KR20080083187A - 암 전이 및 암 전이와 관련된 골 소실의 예방 및 치료 방법 - Google Patents

암 전이 및 암 전이와 관련된 골 소실의 예방 및 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 M-CSF-길항제를 기타 치료제와 함께 개체에 투여함으로써, 골용해성 질환, 암 전이 및 암 전이와 관련된 골 소실을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

암 전이 및 암 전이와 관련된 골 소실의 예방 및 치료 방법{METHODS FOR PREVENTING AND TREATING CANCER METASTASIS AND BONE LOSS ASSOCIATED WITH CANCER METASTASIS}
본 발명은, M-CSF-길항제 및 기타 치료제를 개체에 투여함으로써, 골용해성 질환 예를 들어, 암 전이 및 암 전이와 관련된 골 소실을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.
뼈의 재흡수를 매개하는 파골 세포(osteoclast)는 정상적 및 비정상적인 뼈의 리모델링 과정 예를 들어, 골용해성 질환(osteolytic disease)에 관여한다. 파골 세포는 조혈 세포로부터 분화되는 다핵 세포이다. 일반적으로, 상기 파골 세포는 불완전 세포 분열에 의하기보다는 골수 내 조혈 줄기 세포로부터 유래하는 단핵 전구체의 융합에 의해서 형성되는 것으로 알려져 있다[Chambers, Bone and Mineral Research, 6: 1- 25, 1989; Gothling외 다수, Clin Orthop Relat R. 120: 201-228, 1976; Kahn외 다수, Nature 258: 325-327, 1975, Suda외 다수, Endocr Rev 13: 66-80, 1-992; Walker, Science 180: 875, 1973; Walker, Science 190: 785-787, 1975; Walker, Science 190: 784-785, 1975]. 파골 세포는 단핵구-대식 세포 계열의 세포와 줄기 세포를 공유한다[Ash외 다수, Nature 283: 669-670, 1980, Kerby외 다수, J. Bone Miner Res 7: 353-62, 1992]. 파골 세포 전구체가 성숙한 다핵 파골 세포로 분화하는데에는 상이한 인자들 예를 들어, 호르몬 자극 및 국소 자극을 필요로 하며[Athanasou외 다수,Bone Miner 3: 317-333, 1988; Feldman외 다수, Endocrinology 107: 1137-1143, 1980; Walker, Science 190: 784-785, 1975; Zheng외 다수, Histochem J 23: 180-188, 1991], 살아있는 골과 골 세포는 파골 세포의 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 파악된다[Hagenaars외 다수, Bone Miner 6: 179-189, 1989]. 골모 세포 또는 골수 기질 세포는 또한 파골 세포의 분화에도 필요하다. 파골 세포 형성을 돕는, 이와 같은 세포에 의해 생성된 인자들 중 하나로서는 대식 세포-콜로니 자극 인자 즉, M-CSF가 있다[Wiktor-Jedrzejczak외 다수, Proc Natl Acad Sci USA 87: 4828-4832, 1990; Yoshida외 다수, Nature 345: 442-444, 1990]. NF-κ B 리간드(RANKL, TRANCE, ODF 및 OPGL이라고도 알려져 있음)에 대한 수용체 활성 인자는, 파골 세포 및 파골 세포 전구체에 위치하는 수용체인 RANK(TRANCER)를 통하여[Lacey외 다수, Cell 93: 165-176, 1998; Tsuda외 다수, Biochem Biophys Res Co 234: 137-142, 1997; Wong외 다수, J Exp Med 186: 2075-2080, 1997; Wong외 다수, J Biol. Chem 272: 25190-25194, 1997; Yasuda외 다수, Endocrinology 139: 1329-1337, 1998: Yasuda외 다수, Proc Natl Acad Sci US 95: 3597-3602, 1998] 파골 세포가 형성 및 재흡수되는 과정을 골모 세포/기질 세포가 자극함으로 인하여 나타나는 또 다른 신호이다[Suda외 다수, Endocr Rev 13: 66-80, 1992]. 골모 세포는 또한 파골 세포 형성 과정을 강력하게 억제하는 단백질 즉, RANKL에 대한 미끼 수용체로서의 역할을 하여, RANK 및 RANKL을 통해 파골 세 포와 골모 세포 간 포지티브 신호를 억제하는, 오스테오프로테그린(osteoprotegerin; OPG, OCIF라고도 부름)를 분비하기도 한다.
파골 세포는 무기 및 유기 골 기질 둘 다를 용해하는데 관여한다[Blair외 다수, J Cell Biol 102: 1164-1172, 1986]. 파골 세포는 그 말단부가, 특화된 막 영역과 소수의 막, 그리고 세포질 마커 예를 들어, 타르타르산염 내성 산 인산 효소(TRAP)(Anderson외 다수 1979), 탄산 탈수 효소 II(Vaananen외 다수, Histochemistry 78: 481-485, 1983), 칼시토닌 수용체(Warshafsky외 다수, Bone 6: 179-185, 1985) 및 비트로넥틴 수용체(Davies외 다수, J Cell Biol 109: 1817-1826, 1989)를 가지는, 독특한 분열된 형태를 취하고 있는 분화 세포로 이루어져 있다. 다핵 파골 세포는 일반적으로 10개 미만의 핵을 함유하지만, 이 파골 세포는 지름이 10∼100㎛인 100개 이하의 핵을 함유할 수도 있다[Gothling외 다수. Clin Orthop Relat R 120: 201-228, 1976]. 이러한 특징으로 말미암아, 상기 다핵 파골 세포는 광학 현미경에 의해 비교적 용이하게 관찰될 수 있다. 다핵 파골 세포는 활성 상태에 있을 때 공포성이 커질 뿐만 아니라, 다수의 미토콘드리아도 함유하는데, 이는 곧, 대사율이 높다는 의미이기도 하다[Mundy, Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism, pages 18-22, 1990]. 파골 세포는 골용해성 골 전이에 있어서 중요한 역할을 하므로, 당 업계에서는 파골 세포 자극 및 기능을 억제하는 방법과 이를 위한 신규 제제를 필요로 하고 있다.
암 전이는, 암 환자에 있어서 수술 후 또는 치료 후 암 재발의 주요 원인이다. 치료법을 개발하고자 많은 노력을 기울여왔음에도 불구하고, 암 전이는 이와 같은 치료법에 대해 여전히 실질적으로 난치성이다. 뼈는 다양한 종류의 인간 발병 암(예를 들어, 유방암, 폐암, 전립선암 및 갑상선 암)이 전이되는 위치 중 가장 일반적인 위치이다. 골용해성 골 전이가 일어나면 극심한 통증, 골절 위험성 증가, 신경 압박 그리고 고칼슘혈증으로 인해 심각한 상태에 이르게 되기도 한다. 이와 같이 심각한 임상학적 문제점에도 불구하고, 암 전이와 관련된 골 소실에 유효한 치료법은 극소수에 불과하다.
골용해성 질환을 표적으로 하는 몇몇 치료 기술이 현재 사용되고 있거나 또는 개발중에 있는데, 이와 같은 기술에서는 주로 파골 세포의 형성 또는 활성을 억제함으로써 골의 재흡수를 차단하는 약물을 개발하는데 주로 매진하고 있다. 뼈에 농축되어 존재하는 비스포스포네네이트(BP), 피로포스페이트 유사체는 현재 골의 재흡수에 대한 가장 유효한 억제제이다. BP는 파골 세포에 의해 흡수되어 이 파골 세포의 활동을 억제하며, 또한 이 세포가 세포 자살하는 것을 막아줌으로써, 골의 재흡수를 억제한다. 알렌드로네이트는 척추/골반 골절률을 대폭 낮춰주는, 골의 재흡수에 대한 첫 번째 BP 억제제로서, 골다공증 치료용으로서 승인되었다. 가장 마지막 세대 BP인 조메타(Zometa)는 고형 암 및 다발성 골수종에 있어서 고칼슘혈증 및 골 질환 치료용으로서 승인되었으며, 현재는 파젯병과, 고형 종양 및 다발성 골수종에 있어서의 골 전이 치료제로 사용될 수 있도록 개발중에 있다. 조메타는 매우 적은 투여량으로, 즉 한 달에 한번 15분 동안 정맥 내 주입하여 투여되지만, 이는 또한 모골 세포에도 영향을 미치며, 신장 독성 및 악골 괴사와 같은 부작용을 일으킬 수도 있다[Fromigue and Brody, J, Endocrinol. Invest. 25:39-46, 2002; Ibrahim, A.외 다수, Clin. Canc. Res. 9:2394-99, 2003; Body, J.J., The Breast. S2:S37-44, 2003; Yaccoby, S.외 다수, Brit. J. Hemat., 116:278-80, 2002; Corey, E.외 다수, Clin. Canc. Res. 9: 295-306, 2003; Coleman, R.E., Sem. Oncol., 29(6): 43-49, 2002; Coleman, R.E., Eur. Soc. Med. Oncol. 16:687-95, 2005; Bamias외 다수, J Clin Oncol 13: 8580-8587, 2005]. 그러므로, 당 업계에는 아직도 골용해성 질환 및/또는 암 전이 예를 들어, 융해성 골 전이를 예방 또는 치료하는 방법 및 이를 위한 신규 약물을 개발할 필요가 절실하다.
본 발명의 개요
본 발명의 조성물 및 방법은 전술한 목적들과 기타 당 업계에서 요구되는 사항들을 만족시키는 것이다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 골용해성 질환이 발병하였거나 또는 발병할 위험이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이행기(transition period) 약 1일∼1년 동안 즉, M-CSF 길항제가 활성 파골 세포의 수를 치료학적으로 바람직한 수준으로 줄이는 동안, 단일 요법상 유효량의 M-CSF 길항제 및 단일 요법상 유효량의 제2 항-파골 세포 제제를 개체에 투여하는 과정을 포함한다. 대표적인 M-CSF 길항제로서는 M-CSF 항체를 포함하고, 대표적인 제2의 항-파골 세포 제제로서는 비스포스포네이트 및 RANKL 억제제 예를 들어, 항-RANKL 항체를 포함한다. 본원의 항-M-CSF 항체 및 파골 세포 억제제가 관련된 방법 및/또는 이것들을 사용하는 방법에서는, 임의로 국제 특허 출원 공보 WO 2005/068503에 개시된 RX1, 5H4, MC1 및 MC3-유래 항체를 사용하지 않기도 하다. 상기 이행기의 지속 기간은 예를 들어, 1일 이상∼1년 이하일 수 있으며, 예 를 들어, 파골 세포 성장 또는 활성과 관련된 마커들을 통해 관찰될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체들은 동시에 투여될 수 있다.
예를 들어, 골 형성 마커로서는 칼슘 및 총 골-특이 알칼리성 인산 효소(BAP), 오스테오칼신(OC, 골-gla-단백질), 제I형 프로콜라겐 C 프로펩티드(PICP), 제I형 프로콜라겐 N 프로펩티드(PINP)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 골 흡수 마커로서는 NTX(골 콜라겐의 N-말단 가교 텔로펩티드) 및 CTX(골 콜라겐의 C-말단 가교 텔로펩티드), 피리디늄 가교체(피리디놀린 및 데옥시피리디놀린[DPD]) 및 관련 펩티드, 제I형 골 콜라겐 분해 산물 하이드록시프롤린 및 하이드록시리신 글리코시드, 타르타르산염-내성 산 인산 효소(TRACP) 및 골 시알로단백질(BSP)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 문헌[Fohr외 다수, J. Clin. Endocrinol. Metab., November 2003, 88(11):5059-5075]을 참조하시오.
관련 구체예에서, 제2의 항-파골 세포 제제의 투여를 이행기 이후에 중단하는, 전술한 방법이 제공된다. 관련 구체예에 있어서, 제2의 항-파골 세포 제제의 양을 이행기 이후에 줄이는, 전술한 방법이 제공된다. 추가의 관련 구체예에서, M-CSF 길항제의 양을 이행기 이후에 줄이는, 전술한 방법이 제공된다.
본 발명의 방법은 M-CSF와 이의 수용체(M-CSFR) 사이의 상호 작용을 억제함으로써 치료 효능을 얻는 것으로 생각된다. 또한, 상기 M-CSF/M-CSFR 사이의 상호 작용을 억제하면, 파골 세포 증식 및/또는 분화도 억제하는 것으로 생각된다. 본 발명의 방법 중 임의의 방법 또는 임의의 조성물에 있어서, 상기 M-CSF 길항제는 항-M-CSF 항체를 포함하는 폴리펩티드; 항-M-CSFR 항체를 포함하는 폴리펩티드; M- CSF 뮤테인(mutein) 또는 이의 유도체를 포함하는 가용성 폴리펩티드; 또는 M-CSFR 뮤테인 또는 이의 유도체를 포함하는 가용성 폴리펩티드; 또는 M-CSF 또는 M-CSFR의 발현을 억제하는 핵산 분자일 수 있다. 다양한 M-CSF 길항제의 동정, 생산 및 변형에 관하여는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 국제 특허 출원 공보 WO 2005/068503호에 개시되어 있다.
상기 M-CSF 항체는 폴리클로날 항체; 모노클로날 항체; 인간화된 항체; 인간 항체; 조작된 인간 항체; 키메라 항체; Fab, F(ab')2 또는 Fv 항체 단편; 또는 전술한 항체 중 임의의 것의 뮤테인일 수 있다.
골용해를 억제하는 본 발명의 M-CSF 항체에 관하여는, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 국제 특허 출원 공보 WO 2005/068503호(M-CSF 항체에 관해 교시하고 있음)에 개시되어 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 도 1, 도 3 및 도 4에 각각 도시된 아미노산 서열을 가지는 쥣과 동물 모노클로날 항체인 RX1, MC1 또는 MC3 중 임의의 하나에 대한 에피토프와 동일한 M-CSF 에피토프에 특이적으로 결합하는 비-쥣과 동물 모노클로날 항체(기능성 단편 포함)가 제공된다. 관련 구체예에서, 전술한 항체 즉, 폴리클로날 항체; 모노클로날 항체 예를 들어, 휴먼 엔지니어드(Human Engineered)™ 항체; 인간화된 항체; 인간 항체; 키메라 항체; Fab, F(ab')2; Fv; ScFv 또는 SCA 항체 단편; 다이아바디(diabody); 선형 항체; 또는 이와 같은 항체들(결합 친화도가 10-7, 10-8 또는 10-9 이상인 것이 바람직한 항체) 중 임의의 것의 뮤테인으로 이 루어진 군으로부터 선택되는 항체가 제공된다. 75% 이상으로 M-CSF에 대해 도 1에 도시된 아미노산 서열을 가지는 모노클로날 항체 RX1, MC1 및/또는 MC3와 경쟁하는 비-쥣과 동물 모노클로날 항체(기능성 단편 포함)도 고려된다.
다른 구체예에서, 비-쥣과 동물 모노클로날 항체(기능성 단편 포함)가 제공되는데, 여기서, 상기 비-쥣과 동물 모노클로날 항체 또는 이의 기능성 단편은 도 7에 제시된 98∼105번 아미노산의 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 이상의 연속 잔기를 포함하는 M-CSF 에피토프와 결합하는 항체이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 비-쥣과 동물 모노클로날 항체(기능성 단편 포함)를 제공하는데, 여기서, 상기 비-쥣과 동물 모노클로날 항체 또는 이의 기능상 단편은 도 7의 65∼73번 또는 138∼144번 아미노산의 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 이상의 연속 잔기를 포함하는 M-CSF 에피토프(5H4 또는 MC3에 의해 인지되는 M-CSF 에피토프와 상응함)와 결합한다.
또 다른 구체예에서, 도 7에 제시된 98∼105번 아미노산을 포함하는 M-CSF 에피토프와 결합하는 전술한 항체 또는 단편이 제공된다. 관련 구체예에서, 도 1a의 CDR3을 포함하는 전술한 항체가 제공된다. 다른 구체예에서, 도 1a에 제시된 쥣과 동물 항체 RX1의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 CDR을 포함하는 항체가 제공된다. 이와 같이 쥣과 동물 항체 RX1의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 CDR을 포함하는 항체는 또한 도 8a∼도 8b에 제시된 항체 5H4의 6개의 CDR 중 임의의 것을 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상 포함할 수도 있다. 대안적으로, 쥣과 동물 항체 RX1의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 CDR을 포함하는 항체도 도 8a∼도 8b에 제시된 항체 MC1의 6개의 CDR 중 임의의 것을 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상 포함할 수 있다. 또 다른 대안에서, 전술한 항체는 도 8a∼도 8b에 제시된 항체 MC3의 6개의 CDR 중 임의의 것을 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상 포함할 수도 있다. 관련 구체예에서, 쥣과 동물 항체 RX1의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 CDR을 포함하는 항체는 도 8a∼도 8b에 제시된 공통 CDR을 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상 포함할 수도 있다. 또 다른 관련 구체예에서, 전술한 항체 중 공통 CDR의 하나 이상의 잔기들은 쥣과 동물 항체 RX1, 5H4, MC1 또는 MC3의 CDR 중 임의의 것의 상응하는 잔기에 의해 치환된다. 원하는 결합 친화도는, 항체 내 아미노산 중 하나 이상이 예를 들어, CDR 내 보존적 치환 및/또는 저 위험도 및 중 위험도 잔기 내 보존적 또는 비 보존적 변이에 의해 돌연 변이되었더라도, 유지될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 도 1a, 도 2, 도 3 또는 도 4에 제시된 아미노산 서열과 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 상동성인 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 전술한 항체의 변이체가 제공된다. 관련 구체예에서, 항체는 도 1a, 도 2, 도 3 또는 도 4에 제시된 아미노산 서열과 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 상동성인 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 항체는 인간 항체 서열의 불변부 및 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변 틀 부위를 포함한다. 관련 구체예에서, 항체는 인간 IgG1, lgG2, IgG3 또는 IgG4의 변형 또는 비 변형 불변부를 포함하다. 바람직한 구체예에서, 불변부는 인간 IgG1 또는 IgG4인데, 이는 임의의 특성이 강화 또는 약화하도록 변형될 수도 있다. IgG1의 경우, 불변부, 특히, 힌지부 또는 CH2 부위에 변형을 가하면, 효과기 기능 예를 들어, ADCC 및/또는 CDC 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 다른 구체예에서, IgG2 불변부는 항체-항원 응집체 형성이 감소하도록 변형된다. IgG4의 경우, 불변부, 특히, 힌지부에 변형을 가하면, 절반 항체(half-antibody)의 형성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 국제 특허 출원 공보 WO 2005/068503호에 개시된 바와 같은 쥣과 동물 항체 RX1, 5H4, MC1 또는 MC3 중 임의의 하나와 동일한 M-CSF 에피토프에 특이적으로 결합하거나, 또는 전술한 쥣과 동물 항체 중 임의의 하나와 M-CSF 결합에 대해 10% 이상, 더욱 바람직하게는 25% 이상, 더더욱 바람직하게는 50% 이상, 더더욱 바람직하게는 75% 이상, 및 가장 바람직하게는 90% 이상 경쟁하는 비-쥣과 동물 모노클로날 항체가 제공된다. 이와 같은 쥣과 동물 항체 예를 들어, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 조작된 인간 항체 또는 이것들의 단편, 뮤테인 또는 화학적으로 유도된 것의 서열로부터 유래하는 항체에 관하여는 WO 2005/068503호에 개시되어 있다.
"RX1-유래 항체"란 용어로서는, 다음과 같은 것들 중 임의의 하나를 포함한다:
1) 도 1에 제시된 아미노산 서열을 가지는 쥣과 동물 항체 RX1의 아미노산 변이체 예를 들어, 도 1에 제시된 아미노산 서열에 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 상동성인 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함하며/포함하거나, 도 1에 제시된 아미노산 서열에 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 상동성인 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 변이체(상동성 측정시 유사 아미노산도 고려함);
2) 도 1에 제시된 아미노산 서열을 가지는 쥣과 동물 항체 RX1의 하나 이상의 상보성 결정 부위(CDR), 바람직하게는 RX1 중쇄의 최소한의 CDR3을 포함하며, 바람직하게는 CDR을 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 5개 이상, 또는 6개 전부 포함하는 M-CSF-결합 폴리펩티드(쥣과 동물 항체 RX1 제외);
3) 도 9b∼도 12b에 제시된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 가지는 휴먼 엔지니어드™ 항체 또는 이의 변이체로서, 도 9b∼도 12b의 원래의 휴먼 엔지니어드™ 중쇄 또는 경쇄와의 아미노산 서열 동일성이 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상, 예를 들어, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 동일한 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 변이체;
4) 도 9b∼도 12b의 휴먼 엔지니어드™ 항체의 하나 이상의 CDR의 고 위험도 잔기를 포함하는, 바람직하게는 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 5개 이상, 또는 6개 전부의 CDR의 고 위험도 잔기를 포함하는 M-CSF-결합 폴리펩티 드(쥣과 동물 항체 RX1 제외);
5) 도 1b에 제시된 고 위험도 아미노산 잔기를 보유하며, 도 1b에 제시된 저 위험도 또는 중 위험도 잔기에 하나 이상의 변이가 발생한 휴먼 엔지니어드™ 항체 또는 변이체로서, M-CSF와의 결합 능을 보유하는 것인 항체 또는 변이체;
예를 들어, 도 1b에 제시된 바와 같이, 저 위험도 잔기에 하나 이상의 변이가 발생하였고 중 위험도 잔기에 보존적 치환이 발생한 항체 또는 변이체, 또는
예를 들어, 도 1b에 제시된 바와 같이, 중 위험도 아미노산 잔기 및 고 위험도 아미노산 잔기를 보유하고, 저 위험도 잔기에 하나 이상의 변이가 발생한 항체 또는 변이체로서,
상기 변이는, 삽입, 결실 또는 치환을 포함하며, 보존적 치환일 수 있거나 또는 조작된 항체의 사슬이 인간의 경쇄 또는 중쇄 서열, 인간의 생식 계열 경쇄 또는 중쇄 서열, 공통 인간 경쇄 또는 중쇄 서열, 또는 공통 인간 생식 계열 경쇄 또는 중쇄 서열과 보다 유사하도록 만들 수 있는 것이다. 이와 같은 항체는 M-CSF와 친화도 10-7, 10-8 또는 10-9 이상으로 결합하는 것이 바람직하며, 또한 M-CSF의 파골 세포 발생 유도 활성을 중화시키는 것이 바람직하다.
