BRPI0706314A2 - método de tratar um paciente que sofre de um distúrbio osteolìtico - Google Patents

Abstract

MéTODO DE TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE UM DISTúRBIO OSTEOLìTICO. Métodos para prevenir e tratar osteólise, metástase do câncer e perda óssea associada com metástase do câncer administrando-se um antagonista de M-CSF em combinação com um agente terapêutico a um paciente são fornecidos.

Description

"MÉTODO DE TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE UMDISTÚRBIO OSTEOLÍTICO"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção diz respeito a métodos para prevenir e tratardoenças osteolíticas, incluindo metástase do câncer e perda óssea associadacom metástase do câncer administrando-se um antagonista de M-CSF emcombinação com um outro agente terapêutico a um paciente.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Osteoclastos, que medeiam reabsorção óssea, estão envolvidosem processos de remodelagem óssea normais e anormais, incluindo doençasosteolíticas. Osteoclastos são células multinucleadas que diferenciam-se decélulas hematopoiéticas. Geralmente é aceito que osteoclastos são formadospela fusão de precursores mononucleares derivados de células-troncohematopoiéticas na medula óssea, ao invés de divisões celulares incompletas(Chambers, Bone and Mineral Research, 6: 1-25, 1989; Gõthling et al., ClinOrthop Relat R. 120: 201-228, 1976; Kahn et al., Nature 258: 325-327, 1975,Suda et al., Endocr Rev 13: 66-80, 1992; Walker, Ciência 180: 875, 1973;Walker, Science 190: 785-787, 1975; Walker, Science 190: 784-785, 1975).Eles compartilham uma célula-tronco comum com células de linhagem demonócito-macrófago (Ash et al., Nature 283: 669-670, 1980, Kerby et al., 1Bone Miner Res 7: 353-62, 1992). A diferenciação de precursores deosteoclasto em osteoclastos multinucleados maduros requer fatores diferentesincluindo estímulos hormonais e locais (Athanasou et al., Bone Miner 3: 317-333, 1988; Feldman et al., Endocrinology· 107: 1137-1143, 1980; Walker,Science 190: 784-785, 1975; Zheng et al., Histochem J 23: 180-188, 1991) ecélulas do osso vivo e ósseas mostraram desempenhar um papel crítico nodesenvolvimento de osteoclasto (Hagenaars et al., Bone Miner 6: 179-189,1989). As células osteoblásticas ou estromais da medula óssea também sãonecessárias para a diferenciação de osteoclasto. Um dos fatores produzidospor estas células que sustenta a formação de osteoclasto é fator estimulante decolônia de macrófago, M-CSF (Wiktor-Jedrzejvzak et al., Proc Natl Acad SciUSA 87: 4828-4832, 1990; Yoshida et al., Nature 345: 442-444, 1990). Oativador do receptor para o ligando B de NF-κ (RANKL, também conhecidocomo TRANCE, ODF e OPGL) é um outro sinal (Suda et al., Endocr Rev 13:66-80, 1992) através do qual células osteoblásticas/estromais estimulam aformação de osteoclasto e reabsorção por intermédio de um receptor, RANK(TRANCER), localizado em osteoclastos e precursores de osteoclasto (Laceyet al., Cell 93: 165-176, 1998; Tsuda et al., Biochem Biophys'Res Co 234:137-142, 1997; Wong et al., J Exp Med 186: 2075-2080, 1997; Wong et al., JBiol. Chem 272: 25190-25194, 1997; Yasuda et al., Endocrinology 139:1329-1337, 1998; Yasuda et al., Proc Natl Acad'Sci US 95: 3597-3602,1998). Os osteoblastos também secretam uma proteína que inibe fortemente aformação de osteoclasto chamada osteoprotegerina (OPG, também conhecidacomo OCIF), que age como um receptor isca para o RANKL inibindo assim osinal positivo entre osteoclastos e osteoblastos por intermédio de RANK eRANKL.

Os osteoclastos são responsáveis por dissolver tanto a matrizóssea mineral quanto orgânica (Blair et al., J Cell Biol 102: 1164-1172, 1986).Os osteoclastos representam células terminalmente diferenciadas queexpressam uma única morfologia polarizada com áreas de membranaespecializadas e vários marcadores de membrana e citoplasmáticos, tais comofosfatase ácida resistente a tartrato (TRAP) (Anderson et al. 1979), anidrasecarbônica II (Vaananen et al., Histochemistry 78: 481-485, 1983), receptor decalcitonina (Warshafsky et al., Bone 6: 179-185, 1985) e receptor devitronectina (Davies et al., J Cell Biol 109: 1817-1826, 1989). Osteoclastosmultinucleados usualmente contêm menos do que 10 núcleos, mas eles podemconter até 100 núcleos estando entre 10 e 100 μπι em diâmetro (Gothling etal., Clin Orthop Relat R 120: 201-228, 1976). Isto os tornam relativamentefáceis para identificar por microscopia óptica. Eles são altamente vacuoladosquando no estado ativo, e também contêm muita mitocôndria, indicativo deuma taxa metabólica alta (Mundy, em Primer on the metabolic bone diseasesand disorders of mineral metabolism, páginas 18-22, 1990). Visto que ososteoclastos desempenham um papel principal em metástases ósseasosteolíticas, existe uma necessidade na técnica para novos agentes e métodos para prevenir a estimulação e função do osteoclasto.

A metástase do câncer é a principal causa de recaída pósoperação ou pós terapia em pacientes com câncer. Apesar de esforços intensospara desenvolver tratamentos, a metástase do câncer permanecesubstancialmente refratária à terapia. O osso é um dos sítios mais comuns demetástase de vários tipos de cânceres humanos (por exemplo, cânceres demama, pulmão, próstata e tireóide). A ocorrência de metástases ósseasosteolíticas causa séria morbidez devido à dor intratável, alta suscetibilidade àfratura, compressão nervosa e hipercalcemia. Apesar da importância destesproblemas clínicos, existem poucos tratamentos disponíveis para a perdaóssea associada com metástase do câncer.

Várias estratégias terapêuticas alvejando a doença osteolíticaestão correntemente sendo usadas ou em desenvolvimento, onde esforçosfocaram principalmente no desenvolvimento de medicamentos para bloqueara reabsorção óssea através da inibição da formação ou atividade dososteoclastos. Os bisfosfonatos (BPs), análogos de pirofosfato que concentram-se no osso, são até agora os inibidores mais eficazes de reabsorção óssea. BPssão absorvidos por osteoclastos, inibindo sua atividade e fazendo com que ascélulas sofram apoptose, inibindo deste modo a reabsorção óssea.Alendronato foi o primeiro inibidor de BP da reabsorção óssea a mostrar umaredução significante em fraturas da espinha dorsal/quadril, e é aprovado parao tratamento de osteoporose. O BP de última geração, Zometa, é aprovadopara o tratamento de hipercalcemia e doença óssea em tumores sólidos emieloma múltiplo e está sob investigação quanto ao possível tratamento dedoença de Paget e metástase óssea que resulta de tumores sólidos e mielomamúltiplo. Zometa age em doses muito baixas, e é dado como uma infusão i.v.de 15 minutos uma vez por mês, mas também afeta os osteoblastos e podecausar efeitos colaterais tais como toxicidade renal e osteonecrose do maxilar(Fromigue e Brody, J, Endocrinol. Invest. 25:39-46, 2002; Ibrahim, A. et al.,Clin. Canc. Res. 9: 2394-99, 2003; Body, J.J., The Breast. S2.S37-44, 2003;Yaccoby, S. et al., Brit. J. Hemat., 116:278-80, 2002; Corey, E. et al., Clin.Canc. Res. 9: 295-306, 2003; Coleman, R.E., Sem. Oncol., 29(6): 43-49,2002; Coleman, R.E., Eur. Soe. Med. Oncol. 16:687-95, 2005; Bamias et al., JClin Oncol 13: 8580-8587, 2005. Assim, permanece uma necessidade natécnica para identificar novos agentes e métodos para prevenir ou tratardoenças osteolíticas e/ou metástase do câncer, incluindo metástases ósseasosteolíticas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As composições e métodos da presente invenção satisfazem asnecessidades anteriormente mencionadas e outras relacionadas na técnica. Emuma forma de realização da invenção, um método é fornecido para tratar umpaciente que sofre de ou em risco de um distúrbio osteolítico compreendendoadministrar ao paciente uma quantidade monoterapeuticamente eficaz de umantagonista de M-CSF e uma quantidade monoterapeuticamente eficaz de umagente anti-osteoclasto secundário por um período de transição de cerca de 1dia a um ano, durante o qual o antagonista de M-CSF reduz o número deosteoclastos ativos a um nível terapeuticamente desejável. Antagonistas de M-CSF exemplares incluem anticorpos de M-CSF e agentes anti-osteoclastosecundários exemplares incluem bisfosfonatos e inibidores de RANKL,incluindo anticorpos anti-RANKL. Os métodos e/ou usos envolvendoanticorpo anti-M-CSF e inibidor de osteoclasto aqui opcionalmente excluem ouso de RX1, 5H4, anticorpos derivados de MCl e MC3 divulgados naPublicação Internacional N2 WO 2005/068503. A duração do período detransição pode ser, por exemplo, pelo menos um dia até um ano, e pode sermonitorada, por exemplo, por marcadores relevantes de crescimento ouatividade de osteoclasto. Alternativamente, eles podem ser fornecidossimultaneamente.

Por via de exemplo, marcadores de formação óssea incluemmas não são limitados a cálcio, e fosfatase alcalina total e específica do osso(BAP), osteocalcina (OC, glaproteína óssea), propeptídeo C de procolagenotipo I (PICP), propeptídeo N de Procolágeno tipo I (PINP), e marcadores dereabsorção óssea incluem mas não são limitados a NTX (telopeptídeo dereticulação de terminal N de colágeno ósseo) e CTX (telopeptídeo dereticulação de terminal C de colágeno ósseo), ligações cruzadas de piridínio(piridinolina e desoxipiridinolina [DPD]) e peptídeos associados, produtos dedegradação de colágeno ósseo tipo I glicosídeos hidroxiprolina ehidroxilisina, fosfatase ácida resistente a tartrato (TRACP), e sialoproteínaóssea (BSP). Ver Fohr et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., Novembro de 2003,88(11): 5059-5075.

Em formas de realização relacionadas, os métodosanteriormente mencionados são fornecidos em que o agente anti-osteoclastosecundário é descontinuado depois do período de transição. Em outras formasde realização relacionadas, os métodos anteriormente mencionados sãofornecidos em que a quantidade do agente anti-osteoclasto secundário éreduzida depois do período de transição. Em outras formas de realizaçãorelacionadas, os métodos anteriormente mencionados são fornecidos em que aquantidade de antagonista de M-CSF é reduzida depois do período detransição.

E considerado que os métodos da presente invenção obtêm seupotencial terapêutico inibindo-se a interação entre M-CSF e seu receptor(M-CSFR). E considerado ainda que a inibição da interação de M-CSF/M-CSFR inibe a proliferação e/ou diferenciação de osteoclasto. Em qualquer umdos métodos ou composições da invenção, o antagonista de M-CSF pode serum polipeptídeo compreendendo um anticorpo anti-M-CSF; um polipeptídeocompreendendo um anticorpo anti-M-CSFR; um polipeptídeo solúvelcompreendendo uma muteína de M-CSF ou derivado desta; ou umpolipeptídeo solúvel compreendendo uma muteína de M-CSFR ou derivadodesta; ou uma molécula de ácido nucléico que inibe a expressão de M-CSF ouM-CSFR. A identificação, produção e modificação de vários antagonistas deM-CSF é descrita na Publicação Internacional Ne WO 2005/068503, por meiodesta incorporada por referência em sua totalidade.

O anticorpo de M-CSF pode ser um anticorpo policlonal; umanticorpo monoclonal; um anticorpo humanizado; um anticorpo humano; umanticorpo engendrado humano; um anticorpo quimérico; fragmento deanticorpo Fab, F(ab')2 ou Fv; ou uma muteína de qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados.

Os anticorpos de M-CSF da presente invenção que inibem aosteólise são descritos na Publicação Internacional N2 WO 2005/068503, queé por meio desta incorporada por referência em sua totalidade quanto ao seuensinamento com respeito aos anticorpos de M-C SF.

Em uma forma de realização da invenção, um anticorpomonoclonal que não de murino é fornecido, incluindo fragmento funcional,que especificamente liga-se ao mesmo epítopo de M-CSF como qualquer umde anticorpo monoclonal de murino RX1, MCI, ou MC3 tendo as seqüênciasde aminoácido apresentadas nas Figuras 1, 3, e 4, respectivamente. Em umaforma de realização relacionada, um anticorpo anteriormente mencionado éfornecido em que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste de umanticorpo policlonal; um anticorpo monoclonal incluindo um anticorpoHuman Engineered®; um anticorpo humanizado; um anticorpo humano; umanticorpo quimérico; fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2; Fv; ScFv ou SCA;um diacorpo; anticorpo linear; ou uma muteína de qualquer um destesanticorpos, que preferivelmente retêm afinidade de ligação de pelo menos 10"10" ou 10" ou mais alto. Um anticorpo monoclonal que não de murino,incluindo fragmento funcional, que compete com anticorpo monoclonal RX1,MCI, e/ou MC3 tendo a seqüência de aminoácido apresentada na Figura 1pela ligação a M-CSF em mais do que 75 %, também é considerado.

Em uma outra forma de realização, um anticorpo monoclonalque não de murino, incluindo fragmento funcional, em que o dito anticorpomonoclonal que não de murino ou fragmento funcional deste liga um epítopode M-CSF que inclui pelo menos 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos contíguos deaminoácidos 98 a 105 da Figura 7 é fornecido.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece umanticorpo monoclonal que não de murino, incluindo fragmento funcional, emque o dito anticorpo monoclonal que não de murino ou fragmento funcionaldeste liga um epítopo de M-CSF que inclui pelo menos 4, 5, 6, 7 ou 8resíduos contíguos de aminoácidos 65 a 73 ou 138 a 144 da Figura 7(correspondendo a epítopos de M-CSF reconhecidos por 5H4 ou MC3).

Ainda em uma outra forma de realização, o anticorpo oufragmento anteriormente mencionado que liga um epítopo de M-CSF queinclui os aminoácidos 98 a 105 da Figura 7 é fornecido. Em uma forma derealização relacionada, o anticorpo anteriormente mencionado é fornecidocompreendendo CDR3 da Figura IA. Em uma outra forma de realização, oanticorpo é fornecido compreendendo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 CDRs deanticorpo de murino RXl apresentado na Figura IA. Um tal anticorpo quecompreende pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 CDRs de anticorpo de murino RXltambém pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 CDRs de qualquer umadas 6 CDRs de anticorpo 5H4 apresentado na Figura 8A-B. Alternativamente,o anticorpo que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 CDRs de anticorpo demurino RXl também pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 CDRs dequalquer um das 6 CDRs de anticorpo MCl apresentado na Figura 8A-B.Ainda em uma outra alternativa, o anticorpo anteriormente mencionadotambém pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 CDRs de qualquer umadas 6 CDRs de anticorpo MC3 apresentado na Figura 8A-B. Em uma formade realização relacionada, o anticorpo que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4,ou 5 CDRs de anticorpo de murino RXl pode compreender pelo menos 1, 2,3, 4 ou 5 CDRs das CDRs de consenso apresentadas na Figura 8A-B éfornecido. Ainda em uma outra forma de realização relacionada, no anticorpoanteriormente mencionado um ou mais resíduos da(s) CDR(s) de consensosão substituídos pelo resíduo correspondente de qualquer uma das CDRs deanticorpo de murino RX1, 5H4, MCl ou MC3. A afinidade de ligaçãodesejada pode ser retida ainda que um ou mais dos aminoácidos no anticorpoforam mutados, por exemplo por substituições conservativas nas CDRs, e/oumudanças conservativas ou não conservativas nos resíduos de risco baixo emoderado.

Em uma outra forma de realização da invenção, variantes doanticorpo anteriormente mencionado são fornecidas, compreendendo umaseqüência de aminoácido de cadeia pesada variável que é pelo menos 60, 65,70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 % homóloga àseqüência de aminoácido apresentada nas Figuras IA, 2, 3, ou 4. em umaforma de realização relacionada, o anticorpo compreende uma seqüência deaminoácido de cadeia leve variável que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85,90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 % homóloga à seqüência deaminoácido apresentada nas Figuras IA, 2, 3, ou 4.

Ainda em uma outra forma de realização, o anticorpocompreende uma região constante e uma ou mais regiões de estruturavariáveis de cadeia pesada e leve de uma seqüência de anticorpo humano. Emuma forma de realização relacionada, o anticorpo compreende uma regiãoconstante modificada ou não modificada de uma IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4humana. Em uma forma de realização preferida, a região constante é IgGl ouIgG4 humana, que opcionalmente pode ser modificada para realçar oudiminuir certas propriedades. No caso de IgGl, modificações à regiãoconstante, particularmente a região da dobradiça ou CH2, podem aumentar oudiminuir a função efetora, incluindo atividade de ADCC e/ou CDC. Emoutras formas de realização, uma região constante de IgG2 é modificada paradiminuir a formação de agregado de anticorpo-antígeno. No caso de IgG4,modificações à região constante, particularmente a região da dobradiça,podem reduzir a formação de meio-anticorpos.

Em uma forma de realização da invenção, um anticorpomonoclonal que não de murino é fornecido que especificamente liga-se aomesmo epítopo de M-CSF como qualquer um dos anticorpos de murino RX1,5H4, MCl ou MC3 como descrito na Publicação Internacional N2 WO2005/068503, ou compete com qualquer um dos anticorpos de murinoanteriormente mencionados pela ligação a M-CSF em mais do que 10 %, maispreferivelmente em mais do que 25 %, ainda mais preferivelmente em maisdo que 50%, ainda mais preferivelmente em mais do que 75 %, e o maispreferivelmente mais do que 90 %. Anticorpos derivados das seqüências detais anticorpos de murino, incluindo os anticorpos quimérico, humano,humanizado, engendrado humano, ou fragmentos ou muteínas ou versõesquimicamente derivadas destes, são descritos na WO 2005/068503.

O termo "anticorpo derivado de RX1" inclui qualquer um dosseguintes:

1) uma variante de aminoácido de anticorpo de murino RXltendo a seqüência de aminoácido apresentada na Figura 1, incluindo variantescompreendendo uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada variável queé pelo menos 60, 65, 70, 75; 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 %homóloga à seqüência de aminoácido como apresentado na Figura 1, e/oucompreendendo uma seqüência de aminoácido de cadeia leve variável que épelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 %homóloga à seqüência de aminoácido como apresentado na Figura 1,considerando aminoácidos similares para a determinação de homologia;

2) Polipeptídeos de ligação de M-CSF (excluindo anticorpo demurino RX1) compreendendo uma ou mais regiões determinantes decomplementaridade (CDRs) de anticorpo de murino RXl tendo a seqüênciade aminoácido apresentada na Figura 1, preferivelmente compreendendo pelomenos CDR3 da cadeia pesada de RX1, e preferivelmente compreendendoduas ou mais, ou três ou mais, ou quatro ou mais, ou cinco ou mais, ou todasas seis CDRs;

3) Anticorpos Human Engineered® tendo as seqüências deaminoácido de cadeia pesada e leve apresentadas nas Figuras 9B a 12B ouvariantes destes compreendendo uma cadeia pesada ou leve tendo pelo menos60 % de identidade de seqüência de aminoácido com a cadeia pesada ou levede Human Engineered® original das Figuras 9B a 12B, mais preferivelmentepelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, maispreferivelmente pelo menos 90 %, e o mais preferivelmente pelo menos 95 %,incluindo por exemplo, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85%, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 93 %, 96 %, 97%, 98 %, 99 %, e 100 % idêntica;

4) Polipeptídeos de ligação de M-CSF (excluindo o anticorpode murino RX1) compreendendo os resíduos de risco alto de uma ou maisCDRs dos anticorpos Human Engineered® das Figuras 9B a 12B, epreferivelmente compreendendo resíduos de risco alto de duas ou mais, outrês ou mais, ou quatro ou mais, ou cinco ou mais, ou todas as seis CDRs;

5) Anticorpos Human Engineered® ou variantes que retêm osresíduos de aminoácido de risco alto apresentados na Figura 1B, ecompreendendo uma ou mais mudanças nos resíduos de risco baixo oumoderado apresentados na Figura 1B;por exemplo, compreendendo uma ou mais mudanças em umresíduo de risco baixo e substituições conservativas em um resíduo de riscomoderado apresentado na Figura 1B, ou

por exemplo, retendo os resíduos de aminoácido de riscomoderado e alto apresentados na Figura IB e compreendendo uma ou maismudanças em um resíduo de risco baixo,

onde mudanças incluem inserções, supressões ou substituiçõese podem ser substituições conservativas ou podem fazer com que o anticorpoengendrado esteja mais próximo em seqüência a uma seqüência humana decadeia leve ou cadeia pesada, uma seqüência humana de linha germinativa decadeia leve ou cadeia pesada, uma seqüência humana de cadeia leve ou cadeiapesada de consenso, ou uma seqüência humana de linha germinativa de cadeialeve ou cadeia pesada de consenso;

que retêm a capacidade para ligar M-CSF. Tais anticorpospreferivelmente ligam-se a M-CSF com uma afinidade de pelo menos 10",10" ou 10" ou mais alto e preferivelmente neutralizam a osteoclastogêneseque induz a atividade de M-CSF.

Similarmente, o termo "anticorpo derivado de MC3" incluiqualquer um dos seguintes:

1) uma variante de aminoácido de anticorpo de murino MC3tendo a seqüência de aminoácido apresentada na Figura 4, incluindo variantescompreendendo uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada variável queé pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 %homóloga à seqüência de aminoácido como apresentado na Figura 4, e/oucompreendendo uma seqüência de aminoácido de cadeia leve variável que épelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 %homóloga à seqüência de aminoácido como apresentado na Figura 4,considerando aminoácidos similares para a determinação de homologia;

2) Polipeptídeos de ligação de M-CSF (opcionalmenteincluindo ou excluindo anticorpo de murino MC3) compreendendo uma oumais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de anticorpo demurino MC3 tendo a seqüência de aminoácido apresentada na Figura 4,preferivelmente compreendendo pelo menos CDR3 da cadeia pesada de MC3,e preferivelmente compreendendo duas ou mais, ou três ou mais, ou quatro oumais, ou cinco ou mais, ou todas as seis CDRs;

3) Anticorpos Human Engineered® gerados alterando-se aseqüência de murino de acordo com os métodos apresentados em Studnicka etai., Patente U.S. N- 5.766.886 e Exemplo 4A aqui, usando a numeração deKabat apresentada nas Figuras 13C-13E para identificar resíduos de riscobaixo, moderado e alto; tais anticorpos compreendendo pelo menos uma dascadeias pesadas seguintes e pelo menos uma das cadeias leves seguintes: (a)uma cadeia pesada em que todos os resíduos de risco baixo forammodificados, se necessário, para serem os mesmos resíduos como umaseqüência de imunoglobulina de referência humana ou (b) uma cadeia pesadaem que todos os resíduos de risco baixo e moderado foram modificados, senecessário, para serem os mesmos resíduos como uma seqüência deimunoglobulina de referência humana, (c) uma cadeia leve em que todos osresíduos de risco baixo foram modificados, se necessário, para serem osmesmos resíduos como uma seqüência de imunoglobulina de referênciahumana ou (b) uma cadeia leve em que todos os resíduos de risco baixo emoderado foram modificados, se necessário, para serem os mesmos resíduoscomo uma seqüência de imunoglobulina de referência humana

4) variantes dos anticorpos anteriormente mencionados noparágrafo (3) precedente compreendendo uma cadeia pesada ou leve tendopelo menos 60 % de identidade de seqüência de aminoácido com a cadeiapesada ou leve de Human Engineered® original, mais preferivelmente pelomenos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmentepelo menos 90 %, e o mais preferivelmente pelo menos 95 %, incluindo porexemplo, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87%, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%, e 100 % idêntico;

5) polipeptídeos de ligação de M-CSF (opcionalmenteincluindo ou excluindo o anticorpo de murino MC3) compreendendo osresíduos de risco alto de uma ou mais CDRs do anticorpo MC3 de murino daFigura 4, e preferivelmente compreendendo resíduos de risco alto de duas oumais, ou três ou mais, ou quatro ou mais, ou cinco ou mais, ou todas as seisCDRs;

6) anticorpos Human Engineered ou variantes retendo osresíduos de aminoácido de risco alto de anticorpo MC3 de murino, ecompreendendo uma ou mais mudanças nos resíduos de risco baixo oumoderado;

por exemplo, compreendendo uma ou mais mudanças em umresíduo de risco baixo e substituições conservativas em um resíduo de riscomoderado, ou

por exemplo, retendo os resíduos de aminoácido de riscomoderado e alto e compreendendo uma ou mais mudanças em um resíduo derisco baixo,

onde mudanças incluem inserções, supressões ou substituiçõese podem ser substituições conservativas ou podem fazer com que o anticorpoengendrado esteja mais próximo em seqüência a uma seqüência humana decadeia leve ou cadeia pesada, uma seqüência humana de linha germinativa decadeia leve ou cadeia pesada, uma seqüência humana de cadeia leve ou cadeiapesada de consenso, ou uma seqüência humana de linha germinativa de cadeialeve ou cadeia pesada de consenso;

que retêm capacidade para ligar M-CSF. Tais anticorpospreferivelmente ligam-se a M-CSF com uma afinidade de pelo menos 10",10"8 ou 10"9 ou mais alto e preferivelmente neutralizam a osteoclastogêneseque induz a atividade de M-CSF.

O termo "anticorpo derivado de 5H4" ou "anticorpo derivadode MCI" é similarmente definido de acordo com a descrição acima.

Como descrito em detalhe aqui, anticorpos derivados de RX1,5H4, MCl ou MC3, incluindo anticorpos Human Engineered® ou variantes,podem ser de isótopos diferentes, tais como IgG, IgA, IgM ou IgE.Anticorpos da classe de IgG podem incluir uma região constante diferente,por exemplo um anticorpo de IgG2 pode ser modificado para exibir umaregião constante de IgGl ou IgG4. Em formas de realização preferidas, ainvenção fornece anticorpos Human Engineered® ou variantescompreendendo uma região constante de IgGl ou IgG4 modificada ou nãomodificada. No caso de IgGl, as modificações à região constante,particularmente a região da dobradiça ou CH2, podem aumentar ou diminuir afunção efetora, incluindo atividade de ADCC e/ou CDC. Em outras formas derealização, uma região constante de IgG2 é modificada para diminuir aformação de agregado de anticorpo-antígeno. No caso de IgG4, modificaçõesà região constante, particularmente a região da dobradiça, podem reduzir aformação de meio-anticorpos. Em formas de realização exemplaresespecíficas, a mutação da seqüência da dobradiça de IgG4 Cys-Pro-Ser-Cyspara a seqüência da dobradiça de IgGl Cys-Pro-Pro-Cys é fornecida.

Uma composição farmacêutica compreendendo qualquer umdos antagonistas de M-CSF ou anticorpos de M-CSF anteriormentemencionados e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamenteaceitável pode ser administrado de acordo com a presente invenção.

Pode ser mais vantajoso misturar dois ou mais antagonistas deM-CSF entre si ou co-administrar um antagonista de M-CSF e um agenteanti-osteoclasto secundário para fornecer eficácia melhorada contra distúrbiososteolíticos da invenção, incluindo metástase do câncer e/ou perda ósseaassociada com metástase do câncer.Em formas de realização exemplares da invenção, os métodosanteriormente mencionados são fornecidos em que o agente anti-osteoclastosecundário é um bisfosfónato. Em uma outra forma de realização, obisfosfonato é zoledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tiludronato,alendronato, ibandronato ou risedronato. Agentes anti-osteoclasto diferentesexemplares incluem bisfosfonatos, agentes neutralizantes de PTHrP (porexemplo, anticorpo, anti-sentido, siRNA), inibidores de catepsina K,antagonistas de MIP-I-a, agentes neutralizantes de RANK/RANKL (porexemplo, anticorpo anti-RANK, anticorpo anti-RANKL, ou receptor deRANKL solúvel, anti-sentido ou muteínas destes), vacina de RANKL,osteoprotegrina (OPG), fatores de crescimento derivados de plaqueta (PDGF),inibidores de src quinase, maltolato de gálio, e inibidores de metaloproteinasede matriz (MMP).

