BRPI0619498A2 - método para usar antagonistas de il6 com inibidores de proteassoma - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA USAR ANTAGONISTAS DE IL6 COM INIBIDORES DE PROTEASSOMA. A presente invenção refere-se a um método para tratar um dis- túrbio ou condição cancerosa, ou um distúrbio ou condição relacionada com IL-6, em um mamífero em necessidade de tal tratamento que compreende co-administrar um inibidor de proteassoma em combinação com um antagonista de IL-6.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA USAR ANTAGONISTAS DE IL6 COM INIBIDORES DE PROTEAS- SOM A".

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao uso de um inibidor de proteas- soma em combinação com um antagonista de interleucina -6 para realçar a resposta de tratamento de um indivíduo sendo tratado de doenças, como câncer. A presente invenção também se refere aos métodos para tratar câncer em um indivíduo administrando-se a um indivíduo uma quantidade efetiva de um inibidor de proteassoma e uma quantidade efetiva de um an- 1,1 tagonista de interleucina -6. A presente invenção particularmente refere-se aos anticorpos, incluindo variantes ou porções especificadas, específicos para proteína de Interleucina -6 (IL-6 também conhecida como Interferon P2)).

Antecedentes

Citocina IL-6

A IL-6 (interleucina 6) é uma glicoproteína segregada de 22-27 kDa antigamente conhecida como fator de crescimento de célula B humana derivada de monócito, fator 2 de célula B estimuladora, BSF-2, interferon beta-2, e fator de crescimento de hibridoma que tem atividades de pró- inflamatórias e estimuladoras do crescimento e (Hirano e outros, Nature 324: 73-76,1986).

IL-6 pertence à família de fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) e fator de crescimento mielomonocítico (MGF) que in- clui fator inibidor de leucemia (LIF), oncostatina M (OSM), fator neurotrópico ciliar (CNTF), cardiotropina-1 (CT-I), IL-I, e IL-11. IL-6 é produzida por uma disposição de tipos de célula, notavelmente células de apresentação de an- tígeno, células T e células B. As citocinas tipo IL-6 todas atuam através de complexos receptores que contêm uma proteína de transdução de sinal co- mum, gpl30 (antigamente IL-6Rbeta). Porém, considerando que IL-6, IL-11, CT-I, e CNTF se ligam primeiro às proteínas de receptor específicas que subseqüentemente se associam com pg130, LIF e OSM se ligam diretamen- te a um complexo de LIF-R e gp130. O receptor de IL-6 específico (IL-6R ou IL - 6alfa, gp80, ou CD126) existe na membrana ligada ou formas solúveis (slL-6R, uma forma de 55 kD), que são igualmente capazes de ativar gpl30.

Vários agentes são conhecidos para induzir a expressão de IL-6 tal como IL-I1 IL-2, TNFa, IL-4, IFNa, oncostatina e LPS. IL-6 está envolvida em atividades diversas tal como ativação de célula BeT, hematopoiese, atividade de osteoclasto, crescimento de ceratinócito, síntese de proteína de fase aguda, crescimento neuronal e ativação de hepatócito (Hirano e outros, Int. Rev. Immunol; 16(3 -4) :249 - 84,1998).

Embora IL-6 esteja envolvida em muitas séries de reações, os camundongos de nocaute de IL-6 ratos têm um fenótipo normal, eles são viáveis e férteis, e mostra número ligeiramente diminuído de células T e res- posta de proteína de fase aguda diminuída a lesão de tecido (Kopf M e ou- tros, Nature: 368:339-42, 1994). Em contraste, os camundongos transgêni- cos que superexpressam IL-6 cerebral, desenvolvem doença neurológica tal como neurodegeneração, astrocitose, angiogênese cerebral, e estes ca- mundongos não desenvolvem uma barreira hematoencefálica (Campbell e outros, PNAS 90: 10061-10065, 1993). O Papel de IL-6 em Câncer

IL-6 está envolvida na patofisiologia de várias doenças malignas por uma variedade de mecanismos. IL-6 é hipotetisada ser um fator causati- vo em morbidez relacionada com câncer como astenia/caquexia e reabsor- ção óssea. Descobriu-se que, caquexia induzida por tumor (Cahlin e outros, 2000) Câncer Res; 60(19):5488-9), reabsorção óssea e hipercalcemia as- sociada são diminuídas em camundongos de nocaute de IL-6 (Sandhu e ou- tros, 1999). A depressão associada ao câncer, e edema cerebral secundário a tumores cerebrais também foram associado com níveis elevados de IL-6 (Musselman e outros, Am. J. Psychiatry; 158(8): 1252-7, 2001).

Os resultados experimentais de vários modelos in vitro e in vivo de vários cânceres humanos demonstraram que IL-6 é um alvo terapêutico para inibição. IL-6 pode induzir proliferação, diferenciação e sobrevivência de células de tumor, promover apoptose (Jee e outros, Oncogene 20: 198- 208,2001), e induzir resistência à quimioterapia (Conze e outro, Câncer Res 61:8851 -8858,2001).

Mieloma múltiplo é malignidade que envolve células de plasma. IL-6 é conhecida por realçar a proliferação, diferenciação e sobrevivência de células de plasma malignas em múltiplos mielomas (MM) através de um me- canismo autócrino ou parácrino que envolve a inibição de apoptose das célu- las malignas. Conseqüentemente, o bloqueio de IL-6 foi postulado ser uma terapia efetiva (Anderson e outros, Hematology: 147 - 165, 2000). Tanto os experimentos in vitro (Tassone, P., e outros, Int. J. Oncol. 21(4): 867-873, 2002) e experiências clínicas foram realizados (Bataille e outro, (1995) Blo- M od; 86(2):685-91 e Van Zaanen, e outros, (1996) J Clin Invest 98: 1441- 1448) e os resultados indicam que o bloqueio de IL6 tem efeito demonstrável em crescimento de célula de câncer. As Séries de Reação de Proteassoma como Alvo Terapêutico

Recente evidência experimental sugere fortemente que os inibi- dores de proteassoma realmente podem ser benéficos em certas patologias, tal como em câncer, asma, infarto cerebral, e encefalomielite auto-imune. Em malignidades, os fármacos podem agir por inibição da degradação de inibidores de ciclo de célula diferentes ou por inibição do regulador transcri- cional anti-apoptótico NF-κΒ, considerando em neuroproteção eles podem agir por inibição da ativação de NF-κΒ, que neste caso elicia a resposta in- flamatória. Em doenças auto-imunes, eles podem agir inibindo a apresenta- ção de "auto" peptídeos, porém também interferindo com a transdução de sinal ao longo das cascatas imunes celulares.

O inibidor de proteassoma de dipeptídeo de ácido borônico PS- 341, bortezomib (VELCADE®), é o primeiro terapêutico aprovado conhecido por agir como um inibidor de proteassoma potente e específico. Embora bortezomib seja um avanço importante no tratamento de mieloma, somente 27% dos pacientes com a doença refratária ou recaída tiveram respostas parciais ou melhores na experiência clínica de fase Il inicial que levou a sua aprovação de FDA (Richardson PG e outros, N Engl J Med 2003, 348: 2609- 17). Os estudos pré-clínicos têm mediadores importantes identificados de quimiorresistência induzível, incluindo as séries de reações antiapoptóticas que são supra-reguladas sob exposição aos inibidores de proteassoma, desse modo atenuando sua eficácia antitumor (revisto em Saleh A e outros, Nat Cell Biol 2000, 2: 476-83).

Um mecanismo de quimiorresistência para inibidores de prote- assoma é a indução de expressão de HSP-70, um inibidor importante de apoptose. A inibição do proteassoma leva ao acúmulo de proteínas de du- plicação incorreta e uma supra-regulação dramática de membros da família de proteína de choque térmico, mais notavelmente HSP-70, por ativação do fator de transcrição, HSF - 1,5-8. Foi hipotetisado que os terapêuticos que anulam a indução de HSP-70 deveriam ser capazes de potencializar a ativi- dade de inibidores de proteassoma. Em outros estudos, o infra-regulamento de expressão de HSP-70 por siRNA ou técnicas de anti-sentido potencializa- ram a atividade pró-apoptótica de inibidores de proteassoma em outros mo- delos pré-clínicos de câncer (Robertson JD e outros, Biochem J 1999, 344: 477-85; Gabai VL e outros, Oncogene 2005, 24: 3328-38).

