BRPI0619424A2 - uso de inibidores c-met/hgfrs para a fabricação de medicamentos - Google Patents

Abstract

USO DE INIBIDORES c-Met/HGFRs PARA A FABRICAçãO DE MEDICAMENTOS. A presente invenção se refere ao uso de (R)-3-[1-(2,6-Dicloro-3-flúor-fenil)-etóxi]-5-(1-piperidin-4-il-lH-pirazol-4-i l)-piridin-2-ilamina, um novo inibidor c-Met/HGFR, para o tratamento do desenvolvimento celular anormal em mamíferos. Em particular, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de mamíferos que sofrem com câncer.

Description

"USO DE INIBIDORES C-Met/HGFRs PARA A FABRICAÇÃO DE MEDICAMENTOS"

O presente pedido reivindica os benefícios do pedido U. S. Provisório de No. 60/742,766 depositado em 5 de Dezembro de 2005, e do pedido U. S. Provisório de No. 60/864, 637 depositado em 7 de Novembro de 2006, os conteúdos dos quais se encontram aqui incorporados por referência em suas totalidades.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere ao uso do inibidor c-Met/HGFRs para o tratamento de desenvolvimento celular anormal em mamíferos. Em particular, a presente invenção proporciona métodos de tratamento a mamíferos que sofrem de câncer.

Antecedentes da Invenção

O composto (R)-3-[1-(2,6-Dicloro-3-flúor-fenil)- etoxi]-5-(l-piperidin-4-il-1H-pirazol-4-il)-piridin-2- ilamina representado pela fórmula 1,

é um potente inibidor de pequena molécula de c-Met/HGFR (receptor de fator de crescimento de hepatócito) quinase e atividade de ALK (quinase de linfoma anaplástico). O composto 1, apresenta propriedades anti-tumor que são farmacologicamente mediadas através da inibição de c- Met/HGFR que está envolvida na regulação do desenvolvimento e progressão metastática de uma grande variedade de tipos de tumor, e ALK que está implicada na patogênese de ALCL (linfoma de célula grande anaplástica). O composto 1 é descrito no pedido de Patente Internacional No. PCT/IB200 5/0028 37 e pedido de patente U.S. No. 11/212,331, ambos os quais se encontram aqui incorporados por referência em suas totalidades. Adicionalmente, o racemato do composto 1 é descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/IB05/002695 e Pedido de Patente U.S. No. 11/213, 039, ambos os quais se encontram aqui incorporados por' referência em suas totalidades.

Os cânceres Humanos compreendem uma estrutura diversa de doenças que coletivamente é uma das causas principais de morte em paises desenvolvidos através do mundo (American Câncer Society, Câncer Facts e Figuras 2005. Atlanta: American Câncer Society; 2005). A progressão dos cânceres é ocasionada por uma série complexa de múltiplos eventos genéticos e moleculares incluindo mutações genéticas. e translocações cromossômicas, e anormalidades cariotipicas (Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of câncer. Célula 2000; 100: 57-70). Embora as causas genéticas de câncer sejam não só diversas como complexas, cada tipo de câncer foi observado exibir traços comuns e capacidades adquiridas que facilitam a sua progressão. As referidas capacidades adquiridas incluem o desenvolvimento celular desregulado, capacidade sustentada de recrutar vasos sangüíneos (isto . é, angiogênese), e capacidade da célula tumoral de se espalhar localmente assim como metástase a campos de órgãos secundários (Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of câncer. Célula 2000; 100: 57 - 70). Portanto, a capacidade de identificar novos agentes terapêuticos que: 1) inibem os alvos moleculares que são alterados durante a progressão do câncer ou 2) processos de múltiplos alvos que são comuns à progressão do câncer em uma variedade de tumores, apresentam uma necessidade significativa não alcançada.

Uma literatura extensa indica que c-Met/HGFR é uma das RTKs mais freqüentemente mutadas ou de outro modo anormalmente ativada em diversos cânceres humanos (Christensen JG, Burrows J, Salgia R. c-Met as a target in human câncer e characterization of inhibitors for therapeutic intervention. Câncer Letters 2005; 225: 1 26). Os tipos de tumor nos quais a c-Met/HGFR foi reportada estar geneticamente alterada por mutação ou amplificação de gene inclui mas não são limitados a, indicações oncológicas com uma forte necessidade médica não alcançada tal como renal, colo-retal metastático, glioma, células pulmonares não pequenas, gástrico, e câncer de cabeça e pescoço (Christensen JG, Burrows J, Salgia R. c-Met as a target in human câncer e characterization of inhibitors for therapeutic intervention. Câncer Letters 2005; 225:1 - 26) . As mutações HGFR estiveram implicadas no carcinoma renal carcinoma (Ver, por exemplo, L. Schmidt, K. Junker, N. Nakaigawa, T, Kinjerski, G. Weirich, M. Milter, et al., Novel mutations of the MET proto-oncogene in papiUary renal carcinomas, Oncogene 1999; 18: 2343 - 2350; L. Schmidt, F. M. Dun, F. Chen, T. Kishida, G. Glenn, P. Choyke, et al., Germ Iine e somatic mutations In the tirosina quinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Nat. Genet. 1997; 16: 68 - 73; L. Schmidt, K. Junker, G. Weirich, G. Glenn, P. Choyke, I. Lubensky, et al., .Two North American families com hereditary papillary renal carcinoma e identical novel mutations in the MET proto-oncogene, Câncer Res. 1998; 58:1719 - 1722). As mutações HGFR estiveram relacionadas ao carcinoma de cabeça e pescoço (Ver, por exemplo, M.F, Di Renzo, M. Olivero, T. Martone, A. Maffe, P. Maggiora, A.D. Stefani, et al., Somatic mutations of the MET oncogene são selected during metastática spread of human HNSC carcinomas, Oncogene 2000; 19: 1547 - 1555; D. M. Aebersold, O. Landt, S. Berthou, G. Gruber, K. T. Beer, R.H. Greiner, Y. Zimmer, Prevalence e clinicai impact of Met Y1253D-activating point mutation in radiotherapytratadas squamous célula câncer of the ore- farynx, Oncogene 2003; 22: 8513 - 8523). As mutações HGFR estiveram relacionadas a carcinoma de pulmão (Ver, por exemplo,. P.C. Ma, T. Kijima, G. Maulik, E.A. Fox, M. Sattler, J.D. Griffin, et al., c-MET mutational analisis in small Iung câncer cell: novel juxtamembrane domain mutations regulating cytoskeletal functions, Câncer Res. 2003; 63: 6272 - 6281; P.C. Ma, S. Jagdeesh, R. Jagadeeswaran, EA Fox, J.G, Christensen, G. Maulik, et al., c-MET expression/activation, functions, e mutations in câncer de pulmão de células não pequenas, Proc. Am. Assoc. Câncer Res. 2004; 63:1875.

Adicionalmente, as mutações HGFR estiveram implicadas em outras indicações incluindo mas não são limitados a, carcinomas hepatocelular da infância, câncer gástrico humano, câncer de estômago do tipo cirrose, câncer colo-retal, e melanoma maligno. (Ver, por exemplo, W.S. Par k, S. M. Dong, S.Y. Kim, E. Y. Na, M.S. Shin, J.H. Pi, et al., Somatic mutations in the quinase domain of the Met/receptor de fator de crescimento de hepatócito gene in childhood hepatocelular carcinomas, Câncer Res. 1999; 59: 307 - 310;' J.H. Lee, S.U. Han, H. Cho, B. Jennings, B. Gerrard, M. Dean, et al., A novel germ line juxtamembrane Met mutation in human' gastric câncer, Oncogene 2000; 19:4947-4953; A. Lorenzato, M. Olivero, S. Patane, E. Rosso, A. Oliaro, P.M. Comoglio, M. F. Di Renzo, Novel somatic mutations of the MET oncogene in human carcinoma metastases activating cell motility e invasão, Câncer Res. 2002; 62: 7025-7030; H. Kuniyasu, W. Yasui, Y. Kitadai, H. Yokozaki, H. Ito, E. Taharav Frequent amplification of the c-met gene in scirrhous type stomach câncer, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992; 189:227 - 232; M. F. Di Renzo, M. Otivero, A. Giacomini, H. Porte, E. Chastre, L. Mirossay, et al., Overexpression e amplification of the met/HGF receptor gene during the progression of colorectal câncer, Clin. Câncer Res. 1995; 1:147 - 154; T. Hara, 5 A. Ooi, M. Kobayashi, M. Mai, K. Yanagihara, I. Nakanishi, Amplification of c-myc, K-sam, e c-met in gastric cancers: detection by fluorescence in situ hybridization, Lab. Invest. 1998; 78:1143 - 1153).

A relação das mutações HGFR para função e potencial oncogênico foi também estabelecida (Ver, por exemplo, M. Jeffers, L Schmidt, N. Nakaigawa, C.P. Webb, G. Wetrich, T. Kishida, et al., Activating mutations for the met tyrosine quinase receptor in human câncer, Proc. Natl. Acad. Scl. USA 1997; 94: 11445 - 11450; M. Jeffers, M. Fiscélulaa, C.P. Webb, M. Anver, S. Koochekpour, G.F. Vande Woude, The mutationaily activated Met receptor mediates motility e metastasis, Proc. Natl. Acad. Set. USA 1998; 95:14417 - 14422).

Finalmente, as mutações HGFR estiveram implicadas em um estudo em tumors de rato (Ver, por exemplo, H. Takayama, W.J. LaRochelle, R. Sharp, T. Otsuka, P. Kriebel, M. Anver, et al., Diverse tumorigenesis associated com aberrant development in mice overexpressing hepatocite growth factor/scatter factor, Proc. Natl Acad. Sei. USA 1997; 94: 701 - 706; T. Otsuka, H. Takayama, R. Sharp, G. Célulai, W.J. LaRochelle, D.P. Bottaro, et al., c-Met autocrine activation induces development of malignant melanoma e acquisition of the metastática phenotype, Câncer Res. 1998; 58: 5157 - 5167; M.I. Gallego, B. Bierie, L. Hennighausen, Targeted expression of HGF/SF in mouse mammary epithelium leads to metastática adenosquamous carcinomas through the activation of multiple signal transduction pathways, Oncogene 2003; 22: 8498 - 8508; C.R. Graveel, Y. Su, L.M. Wang, M. Fiscélulaa, T. Lino, c.

Birchmèier, et al., Tumorigenic effects of activating Met mutations in a knock-in mouse model, Proc. Am. Assoc. Câncer Res. 2004; 44: 5102).

NPM-ALK, uma variante de proteína de fusão oncogênica da quinase de linfoma anaplástico, que resulta da translocação cromossômica está implicada na patogênese de linfoma de células grandes anaplásticas humanas (Pulford K, Morris SW, Turturro F. Quinase de linfoma anaplástico proteínas in growth control and câncer. J Célula Physiol 2004; 199: 330 - 58). Os papéis da expressão aberrante das proteínas quiméricas ALK constitutivamente ativas foi bem definido (Weihua Wan, et al., Quinase de linfoma anaplástico activity is essential for the proliferation e survival of linfoma de células grandes anaplásticas células. Blood First Edition Paper, prepublished online October 27, 2005; DO) 10. 1182/b.lood- 2005-08-3254).

A ativação inapropriada de c-Met/HGFR (incluindo c-Met do tipo selvagem) está também implicada na desregulação dos processos oncogênicos de múltiplos tumores tais como mitogênese, sobrevivência, angiogênese, desenvolvimento invasivo, e em especial nos processos metastáticos (Christensen et al, 2005). Adicionalmente, a expressão de c-Met e HGF, seu ligante único de alta afinidade, foi demonstrada se correlacionar cora o pobre prognóstico ou a progressão metastática em uma série de grandes cânceres humanos (Christensen et al, 2005). NPM-ALK está implicada na desregulação da proliferação celular e apoptose em Células de linfoma ALCL (Pulford et al., 2004).

Sumário da Invenção

Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratar crescimento celular anormal em um mamífero em necessidade do referido tratamento compreendendo, administrar ao referido mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula 1:

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ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Em outra modalidade, o mamífero é um ser humano. Em outra modalidade, o mamífero é um canino.

Em outra modalidade, o crescimento celular anormal é mediado por pelo menos uma tirosina quinase geneticamente alterada. Em outra modalidade, o crescimento celular anormal é mediado por quinase receptora de fator de crescimento de hepatócito (c-Met/HGFR) ou quinase de linfoma anaplástico (ALK). Em outra modalidade, o crescimento celular anormal é mediado por quinase receptora de fator de crescimento de hepatócito (c-Met/HGFR). Em outra modalidade, o crescimento celular anormal é mediado por quinase de linfoma anaplástico (ALK).

Em outra modalidade, o crescimento celular anormal é câncer. Em outra modalidade, o câncer é selecionado a partir de câncer de pulmão, câncer de osso, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intra-ocular, câncer de útero, câncer de ovário, câncer do reto, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do cervix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin's, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, câncer da próstata, leucemia crônica ou aguda, linfomas Iinfociticos, câncer da bexiga, câncer dos rins ou do ureter, carcinoma de célula renal, carcinoma da pélvis renal, neoplasmas do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário do SNC, tumores do eixo espinhal, glioma da haste cerebral, adenoma de pituitária, e combinações dos mesmos.

Ainda em uma outra modalidade, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) , carcinoma de células escamosas, câncer de próstata hormônio- refratário, carcinoma de célula papilar renal, adenocarcinoma colo-retal, neuroblastomas, linfoma de células grandes anaplásticas (ALCL) e câncer gástrico.

Ainda em uma outra modalidade, o composto ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado como uma composição farmacêutica compreendendo o composto de fórmula 1 e pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de inibir a atividade de c- Met/HGFR quinãse em uma célula ao se administrar um composto de fórmula 1

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ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Ainda em uma outra modalidade, a célula é selecionada a partir do grupo que consiste em carcinoma de pulmão humano A54 9, carcinoma gástrico humano GTL-16, carcinoma de cólon humano HT29, carcinoma de cólon humano Colo205, carcinoma renal humano A498, carcinoma renal humano 786-0, carcinoma de mama humana MBA-MD-231, células epiteliais de rim de canino Madlin-Darby (MDCK), células MDCK trabalhadas por engenharia para expressar a P- glicoproteína (MDCK-MDR1), epitélio de rim de rato mlMCD3, HUVEC (células endoteliais da veia umbilical humana) , carcinoma renal Caki-l, e células N1H-3T3 trabalhadas por engenharia para expressar c-Met/HGFR do tipo selvagem humana e c-Met/HGFRs que sofreu mutação incluindo HGFR- V1092I, HGFR-HlO94R, HGFR-Y1230C, e HGFR-M1250T.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: inibição ATP-competitiva de atividade de quinase humana c-Met/HGFR recombinante pelo composto 1.