Os métodos terapêuticos da presente invenção podem sercombinados ainda com um terceiro agente terapêutico tal como um agentequimioterapêutico contra o câncer ou com tratamento com radiação oucirurgia. Agentes quimioterapêuticos contra o câncer incluem, sem limitação,agentes alquilantes, tais como carboplatina e cisplatina; agentes alquilantes demostarda de nitrogênio; agentes alquilantes de nitrosouréia, tais comocarmustina (BCNU); antimetabólitos, tais como metotrexato; antimetabólitosde análogo de purina, mercaptopurina; antimetabólitos de análogo depirimidina, tais como fluorouracila (5-FU) e gencitabina; antineoplásicoshormonais, tais como goserelina, leuprolida, e tamoxifeno; antineoplásicosnaturais, tais como aldesleucina, interleucina-2, docetaxel, etoposido (VP-16),interferon alfa, paclitaxel, e tretinoina (ATRA); antineoplásicos naturaisantibióticos, tais como bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina,doxorrubicina, e mitomicina; e antineoplásicos naturais de alcalóide vinca,tais como vimblastina, vincristina, vindesina; hidroxiuréia; aceglatona,adriamicina, ifosfamida, enocitabina, epitiostanol, aclarrubicina, ancitabina,nimustina, cloridreto de procarbazina, carboquona, carboplatina, carmofur,cromomicina A3, polissacarídeos antitumor, fatores de plaqueta antitumor,ciclofosfamida, Schizophyllan, citarabina, dacarbazina, tioinosina, tiotepa,tegafiir, neocarzinostatina, OK-432, bleomicina, furtulon, broxuridina,busulfano, honvan, peplomicina, Bestatin (ubenimex), interferem-β,mepitiostano, mitobronitol, merfalano, peptídeos de laminina, lentinan,extrato Coriolus versicolor, tegafiir/uracila, estramustina(estrogênio/mecloretamina).

Além disso, agentes adicionais usados como terapia adjuntapara pacientes com câncer incluem EPO, G-CSF, ganciclovir; antibióticos,leuprolida; meperidina; zidovudina (AZT); interleucinas 1 a 18, incluindomutantes e análogos; interferons ou citocinas, tais como interferons α, β, e γ,hormônios, tais como hormônio de liberação de hormônio luteinizante(LHRH) e análogos e, hormônio de liberação de gonadotropina (GnRH);fatores de crescimento, tais como fator-β de crescimento transformante (TGF-β), fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento nervoso(NGF), fator de liberação do hormônio do crescimento (GHRF), fator decrescimento epidérmico (EGF), fator homólogo ao fator de crescimento defibroblasto (FGFHF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), e fator decrescimento de insulina (IGF); fator-α & β de necrose tumoral (TNF-α & β);fator-2 inibidor de invasão (IIF-2); proteínas morfogenéticas ósseas 1 a 7(BMP 1-7); somatostatina; timosina-a-1; γ-globulina; superóxido dismutase(SOD); fatores de complemento; fatores anti-angiogênese; materiaisantigênicos; pró-drogas; inibidores de quinase do receptor do fator decrescimento; anticorpo anti-Her2; e anticorpo neutralizante de VEGF.

Subseqüente ao período de transição, a quantidade deantagonista de M-CSF ou quantidade de agente anti-osteoclasto secundárionecessário para obter um efeito terapêutico pode ser reduzida. Assim, depoisde tal período de tempo, um antagonista de M-CSF pode melhorar a eficáciado agente anti-osteoclasto secundário, ou reduzir efeitos colaterais associadoscom a administração do agente anti-osteoclasto secundário, ou melhorar asegurança do agente anti-osteoclasto secundário. Um antagonista de M-CSFtambém pode melhorar a eficácia, reduzir efeitos colaterais de, ou melhorar asegurança de uma terceira modalidade terapêutica tal como quimioterapiacontra o câncer, outra terapia adjunta, cirurgia ou terapia de radiação. Em umaoutra forma de realização da invenção, uma embalagem, frasco ou recipientesão fornecidos compreendendo um medicamento compreendendo umantagonista de M-CSF e instruções que o medicamento deva ser usado emcombinação com um segundo e/ou terceiro agente terapêutico e/ou comcirurgia ou terapia de radiação.

Numerosos distúrbios osteolíticos são considerados seremacessíveis ao tratamento de acordo com a presente invenção. Como usadoaqui, um "distúrbio osteolítico" é qualquer condição que resulta de atividadede osteoclasto aumentada. Um paciente em risco de um distúrbio osteolíticopode ser um paciente em um grupo predisposto a desenvolver um distúrbioosteolítico, ou um paciente que sofre de uma doença que causa ou contribuipara atividade osteoclástica aumentada. Em formas de realização exemplaresda invenção, o distúrbio osteolítico pode ser um doença óssea metabólicaassociada com atividade de osteoclasto relativamente aumentada, incluindoum endocrinopatia (hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatireoidismoprimário ou secundário, hipertireoidismo), hipercalcemia, estado dedeficiência (raquitismo/osteomalacia, escorbuto, subnutrição), doença crônica(síndromes de má absorção, insuficiência renal crônica (osteodistrofia renal),doença hepática crônica (osteodistrofia hepática)), medicamentos(glucocorticóides (osteoporose induzida por glucocorticóide), heparina,álcool), ou doença hereditária (osteogênese imperfeita, homocistinuria),câncer, osteoporose, osteopetrose, inflamação do osso associada com artrite eartrite reumatóide, doença periodontal, displasia fibrosa, e/ou doença dePaget.

Em outras formas de realização exemplares, o distúrbioosteolítico pode ser um câncer metastático ao osso, em que o câncermetastático é de mama, pulmão, renal, mieloma múltiplo, tireóide, próstata,adenocarcinoma, malignidade de célula sangüínea, incluindo leucemia elinfoma; câncer de cabeça e pescoço; câncer gastrointestinal, incluindo cânceresofágico, câncer estomacal, câncer do cólon, câncer intestinal, câncercolorretal, câncer retal, câncer pancreático, câncer hepático, câncer do dutobiliar ou vesícula biliar; malignidade do trato genital feminino, incluindocarcinoma ovariano, câncer endometrial uterino, câncer vaginal, ou câncercervical; câncer de bexiga; câncer cerebral, incluindo neuroblastoma;sarcoma, osteossarcoma; ou câncer de pele, incluindo melanoma maligno oucâncer de célula escamosa.

Em formas de realização exemplares da invenção, qualquer umdos métodos precedentes pode prevenir ou reduzir a perda óssea ouprevenindo ou reduzindo metástases ósseas ou severidade de perda ósseaassociada com a doença.

O anticorpo de M-CSF administrado de acordo com a presenteinvenção pode ser fornecido em uma dose entre cerca de 2 μg/kg a 30 mg/kg,0,1 mg/kg a 30 mg/kg ou 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura IA mostra a seqüência de aminoácido de anticorpode murino específico de M-CSF RXl (SEQ ID NOs: 2 e 4) (codificado pelainserção de cDNA do plasmídeo depositado com a American Type CultureCollection, Manassas, VA, USA, sob número de depósito de ATCC PTA-6113) e uma seqüência de ácido nucléico correspondente (SEQ ID NOs: 1 e3). As regiões de CDR são numeradas e mostradas em negrito.

As Figuras IB e IC mostram as seqüências de aminoácido decadeias de anticorpo de murino específico de M-CSF RXl leve (SEQ ID NO:5) e pesada (SEQ ID NO: 6), respectivamente, com resíduos de risco alto(negrito), risco moderado (sublinhado), e risco baixo identificados de acordocom Studnicka et al., W093/11794.

As Figuras 2, 3, e 4 mostram as seqüências de aminoácido deanticorpos de murino específicos de M-CSF 5H4 (SEQ ID NOs: 10 e 11),MCI (SEQ ID NOs: 12 e 13) (produzido pelo hibridoma depositado sob onúmero de depósito de ATCC PTA-6263) e MC3 (SEQ ID NOs: 14 e 15)(produzido pelo hibridoma depositado sob o número de depósito de ATCCPTA-6264), respectivamente.

A Figura 5 é a seqüência de aminoácido de M-CSFa (SEQ IDNO: 7).

A Figura 6 é a seqüência de aminoácido de M-CSFp (SEQ IDNO: 8).

A Figura 7 é a seqüência de aminoácido de M-CSFy (SEQ IDNO: 9). Vários polimorfismos na seqüência de DNA podem resultar emdiferenças de aminoácido. Por exemplo, um polimorfismo comum fornece umAla ao invés de Pro na posição 104.

As Figuras 8A e B são um alinhamento de regiões de CDR daseqüências de aminoácido de cadeia pesada e leve de anticorpos de murinoespecíficos de M-CSF humanos RXl; 5H4; MCI; e MC3 (SEQ ID NOs: 16 a 38).

A Figura 9A mostra (a) a linha de risco para a cadeia pesadade RXl de murino (H = risco alto, M = risco moderado, L = risco baixo), (b)a seqüência de aminoácido de cadeia pesada de RXl (SEQ ID NO: 6), (c) aseqüência de aminoácido da seqüência de consenso humana mais fechada,consenso Vh2 de Kabat, alinhado a RXl (SEQ ID NO: 39) e (d) mudançasque foram feitas para produzir duas seqüências Human Engineered®exemplares (SEQ ID NOs: 41 e 43). A Figura 9B mostra as seqüências deaminoácido das duas seqüências Human Engineered® de cadeia pesadaexemplares (SEQ ID NOs: 41 e 43), designadas "risco baixo" e "risco baixo +moderado" assim como seqüências de ácido nucléico correspondentes (SEQID NOs: 40 e 42).

A Figura IOA mostra (a) a linha de risco para a cadeia leve deRXl de murino (H = risco alto, M = risco moderado, L = risco baixo), (b) aseqüência de aminoácido de cadeia leve de RXl (SEQ ID NO: 5), (c) aseqüência de aminoácido da seqüência de consenso humana mais fechada,consenso Vk3 de Kabat, alinhada a RXl (SEQ ID NO: 49) e (d) mudançasque foram feitas para produzir duas seqüências Human Engineered®exemplares (SEQ ID NOs: 45 e 47). A Figura IOB mostra as seqüências deaminoácido das duas seqüências Human Engineered® de cadeia leveexemplares (SEQ ID NOs: 45 e 47), designadas risco baixo" e "risco baixo +moderado" assim como seqüências de ácido nucléico correspondentes (SEQID NOs: 44 e 46).

A Figura IlA mostra (a) a linha de risco para a cadeia leve deRXl de murino (H = risco alto, M = risco moderado, L = risco baixo), (b) aseqüência de aminoácido de cadeia leve de RXl (SEQ ID NO: 5), (c) aseqüência de aminoácido da seqüência de consenso humana mais fechada,consenso Vk3 de Kabat, alinhada a RXl (SEQ ID NO: 49) e (d) umaseqüência de aminoácido exemplar alternada em que as posições 54 a 56 nãoforam mudadas (isto é, permaneceu a seqüência de murino) (SEQ ID NO: 48).

A Figura IlB mostra as seqüências de aminoácido de duas seqüências HumanEngineered® de cadeia leve alternadas exemplares (SEQ ID NOs: 48, 87),assim como seqüências de ácido nucléico correspondentes (SEQ ID NOs: 88.e 86).

A Figura 12A mostra (a) a linha de risco para a cadeia leve deRXl de murino (H = risco alto, M = risco moderado, L = risco baixo), (b) aseqüência de aminoácido de cadeia leve de RXl (SEQ ID NO: 5), (c) aseqüência de aminoácido da seqüência de linha germinativa de consensohumana mais fechada, Subgrupo Vk6 2-I-(I) Al4, alinhada a RXl (SEQ IDNO: 50) e (d) mudanças que foram feitas para produzir duas seqüênciasHuman Engineered® exemplares (SEQ ID NOs: 51 e 53). A Figura 12Bmostra as seqüências de aminoácido das duas seqüências Human Engineered®de cadeia leve exemplares (SEQ ID NOs: 51 e 53), designadas "risco baixo" e"risco baixo + moderado" assim como a seqüência de ácido nucléicocorrespondente (SEQ ID NO: 52).

As Figuras 13 A e 24B mostram o alinhamento da seqüência deaminoácido de cadeia pesada de RXl de murino (SEQ ID NO: 54) com váriasseqüências de consenso de linha germinativa humana de consenso e humanausando o sistema de numeração de Kabat (numeração de aminoácido indicadaem: linha designada "POS") (SEQ ID NOs: 55 a 83). As Figuras 13C a 13Emostram como os resíduos de aminoácido de anticorpos 5H4, MCl e MC3correspondem ao sistema de numeração de Kabat (SEQ ID NOs: 10 e 11;SEQ ID NOs: 12 e 13; SEQ ID NOs: 14 e 15, respectivamente).

A Figura 14 mostra os efeitos anti-reabsorvente de Zometa emum modelo de animal.

A Figura 15 mostra a porcentagem de animais em cada grupocom osteólise detectável.

A Figura 16 mostra as contagens de osteólise médias com baseem análise de imagem de raio X no último dia do estudo.

A Figura 17 mostra imagens de raio X Faxitron representativasde tíbias (sítio de inoculação de tumor) no dia final do estudo. As setasapontam para os sítios de osteólise.

A Figura 18 mostra o efeito de RXl sobre a atividade deosteoclasto.

A Figura 19 mostra a inibição de atividade de osteoclasto porZometa.

A Figura 20 mostra os resultados de um estudofarmacocinético com RXl em primatas.

A Figura 21 mostra os resultados de um estudofarmacocinético com RXl em primatas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Fator estimulante de colônia (CSF-1), também conhecidocomo fator estimulante de colônia de macrófago (M-CSF), foi descoberto sercrucial para a formação de osteoclasto. Além disso, M-CSF mostrou modularas funções osteoclásticas de osteoclastos maduros, sua migração e suasobrevivência em cooperação com outros fatores solúveis e interações célula àcélula fornecidos por osteoblastos e fibroblastos (Fixe e Praloran, Cytokine10: 3-7, 1998; Martin et al., Criticai Rev. em Eukaryotic Gene Expression 8:107-23 (1998)).

O mRNA de M-CSF humano de tamanho natural codifica umaproteína precursora de 554 aminoácidos. Através de união de mRNAalternativa e processamento proteolítico pós traducional diferencial, M-CSFpode ser secretado na circulação como uma glicoproteína ou sulfato decondroitina contendo proteoglicano ou ser expressado como umaglicoproteína de transposição de membrana na superfície de célulasprodutoras de M-CSF. A estrutura tridimensional dos 150 aminoácidos determinal amino bacterianamente expressados de M-CSF humano, a seqüênciamínima necessária para completar a atividade biológica in vitro, indica queesta proteína é um dímero ligado a dissulfeto com cada monômero queconsiste de quatro feixes helicoidais alfa e uma folha beta anti-paralela(Pandit et al., Science 258: 1358-62 (1992)). Três espécies de M-CSFdistintas são produzidas através de união de mRNA alternativa. Os trêsprecursores de polipeptídeo são M-CFSa de 256 aminoácidos, M-CSFP de554 aminoácidos, e M-CSFy de 438 aminoácidos. M-CSFP é uma proteínasecretada que não ocorre em uma forma ligada à membrana. M-CSFa éexpressado como uma proteína de membrana integral que é lentamenteliberada por clivagem proteolítica. M-CSFa é clivada em aminoácidos 191a197 da seqüência apresentada na Figura 5. A forma ligada à membrana de M-CSF pode interagir com receptores em células vizinhas e portanto medeiacontatos de célula à célula específicos. O termo "M-CSF" também podeincluir os aminoácidos 36 a 438 da Figura 7.

Várias formas de M-CSF funcionam ligando-se ao seureceptor M-CSFR em células alvo. M-CSFR é uma molécula de transposiçãode membrana com cinco domínios semelhantes à imunoglobulinaextracelulares, um domínio de transmembrana e um domínio de tirosinaquinase relacionado a Src interrompido intracelular. M-CSFR é codificadopelo proto-oncogene c-fms. A ligação de M-CSF ao domínio extracelular deM-CSFR leva à dimerização do receptor, que ativa o domínio de quinasecitoplasmática, levando à autofosforilação e fosforilação de outras proteínascelulares (Hamilton J. A., J Leukoc Biol., 62(2): 145-55, 1997; Hamilton J.A., Immuno Today., 18(7): 313-7, 1997).

Proteínas celulares fosforiladas induzem uma cascata deeventos bioquímicos levando a respostas celulares: mitose, secreção decitocinas, enrugamento de membrana, e regulação de transcrição de seupróprio receptor (Fixe and Praloran, Cytokine 10: 32-37, 1998).

"Tumor", como usado aqui, refere-se a todo o crescimento eproliferação de célula neoplásica, se maligno ou benigno, e todas as células etecidos pré cancerosos e cancerosos.

Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se a ou descrevema condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada porcrescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem mas não sãolimitados a, carcinoma; linfoma, blastoma, sarcoma; e leucemia. Exemplosmais particulares de tais cânceres incluem câncer de mama, câncer depróstata, câncer do cólon, câncer de célula escamosa, câncer pulmonar decélula pequena, câncer pulmonar de célula não pequena, câncergastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncerovariano, câncer hepático, câncer de bexiga, hepatoma, câncer colorretal,carcinoma endometrial, carcinoma da glândula salivar; câncer renal, câncerhepático, câncer vulvar, câncer da tireóide, carcinoma hepático e vários tiposde câncer de cabeça e pescoço.

"Tratamento" é uma intervenção realizada com a intenção deprevenir o desenvolvimento ou alterar a patologia de um distúrbio.Conseqüentemente, "tratamento" refere-se tanto a tratamento terapêuticoquanto a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles em necessidade detratamento incluem aqueles já com o distúrbio assim como aqueles em que odistúrbio deve ser prevenido. Em tratamento de tumor (por exemplo, câncer),um agente terapêutico pode diminuir diretamente a patologia de célulasrumorosas, ou tornar as células rumorosas mais suscetíveis ao tratamento poroutros agentes terapêuticos, por exemplo, radiação e/ou quimioterapia. A"patologia" do câncer inclui todos os fenômenos que comprometem oreservatório que é do paciente. Isto inclui, sem limitação, crescimento celularanormal ou inconsolável, metástase, interferência com o funcionamentonormal de células vizinhas, liberação de citocinas ou outros produtossecretórios em níveis anormais, supressão ou agravamento de respostainflamatória ou imunológica, etc.

"Mamífero" para propósitos de tratamento refere-se a qualqueranimal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, animaisdomésticos e de criação, e animais de zoológico, de esporte, ou de estimação,tais como cachorros, cavalos, gatos, vacas, etc. Preferivelmente, o mamífero éo ser humano.

Como usado aqui, a frase "câncer metastático" é definidacomo cânceres que têm potencial para difundir a outras áreas do corpo,particularmente osso. Uma variedade de cânceres podem espalhar-se pormetástase ao osso, mas os cânceres que espalham-se por metástase maiscomuns são de mama, pulmonar, renal, mieloma múltiplo, da tireóide epróstata. Por via de exemplo, outros cânceres que têm o potencial paraespalhar-se por metástase ao osso incluem mas não são limitados aadenocarcinoma, malignidades de célula sangüínea, incluindo leucemia elinfoma; cânceres de cabeça e pescoço; cânceres gastrointestinais, incluindocâncer esofágico, câncer estomacal, câncer do cólon, câncer intestinal, câncercolorretal, câncer retal, câncer pancreático, câncer hepático, câncer do dutobiliar ou vesícula biliar; malignidades do trato genital feminino, incluindocarcinoma ovariano, cânceres endometriais uterinos, câncer vaginal, e câncercervical; câncer de bexiga; câncer cerebral, incluindo neuroblastoma;sarcoma, osteossarcoma; e câncer de pele, incluindo melanoma maligno ecâncer de célula escamosa. A presente invenção especialmente considera aprevenção e tratamento de lesões osteolíticas induzidas por tumor no osso.

Como usado aqui, a frase "quantidade terapeuticamenteeficaz" é significada a referir-se a uma quantidade de antagonista de M-CSFterapêutico ou profilático, tal como anticorpo de M-CSF, que seria apropriadopara uma forma de realização da presente invenção, que evocará o efeito ouresposta terapêuticos ou profiláticos desejados quando administrada de acordocom o regime de tratamento desejado.

"M-CSF" humano como usado aqui refere-se a umpolipeptídeo humano tendo substancialmente a mesma seqüência deaminoácido como os polipeptídeos M-CSFa, M-CSFP, ou M-CSFy humanosmaduros descritos em Kawasaki et al., Science 230:291 (1985), Cerretti et al.,Molecular Immunology, 25:761 (1988), ou Ladner et al., EMBO Journal6:2693 (1987), cada um dos quais são incorporados aqui por referência. Talterminologia reflete o entendimento que os três M-CSFs maduros têmseqüências de aminoácido diferentes, como descrito acima, e que a formaativa de M-CSF é um dímero ligado a dissulfeto; assim, quando o termo "M-CSF" refere-se à forma biologicamente ativa, a forma dimérica éintencionada. "Dímero de M-CSF" refere-se a dois monômeros depolipeptídeo de M-CSF que dimerizaram e inclui tanto homodímeros (queconsiste de dois do mesmo tipo de monômero de M-CSF) quantoheterodímeros (que consiste de dois monômeros diferentes). Monômeros deM-CSF podem ser convertidos a dímeros de M-CSF in vitro como descrito naPat. U.S. N2 4.929.700, que é incorporada aqui por referência.

I. Antagonistas

Como usado aqui, o termo "antagonista" geralmente refere-seà propriedade de uma molécula, composto ou outro agente, por exemplo, parainterferir com a ligação de uma molécula com uma outra molécula ou aestimulação de uma célula por uma outra célula através de impedimentoestérico, alterações conformacionais ou outros mecanismos bioquímicos. Emum aspecto, o termo antagonista diz respeito à propriedade de um agente paraprevenir a ligação de um receptor ao seu ligando, por exemplo, a ligação deM-CSF com M-CSFR, inibindo deste modo o caminho de transdução de sinalcausado por M-CSF. O termo antagonista não é limitado por qualquermecanismo de ação específico, mas, de preferência, geralmente refere-se àpropriedade funcional presentemente definida. Antagonistas da presenteinvenção incluem, mas não são limitados a: anticorpos de M-CSF efragmentos e muteínas e modificações destes, M-CSF solúvel e fragmentos emuteínas e modificações destes, anticorpos de M-CSFR e fragmentos emuteínas e modificações destes, M-CSFR solúvel e fragmentos e muteínas emodificações destes, e peptídeos assim como outros compostos químicos emoléculas que ligam-se a M-CSF ou M-CSFR e moléculas de ácido nucléicotais como compostos anti-sentido ou RNAi que inibem a expressão de M-CSFe M-CSFR. Qualquer um dos antagonistas da presente invenção podem seradministrados em qualquer maneira conhecida na técnica. Por exemplo,muteínas de M-CSF, muteínas de M-CSFR ou fragmentos de anticorpo queligam-se a M-CSF ou M-CSFR podem ser administrados por intermédio deterapia genética.

Os antagonistas de M-CSF da presente invenção incluem, ondeaplicável, equivalentes funcionais. Por exemplo, moléculas podem diferir emcomprimento, estrutura, componentes, etc., mas podem reter ainda uma oumais das funções definidas. Mais particularmente, equivalentes funcionais dosanticorpos, fragmentos de anticorpo ou peptídeos da presente invenção podemincluir compostos miméticos, isto é, construções designadas para imitar aprópria configuração e/ou orientação para a ligação do antígeno.

Antagonistas de M-CSF preferidos opcionalmente podem sermodificados por adição de grupos laterais, etc., por exemplo, por acilação determinal amino, amidação de terminal carbóxi ou por ligação de gruposadicionais às cadeias laterais de aminoácido. Antagonistas também podemcompreender uma ou mais substituições de aminoácido conservativas. Por"substituições de aminoácido conservativas" é significado aquelas mudançasem seqüência de aminoácido que preservam a carga geral,hidrofobicidade/hidrofilicidade e/ou massa estérica do aminoácidosubstituído. Por exemplo, substituições entre os grupos seguintes sãoconservativas: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asn/Gln,Ser/Cys/Thr, e Phe/Trp/Tyr. Tais modificações não diminuirãosubstancialmente a eficácia dos antagonistas de M-CSF e podem comunicartais propriedades desejadas como, por exemplo, meia-vida aumentada in vivoou toxicidade diminuída.

A invenção também é intencionada a incluir polipeptídeos queportam modificações exceto a inserção, supressão, ou substituição de resíduosde aminoácido. Por via de exemplo, as modificações podem ser covalentes emnatureza, e incluem por exemplo, ligação química com polímeros, lipídeos,outras porções orgânicas, e inorgânicas. Tais derivados podem ser preparadospara aumentar a meia-vida circulante de um polipeptídeo, ou podem serdesignados a melhorar a capacidade de alvejamento para o polipeptídeo àscélulas, tecidos, ou órgãos desejados. Similarmente, a invenção compreendeainda polipeptídeos M-CSF ou M-CSFR que foram covalentementemodificados para incluir uma ou mais ligações de polímero solúvel em águatais como polietileno glicol, polioxietileno glicol, ou polipropileno glicol.

A. Anticorpos de M-CSF

O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e incluianticorpos completamente montados, anticorpos monoclonais, anticorpospoliclonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorposbiespecíficos), fragmentos de anticorpo que podem ligar antígeno (porexemplo, anticorpos de cadeia única Fab', F'(ab)2, Fv, diacorpos), epeptídeos recombinantes compreendendo o precedente contanto que elesexibam a atividade biológica desejada.

O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se aum anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmentehomogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a populaçãosão idênticos exceto para mutações possíveis que ocorrem naturalmente quepodem estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais sãoaltamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico.

Além disso, ao contrário de preparações de anticorpo convencional(policlonal) que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionadoscontra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal édirecionado contra um único determinante no antígeno. Além de suaespecificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que eles sãosintetizados pela cultura homogêneo, descontaminado por outrasimunoglobulinas com diferentes especificidades e características.

O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpocomo sendo obtido de uma população substancialmente homogênea deanticorpos, e não deve ser interpretado como requerendo a produção doanticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorposmonoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem serfabricados pelo método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al.,Nature, 256:495 [19751, ou pode ser fabricado por métodos de DNArecombinante (ver, por exemplo, Patente U.S. N2 4.816.567). Os "anticorposmonoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fagousando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 [1991]end Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por exemplo.

Dependendo da seqüência de aminoácido do domínioconstante de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser designadas aclasses diferentes. Existem cinco classes principais, IgA, IgD, IgE, IgG eIgM, e várias destas pode ser divididas ainda em subclasses ou isótopos, porexemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Os domínios constantes decadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas sãochamados alfa, delta, épsilon, gama e mi respectivamente. As estruturassubunitárias e configurações tridimensionais de diferentes classes deimunoglobulinas são bem conhecidas. Isótipos diferentes têm funções efetorasdiferentes; por exemplo, isótipos de IgGl e IgG3 têm atividade de ADCC.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de umanticorpo de tamanho natural intacto, preferivelmente a região variável ou deligação de antígeno do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos deanticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorposlineares (Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1037-1062 (1995)); moléculas deanticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados defragmentos de anticorpo. A digestão com papaína de anticorpos produz doisfragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab",cada um com um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento "Fc"residual, cujo nome reflete sua capacidade para cristalizar 35 facilmente. Otratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem doisfragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "sFv" que compreendem osdomínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes emuma única cadeia de polipeptídeo. Preferivelmente, o polipeptídeo Fvcompreende ainda um ligador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL quepermite que o Fv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Parauma revisão de "sFv" ver Pluckthun em The Pharmacology of MonoclonalAntibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, NovaIorque, páginas 269-315 (1994).

O termo região "hipervariável" refere-se aos resíduos deaminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. Aregião hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma regiãodeterminante de complementaridade ou CDR [isto é, resíduos 24 a 34 (LI), 50a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31 a 35 (Hl), 50a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada comodescrito por Kabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5âEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)] e/ou aqueles resíduos de uma alça hipervariável (isto é, resíduos 26 a32 (LI), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a32 (Hl), 53a55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesadacomo descrito por [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)].

