TW202140045A - Ｉｌ－３６ｒ訊息特異性阻礙抗體 - Google Patents

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Abstract

提供特異性結合於人類之IL-36R而阻礙IL-36R致效劑之訊息的IL-36R中和抗體，其係IL-36α、β、γ當中IL-36β之訊息阻礙為弱或無訊息阻礙的IL-36R訊息特異性阻礙抗體。本抗體於3種之人類IL-36R致效劑配位體IL-36α、β及γ當中，對至少1種之配位體的訊息之50%阻礙濃度(IC50 )，為對其他至少1種之配位體的訊息之50%阻礙濃度之10倍以上。

Description

ＩＬ－３６Ｒ訊息特異性阻礙抗體
本發明係關於IL-36R訊息特異性阻礙抗體者。具體而言，係關於結合於脊椎動物之IL-36R，阻礙IL-36R之訊息的抗體。
＜IL-36R＞
細胞激素係以微量即具備生理活性之小分子量(一般而言為5~30kDa)之多胜肽，其係由細胞所分泌，對具有對應之受體的鄰近細胞之行為造成影響的蛋白質之總稱。已知有介白素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子等，伴隨研究的進展，經分類之名稱係由人類基因體組織(Human Genome Organization：HUGO)之人類基因體命名委員會(HUGO Gene Nomenclature Committee：HGNC)所公開。介白素係由淋巴球或巨噬細胞等所分泌，調節免疫系統，負責細胞間之資訊傳導的物質，係依配位體或受體之面向而進行分類(非專利文獻1)。
介白素36受體(IL-36R)及其配位體，係藉由人類基因體計畫，作為類似於IL-1家族之基因序列，而自1990年代至2000年代前半被報告而經系統化。IL-36R自發現當初起已知與TNF受體或類Toll受體(Toll Like Receptor)同樣地，於細胞內區域具備TIR結構域。隨後伴隨組織中的表現分布，確認到係透過於IL-1家族之受體中共通的輔助蛋白質(IL-1RAcP)，使MyD88(myeloid differentiation primary response gene 88)相關之訊息串接(signal cascade)產生作用，而使核因子κB(Nuclear Factor-kappa B：NFkB)、促分裂原活化蛋白質激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase：MAPK)，及c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase：JNK)之訊息活化，於免疫反應之重要性受到認識(非專利文獻2)。IL-36R於皮膚或胸腺、黏膜組織之表現為多，且於角質細胞(非專利文獻3、非專利文獻4)、樹狀細胞(非專利文獻3、5、9)、單核球(非專利文獻3、5)、纖維母細胞(非專利文獻3)、嗜中性球(非專利文獻3、7)、T細胞(非專利文獻8)、巨噬細胞(非專利文獻3、6)、B細胞(非專利文獻8)等複數種免疫活性細胞中確認到IL-36R的表現。
IL-1家族之受體，配位體結合部位之序列的相似性低，另一方面，構造為類似。細胞外區域係稱為類Ig(Ig-like)結構域的由2個β摺疊所形成之3個結構域所構成的糖蛋白質，糖鏈修飾部位在家族間係相異。IL-36受體(以下適當稱為「IL-36R」)與其他IL-1家族受體同樣地，推定與致效劑(agonist)配位體及IL-1受體輔助蛋白質(IL-1RAcP)一起形成3聚體，實驗上亦已經證明(非專利文獻10)。
由配位體之觀點來看，IL-36係與IL-1同樣地，已知有致效劑與拮抗劑(antagonist)兩方。作為配位體，報告有致效劑3種(IL-36α、IL-36β、IL-36γ)與拮抗劑2種(IL-36Ra、IL-38)(非專利文獻11)。IL-36R之各種配位體，係與其他IL-1家族同樣地，通常位於細胞內。分泌之機轉雖不明朗，但認為是因細胞死亡或免疫反應而釋出於細胞外，N末端被蛋白酶切斷而活化。IL-36致效劑藉由在適切之部位受到加工(processing)，對IL-36R/IL-1RAcP複合體之結合活性上昇980倍~36000倍，以報導分析(reporter assay)而得之生物活性上昇1500倍~8000倍(非專利文獻15)。IL-36與藉由凋亡蛋白酶而活化之IL-1α、IL-1β或IL-18不同地，係藉由細胞自溶酶-S或嗜中性球蛋白酶而被活化(非專利文獻12)，活化蛋白酶係隨每個配位體而相異，依活化酵素不同，活性也相異。例如IL-36γ之訊息係有報告相較於細胞自溶酶G(Cathepsin G)而言，因嗜中性球彈性蛋白酶(Elastase)而更為增強(非專利文獻13)。以活化配位體之酵素為標的之阻礙物質係有被開發(非專利文獻14)，另一方面，此等被報告之酵素是否為全部，則尚未明確。例如被報告在異位性皮膚炎中有上昇之IL-18，係有報告其活化酵素為源自肥胖細胞之凝乳酶、源自CD8+T細胞之顆粒酶B(granzyme B)、進而源自葡萄球菌之Sp-A等。因此，即使IL-36亦同樣地藉由土著菌(indigenous bacteria)等之酵素而被活化，亦不會不可思議。
關於IL-36Ra，亦與IL-36R致效劑同樣地以加工為重要，有報告N末端之甲硫胺酸之去除對於活性而言係重要的(非專利文獻15)。就真核生物之N末端之甲硫胺酸的去除而言，有報告N末端之甲硫胺酸以後之胺基酸序列為重要(非專利文獻16)，由於IL-36Ra之N末端之甲硫胺酸後的胺基酸為Val，故於轉譯之過程中受到加工的可能性高。近年來，有報告特別是活化IL-36γ之酵素的嗜中性球彈性蛋白酶，會活化IL-36Ra(非專利文獻17)，暗示了IL-36之致效劑與拮抗劑的平衡係受到複雜的控制。關於另1個拮抗劑之IL-38，雖然有報告，但活化型尚未被市售，亦暗示了對其他IL-1家族受體之結合的可能性，尚在研究中。但是，有報告將全長之IL-38對乾癬之病態模式動物投予時，IL-17或IL-22等之發炎性細胞激素會降低，於實際臨床上亦與抗IL-17抗體之效果相關(非專利文獻18)。
IL-36之拮抗劑被認為與受體結合或與配位體競爭，而抑制或調節IL-36R訊息。依照研究IL-36配位體及IL-36Ra之加工的報告，藉由使N末端之甲硫胺酸1殘基不被去除，IL-36Ra會失去阻礙IL-36R訊息之功能(非專利文獻15)。 ＜IL-36R與乾癬之關聯＞
依照研究IL-36R、IL-1RAcP、IL-36配位體之動力學的報告，IL-36Ra係對IL-36R及IL-36R/IL-1RAcP複合體顯示相同之結合活性，但IL-36配位體之對IL-36R之結合活性係與IL-36Ra同等或稍弱，然而對於IL-36R/IL-1RAcP複合體，係以IL-36Ra之10倍以上的強度結合(非專利文獻19)。疾病中之IL-36R訊息的相關性，係藉由使用了IL-36Ra(別名IL-1F5)、IL-36α(別名IL-1F6)、IL-36R(別名IL-1RL2或IL-1Rrp2)、IL-1RAcP之基因轉殖小鼠的研究而明朗，不僅病態模式，於乾癬患者皮膚也有報告IL-36R、IL-36α、IL-36Ra之表現上昇(非專利文獻20)。進一步地，有報告在使用了IL-36R基因剔除小鼠之咪喹莫特(imiquimod)模式中，也證明了IL-36R之缺失係程度較IL-17或IL-22更甚地造成發炎的抑制，並且推定與IL-17或IL-23一起形成細胞激素迴圈(非專利文獻21)，作為乾癬之治療藥之標的，有報告IL-17或IL-23對TNFα顯示高的效果，其中亦有推定IL-36才是驅動者(非專利文獻22)。
臨床上有報告，乾癬之中尤其重症度高的膿皰性乾癬(pustular psoriasis)(全身型)(GPP)，係與IL-36Ra之缺損有關聯，IL-36Ra之功能缺損在疾病中扮演重要角色(非專利文獻23)，而產生了DITRA(Deficiency of Interleukin - Thirty six Receptor Antagonist)的概念。DITRA在遺傳學上不僅是同型合子變異，有報告異型合子變異亦會發病，因藥劑而發病的急性全身性發疹性膿皰症或於孕期發病的疱疹狀膿痂疹，亦作為DITRA的1者而經系統化(非專利文獻24)。
以乾癬為首的自體免疫疾病中之IL-36配位體之表現平衡，係經複數個團隊報告，但於源自患者之組織或病變部，IL-36β上昇的事例較少，另一方面，係有顯著的IL-36α與IL-36γ之mRNA上昇，IL-36Ra或IL-38之mRNA量降低的傾向(非專利文獻25)。近年來，於重症度高的膿皰性乾癬(全身型)中，抗IL-36受體抗體(以下適當稱為「抗IL-36R抗體」)顯示出臨床效果，有報告以單次投予即於全部症例顯示出改善(非專利文獻26)。雖抑制哪個IL-36為重要尚未明確，但已知即使不是DITRA，抗IL-36R抗體也於GPP顯示高的治療效果，由此報告，明確顯示出抗IL-36R抗體作為醫藥品標靶的潛力，剩下的課題可認為是用法用量或治療方法之設定、風險管理、安全性及適應範圍的擴大等醫藥品開發相關者。 ＜IL-36R與乾癬以外疾病之關聯＞
有報告IL-36配位體不僅是乾癬，於全身性紅斑狼瘡(SLE)或發炎性腸疾病(IBD)等有效的治療方法尚未確立之自體免疫疾病中表現也有上昇(非專利文獻27)。近年來，有專利公開IL-36Ra KO(基因剔除)小鼠其關節炎會發病(專利文獻1)，有報告對類固醇具備抗性之乾癬性關節炎中特別是IL-36α會上昇(非專利文獻28)。
於肺亦確認到IL-36受體或IL-36R致效劑配位體之表現，有報告會引起巨噬細胞或纖維母細胞之活化與膠原蛋白之沈積。近年來，有報告IL-36γ陽性巨噬細胞與纖維化有關聯(非專利文獻29)，IL-36R之阻礙係有對纖維化有效果的可能性。進一步地，有報告IL-36R訊息之剔除或阻礙對腎臟(非專利文獻30)或腸道(非專利文獻31)之病態模式動物亦顯示治療效果。
本案之優先權基礎申請案(日本特願2019-239130)之申請日(2019年12月27日；以下稱「本案優先權日」)後，有報告IL-36R之結晶構造(PDB ID：6U6U)。又，於本案優先權日後始公開的專利文獻6及專利文獻7中，分別報告了抗IL-36R抗體及抗IL-36配位體抗體。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2017-055680號公報 [專利文獻2]國際公開第2013/074569號 [專利文獻3]國際公開第2016/168542號 [專利文獻4]國際公開第2013/180238號 [專利文獻5]國際公開第2006/106366號 [專利文獻6]國際公開第2020/018503號 [專利文獻7]國際公開第2020/065594號 [非專利文獻]
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[發明所欲解決之課題] ＜各IL-36R致效劑配位體之功能＞
對使用於治療之醫藥品，不僅效果，也要求高的安全性。除了至今為止所報告的感染症以外，亦必須顧慮新的感染症之風險或癌惡化之風險。該安全性不僅是短期的觀點，且要求亦包含臨床試驗後之長期的觀點。但是，風濕病或乾癬之治療中廣為使用的抗TNF抗體等以細胞激素為標的之抗體醫藥品，顯示出至今為止之低分子醫藥品無法達成之高的治療效果，另一方面，藉由臨床試驗而得知有副作用，其並不容易預測。因此，若可得到同等的效果，當然風險較低的藥劑係有優勢。
IL-36α、IL-36β、IL-36γ均與IL-17A同樣地，具有抗菌胜肽之表現上昇作用，該作用係IL-36β最強(非專利文獻4)。又，由於對於LPS刺激，樹狀細胞或巨噬細胞等單核球系之細胞中之IL-36β的mRNA之變動少(非專利文獻25)，故認為IL-36β中係有與IL-36α及IL-36γ不同的免疫維持之角色。有報告囓齒類中於神經膠細胞有表現IL-36β(非專利文獻32)或就T細胞之效應物(effector)功能上，IL-36β係重要的(非專利文獻33)，僅IL-36β之基因剔除小鼠，疱疹病毒之感染致死率上昇一事(非專利文獻34)有並非偶然的可能性。
以乾癬為首的自體免疫疾病中，幾乎沒有IL-36β的上昇為重要的報告，另一方面，有報告健康人之血中濃度中，IL-36β之濃度高(非專利文獻35)、IL-36β與γ，係與T細胞之生存及IFNγ之表現等之宿主防禦有密切相關(非專利文獻36)，使MHC類型II(MHC Class II)上昇，並且調節CD40等之癌的新穎標靶之分子的表現(非專利文獻9)。由此，IL-36β之病態生理學的意義尚多有不明朗的點。於抗IL-36R抗體，若亦如JAK阻礙劑所面對般，出現了於帶狀疱疹或其他感染症以外，無法否定對癌的貢獻之結果，則之後之藥劑開發變得困難，可開發選擇性地IL-36阻礙抗體。因此，考量到治療之效益與副作用的風險時，期望特異性地阻礙IL-36α及IL-36γ，但目前並無如此的藥劑。 ＜受體之功能阻礙抗體＞
一般而言，對1個細胞激素受體有複數個配位體時，以結合於受體之抗體來選擇性地阻礙配位體之訊息係困難的。如非專利文獻所記載，抗IL-1受體抗體係阻礙IL-1α與IL-1β兩方的訊息(非專利文獻37)，抗IL-17RA抗體及抗IL-17RC抗體係分別阻礙IL-17A與IL-17F兩方的訊息(非專利文獻38)。專利文獻中亦無IL-36之訊息特異性阻礙抗體的記載(專利文獻2、專利文獻3)。此等報告之抗體的阻礙態樣雖未明確，但若是抗體阻礙受體與配位體形成複合體，考量到細胞激素或其受體與抗體的分子尺寸時，由於抗體的分子尺寸大於IL-36配位體結合於IL-36受體之部位，故對IL-36之各配位體進行選擇性的阻礙等，被認為是不容易的，咸認僅選擇性地阻礙特定之配位體的抗受體抗體係不存在的。 [用以解決課題之手段]
本發明者等人重複深入研究的結果，藉由在結合於IL-36R的同時，不阻礙IL-36β，僅阻礙被報告於自體免疫疾病中表現上昇及對病態之相關性的IL-36α及IL-36γ，而發現安全且有效，用以有效率地進行治療之新穎阻礙劑取得方法，而掌握到該物質。
亦即，本發明之目的為提供特異性結合於人類之IL-36R而阻礙IL-36R致效劑之訊息的IL-36R中和抗體，其係IL-36α、β、γ當中IL-36β之訊息阻礙為弱或無訊息阻礙的IL-36R訊息特異性阻礙抗體或其片段，或該等之衍生物。
又，本發明之目的為抑制IL-36R所媒介之免疫系統之異常活化，提供治療自體免疫疾病或癌之手段。
亦即本發明關於以下者。 [項1] 一種抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其係針對人類IL-36R之抗體或其片段，或該等之衍生物，其中，於3種之人類IL-36R致效劑配位體IL-36α、β及γ當中，對至少1種之配位體的訊息之50%阻礙濃度(IC50 )，為對其他至少1種之配位體的訊息之50%阻礙濃度(IC50 )之10倍以上。 [項2] 如項1之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中於使用了IL-36R表現細胞之Cell ELISA中，顯示1×10-7 M以下之50%效果濃度(EC50 )。 [項3] 如項1或2之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中對人類IL-36R致效劑配位體IL-36β之訊息的50%阻礙濃度，為對人類IL-36R致效劑配位體IL-36α及γ之訊息的50%阻礙濃度之10倍以上。 [項4] 如項1或2之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中人類IL-36R致效劑配位體IL-36α及γ之訊息的阻礙為50%以上，且IL-36β之訊息的阻礙為未達50%。 [項5] 如項3或4之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中於0.2ng/mL以上之濃度中，IL-36β之訊息之50%阻礙濃度為10×10-8 M以上。 [項6] 如項1~5中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其係結合於人類IL-36R之結構域I。 [項7] 如項1~6中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其係於人類IL-36R之胺基酸序列(序列編號11)中，結合於由自N末端起第1~8號之胺基酸殘基所構成的區域、由第25~32號之胺基酸殘基所構成的區域，及由第81~88號之胺基酸殘基所構成的區域當中至少2個區域。 [項8] 如項1~7中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其係於人類IL-36R之胺基酸序列(序列編號11)中，結合於自N末端起第4號之離胺酸殘基及第28號之異白胺酸殘基。 [項9] 如項1~8中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其至少包含重鏈可變序列，且前述重鏈可變序列， (1)包含作為CDR-H1序列的 (1a)序列編號23或25(XH001或XH002)之胺基酸序列、 (1b)與前述(1a)之胺基酸序列具有至少80%以上之相似性的胺基酸序列，或 (1c)前述(1a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列； (2)包含作為CDR-H2序列的 (2a)由序列編號27、29、31及213(XH003~XH005及XH007)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (2b)與前述(2a)之胺基酸序列具有至少88%以上之相似性的胺基酸序列，或 (2c)前述(2a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列； (3)包含作為CDR-H3序列的 (3a)由序列編號33、215及217(XH006、XH008及XH009)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (3b)與前述(3a)之胺基酸序列具有至少83%以上之相似性的胺基酸序列，或 (3c)前述(3a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。 [項10] 如項9之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中前述重鏈可變序列之框架序列，含有人類或包含猴子、小鼠或大鼠之非人類動物的免疫球蛋白之各類型的框架序列。 [項11] 如項9或10之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中前述重鏈可變序列，包含 (a)由序列編號45(Pro000713v)、序列編號47(Pro000722v)、序列編號49(Pro001558v)、序列編號51(Pro001562v)、序列編號53(Pro001554v)、序列編號55(Pro001566v)、序列編號57(Pro001570v)、序列編號59(Pro001574v)、序列編號177(Pro002817v)、序列編號181(Pro002818v)，及序列編號185(Pro002819v)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (b)與前述(a)之胺基酸序列具有至少80%以上之相似性的胺基酸序列，或 (c)前述(a)之胺基酸序列中1~12個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。 [項12] 如項1~11中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其至少包含輕鏈可變序列，且該輕鏈可變序列， (1)包含作為CDR-L1序列的 (1a)由序列編號35、37及219(XL001、XL002及XL006)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (1b)與前述(1a)之胺基酸序列具有至少84%以上之相似性的胺基酸序列，或 (1c)前述(1a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列； (2)包含作為CDR-L2序列的 (2a)由序列編號39、41及221(XL003、XL004及XL007)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (2b)與前述(2a)之胺基酸序列具有至少85%以上之相似性的胺基酸序列，或 (2c)前述(2a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列； (3)包含作為CDR-L3序列的 (3a)由序列編號43、223及225(XL005、XL008及XL009)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (3b)與前述(3a)之胺基酸序列具有至少88%以上之相似性的胺基酸序列，或 (3c)前述(3a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。 [項13] 如項12之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中前述輕鏈可變序列，進一步含有人類或包含猴子、小鼠或大鼠之非人類動物的免疫球蛋白之各類型的框架序列。 [項14] 如項12或13之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中前述輕鏈可變序列，包含 (a)由序列編號61(Pro000714v)、序列編號63(Pro001332v)、序列編號65(Pro001333v)、序列編號67(Pro001334v)序列編號179(Pro002821v)、序列編號183(Pro002823v)，及序列編號187(Pro002822v) 中選擇的任1者之胺基酸序列、 (b)與前述(a)之胺基酸序列具有至少80%以上之相似性的胺基酸序列，或 (c)前述(a)之胺基酸序列中1~10個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。 [項15] 如項1~14中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中重鏈恆定區域及/或輕鏈恆定區域，為人類或包含小鼠、大鼠或猴子之非人類動物的免疫球蛋白之各類型中之恆定區域。 [項16] 如項1~15中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其係Fab、scFv、Diabody或雙特異性抗體，或該等之衍生物。 [項17] 一種核酸分子，其係由編碼如項1~16中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物的多核苷酸序列所構成。 [項18] 一種選殖載體或表現載體，其包含至少一個如項17之核酸分子。 [項19] 一種重組體細胞，其係導入有如項18之載體。 [項20] 一種用以製造如項1~16中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物之方法，其包含培養如項19之重組體細胞。 [項21] 一種醫藥組成物，其含有選自由如項1~16中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物、如項17之核酸分子、如項18之載體，及如項19之重組體細胞所成之群的1或2者以上。 [項22] 如項21之醫藥組成物，其係對人類投予而調節或修飾免疫反應。 [項23] 如項21或22之醫藥組成物，其係對人類以1週1次以下之頻率投予。 [項24] 如項21~23中任一項之醫藥組成物，其係使用於脊椎動物之癌或自體免疫疾病之治療及/或預防。 [項25] 如項21~24中任一項之醫藥組成物，其進一步含有藥學上容許之稀釋劑、藥物載體，及/或其他添加劑。 [項26] 如項21~25中任一項之醫藥組成物，其進一步含有第2活性成分。 [項27] 如項26之醫藥組成物，其中前述第2活性成分，為選自由氮卓斯汀(azelastine)、歐查妥邁(oxatomide)、美喹他嗪(mequitazine)、非索非那定(fexofenadine)、依匹斯汀(epinastine)、依巴斯汀(ebastine)、西替利嗪(cetirizine)、左西替利嗪(levocetirizine)、貝波他汀(bepotastine)、依美斯汀(emedastine)、奧洛他定(olopatadine)、氯雷他定(loratadine)、左卡巴斯汀(levocabastine)、奧扎格雷(ozagrel)、塞拉司特(seratrodast)、雷馬曲班(ramatroban)、普鲁斯特(pranlukast)、蒙特魯卡斯特(montelukast)、扎魯斯特(zafirlukast)、甲磺斯特(suplatast)、苯海拉明(diphenhydramine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、二苯基比拉林(diphenylpyraline)、克雷滿汀(clemastine)、氯菲安明(chlorpheniramine)、屈普利汀(triprolidine)、普美苯噻肼(promethazine)、阿利馬嗪(alimemazine)、苯羥乙嗪(hydroxyzine)、同氯克利定(homochlorcyclizine)、塞浦西他啶(cyproheptadine)、美沙拉嗪(mesalazine)、干擾素貝他1b、干擾素貝他1a、芬格莫德(fingolimod)鹽酸鹽、那他珠單抗(natalizumab)、格拉默(glatiramer)乙酸鹽、富馬酸二甲酯、依曲替酯(etretinate)、他克莫司(tacrolimus)、巰基嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)，及阿普密蘭特(apremilast)所成之群的1者以上。 [項28] 如項26或27之醫藥組成物，其中前述第2活性成分，為選自由皮質類固醇、止吐藥、昂丹司瓊(ondansetron)鹽酸鹽、格拉司瓊(granisetron)鹽酸鹽、美多普胺(metroclopramide)、多潘立酮(domperidone)、氟哌啶醇(haloperidol)、賽克利嗪(cyclizine)、蘿拉西泮(lorazepam)、普洛陪拉幸(prochlorperazine)、地塞米松(dexamethasone)、左美丙嗪(levomepromazine)、托烷司瓊(tropisetron)、癌疫苗、GM-CSF阻礙藥、GM-CSF、DNA疫苗、基於細胞之疫苗、樹狀細胞疫苗、重組病毒疫苗、熱休克蛋白質(HSP)疫苗、同質性腫瘤疫苗、自體腫瘤疫苗、止痛藥、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、三水楊酸膽鹼鎂、羥可待酮(oxycodone)鹽酸鹽、抗血管新生藥、抗血管藥、抗PD-1抗體、納武利尤單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、替雷利珠單抗(tislelizumab)、抗PD-L1抗體、阿替利珠單抗(atezolizumab)、阿維單抗(avelumab)、度伐利尤單抗(durvalumab)、抗CTLA4抗體、伊匹木單抗(Ipilimumab)、抗CD20抗體、利妥昔單抗(rituximab)、抗HER2抗體、曲妥珠單抗(trastuzumab)、抗CCR4抗體、莫加木珠單抗(mogamulizumab)、抗VEGF抗體、貝伐珠單抗(bevacizumab)、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體片段、抗TWEAK抗體、抗TWEAK受體抗體、可溶性TWEAK受體片段、AMG 706、AMG 386、抗α4β7抗體、貝伐珠單抗(bevacizumab)、維多珠單抗(etrolizumab)、抗SIRPα抗體、抗CD40抗體、抗CD40L抗體、抗增殖藥、法尼基(farnesyl)蛋白質轉移酶阻礙藥、αvβ3阻礙藥、αvβ5阻礙藥、p53阻礙藥、Kit受體阻礙藥、ret受體阻礙藥、PDGFR阻礙藥、生長激素分泌阻礙藥、血管生長素(angiopoietin)阻礙藥、腫瘤浸潤巨噬細胞阻礙藥、c-fms阻礙藥、抗c-fms抗體、CSF-1阻礙藥、抗CSF-1抗體、可溶性c-fms片段、培維索蒙(pegvisomant)、吉西他濱(gemcitabine)、帕尼單抗(panitumumab)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、TNFα阻礙劑、IL-17A阻礙劑、IL-17F阻礙劑、IL-17RA阻礙劑、IL-23p19阻礙劑、IL-23p40阻礙劑及IL-1RAcP阻礙劑，及SN-38所成之群的1者以上。 [發明之效果]
本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體或其片段或該等之衍生物，藉由特異性地結合於人類之IL-36R，阻礙IL-36R之訊息當中的特定訊息，而調節細胞反應，具有對自體免疫疾病之治療效果或對癌之治療效果。
以下，基於具體的實施形態說明本發明，但本發明不受此等實施形態任何限定。再者，本說明書中包含所引用之專利公報、專利申請案公開公報，及非專利公報的全部文獻，係於所有的目的上，藉由援用而將其全體併入本說明書中。 [IL-36]
本發明中，「IL-36」係指介白素之一的介白素36致效劑配位體。亦即，「IL-36」中，包含IL-36α、IL-36β，及IL-36γ之3種的致效劑配位體。人類IL-36α、IL-36β，及IL-36γ蛋白質之各胺基酸序列分別示於序列編號1、3及5，所對應之人類IL-36α、IL-36β，及IL-36γ基因的各鹼基序列分別示於序列編號2、4及6。又，圖1顯示比較人類IL-36α、β及γ之活性型之胺基酸序列的序列比對。此等3種IL-36R致效劑配位體當中，針對特定之配位體進行敘述時，係於「IL-36」之後附上α、β或γ，來特定出係指哪種配位體。
與IL-1所結合的IL-1受體同樣地，IL-36所結合的IL-36受體(IL-36R)，係存在有阻礙IL-36之結合的天然之拮抗劑配位體(IL-36R拮抗劑配位體：以下亦有僅稱為「IL-36R拮抗劑」者)。天然之IL-36R拮抗劑，已知有IL-36Ra及IL-38。人類IL-36Ra及IL-38蛋白質之各胺基酸序列係分別示於序列編號7及9，所對應之人類IL-36Ra及IL-38基因的各鹼基序列係分別示於序列編號8及10。
IL-36之基因與IL-36R拮抗劑之基因位於相同基因座，在許多物種中已知係作為關於宿主防禦之重要的生理活性物質而發揮功能。IL-36及IL-36R拮抗劑，主要於皮膚、其次係於黏膜組織與免疫組織存在。又，自體免疫疾病中，於角質細胞、纖維母細胞、上皮細胞、以T細胞為首的白血球、樹狀細胞、巨噬細胞等各種細胞中，報告了IL-36及IL-36R拮抗劑之mRNA有上昇。IL-36及IL-36R拮抗劑，均存在有不活性型及活性型。欲使不活性型變為活性型，主要係以免疫活性細胞所產生的蛋白酶(消化酵素)所為之消化為必要，消化酵素及被消化之序列係依配位體而異。與IL-36不同地，IL-36R拮抗劑之IL-36Ra，僅以將N末端之甲硫胺酸去除即變為活性型。關於另一IL-36R拮抗劑之IL-38之活性型，尚不太清楚。
本說明書中只要無特別指明，僅稱「IL-36」及「IL-36R拮抗劑」時，均指活性型。受到蛋白酶消化之前的IL-36配位體，係如「IL-36前驅物」或「IL-36α前驅物」般附加「前驅物」予以記載。 [IL-36R與IL-36R複合體]
本發明中，「IL-36R」係指IL-36所結合的受體即IL-36受體。圖2中顯示人類IL-36R之胺基酸序列。圖3中示意性顯示人類IL-36R之立體構造。人類IL-36R蛋白質之胺基酸序列，可由NCBI之登錄編號NP_001338375.1或Uniprot之登錄編號Q9HB29等予以參照。
再者，人類IL-36R中報告有複數種同功型，本說明書中只要無特別指明，僅記載為「人類IL-36R」時，係指同功型「a」，進而係指藉由轉譯後修飾而經切斷訊息胜肽之狀態之蛋白質(亦即具有序列編號11(Pro001391)所示胺基酸序列之蛋白質)者。
已知許多脊椎動物保有IL-36配位體及IL-36R蛋白質，IL-36R之胺基酸序列，已知有人類(序列編號13：Q9HB29|ILRL2_HUMAN)、食蟹猴(序列編號15：A0A2K5WSK9_MACFA)、恆河猴(序列編號17：A0A1D5RBJ8_MACMU)、小鼠(序列編號19：Q9ERS7|ILRL2_MOUSE)、大鼠(序列編號21：Q62929|ILRL2_RAT)等之胺基酸序列。該等以外之動物物種之IL-36R之胺基酸序列，亦可參照NCBI或EMBL等之資料庫。圖4顯示比較包含訊息胜肽之人類、食蟹猴、恆河猴、小鼠及大鼠的IL-36R之胺基酸序列的序列比對。
IL-36R係與IL-36及IL-1受體家族共通之訊息傳導受體的IL-1RAcP一起形成複合體(非專利文獻2)。以下將該複合體記載為「IL-36R複合體」。 [IL-36R拮抗劑與IL-36R中和抗體]
本發明中，「IL-36R拮抗劑配位體」或「IL-36R拮抗劑」，係指可結合於IL-36R而阻礙IL-36R訊息之全部配位體。天然存在的IL-36受體拮抗劑，係標記為「IL-36Ra」。IL-36R拮抗劑之形態，可列舉抗體、變體抗體、胜肽、適體等之高分子，或各種低分子等。再者，即使是至今為止無報告的分子，凡可結合於IL-36R而阻礙其訊息之分子，亦包含於IL-36R拮抗劑。可結合於IL-36R之抗IL-36R抗體當中，可阻礙IL-36R致效劑配位體之訊息的IL-36R拮抗劑，在本文中係表述為「IL-36R中和抗體」。 [PAN抗體與IL-36R訊息特異性阻礙抗體]
只要無特別指明，上述IL-36R中和抗體，係阻礙IL-36α、β、γ之各種IL-36R致效劑配位體之訊息全部。本發明中記載的IL-36R中和抗體，亦有附上希臘語中意指「全部」的接頭詞而表述為「PAN抗體」者。IL-36α、β、γ之各種配位體當中，將阻礙1個以上之訊息，另一方面不阻礙1個以上之訊息，或1個以上之訊息之50%阻礙濃度(IC50 )較其他訊息之50%阻礙濃度(IC50 )大10倍以上之抗體，表述為「IL-36R訊息特異性阻礙抗體」。IC50 大10倍或以上之抗體意味著阻礙活性弱10倍或以上。本發明中只要無特別記載，「IL-36R訊息特異性阻礙抗體」，意指相較於IL-36α及IL-36γ，IL-36β之訊息阻礙相對地弱，或不阻礙IL-36β之訊息之抗體。 [抗體之定義]
抗體係指藉由雙硫鍵而相互鍵結之含至少2個重(H)鏈及2個輕(L)鏈的糖蛋白質。重鏈包含重鏈可變區域(略稱為VH)及重鏈恆定區域，重鏈恆定區域包含3個結構域CH1、CH2及CH3。輕鏈包含輕鏈可變區域(略稱為VL)及輕鏈恆定區域。輕鏈恆定區域包含1個結構域CL。輕鏈之恆定區域存在有稱為λ鏈及κ鏈之2種。重鏈之恆定區域存在有γ鏈、μ鏈、α鏈、δ鏈及ε鏈，依其重鏈的不同，分別存在有稱為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE之抗體的同型(isotype)。VH及VL區域進一步細分為稱為框架區域(FR)之更為保留的4個區域(FR-1、FR-2、FR-3、FR-4)，與稱為互補性決定區域(CDR)之可變性之3個區域(CDR-1、CDR-2、CDR-3)。VH自胺基末端向羧基末端，包含以FR-1、CDR-1(CDR-H1)、FR-2、CDR-2(CDR-H2)、FR-3、CDR-3(CDR-H3)、FR-4之順序排列的3個CDR及4個FR。VL自胺基末端向羧基末端，包含以FR-1、CDR-1(CDR-L1)、FR-2、CDR-2(CDR-L2)、FR-3、CDR-3(CDR-L3)、FR-4之順序排列的3個CDR及4個FR。重鏈及輕鏈之可變區域，包含與抗原相互作用之結合結構域。
本發明之抗體，只要具有後述之IL-36R訊息特異性阻礙活性，則可為抗體之片段(例如抗原結合片段)及/或衍生物。抗體之片段可列舉F(ab’)2 、Fab、Fv等。抗體之衍生物，可列舉對恆定區域部分人工導入胺基酸變異之抗體、改變恆定區域之結構域構成之抗體、每1分子具備2個以上之Fc之形態的抗體、僅以重鏈或輕鏈構成之抗體、糖鏈變體抗體、雙特異性抗體、抗體或抗體之片段化合物或與抗體以外之蛋白質結合的抗體接合物(conjugate)、抗體酵素、奈米抗體、串聯scFv、雙特異性串聯scFv、微二價抗體(Diabody)、VHH等。再者，本發明中僅稱為「抗體」時，只要無另外明確記載，亦包含抗體之片段及/或衍生物。
又，單株抗體，古典上係指由源自單一抗體產活細胞之殖株所得的抗體分子，但係指包含由特定之胺基酸序列所構成的VH與VL之組合的單一種類之抗體分子。單株抗體，亦可得到具有編碼其抗體之蛋白質之胺基酸的基因序列之核酸分子，亦可使用如此的核酸分子而基因工程性地製作抗體。又，使用H鏈、L鏈、該等之可變區域或CDR序列等之基因資訊來進行用以提高抗體之結合性或特異性之改變等，或藉由自小鼠等動物之抗體改變為人類型抗體，來製作適合用於治療劑之構造的抗體，為該領域之所屬技術領域中具有通常知識者充分已知的技術。又，亦可藉由使用經導入人類抗體基因之基因轉殖動物作為使抗原進行敏化之動物，來取得人類之單株抗體。於其以外，作為不以對動物敏化為必要之方法，亦使用表現人類抗體之抗原結合區域或其一部分的噬菌體基因庫(人類抗體噬菌體展現)，取得由與對應抗原特異性結合的抗體或特定之胺基酸序列所構成的噬菌體殖株，由該資訊製作人類抗體的技術亦為所屬技術領域中具有通常知識者可適當進行(例如參照Keio J. Med., (2011), 60：37-46之review等)。又，設計對人類以外之動物投予之抗體時，與人類化之技術同樣地，所屬技術領域中具有通常知識者可適當使用CDR或可變區域之胺基酸序列資訊來進行設計。
抗體之特異性，係指抗體對某抗原顯示高的抗原抗體反應。抗原抗體反應之測定，可由所屬技術領域中具有通常知識者適當選擇於固相或液相系統的結合測定來進行。如此的方法，可列舉酵素結合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay：ELISA)、酵素免疫測定法(enzyme immunoassay：EIA)、表面電漿子共振法(surface plasmon resonance：SPR)、螢光共振能量轉移法(fluorescence resonance energy transfer：FRET)、發光共振能量轉移法(luminescence resonance energy transfer：LRET)等，但不限定於該等。又，測定如此的抗原抗體結合時，亦可將抗體及/或抗原以酵素、螢光物質、發光物質、放射性同位素等進行標識，並使用適於該經標識物質之物理及/或化學特性的測定方法檢測抗原抗體反應。 [IL-36R之訊息與IL-36R訊息阻礙抗體之篩選方法]
IL-36係與IL-36R及IL-1RAcP形成IL-36R複合體，進行由TIR結構域所媒介的訊息傳導。MyD88所關聯的該訊息，係針對TLR(Toll  Like Receptor)或IL-1R(Interleukin-1 Receptor)之訊息而有詳細研究，可由NFkB之磷酸化或由IL-8之啟動子所媒介的報導基因分析來評估。又，藉由IL-36之訊息而使細胞活化的結果，亦可藉由評估表現上昇之mRNA或所產生的蛋白質本身來進行評估。本發明中為了使著眼於訊息阻礙之抗體的篩選成為現實，係基於公知資訊，新構築使用了NFkB報導基因之分析系統，藉由該評估系統檢測IL-36R中和抗體及IL-36R訊息特異性阻礙抗體。如實施例6所示，本發明者等人，藉由利用結合分析(binding assay)之篩選及基於前述IL-36α之訊息的報導基因分析(reporter gene assay)，擷取阻礙IL-36α之111種抗體產生融合瘤。對於此等111種抗體產生融合瘤評估IL-36β及IL-36γ之阻礙活性後，IL-36α之訊息阻礙與IL-36γ之訊息阻礙顯示幾乎1：1之關係，亦即相同程度之阻礙，但得到複數種之阻礙IL-36α而另一方面不阻礙IL-36β之抗體。將此等抗體之融合瘤藉由極限稀釋法單一化(單一殖株化)後，純化而得到的抗體，係幾乎完全阻礙IL-36α與IL-36γ之訊息，但就IL-36β訊息而言，係作為部分拮抗劑而作用。由利用對IL-36R之結合的篩選及基於IL-36α之訊息的報導基因分析之相關解析，判斷以基於IL-36α及IL-36β之訊息的報導基因分析來篩選為最佳，再度篩選抗體後，得到相對於IL-36α之阻礙而言，不阻礙IL-36β，且幾乎完全阻礙IL-36α與IL-36γ之訊息的抗體。