Figura 2: ratos atímicos com tumores GTL-16 estabelecidos foram administrados com o composto 1, por via oral na dose indicada ou o veiculo isoladamente por 11 dias.

Figura 2A: Estudos investigaram a inibição de fosforilação de c-Met/HGFR em GTL-16.

Figura 2B: Estudos investigaram a inibição de crescimento de tumor GTL-16.

Figura 3: ratos atimicos com tumores U87MG estabelecidos (150 mm3) foram administrados com o composto 1 por via oral na dose indicada ou veiculo isoladamente por 9 dias.

Figura 3A: Estudos investigando a inibição de crescimento de tumor.

Figura 3B: Estudos investigando a inibição de fosforilação de c-Met/HGFR. Figura 4: A administração oral diária do composto 1 a ratos atimicos portando xenoenxertos de tumor GTL-16 grande estabelecido.

Figura 4A: Regressão de xenoenxertos de tumor GTL-16 grande estabelecido em rato atimico.

Figura 4B: peso corporal de rato em seguida da administração oral diária do composto 1.

Figura 5: A administração oral diária do composto 1 a ratos atimicos portando xenoenxertos NC1-H441 estabelecidos ou de tumor PC-3 tumor.

Figura 5A: Regressão de tumor em ratos atimicos portando NCI-H441 estabelecido.

Figura 5B: Regressão de tumor em ratos atimicos portando xenoenxertos de tumor PC-3 tumor estabelecidos.

Figura 6: eficácia anti-tumor do composto 1 em um modelo de Iinfoma NPM-ALK dependente (Modelo Karpas 5 299 ALCL).

Figura 6A: Estudos investigando a inibição de crescimento de tumor.

Figura 6B: Estudos investigando a inibição de fosforilação de NPM-ALK.

Descrição Detalhada da presente invenção

A não se que de outro modo indicado, todas as referências aqui aos compostos da invenção incluem as referências aos sais, solvatos, hidratos e complexos dos mesmos, e aos solvatos, hidratos e complexos de sais dos mesmos incluindo polimorfos, estereoisômeros, e versões isotopicamente marcadas dos mesmos. Definições

Como usado aqui, a não ser que de outro modo indicado, o termo "crescimento celular anormal" se refere a crescimento celular que é independente dos mecanismos regulatórios normais (por exemplo, perda de inibição de contato).

Como usado aqui, a não ser que de outro modo indicado, o termo "tratar", significa reverter, aliviar, inibir o progresso de, ou evitar a desordem ou condição à qual o termo se aplica, ou um ou mais sintomas da "referida desordem ou condição. O termo "tratamento", como usado aqui, a não ser que de outro modo indicado, se refere ao ato. de tratar como "tratar" é definido imediatamente acima.

Como usado aqui o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" incluem os sais de adição ácida e base (incluindo os disais).

Os sais de adição ácida adequados são formados a partir de ácidos que formam sais não tóxicos. Exemplos incluem os sais de acetato, aspartato, benzoato, besilato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, borato, camsilato, citrato, edisilato, esilato, formato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hexaf lúorfosfato', hibenzato, hidrocloreto/cloreto, hidrobrometo/brometo, hidroiodeto/iodeto, isetionato, lactato, malato, maleato, malonato, mesilato, metilsulfato, naftilato, 2-napsilato, nicotinato, nitrato, orotato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrogênio fosfato/diidrogênio fosfato, sacarato, estearato, succinato, tartrato, tosilato e trifluoroacetato.

Sais de base adequados são formados a partir de bases que formam sais não tóxicos. Exemplos incluem os sais de alumínio, arginina, benzatina, cálcio, colina, dietilamina, diolamina, glicina, lisina, magnésio, meglumina, olamina, potássio, sódio, trometamina e zinco.

Para uma revisão em sais farmaceuticamente aceitáveis adequados, ver "Handbook of Farmaceutical Salts: Properties, Selection, e Use" por Stahl e Wermuth (Wiley- VCH, Weinherm, Germany, 2002), a descrição do qual se encontra aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Um sal farmaceuticamente aceitável dos compostos da presente invenção podem ser prontamente preparados ao se misturar junto soluções do composto e do ácido ou base desejado, como apropriado. O sal pode precipitar a partir da solução e ser coletado por filtragem ou pode ser recuperado por evaporação do solvente. O grau de ionização no sal pode variar de completamente ionizado a quase nãi ionizado.

Os compostos da presente invenção podem existir tanto na forma não solvatada como na solvatada. O termo 'solvato' é usado aqui para descrever um complexo molecular compreendendo o composto da presente invenção e uma ou mais moléculas solventes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, etanol. O termo 'hidrato' é empregado quando o solvente for água. Solvatos farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a presente invenção incluem os hidratos e solvatos onde o solvente de cristalização pode ser isotopicamente substituído, por exemplo, D2O, de-acetona, ds-DMS0.

A presente invenção inclui ainda os compostos isotopicamente-marcados, os quais são idênticos ao composto t, exceto em que um ou mais átomos são substituídos por um átomo dotado de uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa normalmente encontrado na natureza. Exemplos dos isótopos que podem ser incorporados nos compostos da presente invenção incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre, flúor e cloro, tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 170,31P, 32P, 35S, 18F, e 10 36Cl, respectivamente. Os compostos da presente invenção e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos referidos compostos, que contêm os isótopos acima mencionados e/ou outros isótopos de outros átomos, estão dentro do âmbito da presente invenção. Determinados compostos isotopicamente marcados da presente invenção, por exemplo, aqueles nos quais os isótopos radioativos tais como 3H e 14C são incorporados, são úteis nos testes de distribuição de droga e/ou substrato de tecido. Os isótopos tritiados, isto é, os isótopos 3H, e carbono-14, isto é, 14C, são particularmente preferidos por sua facilidade de preparação e capacidade de detecção. Ademais, a substituição com isótopos mais pesados tal como deutério, isto é, 2H, pode proporcionar determinadas vantagens terapêuticas resultante de uma maior estabilidade metabólica, por exemplo, maior meia vida in vivo ou necessidades de dosagem reduzida e, consequentemente, pode ser preferido em algumas circunstâncias. O composto 1 isotopicamente marcado da presente invenção pode em geral ser preparado ao se realizar os procedimentos descritos para o composto não marcado, substituindo um reagente isotopicamente marcado prontamente disponível por um reagente não isotopicamente marcado.

Ainda incluído no âmbito da presente invenção estão os complexos tais como clatratos, complexos de inclusão hospedeiro de droga onde, diferente dos solvatos acima mencionados, a droga e o hospedeiro estão presentes em quantidades estequiométricas ou não estequiométricas. Também incluídos estão os complexos de droga contendo dois ou mais componentes orgânicos e/ou inorgânicos que podem estar em quantidades estequiométricas ou não estequiométricas. Os complexos resultantes podem ser ionizados, parcialmente ionizados, ou não ionizados. Para uma revisão dos referidos complexos, ver, J Farm Sei, 64 (8), 1269 - 1288 por Haleblian (August 1975), a descrição do qual se encontra aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Administração Oral

Os compostos da presente invenção podem ser administrados por via oral. A administração oral pode envolver a deglutição, de modo que o composto entra no trato gastrointestinal, ou a administração bucal ou sublingual pode ser empregada pela qual o composto entra na corrente sangüínea diretamente pela boca.

Formulações adequadas para a administração oral incluem as formulações sólidas tais como tabletes, cápsulas contendo particulados, líquidos, ou pós, pastilhas (incluindo preenchidas de líquido), gomas de mascar, multi- e nano-particulados, géis, solução sólida, liposoma, filmes (incluindo muco-adesivo), óvulos, sprays e formulações líquidas.

As formulações líquidas incluem suspensões, soluções, xaropes e elixires. As referidas formulações podem ser usadas como cargas em cápsulas macias ou rígidas e tipicamente incluem um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água, etanol, polietileno glicol, propileno glicol, metilcelulose, ou um óleo adequado, e um ou mais agentes emulsificantes e/ou agentes de suspensão. As formulações líquidas podem também ser preparadas por constituição de um sólido, por exemplo, a partir de um sachet.

Os compostos da presente invenção podem também ser usados em formas de dosagem de rápida dissolução, rápida desintegração tais como aquelas descritas em Expert Opinion in Therapeutic Patents, H (6), 981 - 986 por Liang e Chen (2001), a descrição do qual se encontra aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Para as formas de dosagem em tabletes, dependendo da dose, a droga pode constituir de 1 % em peso a 80 % em peso da forma de dosagem, mais tipicamente de 5 % em peso a 60 % em peso da forma de dosagem. Além da droga, os tabletes em geral contêm um desintegrante. Exemplos de desintegrantes incluem glicolato amido de sódio, carbóximetil celulose de sódio, carbóximetil celulose de cálcio, croscarmelose de sódio, crospovidona, polivinilpirrolidona, metil celulose, celulose microcristalina, hidróxipropil celulose substituída a alquila inferior, amido, amido pré-gelatinizado e alginato de sódio. Em geral, o desintegrante compreenderá de 1 % em peso a 25 % em peso, preferivelmente de 5 % em peso a 20 % em peso da forma de dosagem.

Agentes de ligação são em geral usados para proporcionar qualidades de coesão a uma formulação de tablete. Agentes de ligação adequados incluem celulose microcristalina, gelatina, açúcares, polietileno glicol, gomas naturais e sintéticas, polivinilpirrolidona, amido pré-gelatinizado, hidróxipropil celulose e hidróxipropil metilcelulose. Os tabletes podem também conter diluentes, tais como lactose (monoidrato, monoidrato seco a pulverização, anídrico e semelhante), manitol, xilitol, dextrose, sucrose, sorbitol, celulose microcristalina, amido e diidrato de fostato de cálcio dibásico.

Os tabletes podem também opcionalmente incluir agentes ativos de superfície, tais como lauril sulfato de sódio e polisorbato 80, e deslizantes tais como dióxido de silício e talco. Quando presentes, os agentes ativos de superfície são tipicamente em quantidades de cerca de 0.2 % em peso a 5 % em peso do tablete, e os deslizantes tipicamente de cerca de 0.2 % em peso a 1 % em peso do tablete.

Tabletes em geral também contêm lubrificantes tais como estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearato de zinco, estearil fumarato de sódio, e misturas de estearato de magnésio com lauril sulfato de sódio. Os lubrificantes em geral estão presentes em quantidades de cerca de 0.25 % em peso a 10 % em peso, preferivelmente de 0.5 % em peso a 3 % em peso do tablete.

Outros ingredientes convencionais incluem anti- oxidantes, colorantes, agentes aromatizantes, conservantes e agentes de mascaramento de sabor.

Tabletes exemplificativos contêm cerca de 80 % em peso da droga, de cerca de 10 % em peso a cerca de 90 % em peso de agente de ligação, de cerca de 0 % em peso a cerca de 85 % em peso de diluente, de cerca de 2 % em peso a cerca de 10 % em peso de desintegrante, e de cerca de 0.25 % em peso a cerca de 10 % em peso de lubrificante.

Misturas de tabletes podem ser comprimidas diretamente ou por rolos para formar os tabletes. As misturas de tabletes ou porções de misturas podem alternativamente ser granuladas úmidas, secas ou fundidas, congeladas por fusão, ou extrudadas antes de formação em tabletes. A formulação final pode incluir uma ou mais camadas e pode ser revestida ou não revestida; ou encapsulada.

A formulação de tabletes é discutida em maiores detalhes em "Farmaceutical dosage form: Tablets, Vol. 1", por Η. Lieberman e L. Lachman, Mareei Dekker, N.Y., N . Y . , 1980 (ISBN 0 - 8 2 4 7 - 6 918-X) , a descrição da qual se encontra aqui incorporada por referência em sua totalidade.

As formulações sólidas para a administração oral podem ser formuladas para serem de liberação imediata e/ou modificada. As formulações de liberação modificadas incluem liberação retardada-, sustentada-, pulsada-, controlada-, direcionada e programada.

As formulações de liberação modificadas são descritas em U.S. Patente No. 6,106,864. Detalhes de outras tecnologias de liberação adequadas tais como dispersões de alta energia e osmótica e partículas revestidas podem ser encontradas em Verma et al., Farmaceutical Technology On-line, 25(2), 1-14 (2001). O uso de goma de mascar para alcançar a liberação controlada é descrito em WO 00/35298. as descrições das referidas referências estão se encontra aqui incorporado por referência em suas totalidades.

Administração Parenteral

Os compostos da presente invenção podem também ser administrados diretamente na corrente sangüínea, no músculo, ou dentro de um órgão interno. Meios adequados para a administração parenteral incluem a administração intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intrasternal, intracraniana, intramuscular e subeutânea. Dispositivos adequados para a administração parenteral incluem injetores de agulha (incluindo micro agulhas), injetores livres de agulha e técnicas de infusão.

AS formulações parenterais são tipicamente soluções aquosas as quais podem conter excipientes tais como sais, carboidratos e agentes de tamponamento (preferivelmente a um pH de cerca de 3 a 9) , mas, para algumas aplicações, as mesmas podem ser mais adequadamente formuladas como uma solução não aquosa estéril ou como uma forma seca a ser usada em conjunto com um veiculo adequado tal como água livre de pirogênio estéril.

A preparação de formulações parenterais sob condições estéreis, por exemplo, por liofilização, pode prontamente ser implementada usando técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas daqueles versados na técnica.

A solubilidade dos compostos da presente invenção usados na preparação de soluções parenterais pode ser aumentada pelo uso de técnicas de formulação apropriadas, tais como a incorporação de agentes de aumento de solubilidade.

As formulações para administração parenteral podem ser formuladas pra serem de liberação imediata e/ou modificada. As formulações de liberação modificada incluem liberação retardada-, sustentada-, pulsada-, controlada-, direcionada e programada. Assim, os compostos da presente invenção podem ser formulados como um sólido, semi-sólido, ou liquido tixotrópico para administração como um depot implantado proporcionando a liberação modificada do composto ativo. Exemplos das referidas formulações incluem stents de revestidos de droga e micro esferas de PGLA.

