CN101325969A - 使用il6拮抗剂与蛋白酶体抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗需要治疗的哺乳动物中癌性疾病或病症或IL－6相关疾病或病症的方法，所述方法包括联合施用蛋白酶体抑制剂和IL－6拮抗剂。

Description

使用IL6拮抗剂与蛋白酶体抑制剂的方法
发明背景
发明领域
本发明涉及蛋白酶体抑制剂与白介素-6拮抗剂的组合在提高所治疗个体对于疾病例如癌症的治疗反应方面的应用。本发明还涉及治疗个体中癌症的方法，包括给个体施用有效量的蛋白酶体抑制剂与有效量的白介素-6拮抗剂。本发明特别涉及特异性针对白介素-6(IL-6，还称为干扰素β2))蛋白的抗体，包括特异性部分或抗体。
背景技术
细胞因子IL-6
IL-6(白介素6)是一种22-27kDa的分泌的糖蛋白，之前称为单核细胞衍生的人B-细胞生长因子、B-细胞刺激因子2、BSF-2、干扰素β-2和杂交瘤生长因子，其具有生长刺激和促炎活性(Hirano等人，Nature324：73-76，1986)。
IL-6属于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和骨髓单核细胞生长因子(MGF)家族，其包括白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、cardiotropin-1(CT-1)、IL-1和IL-11。L-6是由多种类型细胞产生的，最值得注意的是抗原呈递细胞、T和B细胞。IL-6-型细胞因子都通过含有常见信号传导蛋白gp130(之前是IL-6Rβ)的受体复合物而起作用的。然而，鉴于IL-6、IL-11、CT-1和CNTF首先结合特异性受体蛋白，所述特异性受体蛋白随后与pg130结合，所以LIF和OSM直接与LIF-R和gp130的复合物结合。特异性IL-6受体(IL-6R或IL-6α、gp80或CD126)以膜结合形式或溶解形式(sIL-6R，一种55kD的形式)存在，二者都能够激活gp130。
已知有几种物质能诱导IL-6的表达，例如IL-1、IL-2、TNFa、IL-4、IFNa、制瘤素和LPS。IL-6涉及多种活性，例如B和T细胞激活、血细胞生成、破坏细胞活性、角质形成细胞生长、急性期蛋白合成、神经元生长和肝细胞激活激活(Hirano等人，Int.Rev.Immunol；16(3-4)：249-84，1998)。
虽然IL-6涉及多条途径，但是IL-6剔除的小鼠具有正常表型，他们是有活力和能生育的，并且针对组织损伤表现出T细胞数目的轻度下降以及降低的急性期蛋白反应(Kopf M等人，Nature：368：339-42，1994)。相反，过度表达脑IL-6的转基因小鼠发展出了神经疾病例如神经变性、星形细胞增生、脑血管生成，并且这些小鼠没有发展成血脑屏障(Campbell等人，PNAS 90：10061-10065，1993)。
IL-6在癌症中的作用
IL-6通过多种机制参与几种恶性疾病的病生理过程。据假设，IL-6是癌症相关发病例如虚弱/恶病质和骨吸收的病因性因素。已经发现，肿瘤诱导的恶病质(Cahlin等人，(2000)Cancer Res；60(19)：5488-9)、骨吸收以及相关高钙血在IL-6剔除的小鼠中是减轻的(Sandhu等人，1999)。已经发现，癌症相关抑郁症和继发于脑肿瘤的脑水肿与高水平的IL-6有关(Musselman等人，Am J Psychiatry.；158(8)：1252-7，2001)。
由多种人癌症的体外和体内模型获得的实验结果已经证实IL-6是一个用于抑制的治疗靶。IL-6可诱导肿瘤细胞的增殖、分化和存活，促进细胞程序死亡(Jee等人，Oncogene 20：198-208，2001)以及诱导对化疗的抗性(Conze等人，Cancer Res 61：8851-8858，2001)。
多发性骨髓瘤是涉及浆细胞的恶性肿瘤。已知IL-6增强多发性骨髓瘤(MM)中恶性浆细胞的增殖、分化和存活，这是经由涉及恶性细胞的细胞程序死亡的抑制的自分泌或旁分泌机制进行的。因此，据假定阻断IL-6是有效治疗(Anderson等人，Hematology：147-165，2000)。已经进行了体外实验(Tassone，P.等人，Int.J.Oncol.21(4)：867-873，2002)和临床试验(Bataille等人，(1995)Blood；86(2)：685-91and VanZaanen，等人，(1996)J Clin Invest 98：1441-1448)，并且结果表明，并且结果表明，IL6阻断对于癌细胞生长有可证实的影响。
作为治疗靶的蛋白酶体途径
最近的实验证据有力地表明，蛋白酶体抑制剂实际上可能在一些病变例如癌症、哮喘、脑梗塞和自身免疫性脑脊髓炎中是有益的。在恶性病变中，药物可以通过抑制不同细胞周期抑制剂的降解或者通过抑制抗细胞程序死亡转录调节剂NF-κB而起作用，而在神经保护中，药物可以通过抑制NF-κB的激活而起作用，在这种情况下，NF-κB的激活会引发炎性反应。在自身免疫性疾病中，药物可以通过抑制“自”肽的呈递来起作用，但是也可以通过干扰沿着细胞免疫级联的信号传导来起作用。
硼酸二肽蛋白酶体抑制剂PS-341，bortezomib
Figure A20068004592100061
是第一个被批准的已知作为有效特异性蛋白酶体抑制剂起作用的治疗药物。虽然bortezomib是骨髓瘤治疗中的重要进步，但是对于患有顽固性或复发性疾病的患者，只有27％患者在初始II期临床试验中具有部分反应或较好反应，其得到看FDA的批准(Richardson PG等人，N EnglJ Med 2003，348：2609-17)。临床前试验具有鉴定的诱导型药物抗性的重要介质，包括抗细胞程序死亡途径，其在暴露于蛋白酶体抑制剂时被上调，由此减弱了其抗肿瘤效力(综述于Saleh A等人，Nat Cell Biol2000，2：476-83)。
对于蛋白酶体抑制剂的药物抗性的一个机制是诱导HSP-70的表达，HSP-70是细胞程序死亡的重要抑制剂。抑制蛋白酶体导致错折叠蛋白的积聚，以及热激蛋白家族的成员，最值得注意的是HSP-70的剧烈上调，这是通过激活转录因子HSF-1.5-8来实现的。据假设，取消HSP-70诱导的治疗剂应该能够增强蛋白酶体抑制剂的活性。在其他研究中，在其他临床前癌症模型中通过siRNA或反义技术下调HSP-70表达能够增强蛋白酶体抑制剂的促细胞程序死亡活性(Robertson JD等人，Biochem J 1999，344：477-85；Gabai VL等人，Oncogene 2005，24：3328-38)。
诱导型药物抗性的第二个实例是MKP-1磷酸酶，其在转录上被蛋白酶体抑制剂上调(Orlowski RZ等人，J Biol Chem 2002，277：27864-71)。MKP-1是应激反应蛋白，也是抗细胞程序死亡的，通过c-Jun-N-末端激酶的激活而起作用。已经表明了MKP-1的下调能够提高蛋白酶体抑制剂的抗肿瘤效力(Small GW等人，Mol Pharmacol 2004，66：1478-90)。