Resíduos de "estrutura" ou FR são aqueles resíduos dedomínio variável exceto os resíduos de região hipervariável.

O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpopequenos com dois sítios de ligação de antígeno, fragmentos estes quecompreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a umdomínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VHVL). Usando-se um ligador que é muito curto para permitir o pareamentoentre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parearcom os domínios complementares de uma outra cadeia e criam dois sítios deligação de antígeno. Diacorpos são descritos mais completamente, porexemplo, em EP 404.097; WO 93/11161; e 30 Hollinger et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

Em algumas formas de realização, pode ser desejável geraranticorpo monoclonal multiespecífico (por exemplo biespecífico) incluindo osanticorpos monoclonal, humano, humanizado, Human Engineered ou anti-M-CSF variante tendo especificidades de ligação para pelo menos doisepítopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplares podem ligar-se adois epítopos diferentes de M-CSF. Alternativamente, um ramo anti-M-CSFpode ser combinado com um ramo que liga-se a uma molécula deflagradoraem um leucócito tal como uma molécula receptora de célula T (por exemplo,CD2 ou CD3), ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRJ (CD64),FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD 16) de modo a focar os mecanismos de defesacelular à célula que expressa M-CSF. Anticorpos biespecíficos tambémpodem ser usados para localizar agentes citotóxicos a células que expressamM-CSF. Estes anticorpos possuem um ramo de ligação de M-CSF e um ramoque liga o agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-60,alcalóide vinca, cadeia A de ricina, metotrexato ou hapteno de isótoporadioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorposde tamanho natural ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorposbiespecíficos F(ab').sub.2).

De acordo com um outro método para fabricar anticorposbiespecíficos, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode serengendrada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que sãorecuperados de cultura de célula recombinante. A interface preferidacompreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constantede anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidopequenas da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas comcadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades"compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is)grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorposubstituindo-se cadeias laterais de aminoácido grandes com unidades menores(por exemplo, alanina ou treonina). Isto fornece um mecanismo para aumentaro rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados taiscomo homodímeros. Ver WO 96/27011 publicada em 6 de Setembro de 1996.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou"heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugadopode ser ligado à avidina, o outro à biotina. Anticorpos heteroconjugadospodem ser fabricados usando quaisquer métodos de reticulação convenientes.Agentes reticulantes adequados são bem conhecidos na técnica, e sãodivulgados na Pat. U.S. N° 4.676.980, junto com várias técnicas dereticulação.

Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir defragmentos de anticorpo também foram descritas na literatura. Por exemplo,anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química.Brennan et al., Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento em queanticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentosF(ab')2- Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexantede ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e impedir aformação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados depoissão convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados deFab'-TNB depois é reconvertido ao Fab'-tiol por redução commercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outroderivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorposbiespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilizaçãoseletiva de enzimas. Ainda em uma outra forma de realização, fragmentosFab'-SH diretamente recuperados de E. coli podem ser quimicamente ligadosin vitro para formar anticorpos biespecíficos. (Shalaby et al., J. Exp. Med.175:217-225 (1992))Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) descrevem aprodução de uma molécula de anticorpo biespecífico completamentehumanizado F(ab')2- Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado de E.coli e submetido à ligação química dirigida in vitro para formar o anticorpobiespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de ligar-se acélulas que superexpressam o receptor de HER2 e células T humanasnormais, assim como deflagrar a atividade lítica de linfócitos citotóxicoshumanos contra alvos de tumor de mama humano.

Várias técnicas para fabricar e isolar fragmentos de anticorpobiespecíficos diretamente de cultura de célula recombinante também foramdescritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usandozíperes de leucina. (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)) Ospeptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porçõesFab' de dois anticorpos diferentes por fusão de gene. Os homodímeros deanticorpo foram reduzidos na região da dobradiça para formar e depois re-oxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método tambémpode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. Atecnologia de "diacorpo" descrita por Bollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA 90:6444-6448 (1993) tem fornecido um mecanismo alternativo parafabricar fragmentos de anticorpo biespecíficos.

Os fragmentos compreendem uma região variável de cadeiapesada (Vh) conectada a uma região variável de cadeia leve (Vl) por umligador que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domíniosna mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmentosão forçados a parear com os domínios Vl e Vh complementares de um outrofragmento, formando deste modo dois sítios de ligação de antígeno. Umaoutra estratégia para fabricar fragmentos de anticorpo biespecíficos pelo usode dímeros de Fv (sFv) de cadeia única também foi relatada. Ver Gruber etal., J. Immunol. 152: 5368 (1994).Alternativamente, o anticorpo biespecífico pode ser um"anticorpo linear" produzido como descrito em Zapata et al. Protein Eng.8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estes anticorpos compreendem um parde segmentos Fd em tandem (Vh-Ch I-Vh-ChI) que formam um par deregiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficosou monoespecíficos.

Anticorpos com mais do que duas valências também sãoconsiderados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados.(Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991))

Em certas formas de realização, o anticorpo monoclonal,humano, humanizado, Human Engineered® ou anti-M-CSF variante é umfragmento de anticorpo, tal como um fragmento de anticorpo RX1, 5H4,MCI, ou MC3. Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção defragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivadospor intermédio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, porexemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117 (1992) e Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Entretanto, estesfragmentos agora podem ser produzidos diretamente por células hospedeirasrecombinantes. Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) divulgam asecreção de fragmentos de anticorpo funcionais de bactérias (ver, porexemplo, Better et al, Skerra et al. Science 240: 1038-1041 (1988)). Porexemplo, fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli equimicamente ligados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Em uma outra forma de realização, oF(ab')2 é formado usando o zíper de leucina GCN4 para promover amontagem da molécula de F(ab')2. De acordo com um outro método,fragmentos Fv, Fab ou F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura decélula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção defragmentos de anticorpo estarão evidentes ao médico habilitado.Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado erecuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentescontaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam comusos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas,hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em formas derealização preferidas, o anticorpo será purificado (1) a mais do que 95 % empeso de anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e o maispreferivelmente mais do que 99 % em peso, (2) a um grau suficiente paraobter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácido de terminal N ouinterna pelo uso de um seqüenciador de copo dilatado, ou (3) àhomogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não reduçãousando azul de Coomassie ou, preferivelmente, corante prata. O anticorpoisolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes visto quepelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estarápresente. Geralmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por pelomenos uma etapa de purificação.

Para uma descrição detalhada da estrutura e geração deanticorpos, ver Roth, D.B., e Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998), e Patentedos Estados Unidos Na 6.255.458, aqui incorporada por referência em suatotalidade. Brevemente, o processo para gerar DNA que codifica genes deimunoglobulina de cadeia pesada e leve ocorre principalmente em células Bem desenvolvimento. Antes do rearranjo e união de vários segmentosgenéticos de imunoglobulina, os segmentos genéticos V, D, J e constante (C)são encontrados geralmente em proximidade relativamente imediata em umúnico cromossomo. Durante a diferenciação de célula B, um de cada um dosmembros da família apropriada dos segmentos genéticos V, D, J (ou apenas Ve J no caso de genes de cadeia leve) é recombinado para formar genes deimunoglobulina pesada e leve funcionalmente rearranjados. Este processo derearranjo de segmento genético parece ser seqüencial. Primeiro, uniões D-a-Jde cadeia pesada são feitas, seguido por uniões V-a-DJ de cadeia pesada euniões V-a-J de cadeia leve.

A recombinação de segmentos genéticos de região variávelpara formar regiões variáveis de cadeia pesada e leve funcionais é mediadapor seqüências de sinal de recombinação (RSS's) que flanqueiam segmentosV, D e J recombinacionalmente competentes. RSS's necessárias e suficientespara recombinação direta, compreendem um heptâmero díade-simétrico, umnonâmero rico em AT e uma região espaçadora interveniente de 12 ou 23pares de base. Estes sinais são conservados entre os diferentes locos eespécies que realizam recombinação de D-J (ou V-J) e são funcionalmentepermutáveis. Ver Oettinger, et al. (1990), Science, 248, 1517-1523 ereferências citadas nesta. O heptâmero compreende a seqüência CACAGTGou seu análogo seguido por um espaçador de seqüência não conservada edepois um nonâmero tendo a seqüência ACAAAAACC ou seu análogo. Estasseqüências são encontradas no J, ou lado a jusante, de cada segmento genéticoVeD. Imediatamente precedendo a linha germinativa os segmentos DeJ sãonovamente duas seqüências de sinal de recombinação, primeiro o nonâmero edepois o heptâmero novamente separado por uma seqüência não conservada.As seqüências heptaméricas e nonaméricas a seguir de um segmento VL, Vhou D são complementares àquelas precedendo os segmentos JL, D ou Jfi comos quais eles recombinam. Os espaçadores entre as seqüências heptaméricas enonaméricas são de 12 pares de base de comprimento ou entre 22 e 24 paresde base de comprimento.

Além do rearranjo dos segmentos V, D e J, outra diversidade égerada no repertório primário de cadeia pesada e leve de imunoglobulina porvia de recombinação variável nos locais os segmentos V e J na cadeia leve sãounidos e onde os segmentos D e J da cadeia pesada são unidos. Tal variaçãona cadeia leve tipicamente ocorre dentro do último códon do segmentogenético V e do primeiro códon do segmento J. A imprecisão similar na uniãoocorre no cromossomo de cadeia pesada entre os segmentos D e Jh e podeestender-se até 10 nucleotídeos. Além disso, vários nucleotídeos podem serinseridos entre os segmentos genéticos DeJee entre os Vh e D que não sãocodificados por DNA genômico. A adição destes nucleotídeos é conhecidacomo diversidade de região N.

O efeito final de tais rearranjos nos segmentos genéticos deregião variável e a recombinação variável que pode ocorrer durante tal união éa produção de um repertório de anticorpo primário.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítiode reconhecimento e ligação de antígeno completo. Esta região consiste deum dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve emassociação estreita, não covalente. É nesta configuração que as três CDRs decada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígenona superfície do dímero VH VI. Coletivamente, as seis CDRs conferemespecificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo umúnico domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas trêsCDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade para reconhecer e ligaro antígeno, embora em uma afinidade mais baixa do que o sítio de ligaçãointeiro.

O fragmento Fab também contém o domínio constante dacadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada.Fragmentos Fab diferem de fragmentos Fab' pela adição de alguns resíduosno término carbóxi do domínio CHl de cadeia pesada incluindo uma ou maiscisteínas da região da dobradiça de anticorpo. Fab'-SH é a designação aquipara Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes portamum grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foramproduzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas na dobradiçaentre eles.

Por "anticorpo neutralizante" é significado uma molécula deanticorpo que é capaz para eliminar ou significantemente reduzir uma funçãoefetora de um antígeno alvo ao qual ele liga-se. Conseqüentemente, umanticorpo anti-alvo "neutralizante" é capaz de eliminar ou significantementereduzir uma função efetora, tal como atividade enzimática, ligação de ligando,ou sinalização intracelular.

Como fornecido aqui, as composições para e métodos de tratarmetástase do câncer e/ou perda óssea associada com metástase do câncerpodem utilizar um ou mais anticorpos usados singularmente ou emcombinação com outros produtos terapêuticos para obter os efeitos desejados.

Anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser isolados de umanimal que produz o anticorpo como um resultado de contato direto com umantígeno ambiental ou imunização com o antígeno. Alternativamente, osanticorpos podem ser produzidos por metodologia de DNA recombinanteusando um dos sistemas de expressão de anticorpo bem conhecidos natécnica.(Ver, por exemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A LaboratoiyManual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Tais anticorpos podemincluir IgGs recombinantes, proteínas de fusão quiméricas tendo seqüênciasderivadas de imunoglobulina ou anticorpos "Human Engineered que todospodem ser usados para o tratamento de metástase do câncer e/ou perda ósseaassociada com metástase do câncer de acordo com a presente invenção. Alémde moléculas intactas, de tamanho natural, o termo "anticorpo" tambémrefere-se a fragmentos deste (tais como, por exemplo, fragmentos scFv, Fv,Fd, Fab, Fab' e F(ab)'2) ou multímeros ou agregados de moléculas intactase/ou fragmentos que ligam-se a M-CSF (ou M-CSFR). Estes fragmentos deanticorpo ligam antígeno e podem ser derivados para exibir característicasestruturais que facilitam a liberação e captação, por exemplo, porincorporação de resíduos de galactose.

Em uma forma de realização da presente invenção, anticorposmonoclonais de M-CSF podem ser preparados essencialmente como descritoem Halenbeck et al. Pat. U.S. N- 5.491.065 (1997), incorporada aqui porreferência. Anticorpos monoclonais de M-CSF exemplares incluem aquelesque ligam-se a um epítopo conformacional aparente associado com M-CSFdimérico recombinante ou nativo com neutralização concomitante daatividade biológica. Estes anticorpos são substancialmente não reativos comformas biologicamente inativas de M-CSF incluindo M-CSF monomérico edimérico quimicamente derivado.

Em outras formas de realização da presente invenção,anticorpos monoclonais anti-M-CSF Human Engineered® são fornecidos. Afrase "anticorpo Human Engineered®" refere-se a um anticorpo derivado deum anticorpo não humano, tipicamente um anticorpo monoclonal decamundongo. Alternativamente, um anticorpo Human Engineered® pode serderivado de um anticorpo quimérico que retém ou substancialmente retém aspropriedades de ligação de antígeno do anticorpo parental, não humano masque exibe imunogenicidade diminuída quando comparado ao anticorpoparental quando administrado a seres humanos. A frase "anticorpoquimérico," como usado aqui, refere-se a um anticorpo contendo seqüênciaderivada de dois anticorpos diferentes (ver, por exemplo, Patente U.S. N24.816.567) que tipicamente originam-se de espécies diferentes. O maistipicamente, anticorpos quiméricos compreendem fragmentos de anticorpohumano e de murino, geralmente regiões constantes humanas e variáveis decamundongo.

A frase "região determinante de complementaridade" ou otermo "CDR" refere-se a seqüências de aminoácido que juntas definem aafinidade de ligação e especificidade da região Fv natural de um sítio deligação de imunoglobulina nativo (Ver, por exemplo, Chothia et al., J. Mol.Biol. 196:901 917 (1987); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and HumanServices NIH Publication N° 91 3242 (1991)). A frase "região constante"refere-se à porção da molécula de anticorpo que confere funções efetoras. Napresente invenção, regiões constantes de camundongo são preferivelmentesubstituídas por regiões constantes humanas. As regiões constantes dosanticorpos objetos são derivadas de imunoglobulinas humanas. A regiãoconstante de cadeia pesada pode ser selecionada de qualquer um dos cincoisótipos: alfa, delta, épsilon, gama ou mi.

Os anticorpos da presente invenção são dito seremimunoespecíficos ou especificamente de ligação se eles ligam-se ao antígenocom um Ka de mais do que ou igual a cerca de IO6M"1 preferivelmente maisdo que ou igual a cerca de 10'7M'1, mais preferivelmente mais do que ou iguala cerca de 10 M, e o mais preferivelmente mais do que ou igual a cerca de10^9M"1, 10^10M"1, 10^11M"1 ou 10^12M"1. Os anticorpos anti-M-CSF podem ligar-se a diferentes formas que ocorrem naturalmente de M-CSF, incluindoaqueles expressados pelos tecidos do hospedeiro/paciente assim como aquelesexpressados pelo tumor. Os anticorpos monoclonais divulgados aqui, taiscomo anticorpo de RXl, 5H4, MCI, ou MC3, têm afinidade por M-CSF e sãocaracterizados por uma constante de equilíbrio de dissociação (Kd) de pelomenos 10"4 M, preferivelmente pelo menos cerca de 10"7 M a cerca de 10"8 M,mais preferivelmente pelo menos cerca de 10"8 Μ, 10"10 M, 10"11 M ou 10"12M. Tais afinidades podem ser facilmente determinadas usando técnicasconvencionais, tais como por diálise de equilíbrio; usando-se o instrumentoBIAcore 2000, usando procedimentos gerais esboçados pelos fabricante; porradioimunoensaio usando M-CSF rotulado I; ou por um outro métodoconhecido ao técnico habilitado. Os dados de afinidade podem ser analisados,por exemplo, pelo método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660(1949). Assim, será evidente que anticorpos de M-CSF preferidos exibirão umgrau elevado de especificidade por M-CSF e ligarão com afinidadesubstancialmente mais baixa a outras moléculas. Anticorpos preferidos ligamM-CSF com uma afinidade similar como RXl de murino da Figura 4 liga-se aM-CSF, exibem imunogenicidade baixa, e inibem a metástase de células docâncer quando testados em modelos de animais com doença metastática.Outros anticorpos exemplares ligam M-CSF com uma afinidade similar como5H4, MCl ou MC3 de murino da Figura 2, 3 ou 4, respectivamente, ligam-sea M-C SF.

O antígeno a ser usado para a produção de anticorpos pode ser,por exemplo, M-CSF intacto ou um fragmento de M-CSF que retém o epítopodesejado, opcionalmente fundido a um outro polipeptídeo que permite que oepítopo seja exibido em sua conformação nativa. Alternativamente, célulasque expressam M-CSF em sua superfície celular podem ser usadas para geraranticorpos. Tais células podem ser transformadas para expressar M-CSF oupodem ser outras células que ocorrem naturalmente que expressam M-C SF.Outras formas de M-CSF útil para gerar anticorpos estarão evidentes àqueleshabilitados na técnica.

i. Anticorpos policlonais

Anticorpos policlonais são preferivelmente aumentados emanimais por injeções subcutânea (sc) ou intraperitoneal (ip) múltiplas doantígeno relevante e um adjuvante. Uma resposta de anticorpo melhoradapode ser obtida conjugando-se o antígeno relevante a uma proteína que éimunogênica nas espécies a serem imunizadas, por exemplo, hemocianina delapa buraco de fechadura, albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidorde tripsina de soja usando um agente bifuncional ou de derivação, porexemplo, éster de maleimidobenzoil sulfossuccinimida (conjugação através deresíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina),glutaraldeído, anidrido succínico ou outros agentes conhecidos na técnica.

Animais são imunizados contra o antígeno, conjugadosimunogênicos, ou derivados combinando-se, por exemplo, 1OO μg ou 5 μg daproteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a soluçãointradermicamente em sítios múltiplos. Uma mês mais tarde, os animais sãoreforçados com 1/5 para {fração (1/10)} a quantidade original de peptídeo ouconjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em sítiosmúltiplos. Em 7 a 14 dias de injeção pós reforço, os animais são sangrados e osoro é avaliado quanto ao título de anticorpo. Os animais são reforçados até osplatôs de título. Preferivelmente, o animal é reforçado com o conjugado domesmo antígeno, mas conjugado a uma proteína diferente e/ou através de umreagente de reticulação diferente. Conjugados também podem ser fabricadosem cultura de célula recombinante como fusões de proteína. Também, agentesde agregação tais como alume são adequadamente usados para realçar aresposta imune.

ii. Anticorpos monoclonais

Anticorpos monoclonais podem ser fabricados usando ométodo do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256:495(1975), ou podem ser fabricados por métodos de DNA recombinante.

No método do hibridoma, um camundongo ou outro animalhospedeiro apropriado, tal como um hamster ou símio do gênero macaca, éimunizado como aqui descrito para evocar linfócitos que produzem ou sãocapazes de produzir anticorpos que especificamente ligar-se-ão à proteínausada para a imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizadosin vitro. Linfócitos depois são fundidos com células de mieloma usando umagente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célulade hibridoma (Goding; Monoclonal Antibodies: Principies and Practice,páginas 59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma assim preparadas são semeadas ecultivadas em um meio de cultura adequado que preferivelmente contém umaou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células demieloma parentais, não fundidas. Por exemplo, se as células de mielomaparentais carecem da enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferase(HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamenteincluirão hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), substâncias estasque impedem o crescimento de células deficientes de HGPRT.

Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundemeficientemente, suportam a produção estável em alto nível de anticorpo pelascélulas que produzem anticorpo selecionadas, e são sensíveis a um meio.Linhagens de célula de mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonaishumanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (MareeiDekker, Inc., Nova Iorque, 1987)). Linhagens de mieloma de murinoexemplares incluem aquelas derivadas de tumores de camundongo MOP-21 eM.C.-ll disponíveis do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego,Calif. USA, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis da American TypeCulture Collection, Rockville, Md. USA.

O meio de cultura em que as células de hibridoma estãocrescendo é avaliado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidoscontra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorposmonoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada porimunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal comoradioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunossovente ligado à enzima (ELISA).

A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal, por exemplo, pode serdeterminada por análise de Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem.,107:220 (1980)).

Depois que as células de hibridoma são identificadas queproduzem anticorpos da especificidade, afinidade, e/ou atividade desejadas,os clones podem ser subclonados limitando-se procedimentos de diluição ecultivados por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principiesand Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de culturaadequados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ouRPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas invivo como tumores de ascite em um animal. Os anticorpos monoclonaissecretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura,fluido de ascite, ou soro por procedimentos de purificação de imunoglobulinaconvencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia dehidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise, ou cromatografia por afinidade.

Os anticorpos da presente invenção são dito seremimunoespecíficos ou especificamente de ligação se eles ligam-se ao antígenocom uma Ka de mais do que ou igual a cerca de IO6M"1 preferivelmente maisdo que ou igual a cerca de 10'M"1, mais preferivelmente mais do que ou iguala cerca de IO0M"1, e o mais preferivelmente mais do que ou igual a cerca deIO9M"1, IO10M"1, IO11M"1 ou IO12M"1. Os anti-anticorpos de M-CSF podemligar-se a formas diferentes que ocorrem naturalmente de M-CSF, incluindoaqueles expressados pelos tecidos do hospedeiro/paciente assim como aqueleexpressado pelo tumor. Os anticorpos monoclonais divulgados aqui, taiscomo anticorpo RX1, 5H4, MCI, ou MC3, têm afinidade por M-CSF e sãocaracterizadas por uma constante de equilíbrio de dissociação (Kd) de pelomenos 10" M, preferivelmente pelo menos cerca de 10"'M a cerca de 10"° M,mais preferivelmente pelo menos cerca de 10"° Μ, 10"ιυ Μ, IO"11 M ou 10"Μ. Tais afinidades podem ser facilmente determinadas usando técnicasconvencionais, tais como por diálise de equilíbrio; usando-se o instrumentoBIAcore 2000, usando procedimentos gerais esboçados pelo fabricante; porradioimunoensaio usando M-CSF rotulado I; ou por um outro métodoconhecido ao técnico habilitado. Os dados de afinidade podem ser analisados,por exemplo, pelo método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660(1949). Assim, será evidente que anticorpos de M-CSF preferidos exibirão umgrau alto de especificidade para M-CSF e ligará com afinidadesubstancialmente mais baixa a outras moléculas. Anticorpos preferidos ligamM-CSF com uma afinidade similar como RXl de murino da Figura 1 liga-se aM-CSF, exibem imunogenicidade baixa, e inibem metástase de célulascancerosas quando testados em modelos de animal com doença metastática.

Outros anticorpos exemplares ligam M-CSF com uma afinidade similar como5H4, MCl ou MC3 de murino da Figura 2, 3 ou 4, respectivamente, liga-se aM-CSF.

Substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob otítulo de "substituições preferidas". Se tais substituições resultam em umamudança em atividade biológica, então mais mudanças substanciais,denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1, ou como ainda descritoabaixo em referência às classes de aminoácido, podem ser introduzidas e osprodutos triados.

TABELA I

Substituições de Resíduo Preferidas Exemplares Originais

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Modificações substanciais nas propriedades biológicas doanticorpo são realizadas selecionando-se substituições que diferemsignificantemente em seu efeito em manter (a) a estrutura da cadeia principalde polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformaçãoem folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítioalvo, ou (c) a maior parte da cadeia lateral. Resíduos que ocorremnaturalmente são divididos em grupos com base em propriedades de cadeialateral comuns:

(1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr;

(3) ácido: asp, glu;

(4) básico: asn, gin, his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam orientação de cadeia: gly, pro;e

(6) aromático: trp, tyr, phe.

Substituições não conservativas envolvem substituir ummembro de uma destas classes com um membro de uma outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido em manter aprópria conformação do anticorpo humanizado ou variante também pode sersubstituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa damolécula e impedir a reticulação aberrante. Reciprocamente, ligação(ões) decisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade(particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como umfragmento Fv).

B. Muteínas de M-CSF

A invenção fornece ainda muteínas de M-CSF que podem serusadas como antagonistas de M-CSF de acordo com os métodos da invenção.

"Fragmento" como usado aqui significa uma porção damolécula nativa intacta; por exemplo, um polipeptídeo de fragmento é umfragmento do polipeptídeo nativo em que um ou mais aminoácidos doterminal N ou terminal C foram suprimidos.

"Muteína" como usado aqui com respeito a polipeptídeossignifica uma variante da molécula nativa intacta ou uma variante de umfragmento da molécula nativa, em que um ou mais aminoácidos foramsubstituídos, inseridos ou suprimidos. Tais substituições, inserções ousupressões podem estar no término N, término C ou internas à molécula.Assim o termo "muteínas" inclui dentro de seu escopo fragmentos damolécula nativa. Muteínas insercionais incluem fusões no término N ou C,por exemplo fusão à porção Fc de uma imunoglobulina para aumentar a meiavida.

Muteínas preferidas de acordo com a invenção exibem pelomenos cerca de 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % ou mais deidentidade de seqüência (homologia) ao polipeptídeo nativo, comodeterminado pelo algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman(Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997)) como implementado no programaMSPRCH (Oxford Molecular) usando uma pesquisa de intervalo afim com osseguintes parâmetros de pesquisa: penalidade de descontinuidade de 12, epenalidade de extensão na abertura de 1. Outros programas de algoritmo devarredura de homologia/identidade bem conhecidos e rotineiramente usadosincluem Pearson e Lipman, PNAS USA, 85:2444-2448 (1988); Lipman ePearson, Science, 222:1435 (1985); Devereaux et al., Nuc. Acids Res.,12:387-395 (1984); ou os algoritmos BLASTP, BLASTN ou BLASTX deAltschul, et al., Mol. Biol., 215:403-410 (1990). Programas computadorizadosusando estes algoritmos também estão disponíveis e incluem, mas não sãolimitados a: GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA, que estãocomercialmente disponíveis do Genetics Computing Group (GCG) package,Versão 8, Madison Wis., USA; e CLUSTAL no programa PC/Gene daIntellegenetics, Mountain View Calif. Preferivelmente, a porcentagem deidentidade de seqüência é determinada usando-se os parâmetros predefinidosdeterminados pelo programa.

"Modificação" como usado aqui significa qualquermodificação do polipeptídeo nativo, fragmento ou muteína, tal comoglicosilação, fosforilação, conjugação de polímero (tal como com polietilenoglicol), ou outra adição de porções estranhas, contanto que a atividadedesejada (agonista ou antagonista) seja retida.A Patente U.S. N- 6.025.146, e Koths, MoI. Reprod. Dev.1997 Jan; 46(1):31-38 ambos dos quais são incorporados aqui por referênciaem sua totalidade, descrevem a cristalização de M-CSF sozinho e M-CSFcomplexado a MCSF-R, e caracterizam a estrutura tridimensional de M-CSFassim como resíduos envolvidos na ligação de receptor. A Patente U.S. N26.025.146 também descreve métodos para selecionar substituições deaminoácido candidatas em M-CSF, com base na informação estrutural. Atopologia global desta forma de M-CSF é aquela de um feixe quatro alfa-helicoidal antiparalelo, em que as hélices funcionaram para cima-para cima-para baixo-para baixo, diferentemente da conectividade para cima-para baixo-para cima-para baixo mais comumente observada da maioria de quatro feixeshelicoidais. Uma conexão de passagem longa liga a hélice A à hélice B e umaconexão similar é encontrada entre hélices C e D. Na forma dimérica ligada adissulfeto, os feixes são ligados extremidade-a-extremidade, formando umaestrutura alongada, extremamente plana (dimensões aproximadas de 85 χ 35 χ25 ). Existem três ligações de dissulfeto intramolecular em cada monômero(Cys7-Cys90, Cys48-Cysl39, Cysl02-Cysl46) todas as quais estão naextremidade distai da molécula. Uma ligação de dissulfeto intercadeia(Cys31-Cys31) é localizada na interface dimérica com o eixo de simetriaduplo não cristalográfico passando através dela como mostrado na FIG. 2.