Administração Tópica

Os compostos da presente invenção podem também ser administrados por via tópica à pele ou mucosa, ou seja, dérmica ou transdermicamente. Formulações típicas para este fim incluem géis, hidrogéis, loções, soluções, cremes, ungüentos, pós, revestimentos, espumas, filmes, adesivos de pele, lâminas, implantes, esponjas, fibras, bandagens e micro-emulsões. Liposomas podem também ser usados. Veículos típicos incluem álcool, água, óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, glicerina, polietileno glicol e propileno glicol. Intensificadores de penetração podem ser incorporados; Ver, por exemplo, J Farm Sei, 88 (10), 955 - 958 por Finnin e Morgan (Outubro de 1999). Outros meios de administração tópica incluem o envio por eletroporação,. iontoforese, fonoforese, sonoforese e injeção de micro agulha ou livre de agulha (por exemplo, Powderject™, Bioject™, etc.). As descrições das referidas referências se encontram aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

As formulações para a administração tópica podem ser formuladas para serem de liberação imediata e/ou modificada. As formulações de liberação modificada incluem liberação retardada-, sustentada-, pulsada-, controlada-, direcionada e programada.

Administração Inalada/Intranasal Os compostos da presente invenção podem também ser administrados por via intranasal ou por inalação, tipicamente na forma de um pó seco (seja isoladamente, como uma mistura, por exemplo, em uma mistura seca com lactose, ou como uma partícula componente misturada, por exemplo, misturada com fosfolipideos, tais como fosfatidilcolina) a partir de um inalador de pó seco ou como um spray aerossol de um recipiente, bomba, spray, atomizador pressurizado (preferivelmente um atomizador usando eletroidrodinâmica para produzir uma névoa fina), ou nebulizador, com ou sem o uso com ou sem o uso de um propelente adequado, tal como 1,1,1,2-tetraflúoretano ou 1, 1, 1,2,3,3,3-heptaflúorpropano . Para uso intranasal, o pó pode incluir um agente bioadesivo, por exemplo, chitosan ou ciclodextrina.

O recipiente, bomba, spray, atomizador ou nebulizador pressurizado contém uma solução ou suspensão do (s) composto (s) da presente invenção compreendendo, por exemplo, etanol, etanol aquoso, ou um agente alternativo adequado para a dispersão, solubilização, ou liberação estendida do propelente ativo, como solvente e um tensoativo opcional, tal como trioleato de sorbitano, ácido oléico, ou um ácido oligoláctico.

Antes do uso em um pó seco ou formulação de suspensão, o produto de droga é micronizado a um tamanho adequado pra o envio por inalação (tipicamente menos do que 5 mícrons) . Isto pode ser alcançado por qualquer método de cominutação apropriado, tal como trituração de jato em espiral, trituração de jato de leito fluido, processamento de fluido supercrítio para formar nanopartícuias, homogeneização de alta pressão, ou secagem por pulverização.

Cápsulas (produzidas, por exemplo, a partir de gelatina ou HPMC), embalagens tipo bolha e cartuchos para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados para conter uma mistura em pó do composto da presente invenção, uma base de pó adequada tal como lactose ou amido e um modificador de desempenho tal como 1-leucina, manitol, ou estearato de magnésio. A lactose pode ser anidrica ou na forma de monoidrato, preferivelmente o último. Outros excipientes adequados incluem dextrano, glicose, maltose, sorbitol, xilitol, frutose, sucrose e trealose.

Uma formulação de solução adequada para uso em um atomizador usando eletroidrodinâmica para produzir uma névoa fina pode conter de 1 μg a 20 mg do composto da presente invenção por acionamento e o volume de atuação pode variar de 1 μL a 100 μL. Uma formulação típica inclui o composto da presente invenção, propileno glicol, água estéril, etanol e cloreto de sódio. Solventes alternativos que podem ser usados em vez de propileno glicol incluem glicerol e polietileno glicol.

Aromatizantes adequados, tais como mentol e levomentol, ou adoçantes, tais como sacarina ou sacarina sódica, podem ser adicionados às referidas formulações da presente invenção pretendidas para administração inalada/intranasal. As formulações para administração inalada/intranasal podem ser formuladas para serem de liberação imediata e/ou modificada usando, por exemplo, ácido poli(DL-láctico-coglicólico) (PGLA). As formulações de liberação modificada incluem liberação retardada-, sustentada-, pulsada-, controlada-, direcionada e programada.

No caso de inaladores e aerossóis de pó seco, a unidade de dosagem é determinada por meio de uma válvula que envia unidades de quantidade medida de acordo com a presente invenção, são tipicamente dispostas para administrar uma dose medida ou "puff" contendo uma quantidade desejada do composto da presente invenção. A dose diária total pode ser administrada em uma única dose, ou mais usual, como doses divididas através do dia.

Administração Retal/Intravaginal

Os compostos da presente invenção podem ser administrados por via retal ou vaginal, por exemplo, na forma de um supositório, pessário, ou enema. Manteiga de cacau é uma base de supositório tradicional,' mas diversas alternativas podem ser usadas como apropriado.

Formulações pra a administração retal/vaginal podem ser formuladas para serem de liberação imediata e/ou modificada. As formulações de liberação modificada incluem liberação retardada-, sustentada-, pulsada-, controlada-, direcionada e programada.

Administração Ocular Os compostos da presente invenção podem também ser administrados diretamente ao olho ou ouvido, tipicamente na forma de gotas de uma suspensão micronizada ou solução em salina isotônica, de pH ajustado, estéril.

Outras formulações adequadas para administração ocular e aural incluem ungüentos, biodegradáveis (por exemplo, esponjas de gel absorvivel, colágeno) e não-biodegradáveis ('por exemplo, silicone) implantes, lâminas, lentes e sistemas particulados ou vesiculares, tais como niosomas ou liposomas. Um polímero tal como ácido poliacrílico reticulado, álcool polivinílico, ácido hialurônico, um polímero celulósico, por exemplo, hidróxipropil metil celulose, hidróxietil celulose, ou metil celulose, ou um polímero heteropolissacarídeo, por exemplo, goma gelano, pode ser incorporado junto com um conservante, tal como cloreto de benzalcônio. As referidas formulações podem também ser enviadas por iontoforese.

As formulações para administração ocular/aural podem ser formuladas para serem de liberação imediata e/ou modificada. As formulações de liberação modificada incluem liberação retardada-, sustentada-, pulsada-, controlada-, direcionada e programada.

Outras Tecnologias

Os compostos da presente invenção podem ser combinados com entidades macromoleculares solúveis, tais como ciclodextrina e derivados adequados da mesma ou polímeros contendo polietileno glicol, de modo a aprimorar a solubilidade dos mesmos, coeficiente de dissolução, mascaramento de sabor, bioadisponibilidade e/ou estabilidade para uso em qualquer um dos modos de administração acima mencionados.

Os complexos de droga-ciclodextrina, por exemplo, são observados ser em geral úteis pra a maior parte das formas de dosagens e vias de administração. Ambos os complexos de inclusão e de não inclusão podem ser usados. Como uma alternativa para a complexação direta com a droga, a ciclodextrina pode ser usada como um aditivo auxiliar, isto é como um veiculo, diluente, ou solubilizador. Os mais comumente usados para os referidos fins são alfa-, beta- e gama-ciclodextrinas, exemplos das quais podem encontradas nas Publicações PCT Nos. WO 91/11172, WO 94/02518 e WO 98/55148, as descrições das quais se encontram aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

Dosagem

A quantidade do composto ativo administrada dependerá do indivíduo sendo tratado, da gravidade da desordem ou condição, do coeficiente de administração, da disposição do composto e do critério do médico. Entretanto, uma dosagem eficaz está tipicamente na faixa de cerca de 0.001 mg por kg de peso corporal por dia a cerca de 100 mg por kg de peso corporal por dia, preferivelmente de cerca de 0.01 a cerca de 35 mg/kg/dia, em dose única ou dividida. Pra um indivíduo humano de 70 kg, seria uma quantidade de cerca de 0.07 mg/dia a cerca de 7000 mg/dia, preferivelmente de cerca de 0.7 mg/dia a cerca de 2500 mg/dia. Em alguns casos, os níveis de dosagem abaixo do limite inferior da faixa acima mencionada podem ser mais que adequado, enquanto que em outros casos doses ainda maiores podem ser usadas em ocasionar qualquer efeito colateral danoso, com as referidas doses maiores tipicamente dividas em diversas pequenas doses para administração através do dia.

Kit-de-Partes

Na medida em que pode ser desejável se administrar uma combinação de compostos ativos, por exemplo, com o objetivo de tratar uma doença ou condição particular, está dentro do âmbito da presente invenção que duas ou mais composições farmacêuticas, pelo menos uma das quais contém um composto de acordo com a presente invenção, pode convenientemente ser combinada na forma de um kit adequado para co-administração das composições. Assim, o kit da presente invenção inclui duas ou mais composições farmacêuticas separadas, pelo menos uma das quais contendo o composto da presente invenção, . e meios para reter separadamente as referidas composições, tais como um recipiente, frasco dividido, ou bolso laminar dividido. Um exemplo do referido kit é a embalagem do tipo bolha familiar para a embalagem de tabletes, cápsulas e semelhante.

0 kit da presente invenção é particularmente adequado para administrar diferentes formas de dosagens, por exemplo, oral e parenteral, para administrar as composições separadas em diferentes intervalos de dosagem, ou para titular as composições separadas uma em relação a outra. Para auxiliar na anuência, o kit tipicamente inclui direções para a administração e pode ser proporcionado com um auxiliar de memória.

Exemplos

Testes in vitro

Materiais e Métodos

Métodos In-Vitro

Métodos de teste de quinase bioquímica

Os valores bioquímicos Kl do composto 1 para a inibição de c-Met/HGFR quinase foram determinados utilizando o procedimento geral para monitorar a oxidação de NADH que está associada à rotação de ATP como a seguir. Os compostos e os reagentes de teste de quinase são introduzidos nas cavidades de teste e incubados por 10 minutos a 37°C. 0 teste é iniciado pela adição da enzima c- Met/HGFR. Inibidores de enzima reduzem a atividade medida da enzima. No teste espectrofotométrico contínuo-acoplado, a produção dependente de tempo do ADP pela quinase é determinada pela análise do coeficiente de consume de NADH ao se medir a redução na absorção a 340 nm. Na medida em que a enzima quinase produz ADP a mesma é re-convertida em ATP, por reação com fosfoenol piruvato e piruvato quinase. Piruvato é também produzido na referida reação. 0 piruvato é subseqüentemente convertido em lactato por reação com lactato deidrogenase, que simultaneamente converte NADH em NAD. NADH apresenta uma absorção mensurável a 340 nm enquanto que NAD não. Portanto, o ponto final do teste é medido por espectrofotometria a 340 nm nos pontos de tempo designados.

Métodos de teste de quinase de sinalização (upstate)

As quinases foram pré-diluidas em uma concentração de trabalho de IOx antes da adição no teste. Em suma, os substratos foram dissolvidos e diluídos em estoques de trabalho em água deionizada, separado de histona Hl (IOx estoque de trabalho em 20 mM de MOPS pH 7.4), PDKtide (IOx estoque de trabalho em 50mM Tris pH 7.0) e ATF2 5 (que é tipicamente armazenado a 20x de estoque de trabalho em 50 mM de Tris pH 7.5, 150 mM de NaCl, 0.1 mM de EGTA, 0.03% de Brij-35, 50% de glicerol, 1 mM de benzamidina, 0.2 mM de PMSF e 0.1% de mereaptoetanol). A enzima bioquímica de interesse foi então testada em um volume de reação final de 25 pL contendo 5 mU - 10 mU da enzima de escolha incubada com 8 mM de MOPS pH 7.0, 0.2 mM de EDTA, 50 μΜ de EAIYAAP FAKKK, 10 mM de MgAcetate e 32P-ATP (atividade específica de aproximadamente 500 cpm/pmol, concentração como necessário). A reação é iniciada pela adição da mistura MgATP. Após incubação por 40 minutos a temperatura ambiente, a reação é interrompida pela adição de 5 pL de uma solução a 3% de ácido fosfórico. 10 pL da reação é então disposta em um "filtermat" P30 e lavado por três vezes por 5 minutos in 75 mM de ácido fosfórico e uma vez em metanol antes de secagem e contagem de cintilações.

Linhagem celular As linhagens celulares utilizadas para avaliar o composto 1 em estudos in-vitro foram como a seguir: Carcinoma de pulmão humano A54 9, carcinoma gástrico humano GTL-16, carcinoma de cólon humano HT29, carcinoma de cólon humano Colo205, carcinoma renal humano A498, carcinoma renal humano 786-0, carcinoma de mama humana M6A-MD-231, células epiteliais de rim de canino Madlin-Darby (MDCK), células MDCK trabalhadas por engenharia para expressar a P-glicoproteina (MDCK-MDR1), epitélio de rim de rato mlMCD3, HUVEC (células endoteliais da veia umbilical humana), e células N1H-3T3 trabalhadas por engenharia para expressar c-Met/HGFR do tipo selvagem humana e c-Met/HGFRs que sofreu mutação incluindo HGFR-V1092I, HGFR-H1094R, HGFR-Y1230C, e HGFR-M1250T. As linhagens celulares utilizadas para avaliar a inibição da fosforilação de outras tirosina quinases foram como a seguir: células de linfoma humano KARPAS 299, SU-DHL-1, e Jurkat, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), células endoteliais macro vasculares Humanas (HMVEC), células endoteliais de aorta de porcino (PAE) trabalhadas por engenharia para expressar VEGFR2, PDGFRP, TrkA e TrkB humano; células NIH-3T3 trabalhadas por engenharia para expressar Ron, Axt, Sky e EGFR/Tie-2 chimera humano; células HEK293 IRK humano, células de ovário de Hamster Chinês (CHO-B) trabalhadas por engenharia para expressar Ron humano, células BaF3 trabalhadas por engenharia para expressar BCR-Abl humano. Todas as linhagens celulares trabalhadas por engenharia foram geradas em Pfizer, as células de carcinoma gástrico humano GTL-16 foram um presente do Dr. Paolo Comoglio (University Torino Medicai School, Candiolo, Italy), as células HUVEC e HMVEC (célula endotelial Macrovascular Humana) foram adquiridas da Clonetics, Inc. (Walkersville, MD), e as outras foram adquiridas da ATCC (Manassas, VA) . A não ser que de outro modo indicado, os reagentes de cultura celular foram obtidos a partir da Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD) . As células foram mantidas a 37 0C em uma atmosfera umidificada com 5% -10% CO2 e mantidas usando técnicas de cultura celular padrão.

