EA014675B1 - Способ применения антагонистов il-6 с ингибиторами протеасом - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу лечения ракового заболевания или связанного с IL-6 нарушения или состояния у млекопитающего, включающего совместное введение ингибитора протеасом с антагонистом IL-6.

Description

Настоящее изобретение относится к применению ингибитора протеасом в комбинации с антагонистом интерлейкина-6 для усиления ответа на лечение у индивида, получающего лечение в отношении таких заболеваний, как рак. Настоящее изобретение также относится к способам лечения рака у индивида путем введения индивиду эффективного количества ингибитора протеасом и эффективного количества антагониста интерлейкина-6. Настоящее изобретение относится, в частности, к антителам, в том числе к определенным частям или вариантам, специфичным в отношении белка интерлейкина-6 (1Ь-6 известен также как интерферон β2)).

Уровень техники Цитокин 1Ь-6

1Ь-6 (интерлейкин-6) является секретируемым гликопротеином с массой 22-27 кДа, ранее известным как моноцитарный фактор роста В-клеток человека, стимулирующий В-клетки фактор 2, В8Е-2. интерферон бета-2 и гибридомный фактор роста, который обладает как стимулирующей рост активностью, так и провоспалительной активностью (Нйапо с! а1. Ыа!иге 324: 73-76, 1986).

1Ь-6 принадлежит семейству гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (О-С8Е) и миеломоноцитарного фактора роста (МОЕ), которое включает ингибирующий лейкоз фактор (Ь1Е) , онкостатин М (О8М), цилиарный нейротрофический фактор (СЫТЕ), кардиотропин-1 (СТ-1), 1Ь-1 и 1Б-11. 1Ь-6 продуцируется рядом типов клеток, наиболее значительно антигенпрезентирующими клетками, Тклетками и В-клетками. Все цитокины типа 1Ь-6 действуют посредством рецепторных комплексов, содержащих обычный трансдуцирующий сигнал белок, др 130 (ранее известный как 1Ь-6В-бета). Однако, если 1Ь-6, 1Б-11, СТ-1 и СЫТЕ связываются сначала со специфичными рецепторными белками, которые затем связываются с др130, то ЫЕ и О8М непосредственно связываются с комплексом ЫЕ-В и др 130. Специфичный 1Ь-6-рецептор (1Б-6В или 1Ь-6-альфа, др80 или СЭ126) существует либо в мембраносвязанной, либо в растворимой форме (81Б-6В, форме с массой 55 кДа), каждая из которых способна активировать др130.

Известно несколько агентов, индуцирующих экспрессию 1Ь-6, например 1Ь-1, 1Ь-2, ТЫЕа, 1Ь-4, 1ЕЫа, онкостатин и ЬР8. 1Ь-6 принимает участие в разнообразных функциях, таких как активация В- и Тклеток, гематопоэз, активность остеокластов, рост кератиноцитов, синтез белка острой фазы, рост нейронов и активация гепатоцитов (Нйаио е! а1. Ιη!. Веу. 1ттипо1; 16(3-4) :249-84, 1998).

Хотя 1Ь-6 вовлечен во многие пути, мыши с нокаутом 1Ь-6 имеют нормальный фенотип, они являются жизнеспособными и фертильными и обнаруживают слегка повышенное количество Т-клеток и пониженную реакцию белка острой фазы на повреждение ткани (Кор! М., е! а1. Ыа!иге: 368:339-42, 1994). Напротив, у трансгенных мышей, которые сверхэкспрессируют церебральный 1Ь-6, развивается неврологическое заболевание, такое как нейродегенерация, астроцитоз, церебральный ангиогенез, и эти мыши не имеют гематоэнцефалического барьера (СатрЬе11 е! а1. ΡΝΆ8 90: 10061-10065, 1993).

Роль 1Ь-6 при раке

Предполагается, что 1Ь-6 участвует в патофизиологии нескольких злокачественных заболеваний посредством различных механизмов. Существует гипотеза, что 1Ь-6 является причинным фактором связанного с раком осложнения, такого как астения/кахексия и резорбция кости. Было обнаружено, что индуцированная опухолью кахексия (Саййп е! а1. (2000) Сапсег Век; 60 (19):5488-9), резорбция костей и ассоциированная гиперкальциемия уменьшаются у мышей с нокаутом 1Ь-6 (8апбйи е! а1., 1999). Связанная с раком депрессия и отек мозга, являющиеся вторичными нарушениями при опухолях мозга, также связаны с высоким уровнем 1Ь-6 (Микке1тап е! а1. Ат 1 РкусЫайу.; 158 (8) :1252-7, 2001).

Результаты экспериментов на ряде моделей ш νί!το и ш νίνο различных типов рака человека показали, что 1Ь-6 является терапевтической мишенью ингибирования. 1Ь-6 может индуцировать пролиферацию, дифференцировку и выживание опухолевых клеток, стимулирует апоптоз (1ее е! а1. Опсодепе 20: 198-208, 2001) и индуцирует устойчивость к химиотерапии (Сопхе е! а1. Сапсег Век 61: 8851-8858, 2001).

Множественная миелома является злокачественной опухолью, относящейся к плазматическим клеткам. Известно, что 1Ь-6 усиливает пролиферацию, дифференцировку и выживание злокачественных плазматических клеток при множественной миеломе (ММ) за счет аутокринного или паракринного механизма, который включает ингибирование апоптоза злокачественных клеток. Таким образом, было сделано предположение, что блокирование 1Ь-6 может быть эффективной терапией (Апбеткоп е! а1. Нета!о1оду: 147-165, 2000) . Выполнялись эксперименты как ш νίύΌ (Таккопе, Р. е! а1. 1п!. 1. Опсо1. 21(4): 867-873, 2002), так и клинические исследования (Ва!а111е е! а1. (1995) В1ооб; 86(2): 685-91 и Уап 2аапеп, е! а1. (1996) 1 Сйп. 1пуек1. 98: 1441-1448), и результаты показали, что блокада 1Ь-6 оказывает воздействие на рост раковых клеток.

Протеасомный путь в качестве терапевтической мишени

Данные недавних экспериментов явно указывают, что ингибиторы протеасом могут, действительно, быть эффективными при некоторых патологиях, таких как рак, астма, инфаркт головного мозга и аутоиммунный энцефаломиелит. При раке действие таких лекарственных средств заключается в ингибировании деградации различных ингибиторов клеточного цикла или ингибировании антиапоптотического ре

- 1 014675 гулятора ΝΡ-кВ, тогда как при нейропротекции их воздействие связано с ингибированием активации ΝΡκΒ, который в данном случае индуцирует воспалительную реакцию. При аутоиммунных заболеваниях ингибиторы протеасом могут воздействовать путем ингибирования презентации собственных пептидов, а также влияя на передачу сигнала по клеточному иммунному каскаду.

Содержащий борную кислоту дипептидный ингибитор протеасом Р8-341, бортезомиб (УЕЬСАОЕ®), является первым одобренным терапевтическим средством, известным как сильнодействующий и специфичный ингибитор протеасом. Хотя бортезомиб важен для улучшения лечения миеломы, лишь 27% пациентов, с резистентностью к лечению или с рецидивом заболевания, имели частичный ответ или улучшение результатов в клинических испытаниях начальной фазы II, что привело к одобрению их ΕΌΑ (Ктсйатбюп Р.С. е! а1., N Епд1. I Меб. 2003, 348: 2609-17). В преклинических испытаниях были идентифицированы важные медиаторы индуцируемой химиорезистентности, в том числе антиапоптотические пути, активируемые под воздействием ингибиторов протеасом, ослабляя тем самым их противоопухолевую активность (обзор в 8а1ей А е! а1., №11 Се11 Βίο1. 2000, 2: 476-83).

Одним из механизмов химиорезистентности ингибиторов протеасом является индукция экспрессии Н8Р-70, важного ингибитора апоптоза. Ингибирование протеасомы приводит к накоплению неправильно уложенных белков и чрезмерной активации членов семейства белков теплового шока, особенно Н8Р-70, посредством активации фактора транскрипции НМ-1.5-8. Была выдвинута гипотеза, что терапевтические средства, которые подавляют индукцию Н8Р-70, могут стимулировать активность ингибиторов протеасом. В других исследованиях ингибирование экспрессии Н8Р-70 с помощью 81РНК или способов с использованием антисмысловых последовательностей вызывала проапоптотическую активность ингибиторов протеасом на других преклинических моделях рака (РоЬеПюп Ι.Ό. е! а1., Вюсйеш I 1999, 344: 477-85; ОаЬа1 У.Ь. е! а1., Опсодепе 2005, 24: 3328-38).

