CN101400359A - 姜黄属提取物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用超临界CO₂提取方法提取的姜黄属植物原料的提取物，患有诸如与阿尔茨海默氏病相关的淀粉样斑块聚集或原纤维形成的受治疗者的治疗方法以及抑制其组织中淀粉样斑块聚集或原纤维形成的方法。

Description

姜黄属提取物及方法

相关申请

本申请要求以下美国临时专利申请的优先权：2006年3月17日提交，序列号为60/783,454；2006年9月21日提交，序列号为60/846,205以及2006年12月7日提交，序列号为60/873,405，这些申请通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及姜黄属提取物，尤其涉及姜黄(turmeric)提取物及其使用和制备方法。

发明背景

姜黄为姜科姜黄属草本植物姜黄的干燥、磨碎的(ground)根茎，原产于南亚。除其原产地外，姜黄大量种植于中国、加勒比各岛和南美各国。姜黄常用作香料，已被广泛用作咖喱粉和芥末中的着色剂和调味剂，并被用作化妆品和传统药物的成分。姜黄的淡黄色酚类色素由姜黄素类化合物(curcuminoids)组成，占市售姜黄粉的3～5％、咖喱粉的0.34～0.47％(1)。这些天然存在的抗氧化剂被认为与姜黄的药理活性有关(2)。然而最近表明，一种多肽蛋白——姜黄蛋白(turmerin)也表现出强大的抗氧化剂和细胞保护性质，并且在动物和人中产生所希望的临床疗效上，与姜黄素起协同作用(3)。此外，姜黄的挥发油含有姜黄酮类和其他有益的生物活性化学成分(4)，姜黄多糖也已证明具有有效的增强免疫、抗炎和抗癌活性(5、6)。

虽然姜黄属具有多种姜黄物种，但已显示姜黄(curcuma longa L)种的治疗价值最大(7)。这些具有治疗价值的化学品的来源是姜黄植物的根茎(根)，其也称为“姜黄”。

表现出有益治疗价值的四种主要化学组成级分为：1、精油级分(EOF)，它含有姜黄酮、芳姜黄酮(ar-turmerone)、α-姜黄酮、β-姜黄酮、姜黄酮醇A、姜黄酮醇B、姜黄烯、α-姜黄烯、β-姜黄烯、姜黄醇、姜黄新酮、姜黄二酮、α-蒎烯、β-蒎烯、桉树脑、丁子香酚、柠檬烯、芳樟醇、松油烯、松油醇等；2、姜黄素类化合物级分(CF)，它含有姜黄素、四氢姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、姜黄素的3种几何异构体和环姜黄素；3、姜黄蛋白级分(TF)，它含有称为姜黄蛋白的多肽蛋白；以及4、多糖级分(PF)，它包含众多的多糖分子，其中仅有少数分子已被纯化，并得到表征，例如Ukonan A、Ukonan B、Ukonan C和Ukonan D(5、8)。

在该姜黄物种中发现有四种主要的姜黄素类化合物：1)姜黄素；2)四氢姜黄素；3)去甲氧基姜黄素；和4)双去甲氧基姜黄素(9)。还分离出四种次要的姜黄素类化合物成分(10、11)。在某些应用中，姜黄素(主要的姜黄素类化合物)和四氢姜黄素似乎是产生生物活性的重要活性成分。在各个姜黄类物种中，主要的姜黄素类化合物的浓度变化相当大：1)姜黄素40～70％；2)去甲氧基姜黄素16～40％；以及3)双去甲氧基姜黄素0～30％。虽然姜黄的主要活性为抗炎性，但也有报道称其具有强大的抗氧化、抗过敏、细胞保护、改善伤口愈合、抗阿尔茨海默氏病、抗胆固醇(LDL)、肝保护、增强胆汁酸流动、抗痉挛、抗细菌、抗真菌和抗肿瘤(癌)活性，以及增强活力的作用。哈佛医学院最近进行的研究指出姜黄素可能也具有抗HIV活性。此外，耶鲁大学的研究人员最近在学术杂志“Science”上发表文章指出，姜黄素能够显著降低患有遗传疾病囊性纤维化的小鼠的死亡率。

除具有生物活性的姜黄素类化合物以外，姜黄还含有水溶性的5-kD-肽(姜黄蛋白)、多糖和精油，已表明姜黄蛋白是一种强效的抗氧剂、细胞保护剂和抗肿瘤剂，多糖则具有强劲的增强免疫、抗炎和抗肿瘤活性，而精油具有抗氧化、抗炎、抗关节炎、抗痉挛、镇痛、抗过敏、细胞保护、胃保护、肝保护、肺保护、抗哮喘、神经系统保护、抗阿尔茨海默氏病、抗帕金森氏病、抗癌、抗突变活性。

表1列出了姜黄中发现的已知具有有益生物活性的主要化学组成级分。

表1、姜黄中的生物活性化学成分(％重量)^＊

^＊基于科学文献以及天然姜黄原材料的HerbalScience GC-MS(气相色谱-质谱)和HPLC(高效液相色谱)分析。

临床前和临床毒理研究显示，姜黄精油、姜黄素类化合物、姜黄蛋白和姜黄多糖经延长的时期很大剂量使用是安全的(2、12～16)。

为了简要概括姜黄化学成分的治疗价值，近期调查和临床研究表明姜黄属的各种化学成分、化学级分和总提物具有以下疗效，包括：抗氧化活性(EOF、CF、TF、提取物)(4、17、18)；抗炎活性(EOF、CF、TF、PF、提取物)(4、19、20)；抗关节炎/抗风湿性关节炎(EOF、CF、TF、PF、提取物)(19～21)；抗血小板聚集/抗血栓(EOF、CF、提取物)(23)；抗高胆固醇血症(EOF、CF、提取物)(1、24)；抗心血管疾病(EOF、CF、TF、提取物)(1、4、17、18、22、23～25)；抗过敏(EOF、CF、提取物)(4、19、20、21)；抗慢性肺病/抗哮喘(EOF、CF、TF、PF、提取物)(4、19、20、22、26)；抗囊性纤维化(EOF、CF、TF、PF、提取物)(4、19、20、22、26、27)；细胞保护(EOF、CF、TF、提取物)(4、17、18、28)；胃保护、肝保护、胆保护(EOF、CF、提取物(29)；神经系统保护(EOF、CF、TF、提取物)(4、17、18、22、23～25)；抗阿尔茨海默氏病和抗帕金森氏病(EOF、CF、提取物)(30)；抗多发性硬化症(CF、提取物)(31)；抗癌和抗突变(EOF、CF、TF、PF、提取物)(4、6、13～18、32、38)；增强免疫(EOF、PF、提取物)(5、6、33)；抗病毒、抗HIV、抗细菌和抗真菌(EOF、CF、PF、提取物)(5、6、33、34)；以及改善伤口愈合(EOF、CF、提取物)(35)。其他研究显示，姜黄属中的生物活性化学成分的相互协同作用极其重要(36、37)。

发明概述

一方面，本发明涉及一种姜黄属(curcuma species)提取物，其包含具有图9、10或14～78中任何一幅的实时直接分析(DART)质谱色谱图的级分。在另一个实施方案中，该级分具有图14～31、36、37、41、51、52或56中任何一幅的DART质谱色谱图。在另一个实施方案中，该级分具有图35、38～40、50或53～55中任何一幅DART质谱色谱图。在另一个实施方案中，该级分具有图9、10、42～46或57～61中任何一幅的DART质谱色谱图。在另一个实施方案中，该级分具有图32～34或47～49中任何一幅的DART质谱色谱图。在另一个实施方案中，该级分具有图63～78中任何一幅的DART质谱色谱图。在另一个实施方案中，该级分具有图47或62的DART质谱色谱图。在另一个实施方案中，该提取物包含具有图63～78中任何一幅的DART质谱色谱图的精油级分和具有图9、10、42～46或57～61中任何一幅的DART质谱色谱图的多糖级分。在另一个实施方案中，该提取物包含具有图63～78中任何一幅的DART质谱色谱图的精油级分、具有图9、10、42～46或57～61中任何一幅的DART质谱色谱图的多糖级分和具有图47或62的DART质谱色谱图的姜黄蛋白级分。

在另一个实施方案中，本发明的姜黄属提取物进一步包含姜黄素类化合物、姜黄酮、多糖和/或姜黄蛋白。在另一个实施方案中，姜黄素类化合物选自姜黄素、四氢姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素及其组合。在另一个实施方案中，姜黄素类化合物的量为至少约75、80、85、90或95重量％。在另一个实施方案中，姜黄酮选自α-姜黄酮、芳姜黄酮、β-姜黄酮及其组合。在另一个实施方案中，姜黄酮的量为至少约5、10、15、20或25重量％。在另一个实施方案中，姜黄蛋白的量为至少约5、10、15、20或25重量％。在另一个实施方案中，多糖选自Ukonan A、UkonanB、Ukonan C及其组合。在另一个实施方案中，多糖的量为至少约5、10、15、20或25重量％。

另一方面，本发明涉及一种包含本发明的姜黄属提取物的食品或药物。

另一方面，本发明涉及一种治疗受治疗者(subject)的关节炎的方法，其包括对有需要的受治疗者给予有效量的本发明的姜黄属提取物。在另一个实施方案中，该姜黄属提取物进一步包含协同量的α-乳香酸和/或β-乳香酸和/或其C-乙酸酯。在另一个实施方案中，受治疗者为灵长类、牛、绵羊、马、猪、啮齿类、猫或狗。在另一个实施例中，受治疗者为人。

另一方面，本发明涉及一种治疗患有淀粉样斑块聚集或原纤维形成的受治疗者的方法，其包括对有需要的受治疗者给予有效量的本发明的姜黄属提取物。在另一个实施方案中，所述受治疗者患有阿尔茨海默氏病。在另一个实施方案中受治疗者为灵长类、牛、绵羊、马、猪、啮齿类、猫或狗。在另一个实施例中，受治疗者为人。

另一方面，本发明涉及一种预防组织中淀粉样斑块聚集或原纤维形成的方法，其包括使组织与有效量的本发明姜黄属提取物接触。

另一方面，本发明涉及一种制备具有至少一种预定特征的姜黄属提取物的方法，其包括通过以下步骤顺序提取姜黄属植物原料，以得到精油级分、姜黄素类化合物级分、多糖级分以及姜黄蛋白级分：a).通过超临界二氧化碳提取法提取姜黄属植物原料得到精油级分和第一残余物；b).通过超临界二氧化碳提取法提取姜黄属植物原料或得自步骤a)的第一残余物，得到姜黄素类化合物级分和第二残余物；c).通过热水提取法提取得自步骤b)的第二残余物，得到多糖溶液，然后用乙醇使所述多糖沉淀得到多糖级分和第三残余物；以及d).通过柱色谱法从得自步骤c)的第三残余物中分离姜黄蛋白级分。

在另一个实施方案中，步骤a)包括：1)将磨碎的姜黄属植物原料装载入提取容器中；2)在超临界条件下加入二氧化碳；3)使磨碎的姜黄属植物原料与二氧化碳接触一段时间；和4)将精油级分收集于收集容器中。在另一个实施方案中，超临界条件包括约250巴～约500巴的压力和约30℃～约80℃的温度。在另一个实施方案中，用于步骤a)的提取条件包括提取容器的压力为约250巴～约500巴，温度为约35℃～约90℃，以及分离器收集容器的压力为约40巴～约150巴，温度为约20℃～约50℃。

在另一个实施方案中，步骤b)包括：1)将磨碎的姜黄属植物原料或得自步骤a)的第一残余物装载于提取容器中；2)在超临界条件下加入二氧化碳；3)使磨碎的姜黄属植物原料或得自步骤a)的第一残余物与二氧化碳接触一段时间；和4)在分级分离器收集容器中收集姜黄素类化合物级分。在另一个实施方案中，用于步骤b)的提取条件包括提取容器的压力为约350巴～约700巴，温度为约60℃～约95℃，以及分离器收集容器的压力为约120巴～约220巴，温度为约55℃～约75℃。

在另一个实施方案中，步骤c)包括：1)使得自步骤b)的第二残余物与水溶液在约85℃～约100℃下接触足以提取多糖的一段时间；2)通过乙醇沉淀将固体多糖从溶液中分离；和3)利用柱色谱法纯化多糖级分。

在另一个实施方案中，步骤d)包括：1)使得自步骤c)的第三残余物通过用于分离高分子量分子和低分子量分子的树脂柱；和2)使用阳离子交换树脂柱纯化较高分子量的流出溶液，以从流出溶液中收集姜黄蛋白级分。

另一方面，本发明涉及一种通过本发明方法所制备的姜黄属提取物。

另一方面，本发明涉及一种姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计0.1～5％的四氢姜黄素、按姜黄素重量计10～20％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计1～5％的双去甲氧基姜黄素。

另一方面，本发明涉及一种姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计0.1～5％的四氢姜黄素、按姜黄素重量计15～25％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计1～10％的双去甲氧基姜黄素。

另一方面，本发明涉及一种姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计0.1～5％的四氢姜黄素、按姜黄素重量计20～30％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计1～10％的双去甲氧基姜黄素。

另一方面，本发明涉及一种姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计30～40％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计5～15％的双去甲氧基姜黄素。

另一方面，本发明涉及一种姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计45～55％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计40～50％的双去甲氧基姜黄素。

另一方面，本发明涉及一种姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计15～25％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计1～10％的双去甲氧基姜黄素。

另一方面，本发明涉及一种姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计0.1～5％的四氢姜黄素、按姜黄素重量计20～30％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计5～15％的双去甲氧基姜黄素。

在另一个实施方案中，相对于原产地植物原料或目前可得的姜黄属提取产品中的比例，改变该姜黄属的各化学成分的重量百分比分布(profile)(比率)。例如，可以增多或减少相对于姜黄素类化合物和/或姜黄蛋白和/或多糖浓度的精油级分。类似地，可以增多或减少相对于其他提取组成级分的姜黄素类化合物和/或姜黄蛋白和/或多糖，以允许新的成分化学分布的组合物，用于特定的生物学效应。

基于说明书、附图及所附权利要求书，本发明的这些实施方案、其他实施方案及其特征和特性将显而易见。

附图简述

图1示出了制备精油级分的代表性方法。

图2示出了进行乙醇浸提提取的代表性方法。

图3示出了SCCO₂纯化乙醇提取的姜黄素类化合物级分的代表性方法。

图4示出了纯化和分布(profiling)姜黄素类化合物的代表性方法。

图5示出了对得自乙醇浸提提取的残余物进行水浸提的代表性方法。

图6示出了制备多糖级分的代表性方法。

图7示出了制备姜黄蛋白级分的代表性方法。

图8示出了用于姜黄蛋白提取工艺的200～300nm处的紫外光谱扫描。

图9示出了根据本发明的一个实施方案中纯化姜黄多糖级分的代表性DART质谱指纹图谱(正离子模式)。

图10示出了根据本发明的一个实施方案中纯化姜黄多糖级分的代表性DART质谱指纹图谱(负离子模式)。

图11示出了经硫磺素T分析测定的姜黄提取物对Aβ_1-42聚集的影响。在37℃下单独孵育Aβ_1-42肽(50μM)，以及在存在所示出的不同剂量的姜黄提取物或对照化合物(10μM)的情况下对其孵育，持续72小时。所有试验均在Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中进行。数据以相对荧光单位(n＝3)表示。单因素方差分析及随后进行的事后比较显示，在10μM和20μM处理浓度下，姜黄提取物与对照化合物具有显著差异(P<0.001，ANOVA)。