Anticorpos e fatores de crescimento

Anticorpos foram utilizados para avaliar composto 1 em estudos in vitro de ELISA e Western Blot como a seguir: c-Met/HGFR anti-total humana e Zap70 anti-fosfo foram da Zymed/Invitrogen, Carlsbad, CA; Ron anti-total, FGFRlanti-total, PDGFRp anti-total, Trk anti-total, Tie-2 anti-total, e tirosina anti-fosfo tirosina (PY-20) foram da Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; Axl anti-total e c-Met/HGFR de rato anti-total foram da R&D Systems, Minneapolis, MN; IRK anti-total foi da BD Farmingen, San Diego, CA; antÍ-VEGFR2 da Novus Biologicals, Littleton, CO; anti-fosfo-c-Met/HGFR, anti-total e -fosfo ALK, c-ABL anti- total, anti-total e fosfor Gabl, anti-total e fosfo AKT, anti-total e fosfor-MAPK44/42, anti-fosfo Raf, Mekl/2, P90RSK, e STAT5 foram da Cell Signaling Technologies, Boston, MA. A maioria dos fatores de crescimento utilizados em testes de célula foram da R&D Systems, Minneapolis, MN, exceto BDGFfrom GibcoBRL/Invitrogen, Carlsbad, CA, e EGF que foram da Roche Applied Science, Indianapolis, IN.

Testes de forforilação de quinase Celular

Os testes Celulares (isto é, ELISA ou Western blot) usados para diretamente determinar a capacidade do composto 1 em inibir a fosforilação da quinase dependente de ligante ou construtiva foram realizados usando uma variedade de células desprovida de soro.

Preparação da Célula

As células foram semeadas em placas de 96 cavidades em meio de crescimento (meio suplementado com 10% de soro-FBS bovino fetal) e cultivadas durante a noite a 37°C para facilitar a fixação às placas de teste. Após a fixação, o meio de crescimento foi removido e as células foram cultivadas em meio livre de soro (com 0.04% BSA) . Diluições em série do composto 1 foram realizadas, controles apropriados ou concentrações designadas do composto 1 foram adicionados a cada cavidade, e as células foram incubadas a 370C por 1 hora. Em experimentos investigando a fosforilação de RTK dependente de ligante, fatores de crescimento correspondentes (por exemplo, HGF, MSP, Gas 6, EGF, NGF, BDNF, insulina, VEGF, ou PDGF BB) foram adicionados às células por 8 a 20 minutos. H2O2 foi usado para estimular a fosforilação de Axl humano em células HUVEC como descrito em (Konishi, A., Aizawa, T. Mohan, A., Korshunov, V. A. e Berk, B. C, Hidrogen peroxide activates the Gas6-Axl pathway in vascular smooth muscle células. The Journal of Biological Chemistry, 279:28766 - 28770 (2004)). A fosforilação de quinase constitutiva foi medida na ausência de adição de linhagens forçadas de ligantes exógenos com atividade de quinase ativa constitutiva (por exemplo, c-Met/HGFR em células GTL-16, NPM-ALK em células Karpas 299, Ron em células Ron-CHO-B, e BCR-Abl em células BCR-Abl BaF3). Após a incubação das células com o composto 1 e/ou ligantes apropriados pelo tempo designado, as células foram lavadas uma vez com 1 mM de Na3VO4 em HBSS e então lisadas usando tampão de Lisis (Célula Signaling Technologies, Boston MA).

Teste ELISA

A fosforilação de proteína quinases de interesse foi avaliada por um método ELISA de sanduíche utilizando a captura de anticorpos específicos para cada proteína e a detecção de anticorpos específicos para resíduos de tirosina fosforilados. Em cada teste ELISA, os lisados de proteína gerados a partir das diversas linhagens celulares tratadas com ligantes RTK apropriados e/ou composto 1 foram transferidas para uma placa de 96 cavidades que foi pré- revestida com os anticorpos correspondentes incluindo anti- c-Met/HGFR, -Ron, -Axl, -Skyf -IR, -Tie2, -KDR, -PDGFR (3, -Zap70, e etc. As placas revestidas de anticorpos foram incubadas na presença de lisados de proteína a 40C durante a noite e lavadas com 1% Tween 20 em PBS por sete vezes. HRP-PY20 (fosfotirosina -anti-total conjugada de peroxidase de rábano silvestre, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foi diluída 1:500 em tampão de bloqueio (Pierce, Rockford, IL) e e adicionada a cada placa por 30 minutos. As placas foram então lavadas de novo e substrato de peroxidase TMB (Bio-Rad laboratories, Hercules CA) foi adicionado para iniciar a reação colorimétrica HRP- dependente. A reação foi interrompida ao se adicionar 0.09N H2SO4. As placas foram medidas a OD- 450 nm usando um espectrofotômetro. Os valores de ICS0 foram calculados por adaptação de curva de concentração- resposta utilizando um método analítico de quatro parâmetros em um modelo com base em Excel.

Western Blot

A capacidade do composto 1 de inibir a fosforilação de quinase celular foi também medida por método de Western Blot. As células foram tratadas com diluições do composto 1 em meio livre de soro e lisados para extração de proteína como descrito acima. Os lisados celulares foram normalizados para concentração de proteína por teste BSA (Pierce, Rockford, IL) e anticorpos específicos foram usados para imunoprecipitar as proteínas de interesse. As proteínas imunoprecipitadas foram separadas por SDS-PAGE e método de Western Blot com anticorpos anti-fosfotirosina foi realizado para determinar os níveis relativos de proteínas fosforilada em cada concentração de droga. O referido método de Western Blot foi também usado para determinar os níveis totais de proteína para as moléculas de interesse.

Proliferação celular e testes de sobrevivência Teste de Proliferação celular

Células de tumor foram semeadas em placas de 96 cavidades em baixa densidade em meio de crescimento (meio suplementado com 10% de soro-FBS bovino fetal) e cultivadas durante a noite a 37°C. No dia seguinte, o meio de crescimento foi removido e as células foram cultivadas em meio livre de soro (0% FBS e 0.04% BSA). Diluições em série do composto 1 foram realizadas, controles apropriados ou concentrações designadas do composto 1 foram adicionados a cada cavidade, e as células foram incubadas a 37°C por 24 horas a 72 horas. Um teste MTT (Promega, Madison, Wl) foi então realizado para determinar os números celulares relativos. Os valores IC50 foram calculados por adaptação de curva de concentração-resposta utilizando um método analítico de quatro parâmetros.

Apoptose/teste de sobrevivência de CeH

Células GTL-16 foram semeadas em placas de 96 cavidades a 40,000 células/cavidade. Concentrações designadas de PF-02341066 ou veículo foram adicionados às cavidades em meio livre de soro. As células foram incubadas a 37°C, 5% CO2 Por 48 horas. 0 kit de ssDNA Apoptose ELISA (Chemicon International) foi usado para detectar a apoptose.

Teste de sobrevivência de HUVEC HGF-estimulada

Células HUVEC (passagem 3) foram desenvolvidas em confluência em meio EGM2 (Walkersville, MD). As células foram semeadas em placas de 96 cavidades em meio EGM2 em alta densidade (20,000 a 30,000/cavidade) e incubadas por 5 horas a 6 horas para permitir a fixação celular. Após a fixação, as células foram cultivadas em meio livre de soro (Cell Applications, San Diego, CA) durante a noite a 37°C a 5% CO2. o dia seguinte, as células foram expostas a Meio de privação (Cell Applications, San Diego, CA) por 5 horas. O composto 1 foi diluído em série em meio livre de soro e controles apropriados ou concentrações designadas do composto 1 foram adicionados a cada cavidade. Após 1 hora, HGF recombinante humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) foi adicionado a 40 cavidades designadas pra alcançar uma concentração final de 100 ng/mL. Um teste MTT (Promega) foi então realizado após 48 horas a 72 horas para determinar os números celulares relativos. Os valores IC50 foram calculados por adaptação de curva de concentração-resposta utilizando um método analítico de quatro parâmetros.

Teste de invasão e migração de célula dependente de HGF5

Testes de invasão de matriqel e migração de célula NCI-H441

O efeito do composto 1 em invasão matrigel e migração celular de carcinoma de pulmão de células não pequenas NCI-H441 HGF-estimuladas foi determinada utilizando um sistema de invasão e migração celular comercialmente oferecido (BD Biosciences, San Jose, CA) . Células em fase de crescimento Iog foram tripsinizadas e suspensas em meio livre de soro (com 0.04% BSA) a uma densidade de 400,000 células/mL. O composto 1 foi diluído em série em meio livre de soro, as concentrações designadas foram adicionados a células suspensas, e as células foram incubadas a temperatura ambiente por 30 minutos. O controle designado ou as células suspensas tratadas (0.5 raL) foram adicionados a cada câmara de migração ou invasão (isto é, dispositivo de inserção de placa). Adicionalmente, 25 ng/mL HGF (0.75 mL) foi adicionado a uma cavidade inferior de cada placa companheira como um quimioatrator para atrair as células a partir dos dispositivos de inserção da placa da câmara de migração ou invasão inseridos em cima da placa companheira e as células foram incubadas a 37 0C por 22 horas. As células que invadiram ou migraram para a cavidade inferior da placa foram então fixadas e os núcleos foram corados (1 yg/mLDAPl em 100% MeOH) por 15 minutos a 37°C. As células foram subseqüentemente lavadas duas vezes usando solução TBS. Cinco imagens de microscópio foram obtidas a partir de cada cavidade e o número de células para a migração ou invasão foi determinado sob cada condição usando o software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) . Os valores IC50 foram calculados por adaptação de curva de concentração-resposta utilizando um método analítico de quatro parâmetros.

Teste de invasão matrigel HUVEC

Um ACEA RT-CES System (ACEA biologicals, San Diego, CA) foi usado para determinar o efeito do composto 1 em invasão matrigel HUVEC in vitro. Placas ACEA de eletrosensibilização de 96 cavidades foram revestidas com 50 de 0.001% de fibronectina e 100 ng/mL de HGF em PBS e incubadas a 370C por 1 hora e a 40C por 30 minutos. Após lavagem de cada placa com PBS a 4 °C, Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) foi diluída 1:40 em Meio de privação (SM, Célula Applications, San Diego, CA) , suplementado com HGF (100 ng/mL) e/ou diferentes concentrações do composto 1, adicionadas (50 μΙΟ nas cavidades designadas, e permitidas solidificar a 37°C por 2 horas. Células HUVEC foram cultivadas em meio livre de soro (Célula Applications, San Diego, CA) por 5 horas e então em SM por 2 horas. As células foram subseqüentemente coletadas em SM a 60,000 células/mL e tratadas com 100 ng/mL de HGF e/ou apropriada do composto 1 por 30 minutos a 37°C. A suspensão de células HUVEC célula (100 uL) sob condições designadas foi transferida para a parte de cima da camada de Matrigel em placas designadas da placa ACEA revestida. A placa ACEA foi então conectada a estação de dispositivo ACEA a 37GC, 95% ar: 5% C02 e monitorada em tempo real por um Analisador Sensor ACEA por 48 horas. Sensores Eletrônicos embutidos no fundo das placas ACEA detectaram as células HUVEC que invadiram através do Matrigel. O número relativo (índice de célula) das células HUVEC invadidas foi determinado utilizando o programa ACEA RT-CES™ Integrated. Os valores IC50 foram calculados por adaptação de curva de concentração-resposta utilizando um método analítico de quatro parâmetros.

Teste de dispersão de célula MDCK Células MDCK foram semeadas em baixa densidade (25 células/cavidade) em uma placa de 96 cavidades em meio suplementado com 10% FBS e desenvolvidas até que pequenas colônias de 10 - 15 células surgissem. As células foram então estimuladas com HGF (50 ng/mL) na presença de diversas concentrações do composto 1 diluídas em meio de crescimento em meio de crescimento. Após incubação durante a noite, as colônias foram fixadas e coradas com 0.2% cristal violeta em 10% formalina tamponada avaliada quanto a dispersão visualmente a cada concentração.

Teste de germinação vascular HMVEC

Quinhentas HMVEC foram adicionadas a meio EGM-2 contendo 0.24% de metilcelulose e transferidas a Placas de 96 cavidades com fundo em U para formar esferóides durante a noite. Os esferóides foram coletados e misturados em 2 mg/mL de solução de fibrinogênio contendo 4% - 8% FBS ± o composto em placas de 48 cavidades revestidas com trombina (2 mL de 5, 000 U/mL) . O gel de fibrina 3-D resultante foi coberto com EGM-2 contendo 4% - 8% FBS e incubado a 37 °C, 95% ar/5% CO2. a formação do tubo endotelial foi observada diariamente sob microscópio invertido. As imagens foram capturadas no 7 dia por uma câmera digital (Olympus BX60) conectada ao microscópio. O composto 1 foi adicionado em diversas concentrações e a germinação vascular foi visualmente avaliada.

Ciclo celular e análise de Apoptose por citometria de fluxo O efeito do composto 1 na distribuição de ciclo celular NPM-ALK-dependente e apoptose das células de linfoma humano foi avaliado por análise de citometria de fluxo (FACSCalibur, BO Biosciences, San Jose, CA). Células Karpas 299 e SU-DHL-I de linfoma humano foram tratadas com o composto 1, por 24 a 48 horas em meio de crescimento (RPMI + 10% FBS) . As células foram lavadas com PBS duas vezes, fixadas e permeabilizadas com uma solução BDCytofix/Cytoperm por 20 minutos a 4°C. A distribuição de ciclo celular e apoptose das células de linfoma foi avaliada utilizando o kit CycloTest Plus DNA Reagent Kit (BD Biosciences). Usando o referido kit, as células foram lavadas duas vezes com Ix BD Perm/tampão de lavagem, detergente não iônico e Tripsina foram adicionados aos núcleos isolados, iodeto de propidio foi adicionado para visualizar o teor de DNA, e as células foram analisadas por citometria de fluxo. 0 teor de DNA (análise polidy para determinar o percentual de número de célula em cada ciclo celular) foi avaliado usando Célula Quest Pro e analisado com o programa ModFit LT (BD Biosciences). 0 pico apoptótico (Ao) foi definido como o pico que ocorre em números de canais inferiores ao pico G0/G1 como descrito (Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del-Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. S., Lassota, P., e Traganos, F., Cytometry 13:795 808 (1992)) . A apoptose foi também determinada por análise de citometria de fluxo usando coloração Annexin V- FITC (BD Biosciences, San Jose, CA) e também analisada usando FACSCalibur. Métodos In-Vivo

Linhagens celulares

A não ser que indicado o contrário, os reagents de cultura celular foram obtidos da Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD). As células foram mantidas a 370C em uma atmosfera umidificada com 5% - 10% de CO2 e passadas usando técnicas de cultura celular padrão. As células U87MG (glioblastoma humano), NCI-H441 (adenocarcinoma de pulmão de célula não pequena), PC-3 (adenocarcinoma de próstata humana) foram obtidas a partir de e e cultivadas como recomendado pela the American Type Culture Collection (Bethesda, MD).