Вторым примером агента индуцируемой химиорезистентности является фосфатаза МКР-1, которая транскрипционно активируется ингибиторами протеасом (Ог1отек1 Κ..Ζ. е! а1, I Βίο1. Сйеш. 2002, 277: 27864-71). Фосфатаза МКР-1 является белком стрессовой реакции, который также является антиапоптотическим, действующим посредством инактивации с-1ип-№концевой киназы. Было показано, что ингибирование МКР-1 усиливает противоопухолевую эффективность ингибиторов протеасом (8ша11 С.\У. е! а1, Мо1. Рйатшасо1. 2004, 66: 1478-90).

1Ь-6 играет центральную роль в патогенезе миеломы, на что указывает ее способность функционировать в качестве фактора роста и выживания миеломных клеток в микроокружении костного мозга, и активировать антиапоптотическую программу, которая снижает чувствительность к различным химиотерапевтическим средствам. Было показано, что 1Ь-6 активирует экспрессию Н8Р-70 в нескольких модельных системах. Во-вторых, 8ТАТ-1, важный фактор транскрипции конечных этапов сигнального пути, активируемый сигналом 1Ь-6, взаимодействует с Н8Е-1, стимулируя транскрипцию членов семейства белков теплового шока.

Таким образом, при поиске более эффективных, менее токсичных и более длительных клинических ответов важно показать комбинацию агентов, эффективных в лечении определенных типов рака и связанных или не связанных с резким истощением мышц, а также с определенными аутоиммунными нарушениями нейронального или ненейронального происхождения. До сих пор не были показаны эффективные комбинации ингибиторов цитокина 1Ь-6 и ингибиторов протеасом.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения заболевания у индивида путем введения индивиду эффективного количества ингибитора протеасом и эффективного количества антагониста 1Ь-6. Способ по изобретению включает введение антагониста 1Ь-6 последовательно, периодически или одновременно с бортезомибом или соответствующими ингибиторами протеасом. В одном из вариантов осуществления антагонист 1Ь-6 является высокоаффинным анти-1Е-6-антителом. В другом варианте осуществления антагонист 1Ь-6 является анти-1Б6В-антителом.

Заболевание, подлежащее лечению способом по изобретению, включает рак, астму, воспалительное заболевание и неврологическое заболевание. В одном из вариантов осуществления заболевание представляет собой рак.

Настоящее изобретение также относится к способу прогнозирования применимости комбинации по меньшей мере одного антагониста 1Ь-6 и по меньшей мере одного ингибитора протеасом.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан график, демонстрирующий эффект действия увеличивающейся концентрации СКТО328 на клетки множественной миеломы, обработанные указанное число раз.

На фиг. 2Ά-Ό показаны столбчатые диаграммы, представляющие относительную процентную жизнеспособность указанных клеток, инкубированных антителом, Ρ105, и иррелевантным контрольным МаЬ или СКТО328 и указанной концентрацией бортезомиба: Ά) клетки множественной миеломы ΑΝΒΕ-6, прединкубированные с антителом, а затем обработанные бортезомибом при указанной концентрации, В) клетки множественной миеломы КА8-6, прединкубированные с антителом и затем обработанные бортезомибом при указанной концентрации, С) 1Ь-6-независимые миеломные клетки РРМ18226 и Ό) клетки

- 2 014675 множественной миеломы ΑΝΒΕ-б, обработанные одновременно СЫТО328 и бортезомибом.

На фиг. 3А-В показаны столбчатые диаграммы, представляющие относительное кратное увеличение апоптоза, измеренного в 1Ь-б-зависимых клеточных линиях ΑΝΒΕ-б (А) и КАХ-б (В), обработанных комбинациями антитела и бортезомиба, где Р105 является контрольным МаЬ.

На фиг. 4 показан Вестерн-блот геля с белками клеточных образцов ΑΝΒΕ-б после обработки СNТО328 или контрольным МаЬ и увеличивающимися концентрациями бортезомиба, с меткой на Н8С70 и МКР-1.

На фиг. 5 показана столбчатая диаграмма, представляющая относительное кратное увеличение апоптоза, измеренного в клетках ΑΝΒΕ-б, инкубированных с контролем-носителем (ДМСО) или двумя концентрациями бортезомида и увеличивающимися концентрациями аттенуатора белков теплового шока ΚΝΚ.437.

На фиг. б показана столбчатая диаграмма, показывающая относительное кратное увеличение апоптоза, измеренного в клетках МЕР, которые являются дефицитными (-/-) или нормальными (+/+) по Н8Р, инкубированных с контролем-носителем (ДМСО) или двумя концентрациями бортезомиба и увеличивающимися концентрациями аттенуатора белков теплового шока ΚΝΚ437.

Подробное описание изобретения Аббревиатуры

1д - иммуноглобулин; 1§С - иммуноглобулин С; 1Б - интерлейкин; 1Б-6 - интерлейкин-б; ГБ-бВ - рецептор интерлейкина-б; 81Б-6В - растворимый рецептор интерлейкина-б; Н8Р-1 - фактор транскрипции белка теплового шока; Н8Р - белок теплового шока; МАРК - активируемая митогеном протеинкиназа; МРК-1, МАРК - фосфатаза; МаЬ, моноклональное антитело; 8ТАТ - фактор активации трансдукции сигнала.

Определения

Термин антитело используется в данном контексте в самом широком смысле и конкретно включает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела, (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, с длиной, позволяющей проявлять желаемую биологическую активность. Фрагменты антител содержат часть полноразмерного антитела, обычно антигенсвязывающий или вариабельный домен антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2 и Ρν; димерные антитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.

Химерные антитела являются антителами, которые сохраняют различные домены, обычно вариабельный домен, одного вида и остальную часть другого вида; например химеры мышь-человек.

Термин антитело человека включает в этом контексте антитела с вариабельной и константной областями, полученные из последовательностей зародышевой линии человека или близкородственных последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфичным мутагенезом ίη νίίτο или соматической мутацией ίη νίνο, например, во время рекомбинации сегментов V, Ό и 1 тяжелой цепи иммуноглобулина человека). Таким образом, в контексте настоящего изобретения, термин антитело человека относится к антителу, в котором, по существу, каждая часть этого белка (например, СОВ, каркасная область, С_ь-, С_Н-домены (например, С_Н1, С_Н2, С_Н3), шарнирная область, (У_ь, У_Н)) является, по существу, аналогичной частям, кодируемым генами антитела зародышевой линии человека. Антитела человека были классифицированы в группы на основании сходства их аминокислотной последовательности, см., например, ййр://реор1е.сту81:.ЬЬк.ас.ик/~иЬсд078/. Таким образом, при использовании поиска на сходство последовательностей антитело со сходной линейной последовательностью может быть выбрано в качестве шаблона для отбора или создания антител человека или гуманизированных антител.

В данном контексте термин высокая аффинность в применении к антителу обозначает антитело, имеющее К_с 10^-8 М или менее, более предпочтительно 10^-9 М или менее и даже более предпочтительно 10^-10 М или менее. Термин К,|_|;. или К_с или Кб, в данном контексте, относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. К_с является отношением скорости диссоциации (к₂) , также обозначаемой (к_о££), к скорости ассоциации (к_£) или также обозначаемой (к_оп). Таким образом, Ки равна к2/к1 или к_о££/к_оп и выражается в виде молярной концентрации (М). Отсюда следует, что чем меньше К_с, тем сильнее связывание. Так, 10^-6 М (или 1 мМ) свидетельствует о слабом связывании по сравнению с 10^-9 М (или 1 нМ).

В этом контексте система убиквитин-протеасома является мультикомпонентной системой, которая идентифицирует и деградирует нежелательные белки. Эта система включает ферменты, необходимые для распознавания нежелательных белков в результате их повреждения, неправильной укладки или короткоживущих в клетке белков, которые представляют собой ферменты, связанные с убиквитинилированием нежелательных белков, а также ферменты, которые содержат протеасомную структуру, которая является мультисубъединичным комплексом, обнаруживаемым как в ядре, так и в цитозоле.

- 3 014675

В данном контексте термин ингибитор протеасом включает ингибиторы пептидаз протеасомы. Более конкретно, эти ингибиторы пептидаз протеасомы включают ингибиторы химотрипсинподобных и трипсинподобных протеаз наряду с тиоловыми и сериновыми протеазами.

В данном контексте термин резистентный в отношении терапевтического средства при ссылке на раковые клетки обозначает, что эта клетка приобрела резистентность к воздействию этого средства, обычно вызываемую действием средства с определенным уровнем или концентрацией в окружающей среде этого средства, что нарушает или ингибирует пролиферацию, или клетка ингибируется до очень низкой степени при взаимодействии с таким уровнем терапевтического средства по сравнению с ситуацией, когда нормальные или нерезистентные клетки приводят в контакт с тем же самым уровнем или с той же самой концентрацией такого терапевтического средства. Свойство быть резистентным к терапевтическому средству является в высокой степени изменчивым свойством, причем разные типы раковых клеток проявляют различные уровни резистентности к конкретному терапевтическому средству при различных условиях.

