KR102346566B1 - 섬유성 질환의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대체로 섬유증을 치료하는 방법, 보다 구체적으로는 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 CSF-1R 활성 억제제에 관한 것이고, 여기서 억제제는 소형 화학적 실체(NCE), 핵산 또는 항체 또는 이의 기능적 활성 단편 또는 유도체를 포함한다. 본 발명은 또한 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에서, CSF-1R 활성 억제제의 용도에 관한 것이다.

Description

섬유성 질환의 치료 방법{METHOD FOR THE TREATMENT OF FIBROTIC DISEASE}
본 발명은 대체로 섬유성 질환을 치료하는 방법, 및 보다 구체적으로 섬유성 질환의 치료를 위한 항-CSF1-R 항체에 관한 것이다.
마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF)라고도 알려진, 콜로니 자극 인자 1 (CSF-1)은 내피 세포 및 섬유아세포를 포함한, 다양한 세포에서 생성되는 사이토카인이다. CSF-1는 생물학적 활성 이량체 CSF-1 단백질을 형성하는 2개의 "단량체" 폴리펩티드로 구성된다. CSF-1은 교대식 RNA 스플라이싱, 단백질 전구체의 단백질가수분해 프로세싱 및 당화와 프로테오글리칸 부가를 포함한 번역후 개질에 기인하여 적어도 3종의 성숙한 형태로 존재한다(예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: Cerretti DP et al. 1988, Mol Immunol, 25(8),761; Pixley FJ and Stanley ER, 2004, Trends in Cell Biology, 14(1 1) 628-38; Douglass, TG et al, 2008, Int Immunopharmacol, 8, 1354-76). CSF-1 단백질의 다양한 형태는 2종의 분비 분자를 포함하는데, 하나는 당화되고, 다른 하나는 보다 긴 아미노 말단 서열 및 프로테오글리칸 개질을 포함한다. 다른 변이체는 당화되지만 프로테오글리칸 모이어티는 갖지 않는 경막(TM) 분자이다. 이러한 막 형태는 단백질가수분해 절단을 통해 발산되어, 활성 가용성 분자를 방출하게 된다. 모든 형태는 아미노 말단에 32개 아미노산 신호 서열, 카르복실 말단 근처에 대략 23개 아미노산의 추정 경막 영역 및 짧은 세포질 COOH-말단 꼬리부를 갖는 전구체로서 생성된다. 전구체 펩티드는 이후에 아미노 말단 및 카르복실 말단 단백질가수분해 절단에 의해 처리되어 수용체 결합 도메인을 구성하고 잔기 1-149가 동일한 CSF-1의 성숙한 형태를 생성한다. 생체내에서, CSF-1 단량체는 당화되고, 이황화 연결을 통해 이량체화된다. CSF-1은 혈액 세포의 생성을 촉진하는 생물학적 효현제 군에 속한다. 구체적으로, 이는 단핵 식세포 계통의 골수 전구체 세포에 대해 성장, 분화 및 생존 인자로서 작용한다. 또한, CSF-1은 반응 세포 상의 특이적 수용체를 통해 마크로파지의 생존, 증식 및 기능을 자극한다.
CSF-1 수용체(CSF-1R)는 또한 c-fms 유전자 산물 또는 CD115라고도 한다. CSF-1R은 제III형 수용체 티로신 키나아제 패밀리에 속하는 165 kDa의 제1형 TM 당단백질이다. CSF-1이외에도, 구조적으로 유사하지만 서열 비관련 분자 IL-34도 역시 CSF-1R의 리간드인 것으로 확인되었다(Lin, et al. 2008, Science 320:807-81 1). CSF-1R의 발현은 파골세포를 포함한, 순환 및 체류 조직 개체군인, 단핵구-마크로파지 계통의 세포에 주로 국한된다. 또한, 난모세포, 탈락막 세포 및 영양아층을 포함하는 여성 생식계의 수많은 세포에서 발현된다(Pollard JW and Stanley ER, 1996 Advances in Developmental Biochemistry Vol 4, 1996, Pages 153-193(Pleiotropic Roles for CSF-1 in Development Defined by the Mouse Mutation Osteopetrotic); Arceci RJ, PNAS 1989, 86(22), 8818-8822(Temporal Expression and Location of CSF-1 and its receptor in Female Reproductive Tract are consistent with CSF-1-Regulated Placental Development); Arceci, RJ et al, 1992, 151 (1), 1-8; Dev Biol; Regenstreif LJ and Rossant J, Dev Biol 1989 May; 133(1): 284-94(Expression of the c-fms-oncogene and of the cytokine, CSF-1, during mouse embryogenesis), Pampfer S et al, Biol Reprod 1992, 46(1), 48-57(Expression of the CSF-1 receptor(c-fms proto-oncogene product) in the human uterus and placenta; Jokhi PP et al, Lab Invest 1993, 68(3), 308-320(Expression of the CSF-1 receptor(c-fms product) by cells at the human uteroplacental interface); Kauma SW et al, J Clin Endocrinol Metab 1991, 73(4), 746-751(CSF-1 and c-fms expression in human endometrial tissues and placenta during the menstrual cycle and early pregnancy), Byrne J Cell Biol 1981 91(3 Pt 1) 848-53, Hofstetter W et al, Bone 1995, 17, (2), 145-151; Tanaka S et al, 1993, J Clin Invest, 91: 257-63; Weir EC et al, 1993, J Bone Miner Res, 8(12) 1507-18.
CSF-1 수용체에 리간드 CSF-1의 결합은 그의 티로신 키나제 도메인의 작용을 통해 1 이상의 티로신 잔기에서 수용체의 인산화를 일으킨다. 이러한 인산화는 인산화후에만 수용체에 결합하는 항체를 이용할 수 있기 때문에 검출할 수 있다(예를 들어, Cell Signaling Technology사의 Phospho-M-CSF-수용체(Tyr546) 항체 #3083).
CSF-1R에 대한 항체가 당분야에서 알려져 있다. 문헌 [Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793]은 CSF-1 활성을 억제하는 CSF-1R에 대한 항체를 기술한다(Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793). WO09/026303는 항-쥣과동물 CSF-1R 항체를 사용해 생체내 마우스 종양 모델 및 인간 CSF-1R에 결합하는 항-CSF-1R 항체를 개시한다. WO11/123381은 CSF-1R을 내재화시키고 ADCC 활성을 갖는 항-CSF-1R 항체를 개시한다. WO11/123381은 항-쥣과동물 CSF-1R 항체를 사용하는 생체내 마우스 종양 모델을 개시한다. WO11/140249는 암 치료에 유용하다고 언급된 CSF-1R에 CSF-1의 결합을 차단하는 항-CSF-1R 항체를 개시한다. WO09/112245는 CSF-1R과 CSF-1 결합을 억제하고 암, 염증성 장 질환 및 류마티스성 관절염의 치료에 유용한 것으로 언급된 항-CSF-1R IgG1 항체를 개시한다. WO11/131407은 CSF-1R에 CSF-1 결합을 억제하고 골 손실 및 암의 치료에 유용한 것으로 언급된 항-CSF-1R 항체를 개시한다. WO11/107553은 CSF-1R에 CSF-1 결합을 억제하고 골 손실 및 암의 치료에 유용한 것으로 언급된 항-CSF-1R 항체를 개시한다. WO11/070024는 인간 CSF-1R 단편 delD4에 결합하는 항-CSF-1R 항체를 개시한다.
항-CSF-1R 항체는 현재 암 및 류마티스성 관절염 치료를 위해 개발중이다.
용어 "섬유성 질환"은 비정상적인 상처 치유 반응을 의미하고 여기서 과도한 섬유성 연결 조직이 장기 또는 조직에 형성된다. 과도한 세포외 매트릭스(ECM) 성분 예컨대 콜라겐 및 피브로넥틴의 침착 및 축적은 조직의 경화 및 흉터를 야기하고 궁극적으로 장기 부전을 초래할 수 있다.
상처는 잠정적인 세포외 매트릭스(ECM)의 발생과 함께 즉각적인 응집 및 응고 반응을 일으킨다. 초기 혈소판 응집 및 활성화는 혈관확장으로 특징되는 염증성 반응의 촉진 및 혈관 투과성 증가를 도와서, 상처 부위로 호중구, 마크로파지, 호산구 및 림프구를 포함한 다양한 면역 세포의 동원을 가능하게 한다. 호중구 및 마크로파지는 상처 괴사조직을 제거하여서 감염 위험성을 감소시키고 활성화된 림프구와 함께 염증성 반응을 더 증폭시키는 역할을 하는 다양한 성장 인자 및 사이토카인을 분비한다. 분자 예컨대 TGFβ, PDGF 및 IL-13은 마크로파지를 활성화시키고 상처 부위에서 섬유아세포의 동원, 증식 및 활성화를 야기한다. 활성화된 섬유아세포 또는 근섬유아세포는 α-평활근 액틴 및 분비 콜라겐 및 다른 ECM 성분의 발현을 특징으로 한다. 활성화된 섬유아세포는 콜라겐 격자를 수축시켜서, 상처 모서리를 중심으로 끌어당긴다. 상피 및 내피 세포는 증식하고 일시적인 메트릭스 상으로 이동하여서 매트릭스 성분의 분해와 커플링된 손상 조직을 재생시키고, 상처 회복을 완료한다.
하지만, 지속적인 조직 상해 또는 손상, 또는 복구 경로의 이상조절은 부적절한 상처 반응을 초래한다. 이후에 콜라겐 및 ECM의 과도한 침착 및 초가교가 일어나서, 정상 조직 구조 대신에 상흔 조직의 과도한 형성 및 경화가 야기된다.
수많은 접근법들은 폐 섬유증의 마우스 모델에서 마크로파지가 고갈될때 질환 중증도가 감소됨을 보여주었다(Zhang-Hoover J et al, Immunology, 2000, 101(4): 501-511; Gibbons MA et al, Am J Respir Crit Care Med, 2011, 184(5); Murray, LA et al, 2011, Int J Biochem Cell Biol, 43, 154-62). 고갈은 리포솜 클로드로네이트의 투여 또는 CD11c-디프테리아 독소 수용체 형질전환 마우스의 사용을 통해 달성되었으며, 여기서 단핵구/마크로파지 세포는 디프테리아 독소 분자의 주사를 통해 제거되었다. 유사하게, 간 섬유증(Duffield JS et al, J Clin Invest, 2005, 115(1): 56-65) 및 신장 섬유증(Lin SL, et al, 2009, J Immunol, 183, 6733-43) 모델에서, 마크로파지 고갈은 병리학적 손상 및 콜라겐 침착을 감소시켰다. op/op 마우스는 절단형, 비기능성 단백질이 발현되게 되는 CSF-1 리간드 DNA 서열 내 돌연변이를 갖는다. 이들 마우스는 골석화증 표현형이 나타나고 마크로파지 결핍이다. 폐 섬유증의 블레오마이신 모델에서 이용시, 질환 중증도는 야생형 마우스와 비교하여 상당히 감소된다(Baran et al, 2007, Am J Respir Crit Care Med, 176, 78-89).
마크로파지는 적어도 2가지 기능적 표현형, M1 및 M2로 분류될 수 있으므로, 그들의 역할에 복잡성(Mantovani, A et al, 2004, Trends in Immunol, 25(12), 677-86; Mantovani, A et al, 2007, Eur J Immunol, 37, 14-16; Mosser DM and Edwards JP, 2008, Nat Rev Immunol, 8, 958-)이 더해지는데 여기서 M2 마크로파지는 프로섬유증 특징을 보유한다(Lupher, ML and Gallatin, WM, 2006, Adv Immunol, 89, 245-88; Prasse A et al, 2006, Am J Resp Crit Care Med, 173, 781-92; Pechkovsky, DV et al, 2010, Clin Immunol, 137 (1), 89-1-1; Gibbons MA et al, 2011, Am J Resp Crit Care Med, 184, 569-81).
섬유성 질환의 예에는 폐섬유증, 예컨대 특발성 폐섬유증(IPF), 규폐증, 낭포성 섬유증, 신장 섬유증, 간 섬유증, 간 경변증, 원발성 경화성 담관염, 원발성 담즙성 간경화증, 심내막심근 섬유증, 종격동 섬유증, 골수 섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 괴상 섬유증, 신성 전신 섬유증, 크론병, 켈로이드, 심근경색증, 전신 경화증 및 관절섬유증이 포함된다.
섬유성 질환의 원인은 관여되는 장기 또는 조직에 의존적이고 일부 질환 예컨대 특발성 폐섬유증에서는 알려지지 않았다. 간 섬유증 및 궁극적으로 간경변증은 환경 및 식이 인자 또는 감염성 작용제를 포함한 다양한 인자에 대한 노출을 통해 지속된 만성 간 손상에 의한다. 장기간 B형 및 C형 간염 바이러스 감염은 간 섬유증을 야기할 수 있다. 지속적인 알콜 섭취 또는 고 지방/당 식이 역시 간의 경화를 초래할 수 있다. 유사하게, 당뇨병은 신장을 손상시키고 상처내어서 기능 손실을 야기할 수 있다. 가족성 폐섬유증에서, 가족 구성원들은 원인이되는 유전적 요인(들)이 알려져 있지 않지만 섬유증에 대한 감수성이 높다.
IPF는 원인을 모르는 만성, 진행형 질환이며 7가지 특발성 간질성 폐렴 중 하나이다(American Thoracic Society/European Respiratory Society Multidisciplinary Consensus Classification of the Idiopathic Interstitial Pneumonias, 2002, Am J Respir Crit Care Med, 165:277-304). 폐포 상피 세포에 대한 반복적인 손상은 IPF의 전형적인 조직 병리학적 특성을 야기시키는 섬유화 과정을 촉진시키는데서 핵심적인 역할을 하는 것으로 여겨진다(Selman M, 2001, Ann Intern Med, 134(2): 136-51; Gross TJ and Hunninghake GW, 2001). 수많은 위험 인자들, 구체적으로 흡입된 독소 및 작용제들이 상피 세포 손상을 야기할 수 있다. 흡연은 나무 먼지, 금속 먼지, 실리카 또는 다른 광물 먼지에 노출이 IPF 발병 위험성을 증가시킨다고 보고되었지만 그러한 가능성있는 인자 중 하나로 확인되었다([Borchers AT et al, 2011 Clinic Rev Allerg Immunol, 40: 117-134]에서 고찰됨); Maher TM, 2012, Clin Chest Med, 33: 69-83). IPF 환자에 대한 예후는 중간 생존 범위가 진단 후 2-5년으로 좋지 않다(Gribbin J, et al, 2006, Thorax, 61: 980-85; King TE Jr, 2001, Am J Respir Care Med, 1664: 1171-81; Fernandez Perez ER et al, 2010, Chest, 137: 129-37; Lee HL et al, 2005, Chest, 127:2034-41).