Modelos de Xenoenxerto Subcutâneo em ratos atímicos

Fêmeas ou machos nu/nu ou ratos SCID/Beige (5-8 semanas de idade) foram obtidos a partir de Harlan (Madison, Wl) ou Charles River (Wilmington, MA). Os animais foram mantidos sob condições ambientais limpas em gaiolas com filtro de topo estéril com roupas de cama penteadas Alfa-Dri/bed-o-cob alojadas nas estruturas ventiladas filtradas com HEPA. Os animais receberam ração estéril para roedor e água ad libitum. As células para implantação em ratos atimicos foram coletadas e granuladas por centrifugação a 450Xg por 5-10 minutos. Os grânulos de células foram lavados uma vez e re-suspensos em salina tamponada a fosfato estéril ou meio livre de soro. Células tumorais foram suplementadas com 30% - 50% de Matrigel (BD Biosciences, San Jose CA) para facilitar a captação do tumor e o desenvolvimento de células tumorais selecionadas como xenoenxertos. As células (2-5 χ 10^6 em 100. pL) foram implantadas SC na região lateral do rato e permitidas desenvolver ao tamanho designado desejado antes da administração do composto para cada experimento. O tamanho do tumor foi determinado por medição com calibres eletrônicos e o volume do tumor foi calculado como o produto de seu comprimento χ largura2 χ 0.4.

Estudos de modulação (PK/PD) de alvo Ex Vivo Processamento de tumor e Plasma para estudos farmacodinâmicos In Vivo

As células de tumor que expressam c-Met/HGFR ou ALK constitutivamente fosforilados foram implantadas subcutaneamente em ratos nus e permitidas desenvolver não tratadas a um tamanho de 300 mm3 - 800 mm3. Aos ratos foi administrado o composto 1 como uma única dose oral (par estudos de PK/PD agudo) ou múltiplas doses orais (para estudos de PK/PD de estado sólido) nos níveis de dose designados.. Nos momentos indicados em seguida da administração do composto 1, ratos individuais foram eutanasiados humanamente, uma amostra de sangue foi isolada a partir do ventrículo cardíaco esquerdo usando uma seringa com sulfato de heparina, e os tumores foram seccionados. Amostras de plasma foram analisadas para a concentração do composto 1 usando análise LCMS. Os tumores seccionados foram congelados em gelo seco, pulverizados usando pilão e criolmofariz resfriado a nitrogênio líquido, e lisado em tampão frio de Iise de célula IX (Cell Signaling Technologies, Boston MT) ) . As proteínas foram extraídas a partir dos lisados de tumor e a concentração de proteínas foi determinada usando um teste BSA (Pierce, Rockford, IL). 0 nível de proteínas fosforiladas e/ou total de interesse em cada amostra de tumor foi determinado usando o método ELISA de captura abaixo.

Testes ELISA para a avaliação de Inibição Farmacodinâmica de Alvos de Quinase

Em cada teste ELISA, os lisados de proteína que foram gerados a partir do veículo- ou os tumores tratados com o composto 1 foram transferidas a uma placa de 96 cavidades que foi pré-revestida com ou com anti-c- Met/HGFR (Zymed Lab/Invitrogen, Carlsbad, CA) ou com anticorpos de captura de anti-ALK (Célula Signaling Technologies, Boston MT).

As placas revestidas de anticorpos foram incubadas na presença de lisados de tumor a 40C durante a noite e lavadas com 1 % Tween 20 em PBS sete vezes. HRP-PY20 (fosfotirosina anti-total conjugada a peroxidase de rábano silvestre, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foi diluída 1:500 em tampão de bloqueio (Pierce, Rockford, IL) e adicionada a cada placa por 30 minutos. As placas foram lavadas de novo e substrato de TMB peroxidase (Bio-Rad laboratories, Hercules CA) foi adicionado para iniciar a reação HRP-dependente colorimétrica. As reações foram interrompidas ao se adicionar 0.09N H2SO4. a densidade ótica (OD) de cada veículo ou cavidade de tratamento foi medida a 450 nm usando a espectrofotômetro. A fosforilação total de c-Met/HGFR ou ALK em tumores seccionados dos animais tratados com o composto 1 foi comparada com aquela em tumores seccionados dos animais tratados com veiculo no mesmo ponto de tempo com base nas leituras de OD. Com a referida avaliação, a inibição da fosforilação alvo de quinase pelo composto 1 em tumores foi calculada usando a equação a seguir: % Inibição = 100- [(Média de OD tratadas / Média de OD não tratadas) X 100].

Método de Western Blot.

0 Método de Western Blot foi também usado para determinar o status relativo da fosforilação quinase e os níveis de níveis de proteína total em amostras de tumor para a proteína de interesse. Ratos portando tumor foram tratados com diferente doses do composto 1, lisados de tumor e amostras de proteína foram preparadas como descrito acima.

Anticorpos específicos foram usados para imunoprecipitar as proteínas de interesse. As proteínas imunoprecipitadas foram separadas por SDS-PAGE e método de Western Blot com anti-fosfotirosina ou anticorpos totais.

Os anticorpos' utilizados nos estudos com o método de Western Blot foram como a seguir: c-Met/HGFR anti-total humano da Zymed/lnvitrogen, Carlsbad, CA; anti-fosfo-o- Met/HGFR, anti-total e -fosfo ALK, anti-total e fosfor Gabl, anti-total e fosfo AKT, anti-total e fosfor- MAPK4 4/4 2, STAT5 foram da Cell Signaling Technologies, Boston, MA. Implantação de mini-bomba osmótica para os estudos de infusão in vivo

Mini-bombas osmóticas de Alzet 1003D e 1007D foram adquiridas da Durect Corporation (Cupertino, CA).

As Mini-bombas foram abastecidas com soluções de concentrações designadas do composto 1, e iniciadas em solução salina estéril a 37°C até que tenham alcançado equilíbrio em 4 a 5 horas. As bombas foram cirurgicamente implantadas subcutaneamente de acordo com as instruções do fabricante na área torácica dorsal esquerda do rato portando tumores na região direita do flanco. A incisão foi fechada usando grampos cirúrgicos que foram removidos após 5-7 dias quando a incisão da pele foi completamente curada. A cirurgia de substituição de bomba foi conduzida no tempo designado para estudos que necessitavam de tempo de infusão e de volume de droga que excediam a capacidade da bomba.

Histologia de Tumor e Imunohistoquimica (IHC) Os espécimes de tumor a serem avaliados por pontos finais imunohistoquímicos foram coletados e fixados em 10% de formalina tamponada com inibidores de protease e fosfotase for 24 horas antes de serem transferidas a 70% etanol. Os espécimes de tumor foram subseqüentemente embutidos em parafina e seções de 4 μΜ foram cortadas e dispostas em lâminas de microscópio. A Desparafinização e a retirada do antígeno (com base em EDTA) foram realizadas seguindo as instruções do fabricante usando uma câmara de liberação (Biocare Medicai, Cat # DC2001). Amostras congeladas de Tumor OCT foram também coletadas e seccionadas para coloração CD-31. Para a imunocoloração, fatias foram incubadas com os anticorpos primários e então com os anticorpos secundários, e visualizadas usando seja o método colorimétrico (0A0 Envtsion-HARP, DAB kit, DAO, Carpentaria, CA), ou o método fluoremétrico (Alexa 488 ou Alexa 635, Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad CA) . Todas as seções imunocoradas foram contra-coradas usando hematoxilina. Automated Ventana Discovery XT Staining Module (Ventana Medicai Systems, Tucson, AZ) foi também usado para conduzir a coloração histológica seguindo as instruções do fabricante seguindo as instruções do fabricante. As seções coradas foram analisadas usando um microscópio Olympus e a análise quantitativa da coloração da seção foi realizada utilizando o sistema ACIS (Automated Celular Imaging, Clarient, Irvine CA) . As fatias foram também analisadas por patologistas da casa usando métodos clínicos padrão.

Os anticorpos utilizados nos estudos de imunohistoquímica incluíram anti-fosfo-c-Met/HGFR da Biosource Internationals/Invitrogen, Caribad, CA; anti-Ki67 da Dacocytomation, Carpenteria, CA; anti-CD31 da Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA.

Dados e Resultados

Potência enzimática do composto 1 contra o c- Met/HGFR RTK O composto 1 demonstrou ser um potente inibidor ATP-competitivo da atividade de quinase humana c-Met/HGFR recombinante com uma média Kl de 4 nM.

O composto 1 inibiu a atividade de quinase de c- Met/HGFR em um teste de enzima bioquímica com uma Ki de 3 nM. Para se investigar a seletividade de quinase com relação a c-Met/HGFR, o composto 1, foi adicionalmente avaliado em testes de leitura de quinase bioquímica contra um painel de > 120 quinases recombinantes. Nas referidas leituras de seletividade de quinase bioquímica preliminares, um subconjunto de quinases foi identificado contra o qual o composto 1 exibiu atividade de modo que a seletividade para c-Met/HGFR foi estimada ser menor do que 100-vezes em comparação com c-Met/HGFR. A atividade do composto 1 contra a referida quinase potencial foi adicionalmente avaliada em estudos de acompanhamento em testes de seletividade de quinase com base em célula definitiva (Tabela 1). Os valores Ki bioquímicos do composto 1 para a inibição de c-Met/HGFR quinase foram determinados por monitoramento da oxidação de NADH que está associada à rotação de ATP. Os compostos e os reagentes de teste de quinase foram introduzidos nas cavidades de teste e incubados por 10 minutos a 37°C e a reação foi iniciada ao adicionar o c-Met/HGFR. NADH foi medido por espectrofotometria a 340 nm nos pontos de tempo designados.

Seletividade de Quinase do composto 1 em testes com base em Célula A seletividade do composto 1 foi avaliada em um grupo de testes de atividade de quinase com base em célula para as quinases selecionadas que foram êxitos potenciais em testes bioquímicos e outras RTKs relacionadas (por exemplo, RON, SKY, IR) . Em estudos com base em célula, o composto 1 foi mais de 1000 vezes seletivo para VEGFR2 e PDGFRp sptit-RTKs, mais de 200 vezes seletivo para IR e Lck, e aproximadamente 40 a 60 vezes seletivo para Axl, Tie2, TrkA, e TrkB, todos comparados com c-Met/HGFR (A549 IC 50 — 8.6 nM) (Erro! Fonte de referência não encontrada 1) . Para investigar se uma janela de 50 vezes foi suficiente para a seletividade de c-Met/HGFR in vivo, o composto 1 foi avaliado quanto a sua habilidade de inibir fosforilação de Tie-2 em xenoenxertos C6 em ratos nus. No referido estudo, nenhuma inibição significativa de fosforilação de Tie-2 foi observada em qualquer ponto de tempo em seguida de uma dose única PO dose de 50 mg/kg (representando IC99 para a inibição de c-Met/HGFR em 24 horas) ou 100 mg/kg. Isto indica que a inibição de Tie-2, Axl, ou TrkA & B seria improvável em doses superiores a cerca de 2 vezes os níveis de doses associados com a inibição total de c-Met/HGFR em 24 h. O composto 1 foi de 20 - 30 vezes seletivo para RON quinase o que representa um alvo de oncologia potencialmente benéfico em virtude de 1) superexpressão e mutação em cânceres selecionados e 2) falta de fenótipo adverso em ratos RON-null. Diferente dos RTKs acima mencionados, o composto 1 demonstrou um valor de IC50 próximo do equivalente (24 nM) contra uma forma oncogênica de proteína de fusão ALK RTK (Quinase de linfoma anaplástico), NPM-ALK uma variante de proteína de fusão oncogênica de ALK RTK (Quinase de linfoma anaplástico), o que resulta a partir da translação cromossômica que está implicada na patogênese do linfoma de células grandes anaplástico humano (ALCL, em uma linhagem celular de linfoma humano (Erro! Fonte de referência não encontrada.1).

Inibição farmacodinâmica de atividade de c- Met/HGFR RTK em Células

Para se confirmar que a atividade enzimática potente se transformou em inibição de c-Met/HGFR em células, a habilidade do composto 1 de inibir a fosforilação de cMet/HGFR em um grupo de tumor e linhagens de células endoteliais foi avaliada. O composto 1 inibiu HGF-estimulada ou a autofosforilação de tirosina total constitutiva de c-Met/HGFR do tipo selvagem um valor médio de IC50 de 11 nM através do grupo de tumor humano e linhagens de células endoteliais (Tabela 1). O composto 1 demonstra um valor similar em células epiteliais de rato mlMCD3 (IC3O = 5 nM) (Tabela 1).

Potência do composto 1 contra mutações de campo ativas de cMet/HGFR Active em Células

As mutações de ativação de c-Met/HGFR foram identificadas em diversos cânceres humanos e proporcionam uma forte argumentação para provar os conceitos dos estudos clínicos com base tanto em evidências experimentais como em precedência clínica com outros alvos RTK. Embora as mutações c-Met/HGFR no domínio extracelular ou juxtamembrana não sejam previstos afetar a ligação do composto para ativar o campo, é possível que as mutações do domínio quinase ocasionem perda de atividade.

Para se ir de encontro a este item, a fosforilação de RTK IC50 foi avaliada em células NIH3T3 tratadas com o composto 1 trabalhadas por engenharia para expressar c-Met/HGFR do tipo selvagem ou uma série de mutações representativas c- Met/HGFR de campo ativo. Nos referidos estudos, o composto 1 exibiu atividade aprimorada ou similar contra os mutantes de campo de ligação a ATP (V10921, 19 nM e H1094R, 2.2 nM) ou mutantes de alça em P (M1250T, 15 nM) comparadas com o receptor do tipo selvagem (12.6 nM) (Tabela 1). O composto 1 exibe potencialmente também potência de inibição comparável de fosforilação de c-Met em células NCI-H69 (IC50: 13 nM) e HOP92 (IC50: 16 nM) que expressam as variantes de juxtamembrana c-Met endógena R98SC e TlOlOI, respectivamente (Tabela 1). De modo diferente, um desvio significativo de potência (10 vezes) foi observado contra a ativação de mutantes de alça (Y1230C, 127 nM e Y1235D, 92 nM) em comparação com o receptor do tipo selvagem.