Ингибитор протеасом бортезомиб позволяет достичь значительного прогресса в лечении множественной миеломы, но его эффективность ограничивается рядом механизмов резистентности. Одним из наиболее важных является путь белков теплового шока (Н8Р) и путь стрессовых реакций, которые посредством таких членов, как Н8Р-70 и фосфатаза (МКР)-1 активируемой митогеном протеинкиназы (МАРК), противостоят проапоптотической активности бортезомиба. Поскольку передача сигнала интерлейкина (1Ь)-6 повышает реакцию теплового шока через трансдуктор сигнала и активатор транскрипции (8ТАТ)-1 и фактор транскрипции теплового шока (Н8Р)-1, авторы настоящей заявки высказали гипотезу, что отрицательная регуляция передачи сигнала 1Ь-6 могла бы ослаблять индукцию Н8Р бортезомибом, усиливая посредством этого его антимиеломную активность.

Обработка 1Ь-6-зависимых линий клеток множественной миеломы КА8-6 и АИВЬ-6 комбинацией бортезомиба и СИТО 328, химерным моноклональным нейтрализующим 1Ь-6 антителом, приводила к более значительному уменьшению жизнеспособности клеток, чем любым из этих средств по отдельности, зависимым от времени и концентрации образом. Это было связано с повышенной индукцией апоптоза, которая, при некоторых условиях, была более высокой, чем сумма действий этих двух индивидуальных агентов по отдельности, что предполагает синергическое взаимодействие. Подобные результаты не наблюдали при использовании изотипически сходных контрольных антител и при исследованиях 1Ь6-независимой линии клеток миеломы РРМ1 8226. Повышенную активность наблюдали при обработке клеток антителом СИТО 328 последующей обработкой бортезомибом или при их обработке обоими агентами одновременно по сравнению с обработкой бортезомибом с последующей обработкой СИТО 328. Обработка антителом СИТО 328 значительно ингибировала 1Ь-6-опосредованные последующие пути передачи сигнала, как показано заметной блокадой фосфорилирования 8ТАТ-3 и р44/42 МАРК. Антитело СИТО 328 уменьшало опосредованную бортезомибом индукцию экспрессии Н8Р-70 и МКР-1 на 45% и 90%, соответственно. Примечательно, что антитело СИТО 328 заметно уменьшало уровни транс крипционно активного фосфо-8ТАТ-1 и уменьшало гиперфосфорилирование Н8Р-1. Другие стратегии подавления реакции теплового шока, в том числе применение фармакологического ингибитора КИК437, также доказывают синергическое антимиеломное действие комбинации с бортезомибом. Синергическая активность КИК437 и бортезомиба воспроизводилась в фибробластах нормальных эмбрионов мышей (МЕР), но уменьшалась в МЕЕ с нокаутом Н8Е-1. В целом, авторы заявки продемонстрировали, что ингибирование передачи сигнала 1Ь-6 усиливает антимиеломную активность бортезомиба. Это также подтверждает гипотезу, что это происходит, по меньшей мере частично, посредством ослабления опосредованной ингибитором протеасом индукции реакции теплового шока через отрицательную регуляцию транскрипционно активных 8ТАТ-1 и Н8Р-1. Описание настоящего изобретения дает логическое обоснование способа лечения пациентов анти-1Е-6-антителами последовательно, периодически или одновременно с бортезомибом или соответствующими ингибиторами протеаз.

Антагонисты 1Ь-6 по изобретению

Антагонист 1Ь-6, используемый в настоящем изобретении, может быть антагонистом 1Ь-6 любого происхождения при условии, что он блокирует передачу сигнала 1Ь-6 и ингибирует биологическую активность 1Ь-6. Примеры антагонистов 1Ь-6 включают 1Ь-6-антитело, 1Е-6В-антитело, др 130-антитело, мутант 1Ь-6, антисмысловой нуклеотид 1Ь-6В и частичные пептиды 1Ь-6 или 1Б-6Р. Пример мутанта 1Ь6, используемого в настоящем изобретении, описан в ВгакепйоГГ, е! а1., 1. Вю1. Сйет., 269, 86-93, 1994 или δανίηο, е! а1. , ЕМВО 1., 13, 1357-1367, 1994. Этот мутантный полипептид или его фрагмент 1Ь-6 не обладает эффектом на передачу сигнала 1Ь-6, но сохраняет связывающую активность с 1Ь-6В, и его получают за счет введения мутации в форме замены, делеции или инсерции в аминокислотную последовательность 1Ь-6. Хотя нет ограничений в отношении используемых видов животных, предпочтительно использовать 1Ь-6 человека. Подобным образом, любые частичные пептиды 1Ь-6 или частичные пептиды 1Ь-6К, могут быть использованы в настоящем изобретении, при условии, что они предотвращают действие 1Ь-6 или 1Ь-6В (др80) или др130 на трансдукцию сигнала и посредством этого предотвращают связанную с 1Ь-6 биологическую активность (см. патент США № 5210075; ЕР 617126 в отношении деталей, касающихся частичных пептидов 1Ь-6 и частичных пептидов 1Ь-6В). Еще в одном варианте осуществле

- 4 014675 ния, в способе по изобретению могут быть использованы олигонуклеотиды, способные осуществлять сайленсинг РНК 1Ь-6 или 1Ь-6К или антисмысловые механизмы (см. 1Р5-300338 в отношении деталей, касающихся антисмыслового олигонуклеотида 1Ь-6К).

Антитела по изобретению

Антитела, применимые по настоящему изобретению, включают выделенные химерные, гуманизированные и/или СЭК-трансплантированные антитела или антитела человека, имеющие по меньшей мере одну антигенсвязывающую область, которые способны ингибировать биологические функции 1Ь-6. Примеры антител по изобретению включают 1Ь-6-связывающее антитело, 1Ь-6К (др80)-связывающее антитело, др130-связывающее антитело. Примеры 1Ь-6К-антител с подходящими антигенсвязывающими областями включают антитело РМ-1 (Н1га1а, с1 а1., 1. 1ттипо1., 143, 2900-2906, 1989) и антитело АИК1220, АИК64-7 или АИК146-15 (\УО 92-19759). В другом варианте осуществления анти-1Ь-6К-антитело является реконструированным антителом, известным как МКА, описанным в патентах США с номерами 5888510 и 6121423.

В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающую область получают из высокоаффинного анти-1Ь-6-антитела СЬВ-8. Примером антитела по изобретению, полученным из СЬВ-6, является антитело СЫТО328, описанное заявителями в ожидающей одновременного рассмотрения заявке на патент США с порядковым номером 10/280716, содержание которой включено в настоящее изобретение в качестве ссылки. В другом варианте осуществления это антитело является антителом человека, которое связывает 1Ь-6 с высокой аффинностью, например, описанное заявителями в ожидающей одновременного рассмотрения предварительной заявке на патент США с порядковым номером 60/677319. Антитело по изобретению специфично нейтрализует 1Ь-6 человека с высокой аффинностью.

Анти-1Ь-6-антитело, которое может быть использовано в способе по настоящему изобретению, включает любую молекулу белка или пептида, которая содержит по меньшей мере один определяющий комплементарность район (СЭК) тяжелой цепи или легкой цепи или его лигандсвязывающую часть, произведенный из моноклонального антитела СЬВ-8 мыши, в комбинации с константной областью тяжелой цепи или легкой цепи, каркасной областью или любой их частью, которая может быть включена в антитело настоящего изобретения. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к химерному анти-1Ь-6-антителу, содержащему две легкие цепи и две тяжелые цепи, причем каждая из этих цепей содержит по меньшей мере часть константной области человека и по меньшей мере часть вариабельной области (ν), полученной из моноклонального антитела С-СЬВ8 мыши, имеющего специфичность в отношении 1Ь-6 человека, причем указанное антитело связывается с высокой аффинностью с ингибирующим и/или нейтрализующим эпитопом 1Ь-6 человека, такое как антитело еСЬВ-8. Изобретение включает также фрагменты или производное такого антитела, например, одну или несколько частей цепи антитела, например, константной области, 1-области или вариабельной области тяжелой цепи или константной области, 1-области или вариабельной области легкой цепи.

Предпочтительные антитела по изобретению включают химерные, гуманизированные и/или СЬКтрансплантированные антитела или антитела человека, которые будут конкурентно ингибировать связывание ίη νίνο с 1Ь-6 человека анти-1Ь-6-антитела мыши СЬВ-8, химерного анти-1Ь-6-антитела СЬВ-8, или антитела, имеющего, по существу, те же самые характеристики связывания, а также их фрагменты и области.

