JP2010502202A - 細菌性オメガアミノ基転移酵素を利用したラセミアミン混合物の光学的分解能による光学活性ｎ−保護３−アミノピロリジン又は光学活性ｎ−保護３−アミノピペリジン及び対応するケトンの調製方法 - Google Patents

細菌性オメガアミノ基転移酵素を利用したラセミアミン混合物の光学的分解能による光学活性ｎ−保護３−アミノピロリジン又は光学活性ｎ−保護３−アミノピペリジン及び対応するケトンの調製方法 Download PDF

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Abstract

本発明は光学活性キラルアミンの調製方法に関するものであり、つまり薬学的生成物の合成において中間生成物として用いられるものである。

Description

本発明は光学活性キラルアミンの調製方法に関する。
キラルアミンは医薬産業、農薬産業及び化学工業において重要な役割を果たす。キラルアミンは様々な生理学的、つまり薬学的な活性物質を調製するため、中間体或いは合成素子としてよく利用される。薬学的な活性物質とは、例えばセファロスポリン或いはピロリジン誘導体等である。キラルアミンの非常に多数の応用において、ある特定の光学活性体のみ、（Ｒ）又は（Ｓ）光学異性体のどちらかが生理学的に活性である。したがって、キラルアミンを光学活性体の形で調製する方法を提供する明確な必要性がある。
これらの必要性は、キラルカルボン酸の添加を経てジアステレオマー塩を結晶化し、キラルアミンを調製することにより、部分的には達成される（非特許文献１）。他の化学的方法においてはエナンチオ選択的合成が用いられ、この合成はプロキラル先駆物質をＣ＝Ｎ二重結合で減少させることにより行われる。
さらにエナンチオ選択的合成は、様々な酵素を用いて立体選択的にラセミ化合物を切断することで知られている。様々な酵素とは、プロテアーゼ、アミダーゼ或いはリパーゼ等である（非特許文献２）。また、特定のアミノ基転移酵素、主にα−アミノ基転移酵素は光学活性アミノ酸の調製に好適である（非特許文献３、非特許文献４、特許文献１、特許文献２、特許文献３、及び非特許文献５）。
Breuer他、Angewandte Chemie (2004) 116,806-843 Bornscheuer and Kazlauskas，Hydrolases in Organic Synthesis (2005) Wiley-VCH Weinheim Bartsch他、Appl. Environm. Microbiol. (1996) 62, 3794-3799 Cho他、Biotechnol. Bileng. (2003) 83, 226-234 Ziehr他、Biotechnol. Bioeng. (1987) 29, 482-487
JP011 53084 A2(1998) JP633 04986 A2(1988) EP0 248 357 A2
しかし、これらの従来技術における方法は様々な問題を抱えていた。通常酵素過程は、古典的な方法とは対照的な穏やかな条件を採用し、また妥当な立体選択性を達成する。しかし、通常の酵素過程は、基質特異性、立体選択性及び／又は変換が産業上利用可能な方法に十分ではない酵素を利用する。さらに、アミノ基転移酵素を光学活性カミンの調製に用いる場合の最も顕著な欠点の一つは、しばしば見受けられる基質及び生成物の阻止現象に代表される。したがって、本発明の一つの目的は、さらなる改良を加えた光学活性キラルアミンの調製方法を提供することであり、特に、さらに改良された基質特異性、変換及び／又は立体選択性を提供することである。
本発明は、光学活性キラルアミンの調製方法を提供することにより潜在的な技術的問題を解決するものであり、前記方法は、ケト基を備えるアミノ受容体化合物と、３−アミノピロリジン（３ＡＰ）又は３−アミノピペリジン（３ＡＰｉ）のラセミ混合物との反応からなり、アミノ受容体化合物及びラセミ混合物の夫々は、（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素存在下で環窒素原子に保護基を有する。そして、１つの３ＡＰ又は３ＡＰｉの光学異性体、前記アミノ受容体化合物に対応するアミノ化合物、及びケトン化合物としてＮ保護ピロリジン−３−１或いはＮ保護ピペリジン−３−１を獲得する。
本発明の方法は、（ａ）アミノ受容体及び１−Ｎ−保護３ＡＰ又は１−Ｎ−保護３ＡＰｉのラセミ混合物、すなわち、各アミンの２つの光学異性体の混合物を提供することからなる。また本発明の方法は、（ｂ）アミノ受容体及び各アミンのラセミ混合物を（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素で反応させること、及び（ｃ）光学活性キラルアミン、アミノ生成物及びケトン生成物を得ることからなる。