Um segundo exemplo de quimiorresistência induzível é o MKP-I fosfatase, que é transcricionalmente supra-regulado por inibidores de prote- assoma (Orlowski RZ e outros, J Biol Chem 2002, 277: 27864-71). MKP-I fosfatase é uma proteína de resposta de tensão que também é antiapoptóti- ca, agindo por inativação de cinase de terminal N c-Jun. A infra-regulação de MKP-1 foi mostrada realçar a eficácia antitumor de inibidores de proteas- soma (Small GW e outros, Mol Pharmacol 2004, 66: 1478-90).

IL-6 desempenha um papel central na patogênese de mieloma como demonstrado por sua capacidade de funcionar como um fator de cres- cimento e sobrevivência para as células de mieloma no microambiente da medula óssea, e ativar um programa antiapoptótico que diminui a sensibili- dade a uma variedade de quimioterapêuticos. IL-6 foi mostrado supra- regular a expressão de HSP-70 em vários sistemas modelo. Segundamen- te, STAT-1, um importante fator de transcrição a jusante ativado por sinali- zação de IL-6, interage com HSF-I para promover a transcrição de membros da resposta de choque térmico.

Então, na procura para respostas clínicas mais eficazes, menos tóxicas, e mais duráveis seria importante demonstrar combinações de agen- tes valiosos no tratamento de certos cânceres e emaciação muscular rela- cionada ou não relacionada, como também certos distúrbios inflamatórios ou auto-imunes de origem neural ou não neural. Os efeitos vantajosos de com- binar citocina de inibidores de IL-6 e inibidores de proteassoma não foram demonstrados antes.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se aos métodos para tratar doenças em um indivíduo administrando-se a um indivíduo uma quantidade efetiva de 1,1 um inibidor de proteassoma e uma quantidade efetiva de um antagonista de interleucina-6. O método da invenção compreende administração de um antagonista anti-IL6, seqüencialmente, consecutivamente ou simultanea- mente com bortezomib ou inibidores de proteassoma relacionados. Emuma modalidade, o antagonista de IL6 é um anticorpo anti-IL6 de afinidade eleva- da. Em outra modalidade, o antagonista de IL6 é um anticorpo anti-IL6R.

Uma doença tratável pelo método da invenção inclui câncer, asma, doença inflamatória e doença neurológica. Em uma modalidade, a doença é um distúrbio ou condição cancerosa.

A presente invenção também fornece um método para predizer a utilidade de uma combinação pelo menos de antagonista de IL-6 e pelo me- nos um inibidor de proteassoma.

Breve Descrição Dos Desenhos

A figura 1 é gráfico que mostra o efeito de concentração cres- cente de CNT0328 em múltiplas células de mieloma tratadas durante os tempos indicados.

As figuras 2 A-D são gráficos de coluna que representam a viabi- lidade de porcentagem relativa das células indicadas incubadas com anti- corpo, F105 e CNT0328 ou Mab de controle irrelevante e a concentração indicada de bortezomib: A) células de mieloma múltiplo ANBL-6 pré- incubadas com anticorpo e então tratadas com bortezomib na concentração indicada, Β) células de mieloma múltiplo KAS-6 pré-incubadas com anticorpo e então tratadas com bortezomib na concentração indicada, c) células de mieloma independentes de IL6 RPMI8226, e D) células de mieloma múltiplo ANBL-6 tratadas simultaneamente com CNTO 328 e bortezomib.

As figuras 3A-B são gráficos de coluna que representam o au- mento de duplicação relativo em apoptose medido nas linhagens de célula dependentes de IL6 ANBL-6 (A) e KAX-6 (B) tratadas com combinações de bortezomib e anticorpo onde F105 é o Mab de controle.

A figura 4 é uma mancha do oeste de um gel de proteína de a- mostras de células A.NBL-6 após o tratamento com CNT0328 ou Mab de controle e concentrações crescentes de bortezomib sondado para HSC-70 e MKP-1.

A figura 5 é um gráfico de coluna que representa o aumento de duplicação relativo em apoptose medido em células ANBL-6 incubadas com o controle de veículo (DMSO) ou duas concentrações de bortezomib e con- centrações crescentes do atenuador de proteína de choque térmico KNK437.

A figura 6 é um gráfico de coluna que mostra o aumento de du- plicação relativo em apoptose medido em células de MEF que são deficien- tes de HSF (- / -) ou normais (+/+) incubadas com o controle de veículo (DM- SO) ou duas concentrações de bortezomib e concentrações crescentes do atenuador de proteína de choque térmico KNK437.

Descrição Detalhada da Invenção Abreviações

Ig imunoglobulina, IgG imunoglobulina G, IL interleucina, IL6 in- terleucina-6, IL-6R receptor de interleucina-6, slL-6R receptor de interleuci- na-6 solúvel, HSF-1 fator de transcrição de choque térmico, HSP proteína de choque térmico, MAPK proteína cinase ativada por mitógeno, MPK-1 MAPK fosfatase, Mab anticorpo monoclonal, STAT ativação de transdução de sinal.

Definições

O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo especi- ficamente abrange anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclo- nais de tamanho natural), anticorpos policlonais, anticorpos muItiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo contanto que eles exibam a atividade biológica desejada. "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo de tamanho natural, geralmente a ligação de antígeno ou domínio variável deste. Os exemplos de fragmen- tos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab' )2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia único; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

"Anticorpos quiméricos" são aqueles anticorpos que retêm do- mínios distintos, normalmente o domínio variável, de uma espécie e o res- tante de outras espécies; por exemplo, quimeras de camundongo-humano.

O termo "anticorpo humano", como usado aqui, é pretendido in- cluir anticorpos que têm regiões variáveis e constantes derivadas de ou estri- tamente combinando as seqüências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por seqüências de imunoglobulina de linha ger- minativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese a- leatória ou de sítio específico in vitro ou por mutação somática in vivo tal como durante a recombinação dos segmentos V, D, e J da cadeia pesada humana). Deste modo como usado aqui, o termo "anticorpo humano" refere- se a um anticorpo no qual substancialmente toda parte da proteína (por e- xemplo, CDR, estrutura, domínios Cu, CL, (por exemplo, Ch1, Ch2, Ch3), articulação, (VL, VH)) é substancialmente similar àquelas codificadas por genes de anticorpo de linha germinativa humanos. Os anticorpos humanos foram classificados em agrupamentos com base em suas similaridades de seqüência de aminoácido, vide, por exemplo, http://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/. Deste modo, usando uma pesquisa de similaridade de seqüência, um anticorpo com seqüência linear similar po- de ser escolhido como um modelo para selecionar ou criar anticorpos huma- nos ou humanizados.

Como usado aqui, o termo "afinidade elevada" para um anticor- po refere-se a um anticorpo que tem um Kd de 10 8 M ou menos, mais prefe- rivelmente 10"9 M ou menos e até mesmo mais preferivelmente 10'10 M ou menos. O termo "Kdis" ou " KD", ou "Kd", como usado aqui, é pretendido se referir à taxa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particu- lar. O "KD", é a relação da taxa de dissociação (k2), também chamado o "ín- dice de desassociação (koff)", para a taxa de taxa de associação (k1) ou "taxa de associação Ckon)"- Deste modo, K0 de iguala a k2/k1 ou Wkon e é ex- presso como uma concentração molar (M). Segue que quanto menor o Kd, mais forte a ligação. Então 10'6 M (ou 1mM) indica ligação fraca comparada a 10-9M (ou 1nM).

Como usado aqui, o "sistema de ubiquitina-proteassoma" é um sistema de multicomponente que; identifica e degrada proteínas não deseja- das. O sistema inclui as enzimas requeridas para reconhecer as proteínas não desejadas devido ao seu dano, duplicação incorreta ou natureza celular e vida curta, que são enzimas relacionadas com a ubiquitinação das proteí- nas não desejadas como também as enzimas degradantes que compreen- dem a estrutura de proteassoma que é um complexo de multi-subunidade encontrado tanto no núcleo quanto no citosol.

Como usado aqui, o termo "inibidor de proteassoma" é pretendi- do incluir inibidores das peptidases do proteassoma. Mais especificamente, estes inibidores das peptidases do proteassoma incluem inibidores das pro- teases tipo quimiotripsina e tipo tripsina, além de tiol e serina proteases.