IL-6在骨髓瘤的发病机理中起关键作用，这是通过其在骨髓微环境中起骨髓瘤细胞的生长和存活因子功能以及激活抗细胞程序死亡过程的能力而证实的，所述抗细胞程序死亡过程降低了对于多种化疗剂的敏感性。已经在几个模型系统中显示了IL-6上调HSP-70的表达。其次，STAT-1，一种通过IL-6信号传导而激活的重要下游转录因子与HSF-1相互作用来促进热激反应的成员的转录。
因此，在寻求更有效、毒性更低以及持续更长的临床反应过程中，证实活性剂的组合在治疗一些癌症和相关或不相关的肌肉消耗以及一些神经或非神经起源的炎性或自身免疫性病症中有价值是很重要的。IL-6抑制剂与蛋白酶体抑制剂的组合的有利作用迄今为止还没有被证实过。
发明概述
本发明涉及治疗个体中疾病的方法，所述方法包括给个体施用有效量的蛋白酶体抑制剂和有效量的白介素-6拮抗剂。本发明方法包括将白介素-6拮抗剂与bortezomib或相关蛋白酶体抑制剂顺序、连续或同时施用。在一个实施方案中，IL6拮抗剂是高亲和性抗-IL6抗体。在另一个实施方案中，IL6拮抗剂是抗-IL6R抗体。
易于用本发明方法治疗的疾病包括癌症、哮喘、炎性疾病和神经疾病。在一个实施方案中，该疾病是癌性疾病或病症。
本发明还提供了预测至少IL-6拮抗剂与至少一种蛋白酶体抑制剂的组合的用途的方法。
附图简述
图1表明了递增浓度的CNTO328对于处理指示时间的多发性骨髓瘤细胞的作用。
图2A-D是柱状图，其表明了与抗体、F105和相关对照Mab或CNTO328以及指示浓度的bortezomib一起培养的指示细胞的相对存活百分比：A)与抗体预培养，然后用指示浓度的bortezomib处理的ANBL-6多发性骨髓瘤细胞，B)与抗体预培养，然后用指示浓度的bortezomib处理的KAS-6多发性骨髓瘤细胞，c)RPMI8226IL6独立性骨髓瘤细胞，和D)同时用CNTO 328和bortezomib处理的ANBL-6多发性骨髓瘤细胞。
图3A-B是柱状图，其表明了在用抗体和bortezomib组合处理的IL6依赖性细胞系ANBL-6(A)和KAX-6(B)中测定的细胞程序死亡的相对增加倍数，其中F105是对照Mab。
图4是用CNTO328或对照Mab以及递增浓度的bortezomib处理后，ANBL-6细胞样本的蛋白凝胶的Western印迹，是针对HSC-70和MKP-1探测的。
图5是柱状图，其表明了在与载体对照(DMSO)或两种浓度的bortezomib以及递增浓度的热激蛋白衰减剂KNK437一起培养的ANBL-6细胞中测定的细胞程序死亡的相对增加倍数。
图6是柱状图，其表明了在MEF细胞中测定的细胞程序死亡的相对增加倍数，所述MEF细胞是与载体对照(DMSO)或两种浓度的bortezomib以及递增浓度的热激蛋白衰减剂KNK437一起培养的HSF-缺乏-/-)或正常(+/+)的。
发明详述
缩写
Ig免疫球蛋白，IgG免疫球蛋白G，IL白介素，IL6白介素-6，IL-6R白介素-6受体，sIL-6R可溶性白介素-6受体，HSF-1热激蛋白转录因子，HSP热激蛋白，MAPK促细胞分裂剂激活的蛋白激酶，MPK-1MAPK磷酸酶，Mab单克隆抗体，STAT信号传导激活。
定义
术语“抗体”在本文中是在最广义上使用，并且具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要他们表现出所希望的生物活性。“抗体片段”包括一部分全长抗体，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“嵌合抗体”是保留来自一个物种的显著区域，通常是可变区的那些抗体，其余部分来自另一物种，例如小鼠-人嵌合体。
本文所用术语“人抗体”意欲包括具有可变区和恒定区的抗体，所述可变区和恒定区源自人种系免疫球蛋白序列或者与人种系免疫球蛋白序列严格匹配。本发明的人抗体可以包括不是被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过随机或位点特异性的体外诱变或通过体内体细胞突变例如在人重链的V、D和J片段的重组期间引入的突变)。因此，本文所用术语“人抗体”是指这样一种抗体，其中该蛋白的基本每个部分(如CDR、构架区、CL、CH结构域(如CH1、CH2、CH3)、铰链区、(VL，VH))与人种系抗体基因基本相似。基于他们的氨基酸序列相似性，人抗体已经被划分为几个组，参见例如http://people.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s/。因此，使用序列相以性搜索，具有相似线性序列的抗体可以选作模板，以产生人或人源化抗体。
对于抗体，本文所用术语“高亲和力”是指抗体具有10-8M或更小，更优选10-9M或更小，甚至更优选10-10M或更小的KD值。本文所用术语“Kdis”或“KD”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速度。“KD”是解离速度(k2)-也称为“off-rate(koff)”与结合速度(k1)或“on-rate(kon)”的比例。因此，KD等于k2/k1或koff/kon，并且以摩尔浓度(M)表示。这意味着，Kd越小，则结合越强。因此，10-6M(或1mM)意味着结合弱于10-9M(或1nM)。
本文所用的“遍在蛋白-蛋白酶体系统”是一个多组分系统，其识别并且降解不需要的蛋白。该系统包括由于其损伤、错折叠或短的活细胞性质而识别不需要的蛋白所需的酶，他们是涉及不需要的蛋白的遍在蛋白化的酶，以及降解性酶，所述降解性酶包括是在细胞核以及胞质中存在的多亚单位复合物的蛋白酶体结构。
本文所用术语“蛋白酶体抑制剂”包括蛋白酶体的肽酶的抑制剂。更具体来说，这些蛋白酶体的肽酶的抑制剂包括，除了巯基蛋白酶和丝氨酸蛋白酶以外，胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样蛋白酶的抑制剂。
对于治疗剂的本文所用术语“药物抗性”，当提及癌细胞时，是指细胞已经实现了对于治疗剂作用的药物抗性，这通常是由于暴露于环境水平或浓度的具有损伤或抑制增殖作用的治疗剂而引起的，或者，与接触以相同水平或浓度的治疗剂的正常或非药物抗性细胞相比，作为与一定水平治疗剂接触的结果，治疗剂的作用被抑制至非常低的程度。对于治疗剂的药物抗性的性质是高度可变的，对于在不同条件下给予的治疗剂，不同癌细胞表现出不同水平的“药物抗性”。