Experimentos de mutação indicam que todos os resíduos de cisteína nestaforma de M-CSF podem ser necessários para a atividade biológica total. Aestrutura descrita aqui sugere que seu papel é principalmente estrutural aoinvés de estar relacionada ao reconhecimento do receptor. A Patente U.S. N26.025.146 fornece a estrutura tridimensional do dímero M-CSF αrecombinante truncado como identificado pelas posições alfa-carbono dosresíduos de aminoácido na seqüência.

Resíduos específicos nas hélices A, C, e D parecem estarenvolvidos na especificidade da interação da ligação de receptor. Visto queM-CSFp tem ligações de dissulfeto intracadeia envolvendo as cisteínas 157e/ou 159, a região terminal C de M-CSF provavelmente estende-se da "parteposterior" da estrutura, fornecendo uma "corda" de comprimento variávelpara formas ligadas à membrana de M-CSF. Assim, a "frente" ou região deligação de receptor de M-CSF está no lado oposto das moléculas, que consistede resíduos acessíveis em solvente em ou próximo às hélices A, C, e D,incluindo resíduos de cerca de 6 a 26, 71 a 90, e 110 a 130, respectivamente,de M-CSF nativo. A alteração de resíduos acessíveis em solvente nestasregiões por mutagênese sítio dirigida para aumentar ou diminuir interações decadeia lateral com o receptor pode gerar agonistas ou antagonistas de M-CSF.Resíduos tendo uma área de superfície acessível em solvente de mais do quecerca de 0,25 e preferivelmente mais do que cerca de 0,4 são preferidos combase na normalização da área de superfície do aminoácido acessível quandono tripeptídeo gly-x-gly (Kabsch, W. et al., Biopolymers 22:2577 (1983)).Preferivelmente resíduos são escolhidos que não interagem com outras partesda proteína tais como a interface dimérica de modo a manter a orientaçãorelativa de monômeros e a evitar interromper o processo de duplicação deproteína. Uma consideração adicional opcional é selecionar resíduos nãoconservados entre M-CSF humano e de camundongo, que não reconhece oreceptor de M-CSF humano. Aminoácidos candidatos são preferivelmenteselecionados quanto à substituição com aminoácidos não conservativos, demodo a interromper a ligação de hidrogênio e/ou interações hidrofóbicas comresíduos de MCSF-R. Por exemplo, a mudança de uma ou mais histidinaspara aminoácidos não doadores de hidrogênio de tamanho similar pode criarum M-CSF com capacidade de ligação de receptor alterada. Aminoácidospreferidos para a substituição incluem mas não são limitados a: Hl5; Q79;R86; El 15; E41; K93; D99; L55; S18; Q20; 175; V78; L85; D69; N70; H9;N63; e T34. Acredita-se que resíduos de M-CSF importantes na sinalizaçãodo receptor sejam compostos de regiões descontínuas de M-CSF. Paraminimizar a probabilidade de formação de anticorpo para medicamentosproteináceos com base em M-CSF potencialmente administrados, é desejávelreter os resíduos de M-CSF parental acessível em solvente (para assemelhar-se à molécula nativa) quando possível.

A mutagênese de aminoácidos Hl 5 e H9 na região terminalN/hélice A resultou em muteínas com atividade biológica significantementemais baixa e capacidade de ligação de MCSF-R significantemente mais baixa.

Estes resultados indicam que a atividade biológica reduzida foi devido aafinidade de ligação de receptor diminuída; assim, estes aminoácidos dehistidina representam contatos que são importantes para afinidade de ligaçãode receptor de M-CSF e deve ser deixada inalterada se a capacidade deligação de receptor total for desejada. Resíduos acessíveis em solventepróximos tais como Y6 e S13 e outros também podem representar resíduos decontato de receptor de M-CSF. Um mutante duplo de M-CSF (Q20A, V78K)foi construído para testar a importância de resíduos acessíveis em solvente naporção central das hélices A e C. Esta muteína dupla teve atividade biológicalevemente mais baixa (8 a 10 vezes) e atividade de ligação de receptorcorrespondentemente mais baixa. A mutagênese de resíduos Ql7, R21,E115e El 19 mudou as propriedades de cadeia lateral de aminoácidos acessíveis emsolvente nas áreas de interesse mas não afetou a atividade biológicaespecífica, sugerindo que estes resíduos não precisam ser alterados emmuteínas designadas a terem atividade de antagonista.

Em uma forma de realização, a invenção considera o uso demuteínas de M-CSF em que os resíduos das hélices A e/ou C e/ou Denvolvidas na ligação de receptor (por exemplo, aminoácidos 6 a 26, 71 a 90e/ou 110 a 130) foram mutados de forma não conservativa. Tais muteínaspreferivelmente retêm pelo menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % ou 90 % desimilaridade (isto é, aminoácidos que são idênticos ou têm propriedadessimilares) à seqüência nativa dentro das hélices A, C ou D, mas têmsimilaridade mais alta à seqüência nativa no restante do polipeptídeo, porexemplo, pelo menos 95 %, 98 % ou 99 % de similaridade. Além disso,resíduos que sustentam a conformação tridimensional do sítio de ligação dereceptor podem ser mutados de forma não conservativa.

Em uma outra forma de realização, a muteína de M-CSF éuma forma monomérica de M-CSF. A forma dimérica de M-CSF é a formabiologicamente ativa, e as formas monoméricas de M-CSF são geralmentenão ativas. A ligação de dissulfeto dos monômeros parece ocorrer através daligação intercadeia Cys31-Cys31. Assim, é considerado que formasmonoméricas de M-CSF podem ser adequadas para o uso como antagonistas.Tais formas incluem muteínas compreendendo supressões de cisteína e/ousubstituições de cisteína (por exemplo, substituições de cisteína para alanina)de Cys31 e/ou outras cisteínas, ou muteínas em que a(s) cisteína(s),particularmente Cys31, foram quimicamente modificadas de modo que elasnão estão disponíveis para a ligação de dissulfeto.

Ainda em uma outra forma de realização, a muteína de M-CSFcompreende uma ou mais das hélices A, C ou D, ou porções destas envolvidasna ligação de receptor, sozinhas ou fundidas a outros polipeptídeos quepermitem a exibição dos fragmentos em conformação tridimensionalapropriada.

Muteínas contendo quaisquer muteínas conservativas e/ou nãoconservativas desejadas são facilmente preparadas usando técnicas bemconhecidas no ramo, incluindo produção recombinante ou síntese química.

Substituições conservativas, particularmente substituições forade regiões diretamente envolvidas na ligação de ligando-receptor, não sãoesperadas significantemente mudar as propriedades de ligação das muteínasde M-CSF (ou muteínas de M-CSFR). Aminoácidos podem ser classificadosde acordo com propriedades físicas e contribuição à estrutura de proteínasecundária e terciária. Uma substituição conservativa é reconhecida na técnicacomo uma substituição de um aminoácido por um outro aminoácido que tempropriedades similares. Substituições conservativas exemplares sãoapresentadas na Tabela 2 (da WO 97/09433, página 10, publicada em 13 deMarço de 1997 (PCT/GB96/02197, depositada em 6/9/96), imediatamenteabaixo.

Tabela 2

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Alternativamente, aminoácidos conservativos podem seragrupados como descrito em Lehninger, (Biochemistry, Segunda Edição;Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), páginas 71-77) como apresentado naTabela 3, imediatamente abaixo.

Tabela 3

Substituições conservativas II

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Como ainda uma outra alternativa, substituições conservativasexemplares são apresentadas na Tabela 4, imediatamente abaixo.Tabela 4

Substituições conservativas III

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A disponibilidade de uma seqüência de DNA que codifica M-CSF permite o uso de vários sistemas de expressão para produzir ospolipeptídeos desejados. A construção de vetores de expressão e produçãorecombinante a partir das seqüências de DNA apropriadas são realizadas pormétodos bem conhecidos na técnica. Estas técnicas e várias outras técnicassão geralmente realizadas de acordo com Sambrook et al., Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y. (1989), e Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A LaboratoryManual, Stockton Press, Nova Iorque (1990), ambos dos quais sãoincorporados aqui por referência.

Certas modificações à seqüência primária de M-CSF podemser feitas por supressão, adição, ou alteração dos aminoácidos codificadospela seqüência de DNA sem destruir a estrutura desejada (por exemplo, acapacidade de ligação de receptor de M-CSF) de acordo com técnicas deDNA recombinante bem conhecidas. Além disso, um técnico habilitadoavaliará que aminoácidos individuais podem ser substituídos ou modificadospor oxidação, redução ou outra modificação, e o polipeptídeo pode ser clivadopara obter fragmentos que retêm o sítio de ligação ativo e informaçãoestrutural. Tais substituições e alterações resultam em polipeptídeos tendouma seqüência de aminoácido que cai dentro da definição de polipeptídeo"tendo substancialmente a mesma seqüência de aminoácido como ospolipeptídeos maduros de M-CSFa (SEQ ID NO: 7), M-CSFP (SEQ ID NO:8), e M-CSFy (SEQ ID NO: 9)."

Polipeptídeos podem ser produzidos por síntese química outécnicas de produção recombinante conhecidas no ramo.

A relação das proteínas também pode ser caracterizada atravésda relação de seus ácidos nucléicos de codificação. Métodos para determinar aidentidade e/ou similaridade de seqüências de polinucleotídeo são descritosacima. Além disso, métodos para determinar a similaridade de seqüências depolinucleotídeo através de teste de sua capacidade para hibridizar sobcondições moderada ou altamente severas podem ser determinados comosegue. Condições de hibridização moderadamente severas exemplares sãocomo segue: hibridização a 42° C em uma solução de hibridizaçãocompreendendo 50 % de formamida, 1 % de SDS, 1 M de NaCl5 10 % desulfato de dextrano, e lavagem duas vezes durante 30 minutos a 60° C emuma solução de lavagem compreendendo 0,1 χ SSC e 1 % de SDS. Condiçõesaltamente severas incluem lavagens a 68° C em uma solução de lavagemcompreendendo 0,1 χ SSC e 1 % de SDS. E entendido na técnica quecondições de severidade equivalente podem ser obtidas através de variação detemperatura e tampão, ou concentração de sal como descrito na técnica(Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(3994), páginas 6.0.3 a 6.4.10). Modificações em condições de hibridizaçãopodem ser empiricamente determinadas ou precisamente calculadas com baseno comprimento e na porcentagem de pareamento de base deguanosina/citosina (GC) da sonda. As condições de hibridização podem sercalculadas como descrito em Sambrook et al., (Eds.), Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold SpringHarbor, Nova Iorque (1989), páginas 9.47 a 9.51.C. M-CSFR solúvel

Fragmentos de M-CSFR exemplares de acordo com ainvenção podem compreender um ou mais, ou dois ou mais, de domíniosenvolvidos na ligação de M-CSF/receptor (acredita-se ser os domínios 1, 2 e3). Fragmentos de M-CSFR preferidos compreendem todos os três dosdomínios 1, 2 e 3 de M-CSFR. Mutações e/ou modificações adicionais a taisfragmentos ou ao domínio extracelular inteiro de M-CSFR são consideradas epodem ser produzidas como descrito acima na seção em muteínas de M-CSF.

M-CSFR (SEQ ID NOs: 84 e 85) é uma molécula detransposição de membrana com cinco domínios semelhantes àimunoglobulina extracelulares (dos quais acredita-se que os domínios 1 a 3estejam envolvidos na ligação de ligando-receptor), um domínio detransmembrana e um domínio de tirosina quinase relacionado a Srcinterrompido intracelular. Com referência a SEQ ID NO: 85, os domíniosanteriormente mencionados estão localizados como segue: domínio de Ig 1:aminoácidos 27 a 102; domínio de Ig 2: aminoácidos 112 a 196; domínio deIg 3: aminoácidos 215 a 285; domínio de Ig 4: aminoácidos 308 a 399;domínio de Ig 5: aminoácidos 410 a 492; domínio de transmembrana:aminoácidos 515 a 537; e domínio de quinase: aminoácidos 582 a 910. Umdomínio semelhante à imunoglobulina "típico" contém uma estrutura em alçausualmente ancorada por uma ligação de dissulfeto entre duas cisteínas naextremidade de cada alça. Em MCSF-R, estas cisteínas que formam as alçassemelhantes a Ig estão nas posições de aminoácido seguintes: Domínio 1: 42,84; Domínio 2: 127, 177; Domínio 3: 224, 278; Domínio 4: nenhuma cisteínaenvolvida; Domínio 5:419, 485.

A porção extracelular intacta de M-CSFR ou qualquerfragmento desta que retém antigenicidade, por exemplo, uma ou mais dasalças semelhantes a Ig5 podem ser usadas para elevar anticorpos que ligariam-se ao receptor nativo. Anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos,enxertados em CDR, humanizados, completamente humanos e fragmentos deligação de antígeno destes podem ser preparados como descrito acima para osanticorpos a M-CSF. Os produtos de anticorpo podem ser triados quanto àatividade como um antagonista de M-CSF e quanto à adequabilidade nosmétodos de tratamento da invenção usando ensaios como descrito na seçãointitulada "Métodos de Triagem" aqui ou usando quaisquer ensaios adequadosconhecidos na técnica.

Uma ou mais das alças semelhantes a Ig anteriormentemencionadas dentro do domínio extracelular do receptor podem sersuficientes para inibir a interação entre M-CSF e M-CSFR. Assim fragmentosdo domínio extracelular de M-CSFR e muteínas deste podem ser facilmentepreparados usando meios sintéticos recombinantes ou químicos bemconhecidos na técnica. Os produtos podem ser triados quanto à atividadecomo um M-CSF antagonista e quanto à adequabilidade nos métodos detratamento da invenção usando ensaios como descrito na seção intitulada"Métodos de triagem" aqui ou usando quaisquer ensaios adequadosconhecidos na técnica.

D. Terapia genética

A liberação de uma proteína terapêutica a células apropriadaspode ser efetuada por intermédio de terapia genética ex vivo, in situ, ou invivo pelo uso de qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindopelo uso de métodos de transferência de DNA físicos (por exemplo,lipossomos ou tratamentos químicos) ou pelo uso de vetores virais (porexemplo, adenovírus, vírus associado a adeno, ou um retrovírus). Compostosanti-sentido e métodos de usá-los também são fornecidos pela presenteinvenção. O nível de atividade de M-CSF ou M-CSFR pode ser reduzidousando-se métodos anti-sentido, de "knock-out" genético, ribozima, triplahélice ou RNAi bem conhecidos para diminuir a expressão de gene uniforme.Técnicas para a produção e uso de tais moléculas são bem conhecidas àquelesde habilidade no ramo.

Como usado aqui, o termo "peptidomimético" é um compostoque não peptídeo que compreende uma montagem de cadeias laterais deaminoácido, ou farmacóforos, ou derivados adequados destes, que sãosustentados em um esqueleto tal que a orientação espacial dos farmacóforossubstancialmente imitam a conformação bioativa de um peptídeo natural. Porexemplo, um peptidomimético pode carecer de aminoácidos ou ligações depeptídeo mas retêm o arranjo tridimensional particular de grupos de cadeia depeptídeo do peptídeo precursor que é necessário para a atividade de ligação. Oesqueleto pode compreender um esqueleto de carbono ou heteroátomobicíclico, tricíclico ou policíclico superior, ou pode ser fundamentado em umaou mais estruturas de anel (por exemplo, piridina, indazol, etc.) ou ligações deamida. Este esqueleto pode ser ligado por espaçadores a um grupo ácido (porexemplo um grupo funcional em ácido carboxílico) em uma extremidade eum grupo básico (por exemplo uma porção contendo N tal como amidina ouguanidina) na outra extremidade do núcleo. Técnicas exemplares parasintetizar peptidomiméticos são descritas no pedido de patente U.S. n°20030199531 publicado em 23 de Outubro de 2003, Pedido de Patente U.S.N- 20030139348 publicado em 24 de Julho de 2003.

Além de anticorpos e outras proteínas, esta invenção tambémconsidera antagonistas de M-CSF alternativos incluindo, mas não limitados a,peptídeos ou moléculas orgânicas pequenas que também são eficazes eminibir a interação entre M-CSF e M-CSFR ou a ativação de M-CSFR.

II. Terapia de combinação

A administração concorrente de dois agentes terapêuticos deacordo com a presente invenção, tal como um antagonista de M-CSF e umagente anti-osteoclasto secundário, não requer que os agentes sejamadministrados ao mesmo tempo ou pela mesma via, contanto que exista umasobreposição no período de tempo durante o qual os agentes estão exercendoseu efeito terapêutico. A administração simultânea ou seqüencial éconsiderada, como é a administração em diferentes dias ou semanas.

A descoberta de um atraso no tempo significante para observaro efeito terapêutico depois de começar o tratamento com um anticorpo de M-CSF (um antagonista de M-CSF exemplar) torna desejável a co-administraçãode um agente anti-osteoclasto secundário com início de ação mais rápidodurante este período de transição. Durante o período de transição, os doisagentes devem ser administrados em uma quantidade monoterapeuticamenteeficaz. Subseqüente ao período de transição, o agente anti-osteoclastosecundário pode ser descontinuado ou reduzido em dosagem. Se o antagonistade M-CSF e agente anti-osteoclasto secundário exercem efeitos sinérgicos, adose de um ou ambos pode ser diminuída depois do período de transição.

Composições da invenção são administradas a um mamífero jásofrendo, ou predisposto a, distúrbio osteolítico, incluindo metástase docâncer e/ou perda óssea associada com metástase do câncer, ou outrasdoenças relacionadas à perda óssea, tais como osteoporose, em umaquantidade suficiente para prevenir ou pelo menos parcialmente parar odesenvolvimento de tal doença. Uma quantidade de um agente terapêuticoadequado para realizar isto quando o agente terapêutico é dado sozinho (nãoem combinação com um segundo agente terapêutico) é definida como uma"dose monoterapeuticamente eficaz."

Nos métodos de terapia de combinação da presente invenção,o antagonista de M-CSF, tal como o anticorpo de M-CSF, e o agente anti-osteoclasto secundário pode ser administrado simultaneamente ou em tempodiferente. Os dois agentes podem ser administrados, por exemplo, dentro de 8horas, 1 dia, 14 dias, 30 dias, 3 meses, 6 meses, 9 meses ou 1 ano entre si.

Agentes anti-osteoclasto secundários exemplares incluembisfosfonatos, incluindo mas não limitados a zoledronato, pamidronato,clodronato, etidronato, tiludronato, alendronato, ibandronato ou risedronato.Agentes anti-osteoclasto diferentes exemplares incluem bisfosfonatos, agentesneutralizantes de PTHrP (por exemplo, anticorpo, anti-sentido, siRNA),inibidores de catepsina K, antagonistas de MIP-I-a, agentes neutralizantes deRANK/RANKL (por exemplo, anticorpo anti-RANK, tal como AMG-162, ouanti-sentido, receptor de RANKL solúvel ou muteínas destes), vacina deRANKL, osteoprotegrina (OPG), fatores de crescimento derivados deplaqueta (PDGF), inibidores de src quinase, maltolato de gálio, e inibidores demetaloproteinase de matriz (MMP).

Doses exemplares de bisfosfonatos incluem a administraçãointravenosa de 4 mg. Dosagens menores também podem ser administradasincluindo 3,5 mg, 3,3 mg ou 3,0 mg. Outras vias de administração sãopossíveis incluindo subcutânea e como descrito na WO 02/087555.

Quantidades eficazes de um anticorpo de M-CSF variarão e dependerão daseveridade da doença e do peso e estado geral do paciente que é tratado, masgeralmente variam de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de pesocorporal, ou cerca de 10 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, com dosagens de cercade 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kgpor aplicação sendo mais comumente usadas. Por exemplo, cerca de 1011 g/kg a 5 mg/kg ou cerca de 30 mg/kg a 1 mg/kg de anticorpo é umadosagem candidata inicial para a administração ao paciente, se, por exemplo,por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Aadministração é diária, em dias alternados, semanalmente ou menosfreqüentemente, conforme necessário dependendo da resposta à doença e datolerância do paciente da terapia. Dosagens de manutenção durante umperíodo mais longo de tempo, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 10 ou 12 semanas oumais podem ser necessárias até que uma supressão desejada dos sintomas dadoença ocorra, e dosagens podem ser ajustadas conforme necessário. Oprogresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaiosconvencionais.

Embora os métodos da presente invenção possam ser úteispara todos os estágios de cânceres, eles podem ser particularmenteapropriados em cânceres avançados ou metastáticos. A combinação dométodo de terapia com um regime quimioterapêutico ou de radiação pode serpreferida em pacientes que não receberam tratamento quimioterapêutico, aopasso que o tratamento com o método de terapia da presente invenção podeser indicado para pacientes que receberam uma ou mais quimioterapias.Adicionalmente, os métodos de terapia da presente invenção também podempermitir o uso de dosagens reduzidas de quimioterapia concomitante,particularmente em pacientes que não toleram a toxicidade do agentequimioterapêutico muito bem.

O método da invenção considera a administração de anticorposanti-M-CSF únicos, assim como combinações, ou "coquetéis", de anticorposdiferentes. Tais coquetéis de anticorpo podem ter certas vantagens visto queeles contêm anticorpos que exploram diferentes mecanismos efetores oucombinam anticorpos diretamente citotóxicos com anticorpos que contamcom a funcionalidade efetora imune. Tais anticorpos em combinação podemexibir efeitos terapêuticos sinérgicos.

Os métodos da invenção podem ser usados em combinaçãoainda com outros produtos terapêuticos, tais como produtos terapêuticoscontra o câncer. Agentes terapêuticos e/ou procedimentos contra o câncerexemplares, incluem mas não são limitados a vários agentesquimioterapêuticos, bloqueadores de androgênio, e moduladores imunes (porexemplo, IL-2, GM-CSF, SLC), Bisfosfonato(s) (por exemplo, Aredia (isto é,pamidronato, ácido pamidrônico, pamidronato de dissódio, pamidronato dedissódio pentaidratado); Zometa (isto é, Aclasta, ácido zoledrônico,zoledronato); Clondronato (isto é, Bonefos, Loron, clodronato de dissódio,clondronato de sódio); Fosamax (isto é, alendronato, sal de alendronato desódio triidratado, ácido alendrônico); Fosavance (isto é, Fosamax formuladocom vitamina D); Bondronat ou Bonviva ou Boniva (isto é, ibandronato,ácido ibandrônico, ibandronato de sódio); Actonel (isto é, risedronato,risedronato de sódio, ácido risendrônico); Didronel ou Didrocal (isto é,etidronato, ácido etidrônico, etidronato de dissódio); Nerixia (isto é,neridronato, ácido neridrônico); Skelid (isto é, tiludronato, ácido tiludrônico);dimetil-APD (isto é, olpadronato, ácido olpadrônico); e ácido medrônico oumedronato), cirurgia, radiação, quimioterapia citotóxica, terapia hormonal(por exemplo, Tamoxifen; terapia anti-Androgênio), terapia com anticorpo(por exemplo, anticorpos para neutralização de RANKL/RANK; anticorposde neutralização de PTHrP, anti-Her2, anti-CD20, anti-CD40, CD22, VEGF,IGFR-1, EphA2, HAAH, TMEFF2, CAIX), terapia com proteína terapêutica(por exemplo, receptor de RANKL solúvel; inibidores de OPG, e PDGF eMMP), terapia medicamentosa de molécula pequena (por exemplo, inibidorde Src-quinase), inibidores de quinase de receptores do fator de crescimento,ou inibidores de RANKL, terapia com oligonucleotídeos (por exemplo,RANKL ou RANK ou PTHrP Anti-sentido), terapia genética (por exemplo,inibidores de RANKL ou RANK, tais como anticorpos anti-RANKL), terapiacom peptídeo (por exemplo muteínas de RANKL) assim como aquelasproteínas, peptídeos, compostos, e moléculas pequenas descritos aqui.

Agentes quimioterapêuticos contra o câncer incluem, semlimitação, agentes alquilantes, tais como carboplatina e cisplatina; agentesalquilantes de mostarda de nitrogênio; agentes alquilantes de nitrosouréia, taiscomo carmustina (BCNU); antimetabólitos, tais como metotrexato; ácidofolínico; antimetabólitos de análogo de purina, mercaptopurina;antimetabólitos de análogo de pirimidina, tais como fluorouracila (5-FU) egencitabina (Gemzar®); antineoplásicos hormonais, tais como goserelina,leuprolida, e tamoxifeno; antineoplásicos naturais, tais como aldesleucina,interleulcina-2, docetaxel, etoposido (VP-16), interferon alfa, paclitaxel(Taxol®), e tretinoína (ATRA); antineoplásicos naturais antibióticos, taiscomo bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina,daunomicina e mitomicinas incluindo mitomicina C; e antineoplásicosnaturais de alcalóide vinca, tais como vimblastina, vincristina, vindesina;hidroxiuréia; aceglatona, adriamicina, ifosfamida, enocitabina, epitiostanol,aclarrubicina, ancitabina, nimustina, cloridreto de procarbazina, carboquona,carboplatina, carmolur, cromomicina A3, polissacarídeos antitumor, fatoresde plaqueta antitumor, ciclofosfamida (Cytoxin®), esquizofilano, citarabina(citosina arabinosida), dacarbazina, tioinosina, tiotepa, tegafur, dolastatinas,análogos de dolastatina tais como auristatina, CPT-Il (irinotecano),mitozantrona, vinorelbina, teniposido, aminopterina, carminomicina,esperamicinas (Ver, por exemplo, Patente U.S. N2 4.675.187),neocarzinostatina, OK-432, bleomicina, furtulon, broxuridina, busulfan,honvan, peplomicina, bestatina (Ubenimex®), interferon-β, mepitiostano,mitobronitol, melfalano, peptídeos de laminina, lentinan, extrato de Coriolusversicolor, tegafur/uracila, estramustina (e estrogênio/mecloretamina).

Além disso, agentes adicionais usados como terapia parapacientes com câncer incluem EPO, G-CSF, ganciclovir; antibióticos,leuprolida; meperidina; zidovudina (AZT); interleucinas 1 a 18, incluindomutantes e análogos; interferons ou citocinas, tais como os hormônios deinterferons α, β, e γ, tais como hormônio de liberação de hormônioluteinizante (LHRH) e análogos e, hormônio de liberação de gonadotropina(GnRH); fatores de crescimento, tais como fator de crescimento transformanteβ (TGF-β), fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimentonervoso (NGF), fator de liberação do hormônio do crescimento (GHRF), fatorde crescimento epidérmico (EGF), fator homólogo ao fator de crescimento defibroblasto (FGFHF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), e fator decrescimento de insulina (IGF); fator de necrose tumoral α & β (TNF-α & β);fator-2 inibidor de invasão (IIF-2); proteínas morfogenéticas ósseas 1-7 (BMP1-7); somatostatina; timosina-a-1; γ-globulina; superóxido dismutase (SOD);fatores de complemento; fatores anti-angiogênese; materiais antigênicos; epró-drogas.

Pró-droga refere-se a um precursor ou forma derivada de umasubstância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica ou não citotóxicaa células rumorosas comparado ao medicamento precursor e é capaz de serenzimaticamente ativado ou convertido em uma forma precursora ativa ou amais ativa. Ver, por exemplo, Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy"Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375-382, 615th MeetingBelfast (1986) e Stella et ai., "Prodrugs: A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et ai., (ed.), páginas 247-267, Humana Press (1985). Pró-drogas incluem, mas não são limitados a, pró-drogas contendo fosfato, pró-drogas contendo tiofosfato, pró-drogas contendosulfato, pró-drogas contendo peptídeo, pró-drogas modificados poraminoácido D, pró-drogas glicosilados, pró-drogas contendo β-lactama, pró-drogas contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituídos ou pró-drogascontendo fenilacetamida opcionalmente substituídos, 5-fluorocitosina e outrospró-drogas de 5-fluorouridina que podem ser convertidos no medicamentolivre citotóxico mais ativo. Exemplos de medicamentos citotóxicos quepodem ser derivados em uma forma de pró-droga para o uso aqui incluem,mas não são limitados a, aqueles agentes quimioterapêuticos descritos acima.