Антитело по изобретению, предпочтительно, связывает анти-1Ь-6 или анти-1Ь-6К с аффинностью (К) по меньшей мере 10^-9 М, предпочтительно по меньшей мере 10^-10 М и/или, по существу, нейтрализует по меньшей мере одну активность по меньшей мере одного белка 1Ь-6. В предпочтительном варианте осуществления, это антитело связывает 1Ь-6 с аффинностью (Κι) по меньшей мере 1 χ 10^-11 М, предпочтительно 5χ10^-11 М, и нейтрализует 1Ь-6 человека. Предпочтительно это антитело не связывает другие члены суперсемейства 1Ь-6 и блокирует передачу сигнала др130.

Ингибиторы протеасом

Протеасома представляет собой внутриклеточную структуру, которая является мультикаталитической протеиназой, которая является высококонсервативной. Протеасомы ответственны за АТФзависимый протеолиз многих белков, участвующих в важных регуляторных клеточных процессах. Так, протеасома является регуляторным элементом роста и дифференцировки клеток. Средняя клетка человека содержит приблизительно 30000 протеасом, каждая из которых содержит несколько расщепляющих белки протеаз. Эти комплексы находятся в огромном множестве клеточных функций, включающих транскрипцию, контроль клеточного цикла, стрессовую реакцию, биогенез рибосом и отклоняющийся от нормы катаболизм белков. Таким образом, они играют роль в таких процессах, как иммунные и воспалительные реакции (\УО 95/25533), вирусная инфекция, онкогенез, нервная и мышечная дегенерация (патент США № 5340736), процессинг антигенов (XVО 94/17816), репарация ДНК и дифференцировка клеток. Активность протеасомы утонченным образом регулируется для поддержания строгого управления скоростью деградации и специфичными типами деградируемых белков.

Несколько стадий участвуют в деградации белка через протеасомный или убиквитинпротеасомный путь. Сначала белок метят для деструкции цепью малых полипептидов, известных как

- 5 014675 убиквитин. Убиквитинилирование направляет этот белок в заключенную в протеасоме протеолитическую камеру. Для убиквитинилирования необходимы три ферментативные активности, Е1, Е2 и Е3. АТФ-зависимый фермент Е1 активирует убиквитин и связывает его с убиквитинконъюгирующим ферментом, Е2. Затем фермент Е3, убиквитинлигаза, связывает молекулу убиквитина с этим белком. Этот процесс повторяется до тех пор, пока у указанного белка не образуется позади длинная цепь убиквитиновых частей молекулы, и протеасома, наконец, деградирует этот белок на малые фрагменты. Убиквитин-протеасомный путь ответственен за деградацию 90% всех патологических, неправильно уложенных белков и всех короткоживущих, регуляторных белков в клетке. Эти короткоживущие белки, полупериоды существования которых составляют менее трех часов, ответственны за 10-20% всех клеточных белков. Этот путь разрушает также большое количество относительно долгоживущих клеточных белков. Таким образом, убиквитин-протеасомный путь является ответственным за деградацию 80-90% всех внутриклеточных белков.

Описанные ранее ингибиторы протеасом включают пептидилальдегиды. Их предварительная оптимизация показала предпочтение по лейцину в положении Р1 и большого гидрофобного остатка, такого как нафтилаланин, в положениях Р2 или Р3. Поскольку, как было показано, пептидилальдегиды обладают также сильным ингибированием тиоловых пептидаз (например, кальпаинов, катепсинов) и не являются конфигурационно стабильными вследствие кислотности протона в альфа-положении, исследовали замены для альдегидной группы.

Кроме антибиотических ингибиторов, первоначально выделенных из актиномицетов, синтезировали различные пептид-альдегиды, такие как ингибиторы химотрипсин-подобных протеаз, описанные δίтап с1 а1. (\УО 91/13904). Сообщались различные ингибиторы протеасомного комплекса, например, Эюк, е1 а1., Вюсйет. 30: 2725 (1991); Оо1йЬегд, е1 а1. , №Шге 357: 375 (1992); Оо1йЬегд, Еиг. 1. Вюсйет. 203: 9 (1992); Ог1о^8к1, Вюсйет. 29: 10289 (1989); РАеН е1 а1., Агсйз. Вюсйет. Вюрйук. 218: 1 (1989); Шуей, е1 а1., 1. Вю1. Сйет. 264: 12, 215 (1989); Тапака, е1 а1. , Иете Вю1. 4: 1 (1992). Ингибиторы протеасом обсуждаются также в патенте США № 5693617, описание которого включено здесь в качестве ссылки.

Предпочтительным ингибитором протеасом является Р8-341, который называют содержащим боровую кислоту дипептидным ингибитором протеасом бортезомибом (МЬЫ-341, ЬОР-341 и Р8-341; Ν(морфолино)карбонил)-бета-(1-нафтил)-Е-аланин-Ь-лейцин-борная кислота), продаваемым под торговым названием УЕЬСАОЕ®, XVО 96/013266). Р8-341 ингибирует активацию фактора транскрипции ΝΕ-кВ. Р8-341 отрицательно регулирует также экспрессию нескольких ингибиторов апоптоза, индуцирует каспаза-зависимый апоптоз устойчивых к лекарственным средствам линий клеток множественной миеломы (ММ) и клеток пациента, ингибирует связывание клеток ММ со стромальными клетками костного мозга (ВМ8С) и ингибирует продуцирование факторов роста и выживания ММ в среде костного мозга.

В противоположность пептидальдегидам, которые ингибируют активности как протеасомы, так и цистеиновых протеаз, бортезомиб является гораздо более сильным и селективным ингибитором протеасомы. Он имеет очень высокую селективность в отношении протеасомы (более чем 500-кратную) по сравнению с другими сериновыми протеазами, включающими эластазу лейкоцитов человека, катепсин О, хемотрипсин и тромбин. Бортезомиб был недавно одобрен для применения при лечении рецидивирующей и трудно поддающейся лечению множественной миеломы. Ингибирование активности протеасом опухолевых клеток бортезомибом в различных моделях опухолевых культур связано с индукцией апоптоза.

Специфичные ингибиторы протеасом подразделены на пять классов, различающихся фармакофором, который взаимодействует с треонином активного сайта в протеасоме: пептидальдегиды, такие как СЕР1612 и МО132, пептид-боронаты, такие как бортезомиб, пептидвинилсульфоны, пептидэпоксикетоны и β-лактоновые ингибиторы, такие как лактоцистин. Следующие соединения или их аналоги также обсуждаются как применимые в качестве ингибиторов протеасом по изобретению: Р8-519 (1Р[18,4К.,58]]-1-(1-гидрокси-2-метилпропил)-4-пропил-6-окса-2-азабицикло[3.2.1]гептан-3,7-дион); кластолактацистин-бета-лактон; лактацистин, эпоксомицин, СУТ634 (5-метокси-1-инданон-8-ацетиллейцил-Олейцил-1-инданиламид), ТМС96 ((3-метилбутаноил-Ь-треонин-№( 1-(2-(гидроксиметил)оксиран-2-илкарбонил)-3-метилбут-3-енил)амид), МО-115, СЕР1612 и МО132.

Кроме ингибиторов протеаз протеасомы, убиквитинпротеасомный путь может быть блокирован ингибиторами вспомогательных ферментов убиквитинактивирующего фермента (Е1), убиквитинконъюгирующего фермента (Е2) и убиквитинлигаз (ферментов Е3). Были идентифицированы ингибиторы Е1, такие как химеиновая кислота А (ТкикатоФ, е1 а1. 2005, Вюогдап Мей. Сйет. Ьей. 15(1):191-194. Другие способы, известные в данной области, такие как сайленсинг РНК, могут быть также использованы для уменьшения или элиминации активностей специфичных связанных с убиквитинилированием ферментов.

Мониторинг ингибирующей протеосомы активности

Способ мониторинга фармакодинамического лекарственного действия ингибитора протеасом в млекопитающем описан в патенте США № 6613541, причем авторы неожиданно обнаружили, что анализ ех у1уо активности протеасом, а не концентрация лекарственного средства, в биологических пробах обеспечивает полезный способ мониторинга фармакодинамического лекарственного действия ингибито

- 6 014675 ров протеасом и что эти данные обеспечивают руководство для отбора последующего дозового количества и частоты доз ингибитора протеасом, который должен вводиться в будущем. Этот способ предусматривает введение ингибитора протеасом млекопитающему; получение одной или нескольких биологических тест-проб из этого млекопитающего после введения ингибитора протеасом; измерение активности протеасом в биологической тест-пробе или в биологических тест-пробах; определение величины активности протеасом в биологической тест-пробе или в биологических тест-пробах и сравнение величины активности протеасом в биологической тест-пробе с величиной активности протеасом в ссылочной биологической пробе, полученной из млекопитающего, которому не был введен ингибитор протеасом.

Патент США № 6613541 дополнительно относится к способу определения схемы введения доз для ингибитора протеасом, способу определения фоновой активности протеасом у млекопитающего, в том числе у человека, и к набору для измерения активности протеасом в биологической пробе из млекопитающего. Способы патента США № 6613541 могут использоваться для биологических проб, выбранных из проб крови, мочи, тканевой биопсии.