Como usado aqui, o termo "resistente" a um agente terapêutico ao se referir à célula de câncer, significa que a célula obteve resistência aos efeitos do agente normalmente causados por exposição a um nível ambien- tal ou concentração daquele agente que prejudica ou inibe a proliferação, ou é inibido a um grau muito baixo, como um resultado do contato com o nível de agente terapêutico quando comparado a um quando células normais ou não resistentes são levadas em contato com o mesmo nível ou concentração do agente terapêutico. A qualidade de ser resistente a um agente terapêuti- co é uma qualidade altamente variável, com células de câncer diferentes que exibem níveis diferentes de "resistência" a um determinado agente terapêu- tico sob condições diferentes. O inibidor de proteassoma bortezomib representa um avanço significante no tratamento de mieloma múltiplo, porém sua eficácia está limi- tada por vários mecanismos de resistência. Um dos mais importantes é a proteína de choque térmico (HSP) e séries de reações de resposta de ten- são que, através de membros tal como HSP-70 e proteína cinase (MAPK) fosfatase ativada por mitógeno (MKP)-I, de opõem às atividades pró- apoptóticas de bortezomib. Porque a sinalização de interleucina (IL)-6 au- menta a resposta de choque térmico através do transdutor e ativador de si- nal de transcrição (STAT)-I e fator de transcrição de choque térmico (HSF)- 1, os requerentes hipotetisaram que a infra-regulação de sinalização de IL-6 atenuaria a indução de HSP por bortezomib, desse modo realçando sua ati- M vidade antimieloma.

O tratamento de linhagens de célula de mieloma múltiplo depen- dente de IL-6 KAS-6 e ANBL-6 com a combinação de bortezomib e CNTO 328, um anticorpo neutralizante de IL-6 monoclonal quimérico, resultou em maior redução de viabilidade de célula do que com qualquer fármaco sozi- nho de uma maneira dependente do tempo e concentração. Isto foi associ- ado com uma indução realçada de apoptose que, sob algumas condições, foi maior que a soma dos dois agentes individuais somente, sugerindo uma interação sinérgica. Descobertas similares não foram vistas quando usando anticorpos de controle de isótipo, e em estudos da linhagem de célula de mieloma RPMI 8226 independente de IL-6. A atividade aumentada foi vista quando as células foram pré-tratadas com CNTO 328 seguido por bortezo- mib, ou quando elas foram tratadas simultaneamente com ambos os agen- tes, comparado ao tratamento com bortezomib seguido por CNTO 328. O tratamento com CNTO 328 potencialmente inibiu as séries de reações de sinalização a jusante mediadas por IL-6, como demonstrado por bloqueio acentuado de fosforilação de STAT-3 e p44/42 MAPK. CNTO 328 diminuiu a indução mediada por bortezomib de expressão de MKP-1 e HSP70 em 45% e 90%, respectivamente. Notavelmente, CNTO 328 notadamente redu- ziu os níveis de fosfo-STAT-1 transcricionalmente ativo e diminuiu a hiper- fosforilação de HSF-1. Outras estratégias para suprimir a resposta de cho- que térmico, incluindo o uso do inibidor farmacológico KNK437, também produziu evidência para um efeito antimieloma sinérgico em combinação com bortezomib. A atividade sinérgica de KNK437 e bortezomib foi reprodu- zida em fibroblastos de embrião de camundongo normal (MEFs), porém mi- tigada em MEFs de nocaute HSF-1. Considerados juntos, os requerentes demonstraram que a inibição de sinalização de IL-6 aumenta a atividade an- timieloma de bortezomib. Eles também apoiam a hipótese que isto ocorre, pelo menos em parte, se atenuando a indução mediada por inibidor de pro- teassoma da resposta de choque térmico através da infra-regulação de STAT-1 e HSF-1 transcricionalmente ativos. Os ensinos da presente inven- ção fornecem uma razão para o método de tratamento de um indivíduo em necessidade deste com os anticorpos anti-IL6 em seqüencial, consecutiva, ou simultaneamente com bortezomib ou inibidores de proteassoma relacio- nados.

Antaqonistas de IL6 da Invenção

O antagonista de IL-6 usado na presente invenção pode ser de qualquer origem fornecida para bloquear a transmissão de sinal por IL-6, e inibir a atividade biológica de IL-6. Os exemplos de antagonistas de IL-6 incluem anticorpo de IL-6, anticorpo de IL-6R, anticorpo de gp130, mutante de IL-6, oligonucleotídeo de anti-sentido de IL-6R, e peptídeos parciais de IL- 6 ou IL-6R. Um exemplo do mutante de IL-6 usado na presente invenção é descrito em Brakenhoff, e outros, J. Biol. Chem., 269, 86-93, 1994 ou Savi- no, e outros, EMBO J., 13, 1357-1367, 1994. O polipeptídeo de mutante de IL-6 ou fragmento deste não possui os efeitos de transmissão de sinal de IL- 6, porém retém a atividade de ligação com IL-6R, e é produzido introduzin- do-se uma mutação na forma de uma substituição, deleção ou inserção na seqüência de aminoácido de IL6. Ao mesmo tempo em que não há nenhu- ma limitação nas espécies animais usadas, é preferível para usar uma IL6 de origem humana. Similarmente, qualquer peptídeo parcial de IL-6 ou pep- tídeo parcial de IL-6R usado na presente invenção com a condição que eles previnam IL6 ou IL6R (gp80) ou gp130 de afetar a transdução de sinal e desse modo previnam atividade biológica associada de IL-6 (Patente U.S. Ns 5.210.075; ΕΡ617126 para detalhes com respeito aos peptídeos parciais de IL-6 e peptídeos parciais de IL-6R). Em ainda outra modalidade, os oligonu- cleotídeos capazes de mecanismos de anti-sentido ou silenciamento de RNA de IL6 ou IL6R podem ser usados no método da presente invenção (JP5- 300338 para detalhes com respeito ao oligonucleotídeo de anti-sentido de IL-6R).

Anticorpos da Invenção

Os anticorpos úteis na presente invenção incluem anticorpos quiméricos isolados, humanizados e/ou enxertados de CDR1 ou humanos, tendo pelo menos uma região de ligação de antígeno que é capaz de inibir as funções biológicas de IL6. Os exemplos de anticorpos da invenção inclu- 1,1 em anticorpo de ligação de IL-6, anticorpo de ligação de IL-6R (gp80), anti- corpo de ligação de gp130. Os exemplos de anticorpos de IL-6R com regi- ões de ligação de antígeno adequadas incluem anticorpo de PM-1 (Hirata, e outros, J. Immunol., 143, 2900-2906, 1989), e anticorpo de AUK12 - 20, AUK64-7 ou AUK146-15 (W092-19759). Em outra modalidade, o anticorpo anti-IL6R é o anticorpo reformado conhecido como MRA descrito na Patente U.S. N95888510e6121423.

Em uma modalidade a região de ligação antígeno é derivada do anticorpo anti-IL-6 de CLB-8 de afinidade elevada. Um anticorpo exemplar da invenção derivado de CLB-6 é CNT0328 como descrito no pedido de co- pendência dos Estados Unidos dos requerentes Ne 10/280716 os teores do qual estão aqui incorporados por referência. Em uma modalidade alternati- va, o anticorpo é um anticorpo humano que se liga a IL6 com afinidade ele- vada tal·como é descrito no pedido de patente provisório dos U.S. de co- pendência dos requerentes Número de Série 60/677.319. O anticorpo da invenção especificamente neutraliza a IL-6 humana com afinidade elevada.

Um anticorpo anti-IL-6 que pode ser usado no método de acordo com a presente invenção inclui qualquer proteína ou molécula de peptídeo que compreenda pelo menos uma complementaridade que determina a regi- ão (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou uma porção de ligação de ligan- do desta, derivada do anticorpo monoclonal de CLB-8 de murino, em combi- nação com uma região constante de cadeia pesada ou cadeia leve, uma re- gião de estrutura, ou qualquer porção deste, que possa ser incorporado em um anticorpo da presente invenção. Em uma modalidade a invenção está voltada a um anticorpo quimérico anti-IL-6 que compreende duas cadeias de leves e duas cadeias pesadas, cada uma das cadeias compreendendo pelo menos parte de uma região constante humana e pelo menos parte de uma região variável (v) derivada anticorpo monoclonal de C-CLB8 de murino que tem especificidade para IL-6 humana, a referida ligação de anticorpo com afinidade elevada para um epitopo de inibição e/ou neutralizante de IL-6 hu- mano, tal como o anticorpo de cCLB-8. A invenção também inclui fragmen- tos ou um derivado de um tal anticorpo, tal como uma ou mais porções da cadeia de anticorpo, tal como as regiões constantes, de união, de diversida- de ou variáveis de cadeia pesada, ou as regiões constantes, de união ou variáveis de cadeia leve.

