BRPI0709379A2

BRPI0709379A2 - extratos e métodos que compreendem espécies de cúrcuma

Info

Publication number: BRPI0709379A2
Application number: BRPI0709379-9A
Authority: BR
Inventors: Dan Li; George W Sypert; H Brock Manville; Randall S Alberte; Robert T Gow
Original assignee: Herbalscience Singapore Pte Ltd
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2011-07-12
Also published as: KR20090007564A; AU2007227397A1; US20080193573A1; IL193299A0; WO2007109210A2; EP2010199A2; EP2010199A4; MX2008011754A; JP2009530305A; WO2007109210A3; CA2644093A1

Abstract

<B>EXTRATOS E MéTODOS QUE COMPREENDEM ESPECIES DE CúRCUMA <D>A presente invenção relaciona-se a extratos de material da planta da espécie de cúrcuma que usa métodos de extração de CO~ 2~ supercríticos, métodos de tratamento de um indivíduo que sofre de agregação de placa amilóide ou formação de fibrila associada com doença Alzheimer e métodos de inibição da agregação de placa amilóide ou formação de fibrila em tecidos desse.

Description

EXTRATOS E MÉTODOS QUE COMPREENDEM ESPÉCIES DE CÚRCUMA

Pedido relacionado

Este pedido reivindica o benefício de prioridade para os Pedidos Provisórios de Patente U.S. números de série 60/783.454, depositado em 17 de março de 2006, 60/84.205, depositado em 21 de setembro de 2006, e 60/873.405, depositado em 7 de dezembro de 2006, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Campo da invenção

A invenção relaciona-se a extratos do gênero cúrcuma, particularmente cúrcuma longa (turmérica), e métodos de uso e preparação destes.

Fundamento da invenção

Turmérica é o rizoma moído, seco, da erva cúrcuma longa, uma planta da família do gengibre (Zingiberaceae) do gênero cúrcuma nativa do sul da Ásia. Além de seu habitat nativo, a turmérica é altamente cultivada na China, nas Ilhas do Caribe e países das Américas. Comumente usada como um condimento, a turmérica tem sido intensamente utilizada como um agente colorante e flavorizante em curry e mostarda, e como um ingrediente em cosméticos e medicações tradicionais. O pigmento amarelado fenólico da turmérica compreende curcuminóides, que respondem por 3-5% dos pós de turmérica comercialmente disponíveis e 0,34-0,47% de pós de curry (1). Acredita-se que esses antioxidantes de ocorrência natural sejam responsáveis pelas atividades farmacológicas associadas com turmérica (2). No entanto, foi recentemente mostrado que uma proteína de peptídeo, turmerina, também exibe propriedades antioxidantes e protetoras das células poderosas e trabalha de modosinérgico com as curcuminas na produção dos efeitos clínicos desejados em animais e humanos (3). Além disso, o óleo volátil da turmérica contém as turmeronas e outros constituintes químicos bioativos benéficos (4), e os polissacarídeos da turmérica também se mostraram potentes intensificadores imunes, e mostraram ter atividade antiinflamatória e anticâncer (5,6).

Embora haja várias espécies de cúrcuma no gênero cúrcuma, a espécie cúrcuma longa L. mostrou ter o maior valor terapêutico (7). A fonte para esses agentes químicos terapeuticamente valiosos é o rizoma (raiz) da planta cúrcuma também denominada "turmérica".

As quatro principais frações constituintes químicas que exibem valor terapêutico benéfico são: 1) Fração de óleo essencial (EOF) que contém turmerona, ar-turmerona, alfa-turmerona, beta-turmerona, turmeronol A, turmeronol B, curcumeno, alfa-curcumeno, beta-curcumina, curcumenol, curlona, curdiona, alfa-pineno, beta-pineno, cineol, eugenol, limoneno, linalool, terpineno, terpineol etc.; 2) Fração de Curcuminóide (CF) que contém curcumina,tetrahidrocurcumina, desmetoxicurcumina,bisdesmetoxicurcumina, 3 isômeros geométricos de curcumina, e ciclocurcumina: 3) Fração de Turmerina (TF) que contém uma proteína de polipeptídeo denominada turmerina; e 4) Fração de polissacarídeo (PF) que compreende numerosas moléculas de polissacarídeo com apenas algumas moléculas que foram purificadas e caracterizadas como Ukonan A, Ukonan B, Ukonan C e Ukonan D (5, 8).

Há quatro curcuminóides principais encontrados naespécie de cúrcuma: 1) curcumina; 2) tetrahidrocurcumina;3) desmetoxicurcumina; e 4) bisdesmetoxicurcumina (9). Quatro constituintes de curcuminóide menores também foram isolados (10, 11) . A curcumina, o principal curcuminóide, e tetrahidrocurcumina, em algumas aplicações, parecem ser os ingredientes ativos importantes responsáveis pela atividade biológica. Entre as espécies de turmérica, as concentrações dos principais curcuminóides variam substancialmente: 1) curcumina 40-70%; 2) desmetoxicurcumina 16-4 0%: e 3) bisdesmetoxicurcumina 0-30%. Embora a principal atividade de turmérica seja antiinflamatória, também foi relatado que ela possui poderosa atividade antioxidante, antialérgica, protetora celular, de melhor cicatrização de ferimentos, anti-doença de Alzheimerf anticolesterol (LDL), de hepatoproteção, melhor fluxo de ácido biliar, antiespasmódica, antibacteriana, antifúngica e antineoplásica (câncer), bem como melhor vitalidade. Um estudo de pesquisa recente conduzido na "Harvard Medicai School" indicou que a curcumina provavelmente também possui atividade anti-HIV.

Além disso, pesquisadores da Universidade de Yale publicaram recentemente na revistacientífica Science que a curcumina reduz as mortes significativamente entre camundongos com a doença genética, fibrose cística.

Além dos curcuminóides bioativos, as turméricas também contêm um polissacarideo de peptídeos de 5 kD hidrossolúvel, turmerina, que mostrou ser um poderoso antioxidante, protetor celular e antineoplásico, que mostrou ter forte atividade de intensificação imune, antiinflamatória e antineoplásica, e óleos essenciais que mostraram ter atividade antioxidante, antiinflamatória,antiartrítica, antiespasmódica, analgésica, antialérgica, de citoproteção, gastroproteção, hepatoproteção, de proteção pulmonar, antiasmática, de proteção do sistema nervoso, anti-doença de Alzheimer, anti-doença de Parkinson, anticâncer e atividade antimutagênica.

A Tabela 1 lista as principais frações constituintes químicas biologicamente ativas benéficas conhecidas encontradas em C. longa L.

Tabela 1. Constituintes químicos biologicamente ativos de Cúrcuma longa L. (% massa de peso)*

<table>table see original document page 5</column></row><table>Ukonan B 0,0005

Ukonan C 0,0006

*Baseado na literatura científica e análise "Herbal Science GC-MS" (Cromatografia a gás-Espectrometria de massa) e HPLC (cromatografia líquida de alto rendimento) de matéria-prima natural de cúrcuma.

Estudos toxicológicos pré-clínicos e clínicosdemonstraram que o óleo essencial de turmérica, os curcuminóides de turmérica, turmerina, e polissacarídeos de turmérica são seguros em doses muito grandes por períodos de tempo prolongados (2,12-16).

Para resumir brevemente o valor terapêutico dosconstituintes químicos da turmérica, pesquisa recente e estudos clínicos demonstraram os seguintes efeitos terapêuticos dos vários compostos químicos, frações químicas e produtos de extração grosseiros de espécies de cúrcuma: atividade antioxidante (EOF, CF, TF, Extrato) (4,17,18); atividade antiinflamatória (EOF, CF, TF, PF, Extrato) (4,19,20); anti-artrite/anti-reumática (EOF, CF, TF, PF, Extrato) (19-21); anti-agregaçãoplaquetária/antitrombótica (EOF, CF, Extrato) (23); anti-hipercolesterolemia (EOF, CF, Extrato) (1,24); anti-doença cardiovascular (EOF, CF, TF, Extrato) (1, 4, 17, 18, 22, 23-25); antialérgica (EOF, CF, Extrato) (4, 19, 20, 21); anti-doença pulmonar crônica/anti-asma (EOF, CF, TF, PF, Extrato) (4, 19, 20, 22, 26); anti-fibrose cística (EOF, CF, TF, PF, Extrato) (4, 19, 20, 22, 26, 27); proteção celular (EOF, CF, TF, Extrato) (4, 17, 18, 28); gastroproteção, hepatoproteção, proteção biliar (EOF, CF, Extrato (29) ; proteção do sistema nervoso (EOF, CF, TF,Extrato) (4, 17, 18, 22, 23-25); anti-doença de Alzheimer e Parkinson (EOF, CF, Extrato) (30) ; anti-esclerose múltipla (CF, Extrato) (31) ; anticâncer e antimutagenicidade (EOF, CF, TF, PF, Extrato) (4, 6, 13-18, 32, 38); intensificação imunológica (EOF, PF, Extrato) (5, 6, 33); antiviral, anti-HIV, antibacteriana e antifúngica (EOF, CF, PF, Extrato (5,6,33,34); e melhor cicatrização de ferimentos (EOF, CF, Extrato) (35). Outros estudos demonstraram a importância vital de interações sinérgicas dos constituintes químicos bioativos de espécies de cúrcuma (36,37). Sumário da invenção

Em um aspecto, a presente invenção relaciona-se a um extrato de espécies de cúrcuma que compreende uma fração que tem um cromatograma de espectrometria de massa de "Análise Direta em Tempo Real" (DART) de qualquer uma das Figuras 9, 10 ou 14-78. Em uma modalidade adicional, a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa de DART de qualquer uma das Figuras 14-31, 36, 37, 41, 51, 52 ou 56. Em uma modalidade adicional, a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa de DART de qualquer uma das Figuras 35, 38-40, 50 ou 53-55. Em uma modalidade adicional, a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa de DART de qualquer uma das Figuras 9, 10, 42-46 ou 57-61. Em uma modalidade adicional, a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa de DART de qualquer uma das Figuras 32-34 ou 47-49. Em uma modalidade adicional, a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa de DART de qualquer uma das Figuras 63-78. Em uma modalidade adicional, a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa de DART da Figura 47 ou 62. Em umamodalidade adicional, o extrato compreende uma fração de óleo essencial que tem um cromatograma de espectrometria de massa de DART de qualquer uma das Figuras 63-78 e uma fração de polissacarídeo que tem um cromatograma de espectrometria de massa de DART de qualquer uma das Figuras 9, 10, 42-4 6 ou 57-61. Em uma modalidade adicional, o extrato compreende uma fração de óleo essencial que tem um cromatograma de espectrometria de massa de DART de qualquer uma das Figuras 63-78, uma fração de polissacarídeo que tem um cromatograma de espectrometria de massa de DART de qualquer uma das Figuras 9, 10, 42-46 ou 57-61, e uma fração de turmerina que tem um cromatograma de espectrometria de massa de DART da Figura 47 ou 62.

Em uma modalidade adicional, o extrato de espécies de cúrcuma da presente invenção também compreende um curcuminóide, uma turmerona, um polissacarídeo e/ou turmerina. Em uma modalidade adicional, o curcuminóide é selecionado do grupo que consiste em curcumina, tetrahidrocurcumina, desmetoxicurcumina, bisdesmetoxicurcumina, e combinações destas. Em uma modalidade adicional, a quantidade de curcuminóide é pelo menos cerca de 75, 80, 85, 90 ou 95% em peso. Em uma modalidade adicional, a turmerona é selecionada do grupo que consiste em alfa-turmerona, ar-turmerona, beta-turmerona, e combinações destas. Em uma modalidade adicional, a quantidade de turmerona é pelo menos 5, 10, 15, 20 ou 25% em peso. Em uma modalidade adicional, a quantidade de turmerina é pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25% em peso. Em uma modalidade adicional, o polissacarídeo é selecionado do grupo que consiste emUkonan Α, Ukonan Β, Ukonan C, e uma combinação destes. Em uma modalidade adicional, a quantidade de polissacarídeo é pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25% em peso.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um alimento ou medicamento que compreende o extrato de espécies de cúrcuma da presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um método para o tratamento de um indivíduo com artrite que compreende a administração ao indivíduo em necessidade deste de uma quantidade eficaz do extrato de espécies de cúrcuma da presente invenção. Em uma modalidade adicional, o extrato de espécies de cúrcuma também compreende uma quantidade sinérgica de ácido a- e/ou β-boswélico e/ou seus C-acetatos. Em uma modalidade adicional, o indivíduo é um primata, bovino, ovino, eqüino, suíno, roedor, felino ou canino. Em uma modalidade adicional, o indivíduo é um humano.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um método de tratamento de um indivíduo que sofre de agregação de placa amilóide ou formação de fibrila que compreende a administração ao indivíduo em necessidade deste de uma quantidade eficaz do extrato de espécies de cúrcuma da presente invenção. Em uma modalidade adicional, o indivíduo sofre de doença de Alzheimer. Em uma modalidade adicional, o indivíduo é um primata, bovino, ovino, eqüino, suíno, roedor, felino ou canino. Em uma modalidade adicional, o indivíduo é um humano.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um método de prevenção de agregação e placa amilóide ou formação de fibrila em tecido que compreende o contato dotecido com uma quantidade eficaz do extrato de espécies de cúrcuma da presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um método de preparação de um extrato de espécies de cúrcuma que tem pelo menos uma característica predeterminada que compreende: a extração seqüencial de um material de planta de espécies de cúrcuma para gerar uma fração de óleo essencial, fração de curcuminóide, fração de polissacarídeo e fração de turmerina por: (a) extração de um material de planta de espécies de cúrcuma por extração de dióxido de carbono supercrítico para gerar a fração de óleo essencial e um primeiro resíduo; (b) extração de um material de planta de espécies de cúrcuma ou o primeiro resíduo da etapa (a) por extração de dióxido de carbono supercrítico para gerar a fração de curcuminóide e um segundo resíduo; (c) extração do segundo resíduo da etapa (b) por extração de água quente para gerar uma solução de polissacarídeo e então precipitação do polissacarídeo com etanol para gerar a fração de polissacarídeo e um terceiro resíduo; e (d) separação do terceiro resíduo da etapa (c) por cromatografia em coluna da fração de turmerina.

Em uma modalidade adicional, a etapa (a) compreende: 1) carga em um vaso de extração, moagem do material de planta de espécies de cúrcuma; 2) adição de dióxido de carbono sob condições supercríticas; 3) contato do material de planta de espécies de cúrcuma moído e do dióxido de carbono por um tempo; e 4) coleta da fração de óleo essencial em um frasco de coleta. Em uma modalidade adicional, as condições supercríticas compreendem uma pressão de cerca de 25MPa a cerca de 50MPa e umatemperatura de cerca de 30 0C a cerca de 80°C. Em uma modalidade adicional, as condições de extração para a etapa (a) compreendem uma pressão do vaso de extração de cerca de 25MPa a 5OMPa e uma temperatura de cerca de 350C a cerca de 900C e uma pressão do vaso separador de coleta de cerca de 4MPa a cerca de 15MPa e uma temperatura de cerca de 200C a cerca de 50°C.

Em uma modalidade adicional, a etapa (b) compreende: 1) carga em um vaso de extração, de material moído de planta de espécies de cúrcuma ou do primeiro resíduo da etapa (a); 2) adição de dióxido de carbono sob condições supercríticas; 3) o contato do material moldo de planta de espécies de cúrcuma ou do primeiro resíduo da etapa (a) e do dióxido de carbono por um período; e 4) coleta da fração de curcuminóide em um vaso separador de coleta de fracionamento. Em uma modalidade adicional, as condições de extração para a etapa (b) compreendem uma pressão do vaso de extração de cerca de 35MPa a cerca de 7 OMPa, e uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 95°C, e uma pressãodo vaso separador de coleta de cerca de 12MPa a cerca de22MPa, e uma temperatura de cerca de 55°C a cerca de 75°C.

Em uma modalidade adicional, a etapa (c) compreende: 1) o contato do segundo resíduo da etapa (b) com uma solução de água a cerca de 85°C a cerca de 100°C, por um período suficiente para extrair os polissacarídeos; 2) separação dos polissacarídeos sólidos da solução por precipitação de etanol; e 3) purificação da fração de polissacarídeo com o uso de cromatografia em coluna.

Em uma modalidade adicional, a etapa (d) compreende:

1) a passagem do terceiro resíduo da etapa (c) através deuma coluna de resina para a separação de moléculas de peso molecular alto e baixo; e 2) purificação da solução de efluente de peso molecular maior com o uso de uma coluna de resina de troca catiônica para coletar a fração de turmerina da solução de efluente.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um extrato de espécies de cúrcuma preparado pelos métodos da presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um extrato de espécies de cúrcuma que compreende curcumina, tetrahidrocurcumina a 0,1 a 5% em peso da curcumina, desmetoxicurcumina a 10 a 20% em peso da curcumina, e bisdesmetoxicurcumina a 1 a 5% em peso da curcumina.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um extrato de espécies de cúrcuma que compreende curcumina, tetrahidrocurcumina a 0,1 a 5% em peso da curcumina, desmetoxicurcumina a 15 a 25% em peso da curcumina, e bisdesmetoxicurcumina ala 10% em peso da curcumina.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um extrato de espécies de cúrcuma que compreende curcumina, tetrahidrocurcumina a 0,1 a 5% em peso da curcumina, desmetoxicurcumina a 20 a 30% em peso da curcumina, e bisdesmetoxicurcumina ala 10% em peso da curcumina.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um extrato de espécies de cúrcuma que compreende curcumina, desmetoxicurcumina a 30 a 40% em peso da curcumina, e bisdesmetoxicurcumina a 5 a 15% em peso da curcumina.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um extrato de espécies de cúrcuma que compreende curcumina, desmetoxicurcumina a 45 a 55% em peso da curcumina, ebisdesmetoxicurcumina a 40 a 50% em peso da curcumina.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um extrato de espécies de cúrcuma que compreende curcumina, desmetoxicurcumina a 15 a 25% em peso da curcumina, e bisdesmetoxicurcumina ala 10% em peso da curcumina.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um extrato de espécies de cúrcuma que compreende curcumina, tetrahidrocurcumina a 0,1 a 5% em peso da curcumina, desmetoxicurcumina a 20 a 30% em peso da curcumina, e bisdesmetoxicurcumina a 5 a 15% em peso da curcumina.

Uma modalidade adicional consiste em perfis alterados (proporções) por percentual de peso de massa dos constituintes químicos das espécies de cúrcuma em relação àqueles encontrados no material de planta nativo ou produtos de extrato de espécies de cúrcuma disponíveis atualmente. Por exemplo, a fração de óleo essencial pode ser aumentada ou diminuída em relação às concentrações de curcuminóide e/ou turmerina e/ou polissacarídeo. Similarmente, o curcuminóide e/ou a turmerina e/ou ospolissacarídeos podem ser aumentados ou diminuídos emrelação às outras frações constituintes do extrato para permitir composições com novo perfil químico de constituintes para efeitos biológicos específicos.

Essas modalidades da presente invenção, outras modalidades, e seus recursos e características, ficarão evidentes a partir da descrição, desenhos e reivindicações que serão apresentados a seguir.

Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 descreve um método exemplar para apreparação da fração de óleo essencial.A Figura 2 descreve um método exemplar para realizar a extração por lixiviação de etanol.

A Figura 3 descreve um método exemplar para purificação por SCCO2 da fração de curcuminóide extraída com etanol.

A Figura 4 descreve um método exemplar para purificação e definição do perfil dos curcuminóides.

A Figura 5 descreve um método exemplar para realizar a lixiviação de água do resíduo da extração por lixiviação deetanol.

A Figura 6 descreve um método exemplar para a preparação da fração de polissacarídeo.

A Figura 7 descreve um método exemplar para a preparação da fração de turmerina.

A Figura 8 descreve varredura dos espectros UV entre200-300 nm para processo de extração de turmerina.

