KR20080072965A - 비정상 세포 성장의 치료 방법 - Google Patents

비정상 세포 성장의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유류에서 비정상 세포 성장을 치료하기 위한, 신규의 c-Met/HGFR 억제제로서의 (R)-3-[1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일-1H-피라졸-4-일)-피리딘-2-일아민의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암에 걸린 포유류를 치료하는 방법의 제공에 관한 것이다.

Description

비정상 세포 성장의 치료 방법{METHOD OF TREATING ABNORMAL CELL GROWTH}
본 발명은 포유류에서 비정상 세포 성장을 치료하기 위한 c-Met/HGFR 억제제의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암에 걸린 포유류를 치료하는 방법을 제공한다.
본 출원은 2005년 12월 5일에 출원된 미국 특허 가출원 제 60/742,766 호, 및 2006년 11월 7일에 출원된 미국 특허 가출원 제 60/864,637 호의 이익을 청구하고 있으며, 이들 출원의 내용은 그 전체가 본원에서 참조로서 결합되어 있다.
화학식 1로 표시되는 (R)-3-[1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일-1H-피라졸-4-일)-피리딘-2-일아민은 c-Met/HGFR(간세포 성장 인자 수용체) 키나제 및 ALK(퇴행성 림프종 키나제) 활성의 유효한 소분자 억제제이다:
Figure 112008048510808-PCT00001
화학식 1의 화합물은 다양한 종양 유형의 성장 및 전이 진행의 조절과 관련된 c-Met/HGFR, 및 ALCL(퇴행성 대세포 림프종)의 발병기전과 관련된 ALK의 억제를 통해 약물학적으로 조절되는 항종양 성질을 갖는다. 화학식 1의 화합물은 국제 특허 출원 제 PCT/IB2005/002837 호 및 미국 특허 출원 제 11/212,331 호에 개시되어 있으며, 상기 특허 둘다는 그 전체가 본원에서 참고로서 결합되어 있다. 또한, 화학식 1의 화합물의 라세미체는 국제 특허 출원 제 PCT/IB05/002695 호 및 미국 특허 출원 제 11/213,039 호에 개시되어 있으며, 상기 특허 둘다는 그 전체가 본원에서 참고로서 결합된다.
사람의 암은 전세계의 선진국에서 총괄적으로 주된 사망 원인 중의 하나인 다양한 질병을 포함한다(문헌[American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2005. Atlanta: American Cancer Society; 2005] 참조). 암의 진행은 유전자 돌연변이, 염색체 전위, 및 핵형 이상을 포함한 복합적인 다수의 유전 및 분자 사건의 연속에 의해 발생된다(문헌[(Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2000; 100: 57-70) 참조]. 암의 근본적인 유전적 원인은 다양하고 복합적이지만, 각각의 암 유형은 그것의 진행을 용이하게 하는 공통적인 소질 및 후천적인 능력을 보이는 것으로 관측되었다. 이들 후천적 능력은 이상조절된 세포 성장, 혈관을 보충하는 지속적인 능력(혈관생성) 및 국부적으로 확산되고 제 2 기관 부위로 전이되는 종양 세포의 능력을 포함한다(문헌[(Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2000; 100: 57-70] 참조). 그러므로, 1) 암이 진행되는 동안 분자 표적이 바뀌는 것을 억제하거나 또는 2) 여러 종양에서의 암 진행에 공통적인 다수의 과정을 표적으로 하는 새로운 치료제를 찾는 능력의 필요성은 상당히 충족되지 않고 있다.
광범위한 문헌에서는 c-Met/HGFR이 사람의 여러 암 중에서 가장 자주 돌연변이되는 또는 그렇지 않으면 비정상적으로 활성화되는 RTK 중의 하나라는 것을 지적하고 있다(문헌[Christensen JG, Burrows J, Salgia R. c-Met as a target in human cancer and characterization of inhibitors for therapeutic intervention. Cancer Letters 2005; 225: 1-26] 참조). c-Met/HGFR이 돌연변이 또는 유전자 증식에 의해 유전적으로 변경되었다고 보고된 종양 유형은, 충족되지 않는 강한 의약적 필요성을 갖는 종양 증상, 예컨대 직장암, 전이성 결직장암, 신경교종, 비-소세포 폐암, 위암, 및 머리 및 목의 암을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다(문헌[Christensen JG, Burrows J, Salgia R. c-Met as a target in human cancer and characterization of inhibitors for therapeutic intervention. Cancer Letters 2005; 225: 1-26] 참조).
HGFR 돌연변이는 신암종과 관련되어 있다(예를 들면, 문헌[L. Schmidt, K. Junker, N. Nakaigawa, T. Kinjerski, G. Weirich, M. Miller, et al., Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Oncogene 1999; 18: 2343-2350; L. Schmidt, F. M. Duh, F. Chen, T. Kishida, G. Glenn, P. Choyke, et al., Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Nat. Genet. 1997; 16: 68-73; L. Schmidt, K. Junker, G. Weirich, G. Glenn, P. Choyke, I. Lubensky, et al., Two North American families with hereditary papillary renal carcinoma and identical novel mutations in the MET proto-oncogene, Cancer Res. 1998; 58: 1719-1722] 참조). HGFR 돌연변이는 머리 및 목 암종과 관련되어 있다(예를 들면, 문헌[M.F. Di Renzo, M. Olivero, T. Martone, A. Maffe, P. Maggiora, A.D. Stefani, et al., Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas, Oncogene 2000; 19: 1547-1555; D.M. Aebersold, O. Landt, S. Berthou, G. Gruber, KT. Beer, R.H. Greiner, Y. Zimmer, Prevalence and clinical impact of Met Y1253D-activating point mutation in radiotherapytreated squamous cell cancer of the oropharynx, Oncogene 2003; 22: 8519-8523] 참조). HGFR 돌연변이는 폐암종과 연관되어 있다(예를 들면, 문헌[P.C. Ma, T. Kijima, G. Maulik, EA Fox, M. Sattler, J.D. Griffin, et al., c-MET mutational analysis in small cell lung cancer: novel juxtamembrane domain mutations regulating cytoskeletal functions, Cancer Res. 2003; 63: 6272-6281; P.C. Ma, S. Jagdeesh, R. Jagadeeswaran, E.A. Fox, J. G. Christensen, G. Maulik, et al., c-MET expression/activation, functions, and mutations in non-small cell lung cancer, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2004; 63: 1875] 참조).
부가적으로, HGFR 돌연변이는 초기의 간세포 암종, 사람의 위암, 경성 유형 위암, 결직장암 및 악성 흑색종를 포함하지만 이것으로 한정되지 않는 다른 증상과 관련되어 있다(예를 들면, 문헌[W.S. Park, S. M. Dong, S.Y. Kim, E.Y. Na, M.S. Shin, J.H. Pi, et al., Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte growth factor receptor gene in childhood hepatocellular carcinomas, Cancer Res. 1999; 59: 307-310; J.H. Lee, S.U. Han, H. Cho, B. Jennings, B. Gerrard, M. Dean, et al., A novel germ line juxtamembrane Met mutation in human gastric cancer, Oncogene 2000; 19: 4947-4953; A. Lorenzato, M. Olivero, S. Patane, E. Rosso, A. Oliaro, P.M. Comoglio, M.F. Di Renzo, Novel somatic mutations of the MET oncogene in human carcinoma metastases activating cell motility and invasion, Cancer Res. 2002; 62: 7025-7030; H. Kuniyasu, W. Yasui, Y. Kitadai, H. Yokozaki, H. Ito, E. Tahara, Frequent amplification of the c-met gene in scirrhous type stomach cancer, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992; 189: 227-232; M. F. Di Renzo, M. Olivero, A. Giacomini, H. Porte, E. Chastre, L. Mirossay, et al., Overexpression and amplification of the met/HGF receptor gene during the progression of colorectal cancer, Clin. Cancer Res. 1995; 1: 147-154; T. Hara, A. Ooi, M. Kobayashi, M. Mai, K. Yanagihara, I. Nakanishi, Amplification of c-myc, K-sam, and c-met in gastric cancers: detection by fluorescence in situ hybridization, Lab. Invest. 1998; 78: 1143-1153] 참조).
HGFR 돌연변이와 기능 및 발암성과의 관계가 또한 확립되어 있다(예를 들면, 문헌[M. Jeffers, L. Schmidt, N. Nakaigawa, CP. Webb, G. Weirich, T. Kishida, et al., Activating mutations for the met tyrosine kinase receptor in human cancer, Proc. Natl Acad. Sci. USA 1997; 94: 11445-11450; M. Jeffers, M. Fiscella, C.P. Webb, M. Anver, S. Koochekpour, G.F. Vande Woude, The mutationally activated Met receptor mediates motility and metastasis, Proc. Natl Acad. Sci. USA 1998; 95: 14417-14422] 참조).
최종적으로, HGFR 돌연변이는 마우스 종양과 관련되어 있고 상기 종양에서 연구되어 있다(예를 들면, 문헌[H. Takayama, W.J. LaRochelle, R. Sharp, T. Otsuka, P. Kriebel, M. Anver, et al., Diverse tumorigenesis associated with aberrant development in mice overexpressing hepatocyte growth factor/scatter factor, Proc. Natl Acad. Sci. USA 1997; 94: 701-706; T. Otsuka, H. Takayama, R. Sharp, G. Celli, WJ. LaRochelle, D.P. Bottaro, et al., c-Met autocrine activation induces development of malignant melanoma and acquisition of the metastatic phenotype, Cancer Res. 1998; 58: 5157-5167; M.I. Gallego, B. Bierie, L. Hennighausen, Targeted expression of HGF/SF in mouse mammary epithelium leads to metastatic adenosquamous carcinomas through the activation of multiple signal transduction pathways, Oncogene 2003; 22: 8498-8508; C.R. Graveel, Y. Su, L.M. Wang, M. Fiscella, T. Lino, c. Birchmeier, et al., Tumorigenic effects of activating Met mutations in a knock-in mouse model, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2004; 44: 5102] 참조).
염색체 전위로부터 비롯된 NPM-ALK, 즉 퇴행성 림프종 키나제의 발암성 융합 단백질 변이체는 사람의 퇴행성 대세포 림프종의 발병기전과 관련된다(문헌[Pulford K, Morris SW, Turturro F. Anaplastic lymphoma kinase proteins in growth control and cancer. J Cell Physiol 2004; 199: 330-58] 참조). ALCL의 발병기전에서 구성적 활성 ALK 키메라 단백질(chimeric protein)의 비정상 발현의 역할이 잘 정의되어 있다(문헌[Weihua Wan, et.al. Anaplastic lymphoma kinase activity is essential for the proliferation and survival of anaplastic large cell lymphoma cells. Blood First Edition Paper, prepublished online October 27, 2005; DOI 10.1182/blood-2005-08- 3254] 참조).
c-Met/HGFR(야생형 c-Met 포함)의 비적절한 활성은 또한 세포분열, 생존, 혈관생성, 침입성 성장과 같은 다수의 종양의 발암 과정의 이상조절, 특히 전이 과정에서의 이상조절과 관련된다(문헌[Christensen et al, 2005] 참조). 더욱이, c-Met 및 HGF, 즉 이것 단독의 고 친화성 리간드의 발현은 사람의 다수 주요 암에서 열등한 예후 또는 전이 진행과 관련된다는 것이 증명되었다(문헌[Christensen et al, 2005] 참조). NPM-ALK는 ALCL 림프종 세포에서 세포 증식 및 아포프토시스(apoptosis)의 이상조절과 관련된다(문헌[Pulford et al, 2004] 참조).
발명의 개요
하나의 실시양태에서, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량을 비정상 세포 성장의 치료가 필요한 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 치료가 필요한 포유류에서 비정상 세포 성장을 치료하는 방법에 관한 것이다:
화학식 1
Figure 112008048510808-PCT00002
또 다른 실시양태에 있어서, 포유류는 사람이다. 또 다른 실시양태에 있어서, 포유류는 개이다.
또 다른 실시양태에 있어서, 비정상 세포 성장은 유전적으로 변경된 하나 이상의 티로신 키나제에 의해 조절된다. 또 다른 실시양태에서, 비정상 세포 성장은 간세포 성장 인자 수용체(c-Met/HGFR) 키나제 또는 퇴행성 림프종 키나제(ALK)에 의해 조절된다. 또 다른 실시양태에 있어서, 비정상 세포 성장은 간세포 성장 인 자 수용체(c-Met/HGFR) 키나제에 의해 조절된다. 또 다른 실시양태에서 있어서, 비정상 세포 성장은 퇴행성 림프종 키나제(ALK)에 의해 조절된다.