섬유성 질환의 치료는 전형적으로 항염증제 및 면역억제제를 포함하지만 이들은 환자에게 그 혜택이 적다. 이들 치료의 효능 결여는 염증성 상태가 아니라 상처 치유에 대한 이상 반응으로 인해, 대체로 IPF 및 섬유성 질환의 재고려에 기인한다. 피르페니돈은 완전하게 이해되지는 않았지만 부분적으로 TGF-β의 하향 조절을 통해 작용하게 되는 다양한 작용 기전을 통해 아마도 작동하는 것으로 예상되는, 2008년 일본 및 2011년 유럽에서 IPF의 치료에 사용이 승인된 소형 분자 약물이다. 지금까지, 섬유증 징후에 대해 승인된 표적 요법은 없다.
따라서, 현재 섬유성 질환의 개선된 치료를 위한 충족되지 않은 의학적 요구가 존재한다. 예를 들어, IPF의 경우 3년 생존률이 50%이고 5년 생존률은 고작 20%이며 약 20%의 사례는 이식이 요구된다.
따라서, 섬유성 질환의 새로운 치료 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
놀랍게도, 본 발명자들은 섬유성 질환의 치료에서 CSF-1R 활성 억제제가 활성이 있음을 검증할 수 있다. 구체적으로, 본 발명자들은CSF-1R 활성을 억제하는 항-CSF-1R 항체가 폐 섬유증의 생체내 동물 모델에서 활성이 있음을 입증할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한, CSF-1R 활성 억제제를 제공한다. 본 발명은 또한, 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에서, CSF-1R 활성 억제제의 용도를 제공한다. 본 발명은 CSF-1R 활성 억제제의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 방법을 더 제공한다.
본 출원에서, 용어 "섬유성 질환"은 과도한 섬유성 연결 조직이 장기 또는 조직에 형성된, 상처 치유에 대한 이상 반응을 특징으로 하는 질환을 포함한다. 예시적인 섬유성 질환은 제한없이, 폐섬유증, 예컨대 특발성 폐섬유증, 규폐증 및 낭포성 섬유증; 관형 위축증 및 간질성 섬유증을 포함한 신장 섬유증, 간 섬유증 및 간 경변증, 원발성 경화성 담관염, 원발성 담즙성 간경화증, 심내막심근 섬유증, 종격동 섬유증, 골수 섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 괴상 섬유증, 신성 전신 섬유증, 크론병, 켈로이드, 심근경색증, 경피증, 전신 경화증 및 관절섬유증을 포함한다.
본원에서 사용하는 용어 'CSF-1R 활성'은 CSF-1R에 대해 당분야에서 이해하는 활성 범위, 구체적으로 인간 CSF-1R 및 이의 이소폼, 예를 들어 1, 2, 3 또는 모든 이소폼의 활성을 의미한다. 예를 들어, 수용체에 리간드의 결합은 특정 티로신 잔기에서 CSF-1R의 인산화(Bourette RP and Rohrschneider LR, 2000, Growth Factors 17: 155-166)를 유도하고 그 결과로 수반되는 신호 전달 사건의 캐스캐이드는 세포 이동, 생존, 분화 및 증식을 매개하게 된다(Suzu S et al, 1997, J Immunol, 159, 1860-7; Yeung Y-G and Stanley ER, 2003, Mol Cell Proteomics, 2, 1143-55; Yu W et al 2008, J Leukoc Biol84(3), 852-63). 선택된 티로신 잔기 대신 페닐알라닌 잔기를 포함하는 돌연변이체 CSF-1R 수용체 분자의 형질감염 세포의 발현은 특정한 티로산 잔기와 세포내 결과 예컨대 생존, 증식 및 형태의 연관성을 밝혀주었다(Yu et al J Leukoc Biol 2008 Sep 84(3): 852-863). 분자 특이적 항체와 함께 항인산화티로신 항체를 사용하는 면역블랏팅 기술 및 단백질체학적 접근법으로 이 수용체의 리간드 자극 이후 세포의 이러한 기능들을 매개하는데 관여하는 다수의 분자들이 동정되었다(Yeung Y-G et al, 1998, J Biol Chem. 13, 273(46): 17128-37; Husson H et al, 1997, Oncogenel5, 14(19): 2331-8).
일 실시양태에서 피험체는 포유동물, 예를 들어 인간이다.
본 발명에 따른 CSF-1R 활성 억제제는 예를 들어 CSF-1R의 활성, 구체적으로 섬유성 질환에서 CSF-1R 활성을 방해, 예를 들어 감소/억제 또는 차단하는 작용제이다. 특히 바람직하게는 IPF에서 CSF-1R 활성을 방해하는 작용제이다. 본 발명에 따른 억제제는 부분적으로 또는 완전하게 CSF-1R 활성을 억제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 억제제는 제한없이, IL-34, CSF-1 또는 CSF-1 수용체(CSF-1R) 또는 IL-34, CSF-1 또는 CSF-1R을 코딩하는 핵산 분자와 상호작용(예를 들어, 결합 또는 인식)할 수 있거나, IL-34, CSF-1 또는 CSF-1R의 발현을 억제할 수 있거나, 또는 CSF-1R 및 CSF-1 및/또는 IL-34 간 상호작용을 억제할 수 있는 억제제를 포함한다. 이러한 억제제는 제한없이, 항체, 핵산(예를 들어, DNA, RNA, 안티센스 RNA 및 siRNA), 탄수화물, 지질, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드모방체, 소형 분자 및 다른 약물을 포함한다. 일 실시양태에서, 억제제는 수용체 CSF-1R에 CSF-1의 결합을 차단한다.
적합한 억제제의 예에는 제한없이, CSF-1에 결합하여 천연 CSF-1 수용체에의 결합을 방해하는 CSF-1 수용체의 합성 기능적 단편, CSF-1 수용체에 결합하여 천연 CSF-1 수용체와의 결합을 방해하는 CSf-1의 합성 기능성 단편, CSF-1 수용체에 결합하여 천연 CSF-1 수용체와의 결합을 방해하는 IL-34의 합성 기능성 단편, CSF-1 또는 IL-34 또는 CSF-1 수용체에 결합하여 CSF-1 수용체-리간드 상호작용을 방해하는 항체, CSF-1, IL-34 또는 CSF-1 수용체를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 혼성화되는 안티센스 핵산 분자 또는 IL-34, CSF-1 또는 CSF-1R의 활성을 억제하는 소형 분자 또는 다른 약물을 포함한다.
CSF-1 수용체 활성의 억제제는 그러한 억제제를 동정하고 생산하는 방법에 의해 당분야에서 알려져 있다. 중화 항-CSF-1 항체가 예를 들어, [Weir et al, 1996, J Bone Miner. Res.l 1, 1474-1481] 및 [Haran-Ghera et al, 1997, Blood, 89, 2537-2545]에 기술되어 있고, 또한 항-CSF-1R 항체도 기술되어 있다. CSF-1의 안티센트 길항제가 또한 (EP1223980)에 기술되어 있다.
적합한 억제제가 될 수 있는 작용제는 광범위하게 다양한 후보 작용제로부터 선택할 수 있다. 후보 작용제의 예에는 제한없이, 핵산(예를 들어, DNA 및 RNA), 탄수화물, 지질, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드모방체, 소형 분자 및 다른 약물이 포함된다. 작용제는 생물학적 라이브러리; 공간적으로 위치지정가능한 평형 고체상 또는 액체상 라이브러리; 디컨볼루션이 필요한 합성 라이브러리 방법; "원-비드 원-화합물" 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선별을 사용한 합성 라이브러리 방법을 포함한, 당분야에 알려진 조합 라이브러리 방법의 다양한 임의의 접근법을 사용해 얻을 수 있다. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리에 적합한 반면, 다른 4가지 접근법은 화합물의 펩티드, 비펩티드 올리고머 또는소형 분자 라이브러리에 적용가능하다(Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145; U.S. 5,738,996; 및 U.S. 5,807,683).
분자 라이브러리의 합성에 대한 본 설명을 기초로 적합한 방법의 예는 당분야 예를 들어, 다음의 문헌들에서 확인할 수 있다: [DeWitt et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al, 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al, 1993, Science 261:1303; Carrell et al, 1994, Angew. Chem. hit. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al, 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and Gallop et al, 1994, J. Med. Chem. 37: 1233].
화합물의 라이브러리는 예를 들어, 용액 중에(Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421), 또는 비드 상에(Lam, 1991, Nature 354:82-84), 칩(Fodor, 1993, Nature 364:555-556), 박테리아(US 5,223,409), 포자(US 5,571,698; 5,403,484; 및 5,223,409), 플라스미드(Cull et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865- 1869) 또는 파지(Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; 및 Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310)에 존재할 수 있다.
일례에서, 본 발명에서 사용하기 위한 억제제는 핵산이어도 된다. 구체적으로, CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 핵산 분자는 상보성 핵산에 결합하여 그들 개별 폴리펩티드의 발현을 변경시키는, 안티센스 분자로서 사용될 수도 있다. CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 핵산은 예를 들어 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 표준 클로닝 기술을 사용해 얻거나 또는 잘 알려지고 상업적으로 이용가능한 기술을 사용해 합성할 수도 있다. CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 핵산은 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 핵산의 뉴클레오티드 서열에 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 함유해도 된다. 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발법 및 PCR-매개 돌연변이유발법을 포함하는, 당분야의 숙련가에게 공지된 표준 기술을 사용해 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 핵산은 개별 폴리펩티드를 코딩하는 RNA(바람직하게는 mRNA)의 일부분에 대한 일부 서열 상보성을 통해 혼성화할 수 있는 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 핵산을 포함한다. 안티센스 핵산은 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 코딩 및/또는 비코딩 영역에 상보적일 수 있다. 가장 바람직하게, 안티센스 핵산은 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드의 발현을 억제한다. 따라서, 본 발명은 CSF-1R 활성 억제제의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 방법을 제공하고 여기서 억제제는 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 cDNA에 대한 안티센스인 적어도 8 뉴클레오티드(예를 들어 15 내지 22 뉴클레오티드, 예컨대 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 뉴클레오티드)를 포함한다. 본 발명은 또한 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 cDNA에 대한 안티센스인 적어도 8 뉴클레오티드(예를 들어 15 내지 22 뉴클레오티드, 예컨대 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 뉴클레오티드)를 포함하는 핵산의 용도를 제공한다.
일 실시양태에서, 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 억제제는 CSF-1R의 활성을 억제하는 항체이다. 따라서, 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약을 제조를 위한 CSF-1R 활성을 억제하는 항체의 용도를 제공한다. 또한 피험체에서 섬유성 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하고 이 방법은 상기 피험체에게 CSF-1R의 활성을 억제하는 항체의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 섬유성 질환의 치료 및/또는 에방에 사용하기 위한 억제제는 CSF-1 또는 IL-34와 상호작용(즉, 결합 또는 인식)하는 항체이다. 일 실시양태에서, 항체는 CSF-1 또는 IL-34와 선택적으로 상호작용한다. 선택적으로 상호작용(예를 들어, 인식 또는 결합)은 항체가 다른 폴리펩티드에 대한 것보다 CSF-1 또는 IL-34에 대해 보다 높은 친화성을 가짐을 의미한다. 적합한 항체의 예는 생물학적으로 활성인 것을 방지하는 방식으로 CSF-1 또는 IL-34에 결합하여, 예를 들어, CSF-1 또는 IL-34가 그의 수용체에 결합하는 것을 방지하여서, CSF-1 또는 IL-34의 활성을 억제하는 것들이다. 따라서, 본 발명은 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 항-CSF-1 항체 또는 항-IL-34 항체의 용도를 제공한다.
가장 바람직하게, 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 억제제는 CSF-1R과 상호작용(즉, 결합 또는 인식)하여 CSF-1R의 활성을 억제하는 항체이다. 일례에서, 항체는 CSF-1R과 선택적으로 상호작용한다. 선택적으로 상호작용(예를 들어, 인식 또는 결합)은 항체가 다른 폴리펩티드에 대한 것보다 CSF-1R 폴리펩티드에 대한 친화성이 더 큼을 의미한다. 적합한 항체의 예는 생물학적으로 활성인 것을 방지하는 방식으로 CSF-1R에 결합하여 CSF-1R의 활성을 억제하는 것들이다.
일 실시양태에서, 항체는 CSF-1R의 이소폼, 예를 들어 인간 CSF-1R 및 이의 이소폼을 인식한다.
일 실시양태에서, 항-CSF-1R 항체는 CSF-1R에 리간드 결합을 차단할 수 있다. 본원에서 적용하는 차단은 수용체를 폐색시키는 것과 같은 물리적 차단을 의미하지만 또한 항체 또는 단편이 예를 들어 수용체에 대한 천연 리간드가 더 이상 결합하지 않음을 의미하는 입체형태 변화를 야기시키는 에피토프에 결합하는 경우를 포함하게 된다. CSF-1R을 차단하는 항체의 능력을 결정하는데 적합한 어세이는 본원의 실시예, 예를 들어 실시예 2에 기술되어 있다. BIAcore는 결합 동력학을 측정하는데 채택되는 어세이의 일례이고, ELISA 어세이 또는 단핵구 또는 THP-1 세포를 적용하는 세포 기반 어세이도 유용할 수 있다. CSF-1 및 IL-34는 둘 모두 CSF-1R에 대한 리간드이고 항-CSF-1R 항체는 CSF-1 또는 IL-34의 CSF-1R에 대한 결합을 차단하지만 바람직하게는 CSF-1 및 IL-34 둘 모두가 CSF-1R에 결합하는 것을 차단한다. 항-CSF-1R 항체는 또한 바람직하게는 CSF-1R 활성화 또는 CSF-1R 내재화를 야기하지 않는다. CSF-1R 활성화 또는 CSF-1R 내재화를 야기하는 항체의 능력을 결정하는데 적합한 어세이는 실시예, CSF-1 의존적 증식을 측정하는 어세이를 기술한 실시예 2에 기술되어 있다.
따라서, 본 발명은 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 항-CSF-1R 항체의 용도를 제공한다. 또한 본 발명은 피험체에서 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방 방법을 제공하고 이 방법은 상기 피험체에게 항-CSF-1R 항체의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포는 상기 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다. CSF-1, IL-34 및 CSF-1R 폴리펩티드는 '성숙한' 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체일 수 있다. 바람직하게 CSF-1 폴리펩티드는 생물학적 활성에 중요한 것으로 여겨지는 아미노산 1-149를 함유한다.
본원에서 사용하는 CSF-1R은 CSF-1R이라고 명명된 단백질, 이의 이소폼 및 이의 생물학적 활성 단편을 의미한다. 일 실시양태에서, CSF-1R은 인간 단백질 또는 이의 이소폼이다.