A Figura 9 descreve uma impressão digital representativa do espectro de massa DART modo íon positivo para fração purificada de polissacarídeo turmérico deacordo com uma modalidade da presente invenção.

A Figura 10 descreve uma impressão digital representativa do espectro de massa DART modo íon negativo para a fração purificada de polissacarídeo turmérico de acordo com uma modalidade da presente invenção.

A Figura 11 descreve os efeitos de um extrato decúrcuma sobre a agregação de Αβι-42, como determinado com o ensaio de tioflavina Τ. 0 peptídeo Ap1^2 (a 50 μΜ) foi incubado a 37 0C isoladamente, e também na presença do extrato de cúrcuma ou do composto de controle em diferentesdoses, como indicado por 72 horas. Todos os experimentosforam realizados em tampão de Tris-HCl (pH 7,4). Os dados são representados como unidades de fluorescência relativa (n = 3). ANOVA de uma via, seguido por comparação post-hoc, revelou diferenças significativas entre o extrato de turmérica e os compostos de controle em concentrações de tratamento de 10 e 20 μΜ (Ρ < 0,001, ANOVA).

A Figura 12 descreve os efeitos de um extrato de cúrcuma sobre a agregação de Αβι-42, como determinado com o ensaio de tioflavina Τ. 0 peptídeo Αβι-42 (a 50 μΜ) foi incubado a 37 °C isoladamente, e também na presença ou ausência do extrato de turmérica ou do composto de controle (a 10 μΜ) por pontos do tempo diferentes, como indicado. Os dados são representados como unidades de fluorescência relativa (n = 3) . ANOVA de uma via, seguido por comparação post-hoc, revelou diferenças significativas entre o extrato de turmérica e os compostos de controle em incubação de 48 e 72 horas (P < 0,001).

A Figura 13 descreve como o tratamento com um extrato de turmérica inibe, geração de AP em células neuronais cultivadas. Peptideos Αβχ-^, 42 foram analisados em meios condicionados de células SweAPP N2a por ELISA (n = 3 para cada condição). Os dados são representados como percentagem de peptídeos Αβι-40, 42 secretados 12 horas após o tratamento com extrato de turmérica em relação ao controle (não tratado) . ANOVA de uma via, seguido por comparação post-hoc, revelou diferenças significativas entre o extrato de turmérica e os compostos de controle em concentrações de tratamento de 5, 10, 20, 40 e 80 μΜ (Ρ < 0,005).

A Figura 14 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de turmérica # 13 9 (modo íon positivo) .Tetrahidrocurcumina (373,1642) (abund. = 0,16), curcumina (369,1332) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (339,1228) (abund. = 17,27) e bisdesmetoxicurcumina (309,1132) (abund. = 2.93) foram detectadas.

A Figura 15 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o extrato de raiz de turmérica # 310 (modo íon positivo). Curcumina (369,1349) (abund. = 34,54), desmetoxicurcumina (339,1251) (abund. = 9,51) e bisdesmetoxicurcumina (309,1144) (abund. = 5,82) foram 10 detectadas.

A Figura 16 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de raiz de turmérica # 311 (modo íon positivo).

A Figura 17 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de raiz de turmérica # 312 (modo íon positivo).

A Figura 18 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de raiz de turmérica # 313 (modo íon positivo).

A Figura 19 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o extrato de raiz de turmérica # 314 (modo íon positivo). Tetrahidrocurcumina (373,1667) (abund. = 0,55), curcumina (369,1345) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (339,123 9) (abund. = 20,41) e bisdesmetoxicurcumina 25 (309,1138) (abund. = 5,18) foram detectadas.

A Figura 20 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de raiz de turmérica # 315 (modo íon positivo). Tetrahidrocurcumina (373,1674) (abund. = 0,37), curcumina (369,1358) (abund. = 100), desmetoxicurcumina 30 (339,1236) (abund. = 16,58) e bisdesmetoxicurcumina(309,1135) (abund. = 3,50) foram detectadas.

A Figura 21 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de turmérica # 316 (modo íon positivo), Tetrahidrocurcumina (373,1631) (abund. = 0,36), curcumina (369,136) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (339,1228) (abund. = 22,84) e bisdesmetoxicurcumina (309,1122) (abund. = 7,59) foram detectadas.

A Figura 22 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de turmérica # 317 (modo íon positivo).

Tetrahidrocurcumina (373,1642) (abund. = 0,26), curcumina (369,1343) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (339,1238) (abund. = 25,31) e bisdesmetoxicurcumina (309,114) (abund. = 5,75) foram detectadas.

A Figura 23 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o extrato de turmérica # 139 (modo íon negativo). Curcumina (367,116) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (337,106) (abund. = 35,48) e bisdesmetoxicurcumina (3 07,0965) (abund. = 9,02) foram detectadas.

A Figura 24 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o extrato de raiz de turmérica # 310 (modo íonnegativo). Curcumina (367,1127) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (33 7,1033) (abund. = 50,06) e bisdesmetoxicurcumina (307,0942) (abund. = 44,26) foram detectadas.

A Figura 25 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o extrato de raiz de turmérica # 311 (modo íon negativo). Curcumina (367,1127) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (337,1033) (abund. = 49,82) e bisdesmetoxicurcumina (307,0941) (abund. = 44,04) foramdetectadas.A Figura 2 6 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de raiz de turmérica # 312 (modo íon negativo). Curcumina (367,113) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (337,104) (abund. = 18,62) e bisdesmetoxicurcumina (3 07,099) (abund. = 3,08) foram detectadas.

A Figura 27 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de raiz de turmérica # 313 (modo íon negativo). Curcumina (367,1133) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (337,1041) (abund. = 19,56) e bisdesmetoxicurcumina (307,0976) (abund. = 3,75) foram detectadas.

A Figura 2 8 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de raiz de turmérica # 314 (modo íon negativo). Curcumina (367,1133) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (337,1042) (abund. = 19,71) e bisdesmetoxicurcumina (307,0982) (abund. = 3,98) foram detectadas.

A Figura 29 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de raiz de turmérica # 315 (modo íon negativo). Curcumina (367,1128) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (337,1036) (abund. = 26,32) e bisdesmetoxicurcumina (307,0953) (abund. = 8,38) foram detectadas.

A Figura 30 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o extrato de turmérica # 316 (modo íon negativo). Tetrahidrocurcumina (371,1306) (abund. = 0,99), curcumina (367,1131) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (337,1043) (abund. =26,54) e bisdesmetoxicurcumina (307,0958) (abund. = 9,48) foram detectadas.A Figura 31 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de turmérica # 317 (modo íon negativo). Curcumina (367,1128) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (337,1035) (abund. = 35,48) e bisdesmetoxicurcumina (307,0948) (abund. = 8,43) foram detectadas.

A Figura 32 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de turmérica com uma solução de EtOH 75% (HS# 136) (modo íon positivo). Tetrahidrocurcumina (373,1678) (abund. = 0,41), curcumina (369,1418) (abund. = 100),desmetoxicurcumina (339,1304) (abund. = 22,00) e bisdesmetoxicurcumina (309,1201) (abund. = 5,36) foram detectadas.

A Figura 33 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para o extrato de turmérica com uma solução de EtOH 80% (HS# 137) (modo íon positivo). Tetrahidrocurcumina (373,1655) (abund. = 1,09), curcumina (369,1330) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (339,124) (abund. = 18,04) e bisdesmetoxicurcumina (309,1131) (abund. = 5,10) foram detectadas.

A Figura 34 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o extrato de turmérica com uma solução de EtOH 85% (HS# 138) (modo íon positivo). Tetrahidrocurcumina (373,1722) (abund. = 0,31), curcumina (369,1365) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (33 9,1254) (abund. = 13,14) ebisdesmetoxicurcumina (309,1156) (abund. = 2,48) foram detectadas.

A Figura 35 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para raiz de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spices") (HS # 160) (modo íon . positivo). Curcumina369,132) (abund. = 0,31) foi detectada.A Figura 3 6 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para raiz de turmérica da China (HS # 161) (modo ion positivo). Curcumina (369,1273) (abund. = 1,20) foi detectada.

A Figura 37 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara raiz de turmérica da índia (HS # 162) (modo íon positivo). Curcumina (369,1335) (abund. = 0,54) foi detectada.

A Figura 3 8 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para raiz de turmérica disponível comercialmente ("Singapore Tai1 Eng") (HS # 163) (modo íon positivo). Curcumina (369,132) (abund. = 20,80), desmetoxicurcumina (33 9,12) (abund. = 4,83) e bisdesmetoxicurcumina (3 09,111) (abund. = 2,05) foram detectadas.

A Figura 3 9 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara raiz de turmérica disponível comercialmente ("Singapore Tai' Eng") (HS # 164) (modo íon positivo). Curcumina (369,134) (abund. = 11,02), desmetoxicurcumina (339,1205) (abund. = 2,18) e bisdesmetoxicurcumina (309,1122) (abund. = 1,46) foram detectadas.

A Figura 4 0 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para turmérica disponível comercialmente ("Suan Farms") (HS # 165) (modo íon positivo). Tetrahidrocurcumina (373,1658) (abund. = 0,28), curcumina (369,1331) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (339,1221) (abund. = 16,26) e bisdesmetoxicurcumina (309,116) (abund. = 2,65) foram detectadas.

A Figura 41 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para raiz de turmérica de Nápoles (HS # 166) (modo íon positivo). Curcumina (369,1345) (abund. = 3,94),desmetoxicurcumina (339,1198) (abund. = 0,35) e bisdesmetoxicurcumina (309,1106) (abund. = 0,14) foram detectadas.

A Figura 42 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para polissacarídeos precipitados por uma solução de EtOH 20% de uma extração de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spice") (HS # 302) (modo íon positivo).

A Figura 43 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para polissacarídeos precipitados por uma solução de EtOH 40% de uma extração de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spice") (HS # 303) (modo íon positivo).

A Figura 44 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para polissacarídeos precipitados por uma solução de EtOH 20% de uma extração de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spice") (HS # 304) (modo íon positivo).

A Figura 45 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para polissacarídeos precipitados por uma solução de EtOH 80% de uma extração de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spice") (HS # 305) (modo íon positivo).

A Figura 46 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara polissacarídeos precipitados por uma solução de EtOH 95% de uma extração de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spice") (HS # 306) (modo íon positivo). Curcumina (369,1431) (abund. = 3,66), desmetoxicurcumina (339,1436) (abund. 0,73) e bisdesmetoxicurcumina (309,1187) (abund. = 0,97) foram detectadas.

A Figura 47 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para polipeptídeo turmerina processado de sobrenadante 60% de uma extração de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spice") (HS # 307) (modo íon positivo).A Figura 48 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para uma extração de EtOH 75% de turmérica (HS. # 136) (modo Ion negativo). Curcumina (367,1123) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (337,1028) (abund. = 42,60) e bisdesmetoxicurcumina (307,0941) (abund. = 14,09) foram detectadas.

A Figura 49 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para a EtOH 85% extração de turmérica (HS # 138) (modo íon negativo). Curcumina (367,1117) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (337,103) (abund. 23,61) ebisdesmetoxicurcumina (307,0953) (abund. = 5,46) foram detectadas.

A Figura 50 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para raiz de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spices") (HS # 160) (modo íon negativo). Curcumina (367,1125) (abund. 100), desmetoxicurcumina (337,1033) (abund. = 33,89) e bisdesmetoxicurcumina (307,0940) (abund. = 19,46) foram detectadas.

A Figura 51 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para raiz de turmérica da China (HS # 161) (modo íonnegativo). Tetrahidrocurcumina (371,1335) (abund. = 4,34), curcumina (367,1126) (abund. = 100), desmetoxicurcumina (337,1035) (abund. = 90,31) e bisdesmetoxicurcumina (307.0943) (abund. = 39,58) foram detectadas.

A Figura 52 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara raiz de turmérica da índia (HS # 162) (modo íon negativo). Curcumina (367,1129) (abund. = 0,16), desmetoxicurcumina (337,1041) e bisdesmetoxicurcumina (307.0944) foram detectadas.

A Figura 53 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara raiz de turmérica disponível comercialmente ("Singapore Tai' Eng") (HS # 163) (modo íon negativo). Curcumina (367,1142), desmetoxicurcumina (337,1052) e bisdesmetoxicurcumina (307,0963) foram detectadas.

A Figura 54 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara raiz de turmérica disponível comercialmente ("Singapore Tai' Eng") (HS # 164) (modo íon negativo). Curcumina (367,1147), desmetoxicurcumina (337,1059) e bisdesmetoxicurcumina (3 07,095) foram detectadas.

A Figura 55 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara turmérica disponível comercialmente ("Suan Farms") (HS # 165) (modo íon negativo). Tetrahidrocurcumina (371,1282), curcumina (367,1151), desmetoxicurcumina (337,1061) e bisdesmetoxicurcumina (307,0981) foram detectadas.

A Figura 56 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara raiz de turmérica de Nápoles (HS # 166) (modo íon negativo). Curcumina (367,1152), desmetoxicurcumina (337,1064) e bisdesmetoxicurcumina (307,0966) foram detectadas.

A Figura 57 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara polissacarídeos precipitados por uma solução de EtOH 20% de uma extração de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spice") (HS # 302) (modo íon negativo).

A Figura 58 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara polissacarídeos precipitados por uma solução de EtOH 40% de uma extração de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spice") (HS # 303) (modo íon negativo).

A Figura 59 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para polissacarídeos precipitados por uma solução de EtOH60% de uma extração de turmérica disponível comercialmente("Hara Spice") (HS # 304) (modo íon negativo).

A Figura 60 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para polissacarídeos precipitados por uma solução de EtOH 8 0% de uma extração de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spice") (HS # 305) (modo íon negativo). Curcumina (367,1107) e desmetoxicurcumina (337,1114) foram detectadas.

A Figura 61 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para polissacarídeos precipitados por uma solução de EtOH 95% de uma extração de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spice") (HS # 306) (modo íon negativo). Curcumina (367,1141) foi detectada.

A Figura 62 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para polipeptídeo turmerina processado de sobrenadante 60% de uma extração de turmérica disponível comercialmente ("Hara Spice") (HS # 307) (modo íon negativo). Curcumina (367,1163) foi detectada.

A Figura 63 descreve o Espectro de Massa Ac cuTOF-DART para a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 40°C e 8MPa (HS # 160) (modo íon positivo).

A Figura 64 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 40°C e 30MPa (HS # 160) (modo íon positivo).

A Figura 65 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 40°C e 50MPa (HS # 160) (modo íon positivo).

A Figura 66 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 60°C e IOMPa (HS # 160) (modo íon positivo).

A Figura 67 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 60°C e 30MPa (HS # 160) (modo íon positivo).

A Figura 68 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 80°C e IOMPa (HS # 160) (modo íon positivo).

A Figura 69 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 80°C e 30MPa (HS # 160) (modo íon 15 positivo).

A Figura 7 0 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 4 O0C e 50MPa (HS # 164) (modo íon positivo).

A Figura 71 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 40°C e 8MPa (HS # 160) (modo íon negativo).

A Figura 72 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART 25 para a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 40 0C e 3 OMPa (HS # 160) (modo íon negativo).

A Figura 73 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para a fração de óleo essencial da extração supercrítica deCO2 de turmérica a 4 O0C e 50MPa (HS # 160) (modo íonnegativo).

A Figura 74 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 60 °C e IOMPa (HS # 160) (modo ion negativo).

A Figura 7 5 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 60°C e 30MPa (HS # 160) (modo ion negativo).

A Figura 7 6 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 80°C e IOMPa (HS # 160) (modo ion negativo).

A Figura 77 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração de óleo essencial da extração supercrítica de CO2 de turmérica a 80°C e 30MPa (HS # 160) (modo ion negativo).

A Figura 7 8 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART para a fração de óleo essencial da extração supercrítica deCO2 de turmérica a 40°C e 5 OMPa (HS # 164) (modo ionnegativo).

A Figura 7 9 descreve as estruturas químicas de curcumina, tetrahidrocurcumina, desmetoxicurcumina e bisdesmetoxicurcumina, que, em conjunto, formam um grupo decompostos aqui denominados "curcuminóides".

A Figura 80 descreve as estruturas químicas de alguns dos compostos encontrados na fração de óleo essencial das extrações de cúrcuma.

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção apresenta extratos de espécies decúrcuma e espécies relacionadas como, por exemplo, sem limitação, cúrcuma longa L. Como aqui usado, cúrcuma refere-se à planta ou material de planta derivado da família de planta Zingiberaceae; aqui o gênero inclui, sem limitação, C. longa L, C. aromatica Salisb., C. amada Roxb., C. zeodaria Rose. e C. xanthorrhizia Roxb. 0 termo inclui todos os clones, cultivares, variantes e tipos de cúrcuma e espécies relacionadas. Definições

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados para sereferir a um ou a mais de um (ou seja, a pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. Como exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento.

Como conhecido na técnica, o termo "composto" não significa uma molécula, mas várias ou moles de moléculas em um ou mais compostos. Além disso, como conhecido na técnica, o termo "composto" significa um constituinte químico que possui propriedades químicas e físicas distintas, enquanto "compostos" referem-se a mais de um composto de constituinte químico.

Os termos "compreende" e "que compreende" são usados no sentido aberto, inclusivo, significando que elementos adicionais podem ser incluídos.

0 termo "que consiste" é usado para limitar os elementos àqueles especificados, exceto para impurezas normalmente a eles associadas.

0 termo "que consiste essencialmente em" é usado para limitar os elementos àqueles especificados e àqueles que não afetam materialmente as características básicas e inéditas do material ou de etapas.O termo "cúrcuma" é também usado de forma intercambiável com "turmérica" e inclui plantas, clones, variantes e tipos da família de planta Zingiberaceae.

Como aqui usado, o termo "constituintes de cúrcuma" ou "constituintes de turmérica" significa compostos químicos encontrados nas espécies de cúrcuma, e inclui todos os compostos químicos identificados acima, além de outros compostos químicos encontrados em espécies de cúrcuma, incluindo, sem limitação, turmeronas, curcuminóides, turmerina e polissacarídeos.

Como aqui usado, o termo "curcumina" refere-se a um componente dos curcuminóides. Sua estrutura é apresentada na Figura 79.

Como aqui usado, o termo "fração de curcuminóide" compreende os compostos hidrossolúveis, solúveis em etanol, obtidos ou derivados de cúrcuma e de espécies relacionadas, incluindo os compostos químicos classificados como curcuminóides. Os componentes dos curcuminóides incluem curcumina, tetrahidrocurcumina, desmetoxicurcumina e bisdesmetoxicurcumina, e são apresentados na Figura 79.

O termo "quantidade eficaz", como aqui usado, refere-se a uma quantidade necessária para despertar a resposta biológica desejada. Como será observado por aqueles habilitados nesta técnica, a quantidade eficaz de um composto ou agente bioativo pode variar, dependendo de fatores tais como o resultado biológico final desejado, o agente bioativo a ser liberado, a composição da matriz de encapsulação, o tecido-alvo etc.

Como aqui usado, o termo "fração de óleo essencial" compreende compostos Iipo- e hidrossolúveis obtidos ouderivados de cúrcuma e de espécies relacionadas, incluindo os compostos químicos classificados como turmeronas.

Como aqui usado, o termo "matéria-prima" geralmente refere-se ao material de planta bruto, que compreende folhas, ramos, rizomas, raízes, incluindo, sem limitação, raízes principais, raízes acessórias e raízes de fibras, caules, folhas, sementes e flores, em que a planta ou partes constituintes podem compreender material que é bruto, seco, fervido, aquecido ou de algum outro modoprocessado para alterar o tamanho e a integridade do material de planta. Ocasionalmente, o termo "matéria-prima" pode ser usado para caracterizar um produto de extração que deve ser usado como uma fonte de alimentação para processos adicionais de extração.