또 다른 실시양태에 있어서, 비정상 세포 성장은 암이다. 또 다른 실시양태에 있어서, 암은 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 결장암, 유방암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계의 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관의 암, 신세포 암종, 신우의 암종, 중추신경계(CNS)의 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 제 2 경추 종양(spinal axis tumor), 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에 있어서, 암은 비-소세포 폐암(NSCLC), 편평 세포 암종, 호르몬-불응성 전립선암, 유두형 신세포 암종, 결장직장 선암종, 신경아세포종, 퇴행성 대세포 림프종(ALCL) 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에 있어서, 상기 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염은 화학식 1의 화합물 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물로서 투여된다.
또 다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염을 투여함으로써 세포에서의 c-Met/HGFR 키나제 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다:
화학식 1
Figure 112008048510808-PCT00003
또 다른 실시양태에 있어서, 세포는 A549 사람의 폐암종, GTL-16 사람의 위암종, HT29 사람의 결장 암종, Colo205 사람의 결장 암종, A498 사람의 신암종, 786-0 사람의 신암종, MBA-MD-231 사람의 유방 암종, 매들린-다비 개의 신장(Madlin-Darby Canine Kidney; MDCK) 상피 세포, P-글라이코프로테인을 발현하도록 유전자조작된 MDCK 세포(MDCK-MDR1), mIMCD3 마우스 신장 상피 세포, HUVEC(사람의 제대 정맥 내피 세포), Caki-1 신암종, 및 HGFR-V1092I, HGFR-H1094R, HGFR-Y1230C 및 HGFR-M1250T를 비롯한 사람의 야생형 c-Met/HGFR 및 돌연변이된 c-Met/HGFR을 발현하도록 유전자조작된 NIH-3T3 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
도 1은 화학식 1의 화합물에 의한 재조합된 사람의 c-Met/HGFR 키나제 활성의 ATP-경쟁 억제를 도시한 것이다.
도 2는 진행된 GTL-16 종양이 있는 무흉선 마우스에게 11일 동안 화학식 1의 화합물을 지시된 투여량으로 또는 비히클 단독만을 경구적으로 투여한 경우를 도시 한 것이다. 도 2A는 GTL-16에서의 c-Met/HGFR 포스포릴화의 억제를 평가하기 위한 연구이며, 도 2B는 GTL-16 종양 성장 억제를 평가하기 위한 연구이다.
도 3은 진행된 U87MG 종양(150㎣)이 있는 무흉선 마우스에게 9일 동안 화학식 1의 화합물을 지시된 투여량으로 또는 비히클 단독만을 경구적으로 투여한 경우를 도시한 것이다. 도 3A는 종양 성장 억제를 평가하기 위한 연구이며, 도 3B는 c-Met/HGFR 포스포릴화의 억제를 평가하기 위한 연구이다.
도 4는 화학식 1의 화합물을 크게 진행된 GTL-16 종양 이종이식이 있는 무흉선 마우스에게 매일 경구 투여한 경우를 도시한 것이다. 도 4A는 무흉선 마우스에서 크게 진행된 GTL-16 종양 이종이식의 퇴화에 관한 것이며, 도 4B는 화학식 1의 화합물의 매일 경구 투여 후 마우스의 체중에 관한 것이다.
도 5는 화학식 1의 화합물을 진행된 NCI-H441 또는 PC-3 종양 이종이식이 있는 무흉선 마우스에게 매일 경구 투여한 경우를 도시한 것이다. 도 5A는 진행된 NCI-H441이 있는 무흉선 마우스에서의 종양 퇴화에 관한 것이며, 도 5B는 진행된 PC-3 종양 이종이식이 있는 무흉선 마우스에서의 종양 퇴화에 관한 것이다.
도 6은 NPM-ALK-의존성 림프종 모델(카파스(Karpas) 299 ALCL 모델)에서 화학식 1의 화합물의 항종양 효능을 도시한 것이다. 도 6A는 종양 성장 억제를 평가하기 위한 연구이고, 도 6B는 NPM-ALK 포스포릴화의 억제를 평가하기 위한 연구이다.
별도로 다르게 기술되지 않는 한, 본원에서 본 발명의 화합물에 대한 모든 언급에는 이것의 염, 용매화물, 수화물 및 착화물, 및 이것의 염의 용매화물, 수화물 및 착화물, 예컨대 이것의 다형체, 입체이성질체, 및 동위원소적 표지화 변형물을 포함한다.
정의
본원에서, 다르게 지시되지 않는 한, 용어 "비정상 세포 성장"은 정상의 조절 메카니즘과 무관한 세포 성장을 의미한다(즉, 접촉 억제의 손실).
본원에서, 다르게 지시되지 않는 한, 용어 "치료하는"은 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 증상 또는 이러한 장애 또는 증상의 하나 이상의 증후군을 회복시키거나, 감소시키거나, 진행을 억제시키거나 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "치료"는, 다르게 지시되지 않는 한, "치료하는"이 바로 위에서 정의된 바와 같을 때, 이러한 치료하는 행위를 의미한다.
본원에서 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 산부가염 및 염기 염(이염 포함)을 포함한다.
적당한 산 부가염은 비독성 염을 형성하는 산으로부터 형성된다. 이러한 것의 보기로서 아세트산염, 아스파르산염, 안식향산염, 베실산염, 중탄산염/탄산염, 중황산염/황산염, 붕산염, 캄실산염, 시트르산염, 에디실산염, 에실산염, 폼산염, 푸마르산염, 글루셉테이트, 글루콘산염, 글루쿠론산염, 헥사플루오로인산염, 히벤산염, 염산염/염화물, 브롬산염/브롬화물, 요오드산염/요오드화물, 이세티오산염, 락트산염, 말산염, 말레산염, 말론산염, 메실산염, 메틸황산염, 나프틸산염, 2-나프실산염, 니코틴산염, 질산염, 오로테이트, 옥살산염, 팔미트산염, 파모산염, 인산염/인산화수소/이인산화수소, 사카레이트, 스테아르산염, 석신산염, 타타르산염, 토실산염, 및 트라이플루오로아세트산염을 들 수 있다.
적당한 염기 염은 비독성 염을 형성하는 염기로부터 형성된다. 이러한 것의 보기로서 알루미늄, 아르기닌, 벤즈아씬, 칼슘, 콜린, 다이에틸아민, 다이올라민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올라민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민 및 아연 염을 들 수 있다.
적당한 약학적으로 허용되는 염에 대해서는 문헌["Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" by Stahl and Wermuth(Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)]을 참조할 수 있다.
본 발명의 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 상기 화합물의 용액과 함께 적절하다면 목적 산 또는 염기를 혼합시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 이러한 염은 용액으로부터 침전되어 여과에 의해 수거되거나, 또는 용매의 증발에 의해 회수될 수 있다. 염의 이온화 정도는 완전한 이온화로부터 거의 이온화되지 않는 것까지 다양할 수 있다.
본 발명의 화합물은 비용매화 및 용매화 형태로 존재할 수 있다. 용어 "용매화물"은 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 용매 분자(예, 에탄올)를 포함하는 분자 착화물을 기술하는데 사용된다. 용어 "수화물"은 용매가 물인 경우 사용된다. 본 발명에 따라 약학적으로 허용되는 용매화물은, 수화물 및 결정화 용매가 동위원소적으로 치환된 용매화물, 예컨대 D2O, d6-아세톤, d6-DMSO를 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 원자가 자연상태에서 주로 존재하는 원자량 또는 질량수와는 다른 원자량 또는 질량수를 갖는 원자에 의해 치환되는 것을 제외하고는 화학식 1의 화합물과 동일한 동위원소적 표지화 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 포함될 수 있는 동위원소의 보기로서 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소 및 염소의 동위원소, 예컨대 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F, 및 36Cl 각각을 들 수 있다. 본 발명의 화합물 및 전술된 동위원소 및/또는 다른 원자의 다른 동위원소를 함유하는 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염이 본 발명이 범위 내에 있다. 본 발명의 특정 동위원소 표지화 화합물, 예컨대 방사성 동위원소, 예컨대 3H 및 14C가 결합된 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 분석에 유용하다. 삼중수소(즉, 3H) 및 탄소-14(즉, 14C)가 제조 및 검출의 용이성 면에서 특히 바람직하다. 중수소(즉, 2H)와 같은 더 무거운 동위원소로의 치환은 더 큰 대사 안정성으로부터 비롯된 특정 치료학적 이점, 예컨대 생체내에서의 반감기의 증가 또는 필요한 투여량의 감소를 제공할 수 있고, 따라서 경우에 따라 바람직할 수 있다. 본 발명의 화학식 1의 동위원소 표지화 화합물은 비표지화 화합물과 관련하여 기술된 절차를 실시하고 비동위원소 표지화 시약 대신에 용이하게 이용할 수 있는 동위원소적 표지화 시약으로 대체함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 범위 내에는 전술된 용매화물과는 다르게 약물 및 호스트가 화학량논적 또는 비화학량논적 함량으로 존재하는 포접물, 약물-호스트 내포 착화물과 같은 착화물을 포함한다. 화학량논적 또는 비화학량논적 함량일 수 있는 둘 이상의 유기 및/또는 무기 성분을 함유한 착화물이 또한 포함된다. 이러한 결과의 착화물은 이온화될 수있거나, 부분적으로 이온화될 수 있거나 또는 비이온화될 수 있다. 이러한 착화물의 내용에 대해서는 본원에 참고로 그의 전체가 결합되어 있는 문헌[J Pharm Sci, 64(8), 1269-1288 by Haleblian(August 1975)]을 참조할 수 있다.
경구 투여
본 발명의 화합물은 경구적으로 투여될 수 있다. 경구 투여는 삼켜서 화합물이 위장관에 주입되며, 볼 또는 설하 투여가 사용되며, 이로 인해 화합물이 입으로부터 직접적으로 혈류로 주입된다.
경구 투여에 적당한 제제는 고체 제제, 예컨대 정제, 미립자, 액체 또는 분말을 함유하는 캡슐, 로젠지(액체-충전된 것 포함), 츄잉검, 다미립자 및 나노미립자, 겔, 고체 용액, 리포좀, 필름(점액 접착제 포함), 난형, 분무, 및 액체 제제를 포함한다.
액체 제제는 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 이러한 제제는 연질 또는 경질 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있으며, 전형적으로 담체, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글라이콜, 프로필렌 글라이콜, 메틸셀룰로즈, 또는 적당한 오일 및 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁제를 포함한다. 액체 제제는 또한 예를 들면 사세로부터 고형물의 재구성에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 문헌[Expert Opinion in Therapeutic Patents, 11(6), 981-986, by Liang and Chen(2001)]에 기술된 것과 같은 빠른 용해 및 빠른 붕해 투여 형태로 사용될 수 있다.
정제 투여 형태에 있어서, 투여량에 따라 다르지만, 약물은 투여 형태의 1중량% 내지 80중량%, 더욱 전형적으로는 투여 형태의 5중량% 내지 60중량%를 차지할 수 있다. 약물에 더하여, 정제는 일반적으로 붕해제를 함유한다. 붕해제의 보기로서 나트륨 전분 글라이콜레이트, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 칼슘 카복시메틸 셀룰로즈, 크로스카멜로즈 나트륨, 크로스포비돈, 폴리바이닐피롤리돈, 메틸 셀룰로즈, 미세결정질 셀룰로즈, 저급 알킬-치환된 하이드록시프로필 셀룰로즈, 전분, 예비젤라틴화된 전분 및 나트륨 알기네이트를 들 수 있다. 일반적으로, 붕해제는 투여 형태의 1중량% 내지 25중량%, 바람직하게는 5 내지 20중량%를 포함할 것이다.
정제 제제에 응축성을 부여하기 위해 결합제가 일반적으로 사용된다. 적당한 결합제는 미세결정질 셀룰로즈, 젤라틴, 슈가, 폴리에틸렌 글라이콜, 천연 및 합성 검, 폴리바이닐피롤리돈, 예비젤라틴화 전분, 하이드록시프로필 셀룰로즈 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈이다. 정제는 또한 희석제, 예컨대 락토즈(일수화물, 분무건조된 일수화물, 무수물 등), 만니톨, 자일리톨, 덱스트로즈, 슈크로즈, 소비톨, 미세결정질 셀룰로즈, 전분 및 이염기성 인산칼슘 이수화물을 포함할 수 있다.