이와 유사하게, "MC3-유래 항체"라는 용어로서는 다음과 같은 것 중 임의의 하나를 포함한다:
1) 도 4에 제시된 아미노산 서열을 가지는 쥣과 동물 항체 MC3의 아미노산 변이체 예를 들어, 도 4에 제시된 아미노산 서열과 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 상동성인 가변 중쇄 아미노산 서열, 및/또는 도 4에 제시된 아미노산 서열과 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 상동성인 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 변이체(상동성 측정시 유사한 아미노산도 고려함);
2) 도 4에 제시된 아미노산 서열을 가지는 쥣과 동물 항체 MC3의 하나 이상의 상보성 결정 부위(CDR), 바람직하게는 MC3 중쇄의 최소한의 CDR3을 포함하며, 바람직하게는 CDR을 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 5개 이상, 또는 6개 전부 포함하는 M-CSF-결합 폴리펩티드(쥣과 동물 항체 MC3을 포함하기도 하고 제외하기도 함);
3) 도 13c∼도 13e에 제시된 캐벗(Kabat) 번호 메김 방법을 이용하여 저 위험도, 중 위험도 및 고 위험도 잔기를 동정하여, 문헌[Studnicka외 다수, 미국 특허 제5,766,886호] 및 본원의 실시예 4A에 제시된 방법에 따라서 쥣과 동물 서열을 바꾸어줌으로써 생산된 휴먼 엔지니어드™ 항체로서, 다음과 같은 중쇄 중 하나 이상 및 다음과 같은 경쇄 중 하나 이상을 포함하는 항체: (a) 필요에 따라서, 저 위험도 잔기 전부가 인간 참고 면역 글로불린 서열의 잔기와 동일하게 되도록 변형된 중쇄, 또는 (b) 필요에 따라서, 저 위험도 잔기 및 중 위험도 잔기 전부가 인간 참고 면역 글로불린 서열의 잔기와 동일하게 되도록 변형된 중쇄, (c) 필요에 따라서, 저 위험도 잔기 전부가 인간 참고 면역 글로불린 서열의 잔기와 동일하게 되도록 변형된 경쇄, 또는 (d) 필요에 따라서, 저 위험도 잔기 및 중 위험도 잔기 전부가 인간 참고 면역 글로불린 서열의 잔기와 동일하게 되도록 변형된 경쇄;
4) 전술한 상기 3)번 항목에 따른 항체의 변이체로서, 원래의 휴먼 엔지니어드™ 항체의 중쇄 또는 경쇄와의 아미노산 서열 동일성이 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상, 예를 들어, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 동일한 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 항체의 변이체;
5) 도 4의 쥣과 동물 항체 MC3의 하나 이상 CDR의 고 위험도 잔기를 포함하고, 바람직하게는 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 5개 이상, 또는 6개 전부의 CDR의 고 위험도 잔기를 포함하는 M-CSF-결합 폴리펩티드(임의로, 쥣과 동물 항체 MC3를 포함하기도 하고 제외하기도 함);
6) 쥣과 동물 MC3 항체의 고 위험도 아미노산 잔기를 보유하며, 저 위험도 또는 중 위험도 잔기에서 하나 이상의 변이가 발생한 휴먼 엔지니어드™ 항체 또는 변이체로서, M-CSF와의 결합 능을 보유하는 것인 항체 또는 변이체;
예를 들어, 저 위험도 잔기에 하나 이상의 변이가 발생하였고 중 위험도 잔기에 보존적 치환이 발생한 항체 또는 변이체, 또는
예를 들어, 중 위험도 아미노산 잔기 및 고 위험도 아미노산 잔기를 보유하고, 저 위험도 잔기에 하나 이상의 변이가 발생한 항체 또는 변이체로서,
상기 변이는, 삽입, 결실 또는 치환을 포함하며, 보존적 치환일 수 있거나 또는 조작된 항체의 사슬이 인간의 경쇄 또는 중쇄 서열, 인간의 생식 계열 경쇄 또는 중쇄 서열, 공통 인간 경쇄 또는 중쇄 서열, 또는 공통 인간 생식 계열 경쇄 또는 중쇄 서열과 보다 유사하도록 만들 수 있는 것인 항체 또는 변이체. 이와 같은 항체는 M-CSF와 친화도 10-7, 10-8 또는 10-9 이상으로 결합하는 것이 바람직하며, 또한 M-CSF의 파골 세포 발생 유도 활성을 중화시키는 것이 바람직하다.
상기 "5H4-유래 항체" 또는 "MC1-유래 항체"라는 용어는 전술한 바에 따라서 유사하게 정의된다.
본원에 상세히 기술된 바와 같이, RX1, 5H4, MC1 또는 MC3-유래 항체 예를 들어, 휴먼 엔지니어드™ 항체 또는 변이체는 상이한 동 기준 표본형 예를 들어, IgG, IgA, IgM 또는 IgE의 것일 수 있다. IgG군 항체들은 상이한 불변부를 포함할 수 있는데, 예를 들어, IgG2 항체는 IgG1 또는 IgG4 불변부를 디스플레이하도록 변형될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 변형된 또는 변형되지 않은 IgG1 또는 IgG4 불변부를 포함하는 휴먼 엔지니어드™ 항체 또는 변이체를 제공한다. IgG1의 경우, 불변부, 특히 힌지부 또는 CH2 부위에 변형이 일어나면 효과기 기능 예를 들어, ADCC 및/또는 CDC 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 다른 구체예에서, IgG2 불변부는 항체-항원 응집체 형성이 감소하도록 변형된다. IgG4의 경우, 불변부 특히, 힌지부에 변형이 일어나면, 절반-항체가 형성되는 것을 줄일 수 있다. 특정의 대표적인 구체예에서는, IgG4 힌지 서열 Cys-Pro-Ser-Cys를 IgG1 힌지 서열 Cys-Pro-Pro-Cys로 돌연 변이시킨다.
전술한 M-CSF 길항제 또는 M-CSF 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 중 임의의 하나를 포함하는 약학 조성물이 본 발명에 따라서 투 여될 수 있다.
2개 이상의 M-CSF 길항제를 함께 혼합하거나 또는 M-CSF 길항제와 제2의 항-파골 세포 제제를 함께 투여하여 본 발명의 골용해성 질환 예를 들어, 암 전이 및/또는 암 전이와 관련된 골 소실에 대한 효능을 개선시키는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 대표적인 구체예에서, 제2의 항-파골 세포 제제가 비스포스포네이트인 전술한 방법이 제공된다. 추가의 구체예에서, 상기 비스포스포네이트로서는 졸레드로네이트, 파미드로네이트, 클로드로네이트, 에티드로네이트, 틸루드로네이트, 알렌드로네이트, 이반드로네이트 또는 라이즈드로네이트가 있다. 기타 대표적인 항-파골 세포 제제로서는 비스포스포네이트, PTHrP 중화 제제(예를 들어, 항체, 안티센스 siRNA), 카텝신 K 억제제, MIP-1-α 길항제, RANK/RANKL 중화 제제(예를 들어, 항-RANK 항체, 항-RANKL 항체 또는 안티센스 가용성 RANKL 수용체 또는 이의 뮤테인), RANKL 백신, 오스테오프로테그린(OPG), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), src 키나제 억제제, 갈륨 말톨레이트 및 매트릭스 메탈로프로티나제(MMP) 억제제를 포함한다.
본 발명의 치료 방법은 또 다른 제3의 치료제 예를 들어, 암 화학 요법 제제와 함께 사용될 수 있거나, 또는 방사선 치료법이나 수술과 병행될 수도 있다. 암 화학 요법 제제로서는 알킬화제 예를 들어, 카보플라틴 및 시스플라틴; 질소 머스타드 알킬화제; 니트로소우레아 알킬화제 예를 들어, 카머스틴(BCNU); 대사 길항 물질 예를 들어, 메토트렉세이트; 퓨린 유사체 대사 길항 물질, 머캡토퓨린; 피리미딘 유사체 대사 길항 물질 예를 들어, 플루오로우라실(5-FU) 및 젬시타빈; 호르 몬 항종양 물질 예를 들어, 고세렐린, 루프롤리드 및 타목시펜; 천연 항종양 물질 예를 들어, 알데스루킨, 인터루킨-2, 도세탁셀, 에토포시드(VP-16), 인터페론 알파, 파클리탁셀 및 트레티노인(ATRA); 천연 항생 항종양 물질 예를 들어, 블레오마이신, 닥티노마이신, 도노루비신, 독소루비신 및 미토마이신; 및 빈카 알칼로이드 천연 항종양 물질 예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신; 하이드록시우레아; 아세글라톤, 아드리아마이신, 이포스파미드, 에노시타빈, 에피티오스타놀, 아클라루비신, 안시타빈, 니머스틴, 프로카바진 하이드로클로라이드, 카보쿠온, 카보플라틴, 카모풀, 크로모마이신 A3, 항종양 다당, 항종양 혈소판 인자, 사이클로포스파미드, 쉬조필란, 시타라빈, 다카바진, 티오이노신, 티오테파, 테가풀, 네오카지노스타틴, OK-432, 블레오마이신, 푸툴론, 브록수리딘, 부설판, 혼반, 페플로마이신, 베스타틴(우베니멕스), 인터페론-β, 메피티오스탄, 미토브로니톨, 머팔란, 라미닌 펩티드, 렌티난, 코리올루스 베르시콜라(Coriolus versicolor) 추출물, 테가풀/우라실, 에스트라머스틴(에스트로겐/메클로레타민)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
뿐만 아니라, 암 환자에 대한 부속 요법 제제로서 사용되는 부가의 제제로서는, EPO, G-CSF, 갠시클로버; 항생제, 루프롤리드; 메페리딘; 지도부딘(AZT); 인터루킨 1∼인터루킨 18 예를 들어, 돌연 변이체 및 유사체; 인터페론 또는 시토킨 예를 들어, 인터페론 α, β 및 γ; 호르몬 예를 들어, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH) 및 유사체, 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH); 성장 인자 예를 들어, 변형성 성장 인자-β(TGF-β), 섬유 아세포 성장 인자(FGF), 신경 성장 인자(NGF), 성 장 호르몬 방출 인자(GHRF), 상피 성장 인자(EGF), 섬유 아세포 성장 인자 상동성 인자(FGFHF), 간 세포 성장 인자(HGF) 및 인슐린 성장 인자(IGF); 종양 괴사 인자-α 및 β(TNF-α 및 β); 침습 억제 인자(invasion inhibiting factor)-2(IIF-2); 골 형태 형성 단백질 1∼7(BMP1∼7); 소마토스타틴; 티모신-α-1; γ-글로불린; 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD); 보체 인자; 항-신생 혈관 형성 인자; 항원성 물질; 전구 약물; 성장 인자 수용체 키나제 억제제; 항-Her2 항체; 및 VEGF 중화 항체를 포함한다.
이행기 이후에, 치료 효과를 나타내는데 필요한 M-CSF 길항제 또는 제2의 항-파골 세포 제제의 양은 감소될 수 있다. 그러므로, 이와 같은 기간이 경과한 후, M-CSF 길항제는 제2의 항-파골 세포 제제의 효능을 개선하거나, 또는 제2의 항-파골 세포 제제의 투여와 관련된 부작용을 줄이거나, 또는 제2의 항-파골 세포 제제의 안전성을 개선할 수 있다. M-CSF 길항제는 또한 제3의 치료 방법 예를 들어, 암 화학 요법, 기타 부가 치료법, 수술 또는 방사선 요법의 효능을 개선할 수 있거나, 이의 부작용을 줄일 수 있거나 또는 이의 안전성을 개선할 수도 있다. 본 발명의 다른 구체예에서는, M-CSF 길항제를 포함하는 약물과, 이 약물이 제2 및/또는 제3의 치료제와 병용되어야 하며/하거나 수술이나 방사선 요법과 병행되어야 한다는 지시를 포함하는 팩키지, 바이알 또는 용기가 제공된다.
본 발명에 의한 치료법은 다수의 골용해성 질환에 효과가 있는 것으로 생각된다. 본원에 사용된 "골용해성 질환"이란, 파골 세포 활성이 증가함에 따라서 일어나는 임의의 병상을 의미한다. 골용해성 질환이 발병할 위험이 있는 개체는 골용 해성 질환으로 진행될 소인을 가지는 군에 속하는 개체일 수 있거나, 또는 파골 세포의 활성을 촉진하거나 증가시키는 질환을 앓고 있는 개체일 수 있다. 본 발명의 대표적인 구체예에서, 골용해성 질환은 파골 세포의 활성이 비교적 큰, 대사성 골 질환으로서, 예를 들어, 내분비계 질환(과 코티졸증, 성선 기능 저하증, 1차 또는 2차 부 갑상선 기능 항진증, 갑상선 기능 항진증), 고칼슘혈증, 결핍 상태(구루병/골연화증, 괴혈병, 영양 실조), 만성 질환(흡수 장애 증후군, 만성 신부전증(신성 골 이영양증), 만성 간 질환(간 골 이영양증)), 약물(글루코코르티코이드(글루코코르티코이드-유도성 골다공증), 헤파린, 알콜), 또는 유전 질환(골 형성 부전증, 호모시스틴뇨증), 암, 골다공증, 골화석증, 관절염 및 류머티즘성 관절염과 관련된 골 염증, 치주 질환, 섬유성 골 이형성증 및/또는 파젯병일 수 있다.
기타 대표적인 구체예에서, 골용해성 질환은 골에 대한 전이성 암일 수 있으며, 상기 전이성 암으로서는 유방암, 폐암, 신장암, 다발성 골수종, 갑상선 암, 전립선암, 선암종, 혈액 세포 악성 종양 예를 들어, 백혈병 및 림프종; 두부 및 경부 암; 위장관 암 예를 들어, 식도암, 위암, 결장암, 소장 암, 결장 직장암, 직장암, 췌장암, 간암, 담도 관 또는 담낭 암; 여성 생식기관의 악성 종양 예를 들어, 난소 암종, 자궁 내막 암, 질암 또는 자궁 경부암; 방광암; 뇌종양 예를 들어, 신경아세포종; 육종, 골육종; 또는 피부암 예를 들어, 악성 흑색종 또는 편평 세포 암이 있다.
본 발명의 대표적인 구체예에서, 전술한 방법 중 임의의 방법은 골 소실을 예방하거나 줄일 수 있으며, 또는 뼈로의 전이 또는 이 질병과 관련된 골 소실이 심각해지는 것을 예방하거나 줄일 수 있다.
본 발명에 의하여 투여될 M-CSF 항체는 체중 1㎏당 약 2㎍∼30㎎, 0.1∼30㎎, 또는 0.1∼10㎎의 투여량으로 투여될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1a는 M-CSF-특이 쥣과 동물 항체 RX1의 아미노산 서열(서열 번호 2 및 서열 번호 4)(미국 모식균 배양 수집소(Manassas, VA, USA)에 ATCC 기탁 번호 PTA-6113으로 기탁된 플라스미드의 cDNA 삽입체에 의해 암호화됨) 및 상응하는 핵산 서열(서열 번호 1 및 서열 번호 3)을 나타내는 것이다. CDR 부위에는 번호를 메겨 굵은 글씨로 표시하였다.
도 1b 및 도 1c는 각각 문헌[Studnicka외 다수, WO 93/11794]에 따라서 식별된 고 위험도(굵은 글씨), 중 위험도(밑줄) 및 저 위험도 잔기를 가지는 M-CSF-특이 쥣과 동물 항체 RX1 경쇄의 아미노산 서열(서열 번호 5) 및 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 6)을 나타내는 것이다.
도 2∼도 4는 MCSF-특이 쥣과 동물 항체인 5H4(서열 번호 10 및 서열 번호 11), MC1(서열 번호 12 및 서열 번호 13)(ATCC 기탁 번호 PTA-6263으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산됨) 및 MC3(서열 번호 14 및 서열 번호 15)(ATCC 기탁 번호 PTA-6264로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산됨)의 각 아미노산 서열을 나타내는 것이다.
도 5는 M-CSFα의 아미노산 서열(서열 번호 7)을 나타내는 것이다.
도 6은 M-CSFβ의 아미노산 서열(서열 번호 8)을 나타내는 것이다.
도 7은 M-CSFγ의 아미노산 서열(서열 번호 9)을 나타내는 것이다. DNA 서열에 있어서 다수의 다형성으로 인해 아미노산간에 차이가 생길 수 있다. 예를 들어, 일반적인 다형성으로 인해 104번 위치에는 Pro 보다는 Ala가 존재하게 되는 것이다.
도 8a 및 도 8b는 인간 M-CSF 특이 쥣과 동물 항체인 RX1; 5H4; MC1; 및 MC3의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열의 CDR 부위의 배열을 나타내는 것이다(서열 번호 16∼서열 번호 38).
도 9a는, (a) 쥣과 동물 RX1 중쇄에 대한 위험도 라인(H = 고 위험도, M = 중 위험도, L = 저 위험도), (b) RX1 중쇄 아미노산 서열(서열 번호 6), (c) RX1에 대해 정렬된, 가장 가까운 인간 공통 서열, 캐벗 Vh2 공통 서열의 아미노산 서열(서열 번호 39) 및 (d) 2개의 대표적인 휴먼 엔지니어드™ 서열(서열 번호 41 및 서열 번호 43)을 생성하는 변이를 나타내는 것이다. 도 9b는 2개의 대표적인 중쇄 휴먼 엔지니어드™ 서열의 아미노산 서열(서열 번호 41 및 서열 번호 43)("저 위험도(low risk)" 및 "저 위험도 + 중 위험도(low + moderate risk)"로 지정함), 그리고 상응하는 핵산 서열(서열 번호 40 및 서열 번호 42)을 나타내는 것이다.
도 10a는 (a) 쥣과 동물 RX1 경쇄에 대한 위험도 라인(H = 고 위험도, M = 중 위험도, L = 저 위험도), (b) RX1 경쇄 아미노산 서열(서열 번호 5), (c) RX1에 대해 정렬된, 가장 가까운 인간 공통 서열, 캐벗 Vk3 공통 서열의 아미노산 서열(서열 번호 49) 및 (d) 2개의 대표적인 휴먼 엔지니어드™ 서열(서열 번호 45 및 서열 번호 47)을 생성하는 변이를 나타내는 것이다. 도 10b는 2개의 대표적인 경쇄 휴먼 엔지니어드™ 서열의 아미노산 서열(서열 번호 45 및 서열 번호 47)("저 위험도" 및 "저 위험도 + 중 위험도"로 지정), 그리고 상응하는 핵산 서열(서열 번호 44 및 서열 번호 46)을 나타내는 것이다.
도 11a는 (a) 쥣과 동물 RX1 경쇄에 대한 위험도 라인(H = 고 위험도, M = 중 위험도, L = 저 위험도), (b) RX1 경쇄 아미노산 서열(서열 번호 5), (c) RX1에 대해 정렬된, 가장 가까운 인간 공통 서열, 캐벗 Vk3 공통 서열의 아미노산 서열(서열 번호 49) 및 (d) 54∼56번 위치가 변이되지 않은(즉, 쥣과 동물 서열로서 잔류하는) 대체적 아미노산 서열의 예(서열 번호 48)를 나타내는 것이다. 도 11b는 2개의 대표적인 대안 경쇄 휴먼 엔지니어드™ 서열의 아미노산 서열(서열 번호 48 및 서열 번호 87), 그리고 상응하는 핵산 서열(서열 번호 88 및 서열 번호 86)을 나타내는 것이다.
도 12a는 (a) 쥣과 동물 RX1 경쇄에 대한 위험도 라인(H = 고 위험도, M = 중 위험도, L = 저 위험도), (b) RX1 경쇄 아미노산 서열(서열 번호 5), (c) RX1에 대해 정렬된, 가장 가까운 인간 생식 계열 공통 서열, Vk6 하위 군 2-1-(1) A14의 아미노산 서열(서열 번호 50) 및 (d) 2개의 대표적인 휴먼 엔지니어드™ 서열(서열 번호 51 및 서열 번호 53)을 생성하는 변이를 나타내는 것이다. 도 12b는 2개의 대표적인 경쇄 휴먼 엔지니어드™ 서열의 아미노산 서열(서열 번호 51 및 서열 번호 53)("저 위험도" 및 "저 위험도 + 중 위험도"로 지정), 그리고 상응하는 핵산 서열(서열 번호 52)을 나타내는 것이다.
도 13a 및 도 13b는 캐벗 번호 메김 시스템("POS"라고 지정된 라인에 표시된 아미노산 번호)을 이용하는, 다양한 인간 공통 서열 및 인간 생식 계열 공통 서열을 포함하는 쥣과 동물 RX1 중쇄 아미노산 서열(서열 번호 54)의 배열을 나타내는 것이다(서열 번호 55∼서열 번호 83). 도 13c∼도 13e는 항체 5H4, MC1 및 MC3의 아미노산 잔기가 어떻게 캐벗 번호 메김 시스템에 대응되는지를 보여주는 것이다(각각 서열 번호 10 및 서열 번호 11; 서열 번호 12 및 서열 번호 13; 서열 번호 14 및 서열 번호 15).
도 14는 동물 모델에서 조메타의 항-재흡수 효과를 나타내는 것이다.
도 15는 골용해 현상을 확인할 수 있는 각각의 동물군의 %를 나타내는 것이다.
도 16은 연구의 마지막 날에 행하여진 X선 영상 분석 결과를 바탕으로 하는 평균 골용해 스코어를 나타내는 것이다.
도 17은 연구의 마지막 날에 행하여진 각각의 경골(종양 접종 위치)의 팩시트론(Faxitron) X선 영상 분석 결과를 나타내는 것이다. 화살표는 골용해가 일어난 위치를 가리키고 있다.