Como aqui usado, o termo "fração" significa acomposição de extração que compreende um grupo de compostos químicos específicos caracterizados por certas propriedades físicas, químicas ou propriedades físicas ou químicas. Por exemplo, a fração de óleo essencial (EOF) contém asturmeronas bem como outros constituintes químicos, a fraçãode curcuminóide contém os curcuminóides bem como outros constituintes químicos solúveis em etanol, a fração de turmerina contém turmerina bem como outros constituintes químicos de proteína pequena hidrossolúvel, e a fração depolissacarídeo contém ukonan A, B, C, e D bem como outros polissacarídeos de vários pesos moleculares. Outros constituintes químicos de cúrcuma e espécies relacionadas também podem estar presentes nessas frações de extração.

Como aqui usado, o termo "um ou mais compostos"significa que pelo menos um composto, como turmerona (umconstituinte químico de turmérica de óleo essencial) , curcumina (um constituinte químico de turmérica de diferuloilmetano insolúvel em água, insolúvel em etanol) , turmerina (uma proteína de peptídeo hidrossolúvel) e ukonan A (um constituinte químico de polissacarídeo, hidrossolúvel, insolúvel em etanol), ou que mais de um composto, por exemplo, curcumina e turmerina, são incluídos.

Como aqui usado, o termo "fração de polissacarídeo" compreende os compostos hidrossolúveis, insolúveis em etanol obtidos a partir de cúrcuma e espécies relacionadas, incluindo os compostos químicos classificados como ukonans.

Como aqui usado, o termo "perfil" refere-se às proporções por percentual de peso de massa dos compostos químicos em uma fração de extração ou às proporções de peso de massa percentual de cada um dos quatro constituintes químicos da fração de cúrcuma em uma extração de cúrcuma final.

Como aqui usado, o termo frações ou extrações "purificadas" significa uma fração ou composição que compreende um grupo de constituintes químicos específicos caracterizados por certas propriedades físicas ou químicas que são concentradas a mais de 70% dos constituintes químicos da fração ou extração por % de peso de massa seca. Em outras palavras, uma fração ou extração purificada compreende menos que 3 0% de peso de massa seca de constituintes químicos que não são caracterizados por certas propriedades físicas, químicas desejadas ou propriedades físicas ou químicas que definem a fração ou extração.Como aqui usado, o termo "rizoma" refere-se à parte constituinte da cúrcuma e espécies relacionadas que compreendem caules de raiz horizontal ou vertical ou caules modificados (por exemplo, tubérculos), que podem estar em parte ou no todo, sob o solo, que também compreende ramos acima ou raízes abaixo, incluindo, sem limitação, raízes primárias, raízes secundárias, e raízes terciárias.

O termo "sinérgico" é reconhecido na técnica e refere-se a dois ou mais componentes trabalhando juntos de modo que o efeito total seja maior que a soma dos componentes.

0 termo "tratamento" é reconhecido na técnica e refere-se à cura bem como melhoria de pelo menos um sintoma de qualquer condição ou distúrbio.

Como aqui usado, o termo "fração de tumerina" compreende os compostos solúveis em água e etanol obtidos ou derivados de cúrcuma e de espécies relacionadas, incluindo o composto químico classificado como turmerina, um peptídeo. Extrações 20 Fração de óleo essencial

Extrações da presente invenção compreendem combinações de uma ou mais espécies de cúrcuma aqui ensinadas. Uma modalidade de uma extração compreende uma fração de óleo essencial que tem os componentes como mostrado por GC-MS da Tabela 2.

A fração de óleo essencial da raiz de turmérica foi extraída por tecnologia de extração de dióxido de carbono supercrítico por processamento de estágio único. As condições de extração ótimas são em temperaturas de 4O-SO0C e pressões de 100-30MPa com um rendimento de 3,5%. Osprincipais compostos de óleo essência em raiz de turmérica são sesquiterpenóides, como Ar-turmerona, turmerona e curlona, e sesquiterpenos, como curcumeno e zingibereno. O óleo essencial obtido por extração de estágio único de SCCO2 tem alta pureza de 99% guando extraído em temperaturas de 40-60°C e uma pressão de 3OMPa. Turmerona e curlona são os principais compostos, que constituem 75%-81% do óleo essencial total. Sesquiterpenos constituem 5,6-9,7% do óleo essencial, em que curcumeno e zingibereno são relativamente os principais. Os compostos anteriormente mencionados constituem 85-89% do óleo essencial de turmérica total.

Além disso, a pureza de curcuminóide está abaixo de 2,5% em estágio único de extrações de SCCO2 em certas condições, como T = 40 e 60°C e pressão de 100-50MPa. Essas condições podem ser escolhidas para extrair óleo essencial de alta pureza da raiz de turmérica.

Tabela 2. Compostos principais identificados no óleo essencial de cúrcuma.

<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table>

Os compostos têm picos de tempo de retenção de cerca de 30,36 (-curcumeno), 30,74 ( (-)-zingibereno), 31,68 (-sesquifelandreno), 33,45 (Benzeno, l-metil-4-(1-metiletil-), 34,20 (Benzeno, l-metil-2-(l-metiletil)-), 34,90 (Benzeno, 4-etil-1,2-dimetil-), 35,21 (ciclohexeno, 1-(1-propinil)-), 35,96 (ar-tumerona), 36,43 (β-tumerona), 37,00 (composto Ul), 37,36 (a-tumerona), 38,32 ((6S,l'R)-6-(115'-dimetilenex-41-enil)-3-metilciclohex-2-enona), 38,57 (composto U2), 38,73 ( ( + )-beta-atlantona), 38,84 (composto U3), 38,94 (composto U4), 39,24 (composto U5), 39,41 (( + )-alfa-atlantona) , 39,64 (composto U6) , 39,76 (3-buten-2-ona,4 -(4-hidroxi-3-metoxifenil) - ) , 40,03 (composto U7), 40,73 (composto U8) , 41,02 (composto U9) , 41,43 (ácido hexadecanóico, éster metílico), 42,05 (ácidopentadecanóico, 14-metil-, éster metílico) e 42,89 (ácido 9,12-octadecdienõico, metil éster, (E,E)-) minutos usando os métodos analíticos GC-MS como ensinado na presente invenção.

Fração de curcuminóide

Frações de curcuminóide de turmérica foram extraídas epurificadas por tecnologia de extração/fracionamento supercrítico com etanol como o co-solvente. 0 rendimento da extração de curcuminóide foi entre 0,74-2,10% com adição de l,2%-3,7% de etanol como o co-solvente. 0 rendimento daextração de curcuminóide pelo uso de CO2 puro foi apenas mais alto em 0,27%. Portanto, é necessário usar etanol como um co-solvente para aumentar o rendimento da extração de curcuminóide. 70% dos curcuminóides na matéria-prima foram extraídos por adição de 3,7% etanol como co-solvente.

Quanto maior a concentração de etanol, maior o rendimentoda extração. No entanto, não é bom aumentar a concentração de etanol para maximizar a seletividade de SCCO2 para os curcuminóides.

As condições de extração foram em uma temperaturaacima de 80°C e uma pressão acima de 50MPa. As condições dos três separadores foram a 60-67°C/15-17 MPa; 56°C/13 MPa e 28,6°C/6Mpa, respectivamente. Os curcuminóides de alvo são precipitados no primeiro separador. Além disso, diferentes métodos operacionais foram testados, como A: Usode três separadores continuamente durante todo oprocessamento; Β: processo de dois estágios com primeiro estágio para remover óleo essencial em condições leves usando apenas o terceiro separador e segundo estágio para extração e fracionamento dos curcuminóides pelo uso de três separadores continuamente; e C: processo de dois estágios com primeiro estágio para remover óleo essencial em condições adversas pelo uso do segundo e terceiro separadores e segundo estágio para extração e fracionamento de curcuminóides por uso do primeiro e terceiro separadores. Os dados de pureza de curcuminóide resumidos são mostrados na Tabela 3:

Tabela 3. A pureza de curcuminóides por processo de extração/fracionamento de SCCO2.

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A pureza de curcuminóides totais pode ser aumentada a diferentes níveis como se segue: maior que 55%, 60%-70%, 70%-80% e maior que 80%, dependendo dos métodos operacionais. Maior pureza foi obtida pelo uso de processamento de dois estágios com primeiro estágio para remover óleo essencial e segundo estágio para extrair curcuminóides com co-solvente de CO2 e etanol (método C). O perfil resumido de curcuminóide é mostrado na Tabela 4.

Tabela 4. O perfil de curcuminóides por processo de 10 extração/fracionamento de SCCO2

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Observações: 1. Perfil (%): calculado por y: (Pureza de cada curcuminóide)/(pureza total de curcuminóide) χ 100; 2. Média: que é a média aritmética, e é calculada por adição de um grupo de números e então divisão pela contagem daqueles números; e 3. Desvio padrão (D.V.); O desvio padrão é uma medida de como valores são dispersos do valor médio (a média). STDEV (D.P.) foi calculado pela seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 38</formula>

O perfil dos curcuminóides é altamente dependente das condições de operação; não em métodos de operação, uma vez que o perfil de curcuminóides obtidos nas mesmas condições, mas diferentes métodos de operação, é muito próximo ao desvio padrão abaixo de 1%.

O perfil de curcuminóide em matéria-prima é 66%<table>table see original document page 39</column></row><table>

Bisdesmetoxicurcumina, que foi obtido por exaustiva extração de etanol ou metanol. Pelo uso de processamento com SCCO2, o perfil de curcumina (C) , DMC e BDMC pode ser modificado de 61,83%-82,3 6%, 11,10%-15,95% e 6,54%-23,86%, respectivamente. Essas modificações das abundâncias relativas dos curcuminóides individuais não podem ser obtidas com o uso de métodos convencionais de extração.

Fração de polissacarídeo

Polissacarídeos de raiz de turmérica e glicoproteinasforam obtidos com o uso de diferentes concentrações de etanol para precipitações. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5. Resultados de rendimento de lixiviação de água de raiz de turmérica e análise de pureza de polissacarídeo pelo uso de Dextrana como padrões de referência,.

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Observação: F20 não pode ser analisado porque ele não pode ser dissolvido em água para obter certa concentração de solução.

A partir dos dados na Tabela 5, pode ser observado que o rendimento de polissacarídeos precipitados em etanol foina faixa de 2,77-10,28%, por % de peso de massa com base na matéria-prima original de turmérica. O rendimento foi aumentado com concentração crescente de etanol.

A partir da análise de peso molecular de diferentes precipitados, pode ser observado que F4 0 e F6 0 são similares; F80 e F95 são similares, e F20 é diferente de todos eles. Também foi constatado que os polissacarídeos e glicoproteínas da raiz de turmérica eram compostos de diferentes pesos moleculares de polissacarídeos e 10 glicoproteínas em certas proporções. Em polissacarídeos F40 e F6 0, o grupo de composto de maior peso molecular foi a 2.300-2.400 KDa, respondendo por 46-48% por peso de massa, e o peso molecular médio foi de cerca de 1.100—1.200 KDa. Em precipitados de polissacarídeo-glicoproteína F80 e F95, os componentes de maior peso molecular também estavam a 2.300-2.400 KDa, mas respondendo por apenas cerca de 3 0-35% por peso de massa. 0 peso molecular médio foi 780-890 KDa. Fração de turmerina

A fração de proteína da raiz turmérica foi purificada pelo uso de resina de troca de cátion de ácido forte Dowex 50-WX2-200 (grupos -SO3H como o grupo de troca) para processar o sobrenadante do precipitado de etanol a 60%. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6. Rendimento do processamento de Proteína em cada 2 5 etapa e resultados de análise de Bradford

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O rastreamento de espectrofotômetro de UV em um comprimento de onda de 190-300 nm é usado para testar o comprimento de onda em que a solução tem absorção máxima. Tanto efluente quanto eluído Dowex têm absorção máxima em comprimento de onda de 202 nm e solução de carga tem absorção máxima em comprimento de onda de 210 nm. Além disso, efluente Dowex tem a maior intensidade de absorção, o que significa que há maior concentração de proteínas de polipeptídeo no efluente Dowex. Os resultados na Tabela 6 também mostram que o efluente Dowex tem 0,30 g BSA eq./g extratos, que é 2,3 vezes mais alta que aquela em solução de alimentação de Dowex.

Em geral, os métodos e extrações da presente invenção compreendem métodos para fazer uma extração de espécies de cúrcuma que tem características predeterminadas. Tal extrato de espécies de cúrcuma pode compreender quaisquer uma, duas, três ou todas as quatro das quatro frações de extrato concentrado dependendo do efeito biológico benéfico desejado para o dado produto. Tipicamente, uma extração que contém todas as quatro frações de extratos de espécies de cúrcuma é geralmente desejada, uma vez que tais novas extrações representam os primeiros produtos da extração de espécies de cúrcuma altamente purificados e padronizadosque contêm todos os quatro constituintes químicos biologicamente benéficos principais encontrados no material de planta nativo. Modalidades da invenção compreendem métodos em que as características predeterminadas compreendem uma concentração seletivamente aumentada predeterminada do óleo essencial das espécies de cúrcuma, curcuminóides, turmerina e polissacarídeos em frações de extração separadas.

Extrações que resultam dos métodos da presenteinvenção compreendem material extraído de planta de espécies de cúrcuma ou uma extração de espécies de cúrcuma, ou combinação ou mistura de ambos. Extrações compreendem material extraído de planta de espécies de cúrcuma que tem características predeterminadas ou uma espécie de cúrcumaextraída ou uma extração de espécies de cúrcuma que tem uma característica predeterminada.

Uma modalidade adicional de tais extrações compreende uma concentração predeterminada de polissacarídeo substancialmente aumentada em relação àquela encontrada emmaterial de planta seco de espécie de cúrcuma natural ouprodutos convencionais de extrato de espécies de cúrcuma. Por exemplo, uma extração pode compreender frações de polissacarídeos hidrossolúveis, insolúveis em etanol de 10% a 92% por peso de massa.

Outra modalidade de tais extrações, uma concentraçãode fração de turmerina predeterminada substancialmente aumentada em relação àquela encontrada em material de planta de espécies de cúrcuma natural ou produtos de extrato de espécies de cúrcuma convencionais. Por exemplo,uma extração pode compreender uma fração de turmerina maiorque 0,2% a 6,6% por peso de massa. Pureza de Extrações

Na realização dos métodos de extração descritos abaixo, foi constatado que mais de 60% de rendimento por peso de massa do óleo essencial das espécies de cúrcuma que têm mais de 70% de pureza das três tumeronas (ar-tumerona, α-tumerona e tumerona) na matéria-prima de rizoma original seca das espécies de cúrcuma pode ser extraída na fração de extrato de óleo essencial de SCCO2 (Etapa 1).

Com o uso dos métodos como ensinado na etapa 1(Extração de SCCO2 e Fracionamento), uma fração de curcuminóide altamente purificada pode ser extraída. 0 rendimento dessa etapa de extração é de cerca de 22% dos curcuminóides presentes na matéria-prima de espécie decúrcuma natural. A pureza (concentração) da extração de curcuminóide extraída é maior que 8 0% por peso de massa seca, e os três principais curcuminóides tiveram perfis favoráveis (proporções alteradas) em que curcumina é maior que 80% dos curcuminóides por % de peso de massa doscurcuminóides totais. Na etapa 2 (extração por lixiviaçãode etanol), mais de 80% dos curcuminóides (78%) que permanecem na etapa 1 resíduo de extração e fracionamento de SCCO2 podem ser extraídos. A etapa 3 de purificação por SCCO2 e fracionamento da fração de curcuminóide extraídacom etanol resulta em uma fração altamente purificada (>85% de curcuminóides por % de peso de massa seco da composição do extrato) da composição de curcuminóide com > 70% curcumina por % do peso de massa dos constituintes químicos do curcuminóide na composição. Etapa 4 de purificação porSCCO2 e realização do perfil dos curcuminóides também podepurificar a fração de curcuminóide da etapa 3 de extração a uma composição de fração de curcuminóide em que a concentração do curcuminóides é maior que 90% por peso de massa com um perfil de curcuminóide em que a concentração de curcumina é maior que 75% dos constituintes químicos de curcuminóide por % de peso de massa. De fato, a purificação por SCCO2 da etapa 4 e perfil dos curcuminóides pode purificar um produto de extração de curcuminóide altamente concentrado em que a concentração de curcuminóide na composição de fração de curcuminóide é maior que 95% e a distribuição de curcuminóide teve o perfil realizado em que a concentração de curcumina é maior que 85% por peso de massa dos constituintes químicos do curcuminóide. Portanto, o processo de extração e fracionamento de SCCO2 como ensinado nesta invenção permite que as proporções (perfis) dos curcuminóides individuais que compreendem as composições de fração de constituinte químico de curcuminóide sejam alteradas de modo que perfis únicos de composição de fração de curcuminóide possam ser criados para objetivos medicinais particulares.

Com o uso dos métodos como ensinado nas Etapas 5 e 6 desta invenção, uma fração de extração hidrossolúvel, insolúvel em etanol (composição de fração de polissacarídeo) é atingida com um rendimento de 4,5% a partir da matéria-prima de espécie de cúrcuma original tendo uma pureza maior que 90% (concentração) de polissacarídeos de cúrcuma. Isso também se iguala a um rendimento de 70% dos constituintes químicos do polissacarídeo das espécies de cúrcuma encontrados na matéria-prima de espécie de cúrcuma natural.Com o uso dos métodos como ensinado na etapa 5, 6 e 7 desta invenção, um rendimento de fração de turmerina de 2,0% por % de peso de massa seco da matéria-prima de espécie de cúrcuma original. A concentração dos peptideos, principalmente turmerina, na fração de turmerina foi de cerca de 6,6% de peso de massa seca, um aumento de 66 vezes na pureza dos peptideos por % de peso de massa com base na matéria-prima de espécie de cúrcuma nativa. Isso se iguala a um rendimento maior que 90% por % de peso de massa dos constituintes químicos de peptídeo de turmerina encontrados no material de planta nativo de espécies de cúrcuma usando a análise de proteínas de Bradford.

Finalmente, os métodos como ensinados na presente invenção permitem que a purificação (concentração) da composição de fração de óleo essencial, da composição de fração de curcuminóide, da composição de fração de polissacarídeo e da composição de fração de turmerina seja tão alta quanto 70% a 90% dos constituintes químicos desejados na composição de fração de óleo essencial, tão alta quanto 97% de curcuminóides na composição de fração de curcuminóide, tão alta quanto 92% de polissacarídeos na composição de fração de polissacarídeo, e tão alta quanto 6,6% de peptideos de turmerina na composição de fração de turmerina. Os ambientes específicos de extração, taxas deextração, solventes e tecnologia de extração usadosdependem do perfil de constituinte químico de início do material de fonte e do nível de purificação desejada nos produtos de extração finais. Métodos específicos como ensinado na presente invenção podem ser facilmentedeterminados por aqueles habilitados na técnica com o usode não mais que experimentação rotineira típica para ajuste de um processo para responder por variações de amostra nos atributos de materiais de iniciação que são processados a um material de resultado que tem atributos específicos. Por exemplo, em um lote particular de material de planta de espécies de cúrcuma, as concentrações iniciais de óleo essencial, dos curcuminóides, dos polissacarídeos e das proteínas de peptídeo são determinadas com o uso de métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica como ensinado na presente invenção. Uma pessoa habilitada na técnica pode determinar a quantidade de mudança a partir da concentração inicial dos curcuminóides, por exemplo, para as quantidades predeterminadas de curcuminóides para o produto de extração final com o uso dos métodos de extração, como aqui revelado, para atingir a concentração desejada no produto da composição de espécie de cúrcuma final. Extrações e relação à cúrcuma natural

Uma modalidade da presente invenção compreende uma concentração predeterminada de óleo essencial em que a concentração predeterminada de óleo essencial é a concentração do óleo essencial que é maior que aquele que está presente no material de planta de espécies de cúrcuma natural ou produtos convencionais de extrato de espécies de cúrcuma que podem resultar das técnicas de extração aqui ensinadas. Por exemplo, a composição pode compreender mais de 5% a 99% por peso de massa de constituintes químicos de óleo essencial de espécies de cúrcuma. Outra modalidade da presente invenção compreende uma concentraçãopredeterminada de curcuminóide na extração de espécies de cúrcuma extraída em que a concentração de curcuminóide émaior que aquela encontrada no material de planta nativo ou extratos convencionais de espécies de cúrcuma. Por exemplo, uma extração pode compreender curcuminóides de espécies de cúrcuma em uma concentração de 35% a 97% por peso de massa.