대체로, 본 발명에서 사용되는 항체는 CSF-1R의 세포외 도메인에 대해 유도된다.
도 1a는 인간 CSF1-R의 전체 972 아미노산 서열을 도시한 것이고 여기서 잔기 1-19는 예상 신호 펩티드이다. 바람직하게 CSF-1R 폴리펩티드는 도 1a에 도시된 인간 CSF-1R의 아미노산 20-517을 함유한다. 아미노산 20-517은 CSF-1R 서열의 예상 세포외 영역을 나타낸다. 도 1b는 CSF-1R의 일부 교대 형태를 도시한다.
인간 CSF-1R은 P07333으로 UniProt 데이타베이스에 등록되어 있다.
CSF-1 및 CSF-1R 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전자 조직 숙주 세포로부터 당분야에 공지된 방법들을 통해 제조되거나 또는 천연 생물학적 공급원으로부터 회수될 수도 있다.
일 실시양태에서, 도 1c에 도시된 서열을 적합한 세포주에 형질감염시켜서 폴리펩티드를 세포 표면 상에 발현시켰다. 상기 발현을 촉진하기 위해서 아미노산 단편을 GPI-앵커에 융합시켜도 된다. 이후에 이 세포는 인간을 면역화시키는데 사용될 수도 있다.
본 출원에서 용어 "폴리펩티드"는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 이들은 달리 특정하지 않으면 상호교환적으로 사용된다. CSF-1 또는 CSF-1R 폴리펩티드는 일례에서 보다 큰 단백질 예컨대 예를 들어 친화성 태그에 융합된 융합 단백질의 일부분이어도 된다.
이들 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 폴리펩티드 또는 이를 발현하는 세포를 당분야에 알려진 통상적인 프로토콜을 사용해, 동물, 바람직하게는 인간이외의 동물에 투여하여 얻을 수 있고, 예를 들어, [Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986]를 참조한다. 많은 온혈 동물, 예컨대 토끼, 마우스, 래트, 양, 소 또는 돼지가 면역화될수 있다. 하지만, 대체로 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 바람직하다.
단일클론 항체는 당분야에 알려진 방법 예컨대 하이브리도마 기술(Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al, 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, p77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)을 통해 제조해도 된다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체는 또한 예를 들어 [Babcook, J. et al, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848, WO92/02551 및 WO2004/051268 및 WO2004/106377]에 기술된 방법에 의해 특이적 항체의 생산을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성되는 면역글로불린 가변 영역 cDNA의 클로닝 및 발현을 통한 단일클론 림프구 항체 방법을 사용해 생성시켜도 된다.
본원에서 사용하는 특이적은 특이적인 항원만을 인식하는 항체 또는 비특이적인 항원과의 결합과 비교하여 특이적인 항원에 대해 유의하게 더 높은 결합 특이성, 예를 들어 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10 배 이상 더 높은 결합 친화성을 갖는 항체를 의미하고자 한다.
키메라 항체는 경쇄 및 중쇄 유전자가 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 절편으로 구성되도록 유전자 조작된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 항체이다. 이들 키메라 항체는 덜 항원성인 경향이 있다. 2가 항체는 당분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있다(Milstein et al, 1983, Nature 305:537-539; WO 93/08829, Traunecker et al, 1991, EMBO J. 10:3655-3659). 다가 항체는 복수의 특이성을 포함하거나 또는 단일특이성일 수 있다(예를 들어, WO 92/22853을 참조함).
일 실시양태에서 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 인간화된다. 본원에서 사용하는 용어 '인간화 항체 분자'는 항체 분자로서 중쇄 및/또는 경쇄가 억셉터 항체(예를 들어, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크에 그라프트된 도너 항체(예를 들어, 쥣과동물 단일클론 항체) 유래의 1 이상의 CDR(바람직하다면 1 이상의 개질된 CDR)을 함유한다(예를 들어, US 5,585,089; WO91/09967을 참조함). 개괄적으로, [Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]를 참조한다.
일 실시양태에서 전체 CDR이 전달되기 보다는, 상기 본원에 기술된 CDR 중 어느 하나 유래의 특이성 결정 잔기 중 1 이상만이 인간 항체 프레임워크로 전달된다(예를 들어, [Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34]를 참조함). 일 실시양태에서 상기 본원에 기술된 CDR 중 1 이상에서 유래된 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 전달된다. 다른 실시양태에서, 상기 본원에 기술된 CDR 각각에서 유래되는 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다.
본 발명의 인간화 항체에서, 프레임워크 영역은 억셉터 항체의 것과 정확하게 같은 서열을 가질 필요는 없다. 예를 들어, 일반적이지 않은 잔기가 억셉터 사슬 부류 또는 유형에 대해 보다 더 빈번하게 발생되는 잔기로 변화되어도 된다. 대안적으로, 억셉터 프레임워크 영역 내에 선별된 잔기는 그들이 도너 항체의 동일 위치에서 발견되는 잔기에 상응하도록 변화되어도 된다([Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324] 참조). 그러한 변화는 도너 항체의 친화성을 회복하는데 필요한 최소로 유지되어야 한다. 변화가 필요할수도 있는 억셉터 프레임워크 영역 내 잔기를 선택하는 프로토콜은 W091/09967에 기재되어 있다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 그라프트되는 경우, 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 포함하여, CDR이 유래되는 도너 항체의 부류/유형을 고려해서 임의의 적합한 억셉터 가변 영역 프레임워크 서열을 사용할 수 있다.
적합하게, 인간화된 항체는 CDR 중 1 이상뿐만 아니라 인간 억셉터 프레임워크 영역을 포함하는 가변 도메인을 갖는다. 따라서, 일 실시양태에서, 인간 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R에 결합하는 인간화 항체로서 가변 도메인이 인간 억셉터 프레임워크 영역 및 인간이외 도너 CDR을 포함하는 인간화 항체를 제공한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 인간 프레임워크의 예에는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이 있다(Kabat et al, 상동). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 사용될 수 있고, REI는 경쇄에 사용되며 EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 배선 서열이 사용될 수도 있으며, 이들은 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk에서 입수가능하다.
본 발명의 인간화 항체에서, 억셉터 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없고, 바람직하다면 상이한 사슬로부터 유래된 프레임워크 영역을 갖는 복합 사슬을 포함해도 된다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체는 당분야에 알려진 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용해 생성될 수도 있으며 [Brinkman et al.(in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al.(J. Immunol. Methods, 1995, 184: 177- 186), Kettleborough et al(Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al.(Gene, 1997 187 9-18), Burton et al(Advances in Immunology, 1994, 57: 191-280) 및 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108]에 개시된 것들을 포함한다. US 4,946,778에 기술된 것과 같은, 단쇄 항체의 생산 기술을 또한 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드에 대한 단쇄 항체를 생성시키기 위해 조정될 수 있다. 다른 포유동물을 포함하여, 형질전환 마우스, 또는 다른 유기체가 인간화 항체를 발현시키는데 사용되어도 된다.
본 발명에서 사용되는 항체는 전체 길이 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자 또는 이의 단편을 포함할 수 있고, 제한없이, Fab, 개질된 Fab, Fab', 개질된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 임의의 상기의 에피토프 결합 단편일 수 있다(예를 들어, [Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217]를 참조함). 이들 항체 단편을 생성 및 제작하는 방법은 당분야에 공지되어 있다(예를 들어, [Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181]를 참조). 본 발명에서 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특히 출원 WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 기술된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성, 예를 들어 이중특이성을 포함하거나 또는 단일특이성이어도 된다(예를 들어, WO 92/22853, WO05/1 13605, WO2009/040562 및 WO2010/035012를 참조함).
일 실시양태에서 항체는 참조하여 모두 본원에 편입되는 예를 들어 WO2009/040562, WO2010/035012, WO2011/030107, WO2011/061492 및 WO2011/086091에 기술된 바와 같이, 면역글로불린 모이어티, 예를 들어 Fab 또는 Fab' 단편을 포함를 포함하는 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 결합 항체 융합 단백질, 및 그에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 1 또는 2개 단일 도메인 항체(dAb)로서 제공된다.
일 실시양태에서 융합 단백질은 경우에 따라 디설피드 결합에 의해 연결된, 예를 들어 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 쌍으로서, 2개 도메인 항체를 포함한다.
일 실시양태에서 융합 단백질의 Fab 또는 Fab' 성분은 단일 도메인 항체 또는 항체들에 대해 동일하거나 또는 유사한 특이성을 갖는다. 일 실시양태에서 Fab 또는 Fab'은 단일 도메인 항체 또는 항체들에 대해 상이한 특이성을 가지며, 다시말해서, 융합 단백질은 다가이다. 일 실시양태에서 본 발명에 따른 다가 융합 단백질은 알부빈 결합 부위를 가지며, 예를 들어, 그 안의 VH/VL 쌍은 알부민 결합 부위를 제공한다.
항체 단편 및 이들을 생산하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, [Verma et al, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181]을 참조한다. 본 발명에서 사용하기 위한 항체 단편의 특정예는 천연 또는 개질된 힌지 영역을 보유하는 Fab' 단편이다. 수많은 개질 힌지 영역이 예를 들어, US 5,677,425, W099/15549, 및 W098/25971에 이미 기술되어 있고, 이들을 참조하여 본원에 편입시킨다. 본 발명에서 사용하기 위한 특정 항체의 추가 예는 국제 특허 출원 PCT/GB2004/002810, PCT/GB2004/002870 및 PCT/GB2004/002871(이들 모두 2004년 7월 1일에 출원됨)에 기술되어 있는 것들을 포함한다. 구체적으로, 국제 특허 출원 PCT/GB2004/002810에 기술된 개질 항체 Fab 단편이 바람직하다.
일 실시양태에서 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고 항체 경쇄는 카파 또는 람다의 CL 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서 항체 중쇄는 CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고 항체 경쇄는 카파 또는 람다의, CL 도메인을 포함한다.
항체는 임의 부류(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 또는 하위부류의 면역글로불린 분자일 수 있다. 일 실시양태에서 본원에서 사용하기 위한 항체는 IgG 부류이고 임의의 IgG 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서 선택할 수 있다. 상이한 IgG 이소타입에 의한 차등적 ADCC 유도는 FcγR에 대한 이들 잔기의 친화성에 의존적이다. 인간에서, IgG1 및 IgG3은 이펙터 기능을 유도하는 것으로 알려진 반면 IgG2 및 IgG4는 이펙터 기능을 약하게 유도한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 ADCC를 포함하여, 이펙터 기능을 약하게 유도하는 IgG2 또는 IgG4 항체이다. 본 발명에서 섬유성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항체는 이펙터 기능을 갖는 항체의 사용이 환자에서 부작용에 부가될 가능성을 갖는 마크로파지를 포함하여 CSF-1R을 발현하는 세포의 높은 고갈을 야기할 수도 있으므로 이펙터 기능이 제한된 것이 특히 바람직하다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체는 항체의 활성을 변경하기 위한 1 이상의 돌연변이를 포함해도 된다. Angal 등(Angal,S., King,D.J., Bodmer,M.W., Turner,A., Lawson,A.D., Roberts,G., Pedley,B., and Adair,J.R. 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol. Immunol. 30: 105-108)은 IgG4 항체의 절반-분자 형성을 최소화하기 위한 부위 지정 돌연변이유발법을 기술하였다. 이 보고서에서, 코어 힌지 내 단일 아미노산 치환, S241P는 절반-분자 형성을 실질적으로 감소시켰다. 따라서, 항체가 IgG4 항체인 실시양태에서, 항체는 돌연변이 S241P를 포함한다.
항체가 다양한 번역후 개질을 겪을 수 있음은 당분야의 숙련가가 이해할 수 있다. 이들 개질의 유형 및 정도는 항체를 발현시키는데 사용된 숙주 세포주뿐만 아니라 배양 조건에 따라 좌우된다. 이러한 개질은 당화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변이를 포함할 수 있다. 빈번한 개질은 카르복시펩티다아제의 작용에 의한 카르복시 말단 염기성 잔기(예컨대 리신 또는 아르기닌)의 손실이다([Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995에 기재된 바와 같음). 따라서, 항체 중쇄의 C-말단 리신은 없을 수도 있다.
인간 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드의 이러한 특이적 영역 또는 에피토프는 본 발명에 의해 제공되는 항체 중 어느 하나와 조합하여 당분야에 공지된 임의의 적합한 에피토프 맵핑 방법을 통해 동정할 수 있다. 이러한 방법의 예에는 항체에 의해 인식되는 에피토프의 서열을 함유하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 최소 단편을 갖는 본 발명의 항체에 대한 결합에 대해 CSF-1R에서 유래된 다양한 길이의 펩티드를 스크리닝하는 것을 포함한다. CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 펩티드는 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드의 단백질가수분해적 분해에 의해 또는 합성적으로 생성시킬 수 있다. 항체에 결합하는 펩티드는 예를 들어, 질량 분광분석법을 통해 동정할 수 있다. 다른 예에서, NMR 분광분석법 또는 X-선 결정학을 사용하여 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프를 동정할 수 있다. 동정되면, 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프 단편은 필요하다면, 동일한 에피토프에 결합하는 추가 항체를 획득하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다.
생물학적 분자, 예컨대 항체 또는 단편은 산성 및/또는 염기성 작용기를 포함하여서, 분자에 순 양성 또는 음성 전하를 부여한다. 총 "관찰된" 전하의 양은 실체의 절대적인 아미노산 서열, 3D 구조에서 하전된 기의 국소 환경 및 분자의 환경 상태에 의존적이다. 등전점(pi)은 특정 분자 또는 이의 용매 접근가능 표면이 순 전하를 운반하지 않는 pH이다. 일례에서, CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 항체 및 단편은 적절한 등전점을 갖도록 조작될 수 있다. 이는 보다 강건한 특성, 구체적으로 적합한 가용성 및/또는 안정성 프로파일 및/또는 개선된 정제 특징을 갖는 항체 및/또는 단편을 유도하게 된다.
따라서 일 측면에서 본 발명은 원래 동정된 항체와는 상이한 등전점을 갖도록 조작된 인간화 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 아미노산 잔기의 치환 예컨대 산성 아미노산 잔기를 1 이상의 염기성 아미노산 잔기로 치환하여 조작될 수도 있다. 대안적으로, 염기성 아미노산 잔기가 도입되거나 또는 산성 아미노산 잔기를 제거할 수도 있다. 다르게, 분자가 허용할 수 없이 높은 pi 값을 가지면, 필요에 따라 산성 잔기를 제거하여 pi를 낮추어도 된다. pi를 조작할 때 항체 또는 단편의 바람직한 활성이 유지되도록 주의하는 것이 중요하다. 따라서, 일 실시양태에서 조작된 항체 또는 단편은 "미개질된" 항체 또는 단편과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 활성을 갖는다.