後述實施例6及實施例7記載之篩選系統中，無法調整IL-36R中和抗體之濃度，此外以1點評估係偏差為大，故於篩選系統中將訊息減少40%以上的情況定義為「有阻礙活性」。於無法檢測阻礙之個案中，特別係有偏差變大的傾向，因此於訊息上限未設定閾值。使用了融合瘤之培養上清液的篩選係以終濃度150ng/mL之配位體濃度來進行，但於評估經純化之抗體的阻礙強度之試驗中係由動態範圍(dynamic range)或偏差等，於各試驗中對每個配位體設定適切之濃度來實施。如後述實施例6及實施例7所記載，本發明之抗體，係與前述各專利文獻及各非專利文獻記載的以往之抗IL-36R抗體不同地，係會阻礙IL-36α及IL-36γ但不阻礙IL-36β，或其阻礙強度相對地弱的抗體。後述實施例13、14及17中，係使用經純化之重組抗體確認50%阻礙濃度(IC50 )。
不僅IL-36，於複數種配位體所結合的介白素受體之抗體中，僅不阻礙特定配位體所致訊息之抗體，係本案首次報告者。參照本案之手法時，可藉由篩選，來檢測出僅不阻礙IL-36α之抗體或僅阻礙IL-36γ之抗體。
以往之抗IL-36R中和抗體的MAB92 (Spesolimab)，於以重症度高的膿皰性乾癬(全身型)之患者為對象的臨床試驗中，無關於IL-36Ra之缺損，以1次投予即顯示治療效果(非專利文獻26)。一般而言係認為膿皰性乾癬(全身型)係與尋常性乾癬(psoriasis vulgaris)不同的疾病，但對於不相當於IL-36Ra缺損患者之膿皰性乾癬(全身型)之患者，抗IL-36R中和抗體亦顯示治療效果，由有報告IL-17或IL-23之類的乾癬關聯的細胞激素之變動，或者進而由以下介紹的非專利文獻來看，據認抗IL-36R抗體係有效於與乾癬關聯的疾病。暗示了抗IL-36R中和抗體，不僅膿皰性乾癬(全身型)，於尋常性乾癬亦發揮效果的可能性。此處，於IL-36配位體別來觀察對乾癬的貢獻時，有報告IL-36γ係與乾癬之主要評估項目PASI分數有相關(J. Invest. Dermatol., (2015), 135[4]：1025-32)，據認乾癬之約3成會發病的乾癬性關節炎中，有報告IL-36α之上昇(非專利文獻28)，可說IL-36α與γ的阻礙係極為重要。另一方面，IL-36β在以乾癬為首的自體免疫疾病中，發揮何種程度的貢獻則尚不知道。IL-36β相較於皮膚等組織中濃度而言，血中濃度相對地高，有報告其在IL-36之中作用強度或結合係最強，特別是產生抗菌胜肽的能力高(非專利文獻4)。因此，阻礙IL-36之全部配位體的訊息一事，於以感染症為首的宿主防禦所起因之副作用、進而病毒或細菌之感染使病態更加惡化的疾病中，有無法得到所期待效果的可能性。與IL-36屬相同IL-1家族之IL-18，有報告係藉由葡萄球菌之酵素而活化，因此即使IL-36特別是於與外部鄰接之腸內環境或掌蹠等恆常地活化，而對生體防禦作出貢獻，亦不會不可思議。但是，關於IL-36之生體防禦尚不太清楚。
綜上所述，本發明之IL-36R拮抗劑，具體而言，IL-36R訊息特異性阻礙抗體，具有成為IL-36R訊息所關聯的各種疾病之治療藥或預防藥之可能性，且具有克服藉由全部阻礙IL-36R訊息所產生之感染症等副作用及起因於其之疾病的病態惡化，得到穩定之治療效果的可能性。
IL-36之重要性，係藉著作為使重症度高的膿皰性乾癬(全身型)發病之家族性基因變異，而報告了IL-36Ra之功能缺損患者變異而被認識(非專利文獻23)。該功能缺損型之IL-36Ra，相較於正常IL-36Ra而言，IL-36R訊息之IC50 約大10倍，故臨床上，認為IC50 小於10×10-8 M為具有意義的訊息阻礙，抗體之有用性係以IC50 為基準來判斷。因此，本發明中，不阻礙IL-36β之抗體，意指IL-36β所致訊息之50%阻礙濃度(IC50 )為10×10-8 M以上之抗體，IL-36R訊息特異性阻礙抗體，意指IL-36α及IL-36γ所致訊息之50%阻礙濃度(IC50 )為10×10-8 M以下，且不阻礙IL-36β所致訊息之抗體，或IL-36β所致訊息之阻礙活性為IL-36α及IL-36γ所致訊息之阻礙活性以下(較佳為IL-36β之訊息之IC50 為IL-36α及IL-36γ之訊息之IC50 之10倍以上)的抗體。進一步地，本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體，較佳為阻礙50%以上、其中尤為60%以上、進而為70%以上的人類IL-36R致效劑配位體IL-36α及γ之訊息，並且僅阻礙未達50%、其中尤為40%以下、進而為30%以下的人類IL-36R致效劑配位體IL-36β之訊息。如後述實施例13所示，本發明者等所取得的源自融合瘤之抗體及重組抗體(重組抗體)，係阻礙IL-36α及IL-36γ所致訊息，且不阻礙IL-36β所致訊息。進一步地，如後述實施例14所示，即使降低配位體之濃度或提高抗體濃度，亦不會阻礙IL-36β。該抗體即使於相當於抗IL-4受體抗體或抗IL-17受體抗體之谷值(trough value)的抗體濃度，亦不會阻礙IL-36β，具備不顯示濃度依存性阻礙之特性。
如以上所說明，於後述實施例中取得的抗體，為基於IL-36α、IL-36β、IL-36γ之訊息阻礙強度所選出之抗體，其係首次顯示可對IL-36R進行選擇性的訊息阻礙之抗體，並且係首次顯示不阻礙IL-36β之抗體。
惟，本發明之抗體，不限定於後述實施例中所取得的特定抗體。所屬技術領域中具有通常知識者，可藉由適當參照習知技術，同時使用本說明書中詳細記載的各種資訊或技法，不需過度地嘗試錯誤，即可取得與實施例中所取得之抗體的胺基酸序列或抗原決定位不同的新穎之IL-36R訊息特異性阻礙抗體。例如，藉由使用比較本說明書中詳細記載的IL-36α、IL-36β及IL-36γ之訊息阻礙強度的篩選法，可取得別的IL-36R訊息特異性阻礙抗體。又，藉由參照後述關於抗原決定位之資訊，可有效率地取得IL-36R訊息特異性阻礙抗體。又，藉由以後述以往公知之方法檢測與如此方式般實際上得到的抗體競爭之抗體，亦可進一步取得別的IL-36R訊息特異性阻礙抗體。進一步言之，亦可參考本說明書記載的資訊進行免疫，取得具有相同功能之抗體。如此方式般得到之抗體，只要相當於本發明之抗體的定義，則亦包含於本發明之抗體中。 [抗原決定位]
意外地，專利文獻記載之習知技術中，IL-36R之拮抗劑抗體之結合部位毫無被掌握。其一非專利文獻(MAbs., (2017), 9[7]：1143-54)中，作為開發候選物係報告了MAB92之抗原決定位。但是，該抗體之抗原決定位係藉由重氫取代法評估，依別的非專利文獻(MAbs., (2018), 10[2]：204-9)所載，以該手法掌握抗原決定位係顯示出不明確的可能性。事實上，以該手法而作為MAB92之抗原決定位而被掌握到的區域，由抗體之Fab及CDR所形成的結合面之大小來看，作為抗原決定位而發揮功能，在物理上係被認為不可能的區域。因而，雖有複數個抗體作為IL-36R拮抗劑被報告，但例如習知技術之拮抗劑抗體係阻礙IL-36R與IL-36R致效劑配位體之結合，還是阻礙IL-36R與IL-1RAcP之複合體形成，其係不明。
因而，本發明者等人，於後述實施例9中評估抗體對IL-36R之結合，確認到本發明所發現的IL-36R訊息特異性阻礙抗體會結合於人類之IL-36R，但不結合於小鼠之IL-36R(小鼠IL-36R之數據未示)。進而於後述實施例10中，掌握到訊息特異性的阻礙所必要之細胞外結構域。IL-36R之細胞外結構域係有316個殘基，由3個類Ig(Ig-like)結構域所構成。就IL-36R之結構域之定義而言，由於文獻所報告的構造為推定構造，故有各種說法，但本說明書中只要無特別指明，係遵照圖4所示之序列比對，將序列編號11(Pro001391)中之胺基酸編號1~100定為結構域I、胺基酸編號101~198定為結構域II、胺基酸編號199~316定為結構域III。針對各結構域，設計選擇並組合源自人類之結構域或源自小鼠之結構域而得的6種嵌合體受體，對細胞導入基因而評估結合。
後述實施例11中，製作在實施例10所決定之抗體之抗原決定位當中，將結構域I之全部及結構域II之一部分之胺基酸序列取代為小鼠型之受體。關於抗體之抗原決定位進行結晶構造解析之結果，被報告作為連續的胺基酸序列之抗原決定位，係由5個殘基至8個殘基最多(J. Immunol., (2013), 191[3]：1428-35)。因而，係設計自N末端數起第1號之胺基酸起各8個殘基將人類之序列取代為小鼠之序列的受體，及自第5號之胺基酸起各8個殘基將人類之序列取代為小鼠而得之受體，以可辨識5個殘基至8個殘基之抗原決定位的方式進行探討。具體而言，使該受體於細胞暫時性表現(transient expression)，掌握出IL-36R訊息特異性阻礙抗體之抗原決定位。其結果，如後述實施例11所示，得知本發明所提供的IL-36R訊息特異性阻礙抗體，為結合於IL-36R之結構域I的抗體。又，將結構域I中之3個區域，具體而言係由N末端之6個胺基酸殘基所成的區域(以下稱「RI-1」)、由結構域I之第25號至第32號之8個胺基酸殘基所成的區域(以下「RI-2」)，及由結構域I之第81號至第88號之8個胺基酸殘基所成的區域(以下「RI-3」)，分別與小鼠之序列進行置換後，本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體即失去對IL-36R之結合活性。因而，將此等之胺基酸殘基推定為作為抗體之抗原決定位而言為重要，藉由製作將此等殘基各自取代為丙胺酸之受體，進一步掌握出抗原決定位。於評估此等受體之實施例12中，得知第4號的離胺酸(Lys或K)與第28號的異白胺酸(Ile或I)特別重要。
IL-36R自發現當初起，係依基因序列之同源性而分類為IL-1家族，由於具備TIR結構域作為細胞內結構域，故認為訊息傳導中，與IL-1同樣地係以IL-1RAcP為必須。屬於IL-1家族的受體當中，報告了IL-1R1、IL-1R2、IL-18R及IL-33R之結晶構造，此等受體雖胺基酸序列非完全一致，但與其無關地具備3個細胞外結構域，具有同樣的構造，進而與配位體、IL-1RAcP一起形成複合體(非專利文獻10)。因此，IL-36R之結晶構造雖尚未被報告，但認為具有與屬於IL-1受體家族之受體具有同樣之構造性特徵，以使其結晶構造為模板之同源性模擬(homology modeling)為首，於複數個文獻中被報告了推定構造(MAbs., (2017), 9[7]：1143-54； J. Immunol., (2014), 193[2]：921-30； J. Biol. Chem., (2016), 291[32]：16597-609； Sci. Rep., (2019), 9[1]：9089)。
參考此等構造時，可知本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體之抗原決定位即序列編號11(Pro001391)之自第1號之胺基酸數起第4號的Lys與第28號的Ile，即使遠離IL-36配位體之結合部位，亦藉由使抗體結合於該區域而阻礙IL-36α及IL-36γ之訊息。為何IL-36β之訊息未被阻礙雖未明確，但可認為係以下原因的可能性高：藉由使配位體直接結合的可能性高的N末端區域(區域RI-1)、位於與區域RI-1構造上接近之場所的第28號的Ile為首之環狀域區域(區域RI-2)，及第81~88號的環狀域區域(區域RI-3)分別與抗體進行相互作用，而產生了阻礙IL-36α及IL-36γ所致訊息的同時，不阻礙IL-36β所致訊息之訊息特異性阻礙活性。
如以上所說明，本發明者等人首次掌握到IL-36R訊息特異性阻礙抗體之抗原決定位。藉由將該抗原決定位之資訊使用於篩選，所屬技術領域中具有通常知識者，可得到抗IL-36R之結構域I之抗體，或抗區域RI-1~RI-3及其周邊之抗體，進而不需過度地嘗試錯誤，即可有效率地取得本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體。 [IL-36R訊息特異性阻礙抗體]
作為本發明之對象的IL-36R訊息特異性阻礙抗體(本說明書中適當稱為「本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體」或「本發明之抗體」)，為具有特異性結合於人類之IL-36R，並且在3種人類IL-36R致效劑配位體IL-36α、β及γ當中，不阻礙至少1種配位體(較佳為IL-36β)之訊息，或該配位體之訊息的阻礙，較其他至少1種配位體(較佳為IL-36α及/或γ、更佳為IL-36α及γ兩方)之訊息的阻礙更弱之性質(將該性質適當稱為「IL-36R訊息特異性阻礙活性」)的抗體。此處，對IL-36R致效劑配位體所致之IL-36R之訊息(IL-36R致效劑訊息)的阻礙相對地「弱」之概念，係藉由IL-36R致效劑訊息之50%阻礙濃度(IC50 )顯示更大之數值而被說明。具體而言，某個抗體阻礙IL-36α及γ所致訊息並且不阻礙IL-36β所致訊息，或其阻礙為弱，係指將該抗體由後述實施例13所規定之試驗條件進行評估時，對IL-36β之訊息的IC50 ，大於對IL-36α及γ之訊息的IC50 ，較佳為對IL-36β之訊息的IC50 ，為對IL-36α及γ之訊息的IC50 之10倍以上。更佳為，對本發明之抗體所致之IL-36β之訊息的IC50 大於100nM、更期望大於1μM。另一方面，對本發明之抗體所致之IL-36α及IL-36γ之訊息的IC50 ，較期望小於100nM、進而小於10nM、再進而小於1nM。
又，本發明之抗體對IL-36R之結合強度並無特殊限定，於使用了IL-36R表現細胞之Cell-based ELISA中所測定之對IL-36R之50%效果濃度(EC50 )，通常為1×10-7 M以下或1×10-8 M以下為佳。再者，本說明書中抗體之「50%效果濃度」(EC50 )，意指顯示該抗體結合於抗原之最大結合親和性之50%的結合親和性的抗體濃度。以使用了IL-36R表現細胞之Cell-based ELISA之EC50 之具體的測定條件，可列舉後述實施例所採用之條件。
本發明之抗體，只要具備前述IL-36R訊息特異性阻礙活性，其胺基酸序列並無特殊限定。惟，本發明之抗體，較佳具有特定之胺基酸序列作為各CDR序列。具體而言如以下所述。再者，本說明書中，胺基酸序列之「同一性」(identity)，意指一致之胺基酸殘基的比例，「相似性」(similarity)，意指一致或類似之胺基酸殘基的比例。胺基酸序列之相似性及同一性，例如可藉由BLAST法(NCBI之PBLAST之預設條件)決定。又，例如表述為「80%以上之相似性」時，明顯可知其包含「80%以上之同一性」的情況。
此處「類似之胺基酸殘基」，意指具有具備同樣之化學特質(例如電荷或疏水性)之側鏈的胺基酸殘基。類似之胺基酸殘基，例如可列舉以下之組合。
(1)具有脂肪族側鏈之胺基酸殘基：甘胺酸(Gly或G)、丙胺酸(Ala或A)、纈胺酸(Val或V)、白胺酸(Leu或L)，及異白胺酸(Ile或I)殘基。 (2)具有脂肪族羥基側鏈之胺基酸殘基：絲胺酸(Ser或S)及蘇胺酸(Thr或T)殘基。 (3)具有含醯胺側鏈之胺基酸殘基：天門冬醯胺(Asn或N)及麩醯胺(Gln或Q)殘基。 (4)具有芳香族側鏈之胺基酸殘基：苯丙胺酸(Phe或F)、酪胺酸(Tyr或Y)，及色胺酸(Trp或W)殘基。 (5)具有鹼性側鏈之胺基酸殘基：離胺酸(Lys或K)、精胺酸(Arg或R)及組胺酸(His或H)殘基。 (6)具有酸性側鏈之胺基酸殘基：天門冬胺酸(Asp或D)及麩胺酸(Glu或E)殘基。 (7)具有含硫側鏈之胺基酸殘基：半胱胺酸(Cys或C)，及甲硫胺酸(Met或M)殘基。 進一步地，(1)與甲硫胺酸(Met或M)之組合，及(4)與組胺酸(His或H)殘基之組合，亦視為類似之胺基酸殘基。
又，參考生殖細胞系(Germline)之序列，存在該當之變異體時，有可無關類似性地進行取代的情況。參考生殖細胞系之變異體係包含取代、缺失或附加。關於取代，包含亦可取代為脯胺酸(Pro或P)或甘胺酸(Gly或G)之類的推定會對側鏈之方向造成影響的胺基酸的情況。
本發明之抗體之一個態樣，可列舉包含具有以下(1)~(3)之CDR-H1~H3序列的重鏈可變區域之抗體。
(1)包含作為CDR-H1序列的 (1a)序列編號23或25(XH001或XH002)之胺基酸序列(較佳為序列編號23(XH001)之胺基酸序列)、 (1b)與前述(1a)之胺基酸序列具有至少80%以上之相似性(較佳為同一性)之胺基酸序列，或 (1c)前述(1a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
(2)包含作為CDR-H2序列的 (2a)由序列編號27、29、31及213(XH003~XH005及XH007)中選擇的任1者之胺基酸序列(較佳為序列編號27(XH003)之胺基酸序列)、 (2b)與前述(2a)之胺基酸序列具有至少88%以上之相似性(較佳為同一性)之胺基酸序列，或 (2c)前述(2a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
(3)包含作為CDR-H3序列的 (3a)由序列編號33、215及217(XH006、XH008及XH009)中選擇的任1者之胺基酸序列(較佳為序列編號33之胺基酸序列)、 (3b)與前述(3a)之胺基酸序列具有至少83%以上之相似性(較佳為同一性)之胺基酸序列，或 (3c)前述(3a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
本發明之抗體之一個態樣，可列舉包含具有以下(1)~(3)之CDR-L1~L3序列的輕鏈可變區域之抗體。
(1)包含作為CDR-L1序列的 (1a)由序列編號35、37及219(XL001、XL002及XL006)中選擇的任1者之胺基酸序列(較佳為序列編號35(XL001)之胺基酸序列)、 (1b)與前述(1a)之胺基酸序列具有至少84%以上之相似性(較佳為同一性)之胺基酸序列，或 (1c)前述(1a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
(2)包含作為CDR-L2序列的 (2a)由序列編號39、41及221(XL003、XL004及XL007)中選擇的任1者之胺基酸序列(較佳為序列編號39(XL004)之胺基酸序列)、 (2b)與前述(2a)之胺基酸序列具有至少85%以上之相似性(較佳為同一性)之胺基酸序列，或 (2c)前述(2a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
(3)包含作為CDR-L3序列的 (3a)由序列編號43、223及225(XL005、XL008及XL009)中選擇的任1者之胺基酸序列(較佳為序列編號43之胺基酸序列)、 (3b)與前述(3a)之胺基酸序列具有至少88%以上之相似性(較佳為同一性)之胺基酸序列，或 (3c)前述(3a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
本發明之抗體之一個態樣，可列舉分別組合具有前述任一個CDR-H1~H3序列之重鏈可變區域，與具有前述任一個CDR-L1~L3序列之輕鏈可變區域而得的抗體。
本發明之抗體之一個態樣，可列舉具有以下(a)~(c)之任一者作為重鏈可變區域之序列的抗體。
(a)由序列編號45(Pro000713v)、序列編號47(Pro000722v)、序列編號49(Pro001558v)、序列編號51(Pro001562v)、序列編號53(Pro001554v)、序列編號55(Pro001566v)、序列編號57(Pro001570v)、序列編號59(Pro001574v)、序列編號177(Pro002817v)、序列編號181(Pro002818v)，及序列編號185(Pro002819v)中選擇的任1者之胺基酸序列(較佳為序列編號45(Pro000713v)之胺基酸序列)。