도 18은 파골 세포 활성에 미치는 RX1의 효과를 나타내는 것이다.
도 19는 조메타에 의해 파골 세포 활성이 억제됨을 보여주는 것이다.
도 20은 영장류에 있어서, RX1을 사용하여 행하여진 약물 동태학적 연구 결과를 나타내는 것이다.
도 21은 영장류에 있어서, RX1을 사용하여 행하여진 약물 동태학적 연구 결과를 나타내는 것이다.
대식 세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)라고도 알려져 있는 콜로니 자극 인자(CSF-1)는 파골 세포 형성에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 파악된다. 뿐만 아니라, M-CSF는 성숙한 파골 세포의 파골 작용과 이 파골 세포의 이동 그리고 기타 가용성 인자와 연합하여 생존하는 기간, 그리고 조골 세포 및 섬유 아세포에 의해 제공되는 세포 대 세포의 상호 작용을 조정하는 것으로 파악된다[Fixe and Praloran, Cytokine 10: 3-7, 1998; Martin외 다수, Critical Rev. in Eukaryotic Gene Expression 8: 107-23 (1998)].
전장 인간 M-CSF mRNA는 554개의 아미노산으로 이루어진 전구체 단백질을 암호화한다. 대안적 mRNA 스플라이싱(splicing)과 번역 후 차등적 단백 분해 과정을 통하여, M-CSF는 당 단백질 또는 황산 콘드로이친 함유 프로테오글리칸으로서 혈류 중에 분비되거나 또는 M-CSF 생산 세포의 표면상에 존재하는 막 확장성(membrane spanning) 당 단백질로서 발현될 수 있다. 박테리아에 의해 발현되는 인간 M-CSF의 아미노 말단부의 150개 아미노산 즉, 시험관 내 완전한 생물 활성에 필요한 최소한의 서열의 3차원 구조를 통하여, 상기 단백질은 4개의 알파 나선 묶음과 반대 방향으로 평행한 베타 시트 구조로 이루어진 각각의 단량체를 포함하는, 이황화 결합 이량체임을 알 수 있다[Pandit외 다수, Science 258: 1358-62 (1992)]. 3개의 분명한 M-CSF 종은 대안적 mRNA 스플라이싱을 통해 생산된다. 3개의 폴리펩티드 전구체로서는 M-CSFα(256개의 아미노산으로 이루어짐), M-CSFβ(554개의 아미노산으로 이루어짐) 및 M-CSFγ(438개의 아미노산으로 이루어짐)이 있다. M-CSFβ는 막 결합형으로는 존재하지 않는 분비형 단백질이다. M-CSFα는 단백 분해 절단에 의하여 서서히 방출되는 통합형 막 단백질로서 발현된다. M-CSFα는 도 5에 제시된 서열의 191∼197번 아미노산에서 절단된다. 상기 M-CSF의 막 결합형은 인접하고 있는 세포 상에 존재하는 수용체와 상호 작용을 할 수 있으므로, 특이적인 세포-대-세포의 접촉을 매개한다. "M-CSF"란 용어에는 또한 도 7의 36∼438번 아미노산이 포함될 수도 있다.
다양한 형태의 M-CSF는 표적 세포 상에 존재하는, M-CSF의 수용체인 M-CSFR과 이 M-CSF가 결합함으로 인하여 작용한다. 이 M-CSFR은 5개의 세포 외 면역 글로불린-유사 도메인, 경막 도메인 및 세포 내 단속적 Src 관련 티로신 키나제 도메인을 포함하는 막 확장성 분자이다. M-CSFR은 c-fms 원형-발암 유전자(proto-oncogene)에 의해 암호화된다. M-CSFR의 세포 외 도메인과 M-CSF의 결합을 통하여, 수용체의 이량체화가 유도되는데, 즉, 세포질 키나제 도메인을 활성화하여, 기타 세포성 단백질의 자가 인산화 과정 및 인산화 과정을 진행시킨다[Hamilton J. A., J Leukoc Biol. ,62(2):145-55, 1997; Hamilton J, A., Immuno Today., 18(7): 313-7, 1997].
인산화된 세포성 단백질은 생화학적 현상의 케스케이드를 진행시키게 되고, 이로 인하여, 세포 반응 즉, 유사 분열, 시토킨 분비, 막 파동 운동이 유도되며, 또한 이 단백질의 수용체의 전사가 조절된다[Fixe and Praloran, Cytokine 10: 32-37, 1998].
본원에 사용된 "종양"이란 용어는, 악성이거나 양성인, 모든 신생물 세포 성장 및 증식과, 전암성 세포 및 암성 세포, 그리고 조직을 의미한다.
"암" 및 "암성"이란 용어는, 통상적으로 세포 성장이 조절되지 않는 것을 특징으로 하는, 포유 동물 내 생리적 병상을 의미하거나 또는 이를 나타내는 것이다. 암의 예로서는 암종; 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 암에 관한 보다 구체적인 예로서는 유방암, 전립선암, 결장암, 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비 소세포 폐암, 위장관 암, 췌장암, 신경 교종, 자궁 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 결장 직장암, 자궁 내막 암종, 이하선 암종, 신장암, 간암, 외음부 암, 갑상선 암, 간 암종 및 다양한 유형의 두부 및 경부 암을 포함한다.
"치료법"은 질환의 진행을 막거나 병상을 변경시키고자 하는 의도로 행해지는 개입을 의미한다. 그러므로, "치료법"이란, 치료적 처치 및 예방 또는 보호 수단 둘 다를 의미하는 것이다. 치료가 필요한 개체는 어떤 질환이 이미 발생한 개체와, 어떤 질환이 예방될 개체를 포함한다. 종양(예를 들어, 암) 치료에 있어서, 치료제는 종양 세포의 병상을 직접적으로 감소시킬 수 있거나, 또는 이 종양 세포가 기타 치료제에 의한 치료법 예를 들어, 방사선 요법 및/또는 화학 요법에 보다 영향을 많이 받도록 만들 수 있다. 암의 "병상"으로서는, 환자의 행복을 방해하는 모든 현상을 포함한다. 그 예로서는 비 정상적 또는 조절 불가능한 세포 성장, 전이, 인접 세포의 정상적 기능 수행 방해, 시토킨 또는 기타 분비형 생성물의 비정상 수준으로의 분비, 염증 반응 또는 면역학적 반응의 억제 또는 악화 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
치료를 목적으로 하는 "포유동물"이란, 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 의미하는 것으로서, 인간, 집에서 키우는 동물 및 가축, 그리고 동물원에 있는 동물, 스포츠 동물 또는 애완 동물 예를 들어, 개, 말, 고양이 및 소 등을 포함한다. 바람직하게, 상기 포유동물은 인간이다.
본원에 사용된 "전이성 암(metastatic cancer)"이란 어구는, 신체의 다른 부위 구체적으로, 뼈로 퍼질 가능성을 가지는 암으로서 정의된다. 다양한 암이 뼈로 전이되지만, 가장 흔한 전이성 암으로서는 유방암, 폐암, 신장의 다발성 골수종, 갑상선 암 및 전립선 암이 있다. 예를 들어, 뼈로 전이될 가능성이 있는 기타 암으로서는 선암종, 혈액 세포 악성 종양, 예를 들어, 백혈병 및 림프종; 두부 및 경부 암; 위장관 암, 예를 들어, 식도암, 위암, 결장암, 소장 암, 결장 직장 암, 직장 암, 췌장암, 간암, 담도 관 암 또는 담낭암; 여성 생식 기관의 악성 종양 예를 들어, 난소 암종, 자궁 내막 암, 질암 또는 자궁 경부암; 방광암; 뇌종양 예를 들어, 신경아세포종; 육종, 골육종; 그리고 피부암 예를 들어, 악성 흑색종 및 편평 세포 암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 특히 골 내 종양-유도 골용해성 병변의 예방 및 치료에 관한 것이다.
본원에 사용된 "치료학적 유효량"이란 용어는, 치료용 또는 예방용 M-CSF 길항제 예를 들어, M-CSF 항체의 양 즉, 본 발명의 구체예에 적당한 양으로서, 원하는 치료 방식에 따라서 투여될 때 원하는 치료 또는 예방 효과 또는 반응을 나타낼 양을 의미하는 것이다.
본원에 사용된 인간 "M-CSF"란, 성숙한 인간 M-CSFα, M-CSFβ 또는 M-CSFγ 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 인간의 폴리펩티드를 의미하는 것이다[Kawasaki외 다수, Science 230:291 (1985), Cerretti외 다수, Molecular Immunology, 25:761 (1988), 또는 Ladner외 다수, EMBO Journal 6:2693 (1987); 각각 본원에 참고용으로 인용됨]. 이와 같은 용어는, 3개의 성숙한 M-CSF가 전술한 바와 같이 상이한 아미노산 서열을 가지며, M-CSF의 활성형은 이황화 결합 이량체로서, "M-CSF"라는 용어가 생물학적으로 활성인 형태를 의미할 때에는, 이 이량체 형태를 의미한다는 사실을 반영한다. "M-CSF 이량체"란, 이량체화되었으며, 또한 동종 이량체(동일한 종류의 M-CSF 단량체 2개로 이루어짐) 및 이종 이량체(2개의 상이한 단량체로 이루어짐)를 포함하는 2개의 M-CSF 폴리펩티드 단량체들을 의미하는 것이다. M-CSF 단량체는 본원에 참고용으로 인용된 미국 특허 제4,929,700호에 개시된 바와 같이, 시험관 내에서 M-CSF 이량체로 전환될 수 있다.
I. 길항제
본원에 사용된 "길항제"란 용어는, 일반적으로, 예를 들어, 하나의 분자가 다른 분자와 결합하는 것을 방해하거나, 또는 입체 장애, 형태상의 변화 또는 기타 생화학적 기작을 통하여, 다른 세포에 의해 하나의 세포가 자극되는 것을 방해하는 특성을 갖는 분자, 화합물 또는 기타 제제를 의미하는 것이다. 하나의 측면에서, 길항제란 용어는, 수용체와 이의 리간드 예를 들어, M-CSF와 M-CSFR가 결합하여, M-CSF에 의해 촉발되는 신호 전달 경로가 억제되는 것을 막아주는 특성을 갖는 제제를 의미하는 것이다. 길항제란 용어는 임의의 특정 작용 기작에 의해 제한되지는 않고, 오히려, 일반적으로 본 발명에서 정의된 기능상의 특성을 의미한다. 본 발명의 길항제로서는 M-CSF 항체 및 이의 단편 및 뮤테인 및 변형체, 가용성 M-CSF 및 이의 단편 및 뮤테인 및 변형체, M-CSFR 항체 및 이의 단편 및 뮤테인 및 변형체, 가용성 M-CSFR 및 이의 단편 및 뮤테인 및 변형체, 그리고 M-CSF 또는 M-CSFR에 결합하는 펩티드와 기타 화학적 화합물 및 분자, 그리고 M-CSF 및 M-CSFR의 발현을 억제하는 핵산 분자 예를 들어, 안티센스 또는 RNAi 화합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 길항제 중 임의의 것은 당 업계에 공지된 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, M-CSF 또는 M-CSFR에 결합하는 M-CSF 뮤테인, M-CSFR 뮤테인 또는 항체 단편은 유전자 요법을 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 M-CSF 길항제로서는 적당한 경우, 기능상 균등물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자는 길이, 구조, 성분 등이 상이할 수 있으나, 일정 기능 중 하나 이상을 여전히 보유할 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 펩티드의 기능상의 균등물로서는 모의체 화합물 즉, 항원 결합에 적당한 형태 및/또는 배향을 모의하도록 디자인된 구조물을 포함할 수 있다
바람직한 M-CSF 길항제는, 측기를 부가함으로써(예를 들어, 아미노 말단부 아실화, 카복시 말단부 아미드화 또는 아미노산 측쇄에 부가의 기를 커플링시킴으로써) 임의로 변형될 수도 있다. 길항제는 또한 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수도 있다. "보존적 아미노산 치환"이란, 치환된 아미노산의 전체 하전, 소수성/친수성 및/또는 입체 벌크(steric bulk)가 보존되는, 아미노산의 변이를 의미한다. 예를 들어, 다음과 같은 군 사이에서 일어나는 치환은 보존적이다: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asn/Gln, Ser/Cys/Thr, 및 Phe/Trp/Tyr. 이와 같은 변형은 M-CSF 길항제의 효능을 실질적으로 감소시키지는 않을 것이며, 예를 들어, 생체 내 반감기를 증가시키거나 독성을 감소시키는 것과 같이 바람직한 특성을 부여할 수 있다.
본 발명은 또한 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환 이외의 변형을 포함하는 폴리펩티드를 포함하기도 한다. 예를 들어, 이와 같은 변형은 원래 공유적인 것일 수 있는데, 예를 들어, 중합체, 지질, 기타 유기 부분 및 무기 부분과의 화학적 결합을 포함한다. 이와 같은 유도체는 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시키도록 제조될 수 있거나, 또는 폴리펩티드를 원하는 세포, 조직 또는 기관으로 표적화할 수 있는 능력이 개선되도록 디자인될 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명은 또한 하나 이상의 수용성 중합체 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜이 결합하도록 공유적으로 변형된 M-CSF 또는 M-CSFR 폴리펩티드를 포함하기도 한다.
A. M- CSF 항체
"항체"라는 용어는, 최 광의로 사용된 것으로서, 이로서는 완전히 조립된 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체), 항원과 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들어, Fab', F'(ab)2, Fv, 단일 사슬 항체 및 다이아바디), 그리고 항체가 원하는 생물 활성을 나타내는 한 전술한 것들을 포함하는 재조합 펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 "모노클로날 항체"란 용어는, 실질적으로 균질한 항체 군집으로부터 유래하는 항체로서, 가능성은 희박하지만 그래도 발생할 수는 있는 천연 발생 돌연 변이가 일어날 수 있다는 점을 제외하고는 동일한 군집에 포함되는 개별 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 위치에 대해 생성되는 항체이다. 또한, 통상적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 생성된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상에 존재하는 단일 결정기에 대해 생성된다. 이 항체의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는, 상이한 특이성과 특성을 갖는 다른 면역 글로불린에 의해 오염되지 않은 균질 배양액에서 합성된다는 점에서도 유리하다.
"모노클로날"이란 수식어는, 항체의 실질적으로 균질한 군집으로부터 유래하는 항체의 특성을 나타내는 것으로서, 특정 방법에 의해 항체를 생산하는데 있어서 필요한 특성으로 해석되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 의하여 사용될 모노클로날 항체는 콜러(Kohler) 외 다수에 의하여 처음 기술된[Nature, 256:495 (1975)] 하이브리도마 방법에 의해서 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해서 제조될 수 있다(미국 특허 제4,816,567호 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌[Clackson외 다수,Nature,352:624628[1991] end Marks외 다수, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 개시된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수도 있다.
항체 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 면역 글로불린은 상이한 군으로 분류될 수 있다. 면역 글로불린으로서는 5개의 주요 군이 있으며(IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM), 이 군 중 몇몇은 하위 군이나 동 기준 표본형으로 더욱 세분될 수 있다(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2). 면역 글로불린의 상이한 군에 해당하는 중쇄 불변 도메인을 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라고 부른다. 상기 면역 글로불린의 상이한 군의 서브유닛 구조와 3차원 형태에 관하여는 널리 공지되어 있다. 상이한 동 기준 표본형들은 상이한 효과기 기능을 가지는데; 예를 들어, IgG1과 IgG3 동 기준 표본형은 ADCC 활성을 갖는다.
"항체 단편"은 바람직하게는 원래 항체(intact antibody)의 항원 결합부 또는 가변부와 같이, 원래 전장 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예로서는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 다이아바디; 선형 항체(Zapata외 다수, Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995)); 단일 사슬 항체 분자; 그리고 항체 단편으로 이루어진 다중 특이적 항체를 포함한다. 항체를 파페인으로 분해하면, "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편(이들 단편은 각각 하나의 항원 결합 위치를 가짐)과, 나머지 "Fc" 단편(이 단편의 명칭은 이것이 35가지로 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것임)이 생성된다. 펩신으로 처리하면, 2개의 "단일-사슬 Fv" 즉, "sFv" 항체 단편을 가지는 F(ab')2 단편이 생성되고, 이들 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 여기서, 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로서 존재한다. 바람직하게, 상기 Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는데, 이 링커는 Fv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성하도록 만들어준다. sFv에 관한 사항에 관하여는 문헌[Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참고하시오.
"초가변" 부위라는 용어는, 항원 결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 의미하는 것이다. 상기 초가변부는 상보성 결정 부위 즉, CDR로부터 유래하는 아미노산 잔기들[즉, 24∼34번 잔기(L1), 50∼56번 잔기(L2) 및 89∼97번 잔기(L3)(경쇄 가변 도메인 내), 그리고 31∼35번 잔기(H1); 50∼65번 잔기(H2) 및 95∼102번 잔기(H3)(중쇄 가변 도메인 내)(Kabat외 다수, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 및/또는 초가변 루프로부터 유래하는 잔기들[즉, 26∼32번 잔기(L1), 50∼52번 잔기(L2) 및 91∼96번 잔기(L3)(경쇄 가변 도메인 내), 그리고 26∼32번 잔기(H1), 53∼55번 잔기(H2) 및 96∼101번 잔기(H3)(Chothia외 다수, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)]을 포함한다.
"틀" 또는 FR 잔기는 초가변부 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"다이아바디"란 용어는, 2개의 항원 결합 위치를 포함하는 소형 항체 단편을 의미하는 것으로서, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 내에서 경쇄 가변 도메인(VL)과 중쇄 가변 도메인(VH)이 서로 결합되어 있다. 동일한 사슬 상에 존재하는 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인들은 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루고, 또한 2개의 항원 결합 위치를 형성하게 된다. 다이아바디에 관하여는 예를 들어, 문헌[EP 404,097; WO 93/11161; 및 30 Hollinger외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세히 기술되어 있다.
몇몇 구체예에서, 다중 특이적(예를 들어, 이중 특이적) 모노클로날 항체 예를 들어, 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 휴먼 엔지니어드™ 항체 또는 변이체 항-M-CSF 항체(즉, 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 항체)를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 대표적인 이중 특이적 항체는 M-CSF의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 항-M-CSF 팔(arm)은 백혈구 상에 존재하는 촉발 분자(triggering molecule) 예를 들어, T-세포 수용체 분자(예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR) 예를 들어, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)와 결합하는 팔과 결합하여, M-CSF-발현 세포에 대한 세포 내 방어 기작을 증진시킬 수 있다. 이중 특이적 항체는 또한 M-CSF를 발현하는 세포에 세포 독성 제제를 국소화하는데 사용될 수도 있다. 이와 같은 항체는 M-CSF 결합 팔과, 세포 독성 제제(예를 들어, 사포린, 항-인터페론-60, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위 원소 햅텐)와 결합하는 팔을 갖는다. 이중 특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이중 특이적 항체)로서 제조될 수 있다.
이중 특이적 항체를 제조하는 또 다른 방법에 따르면, 재조합 세포 배양액으로부터 회수되는 이종 이량체의 비율을 최대로 만들도록 항체 분자 쌍 사이의 계면을 조작할 수 있다고 한다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 일부를 포함한다. 이 방법에 있어서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 유래하는 하나 이상의 소형 아미노산 측쇄는 보다 큰 측쇄를 가지는 것(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)으로 치환된다. 동일하거나 유사한 크기를 가지는, 대형 측쇄(들)에 대해 보상적인 "공동(cavity)"은, 대형 아미노산 측쇄와 소형 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌 측쇄)를 치환함으로써, 제2 항체 분자의 계면 상에 형성된다. 이로써, 기타 원치 않는 최종 산물 예를 들어, 동종 이량체의 수율에 비하여 이종 이량체의 수율을 증가시키는 기작을 제공한다. WO 96/27011(1996년 9월 6일 발행)을 참조하시오.
이중 특이적 항체는 가교 항체 또는 "이종 접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종 접합체 형태인 항체 중 어느 하나는 아비딘과 커플링될 수 있으며, 다른 하나는 바이오틴과 커플링될 수 있다. 이종 접합 항체는 통상의 가교법에 의해 제조될 수 있다. 적당한 가교제에 관하여는 다수의 가교 기술과 함께 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이에 관하여는 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중 특이적 항체를 생산하는 기술에 관하여도 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어, 이중 특이적 항체는 화학 결합법을 사용하여 제조될 수 있다. 문헌[Brennan외 다수, Science 229:81 (1985)]에는, 원래 항체를 단백 분해하여 F(ab')2 단편을 생성하는 방법에 관해 기술되어 있다. 이와 같은 단편들은 디티올 착물화제 소듐 아르세나이트의 존재하에 환원되어, 인접한 디티올을 안정화시키며, 또한 분자간 이황화 결합이 형성되는 것도 막아준다. 이후, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 이후, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캡토에틸아민을 사용하여 환원시켜 다시 Fab'-티올로 전환되고, 이것을 동량의 나머지 Fab'-TNB 유도체와 혼합하면, 이중 특이적 항체가 형성된다. 이와 같이 생성된 이중 특이적 항체는 효소의 선택적 고정화에 대한 제제로서 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이.콜라이(E.Coli)로부터 직접 회수된 Fab'-SH 단편은 시험관 내에서 화학적으로 커플링되어 이중 특이적 항체를 형성할 수 있다[Shalaby외 다수, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)].
문헌[Shalaby외 다수, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에는, 완전히 인간화된 이중 특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산 방법에 관하여 기술되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 이.콜라이로부터 개별적으로 분비되며, 이것들을 시험관 내에서 화학 커플링시키면 이중 특이적 항체가 생성된다. 그러므로, 생성된 이중 특이적 항체는 HER2 수용체를 과발현하는 세포와 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있으며, 또한 인간 유방 종양 표적에 대해 인간 세포 독성 림프구의 용해 활성을 촉발한다.