III. Administração e preparação

Quantidades eficazes de um antagonista de M-CSF variarão edependerão da severidade da doença e do peso e estado geral do paciente queé tratado, mas geralmente variam de cerca de 1,0 μg/kg a cerca de 100 mg/kgde peso corporal, com dosagens de cerca de 10 μg/kg a cerca de 10 mg/kg poraplicação sendo mais comumente usadas. A determinação de uma quantidadeeficaz de uma composição da invenção pode ser realizada através de métodosempíricos padrão que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, aatividade neutralizante in vivo de soros de um paciente tratado com umadosagem dada de antagonista de M-CSF pode ser avaliada usando um ensaioque determina a capacidade dos soros para bloquear a proliferação esobrevivência induzidas por M-CSF de monócitos de murino (célula CDl Ib+,um subconjunto de células CDl 1, que expressa níveis elevados de receptorpara M-CSF) in vitro como descrito em Cenci et al., J Clin. Invest. 1055:1279-87, 2000.

A administração é diária, a cada dois dias, a cada 3 dias, duasvezes por semana, semanalmente ou menos freqüentemente, conformenecessário dependendo da resposta à doença e da tolerância do paciente daterapia. Dosagens de manutenção durante um período prolongado de tempopodem ser necessária, e dosagens podem ser ajustadas conforme necessário.

Administrações únicas ou múltiplas das composições podemser realizadas com os níveis de dose e padrão sendo selecionados pelo médicodo tratamento.

Os antagonistas de M-CSF, incluindo anti-anticorpos de M-CSF usados na prática de um método da invenção podem ser formulados emcomposições farmacêuticas compreendendo um carreador adequado para ométodo de liberação desejado. Carreadores adequados incluem qualquermaterial que, quando combinado com o antagonista de M-CSF, retém afunção anti-tumor do antagonista e é não reativo com os sistemas imunes dopaciente. Exemplos incluem, mas não são limitados a, qualquer um de várioscarreadores farmacêuticos padrão tais como soluções salinas tamponadas comfosfato estéreis, água bacteriostática, e semelhantes. Uma variedade decarreadores aquosos podem ser usados, por exemplo, água, água tamponada,0,4 % de solução salina, 0,3 % de glicina e semelhantes, e podem incluiroutras proteínas para estabilidade realçada, tais como albumina, lipoproteína,globulina, etc., submetidas a modificações químicas suaves ou semelhantes.Formulações terapêuticas do antagonista são preparadas para oarmazenamento misturando-se o antagonista tendo o grau desejado de purezacom carreadores, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveisopcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16â edição, Osol, A. Ed.(1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.

Carreadores, excipientes, ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos aosreceptores nas dosagens e concentrações utilizadas, e incluem tampões taiscomo fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácidoascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto deoctadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto debenzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico;alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol;cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo(menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica,gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais comopolivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina; asparagina,histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outroscarboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes taiscomo EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol;contra-íons formadores de sal tais como sódio; complexos de metal (porexemplo, complexos de proteína de Zn); e/ou tensoativos não iônicos taiscomo TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).

A formulação aqui também pode conter mais do que umcomposto ativo conforme necessário para a indicação particular que é tratada,preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetamadversamente um ao outro. Por exemplo, pode ser desejável fornecer aindaum agente imunossupressor. Tais moléculas estão adequadamente presentesem combinação em quantidades que são eficazes para o propósitointencionado.Os ingredientes ativos também podem ser capturados namicrocápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou porpolimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulade gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, emsistemas de liberação de medicamento coloidal (por exemplo, lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ouem macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington'sPharmaceutical Sciences 16â edição, Osol, A. Ed. (1980).

As formulações a serem usadas para a administração in vivodevem ser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através demembranas de filtração estéreis.

O antagonista é administrado por quaisquer meios adequados,incluindo administração parenteral, subcutânea, intraperitoneal,intrapulmonar, e intranasal, e, se desejado para o tratamento local,intralesional. Infusões parenterais incluem administração intravenosa,intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica ou subcutânea. Alémdisso, o antagonista é adequadamente administrado por infusão de pulso,particularmente com doses em declínio do antagonista. Preferivelmente adosagem é dada por injeções, o mais preferivelmente injeções intravenosas ousubcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crônica.Outros métodos de administração são considerados, incluindo a administraçãotópica, particularmente transdérmica, transmucosa, retal, oral ou local porexemplo através de um cateter colocado próximo ao sítio desejado.

Composições da presente invenção podem estar na forma, porexemplo, de grânulos, pós, tabletes, cápsulas, xarope, supositórios, injeções,emulsões, elixires, suspensões ou soluções. As composições presentes podemser formuladas para várias vias de administração, por exemplo, poradministração oral, por administração nasal, por administração retal, injeçãosubcutânea, injeção intravenosa, injeções intramusculares, ou injeçãointraperitoneal.

Formas de dosagem injetáveis geralmente incluem suspensõesaquosas ou suspensões oleosas que podem ser preparadas usando umdispersante ou agente umectante adequados e um agente de suspensão.Formas injetáveis podem estar em fase de solução ou na forma de umasuspensão, que é preparada com um solvente ou diluente. Solventes ouveículos aceitáveis incluem água esterilizada, solução de Ringer, ou umsolução salina aquosa isotônica. Alternativamente, óleos estéreis podem serutilizados como solventes ou agentes de suspensão. Preferivelmente, o óleoou ácido graxo é não volátil, incluindo óleos naturais ou sintéticos, ácidosgraxos, mono-, di- ou tri-glicerídeos.

Para injeção, a formulação farmacêutica e/ou medicamentopode ser um pó adequado para a reconstituição com uma solução apropriadacomo descrito acima. Exemplos destes incluem, mas não são limitados a, póssecos por congelamento, secos por rotação ou secos por pulverização, pósamorfos, grânulos, precipitados, ou particulados. Para injeção, as formulaçõesopcionalmente podem conter estabilizadores, modificadores de pH,tensoativos, modificadores de biodisponibilidade e combinações destes.

Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas.Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluemmatrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo oantagonista, matrizes estas que estão na forma de artigos formados, porexemplo, películas, ou microcápsula. Exemplos de matrizes de liberaçãoprolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(metacrilato de2-hidroxietila), ou poli(áIcool vinílico)), polilactídeos (Patente U.S. N°3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólicodegradáveis tais como o Lupron Depot® (microesferas injetáveis compostasde copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), eácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etileno-acetato de vinila e ácido láctico-ácido glicólico permitam a liberação demoléculas durante mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínasdurante períodos de tempo mais curtos. Quando antagonistas encapsuladospermanecem no corpo durante um longo tempo, eles podem desnaturar ouagregar como um resultado de exposição à umidade a 37° C., resultando emuma perda de atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade.Estratégias racionais podem ser projetadas para a estabilização dependendodo mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação édescoberto ser formação de ligação S--S intermolecular através de troca detio-dissulfeto, a estabilização pode ser obtida modificando-se resíduos desulfidrila, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando o teor deumidade, usando aditivos apropriados, e desenvolvendo composições dematriz polimérica específicas.

As formulações da invenção podem ser designadas a serem deação curta, liberação rápida, ação longa, ou liberação prolongada comodescrito aqui. Assim, as formulações farmacêuticas também podem serformuladas para a liberação controlada ou para a liberação lenta.

As presentes composições também podem compreender, porexemplo, micelas ou lipossomos, ou alguma outra forma encapsulada, oupodem ser administradas em uma forma de liberação prolongada parafornecer um efeito de armazenamento e/ou liberação prolongado. Portanto, asformulações farmacêuticas e medicamentos podem ser comprimidos empelotas ou cilindros e implantadas intramuscular ou subcutaneamente comoinjeções de depósito ou como implantes tais como stents. Tais implantespodem utilizar materiais inertes conhecidos tais como siliconas e polímerosbiodegradáveis.

Além daquelas formas de dosagem representativas descritasacima, excipientes e carreadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmenteconhecidos àqueles habilitados na técnica e são assim incluídos na presenteinvenção. Tais excipientes e carreadores são descritos, por exemplo, em"Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991),que é incorporado aqui por referência.

Dosagens específicas podem ser ajustadas dependendo dascondições de doença, da idade, peso corporal, condições de saúde geral, sexo,e dieta do paciente, intervalos de dose, vias de administração, taxa deexcreção, e combinações de medicamentos. Qualquer uma das formas dedosagem acima contendo quantidades eficazes estão bem dentro dos limitesda experimentação de rotina e portanto, bem dentro do escopo da presenteinvenção.

Antagonistas de M-CSF ou anticorpos úteis como produtosterapêuticos de acordo com a invenção freqüentemente serão preparadossubstancialmente livres de outras imunoglobulinas que ocorrem naturalmenteou outras moléculas biológicas. Antagonistas de M-CSF preferidos tambémexibirão toxicidade mínima quando administrados a um mamífero afligidocom, ou predisposto a sofrer de, distúrbios osteolíticos, incluindo metástasedo câncer e/ou perda óssea associada com metástase do câncer.

As composições da invenção podem ser esterilizadas portécnicas de esterilização convencionais, bem conhecidas. As soluçõesresultantes podem ser embaladas para o uso ou filtradas sob condiçõesassépticas e liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada com umasolução estéril antes da administração. As composições podem contersubstâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário paraaproximar-se de condições fisiológicas, tais como agentes de ajuste de pH etamponantes, agentes de ajuste de toxicidade e semelhantes, por exemplo,acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloretode cálcio e estabilizadores (por exemplo, 1 20 % de maltose, etc.).

Os antagonistas de M-CSF da presente invenção tambémpodem ser administrados por intermédio de lipossomos, que são vesículaspequenas compostas de vários tipos de lipídeos e/ou fosfolipídeos e/outensoativos que são úteis para a liberação de um medicamento (tal como osantagonistas divulgados aqui e, opcionalmente, um agente quimioterapêutico).Lipossomos incluem emulsões, espumas, micelas, monocamadas insolúveis,dispersões de fosfolipídeo, camadas lamelares e semelhantes, e podem servircomo veículos para alvejar os antagonistas de M-CSF a um tecido particularassim como para aumentar a meia-vida da composição. Uma variedade demétodos estão disponíveis para preparar lipossomos, como descrito, porexemplo, nas Patentes U.S. N— 4.837.028 e 5.019.369, patentes estas que sãoincorporadas aqui por referência.

Lipossomos contendo o antagonista são preparados pormétodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sei.USA 77: 4030 (1980); e Patentes U.S. N^ 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomoscom tempo de circulação realçado são divulgados na Patente U.S. N°5.013.556. Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo métodode evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeocompreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidilethanolamina derivadade PEG (PEG-PE). Lipossomos são extrusados através de filtros de tamanhode poro definido para produzir lipossomos com o diâmetro desejado.Fragmentos Fab' do anticorpo de M-CSF da presente invenção podem serconjugados aos lipossomos como descrito em Martin et al., J. Biol. Chem.257: 286-288 (1982) por intermédio de uma reação de troca de dissulfeto. Umagente quimioterapêutico (tal como Doxorrubicina) está opcionalmentecontido dentro do lipossomo [ver, por exemplo, Gabizon et al., J. NationalCâncer Inst. 81(19): 1484 (1989)].

A concentração do antagonista de M-CSF nestas composiçõespode variar amplamente, isto é, de menos do que cerca de 10%, usualmentepelo menos cerca de 25 % a tanto quanto 75 % ou 90 % em peso e seráselecionada principalmente por volumes de fluido, viscosidades, etc., deacordo com o modo particular de administração selecionado. Métodos reaispara preparar composições oral, tópica e parenteralmente administráveis serãoconhecidos ou estarão evidentes àqueles habilitados na técnica e são descritosem detalhe, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Science, 19~ ed.,Mack Publishing Co., Easton, PA (1995), que é incorporado aqui porreferência.

A determinação de uma quantidade eficaz de uma composiçãoda invenção pode ser realizada através de métodos empíricos padrão que sãobem conhecidos na técnica. Por exemplo, a atividade de neutralização in vivode soros de um paciente tratado com uma dosagem dada de antagonista de M-CSF pode ser avaliada usando um ensaio que determina a capacidade dossoros para bloquear a proliferação e sobrevivência induzidas por M-CSF demonócitos de murino (célula CDllb+, um subconjunto de células CDl 1, queexpressa níveis elevados de receptor para M-CSF) in vitro como descrito emCenci et al., J Clin. Invest. 1055: 1279-87, 2000.

As composições da invenção são administradas a ummamífero já sofrendo de, ou predisposto a, distúrbio osteolítico, incluindometástase do câncer e/ou perda óssea associada com metástase do câncer emuma quantidade suficiente para prevenir ou pelo menos parcialmente parar odesenvolvimento de tal doença. Quantidades eficazes de um antagonista deM-CSF variarão e dependerão da severidade da doença e do peso e estadogeral do paciente que é tratado, mas geralmente variam de cerca de 1,0 mg/kga cerca de 100 mg/kg de peso corporal, ou cerca de 10 mg/kg a cerca de 90mg/kg, com dosagens de cerca de 20 mg/kg a cerca de 80 mg/kg ou cerca de30 mg/kg a cerca de 70 mg/kg ou cerca de 40 mg/kg a cerca de 60 mg/kg poraplicação. Por exemplo, cerca de 10 mg/kg a 50 mg/kg ou cerca de 20 mg/kga 60 mg/kg de anticorpo anti-M-CSF é uma dosagem candidata inicial para aadministração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administraçõesseparadas, ou por infusão contínua. A administração é diária, em diasalternados, semanalmente ou menos freqüentemente, conforme necessáriodependendo da resposta à doença e da tolerância do paciente da terapia.Dosagens de manutenção durante um período mais longo de tempo, tal como4, 5, 6, 7, 8, 10 ou 12 semanas ou mais podem ser necessárias até que umasupressão desejada dos sintomas da doença ocorra, e dosagens podem serajustadas conforme necessário. O progresso desta terapia é facilmentemonitorado por técnicas e ensaios convencionais.

Administrações únicas ou múltiplas das composições podemser realizadas com os níveis de dose e padrão sendo selecionados pelo médicodo tratamento. Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagemapropriada de antagonista de M-CSF, incluindo anticorpo anti-M-CSFdependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, daseveridade e curso da doença, se o antagonista é administrado para propósitospreventivos ou terapêuticos, terapia anterior, da história clínica do paciente eresposta ao antagonista, e da discrição do médico. O antagonista éadequadamente administrado ao paciente de uma vez ou durante uma série detratamentos.

A composição de antagonista será formulada, dosada, eadministrada em uma forma compatível com boa prática médica. Fatores paraconsideração neste contexto incluem o distúrbio particular que é tratado, omamífero particular que é tratado, a condição clínica do paciente individual, acausa do distúrbio, o sítio de liberação do agente, o método de administração,o programa de administração, e outros fatores conhecidos aos médicos. Aquantidade terapeuticamente eficaz do antagonista a ser administrado seráadministrada por tais considerações, e é a quantidade mínima necessária paraprevenir, melhorar, ou tratar a doença condição ou distúrbio, mediados por M-CSF, particularmente para tratar células cancerosas, e o mais particularmentepara tratar metástases de célula tumorosa. Tal quantidade está preferivelmenteabaixo da quantidade que é tóxica ao hospedeiro ou torna o hospedeirosignificantemente mais suscetível a infecções.

Em uma outra forma de realização da invenção, um artigo defabricação contendo materiais úteis para o tratamento das doenças, distúrbiosou condições descritos acima é fornecido. O artigo de fabricação compreendeum recipiente e um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo,garrafas, frascos, seringas, e tubos de teste. Os recipientes podem serformados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. Orecipiente contém uma composição que é eficaz para tratar a condição e podeter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser uma bolsade solução intravenosa ou um frasco tendo uma tampa perfurável por umaagulha de injeção hipodérmica). O agente ativo na composição é o antagonistade M-CSF ou anticorpo da invenção. O rótulo em, ou associado com, orecipiente indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha.O artigo de fabricação pode compreender ainda um segundo recipientecompreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como soluçãosalina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Elepode promover outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vistacomercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas,seringas, e encartes de embalagem com instruções para o uso.

A invenção é ilustrada pelos exemplos seguintes, que não sãointencionados a serem limitantes de qualquer modo.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Este Exemplo estabelece os efeitos anti-reabsorventes,dependentes de dose do Zometa (zoledronato) em um modelo de animal(Figura 14). Tratamento com 0,03 mg/kg de Zometa inibiu o dano osteolíticocausado por crescimento de tumor no sítio ósseo. Além disso, um efeito deresposta de dose foi observado quando camundongos foram tratados comconcentrações aumentadas de Zometa. mAbs de M-CSF anti-camundongo eanti-humano 5Al e 5H4 combinados também protegidos contra dano do osso.

Anticorpo de M-CSF sozinho foi mais eficaz do que 0,03 mg/kg de Zometaem tratar dano osteolítico severo. Contagem de osteólise com base emimagem de raio X no último dia de estudo (Figura 14):

0 = normal;

1 = Lesão duvidosa ou mínima com arquitetura do córtexnormal;

2 = Lesão lítica definida com rompimento mínimo docórtex/arquitetura

3 = Lesão(ões) grande(s) com rompimento docórtex/ arquitetura

4 = Destruição total sem nenhuma arquitetura preservada

A partir deste estudo inicial, um estudo de combinação foirealizado usando uma dose sub-eficaz de 0,03 mg/kg de Zometa. Duassemanas depois de inoculação intratibial de 6 χ IO5 células de Luc MDA-MB-231, camundongos Nu/Nu foram tratados com 5A1/5H4 (10 mg/kg uma vezsemanalmente), Zometa (0,03 mg/kg duas vezes semanalmente) ou tantoanticorpo quanto bisfosfonato. Lesões no osso foram monitoradasemanalmente por análise de Faxitron (tecnologia de raio X), e no fim doestudo, todos os animais foram submetidos a um raio X final, e as imagensreunidas e distribuídas para contagem da severidade das lesões. Análise dosresultados mostraram que tanto anti-M-CSF mAb quanto Zometa forameficazes em tratar a osteólise, mas que o tratamento combinado de Zometa e aincidência inibida de M-CSF mAb (Figura 15) e extensão (Figura 16) de Iiseóssea a uma extensão maior do que um outro tratamento sozinho.

Figura 16 mostra que tratamento com 0,03 mg/kg de Zometaou 10 mg/kg de anticorpo anti-M-CSF (5A1+5H4) inibiu o dano osteolíticocausado por crescimento de tumor no sítio ósseo. Um regime de combinaçãode Zometa mais anticorpo anti-M-CSF inibiu ainda Iise óssea. Contagens deosteólise médias foram calculadas a partir de 1) uma média de contagens de 3marcadores voluntários separados e 2) um grupo médio (originalmente 10animais/grupo).

Contagem de osteólise com base em imagem de raio X noúltimo dia de estudo:

0 - normal;

1 = Lesão duvidosa ou mínima com arquitetura do córtexnormal;

2 = Lesão lítica definida com rompimento mínimo docórtex/arquitetura

3 = Lesão(ões) grande(s) com rompimento docórtex/arquitetura

4 — Destruição total sem nenhuma arquitetura preservada

Análise de imagens de Faxitron representativas demonstraramainda a severidade das lesões encontradas em animais não tratadoscomparadas às lesões relativamente menores em animais tratados comZometa e anticorpo de anti-M-CSF (Figura 17). Não houve nenhuma:interação adversa observada no grupo de tratamento de combinação.

Em conclusão, tanto anticorpo anti-M-CSF quanto Zometaefetivamente inibem osteólise, e combinando os dois tratamentos resultam emum efeito anti-reabsorvente aumentado comparado com um outro tratamentosozinho. Isto sugere que a combinação pode ser uma opção segura e eficazpara pacientes com doença óssea que são intolerantes a bisfosfonato, ou quejá estão sendo tratados com bisfosfonatos.

EXEMPLO 2

Este Exemplo mostra que inibição da atividade M-CSF nãotem nenhum efeito em atividade de osteoclastos diferenciada (Figura 18). Oefeito de anticorpo M-CSF neutralizantes e bisfosfonato em atividade deosteoclasto diferenciada foi testado com Chir-RXl humanizado e Zometa.

As células CD34+ da medula óssea humana (catálogoBiowhittaker número 2M-101A, 3 χ 1,05 células/frasco) foram induzidas paradiferenciar em osteoclastos sob as condições experimentais descritas aqui. NoDia 1, células CD34+ foram descongeladas de um frasco congelado em 10 mlde meios (Alfa MEM com 10 % de FCS, 1 χ Pen Strep e 1 χ fungizona). Ascélulas foram lavadas uma vez e recolocadas em suspensão em 2 ml de meiose plaqueadas sobre a placa OsteoLyse (Kit de Ensaio OsteoLyse® (HumanCollagen), Cambrex) em 100 μΐ por reservatório.

No dia 2, sem remover os meios originais, adicionar a cadareservatório 50 μΐ de 4 χ CSF-I a 30 ng/ml de concentração final e 50 ul de 4χ RANKL (sRANKL, catálogo Chemicon # GF091, 10 ug/embalagem) àconcentração final de 100 ng/ml. No dia 7, adicionar a cada reservatório 50 ulde 5 χ RANKL à concentração final de 100 ng/ml.

No dia 15, anticorpos (Chir-RXl ou anticorpo de controle) ouZometa foram adicionados nas concentrações indicadas. No dia 17, 10 ul desobrenadante de cultura celular foram testados e misturados com 200 μΐ deReagente de Liberação de Fluoróforo em cada reservatório da placa de ensaiopreta de 96 reservatórios (incluída no Kit de Ensaio OsteoLyse).

EXEMPLO 3

Este Exemplo mostra que Zometa inibe a atividade deosteoclasto diferenciada em uma maneira dependente de dose (Figura 19). Oefeito de anticorpos neutralizantes de M-CSF e bisfosfonato em atividade deosteoclasto diferenciada foi testado com Chir-RXl humanizado e Zometa.

As células CD34+ da medula óssea humana (catálogoBiowhittaker número 23VI-101 A, 3 χ IO5 células / frasco) foram induzidas adiferenciar em osteoclastos sob as condições experimentais descritas aqui. Nodia 1, as células CD34+ foram descongeladas a partir de um frasco congeladoem 10 ml de meios (Alfa MEM com 10 % de FCS, 1 χ Pen Strep e 1 χfungizona). As células foram lavadas uma vez e recolocadas em suspensão em2 ml de meios e plaqueadas sobre a placa OsteoLyse (Kit de EnsaioOsteoLyse® (Human Collagen), Cambrex) em 100 ul por reservatório.

No dia 2, sem remover os meios originais, adicionar a cadareservatório 50 ul de 4 χ CSF-I a 30 ng/ml de concentração final e 50 ul de 4χ RANKL (sRANKL, catálogo de Chemicon # GF091, 10 ug/embalagem) àconcentração final de 100 ng/ml. No dia 7, adicionar a cada reservatório 50 ulde 5 χ RANKL à concentração final de 100 ng/ml.

No dia 15, anticorpos (Chir-RXl ou anticorpo de controle) ouZometa foram adicionados nas concentrações indicadas. No dia 17, 10 ul desobrenadante da cultura celular foi testado e misturado com 200 μΐ deReagente de Liberação de Fluoróforo em cada reservatório da placa de ensaiopreta de 96 reservatórios (incluído no Kit de Ensaio OsteoLyse).

EXEMPLO 4

Este Exemplo mostra os resultados de um estudofarmacocinético e farmacodinâmico usando RXl em primatas (Figura 20 eFigura 21).

O propósito deste estudo foi para investigar osfarmacodinâmicos e farmacocinéticos de heRXl-lO.Gl, um anticorpo de MCSF anti-humano humanizado, quando administrado aos macacos cinomolgoscomo uma injeção intravenosa de bolo lenta única (Grupos 2 e 3 no dia 1)seguido por um período de observação de 13 semanas ou como doses repetidas(Grupo 1 em Dias 1, 43, 50, e 57) seguido por um período de observação de10 semanas. Anticorpo monoclonal de IgGl anti-M-CSF humanizado foiadministrado por intermédio de injeção intravenosa (IV) de bolo lento porintermédio de uma veia braquial ou safena.

O uso de animal é requerido por agências reguladorasmundiais para a avaliação de segurança de novos medicamentos. O anticorponão é reativo cruzado em espécies de roedores mas foi mostrada ser ativa emmacacos cinomolgos. Portanto, o macaco cinomolgo foi selecionado visto queele é uma espécie que não de roedor aceita para o uso em estudos de injeçãointravenosa com biológicos.

Os animais foram randomizados nos grupos seguintes:

<table>table see original document page 79</column></row><table>

aNo dia 1, Grupo 1 receberá 0,2 mg/kg/dose, e nos Dias 43, 50,e 57, os mesmos animais receberão 10 mg/kg/dose.

Grupos 2 e 3 foram administrados na formulação do artigo deteste (2 e 2,0 mg/kg/dose, respectivamente) no dia 1 por injeção de bolointravenosa lenta durante um período aproximado de 10 minutos.Formulações foram administradas por intermédio de uma veia safena usandoum cateter e um abbocath. O volume de dose foi 4 mL/kg e a dose real foicom base no peso corporal prático mais recente de cada animal. Grupo 1 foiadministrado uma dose de 0,2 mg/kg no dia 1 e doses subseqüentes de 10mg/kg/dose nos Dias 43, 50 e 57. A formulação foi administrada por injeçãode bolo lenta intravenosa (durante um período aproximado de 10 minutos) porintermédio de uma veia safena usando um cateter e um abbocath. O volumede dose foi 4 mL/kg e a dose real foi com base no peso corporal prático maisrecente de cada animal.

Sangue foi reunido de todos os animais para hematologia e/oubioquímica clínica, como segue:

<table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table>

Os seguintes foram examinados:

Hematologia: morfologia da célula sangüínea; índices deeritrócitos (MCV, MCH, MCHC e RDW); hematócrito; hemoglobina; volumede plaqueta médio; contagem de plaqueta; contagem de célula sangüíneavermelha; reticulócitos (total e percentual); e contagem de célula sangüíneabranca (total, absoluta e percentual diferencial).

Bioquímica clínica: razão A/G (calculada); alaninaaminotransferase; albumina; fosfatase alcalina; aspartato aminotransferase;nitrogênio uréia sangüíneo; cálcio; cloreto; colesterol; creatinina; globulina(calculada); glicose; fósforo inorgânico; potássio; sódio; bilirrubina total,direta e indireta; proteína total; triglicerídeos; e proteína C reativa.

Marcadores bioquímicos de modificação óssea foramanalisados como segue (aproximadamente 2 mL de sangue foi reunido detodos os animais para determinação de biomarcadores ósseos):

<table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table>

(NTX: telopepídeo de reticulação do terminal N de colágenoósseo)

(CTX: telopepídeo de reticulação do terminal C de colágenoósseo)

Avaliação farmacocinética e atividade do soro M-CSF:

Para os Grupos 2 e 3, sangue (1,5 mL cada) foi reunido porvenipuntura em pré dose em tubos SST, Dia 1 (imediatamente depois do fimda infusão e 4 horas depois do fim da infusão), e Dias 3, 8, 15, 22, 29, 43, 57,71, e 85. Para animais do Grupo 1, sangue (1,5 mL cada) foi reunido porM 10 venipuntura em pré dose nos tubos SST, Dia 1 (imediatamente depois do fimda infusão e 4 horas depois do fim da infusão), e Dias 3, 8, 15, 22, 29, 43 (prédose e 4 horas depois do fim da infusão), 50 (pré dose e 4 horas depois do fimda infusão), 57 (pré dose e 4 horas depois do fim da infusão), 59, 64, 71, 78,92, 106 e 120. Amostras foram analisadas por avaliação farmacocinética epara a atividade do soro M-CSF e atividade de IOlGlde heRXl remanescente.

Amostras de sangue foram deixadas coagular em temperaturaambiente durante aproximadamente 30 minutos antes da centrifugação. Osoro foi obtido por centrifugação em aproximadamente 2700 rpm durante 10minutos em aproximadamente 4o C, e o soro resultante foi dividido em 4alíquotas.

Todas as patentes U.S., publicações de pedido de patente U.S.,pedidos de patente U.S., patentes estrangeiras, pedidos de patente estrangeirose publicações que não de patente acima referidos neste relatório descritivoe/ou listados na Folha de Dados do Pedido, são incorporadas aqui porreferência, em sua totalidade.