Uma modalidade de tais extrações de curcuminóide compreende um perfil de distribuição de curcuminóide purificado preferida predeterminada em que a concentração predeterminada de curcumina é maior que aquela que é presente no material de planta de espécies de cúrcuma natural ou produtos de extração curcuminóide convencionais de espécies de cúrcuma que podem resultar das técnicas de extração aqui ensinadas. Por exemplo, a fração de curcuminóide purificada pode compreender um perfil de curcuminóide em que a curcumina está em uma concentração de 75% a 90% por peso de massa dos curcuminóides com uma redução correspondente na concentração dedesmetoxicurcumina e bisdesmetoxicurcumina.

As modalidades também compreendem extrações em que uma ou mais das frações, incluindo os constituintes químicos do óleo essencial, os curcuminóides, a fração de turmerina, ou polissacarídeos, são encontrados em uma concentração que é menor que aquela encontrada em material de planta de cúrcuma nativa. Por exemplo, extrações da presente invenção compreendem frações em que a concentração da fração de óleo essencial é de 0,001 a 22 vezes a concentração de material de planta nativo de espécies de cúrcuma, e/ou extrações em que a concentração de curcuminóides é de 0,001 a 25 vezes a concentração de material de planta nativo de espécies de cúrcuma, e/ou composições em que a concentração da fração de turmerina é de 0,001 a 66 vezes a concentração dematerial de planta nativo de espécies de cúrcuma, e/ou polissacarídeos é de 0,01 a 16 vezes a concentração de material de planta nativo de espécies de cúrcuma. Ao fazer uma extração combinada, de cerca de 0,001 mg a cerca de 100 5 mg de uma fração de óleo essencial pode ser usada; de cerca de 0,001 mg a cerca de 1.000 mg da fração de curcuminóide pode ser usada; de 0,001 mg a cerca de 100 mg de uma fração de turmerina pode ser usada; e de cerca de 0,001 mg a cerca de 1000 mg de uma fração de polissacarideo pode ser suada.

Uma modalidade de tais extrações compreendeconcentrações predeterminadas de frações de constituinte químico extraídas e purificadas e/ou perfiladas em que os perfis de concentração de óleo essencial/curcuminóides, óleo essencial/turmerina, óleo essencial/polissacarídeos,curcuminóides/turmerina, curcuminóides/polissacarídeo e turmerina/polissacarídeo de espécie de cúrcuma (% de peso seco) (proporções) são maiores ou menores que aqueles encontrados no material de planta natural seco ou em extrações convencionais de produtos de espécies de cúrcuma.

A alteração das relações de concentração (perfis químicos)dos constituintes químicos benéficos das espécies de cúrcuma permite a formulação de produtos de extração de espécies de cúrcuma únicos ou novos desenhados para condições ou males humanos específicos. Por exemplo, umanova e poderosa extração de cúrcuma para atividade antiinflamatória e terapia de artrite pode ter óleo essencial mais purificado, curcuminóide (preferivelmente tendo um perfil de curcuminóide alterado em que a concentração de curcumina é maior que 8 0% por peso de massados curcuminóides) e composições de turmerina e umacomposição de polissacarídeo reduzida por % de peso de massa que aquela encontrada no material de planta de espécie de cúrcuma nativa ou produtos de extração convencionais conhecidos. Em contraste, uma nova extração de cúrcuma para melhoria imune pode ter uma maior fração purificada de polissacarídeo e uma fração reduzida de curcuminóide e fração de turmerina por % de peso de massa que aquela encontrada no material de planta de cúrcuma nativo ou produtos de extração convencionais conhecidos.

Outro exemplo de um novo perfil de extração de cúrcuma para doença de Alzheimer pode ser um perfil de extração com mais composições de óleo essencial e curcuminóides purificados e frações reduzidas purificadas de turmerina e de polissacarídeos que aquelas encontradas em material de planta nativa de espécie de cúrcuma nativa ou produtos de extração de cúrcuma convencionais conhecidos. Métodos de Extração

O material de iniciação para extração é material de planta de espécies de cúrcuma. C. longa L. é um material deiniciação preferido. 0 material pode ser a porção aérea daplanta, que inclui as folhas, caules, ou outras partes da planta, embora o rizoma (raízes) seja o material de iniciação preferido. O material de planta de espécies de cúrcuma pode ser submetido a etapas de pré-extração paratornar o material em uma forma útil para extração. Tais etapas de pré-extração incluem, mas não são limitadas a, aquelas em que o material é partido, picado, triturado, moído, pulverizado, cortado, ou rasgado, e o material de iniciação, antes das etapas de pré-extração, é seco oumaterial de planta fresco. Uma etapa de pré-extração49/112preferida compreende moagem e/ou pulverização do material de rizoma de espécies de cúrcuma em um pó fino. 0 material de partida ou material após as etapas de pré-extração pode ser seco ou ter umidade adicionada a ele.

Extração supercrítica de fluido de cúrcuma

Em geral, os métodos da presente invenção compreendem, em parte, métodos em que o material de planta de espécies de cúrcuma é extraído com o uso de nova extração de dióxido de carbono de fluido de fracionamento supercrítica (SCCO2 10 ou SFE) que é seguida por uma ou mais etapas de extração de solvente, como, por exemplo, sem limitação, água, extrações hidroalcoólicas, absorção de resina adsorvente, e processos adicionais novos de extração e fracionamento de SCCO2. Métodos adicionais contemplados para a presente invenção 15 compreendem a extração de material de planta de cúrcuma usando outros solventes orgânicos, agentes químicos de refrigeração, gases compressíveis, sonificação, extração de líquido por pressão, processo de cromatografia líquida, cromatografia contra corrente de alta velocidade, 20 adsorventes de polímero, polímeros moleculares impressos e outros métodos de extração conhecidos. Tais técnicas são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

A especificação inclui um processo para a extração do óleo-resina de material de planta turmérica com a 25 utilização de SCCO2. A especificação inclui o fracionamento dos extratos de óleo-resina em, por exemplo, o óleo essencial e os componentes químicos de curcuminóide com alta pureza. Além disso, a especificação inclui um processo de SCCO2 no qual os constituintes químicos individuais 3 0 dentro de uma fração de extração podem ter suas proporçõesou seus perfis de constituintes químicos alterados. Por exemplo, separação fracionada por SCCO2 dos curcuminóides permite a extração seletiva de curcumina em relação aos outros curcuminóides de tal forma que uma fração do extrato de curcuminóide pode ser produzida com uma concentração de curcumina maior que 80% dos curcuminóides presentes na fração de extrato de curcuminóide purificada.

"Extração fracionária" e "separação fracionária" de resinas oleosas de plantas com o uso de SCCO2 (veja U.S 5.120.558) permitem a extração seletiva dos constituintes quimicos do óleo essencial de cúrcuma sob condições relativamente leves (temperaturas de 50 0C ou menos, pressões de 3OMPa ou menos). Subseqüentemente, é então possível re-extrair o material de matéria-prima de cúrcuma sob condições mais severas (temperaturas > 50°C, pressões > 30MPa) para se obter constituintes químicos de curcuminóide, que são geralmente menos solúveis em SCCO2 líquido. Como resultado, são obtidas duas frações altamente purificadas: a fração leve (fração de óleo essencial) e afração pesada (fração de curcuminóide). 0 fracionamentoadicional das frações do extrato em temperaturas e pressões elevadas ocorre simultaneamente por passagem do jato de extrato/líquido através de uma série de 3 separadores. As condições de pressão e temperatura em cada vaso do separador são escolhidas com precisão para precipitar um constituinte químico de interesse individual como, por exemplo, sem limitação, curcumina.

A extração de líquido supercrítico e o sistema de fracionamento são um sistema de processamento de materialprojetado para a produção de produtos medicinais a partirde fontes botânicas com o uso de SCCO2. 0 sistema é equipado com características que permitem que um material pré-processado de matéria-prima botânica natural adequado seja carregado dentro de um vaso de processamento, exposto 5 a um jato pressurizado de CO2 para a remoção de um constituinte químico selecionado, e subseqüentemente seja passado através de um equipamento de processo químico (separadores) que separa seletivamente os constituintes químicos desejados do jato de CO2 principal.

o sistema de SCCO2 é composto por dois vasos deextração principais, três vasos de separação, permutadores de calor elétricos, condensadores de líquido resfriado, CO2 acumulador, medidores de fluxo de massa, bomba de CO2, bomba de aditivo e refrigerador. Os vasos de extração 15 primária são de 24 litros, fabricados com aço inoxidável 17-4PH e capacidade de pressão até 70MPa (75,842 MPa) . Os vasos de separação são de 2 0 litros, fabricados com aço inoxidável 316 e capacidade de pressão até 20MPa (20,684 MPa) . Cada extrator e cada separador é equipado com um sistema de fechamento de ação rápida, que permite um tempo curto de carga e descarga do sistema de extração.

Todas as partes que trabalham sob pressão são protegidas contra o excesso de pressão por válvulas de segurança. Vários dispositivos de intertravamento são integrados no sistema para evitar falhas de operação. No caso de falha do instrumento ou da fonte de energia, todas as válvulas de ativação pneumática entrarão em modo de segurança. Uma bomba de aditivo é usada para dosar co-solventes como, por exemplo, etanol, no CO2 em uma taxa de 30 fluxo de 0,5 l/min. Para evitar que a bomba apresentebolhas de ar, CO2 líquido flui do vaso de estocagera de CO2 através de um refrigerador até a bomba de CO2.0 CO2 é comprimido até a pressão de extração desejada com o uso da bomba de CO2 e aquecido até a temperatura de extração com um aquecedor. O sistema é controlado rigorosamente com o uso de dois processadores fieldpoint compactos da "National Instruments" (CFP-2020 e CFP-200). "National Instrument Labview RT" (tempo real) é executado nesses processadores com o uso de um programa de computador feito sob medida. Os CPF são interconectados por meio de Ethernet aos computadores da interface do operador.

Resumidamente, o processo compreende fluxo de CO2 liqüefeito a partir do vaso de estocagem de CO2 através de um refrigerador até a bomba de CO2. A seguir, o CO2 é comprimido até a pressão de extração desejada e aquecido até a temperatura desejada. Os vasos do extrator são preenchidos com cestas de material pré-tratado de matéria-prima botânica e operados alternativamente ou em série. Durante a operação do sistema, um vaso do extrator está no circuito CO2, enquanto o outro poderia ser despressurizado, a matéria-prima trocada, e esse vaso do extrator re-pressurizado. Esse último modo de operação leva a um fluxo semicontínuo de material sólido. A separação é efetuada em três etapas rigorosamente controladas, alta pressão, pressão média e baixa, pressão com ajuste apropriado de temperatura para cada separador. O CO2, após passagem através dos separadores, agora está livre de extrato e flui até um condensador, onde é liqüefeito. O CO2 líquido então flui para dentro do vaso de estocagem de CO2 para reciclagem.A extração da resina oleosa de espécies de cúrcuma com SCCO2, como ensinado na presente invenção, elimina o uso de solventes orgânicos e fornece fracionamento simultâneo dos extratos. o dióxido de carbono é um produto biológico 5 natural e seguro e um ingrediente em muitos alimentos e bebidas. Diferentemente do SCCO2 convencional, que é caro, opera em um modo de batelada distinto, não econômico comparado como métodos de extração de solvente. Na presente invenção, o sistema de extração e separação fracionária de SCCO2 supera essas limitações.

Um diagrama esquemático dos métodos de extração dos constituintes químicos biologicamente ativos de espécies de cúrcuma é ilustrado nas Figuras 1-7. 0 processo de extração ocorre tipicamente, sem limitação, em 7 etapas. Para referência no texto, quando o símbolo # aparece entre colchetes [#x] , o número seguinte refere-se aos números nas Figuras 1-7. Os métodos analíticos usados no processo de extração são apresentados na seção de Exemplificação. Etapa 1. Processos de extração de óleo essencial

Em função da natureza hidrofóbica do óleo essencialdas espécies de cúrcuma, solventes não polares, incluindo, sem limitação, extração de fluido supercrítica (SFE), como SCCO2, hexano, éter de petróleo e acetato de etila, bem como destilação de vapor, podem ser usados para esse processo de extração.

Esse método do processo compreende uma única etapa de extração para purificação (concentração) do óleo essencial (Figura la) ou, se desejado, purificação do óleo essencial com purificação simultânea dos curcuminóides e alteraçãodas proporções dos compostos de curcuminóide individuais nogrupo químico de curcuminóide (Figura lb).

Uma descrição generalizada da extração de fracionamento de extração de fluido supercrítica (SFE) de óleo essencial da matéria-prima de espécie de cúrcuma nativa é representada como um diagrama na Figura 1 - Etapa 1. A matéria-prima [#10] é matéria-prima de rizoma de espécies de cúrcuma molda seca (trama 8-20). A matéria-prima é carregada em um cesto que é colocado no interior de um vaso de extração SFE [#20 ou # 50]. O solvente [#210 ou # 220] é dióxido de carbono puro (CO2). Etanol a 95% pode ser usado como um co-solvente [#220]. Após a limpeza e teste de vazamentos, o processo compreende fluxo de CO2 liqüefeito a partir de um vaso de armazenamento através de um refrigerador até uma bomba de CO2. 0 CO2 é comprimido até a pressão desejada e flui através da matéria-prima no vaso de extração, onde a pressão e a temperatura são mantidas no nível desejado. As pressões para a extração variam de cerca de IOMPa a 8 OMPa, de cerca de 2OMPa a cerca de 60MPa, de cerca de 300 a cerca de 40MPa, e a temperatura varia de cerca de 30°C a cerca de 100°C, de cerca de 40°C a cerca de 90°C, e de cerca de 60°C a cerca de 80°C. As extrações de SCCO2 aqui ensinadas são realizadas preferivelmente em pressões de pelo menos lOMPa, e uma temperatura de pelo menos 30°C e, mais pref erivelmente, em uma pressão de cerca de 30MPa a 60MPa e em uma temperatura de cerca de 50°C a cerca de 90°C. 0 tempo para extração varia de cerca de 30 minutos a cerca de 2,5 horas, de cerca de 1 hora a cerca de 2 horas, a cerca de 1,5 hora. A proporção de solvente em relação à alimentação é tipicamente de cerca de 50 a 1 para cada uma das extraçõesde SCCO2. O CO2 é reciclado. 0 óleo essencial extraído e purificado, e a fração de curcuminóide extraída, purificada e com perfil definido são então coletados em um frasco coletor ou separador [#3 0 e # 40 ou # 60, # 300, e # 80], 5 salvos e armazenados no escuro a 4 °C. O material de matéria-prima de rizoma moído de espécies de cúrcuma [#10] pode ser extraído em um processo de uma etapa, em que a fração de óleo essencial de cúrcuma extraída resultante é coletada em um sistema coletor SFE ou SCCO2 [#20] (etapa 1,acima) . Alternativamente, uma vez que em um sistema SFE fracionário [#50] o material de matéria-prima de espécie de cúrcuma extraído por SCCO2 pode ser separado em frascos coletores (separadores) [#60, # 300, # 80] de modo que em um dos frascos coletores (separador) há uma fração de óleo essencial purificada [#60], no segundo frasco coletor há uma fração de curcuminóide purificada e com definição de perfil [#300] e em um terceiro frasco coletor há o resíduo ou restante [#80] do material de rizoma de espécies de cúrcuma extraído. Uma modalidade da invenção compreende a extração do material de rizoma natural de espécies de cúrcuma com o uso de extração fracionária de SCCO2 a 300 a 6OMPa, e em uma temperatura entre 50°C e 90°C e coleta do material extraído de espécies de cúrcuma em diferentes frascos coletores em condições predeterminadas (pressão, temperatura e densidade) e intervalos predeterminados(tempo).

A fração de óleo essencial purificada extraída de espécies de cúrcuma resultante pode ser recuperada e usada independentemente, ou pode ser combinada para formar uma ou mais extrações extraídas de espécies de cúrcuma. Um aspectoda fração de óleo essencial extraída por SCCO2 compreende uma concentração predeterminada de constituinte químico de óleo essencial que é maior do que aquela encontrada no material de planta nativo ou em produtos convencionais da extração de espécies de cúrcuma. Tipicamente, o rendimento total de constituintes químicos do óleo essencial é maior que 95%, e a pureza dos constituintes químicos do óleo essencial na fração extraída de óleo essencial é maior do que 99% por peso de massa. A pureza e os constituintes químicos na fração de óleo essencial podem ser medidos com o uso de análise de cromatografia a gás-epectroscopia de massa (GC-MS). Os resultados analíticos dessas extrações são mostrados nas Tabelas 7 e 8. Exemplos experimentais dessas extrações são encontrados abaixo. A fração de curcuminóide extraída purificada com perfil definido de espécies de cúrcuma resultante pode ser recuperada independentemente e usada independentemente, ou pode ser combinada para formar uma ou mais extrações de espécies de cúrcuma.

Um aspecto da fração de curcuminóide extraída porSCCO2 compreende uma concentração predeterminada de constituinte químico de curcuminóide combinada com o perfil da concentração de curcuminóide, em que a cúrcuma é maior do que aquela encontrada no material de planta nativo ou em produtos convencionais de extração de cúrcuma. Tipicamente, o rendimento total de frações de curcuminóide a partir da matéria-prima de espécies de cúrcuma é cerca de 22% dos curcuminóides por % de peso de massa, possuindo uma pureza da fração de curcuminóide de mais de 80%, e um perfil definido do constituinte químico da fração de curcuminóidede mais de 80% de cúrcuma por % de peso de massa dos curcuminóides. A pureza e as distribuições de curcuminóide são medidas com o uso de análise por HPLC. Exemplos e os resultados desses processos de extração são encontrados no Exemplo 1 e nas Tabelas 9 e 10.

Etapa 2. Extração por lixiviação de etanol

Uma descrição generalizada da extração de material de resíduo de espécies de cúrcuma [#4 0 ou # 80] do processo de extração por SCCO2 da Etapa 1 com o uso de um processo de lixiviação de etanol é representado graficamente na Figura 2-Etapa 2. A matéria-prima [#40 ou # 80] é o resíduo da Etapa Ia ou Etapa Ib. O solvente de extração [#23 0] é etanol 95%. Nesse método, a matéria-prima e o solvente de extração são carregados separadamente em um vaso de extração aquecido até 60 a 80°C, e agitado por 3 a 7 horas. Após a mistura ser interrompida, permite-se que a solução fique em repouso por 10 a 20 horas. A camada superior foi decantada [#100] , filtrada [#110] , centrifugada [#120] . O sobrenadante enriquecido em curcuminóide foi evaporado [#130] até uma massa ou pó [#140]. Esse produto de extração seco [#14 0] é então usado para processamento posterior (Etapa 3) . O resíduo sólido [#150] pode ser salvo e usado para processamento posterior (Etapa 4) para a obtenção de frações purificadas de polissacarídeos e polipeptídeos (turmerina) de espécies de cúrcuma. Um exemplo e os resultados desses processos de extração são encontrados no Exemplo 3 e na Tabela 11.

Etapa 3. Purificação por SCCO2 da fração de curcuminóide extraída por etanol

Esse método do processo compreende uma única etapa deextração para purificação (concentração) dos curcuminóides e, se desejado, alteração das proporções dos curcuminóides individuais dentro do grupo químico do curcuminóide. Em uma etapa de pré-processamento, o óleo essencial na matéria- prima natural de espécies de cúrcuma é extraído com o uso de SCCO2 (Etapa 1), e os curcuminóides são então extraídos do resíduo da Etapa 1 com o uso de etanol (Etapa 2) e secos a vácuo para formar um tipo de massa, como ensinado na Etapa 2, e misturados com glóbulos de vidro para formar um pó pulverizável, ou secos por vaporização até uma forma de pó (tamanho de partícula maior que 100 μm).