图12示出了经硫磺素T分析测定的姜黄提取物对Aβ_1-42聚集的影响。在37℃下单独孵育Aβ_1-42肽(50μM)，同时在存在或不存在姜黄提取物或对照化合物(10μM)的情况下对其孵育，持续所示出的不同时间。数据表示为相对荧光单位(n＝3)。单因素方差分析及随后进行的事后比较显示，孵育48小时和72小时处，姜黄提取物与对照化合物之间具有显著差异(P<0.001)。

图13示出了姜黄提取物处理如何抑制培养神经元细胞中Aβ的产生。通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)在培养过SweAPP N2a细胞的条件培养基中分析Aβ_1-40，42肽(每个条件n＝3)。数据表示为经姜黄提取物处理12小时后分泌的Aβ_1-40，42肽相对于对照组(未经处理)的百分数。单因素方差分析及随后01进行的事后比较显示在5、10、20、40和80μM处理浓度下，姜黄提取物与对照化合物具有显著差异(P<0.005)。

图14示出了姜黄提取物#139的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到四氢姜黄素(373.1642)(丰度＝0.16)，姜黄素(369.1332)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(339.1228)(丰度＝17.27)以及双去甲氧基姜黄素(309.1132)(丰度＝2.93)。

图15示出了姜黄根提取物#310的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到姜黄素(369.1349)(丰度＝34.54)，去甲氧基姜黄素(339.125l)(丰度＝9.51)和双去甲氧基姜黄素(309.1144)(丰度＝5.82)。

图16示出了姜黄根提取物#311的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图17示出了姜黄根提取物#312的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图18示出了姜黄根提取物#313的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图19示出了姜黄根提取物#314的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到四氢姜黄素(373.1667)(丰度＝0.55)，姜黄素(369.1345)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(339.1239)(丰度＝20.41)和双去甲氧基姜黄素(309.1138)(丰度＝5.18)。

图20示出了姜黄根提取物#315的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到四氢姜黄素(373.1674)(丰度＝0.37)，姜黄素(369.1358)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(339.1236)(丰度＝16.58)和双去甲氧基姜黄素(309.1135)(丰度＝3.50)。

图21示出了姜黄提取物#316的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到四氢姜黄素(373.163l)(丰度＝0.36)，姜黄素(369.136)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(339.1228)(丰度＝22.84)和双去甲氧基姜黄素(309.1122)(丰度＝7.59)。

图22示出了姜黄提取物#317的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到四氢姜黄素(373.1642)(丰度＝0.26)，姜黄素(369.1343)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(339.1238)(丰度＝25.31)和双去甲氧基姜黄素(309.114)(丰度＝5.75)。

图23示出了姜黄提取物#139的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.116)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.106)(丰度＝35.48)和双去甲氧基姜黄素(307.0965)(丰度＝9.02)。

图24示出了姜黄根提取物#310的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1127)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.1033)(丰度＝50.06)和双去甲氧基姜黄素(307.0942)(丰度＝44.26)。

图25示出了姜黄根提取物#311的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1127)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.1033)(丰度＝49.82)和双去甲氧基姜黄素(307.0941)(丰度＝44.04)。

图26示出了姜黄根提取物#312的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.113)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.104)(丰度＝18.62)和双去甲氧基姜黄素(307.099)(丰度＝3.08)。

图27示出了姜黄根提取物#313的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1133)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.1041)(丰度＝19.56)和双去甲氧基姜黄素(307.0976)(丰度＝3.75)。

图28示出了姜黄根提取物#314的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1133)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.1042)(丰度＝19.71)和双去甲氧基姜黄素(307.0982)(丰度＝3.98)。

图29示出了姜黄根提取物#315的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1128)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.1036)(丰度＝26.32)和双去甲氧基姜黄素(307.0953)(丰度＝8.38)。

图30示出了姜黄提取物#316的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到四氢姜黄素(371.1306)(丰度＝0.99)，姜黄素(367.1131)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.1043)(丰度＝26.54)和双去甲氧基姜黄素(307.0958)(丰度＝9.48)。

图31示出了姜黄提取物#317的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1128)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.1035)(丰度＝35.48)和双去甲氧基姜黄素(307.0948)(丰度＝8.43)。

图32示出了含75％乙醇溶液的姜黄提取物(HS#136)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到四氢姜黄素(373.1678)(丰度＝0.41)，姜黄素(369.1418)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(339.1304)(丰度＝22.00)和双去甲氧基姜黄素(309.1201)(丰度＝5.36)。

图33示出了含80％乙醇溶液的姜黄提取物(HS#137)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到四氢姜黄素(373.1655)(丰度＝1.09)，姜黄素(369.1330)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(339.124)(丰度＝18.04)和双去甲氧基姜黄素(309.1131)(丰度＝5.10)。

图34示出了含85％乙醇溶液的姜黄提取物(HS#138)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到四氢姜黄素(373.1722)(丰度＝0.31)，姜黄素(369.1365)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(339.1254)(丰度＝13.14)和双去甲氧基姜黄素(309.1156)(丰度＝2.48)。

图35示出了市售(Hara Spices)姜黄根(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到姜黄素(369.132)(丰度＝0.31)。

图36示出了产自中国的姜黄根(HS#161)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到姜黄素(369.1273)(丰度＝1.20)。

图37示出了产自印度的姜黄根(HS#162)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到姜黄素(369.1335)(丰度＝0.54)。

图38示出了市售(Singapore Tai′Eng)姜黄根(HS#163)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到姜黄素(369.132)(丰度＝20.80)，去甲氧基姜黄素(339.12)(丰度＝4.83)和双去甲氧基姜黄素(309.111)(丰度＝2.05)。

图39示出了市售(Singapore Tai′Eng)姜黄根(HS#164)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到姜黄素(369.134)(丰度＝11.02)，去甲氧基姜黄素(339.1205)(丰度＝2.18)和双去甲氧基姜黄素(309.1122)(丰度＝1.46)。

图40示出了市售(Suan Farms)姜黄(HS#165)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到四氢姜黄素(373.1658)(丰度＝0.28)，姜黄素(369.1331)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(339.1221)(丰度＝16.26)和双去甲氧基姜黄素(309.116)(丰度＝2.65)。

图41示出了产自那不勒斯的姜黄根(HS#166)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到姜黄素(369.1345)(丰度＝3.94)，去甲氧基姜黄素(339.1198)(丰度＝0.35)和双去甲氧基姜黄素(309.1106)(丰度＝0.14)。

图42示出了经20％乙醇溶液沉淀市售姜黄(Hara Spice)的提取物所得到的多糖(HS#302)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图43示出了经40％乙醇溶液沉淀市售姜黄(Hara Spice)的提取物所得到的多糖(HS#303)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图44示出了经20％乙醇溶液沉淀市售姜黄(Hara Spice)的提取物所得到的多糖(HS#304)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图45示出了经80％乙醇溶液沉淀市售姜黄(Hara Spice)的提取物所得到的多糖(HS#305)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图46示出了经95％乙醇溶液沉淀市售姜黄(Hara Spice)的提取物所得到的多糖(HS#306)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。检测到姜黄素(369.1431)(丰度＝3.66)，去甲氧基姜黄素(339.1436)(丰度＝0.73)和双去甲氧基姜黄素(309.1187)(丰度＝0.97)。

图47多肽姜黄蛋白(HS#307)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)，对提取市售姜黄(Hara Spice)得到的60％上清液进行处理得到所述多肽姜黄蛋白。

图48示出了姜黄的75％乙醇提取物(HS#136)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1123)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.1028)(丰度＝42.60)和双去甲氧基姜黄素(307.0941)(丰度＝14.09)。

图49示出了姜黄的85％乙醇提取物(HS#138)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1117)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.103)(丰度＝23.61)和双去甲氧基姜黄素(307.0953)(丰度＝5.46)。

图50示出了市售(Hara Spices)姜黄根(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1125)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.1033)(丰度＝33.89)和双去甲氧基姜黄素(307.0940)(丰度＝19.46)。

图51示出了产自中国的姜黄根(HS#161)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到四氢姜黄素(371.1335)(丰度＝434)，姜黄素(367.1126)(丰度＝100)，去甲氧基姜黄素(337.1035)(丰度＝90.31)和双去甲氧基姜黄素(307.0943)(丰度＝39.58)。

图52示出了产自印度的姜黄根(HS#162)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1129)(丰度＝0.16)，去甲氧基姜黄素(337.1041)和双去甲氧基姜黄素(307.0944)。

图53示出了市售(Singapore Tai′Eng)姜黄根(HS#163)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1142)，去甲氧基姜黄素(337.1052)和双去甲氧基姜黄素(307.0963)。

图54示出了市售(Singapore Tai′Eng)姜黄根(HS#164)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1147)，去甲氧基姜黄素(337.1059)和双去甲氧基姜黄素(307.095)。

图55示出了市售(Suan Farms)姜黄根(HS#165)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到四氢姜黄素(371.1282)，姜黄素(367.1151)，去甲氧基姜黄素(337.1061)和双去甲氧基姜黄素(307.0981)。

图56示出了产自那不勒斯的姜黄根(HS#166)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1152)，去甲氧基姜黄素(337.1064)和双去甲氧基姜黄素(307.0966)。

图57示出了经20％乙醇溶液沉淀市售姜黄(Hara Spice)的提取物所得到的多糖(HS#302)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图58示出了经40％乙醇溶液沉淀市售姜黄(Hara Spice)的提取物所得到的多糖(HS#303)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图59示出了经60％乙醇溶液沉淀市售姜黄(Hara Spice)的提取物所得到的多糖(HS#304)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图60示出了经80％乙醇溶液沉淀市售姜黄(Hara Spice)的提取物所得到的多糖(HS#305)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1107)和去甲氧基姜黄素(337.1114)。

图61示出了经95％乙醇溶液沉淀市售姜黄(Hara Spice)的提取物所得到的多糖(HS#306)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。检测到姜黄素(367.1141)。

图62示出了多肽姜黄蛋白(HS#307)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)，对提取市售姜黄(Hara Spice)得到的60％上清液进行处理得到所述多肽姜黄蛋白。检测到姜黄素(367.1163)。

图63示出了在40℃、80巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图64示出了在40℃、300巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图65示出了在40℃、500巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图66示出了在60℃、100巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图67示出了在60℃、300巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图68示出了在80℃、100巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图69示出了在80℃、300巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图70示出了在40℃、500巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#164)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图71示出了在40℃、80巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图72示出了在40℃、300巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图73示出了在40℃、500巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图74示出了在60℃、100巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图75示出了在60℃、300巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图76示出了在80℃、100巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图77示出了在80℃、300巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#160)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图78示出了在40℃、500巴下CO₂超临界提取姜黄得到的精油级分(HS#164)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图79示出了姜黄素、四氢姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的化学结构，它们一起组成本文称为“姜黄素类化合物”的一组化合物。

图80示出了在姜黄提取物的精油级分中发现的一些化合物的化学结构。

发明详述

本发明特征在于姜黄属及其相关物种(例如但不限于姜黄)的提取物。本文所使用的姜黄是指来源于姜科植物的植物或植物原料，所述属在本文中包括但不限于姜黄(C.longa L)、郁金(C.aromatica Salisb.)、芒果姜(C.amada Roxb.)、莪术(C.zeodaria Rosc.)和印尼莪术(C.xanthorrhizia Roxb.)。该术语包括姜黄属和相关物种(curcuma and related species)的所有的克隆、载培品种、变种及芽变(sports)。

定义

本文使用的冠词“一”是指一种/个或超过一种/个(即至少一种/个)的该冠词的语法对象。例如，“一种成分”表示一种或多于一种成分。

如本领域中已知的，术语“化合物”并不表示一个分子，而是指一种或多种化合物上的多个或摩尔量分子。另外，如本领域中已知的，术语“化合物”是指具有明确化学和物理特性的化学成分，而“化合物类(compounds)”是指超过一种化学成分的化合物。

术语“包括”和“包含”用于开放式包括，意味着可以包括其他成分。

术语“由...组成”用于将成分限制到那些规定的那些，而不包括那些一般与之相关的杂质。

术语“基本由...组成”用来将分成限制到规定的那些以及那些实质上不影响材料或步骤的基本和新颖特征的成分。

术语“姜黄(curcuma)”也可与“姜黄(turmeric)”互换使用，包括来自姜科植物的植株、克隆、变种和芽变。

本文中所使用的术语“姜黄成分”应指在姜黄属中发现的化合物，应包括上述确定的所有此类化合物以及姜黄属中发现的的其他化合物，其包括但不限于姜黄酮、姜黄素类化合物、姜黄蛋白和多糖。

本文中所使用的术语“姜黄素”是指姜黄素类化合物中的一种组分，其结构在图79中示出。

本文中所使用的术语“姜黄素类化合物级分”包含包含得自或衍生自姜黄属及相关物种的不溶于水、可溶于乙醇的化合物，其包括被归类为姜黄素类化合物的化合物。姜黄素类化合物的组分包括姜黄素、四氢姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素，这些组分在图79中示出。

本文中所使用的术语“有效量”是指能够产生所需生物效应的必需量。如本领域普通技术人员所理解的，复合物或生物活性剂的有效量可随以下因素而变化：所期望的生物终点、待传递的生物活性剂、包囊基质的组成、靶组织等等。

本文中所使用的术语“精油级分”包含得自或衍生自姜黄属及相关物种的脂溶性、水不溶性的化合物，其包括被归类为姜黄酮的化合物。

本文中所使用的术语“原料”一般指未加工的植物材料，包含叶子、枝条、根茎、根(包括但不限于主根、根尖和须根)、茎、叶子、种子和花，其中植株或组成部分可包含未经加工、经过干燥、蒸煮、加热或者其他影响植物材料尺寸和整体性的处理的材料。偶尔，术语“原料”可用来表征即将用作其他提取加工的原料来源的提取产品。

本文中所使用的术语“级分”指提取物组合物，其包含以特定理化性质或物理性质或化学性质为特征的一特定组化合物。例如，精油级分(EOF)含有姜黄酮以及其他化学成分，姜黄素类化合物级分包含姜黄素类化合物以及其他醇溶性化学成分，姜黄蛋白级分含有姜黄蛋白以及其他小的水溶性蛋白化学成分，多糖级分含有ukonanA、B、C和D以及其他不同分子量的多糖。姜黄其相关物种的其他化学成分也可存在于这些提取级分中。

本文中所使用的术语“一种或多种化合物”有意指至少一种化合物，例如姜黄酮(精油姜黄化学成分)、姜黄素(不溶于水的、不溶于乙醇的二阿魏酰甲烷(diferuloylmethane)，姜黄化学成分)、姜黄蛋白(水溶性多肽蛋白)以及ukonanA(水溶性、不溶于乙醇的多糖化学成分)，或者有意指超过一种化合物，例如姜黄素和姜黄蛋白。