정제는 또한 임의적으로 표면활성제, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트 및 폴리솔베이트 80; 및 활제(glidant), 예컨대 이산화규소 및 활석을 포함할 수 있다. 존재시, 표면활성제는 정제의 0.2중량% 내지 5중량%의 양이며, 활제는 정제의 0.2중량% 내지 1중량%이다.
정제는 또한 일반적으로 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 및 마그네슘 스테아레이트와 나트륨 라우릴 설페이트와의 혼합물을 함유한다. 윤활제는 일반적으로 정제의 0.25중량% 내지 10중량%, 바람직하게는 0.5중량% 내지 3중량%의 양으로 존재한다.
다른 가능한 성분은 산화방지제, 착색제, 향미제, 보존제 및 맛차단제이다.
전형적인 정제는 약 80중량% 이하의 약물, 약 10중량% 내지 약 90중량%의 결합제, 약 0중량% 내지 약 85중량%의 희석제, 약 2중량% 내지 약 10중량%의 붕해제 및 약 0.25중량% 내지 약 10중량%의 윤활제를 함유한다.
정제 결합제는 정제를 형성하기 위해 직접적으로 압착되거나 롤러에 의해 압착될 수 있다. 정제 배합물 또는 배합물의 일부는 다르게는 정제화되기 전에 습식, 건식 또는 용융-그래뉼, 용융 응고 또는 압출될 수 있다. 최종 제제는 하나이상의 층을 포함할 수 있으며, 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있거나, 캡슐화될 수 있다.
정제 제제는 본원에 참고로 그의 전체가 결합되어 있는 문헌["Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol. 1" by H. Lieberman and L. Lachman, Marcel Dekker, N.Y., N.Y., 1980(ISBN 0-8247-6918-X)]에 논의되어 있다.
경구 투여용 고체 제제는 즉시 방출형 및/또는 변형된 방출형으로 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연 방출형, 서방성 방출형, 맥동 방출형, 제어 방출형, 표적 방출형 및 프로그램화 방출형을 포함한다.
적당한 변형된 방출 제제는 미국 특허 제 6,106,864 호에 기술되어 있다. 고에너지 분산, 및 삼투성 및 코팅된 입자와 같은 다른 적당한 방출 기법에 대한 상세한 설명은 버마(Verma) 등의 문헌[Pharmaceutical Technology On-line, 25(2), 1-14(2001)]에서 찾아볼 수 있다. 제어 방출을 달성하기 위한 츄잉검의 용도는 국제 특허 공개 제 00/35298 호에 기술되어 있다. 이러한 참조 문헌의 기술 내용이 참고로서 그 전체가 본원에 결합되어 있다.
비경구 투여
본 발명의 화합물은 또한 혈류에, 근육 또는 내부 조직에 직접적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적당한 수단은 정맥내, 동맥내, 복강내, 경막내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내, 및 피하 투여를 포함한다. 비경구 투여를 위한 적당한 장치는 침(마이크로침 포함) 주입기, 침이 없는 주입기 또는 주입 기법을 포함한다.
비경구 제제는 전형적으로 부형제, 예를 들면 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게는 pH 3 내지 9)를 함유할 수 있는 수성 용액이지만, 일부 용도에서는 이것들은 멸균 비수성 용액으로서 또는 피로겐이 없는 멸균 수와 같은 적당한 비히클과 결합하여 사용되는 건조형태로서 제제화될 수 있다.
예를 들면, 동결건조에 의한 멸균 조건 하에서의 비경구 제제의 제조는 당해 기술분야의 숙련가에게 널리 공지된 표준 약학 기법을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다.
비경구 용액의 제조에 사용되는 본 발명의 화합물의 용해도는, 용해도 증진제의 혼입과 같은 적절한 제제 기술을 사용하여 증가시킬 수 있다.
비경구 투여용 제제는 즉시 방출형 및/또는 변형된 방출형으로서 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연 방출형, 서방성 방출형, 맥동 방출형, 제어 방출형, 표적 방출형 및 프로그램화 방출형을 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 활성 화합물의 변형된 방출을 제공하는 주입 장소에 투여하기 위해 고체, 반고체 또는 틱소트로픽 액체로서 제제화될 수 있다. 이러한 제제의 보기로서는 약물-코팅된 스텐트 및 PGLA 미소구체를 포함한다.
국소 투여
본 발명의 화합물은 또한 피부 또는 점막에 국소적으로, 즉 피하적으로 또는 경피적으로 투여될 수 있다. 이러한 목적을 위한 전형적인 제제는 겔, 하이드로겔, 로션, 용액, 크림, 연고, 더스팅 분말, 드레싱, 발포체, 필름, 피부 패치, 웨이퍼, 임플런트, 스폰지, 섬유, 붕대, 및 마이크로유화액을 포함한다. 리포좀이 또한 사용될 수 있다. 전형적인 담체는 알콜, 물, 무기질 오일, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 글라이세린, 폴리에틸렌 글라이콜 및 프로필렌 글라이콜을 포함한다. 침투 증진제가 혼입될 수 있다(예컨대, 문헌[J Pharm Sci, 88(10), 955-958 by Finnin and Morgan(October 1999)] 참조). 국소 투여의 다른 수단은 전기천공법, 전리요법, 포노포레시스(phonophoresis), 소노포레시스(sonophoresis), 및 미소침 또는 침이 없는(예, 상표명 파우더젝(Powderject), 상표명 바이오젝(Bioject) 등) 주입법에 의한 전달을 포함한다. 상기 참고 문헌의 기술 내용은 참고로서 그의 전체가 본원에 결합되어 있다.
국소 투여를 위한 제제는 즉시 방출형 및/또는 변형된 방출형으로 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연 방출형, 서방성 방출형, 맥동 방출형, 제어 방출형, 표적 방출형 및 프로그램화 방출형을 포함한다.
흡입/ 비강내 투여
본 발명의 화합물은 또한 무수 분말 흡입기로부터의 건조 분말 형태(단독으로, 또는 예를 들면 락토즈와의 무수 배합물 중의 혼합물 형태로서, 또는 예를 들면 포스파타이딜콜린과 같은 포스포리피드와 혼합된 혼합 성분 입자로서)로, 또는 적합한 추진제, 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에테인 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로페인을 사용하거나 사용하지 않고서, 가압 용기, 펌프, 분무기, 아토마이저(바람직하게는 미세 미스트를 형성하기 위한 일렉트로하이드로다이나믹스(electrohydrodynamics)를 사용하는 아토마이저) 또는 네블라이저로부터의 에어로졸 분무 형태로서 비강내로 또는 흡입으로 투여될 수 있다. 비강내 사용에 있어서, 분말은 키토산 또는 사이클로덱스트린과 같은 바이오접착제를 포함할 수 있다.
가압 용기, 펌프, 분무기, 아토마이저 또는 네블라이저는, 예컨대 용매로서 에탄올, 수성 에탄올, 또는 활성 물질을 분산, 용해 또는 연장방출시키는 적당한 또 다른 시약, 용매로서의 추진제 및 선택적인 계면활성제(예컨대, 소르비탄 트라이올레이트, 올레산 또는 올리고락트산)을 포함하는 본 발명의 화합물의 용액 또는 현탁액을 함유한다.
건조 분말 또는 현탁액 제제에 사용하기 전에, 약물은 흡입(전형적으로 5마이크론 미만)에 의한 전달을 위해 적당한 크기로 퇴행될 수 있다. 이것은 나선형 젯 밀링, 유상 젯 밀링, 나노입자를 형성하기 위한 초임계 유체 처리, 고압 균질화 또는 분무 건조와 같은 적절한 분쇄 방법에 의해 달성될 수 있다.
흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐(예컨대, 젤라틴 또는 HPMC로 제조됨), 블리스터(blister) 및 카트리지(cartridge)는 본 발명의 화합물, 락토즈 또는 전분 같은 적합한 분말 베이스 및 l-루이신, 만니톨, 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 성능 개질제의 분말 혼합물을 함유하도록 제제화될 수 있다. 락토즈는 무수물이거나 또는 일수화물 형태(바람직하게는 후자)일 수 있다. 다른 적당한 부형제는 덱스트란, 글루코스, 말토즈, 소비톨, 자일리톨, 프락토즈, 슈크로즈 및 트레할로즈를 포함한다.
미세 미스트를 제조하기 위해 일렉트로하이드로다이나믹스를 사용하는 아토마이저에 사용하기 적당한 용액 제제는 작동당 본 발명의 화합물을 1㎍ 내지 20mg으로 함유할 수 있으며, 작동 부피는 1㎕ 내지 100㎕이다. 전형적인 제제는 본 발명의 화합물, 프로필렌 글라이콜, 멸균 수, 에탄올 및 염화나트륨을 포함한다. 프로필렌 글라이콜 대신에 사용될 수 있는 또 다른 용매에는 글라이세롤 및 폴리에틸렌 글라이콜을 포함한다.
흡입 또는 비강내 투여를 위해 사용하고자 하는 본 발명의 상기 제제에 적합한 향미제(예, 메탄올 및 레보멘톨) 또는 감미제(예, 사카린 또는 사카린 나트륨)가 첨가될 수 있다.
흡입/비강내 투여를 위한 제제는 예를 들면 폴리(DL-락트산-코글라이콜산(PGLA)를 사용하여 즉시 방출형 및/또는 변형된 방출형으로 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연 방출형, 서방성 방출형, 맥동 방출형, 제어 방출형, 표적 방출형 및 프로그램화 방출형을 포함한다.
건조 분말 흡입제 및 에어로졸의 경우에 있어서, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브의 수단에 의해 결정된다. 본 발명에 따른 단위는 본 발명의 화합물의 목적 양을 함유한 계량된 투여량 또는 "퍼프(puff)"가 투여되도록 조정될 수 있다. 전체 일일 투여량은 하루를 통해 1회 투여량 또는 더욱 일반적으로는 분할된 투여량으로 투여될 수 있다.
직장/질내 투여
본 발명의 화합물은 예를 들면 좌제, 페사리 또는 관장제 형태로 직장적으로 또는 질내로 투여될 수 있다. 코코어 버터가 전형적인 좌제 베이스이지만, 다양한 대체물이 적절하게 사용될 수 있다.
직장/질내 투여를 위한 제제는 즉시 방출형 및/또는 변형된 방출형으로 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연 방출형, 서방성 방출형, 맥동 방출형, 제어 방출형, 표적 방출형 및 프로그램화 방출형을 포함한다.
눈에의 투여
본 발명의 화합물들은 또한 전형적으로 pH-조정된 등장성 멸균 염수 중의 미분된 현탁액 또는 용액의 점적약의 형태로, 눈 또는 귀에 직접 투여될 수 있다. 눈 또는 귀에 투여하기에 적당한 다른 제제들은 연고, 생물 분해성(예, 흡수성 겔 스펀지, 콜라겐) 및 비-생물 분해성(예, 실리콘) 임플란트, 웨이퍼, 렌즈 및 니오좀(niosome) 또는 리포좀과 같은 미립자 또는 소포 시스템을 포함한다. 가교 결합된 폴리아크릴산, 폴리바이닐알콜, 히알루론산, 예를 들어 하이드록시프로필메틸셀룰로즈, 하이드록시에틸셀룰로즈, 또는 메틸 셀룰로즈와 같은 셀룰로즈성 중합체, 또는 예를 들어 겔란 검(gelan gum)과 같은 헤테로폴리사카라이드 중합체와 같은 중합체들이 벤즈알코늄 클로라이드와 같은 보존제와 함께 혼입될 수 있다. 이러한 제제들은 또한 전리요법에 의해 전달될 수 있다.
눈/귀에 투여하기 위한 제제는 즉시 방출형 및/또는 변형된 방출형으로 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연 방출형, 서방성 방출형, 맥동 방출형, 제어 방출형, 표적 방출형 및 프로그램화 방출형을 포함한다.
기타 기법
본 발명의 화합물들은, 전술한 임의 투여 방식에 사용되기 위해 이들의 가용성, 용해율, 맛-차단성, 생물학적 이용가능성 및/또는 안정성을 향상시키기 위해, 사이클로덱스트린 및 이의 적당한 유도체 또는 폴리에틸렌 글라이콜-함유 중합체와 같은 가용성 고분자체와 조합될 수 있다.