Uma descrição generalizada da extração por fracionamento por SFE da fração de curcuminóide a partir do produto de extração da Etapa 2 [#14 0] é representada graficamente na Figura 3-Etapa 3.

A matéria-prima [#140] é misturada com glóbulos de vidro e carregada em um vaso de extração por SFE [#160]. 0 solvente é dióxido de carbono puro [#24 0]. Etanol pode ser utilizado como co-solvente. Após depuração e testes em busca de vazamentos, o processo compreende o fluxo de CO2 liqüefeito a partir de um vaso de estocagem através de um refrigerador até a bomba de CO2. 0 CO2 é comprimido até a pressão desejada, e depois flui através da matéria-prima no vaso de extração, onde a pressão e a temperatura sãomantidas no nível desejado. As pressões para a extraçãovariam de cerca de IOMPa a 80MPa, de cerca de 20MPa a 70MPa, de cerca de 30MPa a 60MPa, e as faixas de temperatura de cerca de 30°C a cerca de 100°C, de cerca de 450C a cerca de 95°C e de cerca de 60°C a cerca de 90°C. Asextrações de SCCO2 aqui ensinadas são realizadaspreferivelmente em pressões de pelo menos 3OMPa e em uma temperatura de pelo menos 4 0°C e, mais pref erivelmente, em uma pressão de cerca de 4OMPa a cerca de 6OMPa e em uma temperatura de cerca de 600C a cerca de 90°C. O tempo de extração varia de cerca de 30 minutos a 4 horas, de cerca de 1 hora a 3 horas, a cerca de 2 horas. A proporção de solvente para alimentação é tipicamente cerca de 1.000 a 1 para cada uma das extrações de SCCO2. O CO2 é reciclado. As frações de curcuminóide extraídas, purificadas e com perfil 10 definido são então coletadas em vasos do coletor ou do separador [#310] que possuem ajustes predeterminados de pressões e temperaturas.

Uma modalidade da invenção que compreende o material de curcuminóide extraído enriquecido em etanol ou um material de curcuminóide extraído enriquecido com o uso de extração fracionária de SCCO2 a 30MPa a 60MPa, e em uma temperatura entre 60°C e 95°C e coleta do material da fração extraída de curcuminóide em diferentes vasos do coletor em condições predeterminadas (pressão, temperatura, e densidade) e intervalos predeterminados (tempo). A fração de curcuminóide extraída purificada de espécies de cúrcuma resultante em cada coletor pode ser recuperada ou usada independentemente, ou pode ser combinada para formar um ou mais produtos de extração de espécies de cúrcuma. Umaspecto da fração de curcuminóide de espécies de cúrcuma extraída por SCCO2 compreende uma concentração predeterminada de constituinte químico de curcuminóide que é maior do que aquela encontrada no material de planta nativo de espécies de cúrcuma ou em produtos convencionaisda extração de espécies de cúrcuma. Um aspecto adicional dainvenção é uma fração extraída purificada de curcuminóide em que a concentração da cúrcuma é maior que 70% do peso de massa do peso de massa dos constituintes químicos de curcuminóide. Tipicamente, o rendimento total da fração purificada de curcuminóide a partir do material nativo de rizoma de espécies de cúrcuma é cerca de 2,6%, possuindo uma concentração de curcuminóide de mais de 85% de curcuminóides por peso de massa da fração de extração de curcuminóide. Além disso, o perfil da concentração dos curcuminóides pode ser alterado até uma concentração de cúrcuma de mais de 70% por peso de massa. Um exemplo e os resultados desses processos de extração são encontrados no Exemplo 4 e na Tabela 12.

Etapa 4. Purificação e definição do perfil dos curcuminóides

Esse método do processo compreende uma única etapa de extração para purificação adicional (concentração) dos curcuminóides e, se desejado, alteração das proporções dos curcuminóides individuais dentro do grupo químico do curcuminóide. Em uma etapa de pré-processamento, o óleo essencial na matéria-prima natural de espécies de cúrcuma é extraído com o uso de SCCO2 (Etapa 3) e seco a vácuo para formar um tipo de massa, e misturado com glóbulos de vidro para formar um pó pulverizável ou seco por vaporização até uma forma de pó (tamanho de partícula maior que 100 μπι) . Em outra etapa de pré-processamento, um produto de extração de curcuminóide altamente enriquecido é misturado com glóbulos de vidro para formar um pó pulverizável.

Uma descrição generalizada da extração por fracionamento por SFE da fração de curcuminóide a partir doproduto de extração da Etapa 3 [#310] ou de um produto de extração de curcuminõide altamente enriquecido [#320] é representada graficamente na Figura 4-Etapa 4. A matéria-prima [#310 ou # 320] é misturada com glóbulos de vidro e carregada em um vaso de extração por SFE [#170] . 0 solvente é dióxido de carbono puro [#250]. Etanol pode ser utilizado como co-solvente. Após depuração e testes em busca de vazamentos, o processo compreende o fluxo de CO2 liqüefeito a partir de um vaso de estocagem através de um refrigerador até a bomba de CO2. 0 CO2 é comprimido até a pressão desejada, e depois flui através da matéria-prima no vaso de extração, onde a pressão e a temperatura são mantidas no nível desejado. As pressões para a extração variam de cerca de IOMPa a 80MPa, de cerca de 20MPa a 70MPa, de cerca de 30MPa a 60MPa, e as faixas de temperatura de cerca de 30°C a cerca de 100°C, de cerca de 45°C a cerca de 95°C e de cerca de 60°C a cerca de 90°C. As extrações de SCCO2 aqui ensinadas são realizadas preferivelmente em pressões de pelo menos 3OMPa, e uma temperatura de pelo menos 4O0C e,mais preferivelmente, em uma pressão de cerca de 4 OMPa acerca de 6 OMPa e em uma temperatura de cerca de 60 0C a cerca de 90°C. O tempo de extração varia de cerca de 30 minutos a 4 horas, de cerca de 1 hora a 3 horas, a cerca de 2 horas. A proporção de solvente para alimentação é tipicamente cerca de 1.000 a 1 para cada uma das extrações de SCCO2. O CO2 é reciclado. As frações de curcuminóide extraídas, purificadas e com perfil definido são então coletadas em vasos do coletor ou do separador [#33 0] que possuem ajustes predeterminados de pressões e temperaturas.

Uma modalidade da invenção que compreende o materialextraído de curcuminóide enriquecido em etanol ou um material de curcuminóide extraído enriquecido com o uso de extração fracionária de SCCO2 a 3OMPa a 6OMPa e em uma temperatura entre 60°C e 95°C e coleta do material da fração extraída de curcuminóide em diferentes vasos do coletor em condições predeterminadas (pressão, temperatura, e densidade) e intervalos predeterminados (tempo). A fração de curcuminóide extraída purificada de espécies de cúrcuma resultante em cada coletor pode ser recuperada ou usada independentemente, ou pode ser combinada para formar um ou mais produtos de extração de espécies de cúrcuma.

Um aspecto da fração de curcuminóide de espécies de cúrcuma extraída por SCCO2 compreende uma concentração predeterminada de constituinte químico de curcuminóide que 15 é maior do que aquela encontrada no material de planta nativo de espécies de cúrcuma ou em produtos convencionais da extração de espécies de cúrcuma.

Um aspecto adicional da invenção é uma fração extraída purificada de curcuminóide, em que a concentração da cúrcuma é maior que 80% dos constituintes químicos de curcuminóide por % de peso de massa. Tipicamente, o rendimento total da fração purificada de curcuminóide a partir do material nativo de rizoma de espécies de cúrcuma é cerca de 0,9% do peso de massa, possuindo umaconcentração de curcuminóide de mais de 85% decurcuminóides por peso de massa. Além disso, o perfil da concentração dos curcuminóides pode ser alterado até uma concentração de cúrcuma de mais de 75% do peso de massa dos curcuminóides. Com relação ao produto de extração decurcuminóide altamente enriquecido, o rendimento é maiorque 60% por peso de massa com uma pureza de curcuminóide de mais de 95% e um perfil de curcuminóide em que a cúrcuma é maior que 85% dos curcuminóides por % de peso de massa. Exemplos e os resultados desses processos de extração são encontrados no Exemplo 5 e nas Tabelas 13, 14 e 15.

Etapa 5. Lixiviação de água do resíduo da Etapa 2

Em um aspecto, a presente invenção compreende extração e concentração dos constituintes químicos bioativos de polissacarídeo e polipeptídeo (tumerina) do material de planta de espécies de cúrcuma. Uma descrição generalizada de uma etapa de extração preparatória é representada graficamente na Figura 5-Etapa 5. Esse processo de extração da Etapa 5 é um processo em um único estágio de lixiviação de solvente. A matéria-prima para esse processo de extração é o resíduo da Etapa Ib [#40] ou da Etapa 2 [#150] .

O solvente de extração [#260] é água destilada. Nesse método,

O resíduo de espécies de cúrcuma e o solvente de extração são carregados em um vaso de extração [#4 00] e aquecidos e agitados. Ele pode ser aquecido até 100°C, a cerca de 90°Cou a cerca de 70-90°C. A extração é realizada por cerca de1 a 5 horas, por cerca de 2-4 horas ou por cerca de 3 horas. A extração de líquido resultante é filtrada [#410] e centrifugada [#420] . O sobrenadante [#430] foi evaporado [#440] até um sobrenadante concentrado [#450] paraprocessamento posterior (Etapas 6 e 8) . 0 resíduo sólido é descartado [#460] . Um exemplo dessa etapa de extração é encontrado no Exemplo 6, e os resultados na Tabela 16. Etapa 6. Extração e purificação da fração de polissacarídeo Como aqui ensinado, um extrato da fração purificada de polissacarídeo das espécies de cúrcuma pode ser obtido porprecipitação de etanol dos polissacarídeos hidrossolúveis, insolúveis em etanol de um extrato aquoso de matéria-prima de espécies de cúrcuma, e depois o contato do precipitado em solução aquosa com um adsorvente de resina de polímero sólido de modo a adsorver as moléculas menores de peso molecular de menos de 700 D contidas na solução aquosa. Os polissacarídeos são então concentrados no efluente. As moléculas ligadas são eluídas e descartadas. Antes da separação dos constituintes químicos na solução aquosa de precipitado, o adsorvente de tamanho molecular com os constituintes químicos indesejados nele adsorvidos pode ser separado do efluente (constituintes químicos desejados) de qualquer forma conveniente, preferivelmente; o processo de contato do adsorvente e a separação são efetuados por passagem do produto de extração aquosa por meio de uma coluna ou leito de extração do material adsorvente.

Podem ser utilizados diversos adsorventes para purificar os constituintes químicos de polissacarídeo de espécies de cúrcuma. Um adsorvente de separação de tamanho molecular como, por exemplo, Sefadex G-10, é preferivelmente usado para separar moléculas de peso molecular de menos de 700 das moléculas de polissacarídeo de peso molecular maior.

De preferência, o material nativo de matéria-prima de espécies de cúrcuma foi submetido a um ou mais processos preliminares de purificação como, por exemplo, sem limitação, os processos descritos na Etapa 1, 2 e 5, antes do contato do constituinte químico aquoso de polissacarídeo que contém extrato com o adsorvente de afinidade.

O uso de adsorventes de afinidade, como ensinado napresente invenção, resulta em constituintes químicos de polissacarídeo altamente purificados de espécies de cúrcuma que são acentuadamente de outros constituintes químicos que estão normalmente presentes em material natural de planta 5 ou em produtos comerciais de extração disponíveis. Por exemplo, os processos ensinados na presente invenção podem resultar em extratos de polissacarídeo purificados que contêm constituintes químicos totais de polissacarídeo em excesso de 90% por peso de massa seca.

Uma descrição generalizada da extração e purificaçãodos polissacarídeos do rizoma das espécies de cúrcuma com o uso de precipitação de etanol e glóbulos de resina adsorvente de afinidade é representada graficamente na Figura 6-Etapa 6. A matéria-prima [#450] para essa extração pode ser a solução concentrada do extrato aquoso contendo os polissacarídeos da etapa - Extração por lixiviação de água. o solvente [#270] usado para precipitação dos polissacarídeos da solução aquosa é etanol. A solução do sobrenadante concentrado [#450] é diluída por adição de etanol suficiente [#270] para gerar uma precipitação máxima [#500] dos polissacarídeos hidrossolúveis, insolúveis em etanol. A solução é filtrada [#510], centrifugada [#520] e decantada [#530] . O resíduo do sobrenadante [#550] é coletado e salvo para processamento posterior para extrair e purificar constituintes químicos da fração de turmerina de espécies de cúrcuma. o precipitado [#540] é coletado e o etanol e a água no precipitado são removidos por evaporação. A quantidade apropriada de glóbulos de resina adsorvente [#560] é limpa e hidratada para formar um caldo, e carregada em uma coluna. o extrato do precipitado depolissacarídeo é dissolvido em água para formar uma solução de 1% e carregado na coluna [#560] . 0 efluente [#600] é coletado, analisado quanto aos polissacarídeos, seco e salvo como produto polissacarídico. Um exemplo desse processo de extração é encontrado no Exemplo 7.

Etapa 7. Extração e purificação da fração de turmerina

Como aqui ensinado, um extrato da fração purificada de polipeptideo de turmerina de espécies de cúrcuma pode ser obtido por diluição do extrato do resíduo do sobrenadante da solução aquosa de etanol da Etapa 6 com uma solução salina tamponada com fosfato, e o contato dessa solução diluída do extrato com um adsorvente de afinidade sólido de separação de tamanho, seguido por coleta do efluente e contato do efluente com uma coluna de resina de troca catiônica de modo a remover impurezas de peso molecular menor do que a turmerina e impurezas que trocam Ions com a coluna de resina de troca catiônica, respectivamente. 0 efluente é coletado e salvo como produto por métodos aqui ensinados. As substâncias químicas ligadas (impurezas) são subseqüentemente eluídas de cada um dos adsorventes, levando à regeneração da resina de troca iônica.

Embora possam ser usados diversos adsorventes para purificar a fração do constituinte químico de turmerina, prefere-se utilizar Sefadex G-10 como o adsorvente de separação de tamanho para a adsorção de impurezas de peso molecular de 700 ou menos (o peso molecular da turmerina é de 5.000) e Dowex 50-WXZ-200, glóbulos de resina de troca catiônica fortemente ácida que possui grupos de troca de ácido sulfônico, como o adsorvente de troca catiônica.

De preferência, a matéria-prima de espécies de cúrcumafoi submetida a um ou mais processos preliminares de purificação como, por exemplo, sem limitação, os processos descritos na Etapa 1, 2, 5 e 6, antes do contato do extrato aquoso contendo turmerina com os glóbulos de resina adsorvente de afinidade.

O uso de adsorventes de afinidade, como ensinado na presente invenção, resulta na purificação significativa de turmerina do material de planta de espécies de cúrcuma, comparada com a concentração de turmerina normalmente presente no material natural de planta ou em produtos comerciais de extração disponíveis. Por exemplo, os processos ensinados na presente invenção podem resultar em um aumento na concentração de turmerina de cerca de 0,1% por peso de massa no rizoma natural de espécies de cúrcuma a cerca de 6,6% por peso de massa no produto final da fração de extração de turmerina, um aumento de 66 vezes na concentração em relação àquela encontrada tipicamente na matéria-prima natural de espécies de cúrcuma.

Uma descrição generalizada da extração e purificaçãoda fração de turmerina de extratos do rizoma de espécies decúrcuma com o uso de glóbulos de resina adsorvente de afinidade é representada graficamente na Figura 7-Etapa 7.

A matéria-prima [#550] para o primeiro processo de extração pode ser o resíduo da solução aquosa que contém o polipeptídeo turmerina da etapa 6 - Purificação de polissacarídeo. O solvente [#280] usado para diluir a solução de matéria-prima é solução salina tamponada com fosfato até uma concentração final de 1 mg/ml. A solução de matéria-prima diluída [#700] é carregada em uma coluna compactada com um leito de um caldo limpo e hidratado deglóbulos de Sefadex G-IO [#710] em uma taxa de fluxo de cerca de 0,5 volume de leito/hora. 0 efluente [#720] foi coletado e salvo para processamento posterior. Os glóbulos de resina foram eluídos, limpos e reciclados. 0 eluente [#730] foi descartado.

A matéria-prima [#720] para o segundo processo de extração pode ser a solução de efluente do primeiro processo de extração com o uso da coluna de resina de separação de tamanho. A solução de matéria-prima é carregada em uma coluna compactada com um leito de caldo de glóbulos de resina Dowex 50-WX2-200 limpos embebidos em 0,1 M HCl [#740]. Antes da carga da solução de matéria-prima, a coluna foi lavada com 3 volumes de leito de água destilada. A taxa de fluxo da carga de matéria-prima é de cerca de 3,4 volumes de leito/hora. 0 efluente [#800] foi coletado, analisado quanto ao teor de peptideo proteína, seco e salvo como o produto final da fração de turmerina. Os glóbulos de resina Dowex foram eluídos, limpos e reciclados. 0 eluente foi descartado. Um exemplo desse processo de extração é encontrado no Exemplo 8, e os resultados na Tabela 18.

Foi usada a análise de proteína Bradford para calcular a proteína total em cada amostra. No extrato aquoso bruto, havia 26,4% ([0,82/3,1] χ 100 = 24,4%) do teor de proteína da massa dissolvida, o que eqüivale a um rendimento total de proteína de 2,73% por peso de massa com base na matéria-prima original. Como ilustrado na Figura 8A, foi observado um pico de absorbância a 202 nm, consistente com o peptideo turmerina. Em contraste, embora o teor de proteína no precipitado de etanol 60% fosse de 2,2%, não foi observado pico de absorbância em torno de 202 nm (Figura 8B e C). Asolução restante após precipitação de etanol 60%, havia 10% de proteína na solução com um pico de absorbância em 2 02 nm (Figura 8C) . Após a remoção em coluna de Sefadex de impurezas de menos de 700 PM (turmerina possui um PM de 5.000), havia 3,7% de proteína por peso de massa na solução de efluente com preservação do pico de absorbância em 202 nm (Figura 8D) - solução de carga de Dowex) . A solução de carga para a coluna Dowex foi o efluente de Sefadex dissolvido em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4. O ponto isoelétrico da turmerina é 4,2 e, portanto, ela estará carregada positivamente caso o pH da solução seja menor do que seu ponto isoelétrico. Portanto, a turmerina estará carregada negativamente na solução de carga e não se ligará à coluna de troca catiônica de Dowex. Dessa forma, a turmerina estará no efluente da coluna Dowex, o que é confirmado pela alta absorbância em 202 nm (em função de ligações peptídicas) encontrada na solução de efluente (Figura 8D) . O produto da fração de turmerina do efluente de Dowex possui o equivalente a 0,04 g de albumina sérica bovina (BSA) , e um rendimento total de 0,12% por peso de massa com base na matéria-prima de espécie de cúrcuma original. No efluente da coluna Dowex ou na fração de turmerina, o teor de proteína foi de 6,6%, o que indica que a concentração de peptídeo turmerina é aumentada em cerca de 0,1% da concentração do material da matéria-prima bruta original até 6,6% da concentração por peso de massa seca, um aumento de 66 vezes na concentração em relação àquela encontrada na matéria-prima natural de espécies de cúrcuma.

Alimentos e medicamentos Como uma forma de alimentos da presente invenção, elespodem ser formulados para formas opcionais, por exemplo, um estado de grânulos, um estado de grãos, um estado pastoso, um estado de gel, um estado sólido ou um estado líquido. Nessas formas, vários tipos de substânciasconvencionalmente conhecidas por aqueles habilitados na técnica cuja adição aos alimentos é permitida, por exemplo, um ligante, um desintegrante, um espessante, um dispersante, um agente promotor de reabsorção, um agente flavorizante, um tampão, um tensoativo, um auxiliar de dissolução, um conservante, um emulsificante, um agente de isotonicidade, um estabilizante ou um controlador do pH etc. podem ser opcionalmente contidos. Uma quantidade do extrato de cúrcuma a ser adicionada aos alimentos não é especificamente limitada e, por exemplo, ela pode ser cerca de 10 mg a 5 g, preferivelmente 50 mg a 2 g por dia como uma quantidade ingerida por um adulto que pesa cerca de 60 kg.