本文中所使用的术语“多糖级分”包含得自姜黄属及有关物种的可溶于水、不溶于乙醇的化合物，包括被归类为ukonans的化合物。

本文中所用的术语“分布”是指一种提取物级分中的化合物的重量百分比率，或指最终的姜黄提取物中四种姜黄级分化学成分中的每一种的重量百分数的比率。

本文所使用的术语“纯化”级分或提取物是指包含一特定组表征为某些化学或物理性质的化学成分的级分或组合物，所述化学成分被浓缩至超过所述级分或提取物的化学成分的70％(以干重计)。换句话说，纯化级分或提取物包含少于30％(以干重计)的化学成分，所述化学成分不表征为定义所述级分或提取物的某些希望的理化性质或物理性质或化学性质。

本文所使用的术语“根茎”是指姜黄属及相关物种的组成部分，其包含可以部分或完全在地下的水平或垂直根茎或变态茎(例如块茎)，其进一步包含上面的茎干或下面的根(包括但不限于初生根、次生根和三生根)。

术语“协同”为本领域所认可，指两种或更多种组分共同起作用，以致总效果大于各组分效果的总和。

术语“治疗”为本领域所认可，指治愈以及改善任何疾病或病症的至少一种症状。

本文所用的术语“姜黄蛋白级分”包含得自或源自姜黄属及相关物种的可溶于水和乙醇的化合物，其包括被归类为姜黄蛋白(一种肽)的化合物。

提取物

精油级分

本发明的提取物包含本文教导的一或多种姜黄物种的组合。提取物的一个实施方案包含具有如表2中GC-MS所示组分的精油级分。

利用超临界二氧化碳提取技术，通过单级处理(single stage processing)来提取姜黄根精油级分。最佳的提取条件为40～60℃的温度以及100～300巴的压力，产率约为3.5％。姜黄根中的主要精油化合物为倍半萜类化合物(例如芳姜黄酮、姜黄酮和姜黄新酮)和倍半萜烯(例如姜黄烯和姜烯)。在40～60℃的温度和300巴的压力下提取时，通过SCCO₂单级提取得到的精油具有99％的高纯度。姜黄酮和姜黄新酮为主要化合物，占总精油的75％～81％。倍半萜烯占精油的5.6～9.7％，其中姜黄烯和姜烯为相对主要的成分。上述化合物占姜黄精油总量的85～89％。

此外，在特定条件下(例如T＝40℃和60℃，压力为100～500巴)SCCO₂单级提取中姜黄素类化合物的纯度低于2.5％。可选择这些条件，以从姜黄根中提取高纯度精油。

表2 姜黄精油中鉴定的主要化合物

使用本发明中教导的GC-MS分析方法，这些化合物具有以下保留时间的峰：约30.36分钟(-姜黄烯)、30.74分钟((-)-姜烯)、31.68分钟(-倍半水芹烯)、33.45分钟(1-甲基-4-(1-甲基乙基-苯)、34.20分钟(1-甲基-2-(1-甲基乙基)-苯)、34.90分钟(4-乙基-1，2-二甲基-苯)、35.21分钟(1-(1-丙炔基)-环己烯)、35.96分钟(芳姜黄酮)、36.43分钟(β-姜黄酮)、37.00分钟(化合物U1)、37.36分钟(α-姜黄酮)、38.32分钟((6S，1′R)-6-(1’，5′-二亚甲基联-4′-苯基)-3-甲基环己-2-烯酮)、38.57分钟(化合物U2)、38.73分钟((+)-β-大西洋萜酮)、38.84分钟(化合物U3)、38.94分钟(化合物U4)、39.24分钟(化合物U5)、39.41分钟((+)-α-大西洋萜酮)、39.64(化合物U6)、39.76分钟(4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-丁烯-2-酮)、40.03分钟(化合物U7)、40.73分钟(化合物U8)、41.02分钟(化合物U9)、41.43分钟(十六烷酸甲酯)、42.05分钟(14-甲基-十五烷酸甲酯)以及42.89分钟((E，E)-9，12-十八碳二烯酸甲酯)。

姜黄素类化合物级分

通过超临界提取/分级技术，以乙醇作为共溶剂提取和纯化姜黄的姜黄素类化合物级分。在加入1.2％～3.7％乙醇作为共溶剂的情况下，姜黄素类化合物提取物的产率为0.74～2.10％。使用纯CO₂进行提取，化合物提取物的产率仅为0.27％。因此，必须使用乙醇作为共溶剂来提高姜黄素类化合物提取物的产率。通过加入3.7％乙醇作为共溶剂，原料中70％的姜黄素类化合物被提取。乙醇浓度越高，提取物的产率越高。然而，为了使SCCO₂对姜黄素类化合物的选择性达到最大，并不适宜进一步增大乙醇的浓度。

提取条件为：温度高于80℃，压力大于500巴。三个分离器的条件分别为60～67℃/150～170巴、56℃/130巴和28.6℃/60巴。在第一分离器中沉淀目标姜黄素类化合物。另外，试验不同的操作方法，例如A：在整个处理过程中连续使用三个分离器；B：两阶段处理，第一阶段在温和的条件下仅使用第三分离器脱除精油，第二阶段通过连续使用三个分离器来提取和分级姜黄素类化合物；以及C：两阶段处理，第一阶段在严格条件下使用第二和第三分离器脱除精油，第二阶段通过使用第一和第三分离器来提取和分级姜黄素类化合物。姜黄素类化合物的纯度总结数据显示于表3中：

表3.通过SCCO₂提取/分级处理得到的姜黄素类化合物的纯度

(A)

(B)

取决于操作方法，总姜黄素类化合物的纯度可提高至如下不同程度：大于55％、60％～70％、70％～80％以及大于80％。通过使用两阶段处理获得较高的纯度：第一阶段脱除精油，第二阶段用CO₂和乙醇共溶剂提取姜黄素类化合物(方法C)。姜黄素类化合物分布概括于表4中。

表4.通过SCCO₂提取/分级处理得到的姜黄素类化合物的分布

注：1.分布(％)：通过以下公式计算：(每种姜黄素类化合物的纯度)/(姜黄素类化合物的总纯度)x100；2.平均值：其为算术平均值，通过以下方法计算：将一组数字相加，然后除以这些数字的个数；3.标准差：标准差是对各数值自平均值的离散宽度的衡量。标准差通过以下公式进行计算：

姜黄素类化合物的分布高度取决于操作条件，而不依赖于操作方法，因为相同条件但不同操作方法所得到的姜黄素类化合物的分布非常接近，标准差小于1％。

原料中姜黄素类化合物的分布为66％姜黄素、14％去甲氧基姜黄素和20％双去甲氧基姜黄素，所述姜黄素类化合物通过极限乙醇或甲醇抽提得到。通过使用SCCO₂处理，能将姜黄素(C)、DMC和BDMC的比例分别在61.83％～82.36％、11.10％～15.95％以及6.54％～23.86％范围内进行变化。使用常规提取方法不能使个别姜黄素类化合物的相对丰度发生这些变化或对其进行调整。

多糖级分

使用不同浓度的乙醇沉淀获得姜黄根多糖和糖蛋白。结果显示于表5中。

表5.以葡聚糖作为参比标准，水浸提姜黄根的产率和多糖纯度分析结果

注：不能对F20进行分析，因为其不溶于水，不能获得特定浓度的溶液。

自表5中的数据可看出，经乙醇沉淀的多糖的产率为2.77～10.28％(基于初始姜黄原料的重量计)。该产率随着乙醇浓度的增大而增加。

从不同沉淀物的分子量分析可看出，F40与F60相似；F80与F95相似；而F20则与它们均不同。还发现姜黄根多糖和糖蛋白由不同分子量的多糖和糖蛋白以特定的比例组成。在F40和F60多糖中，最高分子量化合物组为2300～2400KDa，占46～48重量％，平均分子量约为1100～1200KDa。在F80和F95多糖-糖蛋白沉淀中，最高分子量组分也为2300～2400KDa，但仅占约30～35重量％。平均分子量为780～890KDa。

姜黄蛋白级分

通过使用Dowex50-WX2-200强酸阳离子交换树脂(-SO3H基团作为交换基团)处理60％乙醇沉淀的上清液来纯化姜黄根蛋白级分。结果显示于表6中。

表6.每一步中蛋白质处理的产率和Bradford分析结果

使用紫外分光光度计在190～300nm波长处进行扫描，检测溶液的最大吸收波长。Dowex流出液和洗脱液在202nm波长处均具有最大吸收，负载溶液在210nm波长处具有最大吸收。此外，Dowex流出液具有最大吸收强度，这意味着Dowex流出液中存在着较高浓度的多肽蛋白。表6中的结果也显示出Dowex流出液具有0.30g BSAeq./g提取物，这比Dowex原料溶液中的高2.3倍。

一般而言，本发明的方法和提取包括用于制备具有预定特征的姜黄属提取物的方法。此类姜黄属提取物可包含四种浓缩提取级分中的任何一种、两种、三种或所有四种，这取决于给定产品所期望的有益生物效果。通常，含有所有四种姜黄属提取级分的提取物一般是合意的，此类新颖提取物代表了含有天然植物原料中所发现的所有四种主要生物有效化学成分的第一种高度纯化和标准化的姜黄属提取产品。本发明的实施方案包含这样的方法，其中预定特征包含单独提取级分中预定选择性增加的姜黄属精油、姜黄素类化合物、姜黄蛋白和多糖的浓度。

由本发明方法所得到的提取物包含经提取的姜黄属植物原料或姜黄属提取物或两者的组合物或混合物。提取物包含具有预定特征的经提取的姜黄属植物原料或具有预定特征的姜黄属提取物。

此类提取物的另一个实施方案包含相对于干燥的天然姜黄属植物原料或传统姜黄属提取产品中所发现的多糖浓度，实质性增加的预定多糖浓度。例如，提取物可包含10重量％～92重量％的水溶性、醇不溶性多糖级分。

此类提取物的另一个实施例包含相对于干燥的天然姜黄属植物原料或传统姜黄属提取产品中所发现的姜黄蛋白浓度，实质性增加的预定的姜黄蛋白级分浓度。例如，提取物可包含大于0.2重量％～6.6重量％的姜黄蛋白级分。

提取物的纯度

在实施下述提取方法时，发现姜黄属的原始干燥根茎原料中，产率大于60重量％，三种姜黄酮(芳姜黄酮、α-姜黄酮和姜黄酮)的纯度大于70％的姜黄属精油可在SCCO₂精油提取物级分(步骤1)中得到提取。

使用步骤1所教导的方法(SCCO₂提取和分级法)，可提取出高度纯化的姜黄素类化合物级分。该提取步骤的产率约为存在于天然姜黄属原料中的姜黄素类化合物的22％。所提取的姜黄素类化合物提取物的纯度(浓度)为大于80％(以干重计)，三种主要的姜黄素类化合物已被有利地分布(改变比例)，其中姜黄素占姜黄素类化合物总重量的大于80％。在步骤2(乙醇浸提提取)中，余留在步骤1 SCCO₂提取和分级残余物中的姜黄素类化合物(78％)中超过80％可得到提取。步骤3对乙醇提取的姜黄素类化合物级分的SCCO₂纯化和分级得到高度纯化(以提取组合物的干重计，超过85％的姜黄素类化合物)姜黄素类化合物级分组合物，其中以组合物中姜黄素类化学成分的重量计，大于70％为姜黄素。姜黄素类化合物的SCCO₂纯化和分布(步骤4)可进一步将步骤3的姜黄素类化合物提取级分纯化至这样的姜黄素类化合物级分组合物，其中姜黄素类化合物的浓度超过90重量％，并且具有其中姜黄素浓度超过75％(以姜黄素类化学成分的重量计)的姜黄素类化合物分布。事实上，姜黄素类化合物的SCCO₂纯化和分布(步骤4)可纯化高浓缩的姜黄素类化合物提取产物，其中姜黄素类化合物级分组合物中姜黄素类化合物的浓度为大于95％，并且姜黄素类化合物的分布概括为其中姜黄素的浓度为超过姜黄素类化学成分重量的85％。因此，本发明中所教导的SCCO₂提取和分级工艺允许改变包含姜黄素类化学成分级分组合物的个别姜黄素类化合物的比例(分布)，以致产生用于特定医学目的的独特姜黄素类化合物级分组合物分布。

使用本发明的步骤5和步骤6所教导的方法，从姜黄多糖的纯度(浓度)大于90％的初始姜黄属原料中得到溶于水、不溶于乙醇的提取级分(多糖级分组合物)，其产率为4.5％。这将进一步等同于天然姜黄属原料中发现的姜黄属多糖化学成分的产率为70％。

使用本发明步骤5、6和7中所教导的方法，从原始姜黄属原料中得到的姜黄蛋白级分的产率为2.0％(以干重计)。姜黄蛋白级分中肽(大多数为姜黄蛋白)的浓度约为6.6％(干重)，按重量百分比计是天然姜黄属原料中肽纯度的66倍。这等同于使用Bradford蛋白质分析法，按天然姜黄属植物原料中姜黄蛋白肽化学成分重量计超过90％的产率。

最后，本发明所教导的方法允许将精油级分组合物、姜黄素类化合物级分组合物、多糖级分组合物以及姜黄蛋白级分组合物纯化(浓缩)至以下程度：精油级分组合物中所需化学成分高达70％～90％，姜黄素类化合物级分组合物中姜黄素类化合物高达97％，多糖级分组合物中多糖高达92％，姜黄蛋白级分组合物中姜黄蛋白肽高达6.6％。所使用的具体提取环境、提取率、溶剂以及提取技术取决于原材料中起始化学成分的分布以及最终提取产物所需纯化的程度。本领域技术人员只使用根据被处理原料属性的变化来调节方法以生成具有特定属性的产物的常规实验，能容易地确定本发明所教导的具体方法。例如，使用本发明中教导的本领域技术人员知晓的方法来测定相当多的姜黄属植物原料中精油、姜黄素类化合物、多糖和肽蛋白的初始浓度。本领域技术人员能确定从姜黄素类化合物的初始浓度到(例如)使用本文中所公开的提取方法得到的最终提取产物中预定量的姜黄素类化合物的改变量，以达到最终的姜黄属组合物产品中的所需浓度。

相对于天然姜黄的提取物

本发明的一个实施方案包含预定的精油浓度，其中该预定的精油浓度为可由本文所教导的提取技术得到的精油浓度，其高于天然姜黄属植物原料或传统姜黄属提取产物中所存在的精油浓度。例如，组合物可包含大于5重量％～99重量％的姜黄属精油化学成分。本发明的另一个实施方案在提取的姜黄属提取物中包含预定的姜黄素类化合物浓度，其中该姜黄素类化合物浓度大于天然姜黄属植物原料或传统姜黄属提取产物中发现的浓度。例如，提取物可包含浓度为35重量％～97重量％的姜黄属姜黄素类化合物。此类姜黄素类化合物提取物的一个实施方案包含预定的优选纯化的姜黄素类化合物的分布比例，其中可由本文所教导的提取技术得到的预定的姜黄素浓度大于天然姜黄属植物原料或传统姜黄属姜黄素类化合物提取产物中所存在的姜黄素浓度。例如，纯化的姜黄素类化合物级分可包含一种姜黄素类化合物分布，其中姜黄素的浓度为姜黄素类化合物重量的75％～90％，去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的浓度相应降低。