Os anticorpos preferidos da presente invenção incluem aqueles anticorpos quiméricos, humanizados e/ou enxertado por CDR, que competi- tivamente inibirão in vivo a ligação a IL-6 humana de CLB-8 de murino anti- IL-6, CLB-8 anti-IL-6 quimérico, ou um anticorpo tendo substancialmente as mesmas características de ligação, como também fragmentos e regiões des- tas.

O anticorpo da invenção preferivelmente liga anti-IL6 ou anti- IL6R com uma afinidade (Kd) de pelo menos 10"9 M, preferivelmente pelo menos 10'10 M, e/ou substancialmente neutraliza pelo menos uma atividade de pelo menos uma proteína de IL-6. Em uma modalidade preferida, o anti- corpo liga IL-6 com uma afinidade (Kd) de pelo menos 1 X 10~11 M, preferi- velmente 5 X 10"11 neutraliza a IL-6humana. Preferivelmente, o anticorpo não liga outros membros da superfamília de IL-6 e bloqueia a transinalização de GP130.

Inibidores de Proteassoma

O proteassoma é uma estrutura de intracelular que é uma pro- teinase multicatalítica que é altamente conservado. Proteassomas são res- ponsáveis pela proteólise dependente de ATP de muitas proteínas envolvi- das em processos celulares reguladores importantes. Deste modo, o prote- assoma é um elemento regulador no crescimento e diferenciação de célula. A célula humana comum contém cerca de 30.000 proteassomas, cada dos quais contém várias proteases de digestão de proteína. Estes complexos estão em um miríade de funções celulares incluindo transcrição, controle de ciclo de célula, resposta de tensão, biogênese de ribossoma, e catabolismo de proteína anormal. Então, eles desempenham um papel em tais proces- sos como respostas imunes e inflamatórias (WO 95/25533), infecção viral, oncogênese, degeneração neural e muscular (Patente U.S. Nq 5.340.736), processamento de antígeno (WO 94/17816), reparo de DNA, 3 diferenciação celular. A atividade de proteassoma é perfeitamente controlada para manter 1,1 o controle rígido sobre a taxa e tipos específicos de proteínas degradadas.

Várias etapas estão envolvidas na degradação de proteína pelo proteassoma ou pelas séries de reações de "ubiquitina-proteassoma". Inici- almente, uma proteína é marcada para destruição com uma cadeia de poli- peptídeos pequenos conhecida como ubiquitina. A ubiquitinação guia a pro- teína na câmara proteolítica fechada do proteassoma. Três atividades enzi- máticas, E1, E2, e E3, são requeridas para ubiquitinação. A enzima E1 de- pendente de ATP ativa a ubiquitina e a liga à enzima de conjugação de ubi- quitina, E2. A enzima E3, uma ubiquitina ligase, então liga a molécula de ubiquitina à proteína. Este processo é repetido até que o polipeptídeo de- signado arraste uma cadeia longa de porções de ubiquitina e o proteassoma finalmente degrade a proteína em fragmentos pequenos. As séries de rea- ções de ubiquitina-proteassoma são responsáveis pela degradação de 90% de todas as proteínas de duplicação incorreta, anormais, e todas as proteí- nas reguladoras de vida curta na célula. Estas proteínas de vida curta, cujas meias-vidas são menores do que três horas, são responsáveis por 10% a 20% de todas as proteínas celulares. As séries de reações também destro- em muitas das proteínas celulares de vida longa. Deste modo, as séries de reações de ubiquitina-proteassoma são responsáveis pela degradação de 80% a 90% de todas as proteínas intracelulares.

Os inibidores de proteassoma anteriormente reportados incluí- ram aldeídos de peptidila. A otimização preliminar destes sugeriu uma pre- ferência para Ieucina na posição P1 e um resíduo hidrofóbico grande, tal como naftilalanina, nas posições P2 ou de P3. Porque os aldeídos de pepti- dila também demonstram inibição potente de tiol proteases (por exemplo, calpaínas, catepsinas) e não são configuracionalmente estáveis devido à acidez do próton na alfa-posição, as substituições para o grupo de aldeído foram investigadas.

Além de inibidores antibióticos originalmente isolados de actino- micetos, uma variedade de aldeídos de peptídeo foi sintetizada, tal como os inibidores de proteases tipo quimiotripsina descritos por Siman e outro (W091/13904). Uma variedade de inibidores do complexo de proteassoma foi reportada, por exemplo, em Dick, e outros, Biochem. 30: 2725 (1991); Goldberg, e outros, Nature 357: 375 (1992); Goldberg, Eur. J. Biochem. 203: 9 (1992); Orlowski, Biochem. 29: 10289 (1989); Rivett, e outros, Archs. Bio- chem. Biophys. 218: 1 (1989); Rivett, e outros, J. Biol. Chem. 264: 12, 215 (1989); Tanaka, e outros, New Biol 4: 1 (1992). Os inibidores de proteasso- ma também são descritos na Patente U.S. Nq 5.693.617, a descrição da qual está aqui incorporada por referência.

Um inibidor de proteassoma preferido é "PS-341" que se refere a um inibidor de proteassoma de dipeptídeo de ácido borônico bortezomib, (ácido MLN-341, LDP-341 e PS-341; ácido borônico de N- (morfolino)carbonil)-beta-(l-naptil)-L-alanina-L-leucina) vendido sob a marca VELCADE®, W096/013266). PS-341 inibem a ativação do fator de transcri- ção NF-κΒ. PS-341 também infra-regula a expressão de vários inibidores de apoptose, induz a apoptose dependente de caspase de linhagens de célula de mieloma múltiplo (MM) resistentes a fármaco e células de paciente, inibe a ligação de célula MM às células estromais da medula óssea (BMSCs) e inibe a produção de fatores de crescimento e sobrevivência de MM ambiente de medula óssea.

Ao contrário dos aldeídos de peptídeo, que inibem as atividades do proteassoma e cisteína protease, bortezomib é um inibidor muito mais potente e seletivo do proteassoma. Ele tem seletividade muito elevada para o proteassoma (> 500-vezes) acima de outras serinas proteases, incluindo leucócito elastase humana, catepsina G, quimiotripsina e trombina. Borte- zomib foi recentemente aprovado para uso para tratar mieloma múltiplo rein- cidente e refratário. A inibição de atividade de proteassoma de célula de tumor por bortezomib em vários modelos de cultura de tumor é associada com a indução de apoptose.

Os inibidores de proteassoma específicos se incluem em cinco classes distinguidas pelo farmacoforo que interage com a treonina de sítio ativo no proteassoma: aldeídos de peptídeo tal como CEP1612 e MG132, boronatos de peptídeo tal como bortezomib, sulfonas de vinila de peptídeo, epoxicetonas de peptídeo e inibidores de β-lactona tal como lactocistina. Os 1,1 seguintes compostos, ou análogos destes, também são contemplados serem usados como inibidores de proteassoma na presente invenção: OS-519 (1R - [1S,4R,5S]] -1-(1-hidróxi-2-metilpropil)-4-propil-6-oxa-2-azabiciclo [3.2.1.] heptano-3,7-diona); beta-lactona de clasto-lactacistina; lactacistina, epoxo- micina, CVT634 (-5-metóxi-1-indanona-3-acetil-leucil-D-leucil-1- indanilamida), TMC96 ((3-metilbutanoil-L-treonina N-(1-(2-(hidroximetil)- oxiran-2-ilcarbonil)-3-metilbut-3enil)amida), MG-115, CEP1612 e MG132.

