BRPI0716874A2 - Processo para a clivagem enzimática de um racemato - Google Patents

Processo para a clivagem enzimática de um racemato Download PDF

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "PROCESSO PARA A CLIVAGEIM ENZIMÁTICA DE UM RACEMATO" .
Descrição
A presente invenção se refere a um processo para a preparação de aminas quirais opticamente ativas.
Aminas quirais desempenham um papel importante na indústria farmacêutica, agroquímica e química. Elas são freqüentemente usadas como intermediárias ou síntons para a preparação de várias substâncias fisiologicamente ativas, por exemplo, farmaceuticamente ativas, tais como derivados da pirrolidina ou cefalosporina. Em um grande número das várias aplicações das aminas quirais, somente uma forma opticamente ativa particular, o enantiômero (R) ou o enantiômero (S), é fisiologicamente ativa. Deste modo, existe uma necessidade clara em fornecer processos para a preparação de aminas quirais numa forma opticamente ativa.
Essas necessidades são parcialmente atendidas pelo preparo de aminas quirais pela cristalização de sais diastereoméricos através da adição de ácidos carboxílicos quirais (Breuer et al., Angewandte Chemie (2004) 116, 806- 843) . Outros métodos químicos usam a síntese enantiosseletiva pela redução de precursores pró-quirais com ligações duplas C=N-.
Além disso, sabe-se como clivar racematos de maneira estereosseletiva usando várias enzimas, tais como proteases, amidases ou lipases (Bornscheuer and Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis (2005), Wiley-VCH Weinheim). Sabe-se também que transaminases especificas, a saber, α-transaminases, são adequadas para o preparo de aminoácidos opticamente ativos (Bartsch et al., Appl. Environm. Microbiol. (1996) 62, 3794-3799, Cho et al., Biotechnol. Bioeng. (2003) 83, 226-234, JP 011 53084 A2 (1998), JP 633 04986 A2 (1988), EP 0 248 357 A2 e Ziehr et al., Biotechnol. Bioeng. (1987) 29, 482-487).
Entretanto, esses processos das técnicas anteriores sofrem várias desvantagens. Embora os processos enzimáticos geralmente empreguem, ao contrário dos métodos clássicos, condições brandas favoráveis e alcancem uma estereosseletividade razoável, eles regularmente usam enzimas cuja especificidade do substrato,
enantiosseletividade e/ou conversão não são suficientemente altas para processos aplicáveis industrialmente. Além disso, uma das desvantagens mais proeminentes do uso de transaminases para a preparação de aminas opticamente ativas é representada pelos fenômenos freqüentemente observados de inibição do substrato e do produto. É, portanto, um dos objetos da presente invenção fornecer um processo aperfeiçoado para preparar aminas quirais opticamente ativas, particularmente um processo com uma especificidade de substrato aperfeiçoada, uma conversão aperfeiçoada e/ou uma enantiosseletividade aperfeiçoada.
A presente invenção soluciona o problema técnico essencial fornecendo um processo para a preparação de uma amina quiral opticamente ativa, o referido processo compreendendo a reação de um composto aceptor de amino compreendendo um grupo ceto e uma mistura racêmica de 3- aminopirrolidina (3AP) ou 3-aminopiperidina (3APi) , cada uma com um grupo protetor no átomo do anel de nitrogênio, na presença de uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva para obter um enantiômero de 3AP ou 3APi, o composto amino correspondente ao referido composto aceptor de amino e pirrolidin-3-ona N-protegida ou piperidin-3-ona N-protegida como um produto de cetona.
O processo da presente invenção compreende (a) fornecer um aceptor de amino e uma mistura racêmica de 3AP I-N-protegida ou de 3APi 1-N-protegida, isto é, uma mistura dos dois enantiômeros da respectiva amina, (b) reagir o aceptor de amino e a mistura racêmica da respectiva amina com uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva, e (c) obter uma amina quiral opticamente ativa, um produto de amino e um
produto de cetona.
De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, numa etapa opcional adicional subsequente do processo, a amina quiral opticamente ativa obtida na etapa c) é isolada e purificada a partir da mistura reacional obtida na etapa c).