本発明の好適な実施形態に従い、次の更なる光学的工程段階において、ステップｃ）で得られた光学活性キラルアミンは、ステップｃ）で得られた反応混合物から分離され精製される。
Figure 2010502202
本発明の反応は、原則として以下に続く図式に示される。
本発明によると、３−アミノピロリジン（３ＡＰ）のラセミ混合物或いは３−アミノピペリジン（３ＡＰｉ）のラセミ混合物は、二級窒素原子の環の部分（位置１）に保護基を有する一方、アミンのキラル中心（位置３）にアミノ基を有する。アミノ基転移に関与するアミノ基は保護されない。
保護基の存在により、保護アミン（すなわち１−Ｎ−保護３ＡＰ又は１−Ｎ−保護３ＡＰｉ）は更に効率的に所望の光学活性キラルアミンに変換される。したがって、保護基の存在により、より高い収率で所望の光学活性キラルアミンが得られる。環窒素原子に保護基がない場合のアミン開始の変換は、保護基有りの場合と比較すると効率的でない。
したがって、本発明は１−Ｎ−保護アミンの酵素的切断方法を提供する。この酵素的切断は、少なくとも１つの（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素を用い、１−Ｎ−保護キラルアミン光学異性体の混合物のある特定の光学異性体からアミノ受容体へのアミノ基のアミノ基転移を行う。これにより、所望の光学活性生成物が形成される。本発明との関連において、「アミンの酵素的切断」或いは「ラセミ混合物の酵素的切断」は、一つの光学異性体の立体選択的な酵素変換反応によるラセミ混合物の光学的分解能を意味する。特定の（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素を用いることにより、所望の光学的配置の光学活性キラルアミン（例えば、（Ｒ）又は（Ｓ）光学異性体のどちらか一方）が得られる。したがって、本発明のある実施形態において、酵素的切断合成の（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素は、（Ｓ）光学異性体をラセミ混合物から排除し、キラルアミンの所望の光学活性（Ｒ）の光学異性体を生成する。その一方、他の実施形態においては、（Ｒ）選択的アミノ基転移酵素は（Ｒ）光学異性体をラセミ混合物から排除し、所望の光学活性（Ｓ）の光学異性体を生成する。キラルアミンの所望の光学活性に加え、反応によりラセミ混合物のアミノ基転移からケトン生成物が、また用いたアミノ受容体からアミノ生成物が、及び無変換アミノ受容体と同様に部分的に非切断の不要な光学異性体が生成される。
本発明の好適な実施形態において、保護基は三級ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基である。他の好適な実施形態において、保護基はベンジル基である。さらに他の好適な実施形態において、保護基はカルボベンゾキシ基であって、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基とも呼ばれる。
本発明との関連において、アミノ基転移酵素はリン酸ピリドキサル依存性酵素であって、この酵素はアミノ基の転移を触媒する。アミノ基転移酵素はＥ.Ｃ.２.６.１.Ｘに分類される。本発明の特に好適な実施形態において、アミノ基転移酵素は（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素であって、特に好適な実施形態においては、ω−アミノ基転移酵素である。
本発明との関連において、（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素は、分類コードＥ.Ｃ.２.６.１.１８の酵素である。これらのアミノ基転移酵素の特徴として、一級アミンを基質として主に利用することが挙げられる。これらの酵素はさらに、１以上の反応により触媒される（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素の平衡定数を示すという特徴を有する。本発明において用いられる（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素は例えば、Biotechnol. Lett.（Iwasaki他（2003） 25, 1843-1846）、Biotechnol. Bioeng.（Shin他（1997）55, 348-358）、Book of Abstracts, 217th ACS National Meeting, Anaheim, Calif.,（Shin及びKim, March 21-25,（1999）180）、Biosc. Biotechnol. Biochem.（Shin及びKim,（2001）65, 1782-1788）及びBiotechnol. Bioeng.（Shin及びKim（1998）60, 534-540）において説明されている。