Em particular, quando é utilizado como alimentos para a preservação da saúde, alimentos funcionais etc., prefere-se que contenha o ingrediente eficaz da presente invenção em uma quantidade tal que os efeitos predeterminados da presente invenção sejam suficientemente exibidos.

Os medicamentos da presente invenção podem ser opcionalmente preparados de acordo com os métodos convencionalmente conhecidos, por exemplo, como um agente sólido como, por exemplo, um comprimido, um grânulo, pó, uma cápsula etc., ou como um agente líquido como, por exemplo, uma injeção etc. A esses medicamentos, podem ser formulados quaisquer outros materiais geralmente usados, como, por exemplo, um ligante, um desintegrante, umespessante, um dispersante, um agente promotor de reabsorção, um agente flavorizante, um tampão, um tensoativo, um auxiliar de dissolução, um conservante, um emulsificante, um agente de isotonicidade, um estabilizante ou um controlador do pH.

Uma quantidade de administração do ingrediente eficaz (extrato de cúrcuma) nos medicamentos pode variar, dependendo do tipo, da forma do agente, da idade, do peso corporal ou de um sintoma a ser aplicado a um paciente, e semelhantes, por exemplo, quando ele for administrado oralmente, ele será administrado uma ou várias vezes por dia para um adulto que pesa cerca de 60 kg, e administrado em uma quantidade de cerca de 10 mg a 5 g, preferivelmente cerca de 50 mg a 2 g por dia. 0 ingrediente eficaz pode ser um ou vários componentes do extrato de cúrcuma. Sistemas de liberação

Modos de administração úteis para a liberação das extrações da presente invenção a um indivíduo incluem modos de administração normalmente conhecidos por aqueles habilitados na técnica como, por exemplo, pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros e inalantes.

Em uma modalidade, o modo de administração é um inalante que pode incluir formas de inalante de liberação temporizada ou de liberação controlada como, por exemplo, formulações lipossômicas. Um sistema de liberação desse tipo seria útil para o tratamento de um indivíduo para SARS, gripe dos pássaros, e semelhantes. Nessa modalidade, as formulações da presente invenção podem ser usadas em qualquer dispositivo de dispensa de dosagem adaptado paraadministração intranasal. O dispositivo deve ser construído tendo em vista a verificação da precisão e da compatibilidade de metrificação ideais de seus elementos úteis como, por exemplo, recipiente, válvula e acionador com a formulação nasal, e poderia ser baseado em um sistema de bomba mecânica, por exemplo, aquele de um nebulizador de dose metrificada, inalador de pó seco, inalador de névoa suave, ou um nebulizador. Em função da grande dose administrada, dispositivos preferidos incluem nebulizadores de jato (por exemplo, PART LC Star, AKITA) , inaladores de névoa suave (por exemplo, PARI e-Flow) e inaladores de pó seco que utilizam cápsulas (por exemplo, PH&T Turbospin) . Propelentes adequados podem ser selecionados entre gases tais como fluorcarbonos, hidrocarbonetos, nitrogênio e óxido de dinitrogênio ou misturas destes.

O dispositivo de liberação de inalação pode ser um nebulizador ou um inalador de dose metrificada (MDI), ou qualquer outro dispositivo de liberação de inalação adequado conhecido por aqueles habilitados na técnica. Odispositivo pode conter e ser usado para liberar uma doseúnica das formulações, ou o dispositivo pode conter e ser usado para liberar multidoses das extrações da presente invenção.

Um dispositivo de liberação de inalação do tipo nebulizador pode conter as extrações da presente invenção como uma solução, normalmente aquosa, ou uma suspensão. Na geração do spray nebulizado das extrações para inalação, o dispositivo de liberação do tipo nebulizador pode ser acionado por ultra-som, por ar comprimido, por outrosgases, eletronicamente ou mecanicamente. 0 dispositivonebulizador ultra-sônico normalmente trabalha por imposição de uma frente de onda rapidamente oscilante na película de líquido da formulação por meio de uma superfície eletromecânica vibrante. Em certa amplitude, a frente de 5 onda se torna instável e, dessa forma, desintegra a película de líquidos, e produz pequenas gotículas da formulação. O dispositivo nebulizador acionado por ar ou outros gases opera baseada no fato de que um jato de gás de alta pressão produz uma queda da pressão local que puxa a formulação líquida para dentro do jato de gases por meio de ação capilar. Esse jato líquido fino é então desintegrado por forças de cisalhamento. O nebulizador pode ter um design portátil e manual, e pode ser equipado com uma unidade elétrica nele contida. o dispositivo nebulizadorpode compreender um bocal que tem dois canais de saída coincidentes de tamanho de abertura definido através dos quais a formulação líquida pode ser acelerada. Isso causa um impacto dos dois jatos e a atomização da formulação. 0 nebulizador pode utilizar um acionador mecânico para forçara formulação líquida através de um bocal com váriosorifícios de tamanho(s) de abertura definido para produzir um aerossol da formulação para inalação. No design de nebulizadores de dose única, podem ser empregadas embalagens em blister contendo doses únicas da formulação.

Na presente invenção, o nebulizador pode ser empregadopara assegurar que o dimensionamento de partículas seja o ideal para o posicionamento da partícula dentro, por exemplo, da membrana pulmonar.

Um inalador de dose metrificada (MDI) pode serempregado como o dispositivo de liberação de inalação paraas extrações da presente invenção. Esse dispositivo é pressurizado (pMDI) e sua estrutura básica compreende uma válvula de metrificação, um acionador e um recipiente. Um propelente é usado para descarregar a formulação do dispositivo. A extração pode consistir em partículas de um tamanho definido suspensas no(s) líquido(s) propelente(s) pressurizado(s), ou a extração pode estar em uma solução ou suspensão de propelente(s) líquido(s) pressurizado(s). Os propelentes usados são primariamente hidroflourcarbonos que não agridem a atmosfera (HFCs) como, por exemplo, 134a e 227. Clorofluorcarbonos tradicionais como CFC-11, 12 e 114 são usados somente quando essenciais. O dispositivo do sistema de inalação pode liberar uma dose única por meio, por exemplo, de um pacote em blister, ou ele pode ter um design multidoses. O inalador pressurizado de dose metrificada do sistema de inalação pode ser acionado pela respiração para liberar uma dose precisa da formulação que contém lipídeo. Para assegurar a precisão da dosagem, a liberação da formulação pode ser programada por meio de um microprocessador para que ocorra em certo ponto no ciclo de inalação. O MDI pode ser portátil e manual.

Em outra modalidade, o sistema de liberação pode ser um sistema de liberação transdérmica como, por exemplo, um hidrogel, um creme, loção, pomada ou emplastro. Um emplastro em particular pode ser usado quando se deseja uma liberação com intervalos de semanas ou até mesmo meses.

Em outra modalidade, podem ser usadas vias parenterais de administração. Vias parenterais envolvem injeções em vários compartimentos do corpo. As vias parenterais incluem a via intravenosa (iv), ou seja, administração diretamenteno sistema vascular através de uma veia; a via intra-arterial (ia), ou seja, administração diretamente no sistema vascular através de uma artéria; a via intraperitoneal (ip), ou seja, administração na cavidade abdominal; a via subcutânea (sc), ou seja, administração sob a pele; a via intramuscular (im) , ou seja, administração em um músculo; e a via intradérmica (id) , ou seja, administração entre camadas da pele. Algumas vezes prefere-se a via parenteral em relação àquelas orais, quando parte da formulação administrada seria parcial ou totalmente degradada no trato gastrointestinal. Similarmente, quando for necessária uma resposta rápida em casos de emergência, a administração parenteral será normalmente preferida em relação à oral.

Métodos de tratamento

Os métodos da presente invenção compreendem o fornecimento de novas extrações de cúrcuma para o tratamento e a prevenção de distúrbios humanos. Por exemplo, uma nova extração de espécies de cúrcuma para o tratamento de alergias, artrite, reumatismo, doençacardiovascular, hipercolesterolemia, agregação plaquetária, doença cerebrovascular, asma, doença pulmonar crônica, fibrose cística, cicatrização de feridas, doença de Alzheimer e de Parkinson, esclerose múltipla, úlcerapéptica, câncer, HIV/AIDS, infecções bacterianas e fúngicas podem ter uma concentração aumentada da fração de óleo essencial, uma concentração aumentada da fração de cúrcuma e uma concentração aumentada da fração de polissacarídeo em peso % do que aquelas encontradas no material de planta nativo de espécies de cúrcuma ou em produtosconvencionalmente conhecidos.

Um método preferido de tratamento inclui métodos de tratamento de artrite que compreendem a administração a um indivíduo em necessidade destes de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma extração de cúrcuma da presente invenção. Em uma modalidade particularmente preferida, a extração de cúrcuma também compreende uma quantidade sinérgica de extratos de espécies de Boswellia obtidos de forma similar, em particular os componentes de Boswellia ácido a- e/ou β-boswélico e/ou seus C-acetatos. Métodos de extração de espécies de Boswellia são totalmente descritos no pedido provisório de patente depositado pelos inventores em 21 de setembro de 2006, e é aqui incorporado em sua totalidade. O sinergismo refere-se ao efeito aumentado que os extratos de cúrcuma e boswellia combinados possuem sobre a artrite, comparado com o efeito que cada extrato possui individualmente.

A descrição apresentada anteriormente inclui o melhor modo de realização da invenção atualmente contemplado. Essa descrição tem a finalidade de ilustrar os princípios gerais das especificações, e não deve ser considerada em um sentido limitante. Essa especificação é ainda ilustrada pelos exemplos a seguir, que não devem ser considerados, de forma alguma, como imposição de limitações ao escopo desta. Pelo contrário, deve-se entender claramente que podem ser utilizadas várias outras modalidades, modificações e equivalentes destas, as quais, após leitura da descrição aqui apresentada, podem, elas mesmas, ser sugeridas por aqueles habilitados na técnica, sem se afastar do espírito da presente invenção.Todos os termos aqui utilizados devem ser interpretados no seu sentido normalmente aceito por aqueles habilitados na técnica. Todas as patentes e pedidos de patentes ou referências aqui citados são incorporados por referência em suas totalidades. Exemplificação Materiais e métodos

Matéria-prima de cúrcuma

Foram usadas duas raízes moídas de turmérica de fontes diferentes para o estudo atual. 0 extrato de turmérica (Lote #: CL/02 005) foi adquirido de Suan Farma Inc. Os resultados da análise do componente ativo são mostrados na Tabela 7.

Tabela 7. Informação da matéria-prima para raiz e extrato de turmérica usada nesse estudo

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Observação: 1: a concentração de óleo essencial foi medida por extração exaurida de hexano por 14 horas. 0 rendimento total como 7,24% e o curcuminóide foi de 0,6%, portanto, o óleo essencial foi de 7,24-0,6 = 5,96%. 2.

Informações fornecidas pelo vendedor com data de setembrode 2000.

Padrões de referência e solventes orgânicos

Os padrões de curcuminóide foram adquiridos de ChromaDex, Inc. 2952 S. Daimler St. Santa Ana CA 92705 Tel: 5 949, 419, 0288, Fax: 949, 419, 0294, www.chromadex.com, e suas propriedades são listadas na Tabela 8.

Tabela 8. Propriedades físicas do padrão de curcuminóide.

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Todos os solventes foram obtidos de E. Merck. Aspropriedades estão listadas na Tabela 9.

Tabela 9. Propriedade física do solvente orgânicoconsiderado.

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A resina de troca catiônica Dowex 50WX2-200 (H) foiadquirida de Sigma-Aldrich, Co. Ela é uma forte resina de troca catiônica ácida com 2% de entrecruzamento; forma de íon hidrogênio, trama de 100-200.

Sefadex G-10 (diâmetro do glóbulo seco aproximado de 40-120 μm) foi adquirida de sigma- Aldrich, Co. Sefadex é um gel em glóbulos preparado por entrecruzamento de dextrana com epicloridrina. Sua principal aplicação é separação de grupos de moléculas de peso molecular baixo e alto. G-10 é usada para separar peso molecular < 700.

Métodos analíticos

Caracterização e quantificação de óleo essencial:

A composição química do óleo essencial de turmérica foi determinada com um sistema de GC-MS HP série 5890 equipado com a coluna fundida de sílica (5% de fenilpoli (dimetilsiloxana) XTI-5, 30 m χ 0,25 mm i.d. e 0,25 μπι de espessura de película, Restek) . A energia de ionização de elétrons foi de 7 0 eV. 0 gás transportador foi hélio (1,7 ml/min) e foi injetado 1 μΐ de amostra. A temperatura de injeção foi de 240°C, e a do detector foi de 230°C. A programação de temperatura foi BO0C por 5 min, aumento até 180°C a 4°C/min e até 280°C a 15°C/min, e mantida em 280°C por 19 min. A identificação de compostos foi realizada por comparação de seus espectros de massa com os dados do "US National Institute of standards and technology" (NIST, EUA) e espectros WILEY de uma biblioteca de massa.

Caracterização e quantificação de curcuminóides.

A análise por HPLC foi realizada com um sistema Shimadzu LC-10AVP que inclui uma bomba LC-IOADVP, um detector de arranjo de fotodiodo SPD-M10AVP, umacontroladora SCL-10ADVP e um forno de coluna CTO-IOACVP usando uma coluna Júpiter (250 mm H, 4,6 mm I.D., 5 pm C18 300 Á). A eluição foi realizada com sistemas de gradiente com uma taxa de fluxo de 1 ml/min a 3 O0C. A fase móvel consistiu em ácido acético 2% (A), acetonitrila (B) e metanol (C). Os níveis quantitativos de curcuminóides foram determinados com o uso dos solventes acima programados linearmente de acetonitrila 30-36% em A por 0-30 min. 0 gradiente foi então de 3 % a 95% de acetonitrila em A por 30-45 min, com uma constante de 5% C. A linearidade do método foi avaliada por análise de uma série de curcuminóides-padrão. Vinte μΐ de cada uma das cinco soluções de trabalho padronizadas contendo 0,06-2 pg de curcumina-, desmetoxicurcumina- e bisdesmetoxicurcumina-padrão foram injetados em HPLC. As curvas-padrão de calibração foram obtidas por tabulação da concentração de curcuminóides-padrão versus área de pico (média de três execuções). A faixa de calibração foi escolhida para refletir as concentrações normais de curcuminóide em amostras de turmérica.

Caracterização e quantificação de polissacarídeos Foram usados testes colorimétricos para caracterizar polissacarideo em espécies de cúrcuma. Os reagentes usados para o teste são ácido sulfúrico 95,5% (em conformidade com a especificação do ACS, gravidade específica de 1,84) e solução de fenol 5%, preparada por adição de 2 g de água destilada a 38 g de fenol de grau reagente. Essa mistura forma um líquido esbranquiçado que é facilmente pipetado. Dextrana (produto Fluka) com peso molecular de 5.220, 48.600 e 409.800 foi usada como padrão.Dois ml de solução de açúcar foram pipetados em um tubo colorimétrico, e 1 ml de fenol 5% é adicionado. A seguir, 5 ml de ácido sulfúrico concentrado são adicionados rapidamente, o jato de ácido sendo dirigido contra a superfície do líquido, e não contra a lateral do tudo de teste a fim de obter uma boa mistura. Deixam-se os tubos em repouso por 10 minutos. A cor é estável por várias horas, e as leituras podem ser feitas mais tarde, se necessário. A absorbância da cor amarelo-alaranjada característica é medida a 488 nm. Os brancos são preparados por substituição da água destilada pela solução de açúcar. A quantidade de açúcar pode então ser determinada por referência a uma curva-padrão construída para dextrana. Todas as soluções são preparadas em triplicata para minimizar erros resultantes de contaminação acidental. A fim de testar o método, os experimentos foram repetidos em dias diferentes. Em todos os casos, as variações entre experimentos eram de, no máximo, 0,01 a 0,02 unidade em absorbância, que era a mesma ordem de magnitude que a variação entre as amostras em triplicata.

Espectrometria de massa por análise direta em tempo real (DART) para análise de polissacarídeo.

Todos os cromatogramas de DART foram executados usando os instrumentos e métodos descritos abaixo.

Instrumentos: espectrômetro de massa de tempo de vôoAccuTOF DART LC JOEL (Joel USA, Inc., Peabody, Massachusetts, EUA). Essa tecnologia de espectrômetro de massa de tempo de vôo (TOF) não exige nenhuma preparação da amostra e gera massas com precisões de até 0,00001 unidade de massa.Métodos: os ajustes do instrumento utilizados para capturar e analisar a fração de polissacarídeos são os seguintes: para o modo catiônico, a voltagem da agulha de DART é de 3.000 V, elemento de aquecimento a 250°C, Eletrodo 1 a 100 V, Eletrodo 2 a 250 V, e fluxo de gás hélio de 7,45 litros/minuto (l/min). Para o espectrômetro de massa, o orifício 1 é 10 V, lente do anel é 5 V e o orifício 2 é 3 V. A voltagem dos picos é ajustada para 600 V a fim de gerar poder de resolução começando em aproximadamente 60 m/z, embora ainda permita resolução suficiente em faixas de massa maiores. A voltagem do detector de microcanal de placa (MCP) é ajustada em 2.450 V. As calibrações são realizadas a cada manhã, antes da introdução de amostra usando um padrão de solução 0,5 M de cafeína (Sigma-Alrich Co., St. Louis, EUA). As tolerâncias da calibração são mantidas < 5 mmu.

As amostras são introduzidas no plasma de hélio de DART com pinças estéreis, assegurando que uma área de superfície máxima da amostra seja exposta ao feixe de plasma de hélio. Para introduzir a amostra no feixe, é empregado um movimento de varredura. Esse movimento permite que a amostra seja exposta repetidamente para frente e para trás por aproximadamente 0,5 seg/varredura, e evita a pirólise da amostra. Esse movimento é repetido até que seja observado um sinal de Corrente Iônica Total (TIC) no detector, e então a amostra é removida, permitindo a normalização basal/de fundo.

Para o modo aniônico, DART e AccuTOF MS são mudados para o modo íon negativo. A voltagem da agulha é de 3.000 30 V, elemento de aquecimento 250°C, Eletrodo 1 a 100 V,Eletrodo 2 a 250 V e fluxo de gás hélio a 7,45 l/min. Para o espectrômetro de massa, o orifício 1 é —20 V, a lente em anel é de -13 V e o orifício 2 é de —5 V. A voltagem do pico é de 200 V. A voltagem de MCP é ajustada a 2.450 V. As amostras são introduzidas exatamente da mesma forma que no modo catiônico. Toda a análise de dados é realizada com a utilização do software MassCenterMain Suite fornecido com o instrumento.

Ensaio de absorbância:

A proteína em solução absorve luz ultravioleta comabsorbância máxima a 280 e 200 nm. Peptídeos ligados são primariamente responsáveis pela absorbância a 200 m. o espectrofotômetro Shimadzu série 1700 foi usado na pesquisa atual. O procedimento inclui as seguintes etapas:

- aquecimento da lâmpada UV por 15 minutos;

calibrar até absorbância zero apenas com solução salina com tampão fosfato;

- varrer a solução da amostra de 190 a 300 nm;

encontrar o comprimento de onda de absorbância máxima.

Ensaio de proteína de Bradford:

O ensaio de Bradford pode ser usado para determinar a concentração de proteínas em solução. 0 procedimento se baseia na formação de um complexo entre o corante, AzulBrilhante G e as proteínas em solução. 0 complexo proteína -corante produz uma mudança na absorção máxima do corante de 465 para 595 nm. A quantidade de absorção é proporcional à proteína presente.