예를 들어, 약물-사이클로덱스트린 착화물은 대부분의 투여 형태 및 투여 방식에 일반적으로 유용한 것으로 밝혀졌다. 내포 및 비내포 착화물 둘 다가 사용될 수 있다. 약물과의 직접적인 착체화의 대안으로서 사이클로덱스트린이 보조 첨가제로서, 즉, 담체, 희석제, 또는 용해제로서 사용될 수 있다. 알파, 베타 및 감마 사이클로덱스트린이 이러한 목적으로 가장 일반적으로 사용되며, 이들의 예는 국제 특허 공개 제 91/11172 호, 국제 특허 공개 제 94/02518 호, 및 국제 특허 공개 제 98/55148 호에서 찾을 수 있으며, 상기 기술 내용은 그의 전체가 참고로서 본원에 결합되어 있다.
투여량
투여된 활성 화합물의 양은, 치료될 환자, 질환 및 증상의 심각성, 투여 비율, 화합물의 특성 및 처방 의사의 판단에 좌우될 것이다. 그러나, 효과적인 투여량은 전형적으로 1일당 약 0.001 내지 약 100mg/체중 kg, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 35mg/kg으로서 한번에 또는 분할하여 투여될 수 있다. 70kg의 사람인 경우, 이것은 약 0.07 내지 약 7000mg/일, 바람직하게는 약 0.7 내지 약 2500mg/일이다. 경우에 따라, 전술된 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 더욱 적절할 수 있으며, 다른 경우에는 훨씬 더 큰 투여량이 어떠한 해로운 부작용을 일으키지 않으면서 사용될 수 있으며, 상기 더 큰 투여량은 전형적으로 하루에 걸쳐 더욱 작은 수개의 투여량으로 분할된다.
키트
예를 들면 특정 질환 또는 증상을 치료하기 위해, 활성 화합물의 조합물을 투여하는 것이 요망되는 한, 본 발명의 범주 내에 2종 이상의 약학 조성물(이중 적어도 1종은 본 발명에 따른 화합물을 함유함)이 이들 조성물의 동시투여에 적합한 키트의 형태로 편리하게 조합된 것도 포함된다. 따라서, 본 발명의 키트는 2종 이상의 별도의 약학 조성물(이중 적어도 1종은 본 발명의 화합물을 함유함), 및 이 조성물을 별도로 보유하기 위한 수단, 예컨대 용기, 분할된 병 또는 분할된 호일 패킷(foil packet)을 포함한다. 이러한 키트의 보기로서 정제, 캡슐 등을 포장하는데 사용된 잘 알려진 블리스터 팩을 들 수 있다.
본 발명의 키트는 상이한 투여 형태, 예컨대 경구 및 비경구 투여 형태를 투여하거나, 별도의 조성물을 상이한 투여 간격으로 투여하거나, 또는 별도의 조성물을 서로에 대하여 적정하기에 특히 적합하다. 컴플라이언스(compliance)를 돕기 위해, 키트는 전형적으로는 투여용 지침서를 포함하고, 기억 보조물과 함께 제공될 수 있다.
실험실내 분석
재료 및 방법
실험실내 방법
생화학적 키나제 분석 방법
c-Met/HGFR 키나제의 억제를 위한 화학식 1의 화합물의 생화학적 Ki 값은 하기와 같이 ATP 턴오버(turnover)에 결합된 NADH 산화를 모니터하는 일반적인 절차를 사용하여 측정하였다. 화합물 및 키나제 분석 시약을 시험 웰에 도입하고 37℃에서 10분 동안 배양시킨다. c-Met/HGFR 효소의 첨가에 의해 분석을 개시한다. 효소 억제제가 측정된 효소의 활성을 감소시킨다. 연속-결합 분광광도 분석에서, 340nm에서 흡광도의 감소를 측정하여 NADH의 소비율을 분석함으로써 키나제에 의한 시간-의존성 ADP 생성을 측정한다. 키나제 효소가 ADP를 생성할 때, ADP는 포스페놀 피루베이트 및 피루베이트 키나제와의 반응에 의해 ATP로 재전환된다. 피루베이트도 또한 상기 반응에서 생성된다. 이어서, 피루베이트는 락테이트 데하이드로게나제(dehydrogenase)와의 반응에 의해 락테이트로 전환되고, 이것은 동시에 NADH를 NAD로 전환시킨다. NADH는 340nm에서 측정가능한 흡광도를 갖는 반면, NAD는 그렇지 않다. 그러므로, 분석 종말점은 340nm에서 분광광도에 의해 지정된 시점에서 측정된다.
세포 시그널링 생화학적 키나제 분석 방법(업스테이트: Upstate )
분석 물질에 첨가하기 전에 키나제를 10배(10x)의 실험 농도로 미리희석시켰다. 간단하게 말하자면, 기질을 히스톤 H1(20mM MOPS(pH 7.4) 중의 1O x 실험 원료), PDKtide(5OmM Tris(pH 7.0) 중의 10 x 실험 원료) 및 ATF2(이것은 전형적으로 50mM Tris(pH 7.5), 150mM NaCl, 0.1mM EGTA, 0.03% Brij-35, 50% 글라이세롤, 1mM 벤즈아미딘, 0.2mM PMSF 및 0.1% α-머캅토에탄올 중의 20 x 실험 원료에서 보관됨)에 더하여 탈이온수 중에서 실험 원료로 용해시키고 희석시켰다. 이어서, 8mM MOPS(pH 7.0), 0.2mM EDTA, 50μM EAIYAAPFAKKK, 10mM 아세트산 마그네슘 및 32P-ATP(비활성도 약 500cpm/pmol, 필요에 따른 농도)로 배양된 선택된 효소 5 내지 10mU를 함유한 25㎕의 최종 반응 부피에서 실험 대상의 생화학적 효소를 분석하였다. MgATP 혼합물을 첨가하여 반응을 개시하였다. 실온에서 40분 동안 배양시킨 후, 5㎕의 3% 인산 용액을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 이어서, 10㎕의 반응물을 P30 필터매트(filtermat)에 떨어뜨리고, 75mM 인산에서 5분 동안 3회 그리고 메탄올에서 1회 세척한 후 건조시키고 섬광계수하였다.
세포주
실험실 내 연구에서 화학식 1의 화합물의 평가를 위해 사용된 세포주는 다음과 같다: A549 사람의 폐암종, GTL-16 사람의 위암종, HT29 사람의 결장 암종, Colo205 사람의 결장 암종, A498 사람의 신암종, 786-0 사람의 신암종, MBA-MD-231 사람의 유방 암종, 매들린-다비 개의 신장(MDCK) 상피 세포, P-글라이코프로테인을 발현하도록 유전자조작된 MDCK세포(MDCK-MDR1), mIMCD3 마우스 신장 상피 세포, HUVEC(사람의 제대 정맥 내피 세포), 및 HGFR-V1092I, HGFR-H1094R, HGFR-Y1230C 및 HGFR-M1250T를 비롯한 사람의 야생형 c-Met/HGFR 및 돌연변이된 c-Met/HGFR을 발현하도록 유전자조작된 NIH-3T3 세포. 다른 티로신 키나제의 포스포릴화의 억제를 평가하는데 사용된 세포주는 다음과 같았다: KARPAS 299, SU-DHL-1, 및 쥬르캐트(Jurkat) 사람의 림프종 세포, 사람의 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), 사람의 거대 혈관 내피 세포(HMVEC), 사람의 VEGFR2, PDGFRβ, TrkA 및 TrkB를 발현하도록 유전자조작된 돼지의 대동맥 내피(PAE) 세포, 사람의 Ron, Axl, Sky 및 EGFR/Tie-2 키메라를 발현하도록 유전자조작된 NIH-3T3 세포, 사람의 IRK를 발현하도록 유전자조작된 HEK293 세포, 사람의 Ron을 발현하도록 유전자조작된 차이나 햄스터 난소(CHO-B) 세포 및 사람의 BCR-Abl를 발현하도록 유전자조작된 BaF3 세포. 유전자조작된 세포주 모두는 화이자(Pfizer)에서 생산되었으며, GTL-16 위암종 세포는 파 올로 코모글리오(Paolo Comoglio) 박사(유니버시티 토리노 메디칼 스쿨(University Torino Medical School); 이탈리아 칸디올로 소재)로부터 기부된 것이며, HUVEC 및 HMVEC(사람의 거대 혈관 내피 세포)는 클로네틱스 인코포레이티드(Clonetics, Inc.; 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)로부터 구매한 것이며, 다른 것들은 ATCC(미국 버어지니아주 마나싸스 소재)로부터 입수한 것이다. 다르게 지시되지 않는 한, 세포 배양 시약은 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(Life Technologies, Inc.; 미국 메릴랜드주 카이터스버그 소재)로부터 입수한 것이다. 세포들은 5 내지 10%의 CO2가 있는 가습 대기 중의 37℃에서 보관되었으며, 표준 세포 배양 기술을 사용하여 유지되었다.
항체 및 성장 인자
실험실내 ELISA 및 면역블로팅(immunoblotting) 연구에서 화학식 1의 화합물을 평가하기 위해 사용된 항체는 다음과 같았다: 지메드/인비트로겐(Zymed/Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터의 안티-토탈(anti-total) 사람의 c-Met/HGFR 및 안티-포스포 Zap70; 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology; 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)로부터의 안티-토탈 Ron, 안티-토탈 FGFR1, 안티-토탈 PDGFRβ, 안티-토탈 Trk, 안티-토탈 Tie-2, 및 안티-포스포 티로신(PY-20); 알앤디 시스템스(R&D Systems; 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터의 안티-토탈 Axl 및 안티-토탈 마우스 c-Met/HGFR; 비디 파르민겐(BD Pharmingen; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로부터의 안티- 토탈 IRK; 노버스 바이오로지칼스(Novus Biologicals; 미국 콜로라도주 리틀톤 소재)로부터의 안티-VEGFR2; 및 셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies; 미국 매사츄세츠주 보스톤 소재)로부터의 안티-포스포-c-Met/HGFR, 안티-토탈 및 포스포 ALK, 안티-토탈 c-ABL, 안티-토탈 및 포스포르 Gab1, 안티-토탈 및 포스포 AKT, 안티-토탈 및 포스포르-MAPK44/42, 안티-포스포 Raf, Mek1/2, P90RSK, 및 STAT5.
세포 분석에 이용되는 대부분의 성장 인자는 알앤디 시스템스(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터 입수한 것이지만, BDGF는 깁코BRL/인비트로겐(GibcoBRL/lnvitrogen; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터 입수한 것이고, EGF는 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science; 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)로부터 입수한 것이었다.
세포 키나제 포스포릴화 분석
리간드-의존성 또는 구성적 키나제 포스포릴화를 억제하는 화학식 1의 화합물의 능력을 직접적으로 측정하기 위해 사용된 세포 분석(즉, ELISA 또는 면역 블로팅)은 다양한 혈청-결핍 세포를 사용하여 실시하였다.
세포 제조
성장 배지(10%의 우태 혈청(FBS)으로 보충된 배지) 중의 96웰 플레이트에서 세포를 시드화하고, 분석 플레이트에의 부착을 용이하게 하기 위해 37℃에서 밤새 배양시켰다. 부착 후, 성장 배지를 제거하고, 세포들을 혈청이 없는 배지(0.04% BSA를 지님)에서 배양시켰다. 화학식 1의 화합물의 연속적인 희석을 실시하고, 적 절한 대조 또는 지정 농도의 화학식 1의 화합물을 각 웰에 첨가하고, 세포들을 1시간 동안 37℃에서 배양시켰다. 리간드-의존성 RTK 포스포릴화를 평가하는 실험에서, 대응하는 성장 인자들(예, HGF, MSP, Gas6, EGF, NGF, BDNF, 인슐린, VEGF, 또는 PDGF BB)을 8 내지 20분 동안 세포에 첨가하였다. H2O2를 사용하여 하기 문헌에 기재된 바와 같이 HUVEC 세포에서 사람의 Axl 포스포릴화를 자극하였다(문헌[Konishi, A., Aizawa, T. Mohan, A., Korshunov, V. A. and Berk, B. C, Hydrogen peroxide activates the Gas6-Axl pathway in vascular smooth muscle cells. The Journal of Biological Chemistry, 279:28766-28770(2004)] 참조). 구성적 활성 키나제 활성을 갖는 세포주에 대한 외인성 리간드(예, GTL-16 세포에서의 c-Met/HGFR, 카파스 299 세포에서의 NPM-ALK, Ron-CHO-B 세포에서의 Ron, 및 BCR-Abl BaF3 세포에서의 BCR-Abl)의 첨가없이 구성적 키나제 포스포릴화를 측정하였다. 화학식 1의 화합물/또는 적절한 리간드로 지정된 시간 동안 배양시킨 후, 세포들을 HBSS 중에서 1mM Na3VO4로 1회 세척한 후, 용해 완충액(셀 시그널링 테크놀로지스; 미국 매사츄세츠주 보스톤 소재)을 사용하여 용해시켰다.