프로그램 예컨대 ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html, 및 http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abimcompo-p.html을 사용하여 항체 또는 단편의 등전점을 예측할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 항체의 친화성은 당분야에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용해 변경시킬 수 있음을 이해할 것이다. 따라서 본 발명은 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R에 대해 개선된 친화성을 갖는, 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이다. 그러한 변이체는 CDR의 돌연변이(Yang et al, J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 사슬 셔플링(Marks et al, Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 이.콜라이의 돌연변이체 균주의 사용(Low et al, J. Mol. Biol, 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링(Patten et al, Curr. Opin. BiotechnoL, 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(Thompson et al, J. Mol. Biol, 256, 77-88, 1996) 및 섹슈얼 PCR(Crameri et al, Nature, 391, 288-291, 1998)을 포함하는, 다수의 친화성 성숙화 프로토콜을 통해 얻을 수 있다. Vaughan 등(상동)은 친화성 성숙화에 대한 이들 방법들을 기술하였다.
바람직하다면 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 1 이상의 이펙터 분자(들)에 접합될 수도 있다. 이펙터 분자는 단일 이펙터 분자 또는 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 연결된 2 이상의 그러한 분자를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 이펙터 분자에 연결된 항체 단편을 얻는 것이 바람직한 경우, 항체 단편이 직접적으로 또는 커플링제를 통해 이펙터 분자에 연결되는 표준 화학 또는 재조합 DNA 방법을 통해 제조될 수 있다. 항체에 이러한 이펙터 분자를 접합시키는 기술은 당분야에 공지되어 있다(예를 들어, 다음을 참조함: Hellstrom et ah, Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et ah, eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et ah, 1982 , Immunol. Rev., 62: 119-58 and Dubowchik et ah, 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). 구체적인 화학적 방법은 예를 들어, WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 및 WO 03/031581에 기술된 것들을 포함한다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우, 예를 들어 WO 86/01533 및 EP0392745에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 기술을 사용해 연결을 수행할 수 있다.
본원에서 사용하는 용어 이펙터 분자는 예를 들어, 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성핵종, 구체적으로 방사성요오드화물, 방사성동위원소, 킬레이트화금속, 나노입자 및 리포터 기 예컨대 형광발광성 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광법으로 검출할 수 있는 화합물을 포함한다.
이펙터 분자의 예에는 세포에 유해한(예를 들어, 사멸시킴) 임의의 작용제를 포함한 세포독성제 또는 세포독소가 포함될 수 있다. 예에는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 마이탄시노이드, 스폰지스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스테를린, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 프로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 상동체가 포함된다.
이펙터 분자는 또한 제한없이, 항대사산물(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오쿠아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플라티넘(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에 악티노마이신), 플레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아미신 또는 두오카르마이신), 및 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.
다른 이펙터 분자는 킬레이트화 방사성핵종 예컨대 111In 및 90Y, Lu177, 비스무쓰213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188; 또는 약물 예컨대 제한없이, 알킬포스포콜린, 토포이소머라아제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민를 포함할 수도 있다.
다른 이펙터 분자는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심 효소는 제한없이, 단백질가수분해 효소, 히드롤라아제, 리아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제를 포함한다. 관심 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 제한없이, 면역글로불린, 독소 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소, 단백질 예컨대 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유도 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성인자, 혈전제 또는 항혈관생성제, 예를 들어 안지오스타틴 도는 엔도스타틴, 또는 생물학적 반응 개질제 예컨대 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린을 포함한다.
다른 이펙터 분자는 예를 들어 진단에 유용한 검출가능 물질을 포함해도 된다. 검출가능 물질의 예에는 다양한 효소, 보결기, 형광발광재, 발광성 물질, 생물발광성 물질, 방사능 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층촬영 사용용), 및 비방사능 상자성 금속 이온이 포함된다. 예를 들어, 진단제로서 사용하기 위해 항체에 접합시켜도 되는 금속 이온에 대해 대체적으로 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소는 홀스래디쉬 퍼록시다아제, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스터라아제를 포함하고; 적합한 보결기는 스트렙타비딘, 아비딘 및 비오틴을 포함하며; 적합한 형광발광재는 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 파이코에리스린을 포함하며; 적합한 발광성 물질은 루미놀을 포함하고; 적합한 생물발광 물질은 루시퍼라아제, 루시페린, 및 애쿠오린을 포함하고; 적합한 방사능 핵종은 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
다른 예에서 이펙터 분자는 생체내에서 항체의 반감기를 증가시키고/시키거나 항체의 면역원성을 감소시키고/시키거나 상피 장벽을 거쳐 면역계로 항체의 전달을 강화시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예에는 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물 예컨대 WO05/117984에 기술된 것들이 포함된다.
일 실시양태에서 CSF-1R과 독립적인 이펙터 분자에 의해 제공되는 반감기가 유리하다.
이펙터 분자가 중합체인 경우, 대체로 합성 또는 천연 발생 중합체, 예를 들어 임의 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지형 또는 비분지형 다당류, 예를 들어 동종 또는 이종 다당류일 수 있다.
상기 언급한 합성 중합체에 존재해도 되는 특별한 선택 치환기는 1 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시 기를 포함한다.
합성 중합체의 특정 예에는 임의 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알콜) 또는 이의 유도체, 특히 임의 치환된 폴리(에틸렌글리콜) 예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체가 포함된다.
특별한 천연 발생 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이의 유도체를 포함한다.
일 실시양태에서 중합체는 알부민 또는 이의 단편, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편이다.
본원에서 사용하는 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어 티올-선별적 반응성 기 예컨대 말레이미드 등을 포함하고자 한다. 반응성 기는 직접적으로 또는 링커 절편을 통해 중합체에 연결될 수도 있다. 이러한 기의 잔기는 일례에서 항체 단편과 중합체간 연결 기로서 생성물의 일부를 형성함을 이해하게 될 것이다.
중합체의 크기는 바람직하다면 다양할 수도 있지만, 대체로는 평균 분자량이 500 Da 내지 50000 Da, 예를 들어 5000 내지 40000 Da 예컨대 20000 내지 40000 Da 범위이다. 중합체 크기는 구체적으로 생성물에 대해 의도된 용도 예를 들어 일정 조직 예컨대 종양에 국재하는 능력 또는 순환 반감기를 연장시키는 능력을 기초로 선택된다(예를 들어, [Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545]를 참조한다). 따라서, 예를 들어, 생성물이 순환계를 떠나서 조직을 침투하려는 경우, 예를 들어 종양의 치료에 사용하려는 경우, 소분자량 중합체, 예를 들어 분자량이 대략 5000 Da인 것을 사용하는 것이 유리하다. 생성물을 순환계에 유지시키고자 하는 용도의 경우, 고분자량 중합체, 예를 들어 분자량 범위가 20000 Da 내지 40000 Da인 것을 사용하는 것이 유리하다.
적합한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜) 또는 특히, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체, 및 특히 분자량 범위가 약 15000 Da 내지 약 40000 Da인 것을 포함한다.
일례에서, 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 일 특정예에서, 항체는 항체 단편이고 PEG 분자는 항체 단편에 위치하는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 자유 아미노, 이미노, 티올, 히드록실 또는 카르복실 기를 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에 천연적으로 발생되거나 또는 재조합 DNA 방법을 사용해 단편으로 조작될 수 있다(예를 들어, US 5,219,996; US 5,667,425; W098/25971, WO2008/038024를 참조함). 일례에서 본 발명의 항체 분자는 개질된 Fab 단편으로서 여기서 개질은 이펙터 분자가 부착될 수 있도로 1 이상의 아미노산을 그 중쇄의 C-말단에 부가하는 것이다. 적합하게, 부가된 아미노산은 이펙터 분자가 부착될 수 있는 1 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 개질된 힌지 영역을 형성한다. 다수의 부위를 2 이상의 PEG 분자를 부착시키는데 사용할 수 있다.
적합하게, PEG 분자는 항체 단편에 위치하는 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 공유적으로 연결된다. 개질된 항체 단편에 부착된 각각의 중합체 분자는 단편에 존재하는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유 연결된다. 공유 연결은 대체로 디설피드 결합이거나, 구체적으로 황-탄소 결합이다. 티올 기가 부착점으로 사용되는 경우, 적절하게 활성화된 이펙터 분자, 예를 들어 티올 선택적 유도체 예컨대 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기 기술된 바와 같이 중합체-개질 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응성 기를 함유하는 임의의 중합체 예컨대 α-할로카르복실산 또는 에스테르, 예를 들어 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설피드일 수 있다. 이러한 출발 물질은 상업적으로 입수(예를 들어, Nektar, 이전에 Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA)하거나 또는 통상의 화학 방법을 사용해 시판되는 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 구체적인 PEG 분자는 20K 메톡시-PEG-아민(Nektar, 이전에 Shearwater; Rapp Polymere; 및 SunBio에서 입수) 및 M-PEG-SPA(Nektar, 이전에 Shearwater에서 입수)를 포함한다.
일 실시양태에서, 항체는 예를 들어 EP 0948544 또는 EP 1090037에 개시된 방법에 따라서, PEG화, 즉 그에 공유 부착된 PEG(폴리(에틸렌글리콜))를 갖는, 개질된 Fab 단편, Fab' 단편 또는 diFab이다(또한, 다음의 문헌들을 참조함: "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. 일례에서 PEG는 힌지 영역 내 시스테인에 부착된다. 일례에서, PEG 개질된 Fab 단편은 개질된 힌지 영역 내 단일 티올 기에 공유 연결된 말레이미드 기를 갖는다. 리신 잔기가 말레이미드 기에 공유적으로 연결되고 리신 잔기 상의 아민 기 각각에 분자량이 대략 20,000 Da인 메톡시폴리(예틸렌글리콜)가 부착될 수 있다. Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 따라서 대략 40,000 Da일 수 있다.
구체적인 PEG 분자는 PEG2MAL40K(Nektar, 이전에 Shearwater에서 입수)라고도 알려진, N,N'-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 20,000) 개질된 리신의 2-[3-(N-말레이미도)프로피온아미도]에틸 아미드이다.
PEG 링커의 다른 공급원은 GL2-400MA3 (하기 구조식에서 m은 5임) 및 GL2-400MA(여기서 m은 2임)를 공급하는 NOF를 포함하고 n은 대략 450이다:
Figure 112016028259298-pct00001
상기 식에서 m은 2 또는 5이다.
다시 말해서 각각의 PEG는 약 20,000 Da이다.
따라서 일 실시양태에서 PEG는 SUNBRIGHT GL2-400MA3으로 알려진, 2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-l-{[3-(6-말레이미도-1-옥소헥실)아미노]프로필옥시} 헥산(2개 팔 분지된 PEG, -CH2) 3NHCO(CH2)5-MAL, Mw 40,000이다.
추가의 대안적인 PEG 이펙터 분자는 다음과 같은 유형이다:
Figure 112016028259298-pct00002
일 실시양태에서 항체, 예컨대 사슬 내 아미노산 226 또는 대략 아미노산 226, 예를 들어 중쇄의 아미노산 226(순차적인 번호매김에 의함)의 시스테인 아미노산 잔기를 통해 부착된, PEG화(예를 들어, 본원에 기술된 PEG에 의함)된, 전체 길이 항체를 제공한다.
일 실시양태에서 본원은 1 이상의 PEG 중합체, 예를 들어 1 또는 2 중합체 예컨대 40 kDa 중합체 또는 중합체들을 포함하는 Fab' PEG 분자를 제공한다.
본 발명에 따른 Fab-PEG 분자는 그들이 Fc 단편과 독립적인 반감기를 갖는다는 점에서 특히 유리하다.
일 실시양태에서 중합체, 예컨대 PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자에 접합된 scFv를 제공한다.
일 실시양태에서 항체 또는 단편은 예를 들어 반감기를 증가시키기 위해 전분 분자에 접합된다. 출발물을 단백질에 접합시키는 방법은 참조하여 본원에 편입되는 US 8,017,739에 기술된 바와 같다.
CSF-1R 활성 억제제를 동정하기 위해 다수의 상이한 접근법이 당분야의 숙련가에 의해 수행될 수 있다. 일례에서 억제제는 먼저 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R과 상호작용하는 작용제를 동정하고 이후에 CSF-1R 활성을 억제하는 것을 동정하기 위해 이들 작용제를 검토하여 동정된다. 이러한 예에서 작용제는 항체이다.
CSF-1, IL-34 또는 CSF1-R과 상호작용하는 작용제는 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드를 후보 작용제와 접촉시키고 폴리펩티드와 상호작용하는 후보 작용제의 능력을 결정하는 경우 세포 무함유 또는 세포 기반 어세이 시스템을 사용하여 동정할 수 있다. 바람직하게, CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드와 상호작용하는 후보 작용제의 능력을 기준 범위 또는 대조군과 비교한다. 바람직하다면, 이러한 어세이는 다수의 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드를 사용하여 다수의 후보 작용제(예를 들어, 라이브러리)를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 세포 무함유 어세이의 일례에서, 천연 또는 재조합 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드를 포함하는 제1 및 제2 샘플을 후보 작용제 또는 대조군 작용제와 접촉시키고 폴리펩티드와 상호작용하는 후보 작용제의 능력을 후보 작용제 및 대조군 작용제 간 차이를 비교하여 결정하게 된다. 바람직하게, 폴리펩티드는 예를 들어 폴리펩티드를 이를 특이적으로 인식하여 결합하는 고정된 항체와 접촉시켜서, 또는 단백질에 결합하도록 설계된 표면과 폴리펩티드의 정제된 조제물을 접촉시켜 먼저 고정된다. 폴리펩티드는 부분적으로 또는 완전하게 정제(예를 들어, 다른 폴리펩티드가 부분적으로 또는 완전하게 없음)되거나 또는 세포 용해물의 일부일 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 CSF-1, IL-34 또는 CSF1-R 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 부분 및 도메인 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 또는 IgG1의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질이여도 된다. 대안적으로, 폴리펩티드는 당분야의 숙련가에게 알려진 기술(예를 들어, 바이오틴화 키트, Pierce Chemicals; Rockford, IL)을 사용해 바이오틴화될 수 있다. 폴리펩티드와 상호작용하는 후보 작용제의 능력은 당분야의 숙련가에게 알려진 방법, 예를 들어, ELISA, BIAcore™, 유세포 측정법 또는 형광발광 미세부피 어세이 기술(FMAT)을 통해 결정될 수 있다. 세포 기반 어세이가 사용되는 다른 예에서, CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R을 발현하는 세포의 개체군을 후보 작용제와 접촉시키고 폴리펩티드와 상호작용하는 후보 작용제의 능력을 결정한다. 바람직하게, CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R과 상호작용하는 후보 작용제의 능력을 기준 범위 또는 대조군과 비교한다. 세포는, 예를 들어 진핵생물 기원(예를 들어, 효모 또는 포유동물)이고 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드를 내생적으로 발현하거나 또는 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 일례에서, CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드 또는 후보 작용제는 예를 들여 방사능 표지(예컨대, P, S 또는 I) 또는 형광발광성 표지(예컨대, 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 파이코에리쓰린, 파이코시아닌, 알로파이코시아닌, o-알로파이코시아닌, o-프탈데히드 또는 플루오레스카민)로 표지되어 폴리펩티드와 후보 작용제간 상호작용을 검출할 수 있게 된다. 대안적인 방법 예컨대 ELISA, 유세포측정법 및 FMAT를 또한 사용해도 된다. CSF-1R 활성을 억제하는 작용제는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 (i) 후보 작용제의 부재 또는 대조군 작용제의 존재시 상기 폴리펩티드의 활성과 후보 작용제 존재시 CSF-1R의 활성을 비교하고; (ii) 후보 작용제가 CSF-1R의 활성을 억제하는지 여부를 결정하여서 동정할 수 있다. 그러한 어세이를 사용하여 임상 모니터링 또는 약물 개발시에, 후보 작용제를 스크리닝할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 작용제는 CSF-1R 활성을 억제하는 그 능력에 대해 결합하는 작용제를 스크리닝하기 전에 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R과 상호작용하는 작용제를 동정하는 것이 적절한 경우(예를 들어, 항체) 사전스크리닝될 수 있다. 일례에서, 세포 기반 어세이 시스템을 사용하여 CSF-1R의 활성을 억제할 수 있는 작용제를 동정한다.