Reagente:

O reagente de Bradfrod (produto Sigma, B6919) consisteera Azul Brilhante G 0,004%, ácido fosfórico 10% e metanol 4%.

Solução salina tamponada com fosfato (PH = 7,4) (produto Sigma, P3813) consiste em cloreto de sódio 83,8%, 12% fosfato dissódico de hidrogênio anidro, potássio fosfato monobásico 2% e cloreto de potássio 2%.

Albumina sérica bovina (BSA) tamponada com solução salina-fosfato, PH = 7,4: produto Sigma, P3688.

Procedimento:

Preparar seis soluções-padrão contendo 0, 200, 400,600, 800 e 1.000 pg de BSA. Ajustar o espectrof otômetro para coletar os espectros sobre uma faixa de comprimento de onda de 400 a 700 nm e sobre uma faixa de absorbância de 0-2 unidades de absorbância. Usar uma cubeta de quartzo de 4 ml preenchida com água destilada para zerar o espectrofotômetro sobre essa faixa de comprimento de onda. Registrar o espectro de absorbância de 400-700 nm e anotar a absorbância a 595 nm. Repetir as etapas acima para cada um dos padrões de proteína e para as amostras a serem testadas. Examinar o espectro dos padrões e das amostras. Caso qualquer espectro tenha uma absorbância a 595 nm maior do que 2, ou caso qualquer amostra tenha uma absorbância maior do que a maior absorbância para qualquer um dos padrões, diluir a amostra por uma quantidade conhecida e repetir o ensaio. Em um comprimento de onda em torno de 575 nm, todos os espectros devem ter a mesma absorbância (uma interseção desse tipo é denominada um ponto isosbéstico e é uma característica definitiva das soluções que contêm a mesma concentração total de uma espécie absorvente com duas formas possíveis). Caso qualquer espectro não intersecte osoutros espectros no ponto isosbéstico ou próximo a ele, ele deverá ser ajustado ou rejeitado e repetido.

Preparar um gráfico de absorbância a 595 nm vs concentração de BSA. Para determinar a concentração de proteína de uma amostra a partir de sua absorbância, usar a curva-padrão para encontrar a concentração de padrão que teria a mesma absorbância que a amostra.

Ensaio de tioflavina T

A presença de fibras AB1-42 foi monitorada por fluorescência de tioflavina T. Amostras de 15 μm em triplicata de Αβι-42 [50 μΜ em tampão de 50 mM Tris-HCl (pH 7,4)] foram removidas após incubação da solução de peptídeo por vários períodos de tempo a 37°C na presença ou ausência de um extrato de cúrcuma da presente invenção ou de composto de controle em diferentes doses. Cada uma dessas amostras foi adicionada a 2 ml de 10 μΜ tioflavina T (Sigma) em 50 mM glicina/NaOH (pH 9,0), antes de a mudança da característica na fluorescência ter sido monitorada (excitação a 450 nm e emissão a 482 nm) após ligação de tioflavina T ás fibras amilóides. As amostras em triplicata foram rastreadas três vezes antes e imediatamente após a adição de peptídeo. Os resultados mostram o valor médio das amostras em triplicata + a diferença entre aqueles valores médios.

ELISA de Αβχ.40,42

Os meios condicionados foram coletados e analisados em uma diluição 1:1 usando o método como descrito previamente (Tan e cols., 2002), e os valores foram registrados como percentagem de Αβι_χ secretada em relação ao controle. A quantificação de espécies totais de Αβ foi realizada deacordo com métodos publicados (Marambaud e cols. , 2005; Obregon e cols., 2006). Resumidamente, 6E10 (anticorpo de captura) foi revestido a 2 μ9/πι1 em PBS em placas de imunoensaio de 96 poços de um dia para o outro a 4°C. As 5 placas foram lavadas com Tween 0,05% em PBS cinco vezes e bloqueadas com tampão de bloqueio (PBS com BSA 1%, soro de cavalo 5%) por 2 horas em temperatura ambiente. Meio condicionado ou padrões de Αβ foram adicionados às placas e incubados de um dia para o outro a 4°C. Após 3 lavagens,

anticorpo biotinilado, 4G8 (0,5 μg/ml em PBS com BSA 1%) foi adicionado às placas e incubado por 2 horas em temperatura ambiente. Após 5 lavagens, estreptavidina-peroxidase de raiz-forte (diluições 1:200 em PBS com BSA 1%) foi adicionada aos 96 poços por 30 minutos emtemperatura ambiente. Substrato de tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionado às placas e incubado por 15 minutos em temperatura ambiente. Cinqüenta μΐ de solução de interrupção (2 N de N2SO4) foram adicionados a cada poço das placas. A densidade óptica de cada poço foiimediatamente determinada por uma leitora de microplacas a450 nm. Os níveis de Αβ foram expressos como uma percentagem de controle (meio condicionado de células N2a SweAPP não tratadas).

Exemplo 1

Exemplo de Extração de SCCO2 em uma única etapa

A extração foi realizada usando uma Plataforma de Processamento SFT-250 SFT/SFR, Supercritical Fluid Technologies, Inc., Newark, Delaware. A fração de óleo essencial de espécies de cúrcuma foi extraída com SCCO2 emum processo de extração de fluxo semicontínuo. Dióxido decarbono líquido de um cilindro de armazenamento foi passado através de um banho de resfriamento e depois foi comprimido até a pressão de operação por uma bomba Haskel acionada por ar. O dióxido de carbono comprimido fluiu para dentro de um vaso de extração de 100 ml contendo 30 g de pó moído de rizoma de espécies de cúrcuma (trama 20) até um ponto no qual não se observava soluto na saída do vaso de extração. O vaso de extração contendo o material de planta bruto a ser extraído estava em um forno controlado por termostato.

A temperatura dentro do vaso de extração era controlada com um controlador digital com uma precisão de +/- 0,1°C. A taxa de fluxo do dióxido de carbono foi de 10 l/min (19 g/min). O volume de dióxido de carbono consumido foi calculado com taxa de fluxo e tempo de execução. Os produtos de extração foram coletados em 5 frações para cada execução em intervalos de tempo definidos em uma ampola de vidro de 6 5 mm de altura e 24 mm de diâmetro, e pesados de forma gravimétrica para a obtenção de curvas de extração. Os experimentos foram executados em uma pressão de 3OMPa e uma temperatura de 40°C. A quantidade de material solúvel de dióxido de carbono extraído foi calculada como a proporção de peso de massa total do extrato e o peso de massa total do material de matéria-prima natural. Os produtos de extração foram dissolvidos em hexano para análise de cromatografia a gás-epectroscopia de massa (GC-MS) . Os resultados são mostrados nas Tabelas 2 e 6. Houve um alto rendimento total de 4,2% por peso de massa com base no peso da matéria-prima de cúrcuma original e a alta concentração das três turmeronas principais, ar-turmerona, β-turmerona e α-turmerona, que constituem 76,5% da fraçãode óleo essencial por % de peso de massa. A pureza dos constituintes químicos do óleo essencial foi maior que 99%. O procedimento acima foi executado várias vezes com temperaturas e pressões variáveis. As frações dessas execuções foram coletadas e analisadas por espectrometria de massa DART e aparecem nas Figuras 63-78.

Exemplo 2

Exemplo de Extração e fracionamento de SCCO2

A extração e o fracionamento de SCCO2 das matérias-10 primas de espécies de cúrcuma foram realizados com o uso de um sistema proprietário de extração e de fracionamento de líquido supercrítico, como descrito previamente. Foram introduzidos 2.000 g do rizoma moído de espécies de matéria-prima de cúrcuma no vaso de extração de 24 litros. A temperatura de extração e a pressão foram ajustadas, e a alimentação de dióxido de carbono foi iniciada. Permitiu-se que o CO2 comprimido fluísse para cima através de um leito montado verticalmente, e o óleo essencial e outros constituintes químicos lipofílicos, incluindo os curcuminóides, foram extraídos. A solução saía do vaso do extrator através de uma válvula de redução de pressão e fluía para dentro do primeiro separador, onde o dióxido de carbono era evaporado e reciclado. A precipitação dos extratos em estágios foi obtida por liberação da pressão do solvente e diminuição da temperatura em três estágios usando os três separadores de fracionamento em série. Os Separadores 1 e 3 foram usados para fracionamento. 0 produto de extração pesado (fração de curcuminóide) precipitado no vaso de coleta do separador 1 em uma pressão 30 mais elevada, o produto leve (óleo essencial) foirecuperado no separador 3 em uma pressão menor. 0 peso total de CO2 consumido e a taxa de fluxo do líquido foram medidos pelo medidor de fluxo de massa e pelo tempo de fluxo. A pressão foi ajustada por uma válvula automática de pressão retrógrada com uma precisão de +/- 0,3MPa no vaso do extrator e de +/- 0,1 MPa nos vasos do separador. A temperatura foi ajustada com termostatos, com uma precisão de +/- 1°C. A temperatura e a pressão de extração foram as seguintes: 700C e 4 5MPa para o vaso de extração; 650C e 17MPa para o Separador 1; 59°C e 13MPa para o Separador 2; e 28°C e 6MPa para o Separador 3. As condições de extração de SCCO2 e os rendimentos (% do peso de massa com base na matéria-prima) estão documentados na Tabela 8.

0 óleo essencial foi coletado no Separador 3. Os resultados analíticos de GC-MS são mostrados nas Tabelas 6 e 7. Com a utilização das condições de SCCO2 acima para separação fracionária, 95,5% do óleo essencial na matéria-prima podem ser extraídos em 30 minutos de tempo de extração. Nessa fração altamente purificada (>99%) de óleo essencial, três constituintes químicos, ar-turmerona, a-turmerona e β-turmerona, compunham 73,6% por peso de massa. Tabela 10. % da área de pico de extratos de óleo essencial de turmérica para diferentes solventes.

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Tabela 11. Rendimento total, distribuição de três turmeronas expressa por percentagem do pico.

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Tabela 12. Condições de execução e rendimento doexperimento de extração/f racionamento de SCCO2. 0 rendimento foi calculado por extratos/matéria-prima

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Uma fração altamente purificada (81,3%) decurcuminóide foi coletada no Separador 1 no exemplo 5 experimental acima (o rendimento no Separador 2 foi apenas0.02%, sem nenhuma quantidade significante de constituinte químico de óleo essencial ou de curcuminóide estando presente e, portanto, foi descartada). orendimento total foi de 1,80% do peso de massa com base na matéria-prima,com uma concentração de 81,3% dos curcuminóides. 0 rendimento dos curcuminóides foi de 22% do peso de massa com base na matéria-prima. No entanto, permaneceram 78% dos curcuminóides (5,42% de peso de massa) restando no resíduo de SCCO2, que foi utilizado na Etapa 2 abaixo. Os 15 resultados analíticos de HPLC da fração extraída de curcuminóide do Separador 1 estão documentados na Tabela 13 .

Tabela 13. Fração de extração de curcuminóide do Separador 1.

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Cur = curcuminóides;C = curcuraina;

DMC = desmetoxicurcumina;

BDMC = bisdesmetoxicurcumina.

Exemplo 3

Exemplo de extração da Etapa 2

Quatrocentos g do resíduo de SFE da Etapa 1 foram carregados com etanol 95% em um vaso de extração e misturados por 5 horas a 75°C. A mistura foi então interrompida e a solução foi deixada em repouso por 16 horas. A camada superior foi decantada e filtrada 2 vezes com papel de filtro Fisherbrand P4 com tamanho de retenção de partícula de 4-8, e centrifugada a 3.000 rpm. 0 sobrenadante enriquecido em curcuminóide foi evaporado e seco em um forno a vácuo a 50°C até uma massa, ou seco por vaporização em um pó seco pulverizãvel. Esse produto de extração seco foi então usado para processamento posterior (Etapa 3) . A análise e os dados de HPLC são mostrados na Tabela 14. O rendimento total do processo de lixiviação foi de 4,52% do peso, com base na matéria-prima de cúrcuma original, com uma pureza de curcuminóide de 37,8%. A distribuição de curcuminóide ou perfil por % do peso de massa dos curcuminóides foi de 35,1% de curcumina, 39,0% de bisdesmetoxicurcumina e 25,9% de desmetoxicurcumina. Esse processo de extração foi capaz de extrair 83,3% dos5 constituintes químicos de curcuminóide na matéria-prima doresíduo de SFE com um rendimento total de 11,9% do peso de massa com base na matéria-prima original de espécie de cúrcuma nativa. O resíduo sólido (camada do fundo) foi salvo para processamento posterior para a obtenção defrações purificadas de peptídeos de proteínas de cúrcuma epolissacarídeos de cúrcuma (Etapas 5, 6 e 7). Tabela 14. Rendimento do processo de lixiviação e pureza de curcuminóide nos extratos por utilização do resíduo de SFE da Etapa 1 como matéria-prima.

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Exemplo 4

Exemplo de purificação por SCCO2 do produto de lixiviaçãode etanol

Uma porção de 300 g do produto de extração do processo de lixiviação de etanol enriquecido em curcuminóide foi misturada com 2.000 g de glóbulos de vidro (O.D. = 80 mm) e depois carregada no vaso de extração de 24 litros por SFE. Após a temperatura e a pressão de extração serem ajustadas, foi iniciado o fluxo de dióxido de carbono. Permitiu-se que o CO2 comprimido fluísse para cima através do leito montado verticalmente no vaso de extração. As substâncias lipofílicas, tais como os curcuminóides, foram extraídas. A solução sai do vaso de extração por meio de uma válvula de redução de pressão e flui para dentro do Separador 1, onde o CO2 era evaporado para reciclagem. A precipitação em estágios da solução do extrato foi obtida por liberação dapressão e temperatura do solvente em três estágios com a utilização dos três separadores em série. Após redução da pressão e da temperatura no Separador 1, o produto pesado que contém os curcuminóides se precipitou no Separador 1.

Produtos mais leves formados por constituintes químicos lipofílicos que eram essencialmente livres de curcuminóides na análise por HPLC foram recuperados nos Separadores 2 e 3, e foram descartados. A taxa de fluxo do líquido foi medida para ser de 3,5 kg/min com o uso de medidor de fluxo de massa. 0 tempo de execução total foi de 120 minutos, e a proporção de solvente/alimentação foi de 426. As condições para o vaso de extração foram uma pressão de 4 OMPa e uma temperatura de 90°C. As pressões e temperaturas para os Separadores foram ajustadas da seguinte forma: Separador 1-17MPa, 63°C; Separador 2-13MPa. 65°C; e Separador 3-6MPa, 28°C. Os resultados do produto de extração do Separador 1 são mostrados na Tabela 15. A fim de purificar e definir ainda mais o perfil dos constituintes químicos de curcuminóide dessa extração, foi necessária uma etapa adicional de extração e fracionamento de SCCO2 (Etapa 4).

Tabela 15. Rendimento do processo de SCCO2 (Etapa 3) e pureza de curcuminóide no produto de extração com o uso da extração por lixiviação de etanol da Etapa 2 do resíduo de SFE da Etapa 1 como matéria-prima.

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Exemplo 5

Exemplo de purificação e definição do perfil do produto de extração de curcuminôide da Etapa 3

Dez g do produto de extração da Etapa 3 foram misturados com 40 ml (45 g) de glóbulos de vidro (diâmetro = 4 mm) e depois carregados em um vaso de extração de 1 litro de um sistema de fracionamento por SFE proprietário projetado por HerbalScience de escala laboratorial de 1 litro modelado no sistema de escala de produção de 24 litros. Após depuração e testes em busca de vazamentos, o vaso de extração foi levado até uma pressão de 410,3MPa e uma temperatura de 90°C. Foram usados dois separadores para o fracionamento. A temperatura e a pressão do Separador 1 foram ajustadas em 65°C e 17MPa, e a temperatura e a pressão do Separador 2 foram ajustadas em 65°C e 13MPa. Após o sistema ter alcançado o equilíbrio nas condições definidas, inicia-se o fluxo de dióxido de carbono em uma taxa de fluxo de 40l/min do fundo para cima de um leito de matéria-prima montado verticalmente no vaso de extração. 0 tempo de fluxo total de dióxido de carbono foi de 120 minutos, com uma proporção de solvente para alimentação de 705. As frações extraídas em cada um dos Separadores foram analisadas usando HPLC para identificação dos constituintes químicos de curcuminôide e cálculos da pureza desses componentes. Os resultados são mostrados na Tabela 16.

Tabela 16. Purificação por SCCO2 e definição do perfil do produto de extração da Etapa 3.

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Exemplo de purificação e definição do perfil de um produtode extração enriquecido em curcuminóide

Em outro exemplo de purificação e definição do perfil fracionário dos curcuminóides, um produto de extração de curcuminóide altamente concentrado (Lote #: CL02005) adquirido de Suan Farma, Inc. foi usado como matéria-prima. Nesse extrato de matéria-prima, a concentração total de curcuminóide foi de 91,14% por peso de massa, com a seguinte distribuição de curcuminóide: curcumina (C) 68,22%; desmetoxicurcumina (DMC) 9,63%; ebisdesmetoxicurcumina (BDMC) 4,81%. Trezentos g desse produto de extração misturados com 1.200 g de glóbulos de vidro (O.D. = 1 cm) foram carregados no vaso de extração de 24 litros. As temperaturas e pressões da extração foram ajustadas e, a seguir, a alimentação de dióxido de carbono foi iniciada. Permitiu-se que o dióxido de carbono comprimido fluísse para cima através de um leito montadoverticalmente de matéria-prima no vaso de extração, e os constituintes químicos lipofílicos, incluindo os curcuminóides, foram extraídos. A cada 30 minutos, 1,38 litro de co-solvente etanol era adicionado do fundo do vaso do extrator com o uso de uma bomba de líquido de alta pressão, e deixado em repouso por 5 minutos, antes de iniciar o fluxo dinâmico de CO2. A solução de extração deixava o vaso de extração por meio de uma válvula de redução de pressão e fluía para o Separador 1, onde o dióxido de carbono era evaporado para reciclagem. A precipitação em estágios do extrato foi obtida por redução da pressão e da temperatura em três estágios usando os três Separadores em série. Após redução da pressão, os constituintes químicos mais pesados precipitaram para dentro do Separador 1 e os constituintes químicos mais leves nos Separadores 2 e 3. 0 peso total de dióxido de carbono consumido foi medido pelo medidor de fluxo de massa e tempo de fluxo. A pressão foi ajustada por uma válvula automática de pressão retrógrada com uma precisão de +/- 0,3MPa para o vaso de extração e de +/- 0,1 MPa para os vasos do Separador. As temperaturas foram ajustadas com o uso de termostatos com uma precisão de +/- 1°C. A taxa de fluxo do líquido foi medida com o uso de um medidor de fluxo de massa. 0 tempo de processamento foi de 2 horas com uma taxa de fluxo de CO2 de 3,5 kg/min. Foi usado um volume de 5,5 litros de etanol absoluto como co-solvente. 0 co-solvente de etanol foi separado por fase do CO2 no Separador 3, e era expulso do sistema a cada 30 minutos para evitar o acúmulo de etanol no sistema. 0 etanol foi reciclado por meio de destilação. Os resultados desseexemplo de extração são mostrados nas Tabelas 17 & 18. Tabela 17. Condições e rendimento da extração/fracionamento de SCCO2 para matéria-prima de Suan Farma

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Tabela 18. Produto de extração por extração/definição do 5 perfil de SCCO2 do Separador 1 para matéria-prima de SuanFarma.

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* peso de massa do rendimento / peso de massa da matéria-prima .

** peso de massa de curcumina / peso de massa do 10 rendimento.

Exemplo 6

Exemplo de lixiviação de água do resíduo da Etapa 2

Trinta g de resíduo de extração de etanol de cúrcuma (Etapa 2) foram carregados em um frasco aberto por 3 horas a 90 °C com 20 volumes de água destilada com agitação magnética constante. 0 caldo foi centrifugado por 15 minutos a 3.000 rpm. o sobrenadante foi coletado. o rendimento total do peso de massa seco foi de 9,9% com basena matéria-prima original. Foi usada evaporação rotatória para evaporar a água e concentrar o extrato por cerca de 60%. O resíduo sólido foi descartado. Os resultados analíticos estão listados como "bruto" na Tabela 19.