(b)與前述(a)之胺基酸序列具有至少80%以上(較佳為85%以上，或90%以上，或95%以上，或96%以上，或97%以上，或98%以上，或99%以上)之相似性(較佳為同一性)的胺基酸序列。
(c)前述(a)之胺基酸序列中1~12(較佳為1~11、更佳為1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2或1)個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
本發明之抗體之一個態樣，可列舉具有以下(a)~(c)之任一者作為輕鏈可變區域之序列的抗體。
(a)由序列編號61(Pro000714v)、序列編號63(Pro001332v)、序列編號65(Pro001333v)、序列編號67(Pro001334v)、序列編號179(Pro002821v)、序列編號183(Pro002823v)，及序列編號187(Pro002822v)中選擇的任1者之胺基酸序列(較佳為序列編號61(Pro000714v)之胺基酸序列)。
(b)與前述(a)之胺基酸序列具有至少80%以上(較佳為85%以上，或90%以上，或95%以上，或96%以上，或97%以上，或98%以上，或99%以上)之相似性(較佳為同一性)之胺基酸序列。
(c)前述(a)之胺基酸序列中1~10(較佳為1~9、更佳為1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2或1)個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
本發明之抗體之一個態樣，可列舉分別組合前述任一個重鏈可變區域與前述任一個輕鏈可變區域而得的抗體。
再者，鑑定抗體中之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2，或CDR-L3之各序列的方法，例如可列舉Kabat法(NIH Publication, (1991),No. 91-3242)或Chothia法(J. Mol. Biol., (1997), 273[4]：927-48)。此等方法對於該所屬技術領域中具有通常知識者而言為技術常識，例如亦可由Dr. Andrew C.R. Martin‘s Group之網際網路首頁 (http：//www.bioinf.org.uk/abs/)得知概要。再者，本發明中之CDR係作為Kabat之CDR而記載。
本發明之抗體之免疫球蛋白的重鏈可變區域及輕鏈可變區域之各框架序列，較佳為脊椎動物的免疫球蛋白之各類型中之框架序列。特佳為人類或包含小鼠或大鼠之非人類動物的免疫球蛋白之各類型中之框架序列。
藉由對以上之重鏈及輕鏈的各CDR及/或各鏈可變區域之胺基酸序列，適當組合人類或包含小鼠或大鼠之非人類動物之抗體之重鏈及輕鏈的各框架區域及/或各恆定區域之胺基酸序列，所屬技術領域中具有通常知識者可設計本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體。特別是藉由使用人類抗體之重鏈及輕鏈的各框架區域及/或各恆定區域之胺基酸序列，可成為人類化IL-36R訊息特異性阻礙抗體。人類化抗體之重鏈及輕鏈的各框架區域及/或各恆定區域之胺基酸序列，例如可由人類之IgG、IgA、IgM、IgE、IgD之各類型或其變異體中選擇。
再者，作為參考，將大鼠抗體之例子的117(試驗例1、C_00028)之重鏈恆定區域之胺基酸序列示於序列編號159、將編碼其之基因的鹼基序列示於序列編號160。又，將一般的人類IgG1抗體之重鏈恆定區域示於序列編號161、將編碼其之基因的鹼基序列示於序列編號162。又，將先前技術文獻記載的人類化抗體之例子B3，及將試驗例1之抗體的恆定區域取代為人類型之大鼠/人類嵌合體抗體之例子117hG1Dk之重鏈恆定區域示於序列編號163、將編碼其之基因的鹼基序列示於序列編號164。又，將先前技術文獻記載的人類化抗體之例子APE6060，及將試驗例1之抗體的恆定區域取代為人類型之大鼠/人類嵌合體抗體之例子117hG4k之重鏈恆定區域示於序列編號165、將編碼其之基因的鹼基序列示於序列編號166。又，將大鼠抗體之例子117之輕鏈恆定區域之胺基酸序列示於序列編號167、將編碼其之基因的鹼基序列示於序列編號168。又，將嵌合體抗體117hG1Dk及117hG4k，以及人類化抗體之例子B3，及APE6060之人類輕鏈恆定區域之胺基酸序列示於序列編號169、將編碼其之基因的鹼基序列示於序列編號170。
本發明之抗體，較佳為IgG類型或其變異體，更佳為人類IgG類型或其變異體、人類IgG4次類型或其變異體，或人類IgG1次類型或該等之變異體。於1個例子中，經穩定化之IgG4恆定區域，依Kabat系統，係於絞鏈區域之位置241含有脯胺酸。該位置依照EU編號方式(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1969), 63[1]：78-85)、有關免疫學的蛋白質序列(Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001及NIH Publication, (1991), No. 91-3242)，係對應於絞鏈區域之位置228。人類IgG4中，該殘基一般而言為絲胺酸，可藉由將絲胺酸取代為脯胺酸取代來誘導穩定化。於1個例子中，可於IgG1之恆定區域中導入N297A變異，而盡可能抑制對Fc受體之結合及/或固定補體的能力。 [競爭結合]
本發明之一態樣，可列舉對本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體競爭結合之抗體。該競爭結合之抗體亦包含於本發明之範圍中。本發明中「競爭結合」意指複數種之單株抗體與抗原共存時，一方之抗體對抗原的結合，被另一方之抗體對抗原的結合所阻礙之現象。一般而言，可藉由在對於一定量(濃度)之單株抗體，改變別的單株抗體之量(濃度)來進行添加時，測定使前者之一定量之單株抗體對抗原的結合量降低之添加量(濃度)來進行測定。其阻礙的程度，能夠以IC50 或Ki之值表示。與本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體競爭結合之單株抗體，係指使用10nM之本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體來檢測抗原抗體結合時，IC50 通常為1000nM以下、其中尤其是100nM以下、進而為10nM以下的抗體。進行競爭結合之測定時，能夠藉由將所使用之抗體以酵素、螢光物質、發光物質、放射性同位素等進行標識，並使用適於該經標識物質之物理及/或化學特性的測定方法進行檢測來進行其測定，亦可使用以表面電漿子共振法(Surface Plasmon Resonance：SPR)或生物膜干涉法(Bio-Layer Interferometry：BLI)為首的生物感測器(biosenser)。 [IL-36R訊息特異性阻礙抗體之製造方法]
本發明中之抗體，可使用所屬技術領域中具有通常知識者週知之技法得到。本發明中之抗體，係多株抗體或單株抗體(Nature, (1983), 305(5934)： 537-40)。例如，多株抗體，可藉由以具有序列編號11(Pro001391)表示之胺基酸序列的IL-36R蛋白質，或具有其一部分之胺基酸序列的IL-36R部分胜肽(例如包含由胺基酸殘基1~100部位成之結構域I的胜肽，或包含由前述結構域I之N末端側6個殘基所成的RI-1區域、由第25~32號之胺基酸8個殘基所成的RI-2區域，及/或由結構域I之第81~88號之胺基酸8個殘基所成的RI-3區域之胺基酸序列的胜肽等)為抗原，或使用包含編碼附訊息胜肽之IL-36R蛋白質之胺基酸序列(序列編號13：Q9HB29|ILRL2_HUMAN)之IL-36R之基因序列(序列編號14)，或編碼其部分胜肽之抗原表現多核苷酸等，對哺乳動物之肌肉內或皮下投予，於動物體內使抗原表現來將動物敏化，而由該動物之血清等回收。又，使用胜肽作為抗原時，能夠使用結合於BSA或KLH等之攜載蛋白質或聚離胺酸等的形態之抗原。
該發明中之單株抗體，可藉由將具有序列編號11(Pro001391)表示之胺基酸序列的IL-36R之核苷酸對哺乳動物投予，於該動物體內使抗原產生，並由以所產生之抗原進行敏化的該動物中取出免疫細胞，與骨髓瘤細胞等進行細胞融合，並選殖所得之融合瘤，由其培養物中回收。如此的單株抗體之取得方法(Nature, (1992), 356[6365]：152-4；專利文獻4)或細胞融合的手法(Nature, (1975), 256[5517]：495-7)已被報告而一般化，可藉由免疫賦活物質的投予進一步提高取得效率(Cancer Gene Ther., (2007), 14[11]：904-17)。藉此所得之單株抗體，可列舉具有具備序列編號45(Pro000713v)表示之重鏈可變序列(重鏈可變區域)的重鏈，及具備序列編號61 (Pro000714v)表示之輕鏈可變序列(輕鏈可變區域)的輕鏈之單株抗體，但不限定於該等。
所得之單株抗體，亦可得到具有編碼構成該抗體之重鏈及輕鏈等蛋白質之胺基酸序列的基因序列之核酸分子。如此的基因序列的取得方法之一例，雖不被限定但可列舉後述實施例記載之方法，藉此所得之單株抗體，雖不被限定但可列舉由具有序列編號77之胺基酸序列的重鏈，及具有序列編號79之胺基酸序列的輕鏈所構成之抗體(C_00028；CL_00071)。
亦可使用編碼構成如此的抗體之重鏈及輕鏈等之蛋白質之胺基酸的核酸分子，來基因工程性地製作抗體。作為該抗體之基因資訊，使用H鏈及L鏈，或該等之可變區域或CDR等之序列資訊，進行用以提高抗體之結合性或特異性之改變等，或者藉由自小鼠等動物之抗體改變為人類型抗體，來製作適於治療劑所用之構造的抗體，為該所屬技術領域中具有通常知識者週知之技術。又，亦可藉由使用經導入人類抗體基因之非人類-基因轉殖動物作為使抗原敏化的動物，而取得人類型之單株抗體。於其以外，使用表現人類抗體之可變區域或其一部分之噬菌體基因庫(人類抗體噬菌體展現)，作為不以對動物之敏化為必要之方法，取得由與對應抗原特異性結合的抗體或特定之胺基酸序列所成之噬菌體殖株，並由該資訊製作人類抗體的技術，亦為所屬技術領域中具有通常知識者可適當進行(例如參照Keio J. Med., (2011), 60：37-46之review等)。
又，作為製造前述單株抗體之方法，可分別培養產生所欲取得之抗體的融合瘤，由所得之培養上清液藉由常規方法將抗體純化而取得。又，作為別的製造方法，亦可由產生所欲取得之抗體的融合瘤或以人類抗體噬菌體展現而得到的噬菌體殖株等中，取得編碼抗體之基因、更詳細而言為編碼免疫球蛋白之重鏈及/或輕鏈之基因，並製作用以表現該基因之載體，導入於宿主細胞(哺乳類細胞、昆蟲細胞、微生物等)，而產生該抗體。此時，對於編碼免疫球蛋白之重鏈及/或輕鏈之基因，實施用以導入所期望性質之基因改變、使用免疫球蛋白之重鏈及/或輕鏈之可變區域或CDR區域之構造資訊來製作人類型化抗體、抗體嵌合體蛋白質、低分子抗體或支架抗體，乃是所屬技術領域中具有通常知識者可藉由使用公知技術而實施。又，以抗體之性能提高或副作用之避免為目的，來對抗體之恆定區域的構造導入改變，或進行於糖鏈部分之改變，亦可藉由所屬技術領域中具有通常知識者週知之技術適當進行。
本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體，可使用所屬技術領域中具有通常知識者週知之技法而得到。具體而言，本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體，通常為單株抗體(Nature, (1975), 256[5517]：495-7)，該單株抗體例如可藉由以下手法製作。
例如，係製作編碼本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體的免疫球蛋白之重鏈及/或輕鏈之胺基酸序列的核酸分子。此處，亦可藉由將該核酸分子導入於各種載體或質體，來製作包含該核酸分子之載體或質體。接著，以前述之核酸分子、載體或質體對宿主細胞轉形。宿主細胞例如可列舉哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞，或植物細胞等之真核細胞，或細菌細胞。接著，將該經轉形之宿主細胞，在用以產生本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體的適切條件下培養。此處，亦可依需要，將所得之本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體由宿主細胞單離。用於此等順序之各種手法，均為所屬技術領域中具有通常知識者所週知。
又，作為使用對動物之敏化的方法，可使用經導入人類抗體基因之非人類-基因轉殖動物作為將抗原敏化之動物，使IL-36R及/或其部分胜肽等進行敏化，取出免疫細胞與骨髓瘤細胞等進行細胞融合，將藉此所得之融合瘤進行選殖，由所得之培養上清液藉由常規方法純化抗體並回收藉以得到。如此的單株抗體之取得方法，例如記載於專利文獻4。
其以外，亦可使用利用表現所期望之人類化抗體之可變區域或其一部分的噬菌體基因庫(人類抗體噬菌體展現)，取得由與對應抗原特異性結合之抗體或特定之胺基酸序列所構成的噬菌體殖株，並由該資訊製作人類化抗體之技術(例如參照Keio J. Med., (2011), 60：37-46之review等)。
此處，針對編碼免疫球蛋白之重鏈及/或輕鏈之基因，進行用以導入所期望性質之基因改變，或使用免疫球蛋白之重鏈及/或輕鏈的可變區域或CDR區域之構造資訊，藉以製作抗體嵌合體蛋白質、低分子抗體、支架抗體等，為所屬技術領域中具有通常知識者可使用公知技術來實施。又，以抗體之性能提高或副作用之避免為目的，對抗體之恆定區域構造導入改變，或進行於糖鏈之部分的改變，亦為所屬技術領域中具有通常知識者可藉由週知之技術而適當進行。 [含有IL-36R訊息特異性阻礙抗體之藥]
本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體，可利用作為用以治療及/或預防IL-36所關聯的狀態或起因於對IL-36R(IL-36受體)之作用的疾病之醫藥(醫藥組成物。再者，本說明書中，「醫藥」與「醫藥組成物」係以同義來使用)之活性成分。具體而言，IL-36或IL-36R所關聯的狀態或作為以IL-36R訊息特異性阻礙抗體治療或預防之對象的疾病，係有顯示自體免疫疾病之病態的尋常性乾癬、膿皰性乾癬(全身型)、乾癬性紅皮症、乾癬性關節炎、掌蹠膿皰症、潰瘍性大腸炎、克隆氏症、全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、氣喘、異位性皮膚炎、移植排斥反應、全身性僵直症、第1型糖尿病、視神經炎、葡萄膜炎、腦中風、思覺失調症、肌肉萎縮性側索硬化症、皮膚肌炎、僵直性脊椎炎、多發性肌炎、肺纖維化、橋本甲狀腺炎、重症肌無力症、自體免疫性甲狀腺炎、貝塞特氏病(Behcet’s disease)、巴塞多氏病(Basedow’s disease)、硬皮症、視神經炎、多發性硬化症、關節風濕病、修格連氏症候群(Sjögren’s syndrome)、細胞激素釋放症候群。又，可作為癌治療藥而期待之疾病，可列舉神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、小兒癌、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、攝護腺癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、頸部癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、威爾姆斯腫瘤、轉移性類癌及血管活性腸道胜肽分泌腫瘤所關聯的下痢、VIP瘤、瓦-馬二氏症候群(Verner-Morrison syndrome)、貝克威思-威德曼症候群(Beckwith-Wiedemann syndrome)、腎臟癌、腎細胞癌、移行上皮癌、伊文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、白血病、急性淋巴母細胞性白血病、腦腫瘤、神經膠母細胞瘤、非神經膠母細胞瘤性腦腫瘤、腦脊髓膜瘤、腦下垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、未分化神經外胚葉性腫瘤、髓母細胞瘤、星狀細胞瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、腦室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤。
本發明之IL-36R中和抗體(IL-36R訊息特異性阻礙抗體)，較佳使用作為分類為乾癬及乾癬之一個表現型的疾病之治療藥或預防藥。進一步地，本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體，藉由抑制與IL-36α或IL-36γ之上昇有關聯的發炎，並且不抑制IL-36β，在對細菌之抵抗力會促進治療效果的疾病上，例如克隆氏症或異位性皮膚炎般的疾病上可期待優良的效果。又，本抗體相較於PAN抗體而言，具有不易產生帶狀疱疹等之病毒感染所致之副作用，且不易產生皮內贅生物或惡性贅生物之特徵。
本發明中之調節或修飾免疫反應的醫藥，係指免疫調節藥等。免疫調節藥係藉由調節異常之免疫反應，抑制作為引起發炎之要因的體內物質等之產生，而改善症狀。該醫藥具有抑制免疫球蛋白或細胞激素等物質之產生，抑制病態的進行，或緩和其症狀之作用。具體而言，該醫藥係調節被癌、自體免疫疾病、感染症、微生物毒素、發炎劑及過敏反應等所引起的於發炎或過敏性免疫反應之部位的免疫及發炎反應之振幅與持續時間等。過剩的IL-36之生成或IL-36之表現的調節異常，可使疾病狀態發病。因此，IL-36係與各種發炎性及免疫調節性之疾病及症狀相關，IL-36之全身性或局部過剩，係為異常免疫反應之一個原因。阻礙IL-36所致之訊息的醫藥，被期待作為調節免疫反應的物質。
含有本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體的藥，亦可作為於本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體以外，一併含有醫藥上容許之藥物載體及/或其他添加劑的醫藥組成物之形態而製劑化。使用醫藥上容許之藥物載體及/或其他添加劑之製劑，例如可藉由University of the Sciences in Philadelphia, “Remington： The Science and Practice of Pharmacy, 20th EDITION”, Lippincott Williams & Wilkins, (2000)記載之方法實施。如此的治療劑或預防劑之一個形態，係作為藉由於無菌之水性液或油性液中溶解、懸浮或乳化所配製的液劑或冷凍乾燥劑而供給。如此的溶劑或溶解液，就水性液而言可列舉注射用蒸餾水、生理食鹽水等，進一步添加滲透壓調節劑(例如D-葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、氯化鈉等)時，亦有併用適當的溶解輔助劑例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性界面活性劑(例如聚山梨醇酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油50)等的情況。又，作為溶劑或溶解液，亦有使用油性液的情況，該油性液之例子可列舉芝麻油、大豆油等，亦有併用苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等作為溶解輔助劑的情況。如此的製劑中，係有適當使用緩衝劑(例如磷酸鹽類緩衝劑、乙酸鹽類緩衝劑)、無痛化劑(例如氯化苄二甲烴銨(benzalkonium chloride)、普卡因鹽酸鹽(procaine hydrochloride)等)、穩定劑(例如人類血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(例如抗壞血酸、異抗壞血酸及該等之鹽等)、著色劑(例如銅葉綠素、β-胡蘿蔔素、紅色2號、藍色1號等)、防腐劑(例如對羥基苯甲酸酯、酚、氯化苯索寧(benzethonium chloride)、氯化苄二甲烴銨等)、增黏劑(例如羥基丙基纖維素、羧基甲基纖維素及該等之鹽等)、穩定化劑(例如人血清白蛋白、甘露醇、山梨醇等)、矯臭劑(例如薄荷腦、柑橘香料等)之添加劑的情況。