Измерение 1Ь-6

1Ь-6 может быть детектирован в биоанализах, использующих чувствительные к 1Ь-6 клеточные линии (см.: 7ΤΏ1; В9; СЕ88, КРММ2; КТ-3; М1, МН60-В8Е-2, МО7Е; Мопо Мас 6; ΝΡ8-60; Р1Ь-6; 8К\\'6С14; Τ1165; ХС-1). 1Ь-6 может также анализироваться по его активности в качестве фактора роста гибридом (см.: НСЕ). Доступны также чувствительные иммуноанализы и колориметрические тесты. Альтернативным способом детектирования является ОТ-ПЦР-определение количества цитокинов. Анализ ЕЫ8А используют для детектирования связанного с рецептором белка др130 (такие реагенты доступны, например, из (Κ.&Ό §у81етз).

Для детектирования 1Ь-6, связанного с ΟΝΤ0328. анти-ГО-(антитела против вариабельной области, описанные заявителями в ожидающей одновременного рассмотрения заявке на патент США с порядковым номером 10/280716), могут быть использованы для детектирования в любом стандартном формате иммуноанализа, таком как анализ типа ЕЫ8А.

Заболевания, поддающиеся лечению с использованием способа настоящего изобретения

Экспрессия 1Ь-6 с нарушенной регуляцией является, возможно, одним из основных факторов, участвующих в патогенезе ряда заболеваний. Избыточная сверхпродукция 1Ь-6 (и других факторов дифференцировки В-клеток) была отмечена при различных патологических состояниях, таких как ревматоидный артрит, множественная миелома, синдром Леннерта (гистиоцитарная лимфома), болезнь Кастлмана (лимфаденопатия с массивной инфильтрацией плазматических клеток, гамма-глобулинемией, анемией и повышенными концентрациями белков острой фазы), сердечные миксомы и цирроз печени. Также был отмечен конститутивный синтез 1Ь-6 глиобластомами и секрецию 1Ь-6 в цереброспинальную жидкость.

Что касается иммуноопосредованных воспалительных заболеваний (1МГО), предполагается, что 1Ь6 участвует в патогенезе хронического полиартрита (вместе с 1Ь-1 и 1Ь-8), так как избыточные концентрации 1Ь-6 обнаруживаются в синовиальной жидкости. В воспалительных кишечных заболеваниях повышенные уровни 1Ь-6 в плазме могут быть показателем патологического состояния. У пациентов с мезангиальным пролиферативным гломерулонефритом повышенные уровни 1Ь-6 в моче являются также показателем патологического состояния. 1Ь-6 может играть роль в иммуноопосредованном патогенезе сахарного диабета как типа I, так и типа II.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного 1Ь-6-связанного заболевания в клетке, ткани, органе, животном или пациенте, известного в данной области или описанного здесь, с использованием по меньшей мере одного 1Ь-6антитела настоящего изобретения, например, введением или контактированием этих клетки, ткани, органа, животного или пациента с терапевтически эффективным количеством ΙΕ-6-антитела вместе с введением ингибитора протеасом. Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного 1Ь-6-связанного заболевания, в клетке, ткани, органе, животном или пациенте, в том числе, но не только, по меньшей мере одного заболевания, выбранного из ожирения, связанного с иммунной системой заболевания, сердечно-сосудистого заболевания, инфекционного заболевания, злокачественного заболевания или неврологического заболевания.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного 1Ь-6-связанного заболевания, связанного с иммунной системой, в клетке, ткани, органе, животном или пациенте, в том числе, но не только, по меньшей мере одного заболевания, выбранного из ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, системного возникновения ювенильного ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, язвы желудка, серонегативных артропатий, остеоартрита, остеолиза, асептического расшатывания ортопедических имплантатов, воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита, системной красной волчанки, антифосфолипидного синдрома, иридоциклита/увеита/ретробульбарного неврита, идиопатического фиброза легких, системного васкулита/гранулематоза Вегенера, саркоидоза, орхита/процедур реверсирования вазектомии, аллергических/атопических заболеваний, астмы, аллергического ринита, экземы, аллергического контактного дерматита, аллергического конъюнктивита, аллергического пневмонита, трансплантатов, отторжения трансплантатов органов, реакции трансплантат против хозяина, системного синдрома воспалительной

- 7 014675 реакции, синдрома сепсиса, грамположительного сепсиса, грамотрицательного сепсиса, культураотрицательного сепсиса, грибкового сепсиса, нейтропенической лихорадки, уросепсиса, менингококкемии, травмы/кровотечения, ожогов, воздействия ионизирующего облучения, острого панкреатита, респираторного дистресс-синдрома взрослых, ревматоидного артрита, индуцированного алкоголем гепатита, хронических воспалительных патологий, саркоидоза, болезни Крона, серповидно-клеточной анемии, диабета, нефроза, атопических заболеваний, аллергических реакций, аллергического ринита, сенной лихорадки, хронического аллергического ринита, конъюнктивита, эндометриоза, астмы, крапивницы, системной анафилаксии, дерматита, пернициозной (злокачественной) анемии (болезни Аддисона-Бирмера), гемолитического заболевания, тромбоцитопении, отторжения трансплантата любого органа или любой ткани, отторжения трансплантата почки, отторжения трансплантата сердца, отторжения трансплантата печени, отторжения трансплантата поджелудочной железы, отторжения трансплантата легкого, отторжения трансплантата костного мозга (ВМТ), отторжения аллотрансплантата кожи, отторжения трансплантата хряща, отторжения трансплантата кости, отторжения трансплантата тонкой кишки, отторжения трансплантата фетальной вилочковой железы, отторжения трансплантата паращитовидной железы, отторжения ксенотрансплантата любого органа или любой ткани, отторжения аллотрансплантата, реакций гиперчувствительности к антителу против рецептора, болезни Грейвса, болезни Рейно, инсулинзависимого диабета типа В, астмы, тяжелой псевдопаралитической миастении, опосредованной антителами цитотоксичности, реакций гиперчувствительности типа III, синдрома ΡΟΕΜ8 (полиневропатии, спланхиомегалии, эндокринопатии, моноклональной гаммапатии и синдрома кожных изменений), полиневропатии, спланхиомегалии, эндокринопатии, моноклональной гаммапатии, синдрома кожных изменений, антифосфолипидного синдрома, пузырчатки, склеродермии, заболевания смешанных соединительных тканей, идиопатической болезни Аддисона, сахарного диабета, хронического активного гепатита, первичного билиарного цирроза, витилиго, васкулита, синдрома пост-М1-кардиотомии, гиперчувствительности типа IV, контактного дерматита, аллергического пневмонита, отторжения аллотрансплантата, гранулем, вызванных внутриклеточными организмами, чувствительности к лекарственным средствам метаболических/идиопатических заболеваний, болезни Вильсона, гемохроматоза, недостаточности альфа-1антитрипсина, диабетической ретинопатии, тиреоидита Хашимото, остеопороза, диагноза системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники, первичного билиарного цирроза, тироидита, энцефаломиелита, кахексии, муковисцидоза, хронической болезни легких новорожденных, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), семейного гематофагоцитарного лимфогистиоцитоза, дерматологических состояний, псориаза, алопеции, нефротического синдрома, нефрита, гломерулярного нефрита, острой почечной недостаточности, гемодиализа, уремии, токсичности, преэклампсии, ок13-терапии, анти-сбЗ-терапии, терапии цитокинами, химиотерапии, лучевой терапии (например, включающей, но не ограничивающейся ими, астению, анемию, кахексию и т.п.), хронической интоксикации салицилатом и т.п. См., например, Мегск Мапиа1, 121Е-171Е Εάίίίοηδ, Мегск & Сотрапу, ВаЕгау, N1 (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), РЕагтасо!Еегару НапбЕоок, \Уе115 е! а1., еб§., 8есопб Εάίίίοη, Арр1е!оп апб Ьапде, 81атГогб, Сопп. (1998, 2000), оба включенные в качестве ссылки в полном виде.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного сердечно-сосудистого заболевания в клетке, ткани, органе, животном или пациенте, включающего, но не ограничивающегося ими, по меньшей мере одно заболевание, выбранное из сердечного синдрома временной потери сознания, инфаркта миокарда, застойной сердечной недостаточности, геморрагического инсульта, ишемического кровоизлияния, кровотечения, артериосклероза, атеросклероза, рестеноза, диабетического атеросклеротического заболевания, гипертензии, артериальной гипертензии, реноваскулярной гипертензии, синкопы, шока, сифилиса сердечно-сосудистой системы, сердечной недостаточности, легочного сердца, первичной легочной гипертензии, сердечных аритмий, предсердных эктопических сокращений, трепетания предсердий, предсердной фибрилляции (постоянной или пароксизмальной), постперфузионного синдрома, воспалительной реакции на искусственное кровообращение, хаотической или многоочаговой предсердной тахикардии, регулярной тахикардии с узкими ОРЗ, специфичных аритмий, желудочковой фибрилляции, аритмий пучка Гиса, атриовентрикулярной блокады сердца, блокады пучка Гиса (межжелудочковой блокады), ишемических нарушений миокарда, заболевания коронарной артерии, стенокардии, инфаркта миокарда, кардиомиопатии, расширенной застойной кардиомиопатии, облитерирующей кардиомиопатии (болезни Беккера), пороков клапанов сердца, эндокардита, перикардиального заболевания, опухолей сердца, аневризм аорты и периферических аневризм, расслоения аорты, воспаления аорты, окклюзии брюшной аорты и ее ветвей, нарушений периферических сосудов, окклюзивных артериальных нарушений, периферического атеросклеротического заболевания, облитерирующего тромбангиита, функциональных нарушений периферических артерий, феномена и болезни Рейно, акроцианоза, эритромелалгии (болезни Митчелла), венозных нарушений, тромбоза вен, варикозных вен, артериовенозного свища, лимфедемы, липедемы, нестабильной стенокардии реперфузионного повреждения, постгемодиализного синдрома, ишемического-реперфузионного повреждения и т. п. Такой способ может необязательно предусматривать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антиЛЬ-б-антитело, в клетку, ткань, орган, животное или пациента, нуждающегося в такой модуляции, таком лечении или такой терапии.