实施方案还包含其中一种或多种级分的浓度小于天然姜黄植物原料中所发现的浓度的提取物，所述级分包括精油化学成分、姜黄素类化合物、姜黄蛋白级分或多糖。例如，本发明的提取物包含其中精油级分的浓度为天然姜黄属植物原料中的浓度的0.001到22倍的级分，和/或其中姜黄素类化合物的浓度为天然姜黄属植物原料中的浓度的0.001到25倍的提取物，和/或其中姜黄蛋白级分的浓度为天然姜黄属植物原料中的浓度的0.001到66倍，和/或多糖浓度为天然姜黄属植物原料中的浓度的0.01到16倍的的组合物。在制备组合提取物中，可使用约0.001mg～约100mg精油级分；可使用约0.001mg～约1000mg姜黄素类化合物级分；可使用0.001mg～约100mg姜黄蛋白级分；以及可使用约0.001mg～约1000mg多糖级分。

此类提取物的一个实施方案包含预定浓度的经提取、纯化和/或分布的化学成分级分，其中姜黄属精油/姜黄素类化合物、精油/姜黄蛋白、精油/多糖、姜黄素类化合物/姜黄蛋白、姜黄素类化合物/多糖以及姜黄蛋白/多糖浓度(干重％)分布(比率)大于或小于天然干燥植物原料或传统姜黄属提取产物中发现的分布。改变姜黄属的有益化学成分的浓度关系(化学分布)允许配制为特定人体病症或疾病而设计的独特或新颖的姜黄属提取产品。例如，用于抗炎活性和关节炎治疗的新颖强效的姜黄提取物，与天然姜黄属植物原料或传统的已知提取产物相比，可具有更多的(以重量百分比计)纯化精油、姜黄素类化合物(优选具有改变的姜黄素类化合物分布，其中姜黄素浓度为超过姜黄素类化合物重量的80％)和姜黄蛋白组合物，以及减少的多糖组合物。相反，用于增强免疫的新颖姜黄提取物，与天然姜黄属植物原料或传统的已知提取产物相比，可具有更多的(以重量百分比计)纯化多糖级分和减少的姜黄素类化合物级分和姜黄蛋白级分。另一个用于阿尔茨海默氏病的新颖姜黄提取物分布的例子可以是这样一种提取物分布，其中与天然姜黄属植物原料或传统的已知提取产物相比，其具有更多的纯化精油和姜黄素类化合物组合物以及减少的纯化姜黄蛋白和多糖级分。

提取方法

用于提取的原材料为姜黄属植物材料。姜黄(C.longa L.)为优选的原材料。该原材料可以是植物的空中(aerial)部分，包括叶子、茎或其他植物部位，但根茎(根)是优选原料。姜黄属植物原料可经历预提取步骤，使得该原料成为可用于提取的形式。此类预提取步骤包括但不限于其中将材料剁碎、切碎、撕碎、研磨、粉碎、切割或撕开的步骤，在预提取步骤之前的原材料为干燥或新鲜的植物原料。优选的预提取步骤包括将姜黄属根茎原料研磨和/或粉碎成细粉。可对原料或预提取步骤后的材料进行干燥或向其中加入水分。

姜黄的超临界流体提取

一般而言，本发明的方法部分地包括其中使用新颖的超临界二氧化碳(SCCO₂或SFE)流体分级提取法，然后进行一个或多个溶剂提取步骤(例如但不限于，水提取、水醇提取、吸附树脂吸附法)来提取姜黄属植物原料的方法，以及其他新颖的SCCO₂分级提取方法。预期用于本发明的其他方法包括使用其他有机溶剂、化学制冷剂、可压缩气体、超声处理、加压液体提取法、过程液相色谱法、高速逆流色谱法、聚合物吸附剂、分子印迹聚合物及其他已知的提取方法来提取姜黄植物原料。此类技术为本领域技术人员所知晓。

本发明包括使用SCCO₂从姜黄植物原料中提取油树脂的方法。本发明包括将油树脂提取物分级成例如高浓度的精油和姜黄素类化学组分。此外，本发明包括其中提取物级分中单独的化学成分的化学组分比例或分布可发生改变的SCCO₂工艺。例如，姜黄素类化合物的SCCO₂分级分离允许相对于其他姜黄素类化合物选择性地提取姜黄素，从而能产生姜黄素类化合物提取物级分，其中姜黄素的浓度超过纯化的姜黄素类化合物提取物级分中所存在的姜黄素类化合物的87％。

使用SCCO₂(参见US 5,120,558)“分级提取”及“分级分离”植物油树脂，使得在相对温和的条件下(温度：50℃或更低，压力：300巴或更低)能够选择性提取姜黄精油化学成分。随后，有可能在更严格的条件下(温度：>50℃，压力：>300巴)再提取姜黄原材料，得到姜黄素类化学成分，其一般难溶于SCCO₂流体中。结果，得到两种高度纯化的级分：轻级分(精油级分)和重级分(姜黄素类化合物级分)。使提取物/流体流通过一连串3个分离器，在高温和高压条件下同时进行提取物级分的额外分级。精确选择每个分离器中的压力和温度条件，以沉淀感兴趣的单独化学成分，例如但不限于姜黄素。

超临界流体提取和分级系统是一种设计用来利用SCCO₂从植物源生产药品的原料处理系统。这个系统具有以下特点：使得适合的预处理天然植物原材料能够装载入处理容器中，与加压CO₂气流接触以除去所选择的化学成分，随后使其通过化学处理设备(分离器)，所述设备从CO₂主气流中选择性分离出所需的化学成分。

SCCO₂系统包含两个主提取容器、三个分离器、电热交换器、液冷冷凝器、CO₂蓄积器、质量流量计、CO₂泵、添加剂泵和冷却器。主提取容器为24L，由17-4PH不锈钢制成，额定压力为700巴(11,000psi)。分离器为20L，由316不锈钢制成，额定压力为200巴(3000psi)。每个提取器和分离器都设有速动关闭系统，该系统能够缩短提取系统的装载和卸载时间。

所有承压部件均通过安全阀来保护以防压力过大。将多个联动装置整合入系统中以防止运行故障。万一仪器或能源发生故障，所有气动阀都将进入安全保险模式。使用添加剂泵将诸如乙醇的共溶剂以0.5L/min的流速定量加入CO₂中。为了防止CO₂泵形成气穴，使液体CO₂从CO₂贮存容器流经冷却器至CO₂泵。CO₂用CO₂泵压缩至所需的提取压力，并用加热器加热至提取温度。使用两个National InstrumentsCompact fieldpoint处理器(CFP-2020和CFP-200)严格控制该系统。NationalInstrument Labview RT(实时)使用客户应用软件在这些处理器上运行。CPF经由以太网连接至操作人员接口计算机。

简而言之，该方法包括液化CO₂自存贮容器经冷却器流至CO₂泵。然后将CO₂压缩至所需的提取压力，并加热至所需温度。提取器填满多篮预处理过的植物原材料，交替或串联操作。在系统操作过程中，使一个提取器处于CO₂回路中，同时可对另一个提取器减压，交换原料，重新对该提取器加压。该后一种操作模式造成了半连续固体物质流。在三个严格控制的步骤中进行分离：高压、中压和低压，并对每个分离器进行适当温度调节。CO₂在通过分离器后不含提取物，并流至冷凝器，在那里液化。然后液态CO₂流入CO₂贮存容器，用于再循环。

用本发明中所教导的SCCO₂法提取姜黄属的油树脂消除使用有机溶剂，并提供了提取物的同时分级。二氧化碳是天然而安全的生物产品，是许多食品和饮料中的成分。不同的是，传统SCCO₂法是一种资本密集型方法，以不连续的分批模式操作，与溶剂提取方法相比，此法并非节省成本。在本发明中，SCCO₂分级提取和分离系统克服了这些局限。

图1～7示出了姜黄属的生物活性化学成分的提取方法的示意图。该提取工艺一般但不限于有7个步骤。在本文中用于参考，当符号#出现在括号[#x]中时，后面的数字是指图1～7中的数字。提取工艺中使用的分析方法在实施例章节中陈述。

步骤1.精油提取工艺

由于姜黄属精油的疏水性质，该提取工艺可使用非极性溶剂，包括但不限于超临界流体提取(SFE)(如SCCO₂)、己烷、石油醚和乙酸乙酯，以及水蒸气蒸馏。

该工艺方法包含一个单步提取步骤，用于纯化(浓缩)精油(图1a)或者，必要时，在纯化精油的同时纯化姜黄素类化合物，并改变姜黄素类化学化合物化学组中的单独姜黄素类化合物的比率(图1b)。

图1-步骤1以图解方式一般化描述了从天然姜黄属原料中用超临界流体提取法(SFE)分级提取精油级分。原料[#10]为干燥、磨碎的姜黄属根茎原料(8～20目)。将原料装载入置于SFE提取器[#20或#50]中的篮内。溶剂[#210或#220]为纯二氧化碳(CO₂)。95％乙醇可用作共溶剂[#220]。在吹扫和渗漏试验之后，该方法包括液化CO₂自存贮容器经冷却器流至CO₂泵。CO₂被压缩至所需压力，然后流经提取器中的原料，提取器中的压力和温度保持在所需水平。提取压力为约100巴～800巴、约200巴～约600巴、约300～约400巴，温度为约30℃～约100℃、约40℃～约90℃和约60℃～约80℃。这里所教导的SCCO₂提取优选在至少100巴的压力和至少30℃的温度下进行，更优选在约300～约600巴的压力和约50℃～90℃的温度下进行。提取时间为约30分钟～约2.5小时、约1小时～约2小时，约1小时～约1.5小时。每次SCCO₂提取的溶剂与原料比通常为50:1。使CO₂再循环。然后在收集器或分离器[#30和#40或#60、#300和#80]中收集经提取和纯化的精油以及经提取、纯化和分布的姜黄素类化合物级分，于4℃下储存在暗处。磨碎的姜黄属根茎原料[#10]可在一步处理中被提取，其中将所提取的姜黄精油级分收集在SFE或SCCO₂[#20]系统收集器中(以上步骤1)。或者，在分级SFE系统[#50]中，经SCCO₂提取的姜黄属原材料可分离至收集容器(分离器)[#60，#300，#80]中，从而在一个收集器(分离器)容器中存在纯化精油级分[#60]，在第二收集器中有纯化并经分布的姜黄素类化合物级分[#300]，在第三收集器中存在经提取的姜黄属根茎原料的残余物或剩余物[#80]。本发明的一个实施方案包括使用SCCO₂分级提取法在300至600巴压力和50℃至90℃的温度下，对天然姜黄属根茎原料进行提取，在预定条件(压力、温度和密度)和预定间隔(时间)下，在不同收集器容器中收集所提取的姜黄属原料。

所提取的姜黄属纯化精油级分可单独进行回收和使用，或可组合形成一种或多种经提取的姜黄属提取物。经SCCO₂提取的精油级分的一个方面包括预定的精油化学成分浓度，其高于天然植物原料或传统姜黄属提取产物中所发现的浓度。通常，精油化学成分的总产率超过95％，精油提取级分中精油化学成分的纯度超过99重量％。可利用气相色谱-质谱(GC-MS)分析来测量纯度和精油级分中化学成分。此类提取物的分析结果显示于表7和表8中。此类提取物的实施例可参见下文。所提取的纯化和经分布的姜黄属姜黄素类化合物级分可进行单独回收和单独使用，或可组合形成一种或多种姜黄属提取物。

经SCCO₂提取的姜黄素类化合物级分的一个方面包括预定的姜黄素类化学成分的浓度以及姜黄素类化合物的浓度分布，其中姜黄高于天然植物原料或传统姜黄提取产物中的浓度。典型地，得自姜黄属原料的姜黄素类化合物级分的总产率为约22重量％姜黄素类化合物，姜黄素类化合物级分的纯度大于80％，按姜黄素类化合物重量计，姜黄素类化合物级分中分布的化学成分超过80％为姜黄素。使用HPLC分析来测量纯度和姜黄素类化合物分布。此类提取工艺的实例和结果可参见实施例1以及表9和表10。

步骤2.乙醇浸提提取

图2-步骤2以图解方式一般化描述了使用乙醇浸提工艺，对步骤1 SCCO₂提取工艺所得到的姜黄残余物材料[#40或#80]进行提取。原料[#40或#80]是来自步骤1a或步骤1b的残余物。提取溶剂[#230]为95％乙醇。在该方法中，将原料和提取溶剂分别装载入加热至60～80℃的提取器中，并搅拌3～7小时。停止混合之后，使溶液静置10～20小时。对顶层溶液进行滗析[#100]、过滤[#110]、离心[#120]。将富含姜黄素类化合物的上清液蒸发[#130]至馅饼状(tart)或粉末[#140]。然后将该干燥的提取产物[#140]用于进一步处理(步骤3)。可以保留固体残余物[#150]，用于进一步处理(步骤4)，得到姜黄属多糖和多肽(姜黄蛋白)纯化级分。此类提取工艺的实例和结果可参见实施例3和表11。

步骤3.经乙醇提取的姜黄素类化合物级分的SCCO₂纯化

该处理方法包括单个提取步骤，用于纯化(浓缩)姜黄素类化合物，以及需要时改变姜黄素类化合物化学组中各种姜黄素类化合物的比例。在预处理步骤中，使用SCCO₂(步骤1)提取天然姜黄属原料中的精油，然后使用乙醇(步骤2)从步骤1的残余物中提取姜黄素类化合物，真空干燥形成步骤2中所述的馅饼状，并与玻璃珠混合形成可流动的粉末，或者喷雾干燥成粉末状(粒径大于100μm)。

图3-步骤3以图解方式一般化描述了从步骤2的提取产物[#140]中SFE分级提取姜黄素类化合物级分。将原料[#140]与玻璃珠混合，并装载入SFE提取器[#160]中。溶剂为纯二氧化碳[#240]。可使用乙醇作为共溶剂。吹扫和渗漏实验之后，该方法包括液化CO₂自存贮容器经冷却器流至CO₂泵。CO₂被压缩至所需压力，然后流经提取器中的原料，提取器中的压力和温度保持在所需水平。提取压力为约100巴～800巴、约200巴～约700巴、约300～约600巴，温度为约30℃～约100℃、约45℃～约95℃和约65℃～约90℃。这里所教导的SCCO₂提取优选在至少300巴的压力和至少40℃的温度下进行，更优选在约400～约600巴的压力和约60℃～90℃的温度下进行。提取时间为约30分钟～约4小时、约1小时～约3小时，约1小时～约2小时。每次SCCO₂提取的溶剂与原料比通常为约1000:1。使CO₂再循环。然后在预定设置了压力和温度的收集器或分离器容器[#310]中收集经提取、纯化和分布的姜黄素类化合物级分。

本发明的一个实施方案包括利用SCCO₂分级提取法，在300巴～600巴的压力和60～95℃的温度下，对富含乙醇的姜黄素类化合物原料或经提取的富含姜黄素类化合物原料进行提取，在预定条件(压力、温度和密度)和预定间隔(时间)下，将所提取的姜黄素类化合物级分材料收集在同收集器容器中。每个收集器中的所提取的姜黄属纯化姜黄素类化合物级分可单独进行回收和使用，或可组合形成一种或多种姜黄属提取产物。经SCCO₂提取的姜黄属姜黄素类化合物级分的一个方面包括预定的姜黄素类化学成分浓度，其高于天然姜黄属植物原料或传统姜黄属提取产物中所发现的浓度。本发明的另一方面是纯化的经提取的姜黄素类化合物级分，其中姜黄素浓度大于姜黄素类化学成分重量的70％。一般地，得自天然姜黄属根茎原料的纯化姜黄素类化合物级分的总产率为约2.6％，其中姜黄素类化合物的浓度超过姜黄素类化合物提取物级分重量的85％。此外，可改变姜黄素类化合物的浓度分布，使姜黄素浓度大于70重量％。此类提取工艺的实例和结果可参见实施例4和表12。