ELISA 분석
각 단백질에 특이한 포획 항체들 및 포스포릴화 티로신 잔기에 특이한 검출 항체를 사용하는 샌드위치(sandwich) ELISA 방법에 의해 실험 대상의 단백질 키나제의 포스포릴화를 평가하였다. 각 ELISA 분석에 있어서, 적절한 RTK 리간드 및/또는 화학식 1의 화합물로 처리된 다양한 세포주로부터 생성된 단백질 용해물을 안 티-c-Met/HGFR, -Ron, -Axl, -Sky, -IR, -Tie-2, -KDR, -PDGFRβ, -Zap70 등을 포함하는 대응하는 항체로 미리 코팅된 96웰 플레이트로 옮겼다. 항체-코팅된 플레이트를 4℃에서 밤새 단백질 용해물의 존재 하에 배양시킨 후, PBS 중의 1% 트윈(Tween) 20으로 여러번 세척하였다. HRP-PY20(양고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬게이트화된 안티-토탈-포스포티로신, 산타 크루즈 바이오테크놀로지; 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)을 블로킹(bloking) 완충액(피어스(Pierce); 미국 일리노이주 록포드 소재) 중에서 1:500으로 희석시키고, 30분 동안 각 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 다시 세척하고, TMB 퍼옥시다제 기질(바이오-래드 레보러토리스(Bio-Rad laboratories); 미국 캘리포니아주 허쿨레스 소재)을 첨가하여 HRP-의존성 비색계 반응을 개시하였다. 0.09N의 H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 분광광도계를 사용하여 OD-450nm에서 플레이트를 측정하였다. 엑셀계 템플레이트(Excel-based template)에서 4-파라미터 분석 방법을 사용하여 농도-반응 곡선 피팅(fitting)에 의해 IC50 값을 계산하였다.
면역블로팅
세포 키나제 포스포릴화를 억제하는 화학식 1의 화합물의 능력을 면역블로팅 방법에 의해 또한 측정하였다. 혈청이 없는 배지에서 화학식 1의 화합물의 희석액으로 세포들을 처리하고 상술된 바와 같이 단백질 추출을 위해 용해시켰다. 세포 용해물을 BSA 분석(피어스; 미국 일리노이주 록포드 소재)에 의해 단백질 농도에 대해 규정화하고 특이 항체를 사용하여 실험 대상의 단백질을 면역침전시켰다. 면 역침전된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고, 안티-포스포티로신 항체로 면역블로팅을 실시하여 각 약물 농도에서의 포스포릴화된 단백질의 상대적인 수준을 측정하였다. 면역블로팅 방법을 또한 사용하여 실험 대상의 분자에 대한 총 단백질 수준을 측정하였다.
세포 증식 및 생존 분석
세포 증식 분석
성장 배지(10%의 우태 혈청(FBS)으로 보충된 배지) 중의 96웰 플레이트에서 낮은 밀도로 종양 세포를 시드화하고, 37℃에서 밤새 배양시켰다. 다음 날, 성장 배지를 제거하고, 세포들을 혈청이 없는 배지(0% FBS 및 0.04% BSA를 지님)에서 배양시켰다. 화학식 1의 화합물의 연속적인 희석을 실시하고, 적절한 대조 또는 지정된 농도의 화학식 1의 화합물을 각 웰에 첨가하고, 세포를 24시간 내지 72시간 동안 37℃에서 배양시켰다. 이어서, MTT 분석(프로메가(Promega); 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 실시하여 상대 세포 수를 측정하였다. 4-파라미터 분석 방법을 사용하여 농도-반응 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다.
아포프토시스 /세포 생존 분석
GTL-16 세포를 96웰 플레이트에서 40,000세포/웰로 시드화시켰다. 지정된 농도의 PF-02341066 또는 비히클을 혈청이 없는 배지 중의 웰에 첨가하였다. 세포들을 37℃, 5% CO2 중에서 48시간 동안 배양시켰다. ssDNA 아포프토시스 ELISA 키트(케미콘 인터내셔널(Chemicon International))을 사용하여 아포프토시스를 검출 하였다.
HGF-자극된 HUVEC 생존 분석
HUVEC 세포들(패세지 3)을 EGM2 배지(미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)에서 합해질 때까지 성장시켰다. 세포들을 EGM2 배지 중의 96웰 플레이트에서 고밀도(20,000 내지 30,000/웰)로 시드화하고 5 내지 6시간 동안 배양시켜 세포들을 부착시켰다. 부착시킨 후, 세포들을 37℃의 5% CO2 중에서 혈청이 없는 배지(셀 어플리케이션(Cell Applications); 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 밤새 배양시켰다. 다음 날, 세포를 결핍 배지(셀 어플리케이션; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 5시간 동안 노출시켰다. 화학식 1의 화합물을 혈청이 없는 배지 중에서 연속적으로 희석시키고, 적절한 대조 또는 지정된 농도의 화학식 1의 화합물을 각 웰에 첨가하였다. 1시간 후, 사람의 재조합 HGF(알앤디 시스템스; 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 지정된 웰에 첨가하여 100ng/㎖의 최종 농도를 얻었다. 이어서, 48시간 내지 72시간 후에 MTT 분석(프로메가)를 실시하여 상대적인 세포 수를 측정하였다. 4-파라미터 분석 방법을 사용하여 농도-반응 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다.
HGF-의존성 세포 이동 및 침입 분석
NCI-H441 세포 이동 및 마트리겔(matrigel) 침입 분석
상업적으로 이용할 수 있는 세포 이동 및 침입 시스템(비디 바이오사이언스(BD Biosciences); 미국 캘리포니아주 산호세 소재)을 사용하여 HGF-자극된 NCI- H441 사람의 비-소세포 폐암종 세포 이동 및 마트리겔 침입에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 측정하였다. 느린 성장 상 중의 세포들을 트립신화하고 혈청이 없는 배지(0.04%의 BSA 지님)에서 400,000세포/㎖의 밀도로 현탁시켰다. 화학식 1의 화합물을 혈청이 없는 배지 중에서 연속하여 희석시킨 후, 지정된 농도로 현탁된 세포에 첨가하고, 세포들을 실온에서 30분 동안 배양시켰다. 지정된 대조 또는 처리된 현탁 세포들(0.5㎖)을 각각의 이동 또는 침입 챔버(즉, 플레이트 삽입물)에 첨가하였다. 또한, 25ng/㎖ HGF(0.75㎖)를 케모트랙턴트(chemotractant)로서 각각의 동반 플레이트의 하부 웰에 첨가하여 동반 플레이트의 상부에 삽입된 이동 또는 침입 챔버 플레이트 삽일물로부터 세포들을 끌어내고, 세포들을 37℃에서 22시간 동안 배양시켰다. 이어서, 플레이트의 하부 웰로 침입 또는 이동된 세포들을 고정시키고, 핵을 37℃에서 15분 동안 염색하였다(100%의 MeOH 중의 1㎍/㎖ DAP1). TBS 용액을 사용하여 세포를 연속하여 2회 세척하였다. 각 웰로부터 5개의 현미경 상을 취하고, 이동 또는 침입된 세포 수를 각 조건 하에서 이미지-프로 플러스 소프트웨어(Image-Pro Plus software)(미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics); 미국 메릴랜드주 실버 스프링 소재)를 사용하여 측정하였다. 4-파라미터 분석 방법을 사용하여 농도-반응 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다.
HUVEC 마트리겔 침입 분석
ACEA RT-CES 시스템(ACEA 바이올로지컬스(ACEA biologicals); 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 사용하여 실험실 내에서 HUVEC 마트리겔 침입에 대한 화학 식 1의 화합물의 효과를 측정하였다. ACEA 전자감지화 96웰 플레이트를 PBS 중의 50㎕의 0.001% 피브로넥틱(fibronectin) 및 100ng/㎖ HGF로 코팅시키고, 37℃에서 1시간 동안 그리고 4℃에서 30분 동안 배양시켰다. 각 플레이트를 4℃에서 PBS로 세척한 후, 마트리겔(비디 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세 소재)를 결핍 배지(SM; 셀 어플리케이션스; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 1:40으로 희석시키고, HGF(100ng/㎖) 및/또는 상이한 농도의 화학식 1의 화합물로 보충시키고, 지정된 웰에 첨가(50㎕)하여 2시간 동안 37℃에서 고화시켰다. HUVEC 세포를 혈청이 없는 배지(셀 어프리케이션스; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 5시간 동안 그리고 SM에서 2시간 동안 배양시켰다. 세포들을 60,000세포/㎖로 SM에서 연속적으로 수거하고, 100ng/㎖ HGF 및/또는 적절한 화학식 1의 화합물로 30분 동안 37℃에서 처리하였다. 지정된 조건의 HUVEC 세포 현탁액(100㎕)을 코팅된 ACEA 플레이트의 지정된 웰 중의 마트리겔 층의 상부로 옮겼다. 이어서, ACEA 플레이트를 37℃의 95% 공기:5% CO2에서 ACEA 디바이스 스테이션(ACEA Device Station)에 연결시키고, 48시간 동안 ACEA 센서 분석기에 의해 실시간으로 모니터하였다. ACEA 플레이트의 하부에 삽입된 전자 센서로 마트리겔을 통해 침입된 HUVEC 세포를 검출하였다. ACEA RT-CES(상표명) 통합 소프트웨어를 사용하여 침입된 HUVEC 세포의 상대적인 수(세포 지수)를 측정하였다. 4-파라미터 분석 방법을 사용하는 농도-반응 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다
MDCK 세포 산포 분석
10%의 FBS로 보충된 배지 중의 96웰 플레이트에서 낮은 밀도(25세포/웰)로 MDCK 세포를 시드화하고, 10 내지 15 세포의 작은 콜로니가 나타날 때까지 성장시켰다. 이어서, 성장 배지에서 희석시킨 다양한 농도의 화학식 1의 화합물의 존재 하에서 HGF(50ng/㎖)로 세포들을 자극시켰다. 밤새 배양시킨 후, 콜로니를 고정시키고, 10% 완충된 포르말린 중에서 0.2% 결정 바이올렛으로 염색시키고, 각 농도에서 산포를 시각적으로 평가하였다.
HMVEC 혈관 발생 분석
500개의 HMVEC를 0.24%의 메틸셀룰로즈를 함유한 EGM-2 배지에 첨가하고, U-바닥형 96웰 플레이트로 옮겨 밤새 스페로이드(spheroid)를 형성하였다. 스페로이드를 수거하고 트롬빈(2㎖의 5,000U/㎖)으로 코팅된 48웰 플레이트에서 4 내지 8%의 FBS ± 화합물을 함유한 2mg/㎖ 피브리노겐 용액 중으로 혼합시켰다. 결과의 3-D 피브린 겔을 4 내지 8%의 FBS를 함유한 EGM-2로 덮고 37℃의 95% 공기/5% CO2에서 배양시켰다. 역현미경(inverted microscope) 하에서 내피관 형성을 매일 관측하였다. 현미경에 연결된 디지털 카메라(올림퍼스(Olympus) BX60)에 의해 7일째에 상을 얻었다. 화학식 1의 화합물을 수 개의 농도로 첨가하여 혈관 생성을 시각적으로 평가하였다.