- 8 014675

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного 1Б-6-связанного инфекционного заболевания в клетке, ткани, органе, животном или пациенте, включающего, но не ограничивающегося ими, по меньшей мере одно заболевание, выбранное из острой или хронической бактериальной инфекции, острого или хронического паразитарного или инфекционного процесса, включающего бактериальные, вирусные и грибковые инфекции, ВИЧ-инфекцию/ВИЧнефропатию, менингит, гепатит (например, А, В или С или т.п.), септический артрит, перитонит, пневмонию, эпиглоссит, Е. со! 0157:17, гемолитический уремический синдром/тромболитическую тромбоцитопеническую пурпуру, малярию, геморрагическую лихорадку денге, лейшманиоз, проказу, синдром токсического шока, стрептококковый миозит, газовую гангрену, МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818, МусоЬас1егшш аушш т1гасе11и1аге, пневмонию РпеитосузИз салил, воспаление тазовых органов, орхит/эпидидимит, инфекцию легионеллы, болезнь Лайма, грипп А, вирус Эпштейна-Барра, вирусассоциированный гемафагоцитарный синдром, вирусный энцефалит/асептический менингит и т.п.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного 1Ь-6-связанного злокачественного заболевания в клетке, ткани, органе, животном или пациенте, включающего, но не ограничивающегося ими, по меньшей мере одно заболевание, выбранное из лейкоза, острого лейкоза, острого лимфобластного лейкоза (АБЕ), острого лимфоцитарного лейкоза, В-клеточного, Т-клеточного или БАВ АББ, острого миелоидного лейкоза (АМБ), острого миелогенного лейкоза, хронического миелоцитарного лейкоза (СМБ), хронического лимфоцитарного лейкоза (СББ), ретикулоэндотелиоза, миелодиспластического синдрома (МЭ8), лимфомы, болезни Ходжкина, злокачественной лимфомы, не-ходжкинской лимфомы, лимфомы Беркитта, множественной миеломы, саркомы Капоши, колоректальной карциномы, карциномы поджелудочной железы, назофарингеальной карциномы, злокачественного гистиоцитоза, паранеопластического синдрома/гиперкальциемии злокачественной опухоли, солидных опухолей, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, рака эндометрия, рака головы, рака шеи, наследственного неполипозного рака, лимфомы Ходжкина, рака печени, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, почечноклеточной карциномы, тестикулярного рака, аденокарцином, сарком, злокачественной меланомы, гемангиомы, метастатического заболевания, связанной с раком резорбции костей, связанной с раком боли костей и т. п.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного ББ-6-связанного неврологического заболевания в клетке, ткани, органе, животном или пациенте, включающего, но не ограничивающегося ими, по меньшей мере одно заболевание, выбранное из нейродегенеративных заболеваний, рассеянного склероза, головной боли (мигрени), комплекса СПИДдеменция, демиелинизирующих заболеваний, таких как рассеянный склероз и острый поперечный миелит; экстрапирамидных и мозжечковых нарушений, например, повреждений, кортикоспинальной системы; нарушений базальных ядер; гиперкинетических нарушений движения, таких как хорея Гентингтона и сенильная хорея; индуцированных лекарственными средствами нарушений движения, таких как нарушения движения, индуцированные лекарственными средствами, которые блокируют рецепторы допамина ЦНС; гипокинетических нарушения движения, таких как болезнь Паркинсона; прогрессирующего супрануклеарного паралича; структурных повреждений мозжечка; относящихся к спинному мозгу и мозжечку дегенераций, таких как спинномозговая атаксия, атаксия Фридрейха, мозжечковых кортикальных дегенераций, дегенераций множественных систем (Мепсе1, □Деппе-ТИотах, δΙί-Огадег и МасИабо1озер1); системных нарушений (болезни Рефсума, абеталипопротеинемии, атаксии, телеангиэктазии и нарушения митохондриальной мультисистемы; демиелинизирующих центральных нарушений, таких как рассеянный склероз, острый поперечный миелит; и нарушений мотонейронов, таких как нейрогенные мышечные атрофии (дегенерация клеток переднего рога, такая как амиотрофический боковой склероз, детская спинальная мышечная атрофия и ювенильная спинальная мышечная атрофия); болезни Альцгеймера; синдрома Дауна в среднем возрасте; диффузного заболевания с тельцами Леви; сенильной деменции типа телец Леви; синдрома Вернике-Корсакова; хронического алкоголизма; болезни Кройтцфельдта-Якоба; подострого склерозирующего панэнцефалита; болезни Галлервордена-Шпатца; ОетепИа ридШзбса; нейротравматического повреждения (например, повреждения спинного мозга, повреждения головного мозга, сотрясения головного мозга, повторяемого сотрясения); боли; боли при воспалении; аутизма; депрессии; инсульта; когнитивных нарушений; эпилепсии и т. п. Такой способ может необязательно предусматривать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно ТИБ-антитело или указанные часть или вариант в клетку, ткань, орган, животное или пациента, нуждающегося в такой модуляции, таком лечении или такой терапии. См., например, Мегск Мапиа1, 16⁴¹ ЕбИоп, Мегск & Сотрапу, ВаИ^ау, N1 (1992).

Способы введения

Способ по изобретению включает введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-1Б-6-антитело, в клетку, ткань, орган, животное или пациента, нуждающегося в такой модуляции, таком лечении или такой терапии, вместе с лечением, предусматривающим введение ингибитора протеасом. Способ по изобретению включает лечение таких заболеваний или нарушений, при которых показано введение указанного по меньшей мере

- 9 014675 одного антагониста 1Ь-6. Способ по изобретению дополнительно предусматривает совместное введение с антагонистом 1Ь-16 до, одновременно и/или после по меньшей мере одного ингибитора протеасом. В конкретном варианте осуществления антагонист 1Ь-6 является антителом, которое предотвращает или ингибирует биологические функции 1Ь-6, таким как нейтрализующее 1Ь-6-антитело или анти-1Ь-6Кантитело, а ингибитор протеасом выбран из группы, состоящей из Р8-314 (бортезомиба), Р8-519; кластолактацистина-бета-лактона; лактацистина, эпоксомицина, СУТ634, ТМС96, МС-115, СЕР1612 и МС132.

Обычно лечение патологических состояний осуществляют введением эффективного количества или дозы композиции анти-1Е-6-антитела, которые составляют в среднем диапазон от по меньшей мере приблизительно 0,01 до 500 миллиграммов по меньшей мере одного анти-1Е-6-антитела на килограмм пациента на дозу и предпочтительно от по меньшей мере приблизительно 0,1 до 100 мг антитела/кг пациента на единственное или на множественные введения, в зависимости от конкретной активности активного агента, содержащегося в этой композиции.

Альтернативно, эффективная концентрация в сыворотке может содержать 0,1-5000 мкг/мл сыворотки на единственное или множественные введения. Подходящие дозы известны врачам-практикам и будут, конечно, зависеть от конкретного пациента, подвергающегося лечению. В некоторых случаях для достижения желаемого терапевтического количества может быть необходимым обеспечение повторяемого введения, т.е. повторяемых отдельных введений конкретно наблюдаемой или отмеренной дозы, причем эти отдельные введения повторяют, пока не достигается желаемая суточная доза или желаемое действие.