A partir do precedente será avaliado que, embora formas derealização específicas da invenção fossem descritas aqui para propósitos deilustração, várias modificações podem ser feitas sem desviar do espírito eescopo da invenção.ustagem da seqüência

<110> Liu, et al.

<120> "métodos para prevenir e tratar metástase do câncer e perda ósseaassociada com metástase do câncer"

<130> 02 8099.001

<140> A ser designado<141>

<150><151>

<150> 88

<170> PatentIri version 3.3

<210> 1

<211> 1401

<212> OKA

<213> Kue musculus

<400> 1

atgggttggt cctgtateafc cctattcctg gtggccactg ccacaggtgt gcactccgac 60

gtgcagctcc aggagtcagg acctggcctc gtgaaacctt ctcagagtct gtccctcacc 120

tgtaetgtca ctgaetaccc caccaccagc gattacgect ggaactggat «cggcaattc 180

ccagggaata aaettgagtg gatggggtac afeaagctaca gtggtagcac ttectacaat 240

ccatctctca aaagtcggat ctcc&tcact cgagacacat ccaagaacca gttcttcctg 300

cagctgaact cfcgfcgaetac tgaggacaca gccacatafcfc actgtgcatc cttcgactat 360

gcccacgcca tggattactg gggceaaggg acfetcggfcca ctgtctcttc cgccaaaaca 420

acagccccat cggtctatcc actggcecct gtgtgtggag> atacaactgg ct-cct-cggtg 4BO

actctaggat gcctggtcaa gggttatttc cctgagccag tgacctegae ctggaaetct 540

ggatocctgfc ccagfcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacacc SOO

ctcagcagct ca.gfcgact.gfc aacctcgagc ecctggccca gccagtccat cacctgcaat 660

gtggcccaec cggcaagcag caccaaggtg gacaágaaaa ttgagcecag agggcceaca 720

atcaagccct gtcctccatg caaatgccca gcacctaacc tcttgggtgg a-ocatccgtc 7 ao.

ctcatcttcc ctccaaagat caaggatgfca ctcatgatct çcctgagccc catagt-caca 840

tgtgtggtgg tggatgtgag egaggatgac ccagatgtcc agatcagctg gtttgtgaac 900

aacgtggaag tacacacagc tcagacacaa acccatagag aggafcfcacaa cagtactctc 960

cgggtggtca gtgccctccc catceagcac eaggactgga tgagtggcaa ggagttcaaa 1020

tgcaaggtca acaacaaaga cctcccagcg cccatcgaga gaaccatctc aaaacocaaa IOSO

gggtcagtaa gagctçcaca ggtatatgtc ttgcctccac -cagaagaaga g&tgactaag 114-0aaacaggtca ctctgacctg catggtcaca gacttcatgc <?tgaa,gacat tcacgtggag 1200

tggaccaaea acgggaaa&e agagce&aac fcacaagaaca ctgaaccagt cctggactct 3,260

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aaCagctact cctgttcagt ggtccacgag ggcctgcaca atcaccacac gactaagagc 2380

ttctcccgga etecgggfcaa a 1401

<210> 2

<211> 447

<212> FHT

<213> Htis musculus

<400> 2

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Het Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly Ser IStr Ser Tyar Asn Pro Ser Lreu50 55 60

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Leu Gln Iieu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys85 90 95

Ála Ser Phe Asp Tyr Ala Mis Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110

Ser Vel Thr Val Ser Ser Ala Lyss Tfer Thr Ala Pro Ser Val Tyr P*r©115 120 125

Iieu Ala Pró Val Cye Gly Aap Thr Thr Gly Ser -Ser Val Thr Leu Gly130 135 140

Cya Leu Val Lyc Sly Tyr Phe Pro Glu Pro VaI Thr Leu Har Trp Asn145 150 155 160

Ser Gly Ser Lett Ser Ser Gly Val Hia' Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser ser Thr180 185 XSO

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19$ zoo aos

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Cye Pro Pro Cys Lys' Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Oly Pro Ser225 230 235 240

Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile I»ys Asp Val Leu Met Ile ser Leu245 250 25S

Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Aep Aep Pro260 265 270

A^p Val Qln Ile Ser Trp Phe Val Asft Asa Val GlU Val Kis Thr Ala275 280 2Θ5

Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Astt Ser Thr !«eu Arg Val Val290 295 300

Ser Ala Iífiti Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Gltt Phe30S 310 3IS 320

Lys Cye Lys Val Aen Asn Lys Aep l#eu Pro Ala Pro He Glu Arg Thr325 330. 33S

He ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gl*i vai Tyr Val teu340 34S 3S0

Pro Pro Pro Glu Glti Glu Met Thr Lys Lya Gln Val Thr Leu Thr Cys355 360 365

Met Val Thr Aep Phe Met Pro Glu Asp Xle Tyr Val Glu Trp Thr Asn370 375 380

Asn. Gly Lya Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp3B5 390 395 400

Ser Asp Gly ser Tyr Phe Ret Tyr ser Lys Jjeu Arg Val Glu Lys Jfcys405 410 415

Asn Trp Val Glu Arg Asa ser Tyr "ser Cys Ser vai vai His Glu Gly420 42S 430Leu Hie Asn Ric Hie Thr Thr Lys ser Phe ser Arg Thr Pro Gly

<210> 3

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<212> DKA

<213> MwS «usculus

<400> 3

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<210» 4

<211> 214

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Gly Ala Ser Val Val Cye Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Xle130 135 140

Asn vai Lya Trp Lys Ile Asp GIy ser Glu Ivrg Gla Mn Gly vai Leu145 150 155 160

Asa ser Trp Thx Asp Gln Asp Ser Lya Asp ser Thr Tyr ser Het ser165 170 173

Ser Thr Leu Thr Leu 1Mir Lys Awp Glu Tyr Slu Arg Uis Asn Ser Tyrxeo 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Sex Thr- Str Pro Ile VaI Lys ser195 200 205

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<211> 105

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<400> 5

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20 25 - 30

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Ala Ser Phe Aep Tyr Ala Hiu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 ÍOS 110

Ser Val Thr Val Ser Ser115

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Oly Ser Leu Leu Leu Leu. Val Cya Leu Leu Ala Ser Arg 'Ser He Thr20 , 25 ' 30

Glu Glu Val Ser Gltt Tyr Cye Ser Kie Mefe Ile Gly Sex Gly His Leu,35 40 45Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp ser 1Gln MeC Qlu Thr Ser Cys OlnSO 55 GO

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Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Vial -Glu Leu Pra Val245 250 255

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Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile -Asp Ser Gln Met Glu Tkr ,Ser Cys Gln50 55 60

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<213>

<400> 9

Met Mir Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thx- Trp Leuι 5 xo XS

Gly Ser Leu Iieu Leu Xaeti Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Xle Thr20 25 30

Glu Glu Val Ser Glu Tyx Cys Ser His-Mefc Ile Gly Ser 1Gly His Leu35 40 45

Gla Ser Leu 01« Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln50 55 60

Ile TlHr Phe Glu Phe vai Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro vai .Cyses 70 75 BD

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu. Val Gln Aap Ile MeC Glu Asp TiHf85 90 9S

Met Arg Phe Arg Aep Asn Thr Pro Áan Ala Ile Ala He Val -Gln LeuIQO IOS 110

Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Sear Cys Phe Thr Lya Asp Tyr -Glu115 120 12 S

Glu His Asp Lys Ala Cya vai Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln130 135 140

Leu Leu GlU Lys Val Lya Asn Val Phet Antn Glu Thr Lya Asu Leu Leu14 S 150 155

Asp Lya Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala165 170 175

Glu Cye Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cyg Asa Cye Leu180 2.SS 190Tyr Pro Lya Ala lie Pro -Ser Ser Aep S>ro Ala ser vai Ser Pro His'195 200 205

Gln Pro Jieu Ala Psro Ser Het Ala Pro Val Ala <3ly Leu Thr Trp <3lu210 215 220

Asp Sex Glu Gly Thr Qlu Oly Sex Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro225 230 235 240

eu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser245 2S0 255

Ttrr cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro .Glu Thr Pro Val Val Lye Asp Ser260 2SS 270

Thir Ile Gly Gly Ser Pro Glsa Pxo Arg Pro Ser Val' Gly Ala Phe Iten27S 280 285

Pro Gly Met Glu Asp Xle Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val290 2SS 300

Peo Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Giu Ile pto vai Pro Gln Gly305 310 315 320

Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser «et* Oln Thr Glu325 330 335

Pro Ala Arg Pro ser Aan Phe Leu Ser Ala. Ser Ser Pro Leu. Pro Ala

340 345 350

Ser Ala Lys Gly Gla Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Hia Glu Arg Gln355 . 360 365

Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gla Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu370 375 , 380

Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Le« Leu385 390 395 400

Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Ar«f Ser His Gln Glu Pro Gln Ars Ala Asp405 410 415

Ser f>ro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Tfer GJLn Aep Asp Arg420 42S 43 0

Gln Val Glu Leu Pro Val43S<210» 10

<21Χ> 441

<212> PftT

<213> MUS «nusculus ·

<400> 10

Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Ijys Thr Gly Thr1 S 10 15

Ser Val LyB Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Tbr Gly Tyr20 25 30

Phe Met His Trp Val Lya Gln Ser Hie Gly LyS Ser Leu Glu Ttp He35 40 45.

Gly Tyx rie Se r Cys Tyr Asa aiy Asp Thx Asn Tyr Aea -Gln Asn PheSO SS 60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyrês 70 75 80

Meti Olá Phe Asn Sex Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Aia Arg Glu Gly Gly Asn Tyr Pro Ala Tyr Tsrp Gly Gln Gly Thr Leu100 IOS 110

Val Thr Val Bgt Ala Ala Lys Thr Thr Pxo Pro Ser Vfel Tyx Pro Leu

lis íao ias

Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gls Thr Ama Ser Met Val Thr Leu <3ly Cys130 135 140

Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr *T«p Asn -Ser145 ISO ISS 16 O

Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln SerISS 170 175

Aep Leu Tyx Tiiir Leu Ser Ser Ser Val Thr VaX Pro Ser Ser Thr Trp180 185 190

Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser ®er ThrISS 200 205

Lys Val Aap Lys Lys Xle Val Pro Ang Asp Cys Gly Cya Lys Pro-Cys210 " 215 220Ile Cya Thr Val Pro Glw Val ser Ser Val Phe He Phe Pro Pro Lys225 230 235 240

Pr© Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val245 250 2S5

Val Val Asp Ile Ser Lye Asp Asp Pxo Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe260 265 270

vai Asp Asp vai Gltt Val Kts Thr Ala Gln Thr Qln Pro Arg Glu Glu275 2BO 235

Gln Phe Asn ser Thr Phe Arg Ser .Val Ser Glu Leta Pro xl« Met Hls250 295 300

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lye Cys Arg' Val Asn -Ser Ala305 310 315 320

Ala Phe Pxo Ala PrO Ile Oltt Lya Thr Ile Ser Lys Hir Lys ,Gly Arg32S 330 335

Pxo Lye Ala Pro Cl» Val Tyr Tfar Ile Pro Pro Pro Lys Glu -Gln Met340 , 34S 350

Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Mefc Ile Thr Asp Phe Phe Pro3S5 360 365

Glti ASp Ile Thr- Val Glu Txp Gln Trp ãsn, Gly Gln Pro Ala Clu Asn370 375 3«0

Tyr Lye Asn Thx Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val385 390 395 400

Tyt ser Lys Leu Aea Val Gln i»ys Ser Asn Trp <3iu Ala Gly Asa Thr4ÓS 410 4X5

Phe Thr Cys Ser Val Leu Hls Glu Gly Leu His Asn His His Thx -Glu420 425 «30

Lye Ser Leu ser Hie Ser Pro Gly Lys435 440

<2!0> 11

<211> 214

<212» PRT

<213» Mue muEculuE

<400> 11Asp Ile Val Mec fMir Gln Ser Mis Lys Phe Met Ser Thr Ser Val <31y1 5 10 15

Aep Arg Val Thr Ile Ttur Cys Itye Ala· Ser Gln Asa Val Gly Thr Ala20 25 30

Vai Thr Trp Tyr Gla Gla Lya Pro Gly 01« Ser Fro Lys .Leu Leu rie35 40 45

Tyr Trp Thr Ser Thr ATg His Ala Gly Val Pro Aisp Arg Phe Titr Oly50 55 60

ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Aep Val Gln Ser65 70 75 80

Qlu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro JUeu9S 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Slu Gln Leu Thr Ser Gly115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asa Asa Phe Tyr Pro Lya Asp Ile130 135 140

Asa vai Lye Trp Lye Ile Asp Gly ser elú Arg Gla As» Gly Val Leu145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Iltr Lyis Aep Glu Tyr Glu Arg His Asa Ser Tyr180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lya Thr Ser Thr -Ser Pro Ile Val Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg Aen Glu Cys210

<210> 12

<211> 449

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Oly Gly Leu Val Glit Pro Gly Gly "1 5 10 15

Ser Leu Lya Leu ser Cya Ala Thr ser Gly Phe Thr Plie Seir Asp Tyr20 25 39

Tyr MeC Tyr Trp vai Arg Oln Thr Pro Glu i.ys Arg Leu Olu Tip Val35 40 45

Ala Tyx Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val50 55 50

Lya Gly Arg Phe Thr Ile Sex Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thx Leu Tyr65 70 75 SO

Leu Gln Itet Ser Arg Leu, Lys Ser Glu Asp Thr Ala: Met Tyr Tyr Cy©SS 90 SS

Ala Arg Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly -Gia Gly100 105 HO

Thx Lett vai Thr vai Ser Ala Ala Lye 1Jrttr Tfcr Ala Pro Ser vai Tyr1X5 " 120 ias

Pro Leu Ala Pro vai Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu130 135 140

Gly Cya Leu Val L.ys Gly Tyr Phe Pro -Qlu Pro Val Ttor Leu Thr Trp145 150 155 160

Asn Sex Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Plie Pro Ala Val Leu165 . 170 175

Oln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser ser ser Val Thr vai Thr -ser Ser160 IBS .190

Tte Trp Pro Ser Gln Ser lie Thr Cys Asn VaH Ala Mis Pro Ala Ser195 200 2ÓS

ser Thr Lye vai Aap Lys Lys He Glu Pro Axg Gly Pro Thr Ile Lye210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Lys cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu -Gly Gly Pro225 230 235 240

Ser Val Phe Ile Plie Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Xle Ser245 2S0 255Leu Ser Pro Ile Vai Thr Cys Val Val Val Asp vai Ser Glu Asp Asp260 265 270

Pro Rsp vai Gln He Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val Kis ISir275 280 26S

Ala Gln Thr OIn Ttor His Arg-Glu Asp Tyr Asn Ser Tiir.iieu Arg Val290 295 300

Val Ser Ala Leu Pro Ila Gln Hls Gln Asp Trp Mac Ser Gly Lys Glw305 310 315 330

Phe Lvs Cys Lys Val Aen Asa Lys Aep Mtt Pro Ala Pro Ile Glu Arg325 330 335

Thr Ile Ser LyS Keo Lys Gly ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val34Ô 345 350

Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Mefc Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu ThrSSS 360 365

Cys Mefc VaI Thr Aep Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr370 375 380

Aea Aan Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asti Thr Glu Pro Val Leu38S 390 39S 400

Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Mefc Tyr Ser Lya Leu Arg Val Glu Lye4Q5 410 415,

Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu420 430

Gly Leu His Aisn His His Thr Ttir Lya ser Phe Ser Arg Ttor Pro Gly43S 440 445

Lya

<210> 13

<211> 214

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400» 13

Ala lie Gln Mefc Thr Gln Thr Thr Ser ser LeU Ser Ala Ser Leu -Qly15 10 ISAsp Arg vai Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly He «er Asn Tyr20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gltt Lys Sro Asp GJy Hir Val Lye Leu Leu üe35 40 45

Yyr Tyr Thr Ser Ser Leu Hia Ser Gly Val Pro Ser Arg Bhe Ser GlySO SS

Ser Gly ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Aen Leu Glu ProSS 70

Glu ASP He Ala Thr Tyr Tyr cys.Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro TSip85 90

Tfcr Phe GIy Gly Gly TEr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Ala Ala

iOO 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser -Gly115 X20 X2S

Gly AJLa Ser Val Val Cys Phe Leu ABn Asn Phe Tyr Pro f»ys Asp Ile130 13S 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Glft As» Gly Val Leu145 150 155

Asn Ser Trp Thr Aep Gln Asp Ser Lya Asp Ser Thr Tyr Ser Mefe Ser165 1^0 i75

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg «ia Aso Ser Tyr180 185 190

THr CVB Gltt Ala Thr Hls Lye Thr ser Thr Ser Pro Ile Val LysX9B 200 2OS,

Phe A©» Arg Asa Glu Cya310

<2 XO> 14

<21!» 522

<212> PRT

<213» MUS BlUSCülUS

<400> 14

Asp Val Gln Lea Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

j 5 10 15Set Leu Ser Leu Tfar Cys Thx Val Thr Gly Tyr Ser Ile Tbr Scr Asp20 25 30

Tyr Ala Trp Asa Trp Ile Arg Gln Phe Pro -Gly Asn Lys Leu TSlu Trp35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyx Ser Gly Ser Thx Sex Tyx Asa,Pro Ser LeuSO 55 60

Lys Sex Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Qln Phe Phe65 ?Õ 75 80

Leu Gln Leu As» Ser Val Thr Thr Glti Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr CysBS BO SS

Ala Arg Leu Glu Thr Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gla Gly Thr Thx100 IOS 110

Iiett Tfer vai ser Ser Alá Lys Thr Thx Pro Pro Ser va.1 Tyr Pxo LeuIiS Í20 125

Alas Pro Gly Cys Gly Asp Thx Thx Gly Ser Ser Val Thx Leu Gly Cys

130 13S 140

Leu Val L.yB Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Aan Ser14 S ISO 155 160

Gly Ser JUeu Ser Ser Ser Val HiB Thx Phe Pro Ala Leu Leu Gln SexIfiS 170 175

Glv Leu Tyr Ttox Met Ser Sex Sex Val Tte Val PxO Ser Ser Thr Trp180 185 190

Pro Sex Gln Ttox Val Thr Cya Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr195 200 205

Thx Val Asp Lys Lye Leu Glu Pro Ser Gly Pro Xle Ser Thr Ile Asn

210 215 220

Pxo Cye Pro Pxo Cya Lys Glu Cys His Lye Cya Pro Ala Pxo Asn Leu225 230 235 240

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pxo Pro Asn Ile Lys Asp Val245 ' 2S0 2S5

Leu Het Ile ser Leu Thr Pro Lya Val Thr Cys VaI vai Val Asp Val260 265 270Ser Qlu Asp Asp Vro Asp Val Gln Ile Ser Trp BUe VaX ASti Asn Val275 2B0 285

Glu Vãl HiS -Kir Ala Gln Tbr Glri Thr His Arg Glu Asp Tyr Aan Ser290 2 95 300

Thr ile Axg Val Val Ser Hir Leu Pro He Gln His G*» asP "rtHP Met305 310 315 320

Ser Gly Irya Glu Phe Lys Cys Lys Val Aso AStt Lys Asp Leu Pro "Ser325 330 335

Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys lle Lya Gly Leu Val Arg Ala Pro340 345 350

Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Alá Glu Glia Leu Ser Arg Lys Asp355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu vai Val Gly Phe Asa Pro Gly Asp Ile Ser370 375 380

Val Qlu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asa Tyr Lye Asp Thr365 3 90 395 400

Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp GXy ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu4 05 410 415

AS» Sdet Lys Thr Ser Lye Trp Glu Lya Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn«20 425 43O

Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser" 435 440 445

Arg Ser Pto Gly Leu Asp Leu Asp ASp Ile Cye Ala Glu Ala Lys Asp«50 455 . 4S0

Glv Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Ttor He Thr £le Phe Ile ser Leu465 470 47S 4®Q

Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Ser Val Thr Leu Phe Lys vai485 450 495

Lve Tro Xle Phe Ser Ser Val Val Glu Leu Lys Gla Lys Ile Ser Pro500 505 , SiO

Aep Tyr Arg Aen Met ile Gly GXn Gly Ala515 S20<210> 15

<210> 214

<212> PRT

<213> Mua muaeulu3

<40O> 15

Asp Ile Lgu Leu Thr Ola Ser Pro Ma Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly5 10 15

Glu Argr Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Oly Ser Pro Arg Leu Leu IJe35 40 45

Lys Tyr Ala ser Qlu Ser Xle Ser Gly He Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ila Asn ser Val Glm Ser65 70 75 BO

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asa Ser Trp Pro Thr85 90 35

Thr Phe Qly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Xle Lys Trp Ala Asp Ala Ala100 105 110

Pro Thx vai ser Ile Ptee Fro Pra Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly115 120 12S

Gly Ala Ser Val Val Cys Fhe Iieu Âsa Asa Phe Tyr Pro Lys Asp Xle130 135 140

Aen vai Lye Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asa Gly Val Leu145 150 155 160

Asn ser Trp Thr Asp Gln Asp ser Lys Asp Ser Thr Tyx Ser Met ser165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg Hia 'Aen Ser Tyr180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Tkr Ser Ttor Ser Pro Ile Val Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cye210<J210> 16

<211> 5

<212> pht

<213 > Homo sapiens

<4OO 16

Sly Tyr Phe Met His1 5

<210> 17

<211> 5

<212> PKT

<213> Homo sapiens

<400> 17

ASp Tyr Tyr Met Tyt1 S

<210> 18

<211» 6

<212> PRT

<213> Homo eaplena

<«00> IB

Ser Aep Tyr Ala Trp Asn1. 5

<210> 19

<211> 17

<212* PRT .

<2l3> Hobio sapiens

<4:003» 19

Tyr Ile Ser Cye Tyr Aen Gly Asp1 5

Thr aftt Tyr As» Gln Asn Phe r»ys10 IS -

Gly

<210> 20

<211» 17

<212> PRT

<213 > Homo saplena

<400> 20

Tyr 11® Ser Aso Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lya1 S 1:0 15

Gly<210> 21

<211» 16

<212» PBT

<213 » Homo eapiens

<400> 21

Iyir Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro ser Leu Lys Ser1 S 10 15

<210» 22

<211» B

<212» PRT

<213» Komo aapiens

<400» 22

Glu Oly Gly Asn Tyr Pro Ala Tyx1 5

<210> 23

<211» 10

<212» WlT

<213» Hãmo sapiena

<4©Q» 23

Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Pro Pihe Ala Tyx1 S • 10

<210» 24

<211» 9

<212> PRT

<213> HOHto sapiens

<400> 24

Pbe Asp Tyr Ala His Ala Met Aep Tyr

1 ' S

<210» 25

<211» S

<212» PRT

<213» Homo sapiena

<400» 25

Lett Glu Thr Trp x<eu Phe Asp Tyr1 s

<210» 26

<211» 7

<212» PRT

<213» Itomo sapiens

<400» 26

Asp Tyr Gly Trp Kte Asp Tyr<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> Roimo sapiens

<400> 2?

Lys AXa Scr Gln Asa Val Oly Thr Ala Val Tbr1 5 10

<210? 28

<211> 11

<212> PRT

<213> Botso eapiens

<400» 29

Ser Ala Ser Gln Gly He Ser Asn Tyr Leu Asn

i 5 10

<210?- 29

<211> 11

<212 > PRT

<213 > Bomo sapiene

<400> 29

Rxxf Ala Ser Qln ser Ile Qly Tiir ser Ile His1 S 10

<2l0> 30

<211» 7

<212> PRT

<213 >' Homo sapiens

<400> 2Ú

Trp Thr Sftr Tbr Arg. Hia Ala1 S

<21Q> 31

<211» 7

<2.12* PRT

<213» HonKS sapiens

<400> 31

Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser1 S

<210* 32

<211> 7

<212> PRT

<213> Hcjftio sapiens<40O> 32

Tyr Ala Ser Qlu Ser Ile Ser1 5

<210» 33

<211> 7

<212» PRT

<2i3> Honto sctpiens

<4O0> 33

Tyr Thr Ber Qlu Ser Ile Ser1 5

<21G> 34

«211> 9

<212 > PRT

<213 » Homo aapiens

<400> 3«

Gla Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro teu iThr

-JL S-

<210» 35

<211> 9

<212> PRT

<213» Homo sapiens .