A reação da presente invenção segue, a principio, o seguinte esquema:
HH,
* 2
• S!-transaminase ...................►
COO-
ãe arair.o mistura racêrnica
NH>
f
I
rcw
amina quiral pura produto de cetona produto
de amino
L!R;-transaminase COO- R ft' ÍSJ
* 2
♦
NHi jb Έ f
NM1
' Λ
cocr
aceptor de amino mistura racêrnica amina quiral pura produto de cetona produto
de amino
De acordo com a presente invenção, a mistura racêrnica de 3-aminopirrolidina (3AP) ou a mistura racêrnica de 3- IG aminopiperidina (3APi) possui um grupo protetor no átomo de nitrogênio secundário do anel, isto é, na posição 1, enquanto que o grupo amino no centro quiral da amina, isto é, na posição 3, que participa da transaminação, não está protegido.
A presença do grupo protetor faz com que a amina
protegida, isto é, a 3AP 1-N-protegida ou a 3APi I-N- protegida, seja convertida de modo mais eficiente na amina quiral opticamente ativa desejada. Deste modo, a presença do grupo protetor faz com que rendimentos mais altos da amina quiral opticamente ativa desejada sejam obtidos. Em comparação com esta, a conversão da amina de partida sem um grupo protetor no átomo de nitrogênio do anel é menos eficiente.
Deste modo, a presente invenção fornece um processo para a clivagem enzimática de aminas 1-N-protegidas pelo uso de pelo menos uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva para a t ransaminação de um grupo amino a partir de um enantiômero específico da mistura dos enantiômeros da amina quiral 1-N-protegida para um aceptor de amino, formando deste modo o produto opticamente ativo desejado. No contexto da presente invenção, os termos "clivagem enzimática de aminas" ou "clivagem enzimática de uma mistura racêmica" devem significar a resolução óptica de uma mistura racêmica pela transformação enzimática estereosseletiva de um enantiômero. Dependendo da enantiopreferência da transaminase (R)- ou (S)- seletiva usada, uma amina quiral opticamente ativa da configuração óptica desejada, isto é, o enantiômero (R) ou (S) é obtido. Deste modo, o uso em uma modalidade da presente invenção de uma transaminase (S)-seletiva para a síntese por clivagem enzimática elimina o enantiômero (S) da mistura racêmica e gera o enantiômero (R) opticamente ativo desejado da amina quiral, enquanto que o uso en outra modalidade da presente invenção de uma transaminase (R)-seletiva elimina o enantiômero (R) da mistura racêmica e gera o enantiômero (S) opticamente ativo desejado. Além da amina quiral opticamente ativa desejada, a reação produz um produto de cetona a partir da transaminação da mistura racêmica, um produto amino a partir do aceptor de amino usado e um enantiômero indesejado parcialmente não-clivado, assim como um aceptor de amino não-convertido.
Numa modalidade preferida da presente invenção, o grupo protetor é um grupo terc-butoxicarbonil (Boc). Em outra modalidade preferida, o grupo protetor é um grupo benzil. Em ainda outra modalidade preferida, o grupo protetor é um grupo carbobenzóxi (Cbz) - também chamado de benziloxicarbonil.
No contexto da presente invenção, uma transaminase é uma enzima dependente de piridoxalfosfato catalisando a transferência de grupos amino. Transaminases são classificadas em E.C. 2.6.I.X. Numa modalidade particularmente preferida da presente invenção, a transaminase é uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva, particularmente é uma ω-transaminase numa modalidade preferida. No contexto da presente invenção, uma transaminase (R)- ou (S)- seletiva é uma enzima com o código de classificação E.C.2.6.1.18. Essas amino transaminases são caracterizadas pelo fato de que elas principalmente usam aminas primárias como substratos. Essas enzimas são adicionalmente caracterizadas pela exibição de uma constante de equilíbrio das reações catalisadas por transaminase (R)- ou (S)-seletivas, a qual é maior do que 1. Transaminases (R)- ou (S)-seletivas, as quais podem ser usadas de acordo com a presente invenção, são descritas, por exemplo, em Iwasaki et al., Biotechnol. Lett. (2003) 25, 1843-1846, Shin et al., Biotechnol. Bioeng. (1997) 55, 348-358, Shin e Kim, Book of Abstracts, 217th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., 21-25 de março, (1999) 180, Shin e Kim, Biosc. Biotechnol. Biochem. (2001) 65, 1782-1788 e Shin e Kim, Biotechnol. Bioeng. (1998) 60, 534- 540.