Tabela 19. Rendimento de extratos aquosos de espéciesde cúrcuma precipitados por etanol e análise de polissacarídeo.

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Exemplo 7

Exemplo de fração e purificação de polissacarídeo da Etapa 10 6.

A solução do sobrenadante concentrado da etapa 5 foi diluída por adição de etanol suficiente para gerar uma solução de concentração final de etanol 60%/água. Isso resulta na precipitação dos polissacarídeos hidrossolúveis, insolúveis em etanol. A solução foi então centrifugada a 3.000 rpm por 15 minutos e depois decantada do precipitado. A solução do resíduo foi salva para processamento posterior para se obter uma fração purificada de turmerina (peptídeo) (Etapa 7). O rendimento do precipitado foi de 6,4% do peso de massa, com base na matéria-prima de espécie de cúrcuma original. O etanol e a água restantes no precipitado foramremovidos com o uso de evaporação rotatória. O precipitado seco foi medido quanto ao teor de polissacarídeo com o uso de um método colorimétrico. Os resultados são encontrados na Tabela 15. A precipitação de polissacarídeo com o uso de uma solução de etanol 60%/ água foi escolhida na medida em que concentrações maiores de etanol não acrescentaram substancialmente o rendimento do precipitado de polissacarídeo. Além disso, a varredura UV a partir de 190-300 nm da solução do resíduo revelou que a absorbância máxima a cerca de 202 nm (absorbância causada pelas ligações do peptídeo turmerina) desaparecia em soluções de etanol 8 0%/ãgua ou em concentrações maiores, indicando que o peptídeo, turmerina, estava sendo precipitado nessas concentrações de etanol.

A fim de purificar ainda mais a fração depolissacarídeo obtida por precipitação de etanol 60%, foi usada uma coluna Sefadex G-10. Sefadex G-10 consiste em glóbulos esféricos pequenos, porosos, de moléculas entrecruzadas de dextrana. Sefadex G-10 foi fornecido por Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Mo) na forma de glóbulos esféricos, com diâmetro de 10-40 μτη. Quando suspensos em água, os poros no material recebem moléculas com pesos moleculares menores do que 700. Os glóbulos de Sefadex foram hidratados por 16 horas com água destilada. A coluna foi preparada pela adição da suspensão de Sefadex para formar um leito de 30 ml. O polissacarídeo precipitado foi dissolvido em água destilada até uma concentração de 1% por peso de massa, e carregado na coluna. A taxa de fluxo da carga de matéria-prima é cerca de 1,8 volume de leito/hora. O efluente foi coletado e medido quanto ao teor depolissacarldeo. Os resultados da análise colorimétrica são mostrados na Tabela 20. Além disso, espectrometria de massa AccuTOF-DART foi usada para definir ainda mais o perfil dos pesos moleculares dos compostos que compreendem a fração de polissacarídeos. Os resultados são mostrados nas Figuras 9, 10, 42-46 e 57-61. Esses dados indicam que a coluna de Sefadex G-10 pode purificar a fração de polissacarídeo de espécies de cúrcuma até um nível de cerca de 92%, com um rendimento de 4,5% em peso com base na matéria-prima original.

Tabela 20. Análise de polissacarídeos para extratos aquosos e precipitados de etanol 60% com o uso do resíduo da extração de etanol como matéria-prima (Etapa 2).

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Exemplo 8

Exemplo de extração e purificação da fração de turmerina

Etapa 7

Verificou-se que a solução do resíduo do sobrenadante da extração da fração de polissacarídeo da Etapa 6 possui uma concentração de 0,3% do peso de massa (1,3 g de sólidosem 438,9 g da solução de etanol/água) . A concentração da solução concentrada foi então diluída com uma solução salina tamponada com fosfato (0,01 M NaCl, 0,0027 M KCl, pH 7,4, 25°C) até uma concentração final de 1 mg/ml (solução total = 1.300 ml). Essa solução foi então purificada por coluna de Sefadex G-10 e coluna de troca catiônica de Dowex.

Os glóbulos de Sefadex G-IO foram embebidos em 200 ml de água destilada por 16 horas. A água foi decantada, e os glóbulos foram misturados com água destilada fresca para formar um caldo. A coluna foi compactada com um leito de 3 0 ml do caldo de Sefadex. Um volume de 175 ml da solução de 1 mg/ml foi carregado na coluna ao longo de 12 horas (14,6 ml/h). 0 efluente foi coletado. A análise de massa demonstrou que 14,5% de sólidos foram removidos durante essa etapa, deixando 0,150 g de sólido em solução.

Glóbulos da resina fortemente ácida de troca catiônica Dowex 50-WX2-200 que possuem grupos ácido sulfônico (-SO3H) como grupos de troca foram usados para purificação adicional da solução de efluente. Os glóbulos de resina Dowex foram lavados com água destilada, que posteriormente foi decantada. 0 Dowex foi então embebido por 1 hora em 0,1 M HCl para formar um caldo. 0 caldo de Dowex foi carregado em uma coluna de vidro para formar um leito de 35 ml. 0 leito de resina foi enxaguado com 3 volumes de leito de água destilada. Após lavagem, o pH do caldo de Dowex era 2,4. O efluente da etapa de Sefadex acima foi carregado na coluna em uma taxa de 2 ml/min. A coluna Dowex foi então eluída com solução salina tamponada com fosfato com o pH ajustado até 4,22 com HCl, em uma taxa de fluxo de 1,9ml/min por 90 minutos. As soluções de efluente e eluente foram coletadas individualmente e analisadas quanto ao equilíbrio de massa e teor de proteína. O equilíbrio de massa demonstrou que 45,5% do sólido carregado (0,068 g) estava na solução de eluente, e 54,5% (0,082 g) estava na solução de efluente. O efluente foi evaporado com o uso de um evaporador rotatório, e o produto final da fração de turmerina foi seco no forno.

Todas as amostras das etapas 6 e 7 foram analisadas por espectrômetro UV, análise de proteína Bradford e equilíbrio de massa. Os resultados dessas análises são mostrados na Tabela 21. Os resultados do espectro UV estão documentados na Figura 8. Os cromatogramas de espectroscopia de massa DART aparecem nas Figuras 47 e 62.

Tabela 21. Rendimento do processo de proteína em cada etapa e resultados da análise de Bradford.

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Exemplo 9

Os seguintes ingredientes são misturados para a formulação:

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O novo extrato de cúrcuma longa L. compreende uma fração purificada de óleo essencial, uma fração de curcuminóide, uma fração de turmerina e uma fração de polissacarídeo por % do peso de massa maiores do queaquelas encontradas no material natural de rizoma ou em produtos de extração convencionais. Além disso, a pureza dos curcuminóides na fração de curcuminóide é maior que 95%, com cúrcuma maior que 85% por peso de massa dos constituintes químicos de curcuminóide. As formulações podem ser feitas em qualquer forma de dosagem oral, e administradas diariamente ou em até 15 vezes por dia, como necessário para os efeitos fisiológicos e psicológicos desejados (aumento da memória e da cognição, analgesia e alívio de distúrbios crônicos artríticos, reumáticos e inflamatórios) e efeitos médicos (antioxidação e remoção de radicais livres, anti-agregação plaquetária e anti-trombose, prevenção e tratamento de doença cardiovascular e cerebrovascular, anti-ateroscleorse, anti-hipercolesterolemia, citoproteção, proteção do sistema nervoso, prevenção e tratamento de doenças neurológicas degenerativas como, por exemplo, doença de Alzheimer e de Parkinson, efeito antiinflamatório, antialérgico, reforço imune, efeito antiviral, anti-doença pulmonar crônica, proteção hepática, anti-úlcera péptica, atividade antiviral e anti-HIV e profilaxia e tratamento do câncer).

Exemplo 10

Os seguintes ingredientes foram misturados para a seguinte formulação:

Extrato de cúrcuma longa L. 150,0 mgFração de óleo essencial (18 mg, 12% do peso seco) Fração de curcuminóide (90 mg, 6 0% do peso seco) Pureza do curcuminóide 94% Perfil de distribuição de curcuminóide Cúrcuma 7 5,6%Desmetoxicúrcuma 19,3% Bisdesmetoxicúrcuma 5,1%

Fração de polissacarídeo (30 mg, 20% do peso seco) Fração de turmerina (12 mg, 8% do peso seco)

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As novas extrações de cúrcuma longa L. compreendem novas frações purificadas dos constituintes químicos de óleo essencial, curcuminóide, turmerina e polissacarídeo por % do peso de massa maiores do que aquelas encontradas no material natural de planta ou em produtos de extração convencionais. Observe também a mudança do perfil nas extrações de espécies de cúrcuma (a proporção de óleo essencial/curcuminóide na matéria-prima era de 0,97/1 e noextrato é de 0,2/1; a proporção de óleoessencial/polissacarídeo na matéria-prima era de 1,1/1 e no extrato 0,6/1; a proporção de óleo essencial/turmerina na matéria-prima era de 66,4/1 e no extrato 34/1; a proporção de curcuminóide/polissacarídeo na matéria-prima era de 1,2/1 e no extrato 2/0/1; a proporção de curcuminóide/turmerina na matéria-prima era de 66,4/1 e no extrato 113/1; e a proporção de polissacarídeo/turmerina na matéria-prima era de 59/1 e no extrato era de 56/1) . Além disso, a distribuição de curcuminóide foi alterada paraaumentar a concentração de curcumina de 66% no material dematéria-prima natural de planta até mais de 75% como % do peso de massa dos curcuminóides. A formulação pode ser feita em qualquer forma de dosagem oral e administrada com segurança até 15 vezes por dia, como necessário para os efeitos fisiológicos, psicológicos e médicos desejados (veja Exemplo 1, acima).

Exemplo 11

Ensaio de agregação - esses ensaios foram realizados com o peptídeo sintético AP^42 incubado com um extrato de cúrcuma de acordo com a presente invenção, em concentrações variáveis de 5 a 80 μΜ (Fig. 11), ou com o extrato de cúrcuma e controle (a 10 μΜ) por diferentes pontos do tempo até 72 horas (Figura 12), com a agregação sendo monitorada pelo método da tioflavina Τ. 0 método da tioflavina T detecta principalmente amilóides maduros (fibras de placa pregueada β). O extrato de cúrcuma foi um inibidor eficaz da agregação de AB1-42 nesse ensaio, quando comparado com o composto de controle. Como mostrado na Figura 11, o extrato de cúrcuma a 10 ou μΜ inibe significativamente a agregação de Api.42 (P < 0,001; ANOVA). Além disso, a Figura 12 mostra dados para os efeitos tempo-dependentes do extrato de cúrcuma sobre a agregação de Ap1^2. Nesses experimentos a 10 μΜ, a incubação do extrato de cúrcuma mostra uma inibição tempo-dependente da agregação que era significativa por 48 horas e aumentava ainda mais em 72 horas de incubação.

ELISA de Αβ - a fim de examinar os efeitos do extrato de cúrcuma sobre a clivagem de APP (proteína precursora de amilóide), células SweAPP N2a foram tratadas com uma ampla gama de doses de cada um desses compostos por 12 horas.Verificou-se que o extrato de cúrcuma reduz a geração de Αβ (tanto peptídeos Αβι-40 quanto Αβι-42) em células SweAPP N2a de uma forma dose-dependente (Figura 12) . E, mais importante, em uma concentração de 10 ou 20 μΜ, o extrato de cúrcuma reduz a geração de Αβ por células SweAPP N2a por 30 a 38%, quando comparado com células não tratadas.

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Claims

1. Extrato da espécie de cúrcuma caracterizado por compreender uma fração que tem um cromatograma de espectrometria de massa "Direct Analysis in Real Time" (DART) de qualquer uma das Figuras 9, 10 ou 14-78.

2. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa DART de qualquer uma das Figuras 14-31, 36, 37, 41, 51, 52 ou 56.

3. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa DART de qualquer uma das Figuras 35, 38-40, 50, ou 53-55.

4 . Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa DART de qualquer uma das Figuras 9, 10, 42-46, ou 57-61.

5. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa DART de qualquer uma das Figuras 32-34 ou 47-49.

6. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa DART de qualquer uma das Figuras 63-78.

7. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração tem um cromatograma de espectrometria de massa DART da Figure 4 7 ou 62.

8. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende uma fração de óleo essencial que tem um cromatograma de espectrometria de massa DART de qualquer uma das Figuras 63-78 e uma fração polissacarídea que tem 5 um cromatograma de espectrometria de massa DART de qualquer uma das Figuras 9, 10, 42-46, ou 57-61.

9. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende uma fração de óleo essencial que tem umcromatograma de espectrometria de massa DART de qualquer uma das Figuras 63-78, uma fração polissacarídea que tem um cromatograma de espectrometria de massa DART de qualquer uma das Figuras 9, 10, 42-46, ou 57-61, e uma fração de turmerina que tem um cromatograma de espectrometria de massa DART da Figura 47 ou 62.

10. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende um curcuminíide, uma turmerona, um polissacarideo, e/ou turmerina.

11. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com areivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o curcuminóide é selecionado do grupo que consiste em curcumina,tetrahidrocurcumina, demetoxicurcumina,bisdemetoxicurcumina e combinações desses.

12. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com areivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a quantidade de curcuminóide é de pelo menos cerca de 75% em peso.

13. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com areivindicação 10, caracterizado pelo fato de que aturmerona é selecionada do grupo que consiste era alfa-turmerona, ar-turmerona, beta-turmerona e combinações desses.

14. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que aquantidade de turmerona é de pelo menos 5% em peso.

15. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a quantidade de turmerina é de pelo menos cerca de 5% em peso.

16. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o polissacarideo é selecionado do grupo que consiste em Ukonan A, Ukonan B, Ukonan C e uma combinação desses.

17. Extrato da espécie de cúrcuma, de acordo com areivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a quantidade de polissacarideo é de pelo menos cerca de 5% em peso.

18. Alimento ou medicamento caracterizado porcompreender extrato da espécie de cúrcuma da reivindicação 1.

19. Método de tratamento de um indivíduo que sofre de agregação de placa amilóide ou formação de fibrila caracterizado por compreender a administração ao indivíduoem necessidade de uma quantidade eficaz de extrato da espécie de cúrcuma da reivindicação 1.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo sofre de doença de Alzheimer.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o extrato da espécie de cúrcuma também compreende uma quantidade sinérgica de ácido a- e/ou β-boswélico e/ou seus C-acetatos.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um primata,bovino, ovino, eqüino, suíno, roedor, felino ou canino.

23. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

24. Método de prevenção da agregação da placa amilóide ou formação de fibrila em tecido caracterizado por compreender o contato do tecido com uma quantidade eficaz de extrato da espécie de cúrcuma da reivindicação 1.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o extrato da espécie decúrcuma também compreende uma quantidade sinérgica de ácido a- e/ou β-boswélico e/ou seus C-acetatos.

26. Método para a preparação de um extrato da espécie de cúrcuma que tem pelo menos uma característica predeterminada caracterizado por compreender: extraçãoseqüencial de um material de planta da espécie de cúrcumapara gerar uma fração de óleo essencial, uma fração curcuminóide, fração polissacarídea e fração de turmerina por:a. extração de um material de planta da espécie de cúrcuma por extração de dióxido de carbono supercríticapara gerar a fração de óleo essencial e um primeiro resíduo;b. extração de um material de planta da espécie de cúrcuma ou do primeiro resíduo da etapa a) extração dedióxido de carbono supercrítica para gerar a fraçãocurcuminóide e um segundo resíduo;c. extração do segundo resíduo da etapa b) por extração em água quente para gerar uma solução de polissacarídeo e então precipitação do polissacarídeo com etanol para gerar a fração de polissacarídeo e um terceiro resíduo; ed. separação do terceiro resíduo da etapa c) por cromatografia em coluna da fração de turmerina.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende:- 1) carga em um frasco de extração de material de planta da espécie de cúrcuma moído;- 2) adição de dióxido de carbono sob condições supercríticas;- 3) contato do material de planta da espécie de cúrcumamoído e o dióxido de carbono por um tempo; e- 4) coleta de uma fração de óleo essencial em um frasco de coleta.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que as condições supercríticascompreendem uma pressão de cerca de 25 MPa a cerca de 50 MPa e uma temperatura de cerca de 3O0C a cerca de 80°C.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as condições de extraçãopara a etapa a) compreendem uma pressão de frasco de extração de cerca de 25 MPa a cerca de 50 MPa e uma temperatura de cerca de 35°C a cerca de 90°C e uma pressão de frasco de coleta separador de cerca de 4 MPa a cerca de 15 MPa de uma temperatura de cerca de 200C a cerca de 50°C.

30. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende:-1) carga em um frasco de extração de material de planta da espécie de cúrcuma moído ou o primeiro resíduo da etapa a);-2) adição de dióxido de carbono sob condiçõessupercríticas;-3) contato do material de planta da espécie de cúrcuma moído ou o primeiro resíduo da etapa a) e o dióxido de carbono por um tempo; e-4) coleta de uma fração de óleo essencial em umfrasco de coleta separador de fracionamento.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que as condições de extração para a etapa b) compreendem uma pressão de frasco deextração de cerca de 35 MPa a cerca de 70 MPa e uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 95°C e uma pressão de frasco de coleta separador de cerca de 12 MPa a cerca de 22 MPa e uma temperatura de cerca de 55°C a cerca de 75°C.

32. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a etapa c) compreende:-1) contato do segundo resíduo da etapa b) com uma solução de água a cerca de 85°C a cerca de IOO0C por um tempo suficiente para extrair polissacarídeos;-2) separação dos polissacarídeos sólidos da soluçãopor precipitação de etanol; e-3) purificação da fração polissacarídea com o uso de cromatografia em coluna.

33. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a etapa d) compreende:-1) passagem do terceiro resíduo da etapa c) atravésde uma coluna de resina para separação de moléculas de alto e baixo peso molecular; e-2) purificação da solução efluente de maior peso molecular com o uso de uma coluna de resina de troca de cátions para coletar a fração de turmerina da solução efluente.

34. Extrato da espécie de cúrcuma caracterizado por ser preparado pelo método de qualquer uma das reivindicações 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33.

35. Extrato da espécie de cúrcuma caracterizado por compreender curcumina, tetrahidrocurcumina a 0,1 a 5% em peso da curcumina, demetoxicurcumina a 10 a 20% em peso da curcumina, e bisdemetoxicurcumina a 1 a 5% em peso da curcumina.

36. Extrato da espécie de cúrcuma caracterizado por compreender curcumina, tetrahidrocurcumina a 0,1 a 5% em peso da curcumina, demetoxicurcumina a 15 a 25% em peso da curcumina, e bisdemetoxicurcumina ala 10% em peso da curcumina.

37. Extrato da espécie de cúrcuma caracterizado por compreender curcumina, tetrahidrocurcumina a 0,1 a 5% em peso da curcumina, demetoxicurcumina a 20 a 30% em peso da curcumina, e bisdemetoxicurcumina ala 10% em peso da curcumina.

38. Extrato da espécie de cúrcuma caracterizado por compreender curcumina, tetrahidrocurcumina a 30 a 40% em peso da curcumina e bisdemetoxicurcumina a 5 a 15% em peso da curcumina.

39. Extrato da espécie de cúrcuma caracterizado por compreender curcumina, demetoxicurcumin a 45 a 55% em pesoda curcumina e bisdemetoxicurcumina a 40 a 50% em peso da curcumina.

40. Extrato da espécie de cúrcuma caracterizado por compreender curcumina, demetoxicurcumin a 15 a 25% em pesoda curcumina e bisdemetoxicurcumina ala 10% em peso da curcumina.

41. Extrato da espécie de cúrcuma caracterizado por compreender curcumina, tetrahidrocurcumina a 0,1 a 5% em peso da curcumina, demetoxicurcumina a 20 a 30% em peso da curcumina e bisdemetoxicurcumina a 5 a 15% em peso da curcumina.