유체세포분석법에 의한 세포 사이클 및 아포프토시스 분석
사람의 림프종 세포의 NPM-ALK-의존성 세포 사이클 분포 및 아포프토시스에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 유체세포분석법(FACSCalibur, 비디 바이오사이언 스; 미국 캘리포니아주 산호세 소재)에 의해 평가하였다. 카파스 299 및 SU-DHL-1 사람의 림프종 세포를 성장 배지(RPMI + 10% FBS)에서 24 내지 48시간 동안 화학식 1의 화합물로 처리하였다. 세포들을 PBS로 2회 세척하고, 고정시킨 후, 4℃에서 20분 동안 BDCytofix/Cytoperm 용액에 투과시켰다. 림프종 세포의 세포 사이클 분포 및 아포프토시스를 사이클로테스트 플러스 DNA 시약 키트(CycloTest Plus DNA Reagent Kit)(비디 바이오사이언스)를 사용하여 평가하였다. 상기 키트를 사용하여 세포들을 1x BD Perm/와시(Wash) 완충액으로 2회 세척하고, 비이온성 세제 및 트립신을 첨가하여 핵을 단리시키고, 프로피듐 아이오다이드를 첨가하여 DNA 함량을 시각화한 후 유체세포분석법에 의해 세포들을 분석하였다. DNA 함량(각 세포 사이클에서 세포 수의 백분율을 측정하는 배수성(ploidy) 분석)을 셀 퀘스트 프로(Cell Quest Pro)를 사용하여 평가하고, 모드피트(ModFit) LT 소프트웨어(비디 바이오사이언스)로 분석하였다. 아포프토틱 피크(A0)를 하기 문헌에 기술된 바와 같이 G0/G1 피크보다 낮은 채널 수를 발생하는 피크로서 정의하였다(문헌[Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del-Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. S., Lassota, P., and Traganos, F., Cytometry 13:795-808(1992)] 참조). 아넥신(Annexin) V-FITC 염색(비디 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세 소재)를 사용하는 유체세포분석법에 의해 아포프토시스를 측정하고 또한 FACSCalibur를 사용하여 분석하였다.
생체내 방법
세포주
다르게 지시되지 않는 한, 세포 배양 시약을 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(미국 메릴랜드주 카이터스버그 소재)로부터 입수하였다. 세포들을 5 내지 10%의 CO2를 함유한 가습 대기 중의 37℃에서 유지시키고, 표준 배양 기법을 사용하여 진행시켰다. U87MG(사람의 교아종), NCI-H441(사람의 비-소세포 폐선암종) 및 PC-3(사람의 전립선 선암종) 세포들을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 미국 메릴랜드주 베테스다 소재)로부터 입수하여 추천되는 바에 따라 배양시켰다.
무흉선 마우스에서의 피하 이종이식 모델
암컷 또는 수컷 nu/nu 또는 SCID/베이지(Beige) 마우스(5 내지 8주령)를 하란(Harlan; 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 또는 찰스 리버(Charles River; 미국 매사츄세츠주 윌밍톤 소재)로부터 입수하였다. HEPA-필터가 구비된 환기 랙이 있는 알파-드라이/베드-o-콤 컴브(Alpha-Dri/bed-o-cob comb) 깔짚을 갖는 멸균 필터 상부 케이지의 깨끗한 실내 조건 하에서 상기 동물들을 가두었다. 동물들은 멸균된 설치류 조각 및 물을 임의로 섭취하였다. 무흉선 마우스 중으로의 이식을 위한 세포들을 수확하여 5분 내지 10분 동안 450xg에서 원심분리하여 펠릿화시켰다. 세포 펠릿을 1회 세척하고, 멸균 인산염 완충된 염수 또는 혈청이 없는 배지에 재현탁시켰다. 종양 세포를 30 내지 50% 마트리겔(비디 바이오사이언스, 미국 캘리포니아주 산호세 소재)로 보충하여 이종이식으로서 선택된 종양 세포의 종양 감염 및 성 장을 용이하게 하였다. 세포들(100㎕ 중의 2 내지 5 x 106)을 SC로 마우스의 후위 옆구리 부위에 이식하고, 지정된 크기로 성장시킨 후 각각의 실험을 위하여 화합물을 투여하였다. 전자 캘리퍼로 측정하여 종양 크기를 결정하고, 종양 부피를 이것의 길이 x 너비2 x 0.4의 곱으로서 계산하였다.
생체외 표적 조절( PK / PD ) 연구
생체내 약물동력학 연구를 위한 종양 및 혈장 처리
구성적으로 포스포릴화된 c-Met/HGFR 또는 ALK를 발현하는 종양 세포들을 누드 마우스의 피하에 이식하고 비처리된 채로 300 내지 800mm3의 크기로 성장시켰다. 상기 마우스에게 화학식 1의 화합물을 지정된 투여량 수준으로 1회 경구 투여(급성 PK/PD 연구를 위해) 또는 다회 경구 투여(정상 상태의 PK/PD 연구를 위해)로서 투여하였다. 화학식 1의 화합물의 투여 후 지시된 시간에서, 각각의 마우스를 안락사시키고, 헤파린 설페이트로 예비처리된 주사기를 사용하여 심장 좌심실로부터 혈액 샘플을 단리시키고, 종양을 잘라내었다. LCMS 분석을 사용하여 혈장 샘플에서 화학식 1의 화합물의 농도를 분석하였다. 잘라낸 종양을 드라이 아이스를 사용하여 빠르게 동결시키고, 액체 질소-냉각된 저온 막자 사발 및 공이를 사용하여 분쇄시키고 냉각된 1 x 세포 용해물 완충액(셀 시그널링 테크놀로지스; 미국 매사츄세츠주 보스톤 소재)에서 용해시켰다. 단백질을 종양 용해물로부터 추출하여 단백질의 농도를 BSA 분석법(피어스; 미국 일리노이주 록포드 소재)을 사용하여 측정하였다. 각 종양 샘플에서 실험 대상의 총 및/또는 포스포릴화된 단백질의 수준을 하 기의 포획(capture) ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.
키나제 표적의 약물동력학적 억제의 평가를 위한 ELISA 분석
각각의 ELISA 분석에 있어서, 비히클 또는 화학식 1의 화합물로 처리된 종양으로부터 형성된 단백질 용해물을 안티-c-Met/HGFR(지메드 랩/인비트로겐(Zymed Lab/lnvitrogen); 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 또는 안티-ALK 포획 항체(셀 시그널링 테크놀로지스; 미국 매사츄세츠주 보스톤 소재)로 미리 코팅시킨 96웰 플레이트로 옮겼다. 항체-코팅된 플레이트를 종양 용해물의 존재 하에 4℃에서 밤새 배양시킨 후, PBS 중의 1% 트윈 20으로 수회 세척하였다. HRP-PY20(양고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬게이트화된 안티-토탈-포스포티로신, 산타 크루즈 바이오테크놀로지; 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)을 블로킹 완충액(피어스; 미국 일리노이주 록포드 소재) 중에서 1:500으로 희석시키고, 30분 동안 각 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 다시 세척하고, TMB 퍼옥시다제 기질(바이오-래드 레보러토리스; 미국 캘리포니아주 허쿨레스 소재)을 첨가하여 HRP-의존성 비색계 반응을 개시하였다. 0.09N의 H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 분광광도계를 사용하여 450nm에서 비히클 또는 처리 웰 각각의 광학 밀도(OD)를 측정하였다. OD 판독에 기초하여 화학식 1의 화합물로 처리된 동물로부터 잘라낸 종양의 c-Met/HGFR 또는 ALK의 총 포스포릴화를 동일 시점에서 비히클로 처리된 동물로부터 잘라낸 종양에서의 총 포스포릴화와 비교하였다. 이러한 평가에서, 종양에서의 화학식 1의 화합물에 의한 키나제 표적 포스포릴화의 억제는 하기 수학식 1을 사용하여 계산되었다:
억제% = 100-[(처리 시의 평균 OD/비처리 시의 평균 OD) x 100]
면역블로팅
실험 대상의 단백질에 대한 종양 샘플에서 상대 키나제 포스포릴화 상태 및 총 단백질 수준을 측정하기 위해 면역블로팅 방법이 또한 사용되었다. 종양이 있는 마우스를 상이한 투여량의 화학식 1의 화합물로 처리하고, 종양 용해물 및 단백질 샘플을 상술한 바와 같이 제조하였다. 실험 대상의 단백질을 면역침전시키기 위해 특이 항체를 사용하였다. 면역침전된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고, 안티-포스포티로신으로 또는 총 항체(total antibody)로 면역블로팅하였다.
면역블로팅에 사용된 항체는 다음과 같았다: 지메드/인비트로겐(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터의 안티-토탈 사람의 c-Met/HGFR; 셀 시그널링 테크놀로지스(미국 매사츄세츠주 보스톤 소재)로부터의 안티-포스포-c-Met/HGFR, 안티-토탈 및 -포스포 ALK, 안티-토탈 및 포스포르 Gab1, 안티-토탈 및 포스포 AKT, 안티-토탈 및 포스포르-MAPK44/42, STAT5.
생체내 주입 연구를 위한 삼투압 미니-펌프 이식
알제트(Alzet) 1003D 및 1007D 삼투압 미니-펌프를 듀렉트 코포레이션(Durect Corporation; 미국 캘리포니아주 쿠퍼티노 소재)으로부터 구매하였다. 미니 펌프를 지정 농도의 화학식 1의 화합물의 용액으로 충전시키고, 이것들이 4 내지 5시간 동안에 평형에 도달할 때까지 37℃에서 멸균 염수 용액으로 미리처리하였다. 펌프를 제조자의 지시에 따라 오른쪽 옆구리 부위에 종양이 있는 마우스의 좌척추 흉부 부위의 피하에 외과적으로 이식하였다. 피부 절개 부분이 완전히 치유되는 5 내지 7일 후에 제거되는 수술용 클립을 사용하여 절개 부분을 닫았다. 펌프 수용력을 초과하는 주입 시간 및 약물 부피를 요구하는 연구를 위해 지정된 시간에서 펌프 대체 수술을 실시하였다.
종양 조직학 및 면역 조직 화학(IHC)
면역 조직 화학 종말점을 평가하기 위한 종양 표본을 수집하여 24시간 동안 프로테아제(protease) 및 포스포테아제(phosphotase) 억제제를 지닌 10% 완충된 포르말린에서 고정시킨 후 70%의 에탄올로 옮겼다. 이어서, 종양 표본에 파라핀을 삽입시키고, 4μM 부분을 절단하여 현미경 슬라이드 상에서 구웠다. 상업적으로 입수할 수 있는 탈크로킹(decloaking) 챔버(바이오케어 메디칼(Biocare Medical), Cat # DC2001)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 탈파라핀화 및 항원 회복(EDTA계)을 실시하였다. 종양 OCT 동결 샘플을 또한 CD-31 염색을 위해 수취하여 절단하였다. 면역염색을 위해, 슬라이드를 1차 항체 및 이어서 2차 항체를 사용하여 배양시키고, 비색법(DAO Envision-HARP, DAB 키트, DAO, 미국 캘리포니아주 카펜테리아 소재), 또는 형광계법(Alexa 488 또는 Alexa 635, 몰레큘러 프로브/인비트로겐(Molecular Probes/lnvitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 사용하여 시각화하였다. 헤마톡실린을 사용하여 면역염색된 부분 모두를 대비염색(counterstain)하였다. 자동화된 벤타나 디스커버리 XT 염색 모듈(Automated Ventana Discovery XT Staining Module)(벤타나 메디칼 시스템스(Ventana Medical Systems); 미국 아리조나주 투손 소재)를 또한 사용하여 제조자의 지시에 따라 조 직 염색을 실시하였다. 올림퍼스 현미경을 사용하여 염색된 부분을 분석하고, ACIS 시스템(자동화된 세포 이미징(Automated Cellular Imaging), 클라이언트(Clarient); 미국 캘리포니아주 어빈 소재)을 사용하여 염색된 부분의 정량 분석을 실시하였다. 입주 병리학자에 의해 표준 임상 방법을 사용하여 슬라이드를 또한 분석하였다.
면역 조직 화학 연구에 사용된 항체는 바이오소스 인터내셔널스/인비트로겐(Biosource Internationals/lnvitrogen; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터의 안티-포스포-c-Met/HGFR 및 다코사이토매이션(Dacocytomation; 미국 캘리포니아주 카펜테리아 소재)으로부터의 안티-Ki67; 및 산타 크루즈 바이오테크놀로지(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)로부터의 안티-CD31을 포함한다.
데이터 및 결과
c- Met / HGFR RTK 에 대한 화학식 1의 화합물의 효소 효능
화학식 1의 화합물은 4nM의 평균 Ki를 갖는 재조합된 사람의 c-Met/HGFR 키나제 활성의 유력한 ATP-경쟁 억제제임이 증명되었다.