したがって、本発明の好適な実施形態において、本方法において用いられる（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素は、ビブリオ・フルビアリス、特にＪＳ１７株より得られる。また、アルカリジェネス・デニトリフィカンスの場合は、特にＹ２ｋ−２株より得られ、クレブシエラニューモニエの場合は、特にＹＳ２Ｆ株から得られ、或いはバチルスチューリンゲンシスの場合は、特にＪＳ６４株から得られる（株の定義については上記のShin及びKim（1998）を参照のこと）。もちろん本発明はまた、（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素という用語により、有機体の抽出物を定義する。有機体は例えば、微生物或いは細胞を指し、（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素、或いは（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素を有する生細胞又は死細胞又は微生物そのものを指す。このような微生物、或いは細胞、或いは抽出物、或いはアミノ基転移酵素は、固定化又は非固定化の形で用いられてもよい。（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素はまた、組換え自然発生的（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素、或いは遺伝子組換え（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素であってもよい。この（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素は、部分的或いは完全に核酸配列或いはその誘導体によってコードされる。核酸配列或いはその誘導体は、上記に示す有機体或いはそれに等しいものの一つに含まれる。
本発明との関連において、光学活性キラルアミンという用語は、鏡像異性体活性キラルアミンと同じ対象に関連する。これらの用語は特に本来光学異性体を有しない調整法について言及し、より更なる好適な実施形態においては不要な光学異性体のない調製法について言及している。したがって、光学活性キラルアミンは基本的に１つの光学異性体の過剰分を含むものであり、或いは１つの光学異性体のみを構成するものでもある。
特に、本発明との関連において、光学活性キラルアミンは少なくとも７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、及び特に少なくとも９９．９％の光学純度を有する。
本発明において、光学純度は他の光学異性体を越える光学異性体の過剰率で示される。したがって、光学純度率は（Ｒ）及び（Ｓ）光学異性体濃度間の差及び２つの光学異性体の濃度の和の商である（Ａの光学純度率＝([A]-[B]):([A]+[B]）x 100であり、Ａ及びＢは（Ｒ）及び（Ｓ）光学異性体濃度或いはその逆を表す）。
本発明において、キラルアミンのラセミ混合物は所望の光学活性キラルアミンに変換される。その変換の度合は少なくとも３０、４０、４５、４６、４７、４８、４９、特に５０％である。光学純度及び変換を分析するための濃度は、例えばＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）或いは光度或いは蛍光測定法を用いることにより決定することができる。
本発明によると、保護基は変換率に対しプラスの影響を有し、これにより（Ｓ）特異的アミノ基転移酵素を用い（Ｒ）−３−アミノピロリジンの収率を上昇させる。さらに、あまり明確なものではないが、保護基はまた３−アミノピロリジンの変換率にも影響を表し、酵素の選択においてプラス効果を及ぼした。