Deste modo, numa modalidade preferida da presente invenção, a transaminase (R)- ou (S)-seletiva usada no presente processo é uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva obtida a partir de Vibrio fluvialis, particularmente da cepa JS17, Alcaligenes denitrificans, particularmente da cepa Y2k-2, Klebsiella pneumoniae, particularmente da cepa YS2F ou Bacillus thuringiensis, particularmente da cepa JS64 (para as designações das cepas ver Shin e Kim, 1998, acima). É claro que a presente invenção também entende dentro do termo transaminase (R)- ou (S)-seletiva um extrato de um organismo, tal como um microrganismo ou uma célula, contendo uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva ou uma célula viva ou morta ou o próprio microrganismo compreendendo uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva. Tal microrganismo ou célula ou extrato de enzima transaminase pode ser usado na forma imobilizada ou na forma não- imobilizada. A transaminase (R)- ou (S)-seletiva também pode ser uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva geneticamente modificada ou de ocorrência natural produzida de modo recombinante, a qual é codificada parcialmente ou completamente por uma seqüência de ácidos nucléicos ou um derivado seu contido em um dos organismos acima identificados ou sendo equivalente a isso.
No contexto da presente invenção, o termo amina quiral opticamente ativa se refere ao mesmo assunto em questão que o termo amina quiral enantiomericamente ativa. Esses termos, particularmente, se referem a uma preparação a qual seja essencialmente livre, numa modalidade ainda mais preferida, livre do enantiômero indesejado.
Consequentemente, uma amina quiral opticamente ativa essencialmente compreende um excesso de um enantiômero ou mesmo consiste de somente um enantiômero.
Particularmente, no contexto da presente invenção, uma amina quiral opticamente ativa tem uma pureza óptica de pelo menos 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 e, particularmente, de pelo menos 99,9% .
Na presente invenção, a pureza óptica é dada em % de excesso de um enantiômero em relação ao outro enantiômero. Deste modo, a pureza óptica em % é o quociente da diferença entre as concentrações de enantiômero (R) e (S) e a soma das concentrações de ambos os enantiômeros (pureza óptica de A em % = ( [A] - [B] ) : ( [A] + [Β] ) χ 100, em que AeB representam as concentrações dos enantiômeros (R) e (S) ou vice-versa).
Na presente invenção, é preferível que a mistura
racêmica da amina quiral seja convertida na amina quiral opticamente ativa desejada num grau de conversão de pelo menos 30, 40, 45, 46, 47, 48, 49, particularmente 50%. As concentrações para analisar a pureza óptica e a conversão podem ser determinadas, por exemplo, usando HPLC, cromatograf ia gasosa (GC) ou métodos foto- ou fluorimétricos.
De acordo com a presente invenção, deve ser demonstrado que o grupo protetor tem um efeito positivo na taxa de conversão e, deste modo, leva a um rendimento elevado de (R)-3-aminopirrolidina usando uma transaminase (S)-especifica. Além disso, o grupo protetor também apresentou um - embora menos pronunciado - efeito na taxa de conversão de 3-aminopiperidina e exerceu um efeito positivo na seletividade da enzima.