蛋白酶体抑制剂bortezomib代表多发性骨髓瘤治疗中的显著进步，但是其效力受到多种抗药性机制的限制。一个最重要的机制是热激蛋白(HSP)和应激反应途径，该途径经由成员例如HSP-70和氮激活的蛋白激酶(MAPK)磷酸酶(MKP)-1，对抗bortezomib的促细胞程序死亡活性。因为白介素(IL)-6信号传导增强经由信号转导物和转录激活物(STAT)-1以及热激转录因子(HSF)-1的热激反应，申请人假设IL-6信号传导的下调将减弱bortezomib的HSP诱导，由此提高其抗骨髓瘤活性。
使用bortezomib和CNTO 328-一种嵌合型单克隆IL-6中和抗体的组合处理IL-6-依赖性多发性骨髓瘤细胞系KAS-6和ANBL-6，与单独的所述任一药物相比，以时间和浓度依赖性方式导致细胞生存能力显著下降。这与提高的细胞程序死亡有关，在某些情况下，细胞程序死亡大于单独两种治疗剂的加和，这表明存在协同作用。当使用同种型对照抗体，并且在IL-6-独立型RPMI 8226骨髓瘤细胞系的试验中时，没有看到类似结果。当用CNTO 328预处理然后用bortezomib处理细胞时，或者当用这两种治疗剂同时处理细胞时，与用bortezomib处理然后用CNTO 328处理相比，没有看到增加的活性。用CNTO 328处理有效地抑制了IL-6介导的下游信号传导途径，这是通过STAT-3和p44/42MAPK磷酸化的显著阻断而证实的。CNTO 328把bortezomib-介导的HSP70和MKP-1表达的诱导分别降低了45％和90％。显著地，CNTO 328显著降低了转录活性磷酸-STAT-1的水平以及降低了HSF-1的高磷酸化。抑制热激反应的其他策略，包括使用KNK437的药物抑制剂，也得到了与bortezomib的组合的抗骨髓瘤协同作用的证据。KNK437和bortezomib的协同活性在正常小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中再现，但是在HSF-1剔除的MEF中则不明显。综上所述，申请人已经证实了抑制IL-6信号传导增强了bortezomib的抗骨髓瘤活性。他们还支持这样的假设，这至少是部分地通过减弱蛋白酶体抑制剂介导的热激反应诱导而发生的，而减弱该热激反应诱导是经由转录活性STAT-1和HSF-1的下调来实现的。本发明的该教导给以下方法提供了基本原理：将抗IL-6抗体与bortezomib或相关蛋白酶体抑制剂顺序、连续或同时施用来治疗有此需要的个体的方法。
本发明的IL-6拮抗剂
在本发明中使用的IL-6拮抗剂可以是任何起源的，只要其阻断通过IL-6的信号传导，并且抑制IL-6的生物活性。IL-6拮抗剂的实例包括IL-6抗体、IL-6R抗体、gp130抗体、IL-6突变体、IL-6R反义寡核苷酸，以及IL-6或IL-6R的部分肽。用于本发明的IL-6突变体的实例公开在Brakenhoff，等人，J.Biol.Chem.，269，86-93，1994或Savino，等人，EMBO J.，13，1357-1367，1994中。IL-6突变体多肽或其片段不具有IL-6的信号传导作用，但是保留与IL-6R结合的能力，并且通过以取代、删除或插入到IL-6序列内的形式引入突变来产生。虽然对于所用的动物物种没有任何限制，但是优选使用来源于人的IL-6。类似地，任何IL-6部分肽或IL-6R部分肽可以在本发明中使用，只要他们能够阻止IL6或IL6R(gp80)或gp130影响信号传导，并且由此阻止IL-6相关生物活性即可(U.S.专利5,210,075；EP617126有关IL-6部分肽和IL-6R部分肽的详细描述)。在另一个实施方案中，能够实现IL6或IL6R RNA沉默或反义机制的寡核苷酸可以用于本发明方法中(JP5-300338有关IL-6R反义寡核苷酸的详细描述)。
本发明的抗体
可用于本发明的抗体包括分离的嵌合型、人源化和/或CDR-接枝的或人抗体，其具有至少一个能够抑制IL6的生物功能的抗原结合区。本发明抗体的实例包括IL-6结合抗体、IL-6R(gp80)结合抗体、gp130结合抗体。具有合适的抗原结合区的IL-6R抗体的实例包括PM-1抗体(Hirata，等人，J.Immunol.，143，2900-2906，1989)和AUK12-20、AUK64-7或AUK146-15抗体(WO92-19759)。在另一个实施方案中，抗-IL6R抗体是公开在US专利5888510和6121423中的称为MRA的整形抗体。
在一个实施方案中，抗原结合区源自高亲和力CLB-8抗-IL-6抗体。本发明的源自CLB-6的抗体的实例是CNTO328，其描述在本申请人的共同未决申请U.S.Ser.No.10/280716中，该申请的内容引入本文以供参考。在另一个实施方案中，抗体是能够以高亲和力结合IL6的人抗体，其例如描述在本申请人的共同未决申请US临时专利申请系列号60/677,319中。本发明的抗体以高亲和力特异性地中和人IL-6。
可用于本发明方法中的抗-IL-6抗体包括任何蛋白或肽分子，所述蛋白或肽分子包含源自鼠CLB-8单克隆抗体的重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分与重链或轻链恒定区、框架区或可引入到本发明抗体内的其任何部分。在一个实施方案中，本发明涉及抗-IL-6嵌合型抗体，所述抗体包含两个轻链和两个重链，每一所述链包含至少一部分人恒定区和至少一部分源自对人IL-6具有特异性的鼠c-CLB8单克隆抗体的可变区(v)，所述抗体以高亲和力结合人IL-6的抑制性和/或中和性表位，例如抗体cCLB-8。本发明还包括这样的抗体的片段或衍生物，例如抗体链的一个或多个部分，例如重链恒定区、连接区、多样化区或可变区，或轻链恒定区、连接区或可变区。
优选的本发明抗体包括嵌合型、人源化和/或CDR-接枝的或人抗体，所述抗体在体内竞争性地抑制抗-IL-6小鼠CLB-8、嵌合型抗-IL-6CLB-8或具有基本上相同结合特征的抗体及其片段或区域与人IL-6的结合。
本发明的抗体优选以至少10-9M，优选至少10-10M的亲和力(Kd)结合抗-IL6或抗-IL6R，和/或基本上中和至少一种IL-6蛋白的至少一种活性。在优选的实施方案中，抗体以至少1×10-11M，优选5×10-11M的亲和力(Kd)结合IL-6，中和人IL-6。优选地，抗体不结合其他IL-6超家族成员，并且阻断GP130的反式信号传导(trans-signaling)。蛋白酶体抑制剂
蛋白酶体是细胞内结构，其是高度保守的多催化蛋白酶。蛋白酶体是参与重要调控细胞过程的很多蛋白的ATP-依赖性蛋白酶解的原因。因此，蛋白酶体是细胞生长和分化中的调控元件。人细胞平均含有大约30,000个蛋白酶体，每个蛋白酶体含有几种蛋白消化性蛋白酶。这些复合物是在很多细胞功能中，包括转录、细胞周期控制、应激反应、核糖体生物发生以及异常蛋白分解代谢。因此，他们在这样的过程中起作用，例如免疫和炎性反应(WO 95/25533)、病毒感染、瘤形成、神经和肌肉变性(U.S.专利5,340,736)、抗原加工(WO 94/17816)、DNA修复以及细胞分化。蛋白酶体活性被精确地控制以保持对于降解蛋白的速度和特定类型的严格控制。