일 특정 예에서, CSF-1 활성 또는 CSF-1R 활성 억제제를 동정하는데 사용되는 어세이는 CSF-1이 마크로파지 콜로니의 형성을 자극할 수 있는 [Metcalf, 1970, J. Cell.Physiol.76-89]의 표준 시험관내 콜로니 자극 어세이이다. 잠재적인 억제제를 어세이에 부가하고 마크로파지의 증식을 임의의 적합한 방법 예컨대 3H 티미딘 도입법 또는 포르마잔 염료 전환법에 의해 측정한다. 따라서 억제는 대조군과 비교한 증식 감소로서 측정된다.
다른 예에서, CSF-1R의 억제제는 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드의 발현을 하향 조절할 수 있고, 예를 들어, 안티센스 억제제일 수 있다. 그러한 억제제는 당분야에 공지된 임의 방법으로 동정해도 된다. 일례에서, 그러한 억제제는 세포 기반 어세이 시스템으로 동정한다. 따라서, CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드 또는 핵산을 발현하는 세포의 개체군을 후보 작용제와 접촉시키고, CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드 또는 핵산의 발현을 변경시키는 후보 작용제의 능력을 기준 범위 또는 대조군과 비교하여 결정한다. 일례에서, CSF-1, IL-34 또는 CSF1-R 폴리펩티드를 발현하는 세포의 개체군을 후보 작용제 또는 대조군 작용제와 접촉시키고 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드 또는 핵산의 발현을 변경시키는 후보 작용제의 능력을 처치군 및 대조군의 세포 개체군간 CSF-1, IL-34 또는 CSF1-R 폴리펩티드 또는 핵산의 발현도 차이를 비교하여 결정한다. 바람직하다면, 이러한 어세이를 사용하여 다수(예를 들어, 라이브러리)의 후보 작용제를 스크리닝해도 된다. 세포는 예를 들어, 진핵생물 기원(예를 들어, 효모 또는 포유동물)이고 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드를 내생적으로 발현하거나 또는 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 조작된다. 상기 폴리펩티드 또는 핵산의 발현을 변경시키는 후보 작용제의 능력은 당분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있는데, 예를 들어 제한없이, 유세포측정법, 방사성표지법, 섬광 분석법, 면역침강법, 웨스턴 블랏 분석법, 노던 블랏 분석법 또는 RT-PCR에 의한다.
CSF-1R의 활성을 억제하는 작용제를 동정하거나 또는 더 검사하여, 예를 들어 1 이상의 동물 모델에서 치료 유효량을 결정할 수 있다. 적합한 동물의 예에는 제한없이, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 기니 피그, 개 및 고양이가 포함된다. 작용제가 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R의 발현을 억제하는 일례에서, 포유동물의 제1 및 제2 그룹을 후보 작용제 또는 대조군 작용제로 투여하고 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드 또는 핵산의 발현을 억제하는 후보 작용제의 능력은 제1 및 제2 그룹의 포유동물 간 발현도 차이를 비교하여 결정한다. 바람직한 경우, 제1 및 제2 그룹의 포유동물에서 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드 또는 핵산의 발현도를 대조군 포유동물에서의 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드 또는 핵산의 수준과 비교할 수 있다. 후보 작용제 또는 대조군 작용제는 당분야에 공지된 수단(예를 들어, 경구, 직장 또는 비경구 예컨대 복강내 또는 정맥내)에 의해 투여될 수 있다. 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 변화는 상기 개략된 방법으로 평가할 수 있다. 다른 예에서, CSF-1R 활성 억제제는 질환 증상에서의 완화 또는 호전, 및/또는 질환 발병의 지연 또는 질환 진행 지연을 모니터링하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 제한없이, IPF의 경우에서, 이는 노력성 폐활량으로 측정시 폐기능 감쇠의 감소, DLCO로 측정된 확산능 감쇠의 감소, 또는 6분 도보 거리 감쇠의 감소로 분명해질 수 있다. IPF를 갖는 환자에서 CSF-1R 활성의 억제는 다른 원인이 없을시 질환 활성의 급속한 저하로 정의되는, 악화와 같은 임상적 사건을 모니터링하여 결정된다. 간 섬유증의 경우, 심층 간 섬유증(ELF) 검사를 사용하여 혈청 내 히알루론산, 제III형 프로콜라겐(PIIINP)의 아미노 말단 프로펩티드 및 메탈로프로테나아제 1의 조직 억제제(TIMP1)의 양을 정량적으로 측정하고 그 규모가 질환 중증도를 의미하는, 단일 ELF 점수를 산출하는 알고리즘의 사용을 통해 그들을 조합하여 질환을 모니터링할 수 있다. 전신 경화증과 관련하여, CSF-1R 억제의 효과는 변형 로드난 피부 점수 및/또는 멧지거 중증도 스케일의 감소된 진행, 또는 개별 장기 수준에서, 예를 들어 경피증 연관된 간질 폐 질환의 완화로서 명백해질 수 있다. 제한없이, 만성 신장 질환 및 이식 후 그라프트 섬유증을 포함한, 신장 섬유증 과정에서 CSF-1R 억제의 효과는 사구체 여과율(GFR) 및/또는 단백뇨의 호전 또는 감퇴의 감소로서 명백해질 수 있다.
따라서 일 실시양태에서 CSF-1R의 억제제의 적용은 다음 중 1 이상에서 IPF 환자에서 6분 도보 검사에서 포괄하는 거리 감퇴의 감소 또는 노력성 폐활성으로 측정한 폐 기능 감퇴에서의 감소를 제공한다. 심층 간 섬유증(ELF) 검사는 혈청에서 히알루론산, 제III형 프로콜라겐의 아미노 말단 프로펩티드(PIIINP), 및 메탈로프로테나아제 1의 조직 억제제(TIMP1)의 양을 정량적으로 측정하고 이들을 그 규모가 질환 중증도를 의미하는, 단일 ELF 점수를 산출하는 알고리즘의 사용을 통해 통합하여 간 섬유증을 모니터링할 수 있다.
섬유성 질환에 친숙한 의사에게 알려진 기술을 사용하여 질환과 연관된 1 이상의 증상을 후보 작용제가 변경시키는지 여부를 결정할 수 있다. 수많은 다양한 섬유성 질환 모델이 당분야에 알려져 있다. 이들에는 [Moore BB and Hogaboam CM, 2008, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 294, LI 52-60; Scotton CJ and Chambers RC, 2010 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 299, L439-41]에서 개괄한 블레오마이신-유도된 폐 섬유증, 아데노신-유도된 섬유증의 아데노신 디아미나아제 결핍 마우스 모델(Chunn JL et al, 2005, J Immunol 175: 1937-46; Sun C_X et al, 2006, J Clin Invest, 116, 2173-82), 방사선 유도된 폐 섬유증(Sharplin J and Franko AJ, 1989, Radiation Research 119, 1-14; Sharplin J and Franko AJ, 1989, Radiation Research 119, 15-31; Johnston CJ et al, 1998, Exp Lung Res, 24, 321-37; Hasten CK and Travis EL, 1997, Cancer Res 57, 5286-91 ; Katoh H et al, 2010, J Radiat Res, 51 , 325-332,), FITC 유도된 폐 섬유증(Roberts SN et al, 1995, J Pathol, 176, 309-18; Christensen, P et al, 1999, Am J Pathol, 155, 1773-79), 마우스에서 실리카 유도된 섬유증(Davis GS, et al, 1998, J Environ Pathol Toxicol Oncol 17, 81-97; Lakatos HF et al, 2006, Exp Lung Res 32, 181-99), 간 섬유증의 사염화탄소(CCl4) 모델(Iredale JP et al, 1998, J Clin Invest, 102, 538-49), 간섬유증의 담관 결찰 모델(Stahelin BJ et al, 1999, Virchows Arch, 434, 333-39; Issa R et al, 2001, Gut, 48, 548-57), 신장 섬유증의 UUO(unilateral ureteric obstruction)(Klahr S and Pukerson ML, 1994, Am J Kidney Dis, 23, 219-23; Satoh M et al, 2001, J Am Soc Nephrol, 12, 317-25), 만성 신장 질환의 아드리아마이신 유도 모델(Tamaki, K et al, 1994, Kidney Int, 45, 525-36; Wang Y et al, 2000, Kidney Int, 58, 1797-1804 and reviewed by Lee VW and Harris DC, 2011, Nephrology, 16, 30-38), 만성 신장 질환의 5/6 감소 모델(Griffin A et al, 1994, J Am Soc Nephrol, 4, 2023-31); 전신 경화증의 차아염소산 유도 모델(Servettaz, A et al, 2009, J Immunol, 182(9), 5855-64), 및 전신 경화증의 대안 모델 예커대 블레오마이신 유도 피부 섬유증, 마우스가 피브릴린-1 유전자 내 돌연변이에 대해 이종접합성인 견피 마우스 모델 및 마우스가 피부 및 폐 섬유증이 발생된 경피성 이식편 대 숙주 질환 모델(Yamamoto, T, 2010, J Dermatol, 37, 26-41)이 포함된다. 대체로, 상이한 동물 모델은 섬유증의 특징인 영향받은 장기 또는 조직에서의 콜라겐을 포함한 세포외 매트릭스의 과도한 생성 및 침착을 나타낸다. 섬유성 질환의 다른 척도는 특정 모델에서 상이한 장기가 영향받기 때문에 모델간에 다양하게 된다. 요소 중 단백질 및 크레아티닌 농도의 상승이 신장 섬유증 모델에서 측정되는 반면 폐 섬유증 모델에서는 섬유증의 정도 및 중증도에 대한 조직병리학적 점수, 예를 들어, 변형된 아쉬크로프트 점수가 흔히 사용된다(Hubner RH et al, 2008, Biotechniques 44: 507-17).
섬유증을 모니터링하는 기술은 폐 섬유증에 대한 폐 기능 검사, 간 질환/섬유증에 대한 ELF 검사, 간 질환에 대한 FibroTest(섬유증 마커의 혈액 분석) 및 간 섬유증을 검출 및 평가하는데 유용한, 간 강직성 척도를 제공하는 영상화 기술인 순간 탄성영상법(Fibroscan®)을 포함한다. 생검 유래 조직 샘플 분석도 역시 수행될 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같이, CSF-1R 활성 억제제는 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 이러한 용도를 위해서 작용제는 대체로 약학 조성물의 형태로 투여되게 된다. 또한 CSF-1R 활성 억제제 및 악?e적 허용 희석제, 부형제 및/또는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 용어 '치료'는 치료적 또는 예방적 요법을 포함한다. 특정 억제제 또는 억제제의 조합을 사용하여 질환 또는 병태를 치료하거나 또는 예방하는 방법에 대해 본원에서 언급하는 경우, 그러한 언급은 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 억제제 또는 억제제의 조합의 용도를 포함하고자 함을 이해한다. 조성물은 정상적으로 약학적 허용 담체를 포함하는 멸균된, 약학 조성물의 일부로서 일반적으로 제공된다. 이러한 조성물은 임의의 적합한 형태(환자에 투여되는 바람직한 방법에 따라 좌우됨)여도 된다. 본 발명에서 사용하는 억제제는 바람직하게는 피험체에게 경구 또는 직장내 투여되지만 다른 다양한 경로 예커대 경피, 피하, 비내, 정맥내 및 근육내로 투여될 수도 있다. 임의의 소정 사례에서 투여에 가장 적합한 경로는 구체적인 억제제, 피험체, 및 질환의 성질과 중증도 및 피험체의 신체 상태에 따라 좌우된다.
본 발명에서 사용하는 억제제는 예를 들어, 항섬유증 요법 예컨대 페르페니돈 또는 항암 요법이어도 되는, 1 이상의 다른 치료적 활성 화합물과 병용하여, 예를 들어 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
약학 조성물은 용량 당 본 발명의 작용제의 예정량을 함유하는 단위 용량 형태로 편리하게 존재할 수 있다. 이러한 단위는 치료되는 병태, 투여 경로 및 피험체의 연령, 체중 및 상태에 따라서 제한없이, 1OOO mg/kg 내지 O.O1 mg/kg 예를 들어 750 mg/kg 내지 O.1 mg/kg, 예컨대 1OO mg/kg 내지 1 mg/kg을 함유해도 된다.
본 발명에서 사용하기 위한 약학적 허용 담체는 예를 들어, 투여 경로에 따라서 광범위하게 다양한 형태를 취하게 된다.
경구 투여용 조성물은 액상이거나 또는 고형일 수 있다. 경구 액상 조제물은 예를 들어 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀션, 시럽 또는 엘릭시르의 형태이거나, 또는 사용전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성되는 건조 산물로서 존재해도 된다. 경구 액상 조제물은 당분야에 공지된 현탁제를 함유해도 된다. 경구 고형 조제물 예컨대 분말, 캡슐 및 정제의 경우, 담체 예컨대 전분, 설탕, 미정질 셀룰로스, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 포함해도 된다. 그들의 투여 용이성때문에, 정제 및 캡슐은 약학 담체가 대체로 적용되는 경우에서 가장 유래한 경구 단위 제형을 대표한다.