<40Q> 3S

Qln Gln Tyr Ser I«ye fceu Prp Trp Thrl S

«210> 3«

«211» 9

c2X2> PRT

<213> HoniO eapiens

<400> 35

Oln Gln, Ile Asn Ser Trp Pro Thr Tiir1 5

<21,0» 37

<211» 9

<212» FRT

<213» Homo sapiens

<400 » 37

©la Gln ser Asn Ser Trp Pro Thr Thr1 5

<210> 38<211» 9<212> PRr

<213 > Homo eapiens

<40Ô> 38

GliEi Gln Tyr Ser Ser Trp Pro Thr Thr1 5

C210> 39

e211> 130

<212 > PRT

<213 > Botao eapiena

<220>

<221> misc_feature

<222» <23) .. (23)

<223 > Xaa ca» be any naturaily ©eeurring a mino acid<22 O >

<221> misc_f eatuxe

<222> (27)..<27)

<223 > Xaa can be any naturally oecurxing amino acid«220>

<22l> Kilfic feature

<222> (29)..(29)

<223 > Xaa ca» be aay naturally óccurring amino acid<22B>

<22l> misc_£eature

<222> (31) .. <3S)

<223> xaa ca» be any naturally oecurring amino acid<220»

«221> rai ee_feature

<222> (Sl)..(Sl)

<223> Xaa can be any naturally occtirríng asu.no acid«220»

<22l> mÍBC_feature ,

<222» (5S)..(57)

<223» Xaa can be any naturally oeeturring amino acid<22Q>

<22i> raisc_£eature

«222> (SS)..(59)

<223 > Xaa can be any naturally occturring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222 > (61) -. (61)

<223> Xaa can be any naturally

occurrincj amino acid

<220*

<221> misc_feafcure<222.> (84) ♦ » (84)

<223> xaa can be any naturally occurring amino acid«220>

«221> mise_£eat"ure

<222> (86>..(8<S)<223> xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220 >

<221> miec_feature

<222> (101).-(X16)

<223> Xaa p0(ie ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> misc_£eature

<222> (119),,<119)

<223> Xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> raisc_feainire

<222> <125>.- C125)

<223> Xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente

<400> 39

Asp Val Gln I>eu Qln Qlu Ser Gly Pro <3ly Leu Val Lys PrO Ser Gln5 10 15

Thr teu Ser Leu Thr Cys xaa Val Ser Qly Xaa Ser Xaa Ser Xaa Xaa20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly i»ys Gly I«eu Glu Trp35 40 45

Ile Gly Xaa Tyx Tyx Arg Ala Xaa Xaa Gly Xaa «ir Xaa Tyr Asn Pro50 558 60

Ser JUeu Lys Ser Azrg Val Tlir Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Aen Qln65 70 75 60

Phe Ser Deu Xaa X*eu xaa Ser Val Thr Ala Ala Aep Trtur Ala Val Tyr85 90 95

Tvr Clys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa100 105 110

Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Xaa Ttp Gly Gln Gly Tkr Xaa Val Thr Val115 120 125

Ser Ser

<210> 40

<211> 354

<212> DNA

<213> Homo sapienB

<400> 40

gacgcacaac ttcaagaatc tggcccaggt ctcgtcaaac cfcfccfc-caaac tcfcctcactcacccgcactg ttactgacta ctctattaca tccgactacg -ct-eggaactg gatccgacaa 120

tcccctggca aaaaactcga atggatgggt tatatttott actctggctc -cacctcctac 180

aatccttccc fcgaaatcacg catcacaatt tccogcgata cctctaaaaa tcaattttca 240

ctccaactca attctgttac cgccgccgat" actgccacct actaxstgtgc ©tcttttgac 300

Cacgctcacg ccatggatta Ctggggacag ggtactaccg ttacegtaag ctca 354

<2X0 > 41

<211> 118

«212» PHT

<213> Homo sapieas

<4Ú0> 41

Asp Val Gla Leu Gln Gltt Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln1 S 10 , 15

Thx Leu Ser Leu Thr CyB Thr vai Thr Asp Tyr ser Ile Thr Ser Asp20 2S 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Sla Phe Pro Gly Lys Lys Irfsu Olu Trp35 40 4S

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser LeuSO 55 60

Lys ser Arg Ile Thr He Ser Arg Aep Thr Ser Lys Asa Gla Phe SerSS 70 75 80

Leu Gla Leu Asa Ser Val Thr Ala Ala Asp Tfer Ala Thr Tyr Tyr CyS85 90 95

Ala Ser Phe Asp Tyr Alá His Ala Het Aep Tyr Trp Gly -Gla Gly Thr100 IOS 110

Thr Val Thr Val Ser SerHS

<210> 42

«211* 354

<212> DHA

<213> Homo eapiens

<400> 42

caagttcaac ttcaagaatc aggccccgga ctcgttaaac cctctcaaao tctctcfcett 60

actcgcactg tatccgatta ctctattact tcagactacg cttggaactg gatcagacaa. 120

tttcccggaa aaggacfccga atggatggga tatatctctt actctggctc aacctcfctac 180

aacccctctc tçaaafcctcg aataacaatc tcâcgcgafca ettctaaaaa tcaafctctca 240cttcaactta actccgttac tgccgccgac actgcegttt actactgtgc ctcctccgat 300tacgcccacg ctatggatta ttggggacaa ggaactaccg tcactgfccag ctca 354

<2X0> 43

<211> 118

<212> PRT

<213 > Homo sapiens

<400> 43

Gln Val Oln Leu Gln Qlu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Set Gln1 s IO- 15

THr XlSHi Ser Leu Thr Cys Thc Val Ser Asp Tyr Ser Ile Thr- Ser Asp20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp IXe Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly IrfiU Glu Trp35 «0 45

Met Gly Tyr Xle Ser Tyx Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asa Pro Ser Leu50 55 SO

l,ys ser Arg He Thr Xle Ser Arg Aap Thr ser Lya Asn Gln Phe SerSS 70 ?5 80

Leu Gln Leu Aen ser Val Thr Ala Ala Asp llir Ala Val Tyr Tyr CysSS 90 95

Ala Ser Phe Asp Tyr Ala His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 IOS 110

Thr VaX Thr Val ser Ser115

<220> 44

<211> 327

<2l2> SMA

<213> Howo aApiene

<400> 44

gaaatagttc ttactcaatc ccccggtaca cCctcagttt ccccaggcga aegcgtcact 60

ttttcctgca gagcafccaca atcaatcggç acttcaattc afctggfcatca acaaaaaaca 120

ggacaggccc cacgactfcet tattaaatat gcatcagaac gagccacagg catcccagac 180

agafcfcfcfccag gttcaggatc aggcaccgat fcfccaçacfcfca. caatatccag agtcgaatca 240

gaagattttg cagattaeta ttgtcaacaa ataaacagct ggcccactac attcggacaa 300

ggcacaaaac tcgaaatfcaa aegtacg; 327<210> 45

<211> 109

<212> PRT

<213> Hcwio sapiens

<400> 45

Glu Ile Val Ijsm Thr Gln Ser Pro Gly Shr Leu Ser Val Scr PTo Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Tlur Phe Ser Cyâ Arg Ala Ser Gla Ser Ile Gly Thr Ser20 25 30

lie ais Trp Tyr Gln CJla Lys TJir Gly Gln Ser Pra Arg I«eu Leu Ile35 40 . 45

Lya Tyr Ala Ser Glu Arg Xle Ser Gly 11« Pro Asp Arg Phe Ser GlySO SS 60 '

Ser Gly Ser Sly Titr Jygp Phe Thr teu Thr Xle Ser Arg Val Glu SerGS 70 7S 80

Glu Asp Plie Ala Acp ,Tyr Tyr Cys Gln Gln He Asn -Ser Trp Pro Thr«S 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lya Lmt Glu Ile I.yk Arg Hur100 XOS

<210» 4£

c2Il> 337

c2Í2> DÍEA

<213» Eomo Bapiena

<«00» 46

gaaatagttc ttectcaatc ccccggtaca ctctcagttt ccecaggega aegcgtcacttcttcttgca gagcatcaca atcaateggc actteaattc attggfc&tca. acaaaaaectggaeaggcoc cacgacttct tattaaatat geatcagaae gagecacagg eatcccagacagattfctcag gttcaggatc aggcaccgat tteacacfcta caatatccag agtogaafceagaagattttg eagacfcacca ttgtcaacaa ataaacagct ggcceactae attcggacaaggcacaaaac tegaaafcfcaa acgeacg

47109PRT

Kowo sapietis«400» 47

GlU lie Val Kiett Thr Gltt Ser Pro Gly Thr teu Sj»r Val Ser Pro GJy15 10 15

<210><211><212><213?.Glu Arg Val Thr Phe Ser Cy3 Arg Ala Ser <51» Ser Xle Gly Thr Ser

20 2S 30

Ile Kis Trp Tyr Gln Gla Lys Tbr Gly -Gln Ala Pro Arg teu Leu Ile3S 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly50 SS 60

ser GXy ser Gly Thr Asp Plie Thr Ihju Thr Ile Ser Arg Val Glu Ser65 70 ?5 SO

Glu Amp Phe Al« Asp Tyr Tyr Cya Gln Gln Ile Aen Ser Txp Pro Thr85 90 95

Thr Phe Oly Gln Gly Tto Lya Leu Gltt Ile í<ys Arg Thr100 IOS

<210» 4 8<211> 109<212> PRtP<213 > Homo 48Asp Ile ZjéU

5 10 IS-

Glm Arg Val ser Pha Ser Cye Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser20 25 30

Ile Hla Trp Tyr Gltl Gltt Arg Thr As» Gly Ser Pro Arg Deu Leu Ile35 .40 45

Lya Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Xle Pro Asp Arg Phe Ser GlyX 50 SS SO

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1Jtir Leu Thr Ile Ser Arg Val Glte Sér65 70 75 80

Glu Aera Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gltt Gln He Asn Ser Trp Pro Thr85 ' 90 »5

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Iiys Leu Glu Ile Lys Arg Thr100 105,

<210> 49<211> 1X1<212> PRT<213> Homo sapiens

<220>

<221> ini s c_fe ature<222> (98)..(9B>

<223> Xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<400> 49

Glu Ile Val Leu Thr Gla Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cy8 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30

Tyr Leu Ala Iip Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gla Ala Pro Arg Leu Leu35 40 4S

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Ascg Ala Thr Gly Xle Pro Asp Arg Phe Ser50 SS 60

Glv ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ila Ser Arg Leu Glu65 70 TB 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser ProBS 90 95

Pro Xaa Thr Phe Gly Gln Gly Ttor Lya Val Glu Ile Lys Arg Thr

105 HO

<210> 50

<211> IOS

<212» PRT

<213> Homo eapiens

<4Q0> 50

ASP Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser vai Thr Pro -Gly1 S 10 15

Glu Lya Val Thr Ile Thr Cye Gln Ala Ser Glu Gly He Bly Aen Tyr20 25 30

Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Aep Gln Ala Lys Leu Leu Ile Lys3S 40 45

Tyr Ala Ser Gl» Ser Ile Ser Gly vai Pro ser Arg Phe ser Gly Seif50 55 «0Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Lys Hie Paro Leu Thr85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu He Lys Arg Tfar100 105

<210> 51<213> 109<212> PRT

<213> g e qüência Artificial

<220>

<223> LOW RIak Light Chain vs. VKS Subgroup 2-1- (1) Al 4 :<400> 51

Asp Ile Val Leu Kjht GIo Ser Pro Ala Phe Jieu Ser Val Thr Pro Gly5 10 15

Glu Lys Vai" Thr Phe Tihr CysGln Ala Ser Gln Ser Xle Gly Thr ser20 25 30

Jle Hia Trp Tyx Gla Gln Lye Thr Asp Gln Ser Pro Arg Lea Leu Ile35 40 45

Lya Tyr Ala Ser Gltt Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser -Gly50 55 60

ser Gly Ser Gly Thr Asp Phs Thr Leu Thr Ile Ser Ser. Val Glu Ala65 70 75 80

Glu Aap Ala Ala Aep Tyr Tyr Cys Glii Gln Ile Asn Ser Trp Pro Thuf85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Iyys Leu Glu XI* Lys Arg Tbr100 105

<210> 52<211> 327<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia leve de baixo risco + risco moderado vs. subgrupo vk6 2-I-(I) A14:SEQ.DE DNA

<400> 52

gacatagttc tcacacaatc accagcattc ctcfccagtea cacccggcga aaaagtaacc 60

tttacctgee aggctectca atctatcggc acttctattc actggtatca acaaaaaacc 12o

gatcaagctc etaaactecfc cataaaatac gcatccgaat -ccatctccgg tafcccccecc ieoagatttccag gctccggctc cggcacagafc ttcaccctta ccactagete agttgaagcc 24 0

gaagacgcag ctgattaçta ctgtcaacaa ataaactcat ggcccactac cttcggcggc 300

327

ggcactaaac tcgaaataaa acgtacg

<210>. S3<2H> 109<212> PRT

<213> SeqüênciaArtificial

<223> LOw EiBk + Moderate Xisk Light Chain vs. VK6 Subgroup 2-1-<1>Al 4 :

<400> 53

Aep Ile vai Leu Thr Gla Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly

2 5 10 1®

Glu Lyo Val Thr Phe Thr Cys Gla Ala Ser Gln sei- Ile Gly Thr Ser20 25 30

Ile His Trp Tysr Gln Gln Lye Iter Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 «5

Lye Tyr Ala ser Glti ser Ile Ser Gly Ile Pro ser Argr Phe ser GlySO SS «o

Ser Gly ser Gly Thr Aap Phe Thr Leu Thr 11« ser ser Val Glu Ala65 ,70 7S • 80

Glu Asp Ala Ala ABp Tyr Tyr Cye Gls Gln Ile Asn Ser Ttp Pro Thr85 90 95

Thr She Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr100

<2X0» 54"<211» IOO<212» PRT<213> Honw saplene

<400» 54

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lya Pro Thr GlnX Sr IO 15

Thr Leu Wur Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser„20 2S

Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Prp -Gly Lys Ala Leu Glu35 40 45Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Aacg Tyr Ser Pro serSO 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thx Ile Thr Lys Aap Thsr Ser Lyg Asa Gln Val55 70 73 80

Vatl Leu Hxr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr TyrSS 90 95

Cys Ala His Arg100

<210> 55

<211> 9 B

<212> PRT

<213» Homo s&piena

<400> 55

Oiu Val Qln Lew Val Glu Ser Gly Gly Oly Leu Val Gln Pro 431y <3lyIS 10 15

Set Leu Arg Lett Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pfae Kir Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Tip Met Ser Trp Val Aarg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Aan Ile Lys Gln Asp Gly Ser Slu Lye Tyr Tyr Val Asp iSer Val50 55 60

Lye Gly Arg Pbe 1Kir Ile Sec Arg Asp Aen Ala Lys Asn Ser Leu Tyai65 70 75 60

Leu Glia Mec Asn Ser Leu Arg Ala Glu Aep Thr Ala Val Tyr Tyr CysSS »0 95

Ala Arg

<210> 5€

<211> 98

<2Í2> PRT

<2X3» Horao Bapieno

<400> se

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pto Ser Gly15 XO 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Qly Ser Ile Ser Ser Ser20 25 30

Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp35 40 45

Xle Gly Glu Xle Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Aan Pro Ser LeuSO 55 60

Lys Ser Ayg Val Thr Ile ser Val Asp Lysi Ser Lys Asa Gln Phe Ser55 70 75 BO

Leu Lye Leu Ser Ser Val Thr Ala AJa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cya

SS SO gS

Ala Arg

<210> S7

<211> 98

<212» PJRT

<213» Hoina sapieixs

«400» 57-

Glu Val Glii Leu Val Gln Ser Gly Ala <31u Val Lys Lye Vxo Gly Glu1 5 I0 is

Ser Leu Lys lie Ser Cyo Lys Gly Ser Gly Tyr ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30

Trp He Qly Trp vai Jir3 Gln Met Pro Sly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Xle Xle Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Pte50 SS eo

Gln Gly Gln Val Thr Xle Ser Ala Asp Lys Ser Xle ser Thr Ala Tyr65 70 75 so

Leu Gln Trp ser Ser Leu Lys Ala Ser Aep Thr Ala Mec Tyr Tyr Cys8S 90

Ala Arçf

<2X0» 58

<211» XOl

<212> PRT

<213» Homo sapíens<400> 58

Gln Val Gin í,eu Gin Gln Ser Oly Pro Gly Le-u Val Lys Pro Ser <3ln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Lsu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser vai Ser Ser Asn20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gla ser Pró Ser Arg Gly Leu Olu35 4 0 45

Trp Leu Gly Arg Thr 'Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala50 £5 SO

Val Ser Val Lya Ser Arg Ile Thr lie Asn Pro ASp Thr Ser Lys Asn65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser vai Thr Pxo -Glu Aap Thr Ala Val85 90 $$

Tyr Tyr Cys Ala Arg100

<210> SS

«211» 93

<212> PRt

<213 s. Homo sapíens

«s40Ô> 59

Gln vai Gln Leu Val Gln ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15 '

Ser Val Lys Val Ser Cys LyS Ala Ser Gly Tyr Thr Ph& Thr Ser Tyr'20 25 3 0

Ala Ket Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Slu Trp Met3 5 4 0 45

Gly Trp Ile Aan Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala. Gln Gly PheSO 55 60

Thr Gly Arg Pha Vsl Phe ser Leu Aep Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 7Q 75 00

Leu Gla Ile Cys ser Leu. Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys65 90 95

Ala Arg<21Ô> SÓ

<2ii> se

<212> PRT

<213 > Mus museulus

<400 > 60

ASp Val Cln Leu Glu Glu Ser Giy Pro Gly Leu VaI Lyst Pro Ser GlaIS 10 LS

Ser Leu S«sr Leu Thr Cys Thr Val Thr Asp Tyr Ser Ile Thr Ser Asp20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg GIn Phe Pro Gly Asn Lys Léu Glu Trp35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser ThrSO SS

<21©> €1<211> S9

<212> PRT

<213> Homo Bapiens

<22 0 >

<221 > misc feature

<222> (1).7(1}

<223> Xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220*

<221> raisc_featucê

<222> (IS) , , {16}

<223:. Xaa p0de ser qualquer amino ácido ocorrendo naturalmente<220»

<22l> miso faature .

<222* (30)~. (30)

<223 > xaa Pode ser qualquer amino ácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> misc feature

<222» (33) . . (33)

<223* xaa Pode ser qualquer amino ácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> «ise:_f eature

<222> Íâ5>..(3S)

<223> Xaa p0de ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<22i> misc_feature

<222> (50) . . í 50)

<223 > xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220»

<221> miac_£eature

<222> (S2J..(52J<223? Xsa Pode ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente<220>

<221> Hiisc featusre<2ZZ> (55)T.(56)

c223> Xaa p0de ser qualquer amino ácidos ocorrendo naturalmente<220>

<22l> raisc featüie<222> {58)T.(5e)

<22 3 > x&a p0de ser qualquer amino ácidos ocorrendo naturalmente<400> Sl

Xaa Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val bya Lys Pro Gly xaa1 S 10 is

Ser Val Iya Val Ser Cya Lys Ala Set Gly Tyr Thr Phe Xaa Ser Tyr20 25 30

Xaa Ile Xas Trp Val Arg Gln Ala- Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ket35 40 '45

Gly Xaa Ile Xaa Pro Tyr Xaa Xaa Gly Xaa Thr50 5 5

<210> 62

<21i> 62

<212 > ?RX

<21 3» Jicnno eapiens

c22Q>

<221> misc_feature<222> (23),.(23>

<223 > Xaa Pode ser qualquer amino ácidos ocorrendo naturalmente< 2 2 o >

<221> miec feature<222» (2?)T.(27)

<223> xaa p0íje ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente<220>

<221> raisç_feature<222> (23)..(29)

<323> xaa Pode ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente<220»

<221> mi sc_£eature

<222> <32)..(37)

<323> Xaa p0de ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente<220>

<22l> mise_£eature

<222> (52) - . C52)

<223 s xaa Pode ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente<220»

<22l> ríisc_f eature«222» (56),.(59)

<223» xaa Pode ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente<220»

<221» misc_fest*are

<222> (61),.(61)

<223> Xaa Pode ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente

<4OQ» S2

Sln Val Gln Leu Gla Gla Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Xaa Val Sfer Gly Xaa Ser Xaa Ser Ser Xaa20 2S 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pko Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45

Trp Ile Gly Xaa Ile Tyr Tyr Arg Ala Xaa Xaa Gly Xaa Thr56 SS 60

<210» 63

«211» 60

<212» PRT

«2X3» Homo sapierte

<220»

<221> mi sc_£eature

•<222» (31)..{31)

<223 » Xaa Pode ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente<220»

«221» rei s c_Êeature

<222» (3 3) . , (33)

<223 > Xaa P0^e ser qualquer amino ácido soe orrendo naturalmente<22 o >

<221> misc_feature

<222> (3S)..<3S)

<223» xaa Pode ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente<220>

<221» roisc feature

<2 22» (49)7. (50)

Xaa Pode ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente

«223»

<220»

<221> mise feature

<222» (52)7.(53)

<223> Xaa Pode ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente<220>

<221> «r.isc Ceature

<222» (55)7.(SS)

<223 > Xaa Pode ser qualquer aminoácidos ocorrendo naturalmente<22 O ><221;» tnisç feature<222> <58)7.(59)

xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente

<4 00> 63

Glu Val Gln l»SM Val Glu Ser Gly Oly Gly Leu VaI Gln Pro Gly Gly1 S 10 15

Ser Leu Arg keu Ser Cya Ala Ala Ser Gly'Phe Thr Fhe Ser Xaa Tyr20 25 30

Xaa Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu.Glu Trp Val35 40 45

Xsa Xaa tle Xaa Xaa Lye Xsa Xaa Gly Xaa Xaa Thr50 SS €0

<210> 64

<211> 50

<212 > PRT

«213 > Homo eapiens

<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lya Lys Pro Gly Ala15 10 i-s

ser Wal Lya Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30

Tyr Met Mia Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glii Trp Met35 40 4$

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser GIy Gly ThrSO SS

<210:» 65

<2X1> SS

<212> PET

<213 > Kottco sapiens

<400> 65

Gln lie Tlir Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr GlnIS 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cye Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr ser20 25 30

Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Ly3 Ala Leu Glu35 4Q 4 5Trp Leu Ala Lèu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys50 55

<2io> es

<211> 58

<21Z> PRT

<213> Komo sapiens

«400» 66

Glu Val Gln Lew Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Qla Paco Gly Gly15 JO 15

Ser leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Tter Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Trp Met Sér Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly JLys GIy Leu Glu Trp Val35 4 0 4 5

Aia Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu LysBO 55

c210> 67

<211> 5B

<212» PRT

<213 > Hoitio sapiens

<400> $7

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lye Pro Ser Gly15 10 IS

Thr Leu Ser Leu Tiir Cya Ala Val Ser Gly Gly Ser Jle Ser Ser Ser20 25 30

Aen Trp Trp ser Trp VaX Arg Gln Pro Pro Gly LyB Gly Leu Glu Trp35 40 45

lie Gly Glu He Tyr His ser Gly Sar ThrSÓ 55

<210> SS

«211> 58

<212> PRT

<2i3> Homo sapieas

<4 00> SB

Glu Vàl Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 S 10 15

Ser Leu Lys Xle Ser Cys Lys GIy Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ssr Tyr20 25 30Trp Ile Gly Trp vai Rrg Gln Nst pro Gly Lys Gly Leu -Glu Trp Met3S 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly As? Ser asd Thr50 55

<210> 63

<211> Sl

<212» PRT

<213> Hosno sapiens

<•400> 69

Gln vai Gln Leu Gltv Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser CSlts1 S 10 15

Thr Jteu Ser Leu Thr Cys Ala He Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Txp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg 'Gly Leu -Glu35 40 «5

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lya Trp Tyr Asn50 55 60

<210» 70

«311» SS

<2X2> PRT

<213> Komo eapiens

<400» 70

Gln Val Gln Leu Val Glrt Ser Gly ser Glw Leu Lys Lys Pro Qly Ala

IS 10 is

Sar Val Lys Vál Ser Cye Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr iSer Tyr20 25 30

Ala Met Aan Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro50 SS

<210» 71

<211» 60

<212» PRT

<2i3> Ktse museulus

<400» 71

Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp ThrSer Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asifii Ser Val Thr Thr Glu Asp20 25 30

Thr Aia Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser Phe Asp Tyr Ala His Ala Met Asp35 40 45

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser VaI Thr Val ser Ser50 55 60

<210> 72

<211> ?õ

<212> í?RT

<213> Komo eapienü

<22 0>

<221 > raisc_feature

<222> . . (Í4)

c2 23> Xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente«22 o >

<221> ir«is>c_£ea.tu.re

e222> {!«).'. {16j

<223» Xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> misc_f«ature

<222> (31) > , {31}

<22 3 > xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<22i> núsc_£eature

<222> (41)„,ÍS3)

<223» Xaa p0de ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> tnisc_feature

<222> (SS).»(SS)

<223> Xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<22X> mlsc_featurc

<222> (59).. (53)

<223> xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<400> 12

Asn Tyr Ala Gln hys Phe Glii Gly Arg Val Thr Ile Thr Xaa Asa Xaa

1 s 10 15*

Ser Thr Ser ThK Ala Tyr Ket GltA Leu Ser Ser Leu Arg Ser Xaa Asp20 2S 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa33 40 45Xaa Xaa Xaa Xáa Xaa Asp Xaa Xaa Phe Asp Xaa Trp Cly GIn CXy ThrSO 55 60

LSTJ Val Thr VaX Ser Ser65 70

<210> 73

<211> 70

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<22 Ú>

<221 > tnisc_f eataire

<222> (1) . . (!)

«223> xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221» ieísc feature

<222> (24)7.(24)

<223 > xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> mi.se feature

<222> (2S)7. (26}

<223> Xaa p0de ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<22Q>

<22l> misc feature

<222* (41).,<S6}

<223> Xaa p0(Je ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220»

<221» ftii sc Ceat-ute

<222> (59)7. (59)

<223> Xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<22Ó>

<221> miec_feature

<222> (SS).. (SS)

<223> xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<400> 73

xaa Tyr Asn Pro Ser Leu Lys ser Arg VaX Thr Ile Ser VaI Asp Thr

15 10 15

Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Xaa Leu Xaa ser Val Thr Ala Ala Aep20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45

Xaa Xaa Xaa Xag Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Xaa Trp Gly Gln Gly fhr50 £5 60Xaa vai Thr Vai Ser ser€5 TO

<210> 74

<221» 70

<212» PRT

<213> Komo eap^ens

<220>

<221> miae_feature

<222 > (40) . . (52I

<223> xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> misc^féature

<222> (55)..(SS)

«223» xaa Pode ser qualquer amino ácido ocorrendo naturalmente<220>

<22X> tni5c_faa;ure

<222 > (S9!.,(59)

<223 > Xaa Pode ser qualquer amino ácido ocorrendo naturalmente

<4005. 74

Tyr Tyr Ala Asp Ser vai Dye Gly Arg Phe Tbi Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 IS .

Ser Lyg Asa Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45

Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Ffee Asp Xaa Trp Qly Gln Gly ThrSO 55 60

Leu Val Thr Val ser ser65 70

<210> 7S

<iix> 70

<2L2> Í>RT

<213v Hono sapíene

<220>

<221» misc_£eature<222> (41)..(SS)

<223> Xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<400> 75

Asn Tyr Ala Gla Lys Phe Gln Gly Arg vai Ttir Met Thr Arg Asp Thr15 10 isSer Ile ser Thr Ala Tyr Mec Glu Leu Ser Arg Lcu Arg Sar Asp Asp20 25 30

Thr Ala vai Tyr Tyr Cys Als Arg Xaa Xas. Xaa Xaa Xaa Jíaa. Xaa Xaa35 40 45

Xaa Xiaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Oln Gly Thr50 SS SO

Leu Val Thr Val Ser Ser65 70

<210> 76

<211> 70

<212> PRT

<21%> HomD sapiene

<220>

<221> raisc_feature<222> {42),.(35)

<223> xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<400> ?€

Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lya Asp Thr15 10 XS

Ser Lye Asn Oln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Mst Asp Pro Val Agp20 25 30

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Hia Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa- Xaa3S 40 45

Xaa Xaa Xaa Xaa Xáâ Xaa Xaa Tyr Ph® Asp Tyr Trp Qly Gln Gly Thr50 55 60

Leu Val Thr vai. Ser Ser

65

70

<210> 77

<21i> 70

«212> SRT

<213» Horao sapiens

<22 0>

<2:2i> TRise featíirec222> («1>7.tSS)

<223 > Xaa P0de ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<400> 77

Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Aep Asri1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala olu Asp

20 25 30

-Thr Ala Val Tyx Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaá Xaa Xaa Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr50 55 fio

Leu Val Thr Val Ser Ser65 70

•i210> 78

<211> 70

<212> ?RT

<2X2> Homo sapiens

<22Ô>

<222» roísc f«ature<222» (41)7. (SS)

<223» Xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrido naturalmente i<400» 78

Aen Tyr Aan Pro Ser Iieu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lye3- 5 XO 15

Ser Lys Asn Gln Pha ser Leu Lye Leu Ser ser Val Thr Ala Ala Asp20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cya Aia Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Aep Tyr Trp Gly Gln Gly ThrSO 55 ^O

Leu vai Thr Val Ser Ser63 70

<210> 75

<2ÍX> 7 0

<212 a. PRT

«213 > Hotno sapxers3

<220 >

<221> misc feature<222» (41}..(55)

<223 > xaa Pode ser qualquer aminoácido ocorrido naturalmente<4OO > 73

Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Oln Val Thr Ile Ser Ala Asp l>ys13 IO IS

Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Iueu Lys Ala Ser Asp20 25 30

Thr Ala Met Iyr TV^ CVS Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 43 45

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Aap Tyr Trp GIy Gln Gly Thr50 SS 60

teu Val Thr Val Ser Ser65 70

<2ÍC> 8 0

<211» 70

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens

<220>

<221> ijÍ3C_£ eacure<222> <41) . , (55)

<223> XaaPode ser qualquer amino ácido ocorrido naturalmente<400> 80

Aap Tyr Ala vai Sçr Val Lys Sier Arg Ile Thr lie Asn- ?ro Asp Tbr1 S '10 IS

Ser Lys Aaa Gln Phe Ser I»eu Gln teu Asn Ser Val Thr Pro Olis Asp20 SS 30

Thr Ala vai Tyr Tyr Cye Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr50 55 eo

teu Val Thr vai Ser ser65 7Ú

«210> 81

<211» 70

<212> PItT

«213» Homo sapiens

<220>

«221» misc feature<222> (41)--(55)

<223> xaa Pode ser qualauer aminoacido ocorndo naturalmente<400> 81

Thr Tyr Ala Gln Oly Phe Thr Gly X 5 Arg Phe Val 10 Phe Ser Leu Asp Thr 15 Ser Val Ser Tfcr Ala Tyr Leu Gln 20 lie cys ser 25 Leu Lys Ala Glu Asp 30 thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 40 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa xaa 45 Kaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 50 55 Phe Asp Tyr Trp çly Gln Gly Thr 50 Leu Val Thr Val Ser ser SS 70