步骤4.姜黄素类化合物的纯化和分布

该处理方法包括单个提取步骤，用于另外纯化(浓缩)姜黄素类化合物，以及需要时改变姜黄素类化合物化学组中各种姜黄素类化合物的比例。在预处理步骤中，使用SCCO₂(步骤3)提取天然姜黄属原料中的精油，进行真空干燥形成馅饼状，并与玻璃珠混合形成易流动的粉末，或者喷雾干燥成粉末状(粒径大于100μm)在另一种预处理步骤中，将高度富集的姜黄素类化合物提取产物与玻璃珠混合形成易流动的粉末。

图4-步骤4以图解方式一般化描述了从步骤3的提取产物[#310]或高度富含姜黄素类化合物的提取产物[#320]中SFE分级提取姜黄素类化合物级分。将原料[#310或#320]与玻璃珠混合，并装载入SFE提取器[#170]中。溶剂为纯二氧化碳[#250]。可使用乙醇作为共溶剂。吹扫和渗漏实验之后，该方法包括液化CO₂自存贮容器经冷却器流至CO₂泵。CO₂被压缩至所需压力，然后流经提取器中的原料，提取器中的压力和温度保持在所需水平。提取压力为约100巴～800巴、约200巴～约700巴、约300～约600巴，温度为约30℃～约100℃、约45℃～约95℃和约60℃～约90℃。这里所教导的SCCO₂提取优选在至少300巴的压力和至少40℃的温度下进行，更优选在约400～约600巴的压力和约60℃～90℃的温度下进行。提取时间为约30分钟～约4小时、约1小时～约3小时，约1小时～约2小时。每次SCCO₂提取的溶剂与原料比通常为约1000:1。使CO₂再循环。然后在预定设置的压力和温度下的收集器或分离器容器[#330]中收集经提取、纯化和分布的姜黄素类化合物级分。本发明的一个实施方案包括利用SCCO₂分级提取法，在300巴～600巴的压力和60～95℃的温度下，对富含乙醇的姜黄素类化合物原料或经提取的富含姜黄素类化合物原料进行提取，在预定条件(压力、温度和密度)和预定间隔(时间)下，将所提取的姜黄素类化合物级分材料收集在同收集器容器中。每个收集器中的所提取的姜黄属纯化姜黄素类化合物级分可单独进行回收和使用，或可组合形成一种或多种姜黄属提取产物。

经SCCO₂提取的姜黄属姜黄素类化合物级分的一个方面包括预定的姜黄素类化学成分浓度，其高于天然姜黄属植物材料或传统姜黄属提取产物中所发现的浓度。本发明的另一方面是纯化的经提取的姜黄素类化合物级分，其中姜黄素浓度大于姜黄素类化学成分重量的70％。

本发明的另一方面是纯化的经提取的姜黄素类化合物级分，其中姜黄素浓度大于姜黄素类化学成分重量的80％。一般地，得自天然姜黄属根茎原料的纯化姜黄素类化合物级分的总产率为约0.9％，其中一种姜黄素类化合物的浓度超过各姜黄素类化合物重量的85％。此外，可改变姜黄素类化合物的浓度分布，使姜黄素浓度大于姜黄素类化合物的75重量％。对于高度富含姜黄素类化合物的提取产物，产率超过60重量％，姜黄素类化合物的纯度超过95％，并具有其中姜黄素超过姜黄素类化合物重量的85％的姜黄素类化合物分布。此类提取工艺的实例和结果可参见实施例5以及表13、14和15。

步骤5.步骤2的残余物的水浸提

一方面，本发明包括对姜黄属植物原料中生物活性多糖和多肽(姜黄蛋白)化学成分的提取和浓缩。图5-步骤5以图解方式一般化描述了预备的提取步骤。该步骤5提取工艺为单级溶剂浸提方法。用于该提取工艺的原料为步骤1b[#40]或步骤2[#150]的残余物。提取溶剂[#260]为蒸馏水。在此方法中，将姜黄属残余物和提取溶剂装载入提取器[#400]中，加热、搅拌。可加热至100℃、约90℃或约70～90℃。提取进行约1～5小时、约2～4小时或约3小时。对所得流体提取物进行过滤[#410]和离心[#420]。蒸发[#440]上清液[#430]至浓缩的上清液[#450]，供进一步处理(步骤6& &)。弃去[#460]固体残余物。此类提取工艺的实例可参见实施例6，结果见表16。

步骤6：多糖级分的提取和纯化

如这里所教导的，可通过以下方法从姜黄属得到纯化的多糖级分提取物：用乙醇从姜黄属原料的含水提取物中沉淀出溶于水、不溶于乙醇的多糖，然后使水溶液中的沉淀与固体聚合物树脂吸附剂接触，从而吸附水溶液中含有的分子量小于700D的较小分子。然后将多糖浓缩于流出液中。洗脱被结合的分子并弃去。在分离水性沉淀溶液中的化学成分之前，可以任何便利方法将其上吸附了不需要的化学成分的分子大小的吸附剂从流出物(所需化学成分)中分离出来，优选接触吸附剂的方法，通过让水性提取产物流经提取柱或吸附剂材料床来实现分离。

可使用各种吸附剂来纯化姜黄属的多糖化学成分。优选使用分子大小的分离吸附剂(例如Sephadex G-10)将分子量小于700的分子与大分子量的多糖分子分离。

优选地，在使含有含水多糖化学成分的提取物与亲和吸附剂接触之前，使天然姜黄属原料物质经历一个或多个预纯化过程，例如但不限于步骤1、2和5中所述的过程。

如本发明所教导的，使用亲和吸附剂可获得高度纯化的姜黄属的多糖化学成分，其显著高于正常存在于天然植物原料或市售提取产品中的其它化学成分。例如，本发明中所教导的方法可得到纯化多糖提取物，其含有超过90％的总多糖化学成分(按干重计)。

图6-步骤6以图解方式一般化描述了利用乙醇沉淀和亲和吸附剂树脂珠从姜黄属根茎中提取和纯化多糖。供提取的原料[#450]可以是得自步骤5水浸提提取的含多糖的浓缩水提取物溶液。用于从水溶液中沉淀多糖的溶剂[#270]为乙醇。加入足够的乙醇[#270]来稀释浓缩的上清溶液[#450]，得到最大量的溶于水、不溶于乙醇的多糖沉淀[#500]。将溶液过滤[#510]、离心[#520]和滗析[#530]。收集并保存上清液残余物[#550]，供进一步处理以提取并纯化姜黄属中的姜黄蛋白级分的化学成分。收集沉淀[#540]，通过蒸发除去沉淀中的乙醇和水。清洁适量的吸附剂树脂珠[#560]，使之水化，制成浆液，并装载到柱上。将多糖沉淀提取物溶于水中，制成1％的溶液，装载到柱[#560]上。收集流出液[#600]，分析多糖，进行干燥，保存为多糖产物。此提取方法的实例参见实施例7。

步骤7.姜黄蛋白级分的提取和纯化

如本文所教导的，可通过以下方法从姜黄属获得纯化的姜黄蛋白多肽级分提取物：用磷酸盐缓冲溶液稀释步骤6产生的乙醇水溶液的上清残余物的提取物，使该经稀释的提取物溶液与固体筛分(size seperation)亲和吸附剂接触，随后收集流出液，使该流出液与阳离子交换树脂柱接触，以致分别除去分子量小于姜黄蛋白的杂质以及与阳离子交换树脂柱进行离子交换的杂质。利用本文所教导的方法收集流出液，并保存为产物。随后从每个吸附剂中洗脱出被结合的化学成分(杂质)，使离子交换树脂再生。

虽然可使用各种吸附剂来纯化姜黄蛋白化学成分级分，但优选使用SephadexG-10作为吸附剂来吸附分子量为700或更小的杂质(姜黄蛋白的分子量为5,000)，使用Dowex 50-WXZ-200(具有磺酸交换基团的强酸阳离子交换树脂珠)作为阳离子交换吸附剂。

优选地，在使含有提取物的姜黄蛋白水溶液与亲和吸附剂树脂珠接触之前，使姜黄属原料经历一个或多个预纯化处理，例如但不限于步骤1、2、5和6中所述的处理。

使用本发明所教导的筛分亲和吸附剂，从姜黄属植物原料得到与天然植物原料或市售提取产物中通常存在的姜黄蛋白浓度相比，显著纯化的姜黄蛋白。例如，本发明所教导的方法可使得姜黄蛋白浓度从天然姜黄属根茎中约0.1wt％增加到最终的姜黄蛋白级分提取产物中约6.6wt％，相对于天然姜黄属原料中通常发现的浓度提高66倍。

图7-步骤7以图解方式一般化描述了使用亲和吸附剂树脂珠，从姜黄属根茎提取物中提取和纯化姜黄蛋白级分。

用于第一提取处理的原料[#550]可以是步骤6多糖纯化得到的含多肽姜黄蛋白的水溶液残余物。用于稀释原料溶液的溶剂[#280]为磷酸盐缓冲溶液，稀释至终浓度为1mg/ml。将稀释的原料溶液[#700]装载入填充有洁净Sephadex G-10珠水化浆液[#710]的柱中，流速约为每小时0.5床体积。收集流出液[#720]，保存供进一步处理。洗脱树脂珠，进行清洁和再循环。弃去洗脱液[#730]。

用于第二提取处理的原料[#720]可以是得自使用筛分树脂柱的第一提取处理的流出液。将原料溶液装载入填充有一床经0.1M HCl浸泡的洁净Dowex 50-WX2-200树脂珠浆液的柱[#740]。装载原料溶液前，用3床体积的蒸馏水洗涤柱子。原料装载流速约为3.4床体积/小时。收集流出液[#800]，分析多肽蛋白含量，进行干燥并作为最终的姜黄蛋白级分产物保存。对Dowex树脂珠进行洗脱、清洁并再循环。弃去洗脱液。此类提取工艺的实例可参见实施例8，结果见表18。

使用Bradford蛋白质分析法来计算每个样品中的总蛋白。在粗水提取物中，溶解质量(dissolved mass)中蛋白质含量为26.4％([0.82/3.1]x100＝24.4％)，基于原始原料计，总蛋白的产率为2.73重量％。如图8A中所述，在202nm处观测到吸收峰，与肽姜黄蛋白的一致。相反，虽然60％乙醇沉淀中的蛋白质含量为2.2％，但在202nm附近并未观察到吸收峰(图8B和图8C)。在60％乙醇沉淀后的剩余溶液中含有10％蛋白质，在202nm处有吸收峰(图8C)。用Sephadex柱除去分子量小于700的杂质(姜黄蛋白分子量为5,000)之后，流出溶液中含3.7wt％蛋白质，且202nm处保持有吸收峰(图8D-Dowex负载溶液)。用于Dowex柱的装载溶液为溶于磷酸缓冲盐溶液(pH7.4)中的Sephadex流出液。姜黄蛋白的等电点为4.2，从而当溶液的pH小于其等电点时，则该溶液带正电荷。因此，姜黄蛋白在装载溶液中将带有负电荷，不会与Dowex阳离子交换柱结合。因此，Dowex柱流出液中含有姜黄蛋白，这可由流出溶液中发现的202nm处的高吸收(由于肽键(due peptic bonds))证实(图8D)。Dowex流出液中姜黄蛋白级分产物具有0.04克牛血清白蛋白(BSA)等价物(equivalent)，基于原始姜黄属原料计，总产率为0.12wt％。Dowex柱流出液或姜黄蛋白级分中，蛋白质含量为6.6％，这表明姜黄蛋白肽的浓度从原始原料中的0.1％左右增加至6.6％(按干重计)，比天然姜黄属原料中所发现的姜黄蛋白浓度高66倍。

食品和药物

作为本发明食品的形式，可配制成任何可选形式，例如细粒状、颗粒状、糊状、凝胶状、固体状或液体状。在这些形式中可任选含有允许在食品中加入的本领域技术人员已知的各种常规物质，例如粘合剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、调味剂、缓冲剂、表面活性剂、溶解助剂、防腐剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂或pH控制剂等等。姜黄提取物在食品中的加入量不受特别限制，例如，体重约为60kg的成年人的摄取量可以是10mg～5g/天，优选为50mg～2g/天。

特别是当其用作保健食品、功能食品等时，优选含有充分显示本发明预定效果的量的本发明有效成分。

可任选根据已知的常规方法将本发明的药物制成，例如，诸如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂等的固体制剂或者诸如注射剂等的液体制剂。可将常用的任何材料配制入这些药物中，例如粘合剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、调味剂、缓冲剂、表面活性剂、溶解助剂、防腐剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂或pH控制剂。

药物中有效成分(姜黄提取物)的施用量可根据种类、剂型、待用患者的年龄、体重或症状等而改变，例如，当口服给药时，对体重约60kg的成人每天施用一次或数次，每天的施用量为约10mg～5g，优选为约50mg～2g。有效成分可以是一种或数种姜黄提取物成分。

传递系统

用于向受治疗者传递本发明提取物的给药方式包括本领域普通技术人员已知的给药方式，例如粉剂、喷雾剂、膏剂、糊剂、霜剂、洗液、凝胶、溶液、贴片和吸入剂。

在一个实施方案中，给药方式为吸入剂，其可包括定时释放或控制释放的吸入剂形式，例如脂质体制剂。这种传递系统用于对受治疗者治疗SARS、禽流感等。在该实施方案中，本发明的制剂可在任何适用于鼻内施用的剂量分配装置(dosagedispensing device)中使用。该装置的构建应着眼于确定最佳计量精确度及其构造部件(例如容器、阀或驱动器)与鼻制剂的相容性，其可以机械泵系统为基础，例如定量喷雾器、干粉吸入器、柔雾(soft mist)吸入器或喷雾器的机械系统。由于给药剂量大，优选的装置包括喷射喷雾器(例如PART LC Star，AKITA)、柔雾吸入器(例如PARI e-Flow)以及基于胶囊的干粉吸入器(例如PHT&T Turbospin)。合适的推进剂可在诸如碳氟化合物、碳氢化合物、氧化氮和一氧化二氮或其混合物等气体中选择。

吸入传递装置可以是喷雾器或定量吸入器(MDI)，或者本领域普通技术人员已知的任何其他合适的吸入传递装置。该装置可含有并用于传递单剂量的制剂或者可含有并用于传递多剂量的本发明提取物。