Além dos inibidores de protease de proteassoma, as séries de reações de ubiquitina-proteassoma podem ser bloqueadas por inibidores das enzimas de facilitação. A enzima de ativação de ubiquitina (E1), enzima de conjugação de ubiquitina (E2), e ubiquitina-ligases (enzimas E3). Os inibido- res de E1 foram identificados tal como ácido himéico A (Tsukamoto, e outro 2005, Bioorgan Med Chem Lett 15(1): 191 -194. Outros métodos conhecidos na técnica, tal como silenciamento de RNA, também podem ser usados para reduzir ou eliminar as atividades de enzimas relacionadas com ubiquitinação específica.

Monitoração de Atividade Inibidora de Proteassoma

Um método para monitorar a ação de fármaco farmacodinâmica de um inibidor de proteassoma em um mamífero, é ensinado na Patente U.S. No. 6613541, os inventores tendo surpreendentemente descoberto que o ensaio ex vivo da atividade de proteassoma, exceto concentração de fár- maco, em amostras biológicas fornece um método útil para monitorar a ação de fármaco farmacodinâmico de inibidores de proteassoma e que estes da- dos fornecem a orientação para selecionar uma quantidade de dose futura e freqüência de dose do inibidor de proteassoma a ser administrado no futuro.

O método compreende administrar o inibidor de proteassoma ao mamífero; obtendo uma ou mais amostras biológicas de teste do mamífero em um ou mais tempos especificados após administrar o inibidor de proteas- soma; medir a atividade de proteassoma na amostra ou amostras biológicas de teste; determinar a quantidade de atividade de proteassoma na biológica ou amostras amostra de teste; e comparar a quantidade de atividade de pro- teassoma na amostra biológica de teste com aquela em uma amostra bioló- gica de referência obtida de um mamífero ao qual nenhum inibidor de prote- assoma foi administrado.

A Patente U.S. N° 6613541 adicionalmente fornece um método para determinar o regime de dose para um inibidor de proteassoma, um mé- todo por determinar atividade de proteassoma de valor de referência em um mamífero, incluindo um humano, e fornece um kit para medir a atividade de proteassoma em uma amostra biológica de um mamífero. Os métodos da Patente U.S. No. 6.613.541 podem ser praticados em amostras biológicas selecionadas de uma amostra de sangue, urina, e biópsia de tecido.

Avaliação de IL6

IL6 pode ser detectado em bioensaios empregando linhagens de célula responsiva de IL6 (vide: 7TD1; B9; CESS, KPMM2, KT-3; M1, MH60- BSF-2, M07E; Mono Mac 6; NFS-60; PIL-6; SKW6-CI4; T1165; XG-1). IL6 também pode ser ensaiada quanto a sua atividade como um fator de cresci- mento de hibridoma (vide: HGF). Os imunoensaios sensíveis e testes colo- rimétricos também estão disponíveis. Um método de detecção alternativo é a quantificação RT-PCR de citocinas. Existe um ensaio de ELISA que de- tecta a proteína gp130 associada ao receptor (tais reagentes estão disponi- bilizados por, por exemplo, R&D Systems).

Para detecção de IL6 ligado a CNT0328, o anti-ID (anticorpos de região antivariável descritos em pedidos dos Estados Unidos de co- pendência dos requerentes Número de Série 10/280716) pode ser usado para detectar em qualquer formato de imunoensaio-padrão, tal como um en- saio tipo ELISA.

Doenças Tratáveis pelo Tratamento pelo Método da Invenção

A expressão desregulada de IL6 provavelmente é um dos fato- res principais envolvidos na patogênese de várias doenças. A superprodu- ção excessiva de IL6 (e outros fatores de diferenciação de célula B) foi ob- servada em várias condições patológicas tal como artrite reumática, mieloma múltiplo, síndrome de Lennert (linfoma histiocítico), doença de Castleman (linfadenopatia com infiltração volumosa de células de plasma, hiper-gama- globulinemia, anemia, e concentrações realçadas de proteínas de fase agu- 1,1 das), mixomas cardíacos e cirrose hepática. A síntese constitutiva de IL6 por glioblastomas e a secreção de IL6 no fluido cérebro-espinhal foi obser- vada.

Com respeito às doenças inflamatórias imunomediadas (IMIDs), IL6 está envolvida na patogênese de poliartrite crônica (junto com IL1 e IL8) uma vez que as concentrações excessivas de IL6 são encontradas no fluido sinovial. Em doenças intestinais inflamatórias, os níveis elevados de plasma de IL6 podem ser um indicador do estado da doença. Em pacientes com glomerulonefrite proliferativo mesangial os níveis de urina elevados de IL6 também são um indicador do estado da doença. IL6 pode desempenhar um papel na patogênese imunomediada de diabetes melito tanto do tipo I quanto do tipo II.

Conseqüentemente, a presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença relacionada com IL- 6, em uma célula, tecido, órgão, animal, ou paciente, como conhecido na técnica ou como descrito aqui, usando pelo menos um anticorpo de IL-6 da presente invenção, por exemplo, administrando ou contatando a célula, teci- do, órgão, animal, ou paciente com uma quantidade efetiva terapêutica de anticorpo de IL-6 junto com administração de um inibidor de proteassoma. A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença relacionada com IL-6, em uma célula, tecido, órgão, a- nimal, ou paciente incluindo, porém não limitado a, pelo menos um dentre obesidade, uma doença imune relacionada, uma doença cardiovascular, uma doença infecciosa, uma doença maligna ou uma doença neurológica.

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença imunorrelacionada relacionada com IL-6, em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente incluindo, porém não limi- tado a, pelo menos um dentre artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, artrite reumatóide juvenil de início sistêmico, artrite psoriática, espondilite ancilosante, úlcera gástrica, artropatia soronegativa, osteoartrite, osteólise, liberação asséptica de implantes ortopédicos, doença intestinal inflamatória, colite ulcerativa, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de antifosfolipídeo, iridociclite/uveíte/neurite óptica, fibrose pulmonar idiopática, vasculite sistê- mica/ grariulomatose de wegener, sarcoidose, procedimentos reversos de vasectomia/orquite, doenças alérgicas/atópicas, asma, rinite alérgica, ecze- ma, dermatite de contato alérgica, conjuntivite alérgica, pneumonite por hi- persensibilidade, transplantes, rejeição de transplante de órgão, doença de enxerto versus hospedeiro, síndrome de resposta inflamatória sistêmica, sín- drome de sepse, sepse gram positiva, sepse gram negativa, sepse de cultu- ra negativa, sepse fúngica, febre neutropênica, urosepse, meningococemia, trauma/hemorragia, queimaduras, exposição à radiação ionizante, pancreati- te aguda, síndrome de angústia respiratória de adulto, artrite reumatóide, hepatite induzida por álcool, patologias inflamatórias crônicas, sarcoidose, patologia de Crohn, anemia de célula falciforme, diabete, nefrose, doença atópica, reações à hipersensibilidade, rinites alérgicas, febre do feno, rinite perenial, conjuntivite, endometriose, asma, urticária, anafalaxia sistêmica, dermatite, anemia perniciosa, doença hemolítica, trombocitopenia, rejeição de enxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição de transplante de rim, rejei- ção de transplante do coração, rejeição de transplante de fígado, rejeição de transplante do pâncreas, rejeição de transplante do pulmão, rejeição de transplante de medula óssea (BMT), rejeição de aloenxerto de pele, cartilage rejeição de transplante de cartilagem, rejeição de enxerto ósseo, rejeição de transplante de intestino delgado, rejeição de implante do timo fetal, rejeição de transplante de paratiróide, rejeição de xenoenxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição de aloenxerto, reações de hipersensibilidade ao anti- receptor, doença de Graves, doença de Raynoud, diabetes resistente a insu- lina tipo B, asma, miastenia grave, citotoxicidade mediada pelo anticorpo, reações de hipersensibilidade tipo III, síndrome de POEMS (polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal, e síndrome de alte- rações da pele), polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal, síndrome de alterações da pele, síndrome de antifosfolipídeo, pênfigo, escleroderma, doença do tecido conectivo misturada, doença de Addison idiopática, diabetes melito, hepatite ativa crônica, cirrose biliar pri- mária, vitiligo, vasculite, síndrome de cardiotomia pós-MI, hipersensibilidade 1,1 tipo IV, dermatite de contato, pneumonite de hipersensibilidade, rejeição de aloenxerto, granulomas devido aos organismos intracelulares, sensibilidade ao fármaco, doença de Wilson, metabólica/idiopática, hemacromatose, defi- ciência de alfa-1 -antitripsina, retinopatia diabética, tiroidite de hashimoto, osteoporose, avaliação do eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal, cirrose biliar primária, tiroidite, encefalomielite, caquexia, fibrose cística, doença do pul- mão crônica neonatal, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Iinfoisti- ocitose hematofagocítica familiar, condições dermatológicas, psoríase, alo- pecia, síndrome nefrótica, nefrite, nefrite glomerular, insuficiência renal agu- da, hemodiálise, uremia, toxicidade, pré-eclampsia, terapia de okt3, terapia anti-cd3, terapia de citocina, quimioterapia, terapia de radiação (por exem- plo, incluindo porém não limitado a, astenia, anemia, caquexia, e similar), intoxicação de salicilato crônica, e similar. Vide, por exemplo, o Merck Ma- nual, 12â - 17â Edições, Merck & Company, Rahway, o NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells e outros, eds., Segunda Edição, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), cada completamente incorporado por referência.