本発明との関連において、アミノ受容体はケト基を含む分子であって、アミノドナーから移送されたアミノ基を受容することができる。すなわち、本発明の場合はアミンのラセミ混合物のアミンから、（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素によって移送される。本発明の特に好適な実施形態において、アミノ受容体はα−ケト酸である。更により好適な実施形態において、アミノ受容体は、フェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、グリオキシル酸、その塩、アセトフェノン、２−ケトグルタル酸、その塩、アセトン、３−オキソ酪酸、その塩、及び２−ブタノンより選択される群からなる。さらに、３−オキソピロリジン（３−ＯＰ）、（３−ピリジル）メチルケトン（３−ＰＭＫ）、３−オキソ酪酸エチルエステル（３−ＯＢＥＥ）、或いは３−オキソペンタン酸メチルエステル（３−ＯＰＭＥ）もまた、本発明のさらなる実施形態においてアミノ受容体として用いられる。
本発明によると、アミノ受容体フェニルピルビン酸の変換により得られたアミノ生成物はフェニルアラニンである。アミノ受容体ピルビン酸の変換により得られたアミノ生成物はアラニンである。アミノ受容体グリオキシル酸の変換により得られたアミノ生成物はグリシンである。アミノ受容体アセトフェノンの変換により得られたアミノ生成物は１−フェニルエチルアミンである。アミノ受容体２−ケトグルタル酸の変換により得られたアミノ生成物はグルタミン酸である。アミノ受容体アセトンの変換により得られたアミノ生成物はイソプロピルアミンである。アミノ受容体３−オキソ酪酸の変換により得られたアミノ生成物は３−アミノ酪酸である。アミノ受容体２-ブタノンの変換により得られたアミノ生成物はｓｅｃ−ブチルアミンである。アミノ受容体３−オキソ酪酸エチルエステル（３ＯＢＥＥ）の変換により得られたアミノ生成物は３−アミノ酪酸である。アミノ受容体３−オキソ酪酸エチルエステル（３ＯＰＭＥ）の変換により得られたアミノ生成物は３−アミノペンタン酸メチルエステルである。
したがって好適な実施形態において、得られた所望の光学活性キラルアミンは、用いられた（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素、或いはキラルアミンの（Ｓ）又は（Ｒ）光学異性体に依存する。
本発明によると、本発明の方法により得られたケトン生成物は、１−Ｎ−保護−ピロリジン−３−ｏｎｅ或いは１−Ｎ−保護ピペリジン−３−ｏｎｅである。
本発明の方法は、１−Ｎ−保護３−アミノピロリジン（３ＡＰ）及び（Ｓ）又は（Ｒ）選択的アミノ基転移酵素とのラセミ混合物をアミノ受容体と反応させることを含み、光学活性（Ｒ）又は（Ｓ）１−Ｎ−保護３ＡＰが得られる。本発明の方法はまた、１−Ｎ−保護３−アミノピペリジン（３ＡＰｉ）と（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素との混合物をアミノ受容体と反応させることを含み、光学活性（Ｓ）又は（Ｒ）１−Ｎ−保護３ＡＰｉが得られる。
本発明の方法によると、１−Ｎ−保護３ＡＰ或いは１−Ｎ−保護３ＡＰｉの保護基は、除去に関する従来技術において知られているいかなる脱保護法により除去されてもよい。三級ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を濃縮ＨＣｌ及びアセトンを用いて除去する方法は、例えばOrg. Proc. Res. Dev., 8 (6) （Coffey他、(2004)945-947頁）に記述されている。
本発明の特に好適な実施形態において、アミノ受容体及びアミンのラセミ混合物は、例えば生理緩衝液などの水性溶媒中のアミノ基転移酵素と反応する。特に好ましい実施形態において、アミノ基転移酵素の反応は５から９の範囲、特に７から８．５の範囲のｐＨで行われる。特に好適な実施形態において、反応は１０から６５度の温度範囲で、特に２０から５０度の範囲において、特に１８から２５度の範囲において行われるが、好ましい室温は３４から３９度、特に３７度がよいとされる。本発明のさらなる好適な実施形態において、アミノ受容体及びアミンのラセミ混合物は、モル比が１：１から１：１０で、特に１：１から１：４である。本発明の好適な実施形態において、酵素活性は１から２０．０００μｍｏｌ／分である。