재조합 세포 배양액으로부터 직접 이중 특이적 항체 단편을 제조 및 분리하는 다양한 기술에 관하여도 기술된 바 있다. 예를 들어, 이중 특이적 항체를 루신 지퍼(leucine zipper)를 이용하여 생산하였다[Kostelny외 다수, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터 유래하는 루신 지퍼 펩티드를 유전자 융합법에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분과 결합시켰다. 항체의 동종 이량체를 힌지부에서 환원시켜 단량체로 만들고, 이후 이를 다시 산화시켜 항체의 이종 이량체로 만든다. 이 방법은 또한 항체의 동종 이량체를 만들 때에도 활용할 수 있다. 문헌[Hollinger외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 개시된 "다이아바디" 기술은 이중 특이적 항체 단편을 생산하는 대안적 기작을 제공한다.
단편은 동일한 사슬 상에서 2개의 도메인들 간 쌍을 형성시키기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변부(VL)에 결합된 중쇄 가변부(VH)를 포함한다. 그러므로, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루게 되며, 그 결과, 2개의 항원 결합 위치를 형성하는 것이다. 단일 사슬 Fv(sFv) 이량체를 사용함으로써 이중 특이적 항체 단편을 제조하는 또 다른 기법에 관하여도 보고된 바 있다. 문헌[Gruber외 다수, J. Immunol. 152: 5368 (1994)]을 참조하시오.
대안적으로, 이중 특이적 항체는 문헌[Zapata외 다수 Protein Eng. 8(10):1 057-1062 (1995)]에 개시된 바와 같이 생산된 "선형 항체"일 수 있다. 간단히 말해서, 이 항체는 항원 결합부 쌍을 형성하는 직렬 Fd 절편(VH-CH1-VH-CH1) 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이중 특이적이거나 단일 특이적일 수 있다.
2개 이상의 결합 가를 가지는 항체도 생각해 볼 수 있다. 예를 들어, 삼중 특이적 항체를 제조할 수 있다[Tutt외 다수, J. Immunol. 147:60 (1991)].
임의의 구체예에서, 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 휴먼 엔지니어드™ 항체 또는 변이체 항-M-CSF 항체로서는 항체 단편 예를 들어, RX1, 5H4, MC1, 또는 MC3 항체 단편이 있다. 항체 단편을 생산하는 다양한 기술이 개발되었다. 통상적으로, 이와 같은 단편들은 원형 항체의 단백 분해를 통하여 생성되었다[예를 들어, Morimoto외 다수, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan외 다수, Science 229:81 (1985)]. 그러나, 현재는 이 단편들을 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산할 수 있다. 문헌[Better외 다수, Science 240: 1041-1043 (1988)]에는 박테리아로부터 기능성 항체 단편을 분비시키는 방법에 관하여 개시되어 있다[예를 들어, Better외 다수, Skerra외 다수 Science 240: 1038-1O41 (1988)]. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 이.콜라이로부터 직접 회수될 수 있으며, 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성한다[Carter외 다수, Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 다른 구체예에서, 상기 F(ab')2은 이 F(ab')2 분자의 조립을 촉진하는 루신 지퍼 GCN4를 사용하여 형성된다. 다른 기술에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접 분리될 수 있다고 한다. 항체 단편을 생산하는 다른 기술은 당 업자에게 명백할 것이다.
"분리된" 항체란, 항체가 존재하던 천연의 환경을 이루는 성분으로부터 동정되어 분리 및 회수된 항체를 의미한다. 이 항체가 존재하던 환경에 있는 오염 성분은 항체가 진단용 또는 치료용으로 사용될 때, 항체의 효능을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비 단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 (1) 이 항체 중량의 95% 이상, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상으로 정제될 것이거나(로우리(Lowry)법에 의해 측정됨), (2) 급회전 컵 서열 분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열 중 15개 이상의 잔기를 얻는데 충분한 정도로 정제될 것이거나, 또는 (3) 환원 조건 또는 비 환원 조건 하에서 쿠마쉬 블루(Coomassie blue), 또는 바람직하게는, 은 염색을 이용하여 SDS-PAGE에 의해 균질한 정도로 정제될 것이다. 분리된 항체는 재조합 세포 내에 있는 항체를 포함하는데, 그 이유는 원래 항체가 있던 환경을 이루는 성분 중 하나 이상이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 일반적으로, 분리된 항체는 하나 이상의 분리 단계에 의해 제조될 것이다.
항체의 구조 및 생성에 대한 자세한 설명은, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Roth, D.B., and Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998), 및 미국 특허 제6,255,458호]에 개시되어 있다. 간단히 말하면, 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 유전자를 암호화하는 DNA를 생산하는 과정은 주로 발생중인 B-세포 내에서 진행된다. 다양한 면역 글로불린 유전자 분절을 재배열 및 결합시키기 이전에, V, D, J 및 불변(C) 유전자 분절은 일반적으로 단일 염색체 상 비교적 인접한 위치에서 발견된다. B-세포 분화시, V, D, J(또는 경쇄 유전자일 경우에는 V 및 J)의 적당한 군의 일원을 이루는 각각의 것들 중 하나인 유전자 분절은 재조합되어, 기능상 재배열된 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 유전자를 형성한다. 이와 같은 유전자 분절 재배열 과정은 연속적인 것으로 파악된다. 우선, 중쇄 D-대-J 연결부가 형성된 다음, 중쇄 V-대-DJ 연결부와 경쇄 V-대-J 연결부가 형성된다.
가변부 유전자 분절을 재조합하여 기능성 중쇄 및 경쇄 가변부를 형성하는 과정은, 재조합적으로 수용성인 V, D 및 J 분절에 측접하는 재조합 신호 서열(RSS)에 의해 매개된다. 재조합을 유도함에 있어서 필수적이고도 충분한 RSS는 한 쌍의 대칭 7량체, AT-풍부 9량체 및 (12개 또는 23개의 염기쌍 중 어느 하나로 이루어진) 개입 스페이서 부위를 포함한다. 이와 같은 신호들은 D-J(또는 V-J) 재조합을 수행하는 상이한 위치 및 화학 종들 간에 보존되며, 또한 기능상으로도 호환될 수 있다. 문헌[Oettinger,외 다수 (1990), Science, 248, 1517-1523 및 이에 인용된 참고 문헌들]을 참조하시오. 7량체는 서열 CACAGTG 또는 이의 유사체 → 비 보존 서열의 스페이서로 이루어져 있고, 9량체는 서열 ACAAAAACC 또는 이의 유사체를 갖는다. 이와 같은 서열은 J 분절과, V 및 D 유전자 분절 각각의 하류 쪽에서 발견된다. 생식 계열 D 및 J 분절 바로 앞에는 2개의 재조합 신호 서열이 존재하는데, 처음 것은 9량체이고, 그 다음 것은 7량체로서, 이는 다시 비 보존 서열에 의해 나누어져 있다. VL, VH 또는 D 분절 뒤에 존재하는 상기 7량체 및 9량체 서열은 이와 같은 JL, D 또는 JH 분절에 앞에 존재하는 서열(상기 분절들이 재조합될 서열)과 상보성이다. 7량체 및 9량체 서열 사이에 존재하는 스페이서는 그 길이가 12 염기쌍이거나 또는 22∼24 염기쌍이다.
V, D 및 J 분절의 재배열 이외에도, 경쇄 내 V 및 J 분절이 결합하는 위치와, 중쇄 내 D 및 J 분절이 결합하는 위치에서 일어나는 다양한 재조합에 의해, 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄의 주요 레퍼토리에도 다양성이 추가로 존재한다. 이와 같이 경쇄 내 변이는 통상적으로 V 유전자 분절의 마지막 코돈과, J 분절의 첫 번째 코돈 내에서 일어난다. 이와 유사하게, D 및 JH 분절 사이의 중쇄 염색체의 결합도 부정확하게 일어나며, 또한 10개 정도의 뉴클레오티드에서의 결합도 부정확하게 일어날 수 있다. 뿐만 아니라, 몇몇 뉴클레오티드는 게놈 DNA에 의해서 암호화되지 않는 D 및 JH 유전자 분절 사이 및 VH 및 D 유전자 분절 사이에 삽입될 수 있다. 이와 같은 뉴클레오티드의 부가 현상을 N-부위의 다양성(N-region diversity)이라 부른다.
이와 같은 결합 과정에서 일어날 수 있는 다양한 재조합 과정과 가변부 유전자 분절에서의 재배열이 일어나게 되면, 전체적으로 1차 항체 레퍼토리가 생성된다.
"Fv"는 완전 항원 인지 위치 및 결합 위치를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 부위는 단단한 비 공유 결합으로 결합되어 있는 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어져 있다. 이러한 형태로 인하여, 각각의 가변 도메인을 이루는 3개의 CDR이 상호 작용함으로써, VH V1 이량체의 표면에 존재하는 항원 결합 위치가 한정되는 것이다. 총괄적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 하나의 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 CDR을 3개만 포함하는 Fv의 절반부)은, 비록 전체적인 결합 위치보다 친화도가 낮지만, 항원을 인지하고 이와 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유하기도 한다. Fab 단편은, 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 소수의 잔기 예를 들어, 항체 힌지부로부터 유래하는 하나 이상의 시스테인이 부가되어 있으므로, Fab' 단편과 상이하다. 본원에 있어서 Fab'-SH란, 불변부 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 의미한다. 원래 F(ab')2 항체 단편은 이 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 단편 쌍으로서 생산되었다.
"중화 항체"란, 그것이 결합하는 표적 항원의 효과기 기능을 없애거나 상당 수준 감소시킬 수 있는 항체 분자를 의미한다. 그러므로, "중화" 항-표적 항체는 효과기 기능 예를 들어, 효소 활성, 리간드 결합, 또는 세포 내 신호 전달을 없애거나 상당 수준 감소시킬 수 있다.
본원에서 규명된 바와 같이, 암 전이 및/또는 암 전이와 관련된 골 소실을 치료하기 위한 조성물 및 방법은 원하는 효과를 얻기 위하여, 단독으로 사용되거나 또는 기타 치료제와 함께 사용되는 하나 이상의 항체를 이용할 수 있다. 본 발명에 의한 항체는 환경에 존재하는 항원과 직접 접촉하거나, 또는 항원으로 면역화됨으로써 항체를 생산하는 동물로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 항체는 당 업계에 널리 공지된 항체 발현 시스템 중 하나를 이용하는 재조합 DNA법에 의해 생산될 수 있다[예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. 이러한 항체는, 본 발명에 따라서 암 전이 및/또는 암 전이와 관련된 골 소실을 치료하는데 사용될 수 있는, 재조합 IgG, 면역 글로불린 유래 서열을 가지는 키메라 융합 단백질 또는 "휴먼 엔지니어드™" 항체를 포함할 수 있다. 원형의 전장 분자 이외에도, 상기 "항체"라는 용어는, 이의 단편(예를 들어, scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' 및 F(ab)'2 단편) 또는 M-CSF(또는 M-CSFR)에 결합하는 원형 분자 및/또는 단편의 다량체 또는 응집체를 의미하기도 한다. 이와 같은 항체 단편은 항원과 결합하고, 유도체화되는 결과, 예를 들어, 갈락토스 잔기가 통합됨에 따라서 소멸 및 흡수를 촉진하는 구조적인 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, M-CSF 모노클로날 항체는 본질적으로 본원에 참고용으로 인용된 문헌[Halenbeck외 다수 미국 특허 제5,491,065호(1997)]에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 대표적인 M-CSF 모노클로날 항체로서는, 생물 활성을 중화시키는 재조합 또는 천연 이량체 M-CSF와 결합된 항체로서, 명확한 형태를 가지는 에피토프와 결합하는 항체를 포함한다. 이와 같은 항체들은 M-CSF 예를 들어, 단량체 및 화학적으로 유도체화된 이량체 M-CSF의 생물학적 비활성 형태와는 실질적으로 반응하지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 휴먼 엔지니어드™ 항-M-CSF 모노클로날 항체가 제공된다. "휴먼 엔지니어드™ 항체"란 어구는, 비-인간 항체, 통상적으로 마우스 모노클로날 항체로부터 유래하는 항체를 의미하는 것이다. 대안적으로, 휴먼 엔지니어드™ 항체는 비-인간 모 항체의 항원 결합 특성을 보유하거나 또는 실질적으로 보유하되, 인간에 투여될 경우 모 항체에 비하여 면역원성이 감소되는 키메라 항체로부터 유래할 수 있다. 본원에 사용된 "키메라 항체"란 어구는, 통상적으로 상이한 종으로부터 기원하는 2개의 상이한 항체들(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호)로부터 유래되는 서열을 함유하는 항체를 의미한다. 가장 통상적으로, 키메라 항체는 인간 및 쥣과 동물의 항체 단편, 일반적으로 인간 불변부 및 마우스 가변부를 포함한다.
"상보성 결정 부위"라는 어구 또는 "CDR"이라는 용어는, 천연 면역 글로불린 결합 위치의 천연 Fv 부위의 결합 친화도 및 특이성을 함께 한정하는 아미노산 서열을 의미하는 것이다[예를 들어, Chothia외 다수, J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987); Kabat외 다수, U.S. Dept. of Health and Human Services NIH Publication No. 91 3242 (1991)]. "불변부"라는 어구는, 효과기 기능을 부여하는 항체 분자의 일부를 의미하는 것이다. 본 발명에 있어서, 마우스의 불변부는 인간 불변부와 치환되는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체의 불변부는 인간 면역 글로불린으로부터 유래한다. 중쇄 불변부는 다음과 같은 5개의 동 기준 표본형 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다: 알파, 델타, 엡실론, 감마 또는 뮤.
본 발명의 항체는, 항원과 Ka 약 106M-1 이상, 바람직하게는 약 107M-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 108M-1 이상, 및 가장 바람직하게는 약 109M-1, 1010M-1, 1011M-1 또는 1012M-1로 결합하면, 면역 특이적이거나 특이적으로 결합하는 것으로 간주한다. 이러한 항-M-CSF 항체는 M-CSF의 상이한 천연 생성 형태의 것 예를 들어, 숙주 조직/개체 조직에 의해 발현되는 것과, 종양에 의해 발현되는 것과 결합할 수 있다. 본원에 개시된 모노클로날 항체 예를 들어, RX1, 5H4, MC1, 또는 MC3 항체는 M-CSF에 대해 친화성을 가지며, 또한 해리 상수(Kd)가 10-4M 이상, 바람직하게는 약 10-7∼약 10-8M 이상, 더욱 바람직하게는 약 10-8M, 10-10M, 10-11M 또는 10-12M 이상인 것을 특징으로 한다. 이와 같은 친화도는 통상의 기술 예를 들어, 평형 투석법(equilibrium dialysis); 바이어코어(BIAcore) 2000 장치를 사용하는 방법, 제조자에 의해 개략적으로 설명되는 일반적인 방법; 방사능 면역 검정법(125I 표지화된 M-CSF 사용); 또는 당 업자에게 공지된 다른 방법에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 친화도 데이터는 예를 들어, 문헌[Scatchard외 다수, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51 :660 (1949)]에 개시된 방법에 의해 분석될 수 있다. 그러므로, 바람직한 M-CSF 항체는 M-CSF에 대하여 고도의 특이성을 나타낼 것이며, 또한 다른 분자에 대해서는 실질적으로 낮은 친화도로 결합할 것이다. 바람직한 항체는, 도 4의 쥣과 동물 RX1과 M-CSF가 결합할 때의 친화도와 유사한 친화도로 M-CSF와 결합하고, 면역원성도 낮으며, 또한 전이성 질병이 발병된 동물 모델에서 테스트될 때 암 세포의 전이를 막아준다. 기타 대표적인 항체는 각각, 도 2, 도 3 또는 도 4의 쥣과 동물 5H4, MC1 또는 MC3와 M-CSF가 결합할 때와 유사한 친화도로, M-CSF와 결합한다.
항체 생산에 사용될 항원은 예를 들어, 원형 M-CSF, 또는 원하는 에피토프를 보유하고, 임의로는 에피토프가 천연의 형태로 디스플레이될 수 있도록 만들어주는, 다른 폴리펩티드에 융합된 M-CSF의 단편일 수 있다. 대안적으로, 세포 표면에 M-CSF를 발현하는 세포는 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 세포는 M-CSF를 발현하도록 형질 전환될 수 있거나, 또는 M-CSF를 발현하는 기타 천연 생성 세포일 수 있다. 항체 생성에 유용한 M-CSF의 기타 형태에 관하여는 당 업자에게 잘 알려져 있다.
i. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는, 관련 항원 및 애쥬반트를 피하(sc) 또는 복막 내(ip) 다수 회 주사함으로써 동물에서 생산되는 것이 바람직하다. 이 작용성 또는 유도체화 제제 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 접합체), N-하이드록시숙신이미드(리신 잔기를 통한 접합체), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물 또는 기타 당 업계에 공지된 제제를 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합하면 항체 반응이 개선될 수 있다.
예를 들어, 100㎍ 또는 5㎍의 단백질 또는 접합체(각각 토끼나 마우스에 대한 것임)와 3부피의 프룬트 완전 애쥬반트를 합하여, 이 용액을 다수의 위치에 진피 내 주입함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후, 프룬트 완전 애쥬반트 중 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5∼1/10만큼 동물의 다수 위치에 피하 주사하여 동물의 면역 반응을 증강한다. 증강 주사 후 7∼14일 경과시, 동물로부터 채혈하여, 그 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 역가가 일정해질 때까지 동물에서 면역 반응을 증강한다. 바람직하게, 상기 동물의 면역 반응은, 상이한 단백질에 접합되었고/되었거나 상이한 가교제를 통해 접합된 동일 항원의 접합체를 사용함으로써 증강된다. 접합체는 또한 단백질 융합체와 같은 재조합 세포 배양액 중에서도 생산될 수 있다. 뿐만 아니라, 응집제 예를 들어, 명반은 이와 같이 면역 반응을 증진시키는데 적당히 사용된다.
ii . 모노클로날 항체
콜러외 다수에 의해 처음 제안된 하이브리도마 방법을 이용하여 모노클로날 항체를 제조할 수 있거나[Nature, 256:495 (1975)], 재조합 DNA법에 의해 모노클로날 항체를 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에 있어서, 마우스 또는 기타 적당한 숙주 동물 예를 들어, 햄스터 또는 짧은 꼬리 원숭이는 본원에 기술된 바와 같이 면역화되며, 그 결과, 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구가 생성된다. 대안적으로, 림프구는 시험관 내 면역화될 수 있다. 이후, 림프구는 적당한 융합 제제 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포에 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)].
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포는 적당한 배양 배지에 접종되어 생장하게 되며, 이때 사용되는 배지는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 생장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 만일 모 골수종 세포에 효소인 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 전이 효소(HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있다면, 상기 하이브리도마 배양용 배지는 통상적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것인데(HAT 배지), 이 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의해 항체를 일정하게 높은 수준으로 생산하며, 배지에 감수성인 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종 골수종(heteromyeloma) 세포주는 또한 인간의 모노클로날 항체를 생산하는 것으로 개시되어 있다[Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984);Brodeur외 다수, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]. 대표적인 쥣과 동물 골수종 세포주로서는, MOP-21 및 M.C.-11 마우스 종양(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA), 그리고 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포(미국 모식균 배양 수집소로부터 입수 가능; Rockville, Md. USA)로부터 유래하는 세포주를 포함한다.
하이브리도마 세포가 생장하고 있는 배양 배지를, 이 배지가 항원에 대해 생성되는 모노클로날 항체를 생산하는지 여부에 대해 분석한다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역 침전법 또는 시험관 내 결합 분석법 예를 들어, 방사성 면역 검정법(RIA) 또는 효소-결합 면역 흡착체 분석법(ELISA)에 의해 측정된다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 스케처드 분석법(Scatchard analysis; Munson외 다수, Anal. Biochem., 107:220 (1980))에 의해 측정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 가지는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 희석 과정을 제한하면서 클론을 서브클로닝하여, 표준적인 방법에 따라서 생육할 수 있다[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]. 이러한 목적으로 사용하기 적당한 배양 배지로서는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 뿐만 아니라, 하이브리도마 세포는 동물 내에서 복수형 종양(ascites tumor)으로서 생체 내 생육할 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는, 통상적인 면역 글로불린 정제 방법 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기 영동법, 투석법 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 적당히 분리된다.
본 발명의 항체가 항원과 Ka 약 106M-1 이상, 바람직하게는 약 107M-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 108M-1 이상, 및 가장 바람직하게는 약 109M-1, 1010M-1, 1011M-1 또는 1012M-1 이상으로 결합하면, 이 항체는 면역 특이적이거나 특이적으로 결합하는 것으로 간주한다. 이러한 항-M-CSF 항체는 M-CSF의 상이한 천연 생성 형태의 것 예를 들어, 숙주 조직/개체 조직에 의해 발현되는 것, 그리고 종양에 의해 발현되는 것과 결합할 수 있다. 본원에 개시된 모노클로날 항체 예를 들어, RX1, 5H4, MC1, 또는 MC3 항체는 M-CSF에 대해 친화성을 가지며, 또한 해리 상수(Kd)가 10-4M 이상, 바람직하게는 약 10-7∼약 10-8M 이상, 더욱 바람직하게는 약 10-8M, 10-10M, 10-11M 또는 10-12M 이상인 것을 특징으로 한다. 이와 같은 친화도는 통상의 기술 예를 들어, 평형 투석법; 바이어코어 2000 장치를 사용하는 방법, 제조자에 의해 개략적으로 설명되는 일반적인 방법; 방사능 면역 검정법(125I 표지화된 M-CSF 사용); 또는 당 업자에게 공지된 다른 방법에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 친화도 데이터는 예를 들어, 문헌[Scatchard외 다수, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51 :660 (1949)]에 개시된 방법에 의해 분석될 수 있다. 그러므로, 바람직한 M-CSF 항체는 M-CSF에 대하여 고도의 특이성을 나타낼 것이며, 또한 다른 분자에 대해서는 실질적으로 낮은 친화도로 결합할 것이다. 바람직한 항체는, 도 1의 쥣과 동물 RX1과 M-CSF가 결합할 때의 친화도와 유사한 친화도로 M-CSF와 결합하고, 면역원성도 낮으며, 또한 전이성 질병이 발병된 동물 모델에서 테스트될 때 암 세포의 전이를 막는다. 기타 대표적인 항체는, 각각 도 2, 도 3 또는 도 4의 쥣과 동물 5H4, MC1 또는 MC3와 M-CSF가 결합할 때와 유사한 친화도로, M-CSF와 결합한다.