상기 기재된 일반적인 제형이외에도, 본 발명의 활성제는 또한 제어 방출 수단 및/또는 전달 장치를 통해 투여될 수 있다. 정제 및 캡슐은 통상적인 담체 또는 부형제 예컨대 결합제 예를 들어 시럽, 아카시아, 젤라틴, 솔비톨, 트라가칸트, 또는 폴리비닐피롤리돈; 충전제, 예를 들어 락토스, 설탕, 옥수수 전분, 인산칼슘, 솔비톨 또는 글리신; 정제화 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜 또는 실리카; 붕해제, 예를 들어 감자 전분; 또는 허용되는 습윤제 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트를 포함한다. 정제는 정상적인 제약 관행에서 잘 알려진 방법에 따라서 표준 수성 또는 비수성 기술을 통해 코팅될 수 있다. 경구 투여용으로 적합한 본 발명의 약학 조성물은 분말 또는 과립, 수성액, 비수성액, 수중유 에멀션 또는 유중수 액상 에멀션 중 현탁액 또는 용액으로서, 활성제의 예정량을 각각 함유하는, 개별 단위 예컨대 캡슐, 샤세 또는 정제로서 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 임의의 약제 방법을 통해 제조할 수 있지만 모든 방법은 1 이상의 필수 성분을 구성하는, 담체와 활성제를 회합시키는 단계를 포함한다. 대체로, 조성물은 액상 담체 또는 미분 고형 담체 또는 둘 모두와 활성제를 균일하고 친밀하게 혼합시킨 후, 필요하다면, 그 생성물을 바람직한 외양으로 성형시켜 제조된다. 예를 들어, 정제는 경우에 따라 1 이상의 보조 성분과 함께, 압착 또는 몰딩되어 제조된다.
비경구 투여에 적합한 약학 조성물은 계면활성제 예컨대 히드록시프로필셀룰로스와 적합하에 혼합된 물 중 본 발명의 활성제의 현탁액 또는 용액으로 제조된다. 분산물은 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 및 오일 중 이의 혼합물에 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건 하에서, 이들 조제물은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다. 주사용으로 적합한 약학적 형태는 항산화제, 완충제, 박테리아생육억제제 및 조성물이 대상 수용자의 혈액과 등장성이게 하는 용질을 함유하는 수성 또는 비수성 멸균 주사 용액, 및 현탁제 및 증점제를 포함하는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 즉석 주사 용액, 분산액 및 현탁액을 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조할 수 있다. 약학 조성물은 당분야에 알려진 의학 장치로 투여된다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치와 같은, 무봉 피하 주사 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 임플란트 및 모듈의 예는 제어된 속도로 의약을 분배하는 이식가능한 미세주입 펌프를 개시하는 US 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하는 치료 장치를 개시한 US 4,486,194; 정밀한 주입 속도로 의약을 전달하는 의약 주입 펌프를 개시하는 US 4,447,233; 연속적인 약물 전달을 위한 가변성 유동 이식형 주입 장치를 개시하는 US 4,447,224; 다중 챔버 구획을 구비한 삼투압 견인 전달 시스템을 개시하는 US 4,439,196; 및 삼투압 견인 전달 시스템을 개시하는 US 4,475,196를 포함한다. 많은 다른 이러한 임플란트, 전달 시스템, 및 모듈이 당분야의 숙련가에게 알려져 있다.
국소 투여용으로 조정된 약학 조성물은 연고, 크림, 현탁제, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 침지형 드레싱, 스프레이, 에어로졸 또는 오일, 경피 장치, 살포제 등으로 제제화될 수 있다. 이들 조성물은 활성제를 함유하는 통상의 방법을 통해서 제조될 수 있다. 따라서, 이들은 또한 상용성인 통상의 담체 및 첨가제, 예컨대 약물 침투 보조용 용매, 크림 또는 연고의 연화제 및 로션용 에탄올 또는 올레일 알콜을 포함한다. 이러한 담체는 조성물 중 약 1% 내지 약 98%로 존재하게 된다. 보다 일반적으로 조성물의 최대 약 80% 까지를 형성하게 된다. 단지 예시로서, 크림 또는 연고는 바람직한 경도를 갖는 크림 또는 연고가 생성되기에 충분한 양으로, 화합물 중 약 5-10 중량%를 함유하는, 충분한 양의 친수성 물질 및 물과 혼합되어 제조된다. 경피 투여로 적합한 약학 조성물은 장기간 동안 수용자의 표피와 친밀하게 접촉되어 유지되도록 개별 팻치로서 존재할 수 있다. 예를 들어, 활성제는 이온도입법을 통해 팻치로부터 전달될 수 있다. 외부 조직, 예를 들어 입 및 피부에 도포를 위해서, 조성물은 바람직하게는 국소 연고 또는 크림으로 적용된다. 연고로 제제화되는 경우, 활성제는 파라핀성 또는 수혼화성 연고 베이스와 함께 적용된다. 대안적으로, 활성제는 수중유 크림 베이스 또는 유중수 베이스와 함께 크림으로 제제화될 수 있다. 입에 국소 투여를 위해 적합한 약학 조성물은 로젠지, 패스틸 및 구강 세정제를 포함한다. 눈에 국소 투여를 위해 적합한 약학 조성물은 점안제로서 여기서 활정제는 적합한 담체, 특히 수성 용매에 용해 또는 현탁된 점안제를 포함한다. 또한 상기와 같이 국소 연고 또는 크림을 포함한다. 담체가 고형인 직장 투여용으로 적합한 약학 조성물은 바람직하게 단위 용량 좌제로 존재한다. 적합한 담체는 코코아 버터 또는 다른 글리세리드 또는 당분야에서 통용되는 재료이고, 좌제는 연질 또는 용융 카피어(들)와의 조합물을 혼합한 후 식히고 몰드로 성형하여 쉽게 형성시킬 수 있다. 이들은 관장제로도 투여된다.
CSF-1R 활성 억제제의 투여되는 용량은 특정 억제제, 섬유성 질환의 유형, 피험체, 및 질환의 성질 및 중증도, 피험체의 신체 상태, 및 선택된 투여 경로에 따라 다양하게 되며; 적절한 용량은 당분야의 숙련가가 쉽게 결정할 수 있다. 인간 및 동물에서 섬유성 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 항체를 포함하는 약학 조성물은 임의의 적합한 투여 경로, 예컨대 주사 및 임상 제품, 예컨대 항체-기반 임상 제품에 대해 당분야에 알려진 다른 경로를 사용하여 치료 또는 예방 유효량(예를 들어, 섬유성 질환의 억제 및/또는 섬유성 질환 증상의 경감을 일으키는 용량)으로 환자(예를 들어, 인간 피험체)에 투여될 수 있다. 조성물은 투여 방법에 따라서, 본 발명의 억제제를 적어도 0.05 중량%, 예를 들어 0.5 내지 50 중량% 예컨대 1 내지 10 중량% 또는 그 이상을 함유해도 된다. 본 발명의 억제제의 개별 투약 간격 및 최적 정량은 치료하려는 병태의 성질 및 정도, 투여 형태, 경로 및 부위, 및 치료하려는 특정 환자의 연령 및 상태에 의해 결정되고 의사가 궁극적으로 사용되는 적절한 용량을 결정하게 됨을 당분야의 숙련가는 인식할 수 있다. 이러한 투약은 적절한만큼 자주 반복될 수 있다. 부작용이 발생되면 투약하는 양 및/또는 빈도를 정상적인 임상 관행에 따라 변경시키거나 또는 감소시킬 수 있다.
다른 예에서, 억제제가 핵산인 경우 유전자 요법을 통해 투여해도 된다(예를 들어, 다음의 문헌들을 참조함: Hoshida, T. et al, 2002, Pancreas, 25: 1 11-121; Ikuno, Y. 2002, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002 43:2406-2411 ; Bollard, C, 2002, Blood 99:3179- 3187; Lee E., 2001, Mol. Med. 7:773-782). 유전자 요법은 발현되거나 또는 발현될 수 있는 핵산, 일례에서, CSF-1, IL-34, 또는 CSF-1R 핵산 또는 이의 일부분을 피험체에 투여하는 것을 의미한다. 당분야에서 이용할 수 있는 유전자 요법에 대한 임의의 방법을 본 발명에 따라서 사용할 수 있다. 환자에 치료 핵산의 전달은 생체내 유전자 요법으로 직접(즉, 환자가 직접적으로 핵산 또는 핵산 함유 벡터에 노출됨)하거나 또는 생체외 유전자 요법으로 간접적(즉, 세포를 먼저 시험관내에서 핵산으로 형질전환시킨 후 환자에 이식)으로 될 수 있다. 예를 들어, 생체내 유전자 요법의 경우, CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 핵산을 함유하는 발현 벡터를 즉, 예를 들어, US 4,980,286 또는 [Robbins et al, 1998, Pharmacol. Ther. 80:35-47]에 기술된 바와 같이 결핍 또는 약독화 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해서, 세포내가 되게하는 방식으로 투여된다. 당분야에 공지된 다양한 레트로바이러스 벡터는 예컨대 바이러스 게놈의 포장 및 이후 숙주 세포 DNA로의 통합에 필요한 레트로바이러스 서열이 결실되도록 개질된 Miller 등(1993, Meth. Enzymol. 217:581-599)이 기술한 것들이다. 또한 비분열 세포를 감염시키는 그 능력덕분에 유리한 아데노바이러스 벡터를 사용할 수 있으며, 이러한 고능력 아데노바이러스 벡터는 Kochanek(1999, Human Gene Therapy, 10:2451-2459)이 기술하고 있다. 사용될 수 있는 키메라 바이러스 벡터는 Reynolds 등(1999, Molecular Medicine Today, 1:25-31)이 기술한 것들이다. 하이브리드 벡터가 또한 사용될 수 있고 Jacoby 등(1997, Gene Therapy, 4: 1282-1283)이 기술한 것들이 있다. 나 DNA의 직접 주사 또는 미세입자 충격법(예를 들어, 유전자 총(R); Biolistic, Dupont)의 사용을 통하거나 또는 지질 코딩에 의한 직접 주사가 또한 유전자 요법에 사용될 수 있다. 세포-표면 수용체/화합물 형질감염 또는 리포솜 캡슐화, 미립자 또는 미세캡슐 또는 핵으로 진입이 알려진 펩티드에 연결된 핵산의 투여 또는 수용체-매개 세포이입되는 리간드에 연결하여 투여(Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem., 262:4429-4432) 등이 관심 수용체를 특이적으로 발현하는 세포 유형을 표적화하는데 사용될 수 있다. 생체외 유전자 요법에서, 유전자는 조직 배양을 사용해 시험관내 세포로 형질전달되고 세포를 다양한 방법 예컨대 피하 주사, 피부 이식편에 세포 도포 및 재조합 혈액 세포 예컨대 조혈 줄기 또는 전구체 세포의 정맥내 주사를 통해 환자에 전달한다. 유전자 요법의 목적으로 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 핵산이 도입되는 세포는, 예를 들어 상피 세포, 내피 세포, 케라티노사이트, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포 및 혈액 세포를 포함한다. 사용될 수 있는 혈액 세포는 예를 들어, T-림프구, B-림프구, 단핵구, 마크로파지, 호중구, 호산구, 거핵구, 과립구, 조혈 세포 또는 전구체 세포 등을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명의 약학 조성물은 CSF-1, IL-34 또는 CSF-1R 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 CSF1, IL-34 또는 CSF-1R 폴리펩티드 또는 이의 키메라 단백질을 적합한 숙주에서 발현하는 발현 벡터의 일부이다. 구체적으로, 이러한 핵산은 폴리펩티드 코딩 영역에 작동적으로 연결된 프로모터를 가지고, 상기 프로모터는 유도성이거나 또는 항상성이다(그리고, 경우에 따라 조직 특이성임).
본 발명을 이하 실시예를 참조하여 설명하지만, 이는 단지 예시적인 것이고 임의 방식으로 본 발명의 범주를 제한하려는 것으로 이해해서는 안된다.
도 1a는 인간 CSF-1R에 대한 아미노산 서열을 도시한다.
도 1b는 CSF-1R의 일정 변이체에 대한 아미노산 서열을 도시한다.
도 1c는 세포 표면 상에서 발현에 적합한 CSF-1R의 아미노산 서열을 도시한다.
도 2는 M-NFS-60 세포 상의 수용체-결합된 CSF-1을 유세포 측정법을 통해 검출할 수 있음을 검증한 유세포측정 데이타를 도시한다.
도 3은 조직 배양 웰의 표면 상에 고정되거나, 또는 용액 중에 유리시킨, Ab535가 사용된 농도에서 CSF-1이 없을 시 M-NFS-60 세포의 증식을 지원하지 않음을 보여준다.
도 4a는 Ab535를 사용한 블레오마이신-유도된 폐 섬유증의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료와 비교하여 BAL 유체 콜라겐의 양을 감소시켰음을 보여준다.
도 4b는 Ab535을 사용한 블레오마이신 유도된 폐 섬유증의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료와 비교하여 샘플의 애쉬크로프트 점수를 감소켰음을 보여주며 Ab535로 치료된 마우스가 섬유증 병변이 호전되었음을 입증한다.
도 4c는 Ab535를 사용한 블레오마이신 유도된 폐 섬유증의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료와 비교하여 BAL 유체에서 알부민의 양을 감소시킴을 보여주어 Ab535로 치료된 마우스의 폐 장벽의 온전성이 개선되었음을 보여준다.
도 4d는 Ab535를 사용한 블레오마이신 유도된 폐 섬유증의 치료가 BAL 유체에서 마크로파지 개수를 감소시켰음을 보여준다.
도 5는 염수 대조군, 블레오마이신과 이소타입 대조군 및 블레오마이신과 A535를 처치한 동물의 조직병리학적 분석에 대한 대표적인 영상을 보여준다. Ab535를 처치한 동물은 이소타입 대조군, 블레오마이신 처치된 동물과 비교하여 폐의 섬유증이 상당히 감소되었다.
도 6a는 Ab535를 사용하여, 폐 섬유증이 유도된 ADA-결핍 마우스의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료와 비교하여 BALF 콜라겐 농도를 감소시켰음을 보여준다.
도 6b는 Ab535를 사용한, 폐 섬유증 유도된 ADA-결핍 마우스의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료와 비교하여 샘플의 애쉬크로프트 점수를 감소시킴을 보여주며 Ab535를 처치한 마우스가 섬유증 병변이 호전되었음을 입증한다.
도 6c는 Ab535를 사용한, 폐 섬유증 유도된 ADA-결핍 마우스의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료와 비교하여 BAL의 알부민 양을 감소시킴을 보여주며 Ab535가 처치된 마우스의 폐 장벽의 온전성이 개선되었음을 입증한다.