又，作為別的治療劑或預防劑之形態，可列舉散劑、錠劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、栓劑、片劑等固形劑。以經口用製劑之形態投予的固形劑的情況時，作為添加劑可使用賦形劑(例如結晶性纖維素、乳糖、澱粉等)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石等)、結合劑(例如羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙二醇等)、崩解劑(例如澱粉、羧基甲基纖維素鈣等)等。又，可依需要使用防腐劑(例如苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等)、抗氧化劑、著色劑、甘味劑等之添加劑。進一步亦可列舉黏膜適用用治療劑或預防劑作為別的形態，該製劑中亦有以賦予對黏膜之吸附性、滯留性等為主要目的，而含有黏著劑、增黏劑、黏稠劑、增稠劑等(例如黏液素、洋菜、明膠、果膠、鹿角菜膠、海藻酸鈉、刺槐豆膠、三仙膠、黃蓍樹膠、阿拉伯膠、幾丁聚糖、聚三葡萄糖(pullulan)、糯性澱粉、斯克拉非(sucralfate)、纖維素，及該等之衍生物)作為添加劑的情況。但是，對生體供予的治療劑或預防劑之形態及溶劑或添加劑不限定於此等，所屬技術領域中具有通常知識者可適當選擇。
含有本發明之IL-36R中和抗體之藥，於本發明之IL-36R中和抗體以外，亦可含有既有之其他藥物(活性成分)。又，亦可將含有本發明之IL-36R訊息特異性阻礙抗體之藥，與既有之其他藥物組合，而作為套組的形態。與IL-36R訊息特異性阻礙抗體組合的活性成分，可列舉IL-36Ra、IL-38、免疫調節藥或其類似物、免疫抑制劑或其類似物、抗菌藥或其類似物、抗癌劑或其類似物、IL-36R訊息特異性阻礙抗體或其類似物、氮卓斯汀(azelastine)、歐查妥邁(oxatomide)、美喹他嗪(mequitazine)、非索非那定(fexofenadine)、依匹斯汀(epinastine)、依巴斯汀(ebastine)、西替利嗪(cetirizine)、左西替利嗪(levocetirizine)、貝波他汀(bepotastine)、依美斯汀(emedastine)、奧洛他定(olopatadine)、氯雷他定(loratadine)、左卡巴斯汀(levocabastine)、奧扎格雷(ozagrel)、塞拉司特(seratrodast)、雷馬曲班(ramatroban)、普鲁斯特(pranlukast)、蒙特魯卡斯特(montelukast)、扎魯斯特(zafirlukast)、甲磺斯特(suplatast)、苯海拉明(diphenhydramine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、二苯基比拉林(diphenylpyraline)、克雷滿汀(clemastine)、氯菲安明(chlorpheniramine)、屈普利汀(triprolidine)、普美苯噻肼(promethazine)、阿利馬嗪(alimemazine)、苯羥乙嗪(hydroxyzine)、同氯克利定(homochlorcyclizine)、塞浦西他啶(cyproheptadine)、美沙拉嗪(mesalazine)、干擾素貝他1b、干擾素貝他1a、芬格莫德(fingolimod)鹽酸鹽、那他珠單抗(natalizumab)、格拉默(glatiramer)乙酸鹽、富馬酸二甲酯、他克莫司(tacrolimus)、巰基嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、阿普密蘭特(apremilast)、皮質類固醇、止吐藥、昂丹司瓊(ondansetron)鹽酸鹽、格拉司瓊(granisetron)鹽酸鹽、美多普胺(metroclopramide)、多潘立酮(domperidone)、氟哌啶醇(haloperidol)、賽克利嗪(cyclizine)、蘿拉西泮(lorazepam)、普洛陪拉幸(prochlorperazine)、地塞米松(dexamethasone)、左美丙嗪(levomepromazine)、托烷司瓊(tropisetron)、癌疫苗、GM-CSF阻礙藥、GM-CSF、DNA疫苗、基於細胞之疫苗、樹狀細胞疫苗、重組病毒疫苗、熱休克蛋白質(HSP)疫苗、同質性腫瘤疫苗、自體腫瘤疫苗、止痛藥、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、三水楊酸膽鹼鎂、羥可待酮(oxycodone)鹽酸鹽、抗血管新生藥、抗血栓藥、抗PD-1抗體、納武利尤單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、替雷利珠單抗(tislelizumab)、抗PD-L1抗體、阿替利珠單抗(atezolizumab)、阿維單抗(avelumab)、度伐利尤單抗(durvalumab)、抗CTLA4抗體、伊匹木單抗(Ipilimumab)、抗CD20抗體、利妥昔單抗(rituximab)、抗HER2抗體、曲妥珠單抗(trastuzumab)、抗CCR4抗體、莫加木珠單抗(mogamulizumab)、抗VEGF抗體、貝伐珠單抗(bevacizumab)、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體片段、抗TWEAK抗體、抗TWEAK受體抗體、可溶性TWEAK受體片段、AMG 706、AMG 386、抗α4β7抗體、貝伐珠單抗(bevacizumab)、維多珠單抗(etrolizumab)、抗SIRPα抗體、抗CD40抗體、抗CD40L抗體、抗增殖藥、法尼基(farnesyl)蛋白質轉移酶阻礙藥、αvβ3阻礙藥、αvβ5阻礙藥、p53阻礙藥、Kit受體阻礙藥、ret受體阻礙藥、PDGFR阻礙藥、生長激素分泌阻礙藥、血管生長素(angiopoietin)阻礙藥、腫瘤浸潤巨噬細胞阻礙藥、c-fms阻礙藥、抗c-fms抗體、CSF-1阻礙藥、抗CSF-1抗體、可溶性c-fms片段、培維索蒙(pegvisomant)、吉西他濱(gemcitabine)、帕尼單抗(panitumumab)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、依曲替酯(etretinate)、磷酸二酯酶4阻礙劑、TNFα阻礙劑、IL-17A阻礙劑、IL-17F阻礙劑、IL-17RA阻礙劑、IL-23p19阻礙劑、IL-23p40阻礙劑及IL-1RAcP阻礙劑、SN-38。所摻合之IL-36R訊息特異性阻礙抗體以外的藥物之用量，能夠以通常之治療所用的用量來進行，但亦可依狀況增減。
本發明中之治療劑或預防劑，能夠以症狀改善為目的而非經口地投予。非經口投予的情況時，例如可為經鼻劑，可選擇液劑、懸浮劑、固形製劑等。又，別的非經口投予之形態，可為注射劑，注射劑可選擇皮下注射劑、靜脈注射劑、點滴注射劑、肌肉注射劑、腦室內注射劑或腹腔內注射劑等。又，其他非經口投予所用的製劑，亦可列舉栓劑、舌下劑、經皮劑、經鼻劑以外之經黏膜投予劑等。進一步地，亦能夠以於血管支架(stent)或血管內栓塞劑中含有或塗佈於該等的態樣，對血管內局部投予。亦可依情況以編碼本抗體之DNA或RNA或者產生本抗體之細胞或土著菌的形態投予。
本發明中之治療劑或預防劑之投予量，雖依患者之年齡、性別、體重、症狀、治療效果、投予方法、處理時間，或該醫藥組成物中含有的活性成分之種類等而異，但通常可於成人每1人，將主劑以每1次0.1mg至1g之範圍、較佳為0.5mg至300mg之範圍，1週至4週1次，或1個月至6個月1次來進行投予。但是，投予量及投予次數會依各種條件而變動，因此亦有以少於前述投予量及次數之量及次數即為足夠的情況，又，亦有超過前述範圍之投予量及投予次數為必要的情況。又，本發明中之治療劑或預防劑，藉由減輕副作用，能夠以短的投予期間得到效果或進行長期投予。 [實施例]
以下遵照實施例進一步詳細說明本發明，但此等實施例僅不過是為了說明方便而示出之例子，本發明在任何意義上均不限定於此等實施例。
[實施例1]hIL-36R基因等之配製 編碼人類IL-36R(hIL-36R)(序列編號11：Pro001391)之基因，係基於登錄在NCBI之類IL1RL2介白素1受體2(IL1RL2 interleukin 1 receptor like 2 [Homo sapiens (human)]之mRNA的參考序列NM_003854.4而設計。具體而言，該基因包含編碼hIL-36R之胺基酸序列的序列、其5’末端所配置的EcoRI辨識序列及KOZAK序列，與其3’末端所配置的NotI辨識序列，藉由人工合成而配製(序列編號171：DNA-000224S)。將所合成的基因選殖於pIRESpuro3(Chrontech Cat. No. 631619、序列編號172：vDNA-000011)及pCAG-Neo(和光純藥Cat.No. 163-25601、序列編號173：vDNA-000005)。將此等分別稱為hIL-36R表現質體1(選殖於pIRESpuro3)及hIL-36R表現質體2(選殖於pCAG-Neo)。又，編碼人類IL-1RAcP之基因(序列編號174：NM_002182)及編碼小鼠IL-1RAcP之基因(序列編號175：NM_008364)，亦對5’末端賦予EcoRI辨識序列及KOZAK序列、對3’末端賦予NotI辨識序列，進行人工合成，次選殖(subclone)於pIRESpuro3。報導基因分析所使用的包含螢火蟲螢光酵素基因之NF-kB報導基因的質體，係使用pGL4.32(Promega公司、E8491)(以下將其記載為「報導質體」)。作為控制組報導質體而用於補正的海腎螢光酵素(Renilla luciferase)基因之質體，係使用對市售質體pGL4.70(Promega公司、E6881)使用限制酵素反應導入編碼啟動子之基因(序列編號176：vDNA-000028)者(以下將其記載為「補正質體」)。
[實施例2] 穩定表現hIL-36R之CHO細胞之製作 穩定表現人類IL-36R之細胞，係藉由脂質轉染(lipofection)法對CHO-K1細胞(JCRB細胞庫、JCRB9018)導入hIL-36R表現質體1，使用添加適切濃度之嘌呤黴素與血清的Ham’s F12培養基製作穩定表現細胞株。將此處所製作之穩定表現株，使用於之後所記載的實施例6、9及15之Cell ELISA及實施例4之流式細胞術。
[實施例3]以電穿孔製作表現hIL-36R之功能評估用細胞 準備實驗足夠量的293A細胞(R70507、Thermofisher Scientific)。以電穿孔實施時到達匯合(confluent)的方式，用245mm×245mm之方形細胞培養皿培養細胞。將電穿孔所用之細胞，以胰蛋白酶EDTA溶液由培養皿剝離，添加添加有10%FBS之DMEM培養基後回收。將細胞懸浮液適量移至50mL管子，以300g×5分鐘、4℃進行離心，以配製細胞團塊。去除培養液後於每1根管子添加10mL之電穿孔緩衝液使細胞懸浮，計數活細胞數。將懸浮於電穿孔緩衝液之細胞懸浮液合併為一，進一步以300g×5分鐘、4℃進行離心分離，再懸浮於電穿孔緩衝液，使活細胞數成為1×108 細胞/mL。1次電穿孔設為細胞懸浮液400μL，添加配製為3mg/mL以上之濃度的hIL-36R表現質體1為25μg/次、報導質體為25μg/次、補正質體為10~25μg/次，使用吸量管小心地混合。將細胞懸浮液置入容量400μL之套管(cartridge)中，使用MaxcyteSTX( 註冊商標 ) ，以293細胞用實驗指南(protocol)實施電穿孔。每1次電穿孔，即使用吸量管將電穿孔後之細胞小心地移至24孔盤之1孔中，於37℃、5%CO2 之環境下靜置30分鐘。
靜置後，以培養基將細胞回收，於方形細胞培養皿培養細胞1日。將經接著的細胞再度使用胰蛋白酶EDTA溶液與培養基回收，使用細胞保存液於適切之濃度冷凍保管。細胞之製作係使用Promega公司之Dual-Glo( 註冊商標 ) Luciferase Assay System(E2920或E2940、Promega公司)進行確認。將經冷凍保管的細胞融解，懸浮於10mL之培養基後，以300g×5分鐘、4℃之條件離心，使細胞團塊化，去除保存劑，再懸浮於10mL之培養基，計數活細胞數。配製2×105 細胞/mL之細胞懸浮液，播種於96孔之Optical Corning( 註冊商標 ) BioCoat( 註冊商標 ) 聚-D-離胺酸96孔白色平底微孔盤(White Flat Bottom Microplate)中，使成為100μL/孔，培養至翌日。去除培養基後，添加使用於培養融合瘤之培養基30μL，於37℃、5%CO2 之環境下靜置30分鐘。之後，添加配製為含200ng/μL之適切濃度的活性型人類IL-36α(6995-IL/CF、R&D公司製)、人類IL-36β(6834-ILB/CF、R&D公司製)，及人類IL-36γ(6835-IL/CF、R&D公司製)之各配位體的稀釋系列，使分別成為30μL/孔，於37℃、5%CO2 之環境下靜置5小時。又，於前述盤中進一步設定不含配位體之僅有培養基的陰性控制組之孔，與由培養基及配位體溶液之組合所構成的陽性控制組之孔。
5小時後，去除培養基，以100μL/孔進行添加經PBS稀釋為2倍之Dual-Glo( 註冊商標 ) 螢光酵素分析試藥。以遮光之狀態緩慢振盪10分鐘，使用Tristar LB941(Berthold Technologies)，將“Counting Time”設定為“0.1 sec”、將“Emission Filter”設定為“No filter slot-A8”進行測定。以該測定值為F值。將任意孔之F值標記為Fx 、於最大之配位體濃度之F值之平均值標記為Fposi 、陰性控制組之平均值標記為Fnega 。
接著，添加經稀釋之Dual-Glo( 註冊商標 ) Stop & Glo( 註冊商標 ) 試藥，使成為50μL/孔，以遮光之狀態緩慢振盪10分鐘，同樣地進行測定。以該測定值為R值。將任意孔之R值標記為Rx 、最大之配位體濃度之R值之平均值標記為Rposi 、陰性控制組之R值之平均值標記為Rnega 。
NFkB之訊息係如以下般定義。
Figure 02_image001
使用利用終濃度100ng/mL之人類IL-36α配位體進行上述實驗後F值成為1000以上、R值成為100以上的細胞，進行抗體之評估。
[實施例4] 穩定表現人類IL-36R之CHO細胞之人類IL-36R表現確認及功能評估用細胞之人類IL-36R、人類IL-1RAcP之表現確認 將穩定表現人類IL-36R之CHO細胞及人類IL-36R之功能評估用細胞由培養皿回收，使經稀釋之抗hIL-36R抗體(R&D、AF872)於室溫反應20分鐘。以Cell Staining Buffer(BioLegend、420201)洗淨一次後，為了檢測抗人類IL-36R抗體，使稀釋1000倍之抗山羊IgG-Alexa Fluor( 註冊商標 ) 488標識抗體(二次抗體)(Thermo Fisher Scientific, A-11078)反應20分鐘。將細胞洗淨一次後，再懸浮為適切的濃度，以流式細胞儀 BD Accuri C6(Becton Dickinson)測定。將所檢出之細胞以FSC(Forward Scatter)與SSC(Side Scatter)進行閘控(gating)，分別確認人類IL-36R之表現(穩定表現人類IL-36R之CHO細胞：圖5A、功能評估用細胞：圖5C)。再者，陰性控制組係使用對表現人類IL-36R之細胞不使一次抗體反應，僅使二次抗體反應者。又，使用抗IL-1RAcP抗體(R&D、AF676)，藉由流式細胞術同樣地檢測293A細胞及功能評估用細胞之人類IL-1RAcP之表現(293A細胞：圖5B、功能評估用細胞：圖5D)。
[實施例5]產生大鼠抗人類IL-36R單株抗體的融合瘤之製作 以人類IL-36R對大鼠的免疫誘發係藉由使用基因槍之DNA免疫法進行。以流式細胞術(FCM)測定採血後之血中抗體價，確認抗體價上昇，對於DNA免疫開始起至約6週後為止抗體價上昇的全部個體進行增幅(boost)，由動物回收淋巴節細胞，以細胞冷凍液進行冷凍保管。
藉由電融合法製作融合瘤取得大鼠抗人類IL-36R單株抗體。具體而言，將1.8×107 個細胞之P3U1及大鼠淋巴球，懸浮於ECF緩衝液(0.3M 甘露醇、10mM CaCl2 、10mM MgCl2 、1mg/mL BSA)700μL，使用細胞融合裝置(ECFG21、Nepa Gene)及腔室電極(CUY497P2)，藉由施加10秒交流電壓30V、30μ秒×3次直流電壓350V的電壓使其融合。將融合後之細胞懸浮於含有次黃嘌呤、胺基喋呤，及胸苷之選擇培養基，播種於96孔盤，使得含有200μL以上之培養液，進行培養。
[實施例6] 阻礙IL-36α及γ之訊息的抗人類IL-36R抗體產生融合瘤之篩選 於15片微孔盤中播種的融合瘤細胞於孔內形成複數個群落，達到適當尺寸的階段，以抗IL-36R抗體對人類IL-36R之結合活性為指標篩選融合瘤為目的，使用穩定表現人類IL-36R之細胞實施Cell ELISA。將穩定表現人類IL-36R之CHO細胞配製為1×106 細胞/mL，以100μL/孔播種於聚-D-離胺酸96孔盤(Corning、356461)。一晩培養後丟棄培養基，添加融合瘤培養上清液成為30μL/孔，於室溫反應1小時。
使融合瘤培養上清液進行反應後，丟棄含抗IL-36R抗體之反應溶液，以含0.05% Tween20之PBS(PBS-T)洗淨2次。洗淨後，丟棄PBS-T，使用10%中性緩衝福馬林溶液於室溫固定細胞約10分鐘。細胞固定後，丟棄10%中性緩衝福馬林溶液，以PBS-T洗淨1次，添加經0.2%FBS/3%BSA/PBS稀釋5000倍之抗大鼠IgG抗體HRP(Horse Radish Peroxidase)接合(SouthernBiotech、3030-05)溶液為30μL/孔，於室溫反應約1小時。二次抗體反應後，重複4次以PBS-T之洗淨後，添加遵照廠商實驗指南配製之顯色基質TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)(Thermofisher Sceintific、34021)溶液為100μL/孔，開始反應。一邊觀察顯色之程度同時於約20分鐘後添加2N硫酸為100μL/孔，停止反應。測定於450nm及650nm之吸光度，算出(於450nm之吸光度)-(於650nm之吸光度)，以其為OD值(吸光度)。進行各吸光度之數值及統計解析(算出平均、標準差、最大、最小)，為了2次篩選，設定吸光度0.3作為用以選出上位殖株之閾值，回收上位458個殖株之培養上清液。針對458個殖株，以80個殖株/微孔盤，使用150ng/mL之活性型IL-36α，由以下記載之分析來評估融合瘤上清液之阻礙活性。
使用實施例3記載之功能評估用細胞，以1×104 個細胞/孔播種細胞並培養一晩。翌日去除培養基後，於控制組用之孔中僅添加培養基30μL，於評估用之孔中添加融合瘤之培養上清液30μL。