几个步骤经由蛋白酶体或“遍在蛋白-蛋白酶体”途径参与蛋白降解。最初，蛋白破坏的标记是具有称为遍在蛋白的小多肽链。遍在蛋白化引导蛋白进入蛋白酶体封闭的蛋白酶解室。对于遍在蛋白，需要三种酶活性，E1、E2和E3。ATP-依赖性E1酶激活遍在蛋白，并且将其连接到遍在蛋白-缀合性酶E2上。然后，E3酶，一种遍在蛋白连接酶，将遍在蛋白分子与蛋白连接。该过程不断重复直至指定的多肽拖着一个长的遍在蛋白部分的链，并且蛋白酶体最终把蛋白降解成小片段。遍在蛋白-蛋白酶体途径是细胞中90％所有异常、错折叠蛋白以及所有短寿命、调控蛋白降解的原因。其半寿期小于3小时的这些短寿命蛋白占所有细胞蛋白的10％至20％。该途径还分解很多寿命细胞蛋白。因此，遍在蛋白-蛋白酶体途径是80％至90％所有细胞蛋白降解的原因。
早期报道的蛋白酶体抑制剂包括肽基醛类。这些抑制剂的初步优化提出了优选在P1位具有亮氨酸以及在P2或P3位具有大的疏水性残基例如萘基丙氨酸。因为肽基醛类还表现出有效的巯基蛋白酶(例如钙蛋白酶、组织蛋白酶)抑制作用，并且由于在α-位上的质子的酸性而在构型上是不稳定的，因此研究了对醛基团的替换。
除了最初从放线菌类分离出的抗生素类抑制剂以外，已经合成了多种肽醛类物质，例如Siman等人，(WO91/13904)描述的胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的抑制剂。已经报道了多种蛋白酶体复合物的抑制剂，例如Dick，等人，Biochem.30：2725(1991)；Goldberg，等人，Nature 357：375(1992)；Goldberg，Eur.J.Biochem.203：9(1992)；Orlowski，Biochem.29：10289(1989)；Rivett，等人，Archs.Biochem.Biophys.218：1(1989)；Rivett，等人，J.Biol.Chem.264：12，215(1989)；Tanaka，等人，NewBiol.4：1(1992)。U.S.专利5,693,617中也公开了蛋白酶体抑制剂，其公开内容引入本文以供参考。
优选的蛋白酶体抑制剂是“PS-341”，其成为硼酸二肽蛋白酶体抑制剂bortezomib，(MLN-341、LDP-341和PS-341；N-(吗啉代)羰基)-β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸)，以商标名
Figure A20068004592100131
销售WO96/013266)。PS-341抑制转录因子NF-κB的激活。PS-341还下调几种细胞程序死亡抑制剂的表达，诱导药物抗性多发性骨髓瘤(MM)细胞系和患者细胞的caspase依赖性细胞程序死亡，抑制剂MM细胞与骨髓基质细胞(BMSCs)的结合，以及在骨髓环境中抑制MM生长和存活因子的产生。
与既抑制蛋白酶体又抑制半胱氨酸蛋白酶的肽醛类不同，bortezomib是蛋白酶体的效力更强的选择性抑制剂。相对于其他丝氨酸蛋白酶，包括人白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、胰凝乳蛋白酶和凝血酶，其对于蛋白酶体具有非常高的选择性(＞500倍)。Bortezomib最近被批准用于治疗复发性和顽固性多发性骨髓瘤。在多种肿瘤培养模型中，bortezomib对于肿瘤细胞蛋白酶体活性的抑制与诱导细胞程序死亡有关。
通过与蛋白酶体中活性位点苏氨酸相互作用的药效基团，具体蛋白酶抑制剂分为5类：肽醛类例如CEP1612和MG132，肽硼酸酯类例如bortezomib，肽乙烯基砜类，肽环氧酮类以及β-内酯抑制剂例如lactocystin。下列化合物或其类似物也在本发明中用作蛋白酶体抑制剂：PS-519(1R-[1S，4R，5S]]-1-(1-羟基-2-甲基丙基)-4-丙基-6-氧杂-2-氮杂二环[3.2.1.]庚烷-3，7-二酮)；clasto-lactacystin β-内酯；lactacystin、epoxomicin、CVT634(-5-甲氧基-1-茚满酮-3-乙酰基-亮氨酰基-D-亮氨酰基-1-茚满基酰胺)、TMC96((3-甲基丁酰基-L-苏氨酸N-(1-(2-(羟基甲基)-环氧乙烷-2-基羰基)-3-甲基丁-3-烯基)酰胺)、MG-115、CEP 1612和MG132。
除了蛋白酶体蛋白酶抑制剂以外，遍在蛋白-蛋白酶体途径还可以通过促进酶遍在蛋白-激活酶(E1)、遍在蛋白-缀合酶(E2)和遍在蛋白-连接酶(E3酶)来阻断。已经鉴定了E1抑制剂例如himeic acid A(Tsukamoto，等人，2005，Bioorgan Med Chem Lett 15(1)：191-194)。本领域已知的其他方法例如RNA沉默也可用于降低或消除特定遍在蛋白化相关酶的活性。
监测蛋白酶体抑制活性
US专利6613541中教导了在哺乳动物中监测蛋白酶体抑制剂的药效学药物作用的方法，本发明者们已惊奇地发现，在生物样本中，蛋白酶体活性而不是药物浓度的体外分析提供了监测蛋白酶体抑制剂的药效学药物作用的有用方法，并且该数据给选择将来预施用的蛋白酶体抑制剂的将来剂量以及给药频率提供了指导。
所述方法包括给哺乳动物施用蛋白酶体抑制剂；在施用蛋白酶体抑制剂之后的一个或多个具体时间从哺乳动物获得一个或多个测试生物样本；测定在测试生物样本中的蛋白酶体活性；确定测试生物样本中蛋白酶体活性的量；以及比较测试生物样本中的蛋白酶体活性的量与参照生物样本中的蛋白酶体活性的量，所述参照生物样本是从没有施用蛋白酶体抑制剂的哺乳动物中获得的。
US专利6613541还提供了确定蛋白酶体的给药方案每的方法，确定哺乳动物，包括人中基准蛋白酶体活性的方法，并且提供了测定哺乳动物生物样本中蛋白酶体活性的试剂盒。U.S.专利6,613,541的方法可以在选自血样、尿样和组织活组织检查样本的生物样本上实施。
测定IL6
IL6可以在采用IL6反应性细胞系的生物测定中检测(参见：7TD 1；B9；CESS，KPMM2，KT-3；M1，MH60-BSF-2，MO7E；Mono Mac 6；NFS-60；PIL-6；SKW6-C14；T1165；XG-1)。IL6还可以通过其作为杂交瘤生长因子的活性来测定(参见：HGF)。也可以采用敏感免疫测定和比色测定。另一检测方法是细胞因子的RT-PCR定量测定。还有用于检测受体相关gp130蛋白的ELISA测定(这样的试剂可得自例如R&DSystems)。
为了检测IL6与CNTO328的结合，可以使用在本申请人的共同未决申请U.S.系列号10/280716中公开的抗-ID(抗可变区抗体)来在任何标准免疫测定格式例如ELISA-型测定中进行检测。
可通过本发明方法治疗的疾病