Tabela 1

<table>table see original document page 52</column></row><table> <table>table see original document page 53</column></row><table> <table>table see original document page 54</column></row><table> <table>table see original document page 55</column></row><table>

Efeito do composto 1 em c-Met/HGFR- ou NPM-ALK- dependente em fenótipos Oncogênicos em Células

Testes Fenotípicos

c-Met/HGFR esteve implicada na desregulação do crescimento celular, migração, e invasão de uma variedade de células de tumor e células endoteliais de tumor enquanto NPM-ALK está implicada na desregulação da proliferação celular e apoptose em Células de linfoma ALCL. Em uma série de testes funcionais com base em célula, o composto 1 potencialmente inibiu o crescimento celular do carcinoma gástrico GTL-16 humano, induziu a apoptose de célula GTL- 16, inibiu a migração e invasão de célula de carcinoma de pulmão NC1-H441 HGF-estimulada através da matriz de matrigel, e inibiu a motilidade/dispersão da célula MDCK HGF-estimulada. (Tabela 2) O composto 1 também inibiu a proliferação de células Karpas 299 ou SU-DHL-I ALCL que expressam uma proteína de fusão NPM-ALK em virtude da uma translocação cromossômica t2;5. A inibição do crescimento pelo composto 1 nas referidas células de linfoma NPM-ALK positivo esteve associada com a interrupção do ciclo celular G0/Gi e indução de apoptose. Para ainda se investigar a atividade potencial anti-angiogênica, o composto 1 inibiu a sobrevivência de célula endotelial HUVEC HGF-mediada e a invasão de matrigel assim como a tubulogênese de célula endotelial HMVEC em géis de fibrina. OS referidos dados demonstram a habilidade do composto 1 de inibir ambas as funções'c-MetfHGFR- e NPM-ALK-dependente em células que expressam c-Met/HGFR ativada ou NPM-ALK, respectivamente. Adicionalmente, os referidos dados sugerem que a eficácia anti-tumor do composto 1 pode ser mediada tanto por efeitos diretos no crescimento celular do tumor ou sobrevivência, assim como nos mecanismos anti- angiogênicos.

Tabela 2

<table>table see original document page 56</column></row><table> <table>table see original document page 57</column></row><table>

Estudos in vivo

Dados e Resultados

Inibição alvo de quinase in vivo e inibição de crescimento de tumor

Seleção de Modelo de Tumor Modelos de xenoenxerto de tumor c-Met/HGFR- dependentes foram utilizados para avaliar a relação de inibição alvo de c-Met/HGFR, inibição de crescimento de tumor, e exposição a plasma do composto 1 in vivo. Em virtude da falta de ativação parácrina de c-Met/HGFR humana expressa por xenoenxertos de tumor por células mesenquimais de rato, os modelos de xenoenxerto humano que exibem atividade de c-Met/HGFR constitutiva foram utilizados como a seguir: 1) o carcinoma gástrico humano GTL-16 ou o modelo de carcinoma renal CakM que expressa níveis elevados de c-Met/HGFR constitutivamente ativa, 2) o glioblastoma U87MG humano ou o modelo de carcinoma de próstata PC-3 humana que expressa ambos HGF e c-Met/HGFR compreendendo uma alça autócrina, ou 3) co-implantação de células de tumor humanas (por exemplo, NC1-H441 NSCLC) com fibroblastos MRC5 humanos para fornecer uma fonte de HGF humano bioactivo a partir do compartimento estromal do tumor para restabelecer a ativação parácrina específica de espécie da c-Met/HGFR.

Relação da inibição de c-Met/HGFR com a eficácia do Anti-tumor em seguida da administração oral Tumores GTL-16

Ratos atímicos portando tumores GTL-16 estabelecidos (250 mm3) foram administrados com o composto 1 por via oral na dose indicada ou veículo isoladamente por 11 dias. Estudos investigando a inibição de fosforilação de c-Met/HGFR em GTL-16 (Figura 2A) , os ratos foram humanamente eutanasiados no final do estudo em pontos de tempo designados pós-administração, os tumores foram seccionados e congelados, e fosforilação em veículos e os grupos tratados foram quantificados por ELISA. A inibição da fosforilação da quinase alvo pelo composto 1 em tumores foi calculada como: % inibição = 100-[(Média OD tratadas / Média OD não tratadas) X 100]. Para os estudos que investigam a inibição de crescimento de tumor GTL-16 (Figura 2B), o volume do tumor volume foi medido por calibres nos dias indicados com o volume médio de tumor ± SEM indicados para os grupos de 15 ratos.

Os valores percentuais (%) mostrados são o % de inibição de crescimento de tumor medidos no dia 20 para os ratos tratados com droga em comparação aos ratos tratados com veículo e são calculados como: 100*{1- [(Tratados Dia 20 - Tratados Dia 10) / (dia de controle 20 - dia de controle 10)]}. Um * denota que os volumes médios de tumor são significativamente menores no grupo tratado com relação ao grupo de controle (P < 0.001) conforme determinado usando a análise de variação de sentido único (ver Figura 2B) .

Para avaliar a resposta de c-Met/HGFR PD ao composto 1, tumores GTL-16 foram coletados em diversos pontos de tempo em seguida da administração oral pf do composto 1 em ambos os estudos de dose única e de dose repetida (estado estável). A fosforilação de status de c- Met/HGFR em tumores foi quantificada por ELISA em uma faixa de doses. Com foco em estudos de PD de estado estável (dia 11) para se obter a correlação com inibição de crescimento de tumor, o composto 1 demonstrou o seguinte como mostrado nas Figuras 2A e 2B:

Com 50 mg/kg/dia; 100 % inibição de crescimento de tumor correlacionada com a completa inibição de fosforilação de c-Met/HGFR em tumores GTL-16 sustentados por 24 horas (25 mg/kg - inibição próxima de completa tanto na fosforilação como em crescimento de tumor). Com 12.5 mg/kg/dia: 60% inibição de crescimento de tumor correlacionado com 80% - 90% de inibição de fosforilação de c-Met/HGFR a 1 hora - 8 horas que reduziu para 50% - 60% de inibição por 16 horas - 24 horas.

Com 6.25 mg/kg/dia: tendência não significativa em direção da inibição de crescimento de tumor correlacionado com 30% - 50% de inibição de fosforilação de c-Met/HGFR a 1 hora - 8 horas com completa recuperação por 16 horas.

Tumores U87MG

Ratos atimicos portando tumores U87MG estabelecidos (150 mm3) foram administrados com o composto 1 por via oral na dose indicada ou veiculo isoladamente por 9 dias. Para os estudos investigando a inibição de crescimento de tumor (Figura 3A), o volume do tumor foi medido por calibres nos dias indicados com o volume médio de tumor ±SEM indicado para os grupos de 10-12 ratos. Os valores percentuais (%) mostrados são o % de giro ou inibição de crescimento medido no dia 14 para os ratos tratados com droga em comparação aos ratos tratados com veiculo e são calculados como: 100* {1-[(Tratados Dia 14 - Tratados Dia 6) / (Controle do Dia 14 - Controle do Dia 6) ] } . Um * denotes que o volume médio de tumor é significativamente menor nos ratos tratados com relação ao grupo de controle (P < 0.001) conforme determinado usando a análise de variação de sentido único (ver Figura 3A) . Para os estudos investigando a inibição de fosforilação de c-Met/HGFR (Figura 3B), os ratos foram humanamente eutanasiados no final do estudo 4 horas pós- administração do composto 1, os tumores foram seccionados e congelados, e fosforilação em veículos e os grupos tratados foram quantificados por ELISA. A inibição da fosforilação da quinase alvo pelo composto 1 em tumores foi calculada como: % inibição = 100-[(Média OD tratadas / Média OD não tratadas) X 100].

A inibição farmacologicamente relevante de fosforilação de Tie-2 não foi observada em xenoenxertos U87MG em níveis de doses de cerca de 100 mg/kg sugerindo que o composto 1 foi seletivo para os seus alvos pretendidos em níveis de doses similares.

Eficácia anti-tumor do composto 1 em modelos de xenoenxerto Humano

A eficácia anti-tumor do composto 1 foi avaliada em uma variedade de modelos de xenoenxerto de tumor humano representativos de indicações de câncer no qual a desregulação de c-Met/HGFR está implicada incluindo carcinoma gástrico GTL-16, glioblastoma UB7MG, NCI-H441 NSCLC, e carcinoma de próstata PC-3 (Tabela 4).

Modelo de carcinoma gástrico GTL-16 Utilizando o modelo de carcinoma gástrico GTL-16,

O composto 1 demonstrou a habilidade de ocasionar uma significativa regressão de grandes tumores estabelecidos (> 600 mm3) (Figura 4) . No presente estudo, o grupo de tratamento com the 50 mg/kg/dia e 75 mg/kg/dia do composto

1 exibiu regressão média equivalente do tumor durante o programa de 43 dias de administração, o que proporcionou evidência adicional de que 50 mg/kg/dia representa o nivel de dose de eficácia máxima. Como ilustrado na figura 4, a regressão média de tumor a 50 mg/kg/dia ou 75 mg/kg/dia foi de 60% após 43 dias da administração composto 1. No presente estudo, cada tumor apresentou redução de massa durante o ciclo de administração de 43 dias do composto 1 em cada nivel de dose, com 9 de 14 ratos exibindo uma redução >30% na massa de tumor (resposta parcial), e um animal exibiu uma resposta completa sem evidência de tumor mesmo após cessação do tratamento por 10 dias.

Regressão de xenoenxertos de tumor GTL-16 grande estabelecido em ratos atimicos (Figura 4A) e peso corporal de rato (Figura 4B) em seguida da administração oral diária do composto 1. Ratos atimicos portando tumores GTL-16 estabelecido (620 mm3) foram administrados com o composto 1 por via oral nos níveis indicados de dose ou veículo isoladamente por 43 dias. Para investigar a eficácia anti-tumor (Figura 4A) , o volume do tumor foi medido por calibres nos dias indicados com o volume médio de tumor ± SEM indicado para os grupos de 6 - 8 ratos. (Figura 4B) O peso médio do rato no tratamento com o composto 1 e nos grupos de controle com veículo são ilustrados no painel direito.

NCI-H441 NSCLC modo/ Caki-I/ xenoenxertos de tumor PC-3

Ratos atímicos portando NCI-H441 estabelecido (100 mm3) (Figura 5A) , Caki-I (Tabela 3A, Tabela 3B) ou PC- 3 tumor xenoenxertos (Figura 5B) foram administrados o composto 1 por via oral na dose indicada ou veículo isoladamente por 38, 40 ou 20 dias, respectivamente. O volume do tumor foi medido por calibres nos dias indicados com o volume médio de tumor ± SEM. Um * denota que os volumes médios de tumor são significativamente menores no grupo tratado com relação ao grupo de controle (P < 0.001) conforme determinado usando a análise de variação de sentido único (ver Figura 5) .

No modelo NC1-H441 NSCLC, uma regressão média de 43% de tumores estabelecidos foi observada a 50 mg/kg/dia após 38-dia da administração do composto 1 (Figura 5). No presente estudo, cada tumor reduziu em massa durante o ciclo de administração de 33 dias do composto 1 a 50 mg/kg/dia, com 3 dos 11 ratos exibindo uma redução >30% na massa do tumor (resposta parcial), e 3 animais exibiram uma resposta completa sem evidências de tumor (Figura 5) . A eficácia anti-tumor do composto 1 foi dependente de dose com a regressão da inibição de crescimento de tumor) observada a 15 mg/kg/dia (Figura 5). A eficácia anti-tumor do composto 1 observada no modelo NCI-H441 foi consistente com a inibição de fosforilação de c-Met/HGFR em tumores dos grupos de tratamento com o composto em comparação com os controles tratados com veículo. No modelo de carcinoma renal Caki-1, uma redução de 53% no volume médio de tumor foi observada a 50 mg/kg/dia durante o ciclo de administração de 33 dias do composto 1 {Figura 5B). No estudo de Caki-1, cada tumor reduziu em volume em pelo menos 30% durante o ciclo de administração de 33 dias do composto 1 (Tabela 3B, tabela 4). A eficácia anti-tumor do composto 1 foi também investigada no modelo de xenoenxerto de carcinoma de próstata PC-3 e uma inibição próxima da completa de crescimento de tumor (84% de inibição de crescimento) foi observada no referido modelo.

Tabela 3A

<table>table see original document page 64</column></row><table> <table>table see original document page 65</column></row><table>

Tabela 3B

<table>table see original document page 65</column></row><table> A relação entre a eficácia anti-tumor e a inibição de c-Met/HGFR

Uma série de estudos sobre dose-resposta de eficácia anti-tumor e sobre farmacodinâmica foi realizada para demonstrar a relação entre a inibição do alvo c-Met/HGFR com a eficácia anti-tumor. Para avaliar a inibição farmacodinâmica de c-Met/HGFR pelo composto 1, tumores de carcinoma gástrico GTL-16 foram colhidos em diversos pontos de tempo que se seguiram à administração oral do composto 1.

O status de fosforilação de c-Met/HGFR em tumores foi quantificado em uma série de dosagens. Nos referidos estudos, o composto 1 demonstrou uma forte correlação entre a inibição dependente da dose e a inibição dependente do tempo de c-Met/HGFR para a inibição do crescimento de um tumor. Foi possível chegar a seguinte conclusão quando se definiu a relação do PD do alvo com a eficácia no modelo GTL-16: 1) a inibição completa da atividade de c-Met/HGFR para 24 horas foi inconsistente com a inibição completa do crescimento do tumor (50 mg/kg, 100% TGI), 2) a potente inibição da atividade de c-Met/HGFR para somente uma parcela da programação é consistente com uma eficácia abaixo da ideal (12,5 mg/kg, 60% TGI), 3) a incapacidade de alcançar >50% da inibição da atividade de c-Met/HGFR (3,125; 6,25 mg/kg) é consistente com a ausência de inibição significativa de crescimento de tumor (TGI) (Figura 2A e 2B). Um estudo adicional de GTL-16 demonstrou que grupos de tratamento com 50 mg/kg/dia e 75 mg/kg/dia de composto 1 exibiram regressão equivalente de tumor maligno o que proporcionou uma conseqüente evidência de que 50 mg/kg/dia representa a máxima dose eficaz (Figura 4 e Tabela 4). As referidas descobertas sugerem que a duração da inibição de c-Met/HGFR está diretamente relacionada com a eficácia anti- tumor do composto 1.