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença cardiovascular em uma célula, tecido, ór- gão, animal, ou paciente, incluindo, porém não limitado a, pelo menos um dentre síndrome do atordoamento cardíaco, infarto do miocárdio, insuficiên- cia cardíaca congestiva, acidente vascular cerebral, acidente vascular cere- bral isquêmico, hemorragia, arteriosclerose, aterosclerose, restenose, doen- ça aterosclerótica diabética, hipertensão, hipertensão arterial, hipertensão renovascular, síncope, choque, sífilis do sistema cardiovascular, insuficiência cardíaca, coração pulmonar, hipertensão pulmonar primária, arritmias cardí- acas, batidas ectópicas atriais, flutter atrial, fibrilação atrial (contínuo ou pa- roxística), síndrome pós-perfusão, resposta da inflamação do desvio cardio- pulmonar, taquicardia atrial caótica ou multifocal, taquicardia de QRS estreito regular, arritmias específicas, fibrilação ventricular, arritmias em feixe His, bloqueio atrioventricular, bloqueio de ramificação em feixe, distúrbios isquê- micos miocárdicos, doença da artéria coronária, angina do peito, infarto mio- cárdico, cardiomiopatia, cardiomiopatia congestiva dilatada, cardiomiopatia restritiva, doenças cardíacas valvulares, endocardite, doença pericardial, tumores cardíacos, aneurismas aórdicos e periféricos, dissecação aórtica, inflamação da aorta, oclusão da aorta abdominal e suas ramificações, dis- túrbios vasculares periféricos, distúrbios arteriais oclusivos, doença periférica aterosclerótica, tromboangeíte obliterante, distúrbios arteriais periféricos fun- cionais, fenômeno e doença de Raynaud, acrocianose, eritromelalgia, doen- ças venosas, trombose venosa, veias varicosas, fístula arteriovenosa, Iinfe- dema, lipedema, angina instável, lesão de reperfusão, síndrome pós-bomba, lesão de reperfusão de isquemia, e similar. Um tal método pode opcional- mente compreender administrar uma quantidade efetiva de uma composição ou composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo anti- IL-6, a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia.

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença infecciosa relacionada com IL-6 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitado a, pelo menos um dentre: infecção bacteriana aguda ou crônica, processos parasitários ou infecciosos agudos e crônicos, que inclui infecções bacteria- nas, virais e fúngicos, infecção de HlV/neuropatia de HIV, meningites, hepa- tite (por exemplo, A, B ou C, ou similar), artrite séptica, peritonite, pneumoni- a, epiglotite, e. coli 0157:h7, síndrome urêmica hemolítica/ púrpura tromboci- topênica trombolítica, malária, febre hemorrágica de dengue, leishmaniose, lepra, síndrome do choque tóxico, miosite estreptocócica, gangrena gasosa, tuberculose de micobactéria, micobactéria aviária intracelular, pneumonia de pneumocystis carinii, doença inflamatória pélvica, orquite/epididimite, Iegio- nella, doença de Lyme, influenza a, vírus Epstein-Barr, síndrome hemafago- cítica associada ao vírus, encefalite viral/meningite asséptica, e similar.

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença maligna relacionada de IL-6 em uma célu- la, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitado a, pelo menos um dentre: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica aguda, célula B, célula T ou FAB ALL, leucemia mielóide aguda (AML), leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielocítica crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de célula pilosa, síndrome mielodiplásica (MDS), um linfoma, doença de Hodgkin, um linfoma maligno, o linfoma de não-Hodgkin, o linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorretal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitose maligna, síndrome paraneoplásica/hipercalcemia de malignidade, tumores sólidos, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer endometiral, câncer de cabeça, câncer de pescoço, câncer não polipose hereditário, linfoma de Hodgkin, câncer do fígado, câncer do pulmão, câncer do pulmão de célula não pequena, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma de célula renal, câncer testicular, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, doença me- tastática, câncer relacionado com a reabsorção óssea, dor óssea relaciona- da com o câncer, e similar.

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença neurológica relacionada com IL-6 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitado a, pelo menos um dentre: doença neurodegenerativa, esclerose múltipla, dor de cabeça de enxaqueca, complexo demência causada pela AIDS, doença desmielinizante, tal como esclerose múltipla e mielite transversal aguda; dis- túrbio extrapiramidal e cerebelar, tal como lesões do sistema corticoespinhal; distúrbios dos gânglios basais; distúrbios do movimento hipercinético, tal como coréia de Huntington e coréia senil; distúrbios do movimento induzido por fármaco, tal como aqueles induzidos por fármacos que bloqueiam os receptores de dopamina de CNS; distúrbios do movimento hipocinético, tal como a doença de Parkinson; paralisia supranuclear progressiva; lesões es- truturais do cerebelo; degenerações espinocerebelares, tal como ataxia es- pinhal, ataxia de Friedreich1 degenerações corticais cerebelares, degenera- ções de sistemas múltiplos (Mencel, Dejerine-Thomas1 Shi-Drager, e Ma- chado-Joseph); distúrbios sistêmicas (doença de Refsum1 abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia, e distúrbio de multissistema mitocondrial); distúrbios de desmielinizante, tal como esclerose múltipla, mielite transversal aguda; e distúrbios da unidade motora, tal como atrofias musculares neurogênicas (degeneração de célula de corno anterior, tal como, esclerose lateral amio- trófica, atrofia muscular espinhal infantil e atrofia muscular espinhal juvenil); a doença de Alzheimer; Síndrome de Down em meia-idade; doença de corpo de Lewy Difuso; Demência Senil de tipo de corpo de Lewy; síndrome de Wernicke-Korsakoff; alcoolismo crônico; doença de Creutzfeldt-Jakob; pa- nencefalite esclerosante subaguda, doença de Hallerrorden-Spatz; Demên- cia pugilística; lesão neurotraumática (por exemplo, lesão da espinha dorsal, lesão cerebral, concussão, concussão repetitiva); dor; dor inflamatória; au- tismo; depressão; acidente vascular cerebral; distúrbios cognitivos; epilepsia; e similar. Um tal método pode opcionalmente compreender administrar uma quantidade efetiva de uma composição ou composição farmacêutica que compreendem pelo menos um anticorpo de TNF ou porção especificada ou variante a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia. Vide, por exemplo, o Merck Manual, 16ã Edição, Merck & Company1 Rahway, NJ (1992).

Métodos de Administração

O método da presente invenção compreende administrar uma quantidade efetiva de uma composição ou composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo anti-IL-6 a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em falta de tal modulação, tratamento ou terapia junto com tratamento que compreende administração de um inibidor de proteas- soma. O método da invenção compreende tratar tais doenças ou distúrbios, em que a administração do referido pelo menos um antagonista de IL-6 é indicada. O método da invenção também compreende a co-administração com o antagonista de IL6, antes, simultaneamente, e/ou após, pelo menos um inibidor de proteassoma. Em uma modalidade específica, o antagonista de IL6 é um anticorpo que previne ou inibe as funções biológicas de IL6, tal como um anticorpo de IL6 neutralizante ou um anticorpo anti-IL6R, e o inibi- dor de proteassoma é selecionado do grupo que consiste em PS-314 (borte- zomib), PS-519; clasto-lactacistina beta-lactona; lactacistina, epoxomicina, CVT634, TMC96, MG-115, CEP1612 e MG132.