IL6的失控表达可能是参与多种疾病的发病机理的重要因素之一。已经在多种病症中观察到了IL6(以及其他B-细胞分化因子)的过度产生，所述病症是例如类风湿性关节炎，多发性骨髓瘤，Lennert综合征(组织细胞淋巴瘤)，Castleman′s病(具有大量浆细胞渗入的淋巴结病、高γ-球蛋白血、贫血以及增高的急性期蛋白浓度)、心脏粘液瘤和肝硬化。已经观察到了成胶质细胞瘤的IL6的组成型合成以及IL6分泌到脑脊液中。
对于免疫介导的炎性疾病(IMID)，IL6参与慢性多发性关节炎的发病机理(与IL1和IL8一起)，因为在滑液中发现了高浓度的IL6。在炎性肠病中，增高的IL6血浆水平可以是疾病状态的指标。在膜增生性肾小球肾炎中，增高的IL6尿水平也是疾病状态的指标。IL6可以在I型和II型糖尿病的免疫介导的发病机理中起重要作用。
因此，本发明提供了调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种本领域已知的或本文所述的IL-6相关疾病的方法，所述方法使用至少一种本发明的IL-6抗体，例如给细胞、组织、器官、动物或患者施用或者让其接触治疗有效量的IL-6抗体，并且联合施用蛋白酶体抑制剂。本发明还提供了调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种IL-6相关疾病的方法，所述疾病包括但不限于至少一种以下疾病：肥胖、免疫相关疾病、心血管疾病、感染疾病、恶性疾病或神经疾病。
本发明还提供了调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种IL-6相关免疫有关疾病的方法，所述疾病包括但不限于至少一种以下疾病：类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、全身发作的青少年类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊椎炎、胃溃疡、血清反应阴性关节病、骨关节炎、骨质溶解、外科埋植剂的无菌松弛、炎性肠病、溃疡性结肠炎、全身性红斑狼疮、抗磷脂综合征、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、特发性肺纤维变性、系统性血管炎/韦格内氏肉芽肿症、肉样瘤病、睾丸炎/输精管切除术逆转过程、变应性/特应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、过敏性接触性皮炎、变应性结膜炎、过敏性肺炎、移植物、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身炎性反应综合征、脓毒病综合征、革兰氏阳性脓毒症、革兰氏阴性脓毒症、培养物阴性脓毒症、真菌脓毒症、中性白细胞减少症发热、尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、创伤/出血、烧伤、电离辐射暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、酒精诱导的肝炎、慢性炎症性病变、肉样瘤病、Crohn’s病、镰状细胞性贫血、糖尿病、肾病、特应性疾病、过敏反应、变应性鼻炎、花粉热、常年性鼻炎、结膜炎、子宫内膜异位、哮喘、风疹、全身过敏、皮炎、恶性贫血、溶血性疾病、血小板减少症、任何器官或组织的移植物排斥、肾移植排斥、心脏移植排斥、肝移植排斥、胰腺移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、皮肤同种移植物排异反应、软骨移植排斥、骨移植物排斥、小肠移植排斥、胎儿胸腺植入排斥、甲状旁腺移植排斥、任何器官或组织的异种移植物排斥、同种异体移植物排斥、抗受体过敏反应、格雷夫斯病、雷诺氏病、B型胰岛素抵抗性糖尿病、哮喘、重症肌无力、抗体介导的细胞毒性、III型过敏反应、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合征)、多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、皮肤变化综合征、抗磷脂综合征、天疱疮、硬皮症、混合性结缔组织病、原发性阿狄森氏病、糖尿病、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、白斑病、血管炎、MI后心切开术综合征、IV型过敏症、接触性皮炎、过敏性肺炎、同种异体移植物排斥、由于细胞内生物体的肉芽肿、药物过敏、代谢病/自发病、威尔逊氏病、血色素沉着症、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、糖尿病性视网膜病、桥本甲状腺炎、骨质疏松症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评估、原发性胆汁性肝硬化、甲状腺炎、脑脊髓炎、恶病质、纤维囊泡症、新生儿慢性肺病、慢性阻塞性肺病(COPD)、家族性噬血细胞淋巴组织细胞增多病(familial hematophagocyticlymphohistiocytosis)、皮肤病症、牛皮癣、秃顶、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎、急性肾功能衰竭、血液透析、尿毒症、中毒、先兆子痫、okt3疗法、抗cd3疗法、细胞因子疗法、化学疗法、放射疗法(如包括但不限于乏力、贫血、恶病质等)、慢性水杨酸盐中毒等。参见例如theMerck Manual，12th-17th Editions，Merck&Company，Rahway，NJ(1972，1977，1982，1987，1992，1999)，Pharmacotherapy Handbook，Wells等人，eds.，Second Edition，Appleton and Lange，Stamford，Conn.(1998，2000)，其全文引入本文以供参考。