特に好適な実施形態において、本発明は上記に係る光学活性キラルアミンの調製方法に関する。つまり、第一の段階のステップａ）において、それぞれ環窒素原子に保護基を有するアミノ受容体及び３−アミノピロリジン（３ＡＰ）又は３−アミノピペリジン（３ＡＰｉ）のラセミ混合物がもたらされ、また第二の方法のステップｂ）において、キラルアミンのラセミ混合物及びアミノ受容体は少なくとも１つのω−アミノ基転移酵素と反応し、そして第三の段階のステップｃ）において、光学活性キラルアミン、アミノ生成物及びケトン生成物が得られる。またさらなる段階のステップｄ）において、ステップｃ）で得られた１つ以上のケトン生成物及び／又はアミノ生成物が得られた反応混合物から除去され、特に酵素との反応により除去される。これは、酵素的切断により除去されることを意味する。この酵素には特に、デカルボキシラーゼ、シンターゼ或いはデヒドロゲナーゼが用いられる。
さらなる好適な実施形態において、ケトン及び／又はアミノ生成物は蒸発或いは抽出により除去される。さらなる好適な実施形態として、得られたケトン生成物は自然発生的な脱炭酸により除去される。
さらなる好適な実施形態において、ステップｃ）で得られたケトン生成物は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）との反応により除去される。例えば、乳酸菌ケフィアＡＤＨは、アセトフェノンを１−フェニルエタノールに好適に還元する。
本発明のさらなる好適な実施形態において、ステップｃ）で得られたケトン及び／又はアミノ生成物は、反応混合物から連続的に除去され、好適には連続的な抽出により除去される。
特に好適な実施形態において、ケトン生成物は連続的な抽出による二段階のシステム或いは酵素膜リアクタを用いることにより除去される。
これらの特に好適な実施形態は、所望の変換を得るという利点をもたらす。これは本発明の方法によるケトン生成物が平衡反応より除去されるためである。この反応は生成物の方向へ押圧され、その結果、所望の生成物への変換に高立体選択性をもたらす。ケトン生成物の除去は、生成物阻害を最小限化するので特に有益である。
本発明のさらに好適な実施形態は、従属項の対象である。
本発明は以下の実施例においてより詳細に説明される。
（試験例１：（Ｒ,Ｓ）−Ｂ３ＡＰの酵素的切断）
本試験例において、ビブリオ・フルビアリス（Vibrio fluvialis）から得た（Ｓ）ω-アミノ基転移酵素（Julich Chemical Solutions社製：独国）（以下、TA7と称する）及びアルカリジェネス・デニトリフィカンスから得た（Ｓ）ω-アミノ基転移酵素（Julich Chemical Solutions社製：独国）（以下、ＴＡ８と称する）が混合反応器内で用いられ、最終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中４Ｕ／ｍｌ（ｐＨ７）とされた。１０ｍＭ（最終濃度）の（Ｒ，Ｓ）−Ｂ３ＡＰ(Ｎ−１−ｂｏｃ−アミノピロリジン)（２０μｍｏｌ)のラセミ混合物溶液が、遊離体として用いられ、３７℃の温度で１５時間、ＴＡ７又はＴＡ８との反応混合器内で反応が行なわれた。この反応には、最終濃度１０ｍＭのピルビン酸塩が、アミノ受容体として用いられた。
15時間の反応時間の後、（Ｓ）ω−アミノ基転移酵素ＴＡ７は、３９．０＋／−５％の変換率で、得られた光学活性アミン（Ｒ）−Ｂ３ＡＰの光学純度６２．５＋／−０．５％となった。
15時間の反応時間の後、（Ｓ）ω−アミノ基転移酵素ＴＡ８は、４７．６＋／−５％の変換率で、得られた光学活性の（Ｒ）−Ｂ３ＡＰの光学純度９７．５＋／−０．５％となった。
得られた光学純度は高く又は非常に高く、理想的な立体選択的酵素に対して期待される値に非常に近い値である。ＴＡ７に関して述べると、比較的低い光学純度は、おそらく低い変換率に起因するものと考えられる。
（試験例２：（Ｒ,Ｓ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジンの酵素的切断）
（Ｒ,Ｓ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジン（最終濃度：１０ｍＭ）とアミノ受容体としてのピルビン酸塩（最終濃度：１０ｍＭ）のラセミ混合物の酵素的切断に関し、（Ｓ）ω−アミノ基転移酵素TA8が、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．５）中で用いられた。ＴＡ８の２Ｕ／ｍｌの酵素濃度で、３７℃で７２時間の反応時間の後、５４＋／−５％の変換率で、得られた光学活性な（Ｒ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジンの７０＋／−０．５％の光学純度に達した。同じ反応条件で、２０Ｕ／ｍｌを用いると、７２＋／−５％の変換率で、得られた（Ｒ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジンの９８．５＋０．５％の光学純度となった。