Tipicamente, o tratamento de condições patológicas é efetuado administrando-se uma quantidade ou dosagem efetiva de uma composição de anticorpo anti-IL-6 que totaliza, em média, uma faixa de pelo menos cerca de 0,01 a 500 miligramas de pelo menos um anticorpo anti-IL-6 por quilo- grama de paciente por dose, e, preferivelmente, de pelo menos cerca de 0,1 a 100 miligramas de anticorpo/quilograma de paciente por administração única ou múltipla, dependendo da atividade específica do agente ativo conti- do na composição. Alternativamente, a concentração de soro efetiva pode compreender 0,1-5000 microgm/ml de concentração de soro por administra- ção única ou múltipla. As dosagens adequadas são conhecidas pelos médi- cos e, certamente, dependerão do estado da doença particular, atividade específica da composição que é administrada, e do paciente particular que se submete ao tratamento. Em alguns casos, para alcançar a quantidade terapêutica desejada, pode ser necessário prover a subsistência de adminis- tração repetida, isto é, administrações individuais repetidas de uma dose monitorada ou dosada particular, onde as administrações individuais são repetidas até que o efeito ou dose diária desejada seja alcançado.

Para administração parenteral, o anticorpo ou o inibidor de pro- teassoma pode ser formulado como uma solução, suspensão, emulsão, par- tícula, pó, ou pó Iiofilizado em associação, ou separadamente contanto que, com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Os exemplos de tais veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dex- trose, e 1-10% de albumina de soro humano. Os Iipossomas e veículos não aquosos, tal como óleos fixos, também podem ser usados. O veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conservantes). A formulação é esterilizada por técnicas conhecidas ou ade- quadas.

Os veículos farmacêuticos adequados são descritos nas edições mais recentes de Remington1S Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto de referência-padrão neste campo.

Administração

Muitos modos desenvolvidos e conhecidos podem ser usados de acordo com a presente invenção para administrar quantidades farmaceuti- camente efetivas do antagonista de IL6 e inibidor de proteassoma de acordo com a presente invenção. Ao mesmo tempo em que a administração paren- teral é típica, outros modos de administração podem ser usados de acordo com a presente invenção com resultados adequados. A composição da pre- sente invenção pode ser liberada em um veículo, como uma solução, emul- são, colóide, ou suspensão, ou como um pó seco, usando qualquer de uma variedade de dispositivos e métodos adequados para administração por ina- lação ou outros modos descritos aqui incluídos ou conhecidos na técnica.

As rotinas alternativas de administração incluem meios subcutâ- neos, intramusculares, intravenosos, intra-articulares, intrabronquiais, intra- abdominais, intracapsulares, intracartilaginosos, intracavitário, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-epático, intramiocardial, intraosteal, intrapélvico, intrapericárdico, intra- peritoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intra-retal, intra-renal, intra-retinal, intra-espinal, intra-sinovial, intratorácica, intra-uterino, intravesi- cular, intralesional, bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, ou trans- dérmico.

Exemplo 1: Atividade de anticorpo ANTI-IL6 em combinação com um inibidor de Proteassoma

Com base na hipótese que a inibição de IL-6 com o anticorpo de IL-6 neutralizante, quimérico, monoclonal, CNTO 328, potencializaria a ativi- dade antimieloma do inibidor de proteassoma, bortezomib, se atenuando a supra-regulação mediada por bortezomib de HSP-70, os seguintes estudos foram designados e realizados.

A. Inibição de sinalização de IL-6 com o anticorpo monoclonal, CNTO 328, diminui a viabilidade de célula das linhagens de célula de mielo- ma múltiplo dependente de IL-6, ANBL-6 e KAS-6.

-As células ANBL-6 e KAS-6 (Dr. Diane Jelinek, Mayo Clinic, Ro- chester, MN) foram incubadas com concentrações crescentes de CNTO 328 1,1 ou o anticorpo de controle de isótopo, F105, durante 24 e 48 horas. Durante as últimas 4 horas, as células foram incubadas na presença de WST-1 (Ro- che Applied Science, Indianapolis, IN). A redução de WST-1 em um sal de formazan solúvel em água através de células viáveis foi medida a uma ab- sorbância de 450 NM usando uma leitora de placa ELISA. A viabilidade foi medida como porcentagem de viabilidade relativa às células não tratadas. Todas as células foram tratadas em meios RPMI 1640 contendo 10% de FBS e 1 ng/mL de IL-6.

Os resultados são mostrados graficamente na Figura 1 (valores são a média de culturas quintuplicata; barras, SEM). O tratamento de célu- las ANBL-6 e KAS-6 com CNTO 328 leva a uma redução dependente do tempo e dose em viabilidade de célula. As células KAS-6 foram significan- temente mais sensíveis aos efeitos de inibição de IL-6 do que as células ANBL-6.

B. CNTO 328 potencializa a atividade antimieloma de bortezo- mib em células de mieloma dependentes de IL-6.

As linhagens de célula de mieloma RPMI 8226 independentes de IL-6, ANBL-6 ou KAS-6 foram pré-incubadas com 0,1 mcg/ml (KAS-6) ou 10 mcg/ml (ANBL-6 e RPMI 8226) do anticorpo de controle, F105, ou CNTO 328 durante 24 horas, seguido por co-incubação com ou DMSO de controle ou concentrações crescentes de bortezomib na presença continuada de F105 ou CNTO 328 durante outras 24 horas. Para experiências de seqüen- ciamento, as células de ANBL-6 foram tratadas com: 1) F105 ou CNTO 328 durante 24 horas seguido por F105 ou CNTO 328 e 5 nM de bortezomib du- rante outras 24 horas (anticorpo —>■ bortezomib); 2) F105 ou CNTO 328 e 5 nM de bortezomib simultaneamente durante 24 horas (anticorpo + bortezo- mib), ou bortezomib a 5 nM durante 12 horas seguidas por F105 ou CNTO 328 durante 24 horas (bortezomib—)· anticorpo). A viabilidade de célula foi ensaiada como descrito acima e medida como percentual de viabilidade rela- tiva a células não tratadas. Todas as células foram tratadas em meios de RPMI 1640 contendo 10% de FBS e 1 ng/mL de IL-6. As colunas, meios de culturas quintuplicadas; barras, SEM.

A pré-incubação de células ANBL-6 e KAS-6 com CNTO 328 potencializou a citotoxicidade de bortezomib, como demonstrado por uma redução significante na viabilidade de célula relativa às células pré-tratadas com o anticorpo de controle, F105 (figura 12 A e B). CNTO 328 não realçou a atividade de bortezomib na linhagem de célula de mieloma independente de IL-6, RPMI 8226 (painel C). CNTO 328 realçou a citotoxicidade da maio- ria de bortezomib quando as células ANBL-6 foram pré-tratadas com CNTO 328 seguido por bortezomib ou tratadas simultaneamente com CNTO 328 e bortezomib. Em contraste, CNTO 328 teve pouco efeito adicional quando as células foram pré-tratadas com bortezomib (painel D).

C. Inibição de sinalização de IL-6 com CNTO 328 realça a apop- tose mediada por bortezomib das linhagens de célula de mieloma múltiplo dependentee de IL-6s, ANBL-6 e KAS-6.

As células ANBL-6 e KAS-6 foram incubadas com 10 mcg/ml (ANBL-6) ou 1 mcg/ml (KAS-6) de CNTO 328 ou do anticorpo de controle, F105, durante 8 (ANBL-6) a 12 (KAS-6) horas. A apoptose foi determinada usando um ensaio com base em ELISA que avalia a presença de mono- e oligo-nucleossomas (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) e expressa como um aumento de duplicação em apoptose em controles tratados com DMSO e F105. As células foram tratadas em meios RPMI 1640 contendo 10% de FBS e 1 ng/mL de IL-6 (Figura 3 A e B, altura da coluna representa a média de culturas triplicadas; barras, SEM).

O tratamento de células ANBL-6 e KAS-6 com CNTO 328 e bor- tezomib levou à indução realçada de apoptose comparada com células tra- tadas com quaisquer dos fármacos sozinhos. CNTO 328 não pôde potencia- lizar apoptose na linhagem de célula de mieloma independente de IL-6 RPMI 8226 (dados não mostrados).

D. CNTO 328 infra-regula a sinalização de interleucina-6 e se atenua a indução mediada por bortezomib de MKP-1 e HSP-70 antiapoptóti- co em células ANBL-6.