本发明还提供了调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种心血管疾病的方法，所述疾病包括但不限于至少一种以下疾病：心脏晕眩综合征(cardiac stun syndrome)、心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病性粥样硬化病(diabetic aterosclerotic disease)、高血压、动脉性高血压、肾血管性高血压、晕厥、休克、心血管系统梅毒、心力衰竭、肺原性心脏病、原发性肺动脉高压、心律失常、心房异位性博动、心房扑动、心房颤动(持续性或突发性)、灌注后综合征、心肺分流术炎症反应、紊乱性或多源性房性心动过速、规律性窄QRS心动过速、特殊心律失常、心室颤动、希氏束心律失常(His bundle arrythmias)、房室性传导阻滞、束支传导阻滞、心肌局部缺血性病症、冠状动脉疾病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张性充血性心肌病、限制性心肌病、心脏瓣膜疾病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动脉和周围性动脉瘤、主动脉壁夹层形成、主动脉炎症、腹主动脉及其分支闭塞、外周血管病症、闭塞性动脉病症、周围动脉粥样硬化疾病(peripheral atherloscleroticdisease)、血栓闭塞性脉管炎、机能性周围动脉病症、雷诺氏现象和疾病、手足发绀、红斑性肢痛、静脉疾病、血栓静脉炎、曲张静脉、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定心绞痛、再灌注损伤、泵后综合征(post pump syndrome)、缺血-再灌注损伤等。这样的方法可任选地包括施用有效量的包含至少一种抗IL-6抗体的组合物或药物组合物于需要这样的调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者。
本发明还提供了调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种IL-6相关感染疾病的方法，所述疾病包括但不限于至少一种以下疾病：急性或慢性细菌感染，急性或慢性寄生或传染过程，包括细菌、病毒和真菌感染，HTV感染/HIV神经病变、脑膜炎、肝炎(如甲型、乙型或丙型等)、脓毒性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌0157:h7、溶血性尿毒症综合征/溶栓性血小板减少性紫癜、疟疾、登革出血热、利什曼病、麻风病、中毒性休克综合征、链球菌肌炎、气性坏疽、结核分支杆菌、鸟分枝杆菌胞内寄生菌、卡氏肺囊虫性肺炎、盆腔炎症性疾病、睾丸炎/附睾炎、军团杆菌、莱姆病、甲型流感、EB病毒、病毒相关的噬血细胞综合征、病毒性脑炎/无菌脑膜炎等。
本发明还提供了调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种IL-6相关恶性疾病的方法，所述疾病包括但不限于至少一种以下疾病：白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性淋巴细胞性白血病、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性骨髓性白血病(AML)、急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特(Burkitt’s)淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波济氏肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增多症、副肿瘤性综合征/恶性高钙血症、实体瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、头癌、颈癌、遗传性非息肉癌、何杰金氏淋巴瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、睾丸癌、腺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、血管瘤、肿瘤转移性疾病、癌有关的骨吸收、癌有关的骨痛等。
本发明还提供了调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种IL-6相关神经疾病的方法，所述疾病包括但不限于至少一种以下疾病：神经变性疾病、多发性硬化症、偏头痛、AIDS痴呆综合征、脱髓鞘性病，例如多发性硬化和急性横贯性脊髓炎；锥体束外和小脑病症，例如皮质脊髓系统损害；基底神经节病症；运动机能亢进的运动障碍，例如亨廷顿氏舞蹈病和老年性舞蹈病；药物诱发的运动障碍，例如为阻断CNS多巴胺受体的药物所诱发的那些病症；运动机能减退的运动障碍，例如帕金森病；进行性前核麻痹(Progressive supranucleoPalsy)；小脑结构损害；脊髓小脑变性，例如脊髓性共济失调，弗里德赖希氏共济失调，小脑皮质变性，多系统变性病(Mencel，Dejerine-Thomas，Shi-Drager和Machado-Joseph)；全身性病症(雷弗素姆氏病，一种β-脂蛋白血症，共济失调，毛细血管扩张和线粒体多系统病症)；脱髓鞘核病症(demyelinating core disorders)，例如多发性硬化，急性横贯性脊髓炎；以及运动单元病症例如神经性肌萎缩(前角细胞变性，例如肌萎缩性(脊髓)侧索硬化、婴儿型脊髓性肌萎缩和青少年脊髓性肌萎缩)；阿尔茨海默氏病；中年人中的唐氏综合征；弥漫性雷维小体病；雷维小体型老年性痴呆；韦尼克-科尔萨科夫综合征；慢性酒精中毒；克罗伊茨费尔特-雅各布病；亚急性硬化性全脑炎、Hallerrorden-Spatz病；拳击员痴呆；神经外伤(如脊髓损伤、脑损伤、脑震荡、重复性脑震荡)；疼痛；炎性痛；孤独症；抑郁症；中风；认知障碍；癫痫等。这样的方法可任选地包括施用有效量的包含至少一种TNF抗体或特定部分或变体的组合物或药物组合物于需要这样的调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者。参见如the MerckManual，第16版，Merck&Company，Rahway，NJ(1992)。
给药方法
本发明方法包括施用有效量的包含至少一种抗IL-6抗体的组合物或药物组合物于需要这样的调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者，并且联合给予包括施用蛋白酶体抑制剂的治疗联合。本发明方法包括治疗这样的疾病或病症，其中使用所述至少一种IL-6拮抗剂。本发明方法还包括将IL-6拮抗剂与蛋白酶体抑制剂联合给药，其中蛋白酶体抑制剂在IL-6拮抗剂施用之前、同时和/或之后施用。在一个具体实施方案中，所述IL6拮抗剂是阻止或抑制IL6的生物功能的抗体，例如中和性IL6抗体或抗-IL6R抗体，并且所述蛋白酶体抑制剂选自PS-314(bortezomib)、PS-519；clasto-1actacystinβ-内酯；lactacystin、epoxomicin、CVT634、TMC96、MG-115、CEP1612和MG132。
典型地，通过施用有效量或剂量的至少一种抗IL-6抗体组合物进行病理病症的治疗，取决于组合物中所含有的活性剂的比活性，有效量或剂量合计平均至少约0.01-500毫克至少一种抗IL-6抗体/公斤患者/剂量，以及优选地，至少约0.1-100毫克抗体/公斤患者/剂量或多次施用。或者，有效的血清浓度可包括1-5000μg/ml血清浓度/单次或多次施用。适合的剂量为医学从业者所知，且当然应取决于具体的疾病状况、施用的组合物的比活性以及患者所经历的具体治疗。在某些情况下，为达到期望的治疗量，可能需要提供重复施用，即重复具体监测或计量的剂量的单独施用，其中重复单独施用直至达到期望的日剂量或效果为止。