화학식 1의 화합물은 생화학적 효소 분석에서 Ki가 3nM인 c-Met/HGFR의 키나제 활성을 억제하였다. c-Met/HGFR에 대한 키나제 선택도를 평가하기 위해, 생화학적 키나제 스크린 분석에서 화학식 1의 화합물을 120 초과의 재조합 키나제 패널에 대해 추가적으로 평가하였다. 이러한 일차적인 생화학적 키나제 선택도 스크린에서, 화학식 1의 화합물이 c-Met/HGFR의 선택도가 c-Met/HGFR RTK와 비교시 100배 미만인 것으로 평가되는 활성을 갖도록 하는 하부 세트의 키나제를 확인하였다. 이러한 확인된 유력한 키나제에 대한 화학식 1의 화합물의 활성은 한정적인 세포계 키나제 선택도 분석에 대한 후속의 연구에서 추가적으로 평가되었다(표 1). c-Met/HGFR 키나제의 억제에 대한 화학식 1의 화합물의 생화학적 Ki 값은 ATP 턴오버에 결합된 NADH 산화를 모니터링함으로써 측정되었다. 화합물 및 키나제 분석 시약이 시험 웰에 도입된 후, 37℃에서 10분 동안 배양시키고, c-Met/HGFR을 첨가함으로써 반응을 개시시켰다. NADH는 지정된 시점에서 340nm에서의 분광광도계에 의해 측정되었다.
세포계 분석에서의 화학식 1의 화합물의 키나제 선택도
화학식 1의 화합물의 선택도를 생화학적 분석 및 다른 관련 RTK(예, RON, SKY, IR)에서 유효한 것으로 확인된 선택된 키나제에 대한 세포 패널계 키나제 활성 분석에서 평가하였다. 세포계 연구에서, 화학식 1의 화합물의 선택성은 c-Met/HGFR(A549 IC50 = 8.6nM)에 비해 VEGFR2 및 PDGFRβ 스플릿-RTK에 대해서는 1000배 초과이며, IR 및 Lck에 대해서는 200배 초과이며, Axl, Tie-2, TrkA, 및 TrkB에 대해서는 약 40 내지 60배이다. 생체 내에서 c-Met/HGFR의 선택성에 대해 50배의 값이 충분한 지의 여부를 평가하기 위해서, 누드 마우스에서의 C6 이종 이식에서 Tie-2 포스포릴화를 억제하는 화학식 1의 화합물의 능력을 평가하였다. 이러한 연구에서, 50mg/kg(24시간에 걸친 c-Met/HGFR 억제에 대한 IC99를 나타냄) 또는 100mg/kg의 단일 PO 투여 후 임의 시점에서 Tie-2 포스포릴화의 어떠한 유의한 억제가 관측되지 않았다. 이것은, Tie-2, Axl, 또는 TrkA 및 TrkB의 억제가 24시 간에 걸친 c-Met/HGFR의 완전한 억제와 관련된 투여량 수준보다 2배까지 더 큰 투여량에서는 발생하지 않을 것이라는 것을 의미한다. 화학식 1의 화합물은, 1) 선택된 암에서의 과발현 및 돌연변이 및 2) RON-눌(null) 마우스에서의 역 표현형 결핍 때문에 효능있는 유리한 종양 표적을 나타내는 RON 키나제에 대해 20 내지 30 배 선택적이다. 전술된 RTK와는 다르게, 화학식 1의 화합물은 발암성 형태의 ALK RTK(퇴행성 림프종 키나제) 융합 단백질 및 ALK RTK(퇴행성 림프종 키나제)의 발암성 융합 단백질 변이체인 NPM-ALK(사람의 발암성 대세포 림프종(ALCL, 사람의 림프종 세포주에서)의 발병기전과 관련된 염색체 전위로부터 비롯됨)에 대해 거의 동일한 IC50 값(24nM)을 나타낸다.
세포에서 c- Met / HGFR RTK 활성의 약물동력학적 억제
세포에서 유력한 효소 활성이 c-Met/HGFR의 억제로 변환되는 것을 확인하기 위해, 종양 및 내피 세포주 패널에서 c-Met/HGFR 포스포릴화를 억제하는 화학식 1의 화합물의 능력을 평가하였다. 화학식 1의 화합물은 야생형 c-Met/HGFR의 HGF-자극된 또는 구성 총 티로신 자동 포스포릴화를 사람의 종양 및 내피 세포주 패널에 대해 11nM의 평균 IC50 값으로 억제하였다(표 1). 화학식 1의 화합물은 mIMCD3 마우스 상피 세포에서도 유사한 값을 나타내었다(IC50 = 5nM)(표 1).
세포에서 c- Met / HGFR 활성 자리 돌연변이에 대한 화학식 1의 화합물의 효능
c-Met/HGFR 활성 돌연변이가 수개의 사람의 암에서 확인되었으며, 이것은 다른 RTK 표적과 함께 실험적인 증거 및 임상적 전례 둘다에 기초한 기본적인 임상 연구의 증거에 대한 강한 근거를 제공한다. 비록 세포외 또는 병렬막(juxtamembrane) 영역에서 c-Met/HGFR 돌연변이가 활성 자리에 결합한 화합물에 영향을 주는 것으로 예견되지는 않는다고 할지라도, 키나제 영역 돌연변이가 활성의 손실을 유발할 것이라는 것은 가능하다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 야생형 c-Met/HGFR 또는 일련의 대표적인 c-Met/HGFR 활성 자리의 돌연변이를 발현하도록 유전자조작된 화학식 1의 화합물로 처리된 NIH3T3 세포에서 RTK 포스포릴화 IC50을 평가하였다. 이러한 연구에서, 화학식 1의 화합물은 야생형 수용체(12.6nM)와 비교할 때 ATP 결합 자리 변종(V1092I, 19nM 및 H1094R, 2.2nM) 또는 P-루프 변종(M1250T, 15nM)에 대하여 증진되거나 또는 유사한 활성을 보여 주었다(표 1). 또한, 화학식 1의 화합물은 내인성 c-Met 병렬막 변이체 R988C 및 T1010I를 각각 발현시키는 NCI-H69(IC50: 13nM) 및 HOP92(IC50: 16nM) 세포에서 c-Met 포스포릴화를 억제하는 유사한 효능을 보여 주었다(표 1). 이와는 다르게, 야생형 수용체와 비교할 때 활성 루프 변종(Y1230C, 127nM 및 Y1235D, 92nM)에 대해서는 상당한 효능 변화(10배)가 관측되었다(표 1).
분석 IC50 nM 선택도 비d
실험실 내의 생화학 활성
c-Met/HGFR 효소(Ki, nM)a 4 NA
실험실 내의 세포 활성
사람의 종양 세포주에서의 c-Met 포스포릴화(평균 IC50)b,c 11 NA
마우스의 IMCD3 상피 세포에서의 c-Met 포스포릴화(IC50)b 5 NA
NIH3T3 세포에서의 c-Met WT 포스포릴화(IC50)b 13 NA
NIH3T3 세포에서의 c-Met 변종 V1092I의 포스포릴화(IC50)b 19 NA
NIH3T3 세포에서의 c-Met 변종 H1094R의 포스포릴화(IC50)b 2 0.1X
NIH3T3 세포에서의 c-Met 변종 Y1230C의 포스포릴화(IC50)b 127 11X
T47D 세포에서의 c-Met 변종 Y1235D의 포스포릴화(IC50)b 92 8X
NIH3T3 세포에서의 c-Met 변종 M1250T의 포스포릴화(IC50)b 15 NA
c-Met R988C 변이체를 발현시키는 NCI-H69 세포에서의 c-Met의 포스포릴화(IC50)b 13 NA
c-Met T1010I 변이체를 발현시키는 HOP92 세포에서의 c-Met 포스포릴화(IC50)b 16 NA
사람의 카파스(Karpas) 299 림프종 세포에서의 NPM-ALK 포스포릴화(IC50)b 24 2X
실험실 내에서의 비-표적 키나제에 대한 세포 활성
NIH-3T3-RON 세포에서의 MSP-자극 RON 포스포릴화(평균 IC50)b 189 17X
RON-GYRB 세포에서의 RON 포스포릴화(평균 IC50)b 298 27X
NIH-3T3-Axl 세포에서의 Gas6-자극 Axl 포스포릴화(평균 IC50)b 322 29X
NIH-3T3-Tie-2/EGFR 세포에서의 리간드-자극 Tie-2 포스포릴화(평균 IC50)b 448 41X
Trk A-PAE 세포에서의 NGF-자극 TrkA 포스포릴화(평균 IC50)b 580 53X
Trk B-PAE 세포에서의 BDNF-자극 TrkB 포스포릴화(평균 IC50)b 399 36X
BCR-Abl-BaF3 세포에서의 BCR-Abl 포스포릴화(평균 IC50)b 1159 >100X
293-IRK 세포에서의 인슐린-자극 인슐린 수용체 포스포릴화(평균 IC50)b 2887 >250X
쥬르캐트 세포에서의 CD3-자극 Lck-의존성 Zap70 포스포릴화(평균 IC50)b 2741 >250X
NIH-3T3-Sky 세포에서의 Gas6-자극 Sky 포스포릴화(평균 IC50)b >10000 ∼1000X
정의 a c-Met/HGFR 효소 억제에 대한 Ki 값은 ATP 턴오버에 결합된 NADH 산화를 모니터링함으로서 측정되었다 b IC50 값은 수 개의 농도의 PF-02341066에 다양한 세포주를 1시간 동안 노출시킨 후 ELISA에 의해 세포 단백질 용해물에서 포스포릴화를 측정하여 결정하였다. IC50 값은 4-파라미터 분석을 사용하는 곡선 피팅에 의해 생성되었다. c 평균 IC50 값은 7개의 사람의 종양 세포주(즉, A549, MDA-MB-231, GTL-16, HT29, 786-O, Colo-205, A498) 패널에 대한 c-Met/HGFR 포스포릴화의 평균 IC50 값으로부터 유도되었다. d c-Met IC50을 사용하여 세포 분석을 위한 선택도 비를 계산하였다. 선택도 지수는 IC50(c-Met)/IC50(표적)로서 계산되었다. WT = 야생형
세포에서 c- Met / HGFR - 또는 NPM - ALK -의존성 암유전자 표현형에 대한 화학식 1의 화합물의 효과
표현형 분석
c-Met/HGFR는 다양한 종양 세포 및 종양 내피 세포의 세포 성장, 이동 및 침입의 이상조절과 관련된 반면, NPM-ALK는 ALCL 림프종 세포에서의 세포 증식 및 아포프토시스의 이상조절과 관련된다. 일련의 세포계 기능 분석에 있어서, 화학식 1의 화합물은 유효하게 사람의 GTL-16 위암종 세포 성장을 억제하고, GTL-16 세포 아포프토시스를 유발하고, 마트리겔 매트릭스를 통해 HGF-자극된 사람의 NCI-H441 폐암종 세포 이동 및 침입을 억제하고, HGF-자극 MDCK 세포의 운동성/산포를 억제하였다(표 2). 화학식 1의 화합물은 또한 t2;5 염색체 전위에 의한 NPM-ALK 융합 단백질을 발현시키는 카파스 299 또는 SU-DHL-1 ALCL 새포의 증식을 억제하였다. 이러한 NPM-ALK 양성 림프종 세포에서 화학식 1의 화합물에 의한 성장 억제는 G0/G1 세포 사이클 정지 및 아포프토시스의 유발과 관련된다. 또한, 유효한 항-혈관생성 활성을 평가하면, 화학식 1의 화합물은 HGF-조절 HUVEC 내피 세포 생존 및 마트리겔 침입뿐만 아니라 피브린 겔에서의 HMVEC 내피 세포 세뇨관 형성을 억제하였다. 이러한 데이터는, 활성화 c-Met/HGFR 또는 NPM-ALK를 각각 발현시키는 세포에서의 c-Met/HGFR- 및 NPM-ALK-의존성 기능 둘다를 억제하는 화학식 1의 화합물의 능력을 보여준다. 또한, 상기 데이터는, 화학식 1의 화합물의 항종양 효능이 종양 세포 성장 또는 생존뿐만 아니라 항-혈관생성 기작에 대한 둘다의 직접적인 효과에 의해 조절될 수 있다는 것을 시사한다.