As células ANBL-6 foram incubadas com 10 mcg/ml de CNTO 328 ou o anticorpo de controle, F105, com ou sem concentrações crescentes de bortezomib durante 8 horas. Os Iisados de célula foram preparados e submetidos à análise de imunomancha. As manchas foram extraídas e son- dadas para HSC-70 para garantir carregamento de proteína igual por faixa. Densitometria foi realizada em imunomanchas de HSP-70 e MKP-1.

O tratamento de células ANBL-6 com CNTO 328 levou a uma diminuição dramática em mediadores a jusante de sinalização de IL-6 como demonstrado por uma redução em níveis de fosfo-p42/44 MAPK e fosfo- STAT-3 (Figura 4). Notavelmente, as doses crescentes de bortezomib tam- bém diminuíram os níveis de fosfo-STAT-3 e fosfo-p42/44 MAPK. Estes da- dos indicam que bortezomib, interfere com a sinalização de IL-6 (também reportado em Hideshima T e outros, Oncogene 2003, 22: 8386-93) Além disso, CNTO 328 interferiu com a indução mediada por bortezomib de HSP- 70 e MKP-1 em 45 e 90%, respectivamente, que se correlacionou com níveis diminuídos de HSF-1 hiperfosforilado e fosfo-STAT-1 transcricionalmente ativo.

Ε. KNK437 realça apoptose mediada por bortezomib de células ANBL-6 e HSF-1 +/+ MEF.

As células ANBL-6 ou MEF (controle e HSF-1 - / -) foram incuba- das com ou controle de DMSO ou concentrações crescentes de bortezomib e KNK437 durante 12 (ANBL-6) a 24 horas (MEFs). A apoptose foi determi- nada como descrito acima e expressa como um aumento de duplicação em apoptose acima dos controles tratados com DMSO. As células ANBL-6 fo- ram tratadas em meios RPMI 1640 contendo 10% de FBS e 1 ng/mL de IL-6 (Figura 5, colunas, meios de culturas triplicadas; barras, SEM).

O tratamento de células ANBL-6 com KNK437 levou a um au- mento significante em apoptose mediada por bortezomib comparado com células tratadas com controle. O realce de apoptose mediada por bortezo- mib foi cegado em HSF-1-/- MEFs relativo aos MEFs de controle (Figura 6), sugerindo que a atividade aumentada da combinação é devido a infra- regulação da resposta de proteína de choque térmico.

Sumário dos resultados de combinação de CNTQ328 com Bortezomib

O anticorpo neutralizante de IL-6 CNTO 328 diminuiu a viabilida- de das linhagens de célula de mieloma múltiplo ANBL-6 e KAS-6 de uma maneira dependente da dose e tempo.

O tratamento de células ANBL-6 e KAS-6 com CNTO 328 poten- cializou a atividade antimieloma de bortezomib como demonstrado por uma redução na viabilidade da célula e realce da apoptose com a combinação comparada com um anticorpo de controle e bortezomib. O efeito antimielo- ma de CNTO 328 foi diminuído quando as células foram tratadas consecuti- vamente com bortezomib seguido por CNTO 328 exceto a ordem inversa, talvez devido à capacidade de bortezomib de infra-regular mediadores a ju- sante importantes de sinalização de IL-6, ou por supra-regulação precoce de membros da resposta proteína de choque térmico.

O tratamento de células ANBL-6 e KAS-6 com CNTO 328 levou a infra-regulação de sinalização de IL-6 como mostrado por uma diminuição acentuada nos níveis de fosfo-STAT-3 e fosfo-p42/44 MAPK. Bortezomib também infra-regulou os níveis de fosfo-STAT-3 e fosfo-p42/44 MAPK de uma maneira dependente da concentração.

A atividade aumentada da combinação de CNTO 328 e borte- zomib foi associada com o acúmulo mediado por bortezomib diminuída de MKP-1 e HSP-70 antiapoptótico. A indução de HSP-70 diminuída correla- cionou-se com os níveis diminuídos de fosfo-STAT-1 e HSF-1 hiperfosforilado. O tratamento de células ANBL-6 e KAS-6 com KNK437 aumen- tou a atividade apoptótica de bortezomib, que em parte foi devido a sua ca- pacidade de interferir com a indução da resposta de proteína de choque tér- mico, como demonstrado pelo fato que o efeito apoptótico aumentado foi acentuadamente cegado em fibroblastos embriônicos de camundongo HSF- 1 -negativo.

Considerados juntos, os dados acima fornecem uma razão para trasladar a combinação de bortezomib/CNTO 328 em experiências clínicas e planejando outras novas estratégias apontadas na resistência de infra- regulação a bortezomib (por exemplo, inibidores de HSP-70, MKP-1).

Claims (19)

1. Método para tratar um distúrbio ou condição cancerosa em um mamífero em necessidade de tal tratamento que compreende co- administrar um inibidor de proteassoma em combinação com um antagonista de IL-6.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, na qual o antagonis- ta de IL-6 é um anticorpo ou um fragmento deste.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpo ou fragmento se liga a IL6.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpo ou fragmento se liga ao receptor de IL-6.

6. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o frag- mento de anticorpo é um fragmento Fab1 Fab', ou F(ab')2 ou derivados destes.

7. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo monoclonal compete com de anticorpo monoclonal cCLB8 para ligar-se a IL6 humana.

8. Método de acordo com reivindicação 3, em que o anticorpo monoclonal é administrado intravenosamente.

9. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo monoclonal é administrado na quantidade de 0,01 mg/kg a 12,0 mg/kg de peso corporal.

10. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo monoclonal é administrado em uma dose de bolo seguido por uma infusão do referido anticorpo.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o mamífero é um paciente humano.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de proteassoma é selecionado do grupo que consiste em inibidor de prote- assoma de dipeptídeo de ácido borônico, bortezomib, OS-519 (1R- [1 S,4R,5S]]-1 -(1 -hidróxi-2-metilpropil)-4 -propil-6-oxa-2-azabiciclo [3.2.1.] heptano-3,7-diona); clasto-lactacistin beta-lactona; lactacistina, epoxomicina, CVT634 (-5-metóxi-1 -indanona-3-acetil-leucil-D-leucil-1 -indanilamida), TMC96 ((3-metilbutanoil-L-treonina N-(1 -(2-(hidroximetil)-oxiran-2-ilcarbonil)- 3-metilbut-3enil)amida), MG-115, CEP1612 e MG132.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de proteassoma é o inibidor de proteassoma de dipeptídeo de ácido borôni- co bortezomib.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o distúrbio ou condição cancerosa é pelo menos selecionado de leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), célula B, célula T ou FAB ALL, leucemia mielóide aguda (AML)1 leucemia mielocítica crônica (CML), leuce- mia linfocítica crônica (CLL), leucemia de célula pilosa, síndrome mielodiplá- sica (MDS)1 linfoma a, doença de Hodgkin, um linfoma maligno, linfoma de não-Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, sarcoma de Kaposi, car- cinoma de colorretal, carcinoma pancreático, carcinoma de célula renal, car- cinoma de célula prostática, carcinoma nasofaríngeo, histiocitose maligna, síndrome paraneoplásica/hipercalcemia de malignidade, tumores sólidos, adenocarcinomas, sarcomas, e melanoma maligno.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o antago- nista anti-IL6 é administrado seqüencialmente, consecutivamente, ou simul- taneamente com o inibidor de proteassoma.

16. Método para inibir o crescimento de tumor em um mamífero em necessidade deste, que compreende administrar ao mamífero junto com um inibidor de proteassoma, um anticorpo monoclonal ou fragmento deste que previne a ativação de sinalização de IL6 através dos receptores ligados à membrana em uma quantidade efetiva para inibir o crescimento do referido tumor.

17. Método para prevenir metástase em um mamífero compre- endendo administrar ao mamífero junto com um inibidor de proteassoma, um anticorpo monoclonal ou fragmento deste, que previne ativação de sinaliza- ção de IL6 através dos receptores ligados à membrana em uma quantidade efetiva para prevenir a metástase no referido mamífero.

18. Método de acordo com a reivindicação 3,16 ou 17, em que o anticorpo é cCLB8 ou um fragmento deste.

19. Método para tratar um distúrbio ou condição relacionado com IL-6, em um mamífero em necessidade de tal tratamento, que compreende co-administrar um inibidor de proteassoma em combinação com um antago- nista de IL-6.