喷雾器型吸入传递装置可含有溶液(通常是水溶液)或悬浮液形式的本发明提取物。在产生供吸入的提取物的雾状喷雾过程中，可通过超声、压缩空气、其他气体、电子形式或机械形式来驱动喷雾型传递装置。超声喷雾器装置通常通过经由电化学振动表面将快速振动的波形强加于制剂的液体膜上来起作用。在给定振幅下，波形变得不稳定，借此使液体膜碎裂，产生制剂的小液滴。由空气或其他气体驱动的喷雾器装置的操作基础为：高压气流产生局部压降，使得液体制剂经由毛细管作用被吸入气流中。然后这种细液流经剪切力碎裂。喷雾器可设计成便携式和手持式，也可配备自含电装置(self contained electrical unit)。喷雾器装置可包含喷嘴，该喷嘴具有两个具有规定孔径的重合出口通道，液体制剂经过所述通道被加速。这造成了两股流的撞击和制剂的雾化。喷雾器可使用机械驱动器强迫液体制剂通过具有规定孔径的多孔喷嘴，以形成供吸入的制剂气溶胶。在单剂量喷雾器的设计中，可使用含有单剂量制剂的泡罩包装。

在本发明中，可使用喷雾器来确保颗粒的尺寸最适于粒子在例如肺膜中定位。

定量吸入器(MDI)可用作本发明提取物的吸入传递装置。该装置是受压的(pMDI)，其基本结构包含计量阀、驱动器和容器。推进剂用于使制剂从装置中排出。提取物可由悬浮于加压推进剂液体中具有规定大小的粒子组成，或者提取物可以在加压液体推进剂的溶液或悬浮液中。所用的推进剂主要是对环境友好的氢氟烃(HFCs)，例如134a和227。仅在必要时使用常规的含氯氟烃，例如CFC-11、12和114。吸入系统的装置可经由诸如泡罩包装传递单剂量，或可设计为多剂量。吸入系统的加压定量吸入器可以是呼吸驱动的，以传递准确剂量的含脂类制剂。为了确保剂量给药的准确性，可凭借微处理器对制剂的传递进行程控，使其发生在吸入周期的特定点。MDI可以是便携式和手持式。

在另一个实施方案中，传递系统可以是透皮传递系统，例如，水凝胶、霜、洗液、药膏或贴片。当要求数周或者甚至数月定时传递时，尤其可使用贴片。

在另一个实施方案中，可使用胃肠外给药途径。胃肠外途径涉及注射入身体的各种腔室(compartment)。胃肠外途径包括静脉内(iv)，即，通过静脉直接向血管系统给药；动脉内(ia)，即，通过动脉直接向血管系统给药；腹腔内(ip)，即，给药至腹腔内；皮下(sc)，即，在皮下给药；肌内(im)，即，给药至肌肉内；以及皮内(id)，即，在皮层之间给药。有时胃肠外途径优于口服途径，当所施用的部分制剂在胃肠道内部分或全部降解时。类似地，若在紧急情况下需要快速反应，通常胃肠外给药优于口服给药。

治疗方法

本发明的方法包括提供用于治疗和预防人体疾病的新颖姜黄提取物。例如用于治疗过敏、关节炎、风湿、心血管疾病、高胆固醇血症、血小板聚集、脑血管疾病、哮喘、慢性肺病、囊性纤维化、伤口愈合、阿尔茨海默氏病和帕金森氏病、多发性硬化、消化性溃疡疾病、癌症、HIV/AIDS、细菌和真菌感染的新颖姜黄属提取物，其可具有相比于姜黄属天然植物原料或传统已知产物中所发现的浓度有所增加的精油级分浓度、姜黄素级分浓度和多糖级分浓度(按重量％计)。

优选的治疗方法包括治疗关节炎的方法，其包括对有需要的受治疗者给予治疗有效量的本发明姜黄提取物。在一个特别优选的实施方案中，姜黄提取物进一步包含协同量的类似获得的乳香属提取物，尤其是乳香组分α-和/或β-乳香酸和/或其C-乙酸酯。乳香属的提取方法在发明人于2006年9月21日提出的临时专利申请中有充分描述，该申请整体并入本文中。协同作用是指姜黄与乳香提取物联合使用对关节炎的效果，与各个提取物单独使用的效果相比，有所增加。

以上描述包括目前认为最佳的实施本发明的方式。该描述以举例说明本发明的总原则为目的，不应视作限制。通过以下实例进一步说明本发明，实施例不应解释为对本发明范围的任何限制。相反，应清楚理解，本领域技术人员在阅读本说明书之后，在不违背本发明主旨的情况下可以做出各种其它实施方案、修改和等同物。

本文所用的所有术语均考虑以本领域技术人员正常接受的用法来解释。本文所引用的专利和专利申请或参考文献均通过引用整体并入本文中。

实施例

材料与方法

姜黄原料

本研究使用来自不同来源的两种磨碎的姜黄根。姜黄提取物(Lot#：CL/02005)购自Suan Farma公司。活性组分分析结果显示于表7中。

表7.本研究中使用的姜黄根和提取物的原料信息

 

分析物	姜黄根	姜黄提取物2
			供应商	Hara spices	Suan Farma
精油	6.641	N/A
			姜黄素类化合物总量(wt％)	6.82	91.14
姜黄素(wt％)	4.56	68.22
			DMC(％)	1.36	19.63
BDMC(％)	0.90	4.81
			多糖(％)	5.9	N/A
蛋白质	2.78	N/A

注1：通过己烷消耗提取14小时来测量精油浓度。总产率为7.24％，姜黄素类化合物为0.6％，因此精油为7.24-0.6＝5.96％。2.信息由供应商在2000年9月提供。

参比标准品与有机溶剂

姜黄素类化合物标准品购自ChromaDex公司(952S.Daimler St.Santa Ana CA92705，电话：949,419,0288，传真：949,419,0294，www.chromadex.com)，其性质列于表8中。

表8.姜黄素类化合物标准品的物理性质

 

批号	产品名称	化学式	分子量	Tm(℃)	化学族
						03924-724	姜黄素(458-37-7)	C21H20O6	368.4	183	酚酸
04230-727	去甲氧基姜黄素(24393-17-1)	C20H18O5	338.4	N/A	酚酸

 

04231-531

双去甲氧基姜黄素(24393-16-0)

C19H16O4

308.3

N/A

酚酸

所有溶剂均得自E.Merck，其性质列于表9中。

表9.被考虑的有机溶剂的物理性质

Dowex 50WX2-200(H)阳离子交换树脂购自Sigma-Aldrich公司。它是一种2％交联的强酸阳离子交换树脂；氢离子形式，100-200目。

Sephadex G-10(近似干燥，直径为40～120μm的珠子)购自sigma-Aldrich公司。Sephadex是通过使葡聚糖与表氯醇交联制备的珠状凝胶。其主要应用为低分子量分子与高分子量分子的组分离。G-10用于分离分子量小于700的分子。

分析方法

精油的表征和定量

用配备有熔融石英柱(5％苯基聚(二甲基硅氧烷)XTI-5，30m x 0.25mm i.d.，膜厚度为0.25μm，Restek)的HP5890系列GC-MS系统来测定姜黄精油的化学组成。电子电离能为70eV。载气为氦气(1.7ml/min)，注射1μl样品。注射温度为240℃，检测器温度为230℃。程序升温：50℃维持5min，以4℃/min升至180℃，以15℃/min升至280℃，在280℃保持19min。通过比较其质谱与来自美国国家标准技术研究院(US National Institute of standards and technology(NIST，USA))和WILEY质谱库的数据来鉴定化合物。

姜黄素类化合物的表征和定量

用Shimadzu LC-10AVP系统实施HPLC分析，所述系统使用Jupiter柱(250mm高，46mm内径，5μ C18300)，包括LC-10ADVP泵、SPD-M10AVP光电二极管阵列检测器、SCL-10ADVP控制器和CTO-10ACVP柱温箱。在30℃下，以梯度系统进行洗脱，流速为1ml/min。流动相由2％乙酸(A)，乙腈(B)和甲醇(C)组成。使用线性程序变化的以上溶剂(30～36％乙腈在A中的溶液，0～30min)来测定姜黄素类化合物的定量水平。然后该梯度从36％乙腈在A中的溶液至95％乙腈在A中的溶液，历时30～45min，具有5％C的常数。通过分析一系列标准姜黄素类化合物来评估该方法的线性。将各20μl的五份工作标准溶液(含有0.06～2μg标准姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素)注射入HPLC。通过对标准姜黄素类化合物的浓度相对峰面积(三次试验的平均数)进行绘制，得到标准校正曲线。选择校正范围来反映姜黄样品中正常姜黄素类化合物的浓度。

多糖的表征和定量

用比色试验来表征姜黄属中的多糖。用作测试的试剂为95.5％硫酸(符合ACS规范，比重：1.84)和5％苯酚溶液，通过在38g试剂级苯酚中加入2g蒸馏水来制备苯酚溶液。该混合物形成易吸移的水白色液体。使用分子量为5220、48600和409800的葡聚糖(Fluka产品)作为标准品。

用移液管将2ml糖溶液移入氯量滴定管内，加入1ml5％苯酚。然后迅速加入5ml浓硫酸，为了获得良好混合，酸流直接朝向液面，而不靠着试管壁流。使试管静置10分钟。颜色稳定数小时，如有必要可随后进行读数。在488nm处测量特征桔黄色的吸光度。通过以蒸馏水代替糖溶液来制备空白。然后参照为葡聚糖构建的标准曲线来测定糖的量。所有溶液均制成一式三份，以使偶然污染造成的误差最小化。为了检验该方法，在不同日重复这些试验。在所有情况下，试验间的吸光度偏差不超过0.01～0.02个单位，这与一式三份样品之间的偏差的数量级相同。

用于多糖分析的实时直接分析(DART)质谱

使用下述仪器和方法制作所有DART色谱图。

仪器：JOEL AccuTOF DART LC飞行时间质谱仪(Joel USA，Inc.，Peabody，Massachusetts，USA)。该飞行时间质谱技术不需要任何样品预备，得到准确至0.00001质量单位的质量。

方法：用于捕获和分析多糖级分的仪器设置如下：对于阳离子模式，DART针电压为3000V，加热元件处于250℃，电极1处于100V，电极2处于250V，氦气流速为7.45升/分钟(L/min)。对于质谱仪，喷口1为10V，环形透镜为5V，喷口2为3V。峰值电压设为600V，从而使分辨能力自约60m/z开始，在较大质量范围内仍然允许充分分辨。微通道板检测器(MCP)电压设为2450V。每天早上在进样前使用0.5M咖啡因标准溶液(Sigma-Alrich Co.，St.Louis，USA)进行校准。标准公差维持在小于5mmu。

使用无菌钳将样品引入DART氦等离子体内，确保最大表面积的样品暴露于氦等离子体射束下。为了将样品引入该射束中，使用摆动(weeping motion)。该动作允许样品在来回冲击中反复暴露约0.5秒/挥击(swipe)，预防样品的高温分解。重复此动作直到在检测器观察到明显的总离子电流(TIC)信号，然后移去样品，使得基线/背景标准化。

对于阴离子模式，将DART和AccuTOF MS转换到阴离子模式。针电压为3000V，加热元件250℃，电极1处于100V，电极2处于250V，氦气流速为7.45L/min。对于质谱仪，喷口1为-20V，环状透镜为-13V，喷口2为-5V。峰值电压为200V。MCP电压设置在2450V。以与阳离子模式相同方式进样。使用随仪器提供的MassCenterMain软件组进行所有数据的分析。

吸光度试验：

溶液中的蛋白质吸收紫外光，在280和200nm处有最大吸光度。肽键主要造成200nm处的吸光度。Shimadzu1700系列分光光度计已用于当前研究。该程序包括以下步骤：

使UV灯预热15分钟；

用单独的磷酸盐缓冲溶液校准到零吸光度；

从190nm到300nm扫描样品溶液；

找出最大吸收波长。

Bradford蛋白质分析：

Bradford分析可用于测定溶液中蛋白质的浓度。该程序以溶液中染料(亮蓝G)和蛋白质之间形成复合物为基础。蛋白质-染料复合物引起染料的最大吸收从465nm位移到595nm。吸收量与蛋白质的存在量成比例。

试剂：

Bradfrod试剂(sigma产品，B6919)由0.004％亮蓝G、10％磷酸和4％甲醇组成。

磷酸缓冲盐溶液(pH＝7.4)(sigma产品，P3813)由83.8％氯化钠、12％无水磷酸氢二钠、2％磷酸二氢钾和2％氯化钾组成。

经磷酸盐溶液缓冲的牛血清白蛋白(BSA)，pH＝7.4；sigma产品，P-3688。

程序：

制备含0、200、400、600、800和1000μgBSA的六个标准溶液。将分光光度计设定为：在400到700nm波长范围和0～2个吸光度单位的吸光度范围内收集光谱。使用4ml装满蒸馏水的石英小池作为分光光度计在此波长范围内的空白。记录400～700nm的吸光光谱，标记595nm处的吸光度。对每个蛋白质标准品和分析样品重复上述步骤。检查标准品和样品的光谱。如果任何光谱在595nm处的吸光度大于2，或者如果任何样品的吸光度大于任何标准品的最大吸光度，则将样品稀释已知数量，重复此检验。在575nm附近的一个波长处，所有光谱都应具有相同的吸光度(这样的交叉点称为等消光点，是含有相同总浓度的具有两种可能形式的吸收物质的溶液的一个限定特征)。如果任何光谱都未与其他光谱在等消光点或等消光点附近相交，则应进行校准或报废，并重复测试。

制备595nm处吸光度与BSA浓度的曲线图。为了从其吸光度测定样品的蛋白质浓度，使用标准曲线来找出可能具有与样品相同吸光度的标准品浓度。

硫磺素T试验

通过硫磺素T荧光来监测Aβ_1-42纤维的存在。37℃下，一式三份15μL Aβ_1-42样品(50mM Tris-HCl缓冲剂(pH7.4)中溶有50μM Aβ_1-42)在不同剂量的本发明姜黄提取物或对照化合物存在或不在的情况下，于肽溶液中孵育不同时间之后被移出。将这些样品各自加到2mL 10μM硫磺素T(Sigma)(溶于50mM甘氨酸/NaOH(pH9.0))中，随后硫磺黄素T与淀粉样纤维结合，然后监测到荧光特征改变(在450nm处激发，482nm处发射)。在加入肽之前和刚刚加入肽之后扫描一式三份样品三次。结果显示一式三份样品的平均值±那些平均值之间的差异。

Aβ_1-40，42ELISA

使用先前所描述的方法(Tan等，2002)，以1:1稀释条件培养基，并对其收集和分析，数值以相对于对照品，所分泌的Aβ_1-X的百分比来报告。根据出版的方法(Marambaud等，2005；Obregon等，2006)对总Aβ物质(species)进行定量。简而言之，4℃下，将溶于PBS中的2μg/mL 6E10(捕捉抗体)包被到96孔免疫测定板中过夜。

室温下，测定板用0.05％吐温-20(溶于PBS中)洗涤5次，用封闭缓冲液(含1％BSA，5％马血清的PBS)封闭2小时。在测定板中加入条件培养基或Aβ标准品，4℃下孵育过夜。洗涤3次之后，在测定板中加入生物素化抗体4G8(0.5μg/mL，溶于含1％BSA的PBS中)中，在室温下孵育2小时。洗涤5次之后，在96孔板中加入链霉抗生物素蛋白—辣根过氧化物酶(1:200稀释于含1％BSA的PBS中)，室温下孵育30分钟。在测定板中加入四甲基联苯胺(TMB)底物，室温下孵育15分钟。向测定板的每个孔中加入50μL终止溶液(2N N₂SO₄)。立即用酶标仪在450nm处测定每个孔的光密度。Aβ水平以对照品(得自未经处理的N2a SweAPP细胞的条件培养基)的百分比来表示。