30分鐘後，添加使用培養基配製為300ng/mL之活性型人類IL-36α(6995-IL/CF、R&D公司製)成為30μL/孔。又，陰性控制組係於經添加培養基的孔中添加培養基，陽性控制組係於經添加培養基的孔中添加含IL-36α配位體之培養基，於37℃、5%CO2 之環境下靜置5小時。去除含配位體溶液之培養基，以100μL/孔添加經PBS稀釋為2倍之Dual-Glo( 註冊商標 ) 螢光酵素分析試藥。於遮光之狀態緩慢振盪10分鐘，使用Tristar LB941(Berthold Technologies)，以Counting Time：0.1 sec、Emission Filter：No filter slot-A8之條件測定。以該測定值為F值。將任意孔之F值標記為Fx 、於最大之配位體濃度之F值之平均值標記為Fposi 、陰性控制組之平均值標記為Fnega 。
接著，以50μL/孔，添加經稀釋之Dual-Glo( 註冊商標 ) Stop & Glo( 註冊商標 ) 試藥，於遮光之狀態緩慢振盪10分鐘，以同樣之條件進行測定。以該測定值為R值。將任意孔之R值標記為Rx 、最大之配位體濃度的R值之平均值標記為Rposi 、陰性控制組之R值之平均值標記為Rnega 。
以陽性控制組之孔之訊息的平均值為100%時，任意孔x之IL-36α、β或γ的各配位體之NFkB訊息係如以下般定義。
Figure 02_image003
圖6係顯示表示抗IL-36R抗體所致之結合篩選結果與IL-36α訊息阻礙篩選結果之關係的圖。比較評估所評估的458個殖株之融合瘤的培養上清液之結合活性(吸光度)與IL-36α訊息阻礙活性後，結合強度與阻礙活性並無相關性。
接著，使用前述評估方法，針對使IL-36α之訊息(NFkB Signal(%))成為60%以下的111種抗體產生融合瘤之培養上清液與無阻礙活性的3種抗體產生融合瘤之培養上清液，評估融合瘤之培養上清液對終濃度150ng/mL之IL-36α、IL-36β、IL-36γ的阻礙活性，將IL-36β NFkB Signal(%)或IL-36γ NFkB Signal(%)對IL-36α NFkB Signal(%)作圖，解析相對的訊息強度。
藉由篩選所選出的抗IL-36R抗體當中，顯示IL-36β之訊息阻礙或IL-36γ之訊息阻礙相對於IL-36α之訊息阻礙的結果(NFkB Signal(%))的圖係分別示於圖7A及B。由此結果，IL-36α與IL-36γ之訊息阻礙活性顯示相同傾向、換言之IL-36αNFkB Signal(%)與IL-36βNFkB Signal(%)或IL-36γNFkB Signal(%)相等時，數據係於圖示直線上作圖。另一方面，確認到IL-36β之訊息阻礙活性相對弱的抗體存在。由本探討的結果，可知係有阻礙IL-36α及IL-36γ之IL-36R訊息，另一方面不阻礙IL-36β之IL-36R訊息的融合瘤培養上清液。
[實施例7]不阻礙IL-36β訊息之抗人類IL-36R抗體之篩選 以實施例5記載之方法進行第2次之細胞融合，於10片微孔盤中所播種的融合細胞(融合瘤)於孔內形成複數個群落，達到適當尺寸的階段，以實施例6記載之方法評估作為1次篩選之融合瘤之培養上清液對於終濃度150ng/mL之IL-36α及IL-36β刺激的阻礙活性。
對於融合瘤之培養上清液評估IL-36α及IL-36β之訊息強度，以添加有該培養上清液之孔之IL-36αNFkB Signal(%)為橫軸、IL-36βNFkB Signal(%)為縱軸進行作圖。表示所得結果之圖係示於圖8。由該結果，檢測出本篩選條件中觀察不到IL-36β之訊息阻礙的殖株(圖中之虛線所示之圓表示的殖株)。
[實施例8]抗IL-36R抗體之胺基酸序列之決定、同型鑑定(isotyping)及抗體配製 將具有IL-36R訊息特異性阻礙抗體之活性的陽性孔中所含的融合瘤(CL_00071：試驗例1之融合瘤)，及作為比較對象的產生與公知之抗IL-36R抗體同樣地阻礙全部IL-36R訊息之抗hIL-36R抗體的融合瘤(CL_00055及CL_00069；參照例1及2之融合瘤)，藉由極限稀釋法予以單一殖株化。由各試驗例及參照例之融合瘤的細胞團塊，使用RNA擷取套組(Qiagen、74106)遵照製品附屬的方法擷取全RNA。藉由吸光度法定量RNA濃度後，使用Omniscript RT Kit(Qiagen、205113)，遵照製品附屬的方法由全RNA 1μg製作cDNA。融合瘤殖株之抗體基因之決定，係藉由PCR法，使用國際公開第2006/106366號(專利文獻5)記載之引子來進行。以所製作之cDNA為模板，將編碼抗體可變區域之基因藉由使用了DNA聚合酶之PCR反應而放大。PCR反應，係將含有上述所製作的cDNA、引子組(終濃度各1μM)、DNA聚合酶的50μL之反應液，進行由98℃10秒、55℃10秒、68℃30秒所成之循環30次。
藉由所使用之引子組，未見到基因之PCR放大時，或所取得之抗體基因無活性時，係基於登錄在IMGT(Immuno Gene Tics：http：//www.imgt.org/)之編碼抗體之訊息胜肽的基因資訊重新製作引子進行同樣的探討，或藉由5’RACE法決定抗體可變區域之鹼基序列。
抗體之純化與同型之確認係如以下般進行。於適切尺寸之培養皿添加10~15mL之培養基，培養融合瘤，將所得之培養上清液以15000g×10分鐘離心予以清澈化，使用蛋白質G以批式法純化抗體。將蛋白質G樹脂回收於開放管柱，以足夠量的緩衝液洗淨後，使用pH2.8之0.1M 甘胺酸鹽酸溶液溶出抗體，立即以pH8之1M Tris-HCl中和。取得複數個區分(fraction)，對於以Nanodorop2000 (Thermofisher Sceintific製)可確認到280nm之吸光度的區分，使用截止分子量30,000Da之離心膜濃縮裝置濃縮溶出液。添加濃縮液之10倍以上體積的PBS，再度進行3次以上的濃縮操作，取代為PBS，以1mg/mL之吸光度(光徑長10mm)為1.37，配製為1mg/mL(亦有將由融合瘤之培養上清液所純化之抗體，記載為融合瘤上清液純化抗體者)。評估均使用取代為PBS者。抗體之同型，係使用大鼠抗體同型鑑定套組(ANP：Antagen Pharmaceuticals、ISO-R8-20)而決定。抗體之莫耳濃度，分子量係全部以150kDa來計算。對於所取得的各試驗例及參照例之融合瘤所產生的抗體(試驗例1以及參照例1及2之抗體)，係人工合成編碼組合了其抗體之可變區域與在同型鑑定之結果一致的恆定區域之胺基酸序列的經密碼子最佳化之基因序列，接入於pcDNA3.4(Thermofisher Scientific、A14697)或pCAG-Neo(和光純藥、163-25601)。質體係使用無內毒素之質體配製套組(MACHEREY-NAGEL、740422.50)純化。重組抗體係使用對浮游CHO細胞導入抗體之重鏈與輕鏈之基因的暫時性表現系統(Thermofisher Sceintific、A29133)取得。進行適切的期間培養，於得到評估所必要之抗體時，回收培養上清液與源自融合瘤之抗體同樣地進行純化。再者，純化具有人類之恆定區域的抗體時，係將純化所使用之樹脂變更為Protein A、將溶出所用的溶出液變更為pH3.3之0.1M乙酸鈉水溶液，與具有大鼠之恆定區域的抗體同樣地進行純化。
所得試驗例1之抗IL-36R抗體之重鏈及輕鏈的各可變區域之胺基酸序列示於圖9。又，參照例1及2以及試驗例1之抗IL-36R抗體的選殖結果示於下表。表中之「重組體/融合瘤名」之欄，係顯示重組抗體名，及所對應之抗體產生融合瘤名。又，表中之「抗體之功能」之欄，係顯示對於各IL-36刺激而言，抗體所致阻礙之選擇性。
Figure 02_image005
又，基於所取得之試驗例1之抗體的胺基酸序列，以生殖細胞系(Germline)之序列為參考，配製對胺基酸序列導入變異之IL-36R訊息特異性阻礙抗體之變異抗體(試驗例2~9之抗體)。與參照例1及2以及試驗例1之抗體的選殖結果同樣地，將試驗例2~9、117hG1Dk及117hG4k之抗體之序列資訊示於下表。117hG1Dk及117hG4k，為具有試驗例1之抗體的可變區域與人類之抗體的恆定區域之嵌合體抗體。再者，表中之「重組體名」之欄，係顯示重組抗體名。
Figure 02_image007
Figure 02_image009
Figure 02_image011
[實施例9]IL-36R訊息特異性阻礙抗體對人類IL-36R的結合活性(Cell ELISA)之評估 (9-1)使用了融合瘤上清液純化抗體之評估 為了探討源自參照例1及2以及試驗例1之融合瘤的培養上清液之抗IL-36R抗體對人類IL-36R之結合活性，係使用穩定表現人類IL-36R之細胞實施Cell ELISA。將穩定表現人類IL-36R之CHO細胞以1×105 細胞/孔播種於聚-D-離胺酸96孔盤(Corning、356461)。一晩培養後，丟棄培養基，添加抗IL-36R抗體系列稀釋液及大鼠同型控制組系列稀釋液(R&D、MAB0061)成為30μL/孔，於室溫反應1小時。再者，抗IL-36R抗體系列稀釋液為將抗IL-36R抗體溶液以培養基調整為15μg/mL，之後，以培養基以稀釋倍率3倍分11階段稀釋者。又，大鼠同型控制組系列稀釋液，為以培養基配製為15μg/mL，之後以培養基以稀釋倍率9倍分5階段稀釋者。使抗IL-36R抗體稀釋液及同型控制組稀釋液反應約1小時後，丟棄含抗IL-36R抗體或同型控制組之反應溶液，以含0.05% Tween20之PBS(PBS-T)洗淨2次。洗淨後，丟棄PBS-T，使用10%中性緩衝福馬林溶液於室溫固定細胞約10分鐘。之後，丟棄10%中性緩衝福馬林溶液，以PBS-T洗淨1次。洗淨後，丟棄PBS-T，以30μL/孔來添加經0.2%FBS/3%BSA/PBS稀釋5000倍的抗大鼠IgG抗體HRP接合溶液，於室溫反應約1小時。丟棄抗大鼠IgG抗體HRP接合溶液，以PBS-T洗淨4次。洗淨後，丟棄PBS-T，添加遵照廠商實驗指南所配製的TMB溶液(Thermofisher Sceintific、34021)成為100μL/孔，開始反應。約20分鐘後，添加2N硫酸成為100μL/孔，停止反應。以吸光微孔盤讀取儀測定於450nm及650nm之吸光度，算出(於450nm之吸光度)-(於650nm之吸光度)，作為OD值。使用GraphPad Prism( 註冊商標 ) Ver8.2.1，以log(agonist) vs. response-Variable slope(four parameters)進行用量反應曲線之擬合，算出EC50 值。結果示於下表。
Figure 02_image013
(9-2)使用了重組抗體之評估 為了探討重組抗IL-36R抗體對人類IL-36R之結合活性，係使用穩定表現人類IL-36R之細胞來實施Cell ELISA。將穩定表現人類IL-36R之CHO細胞以1×105 細胞/孔播種於聚-D-離胺酸96孔盤(Corning、356461)。一晩培養後，丟棄培養基，添加重組抗IL-36R抗體系列稀釋液及大鼠同型控制組系列稀釋液成為30μL/孔，於室溫反應1小時。再者，重組抗IL-36R抗體系列稀釋液為以培養基調整為15μg/mL，之後，以培養基將3倍系列稀釋液分11階段稀釋者。又，大鼠同型控制組系列稀釋液為以培養基配製為15μg/mL，之後以培養基將9倍系列稀釋分5階段稀釋者。使抗IL-36R抗體溶液及大鼠同型控制組溶液反應約1小時後，丟棄含抗IL-36R抗體或大鼠同型控制組之反應溶液，以含0.05% Tween20之PBS(PBS-T)洗淨2次。以PBS-T洗淨後，使用10%中性緩衝福馬林溶液於室溫固定細胞約10分鐘。丟棄10%中性緩衝福馬林溶液，以PBS-T洗淨1次。丟棄PBS-T，以30μL/孔來添加經0.2%FBS/3%BSA/PBS稀釋5000倍的抗大鼠IgG抗體HRP接合溶液，於室溫反應約1小時。丟棄抗大鼠IgG抗體HRP接合溶液，添加PBS-T。重複丟棄PBS-T、添加PBS-T之步驟4次。丟棄PBS-T，添加遵照廠商實驗指南所配製的TMB溶液(Thermofisher Sceintific、34021)成為100μL/孔，開始反應。約20分鐘後，添加2N硫酸成為100μL/孔，停止反應。以吸光微孔盤讀取儀測定於450nm及650nm之吸光度，算出(於450nm之吸光度)-(於650nm之吸光度)，作為OD值。使用GraphPad Prism( 註冊商標 ) Ver8.2.1以log(agonist) vs. response-Variable slope(four parameters)進行用量反應曲線之擬合，算出EC50 值。結果示於下表。
Figure 02_image015
[實施例10]IL-36R訊息特異性阻礙抗體之結合部位之解析(流式細胞術、Cell ELISA)、結構域重組 為了鑑定由融合瘤之培養上清液所純化的參照例1及2以及試驗例1之抗IL-36R抗體對人類IL-36R(hIL-36R)之結合結構域，係測定抗IL-36R抗體對將人類IL-36R之結構域取代為小鼠IL-36R之結構域的IL-36R之結構域重組變異體的結合性。
具體而言，係將序列編號11所示之人類IL-36R之胺基酸序列當中，區域X1-Y1(胺基酸殘基1~100)定為細胞外結構域I、區域X2-Y2(胺基酸殘基101~198)定為細胞外結構域II、區域X3-Y3(胺基酸殘基199~316)定為細胞外結構域III，製作3個結構域序列當中1個或2個經取代為小鼠IL-36R所對應之結構域的以下6個IL-36R變異體(或亦有表述為「取代體」者)。
(變異體1：m1h2h3)將人類IL-36R之結構域I序列取代為小鼠IL-36R之結構域I序列的變異體。 (變異體2：h1m2h3)將人類IL-36R之結構域II序列取代為小鼠IL-36R之結構域II序列的變異體。 (變異體3：h1h2m3)將人類IL-36R之結構域III序列取代為小鼠IL-36R之結構域III序列的變異體。 (變異體4：m1m2h3)將人類IL-36R之結構域I序列及結構域II序列取代為小鼠IL-36R之結構域I序列及結構域II序列的變異體。 (變異體5：m1h2m3)將人類IL-36R之結構域I序列及結構域III序列取代為小鼠IL-36R之結構域I序列及結構域III序列的變異體。 (變異體6：h1m2m3)將人類IL-36R之結構域II序列及結構域III序列取代為小鼠IL-36R之結構域II序列及結構域III序列的變異體。
所得之IL-36R結構域重組變異體1~6各自之胺基酸序列及編碼此等之鹼基序列的各序列編號如下表所示。
Figure 02_image017
對HEK293細胞藉由脂質轉染法導入分別接入有編碼上述6種IL-36R變異體1~6之胺基酸序列的基因(序列編號90、92、94、96、98，及100)之pCAG-Neo載體，培養一晩。將各種抗hIL-36R抗體以細胞染色緩衝液稀釋成為各5μg/mL。培養後，將導入有基因之HEK293細胞由培養皿回收，使經稀釋之各種抗hIL-36R抗體於室溫反應20分鐘。以細胞染色緩衝液洗淨一次後，使作為二次抗體之經1000倍稀釋之抗大鼠IgG-AlexaFluor( 註冊商標 ) 488抗體(Thermo Fisher Scientific、A-11006)反應20分鐘。將細胞洗淨1次後，懸浮為適切濃度，以流式細胞儀Accuri C6 plus(Becton Dickinson)測定。再者，negative-cotrol為對表現各變異體之細胞，不使各種抗IL-36R抗體等之一次抗體反應，僅使二次抗體反應者。以FSC與SSC閘控後，以陽性細胞數成為0%的方式設定閾值。以該閾值為基準，將抗體對各變異體之結合以陽性細胞數率(相對於全細胞數而言超過閾值之細胞數的比例)表示。其結果示於下表。陽性細胞數率未達5%者，判斷為無結合，下述表中表述為「-」。另一方面，陽性細胞數率為20%以上者，判斷為結合，下述表中表述為「+」。對於5%以上且未達20%，則表述為「±」。
Figure 02_image019
進一步地，亦藉由Cell ELISA法確認結合結構域。對HEK293細胞藉由脂質轉染法導入分別接入有編碼上述6種人類IL-36R的變異體1~6之胺基酸序列的基因(序列編號90、92、94、96、98及100)之pCAG-Neo載體，培養一晩。由培養皿回收細胞，於聚-D-離胺酸96孔盤(Corning、356461)播種成為1×105 細胞/孔。一晩培養後，丟棄培養基，添加抗IL-36R抗體系列稀釋液及大鼠同型控制組系列稀釋液(R&D、MAB0061)成為30μL/孔，於室溫反應1小時。再者，抗IL-36R抗體系列稀釋液及大鼠同型控制組系列稀釋液係使用經培養基(10%FBS、盤尼西林/鏈黴素溶液/DMEM)調整為3.75μg/mL，之後以培養基稀釋為1.5μg/mL、0.75μg/mL、0.15μg/mL、0.03μg/mL、0.006μg/mL者。使抗體稀釋溶液反應約1小時後，丟棄含抗IL-36R抗體或大鼠同型控制組抗體之反應溶液，以含0.05% Tween20之PBS(PBS-T)洗淨2次。洗淨後，丟棄PBS-T，使用10%中性緩衝福馬林溶液於室溫固定細胞約10分鐘。丟棄10%中性緩衝福馬林溶液，以PBS-T洗淨1次。洗淨後，丟棄PBS-T，添加經0.2%FBS/3%BSA/PBS稀釋5000倍之抗大鼠IgG抗體HRP接合(SouthernBiotech、3030-05)溶液成為30μL/孔，於室溫反應約1小時。丟棄抗大鼠IgG抗體HRP接合溶液，添加PBS-T。丟棄PBS-T，以PBS-T洗淨4次。洗淨後，丟棄PBS-T，添加遵照廠商實驗指南所配製的TMB溶液(Thermofisher Sceintific、34021)成為100μL/孔，開始反應。約20分鐘後，添加2N硫酸成為100μL/孔，停止反應。使用吸光微孔盤讀取儀 SpectraMax 190(Molecular Devices)，測定於450nm及650nm之吸光度，算出(於450nm之吸光度)-(於650nm之吸光度)，作為OD值(吸光度)。使用GraphPad Prism( 註冊商標 ) Ver8.2.1，以log(agonist) vs. response-Variable slope(four parameters)進行用量反應曲線之擬合，製成圖。
結果示於圖10及下表。於3.75μg/mL之濃度的吸光度為0.9以上者，判斷為結合，下表中表述為「+」。另一方面，吸光度未達0.5者，判斷為結合量顯著減少，下表中表述為「-」。對於未達0.9且0.5以上，係表述為「±」。
Figure 02_image021
由以上結果，試驗例1之抗體，結合於具有人類IL-36R之結構域I即h1之全部受體，相對於此，對具有小鼠IL-36R之結構域I即m1之受體均不結合。另一方面，可知參照例1及2之抗體，結合於具有人類IL-36R之結構域II即h2之受體。由此等之結果，確認到試驗例1之抗體係以結構域I為抗原決定位。
[實施例11]抗hIL-36R抗體之抗原決定位的決定(Cell ELISA) 由於試驗例1之IL-36R訊息特異性阻礙抗體為結合於結構域I之抗體，故為了限定結合部位，製作將序列編號11之IL-36R之N末端數起第1號至第112號之胺基酸殘基以每次8個殘基成為小鼠之IL-36R之序列的方式將一部分之胺基酸進行取代而得的變異體，及將N末端第5號起至第108號之胺基酸殘基以每次8個殘基成為小鼠之IL-36R之序列的方式將一部分之胺基酸取代而得的IL-36R之變異體。具體而言，係製作下述25種之IL-36R之變異體。