No contexto da presente invenção, um aceptor de amino é uma molécula contendo um grupo ceto e capaz de aceitar um grupo amino transferido a partir de um doador de amino, isto é, no presente caso, de uma amina de uma mistura racêmica de aminas, por uma transaminase (R)- ou (S)- seletiva. Numa modalidade particularmente preferida da presente invenção, o aceptor de amino é um a-cetoácido. Numa modalidade ainda mais preferida da presente invenção, o aceptor de amino é selecionado do grupo consistindo de ácido fenilpirúvico, um sal seu, ácido pirúvico, um sal seu, ácido glioxilico, um sal seu, acetofenona, ácido 2- cetoglutárico, um sal seu, acetona, ácido 3-oxobutírico, um sal seu e 2-butanona. Além disso, 3-oxopirrolidina (3-0P), (3-piridil) metilcetona (3-PMK), éster etilico do ácido 3- oxobutirico (3-0BEE) ou éster metilico do ácido 3- oxopentanóico (3-0PME) podem, numa outra modalidade da presente invenção, também ser usados como aceptores de amino. De acordo com a invenção, o produto de amino obtido pela conversão do aceptor de amino de ácido fenilpirúvico é fenilalanina. 0 produto de amino obtido pela conversão do aceptor de amino de ácido pirúvico é alanina. 0 produto de amino obtido pela conversão do aceptor de amino de ácido glioxilico é glicina. 0 produto de amino obtido pela conversão do aceptor de amino de acetofenona é 1- feniletilamina. 0 produto de amino obtido pela conversão do aceptor de amino de ácido 2-cetoglutárico é ácido glutâmico. O produto de amino obtido pela conversão do aceptor de amino de acetona é isopropilamina. O produto de amino obtido pela conversão do aceptor de amino de ácido 3- oxobutirico é ácido 3-aminobutírico. O produto de amino obtido pela conversão do aceptor de amino de 2-butanona é sec-butilamina. O produto de amino obtido pela conversão do aceptor de amino de éster etilico do ácido 3-oxobutirico (3-OBEE) é ácido 3-aminobutírico. O produto de amino obtido pela conversão do aceptor de amino de éster metílico do ácido 3-oxopentanóico (3-OPME) é éster metílico do ácido 3- aminopentanóico.
A amina quiral opticamente ativa desejada obtida é, deste modo, numa modalidade preferida, dependente da transaminase (R)- ou (S)- seletiva usada do enantiômero (S) ou (R) da referida amina quiral. De acordo com a invenção, o produto de cetona obtido pelo presente processo é pirrolidin-3-ona 1-N-protegida ou piperidin-3-ona 1-N-protegida.
0 processo da presente invenção compreende a reação de uma mistura racêmica de 3-aminopirrolidina 1-N-protegida (3AP) com uma transaminase (S)- ou (R)- seletiva e um aceptor de amino para obter 3AP 1-N-protegido (R) ou (S) opticamente ativo. 0 processo da invenção também compreende a reação de uma mistura racêmica de 3-aminopiperidina I-N- protegida (3APi) com uma transaminase (R)- ou (S)- seletiva e um aceptor de amino para obter 3APÍ 1-N-protegida (S) ou (R) opticamente ativa.
De acordo com o processo da presente invenção, o grupo protetor da 3AP 1-N-protegida obtida ou da 3APÍ I-N- protegida pode ser removido por qualquer método de desproteção conhecido na técnica para a remoção. Um método para a remoção do grupo terc-butoxicarbonil (Boc) usando HCl concentrado e acetona é, por exemplo, descrito em Coffey et al., Org. Proc. Res. Dev., 8 (6) (2004), páginas 94 5-947 .
Numa modalidade particularmente preferida da presente invenção, o aceptor de amino e a mistura racêmica de aminas reagem com a transaminase em meio aquoso, por exemplo, em tampão fisiológico. Numa modalidade particularmente preferida, a reação de transaminação é efetuada num pH na faixa de 5 a 9, particularmente de 7 a 8,5. Numa modalidade particularmente preferida, a reação é efetuada numa faixa de temperatura de 10 a 65°C, preferivelmente de 20 a 50°C, particularmente de 18 a 25°C, preferivelmente em temperatura ambiente ou de 34 a 39°C, particularmente a 37°C. Numa outra modalidade preferida da presente invenção, o aceptor de amino e a mistura racêmica de aminas são fornecidos numa proporção molar de 1:1 até 1:10, particularmente de 1:1 até 1:4. Numa modalidade preferida da presente invenção, a atividade enzimática pode ser de 1 a 20.000 μηιοΙ/Γηίη.
Numa modalidade particularmente preferida, a presente invenção se refere a um processo para a preparação de uma amina quiral opticamente ativa de acordo com o descrito acima, o que significa de acordo com o qual numa primeira etapa do processo a) são fornecidos um aceptor de amino e uma mistura racêmica de 3-aminopirrolidina (3AP) ou 3- aminopiperidina (3APi), cada um carregando um grupo protetor no átomo de nitrogênio do anel, numa segunda etapa do processo b) a mistura racêmica da amina quiral e o aceptor de amino reagem com pelo menos uma ω-transaminase, numa terceira etapa do processo c) são obtidos uma amina quiral opticamente ativa, um produto de amino e um produto de cetona, e em que numa etapa adicional do processo d) o produto de cetona e/ou o produto de amino na etapa c) é ou são removidos da mistura reacional obtida, particularmente removidos pela reação com uma enzima, o que significa por clivagem enzimática, particularmente usando uma enzima selecionada do grupo consistindo de uma descarboxilase, uma sintase ou uma desidrogenase.
