; (c) secar a fase orgânica e evaporar o solvente para obter um óleo residual; (d) dissolver o óleo em um solvente; e (e) opcionalmente isolar o produto liofilizando a solução ou por precipitação.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de a solução usada para lavar ser uma solução a 10% de salmoura acidificada com ácido benzenossulfônico (BSA).

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de a precipitação ser realizada pelo menos uma vez de um solvente selecionado dentre tetrahidrofurano, (THF), 2-metil-tetrahidrofurano (2-MeTHF) , éter dietilico, éter diisopropilico, éter metilter-butilico (MTBE), acetona, hexano, heptano, ciclohexano, e misturas destes.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de o solvente ou mistura de solventes conter ácido fórmico ou salmoura acidificada com BSA.

18. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a etapa de isolamento (f) compreender ainda realizar uma troca iônica via uma coluna ou cartucho de troca aniônica forte (SAX).

19. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o sistema eluente compreender diclorometano, DMSO e ácido fórmico, e o teor de isômero lR-cis,1'R-cis permanecer inalterado no mesmo durante 26 horas à temperatura ambiente.

20. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o isômero lR-cis,1'R-cis (besilato de cisatracúrio) ter uma pureza isomérica maior que 99,5%.

21. Besilato de cisatracúrio, caracterizado pelo fato de ter pureza superior a 99,5%.

22. Isômero lR-cis, 1'R-cis do besilato de cisatracúrio, caracterizado pelo fato de ser preparado pelo método conforme definido na reivindicação 1.