为了胃肠外给药，抗体或蛋白酶体抑制剂可与药学上可接受的胃肠外载体结合或单独提供配制为溶液、悬浮液、乳剂、颗粒剂、粉剂或冻干粉末。这样的载体的例子是水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和1-10％人血清白蛋白。还可使用脂质体和非水载体例如固定油类。载体或冻干粉末可含有保持等渗性(如氯化钠、甘露糖醇)和化学稳定性(如缓冲剂和防腐剂)的添加剂。通过已知或适合的技术灭菌制剂。
适合的药物载体描述于最近一版的该领域标准参考教科书Remington′s Pharmaceutical Sciences，A.Osol中。
给药
根据本发明，可使用多种已知和开发的方式施用药学有效量的根据本发明的IL-6拮抗剂和蛋白酶体抑制剂。虽然胃肠外给药是典型的，但是可使用根据本发明具有适合结果的其他给药方式。利用适合于吸入给药或在本文中描述的或本领域已知的其他给药方式的多种装置和方法的任何一种，本发明组合物可处于载体中，作为溶液、乳剂、胶体或悬浮液液或作为干粉递送。
其他给药方式包括皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、损害部位内、快速浓注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮装置。
实施例1：抗-IL抗体与蛋白酶体抑制剂的组合的活性
基于假设，嵌合型单克隆IL-6中和性抗体CNTO 328的IL-6抑制将通过减弱bortezomib介导的HSP-70的上调而增强蛋白酶体抑制剂bortezomib的抗骨髓瘤活性，设计和实施以下试验。
A.用单克隆抗体CNTO 328抑制IL-6信号传导降低了IL-6-依赖性多发性骨髓瘤细胞系ANBL-6和KAS-6的细胞存活力。
将ANBL-6和KAS-6细胞(Dr.Diane Jelinek，Mayo Clinic，Rochester，MN)与递增浓度的CNTO 328或同种型对照抗体F105一起培养24和48小时。对于最后4小时，将细胞在WST-1(Roche AppliedScience，Indianapolis，IN)存在下培养。使用ELISA平板读数器在450nM吸收度测定WST-1被活细胞还原成水溶性甲
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盐。测定的存活力以相对于未处理细胞的存活百分比表示。所有细胞都是在含有10％FBS和1ng/mL IL-6的RPMI 1640培养基中处理。
结果在图1中显示(值是一式五份培养物的平均值；条形图，SEM)。用CNTO 328处理ANBL-6和KAS-6细胞导致细胞存活力的剂量和时间依赖性降低。KAS-6细胞对IL-6抑制作用的反应比ANBL-6细胞敏感得多。
B.CNTO 328增强bortezomib在IL-6-依赖性骨髓瘤细胞中的抗骨髓瘤活性
将ANBL-6、KAS-6或IL-6-依赖性RPMI 8226骨髓瘤细胞系与0.1mcg/ml(KAS-6)或10mcg/ml(ANBL-6和RPMI 8226)对照抗体F105或CNTO 328预培养24小时，然后与DMSO对照或递增浓度的bortezomib在F105或CNTO 328的继续存在下一起再培养24小时。对于测序实验，将ANBL-6细胞：1)用F105或CNTO 328处理24小时，然后用F105或CNTO 328和bortezomib 5nM再处理24小时(抗体→bortezomib)；2)用F105或CNTO 328与bortezomib 5nM同时处理24小时(抗体+bortezomib)，或者用bortezomib 5nM处理12小时，然后用F105或CNTO 328处理24小时(bortezomib→抗体)。如上所述测定细胞存活力，并且测定相对于未处理细胞的存活百分比。所有细胞都是在含有10％FBS和1ng/mL IL-6的RPMI 1640培养基中处理。柱状图，一式五份培养物的平均值；条形图，SEM。
ANBL-6和KAS-6细胞与CNTO 328预培养增强了bortezomib的细胞毒性，这是由相对于用对照抗体F105预处理的细胞，细胞存活力的显著降低而证实的(图12A和B)。CNTO 328没有增强IL-6-独立性骨髓瘤细胞系中bortezomib的活性，RPMI 8226(组C)。CNTO 328增强了bortezomib的细胞毒性，当ANBL-6细胞用CNTO 328预处理，然后用bortezomib处理，或者同时用CNTO 328和bortezomib处理时增强的程度最大。相反，当细胞用bortezomib处理时，CNTO 328具有很小的另外作用(组D)。
C.用CNTO 328抑制IL-6信号传导增强了IL-6-依赖性多发性骨髓瘤细胞系ANBL-6和KAS-6的bortezomib介导的细胞程序死亡
将ANBL-6和KAS-6细胞用10mcg/ml(ANBL-6)或1mcg/ml(KAS-6)CNTO 328或对照抗体F105培养8(ANBL-6)至12(KAS-6)小时。使用基于ELISA的分析来测定细胞程序死亡，该分析是测定单和寡核小体的存在(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)，并且以相对于DMSO和F150处理对照的细胞程序死亡增加倍数来表示。细胞是在含有10％FBS和1ng/mL IL-6的RPMI 1640培养基中处理(图3A和B，柱高度代表一式三份培养物的平均值，条形图，SEM)。
用CNTO 328和bortezomib处理ANBL-6和KAS-6细胞使得与用单独所述任一药物处理的细胞细胞，细胞程序死亡的诱导增强。CNTO328不能增强IL-6-独立性骨髓瘤细胞系RPMI 8226中的细胞程序死亡(数据未显示)。
D.CNTO 328下调白介素-6信号传导并且减弱ANBL-6细胞中bortezomib介导的抗细胞程序死亡的MKP-1和HSP-70的诱导。
将ANBL-6细胞和10mcg/ml CNTO 328或对照抗体F105，以及与或不与递增浓度的bortezomib一起培养8小时。制备细胞溶胞物，并且进行免疫印迹分析。提取印迹，并且探测HSC-70以保证每条道有相等的蛋白载量。在HSP-70和MKP-1免疫印迹上进行光密度测定。