도 6d는 Ab535를 사용한, 폐 섬유증 유도된 ADA-결핍 마우스의 치료가 BAL 유체에서 마크로파지의 개수를 감소시켰음을 보여준다.
도 7은 Ab535 또는 이소타입 대조군 항체(마우스 IgG1)를 처치한 ADA 넉아웃 마우스 및 야생형 마우스로부터의 폐 조직에 대한 조직병리학적 분석의 대표적인 영상을 보여준다. 폐 조직 섹션을 매이슨 트리크롬으로 염색하였다. Ab535를 사용한 ADA 넉아웃 마우스의 치료는 섬유증 조직의 양 및 콜라겐 침착을 상당히 감소시켰다.
실시예 1 항-마우스 CSF-1R 항체의 단리
2마리의 토끼는 마우스 CSF-1R의 잔기 1-512(Uniprot 수록번호 p09581)를 일시적으로 발현하는 세포로 5회 면역화시켰다. 항체 반응은 2 ㎍/mL 마우스 CSF-1R-토끼 Fc가 코팅된 Nunc Maxisorp 플레이트를 사용한 ELISA로 모니터링하였다. 1:100,000 희석시에 혈청 역가를 토끼 둘 모두에서 관찰하였다. M-NFS-60 세포(Metcalf et al., 1970)에 대한 혈청의 결합을 또한 FACS를 통해 확인하였다. 중간 FL1을 항체 희석에 대해 그래프화하였다. 1:10,000의 희석에서의 결합이 관찰되었다.
CSF-1-의존적 M-NFS-60 세포주(Metcalf et al, 1970)를 사용하여서, 두 마리 토끼 유래의 혈청이 1:100의 희석시 CSF-1-의존적 세포 생존을 차단할 수 있음을 확인하였다(결과를 도시하지 않음).
100개의 96-웰 플레이트에 웰 당 1000-5000 토끼 PBMC를 접종하고 1주일간 37℃에서 EL4-B5 마우스 흉선종 세포 및 토끼 T 세포 조건화 배지(TSN) 존재하에서 성장시켰다. 이어서 항체 함유 상등액을 M-NFS-60 세포 및 항-토끼 Fc-특이적 Cy5 접합체를 사용한 FMAT 어세이로 스크리닝하였다. 678 CSF-1R-결합제를 동정하였다. 이들로부터 대략 3%가 세포 어세이에서의 CSF-1-의존적 M-NFS-60 증식을 차단하였다. 결합제를 또한 2 ㎍/mL CSF-1R-토끼 Fc가 코팅된 플레이트를 사용한 ELISA에서 스크리닝하였고, 결합은 항-토끼 F(ab')2-HRP 접합체를 사용해 밝혀졌다. 결합제를 또한 ELISA-기반 고체상 차단 어세이에서 스크리닝하였다. 이 어세이를 위해서, Nunc Maxisorp 384-웰 플레이트를 0.5 ㎍/mL CSF-1R-토끼 Fc로 코팅하고 이어서 PBS/0.1% Tween-20/1% PEG20000에서 차단하였다. 플레이트를 이후 배양 상등액을 플레이트에 부가하기 전에 세척하고 실온에서 > 1시간 동안 항온반응시켰다. 다음으로, 최종 농도 10 ng/mL로 상등액에 CSF-1를 부가하고 실온에서 추가 1시간 동안 항온반응시켰다. 플레이트를 세척한 다음 0.5 ㎍/mL의 바이오틴화 염소 항-마우스 CSF-1 항체(R&D systems)와 항온반응시켰다. 수용체에 CSF-1 결합은 스트렙타비딘-HRP를 사용해 밝혔다. 8개 웰을 진행을 위해 선택하였다. 모두 세포 및 단백질에 대한 결합이 확인되었고 M-NFS-60 어세이 및 ELISA에서 차단되었다. .
형광발광 기반 방법을 사용하여 양성 웰 유래의 항원-특이적 B 세포를 동정하였다. 양성 웰 유래의 면역글로불린-분비 B 세포를 바이오틴화된 마우스 CSF-1R-토끼 Fc 및 염소 F(ab')2 항-토끼 F(ab')2 단편-특이적 FITC 접합체(Jackson ImmunoResearch)로 코팅된 스트렙타비딘 비드와 혼합하였다. 1시간 동안 37℃에서 항온반응 후, 항원-특이적 B 세포에서 분비된 항체를 그 B 세포 부근의 비드 상에 포획하였다. FITC 접합체의 존재는 항체-코팅된 비드를 표지화시키고 항원-특이적 B 세포 주변 형광발광 진원지를 형성시킨다. 형광 현미경을 사용해 식별된, 이들 개별 B 세포를 미세조작기로 뽑아서 PCR 튜브에 넣었다. 항체 가변 영역 유전자는 역전사(RT)-PCR에 의해 단일 세포로부터 회수하였다. 토끼 V-영역을 이어 CHO 순간 발현 시스템에서 인간 IgG4 키메라 항체 또는 Fab로서 발현시켰다. 8개 웰 중 4개가 재조합 항-CSF-1R 항체를 생성시켰다. 재조합 항체에 의한 중화 활성은 M-NFS-60 어세이를 확인하였다. CSF-1R 토끼 Fc에 대한 친화성을 결정하기 위해 Fab 분자를 사용하여 BIAcore를 또한 수행하였다(표 1). 중화 활성 및 친화성을 기반으로, Ab535가 항-마우스 CSF-1R 시약으로 선별되었다. 이 항체를 이후에 쥣과동물화시키고, 전체 길이 쥣과동물 IgG1으로 포유동물 시스템에서 발현시키고 정제하였다.
BIAcore 방법
정제된 재조합 CSF-1R/Fc 융합 단백질에 대한 결합 동력학의 측정을 통해 BIAcore 어세이에서 CSF-1R에 결합하는 그 능력에 대해 항체를 검토하였다.
어세이 형식은 고정된 항-인간 IgG, F(ab')2에 의한 항-CSF-1R 항체의 포획과 이후, 포획된 표면 상에서 hCSF-1R/Fc의 적정이다. BIA(Biamolecular Interaction Analysis)는 BIAcore 3000(GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 사용해 수행하였다. 모든 실험은 25℃에서 수행하였다. Affinipure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특이적(Jackson ImmunoResearch)을 ∼6000 반응 유닛(RU) 수준으로 아민 커플링 화학법을 통해 CM5 센서 칩(GE Healthcare Bio-Sciences AB)상에 고정시켰다. HBS-EP 완충액(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20, GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 10 ㎕/분의 유속으로 러닝 완충액으로 사용하였다. 항-CSF-1R 항체의 주입은 고정된 항-인간 IgG, F(ab)2 상에 대략 100 RU의 포획 수준이 되도록 수행하였다.
재조합 인간 CSF-1R Fc는 3분 동안 30 ㎕/분의 유속으로 포획된 항-CSF-1R 항체 상에서 이후 8분 동안 해리상에서 2.5 nM에서 78 pM로 두배로 희석하여 적정하였다(R&D Systems), 이들 센소그램을 사용하여 결합 속도를 생성시켰다. 표면은 2회의 순차적인 10 ㎕의 40 mM HCl 주입 이후 5 ㎕의 10 mM NaOH 주입을 통하여 10 ㎕/분의 유속으로 재생시켰다. 이중 기준 배경값을 뺀 결합 그래프를 표준 절차 이후에 BIAevaluation 소프트웨어(버전 4.1)를 사용해 분석하였다. 동력학 변수는 핏팅 알고리즘을 통해 결정하였다.
Ab553에 대한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
항체 번호: 온 속도
ka(M-1s-1)		 오프 속도
kd(s-1)		 친화성 상수
KD
Ab535 8.05 ± 0.01 e6 1.21 ± 0.15 e-5 1.50 pM
실시예 2 Ab535의 시험관내 분석
Ab535는 시험관내에서 CSF-1 수용체-양성 세포주에 대한 쥣과동물 CSF-1의 결합을 차단한다
CSF-1과 CSF-1R의 결합을 방해하는 수용체-결합된 Ab535의 능력을 조사하였다. 쥣과동물 CSF-1R-양성 세포주, M-NFS-60을 어세이에 사용하였는데, 여기서 이 세포는 CSF-1에 노출하기 전에 Ab535 또는 대조군 항체와 사전항온반응시켰다. 이후 수용체-결합된 CSF-1을 형광발광 표지된 항체 및 유세포측정법을 사용해 검출하였다. 세포 형광발광 강도에서 Ab535-의존적 감소는 CSF-1R에 CSF-1의 결합을 방해하는 수용체-결합된 Ab535의 능력을 나타내는 것으로 해석하였다.
M-NFS-60 세포(LGC Promochem, Teddington, UK)는 10% 태아 소혈청(PAA), Hepes(Invitrogen, 10 mM 최종 농도), 피루브산나트륨(Invitrogen, 1 mM 최종 농도), 포도당(Sigma-Aldrich, 4.5 g/L 최종 농도), 중탄산나트륨(Sigma-Aldrich, 1.5% 최종 농도), 베타-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich, 0.05 mM 최종 농도), 재조합 쥣과동물 CSF-1(Preprotech, 3.3 ng/ml 최종 농도)이 보충된 기본 RPMI 배지(Invitrogen) 중 현탁액으로 유지시켰다.
M-NFS-60 세포는 1x10E6 세포/mL의 농도로 흐름 완충액(0.2% BSA(Sigma-Aldrich), 0.09% 나트륨 아지드(Sigma-Aldrich)가 보충된 PBS(Invitrogen))에 준비하였다. Ab535 또는 쥣과동물 IgG1 이소타입 대조군 항체의 연속 희석물을 흐름 완충액에 준비하고, 200 ㎕ 부피 중에 20, 5, 1.25, 0.32, 0.08 ㎍/mL의 최종 농도가 되도록 세포의 100 ㎕ 분취물에 부가하고 1시간 동안 얼음에서 항온반응시켰다. 이후, 세포를 2회 흐름 완충액으로 세척하고, 얼음 상에서 30분간 0.5 ㎍/mL의 재조합 쥣과동물 CSF-1과 항온반응시키고 2회 흐름 완충액으로 세척하였다. 수용체-결합된 CSF-1을 검출하기 위해서, 세포를 얼음 상에서 30분간 바이오틴화된 항-쥣과동물 CSF-1 항체(R&D Systems, 5 ㎍/mL)와 항온반응시키고, 흐름 완충액으로 2회 세척하고 결합된 항체를 최종 세척 단계 전에 15분간 얼음에서 Alexafluor 488-접합된 스트렙타비딘(Invitrogen, 1:200 희석)과 항온반응시켜 표지화시키고 500 ㎕ 흐름 완충액에 세포를 재현탁시켰다. FACSCaliber 유세포측정기(Becton Dickinson)를 사용한 유세포측정법으로 형광발광성에 대해 세포를 평가하고 WinMDI 소프트웨어를 사용해 분석하였다.
유세포측정 데이타의 분석은 M-NFS-60 세포 상의 수용체-결합된 CSF-1을 이 방법으로 검출할 수 있음을 확인시켜주었다(도 2A). CSF-1의 부가 전에, 사용된 임의 농도에서 Ab535와 세포의 항온반응은 CSF-1R에 CSF-1의 결합을 방지하였다(도 2B). 사용된 임의 농도에서 이소타입 대조군 항체와 세포의 항온반응은 CSF-1 결합 및 검출에 대해 어떠한 효과도 없었다(도 2C).
CSF-1R에 대한 Ab535의 결합은 시험관내에서 CSF-1 의존적 세포주의 증식 및 생존에서 CSF-1을 대신하지 않는다
CSF-1-의존적 세포의 생존 및 증식을 지원하는데 있어서 CSF-1을 대신하는 Ab535의 능력은 용액 중 유리된 Ab535 및 플라스틱 상에 고정된 Ab535에 세포를 노출시키는 것을 포함하는 세포 증식 어세이에서 M-NFS-60 세포를 사용해 조사하였다.
CSF-1 의존적 세포를 지원하는 고정된 Ab535의 능력을 평가하기 위해서, 96웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트의 웰들을 PBS 중 10 ㎍/mL 또는 1 ㎍/mL의 항체를 함유하는 용액을 웰 당 50 ㎕씩 부가하고 4℃에서 항온반응시켜서 세포 증식 어세이를 개시하기 전에 24시간 동안 Ab535 또는 비관련 이소타입 대조군 항체로 사전코팅시켰다. 웰들을 흡입하고 미결합된 항체는 각 웰에 2회씩 100 ㎕ PBS로 세척하여 제거하였다.
상기 기술된 바와 같이 유지시켜서, 증식된 M-NFS-60 세포를 CSF-1이 없는 50 ㎕의 성장 배지 중에 웰 당 10,000 세포 밀도로 96웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 접종하였다. 재조합 쥣과동물 CSF-1, Ab535이 보충되거나 또는 보충되지 않은 추가 50 ㎕ 성장 배지를 적절한 웰에 부가하였다. 플레이트를 72시간 동안 항온반응시키고 실험된 각 조건에 대해서, 세포 갯수를 제조사의 지시에 따라 CellTiter Glo 키트(Promega)를 사용하여 측정하여서, ATP 수준 및 그에 따라 세포 갯수에 비례하는 측정가능한 발광 판독치를 생성시켰다. 모든 조건은 삼중으로 수행하였다.
데이타의 분석은 CSF-1없이 성장 배지에 유지시킨 것과 비교하여 CSF-1이 보충된 웰에서 유의하게 더 높은 세포 갯수를 통해 반영된 바와 같이, M-NFS-60가 증식에 대해 CSF-1에 의존적임을 확인시켜주었다. 또한, 조직 배양 웰의 표면 상에 고정되거나, 또는 용액 중에 유리된, Ab535는 사용된 농도에서 CSF-1이 없을 시 M-NFS-60 세포의 증식을 지원하지 않았다(도 3).
실시예 3. 블레오마이신 유도된 폐 섬유증의 생체내 모델에서 항-CSF-1R 항체의 효과
블레오마이신은 스트렙토마이세스 베르티실라투스(Streptomyces verticillatus)에서 처음 단리된 항생제이고 다양한 암의 화학요법제로서 사용되어 왔다. 폐 섬유증의 블레오마이신 모델은 잘 확립된 모델이고 실질적으로 [Madtes, DK et al, 1999, Am J Respir Cell Mol Biol, 20, 924-34]에 기술된 바와 같이 사용된다. 상세한 프로토콜은 다음의 참조 문헌 [Morschl, E., Molina, J. G., Volmer, J., Mohsenin, A., Pero, R. S., Hong, J. S., Kheradmand, F., Lee, J. J. and Blackburn, M. R. (2008), A3 adenosine receptor signaling influences pulmonary inflammation and fibrosis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.39: 697-705]에서 확인할 수 있다.