보존적 치환을 표 1에 "바람직한 치환"이라는 표제하에 나열하였다. 만일 이와 같은 치환이 생물 활성을 바꾼다면, 보다 실질적인 변이(표 1의 "대표적 치환") 또는 이하에 아미노산 군에 관하여 추가로 기술된 변이가 도입될 수 있으며, 이에 따라서 그 생성물이 스크리닝될 수 있다.
본래의 바람직한 잔기 치환의 예
Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; asp, lys; gln arg Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gln (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gln asp Gly(G) ala His (H) asn; gln; lys; arg Ile(1) leu; val; met; ala; leu phe; 노르루신 Leu(L) 노르루신; ile; val; ile met; ala; phe Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr Pro (P) ala Ser (S) thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; leu ala; 노르루신
(a) 치환 부위의 폴리펩티드 주쇄의 구조 예를 들어, 시트형 또는 나선형, (b) 표적 위치에 존재하는 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크한 정도를 유지시키는 효과가 아주 상이한 치환을 선택함으로써, 항체의 생물학적 특성을 실질적으로 변성시킬 수 있다. 천연 생성 잔기들은 공통된 측쇄의 특성을 바탕으로 하여 여러 개의 군으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 및 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비 보존적 치환은 어느 군에 속하는 일원을 다른 군에 속하는 일원과 치환함으로써 이루어질 수 있다.
인간화된 항체 또는 변이 항체의 형태를 적당히 유지시키는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 일반적으로 세린으로 치환될 수 있으며, 그 결과, 분자의 산화 안정성을 개선하고, 또한 비정상적인 가교가 진행되는 것을 방지할 수 있다. 반대로 말하면, (구체적으로, 항체가 항체 단편 예를 들어, Fv 단편인 경우)시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어, 그 항체의 안정성을 개선할 수 있다.
B. M- CSF 뮤테인
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라서 M-CSF 길항제로서 사용될 수 있는 M-CSF 뮤테인을 제공하기도 한다.
본원에 사용된 "단편"이란, 원래의 천연 분자의 일부를 의미하는 것으로서, 예를 들어, 단편 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단으로부터 유래하는 하나 이상의 아미노산이 결실된 천연의 폴리펩티드의 단편을 말한다.
본원에 있어서, 폴리펩티드와 관련하여 사용된 "뮤테인"이란, 원래의 천연 분자 변이체 또는 천연 분자 단편의 변이체를 의미하는 것으로서, 하나 이상의 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실된 변이체를 의미하는 것이다. 이와 같은 치환, 삽입 또는 결실은 분자의 N-말단, C-말단 또는 내부에서 일어날 수 있다. 그러므로, "뮤테인"이란 용어는 천연 분자의 단편에 속하는 것을 포함한다. 삽입 뮤테인으로서는 N-말단 또는 C-말단에서 융합된 것 예를 들어, 면역 글로불린의 Fc 부분에 융합된 것으로서 반감기가 증가한 것을 포함한다.
본 발명에 따른 뮤테인은 천연 폴리펩티드에 대한 서열 동일성(상동성)이 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 이상인 것이 바람직하다[이때, 동일성(상동성)은 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘(Smith-Waterman homology search algorithm; Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997))(MSPRCH 프로그램(Oxford Molecular)에서 운영되는 프로그램으로서, 아핀 갭 검색법(affine gap search)을 활용함(검색 매개 변수: 갭 개방 패널티 = 12 및 갭 연장 패널티 = 1))에 의해 측정됨]. 기타 널리 공지되었으며, 통상적으로 사용된 상동성/동일성 스캐닝 알고리즘 프로그램으로서는 피어슨 및 립맨(Pearson and Lipman; PNAS USA, 85:2444-2448 (1988); Lipman and Pearson, Science, 222:1435 (1985); Devereaux외 다수, Nuc. Acids Res., 12:387-395 (1984))에 의한 프로그램; 또는 BLASTP, BLASTN 또는 BLASTX 알고리즘(Altschul,외 다수, Mol. Biol., 215:403-410 (1990))을 포함한다. 이와 같은 알고리즘을 사용하는 컴퓨터화 프로그램도 시판되고 있으며, 그 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA(Genetics Computing Group (GCG) 팩키지, 버젼 8, Madison Wis., USA); 및 PC/Gene 프로그램 내 CLUSTAL(Intellegenetics, Mountain View Calif.). 바람직하게, 서열 동일성의 비율은 프로그램에 의해 측정되는 디폴트 매개 변수를 사용하여 측정된다.
본원에 사용된 "변형"이란, 천연 폴리펩티드, 단편 또는 뮤테인이 원하는 활성(작동 활성 또는 길항 활성)을 보유하게 하면서, 이 천연 폴리펩티드, 단편 또는 뮤테인에서 일어나는 임의의 변형으로서, 예를 들어, 글리코실화, 인산화, 중합체 접합(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜과의 접합), 또는 기타 외래 부분의 부가 과정을 의미한다.
본원에 그 자체로서 참고용으로 인용된 문헌[미국 특허 제6,025,146호 및 Koths, Mol. Reprod. Dev. 1997 Jan;46(1):31-38]에는, M-CSF만의 결정화와, M-CSFR에 착화된 M-CSF의 결정화에 관하여 개시되어 있으며, 또한 수용체-결합에 관여하는 잔기와 M-CSF의 3차원 구조에 대하여 특성 규명되어 있다. 미국 특허 제6,025,146호에는 또한 구조 정보를 바탕으로 하여, M-CSF에서 일어난 후보 아미노산 치환부를 선별하는 방법에 관하여도 개시되어 있다. 이와 같은 형태의 M-CSF는 전체적으로 4개의 알파 나선 묶음이 역 평형 상태로 존재하는 형태를 갖는데, 즉, 4개의 나선 묶음이 상-하-상-하의 방향으로 결합하여 존재하는 대부분의 경우와는 달리, 나선 사슬들이 상-상-하-하의 방향으로 존재하는 형태를 갖는다. 긴 교차 결합이 A 나선과 B 나선을 결합하며, C 나선과 D 나선 사이에서도 이와 유사한 결합을 관찰할 수 있다. 이황화-결합된 이량체 형태에 있어서, 상기 묶음은 말단부끼리 결합하여, 매우 편평하고 긴 형태의 구조를 이룬다(대략적인 치수 = 85×35×25). 각각의 단량체에는 3개의 분자 내 이황화 결합(Cys7-Cys90, Cys48-Cys139, Cys1O2-Cys146)이 존재하는데, 이들은 모두 분자의 원위 말단부에 존재한다. 하나의 사슬 간 이황화 결합(Cys31--Cys31)은 도 2에 나타낸 바와 같이 이량체를 관통하는 비 결정형 이중 대칭 축과 이량체의 계면에 존재한다. 돌연 변이 실험 결과, 이와 같은 형태의 M-CSF에 존재하는 시스테인 잔기들 모두는 생물 활성을 완전히 나타내는데 필요할 수 있음을 알 수 있다. 본원에 기술된 구조를 통하여, 이들 잔기의 역할은 주로 수용체 인지보다는 구조를 유지하는 것임을 알 수 있다. 미국 특허 제6,025,146호는, 서열 내 아미노산 잔기의 알파-탄소 위치에 의해 확인되는 절단형 재조합 M-CSF α 이량체의 3차원 구조를 제공한다.
A, C 및 D 나선 구조 내 특정 잔기들은 수용체-결합 상호 작용의 특이성과 관련되어 있는 것으로 파악된다. M-CSFβ는 157번 및/또는 159번 시스테인을 포함하는 사슬 내 이황화 결합을 가지므로, M-CSF의 C-말단부는 상기 구조의 "배면(rear)"으로부터 확장되어, M-CSF의 막 결합에 있어서 길이가 가변적인 "고정 인자(tether)"를 제공한다. 그러므로, M-CSF의 "정면" 또는 수용체 결합부는, 천연 M-CSF의 A, C 및 D 나선 구조 내에 존재하거나 이에 인접하여 존재하는 용매-접근 가능 잔기들 예를 들어, 약 6∼26번, 71∼90번 및 110∼130번 잔기로 이루어진, 분자의 반대편에 존재한다. 이 부위에 존재하는 용매 접근 가능 잔기들을 위치 배향 돌연 변이 유발법으로 변형시켜, 수용체와 측쇄의 상호 작용을 증가 또는 감소시키면, M-CSF 작동제 또는 길항제가 생성될 수 있다. 3원성 펩티드 즉, gly-x-gly 내에 존재할 때 접근 가능한 아미노산의 표면적의 정규화 결과를 바탕으로 하였을 때, 용매 접근 가능 표면적이 약 0.25 이상, 바람직하게는 약 0.4 이상인 잔기가 바람직하다[Kabsch, W.외 다수, Biopolymers 22:2577 (1983)]. 잔기는 단백질의 나머지 부분 예를 들어, 이량체 계면과 상호 작용하지 않아서, 단량체의 상대적 배향을 유지하고, 또한 단백질 폴딩 과정을 망치지 않도록 하는 것으로 선택되는 것이 바람직하다. 임의의 부가 고려 사항으로서는, 인간 M-CSF 수용체를 인지하지 않는, 마우스 및 인간 M-CSF 사이에 보존되지 않은 잔기를 선택하는 것이 있다. 후보 아미노산은, 비 보존적 아미노산과의 치환을 위한 것으로서, M-CSFR 잔기들 간 수소 결합 및/또는 소수성 상호 작용을 파괴하는 것으로 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 하나 이상의 히스티딘을 유사한 크기를 가지는 비-수소-공여 아미노산으로 바꾸는 과정을 통하여, 수용체 결합 능이 변질된 M-CSF를 생성할 수 있다. 치환용으로 바람직한 아미노산으로서는 H15; Q79; R86; E115; E41; K93; D99; L55; S18; Q20; 175; V78; L85; D69; N70; H9; N63; 및 T34를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 수용체 신호 전달에 중요한 M-CSF 잔기는 M-CSF의 불연속 부위를 이루는 것으로 생각된다. 투여될 가능성이 있는, M-CSF를 주성분으로 하는 단백질성 약물에 대한 항체의 형성 가능성을 최소화하기 위하여, 가능하다면 언제든지 (천연 분자와 유사하게) 용매-접근 가능 모 M-CSF 잔기를 보유하도록 만드는 것이 바람직하다.
N-말단부/A 나선부 내에서 아미노산 H15 및 H9를 돌연 변이시켰을 경우, 생물 활성과 M-CSFR과의 결합 능이 상당히 작은 뮤테인이 생성되었다. 이와 같은 결과를 통하여, 수용체 결합 친화도가 감소하면 생물 활성도 떨어진다는 사실을 알 수 있었으며; 이 경우, 히스티딘 아미노산은, M-CSF 수용체 결합 친화성에 중요한, 접촉 상태를 나타내며, 완전한 수용체-결합 능을 원한다면 이 히스티딘 아미노산은 변하지 않은 채로 남아있어야 할 것이다. 인접한 용매 접근 가능 잔기들 예를 들어, Y6 및 S13 그리고 기타 잔기들은 또한 M-CSF 수용체 접촉 잔기들을 나타내는 것일 수도 있다. M-CSF의 2개의 돌연 변이체(Q20A 및 V78K)는 A 및 C 나선부의 중심 부분에 존재하는 용매 접근 가능 잔기들의 중요성을 테스트하도록 구성되었다. 상기 2개의 뮤테인은 생물 활성이 약간 떨어지므로(8∼10배), 이에 따라서 수용체-결합 활성도 떨어진다. 잔기 Q17, R21, E115 및 E119를 돌연 변이시키면, 목적 부위에 존재하는 용매 접근 가능 아미노산의 측쇄 특성들이 변성되었지만, 생물 비 활성(biological specific activity)에는 영향을 미치지 않았는데, 이를 통하여, 길항제 활성을 가지도록 디자인된 뮤테인 내 상기 잔기들은 변형될 필요가 없음을 알 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 수용체-결합에 관여하는 A 및/또는 C 및/또는 D 나선부의 잔기들(예를 들어, 6∼26번 아미노산, 71∼90번 아미노산 및/또는 110∼130번 아미노산)이 비-보존적으로 돌연 변이된 M-CSF 뮤테인을 사용하는 것에 관하여도 고려한다. 이와 같은 뮤테인들은, A, C 또는 D 나선부 내에 존재하는 천연 사슬에 대한 유사성이 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상이되(즉, 천연 아미노산과 동일하거나 유사한 특성을 보유하는 아미노산을 포함하되), 폴리펩티드의 나머지 부분에 존재하는 천연 서열에 대한 유사성이 더욱 높은(예를 들어, 유사성이 95%, 98% 또는 99%인) 것이 바람직하다. 뿐만 아니라, 상기 수용체-결합 위치의 3차원 형태를 유지하는 잔기들은 비-보존적으로 돌연 변이될 수 있다.
다른 구체예에서, M-CSF 뮤테인은 M-CSF의 단량체 형태이다. M-CSF의 이량체 형태는 생물학적으로 활성인 형태이며, M-CSF의 단량체 형태는 일반적으로 비활성이다. 단량체의 이황화 결합은 Cys31-Cys31 사슬 간 결합을 통해 일어나는 것으로 파악된다. 그러므로, M-CSF의 단량체 형태는 길항제로서 사용하기 적당할 수 있다. 이러한 형태의 것으로서는, Cys31 및/또는 기타 시스테인의 시스테인 결실 및/또는 시스테인 치환(예를 들어, 시스테인→알라닌 치환)을 포함하는 뮤테인, 또는 시스테인, 특히 Cys31이 화학적으로 변형되어, 이황화 결합을 형성할 수 없는 뮤테인을 포함한다.
또 다른 구체예에서, M-CSF 뮤테인은 수용체-결합에 관여하는 A, C 또는 D 나선부 또는 이의 일부 중 하나 이상을 단독으로 포함하거나, 또는 단편을 적당한 3차원 형태로 디스플레이할 수 있는 기타 폴리펩티드에 융합된 상태로 포함한다.
임의의 바람직한 보존적 뮤테인 및/또는 비-보존적 뮤테인을 함유하는 뮤테인은 당 업계에 널리 공지된 기술 예를 들어, 재조합 생산법 또는 화학 합성법을 이용하여 용이하게 제조된다.
보존적 치환, 특히, 리간드-수용체 결합에 직접 관여하는 부위의 외부에서 일어나는 치환은 M-CSF 뮤테인(또는 M-CSFR 뮤테인)의 결합 특성을 거의 바꾸지 않는 것으로 예측된다. 아미노산은 물리적인 특성과 단백질의 2차 구조 및 3차 구조에 관여하는 바에 따라서 분류될 수 있다. 당 업계에서, 보존적 치환은 하나의 아미노산이 그 아미노산과 유사한 특성을 보유하는 다른 아미노산으로 치환되는 경우로서 인식되고 있다. 대표적인 보존적 치환을 이하 표 2에 나열하였다[WO 97/09433, 10페이지, 1997년 3월 13일 발행(PCT/GB96/02197; 96년 9월 6일 출원)].
보존적 치환 I
측쇄의 특징 아미노산
지방족 비극성 극성-비하전 극성-하전 GAPILV CSTMNQ DEKR
방향족 HFWY
기타 NQDE
대안적으로, 보존적 아미노산은 문헌[Lehninger; Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77]에 개시된 바와 같이 분류될 수 있으며, 이러한 분류 방식을 이하 표 3에 제시하였다.
보존적 치환 II
측쇄의 특징 아미노산
비극성(소수성) A. 지방족: B. 방향족: C. 황-함유: D. 경계: ALlVP FW M G
비하전-극성 A. 하이드록실: B. 아미드: C. 설프히드릴: D. 경계 STY NQ C G
양 하전(염기성) KRH
음 하전(산성) DE
또 다른 대안으로서, 대표적인 보존적 치환을 이하 표 4에 제시하였다.
보존적 치환 III
원래 잔기 대표적 치환
Ala(A) Val, Leu, Ile
Arg(R) Lys, Gln, Asn
Asn(N) Gln, His, Lys, Arg
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
His(H) Asn, Gln, Lys, Arg
Ile(I) Leu, Val, Met, Ala, Phe
Leu(L) Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys(K) Arg, Gln, Asn
Met(M) Leu, Phe, Ile
Phe(F) Leu, Val, Ile, Ala
Pro(P) Gly
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp, Phe, Thr, Ser
Val(V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala
M-CSF를 암호화하는 DNA 서열의 이용 가능성으로 말미암아, 원하는 폴리펩티드를 생산하는 다양한 발현 시스템을 사용할 수 있다. 적당한 DNA 서열로 발현 벡터를 구성하고 재조합체를 생산하는 과정은 당 업계에 널리 공지된 방법에 의해 수행된다. 이와 같은 기술과 다양한 기타 기술은 일반적으로 문헌[Sambrook외 다수, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), 및 Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, New York (1990); 상기 문헌은 둘 다 본원에 참고용으로 인용됨]에 개시된 바에 따라서 수행된다.
당 업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 따라서 원하는 구조(예를 들어, M-CSF의 수용체 결합 능을 가지는 구조)를 파괴하지 않고 DNA 서열에 의해 암호화되는 아미노산을 결실, 부가 또는 변경함으로써, M-CSF의 1차 서열에 임의의 변형을 가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당 업자는 각각의 아미노산이 산화, 환원 또는 기타 변형법에 의하여 치환 또는 변형될 수 있으며, 이 폴리펩티드를 절단하면 활성 결합 위치와 구조 정보를 보유하는 단편이 생성될 수 있음을 알 것이다. 이와 같은 치환 및 변형을 가하면, "성숙한 M-CSFα(서열 번호 7), M-CSFβ(서열 번호 8) 및 M-CSFγ(서열 번호 9) 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는" 폴리펩티드의 정의에 포함되는, 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드가 생성된다.
폴리펩티드는 당 업계에 공지된 화학적 합성법 또는 재조합 생산 기술에 의해 제조될 수 있다.
단백질의 관련성은 또한 이 단백질을 암호화하는 핵산의 관련성을 통해 특성 규명될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 방법에 관하여는 전술하였다. 뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드 서열이 중간 정도의 엄중도 또는 고도의 엄중도 조건 하에서 혼성화하는 능력을 테스트함으로써, 이 폴리뉴클레오티드 서열의 유사성을 측정하는 방법은 다음과 같이 수행될 수 있다. 대표적인 중간 정도의 엄중도 혼성화 조건으로서는 다음과 같은 조건이 있다: 50% 포름아미드, 1% SDS , 1M NaCl 및 10% 황산덱스트란을 포함하는 혼성화 용액 중, 42℃에서 혼성화하고, 0.1×SSC 및 1% SDS를 포함하는 세척 용액 중, 60℃에서 30분 동안 세척. 고도로 엄중한 조건으로서는, 0.1×SSC 및 1% SDS를 포함하는 세척 용액 중, 68℃에서 세척하는 것을 포함한다. 당 업계에는, 문헌[Ausubel,외 다수 (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3∼6.4.10]에 개시된 바와 같이 온도와 완충액, 또는 염 농도에 변화를 줌으로써, 균등한 엄중도 조건을 얻을 수 있는 것으로 알려져 있다. 혼성화 조건에 가하여지는 변경은 실험에 의해 결정될 수 있거나 또는 프로브의 구아노신/시토신(GC) 염기 쌍의 길이 및 비율을 바탕으로 하여 정확하게 계산될 수 있다. 혼성화 조선은 문헌[Sambrook외 다수, (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47∼9.51]에 개시된 바와 같이 계산될 수 있다.
C. 가용성 M- CSFR
본 발명에 의한 대표적 M-CSFR 단편은 M-CSF/수용체 결합에 관여하는 도메인(도메인 1, 2 및 3이라 생각됨)을 하나 이상, 또는 2개 이상 포함할 수 있다. 바람직한 M-CSFR 단편은 M-CSFR의 도메인 1, 2 및 3, 3개 모두를 포함한다. 이와 같은 M-CSFR 단편 또는 이 M-CSFR의 전체 세포 외 도메인에 부가의 돌연 변이 및/또는 변형을 가하는 것을 고려할 수 있으며, 이는 전술한 "M-CSF 뮤테인" 섹션에서와 같이 수행될 수 있다.
M-CSFR(서열 번호 84 및 서열 번호 85)은 5개의 세포 외 면역 글로불린-유사 도메인(이 중 도메인 1∼3은 리간드-수용체 결합에 관여하는 것으로 생각됨), 경막 도메인 및 세포 내 단속적 Src 관련 티로신 키나제 도메인을 가지는 막 확장 분자이다. 서열 번호 85를 참고로 하였을 때, 전술한 도메인들은 다음과 같이 위치하고 있다: Ig 도메인 1: 27∼102번 아미노산; Ig 도메인 2: 112∼196번 아미노산; Ig 도메인 3: 215∼285번 아미노산; Ig 도메인 4: 308∼399번 아미노산; Ig 도메인 5: 410∼492번 아미노산; 경막 도메인: 515∼537번 아미노산; 및 키나제 도메인: 582∼910번 아미노산. "통상적인" 면역 글로불린-유사 도메인은 루프 구조를 포함하는데, 이 루프 구조의 루프 말단 각각에는 일반적으로 2개의 시스테인이 서로 이황화 결합에 의해 고정되어 있다. M-CSFR에 있어서, Ig-유사 루프를 형성하는 시스테인들은 다음과 같은 아미노산 위치들에 존재한다: 도메인 1: 42, 84; 도메인 2: 127, 177; 도메인 3: 224, 278; 도메인 4: 시스테인 부재; 도메인 5: 419, 485.