用CNTO 328处理ANBL-6细胞导致IL-6信号传导的下游介质显著减少，这是由磷酸-p42/44MAPK和磷酸-STAT-3的水平降低所证实的(图4)。显著地，增加剂量的bortezomib还降低了磷酸-STAT-3和磷酸-p42/44MAPK的水平。这些数据表明bortezomib干扰IL-6信号传导(还报道于Hideshima T等人，Oncogene 2003，22：8386-93)。此外，CNTO 328干扰bortezomib-介导的HSP-70和MKP-1的诱导，分别干扰了45％和90％，这与转录活性磷酸-STAT-1和高磷酸化HSF-1的水平下降有关。
E.KNK437增强了bortezomib介导的ANBL-6和HSF-1+/+MEF细胞的细胞程序死亡。
将ANBL-6或MEF细胞(对照和HSF-1-/-)与DMSO对照或递增浓度的bortezomib和KNK437培养12(ANBL-6)至24小时(MEF)。如上所述测定细胞程序死亡，并且以相对于DMSO处理的对照的增加倍数来表示。将ANBL-6细胞在含有10％FBS和1ng/mL IL-6的RPMI 1640培养基中处理(图5，一式三份培养物的平均值，条形图，SEM)。
用KNK437处理ANBL-6细胞导致与对照处理的细胞相比，bortezomib介导的细胞程序死亡显著增强。bortezomib介导的细胞程序死亡在HSF-1-/-MEF中相对于MEF则不明显(图6)，这意味着该组合的提高的活性是由于热激蛋白反应的下调所致。
CNTO328与Bortezomib的组合的结果的概述
IL-6中和性抗体CNTO 328以剂量和时间依赖性方式降低了多发性骨髓瘤细胞系ANBL-6和KAS-6的存活力。
用CNTO 328处理ANBL-6和KAS-6细胞增强了bortezomib的抗骨髓瘤活性，这是通过与对照抗体和bortezomib相比，细胞存活力的降低以及细胞程序死亡的增强而证实的。当把细胞先后用bortezomib和CNTO 328处理而不是以相反顺序处理时，CNTO 328的抗骨髓瘤活性降低了，这也许是由于bortezomib能够下调IL-6信号传导的重要下游介质，或者是由于较早上调热激蛋白反应的成员。
用CNTO 328处理ANBL-6和KAS-6细胞导致IL-6信号传导的下调，这是由磷酸-STAT-3和磷酸-p42/44MAPK水平的显著下降而显示的。Bortezomib还以浓度依赖性方式下调磷酸-STAT-3和磷酸-p42/44MAPK水平。
CNTO 328和bortezomib的组合的提高的活性与降低的bortezomib介导的抗细胞程序死亡的HSP-70和MKP-1的积聚有关。降低的HSP-70诱导与磷酸-STAT-1和高磷酸化HSF-1的降低的水平有关。
用KNK437处理ANBL-6和KAS-6细胞提高了bortezomib的细胞程序死亡活性，这部分是由于其能够干扰热激蛋白反应的诱导，由以下事实证实：在HSF-1-阴性小鼠胚胎成纤维细胞中，该提高的细胞程序死亡作用非常不明显。
综上所述，上面的数据给将bortezomib/CNTO 328组合扩展到临床试验，并且设计目标是下调对bortezomib抗性的其他新策略(例如HSP-70、MKP-1的抑制剂)提供了原理。

Claims (18)

1.治疗需要治疗的哺乳动物中癌性疾病或病症的方法，所述方法包括联合施用蛋白酶体抑制剂和IL-6拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中所述IL-6拮抗剂是抗体或其片段。
3.权利要求2的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.权利要求2的方法，其中所述抗体或片段结合IL6。
5.权利要求2的方法，其中所述抗体或片段结合IL-6受体。
6.权利要求3或4的方法，其中所述抗体片段是Fab、Fab′或F(ab′)2片段或其衍生物。
7.权利要求3的方法，其中所述单克隆抗体与单克隆抗体cCLB8竞争对人IL6的结合。
8.权利要求3的方法，其中所述单克隆抗体是静脉内给药。
9.权利要求3的方法，其中所述单克隆抗体以0.01mg/kg至12.0mg/kg体重的量给药。
10.权利要求3的方法，其中所述单克隆抗体以快速浓注剂量给药，然后输注所述抗体。
11.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人患者。
12.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自硼酸二肽蛋白酶体抑制剂bortezomib、PS-519(1R-[1S，4R，5S]]-1-(1-羟基-2-甲基丙基)-4-丙基-6-氧杂-2-氮杂二环[3.2.1.]庚烷-3，7-二酮)；clasto-lactacystinβ-内酯；lactacystin、epoxomicin、CVT634(-5-甲氧基-1-茚满酮-3-乙酰基-亮氨酰基-D-亮氨酰基-1-茚满基酰胺)、TMC96((3-甲基丁酰基-L-苏氨酸N-(1-(2-(羟基甲基)-环氧乙烷-2-基羰基)-3-甲基丁-3-烯基)酰胺)、MG-115、CEP1612和MG132。
1 3.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂是硼酸二肽蛋白酶体抑制剂bortezomib。
14.权利要求1的方法，其中所述癌性疾病或病症是至少一种选自以下的疾病：白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波济氏肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、肾细胞癌、前列腺细胞癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增多症、副肿瘤性综合征/恶性高钙血症、实体瘤、腺癌、肉瘤和恶性黑色素瘤。
15.权利要求1的方法，其中所述抗-IL6拮抗剂与蛋白酶体抑制剂顺序、连续或同时施用。
16.抑制有此需要的哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述方法包括给所述哺乳动物联合施用能有效抑制所述肿瘤生长的量的蛋白酶体抑制剂与单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体或其片段能够阻止IL6经由膜结合受体的信号传导激活。
17.预防哺乳动物中肿瘤转移的方法，所述方法包括给所述哺乳动物联合施用能有效预防所述哺乳动物中肿瘤转移的量的蛋白酶体抑制剂与单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体或其片段能够阻止IL6经由膜结合受体的信号传导激活。
18.权利要求3、16或17任一项的方法，其中所述抗体是cCLB8或其片段。
19.治疗需要治疗的哺乳动物中IL-6相关疾病或病症的方法，所述方法包括联合施用蛋白酶体抑制剂和IL-6拮抗剂。
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