사용된 모든 마우스는 Harlan Labs에서 구매한 야생형 C57Blk6 암컷 마우스(20 g)였다. 기관내(IT) 절개 점적법을 사용하였는데, 마우스를 아베르틴으로 마취시키고 50 ㎕ 염수 중 3.5 유닛 용량의 블레오마이신 또는 대조군으로서 50 ㎕ 염수 단독을 점적하기 위해 기관절개술을 수행하였다. 이러한 방칙의 치료는 블레오마이신 노출 이후 7일이 최고인 염증기 및 노출 후 21일에 최대인 섬유증기를 초래한다. 항체 Ab535의 효과를 조사하였으며 이때 항체를 섬유증기 모델에만 투약하였고 30 mg/kg을 9-21일 동안 주당 3회 피하 투여하였다. 21일에 동물을 희생시켰고 판독값에는 폐의 조직병리학적 분석, BAL(bronchoalveolar lavage) 유체 세포질 및 BAL 유체 중 가용성 콜라겐의 측정을 포함시켰다. 조직병리학적 분석은 폐 섬유증의 중증도를 결정하기 위해 변형된 애쉬크로프트 점수 체계를 사용해 폐 손상을 점수매겨 수행하였다(Hubner RH et al, 2008, Biotechniques 44: 507-17). 절개한 폐를 10% 포르말린을 사용해 25 cm 압력으로 팽창시키고 일련의 알콜 및 크실렌을 통해 처리하고, 파라핀에 삽입시켰고 처리전에 조직 섹션을 탈파라핀화시키고 메이슨 트리크롬으로 염색하였다.
BAL 유체 내 가용성 콜라겐의 양은 제조사의 지시에 따라서 상업적으로 입수할 수 있는 Sircol 어세이 키트를 사용해 평가하였다.
BAL 유체 중 마크로파지 개체군에 대한 효과는 사이토스핀 조제물을 사용해 결정하였다. BAL 세포 분취물을 현미경 슬라이드에 놓고 Diff-Quick으로 염색하고 마크로파지를 계측하였다.
9일에 투약을 시작하여, 항-CSF-1R 항체, Ab535을 사용한 치료적 처치가 블레오마이신 유도된 폐 섬유증을 상당히 감소시켰음을 확인하였다. 섬유증 정도 및 중증도 둘 모두 유의하게 감소하였다. 처치된 마우스는 콜라겐 생성이 감소되었고, 섬유증 병변이 개선되었으며 폐 장벽 보호성도 개선되었다.
도 4a는 Ab535를 사용한 블레오마이신 유도된 폐 섬유증의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료에 비해 BAL 유체 중 콜라겐의 양을 감소시켰음을 보여준다.
도 4b는 Ab525를 사용한 블레오마이신 유도된 폐 섬유증의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료와 비교하여 애쉬크로프트 점수를 감소시켰음을 보여주며 Ab535를 처치한 마우스가 섬유증 병변이 개선되었음을 입증해주었다.
도 4c는 Ab535를 사용한 블레오마이신 유도된 폐 섬유증의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료와 비교하여 BAL 유체 중 알부민의 양을 감소시킴을 보여주며 Ab535를 처치한 마우스의 혈관 투과성 및 폐 장벽 온전성이 개선되었음을 입증해주었다.
도 4d는 Ab535를 사용한 블레오마이신 유도된 폐 섬유증의 치료가 BAL 유체 중 마크로파지의 수를 감소시켰음을 보여준다.
도 5는 염수 대조군, 블레오마디신과 이소타입 대조군 및 블레오마이신과 Ab535를 처치한 동물의 조직병리학적 분석의 대표적인 영상을 보여준다. Ab535를 처치한 동물은 이소타입 대조군, 블레오마이신 처치된 동물과 비교하여 폐의 섬유증이 상당히 감소되었다.
실시예 4 폐 섬유증의 아데노신 디아미나아제-결핍 마우스 모델에서 항-CSF-1R 항체의 효과
아데노신은 강력한 신호전달 뉴클레오티드이며, 이의 수준은 세포가 스트레스를 받거나 또는 손상받았을 때 증가되고 아데노신이 그의 특이적 G 단백질 커플링된 수용체와 연결되면 다양한 반응이 생성된다. 아데노신 디아미나아제(ADA)는 아데노신을 이노신으로 전환시키는 퓨린 이화작용 효소이다. ADA 넉아웃 마우스를 생성시켜서 혈청을 비롯하여 조직 예컨대 신장, 간 및 폐에서 아데노신 농도가 증가됨이 확인되었다(Blackburn, MR et al, 1998, J Biol Chem, 273(9): 5093-5100). 이들 마우스는 폐에 아데노신의 높은 농도와 연관된 만성 폐 질환, 예컨대 폐포 파괴, 기도 염증 및 과도한 점액 생성의 특징을 나타낸다(Blackburn MR et al, 2000, J Exp Med, 192: 159-70). 이러한 영향은 호흡 곤란으로 인해 3주령까지 마우스가 폐사된다. 저용량 계획을 사용한 외생성 ADA의 투여는 아데노신 농도를 감소시키고 이들 마우스의 수명을 연장시켜서 폐 섬유증 모델이 발생되도록 한다(Chunn JL et al, 2005, J Immunol 175: 1937-46, Pedrosa M et al, 2011, PLoS One, 6(7): e22667). 이 모델에서, 아데노신 농도의 만성적 상승은 폐에 TGFβ-1을 포함한 프로섬유증 매개인자의 증가, 폐 조직에 높은 콜라겐 침착 및 높은 섬유증 폐 병변과 연관된다. 항-섬유증 잠재력을 갖는 분자의 효과를 조사하기 위해서, ADA-결핍 마우스를 수주 동안 저용량 외생성 ADA 계획으로 유지시킨 후, ADA 치료를 중단하고 잠재적인 항섬유화제를 투여하였다.
항-CSF-1R 항체 Ab535의 효과를 폐 섬유증의 ADA 넉아웃 마우스 모델에서 조사하였다. 이 모델에서, 효소 결핍 마우스를 생후 1일 내지 21일간 ADA 효소 요법으로 유지시켰다. ADA-폴리에틸렌 글리콜(PEG) 접합체를 준비하였고(Young HW et al, 2004, J Immunol 173: 1380-89), 생후 1, 5, 9, 13 및 17일(각각 0.625, 1.25, 2.5, 2.5 및 2.5 유닛)에 근육내 주사 투여한 후, 21일에 5 유닛을 복강내 주사하였다. 21일 후에는 추가적으로 효소를 투여하지 않았다. 42일에 동물을 희생시킬때까지 25일(생후)부터 Ab535를 주당 3회 100 ㎕ 부피 중 30 mg/kg을 피하 투약하였다.
동물을 42일에 희생시키고 판독치에는 폐의 조직병리학적 분석, BAL 유체 세포질 및 BAL 유체 중 가용성 콜라겐의 정량을 포함시켰다. 조직병리학적 분석은 폐 섬유증의 중증도를 결정하기 위해 변형된 애쉬크로프트 점수 체계를 사용하여 폐 손상을 점수매겨서 수행하였다(Hubner et al, 2008, Biotechniques 44: 507-17). 절개한 폐를 10% 포르말린으로 25 cm 압력까지 팽창시키고 일련의 알콜 및 크실렌으로 처리하고, 파라핀에 삽입시키고 처리 전에 조직 섹션을 탈파라핀화시켜서 메이슨 트리크롬으로 염색하였다.
BAL 유체 중 가용성 콜라겐의 양은 제조사의 지시에 따라서 상업적으로 시판되는 Sircol 어세이 키트를 사용해 평가하였다.
BAL 유체 중 마크로파지 개체군에 대한 효과는 사이토스핀 조제물을 사용해 결정하였다. BAL 세포의 분취물을 현미경 슬라이드에 높고, Diff-Quick으로 염색하고 마크로파지를 계측하였다.
항-CSF-1R 항체 Ab535를 사용한 치료적 처치는 ADA-결핍 마우스의 폐 섬유증을 유의하게 감소시켰음을 확인하였다. 처치된 마우스는 콜라겐 생성이 감소되었고, 섬유증 병변이 개선되었으며 폐 장벽 기능 및 보호성이 개선되었다.
도 6a는 Ab535를 사용한 폐 섬유증 유도된 ADA-결핍 마우스의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료와 비교하여 BAl 유체 콜라겐 농도를 감소시켰음을 보여준다.
도 6b는 Ab535를 사용한 폐 섬유증 유도된 ADA-결핍 마우스의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료와 비교하여 샘플의 애쉬크로프트 점수를 감소시켰음을 보여주며 Ab535를 처치한 마우스가 섬유증 병변이 개선되었음을 입증해주었다.
도 6c는 Ab535를 사용한 폐 섬유증 유도된 ADA-결핍 마우스의 치료가 이소타입 대조군을 사용한 치료와 비교하여 BAL 유체 중 알부민의 농도를 감소시켰음을 보여주며 Ab535를 처치한 마우스의 혈관 투과성 및 폐 장벽 온전성이 개선되었음을 입증해주었다.
도 6d는 Ab535를 사용한, 폐 섬유증 유도된 ADA-결핍 마우스의 치료가 BAL 유체에서 마크로파지 수를 감소시켰음을 보여준다.
도 7은 Ab535 또는 이소타입 대조군 항체(마우스 IgG1)을 처치한 ADA 넉아웃 마우스 및 야생형 마우스의 조직병리학적 분석의 대표적인 영상을 보여준다. 폐 조직 섹션을 메이슨 트리크롬으로 염색하였다. Ab535를 사용한 ADA 넉아웃 마우스의 치료는 콜라겐 침착 및 섬유증 조직의 양을 상당히 감소시켰다.
따라서, 항-CSF-1R 항체를 사용한 치료가 섬유성 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 폐 섬유증의 2가지 마우스 모델에서 확인하였다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB Biopharma SPRL <120> METHOD FOR THE TREATMENT OF FIBROTIC DISEASE <130> G0180-PCT <150> GB1315486.9 <151> 2013-08-30 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 972 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CSF-1R sequence <400> 1 Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His 1 5 10 15 Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val 35 40 45 Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala 85 90 95 Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala 100 105 110 Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu 115 120 125 Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg 130 135 140 Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro 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Ser Leu 355 360 365 Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg 370 375 380 Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr 385 390 395 400 Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr 405 410 415 Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu 420 425 430 Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln 435 440 445 Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His 450 455 460 Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn 465 470 475 480 Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp 485 490 495 Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 500 505 510 Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu 515 520 525 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro 530 535 540 Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser 545 550 555 560 Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys 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Val 770 775 780 Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala 785 790 795 800 Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg 805 810 815 Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr 820 825 830 Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile 835 840 845 Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys 850 855 860 Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe 865 870 875 880 Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu 885 890 895 Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu 900 905 910 Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser 915 920 925 Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu 930 935 940 Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala 945 950 955 960 Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys 965 970 <210> 2 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for CSF-1R <400> 2 Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp Asp 20 25 30 Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser 35 40 45 Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr Tyr Arg 50 55 60 Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile His Leu 65 70 75 80 Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gln Glu Val 85 90 95 Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp 100 105 110 Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro 115 120 125 Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr 130 135 140 Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln Cys Ser Ala 145 150 155 160 Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg Leu Lys Val 165 170 175 Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu 180 185 190 Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys Ser Ala Ser 195 200 205 Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn Asn Thr Lys 210 215 220 Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gln Lys 225 230 235 240 Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His Ala Gly Asn 245 250 255 Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser Thr Ser Met 260 265 270 Phe Phe Arg Val Val 275 <210> 3 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for CSF-1R (ENSP00000421174 49 amino acids) <400> 3 Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr Ile 1 5 10 15 His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln Cys Ser Ala Leu 20 25 30 Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg Leu Lys Val Gln 35 40 45 Lys <210> 4 <211> 493 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for CSF-1R (SNP V32G, A245S, H247P, V279M, position underlined) <400> 4 Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp Asp 20 25 30 Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser 35 40 45 Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr Tyr Arg 50 55 60 Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile His Leu 65 70 75 80 Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gln Glu Val 85 90 95 Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp 100 105 110 Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro 115 120 125 Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr 130 135 140 Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln Cys Ser Ala 145 150 155 160 Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg Leu Lys Val 165 170 175 Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu 180 185 190 Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys Ser Ala Ser 195 200 205 Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn Asn Thr Lys 210 215 220 Leu Ala Ile His Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gln Lys 225 230 235 240 Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His Ala Gly Asn 245 250 255 Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser Thr Ser Met 260 265 270 Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Glu Gln 275 280 285 Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn Leu Lys Val 290 295 300 Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp Thr Tyr Leu 305 310 315 320 Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala Asn Ala Thr 325 330 335 Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu Pro Arg Leu 340 345 350 Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg Asn Pro Gly 355 360 365 Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Pro Glu 370 375 380 Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr Leu Leu Cys 385 390 395 400 Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu Gln Cys Ser 405 410 415 Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln Val Trp Asp 420 425 430 Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His Lys Val Thr 435 440 445 Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn Gln Thr Tyr 450 455 460 Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp Ala Phe Ile 465 470 475 480 Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 485 490 <210> 5 <211> 512 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF-1R form suitable for expression on a cell surface <400> 5 Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His 1 5 10 15 Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val 35 40 45 Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala 85 90 95 Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala 100 105 110 Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu 115 120 125 Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg 130 135 140 Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His 145 150 155 160 Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln 165 170 175 Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg 180 185 190 Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val 195 200 205 Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys 210 215 220 Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn 225 230 235 240 Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg 245 250 255 Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His 260 265 270 Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser 275 280 285 Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser 290 295 300 Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn 305 310 315 320 Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp 325 330 335 Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala 340 345 350 Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu 355 360 365 Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg 370 375 380 Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr 385 390 395 400 Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr 405 410 415 Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu 420 425 430 Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln 435 440 445 Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His 450 455 460 Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn 465 470 475 480 Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp 485 490 495 Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 500 505 510

Claims (35)

  1. CSF-1R 활성 억제제를 포함하는, 폐섬유증의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물로서, 상기 억제제가 항체 또는 이의 기능적 활성 단편이며, 상기 항체 또는 이의 단편이 CSF-1R에 결합하는 것인 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 단일클론, 다중클론, 키메라, 인간화 또는 이중특이성인 것인 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 이의 에피토프 결합 단편인 약학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 1 이상의 이펙터 분자에 접합되는 것인 약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폐섬유증은 특발성 폐섬유증(IPF)인 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 다른 치료적 활성 화합물을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 다른 치료적 활성 화합물은 다른 항섬유화 치료제인 약학적 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 이의 에피토프 결합 단편인 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 1 이상의 이펙터 분자에 접합되는 것인 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 폐섬유증은 특발성 폐섬유증(IPF)인 약학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 1종 이상의 다른 치료적 활성 화합물을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 다른 치료적 활성 화합물은 다른 항섬유화 치료제인 약학적 조성물.
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