（試験例３：ラセミ切断を介した光学活性な（Ｒ）−Ｂ３ＡＰの調整）
２３０ｍｇ（０．８５ｍｍｏｌ）のラセミ（Ｒ,Ｓ）−Ｂ３ＡＰが、最終濃度１０ｍＭで０．８Ｕ／ｍｌの（Ｓ）ω-アミノ基転移酵素TA8中で用いられた。最終濃度１０ｍＭのピルビン酸塩がアミノ受容体として用いられた。反応は、ｐＨ８で、３７℃の５０ｍＭのリン酸カリウムバッファを用いて行なわれた。過剰な鏡像体は、ガスクロマトグラフィによって判別された。７時間の反応時間の後、得られた８９．４ｍｇの光学的活性な(R)-B3APの光学純度は、３９＋／−５％（０．３３ｍｍｏｌ）の収率で、９８．７＋／−０．５％であった。
反応が完了した後、５ＮＨＣｌを用いて、ｐＨ５にｐＨ値が調整された。毎時間、７５ｍｌのジクロロメタンを用いて、生成されたＢ３ＯＰが、４時間抽出された。薄層クロマトグラフィは、反応溶液中においてＢ３ＯＰを全く検知しなかった。その後、ＫＯＨ溶液を用いて、ｐＨ値が、ｐＨ１３に調整され、毎回、１００ｍｌのジクロロメタンを用いて、３回の抽出作業が行なわれた。Ｂ３ＡＰを伴う１レーンのみが薄層クロマトグラフィ中で検知された。Ｂ３ＯＰとＢ３ＡＰを含む有機相が、一体化され、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥された。その後、可溶化剤が蒸発された。更にその後、１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラ（３００ＭＨｚ）が得られた。
４４＋／−５％の変換率にしたがって１０３．６ｍｇのＢｏｃ−３−ピロリジンｏｎｅがケトン生成物として得られた。加えて、アミノ生成物のアラニンが得られた。選択的にアミノ生成物のアラニンを除去（例えば、アラニンデヒドロゲナーゼを用いて、酵素反応を生じさせることによって）することで、発生したアラニンに起因する生成物阻害を最小限化でき、実用性を保証可能となる。したがって、高い濃度の遊離体としてのアミンを使用するために利用可能である。同一のことはアセトンを利用しても、当てはまる。
変換率は、アミノ受容体であるアセトンとして用いることによって増加可能である。アミノ生成物であるイソプロピルアミンに変換した後、アミノ受容体であるアセトンが、減圧環境下で、反応生成物から除去されてもよい。
（試験例４：１−Ｎ−ベンジル−３−アミノピロリジン（Ｂｅ３ＡＰ）とビブリオ・フルビアリスのアミノ基転移酵素のラセミ混合物の光学的分解能）
１．５ｍｌの反応バイアルが以下の物で充填された。
・ＤＭＳＯ中の１０μlの（Ｒ,Ｓ）−Ｂｅ３ＡＰ溶液（５ｍＭの最終濃度）
・２０μｌのピリドキサル・リン酸（１０ｍＭ）（０．２ｍＭの最終濃度）
・１００μｌのピルビン酸塩（１００ｍＭ）（１０ｍＭの最終濃度）
・８３０μｌのリン酸ナトリウムバッファ（５０ｍＭ，ｐＨ８）

反応は、４０μｌのビブリオ・フルビアリスのアミノ基転移酵素の添加によって開始した。これは、７Ｕ／ｍｌに相当する。0分、10分、30分及び60分の後、サンプルが採取された。
反応の進捗及び光学純度が表１に示される。
（表１）
Figure 2010502202

尚、（％ｅｅＲ）は、（Ｒ）鏡像体の鏡像体過剰を％で表示したものである。
データは、Ｖｆｌアミノ基転移酵素が高い活性を以って、Ｂｅ３ＡＰを変換することを示す。
（試験例５：（Ｒ,Ｓ）−Ｃｂｚ−３−アミノピロリジン（Ｃ３ＡＰ）とビブリオ・フルビアリスのアミノ基転移酵素のラセミ混合物の光学的分解能）
１．５ｍｌの反応バイアルが以下の物で充填された。
・ＤＭＳＯ中の１０μｌの（Ｒ,Ｓ）−Ｃ３ＡＰ溶液（５ｍＭの最終濃度）
・２０μｌのピリドキサル・リン酸（１０ｍＭ）（０．２ｍＭの最終濃度）
・１００μｌのピルビン酸塩（１００ｍＭ）（１０ｍＭの最終濃度）
・８３０μｌのリン酸ナトリウムバッファ（５０ｍＭ，ｐＨ８）

反応は、４０μｌのビブリオ・フルビアリスのアミノ基転移酵素の添加によって開始した。これは、７Ｕ／ｍｌに相当する。０分、１０分、３０分及び６０分の後、サンプルが採取された。
１０分経過した後、（Ｒ）−Ｃ３ＡＰに対して、９７．３％ｅｅＲの（Ｒ）鏡像体の鏡像体過剰がサンプル中で判別された。３０分後、（Ｓ）−鏡像体は全く検知されなかった。
（試験例６：（Ｒ,Ｓ）−１−Ｎ−ｂｏｃ−３−アミノピペリジン（Ｂ３ＡＰｉ）とビブリオ・フルビアリスのアミノ基転移酵素のラセミ混合物の光学的分解能）
１．５ｍｌの反応バイアルが以下の物で充填された。
・水中の１００μｌの（Ｒ，Ｓ）−Ｂ３ＡＰｉ塩酸塩溶液（５ｍＭの最終濃度）