Для парентерального введения это антитело или ингибитор протеасом могут быть приготовлены в виде раствора, суспензии, эмульсии, частицы, порошка или лиофилизированного порошка, вместе с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем или с отдельно обеспеченным фармацевтически приемлемым парентеральным носителем. Примерами таких носителей являются вода, солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и 1-10% сывороточный альбумин человека. Могут быть также использованы липосомы и неводные носители, такие как нелетучие масла. Носитель или лиофилизированный порошок может содержать добавки, которые поддерживают изотоничность (например, хлорид натрия, маннит) и химическую стабильность (например, буферы и консерванты). Готовую форму стерилизуют известными или подходящими способами.

Подходящие фармацевтические носители описаны в самом недавнем издании РеттДоп'х Рйагтасеи11еа1 8с1еиее8, А. О§о1, стандартном ссылочном руководстве в этой области.

Введение

Многие известные и разработанные способы могут быть использованы в соответствии с изобретением для введения фармацевтически эффективных количеств антагониста 1Ь-6 и ингибитора протеасом в соответствии с настоящим изобретением. Хотя обычным является парентеральное введение, могут быть использованы другие способы введения в соответствии с настоящим изобретением с подходящими результатами. Композиция по изобретению может доставляться в носителе, в виде раствора, эмульсии, коллоида или суспензии, или в виде сухого порошка, с использованием любого из различных устройств и способов, подходящих для введения ингаляцией или другими способами, описанными здесь или известными в данной области.

Альтернативные способы введения включают подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрисуставный, внутрибронхиальный, внутрибрюшной, внутрикапсульный, внутрихрящевой, внутриполостной, интрацелиальный, внутримозжечковый, интрацеребровентрикулярный, внутрикишечный (внутрь толстой кишки), интрацервикальный, внутрижелудочный, внутрипеченочный, интрамиокардиальный, внутрикостный, внутритазовый, интраперикардиальный, внутрибрюшинный, внутриплевральный, внутрипростатный, внутрилегочный, интраректальный, внутрипочечный, интраретинальный, интраспинальный, внутрисуставный, внутригрудной, внутриматочный, внутрипузырный, внутрираневой, болюсный, вагинальный, ректальный, буккальный, сублингвальный, интраназальный или трансдермальный способы.

Пример 1. Активность анти-1Е-6-антитела в комбинации с ингибитором протеасом.

На основе гипотезы, что ингибирование 1Ь-6 химерным, моноклональным 1Ь-6-нейтрализующим антителом, СЫТО 328, могло бы усиливать антимиеломную активность ингибитора протеасом, бортезомиба, ослаблением опосредованной бортезомибом повышающей регуляции Н8Р-70, были задуманы и выполнены следующие исследования.

А. Ингибирование передачи сигнала 1Ь-6 моноклональным антителом, СЫТО 328, уменьшает жизнеспособность клеток ΙΕ-6-зависимых линий клеток множественной миеломы, ΑΝΒΕ-6 и КА8-6.

Клетки ΑΝΒΕ-6 и КА8-6 (Иг. И1аие 1е1шек, Мауо Сйшс, Росйе51ег. ΜΝ) инкубировали с увеличивающимися концентрациями СЫТО 328 или изотипически сходного контрольного антитела, Е105, в течение 24 и 48 ч. В течение последних 4 ч эти клетки инкубировали в присутствии \У8Т-1 (Косйе Аррйеб 8с1еисе, 1пШапаро118, ΙΝ). Восстановление ЭДБТ-1 в водорастворимую соль формазана жизнеспособными клетками измеряли по оптической плотности при 450 нм с использованием планшет-ридера ЕЫ8А. Жизнеспособность измеряли в виде процентной жизнеспособности относительно необработанных клеток. Все клетки обрабатывали в среде КРМ1 1640, содержащей 10% ФТС и 1 нг/мл 1Ь-16.

- 10 014675

Результаты показаны графически на фиг. 1 (величины являются средней величиной четырех повторностей культур; столбики ошибок, 8ЕМ) . Обработка клеток ΆΝΒΕ-6 и КА8-6 антителом ΟΝΤΘ 328 приводит к зависимому от дозы и от времени уменьшению жизнеспособности клеток. Клетки КА8-6 были значимо более чувствительными к действиям ингибирования 1Ь-6, чем клетки ΑΝΒΕ-6.

B. ΟΝΤΘ 328 усиливает антимиеломную активность бортезомиба в 1Ь-6-зависимых миеломных клетках.

Линии клеток миеломы ΑΝΒΕ-6, КА8-6 или 1Ь-6-независимые линии клеток миеломы ВРМ1 8226 прединкубировали с 0,1 мкг/мл (КА8-6) или 10 мкг/мл (ΑΝΒΕ-6 и ВРМ1 8226) контрольного антитела, Е105, или ΟΝΤΘ 328 в течение 24 ч, с последующим коинкубированием либо с контролем ДМСО, либо с увеличивающимися концентрациями бортезомиба при непрерывном присутствии антител Е105 или ΟΝΤΘ 328 в течение 24 ч. Для экспериментов по секвенированию, клетки ΛΝΒΕ-6 обрабатывали: 1) антителами Е105 или ΟΝΤΘ 328 в течение 24 ч и затем антителами Е105 или ΟΝΤΘ 328 и 5 нМ бортезомибом в течение еще 24 ч (антитело бортезомиб) ; 2) антителами Е105 или ΟΝΤΘ 328 и 5 нМ бортезомибом одновременно в течение 24 ч (антитело + бортезомиб) или 5 нМ бортезомибом в течение 12 ч, затем антителами Е105 или ΟΝΤΘ 328 в течение 24 ч (бортезомиб антитело). Жизнеспособность клеток анализировали, как описано выше, и измеряли в виде процентной жизнеспособности относительно необработанных клеток. Все клетки обрабатывали в среде ВРМ1 1640, содержащей 10% ФТС и 1 нг/мл 1Ь-6. Столбцы, средние величины четырех повторностей культур; столбики ошибок, 8ЕМ.

Прединкубация клеток ΑNΒ^-6 и КА8-6 с СОТО 328 усиливала цитотоксичность бортезомиба, как показано значимым уменьшением жизнеспособности клеток относительно клеток, предобработанных контрольным антителом Е105 (фиг. 2А и В) . Антитело СОТО 328 не усиливало активность бортезомиба в 1Ь-6-независимой линии клеток миеломы, ВРМ1 8226 (панель С). Антитело СОТО 328 усиливало цитотоксичность бортезомиба больше всего, когда клетки ΑNΒ^-6 предобрабатывали СОТО 328 и затем бортезомибом или обрабатывали одновременно СОТО 328 и бортезомибом. В противоположность этому, антитело СОТО 328 имело небольшое дополнительное действие, когда клетки предобрабатывали бортезомибом (панель Ό).

C. Ингибирование передачи сигнала 1Ь-6 антителом СОТО 328 усиливает опосредованный бортезомибом апоптоз 1Ь-6-зависимых линий клеток множественной миеломы, ΑNΒ^-6 и КА8-6.

Клетки ΛNΒ^-6 и КА8-6 инкубировали с 10 мкг/мл ^ΗΒΕΑ) или 1 мкг/мл (КА8-6) СОТО 328 или контрольного антитела, Е105, в течение 8 ^ΗΒΕΑ) - 12 (КА8-6) часов. Апоптоз определяли с использованием анализа на основе ЕЫ8А, который измеряет присутствие моно- и олигонуклеосом (Воске Аррйей 8с1еиее, 1ий1аиароЙ8, ΙΝ), и выражали в виде кратного увеличения апоптоза относительно ДМСО и Е105обработанных контролей. Клетки обрабатывали в среде ВРМ1 1640, содержащей 10% ФТС и 1 нг/мл 1Ь-6 (фиг. 3А и В, высота столбцов представляет среднее трех повторностей культур; столбики ошибок, 8ЕМ).

Обработка клеток ΑNΒ^-6 и КА8-6 антителом СОТО 328 и бортезомибом приводила к усиленной индукции апоптоза в сравнении с клетками, обработанными любым лекарственным средством по отдельности. Антитело СОТО 328 не было способно усиливать апоптоз в 1Ь-6-независимой линии клеток миеломы ВРМ1 8226 (данные не показаны).

Ό. СОТО 328 понижающим образом регулирует передачу сигнала интерлейкина-6 и ослабляет опосредованную бортезомибом индукцию антиапоптотических МКР-1 и Н8Р-70 в клетках ΑNΒ^-6.

Клетки ΑNΒ^-6 инкубировали с 10 мкг/мл СОТО 328 или контрольного антитела, Е105, с увеличивающимися концентрациями или без увеличивающихся концентраций бортезомиба в течение 8 ч. Готовили лизаты клеток и подвергали их анализу иммуноблоттинга. Блоты получали и зондировали на Н8С70 для гарантии равной нагрузки белка на дорожку. Денситометрию выполняли на иммуноблотах Н8Р-70 и МКР-1.