항원성을 보유하는, M-CSFR의 원래 세포 외 부분 또는 이의 임의의 단편 예를 들어, Ig-유사 루프 중 하나 이상은 원래 수용체에 결합할 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, CDR 그래프트 항체, 인간화 항체, 완전히 인간의 것인 항체와 이것들의 항원 결합 단편은 M-CSF에 대한 항체에 관하여 전술한 바와 같이 생산될 수 있다. 항체 생성물은 M-CSF 길항제로서의 활성과, 본원의 "스크리닝 방법" 섹션에 기술된 검정법 또는 당 업계에 공지된 임의의 적당한 검정법을 사용하는 본 발명의 치료 방법에 있어서의 적합성에 대해 스크리닝될 수 있다.
전술한 수용체 세포 외 도메인 내 Ig-유사 루프 중 하나 이상은 M-CSF와 M-CSFR 사이의 상호 작용을 억제하기에 충분할 수 있다. 그러므로, M-CSFR의 세포 외 도메인 단편과 이의 뮤테인은 당 업계에 널리 공지된 재조합법 또는 화학 합성법을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. 생산물은 M-CSF 길항제로서의 활성과, 본원의 "스크리닝 방법" 섹션에 기술된 검정법 또는 당 업계에 공지된 임의의 적당한 검정법을 사용하는 본 발명의 치료 방법에 있어서의 적합성에 대해 스크리닝될 수 있다.
D. 유전자 요법
당 업계에 공지된 임의의 적당한 방법 예를 들어, 물리적 DNA 운반 방법(예를 들어, 리포좀 또는 화학적 처리법) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 레트로바이러스)를 사용하는, 세포 외, 실험실 내 또는 생체 내 유전자 요법을 통해, 치료용 단백질을 적당한 세포에 전달할 수 있다. 안티센스 화합물과 이것들을 이용하는 방법도 본 발명에 의해 제공되는 것이다. M-CSF 또는 M-CSFR 활성의 수준은 널리 공지된 안티센스, 유전자 "녹-아웃(knock-out)", 리보자임, 3중 나선체 또는 RNAi 방법을 이용하여 낮출 수 있으며, 그 결과 유전자 발현 수준도 낮아지게 된다. 이와 같은 분자를 생산 및 사용하는 기술에 관하여는 당 업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "펩티도모의체(peptidomimetic)"란 용어는, 스캐폴드(scaffold) 구조 상에 고정되어, 약리단의 공간 배향이 실질적으로 천연 펩티드의 생물 활성 형태를 모의하는, 아미노산 측쇄 또는 약리단 또는 이것들의 적당한 유도체의 조립체를 포함하는 비-펩티드 화합물이다. 예를 들어, 펩티도모의체는 아미노산이나 펩티드 결합은 결여되어 있지만, 결합 활성에 필요한 모 펩티드 유래 펩티드 사슬 기의 특정 3차원 배열은 유지할 수 있다. 상기 스캐폴드 구조는 2환, 3환 또는 다환 탄소 또는 이종 원자 골격을 포함할 수 있거나, 또는 하나 이상의 고리 구조를 바탕으로 하거나(예를 들어, 피리딘 및 인다졸 등) 또는 아미드 결합을 바탕으로 할 수 있다. 이러한 스캐폴드 구조는 중심부의 한쪽 말단에 있는 산성 기(예를 들어, 카복실산 작용기) 및 중심부의 다른 쪽 말단에 있는 염기성 기(예를 들어, N-함유부 예를 들어, 아미딘 또는 구아니딘)에 스페이서에 의해 결합될 수 있다. 펩티도모의체를 합성하는 기술로서 대표적인 기술에 관하여는 미국 특허 출원 제20030199531호(2003년 10월 23일 출원) 및 미국 특허 출원 제20030139348호(2003년 7월 24일 출원)에 개시되어 있다.
항체 및 기타 단백질 이외에도, 본 발명은 또한 M-CSF 및 M-CSFR 사이의 상호 작용 또는 M-CSFR의 활성화를 억제하는데 효과적인, 대안적 M-CSF 길항제 예를 들어, 펩티드 또는 소형 유기 분자에 관한 것이기도 하다.
II . 병행 요법
본 발명에 따라서 2개의 치료제 예를 들어, M-CSF 길항제와 제2의 항-파골 세포 제제를 함께 투여하면, 상기 제제들이 치료 효과를 나타내는 기간이 중첩되는 한, 상기 제제들을 동시에 또는 동일한 경로에 의해 투여할 필요가 없어진다. 동시 투여 또는 연속 투여(상이한 날 또는 상이한 주에 행하여지는 투여)도 고려해볼 수 있다.
M-CSF 항체(대표적인 M-CSF 길항제)를 사용하는 치료법에 착수한 이후에 치료 효과를 얻는데에는 상당한 시간이 소요되므로, 이행기에 제2의 항-파골 세포 제제를 작용 개시 촉진제와 함께 투여하는 것이 바람직하다. 이행기 동안에, 2개의 제제는 단일 요법상 유효량만큼 투여되어야 한다. 이행기 이후, 상기 제2의 항-파골 세포 제제는 투여가 중단되거나 또는 투여량을 줄여서 투여될 수 있다. 만일 M-CSF 길항제 및 제2의 항-파골 세포 제제가 상승 효과를 나타내면, 이행기 이후 상기 제제들 중 하나 또는 둘 다의 투여량을 줄일 수 있다.
본 발명의 조성물은, 골용해성 질환 예를 들어, 암 전이 및/또는 암 전이와 관련된 골 소실, 또는 기타 골 소실 관련 질환 예를 들어, 골다공증이 이미 발병하였거나, 또는 이 질환의 발병 소인을 갖는 포유동물에, 이와 같은 질환의 진행을 막거나 또는 적어도 부분적으로나마 지연시키는데 충분한 양만큼 투여된다. 이와 같이 치료제를 제2의 치료제와 함께 투여하지 않고 단독으로 투여하였을 경우 치료 효과를 나타내기에 적당한 치료제의 양을 "단일 요법상 유효량"이라 정의한다.
본 발명의 병행 요법에 있어서, M-CSF 길항제 예를 들어, M-CSF 항체와 제2의 항-파골 세포 제제는 동시에 또는 상이한 시점에 투여될 수 있다. 상기 2개의 제제의 투여 간격은 예를 들어, 8시간, 1일, 14일, 30일, 3개월, 6개월, 9개월 또는 1년일 수 있다.
대표적인 제2의 항-파골 세포 제제로서는 비스포스포네이트 예를 들어, 졸레드로네이트, 파미드로네이트, 클로드로네이트, 에티드로네이트, 틸루드로네이트, 알렌드로네이트, 이반드로네이트 또는 라이즈드로네이트가 있다. 기타 대표적인 항-파골 세포 제제로서는 비스포스포네이트, PTHrP 중화 제제(예를 들어, 항체, 안티센스 siRNA), 카텝신 K 억제제, MIP-1-α 길항제, RANK/RANKL 중화 제제(예를 들어, 항-RANK 항체, 예를 들어, AMG-162 또는 안티센스 가용성 RANKL 수용체 또는 이의 뮤테인), RANKL 백신, 오스테오프로테그린(OPG), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), src 키나제 억제제, 갈륨 말톨레이트 및 매트릭스 메탈로프로티나제(MMP) 억제제를 포함한다.
비스포스포네이트 투여 방법의 예로서는 4㎎을 정맥 내 투여하는 것을 포함한다. 이보다 더 적은 양(3.5㎎, 3.3㎎ 또는 3.0㎎)을 투여할 수도 있다. 기타 투여 경로 예를 들어, 피하 투여 경로 및 WO 02/087555에 개시된 투여 경로도 적용할 수 있다. M-CSF 항체의 유효량은 질병의 중증도와 치료될 환자의 체중 및 전체적인 상태에 따라서 다양하며 또한 이에 따라서 달라질 것이지만, 일반적인 유효량 범위는 체중 1㎏당 약 1.0∼약 100㎎, 또는 약 10∼약 30㎎이며, 이 경우, 보다 일반적으로 적용되는 투여량은 투여당 약 0.1∼약 10㎎/㎏ 또는 약 1∼약 10㎎/㎏이다. 예를 들어, 항체를 예를 들어, 1회 이상 개별 투여하거나, 또는 연속 주입함으로써, 약 10∼5㎎/㎏ 또는 약 30∼1㎎/㎏으로 환자에게 투여할 수 있다[초기 후보 투여량(initial candidate dosage)]. 질병에 대한 반응성과 환자의 치료법에 대한 내성에 따라서, 매일, 격일로, 1주 간격으로, 또는 그보다 더 적은 횟수로 투여할 수 있다. 질병의 증상이 원하는 만큼 억제될 때까지, 더욱 오랜 시간(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12주, 또는 그 이상)에 걸쳐서 투여량을 유지할 수 있으며, 투여량은 필요에 따라서 조정될 수도 있다. 이와 같은 요법에 다른 경과는 통상의 기술과 검정법에 따라서 용이하게 관찰된다.
본 발명의 방법은 모든 단계의 암에 유용할 수 있지만, 진행되었거나 전이된 암에 특히 적당할 수 있다. 화학 요법 치료를 받지 않은 환자에게 이와 같은 치료 방법을 화학 요법 또는 방사선 요법과 함께 적용시키는 것이 바람직할 수 있지만, 본 발명의 치료 방법과 함께 행해지는 치료법은 1회 이상 화학 요법 치료를 받은 환자에게 필요할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 치료 방법을 수행함으로써 특히, 화학 요법 제제의 독성을 견딜 수 없는 환자에 있어서, 부수적인 화학 요법 제제의 투여량을 줄일 수도 있다.
본 발명의 방법은 항-M-CSF 항체를 단독으로 투여하거나, 또는 상이한 항체들의 배합물 즉, "혼합물(cocktail)"과 함께 병용하는 것도 고려할 수 있다. 이와 같은 항체 혼합물은 이에 함유된 각각의 항체들이 상이한 효과기 기작을 나타내거나, 또는 면역 효과기의 기능을 나타내는 항체와 세포 독성 항체로 인한 효능들을 함께 얻을 수 있다는 점에서 유리하다고 할 수 있다. 병행 요법에 있어서, 이와 같은 항체들은 상승 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 방법은 또 다른 치료법 예를 들어, 암 치료법과 함께 수행될 수 있다. 대표적인 암 치료제 및/또는 치료법으로서는, 다양한 화학 요법 제제, 안드로겐-차단제 및 면역 조정제(예를 들어, IL-2, GM-CSF, SLC), 비스포스포네이트(예를 들어, 아레디아(Aredia)(즉, 파미드로네이트, 파미드론산, 디소듐 파미드로네이트, 파미드로네이트 디소듐 5수화물); 조메타(Zometa)(즉, 아클라스타(Aclasta), 졸레드론산, 졸레드로네이트); 클론드로네이트(Clondronate)(즉, 본포스(Bonefos), 로론(Loron), 클로드로네이트 디소듐, 소듐 클론드로네이트); 포사맥스(Fosamax)(즉, 알렌드로네이트, 알렌드로네이트 소듐 염 3수화물, 알렌드론산); 포사반스(Fosavance)(즉, 비타민 D와 함께 제형화된 포사멕스); 본드로냇(Bondronat) 또는 본비바(Bonviva) 또는 보니바(Boniva)(즉, 이반드로네이트, 이반드론산, 이반드로네이트 소듐); 악토넬(Actonel)(즉, 라이즈드로네이트, 라이즈드로네이트 소듐, 라이즈드론산); 다이드로넬(Didronel) 또는 다이드로칼(Didrocal)(즉, 에티드로네이트, 에티드론산, 에티드로네이트 디소듐); 네릭시아(즉, 네리드로네이트, 네리드론산); 스켈리드(즉, 틸루드로네이트, 틸루드론산); 디메틸-APD(즉, 올파드로네이트, 올파드론산); 및 메드론산 또는 메드로네이트), 수술, 방사선, 세포 독성 화학 요법, 호르몬 요법(예를 들어, 타목시펜(Tamoxifen); 항-안드로겐 요법), 항체 요법(예를 들어, RANKL/RANK 중화 항체; PTHrP 중화 항체, 항-Her2 항체, 항-CD20 항체, 항-CD40, CD22, VEGF, IGFR-1, EphA2, HAAH, TMEFF2, CAIX 항체), 치료 단백질 요법(예를 들어, 가용성 RANKL 수용체; OPG, PDGF 및 MMP 억제제), 소형 분자 약물 요법(예를 들어, Src-키나제 억제제), 성장 인자 수용체의 키나제 억제제, 또는 RANKL 억제제, 올리고뉴클레오티드 요법(예를 들어, RANKL 또는 RANK 또는 PTHrP 안티센스), 유전자 요법(예를 들어, RANKL 또는 RANK 억제제 예를 들어, 항-RANKL 항체), 펩티드 요법(예를 들어, RANKL의 뮤테인), 그리고 본원에 개시된 단백질, 펩티드, 화합물 및 소형 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
암의 화학 요법 제제로서는 알킬화제 예를 들어, 카보플라틴 및 시스플라틴; 질소 머스타드 알킬화제; 니트로소우레아 알킬화제 예를 들어, 카머스틴(BCNU); 대사 길항 물질 예를 들어, 메토트렉세이트; 폴린산; 퓨린 유사체 대사 길항 물질, 머캡토퓨린; 피리미딘 유사체 대사 길항 물질 예를 들어, 플루오로우라실(5-FU) 및 겜시타빈(겜자(Gemzar)®); 호르몬 항 종양제 예를 들어, 고세렐린, 루프롤리드 및 타목시펜; 천연 항 종양제 예를 들어, 알데스루킨, 인터루킨-2, 도세탁셀, 에토포시드(VP-16), 인터페론 알파, 파클리탁셀(탁솔(Taxol)®) 및 트레티노인(ATRA); 항생 천연 항 종양제 예를 들어, 블레오마이신, 닥티노마이신, 도노루비신, 독소루비신, 도노마이신 및 미토마이신 예를 들어, 미토마이신 C; 및 빈카 알칼로이드 천연 항 종양제 예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신; 하이드록시우레아; 아세글라톤, 아드리아마이신, 이포스파미드, 에노시타빈, 에피티오스타놀, 아클라루비신, 안시타빈, 니머스틴, 프로카바진 하이드로클로라이드, 카보쿠온, 카보플라틴, 카모풀, 크로모마이신 A3, 항종양 다당, 항종양 혈소판 인자, 사이클로포스파미드(사이톡신(Cytoxin)®), 쉬조필란, 시타라빈(시토신 아라비노시드), 다카바진, 티오이노신, 티오테파, 테가풀, 돌라스타틴, 돌라스타틴 유사체 예를 들어, 오리스타틴, CPT-11(이리노테칸), 미토잔트론, 비노렐빈, 테니포시드, 아미노프테린, 카미노마이신, 에스페라마이신(예를 들어, 미국 특허 제4,675,187호 참조), 네오카지노스타틴, OK-432, 블레오마이신, 푸툴론, 브록수리딘, 부설판, 혼반, 페플로마이신, 베스타틴(유베니멕스(Ubenimax)®), 인터페론-β, 메피티오스탄, 미토브로니톨, 멜파란, 라미닌 펩티드, 렌티난, 코리올러스 베리시컬러 추출물, 테가풀/우라실, 에스트라머스틴(에스트로겐/메클로레타민)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 암 환자 치료법에 사용되는 부가의 제제로서는 EPO, G-CSF, 갠시클로버; 항생제, 루프롤리드; 메페리딘; 지도부딘(AZT); 돌연 변이체 및 유사체를 포함하는 인터루킨 1∼인터루킨 18; 인터페론 또는 시토킨 예를 들어, 인터페론 α, β 및 γ; 호르몬 예를 들어, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH) 및 유사체, 고나도트로핀 방출 호르몬(GmRH); 성장 인자 예를 들어, 변형성 성장 인자-β(TGF-β), 섬유 아세포 성장 인자(FGF), 신경 성장 인자(NGF), 성장 호르몬 방출 인자(GHRF), 상피 성장 인자(EGF), 섬유 아세포 성장 인자 상동성 인자(FGFHF), 간 세포 성장 인자(HGF) 및 인슐린 성장 인자(IGF); 종양 괴사 인자-α 및 β(TNF-α 및 β); 침습 억제 인자-2(IIF-2); 골 형태 형성 단백질 1∼7(BMP1∼7); 소마토스타틴; 티모신-α-1; γ-글로불린; 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD); 보체 인자; 항-신생 혈관 형성 인자; 항원성 물질; 및 전구 약물을 포함한다.
전구 약물이란, 모 약물에 비하여, 종양 세포에 대한 세포 독성이 덜하거나 아예 없으며, 효소에 의해서 활성인 형태로 되거나, 또는 활성 또는 더욱 활성인 모 형태로 전환될 수 있는, 약학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체를 의미하는 것이다. 예를 들어, 문헌[Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella외 다수, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt외 다수, (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]을 참조하시오. 전구 약물로서는 더욱 활성인 세포 독성 유리 약물로 전환될 수 있는, 인산염-함유 전구 약물, 티오포스페이트-함유 전구 약물, 황산염-함유 전구 약물, 펩티드-함유 전구 약물, D-아미노산-변형 전구 약물, 글리코실화된 전구 약물, β-락탐-함유 전구 약물, 임의 치환된 페녹시아세타미드-함유 전구 약물 또는 임의 치환된 페닐아세타미드-함유 전구 약물, 5-플루오로시토신 및 기타 5-플루오로우리딘 전구 약물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 사용되는 전구 약물의 형태로 유도체화될 수 있는 세포 독성 약물의 예로서는 전술한 화학 요법 제제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
III . 투여 및 제조
M-CSF 길항제의 유효량은 매우 다양하며, 또한 질병의 중증도와 치료될 환자의 체중 및 전체적인 상태에 따라서 달라지겠지만, 일반적으로는, 체중 1㎏당 약 1.0㎍∼약 100㎎이며, 통상적으로 적용되는 투여량은 투여 당 약 10㎍/㎏∼약 10㎎/㎏이다. 본 발명의 조성물의 유효량은 당 업계에 널리 공지된 표준적인 실험 방법에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 소정량의 M-CSF 길항제로 치료받은 개체로부터 얻은 혈청의 생체 내 중화 활성은, M-CSF 유도 증식 및 쥣과 동물 단핵구(M-CSF에 대한 수용체를 높은 수준으로 발현하는 CD11b+ 세포, CD11 세포 하위 세트)의 생존을 혈청이 시험관 내에서 억제하는 능력을 측정하는 검정법을 이용하여 평가될 수 있다[Cenci외 다수, J Clin. Invest. 1055 : 1279-87, 2000].
투여는 질병의 반응성 및 환자의 치료법에 대한 내성에 따라서, 매일, 2일마다, 3일마다, 1주일에 2회, 1주마다 또는 이보다 적은 횟수로 이루어진다. 오랜 기간에 걸쳐서 투여량을 유지할 필요가 있을 수 있으며, 투여량은 필요에 따라서 조정될 수 있다.
치료를 수행하는 전문의에 의하여 선택된 투여량 수준과 투여 패턴으로, 본 발명의 조성물을 1회 투여 또는 복수 투여할 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하는데 사용되는 M-CSF 길항제 예를 들어, 항-M-CSF 항체는 원하는 전달 방법에 적당한 담체를 포함하는 약학 조성물로서 제형화될 수 있다. 적당한 담체로서는, M-CSF 길항제와 함께 사용될 때, 길항제의 항-종양 기능을 유지하고, 개체의 면역 시스템과의 반응성이 없는 임의의 물질을 포함한다. 그 예로서는 다수의 표준적 약학 담체 예를 들어, 멸균 인산염 완충 염 용액 및 정균수 등 중 임의의 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 수성 담체 예를 들어, 물, 완충 수, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있으며, 안정성 증강을 위하여, 화학적으로 약간 변형된 기타 단백질 예를 들어, 알부민, 지단백 및 글로불린 등을 포함할 수도 있다.
길항제의 치료 제형은, 원하는 정도의 순도를 가지는 길항제와 생리적으로 허용 가능한 임의의 담체, 부형제 또는 안정화제를 혼합함으로써, 동결 건조 제형 또는 수용액의 형태를 가지도록 제조 및 보관된다[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량과 농도에서 수용체에게 무독성이며, 그 예로서는 완충액 예를 들어, 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산; 항산화제 예를 들어, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 예를 들어, 염화 옥타데실디메틸벤질 암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤잘코늄, 염화 벤제토늄; 페놀, 부틸 알콜 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저 분자량(약 10개 미만의 잔기로 이루어진) 폴리펩티드; 단백질 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 예를 들어, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제 예를 들어, EDTA; 당 예를 들어, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 짝 이온 예를 들어, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비 이온 계면 활성제 예를 들어, 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 포함한다.
본원의 제형은 또한 필요에 따라서, 특정 증상을 치료하기 위한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는 상보적 활성을 가지는 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 면역 억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같은 분자들은 사용 목적에 효과적인 양만큼 혼합되어 제공되는 것이 적당하다.
활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이트 기술 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세 캡슐 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세 캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세 캡슐, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노 입자 및 나노 캡슐), 또는 매크로에멀젼에 포집될 수도 있다. 이와 같은 기술에 관하여는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체 내 투여에 사용될 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
길항제는 임의의 적당한 수단에 의해 투여되는데, 예를 들어, 비 경구, 피하, 복막 내, 폐 내 및 비강 내 투여에 의해 투여되며, 국소 치료를 원하는 경우에는, 병변 내 투여될 수도 있다. 비 경구 주입법으로서는 정맥 내, 동맥 내, 복막 내, 근육 내, 진피 내 또는 피하 투여를 포함한다. 뿐만 아니라, 길항제는 특히, 길항제의 투여량을 점점 줄이는 맥동성 주입법에 의해 적당히 투여된다. 부분적으로는 투여가 단기에 걸쳐 행해질 것인지 아니면 장기에 걸쳐 행해질 것인지에 따라서, 상기 투여는 주사에 의해 이루어지는 것이 바람직하며, 정맥 내 또는 피하 주사에 의해 이루어지는 것이 가장 바람직하다. 기타 투여 방법 예를 들어, 국소 투여, 구체적으로 경피 투여, 경 점막 투여, 직장, 경구 또는 국소 투여 예를 들어, 원하는 위치에 인접한 곳에 꽂은 카테터를 통한 국소 투여가 고려된다.