Numa outra modalidade preferida, o produto de cetona e/ou amino podem ser removidos por evaporação ou extração. Numa outra modalidade preferida, o produto de cetona obtido pode ser removido por descarboxilação espontânea.
Numa outra modalidade preferida, o produto de cetona obtido na etapa c) é removido pela reação com uma álcool desidrogenase (ADH), por exemplo, uma ADH de Lactobacillus kafir, a qual preferivelmente reduz acetofenona a 1- feniletanol.
Numa outra modalidade preferida da presente invenção, o produto de cetona e/ou amino obtido na etapa c) é continuamente removido da mistura reacional,
preferivelmente por extração continua.
Numa modalidade particularmente preferida, o produto de cetona pode ser removido pelo uso de um sistema bifásico ou de um reator enzima-membrana por extração continua. Essas modalidades particularmente preferidas fornecem a vantagem de se obter a conversão desejada, uma vez que o produto de cetona como subproduto do presente processo é removido da reação de equilíbrio. A reação é forçada na direção dos produtos, deste modo fornecendo uma conversão nos produtos desejados com uma alta estereosseletividade. A remoção do produto de cetona é particularmente útil, uma vez que ela minimiza a inibição do produto.
Outras modalidades preferidas da presente invenção são o assunto das reivindicações abaixo.
A presente invenção é ilustrada em maiores detalhes nos exemplos a seguir.
Exemplo 1: Clivaqem enzimática de (R,S)-B3AP
Para o presente exemplo, uma (S) ω-transaminase de Vibrio fluvialis (Julich Chemical Solutions, Alemanha), a seguir chamada de TA7, e uma (S) ω-transaminase de Alcaligenes denitrificans (Julich Chemical Solutions, Alemanha) a seguir chamada de TA8 foram usadas na mistura reacional numa concentração final de 4 U/mL em 50 mM de Tris-HCl, pH 7. üma solução de uma mistura racêmica de 10 mM (concentração final) de (R,S)-B3AP (N-l-boc- aminopirrolidina) (20 μιτιοί) foi usada como extrato e reagiu na mistura reacional a 370C por 15 h com TA7 ou TA8 usando piruvato numa concentração final de 10 mM como aceptor de
amino.
Depois de 15 h de tempo reacional, a (S) co- transaminase ΤΔ7 levou a uma pureza óptica da amina opticamente ativa obtida (R)-B3AP de 62,5 +/- 0,5% numa conversão de 39,0 +/- 5%.
A (S) ω-transaminase levou, depois de 15 h de tempo reacional, a uma pureza óptica de (R)-B3AP opticamente ativa obtida de 97,5 +/- 0,5% numa conversão de 47,6 +/- 5
TO S- -L 1J í .
É evidente que as purezas ópticas obtidas são elevadas ou mesmo muito elevadas e são próximas dos valores a serem esperados para uma enzima estereosseletiva ideal. É para ser notado que para TA7 a pureza óptica é comparativamente menor devido a uma conversão mais baixa.
Exemplo 2: Clivagem enzimática de (R, S) -l-N-Boc-3- aminopiperidina
Para a clivagem enzimática de uma mistura racêmica de (R, S)-l-N-Boc-3-aminopiperidina (concentração final: 10 mM) com piruvato como aceptor de amino (concentração final: 10 mM) , (S) ω-transaminase TA8 foi usada em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5. Numa concentração enzimática de 2 U/mL de TA8, a pureza óptica da (R)-l-N-Boc-3-aminopiperidina opticamente ativa obtida de 70 +/- 0,5% foi alcançada depois de um tempo reacional de 72 h a 37°C numa conversão de 54 +/- 5%. 0 uso de 20 U/mL de TA8 nas mesmas condições reacionais levou a uma pureza óptica da (R)-l-N-Boc-3- aminopiperidina obtida de 98,5 + 0,5% numa conversão de 72 +/- 5%.