Adicionalmente, um efeito similar entre a dosagem do composto 1 e seu efeito dependente no crescimento do tumor e a fosforilação de c-Met/HGFR foi observado com na utilização de todos os modelos de tumor (GTL-16, U87MG, e NCI-H441) e a programação da dosagem posteriormente comprovou as referidas observações (Tabela 4) . Em cada um dos referidos estudos, o nivel de dosagem de 50 mg/kg/dia resultou ou na inibição completa do crescimento do tumor ou na regressão do tumor (Tabela 4). Adicionalmente, uma correlação dose-dependente entre a inibição da fosforilação de c-Met/HGFR e a eficácia anti-tumor foi observada em cada modelo mais adicional suportando o conceito do aumento da extensão e da duração de inibição de c-Met/HGFR para alcançar a eficácia total. Coletivamente, os referidos estudos sugerem que a inibição quase completa da fosforilação de c-Met/HGFR pela duração da programação de administração é necessária para maximizar os benefícios terapêuticos e a extensão e a duração da atividade de inibição de c-Met/HGFR estavam diretamente relacionadas à eficácia anti-tumor. Os referidos dados suportam a ligação entre a inibição do alvo farmacológico pretendido do composto 1, c-Met/HGFR, e o grau de eficácia anti-tumor. Eficácia anti-tumor do Composto 1 em um modelo de linfoma NPM-ALK-Dependente Modelo Karpas299 ALCL

Ratos portadores de tumores Karpas 299 estabelecidos (220 mm3) receberam oralmente o composto 1 na dose ou veiculo indicados pelo período de tempo designado. Para o estudo de investigação da inibição do crescimento do tumor (Figura 6A) , o volume do tumor foi medido por calibres nos dias indicados com o volume médio do tumor ± SEM para grupos de 8-12 ratos. Os valores percentuais mostrados são o % de inibição de crescimento de tumor medido no dia 23 para ratos tratados com a droga em comparação aos ratos tratados somente com veículo e foram calculados da maneira a seguir: 100* {1- [ (Dia de tratamento 23 - Dia de tratamento 12) / (Dia de controle 23 - Dia de controle 12)]}. Um * denota gue os volumes médios do tumor estão significativamente menores no grupo dos tratados com a droga do gue no grupo de controle (P < 0,001) como determinado usando a análise de variação de sentido único. Para estudos de investigação da inibição da fosforilação de NPM-ALK (Figura 6B) , os ratos foram humanamente sacrificados no final do estudo, 4 horas após a administração do composto 1, os tumores foram ressecados e congelados, e a fosforilação ALK nos tumores tratados e os tumores apenas com veículo foi quantificada por ELISA. A inibição da fosforilação da quinase alvo pelo composto 1 em tumores foi calculada da seguinte maneira: % de inibição = 100 -[(média da densidade óptica dos tratados / média da densidade óptica dos não-tratados) χ 100] . Utilizando o modelo Karpas 299 ALCL, o composto 1 demonstrou a habilidade de causar distinta regressão de tumores estabelecidos (> 200 mm3) (Figura 6A) . No referido estudo, ta administração de composto 1 a 100 mg/kg/dia resultou na completa regressão de tumores de todos os ratos no referido grupo de dosagem no intervalo de 15 dias do inicio da administração do composto (Figura 6A) . Após 17 dias, o tratamento com composto 1 foi interrompido, resultando no retorno do crescimento do tumor. Quando os tumores atingiram um tamanho maior (> 600 mm3) , o tratamento com o composto 1 foi reiniciado por mais 13 dias e mais uma vez demonstrou-se a completa regressão dos tumores (Figura 6A, Tabela 4). O efeito cito-redutivo do composto 1 é consistente com a observação de seus efeitos anti- proliferativos e de apoptose contra células ALCL in-vitro. A relação da inibição de fosforilação de um tumor NPM-ALK com a eficácia anti-tumor também foi determinada em vários momentos e níveis de dosagem. De maneira similar às observações nos modelos de tumor c-Met/HGFR-dependentes, a inibição quase completa (>90% de inibição) da atividade de NPM-ALK para um intervalo de dosagem total (24 horas) é consistente com a máxima eficácia anti-tumor (regressão completa) a 100 mg/kg (Figura 6A e 6B) . A inibição completa de fosforilação de NPM-ALK (90% de inibição a 25 mg/kg ou 50 mg/kg) é consistente com uma eficácia anti-tumor abaixo da máxima (Figura 6A e 6B) . De maneira similar aos estudos nos modelos de tumor c-Met/HGFR-dependentes, os referidos dados afirmam a ligação entre a inibição de outro alvo farmacológico pretendido do composto 1, NPM-ALK, e o grau de eficácia anti-tumor em um modelo de tumor NPM-ALK- dependente.

Tabela 4

<table>table see original document page 70</column></row><table> <table>table see original document page 71</column></row><table>

Síntese do Composto 1

PLE é uma enzima produzida pela Roche e comercializada através de Biocatalytics Inc. como uma preparação crua da esterase do fígado de porco, conhecida geralmente como PLE- AS (pode ser adquirida da Biocatalytics como ICR-123, vendido como uma suspensão do sulfato de amônio). A enzima é classificada no registro CAS como uma "esteridrolase carboxílica, CAS no. 9016-18-6". 0 número de classificação de enzima correspondente é EO 3.1.1.1. A enzima é conhecida por ser dotada de ampla especificidade de substrato para a hidrólise de uma larga gama de ésteres. A atividade de lípase é determinada usando um método baseado na hidrólise do butanoato de etila em um titulador do pH. 1 UL(unidade de lipase) é a quantidade de enzima que libera 1 mmol de ácido butanóico titulável por minuto a 22°C, pH 8,2. A preparação aqui descrita (PLE-AS, como uma suspensão) é normalmente enviada como m líquido marrom-esverdeado, opaco, com uma atividade declarada de > 45 UL/mg (conteúdo de proteína em torno de 4 0 mg/mL).

(1S)-1-(2,6-dicloro-3-flúorfenil)etanol O (IS)-1-(2,6-dicloro-3·flúorfenil)etanol, mostrado como um composto (S-I) nos esquemas abaixo, foi preparado por uma combinação de hidrólises enzimáticas de acetato de 1-(2,6-dicloro-3-flúorfenil)etila racêmico, esterificação e a hidrólise química com inversão de acordo com o Esquema B. 0 acetato de 1-(2,6-dicloro-3-flúorfenil)etila racêmico (composto A2) foi preparado de acordo com o Esquema A.

<formula>formula see original document page 72</formula>

1-(2,6-dicloro-3-flúorfenil)etanol (Al):

Tetraidroborato de sódio (90 mg, 2.4 mmol) foi adicionado a uma solução de 2,6-dicloro-3-flúor-acetofenona (Aldrich, catálogo # 52, 294-5) (207 mg, 1 mmol) em 2 mL de CH3OH anídrico. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora, e a seguir evaporada para dar um óleo de resíduo incolor. 0 resíduo foi purificado por cromatografia flash (eluição com 0->10%EtC)Ac em hexanos) para gerar um composto Al como um óleo incolor (180 mg; 0.88 mmol; 86.5% de rendimento); MS (APCI)(M-H) 208; 1H NMR(400 MHz, clorofórmio-D) δ ppm 1, 64(d, J=6,82 Hz, 3 H) 3, 02(d,J= 9,85 Hz, 1H) 6, 97-7, 07(m, 1 H) 7,19-7,33(m, 1 H) .

Acetato 1-12,6-dicloro-3-flúorfenilletil (A2): Anidrido ascético (1.42 mL, 15 mmol) e piridina (1.7 mL, 21 mmol) foram adicionados seqüencialmente a uma solução de um composto Al (2.2 g, 10.5 mmol) em 20 mL de CH2CI2. A mistura da reação foi agitada a temperatura ambiente por 12 horas e então evaporada para gerar um resíduo de óleo amarelado. 0 resíduo foi purificado por cromatografia flash (eluição com 7->9% EtOAc em hexanos) para gerar um composto

A2 como um óleo incolor (2.26 g; 9.0 mmol; 85.6% de rendimento); 1H NMR(400 MHz, clorofórmio-D)δ ppm 1,88 (d, J= 6,82 Hz, 3 H) 2,31 (s, 3 H) 6, 62 (q, J=6, 82 Hz, 1 H) 7,25 (t, J= 8,46 Hz, 1 H) 7,49(dd, J=8, 84, 5, 05 Hz, 1 H) .

Esquema B

<formula>formula see original document page 73</formula>

A um frasco revestido de 50 mL equipado com um eletrodo de pH, um agitador suspenso e uma linha de adição de base (1M NaOH), foi adicionado 1.2 inL de 100 mM um tampão de fosfato de potássio pH 7.0 e 0.13 mL de suspensão PLEAS. Então, o composto A2 (0.13 g, 0.5 mmol, 1.00 eq) Foi adicionado gota a gota e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 20 horas, mantendo-se o pH da reação constante a 7.0 usando 1 M NaOH. Tanto a conversão e 0 excesso enantiomérico da reação foram monitorados por RP- HPLC, e interrompido após 50% do material inicial ter sido consumido (aproximadamente 17 sob as referidas condições). A mistura foi então extraída três vezes com 10 mL de acetato de etila para recuperar tanto o éster como o álcool como uma mistura de Rl e 5-2.

O cloreto de metanosulfonila (0.06 mL, 0.6 mmol) foi adicionado a uma solução de uma mistura de R-I e S-2 (0.48 mmol) em 4 mL de piridina sob atmosfera de nitrogênio. A mistura da reação foi agitada na temperatura ambiente por 3 horas e a seguir evaporada para se obter um óleo. Água (20 mL) foi adicionada à mistura e então EtOAc (20 mL χ 2) foi adicionado para extrair a solução aquosa. As camadas orgânicas foram combinadas, secas, filtradas, e evaporadas para gerar uma mistura de R-3 e S-2. A referida mistura foi usada na reação da etapa seguinte sem purificação adicional. 1H NMR (400 MHz, clorofórmio-D) δ ppm 1,66 (d, J=7,l Hz, 3 H) 1,84 (d, J=I , 1 Hz, 3 H) 2,09(s, 3 H) 2,92(s, 3 H) 6,39(q, J=TrO Hz, 1 H) 6,46 (q, J=6,8 Hz, 1 H) 6, 98-7, 07 (m, 1 H) 7,07-7,17(m, 1 H) 7,23-7, 30(m, 1 H) 7,34(dd, J= 8,8, 4,80 Hz, 1H) Acetato de potássio (0.027 g, 0.26 mmol) foi adicionado a uma mistura de R-3 e S-2 (0.48 mmol) em 4 mL de DMF sob atmosfera do nitrogênio. A mistura de reação foi aquecida a 100°C por 12 horas. Água (20 mL) foi adicionada à mistura da reação e EtOAc (20 mL χ 2) foi adicionado para extrair a solução aquosa. A camada orgânica combinada foi seca, filtrada, e evaporada para gerar um óleo de S-2 (72 mg, 61% de rendimento em duas etapas). Quiralidade de excesso enantiomérico: 97.6%. 1H NMR (400 MHz, clorofórmio-D) δ ppm 1,66(d, J=I1I Hz, 3 H) 2,09(s, 3 H) 6,39(q, J=6,8 Hz, 1 H) 7,02 (t, J= 8,5 Hz, 1 H) 7,22-7,30(m, 1 H).

Metóxido de sódio (19 mmol; 0.5 M in metanol) foi adicionado lentamente ao composto S-2 (4.64 g, 18.8 mmol) sob atmosfera de nitrogênio a 0°C. A mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 4 horas. O solvente foi evaporado e H2O (100 mL) foi adicionada. A mistura de reação resfriada foi neutralizada com solução-tampão de ácido ascético de acetato de sódio a pH 7. Acetato de etila (100 mL χ 2) foi adicionado para extrair a solução aquosa. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4, filtradas, e evaporadas para se obter S-1 como um sólido branco (4.36 g, 94.9% de rendimento); SFC-MS: 97% de excesso enantiomérico. 1H NMR (400 MHz, clorofórmio-D) δ ppm 1,65 (d, J=6,8 Hz, 3 H) 5,58 (q, J= 6,9 Hz, 1 H) 6,96-7,10(m, 1 H) 7,22- 7, 36(m, 1H) .

5-bromo-3-[1-(2-6-dicloro-3-flúor-fenil)-etoxi]- piridina-2-ilamina (mistura racêmica): <formula>formula see original document page 76</formula>

1. 2, 6-Dicloro-3-flúoracetofenona (15 g, 0.072 mol) foi agitada em THF (150 mL, 0.5M) a 0°C usando um banho de gelo por 10 min. Hidreto de litio e alumínio (2.75 g, 0.072 mol) foi lentamente adicionado. A reação foi agitada na temperatura ambiente por 3 horas. A reação foi refrigerada no banho de gelo, e a água (3 mL) adicionada gota a gota e seguido de adição de 15% NaOH (3 mL) lentamente. A mistura foi agitada na temperatura ambiente por 30 minutos. 15% de NaOH (9 mL) , MgS04 foram adicionados e a mistura foi filtrada para remover os sólidos. Os sólidos foram lavados com THF (50 mL) e o produto filtrado foi concentrado para gerar 1-(2,6-dicloro-3-flúor-fenil)-etanol (14.8 gm, 95% de rendimento) como um óleo amarelo. 1H NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 1,45(d, 3H), 5,42(m, 2H), 7,32(m, 1H), 7,42(m, 1H).

2. A uma solução agitada de trifenil fosfina (8.2 g, 0.03 mol) e DEAD (13.65 mL de uma solução a 40% em tolueno) em THF (200 mL) a 0°C foi adicionada a uma solução de 1- (2,6-dicloro-3-flúor-fenil)etanol (4.55 g, 0.021 mol) e 3- hidroxi-nitropiridina (3.35 g, 0.023 mol) em THF (200 mL). A solução resultante laranja brilhante foi agitada sob atmosfera de nitrogênio em temperatura ambiente por 4 horas até que todos os materiais iniciais fossem consumidos. 0 solvente foi removido, e o material cru foi carregado seco em gel de silica, e eluído com hexanos de acetato de etila (20:80) para render 3-(2,6-dicloro-3-flúor-benziloxi)-2- nitro-piridina (6.21 g, 0.021 mol, 98%) como um sólido rosa. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 1,8-1,85 (d, 3H) , 6,0-6,15 (q, 1H) , -7,0-7,1 (t, 1H), 7,25-7,5(m, 2H), 8,0-8,05(d, 1H) .