본 발명의 조성물은 예를 들어, 과립, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 좌제, 주사제, 에멀젼, 엘릭시르, 현탁액 또는 용액의 형태일 수 있다. 본 발명의 조성물은 다양한 투여 경로용으로서 제형화될 수 있는데, 예를 들어, 경구 투여, 비강 내 투여, 직장 투여, 피하 주사, 정맥 내 주사, 근육 내 주사 또는 복막 내 주사용으로 제형화될 수 있다.
주사용 투여형은 일반적으로, 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 제조될 수 있는 수성 현탁액 또는 오일 현탁액을 포함한다. 주사용 투여형은 용매 또는 희석제와 함께 제조된, 용액 상태일 수 있거나 또는 현탁액의 상태일 수 있다. 허용 가능한 용매 또는 비이클로서는 멸균 수, 링거 용액 또는 등장성 수성 염 용액을 포함한다. 대안적으로, 멸균 오일은 용매 또는 현탁제로서 사용될 수 있다. 바람직하게, 오일 또는 지방산 예를 들어, 천연 또는 합성 오일, 지방산, 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 트리글리세리드는 비 휘발성이다.
주사 투여에 있어서, 약학 제형 및/또는 약물은 전술한 바와 같은 적당한 용액과 재구성되는데 적당한 분말일 수 있다. 그 예로서는 동결 건조, 회전 건조 또는 스프레이 건조 분말, 비 결정성 분말, 과립, 침전물 또는 미립자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 주사 투여에 있어서, 제형은 안정화제, pH 개질제, 계면 활성제, 생체 이용률 개선제 및 이의 혼합물을 함유할 수도 있다.
지속-방출형 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출형 제제의 적당한 예로서는 길항제를 함유하는 소수성 고형 중합체의 반 투과성 매트릭스 즉, 성형품 예를 들어, 필름이나 미세 캡슐의 형태를 갖는 매트릭스를 포함한다. 지속 방출형 매트릭스의 예로서는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 y 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비 분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체 예를 들어, 루프론 데포(Lupron Depot)™(젖산-글리콜산 공중합체와 아세트산 루프롤리드로 이루어진 주사 가능한 미소 구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 중합체 예를 들어, 에틸렌-아세트산 비닐 및 젖산-글리콜산은 분자를 100일 이상의 기간 동안 방출시킬 수 있으며, 어떤 하이드로겔은 단백질을 단기간 동안 방출시킨다. 캡슐에 싸인 길항제가 장기간 동안 체내에 잔류할 때, 이 길항제는 37℃의 수분에 노출됨으로 인해서 변성 또는 응집되어, 생물 활성을 잃을 수 있으며, 면역원성에도 변화가 생길 수 있다. 관련 기작에 따라서, 안정화를 위한 합리적인 기법이 고안될 수 있다. 예를 들어, 만일 응집 기작이 티오-이황화물의 교대를 통하여 형성된 분자 간 S-S 결합으로 인한 것으로 파악된다면, 안정화는 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결 건조시키며, 수분 함량을 조절하고, 적당한 부가제를 사용하며, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 제형은 본원에 개시된 바와 같이, 단기 작용형, 신속 방출형, 장기 작용형 또는 지속 방출형으로서 디자인될 수 있다. 그러므로, 약학 제형은 또한 조절 방출형 또는 서방형으로서도 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 예를 들어, 미셀이나 리포좀, 또는 기타 캡슐에 싸인 형태일 수 있으며, 아니면 장기 보관을 가능하게 하고/가능하게 하거나 전달 효과를 제공하는 장기 방출형(extended realse form)으로 투여될 수 있다. 그러므로, 약학 제형 및 약품은 펠릿이나 실린더 형태로 압착될 수 있으며, 또한 근육 내 또는 피하에 데포(depot) 주사 또는 임플란트 예를 들어, 스텐트의 형태로 이식될 수 있다. 이와 같은 임플란트는 공지의 비활성 물질 예를 들어, 실리콘 및 생분해성 중합체를 사용할 수 있다.
이와 같이, 전술한 각각의 투여형 이외에도, 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체에 관하여는 일반적으로 당 업자에게 공지되어 있으므로, 이러한 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체를 포함하는 투여형도 본 발명에 포함된다. 이와 같은 부형제 및 담체에 관하여는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌["Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991)]에 개시되어 있다.
구체적인 투여량은 질병의 병상, 개체의 연령, 체중, 전체적인 건강 상태, 성별 및 섭취 음식, 투여 간격, 투여 경로, 배설률 및 함께 사용되는 약물에 따라서 조정될 수 있다. 전술한 투여형 중 임의의 것의 유효 투여량은 통상의 실험을 통해 용이하게 결정할 수 있으므로, 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명에 의한 치료제로서 유용한 M-CSF 길항체 또는 항체는 종종 기타 천연 생성 면역 글로불린 또는 기타 생물 분자가 실질적으로 존재하지 않도록 제조될 것이다. 바람직한 M-CSF 길항제는 또한 골용해성 질환 예를 들어, 암 전이 및/또는 암 전이와 관련된 골 소실이 발병하였거나, 발병할 소지가 있는 포유동물에게 투여될 때 최소한의 독성을 나타낼 것이다.
본 발명의 조성물은 종래의 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 결과로 생성된 용액은 사용을 위해 포장될 수 있거나, 또는 무균 조건 하에서 여과되어 동결 건조될 수 있는데, 이때, 동결 건조된 제제는 투여 전 멸균 용액과 혼합된다. 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능하며, 생리적 조건을 적당히 맞추는데 필요한 보조 물질 예를 들어, pH 조정제 및 완충제, 강장 조정제 등 예를 들어, 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 안정화제(예를 들어, 20% 말토스 등)를 함유할 수 있다.
본 발명의 M-CSF 길항제는 또한 다양한 유형의 지질 및/또는 인지질, 및/또는 약물(예를 들어, 본원에 개시된 길항제, 및 임의로는 화학 요법 제제) 전달에 유용한 계면 활성제로 이루어진 소형 소포인 리포좀을 통해 투여될 수도 있다. 리포좀으로서는 에멀젼, 소포, 미셀, 불용성 단일층 구조물, 인지질 분산액, 라멜라층 구조물 등을 포함하며, 이것들은 M-CSF 길항제를 특정 조직에 표적화하고, 조성물의 반감기를 증가시키는 비이클로서 사용될 수 있다. 리포좀을 제조하는 다양한 방법이 사용될 수 있다[예를 들어, 미국 특허 제4,837,028호 및 동 제5,019,369호 참조; 상기 두 특허는 본원에 참고용으로 인용된 것임].
길항제를 함유하는 리포좀은 당 업계에 공지된 방법 예를 들어, 문헌[Epstein외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang외 다수, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호]에 개시된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증가된 리포좀에 관하여는 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다. 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발법에 의하여 특히 유용한 리포좀을 생산할 수 있다. 리포좀은 공극의 크기가 제한된 필터를 통해 배출되며, 그 결과, 원하는 지름을 가지는 리포좀을 얻을 수 있다. 본 발명의 M-CSF 항체의 Fab' 단편은, 문헌[Martin외 다수, J. Biol. Chem.257: 286-288 (1982)]에 개시된 바와 같이, 이황화물 교환 반응을 통해, 리포좀에 접합될 수 있다. 임의로, 화학 요법 제제(예를 들어, 독소루비신)가 상기 리포좀 내에 포함되기도 한다[예를 들어, Gabizon외 다수, J. National Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989) 참조].
이와 같은 조성물 중 M-CSF 길항제의 농도는 약 10 중량% 미만, 일반적으로는 약 25 중량% 이상∼75 중량% 또는 90 중량%로 매우 다양할 수 있으며, 이는 주로 선택된 특정 투여 방식에 따라서 유체 부피 및 점도 등에 의해 선택될 것이다. 경구 투여, 국소 투여 및 비 경구 투여될 수 있는 조성물을 제조하는 실제 방법은 당 업자에게 공지되거나 명백할 것이며, 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)]에 더욱 자세히 기술되어 있다.
본 발명의 조성물의 유효량은 당 업계에 널리 공지된 표준적인 실험 방법을 통해 결정될 수 있다. 예를 들어, 소정량의 M-CSF 길항제를 투여받은 개체로부터 유래하는 혈청의 생체 내 중화 활성은, 혈청이 M-CSF 유도 증식 및 쥣과 동물 단핵구(M-CSF에 대한 수용체를 높은 수준으로 발현하는 CD11b+ 세포, CD11 세포의 하위 세프)의 생존을 시험관 내에서 억제하는 능력을 측정하는 검정법을 통해 평가될 수 있다[Cenci외 다수, J Clin. Invest. 1055: 1279-87, 2000].
본 발명의 조성물은 골용해성 질환 예를 들어, 암 전이 및/또는 암 전이와 관련된 골 소실이 이미 발생한 포유동물 또는 이 질환이 발생할 소지가 있는 포유동물에, 이와 같은 질병을 예방하거나 또는 적어도 부분적으로나마 진행을 지연시키기에 충분한 양만큼 투여된다. M-CSF 길항제의 유효량은 질병의 중증도와 치료될 환자의 체중 및 전체적인 상태에 따라서 다양할 것이며, 또한 이에 따라서 달라질 것이지만, 일반적인 유효량 범위는 체중 1㎏당 약 1.0∼약 100㎎, 또는 약 10∼약 90㎎이며, 투여 당 약 20∼약 80㎎/㎏, 또는 약 30∼약 70㎎/㎏, 또는 약 40∼약 60㎎/㎏이다. 예를 들어, 항-M-CSF 항체를 예를 들어, 1회 이상 개별 투여하거나, 또는 연속 주입함으로써, 약 10∼50㎎/㎏ 또는 약 20∼60㎎/㎏으로 환자에게 투여할 수 있다. 질병에 대한 반응성과 환자의 치료법에 대한 내성에 따라서, 매일, 격일로, 1주 간격으로, 또는 그보다 더 적은 횟수로 투여할 수 있다. 질병의 증상이 원하는 만큼 억제될 때까지, 더욱 오랜 시간(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12주 또는 그 이상)에 걸쳐서 투여량을 유지할 수 있으며, 투여량은 필요에 따라서 조정될 수도 있다. 이와 같은 요법에 다른 경과는 통상의 기술과 검정법에 따라서 용이하게 관찰된다.
치료중인 전문의에 의해 선택된 투여 수준 및 패턴으로 본 발명의 조성물을 1회 투여하거나 다수 회 투여할 수 있다. 상기 질병을 예방 또는 치료함에 있어서, M-CSF 길항제 예를 들어, 항-M-CSF 항체의 적당한 투여량은 전술한 바와 같이, 치료될 질병의 유형과 질병의 중증도 및 경과, 길항제가 예방의 목적으로 투여되는지 아니면 치료의 목적으로 투여되는지 여부, 치료 경험이 있는지 여부, 환자의 병력과 길항제에 대한 반응성, 그리고 치료에 참여하는 전문의의 판단력에 따라서 달라질 것이다. 길항제는 환자에게 한번에 또는 연속 처리 방식으로 투여되는 것이 적당하다.
길항제 조성물은 우수한 의료 행위와 합치하는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이때 고려될 인자로서는 치료될 특정 질환, 치료될 특정 포유동물, 환자 개인의 임상 증상, 질환의 원인, 제제의 전달 위치, 투여 방법, 투여 스케쥴, 그리고 의료업계 실무자들에게 공지된 기타 인자를 포함한다. 투여될 길항제의 치료학적 유효량은 이와 같은 고려 사항들에 의해 좌우될 것이며, 그 양은 곧, M-CSF 매개 질병, 병상 또는 질환을 예방, 경감 또는 치료하는데 필요한 최소량, 구체적으로, 암 세포를 치료하는데 필요한 최소량, 그리고 가장 구체적으로는 전이성 종양 세포를 치료하는데 필요한 최소량이다. 이와 같은 양은 숙주에 독성이거나 또는 숙주가 감염에 더욱 민감하도록 만드는 양보다 작은 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예에서는, 전술한 질병, 질환 또는 병상을 치료하는데 유용한 물질을 함유하는 공산품이 제공된다. 상기 공산품은 용기와 표지를 포함한다. 적당한 용기로서는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 및 시험관을 포함한다. 상기 용기는 다양한 재료 예를 들어, 유리나 플라스틱으로 제조될 수 있다. 상기 용기에는 병상을 치료하는데 효과적인 조성물이 담겨져 있으며, 또한 이 용기의 입구도 멸균되어 있을 수 있다[예를 들어, 상기 용기는 진피 하 주사 바늘에 의해 뚫어지는 마개를 갖는, 정맥 내 투여용 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다]. 본 발명의 조성물 내에 포함된 활성 제제는 본 발명의 M-CSF 길항제 또는 항체이다. 상기 용기에 부착된 표지 또는 이 용기와 합체된 표지에는, 조성물이 특정 병상을 치료하는데 사용된다고 표시되어 있다. 상기 공산품은 또한 약학적으로 허용 가능한 완충액 예를 들어, 인산염-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2의 용기를 포함할 수도 있다. 상업적으로 바람직하고, 사용자의 입장에서도 적당한 기타 물질 예를 들어, 기타 완충액, 희석제, 필터, 바늘이 없는 시린지 및 팩키지 삽입물(사용 방법에 관한 지시 사항)을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 설명할 것인데, 이하 실시예들은 본 발명을 어떠한 방식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예는 동물 모델에 있어서 조메타(졸레드로네이트)의, 투여량 의존적 항-재흡수 효과에 대해 규명하는 것이다(도 14 참조). 0.03㎎/㎏ 이상의 조메타로 처리할 경우, 뼈의 특정 위치에서 종양이 성장함에 따라 유발된 골용해 손상이 억제되었다. 뿐만 아니라, 조메타의 농도를 높여가면서 마우스에 투여한 결과, 투여량 반응 효과가 관찰되었다. 항-마우스 및 항-인간 M-CSF mAb 5A1 및 5H4를 함께 투여하면, 골 손상으로부터 동물을 보호할 수 있었다. 중증 골용해 손상을 치료함에 있어서, M-CSF 항체를 단독 투여한 경우가 0.03㎎/㎏의 조메타를 투여한 경우보다 더욱 효과적이었다. 연구 기간 중 마지막 날에 X선 영상을 바탕으로 골용해 스코어를 다음과 같이 규정하였다(도 14):
0 = 정상;
1 = 정상 피질 구조에서 식별이 모호한 정도 또는 최소한의 병변이 발생한 경우;
2 = 피질 구조가 최소한으로 파괴된, 제한적인 범위의 융해성 병변이 발생한 경우;
3 = 피질 구조가 파괴된, 넓은 범위의 병변이 발생한 경우; 및
4 = 구조가 보존되지 않고 다량으로 파괴되는 경우.
이와 같이 초기 연구 수행시, 조메타 0.03㎎/㎏(아-유효 투여량; sub- efficacious dose)을 사용하여 병용 연구를 수행하였다. 6×105개의 MDA-MB-231Luc 세포를 경골 내 접종한 후 2주 경과시, Nu/Nu 마우스에 5A1/5H4(10㎎/㎏, 1주일에 1회), 조메타(0.03㎎/㎏, 1주일에 2회)를 투여하거나, 또는 항체와 비스포스포네이트 둘 다를 투여하였다. 팩시트론(Faxitron) 분석법(X-선 기술)으로 골 병변을 매주 관찰하였고, 연구 과정 중 후반기에는 최종적으로 모든 동물을 X선 검사하였으며, 이때 수집된 영상들을 사용하여 병변의 중증도에 스코어를 메겼다. 결과들을 분석한 결과, 항-M-CSF mAb 및 조메타 둘 다 골용해를 치료하는데 효과적이었으나, 조메타와 M-CSF mAb를 병용 투여하였을 경우에는, 상기 물질 2개 중 어느 하나만을 단독으로 처리하였을 경우보다 더 많이 골용해를 억제하였으며(도 15) 또한 골용해 정도도 더욱 작았다(도 16).
도 16은 0.03㎎/㎏의 조메타 또는 10㎎/㎏의 항-M-CSF 항체(5A1 + 5H4)로 처리할 경우, 뼈의 특정 위치에서 종양의 성장에 의한 골용해 손상이 억제되었음을 보여주는 것이다. 조메타와 항-M-CSF 항체를 함께 투여하면, 골용해를 더 많이 억제하였다. 평균 골용해 스코어를, 1) 3 마리의 스코어 측정용 지원 동물로부터 구한 평균 스코어 및 2) 군 평균값(즉, 동물 10 마리/군)으로부터 계산하였다.
골용해 스코어는 연구 기간 중 마지막 날에 관찰한 X선 영상을 바탕으로 하여 다음과 같이 규정하였다:
0 = 정상;
1 = 정상 피질 구조에서 식별이 모호한 정도 또는 최소한의 병변이 발생한 경우;
2 = 피질 구조가 최소한으로 파괴된, 제한적인 범위의 융해성 병변이 발생한 경우;
3 = 피질 구조가 파괴된, 넓은 범위의 병변이 발생한 경우; 및
4 = 구조가 보존되지 않고 다량으로 파괴되는 경우.
각각의 팩시트론 영상 분석 결과, 조메타 및 항-M-CSF 항체-처리 동물 내에서 발견되는 비교적 작은 병변에 비한, 미처리 동물에서 발견되는 병변의 중증도를 추가로 확인할 수 있었다(도 17). 병용 처리 군에서는 유해한 상호 작용은 관찰되지 않았다.
결과적으로, 항-M-CSF 항체와 조메타는 둘 다 골용해를 효과적으로 억제하며, 상기 2개의 물질을 함께 투여하면, 하나씩 단독으로 투여하였을 경우에 비하여, 항-재흡수 효과가 증가함을 알 수 있다. 이는 곧, 상기 2개의 물질을 함께 사용하면, 비스포스포네이트에 내성이 없거나 또는 비스포스포네이트로 이미 처리된, 골 질환 환자에게 안전할 뿐만 아니라 효과적인 선택일 수 있음을 말해주는 것이다.
실시예 2
본 실시예는 M-CSF 활성을 억제하여도, 분화된 파골 세포의 활성에 아무런 영향을 미치지 않는다는 사실을 보여주는 것이다(도 18). 인간화된 Chir-RX1 및 조메타를 사용하여, M-CSF 중화 항체와 비스포스포네이트가 분화된 파골 세포 활성에 미치는 영향을 테스트하였다.
이하에 기술된 실험 조건 하에서, 인간 골수 CD34+ 세포(바이오휘태커(Biowhittaker) 카탈로그 번호: 2M-101 A, 3×105개 세포/바이알)를 파골 세포로 분화시켰다. 제1일에, CD34+ 세포를 하나의 동결된 바이알로부터 해동시켜, 이를 10㎖의 배지에 넣었다(10% FCS, 1× 펜 스트렙(Pen Strep) 및 1× 펀지존을 포함하는 알파 MEM). 이 세포들을 1회 세척하고, 2㎖의 배지에 재현탁시킨 다음, 이를 오스테오라이스(OsteoLyse) 평판(OsteoLyse™ Assay Kit(Human Collagen, Cambrex))상에 도말하였다(웰 당 100ul).
제2일에, 원래 배지를 제거하지 않고, 각각의 웰에 50ul의 4× CSF-1을 첨가하여, 최종 농도 30ng/㎖로 만들고, 50ul의 4×RANKL(sRANKL, Chemicon 카타로그 # GF091, 10ug/팩키지)을 첨가하여, 최종 농도 100ng/㎖로 만들었다. 제7일에, 각각의 웰에 50ul의 5× RANKL를 첨가하여 최종 농도 100ng/㎖가 되도록 만들었다.
제15일에, 항체(Chir-RX1 또는 대조군 항체) 또는 조메타를 소정 농도로 첨가하였다. 제17일에, 세포 배양액 상청액을 10ul 취하여 이를, 블랙 96-웰 검정 평판(오스테오라이스 검정 키트 내에 포함됨)의 각 웰 내에서 200㎕의 형광 단 방출 시약과 혼합하였다.
실시예 3
본 실시예는 조메타가 투여량 의존적 방식으로, 분화된 파골 세포의 활성을 억제함을 보여주는 것이다(도 19). 인간화된 Chir-RX1 항체와 조메타를 사용하여, M-CSF 중화 항체 및 비스포스포네이트가 분화된 파골 세포의 활성에 미치는 효과를 테스트하였다.
인간의 골수 CD34+ 세포(바이오휘태커 카탈로그 번호 2M-101 A, 3×105개의 세포/바이알)를 이하에 기술된 실험 조건 하에서 파골 세포로 분화시켰다. 제1일에, CD34+ 세포를 하나의 동결된 바이알로부터 해동시켜, 이를 10㎖의 배지에 넣었다(10% FCS, 1× 펜 스트렙 및 1× 펀지존을 포함하는 알파 MEM). 이 세포들을 1회 세척하고, 2㎖의 배지에 재현탁시킨 다음, 이를 오스테오라이스 평판(OsteoLyse™ Assay Kit(Human Collagen), Cambrex)상에 도말하였다(웰 당 100ul).
제2일에, 원래 배지를 제거하지 않고, 각각의 웰에 50ul의 4× CSF-1을 첨가하여, 최종 농도 30ng/㎖로 만들고, 50ul의 4×RANKL(sRANKL, Chemicon 카타로그 # GF091, 10ug/팩키지)을 첨가하여, 최종 농도 100ng/㎖로 만들었다. 제7일에, 각각의 웰에 50ul의 5× RANKL를 첨가하여 최종 농도 100ng/㎖가 되도록 만들었다.