Exemplo 3: Preparação de (R)-Β3ΆΡ opticamente ativa através
de clivagem racêmica
230 mg (0,85 rrrnol) de (R,S)-B3AP racêmica foram utilizados numa concentração final de 10 mM com 0,8 U/mL de (S) ω-transaminase TA8 . Piruvato numa concentração final de 10 mM foi usado como um aceptor de amino. A reação foi executada em pH 8 com tampão fosfato de potássio 50 mM numa temperatura de 37°C.- 0 excesso de enantiômeros foi determinado por cromatograf ia gasosa. Depois de um tempo reacional de 7 h, a pureza óptica dos 89,4 mg de (R)-B3AP opticamente ativa obtida foi de 98,7 + /- 0,5% com um rendimento de 39 +/- 5% (0,33 mrrtol).
Depois da finalização da reação, o valor do pH foi ajustado com HCl 5 N em pH 5. A B30P formada foi extraída quatro vezes, cada vez com 75 mL de diclorometano. Cromatografia em camada fina não detectou qualquer B30P na solução reacional. Subseqüentemente, o valor de pH foi ajustado com solução de KOH em pH 13 e extraído três vezes com 100 mL de diclorometano cada. Somente uma raia com B3AP pôde ser detectada na cromatografia em camada fina. As fases orgânicas contendo B30P e B3AP foram unificadas, secas com sulfato de sódio desidratado e subseqüentemente o agente solubilizante foi evaporado. Depois disso, os espectros de RMN de 1H e 13C (300 MHz) foram tomados.
103,6 mg de Boc-3-pirrolidona correspondendo a uma conversão de 44 +/- 5% foram obtidos como um produto de cetona. Além disso, o produto de amino de alanina foi obtido. A remoção seletiva do produto de amino de alanina, por exemplo, por reação enzimática com uma alanina desidrogenase, se mostra útil, uma vez que ela minimiza a inibição do produto causada pela alanina gerada, a qual por sua vez poderia ser utilizada para usar concentrações maiores da amina como extrato. 0 mesmo é verdade para o uso de acetona.
A taxa de conversão pode ser aumentada pelo uso de um aceptor de amino de acetona, o qual pode - depois de ter sido convertido no produto de amino de isopropilamina - ser removido do produto reacional sob pressão reduzida. Exemplo 4: Resolução óptica de uma mistura racêmica de I-N- benzil-3-aminopirrolidina (Be3AP) com transaminase de Vibrio fluvialis
Um frasco reacional de 1,5 mL foi carregado com: • 10 μι de uma solução de (R,S)-Be3AP em DMSO (concentração final de 5 mM) ;
• 20 (uL de piridoxal fosfato, 10 mM (concentração final de Or2 mM);
• 100 pL de piruvato, 100 mM (concentração final de 10
mM) ; e
• 830 μΐ^ de um tampão de fosfato de sódio, 50 mM, pH 8.
A reação foi iniciada pela adição de 40 μΙ. de transaminase de Vibrio fluvialis. Isso corresponde a 7 U/mL. Depois de 0 min, 10 min, 30 min e 60 min foram recolhidas amostras.
0 progresso da reação e a pureza óptica estão
disponibilizados na Tabela 1.
Tempo [min] Excesso enantiomérico de (JR) -Be3AP [%eeR] Concentração de Be3AP [mM] Conversão [%] 0 0 5 0 63 2,3 54 96 1, 55 69 60 95 0, 85 83
[%eeR] - excesso enantiomérico do enantiômero (R) em %
Os dados mostram que a transaminase de Vfl converte Be3AP com alta atividade.
Exemplo 5: Resolução óptica de uma mistura racêmica de (R, S) -Cbz-3-aminopirrolidina (C3AP) com transaminase de Vibrio Fluvialís
Um frasco reacional de 1,5 mL foi carregado com:
• 10 μΐ, de uma solução de (R,S)-C3AP em DMSO (concentração final de 5 mM);
• 20 μΐ; de piridoxal fosfato, 10 mM (concentração final de 0,2 mM);
• 100 μΐ; de piruvato, 100 mM (concentração final de 10
mM) ; e
• 830 μΙ; de um tampão de fosfato de sódio, 50 mM, pH 8.