Обработка клеток ΑNΒ^-6 СОТО 328 приводила к разительному уменьшению последующих медиаторов передачи сигнала 1Ь-6, как показано уменьшением уровней фосфо-р42/44 МАРК и фосфо8ΤΑΤ-3 (фиг. 4). Примечательно, что увеличение доз бортезомиба также уменьшало уровни фосфо8ΤΑΤ-3 и фосфо-р42/44 МАРК. Эти данные свидетельствуют о том, что бортезомиб препятствует передаче сигнала 1Ь-6 (что также сообщалось НПекЫта Τ е1 а1, Опсодепе 2003, 22: 8386-93). Кроме того, СОТО 328 препятствовал опосредованной бортезомибом индукции Н8Р-70 и МКР-1 на 45 и 90%, соответственно, что коррелировало с уменьшенными уровнями транскрипционно активного фосфо-8ΤΑΤ-1 и гиперфосфорилированного Н8Е-1.

Е. КИК437 усиливает опосредованный бортезомибом апопотоз клеток ΑNΒ^-6 и Н8Е-1+/+ клеток МЕЕ.

Клетки ΑNΒ^-6 или МЕЕ (контрольные и Н8Е-1-/-) инкубировали либо с контролем ДМСО, либо с увеличивающимися концентрациями бортезомиба и КNК437 в течение 12 ^ΗΒΕΑ) - 24 ч (МЕЕ). Апопотоз определяли, как описано выше, и выражали в виде кратного увеличения апоптоза относительно ЭМ8О-обработанных контролей. Клетки ΑNΒ^-6 обрабатывали в среде ВРМ1 1640, содержащей 10% ФТС и 1 нг/мл 1Ь-6 (фиг. 5, столбцы, средняя величина трех повторностей культур; столбики ошибок,

- 11 014675

8ЕМ).

Обработка клеток ΆΝΒΕ-6 ΚΝΚ437 приводила к значимому увеличению опосредованного бортезомибом апоптоза в сравнении с обработанными контролем клетками. Усиление опосредованного бортезомибом апоптоза снижалось в Н8Е-1-/-МЕЕ относительно контрольных МЕЕ (фиг. 6), что позволяет предположить, что повышенная активность этой комбинации обусловлена понижающей регуляцией реакции белков теплового шока.

Суммирование результатов комбинации СОТО 328 с бортезомибом.

Нейтрализующее ГЕ-6 антитело СОТО 328 уменьшало жизнеспособность клеточных линий множественной миеломы ΆΝΒΕ-6 и ΚΆ8-6 зависимым от дозы и зависимым от времени образом.

Обработка клеток ΆΝΒΕ-6 и ΚΆ8-6 антителом СОТО 328 усиливала антимиеломную активность бортезомиба, как показано уменьшением жизнеспособности клеток и усилением апоптоза этой комбинацией в сравнении с контрольным антителом и бортезомибом. Это антимиеломное действие СОТО 328 уменьшалось, когда клетки обрабатывали последовательно бортезомибом и затем СОТО 328, скорее в этом, а не в обратном порядке, возможно, вследствие способности бортезомиба понижающим образом регулировать важные последующие медиаторы передачи сигнала ГЬ-6 или более ранней повышающей регуляции членов реакции белков теплового шока.

Обработка клеток ΆΝΒΕ-6 и ΚΆ8-6 антителом СNΤΟ 328 приводила к понижающей регуляции передачи сигнала ГЬ-6, как показано заметным уменьшением уровней фосфо-8ТАТ-3 и фосфо-р42/44 МАРК. Бортезомиб также понижающим образом регулировал уровни фосфо-8ТАТ-3 и фосфо-р42/44 МАРК зависимым от концентрации образом.

Повышенная активность комбинации СОТО 328 и бортезомиба ассоциировалась с уменьшенным опосредованным бортезомибом накапливанием антиапоптотических Н8Р-70 и МКР-1. Уменьшенная индукция Н8Р-70 коррелировала с уменьшенными уровнями фосфо-8ТАТ-1 и гиперфосфорилированного Н8Е-1.

Обработка клеток ΑΝΒΕ-6 и ΚΑ8-6 ΚΝΚ437 усиливала апоптотическую активность бортезомиба, что отчасти было следствием его способности препятствовать индукции реакции белков теплового шока, как показано тем фактом, что увеличенное апоптотическое действие заметно уменьшалось в Н8Е-1негативных эмбриональных фибробластах мыши.

Взятые вместе, эти данные обеспечивают логическое обоснование для перенесения комбинации бортезомиба/СОТО 328 в клинические исследования и разработки других новых стратегий, нацеленных на понижающую регуляцию устойчивости к бортезомибу (например, ингибиторов Н8Р-70, МКР-1).

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения раковых заболеваний у млекопитающего, который включает совместное введение ингибитора протеасом в комбинации с антагонистом ГЬ-6.
2. 2. Способ по п.1, в котором антагонистом ГЬ-6 является антитело или его фрагмент.
3. 3. Способ по п.2, в котором антитело является моноклональным антителом.
4. 4. Способ по п.2, в котором антитело или фрагмент связывается с ГЬ-6.
5. 5. Способ по п.2, в котором антитело или фрагмент связывается с рецептором ГЬ-6.
6. 6. Способ по п.3 или 4, в котором фрагментом антитела является РаЬ, РаЬ' или Р(аЬ')₂-фрагмент или его производное.
7. 7. Способ по п.3, в котором моноклональное антитело конкурирует с моноклональным антителом сСЬВ8 за связывание с ГЬ-6 человека.
8. 8. Способ по п.3, в котором моноклональное антитело вводят внутривенно.
9. 9. Способ по п.3, в котором моноклональное антитело вводят в количестве 0,01-12 мг/кг массы тела.
10. 10. Способ по п.3, в котором моноклональное антитело вводят в болюсной дозе с последующей инфузией указанного антитела.
11. 11. Способ по п.1, в котором млекопитающим является человек.
12. 12. Способ по п.1, в котором ингибитор протеасом выбран из группы, состоящей из содержащего борную кислоту дипептидного ингибитора протеасом бортезомиба, Р8-519 (1К-[18,4К,58]-1-(1-гидрокси2-метилпропил)-4-пропил-6-окса-2-азабицикло[3.2.1.]гептан-3,7-диона); класто-лактацистин-беталактона; лактацистина, эпоксомицина, СУТ634 (5-метокси-1-инданон-3-ацетиллейцил-О-лейцил-1инданиламида), ТМС96 ((3 -метилбутаноил-Е-треонин-№( 1-(2-(гидроксиметил)оксиран-2-илкарбонил)-3метилбут-3-енил)амида, МС-115, СЕР1612 и МС132.
13. 13. Способ по п.1, в котором ингибитор протеасом является содержащим борную кислоту дипептидным ингибитором протеасом бортезомибом.
14. 14. Способ по п.1, в котором раковым заболеванием является, по меньшей мере, раковое заболевание, выбранное из лейкоза, острого лейкоза, острого лимфобластного лейкоза (АБЬ), В-клеточного, Тклеточного или РАВ АБТ. острого миелоидного лейкоза (АМЬ), острого миелогенного лейкоза, хронического миелоцитарного лейкоза (СМЬ), хронического лимфоцитарного лейкоза (СЬЕ), ретикулоэндотелиоза, миелодиспластического синдрома (МЭ8), лимфомы, болезни Ходжкина, злокачественной лимфо

    - 12 014675 мы, неходжкинской лимфомы, лимфомы Беркитта, множественной миеломы, саркомы Капоши, колоректальной карциномы, карциномы поджелудочной железы, почечноклеточной карциномы, карциномы клеток простаты, назофарингеальной карциномы, злокачественного гистиоцитоза, паранеопластического синдрома/гиперкальциемии злокачественности, солидных опухолей, аденокарцином, сарком и злокачественной меланомы.
15. 15. Способ по п.1, в котором анти-ББ-б-антагонист вводят последовательно, периодически или одновременно с ингибитором протеасом.
16. 16. Способ ингибирования роста опухоли у млекопитающего, включающий введение этому млекопитающему вместе с ингибитором протеасом моноклонального антитела или его фрагмента, которые предотвращают [Б-б-активацию передачи сигнала через мембраносвязанные рецепторы в количестве, эффективном для ингибирования роста указанной опухоли.
17. 17. Способ профилактики метастазов у млекопитающих, включающий введение этому млекопитающему вместе с ингибитором протеасом моноклонального антитела или его фрагмента, которые предотвращают 1Б-б-активацию передачи сигнала через мембраносвязанные рецепторы в количестве, эффективном для предотвращения метастазов в указанном млекопитающем.
18. 18. Способ по любому из пп.3, 1б или 17, где антителом является еСБВ8 или его фрагмент.