实施例1

单级SCCO₂提取的实施例

使用SFT-250 SFT/SFR处理平台(超临界流体技术公司(Supercritical FluidTechnologies，Inc.)，Newark，Delaware)进行提取。在半连续流动提取工艺中利用SCCO₂提取姜黄属精油级分。使来自储气瓶的液态二氧化碳穿过冷却浴，然后用空气驱动的Haskel泵将之压缩到操作压力。压缩的二氧化碳流入容纳30克磨碎的姜黄属根茎粉(20目)的100ml提取器中，直到提取器的出口观察不到溶解物。将容纳待提取的植物原料的提取器置于恒温控制的烘箱内。用数字控制器控制提取器内的温度，精确度为+/-0.1℃。二氧化碳的流速为10L/min(19gm/min)。用流速和运行时间来计算消耗的二氧化碳体积。每次运行按固定的时间间隔将提取产物分成5种级分收集于高65mm、直径为24mm的玻璃安瓿中，称重并进行重量分析得到提取曲线。实验在300巴压力和40℃温度下进行。所提取的可溶于二氧化碳的物质的量计算为提取物总重量与天然原料总重量之比。将提取产物溶解于己烷中，进行气相色谱-质谱(GC-MS)分析。结果显示于表2和表6中。基于原始姜黄原料的重量计，总产率较高，为4.2％，三种高浓度的主要姜黄酮，即芳姜黄酮、β-姜黄酮和α-姜黄酮构成了76.5wt％的精油级分。精油化学成分的纯度大于99％。

上述程序在不同温度和压力下运行数次。收集得自这些运行的级分，通过DART质谱对其分析，结果在图63～78中示出。

实施例2

SCCO₂提取和分级的实施例

使用前述专利(proprietary)超临界流体提取和分级系统对姜黄属原料进行SCCO₂提取和分级。将2,000克磨碎的姜黄属根茎原料引入24L提取器中。调节提取温度和压力，开始进料二氧化碳。使压缩CO₂向上流经垂直安装的床，精油以及包括姜黄素类化合物在内的其他亲脂性化学成分被提取。溶液通过减压阀离开该提取器容器，流入第一分离器中，在那里蒸发并再循环二氧化碳。使用三个串联的分级分离器，通过分三个阶段释放溶剂压力和降低温度来完成提取物的分级沉淀。分离器1和3用于分级。重的提取产物(姜黄素类化合物级分)在较高压力下沉淀于分离器1收集容器中，轻产物(精油)在较低压力下回收于分离器3中。通过质量流量计和流动时间测量消耗的CO₂总重量和流体流速。通过自动止回阀设定压力，提取器中的压力精确度为+/-3巴，分离器中的压力精确度为+/-1巴。用恒温器调节温度，精确至+/-1℃。提取温度和压力如下：提取器：70℃和450巴；分离器1：65℃和170巴；分离器2：59℃和130巴；分离器3：28℃和60巴。SCCO₂提取条件和产率(基于原料的重量百分比计)记录于表8中。

将精油收集于分离器3中。GC-MS分析结果显示于表6和表7中。使用以上用于分级分离的SCCO₂条件，可在30分钟的提取时间内提取原料中95.5％的精油。在该高度纯化(>99％)的精油级分中，三种化学成分芳姜黄酮、α姜黄酮和β-姜黄酮占73.6wt％。

表10.通过不同溶剂提取的姜黄精油提取物的峰面积％

表11.总产率、用峰百分数表示的三种姜黄酮的分布

 

SCCO2条件	密度(g/cm3)	总产率(％)	芳姜黄酮(％)	β-姜黄酮(％)	α-姜黄酮(％)	总姜黄酮纯度(％)
							CO2＠40℃和300巴	0.909	4.2	34.9	21.4	20.0	76.5
CO2＠70℃和450巴；在28℃和60巴下分级	0.812	5.96	1.3	54.2	18.2	73.6

表12.SCCO₂提取/分级试验的运行条件和产率。通过提取物/原料计算产率。

 

进料(g)＝2000流速(kg/min)＝1.5	T(℃)	P(巴)	产率(％)
				提取器	70.1	450	2.35
步骤1	65	170	1.80
				步骤2	59	130	0.33
步骤3	28.4	60	1.18

在以上试验例中，将高纯化(81.3％)姜黄素类化合物级分收集于分离器1中(分离器2中的产率仅为0.02％，不存在任何明显量的精油或姜黄素类化学成分存在，因此弃去)。以原料为基准计，总产率为1.80wt％，姜黄素类化合物的浓度为81.3％。以原料为基准计，姜黄素类化合物的产率为22wt％。然而，SCCO₂残余物中仍保留78％的剩余姜黄素类化合物(5.42wt％)，在下面的步骤2中处理该残余物。分离器1提取的姜黄素类化合物级分的HPLC分析结果记录于表13中。

表13.分离器1中姜黄素类化合物提取级分

Cur＝姜黄素类化合物；C＝姜黄素；DMC＝去甲氧基姜黄素；BDMC＝双去甲氧基姜黄素。

实施例3

步骤2提取的实施例

将400克SFE步骤1残余物与95％乙醇装载入提取器中，75℃下混合5小时。然后停止混合，并使溶液静置16小时。滗析上层液，用颗粒保留尺寸为4～8μm的Fisherbrand P4滤纸过滤2次，以3000rpm进行离心。蒸发富含姜黄素类化合物的上清液，在真空干燥箱中于50℃干燥至馅饼状或喷雾干燥至干燥可流动粉末。然后该干燥提取产物被用于进一步处理(步骤3)。HPLC分析和数据显示于表14中。基于原始姜黄原料计，浸提过程的总产率为4.52wt％，姜黄素类化合物纯度为37.8％。以姜黄素类化合物的重量百分比计，姜黄素类化合物的分布或比例为：姜黄素35.1％、双去甲氧基姜黄素39.0％以及去甲氧基姜黄素25.9％。该提取工艺能够提取SFE残余物原料中83.3％的姜黄素类化学成分，总产率按天然姜黄属原料计为11.9wt％。保存固体残余物(底层)供进一步处理，得到姜黄肽蛋白和姜黄多糖的纯化级分(步骤5、6和7)。

表14.使用步骤1SFE残余物作为原料的提取物中浸提处理产率和姜黄素类化合物纯度

实施例4

乙醇浸提产物的SCCO₂纯化实施例

300克富含姜黄素类化合物的乙醇浸提处理的提取产物与2000克玻璃珠(外径＝80mm)混合，然后装载入24L SFE提取器中。一旦调节了提取温度和压力，即启动二氧化碳流。使压缩CO₂在提取器中往上流经垂直安装的床。诸如姜黄素类化合物的亲脂性物质被提取。溶液通过减压阀离开提取器，流入分离器1中，在那里CO₂被蒸发供再循环。使用三个串联的分离器，通过分三个阶段释放溶剂压力和降低温度来完成提取溶液的逐级沉淀。降低分离器1中的压力和温度之后，含有姜黄素类化合物的重产物沉淀于分离器1中。在分离器2和3中回收较轻产物，并丢弃，根据HPLC分析所述较轻产物由基本不含姜黄素类化合物的亲脂性化学成分组成。流体流速经质量流量计测量为3.5kg/min。总运行时间为120分钟，溶剂/原料比为426。提取器的条件为400巴的压力和90℃的温度。分离器的压力和温度设定如下：分离器1：170巴，63℃；分离器2：130巴，65℃；分离器3：60巴，28℃。分离器1中提取产物结果显示于表15中。为了进一步纯化和分布该提取物的姜黄素类化学成分，需要进行另外的SCCO₂提取和分级步骤(步骤4)。

表15.使用步骤2乙醇浸提提取步骤1SFE残余物的提取物作为原料的SCCO₂处理(步骤3)产率和姜黄素类化合物纯度

实施例5

步骤3姜黄素类化合物提取产物的纯化和分布实施例

将10克步骤3的提取产物与40ml(45gm)玻璃珠(直径＝4mm)混合，然后装载入1L提取容器1中，所述提取容器是HerbalScience专有的，设计为1L实验室规模SFE分离系统，模仿24L生产规模系统。吹扫和渗漏试验之后，使提取容器的压力为413巴，温度为90℃。使用两个分离器用于分级。分离器1的温度和压力设定在65℃和170巴，分离器2的温度和压力设定在65℃和130巴。一旦系统在设定条件下达到平衡，二氧化碳以40L/min的流量从提取容器中垂直安装的原料床底部流至顶部。二氧化碳的总流动时间为120分钟，其中溶剂与进料之比为705。使用HPLC分析每个分离器中提取的级分，以便鉴定姜黄素类化合物的化学成分，并计算这些组分的纯度。结果显示于表16中。

表16.步骤3提取产物的SCCO₂纯化和分布

富含姜黄素类化合物的提取产物的纯化和分布实施例

在姜黄素类化合物的纯化和分级分布(fractional profiling)的另一个实施例中，使用购自Suan Farma公司的高浓缩姜黄素类化合物提取产物(Lot#：CL02005)作为原料。在该原料提取物中，姜黄素类化合物总浓度为91.14wt％，其中姜黄素类化合物的分布如下：姜黄素(C)：68.22％；去甲氧基姜黄素(DMC)：9.63％；和双去甲氧基姜黄素(BDMC)：4.81％。将300克该提取产物与1,200克玻璃珠(外径＝1cm)的混合物装载入24L提取容器内。调节提取温度和压力，然后开始进料二氧化碳。使压缩二氧化碳在提取容器中向上流经垂直安装的原料床，提取包括姜黄素类化合物在内的亲脂化学成分。每30分钟，利用高压Haskel液体泵自提取容器的底部加入1.38L乙醇共溶剂，并使之静置5分钟，然后开始动态CO₂流。提取溶液通过减压阀离开提取容器，流入分离器1中，在分离器1中蒸发二氧化碳供再循环。使用三个串联的分离器，通过分三个阶段降低压力和温度来完成提取物的逐级沉淀。降低压力之后，最重的化学成分沉淀入分离器1中，较轻的化学成分则沉淀在分离器2和3中。通过质量流量计和流动时间来测量消耗的CO₂总重量。通过自动止回阀设定压力，提取器的压力精确为+/-3巴，而分离器的压力则精确为+/-1巴。用恒温器调节温度，精确至+/-1℃。使用质量流量计测量流体的流速。处理时间为2小时，CO₂流速为35kg/min。使用5.5L无水乙醇作为共溶剂。乙醇共溶剂在分离器3中与CO₂发生相分离，每30分钟将乙醇自系统中排出，以避免乙醇在系统中积累。经由蒸馏使乙醇再生。该提取实施例的结果显示于表17和表18中。

表17.Suan Farma原料的SCCO₂提取/分级条件和产率

 

进料(g)＝300流速(kg/min)＝3.55S/F＝1420共溶剂(％)＝1.0	T(℃)	P(巴)	产率(％)
				提取器	90.0	600	65.6
步骤1	63.0	170	60.3
				步骤2	61.0	130	1.0
步骤3	26.0	60	4.3

表18.Suan Farma原料在分离器1中的SCCO₂提取/分布提取产物

^＊产物重量/原料重量。^＊＊姜黄素重量/产物重量

实施例6

水浸提步骤2残余物的实施例

在恒定磁搅拌下，于90℃下将30g姜黄乙醇提取残余物(步骤2)加入盛有20体积蒸馏水的开口烧瓶中，持续3小时。以3000rpm离心浆液15分钟。收集上清液。基于原始原料的重量计，干物质总量产率为9.9％。利用旋转蒸发蒸除水分，将提取物浓缩60％左右。弃去固体残余物。分析结果作为“粗提物(crude)”列于表19中。

表19.通过乙醇沉淀的姜黄属水提取物的产率和多糖分析

实施例7

步骤6提取和纯化多糖级分的实施例

加入足量的乙醇来稀释得自步骤5的浓缩上清溶液，以制备最终的60％乙醇/水浓度溶液。这使得可溶于水、不溶于乙醇的多糖发生沉淀。然后以3000rpm离心该溶液15分钟，之后将其从沉淀中滗析。保存残余物溶液(residue solution)供进一步处理，以得到纯化姜黄蛋白(肽)级分(步骤7)。基于原始姜黄属原料计，沉淀产率为6.4wt％。利用旋转蒸发去除留在沉淀中的乙醇和水。使用比色法测量干燥沉淀中多糖含量。结果参见表15。选择60％乙醇/水溶液进行多糖沉淀，因为更高浓度的乙醇并不会实质增加多糖沉淀物的产率。此外，残余物溶液在190～300nm处的紫外扫描显示，在80％或更高浓度的乙醇/水溶液中，约202nm处的最大吸光度(由姜黄蛋白肽键引起的吸光度)消失，这表示肽(姜黄蛋白)在这些乙醇浓度下被沉淀。

为了进一步纯化通过60％乙醇沉淀获得的多糖级分，使用Sephadex G-10柱。Sephadex G-10由小的、多孔性、球形交联葡聚糖分子珠组成。Sephadex G-10由Sigma-Aldrich公司(St.Louis，Mo)供应，为直径为10～40μm的球形珠形式。当悬浮于水中时，材料中的孔隙将接纳分子量小于700的分子。Sephadex珠用蒸馏水水化16小时。通过加入Sephadex悬浮液来制备柱，以制成30ml床。将沉淀的多糖溶解于蒸馏水中至浓度为1wt％，并装载到柱上。原料加载流速约为1.8床体积/小时。收集流出液，并测量多糖含量。比色分析的结果显示于表20中。此外，使用AccuTOF-DART质谱进一步分析包含多糖级分的化合物的分子量。结果显示于图9、10、42～46和57～61中。这些数据表明，Sephadex G-10柱可纯化姜黄属多糖级分至92％左右的水平，以初始原料的重量计，产率为4.5％。

表20.使用乙醇提取残余物作为原料(步骤2)得到的水提取物和60％乙醇沉淀物的多糖分析

实施例8

步骤7提取和纯化姜黄蛋白级分的实施例

发现得自步骤6的多糖级分提取的上清残余物溶液的浓度为0.3wt％(438.9g乙醇/水溶液中含有1.3gm固体)。接着用磷酸缓冲盐溶液(0.01M NaCl，0.0027M KCl，pH7.4，25℃)将该浓缩溶液稀释至终浓度为1mg/ml(总溶液＝1300ml)。然后通过Sephadex G-10柱和Dowex阳离子交换柱纯化此溶液。

将Sephadex G-10珠浸泡于200ml蒸馏水中16小时。滗析水，并将珠子与新鲜的蒸馏水混合制成浆液。用30ml Sephadex浆液床填充柱子。将175ml的1mg/ml溶液装载入柱内，历时12小时(14.6ml/h)。收集流出液。质量分析表明，在此步骤中除去14.5％的固体，溶液中剩余0.150克固体。