A reação foi iniciada pela adição de 40 μΐ^ de transaminase de Vibrio fluvialis. Isso corresponde a 7 U/mL. Depois de 0 min, 10 min, 30 min e 60 min foram recolhidas amostras.
Já após 10 min para a (R)-C3AP, um excesso enantiomérico do enantiômero (R) de 97,3%eeR foi determinado na amostra. Depois de 30 min, nenhum enantiômero (S) pôde ser detectado.
Exemplo 6: Resolução óptica de uma mistura racêmica de (R, S)-l-N-boc-3-aminopiperidina (B3APÍ) com transaminase de Vibrio fluvialis Um frasco reacional de 1,5 mL foi carregado com:
• 100 μΏ de uma solução de hidrocloreto de (R,S)-B3APi em água (concentração final de 5 mM);
• 20 μ]1 de piridoxal fosfato, 10 mM (concentração final de 0,2 mM);
• 100 μΙ, de piruvato, pH 8, 100 mM (concentração final de mM); e
• 580 μΙ, de um tampão de fosfato de sódio, 50 mM, pH 8;
A reação foi iniciada pela adição de 200 μ]1 de transaminase de Vibrio fluvialis. Isso corresponde a 35 U/mL. Depois de 10 min, 30 min, 60 min, 2 h, 4 h e 18 h, as amostras foram recolhidas.
Depois de 4 h, um excesso enantiomérico de 96,3%ees foi alcançado. A conversão foi de 55 ± 5%. Embora tenha sido necessário usar uma grande quantidade da enzima, pode- se observar que a transaminase de Vibrio fluvialis pode ser usada para a resolução óptica de (R,S)-B3APi.

Claims (11)

1. Processo para a preparação de uma amina quiral opticamente ativa caracterizado pelo fato de compreender: a) fornecer um aceptor de amino e uma mistura racêmica de 5 3-aminopirrolidina (3AP) ou 3-aminopiperidina (3APi), cada uma com um grupo protetor no átomo de nitrogênio do anel; b) reagir o aceptor de amino e a mistura racêmica da amina com uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva; e c) obter uma amina quiral opticamente ativa, um produto de amino e um produto de cetona.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo protetor é benzil, terc- butoxicarbonil (Boc) ou carbobenzóxi (Cbz).
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o aceptor de amino é selecionado do grupo consistindo de ácido fenilpirúvico, um sal seu, ácido pirúvico, um sal seu, ácido glioxilico, um sal seu, acetofenona, ácido 2-cetoglutárico, um sal seu, acetona, ácido 3-oxobutírico, um sal seu, 2-butanona, 3- oxopirrolidina (3-OP), (3-piridil)metilcetona (3-PMK), éster etilico do ácido 3-oxobutirico (3-OBEE) e éster metílico do ácido 3-oxopentanóico (3-OPME).
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o produto de amino obtido é uma amina primária ou um aminoácido.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a transaminase (R)- ou (S)- seletiva é uma transaminase (R)- ou (S)- seletiva de Vibrio fIuvialisr Alcaligenes denitrificansr Klebsiella pneumoniae ou Bacillus thuringiensis.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o produto de amino e/ou o produto de cetona obtido na etapa c) é, numa etapa adicional d) do processo , removido da mistura reacional pela reação com uma enzima por descarboxilação espontânea, por extração ou por evaporação.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a enzima usada na etapa d) é uma descarboxilase, uma sintase ou uma desidrogenase.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a enzima é uma álcool desidrogenase (ADH).
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a amina quiral opticamente ativa obtida na etapa c) ou d) é removida da mistura reacional obtida na etapa c) ou d).
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o grupo protetor de 3AP 1-N-protegido ou 3APi 1-N-protegido obtido na etapa c) ou d) é removido por um método de desproteção.
11. Processo para a preparação de um composto fisiologicamente ativo selecionado do grupo de derivados de 3-amincpirrolidona, cefalosporina, derivados da cefalosporina, ácidos borônicos heterociclicos, L- diidroxifenilalanina (L-Dopa) , α-metildopa, D- feniIglicina, β-hidroxifenilglicina, fosfinotricina, derivados de piramido e derivados de pirrolidona, caracterizado pelo fato de que é usado o processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.
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