(變異體7)將2號之甘胺酸取代為蘇胺酸、將第4號之離胺酸取代為麩胺酸而得的變異體：G2T、K4E。 (變異體8)將9號之離胺酸取代為組胺酸、將第11號之麩胺酸取代為纈胺酸而得的變異體：K9H、E11V。 (變異體9)將9號之離胺酸取代為組胺酸、將第11號之麩胺酸取代為纈胺酸、將第13號之白胺酸取代為異白胺酸、將第15號之丙胺酸取代為麩胺酸、將第16號之絲胺酸取代為甘胺酸而得的變異體：K9H、E11V、L13I、A15E、S16G。 (變異體10)將13號之白胺酸取代為異白胺酸、將第15號之丙胺酸取代為麩胺酸、將第16號之絲胺酸取代為甘胺酸、將第20號之丙胺酸取代為脯胺酸而得的變異體：L13I、A15E、S16G、A20P。 (變異體11)將25號之苯丙胺酸取代為酪胺酸、將第28號之異白胺酸取代為麩胺酸而得的變異體：F25Y、I28E。 (變異體12)將25號之苯丙胺酸取代為酪胺酸、將第28號之異白胺酸取代為麩胺酸、將第30號之絲胺酸取代為天門冬醯胺、將第32號之麩胺酸取代為丙胺酸而得的變異體：F25Y、I28E、S30N、E32A。 (變異體13)將30號之絲胺酸取代為天門冬醯胺、將第32號之麩胺酸取代為丙胺酸、將第34號之絲胺酸取代為天門冬醯胺、將第35號之纈胺酸取代為白胺酸而得的變異體：S30N、E32A、S34N、V35L。 (變異體14)將34號之絲胺酸取代為天門冬醯胺、將第35號之纈胺酸取代為白胺酸、將第40號之天門冬醯胺取代為蘇胺酸而得的變異體：S34N、V35L、N40T。 (變異體15)將40號之天門冬醯胺取代為蘇胺酸、將第41號之絲胺酸取代為脯胺酸、將第44號之異白胺酸取代為絲胺酸而得的變異體：N40T、S41P、I44S。 (變異體16)將41號之絲胺酸取代為脯胺酸、將第44號之異白胺酸取代為絲胺酸、將第48號之離胺酸取代為天門冬醯胺而得的變異體：S41P、I44S、K48N。 (變異體17)將48號之離胺酸取代為天門冬醯胺、將第49號之異白胺酸取代為天門冬醯胺、將第50號之異白胺酸取代為精胺酸、將第51號之麩醯胺取代為組胺酸、將第52號之絲胺酸取代為白胺酸而得的變異體：K48N、I49N、I50R、Q51H、S52L。 (變異體18)將49號之異白胺酸取代為天門冬醯胺、將第50號之異白胺酸取代為精胺酸、將第51號之麩醯胺取代為組胺酸、將第52號之絲胺酸取代為白胺酸、將第54號之異白胺酸取代為纈胺酸而得的變異體：I49N、I50R、Q51H、S52L、I54V。 (變異體19)將54號之異白胺酸取代為纈胺酸、將第58號之麩胺酸取代為麩醯胺而得的變異體：I54V、E58Q。 (變異體20)將58號之麩胺酸取代為麩醯胺而得的變異體：E58Q。 (變異體21)將66號之甲硫胺酸取代為白胺酸、將第67號之麩胺酸取代為蘇胺酸、將第68號之色胺酸取代為白胺酸而得的變異體：M66L、E67T、W68L。 (變異體22)將66號之甲硫胺酸取代為白胺酸、將第67號之麩胺酸取代為蘇胺酸、將第68號之色胺酸取代為白胺酸、將第69號之甘胺酸取代為麩胺酸而得的變異體：M66L、E67T、W68L、G69E。 (變異體23)將69號之甘胺酸取代為麩胺酸、將第73號之纈胺酸取代為異白胺酸而得的變異體：G69E、V73I。 (變異體24)將73號之纈胺酸取代為異白胺酸、將第79號之離胺酸取代為精胺酸、將第80號之甘胺酸取代為天門冬醯胺而得的變異體：V73I、K79R、G80N。 (變異體25)將79號之離胺酸取代為精胺酸、將第80號之甘胺酸取代為天門冬醯胺、將第81號之精胺酸取代為丙胺酸、將第82號之天門冬胺酸取代為組胺酸、將第83號之絲胺酸取代為天門冬醯胺而得的變異體：K79R、G80N、R81A、D82H、S83N。 (變異體26)將81號之精胺酸取代為丙胺酸、將第82號之天門冬胺酸取代為組胺酸、將第83號之絲胺酸取代為天門冬醯胺、將第85號之組胺酸取代為酪胺酸、將第86號之精胺酸取代為麩醯胺、將第88號之組胺酸取代為丙胺酸而得的變異體：R81A、D82H、S83N、H85Y、R86Q、H88A。 (變異體27)將85號之組胺酸取代為酪胺酸、將第86號之精胺酸取代為麩醯胺、將第88號之組胺酸取代為丙胺酸而得的變異體：H85Y、R86Q、H88A。 (變異體28)將94號之苯丙胺酸取代為白胺酸、將第95號之麩胺酸取代為離胺酸、將第96號之離胺酸取代為天門冬醯胺而得的變異體：F94L、E95K、K96N。 (變異體29)將101號之蘇胺酸取代為絲胺酸、將第103號之異白胺酸取代為甲硫胺酸、將第104號之甘胺酸取代為麩胺酸而得的變異體：T101S、I103M、G104E。 (變異體30)將101號之蘇胺酸取代為絲胺酸、將第103號之異白胺酸取代為甲硫胺酸、將第104號之甘胺酸取代為麩胺酸、將第106號之白胺酸取代為絲胺酸、108號之天門冬醯胺取代為纈胺酸而得的變異體：T101S、I103M、G104E、L106S、N108V。 (變異體31)將106號之白胺酸取代為絲胺酸、將第108號之天門冬醯胺取代為纈胺酸、將第109號之白胺酸取代為天門冬醯胺而得的變異體且其係於第111號插入脯胺酸而得的變異體：L106S、N108V、L109N、111P。
以上之IL-36R變異體7~31各自之胺基酸序列及編碼其之鹼基序列的各序列編號如下表所示。
Figure 02_image023
將分別接入有上述25種之IL-36R變異體基因的pCAG-Neo載體，藉由脂質轉染法導入於HEK293細胞，培養一晩。將HEK293細胞由培養皿回收，以1×105 細胞/孔播種於聚-D-離胺酸96孔盤(Corning、356461)。一晩培養後，丟棄培養基，添加抗IL-36R抗體系列稀釋液及大鼠同型控制組系列稀釋液(R&D、MAB0061)成為30μL/孔，於室溫反應1小時。再者，抗IL-36R抗體系列稀釋液及大鼠同型控制組系列稀釋液，係使用將抗IL-36R抗體溶液或大鼠同型控制組以培養基(10%FBS、盤尼西林/鏈黴素溶液/DMEM)調整為3.75μg/mL，之後以培養基稀釋為1.5μg/mL、0.75μg/mL、0.15μg/mL、0.03μg/mL、0.006μg/mL者。使抗IL-36R抗體溶液及同型控制組溶液反應約1小時後，丟棄含抗IL-36R抗體或同型控制組之反應溶液，以含0.05% Tween20之PBS(PBS-T)洗淨2次。洗淨後，丟棄PBS-T，使用10%中性緩衝福馬林溶液於室溫固定細胞約10分鐘。丟棄10%中性緩衝福馬林溶液，以PBS-T洗淨1次。洗淨後，丟棄PBS-T，添加經0.2%FBS/3%BSA/PBS稀釋5000倍之抗大鼠IgG抗體HRP接合(SouthernBiotech、3030-05)溶液成為30μL/孔，於室溫反應約1小時。丟棄抗大鼠IgG抗體HRP接合溶液，以PBS-T洗淨4次。洗淨後，丟棄PBS-T，添加遵照廠商實驗指南所配製的TMB溶液(Thermofisher Sceintific、34021)成為100μL/孔，開始反應。約20分鐘後，添加2N硫酸成為100μL/孔，停止反應。測定於450nm及650nm之吸光度，算出(於450nm之吸光度)-(於650nm之吸光度)，作為OD值(吸光度)。
所得結果示於下表。本試驗中係於暫時性地導入基因後以流式細胞術確認各變異體之表現，相較於IL-36R而言，表現下降40%以上時判斷為不適合評估，下表中表述為「NA」。以於抗體濃度5nM(0.75μg/mL)時對人類IL-36R之結合量(OD值)為基準，求得試驗例1對各變異體之結合量(OD值)之比率(相對結合量：參照下述式)，相對結合量為80%以上時判斷為無變化(表中表述為「-」)、相對結合量為50%以上且未達80%時判斷為減少(表中表述為「±」)、相對結合量為未達50%時判斷為顯著減少(表中表述為「+」)。抗原決定位判定，係以表中「+」為抗原決定位。
Figure 02_image025
Figure 02_image027
試驗例1之抗體未結合於變異體7，因此暗示了IL-36R之胺基酸序列第2號之甘胺酸與第4號之離胺酸為抗原決定位的可能性。又，試驗例1之抗體未結合於變異體11與12兩方，因此暗示了第25號之苯丙胺酸與第28號之異白胺酸為抗原決定位之可能性。另一方面，試驗例1之抗體結合於變異體8、未結合於變異體9。又，試驗例1之抗體結合於變異體25與27，但未結合於變異體26。
由非專利文獻揭示之IL-36R之構造或圖3，可知變異體26之變異部位與變異體7及變異體11或12之變異部位在構造上接近。抗體對變異體26之結合雖為與變異體25及變異體27不同的結果，但由構造的解析，判斷該部位包含於抗原決定位中。
[實施例12]抗hIL-36R抗體之抗原決定位的決定(Cell ELISA) 由至今為止的探討結果，暗示了hIL-36R之胺基酸序列(序列編號11)中之第2號之甘胺酸、第4號之離胺酸、第25號之苯丙胺酸、第28號之異白胺酸對於試驗例1之IL-36R訊息特異性阻礙抗體的結合為重要。因而，製作經導入變異(將序列編號11之序列之第2號之甘胺酸經丙胺酸取代的變異體G2A(序列編號151)、將第4號之離胺酸經丙胺酸取代的變異體K4A(序列編號153)、將第25號之苯丙胺酸經丙胺酸取代的變異體F25A(序列編號155)，及將第28號之異白胺酸經丙胺酸取代的變異體I28A(序列編號157))之hIL-36R之各種的丙胺酸變異體。依序稱為變異體32、33、34、35。人工合成G2A變異體之基因(序列編號152)、K4A變異體之基因(序列編號154)、F25A變異體之基因(序列編號156)、I28A變異體之基因(序列編號158)。
對HEK293細胞藉由脂質轉染法，分別導入接入有上述4種IL-36R之1胺基酸變異體之基因的pCAG-Neo載體，培養一晩。將HEK293細胞由培養皿回收，以1×105 細胞/孔播種於聚-D-離胺酸96孔盤。一晩培養後，丟棄培養基，添加抗IL-36R抗體系列稀釋液及大鼠同型控制組系列稀釋液(R&D、MAB0061)成為30μL/孔，於室溫反應1小時。再者，抗IL-36R抗體系列稀釋液及大鼠同型控制組系列稀釋液，係使用將抗IL-36R抗體或大鼠同型控制組溶液以培養基(10%FBS、盤尼西林/鏈黴素溶液/DMEM)調整為3.75μg/mL，之後以培養基稀釋為1.5μg/mL、0.75μg/mL、0.15μg/mL、0.03μg/mL、0.006μg/mL者。使抗體溶液反應約1小時後，丟棄含抗IL-36R抗體或大鼠同型控制組之反應溶液，以含0.05% Tween20之PBS(PBS-T)洗淨2次。洗淨後，丟棄PBS-T，使用10%中性緩衝福馬林溶液於室溫固定細胞約10分鐘。丟棄10%中性緩衝福馬林溶液，以PBS-T洗淨1次。洗淨後，丟棄PBS-T，添加經0.2%FBS/3%BSA/PBS稀釋5000倍之抗大鼠IgG抗體HRP接合(SouthernBiotech、3030-05)溶液成為30μL/孔，於室溫反應約1小時。丟棄抗大鼠IgG抗體HRP接合溶液，以PBS-T洗淨4次。洗淨後，重複丟棄PBS-T、添加PBS-T之步驟4次。丟棄PBS-T，添加遵照廠商實驗指南所配製的TMB溶液(Thermofisher Sceintific、34021)成為100μL/孔，開始反應。約20分鐘後，添加2N硫酸成為100μL/孔，停止反應。測定450nm及於650nm之吸光度，算出(於450nm之吸光度)-(於650nm之吸光度)，作為OD值(吸光度)。
抗IL-36R抗體，係使用試驗例1及2以及參照例1及2之抗體。參照抗體係選擇結合特性之EC50 及Emax 接近於試驗例1之抗體的參照例1之抗體。又，試驗例1之抗體，係使用融合瘤上清液純化抗體及重組抗體雙方。算出於抗體濃度0.75μg/mL下，相對於參照例1之抗體而言，試驗例1及2以及參照例2之抗體的吸光度之比例。
結果示於下表。以參照例1之吸光度為100%，相對結合量為90%以上時，判斷為無抗原決定位的可能性(表中表述為「-」)、相對結合量為70%以上且未達90%時，判斷為具有少許之抗原決定位之可能性(表中表述為「±」)、相對結合量為未達70%且50%以上時，判斷為抗原決定位(表中表述為「+」)、相對結合量為未達50%時，可認為有強的相關性，判斷為特別重要的抗原決定位(表中表述為「++」)。
Figure 02_image029
該探討之結果，可知人類IL-36R(序列編號11)之N末端數起第4號之離胺酸(於變異體33取代為Ala)及第28號之異白胺酸(於變異體35取代為Ala)，為試驗例1之重要的抗原決定位。
[實施例13]使用了報導基因分析法之IL-36R訊息特異性阻礙抗體之IL-36R訊息阻礙評估 (13-1)使用了融合瘤上清液純化抗體之評估 以實施例6記載之方法，藉由分別以終濃度50ng/mL之IL-36α、終濃度10ng/mL之IL-36β，及終濃度50ng/mL之IL-36γ刺激細胞，來評估抗體之阻礙活性。抗人類IL-36R抗體及大鼠同型控制組之稀釋液，係以100nM為終濃度且最高濃度，使用以4倍稀釋而經7階段稀釋者。各孔之NFkB Signal%係由式2算出。陰性控制組(0%)係設為培養基之數據，陽性控制組(100%)係設為各IL-36致效劑之數據。使用GraphPad Prism( 註冊商標 ) Ver8.2.1以log(inhibitor) vs. response - Variable slope(four parameters)進行用量反應曲線之擬合。由所得之回歸分析之結果，算出於式：Y=Bottom +(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))之Y=50之抗體濃度，以其為50%阻礙濃度(IC50 )。抗體係使用試驗例1以及參照例1及2之融合瘤上清液純化抗體。
結果示於圖11及下表。源自全部融合瘤殖株之抗體對IL-36α及IL-36γ顯示阻礙活性，但試驗例1之抗體對IL-36β未顯示阻礙活性。再者，下述表中，於實驗中最高濃度之抗體，就阻礙活性值未到達50%之抗體而言係記載為NA。
Figure 02_image031
(13-2)使用了重組抗體之評估 又，以與上述相同之方法，對重組抗體亦進行評估。評估抗體對分別以終濃度50ng/mL之IL-36α、終濃度50ng/mL之IL-36β，及終濃度50ng/mL之IL-36γ刺激細胞時之IL-36R訊息的阻礙活性。重組抗體係使用試驗例1及參照例1之抗體。又，亦使用IL-36R拮抗劑之IL-36Ra(最高處置濃度17μg/mL(相當於1μM))，作為比較。結果示於圖12及下表。試驗例1之重組抗體，與融合瘤上清液純化抗體同樣地，未阻礙IL-36β之訊息。就實驗中抗體之最高處置濃度的阻礙活性值未到達50%之抗體而言，係記載為NA。
Figure 02_image033
[實施例14]藉由IL-36R訊息特異性阻礙抗體(重組抗體)之IL-36β之阻礙活性評估 (14-1)IL-36β之濃度所致影響之評估 以實施例6記載之方法，以終濃度2ng/mL、10ng/mL、250nmg/mL之IL-36β刺激細胞，評估抗體之阻礙活性(n=2)。抗人類IL-36R抗體及大鼠同型控制組之稀釋液，係使用以4倍稀釋而經7階段稀釋者，作為處置100nM之最高濃度。各孔之NFkB Signal%係由式2算出。陰性控制組(0%)係設為培養基之數據，陽性控制組(100%)係設為各IL-36致效劑之數據。使用GraphPad Prism( 註冊商標 ) Ver8.2.1以log(inhibitor) vs. response-Variable slope(four parameters)進行用量反應曲線之擬合，製成圖。抗體係使用試驗例1及參照例1之重組抗體。又，亦使用IL-36R拮抗劑之IL-36Ra，作為比較。結果示於圖13。與IL-36β之濃度無關地，試驗例1之抗體未濃度依存性地阻礙IL-36β。又，同型控制組，未阻礙任何之IL-36R致效劑之訊息。
(14-2)以超過100nM之抗體濃度評估 以最高處置濃度之終濃度成為1μM的方式，配製抗IL-36R抗體之稀釋系列(以4倍稀釋，進行10階段稀釋)，以實施例6記載之方法，以終濃度50ng/mL之IL-36α、10ng/mL之IL-36β、50ng/mL之IL-36γ刺激細胞，評估抗體之阻礙活性(n=2)。各孔之NFkB Signal%係由式2算出。陰性控制組(0%)係設為培養基之數據，陽性控制組(100%)係設為各IL-36致效劑之數據。使用GraphPad Prism( 註冊商標 ) Ver8.2.1以log(inhibitor) vs. response-Variable slope(four parameters)進行用量反應曲線之擬合，製成圖。抗體係使用試驗例1及參照例1之重組抗體。
結果示於圖14。試驗例1之抗體即使抗體濃度達到1μM，亦不阻礙IL-36β之訊息。
[實施例15]IL-36R訊息特異性阻礙抗體(重組抗體)對人類IL-36R之結合活性(Cell ELISA) 將試驗例2~6之重組抗體，及先前技術文獻記載之抗人類IL-36R之重組抗體(專利文獻2記載之抗體：C81B4及B3、C73C5，以及專利文獻3記載之抗體：APE3849及APE6060)之結合活性，以實施例9記載之方法進行評估(n=2)。使用GraphPadPrism( 註冊商標 ) Ver8.2.1以log(agonist) vs. response-Variable slope(four parameters)進行用量反應曲線之擬合，算出EC50 值。結果示於下表。
Figure 02_image035
[實施例16]以往之抗IL-36R抗體之結合結構域及結合部位的解析 (16-1)使用了IL-36R結構域重組變異體之評估 以實施例10記載之方法，將先前技術文獻記載之抗人類IL-36R之抗IL-36R抗體(專利文獻2記載之抗體：C81B4、B3及C73C5，以及專利文獻3記載之抗體：APE3849、APE6060及APE7247)之結合性，以流式細胞儀進行評估。陽性細胞數率未達5%時，判定為無結合(-)，5%以上且未達20%時判定為±，20%以上時判定為有結合(+)。結果示於下表。
Figure 02_image037
由以上結果，確認到以往之專利文獻之抗IL-36R抗體，結合於具有人類IL-36R之結構域II的IL-36R結構域重組變異體，並非結合於人類IL-36R之結構域I之抗體。
(16-2)使用了IL-36R之變異體之評估 使用實施例11記載之人類IL-36R變異體7、26、31、11及8，將試驗例2~6之重組抗體，及基於117(試驗例1、C_00028)大鼠抗體所製作之大鼠/人類嵌合體抗體(117hG1Dk及117hG4k)、先前技術文獻記載之抗人類IL-36R之抗IL-36R抗體(專利文獻2記載之抗體：C81B4及C73C5，以及專利文獻3記載之抗體：APE6060及APE7247)之結合性，以實施例11記載之方法進行評估。將於3.75μg/mL之重組抗體之濃度下之吸光度為0.9以上者，判斷為抗體有結合，作為非抗原決定位者而表述為「-」。另一方面，將吸光度未達0.5者，判斷為結合量顯著減少，判斷為抗原決定位而表述為「+」。
Figure 02_image039
試驗例2~6之重組抗體，與試驗例1之重組抗體同樣地，未結合於變異體7、變異體11及變異體26，結合於變異體8及變異體31。由此明顯可知，試驗例2~6之重組抗體之抗原決定位，係與試驗例1相同。
Figure 02_image041
先前技術文獻記載之抗體，結合於所探討的全部之IL-36R變異體。所評估者當中，先前技術文獻記載之抗體的結合減少或不結合之變異體，並不存在。另一方面，使試驗例1之恆定區域變為人類型之抗體的嵌合體抗體(117hG1Dk及117hG4k)，係與試驗例1之抗體同樣地，未結合於變異體7、變異體11、變異體26，抗原決定位判定為+。因此，明顯可知試驗例1~6記載之抗體，係與習知技術之抗IL-36R抗體為不同的抗原決定位。
[實施例17]使用了報導基因分析法之抗IL-36R抗體之IL-36R訊息阻礙評估 以實施例6記載之方法，以終濃度50ng/mL之IL-36α、10ng/mL之IL-36β、50ng/mL之IL-36γ刺激細胞，評估抗體之阻礙活性。抗人類IL-36R抗體及大鼠同型控制組之稀釋液，係使用以100nM為最高處置濃度，以4倍稀釋而經7階段稀釋者(各孔之NFkB Signal%係由式2算出)。使用GraphPad Prism( 註冊商標 ) Ver8.2.1以log(inhibitor) vs. response-Variable slope(four parameters)進行用量反應曲線之擬合。由所得之回歸分析之結果，算出於式：Y=Bottom +(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))之Y=50時之抗體濃度，以其為50%阻礙濃度IC50 。作為抗體，除了試驗例1之抗體以外，亦使用參照例1、試驗例2~9，及先前技術文獻記載之抗人類IL-36R之抗IL-36R抗體B3、APE6060，及C73C5。結果示於下表(試驗例1及同型控制組為n=1或n=2、其他均為n=2之解析值)。就於最大阻礙濃度(100nM、抗體最高處置濃度)下NFkB Signal%未到達50%之抗體而言，係將評估結果記載為NA。
Figure 02_image043
Figure 02_image045
Figure 02_image047
Figure 02_image049
同型控制組，未阻礙所有的IL-36R致效劑之訊息。試驗例1~9之抗體，阻礙全部的IL-36α及IL-36γ之訊息，但與先前技術文獻之抗體不同地，未阻礙IL-36β之訊息。