3. A uma solução agitada de AcOH (650 mL) e EtOH (500 mL) foi suspendido 3-(2,6-dicloro-3-flúor-benziloxi)-2- nitro-piridina (9.43 g, 0.028 mol) e limalha de ferro (15.7 g, 0.28 mol). A reação foi aquecida lentamente ao refluxo e foi permitido que agitasse por 1 hora. A reação foi refrigerada à temperatura ambiente então éter dietilico (500 mL) e água (500 mL) foram adicionados. A solução foi cuidadosamente neutralizada pela adição de carbonato de sódio. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com NaHCO3 saturado (2 χ 100 mL), H2O (2 χ 100 mL) e salmoura (1 χ 100 mL) e então secos (NasSO4) , filtrados e concentrados secos sob vácuo para render 3-(2,6-dicloro-3-flúor- benziloxi ) -piridina-2-ilamina (9.04 g, 0.027 mol, 99%) como um sólido rosa claro. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 1,8-1,85 (d, -3H), 4,9-5,2(brs, 2H), 6,7-6,84(q, 1H) , 7,0-7,l(m, 1H), 7,2- -7,3(m, 1H), 7,6-7,7(m, 1H).

4. Uma solução agitada de 3-(2, 6-dicloro-3-flúor- benziloxi)-piridina-2-ilamina (9.07 g, 0.03 mol) em acetonitrila foi resfriada para 0°C usando um banho de gelo.

À referida solução foi adicionado N-Bromosuccinimida (NBS) (5.33 g, 0.03 mol) porção a porção. A reação foi agitada a 0°C por 15 min. A reação foi concentrada a seco sob vácuo. O óleo escuro resultante foi dissolvido dentro de EtOAc (500 mL) , e purificado via cromatografia de gel de silica. Os solventes foram então removidos à vácuo para render 5-bromo-3-(2,6-dicloro-3-flúor-benziloxi)-piridina-2- ilamina (5.8 g, 0.015 mol, 51%) como um sólido branco cristalino. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 1, 85-1, 95(d, 3H) , 4,7- 5,0 (brs, 2H) , 5,9-6,01(q, 1H) , 6,8-6,95(d, 1H) , 7,01-7,2(t, 1H) , 7,4-7,45(m, 1H), 7,8-7,85(d, 1H) .

5-bromo-3-[1(R)1-(2,6-dicloro-3-flúor-fenil)-etoxi] - piridina-2-ilamina:

<formula>formula see original document page 78</formula>

O isômero R enantiomericamente puro foi preparado como descrito acima para a mistura racêmica, mas usando os materiais iniciais enantiomecamente puros descritos acima. 1H NMR (400 MH ζ, DMS0-d6) δ 1,74 (d, 3H) , 6,40(m, 1H) , 6,52 (br s, 2H), 7,30(m, 1H), 7,48(m,lH), 7,56(s,lH); MS m/z 382(m+1).

Éster terc-butilico de ácido 4-metanosulfoniloxi- piperidina-1 carboxilico (2)

<formula>formula see original document page 78</formula> A uma solução agitada de éster tart-butil de ácido 4- hidroxi-piperidina-1 carboxilico (7.94 g, 39.45 mmol) em CH2CI2 (100 mL) , esfriada a 0°C, foi lentamente adicionado NEt3 (5.54 mL, 39.45 mmol) seguido de cloreto de metanosulfonila (3.06 mL, 39.45 mmol) e DMAP (48 mg, 0.39 mmol) . A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite. À mistura foi adicionada água (30 mL) . A extração com CH2Cl2 (3 χ 30 mL) seguida por secagem (Na2SO4) e a remoção do solvente a vácuo suportou éster terc-butilico de ácido 4-metanosulfoniloxi-piperidina-1 carboxilico como um sólido branco (11.00 g, >99% de rendimento). 1H NMR (CDCl3, 400 MH ζ) δ 4,89(m, 1H), 3,69(m, 2H), 3,31(m,2H), 3,04(s, 3H), 1,95(m, 2H), l,83(m, 2H), l,46(s, 9H).

Terc-butil-4-[4-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2- dioxaborolano-2-il)-lH-pirazol-l-il]piperidina-1 carboxilato

<formula>formula see original document page 79</formula>

Terc-butil 4- (4-iodo-lH-pirazol-l-il) piperidina-1

carboxilato (3)

NaH (1.2 eq., 0.68 mmol) foi adicionado porção a porção a uma solução agitada de 4-iodopirazol (0.57 mmol) em DMF (2 L) a 4°C. A mistura resultante foi agitada por 1 hora a 4°C e éster tert-butilico de ácido 4-metanosulfoniloxi- piperidina-1 carboxilico, composto 2 (1.1 eq. , 0.63 mmol) foi então adicionado. A mistura resultante foi aquecida a 100°C por 12 horas. A reação foi temperada com H2O e extraída com EtOAc várias vezes. As camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas, e concentradas para suportar um óleo alaranjado. 0 resíduo purificado pela cromatografia de gel de silicone (eluição com 5% EtOAc em pentano) para render o composto 3 como um sólido branco (140 g, 66%).

Terc-butil-4-[4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolano-2-il)-1H-pirazol-1-il]piperidina-1 carboxilato (4)

Bis (pinacolato) diboro (1.4 eq. , 134 g, 0.52 mol) e acetato de potássio (4 eq. , 145 g, 1.48 mol) foram adicionados seqüencialmente a uma solução do composto 3 (140 g, 0.37 mol) em 1.5 L de DMSO. A mistura foi removida com nitrogênio diversas vezes e diclorobis(trifenilfosfino)paládio (II) (0.05 eq. , 12.9 g, 0.018 mol) foi então adicionado. A mistura resultante foi aquecida a 80°C por 2 horas. A mistura da reação foi resfriada e filtrada através de um leito de diatomito e lavado com EtOAc; O resultado da filtragem foi lavado com NaCl saturado (500 mL χ 2), seco sobre Na2SO4, filtrado e concentrado. 0 resíduo purificado pela cromatografia de gel de silicone (eluição com 5% EtOAc em hexanos) para gerar o composto 4 como um sólido branco (55 9, 40%).

3-[(R)-1-(2,6-dicloro-3-flúor-fenil)-etoxi]-5-(1- piperidina-4-il-1H-pirazol-4-il)-piridina-2-ilamina (1) <formula>formula see original document page 81</formula>

A uma solução agitada de 3-[(R)-1-(2,6-dicloro-3- flúor-fenil)-etoxi]-5-(4,4,5,5- tetrametil[1,3,2]dioxaborolano-2-il)-piridina-2-ilamina (15.22 g, 35.64 mmol) e éster tert-butíIico de ácido 4-(4- bromo-pirazol-1-il)-piperidina-1 carboxilico (14.12 g, 42.77 mmol) em DME (143 mL) foi adicionada uma solução de Na2CC>3(11.33 g, 10692 mmol) em água (36 mL) . A solução foi desgaseifiçada e carregada com nitrogênio três vezes. À solução foi adicionado Pd(PPh3)2Cl2 (1.25 mg, 1.782 mmol). A solução de reação foi desgaseifiçada e carregada com nitrogênio três vezes de novo. A solução de reação foi agitada a 87°C em banho de óleo por aproximadamente 16 horas (ou até a consumição do éster borano pinacol), refrigerado à temperatura ambiente e diluído com EtOAc (600 mL). A mistura de reação foi filtrada através de uma base de diatomito e lavada com EtOAc. A solução de EtOAc foi lavado com a salmoura, seca sobre Na2SO4 e concentrada. 0 produto cru foi purificado em uma coluna de gel de silicone e eluído com um sistema EtOAc/Hexano (Biotage 90+ Coluna: equilíbrio 600 mL 100% Hexanos, segmento 1: 2250 mL 50% EtOAc/Hexanos Lineares, segmento 2: 4500 mL 75% EtOAc/Hexanos Lineares, segmento 3: 4500 mL 100% EtOAc) para suportar éster terc- butílico de ácido 4-(4-{6-amino-5-[(R)-1-(2,6-dicloro-3- flúor-fenil)-etoxi]-piridina-3-il)-pirazol-l-il)-piperidina- 1 carboxilico (11.8 g, 60% de rendimento, ~95% de pureza) com um Rf de 0.15 (50% EtOAc/Hexanos). MS m/e 550 (M+l)+.

A uma solução de éster terc-butilico de ácido 4—(4—{6— amino-5-[(R)-1-(2,6-dicloro-3-flúor-fenil)-etoxi]-piridina- 3-il}-pirazol-l-il)-piperidina-1 carboxilico (11.8 g, 21.45 mmol) em CH2Cl2 (59 mL, 0.2M) foi adicionado 4N HCI/Dioxano (21 mL). A solução foi agitada durante a noite dando forma a um sólido. O sólido foi esmagado completamente com uma haste de vidro e vibrado por ultra-som para liberar o material inicial preso no sólido. 4NHCl/Dioxano adicional (21 mL) foi adicionado e agitado por 2 horas a temperatura ambiente na qual LCMS não mostrou nenhum material inicial. A suspensão foi filtrada em um funil Buchner alinhado com papel de enchimento. A água-mãe foi salva porque continha <5% do produto. O sólido foi transferido para um béquer de 500 mL e a água de HPLC foi adicionada até o sólido se dissolver completamente. 0 pH foi ajustado para 10 com a adição de Na2CO3 sólido. A solução aquosa foi extraída com CH2Cl2 (5 χ 200 mL) ou até LCMS não exibir mais nenhum produto na camada aquosa. A solução de CH2Cl2 foi seca sobre Na2SO4 e concentrada. O produto cru, re-dissolvido em CH2Cl2 (10 mL) e MeOH (1 mL) , foi purificada em coluna de gel de sílica e eluída com sistema CH2Cl2/MeoH/NEt3 (Biotage 40+ Coluna: equilíbrio 600 mL CH2Cl2 100% dado pelo produto, segmento 1: 1200 mL 10% MeOH/ CH2Cl2 linear, segmento 2: 2400 mL 10% MeOH/CH2Cl2 etapa, segmento 3: 2400 mL 9% MeOH/1% Net3/CH2C12). As frações desejadas foram coletadas para proporcionar 3-[(R)1-(2,6-dicloro-3-flúor-fenil)-etoxi]-5- (1-piperidina-4-il-1H-pirazol-4-il)-piridina-2-ilamina (7.19 g, 75% de rendimento combinado, sólido branco). MS m/e 450 (M+l)+. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7,92 (s, 1H), 7,76(s, 1H), 7,58 (m, 1H), 7,53(s, 1H), 7,45(m, 1H), 6,90(s, 1H), 6,10(m, 1H), 5,55 (bs, 2H), 4,14(m, 1H), 3,05(m, 2H), 2,58(m, 2H), 1, 94 (m, 2H), 1, 80(d, 3H), 1, 76(m, 2H).

O produto sólido 3-[ (R)-1-(2,6-dicloro-3-flúor-fenil) - etoxi]-5-(1-piperidina-4il-1H-pirazol-4-il)-piridina-2- ilamina foi dissolvido em diclorometano, e o solvente foi evaporado lentamente um sólido cristalino fino. Após a secagem a alto vácuo, a amostra foi confirmada como sendo uma única forma A de polimorfo cristalino com um ponto de fundição de 194°C.

Claims (13)

1. Uso de (R)-3-[1-(2,6-dicloro-3-flúor-fenil)etóxi]- -5-(l-piperidina-4-il-lH-pirazol-4-il)-piridina-2-ilamina ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento do crescimento anormal de células em um mamífero.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é um humano.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é um cachorro.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que o crescimento anormal das células é mediado por pelo menos uma quinase de tirosina geneticamente modificada.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que o crescimento anormal das células é mediado por uma quinase de receptor de fator de crescimento de hepatócito (c-Met/HGFR) ou quinase de linfoma anaplástico (ALK).

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o crescimento anormal das células é mediado por uma quinase de receptor de fator de crescimento de hepatócito (c-Met/HGFR).

7. Uso, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o crescimento anormal das células é mediado por quinase de linfoma anaplástico (ALK).

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que o crescimento anormal das células é câncer.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é selecionado entre câncer de pulmão, ósseo, pancreático, de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intra-ocular, câncer uterino, de ovário, retal, câncer da região anal, de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula supra-renal, sarcoma de partes moles, câncer de uretra, câncer de pênis, câncer de próstata, leucemia crônica ou aguda, linfomas Iinfociticos, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de célula renal, carcinoma da pelve renal, neoplasmas do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário de SNC, tumores da coluna vertebral, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, e suas combinações.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão de células não-pequenas, carcinoma de células escamosas, câncer de próstata hormônio-refratário, carcinoma renal papilar, adenocarcinoma do cólon-retal, neuroblastomas, linfoma de célula grande anaplástica e câncer gástrico.

11. Uso, de qualquer uma das reivindicações 1-10, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto ou sal farmaceuticamente aceitável deste é administrado como uma composição farmacêutica compreendendo (R)-3-[1-(2,6-dicloro- -3-flúor-fenil)-etóxi]-5-(l-piperidina-4-il-lH-pirazol-4-il) - piridina-2-ilamina e pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável.

12. Uso de (R)-3-[1-(2,6-dicloro-3-flúor-fenil) - etóxi]-5-(l-piperidina-4-il-lH-pirazol-4-il)-piridina-2- ilamina, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para a inibição da atividade de quinase de c- Met/HGFR em uma célula.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula é selecionada do grupo que consiste em A54 9 Carcinoma de pulmão humano, GTL-16 Carcinoma gástrico humano, HT29 Carcinoma de cólon humano; Colo205 Carcinoma de cólon humano, A4 98 Carcinoma Renal Humano, 7 8 6-0 Carcinoma Renal Humano, MBA-MD-231 Carcinoma de Mama Humano, células epiteliais de rim canino de Madin-Darby (MDCK), MDCK células projetadas para manifestar glicoproteina P (MDCK-MDR1) , epitélio de rim de rato mlMCD3, células endoteliais do cordão umbilical humano (HUVEC), carcinoma renal Caki-I e células NIH-3T3 projetadas para manifestar c-Met/HGFR comum e c-Met/HGFR mutante incluindo HGFR-V1092I, HGFR-H1094R, HGFR-Y1230C, e HGFR- M1250T.