使用具有磺酸(-SO₃H)基团作为交换基团的Dowex50-WX2-200强酸阳离子交换树脂珠，用于进一步纯化流出溶液。用蒸馏水洗涤Dowex树脂珠，滗析个蒸馏水。然后将Dowex在0.1M HCl中浸泡1小时，制成浆液。将Dowex浆液装载入玻璃柱内，以制备35ml床。用3倍床体积的蒸馏水冲洗树脂床。洗涤后，Dowex浆液的pH为2.4。将得自以上Sephadex步骤的流出液以2ml/min的速度装载到柱上。然后用磷酸缓冲盐溶液(用HCl调节pH至4.22)，以1.9ml/min的流速洗脱Dowex柱，持续90分钟。单独收集流出液和洗脱溶液，进行质量平衡和蛋白质含量分析。质量平衡显示被装载的固体中45.5％(0.068g)在洗脱溶液中，54.5％(0.082g)在流出液中。使用旋转蒸发仪蒸发流出液，在烘箱中干燥最终的姜黄蛋白级分产物。

来自步骤6和7的所有样品均通过紫外光谱仪、Bradford蛋白质分析法和质量平衡法来分析。这些分析的结果显示于表21中。紫外光谱结果记录于图8中。DART质谱色谱图见图47和62。

表21.每个步骤中的蛋白质处理产率和Bradford分析结果

 

编号	样品	质量(g)	产率(％)	C(mg/ml)	595nm处Bradford吸光度	BSA等价物(mg/ml)	溶液中BSA等价物(g)	BSA等价物产率(％)
									1	粗提取物	3.1	9.9	0.731	0.678	0.19	0.82	2.73
2	60％乙醇沉淀	1.8	6.0	0.5	0.551	0.01	0.04	0.14
									3	60％乙醇溶液	1.3	4.2	0.5	0.579	0.05	0.13	0.44
4	Sephadex流出液	1.11	3.7	0.5	0.552	0.01	0.03	0.09
									5	Dowex流出液	0.605	2.0	0.5	0.564	0.03	0.04	0.12
6	Dowex洗脱液	0.505	1.7	0.5	0.547	0.01	0.01	0.02

实施例9

将以下成分混合形成制剂：

新颖的姜黄提取物包含纯化的精油级分、姜黄素类化合物级分、姜黄蛋白级分和多糖级分，这些级分的重量百分比大于在天然根茎原料或传统提取产物中发现的含量。此外，姜黄素类化合物级分中姜黄素类化合物的纯度大于95％，姜黄素超过姜黄素类化合物各化学成分的85重量％。可将制剂制成任何口服剂型，可每日施用或每天施用15次，用于所需的生理和心理效果(增强记忆力和认知能力、镇痛以及缓解慢性关节炎、风湿性关节炎和炎症)以及医疗效果(抗氧化和清除自由基、抗血小板聚集和抗血栓形成、预防和治疗心脑血管疾病、抗动脉粥样硬化、抗高胆固醇血症、细胞保护、神经系统保护、预防和治疗神经变性疾病(例如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病)、抗炎、抗过敏、增强免疫、抗病毒、抗慢性肺病、肝保护和肝病、抗消化性溃疡、抗病毒和抗HIV以及预防和治疗癌症)。

实施例10

混合下列成分，制备以下制剂：

新颖的姜黄提取物包含纯化的新颖的精油、姜黄素类化合物、姜黄蛋白和多糖化学组成级分，这些级分的重量百分比大于在天然植物原料或传统提取产物中发现的含量。还注意到各姜黄提取物中的分布变化(profile change)(精油/姜黄素类化合物比例在原料中为0.97/1，在提取物中为0.2/1；精油/多糖比例在原料中为1.1/1，在提取物中为0.6/1；精油/姜黄蛋白比例在原料中为66.4/1，在提取物中为34/1；姜黄素类化合物/多糖比例在原料中为1.2/1，在提取物中为2/0/1；姜黄素类化合物/姜黄蛋白比例在原料中为66.4/1，在提取物中为113/1；以及多糖/姜黄蛋白比例在原料中为59/1，在提取物中为56/1)。此外姜黄素类化合物的分布已发生改变，使姜黄素的浓度(按占姜黄素类化合物的重量百分比计)，从天然植物原料中的66％增加到大于75％。可将制剂制成任何口服剂型，每天安全施用最多达15次，根据所需的生理、心理和医疗效果而定(参见以上实施例1)。

实施例11

聚集试验—利用以下合成Aβ_1-42肽进行这些试验：与5～80μM的不同浓度的本发明姜黄提取物孵育的合成Aβ_1-42肽(图11)，或与姜黄提取物和对照物(10μM)孵育，持续不同时间点(至多72小时)的合成Aβ_1-42肽(图12)，其中用硫磺素T方法监测聚集。硫磺素T方法主要检测成熟β-折叠片淀粉样蛋白纤维。在此试验中，与对照化合物相比，姜黄提取物是Aβ_1-42聚集的有效抑制剂。如图11中所示，10μM或20μM的姜黄提取物显著抑制Aβ_1-42聚集(P<0001，ANOVA)。此外，图12示出了姜黄提取物对Aβ_1-42聚集的时间依赖性影响的数据。在这些实验中，在10μM处，姜黄提取物孵育结果显示对聚集呈时间依赖性抑制，该抑制到孵育48小时显著，在72小时时进一步增加。

AβELISA—为了检测姜黄提取物对APP(淀粉样前体蛋白)裂解的影响，用宽剂量范围的每一种这些化合物处理SweAPP N2a细胞12小时。发现姜黄提取物以剂量依赖性方式降低SweAPP N2a细胞中Aβ的产生(Aβ_1-40和Aβ_1-42肽两者)(图12)。最重要地，与未经处理的细胞相比，10或20μM浓度的姜黄提取物使得SweAPP N2a细胞中Aβ的产生降低了30％～38％。

参考文献：

1.Asai A & Miyazawa T.J Nutr 131:2932，2001。

2.Asai A & Miyazawa T.Life Sci 67:2785，2000。

3.Srinivas L等，Arch Biochem Biophys 292(2):617，1992。

4.Lee SK等，J Environ Pathol Toxicol Oncol 21(2):141，2002。

5.Gonda R等，Chem Pharm Bull(Tokyo)38(2):482，1990。

6.Kim KI等，MoI Cells 10(4):392，2000。

7.Govendarajan VS.CRC Critical Reviews in Food Sci and Nutrition 12(3):200，1980。

8.Gonda R等，Chem Pharm Bull 40:185，1992。

9.Anuchapreeda S等，Biochem Pharmacol 64:573，2002。

10.Srinivasan KR.Current Sci 2:311，1952。

11.Kiuchi F等，Chem Pharm Bull 41:1640，1993。

12.Shoba G等，Planta Med 64:353，1998。

13.Sharma RA等，Clin Cancer Res 7:1452，2001。

14.Lal B等，Phytother Res 13:318，1999。

15.Cheng AL等，Anticancer Res 21:2895，2001。

16.Sharma RA等，Clin Cancer Res 7:1894，2001。

17.Hong CH等，Planta Med 68(6):545，2002。

18.Jayaprεkasha GK等，Z Naturforsch[C]57(9-10):828，2002。

19.Satoskar RR等，Int J Clin Pharmocol Toxicol 24:651，1986。

20.Chandra D & Gupta SS.J Med Res 60:138，1972。

21.Deodhar SD等，Ind J Med Res 71:632，1980。

22.Srivastava V等，Arzneim-Forsch/Drug Res 36(1):715，1986。

23.Srivastava R等，Thrombosis Res 40:413，1985。

24.Soni KB & Kuttan R.Ind J Physiol Pharmacol 36(4):273-5&239-43，1992。

25.Cohly MHP等，Int J MoI Sci 3:985，2002。

26.Jain JP等，J Res Ind Med Yoga and Homeo 14:110，1979。

27.Egan ME等，Science 304:600，2004。

28.DunsmoreKE等，Crit Care Med 29(11):2199，2001。

29.ShakaiK等，Chem Pharm Bull 37(10):215，1989。

30.Lim GP等，J Neurosci 21:8370，2001。

31.Natarajan C & Bright JJ.J Immunol 168(12):6506，2002。

32.Shao ZM等，Int J Cancer 98(2):234，2002。

33.KimKI等，Biosci Biotechnol Biochem 65(11):2369，2001。

34.Li CJ等，Proc Natl Acad Sci(USA)90:1839。

35.Phan TT等，J Trauma 51(5):927，2001。

36.Williamson EM.Phytomed 8(5):401，2001。

37.Jovanovic SV等，J Am Chem Soc 123(13):3064，2001。

38.Siwak DR等，Cancer 104:879-890，2005。

Claims (41)

1.姜黄属提取物，其包含具有图9、10或14～78中任何一幅的实时直接分析(DART)质谱色谱图的级分。

2.根据权利要求1所述的姜黄属提取物，其中所述级分具有图14～31、36、37、41、51、52或56中任何一幅的DART质谱色谱图。

3.根据权利要求1所述的姜黄属提取物，其中所述级分具有图35、38～40、50或53～55中任何一幅的DART质谱色谱图。

4.根据权利要求1所述的姜黄属提取物，其中所述级分具有图9、10、42～46或57～61中任何一幅的DART质谱色谱图。

5.根据权利要求1所述的姜黄属提取物，其中所述级分具有图32～34或47～49中任何一幅的DART质谱色谱图。

6.根据权利要求1所述的姜黄属提取物，其中所述级分具有图63～78中任何一幅的DART质谱色谱图。

7.根据权利要求1所述的姜黄属提取物，其中所述级分具有图47或62的DART质谱色谱图。

8.根据权利要求1所述的姜黄属提取物，其中所述提取物包含具有图63～78中任何一幅的DART质谱色谱图的精油级分和具有图9、10、42～46或57～61中任何一幅的DART质谱色谱图的多糖级分。

9.根据权利要求1所述的姜黄属提取物，其中所述提取物包含具有图63～78中任何一幅的DART质谱色谱图的精油级分、具有图9、10、42～46或57～61中任何一幅的DART质谱色谱图的多糖级分和具有图47或62的DART质谱色谱图的姜黄蛋白级分。

10.根据权利要求1所述的姜黄属提取物，其中所述提取物包含姜黄素类化合物、姜黄酮、多糖和/或姜黄蛋白。

11.根据权利要求10所述的姜黄属提取物，其中所述姜黄素类化合物选自姜黄素、四氢姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素及其组合。

12.根据权利要求10所述的姜黄属提取物，其中姜黄素类化合物的量为至少约75重量％。

13.根据权利要求10所述的姜黄属提取物，其中所述姜黄酮选自α-姜黄酮、芳姜黄酮、β-姜黄酮及其组合。

14.根据权利要求10所述的姜黄属提取物，其中姜黄酮的量为至少5重量％。

15.根据权利要求10所述的姜黄属提取物，其中姜黄蛋白的量为至少约5重量％。

16.根据权利要求10所述的姜黄属提取物，其中所述多糖选自Ukonan A、Ukonan B、Ukonan C及其组合。

17.根据权利要求10所述的姜黄属提取物，其中多糖的量为至少约5重量％。

18.食品或药物，其包含权利要求1所述的姜黄属提取物。

19.患有淀粉样斑块聚集或原纤维形成的受治疗者的治疗方法，其包括对有需要的受治疗者施用有效量的权利要求1所述的姜黄属提取物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述受治疗者患有阿尔茨海默氏病。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述姜黄属提取物进一步包含协同量的α-乳香酸和/或β-乳香酸和/或其C-乙酸酯。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述受治疗者为灵长类、牛、绵羊、马、猪、啮齿类、猫或狗。

23.根据权利要求19所述的方法，其中所述受治疗者为人。

24.预防组织中淀粉样斑块聚集或原纤维形成的方法，其包括使组织与有效量的权利要求1所述的姜黄属提取物接触。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述姜黄属提取物进一步包含协同量的α-乳香酸和/或β-乳香酸和/或其C-乙酸酯。

26.制备具有至少一种预定特征的姜黄属提取物的方法，其包括通过以下步骤顺序提取姜黄属植物原料，以得到精油级分、姜黄素类化合物级分、多糖级分以及姜黄蛋白级分：

a.通过超临界二氧化碳提取法提取姜黄属植物原料得到精油级分和第一残余物；

b.通过超临界二氧化碳提取法提取姜黄属植物原料或得自步骤a)的第一残余物，得到姜黄素类化合物级分和第二残余物；

c.通过热水提取法提取得自步骤b)的第二残余物，得到多糖溶液，然后用乙醇使所述多糖沉淀得到多糖级分和第三残余物；以及

d.通过柱色谱法从得自步骤c)的第三残余物中分离姜黄蛋白级分。

27.根据权利要求26所述的方法，其中步骤a)包括：

1)将磨碎的姜黄属植物原料装载入提取容器中；

2)在超临界条件下加入二氧化碳；

3)使磨碎的姜黄属植物原料与二氧化碳接触一段时间；和

4)将精油级分收集于收集容器中。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述超临界条件包括约250巴～约500巴的压力和约30℃～约80℃的温度。

29.根据权利要求27所述的方法，其中用于步骤a)的提取条件包括提取容器的压力为约250巴～约500巴，温度为约35℃～约90℃，以及分离器收集容器的压力为约40巴～约150巴，温度为约20℃～约50℃。

30.根据权利要求26所述的方法，其中步骤b)包括：

1)将磨碎的姜黄属植物原料或得自步骤a)的第一残余物装载于提取容器中；

2)在超临界条件下加入二氧化碳；

3)使磨碎的姜黄属植物原料或得自步骤a)的第一残余物与二氧化碳接触一段时间；和

4)在分级分离器收集容器中收集姜黄素类化合物级分。

31.根据权利要求30所述的方法，其中用于步骤b)的提取条件包括提取容器的压力为约350巴～约700巴，温度为约60℃～约95℃，以及分离器收集容器的压力为约120巴～约220巴，温度为约55℃～约75℃。

32.根据权利要求26所述的方法，其中步骤c)包括：

1)使得自步骤b)的第二残余物与水溶液在约85℃～约100℃下接触足以提取多糖的一段时间；

2)通过乙醇沉淀将固体多糖从溶液中分离；和

3)使用柱色谱法纯化多糖级分。

33.根据权利要求26所述的方法，其中步骤d)包括：

1)使得自步骤c)的第三残余物通过用于分离高分子量分子和低分子量分子的树脂柱；和

2)使用阳离子交换树脂柱纯化较高分子量的流出溶液，以从流出溶液中收集姜黄蛋白级分。

34.姜黄属提取物，其通过权利要求26～33中任一项所述的方法制备。

35.姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计0.1～5％的四氢姜黄素、按姜黄素重量计10～20％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计1～5％的双去甲氧基姜黄素。

36.姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计0.1～5％的四氢姜黄素、按姜黄素重量计15～25％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计1～10％的双去甲氧基姜黄素。

37.姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计0.1～5％的四氢姜黄素、按姜黄素重量计20～30％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计1～10％的双去甲氧基姜黄素。

38.姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计30～40％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计5～15％的双去甲氧基姜黄素。

39.姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计45～55％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计40～50％的双去甲氧基姜黄素。

40.姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计15～25％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计1～10％的双去甲氧基姜黄素。

41.姜黄属提取物，其包含姜黄素、按姜黄素重量计0.1～5％的四氢姜黄素、按姜黄素重量计20～30％的去甲氧基姜黄素和按姜黄素重量计5～15％的双去甲氧基姜黄素。

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