<210> 82 <211> 1404 <212 > DMA <2X3> Homo Eaplens <400> 62 atgggafcgga gttgcattat aettttcetc gttgccaccg ccactggagt tcactetgac 60gtacaaetfcc aagaatcfcgg cceaggtctc gtcaaacctfc etcaaactct ctcactcacc 120egcactgtta etgactactc eattacatcc gactacgctt ggaaetggat ccgacaatitt 180CCtggtaaaa aactegaatg gatgggtfcat atttcttacc ctggetccac etcctacaat 240ccttctetga aatcaegeat cacaatttcc egcgatacce ctaaaaatea attfctcactc 3C0eaactcaatc ctgttaeegc cgccgatact gcçacetact actgtgccte tfcttgactae 360gctcacgcca tggattattg gggacagggt actaecgtca ccgtaagete agecageaca 420aagggcccat cggtettcee cctggcaccc tcetceaaga gcacct-etgg gggçacagcg 480gccctggget gcctggtcaa ggactaettc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaaecea 540ggcgccctga Ceageggegt geacâcettc ccggctgtcç tacagtcctc aggaetctae 600tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagettgg gcacceagae etacatctgc 6€0aacgtgaatc acaagccçag caacaccaag gtggaeaaga gagttgagee eaaatcttgt 720gacaaaactc acacatgtec accgtgccca gçacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 700ttcçtcttçc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct eccggacccc tgaggtcaea 640tgegtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggeea agtteaactg gçacgtggac 900ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag cegcgggagg agcagtacaa cagcacgtae 950cgtgtggtea gcgtccc-cac cgtcctgcac caggaetggc tçaatggcaa ggagtacaag 1020tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagçc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1030gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccae cccgggagga gatgaccaag 1140aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggctcctatc ccagcga-cat «cgççgtggag 1200tgggagagca atgggçagcc ggagaacaac tacaagacca cgeefceccgç gctggactcc 1260gacggctcct ccttcctcta tagcaagccc accgtggaca agagcaggtg gcageagggg 1320aacgccttct catgctccgt gaegcatgag gctctgc&ca accactacac gcagaagagc 1380çtçtCCCtgt ccccgggtaa atga 140«

<210> 8J

<211> 467

<212> FRT

<213> Hobio sapiens

c400> 83

Mec ôly Trp Ser Cys Ile Ile Leti Phe leu Val Ala Thr Alá Thr GlyIS ID 15

Val His Ser Rsp vai Gln Leu Gl» GlM ser Gly Pro Oly Lesi Val Lys20 25 30

Pro Ser Qln Tlir Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Asp Tyr Ser Ile3 5 40 45

Thr Ser Asp Tyr Ala Tzp Asn Trp Xle Arg Gln Phe Pro Gly Lys Itys50 55 60

Lau Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser -Gly ser Thr Sísr Tyr Asn65 70 75 SO

Pro Ser Leu Lye Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys AsaSS 90 93

Gla Ph@ Ser LeiU Gla Leu Asn Ser vai Thr Ala Ala Asp Thr Aia Thr100 IOS 110

Tyr Tyr Cys Ala Ser Phe Asp Tyr Ala His Ala Met Aep Tyr Trp GlyIlS 120 125

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro ser130 135 14 0

Val Phe Pró Leu Ala Pro Ser Ser Lyg Ser Thr Ser Gly -Gly Thr Al,a14 S 150 ISS 160Aia Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr ValISS 170 175

Ser Tip Asn Ser Cly Ala Dsu Tiir Ser Gly Val His Thr Phe Pro AlaISO 1B5 190

vai Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leia Ser ser Val Val Tiir Val195 200 205

Pro Ser Ser Ser £>au Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Aen. vai Asn His210 215 220

Lys Pro Ser Asn Tks Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys225 230 235 240

ASp Lys Tfer His Thr Gye Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1Gly245 2S0 255

Óly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Aep Thr Leu Ket260 265 270

Xle Ser Arg Thr Pro 01o. Val Thr Cys Val vai Val Asp Val Ser His275 260 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Pí»e Asn Trp Tyr Val Asp Gly vai Glu Val290 295 300

His Asa Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn ser Thr Tyr305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Si» Asp Trp Leu Asn Oly325 330 335

Lye Glu Tyr Lys Cys Lye Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile34 0 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Glft Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 3S5

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Vai -Ser370 37S 3S0

Leu Tbr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro sex Asp Ile Ala Val Glu3S.S 390 39S 400

Trp GIu Ser Asn Gly Gln Pxo Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 4ISVal Leu Asp Sar Aap Gly Ser Phe Phes teu Tyr Ser Lys Leu TJir Val420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Glrv Oln Gly Asxi Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445

His Glu Ala Lea Kis Asn His' Tyr Thr Gln Lys ser Leu Ser Leu Ser450 455 4€0

Pro Qly Lys4S5

<210> 84

<211> 398S

<212> PNA

<2X3» Homo oapiens

<2205-

<221> CDS

<222> (293)..(3211)

<220>

<22i> sig peptídeo

<222> (293},, E349}

<22 0>

<221> raat_peptideo

<222> (350) . > (3206}

<220>

<221:» migc feaeura

<222> i374~..(598)

<223> Imunoglobulina

<220>

<221> misc feature

<222> Í9in . „ (1177)

<223 > Imunoglobulina

<220>

<221> misc^feaesire

<222 > (2S16) . . (3022)

<223 > Tiro sina, quinas e, catalítico, domínio

<400:. 84

gaagggcaga eagagtgfccc aaaagcgtga gagcacgaag tgaggagaag g-tggagaaga €0gagaagaçga agaggaagag gaagagagga agcggaggga aetgeggeea ggctaaaagg 120ggaagaagag gatcagccca aggaggagga agaggaaaac aagacaaaca gccagtgcag ieoaggagaggaa cgtgtgtcca gtgtcccgat ccctgcggag ctagtagccg agagctctgt 240gccctgggca eefcfcgeagce çtgçasçfcge cfcgeeaettc cccaccgagg cc a-tg -ggc Ket Gly 2 98

1

•cca gga gtt ctg ctg ctc ctg ctg gtg gcc aca gcc tgg ca-c ggt cag 346 .Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Tip His <5ly GlnS 10 15

gga ate eca gtg ata gag ccc agt gtc cct gag ctg gtc gtg aag ccaGly Ile Pro Val lie Glu Pro Ser vai Pro Glu Leu vai Val Lys Pro20 25 30

age ate ctc age acc ,aac aac gct acc ttc caa aac acg ggg acc tatser Xle Leu ser Thr Asa As» Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Tiur Tyr70 7S 80

100 IOS 110

gtg gtc gtg ttc gag gac cag gac gea cta ctg ccc tgt ctg Ctc acaVal Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Lcti Leu ThrIlS 120 12S 130

394

gga gea acg gtg áee ttg cga tgt gtg ggc aat ggc age gtg gaa tgg 442

Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp35 40 45 50

gat ggc ccc ccâ, tca cct cac tgg ace ctg tac fccfc gat ggc toe age 490

Aep Gly Pro Pro Ser Pro Hia Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser5S 60 65

538

cgc tge acfc gag cct gga gac ccc ctg gga ggc age gcc gee ate -cac 586

Arg Cys Thr Glti PxO Gly Asp Pro Leu <3ly Gly Ser Ala Ala lie His85 90 95

ete tat gtc aaa gac cct gcc cgg ccc tgg aac gtg cta gea cag gag 634

Leu Tyr vai Lys ABp Pro Ala. Arg Pro Trp Asn vai Leu Ala .Gln -Glu

^ AA -I IIA

682

gac ccg gtg ctg gaa gea ggc gtc teg -ctg gtg cgt gtg cgt ggc «gg 730

ASp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg13 S 140 14S

ccc ctc atg cgc cac acc aac tac tece ttc fceg -ccc tgg cat ggc ttc 778

Pro Leu Met Jirg His l&r Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp Hie -Gly Phe150 15S 160

acc ate cac agg gcc aag ttc ate cag age cag gac tat caa «tgc agt 826

Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr -Gln Cys -Ser165 170 XtS

gcc ctg atg ggt ggc agg aag gtg atg tcc ate age ate -cgg ctg aaa 874

Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val M®t Ser Xle Ser Ile Aarg Leu Lya190 185 190

gtg cag aaa gtc ate eca ggg ccc cca gcc ttg aca ctg gtg cct gea 922

Val Gla Lys Val lie Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala19S 200 205 210

gag ctg gtg cgg att cga ggg gag gct gcc cag ate gtg fcgc tca gcc 970

Glu Leu vai Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln lie Val Cya ser Ala215 220 22S

age age gtt gat gtfc aac ttt gat gtc ttc ctc caa cac aaç aac acc IOliSer Ser Val Asp Val Aan Phe Asp Val Phe Leu Gla His Asn Asn Thr230 235 240

aag ctc gea ate cct caa caa tet gac ttt cat aat aac -cgt tac -caa 106SLys Leu Ala Xle Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Aan Arg Tyr Gln245 250 255aaa gfcc ctg acc ctc aac ctc gat caa gta gat ttc caa cat gcc ggcLys vaX teu Thr Leu Asa Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln Hia Ala Gly260 265 27Ô

aac tac tcc tgc gtg gcc age aac gtg cag ggc aag cac tcc acc fcecAsn Tyr Ser Cys VaL Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser Thr Ser27S 280 38S 290

atg ttc ttc cgg gtg gta gag agt gcc tac ttg aac -ttg. age tet gagMet Phe Pbe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyx Leu Asn Leu Ser Ser-1Glu295 300' 305

" cag aac ctc ate cag gag gtg acc gtg ggg gag ggg ctc aac -ctc aaaGln Asn Leu Zle Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn Leu Lys310 ' 315 320

gtc atg gtg gag gcc tac cca ggc ctg caa ggt ttt saç tgg acc tacVal Met Val Glú Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp Thr Tyr325 330 335

ctg gga ecc ttt tet gac cac cag cct gag ccc aag ett gct aat gctLeu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala Asn Ala340 345 350

acc acc aag gac aca tac agg cac acc ttc acc ctc tet ctg ccc CgcThr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu Pro Arg355 • 360 365 370

ctg aag ccc tet gag gct ggc cgc tac tcc ttc ctg gcc aga aac ccaLeu Lys Pro ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg Asn Pro375 380 385

gga ggc tgg aga gct ctg acg ttt gag ctc acc ett cga tac cca ccaGly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Pha elu Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Pro390 395 400 '

gag gta age gtc ata tgg aca ttc ate aac ggc tet ggc acc ett ttgGlu Val Ser Val Xle Trp Thr Phe Xle Asn Gly Ser Gly Thr Leu Leu40S 410 . 415

tgt gct gcc tet ggg tac ccc çag ccc aac gtg aca 'tgg ctg -cag tgcCys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gla Pro Asa Val Thr Trp Leu Gln Cys420 - 425 430

agt ggc cac acfc gat agg tgt gat gag gcc caa gtg ctg -cag gtc tggSer Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gla Val Trp435 440 «45 4S0

gat gac cca tac cct gag gtc ctg age cag gag ccc ttc cac aag gtgAsp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe Kis Lys Val455 460 ««5

acg gtg cag age ctg ctg acfc gtt gag acc fcta gag cac aac caa accThr Val Gla Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn Gla Thr470 475 480

tac gag tgc agg gcç cac aac age gtg ggg agt ggc tcc tgg gcc ttcTyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Cly Ser Ttp Ala ,Phe485 490 495

ata ccc ate tet gea gga gcc cac acg cat ecc «cg gat gag ttc ctcXle Pro He Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu Phe Leu500 SOS 510aaa tat gtc cgc agg gac agt ggc ttc tcc age cmg ggt gtg gac accLys Tyr Val Arg Argr Aep Ser Gly Phe Ser Ser Qln Qly Val Asp Thr710 ?15 720

ctg ctt cac tte tcc age caa gta gcc cag ggc atg gcc ttc etc gctLeu Leu Hia Pixe Ser Ser Gln Val Ala Qln Gly Met Ala Phe Leu Ala? SS 7 SO 765 770

ttc aca cca gtg gtg gtc gcc tgc atg tcc ate a cg gcc tcg ctg ctg 1882Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cye Met ser Ile Met Ala Leu Lew LeUSlS 520 S25 530

ctg ctg ctc ctg ctg cta ttg tac aag tat aag cag aag ccc aag tac 1930Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro Lys Tyr535 540 545

cag gtc cgc tgg aag ate ate gag age tat -gag ggc aac age tat act 1978Gla Val Arg Trp Lys Ila Ile Glu ser Tyr Glu Gly Asn Ser Tyr ThrS50 555 560

ttc ate gac cec acg cag ctg cct tac aac gag aag tgg gag ttc ece 2026Phe Xle Asp Pro Thr Qlft Leu Pro Tyx Asn Glu Lys Trp Olu Phe ProSSS 570 575

cgg aac aac ctg cag ttt ggt aag.acc etc gga gct gga gcc ttt ggg 2074Arg Aen Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Oly Ala Phe QlyS80 S8S 590

aag gtg gtg gag gcc acg gcc ttt ggt ctg ggc aag gag gat gct gtc 2122Lys Val Val Qlu Ala Thr Ala Phe Gly Leu -Gly Lys Glu Aep Ala Vai595 600 605 610

ctg aag gtg gct gtg aag atg ctg aag tcc acg gcc cat gct gat gag 2170Leu Ly» Val Ala Val Lys Met Leu Lye Ser Thr Ala Hie Ala Asp Slu615 «20 625

aag gag gcc ctc atg tcc gag ctg aag ate atg age cac ctg ggc cag 2318

Lya Olu Ala Leu Met Ser Qlu Leu Lys Ile «et Ser His Leu Gly Gln630 635 640

cac gag aac ate gtc aac ctt ctg gga gcc tgt acc cat gga gge cct 2266His Glu Amt xle vai Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His -Gly Qly Pro€4S 6S0 655

gta ctg gtc ate acg gag tac tgt tgc tat. ggc gac ctg etc aac ttt 2314

vai Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Phe660 665 670

ctg cga agg aag gct gag gcc atg ctg gga ccc age ctg age ccc ggc .2362Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Qly Pro Ser Leu Ser Paro Gly675 680 68S 690

cag gac ccc gag gga ggc gtc gac tat aag aae ate -cac etc gag aag -243.0Gln Asp Pro Glu Gly Gly vai Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu Qlu Lys695 700 705

2458

tat gtg gag atg agg cct gtc tcc act tet tca aat gac tcc ttc -tet 2506Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser Phe Ser725 730 735

gag caa gac ctg gac aag gag gat gga cgg cee -ctg gag etc egg gae 2554Gltt Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu Arg Asp740 745 7S0

2602Ccc aag aat tgc ate cac Cgg gac gtg gea gcg cgt aac gtg ctg ttg - 2650Ser Lys Asn Cye Ile His Arg Aap Val Ala Ala Asrg Abii Val Leu Leu775 7BO 785

acc aat ggt eat gtg gcc aag att ggg gac ttc ggg ctg gct agg gac 269STtor Asn Gly His vai Ala Lye Ile Gly Aap Pbe Gly Iieu Ala Arg Asp790 795 800

ate atg aat gac tcc aac tac' att gtc aag ggc aat gcccgc ctg çct 2746He Met Asn Asp Ser Asn Tyr He Val bys -Gly Asn Ala Arg teu Pro805 810 815

gtg aag tgg atg gcc eca gág age ate ttt gac tgt gtc tac acg gtt 2754vai Lys Trp Met Ala Pro Olu Ser Ile Plie Asp Cys VaX Tyx Shr ValB20 82S 830

eag age gac gtc tgg tcc tat ggc ate etc etc tgg gag ate etc tca 3842Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Qly Ile JUeu Leu Trp Glu Ile' Phe ser835 840 845 850

ctt ggg ctg aat cec tac cct ggc ate ctg gtg aac age aag tcc tat „ 2890Leu Gly Leu Asii Pr® Tyr Pro Gly Ila Lew Val Asn Ser Lys Phe Tyr855 860 865

aaa ctg gtg aag gat gga tac caa atg gcc cag cct gea ttt gcc eca 2938

Lye Leu Val Lys Asp Gly Tyr Oln Met Ala Gln Pro Ala Phe Ala Pro870 875 880

aag aat ata tac age ate atg cag gcc tgc tgg gcc ttg gag ece acc 2986Lye Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu Pro Thr88S 890 895

cac aga ccc acc ttc cag cag ate tgc tee ttc ctt cag gag cag gcc 3034Hiô Arg Pxo Thr Phe Qln Gla Ile Cys «er Phe Leu Gln Glu Gln Ala .900 SOS 910

caa gag gac agg aga gag cgg gac tat acc aat ctg eçg age age age 3082Gln Glu Aap Arg Arg Glu Arg Ãsp Tyr Ttaf Asn Leu Pro Ser Ser ser915 930 925 930

aga age ggt ggc age ggc age age age agfc gag ctg gag gag gag age 3130

Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu Glu Ser935 940 S4S

tet agt gag cac ctg acc tgc tgc gag caa ggg gat ate gcc -cag -ccc 3178Ser Ser Glu His Leu Thr Cye Cys GluGln Gly Asp Ile Ala Gln Pro950 955 960

ttg ctg cag ece aac aac tat cag ttc tgc Cga ggagttgacg acagggagta 3231Lau Leu Qln Pro Asn Asri Tyr Gln Phe96S 970

ccactctccc ctcctccaaa cttcaacfcce tecatggatg gggcgacacg gggagaacat 3291

acaaactctg ccttcggtca tttcactcaa cagcteggcc cagccctgaa acttgggaag 33S1

gtgagggatt caggggaggt cagaggatcC cacttecfcga gcatgggcca tcactgccag 3411

tcaggggctg ggggctgagc ccfccaccccc ccctccecta ctgttctcat ggtgttggcc 3471

tcgtgtttgc tatgccaact agtagaacct tctttectaa toecettatc fafccatggaaa 3S31

tggactgact tfcatgcctat gaagtcccca ggagctacac tgatactgag aaaaccaggc 3591tcctcggggc cagaeagaec ggcagagagc gagatctcec cecccgagag gagcageaga 3651tgctcacaga ecaeactcag cecaggcccc ccggagcagg atggctcetc taagaatece 3711acaggacete tcagcctccg ecctacaegc cgcetteact ccacageete .acccccccea 3771cccccatact ggtaetgctg caatgageca agtggeaget aaaagttggg ggtgctetge 3631ceagtcccgt eattetggga tagaaggcag gggaccttgg eatgcgge-tg gccacaccaa 3691gcaggaagca caaacíceec Caagefcgact cateetãact aacagtcaeg cegtgggatg 3951tctetgtcca eattaaõcta acagcattaa fcgea 3965

<210> 65

<2ll> 9T2

<212> PRT

<213> Homo aapiena

<400> SS

Mec Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His1 5 10 15

Gly Gln Oly Ile Pro vai Ile Glu Pjro ser vai Pro Qlu -Leu Val Val20 25 3 0

Lys Pro Oiy Ala Thr Val Tfer Leu Arg Cys Val Gly Asn -Qly Ser Val35 40 45

Olu Trp Asp Gly Prô Pro Ser Pro His Trp Thr Lsu Tyr Ser Asp Gly50 55 60

Sar Ser Ser Ile Leu Ser Tiir Asn Asn Ala Thr She <31a Asn Thr Gly65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro GXy Aep Pro Leu Gly Gly 'Ser AXa Ala65 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Aaa Val Leu AlaIOO IOS 110

Glii Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Lea Leu Pro Cys Leu1X5 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leti Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp Hig145 ISO 155 260Gly Phe Thr He His Arg Ala Lye Phe Ile Gln Ser Qln Asp Tyr Gln155 170 IfS

Cys Ser Ala teu Met QIy Cly Arg Lya Val Met Ser Ile Ser Ile Arg180 ias 190

Leu Lys Val Gla Lys Val Ilfc Pro Qly Pro Pro Ala Leu-Thr Leu Val195 200 205

Fro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala <31» Ile Val Cys2X0 ZlS 2^10

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asa Phe Aep Val Phe Leu Gln His Asn225 230 235 240

Asn Thr Lya Leu Ala Ile Pro Gln Gla Ser Asp Phe Hl B Asn Asn Arg245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu TJir Leu Asu Leu Asp Gln Val Aap Phe Gln Mis260 265 270

Alm Gly Asa Tyr Ser Cys Val Ala Ser Aen Val Gln Gly Lys His ser275 O 2BS

Tlir Ser Met Phe Phe Arg Val Vai Glu ser Ala Tyr Leu Asn Leu ser290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu He Gln Glu Val Tlir Val Gly Glu Gly Leu asii305 310 3IS 320

i»eu Lys Val Met vai Glu Ala Tyr pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp325 330 335

Tfctr Tyr —<su Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pró Glu Pro Lya Leu Ala340 345 35 0

Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg Hia Thr Phe Thr Leu Ser Leu355 360 365

Pro Arg Leu Lye Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Argi370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr3SS 390 395 400

Pro Pro õlu Val ser Val Xle Trp Tfar Mie Ile Asn "Gly Ser Gly Thr405 410 4ISLeu Leu Cys Ala Ala Sec Gly Tyr Pro Glti -Pro Asn Val Thr Trp Leu'420 425 430

Gln Cys Ser Gly Kis Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln435 4 4 0 445

Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Olu Val Leu Ser CSln Glu Pro Phe His450 «55 450

Lys Val Thr Val Gln ser Leu Leti Thr Vai Glu Tfer Leu Glu His Asn465 470 475 480

Glii Thr Tyr Glu Cys Arg Ala Bis. Asn Ser Val Gly 'Ser Gly Ser Trp485 490 435

Ala Phe Xle Fro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp GluSOO SOS SIO

Phe Leu Phe Thr Pro Val vai vai Ala Cys Ket Ser Ile Het Ala LeaSlS £20 S2S

Leu LeiU Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gla Lya ProS30 535 540

Lys Tyr Gla Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asa ser545 SSO SSS S60

Tyr Thr Phe Ile Asp Pró Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp -GluS6S 570 575

Phe Pro Arg Abis Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu -Gly Ala Gly Ala580 S65 S90

Phe Gly Lys Val Val Glu Aia Thr AXa Phe Gly Leu 'Gly Lys Glu Asp5SS 600 605

Ala Val Le-u Lyo Va 1 Ala Val Lys Met Leu Lyg Ser Tllr Ala His Ala610 615 €20

Asp Glu Lys GIu Ala Leu IieC Ser GlU Leu Lye Xle Met Ser His Leu625 : 630 635 _ 640

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly64S 650 655

Gly Pro Val Leu Val Ile .Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Aep Leu Leu660 665 670Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Lea Gly Pro Ser Leu ser675 680 s SSS

Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His LsuSSO 695 703

Glu Lys Iiys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Cla Gly Val705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Olu Ket Arg'Pro Val Ser Xhr Ser, Sar Asn Asp Ser72S 730 735

Ph Ser Olu Gln Asp Leu Asp Lys Glxi Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu740 745 750

Arg Asp Leu Leu Kis Pbe Ser Ser Gln Val Ala GIb -Gly Ket Ala Phe755 760 76S

Leu Ala ser Lys Aen Gys Ile Mis Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val770 775 700

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp 'Fhe Gly Leu Ala7SS 790 79S èÔO

Arg Asp He Met Asn Asp ser Asti Tyr Xle Val Lys Gly Asn Alá Axg805 010 915

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pró Glu Ser Ile Phe Asp Cya Val Tyr820 825 630

Thr Val Gln ser Aep vai Trp ser fyx Gly He Leu Leu írp ><51« Ile83S 340 845

Phe Ser Leu Gly Leu Aan Pro Tyr Pro Gly Xle Leu Val Asn Ser Lya850 855 860

Phe Tyr Lys Leu Vsl Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala PheS65 870 875 860

Alá Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu665 890 69S

Pro Thr Hia Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cye Ser Phe Leu Gln -Glu900 tOS 910

Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thjr ASn Leu Pro Ser91S 920 925Ser Ser Arg Ser GXy Gly Ser Gly ser Ser Ser Ser Glu teu Glu Glu930 935 940

Glu Ser Ser ser Glu Hig Iieu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp He Ala .945 950 95 S 960

Qln Pro Leu teu Gln Pro Aen Aen Tyr Gln, Phe Cys

<210> 86

<211> 327

<2X2> DWA

<213» Horao sapiens

<400» 86

gaaatagtcc Ctacccaatc tcccggaaóc ctctcagtat cfceccggcga acgagtaacc 60

ttttcatgta gagcatccca atccafccgge acttcaattc actggtatca gcagaaaaca 120

ggtcaatece cacggcttct tataaaatat geatcagaat caatttctgg caccccagac 180

agattttcag gttcaggatc aggçaccgat ttcaçactta caatatecag agtcgaatca 240

gaagattttg cagattacta ttgtcaacaa ataaacagct ggcccaetae actcggacaa 300

ggcacaaaac tcgaaattaa acgtacg 327

<210> 87

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> B7

Gju Xle Val I>eu Thr Gln ser SPro Gly Thr Leu ser Val ser Pro GlyX S XO - 15

Gln Arg Vai. Thr Phe Ser Cys Arg Ala Sex Gln Ser Ile Gly Thar Ser20 25 30

lie His Tzp Tyr Gln Gln Lya Thr Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile35 - 40 - . 4S

Lys Tyr- Ala Ser Glu Ser He Ser Gly Ile Pro Abo Arg Phe Ser GlySO * SS 60 .

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Sar65 70 7S 80

Glu Asp PJie Ala Asp Tyr Tyr Cya Gln Gln Ile Asn Ser Trp Pro Thr6S 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Tlir Lys Leu Giu Ile Lya Arg Thr100 105<210 > 08

<211> 32?

<222» DNA

<2i3> He«no sapíens

<400? 63

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Claims (31)

1. Método de tratar um paciente que sofre de um distúrbioosteolítico, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas deadministrar ao dito paciente um anticorpo anti-M-CSF em uma dosemonoterapeuticamente eficaz e um inibidor de osteoclasto em uma dosemonoterapeuticamente eficaz.

2. Método de tratar um paciente que sofre de um distúrbioosteolítico, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas deadministrar ao dito paciente um anticorpo anti-M-CSF em uma dosemonoterapeuticamente eficaz e um bisfosfonato em uma dosemonoterapeuticamente eficaz.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o inibidor de osteoclasto é um inibidor de RANKL.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o anticorpo anti-M-CSF é anticorpo derivado de RX1, umanticorpo derivado de MCI, um anticorpo derivado de MC3, ou anticorpoderivado de 5H4.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o anticorpo anti-M-CSF é heRXl.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o distúrbio osteolítico éosteoporose, perda óssea associada com metástase do câncer, doença dePadget, ou perda óssea periprotética.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor de osteoclasto e oanticorpo de M-CSF são administrados simultaneamente.

8. Método de acordo com a reivindicação, caracterizado pelofato de que o inibidor de RANKL é selecionado do grupo que consiste de umanticorpo anti-RANKL, um receptor de RANKL solúvel, e uma vacina deRANKL.

9. Método de acordo com as reivindicações 3, 4, 6, e 7,caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-RANKL é AMG-162.

10. Método de acordo com as reivindicações 2, 4, 6 e 7,caracterizado pelo fato de que o bisfosfonato é selecionado do grupo queconsiste de zoledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tiludronato,alendronato, ibandronato, e risedronato.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o bisfosfonato é zoledronato.

12. Método de tratar um paciente que sofre de um distúrbioosteolítico, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas deadministrar ao dito paciente um anticorpo anti-M-CSF em uma dosemonoterapeuticamente eficaz e um bisfosfonato em uma dosemonoterapeuticamente eficaz por um período de transição.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o inibidor de osteoclasto é um bisfosfonato ou um inibidor deRA NKL.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o período de transição é de aproximadamente 1 a 7 dias.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o período de transição é de 1 semana a 1 mês.

16. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o período de transição é de 1 mês a 3 meses.

17. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o período de transição é de 3 a 6 meses.

18. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o período de transição é de 6 a 12 meses.

19. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que compreende ainda a etapa de descontinuar a terapia combisfosfonato depois do período de transição.

20. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que compreende ainda a etapa de reduzir a dose de bisfosfonatodepois do período de transição.

21. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a dose de bisfosfonato é reduzida imediatamente depois doperíodo de transição.

22. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que compreende ainda a etapa de reduzir a dose de anticorpo anti-M-CSF depois do período de transição.

23. [Claim missing on original document]

24. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a dose de anticorpo anti-M-CSF é reduzida imediatamentedepois do período de transição.

25. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o bisfosfonato é administrado pelo menos uma vez depois doperíodo de transição.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-M-CSFcompreende pelo menos duas das CDRs de anticorpo RXl de murino da SEQID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-M-CSFcompreende pelo menos três das CDRs de anticorpo RXl de murino da SEQID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-M-CSF competecom anticorpo RXl de murino pela ligação a M-CSF da SEQ ID NO: 5 eSEQ ID NO: 6 em pelo menos 75 %.

29. Método de acordo com as reivindicações 6, 13, e 20,caracterizado pelo fato de que o inibidor de osteoclasto é zoledronato e oanticorpo de M-CSF é um anticorpo derivado de RXl.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o zoledronato é administrado em uma dose entre 0,5 mg e 4 mg.

31. Método de acordo com as reivindicações 4, 6, 8, 10, 11, ou-12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-M-CSF liga-se ao mesmoepítopo como os anticorpos RX1, MCI, MC3, ou 5H4.