[實施例18]抗IL-36R抗體之穩定性的評估 評估用樣品(試驗例1)，係使用PBS(Thermofisher Scientific、10010023)配製為1mg/mL之濃度，該抗體之280 nm之吸光度(光徑長為10mm)為1.49。將配製為1mg/mL之抗體200μL移至以下之容器，於冷藏庫(設定為4℃：Panasonic、MPR-1411R-PJ)或細胞培養裝置(設定為37℃：Panasonic、MCO-175-PJ)之中保管30日(約1個月)。
容器 ･玻璃瓶：Amber Glass 12 x 32 ㎜ Screw Neck Vial、2 mL Volume、100/pk(Waters、186000848) ･玻璃瓶內插管：250μL不活化玻璃內插管(Agilent、5181-8872) ･蓋：Green、12 x 32 ㎜ Screw Neck Cap and PTFE/Silicone Septum、100/pk(Waters、186002130)
之後，以實施例6記載之方法，分別以終濃度50ng/mL之IL-36α、10ng/mL之IL-36β，或50ng/mL之IL-36γ刺激細胞，評估抗體之阻礙活性。抗人類IL-36R抗體及大鼠同型控制組之稀釋液，係使用以100nM為最高處置濃度，以4倍稀釋而經7階段稀釋者。將所得之數據使用GraphPad Prism( 註冊商標 ) Ver8.2.1進行解析，以log(inhibitor) vs. response-Variable slope(four parameters)進行擬合。結果示於圖15。
評估之結果，於37℃、30日之保存條件下，試驗例1之抗體，阻礙IL-36α及IL-36γ之訊息，不阻礙IL-36β之訊息，與4℃的情況相同。於37℃、30日之保存條件下，於抗體之IL-36R訊息阻礙活性之強度及訊息阻礙之特異性亦未見到變化。由上述結果，可認為該抗體之序列係穩定性優良。 [產業上之可利用性]
本發明可利用於與IL-36R之特定訊息有關聯的疾病之治療，例如自體免疫疾病或癌等之治療，其產業上之意義極大。
[圖1]圖1為比較人類IL-36α、β及γ之活性型之胺基酸序列所顯示之序列比對(sequence alignment)之圖。 [圖2]圖2為顯示人類IL-36R之胺基酸序列之圖。 [圖3]圖3為示意性顯示人類IL-36R之立體構造之圖。 [圖4-1]圖4-1及圖4-2為將包含訊息胜肽之人類IL-36R之胺基酸序列，與食蟹猴、恆河猴、小鼠及大鼠的IL-36R之胺基酸序列比較所顯示之序列比對之圖。 [圖4-2]同上。 [圖5A]圖5A為顯示確認穩定表現人類IL-36R之細胞株中之人類IL-36R之表現的結果之圖。 [圖5B]圖5B為顯示確認293A細胞中之人類IL-1RAcP之表現的結果之圖。 [圖5C]圖5C為顯示確認人類IL-36R功能評估細胞中之IL-36R之表現的結果之圖。 [圖5D]圖5D為顯示確認人類IL-36R功能評估細胞中之IL-1RAcP之表現的結果之圖。 [圖6]圖6為顯示抗IL-36R抗體之結合篩選及IL-36α所致刺激時之訊息阻礙篩選的結果之圖。 [圖7A]圖7A為顯示藉由篩選所選出的抗IL-36R抗體當中，相對於IL-36α之訊息阻礙而言，IL-36β之訊息阻礙的結果之圖。 [圖7B]圖7B為顯示藉由篩選所選出的抗IL-36R抗體當中，相對於IL-36α之訊息阻礙而言，IL-36γ之訊息阻礙的結果之圖。 [圖8]圖8為顯示篩選不阻礙IL-36β訊息之IL-36R中和抗體的結果之圖。 [圖9]圖9為顯示試驗例1之IL-36R訊息特異性阻礙抗體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列之圖。 [圖10-1]圖10-1及圖10-2為顯示對於人類IL-36R之變異體1~6的參照例1及2以及試驗例1之抗體的用量反應曲線之圖。 [圖10-2]同上。 [圖11]圖11(a)~(c)為顯示由試驗例1以及參照例1及2之融合瘤培養上清液所純化的抗體之IL-36R訊息阻礙活性的評估結果之圖。(a)IL-36α、50ng/mL、(b)IL-36β、10ng/mL、(c)IL-36γ、50ng/mL。 [圖12]圖12(a)~(c)為顯示試驗例1以及參照例1及2的重組抗體之IL-36R訊息阻礙活性的評估結果之圖。(a)IL-36α、50ng/mL、(b)IL-36β、50ng/mL、(c)IL-36γ、50ng/mL。 [圖13]圖13(a)~(c)為顯示試驗例1及參照例1的重組抗體之IL-36R訊息阻礙活性的評估結果之圖。(a)IL-36β、2ng/mL、(b)IL-36β、10ng/mL、(c)IL-36β、250ng/mL。 [圖14]圖14(a)~(c)為顯示試驗例1及參照例1的重組抗體之IL-36R訊息阻礙活性的評估結果之圖。(a)IL-36α、50ng/mL、(b)IL-36β、10ng/mL、(c)IL-36γ、50ng/mL。 [圖15]圖15(a)~(c)為顯示將試驗例1之重組抗體於冷藏(4℃)及37℃保管30日(約1個月)後之IL-36R訊息阻礙活性的評估結果之圖。(a)IL-36α、50ng/mL、(b)IL-36β、10ng/mL、(c)IL-36γ、50ng/mL。
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Claims (28)

  1. 一種抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其係針對人類IL-36R之抗體或其片段，或該等之衍生物，其中，於3種之人類IL-36R致效劑配位體IL-36α、β及γ當中，對至少1種之配位體的訊息之50%阻礙濃度(IC50 )，為對其他至少1種之配位體的訊息之50%阻礙濃度(IC50 )之10倍以上。
  2. 如請求項1之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中於使用了IL-36R表現細胞之Cell ELISA中，顯示1×10-7 M以下之50%效果濃度(EC50 )。
  3. 如請求項1或2之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中對人類IL-36R致效劑配位體IL-36β之訊息的50%阻礙濃度，為對人類IL-36R致效劑配位體IL-36α及γ之訊息的50%阻礙濃度之10倍以上。
  4. 如請求項1或2之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中人類IL-36R致效劑配位體IL-36α及γ之訊息的阻礙為50%以上，且IL-36β之訊息的阻礙為未達50%。
  5. 如請求項3或4之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中於0.2ng/mL以上之濃度中，IL-36β之訊息之50%阻礙濃度為10×10-8 M以上。
  6. 如請求項1~5中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其係結合於人類IL-36R之結構域I。
  7. 如請求項1~6中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其係於人類IL-36R之胺基酸序列(序列編號11)中，結合於由自N末端起第1~8號之胺基酸殘基所構成的區域、由第25~32號之胺基酸殘基所構成的區域，及由第81~88號之胺基酸殘基所構成的區域當中至少2個區域。
  8. 如請求項1~7中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其係於人類IL-36R之胺基酸序列(序列編號11)中，結合於自N末端起第4號之離胺酸殘基及第28號之異白胺酸殘基。
  9. 如請求項1~8中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其至少包含重鏈可變序列，且前述重鏈可變序列， (1)包含作為CDR-H1序列的 (1a)序列編號23或25(XH001或XH002)之胺基酸序列、 (1b)與前述(1a)之胺基酸序列具有至少80%以上之相似性的胺基酸序列，或 (1c)前述(1a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列； (2)包含作為CDR-H2序列的 (2a)由序列編號27、29、31及213(XH003~XH005及XH007)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (2b)與前述(2a)之胺基酸序列具有至少88%以上之相似性的胺基酸序列，或 (2c)前述(2a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列； (3)包含作為CDR-H3序列的 (3a)由序列編號33、215及217(XH006、XH008及XH009)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (3b)與前述(3a)之胺基酸序列具有至少83%以上之相似性的胺基酸序列，或 (3c)前述(3a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
  10. 如請求項9之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中前述重鏈可變序列之框架序列，含有人類或包含猴子、小鼠或大鼠之非人類動物的免疫球蛋白之各類型的框架序列。
  11. 如請求項9或10之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中前述重鏈可變序列，包含 (a)由序列編號45(Pro000713v)、序列編號47(Pro000722v)、序列編號49(Pro001558v)、序列編號51(Pro001562v)、序列編號53(Pro001554v)、序列編號55(Pro001566v)、序列編號57(Pro001570v)、序列編號59(Pro001574v)、序列編號177(Pro002817v)、序列編號181(Pro002818v)，及序列編號185(Pro002819v)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (b)與前述(a)之胺基酸序列具有至少80%以上之相似性的胺基酸序列，或 (c)前述(a)之胺基酸序列中1~12個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
  12. 如請求項1~11中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其至少包含輕鏈可變序列，且該輕鏈可變序列， (1)包含作為CDR-L1序列的 (1a)由序列編號35、37及219(XL001、XL002及XL006)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (1b)與前述(1a)之胺基酸序列具有至少84%以上之相似性的胺基酸序列，或 (1c)前述(1a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列； (2)包含作為CDR-L2序列的 (2a)由序列編號39、41及221(XL003、XL004及XL007)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (2b)與前述(2a)之胺基酸序列具有至少85%以上之相似性的胺基酸序列，或 (2c)前述(2a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列； (3)包含作為CDR-L3序列的 (3a)由序列編號43、223及225(XL005、XL008及XL009)中選擇的任1者之胺基酸序列、 (3b)與前述(3a)之胺基酸序列具有至少88%以上之相似性的胺基酸序列，或 (3c)前述(3a)之胺基酸序列中1或2個胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
  13. 如請求項12之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中前述輕鏈可變序列，進一步含有人類或包含猴子、小鼠或大鼠之非人類動物的免疫球蛋白之各類型的框架序列。
  14. 如請求項12或13之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中前述輕鏈可變序列，包含 (a)由序列編號61(Pro000714v)、序列編號63(Pro001332v)、序列編號65(Pro001333v)、序列編號67(Pro001334v)序列編號179(Pro002821v)、序列編號183(Pro002823v)，及序列編號187(Pro002822v) 中選擇的任1者之胺基酸序列、 (b)與前述(a)之胺基酸序列具有至少80%以上之相似性的胺基酸序列，或 (c)前述(a)之胺基酸序列中1~10個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
  15. 如請求項1~14中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其中重鏈恆定區域及/或輕鏈恆定區域，為人類或包含小鼠、大鼠或猴子之非人類動物的免疫球蛋白之各類型中之恆定區域。
  16. 如請求項1~15中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物，其係Fab、scFv、Diabody或雙特異性抗體，或該等之衍生物。
  17. 一種核酸分子，其係由編碼如請求項1~16中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物的多核苷酸序列所構成。
  18. 一種選殖載體或表現載體，其包含至少一個如請求項17之核酸分子。
  19. 一種重組體細胞，其係導入有如請求項18之載體。
  20. 一種用以製造如請求項1~16中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物之方法，其包含培養如請求項19之重組體細胞。
  21. 一種醫藥組成物，其含有選自由如請求項1~16中任一項之抗人類IL-36R抗體或其片段，或該等之衍生物、如請求項17之核酸分子、如請求項18之載體，及如請求項19之重組體細胞所成之群的1或2者以上。
  22. 如請求項21之醫藥組成物，其係對人類投予而調節或修飾免疫反應。
  23. 如請求項21或22之醫藥組成物，其係對人類以1週1次以下之頻率投予。
  24. 如請求項21~23中任一項之醫藥組成物，其係使用於脊椎動物之癌或自體免疫疾病之治療及/或預防。
  25. 如請求項21~24中任一項之醫藥組成物，其進一步含有藥學上容許之稀釋劑、藥物載體，及/或其他添加劑。
  26. 如請求項21~25中任一項之醫藥組成物，其進一步含有第2活性成分。
  27. 如請求項26之醫藥組成物，其中前述第2活性成分，為選自由氮卓斯汀(azelastine)、歐查妥邁(oxatomide)、美喹他嗪(mequitazine)、非索非那定(fexofenadine)、依匹斯汀(epinastine)、依巴斯汀(ebastine)、西替利嗪(cetirizine)、左西替利嗪(levocetirizine)、貝波他汀(bepotastine)、依美斯汀(emedastine)、奧洛他定(olopatadine)、氯雷他定(loratadine)、左卡巴斯汀(levocabastine)、奧扎格雷(ozagrel)、塞拉司特(seratrodast)、雷馬曲班(ramatroban)、普鲁斯特(pranlukast)、蒙特魯卡斯特(montelukast)、扎魯斯特(zafirlukast)、甲磺斯特(suplatast)、苯海拉明(diphenhydramine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、二苯基比拉林(diphenylpyraline)、克雷滿汀(clemastine)、氯菲安明(chlorpheniramine)、屈普利汀(triprolidine)、普美苯噻肼(promethazine)、阿利馬嗪(alimemazine)、苯羥乙嗪(hydroxyzine)、同氯克利定(homochlorcyclizine)、塞浦西他啶(cyproheptadine)、美沙拉嗪(mesalazine)、干擾素貝他1b、干擾素貝他1a、芬格莫德(fingolimod)鹽酸鹽、那他珠單抗(natalizumab)、格拉默(glatiramer)乙酸鹽、富馬酸二甲酯、依曲替酯(etretinate)、他克莫司(tacrolimus)、巰基嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)，及阿普密蘭特(apremilast)所成之群的1者以上。
  28. 如請求項26或27之醫藥組成物，其中前述第2活性成分，為選自由皮質類固醇、止吐藥、昂丹司瓊(ondansetron)鹽酸鹽、格拉司瓊(granisetron)鹽酸鹽、美多普胺(metroclopramide)、多潘立酮(domperidone)、氟哌啶醇(haloperidol)、賽克利嗪(cyclizine)、蘿拉西泮(lorazepam)、普洛陪拉幸(prochlorperazine)、地塞米松(dexamethasone)、左美丙嗪(levomepromazine)、托烷司瓊(tropisetron)、癌疫苗、GM-CSF阻礙藥、GM-CSF、DNA疫苗、基於細胞之疫苗、樹狀細胞疫苗、重組病毒疫苗、熱休克蛋白質(HSP)疫苗、同質性腫瘤疫苗、自體腫瘤疫苗、止痛藥、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、三水楊酸膽鹼鎂、羥可待酮(oxycodone)鹽酸鹽、抗血管新生藥、抗血管藥、抗PD-1抗體、納武利尤單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、替雷利珠單抗(tislelizumab)、抗PD-L1抗體、阿替利珠單抗(atezolizumab)、阿維單抗(avelumab)、度伐利尤單抗(durvalumab)、抗CTLA4抗體、伊匹木單抗(Ipilimumab)、抗CD20抗體、利妥昔單抗(rituximab)、抗HER2抗體、曲妥珠單抗(trastuzumab)、抗CCR4抗體、莫加木珠單抗(mogamulizumab)、抗VEGF抗體、貝伐珠單抗(bevacizumab)、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體片段、抗TWEAK抗體、抗TWEAK受體抗體、可溶性TWEAK受體片段、AMG 706、AMG 386、抗α4β7抗體、貝伐珠單抗(bevacizumab)、維多珠單抗(etrolizumab)、抗SIRPα抗體、抗CD40抗體、抗CD40L抗體、抗增殖藥、法尼基(farnesyl)蛋白質轉移酶阻礙藥、αvβ3阻礙藥、αvβ5阻礙藥、p53阻礙藥、Kit受體阻礙藥、ret受體阻礙藥、PDGFR阻礙藥、生長激素分泌阻礙藥、血管生長素(angiopoietin)阻礙藥、腫瘤浸潤巨噬細胞阻礙藥、c-fms阻礙藥、抗c-fms抗體、CSF-1阻礙藥、抗CSF-1抗體、可溶性c-fms片段、培維索蒙(pegvisomant)、吉西他濱(gemcitabine)、帕尼單抗(panitumumab)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、TNFα阻礙劑、IL-17A阻礙劑、IL-17F阻礙劑、IL-17RA阻礙劑、IL-23p19阻礙劑、IL-23p40阻礙劑及IL-1RAcP阻礙劑，及SN-38所成之群的1者以上。
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