・２０μｌのピリドキサル・リン酸（１０ｍＭ）（０．２ｍＭの最終濃度）
・１００μｌのピルビン酸塩（ｐＨ８，１００ｍＭ）（１０ｍＭの最終濃度）
・５８０μｌのリン酸ナトリウムバッファ（５０ｍＭ，ｐＨ８）

反応は、200μｌのビブリオ・フルビアリスのアミノ基転移酵素の添加によって開始した。これは、３５Ｕ／ｍｌに相当する。１０分、３０分、６０分、２時間、４時間及び１８時間経過の後、サンプルが採取された。
４時間後、９６．３％ｅｅｓの鏡像体過剰に達した。変換率は、５５＋／−５％であった。大量の酵素が必要であったが、ビブリオ・フルビアリスのアミノ基転移酵素が、（Ｒ,Ｓ）−Ｂ３ＡＰｉの光学的分解に用いることができることが示された。

Claims (11)

  1. 光学活性キラルアミンの調製方法であって、該方法は、
    ａ）環窒素原子に保護基を夫々有するアミノ受容体及び３−アミノピロリジン（３ＡＰ）又は３−アミノピペリジン（３ＡＰｉ）のラセミ混合物を準備する段階と、
    ｂ）前記アミノ受容体及び前記アミンの前記ラセミ混合物を（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素と反応させる段階と、及び、
    ｃ）光学活性キラルアミン、アミノ生成物及びケトン生成物を得る段階を備えることを特徴とする方法。
  2. 前記保護基はベンジル、三級ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）或いはカルボベンゾキシ（Ｃｂｚ）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 前記アミノ受容体は、フェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、グリオキシル酸、その塩、アセトフェノン、２−ケトグルタル酸、その塩、アセトン、３−オキソ酪酸、その塩、２−ブタノン、３−オキソピロリジン（３−ＯＰ）、（３−ピリジル）メチルケトン（３−ＰＭＫ）、３−オキソ酪酸エチルエステル（３−ＯＢＥＥ）、及び３−オキソペンタン酸メチルエステル（３−ＯＰＭＥ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
  4. 前記得られたアミノ生成物は一級アミン或いはアミノ酸であることを特徴とする請求項１から３いずれか１つに記載の方法。
  5. 前記（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素は、ビブリオフルビアリス、アルカリジェネスデニトリフィカンス、クレブシエラニューモニエ、或いはバチルスチューリンゲンシスから選択される（Ｒ）又は（Ｓ）選択的アミノ基転移酵素であることを特徴とする請求項１から４いずれか１つに記載の方法。
  6. ステップｃ）で得られた前記アミノ生成物及び／又はケトン生成物はさらにステップｄ）において、酵素との反応、自然に起こる脱炭酸、抽出或いは蒸発により反応混合物から除去されることを特徴とする請求項１から５いずれか１つに記載の方法。
  7. ステップｄ）で使用される前記酵素は、デカルボキシラーゼ、シンターゼ或いはデヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項６記載の方法。
  8. 前記酵素はアルコール脱炭酸（ＡＤＨ）であることを特徴とする請求項６又は７記載の方法。
  9. ステップｃ）或いはｄ）で得られた前記光学活性キラルアミンは、ステップｃ）或いはｄ）で得られた前記反応混合物から除去されることを特徴とする請求項１から８いずれか１つに記載の方法。
  10. ステップｃ）或いはｄ）で得られた１−Ｎ−保護３ＡＰ又は１−Ｎ−保護３ＡＰｉの前記保護基は、脱保護法により除去されることを特徴とする請求項１から９いずれか１つに記載の方法。
  11. 生理活性生成物の調製方法であって、前記生理活性生成物は、３−アミノピロリジン誘導体、セファロスポリン、セファロスポリン誘導体、複素環ボロン酸、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−Ｄｏｐａ）、α−メチルドパ、Ｄ−フェニルグリシン、β−ヒドロキシフェニルグリシン、ホスフィノスリシン、ピラミド誘導体、及びピロリドン誘導体の群より選択され、請求項１から１０のいずれか１つの方法が用いられることを特徴とする方法。
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