제15일에, 항체(Chir-RX1 또는 대조군 항체) 또는 조메타를 소정 농도로 첨가하였다. 제17일에, 세포 배양액 상청액을 10ul 취하여 이를, 블랙 96-웰 검정 평판(오스테오라이스 검정 키트 내에 포함됨)의 각 웰 내에서 200㎕의 형광 단 방출 시약과 혼합하였다.
실시예 4
본 실시예는 영장류에서 RX1을 사용하는 약물 동태학적 연구 결과 및 약력학적 연구 결과를 나타내는 것이다(도 20 및 도 21).
본 연구의 목적은 heRX1-10.G1, 인간화된 항-인간 M-CSF 항체를 사이노몰거 스 원숭이(cynomolgus monkey)에 투여하였을 때, 이 heRX1-10.G1, 인간화된 항-인간 M-CSF 항체의 약력학적 및 약물 동태학적 특성을 관찰하고자 하는 것이다[즉, 한 번에 서서히 볼루스 정맥 내 주사한 후(제1일, 제2군 및 제3군), 13주에 걸쳐서 관찰하거나, 또는 반복적으로 투여한 후(제1일, 제43일, 제50일 및 제57일, 제1군) 10주 동안 관찰함]. 인간화된 항-M-CSF IgG1 모노클로날 항체를 서서히 볼루스 정맥 내(IV) 주사하여(기관지 또는 종아리 정맥) 투여하였다.
신규 약물의 안전성 평가에 관한 세계적인 규제 당국의 지침에 따라서 동물을 다루어야 한다. 항체는 설치류 종에 있어서는 교차 반응을 나타내지 않았으나, 시아노몰거스 원숭이에 있어서는 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 시아노몰거스 원숭이는 생물 물질을 사용하는 정맥 내 주사 연구에 사용될 비-설치류 종으로서 승인되었으므로, 이 원숭이를 선택하였다.
동물을 다음과 같은 군으로 무작위로 나누었다:
군 번호 명칭 투여량 수준 (㎎/㎏) 투여량 부피 (㎖/㎏) 동물의 수
수컷 암컷
1 heRX1-1O.G1 0.2/10a 4 2 2
2 heRX1-1O.G1 2 4 2 2
3 heRX1-1O.G1 20 4 2 2
a: 제1일, 제1군에 0.2㎎/㎏/투여만큼 투여하였으며, 제43일, 제50일 및 제57일에는, 덩일한 동물에 10㎎/㎏투여만큼을 투여하였다.
제1일에, 제2군과 제3군에는 테스트용 제형 물품(각각 2 및 20㎎/㎏/투여)을 정맥 내 서서히(약 10분에 걸쳐) 볼루스 주사하여 투여하였다. 카테터 및 애보카스(abbocath)를 사용하여 종아리 정맥에 제형을 투여하였다. 이때의 투여 부피는 4㎖/㎏이었으며, 실제 투여량은 가장 최근의 각 동물의 실제 체중을 바탕으로 하여 정하였다. 제1일에, 제1군에는 0.2㎎/㎏만큼 투여하였으며, 이후 제43일, 제50일 및 제57일에는 10㎎/㎏/투여의 투여량으로 투여하였다. 제형을 정맥 내(종아리 정맥, 카테터 및 애보카스 사용) 서서히(약 10분에 걸쳐) 볼루스 주사하여 투여하였다. 이때의 투여 부피는 4㎖/㎏이었으며, 실제 투여량은 가장 최근의 각 동물의 실제 체중을 바탕으로 하여 정하였다.
혈액학적 분석 및/또는 임상 생화학적 분석을 위해 모든 동물로부터 다음과 같은 양만큼 채혈하였다.
경과일 혈액학적 분석 생화학적 분석
제1군 제2군 제3군 제1군 제2군 제3군
제-14일a 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖
제7일 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖
제3일a 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖
제8일 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖
제15일 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖
제22일 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖
제29일 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖
제43일 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖
제50일 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖ 1㎖
제57일 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖ 1㎖ 1㎖
제64일 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖ 1㎖
제71일 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖ 1㎖ 1㎖
제78일 0.5㎖ 0.5㎖ 0.5㎖ 1㎖
제85일 0.5㎖ 0.5㎖ 1㎖ 1㎖
제92일 0.5㎖ 1㎖
제106일 0.5㎖ 1㎖
제120일 0.5㎖ 1㎖
* 상기 표에 있어서, a는 림프구 표현형 분석 결과와 상관 있는 WBC만을 계수한 경우임(총 개수 및 차수).
다음과 같은 매개 변수를 검사하였다:
혈액학적 특성: 혈액 세포의 형태; 적혈구 지수(MCV, MCH, MCHC 및 RDW); 적혈구 용적; 헤모글로빈; 평균 혈소판 부피; 혈소판 개수; 적혈구 개수; 세망 적혈 구 개수(절대치 및 상대치); 및 백혈구 개수(총 수, 절대치 및 차등적 상대치).
임상 생화학적 특성: A/G 비율(계산치); 알라닌 아미노기 전이 효소; 알부민; 알칼리성 인산화 효소; 아스파르트산염 아미노기 전이 효소; 혈중 요 질소; 칼슘; 염화물; 콜레스테롤; 크레아틴; 글로불린(계산치); 글루코스; 무기인; 칼륨; 나트륨; 총, 직접 및 간접 빌리루빈; 총 단백질; 트리글리세리드; 및 C-반응성 단백질의 수치.
골 교체율(bone turnover)에 관한 생화학적 마커를 다음과 같이 분석하였다[모든 동물로부터 골내 생물 마커를 측정하기 위해 약 2㎖의 혈액을 수집함]:
경과일 골 형성 마커 (BAP 및 칼슘#) 골 흡수 마커 (NTx 및 CTx)
제1군 제2군 제3군 제1군 제2군 제3군
제-14일 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖
제-7일 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖
제8일 1㎖ 1㎖ 1㎖
제15일 1㎖ 1㎖ 1㎖
제22일 1㎖ 1㎖ 1㎖
제29일 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖
제43일 1㎖ 1㎖ 1㎖
제45일 1㎖
제50일 1㎖ 1㎖
제52일 1㎖
제57일 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖
제59일 1㎖
제64일 1㎖ 1㎖
제71일 1㎖ 1㎖ 1㎖
제78일 1㎖
제85일 1㎖ 1㎖ 1㎖ 1㎖
제92일 1㎖ 1㎖
제106일 1㎖ 1㎖
제120일 1㎖ 1㎖
(NTX: 골 콜라겐의 N-말단 가교 텔로펩티드)
(CTX: 골 콜라겐의 C-말단 가교 텔로펩티드)
M- CSF 의 약물 동태학적 평가 및 혈청 내 M- CSF 활성
제1일(주입이 끝난 직후 및 주입이 끝난 후 4시간 경과시)과, 제3일, 제8일, 제15일, 제22일, 제29일, 제43일, 제57일, 제71일 및 제85일에, 제2군 및 제3군에 있어서, 정맥 천자를 통해 혈액(각각 1.5㎖)을 채혈하여, 이를 약물 투여 전의 SST 튜브에 넣었다. 제1군 동물에 있어서, 제1일(주입이 끝난 직후 및 주입이 끝난 후 4시간 경과시)과, 제3일, 제8일, 제15일, 제22일, 제29일, 제43일(투여전과 주입이 끝난 후 4시간 경과시), 제50일(투여전과 주입이 끝난 후 4시간 경과시), 제57일(투여전과 주입이 끝난 후 4시간 경과시), 제59일, 제64일, 제71일, 제78일, 제92일, 제106일 및 제120일에, 정맥 천자를 통하여 혈액(각각 1.5㎖)을 채혈하여, 이를 약물 투여 전의 SST 튜브에 넣었다. 시료들을 약물 동태학적 평가를 위해 분석하였으며, 또한 혈청 중 M-CSF 활성과 나머지 heRX1-10G1 활성에 대해 분석하였다.
혈액 시료를 실온에 약 30분 동안 방치하여 응고시킨 다음, 이를 원심 분리하였다. 약 2700rpm에서 10분 동안 원심 분리하여(약 4℃) 혈청을 얻었으며, 결과로 생성된 혈청을 4개의 분취액으로 나누었다.
상기 발명의 상세한 설명에 인용되었으며/인용되었거나, 출원 데이터 시트에 나열된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 특허 공보가 아닌 문헌들은 모두 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용된 것이다.
전술한 사항들로부터, 예시의 목적으로 본 발명의 특정 구체예가 본원에 기술되어 있으나, 본 발명의 사상과 범위를 벋어나지 않고 다양한 형태의 변형을 가 할 수 있음을 알 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Liu, et al. <120> METHODS FOR PREVENTING AND TREATING CANCER METASTASIS AND BONE LOSS ASSOCIATED WITH CANCER METASTASIS <130> 028099.001 <140> To be assigned <141> <150> <151> <160> 88 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1401 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atgggttggt cctgtatcat cctattcctg gtggccactg ccacaggtgt gcactccgac 60 gtgcagcttc aggagtcagg acctggcctc gtgaaacctt ctcagagtct gtccctcacc 120 tgtactgtca ctgactactc catcaccagt gattacgcct ggaactggat acggcaattc 180 ccagggaata aacttgagtg gatggggtac ataagctaca gtggtagcac ttcctacaat 240 ccatctctca aaagtcggat ctccatcact cgagacacat ccaagaacca gttcttcctg 300 cagctgaact ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcatc cttcgactat 360 gcccacgcca tggattactg gggccaaggg acttcggtca ctgtctcttc cgccaaaaca 420 acagccccat cggtctatcc actggcccct gtgtgtggag atacaactgg ctcctcggtg 480 actctaggat gcctggtcaa gggttatttc cctgagccag tgaccttgac ctggaactct 540 ggatccctgt ccagtggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacacc 600 ctcagcagct cagtgactgt aacctcgagc acctggccca gccagtccat cacctgcaat 660 gtggcccacc cggcaagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgagcccag agggcccaca 720 atcaagccct gtcctccatg caaatgccca gcacctaacc tcttgggtgg accatccgtc 780 ttcatcttcc ctccaaagat caaggatgta ctcatgatct ccctgagccc catagtcaca 840 tgtgtggtgg tggatgtgag cgaggatgac ccagatgtcc agatcagctg gtttgtgaac 900 aacgtggaag tacacacagc tcagacacaa acccatagag aggattacaa cagtactctc 960 cgggtggtca gtgccctccc catccagcac caggactgga tgagtggcaa ggagttcaaa 1020 tgcaaggtca acaacaaaga cctcccagcg cccatcgaga gaaccatctc aaaacccaaa 1080 gggtcagtaa gagctccaca ggtatatgtc ttgcctccac cagaagaaga gatgactaag 1140 aaacaggtca ctctgacctg catggtcaca gacttcatgc ctgaagacat ttacgtggag 1200 tggaccaaca acgggaaaac agagctaaac tacaagaaca ctgaaccagt cctggactct 1260 gatggttctt acttcatgta cagcaagctg agagtggaaa agaagaactg ggtggaaaga 1320 aatagctact cctgttcagt ggtccacgag ggtctgcaca atcaccacac gactaagagc 1380 ttctcccgga ctccgggtaa a 1401 <210> 2 <211> 447 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Asp Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Phe Asp Tyr Ala His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr 180 185 190 Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu 245 250 255 Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro 260 265 270 Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala 275 280 285 Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val 290 295 300 Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu 340 345 350 Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys 355 360 365 Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn 370 375 380 Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys 405 410 415 Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly 420 425 430 Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 435 440 445 <210> 3 <211> 702 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 atggtatcca cacctcagtt ccttgtattt ttgcttttct ggattccagc ctccagaggt 60 gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 120 ttctcctgca gggccagtca gagcattggc acaagcatac actggtatca gcaaagaaca 180 aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 240 aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 300 gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa attaatagct ggccaaccac gttcggcggg 360 gggacaaagt tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt 702 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn Ser Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 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Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Phe Asp Tyr Ala His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 256 <212> PRT <213> ? <400> 7 Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr 20 25 30 Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 35 40 45 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 50 55 60 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr 85 90 95 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 100 105 110 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 120 125 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 130 135 140 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 145 150 155 160 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 165 170 175 Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser 180 185 190 Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile 195 200 205 Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg 210 215 220 Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro 225 230 235 240 Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 245 250 255 <210> 8 <211> 554 <212> PRT <213> ? <400> 8 Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr 20 25 30 Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 35 40 45 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 50 55 60 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr 85 90 95 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 100 105 110 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 120 125 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 130 135 140 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 145 150 155 160 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 165 170 175 Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 180 185 190 Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His 195 200 205 Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu 210 215 220 Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro 225 230 235 240 Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser 245 250 255 Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser 260 265 270 Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn 275 280 285 Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val 290 295 300 Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly 305 310 315 320 Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu 325 330 335 Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro 355 360 365 Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro 370 375 380 Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro 385 390 395 400 Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro 405 410 415 Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly 420 425 430 Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp 435 440 445 Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala 450 455 460 Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly 465 470 475 480 His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser 485 490 495 Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val 500 505 510 Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro 515 520 525 Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr 530 535 540 Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 545 550 <210> 9 <211> 438 <212> PRT <213> ? <400> 9 Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr 20 25 30 Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 35 40 45 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 50 55 60 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr 85 90 95 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 100 105 110 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 120 125 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 130 135 140 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 145 150 155 160 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 165 170 175 Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 180 185 190 Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His 195 200 205 Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu 210 215 220 Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro 225 230 235 240 Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser 245 250 255 Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser 260 265 270 Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn 275 280 285 Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val 290 295 300 Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly 305 310 315 320 Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu 325 330 335 Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly His Glu Arg Gln 355 360 365 Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe 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135 140 Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp 180 185 190 Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys 210 215 220 Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe 260 265 270 Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu 275 280 285 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His 290 295 300 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala 305 310 315 320 Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg 325 330 335 Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met 340 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can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (86)..(86) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (101)..(116) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (119)..(119) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (125)..(125) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 39 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys 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Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 52 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Low Risk + Moderate Risk Light Chain vs. VK6 Subgroup 2-1-(1) A14: DNA SEQ <400> 52 gacatagttc tcacacaatc accagcattc ctctcagtta cacccggcga aaaagtaacc 60 tttacctgtc aggcttctca atctatcggc acttctattc actggtatca acaaaaaacc 120 gatcaagctc ctaaactcct cataaaatac gcatccgaat ccatctccgg tatcccctcc 180 agattttcag gctccggctc cggcacagat ttcaccctta ccattagctc agttgaagcc 240 gaagacgcag ctgattacta ctgtcaacaa ataaactcat ggcccactac tttcggcggc 300 ggcactaaac tcgaaataaa acgtacg 327 <210> 53 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial seqeunce <220> <223> Low Risk + Moderate Risk Light Chain vs. VK6 Subgroup 2-1-(1) A14: <400> 53 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn Ser Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 54 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Arg 100 <210> 55 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg 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(33)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (55)..(56) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 61 Xaa Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Xaa Ser Tyr 20 25 30 Xaa Ile Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Xaa Ile Xaa Pro Tyr Xaa Xaa Gly Xaa Thr 50 55 <210> 62 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(37) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (58)..(59) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 62 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Xaa Val Ser Gly Xaa Ser Xaa Ser Ser Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Xaa Ile Tyr Tyr Arg Ala Xaa Xaa Gly Xaa Thr 50 55 60 <210> 63 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (52)..(53) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (55)..(56) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (58)..(59) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr 20 25 30 Xaa Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr 50 55 60 <210> 64 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 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Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr 50 55 <210> 68 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr 50 55 <210> 69 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn 50 55 60 <210> 70 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 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occurring amino acid <400> 72 Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Xaa Asp Xaa 1 5 10 15 Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Xaa Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Phe Asp Xaa Trp Gly Gln Gly Thr 50 55 60 Leu Val Thr Val Ser Ser 65 70 <210> 73 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(56) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 73 Xaa Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 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sapiens <220> <221> misc_feature <222> (41)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 75 Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr 1 5 10 15 Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 50 55 60 Leu Val Thr Val Ser Ser 65 70 <210> 76 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (42)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 76 Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr 1 5 10 15 Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp 20 25 30 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 50 55 60 Leu Val Thr Val Ser Ser 65 70 <210> 77 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (41)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 77 Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 50 55 60 Leu Val Thr Val Ser Ser 65 70 <210> 78 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (41)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 78 Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys 1 5 10 15 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 50 55 60 Leu Val Thr Val Ser Ser 65 70 <210> 79 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (41)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 79 Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys 1 5 10 15 Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp 20 25 30 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 50 55 60 Leu Val Thr Val Ser Ser 65 70 <210> 80 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (41)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 80 Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr 1 5 10 15 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 50 55 60 Leu Val Thr Val Ser Ser 65 70 <210> 81 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (41)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 81 Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr Gly Arg Phe Val 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His Asn Asn Arg 245 250 255 Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His 260 265 270 Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser 275 280 285 Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser 290 295 300 Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn 305 310 315 320 Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp 325 330 335 Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala 340 345 350 Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu 355 360 365 Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg 370 375 380 Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr 385 390 395 400 Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr 405 410 415 Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu 420 425 430 Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln 435 440 445 Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu 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Asp Leu Leu 660 665 670 Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser 675 680 685 Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu 690 695 700 Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val 705 710 715 720 Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser 725 730 735 Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu 740 745 750 Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe 755 760 765 Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val 770 775 780 Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala 785 790 795 800 Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg 805 810 815 Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr 820 825 830 Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile 835 840 845 Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys 850 855 860 Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe 865 870 875 880 Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu 885 890 895 Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu 900 905 910 Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser 915 920 925 Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu 930 935 940 Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala 945 950 955 960 Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys <210> 86 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 gaaatagtcc ttacccaatc tcccggaacc ctctcagtat ctcccggcga acgagtaacc 60 ttttcatgta gagcatccca atccatcggc acttcaattc actggtatca gcagaaaaca 120 ggtcaatccc cacggcttct tataaaatat gcatcagaat caatttctgg catcccagac 180 agattttcag gttcaggatc aggcaccgat ttcacactta caatatccag agtcgaatca 240 gaagattttg cagattacta ttgtcaacaa ataaacagct ggcccactac attcggacaa 300 ggcacaaaac tcgaaattaa acgtacg 327 <210> 87 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn Ser Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 88 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 gaaatagttc ttactcaatc ccccggtaca ctctcagttt ccccaggcga acgcgtcact 60 ttttcttgca gagcatcaca atcaatcggc acttcaattc attggtatca acaaaaaaca 120 ggacaggccc cacgacttct tattaaatat gcatcagaat caatttctgg catcccagac 180 agattttcag gttcaggatc aggcaccgat ttcacactta caatatccag agtcgaatca 240 gaagattttg cagattacta ttgtcaacaa ataaacagct ggcccactac attcggacaa 300 ggcacaaaac tcgaaattaa acgtacg 327

Claims (31)

  1. 골용해성 질환(osteolytic disorder)을 앓고 있는 환자에게 단일 요법 유효량의 항-M-CSF 항체와 단일 요법 유효량의 파골 세포 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 골용해성 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
  2. 골용해성 질환을 앓고 있는 환자에게 단일 요법 유효량의 항-M-CSF 항체와 단일 요법 유효량의 비스포스포네이트를 투여하는 단계를 포함하는, 골용해성 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 파골 세포 억제제는 RANKL 억제제인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항-M-CSF 항체는 RX1-유래 항체, MC1-유래 항체, MC3-유래 항체 또는 5H4-유래 항체인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 항-M-CSF 항체는 heRX1인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 골용해성 질환은 골다공증, 암 전이와 관련된 골 소실, 파젯병 또는 인공 삽입물 주위의 골 소실(periprosthetic bone loss)인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 파골 세포 억제제 및 M-CSF 항체는 동시에 투여하는 방법.
  8. 제3항에 있어서, 상기 RANKL 억제제는 항-RANKL 항체, 가용성 RANKL 수용체 및 RANKL 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  9. 제3항, 제4항, 제6항 또는 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항-RANKL 항체는 AMG-162인 방법.
  10. 제2항, 제4항, 제6항 또는 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 비스포스포네이트는 졸레드로네이트, 파미드로네이트, 클로드로네이트, 에티드로네이트, 틸루드로네이트, 알렌드로네이트, 이반드로네이트 및 라이즈드로네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 비스포스포네이트는 졸레드로네이트인 방법.
  12. 골용해성 질환을 앓고 있는 환자에게 단일 요법 유효량의 항-M-CSF 항체와 단일 요법 유효량의 비스포스포네이트를 이행기(transition period) 동안 투여하는 단계를 포함하는, 골용해성 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 파골 세포 억제제는 비스포스포네이트 또는 RANKL 억제제인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 이행기는 약 1∼7일인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 이행기는 1주∼1개월인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 이행기는 1∼3개월인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 이행기는 3∼6개월인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 이행기는 6∼12개월인 방법.
  19. 제13항에 있어서, 이행기 이후에 비스포스포네이트 요법을 중단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제13항에 있어서, 이행기 이후에 비스포스포네이트의 투여량을 줄이는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제13항에 있어서, 이행기 직후에 비스포스포네이트의 투여량을 줄이는 방법.
  22. 제13항에 있어서, 이행기 이후에 항-M-CSF 항체의 투여량을 줄이는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. .
  24. 제13항에 있어서, 이행기 직후에 항-M-CSF 항체의 투여량을 줄이는 방법.
  25. 제13항에 있어서, 이행기 이후에 비스포스포네이트를 1회 이상 투여하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항-M-CSF 항체는 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 쥣과 동물 RX1 항체로부터의 CDR 중 2 이상을 포함하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항-M-CSF 항체는 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 쥣과 동물 RX1 항체로부터의 CDR 중 3 이상을 포함하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항-M-CSF 항체는 75% 이상으로 M-CSF와의 결합에 대해 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 쥣과 동물 RX1 항체와 경쟁하는 방법.
  29. 제6항, 제13항 또는 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 파골 세포 억제제는 졸레드로네이트이고, 상기 M-CSF 항체는 RX1-유래 항체인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 졸레드로네이트는 0.5∼4 ㎎의 투여량으로 투여하는 방법.
  31. 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제11항 또는 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항-M-CSF 항체는 RX1, MC1, MC3 또는 5H4 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 방법.
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