분석 PF-02314066 농도
nM ng/㎖
종양 세포 표현형
GTL-16 위암종 세포의 증식(MTT 분석)(평균 IC50) 9.7 4.4
GTL-16 위암종 세포의 아포프토시스(ccDNA 분석)(평균 IC50) 8.4 3.8
HGF-자극 NCI-H441 NSCLC 세포 보이덴(Boyden) 챔버 이동(평균 IC50) 11 5
HGF-자극 NCI-H441 NSCLC 세포 마트리겔 침입(평균 IC50) 6.1 2.7
HGF-자극 MDCK 세포 콜로니 산포(평균 IC50) 16 7
내피 세포 표현형
HGF-자극 HUVEC 내피 세포 생존(MTT 분석)(평균 IC50) 11 5
HGF-자극 HUVEC 세포 마트리겔 침입(평균 IC50) 35 16
피브린 겔에서의 HMVEC 내피 세포 세뇨관 형성(예측되는 IC50) 80 36
정의: NSCLC=비-소세포 폐암; MDCK=매들린-다비 개의 신장; ALCL=퇴행성 대세포 림프종; HUVEC=사람의 제대 정맥 내피 세포; HMVEC=사람의 미세혈관 내피 세포
생체내 연구
데이터 및 결과
생체내 키나제 표적 억제 및 종양 성장 억제
종양 모델 선택
c-Met/HGFR-의존성 종양 이종이식 모델을 사용하여 생체 내에서 화학식 1의 화합물의 c-Met/HGFR 표적 억제, 종양 성장 억제, 및 혈장 노출을 평가하였다. 마우스 중간엽 세포에 의해 발현된 마우스 HGF에 의한 종양 이종이식에 의해 발현된 사람의 c-Met/HGFR의 측분비 활성의 부족 때문에, 구성적 c-Met/HGFR 활성을 보이는 사람의 이종이식 모델에서는 다음을 사용하였다: 1) 상승 수준의 구성적 활성 c-Met/HGFR을 발현시키는 GTL-16 사람의 위암종 또는 Caki-1 신암종 모델, 2) 자가분비 루프를 포함하는 HGF 및 c-Met/HGFR 둘다를 발현시키는 U87MG 사람의 교아종 또는 PC-3 사람의 전립선 암종 모델 또는 3) c-Met/HGFR의 종-특이 측분비 활성을 회복시키기 위해 종양 기질 구획으로부터 사람의 생활성 HGF의 원료를 공급하는 사람의 MRC5 섬유아세포와 사람의 종양 세포(예, NCI-H441 NSCLC)의 공동이식.
경구 투여 후 c- Met / HGFR 억제와 항-종양 효능과의 관계
GTL-16 종양
진행된 GTL-16 종양(250㎣)이 있는 무흉선 마우스에게 11일 동안 화학식 1의 화합물을 지시된 용량으로 또는 비히클 만을 경구적으로 투여하였다. GTL-16에서 c-Met/HGFR 포스포릴화의 억제를 평가하는 연구(도 2A)에서, 투여 후 지정된 시점에서 연구가 종결될 때 마우스를 안락사시키고, 종양을 잘라내어 동결시킨 후, 비히클 및 처리된 군에서의 포스포릴화를 ELISA에 의해 정량화하였다. 종양에서 화학식 1의 화합물에 의한 키나제 표적 포스포릴화의 억제는 하기 수학식 1에 따라 계산되었다:
수학식 1
억제% = 100-[(처리 시의 평균 OD/비처리 시의 평균 OD) x 100]
GTL-종양 성장 억제를 평가하는 연구(도 2B)에서, 종양의 부피를 15마리의 마우스 군에서 지시된 중앙 종양 부피 ± SEM으로 지시된 날짜에 캘리퍼에 의해 측정하였다. 기재된 백분율(%) 값은 약물 처리된 마우스에서 20일째에 측정된 종양 성장 억제를 비히클로 처리된 마우스와 비교한 %값이며, 하기 수학식 2로서 계산된다:
100*{1-[(처리일 20 - 처리일 10)/(대조일 20 - 대조일 10)]}
*는 일원 변량분석을 사용하여 측정될 때 대조군과 비교하여 처리군에서 중앙 종양 부피가 상당히 적다는 것을 의미한다(P<0.001)(도 2B 참조).
화학식 1의 화합물에 대한 c-Met/HGFR PD 반응을 평가하기 위해, 단일 투여 또는 반복된 투여(정상 상태) 연구에서 화학식 1의 화합물의 경구 투여 후 GTL-16 종양을 여러 시점에서 수확하였다. 종양에서의 c-Met/HGFR 포스포릴화 상태는 광범위한 투여량에 걸쳐 ELISA에 의해 정량화되었다. 종양 성장 억제와의 관계를 유도하기 위한 정상 상태 PD 연구(11일)에 초점을 맞추면, 화학식 1의 화합물은 도 2A 및 2B에 도시된 바와 같이 다음을 보여 주었다:
50mg/kg/일에서: 100% 종양 성장 억제는 24시간 동안 지속된 GTL-16 종양에서 c-Met/HGFR 포스포릴화의 완전한 억제와 관련되었다(25mg/kg에서: 포스포릴화 및 종양 성장 둘 다에서 거의 완전한 억제를 보여줌). 12.5mg/kg/일에서: 60%의 종양 성장 억제는 1 내지 8시간 동안에서의 c-Met/HGFR 포스포릴화의 80 내지 90% 억제와 관련되는데, 이것은 16 내지 24시간 동안에서는 50 내지 60% 억제로 감소되었다.
6.25mg/kg/일에서: 종양 성장 억제에 대한 비유의적 경향은 1 내지 8시간 동안 c-Met/HGFR 포스포릴화의 30 내지 50% 억제와 관련되며, 이때 16시간 동안에서는 완전하게 회복되었다.
U87MG 종양
진행된 U87MG 종양(150㎣)이 있는 무흉선 마우스에게 9일 동안 화학식 1의 화합물을 지시된 용량으로 또는 비히클 만을 경구적으로 투여하였다. 종양 성장 억제를 평가하는 연구(도 3A)에서, 종양의 부피를 10 내지 12마리의 마우스 군에서 지시된 중앙 종양 부피 ± SEM으로 지시된 날짜에 캘리퍼에 의해 측정하였다. 기재된 백분율(%) 값은 약물 처리된 마우스에서 14일째에 측정된 종양 성장 억제를 비히클로 처리된 마우스와 비교한 %값이며, 수학식 3으로서 계산된다:
100*{1-[(처리일 14 - 처리일 6)/(대조일 14 - 대조일 6)]}
*는 일원 변량분석을 사용하여 측정될 때 대조군에 비하여 처리군에서 중앙 종양 부피가 상당히 적다는 것을 의미한다(P<0.001)(도 3A 참조). c-Met/HGFR 포스포릴화의 억제를 평가하는 연구(도 3B)에서, 화학식 1의 화합물의 투여 후 4시간의 연구가 종결될 때 마우스를 안락사시키고, 종양을 잘라내어 동결시킨 후, 비히클 및 처리된 군에서의 포스포릴화를 ELISA에 의해 정량화하였다. 종양에서 화학식 1의 화합물에 의한 키나제 표적 포스포릴화의 억제는 하기 수학식 1에 따라 계산되었다:
수학식 1
억제% = 100-[(처리 시의 평균 OD/비처리 시의 평균 OD) x 100]
약물학적으로 관련된 Tie-2 포스포릴화의 억제는 100mg/kg 이하의 투여 수준에서의 U87MG 이종이식에서는 관측되지 않았는데, 이것은 화학식 1의 화합물이 유사 투여량 수준에서의 의도하는 표적에 대해서 선택적이라는 것을 시사한다.
사람의 이종이식 모델에서의 화학식 1의 화합물의 항종양 효능
GTL-16 위암종, U87MG 교아종, NCI-H441 NSCLC, 및 PC-3 전립선 암종을 비롯하여, c-Met/HGFR의 이상조절이 관련된 암 증상을 대표하는 다양한 사람의 종양 이종이식 모델에서 화학식 1의 화합물의 항종양 효능을 평가하였다(표 4).
GTL-16 위암종 모델
GTL-16 위암종 모델을 사용하여, 화학식 1의 화합물이 크게 진행된 종양(600㎣ 초과)에서 뚜렷한 퇴화를 유발하는 능력을 가진다는 것을 보여 주었다(도 4). 이러한 연구에서, 50 및 75mg/kg/일의 화학식 1의 화합물로 처리된 코호트(cohort)는 43일간의 투여 스케쥴 동안 동일한 평균 종양 퇴화를 나타냈으며, 이것은 50mg/kg/일이 최대 유효 투여 수준임을 나타내는 추가적인 증거를 제공한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 50 또는 75mg/kg/일에서 평균 종양 퇴화는 화학식 1의 화합물의 43일간의 투여 후 60%이었다. 본 연구에서, 각각의 종양은 화학식 1의 화합물의 43일간의 투여 사이클 동안 각각의 투여 수준에서 크게 감소하였으며, 이때 14마리의 마우스 중 9마리는 종양 덩어리에서 30% 이상의 감소가 나타났으며(부분 반응), 1마리의 동물에서는 10일 동안의 처리 중단 후에도 종양 증거가 없는 완전한 반응을 보여 주었다.
화학식 1의 화합물의 매일 경구 투여 후, 무흉선 마우스에서 크게 진행된 GTL-16 종양 이종이식의 퇴화(도 4A) 및 마우스 체중(도 4B)을 도시하였다. 진행된 GTL-16 종양(620㎣)이 있는 무흉선 마우스에게 43일 동안 화학식 1의 화합물을 지시된 투여량으로 또는 비히클 만을 경구적으로 투여하였다. 항종양 효능(도 4A)을 평가하기 위해, 종양 부피를 6 내지 8마리의 마우스 군에 대해 지시된 중앙 종양 부피 ± SEM으로 지시된 날짜에 캘리퍼로 측정하였다. 화학식 1의 화합물로 처리된 군 및 비히클로 처리된 대조군에서의 마우스의 평균 중량은 우편 패널에 도시되어 있다(도 4B).
NCI-H441 NSCLC 모델/Caki-1/PC-3 종양 이종이식
진행된 NCI-H441(100㎣)(도 5A), Caki-1(표 3A, 표 3B) 또는 PC-3 종양 이종이식(도 5B)이 있는 무흉선 마우스에게 38일, 40일 또는 20일 동안 각각 화학식 1의 화합물을 지시된 투여량으로 또는 비히클 만을 경구적으로 투여하였다. 종양 부피를 중앙 종양 부피 ± SEM으로 지시된 날짜에 캘리퍼로 측정하였다. *는 일원 변량분석을 사용하여 측정될 때 대조군에 비교하여 처리군에서 중앙 종양 부피가 상당히 적다는 것을 의미한다(P<0.001)(도 5 참조).
NCI-H441 NSCLC 모델에서, 화학식 1의 화합물을 38일 동안 투여한 후 50mg/kg/일에서 진행된 종양의 43%의 평균 퇴화가 관측되었다(도 5). 이러한 연구에서, 각 종양은 50mg/kg/일에서 화학식 1의 화합물의 38일간의 투여 사이클 동안 크게 감소하였으며, 이때 11마리의 마우스 중 3마리는 종양 덩어리에서 30% 이상의 감소가 나타났으며(부분 반응), 3마리의 동물에서는 종양 증거가 없는 완전한 반응을 보여 주었다(도 5). 화학식 1의 화합물의 항종양 효능은 투여량 의존성이어서, 진행된 NCI-H441 종양의 퇴화가 50mg/kg/일에서 관측되었으며, 종양 성장의 부분 억제(57%의 종양 성장 억제)는 15mg/kg/일에서 관측되었다(도 5). NCI-H441 모델에서 관측된 화학식 1의 화합물의 항종양 효능은 비히클로 처리된 대조와 비교한 화합물 처리군으로부터의 종양에서의 c-Met/HGFR 포스포릴화 억제와 일치하였다. Caki-1 신암종 모델에서, 화학식 1의 화합물의 38일간의 투여 사이클 동안 50mg/kg/일에서 평균 종양 부피의 53% 감소가 관측되었다(도 5B). Caki-1 연구에서, 화학식 1의 화합물의 38일간의 투여 사이클 동안 각 종양에서 30% 이상의 부피가 감소하였다(표 3B, 표 4). 화학식 1의 화합물의 항종양 효능을 PC-3 전립선 암종 이종이식 모델에서 또한 조사하였으며, 거의 완전한 종양 성장 억제(84%의 성장 억제)가 상기 모델에서 관측되었다.
Figure 112008048510808-PCT00004
Figure 112008048510808-PCT00005
항종양 효능과 c- Met / HGFR 의 억제와의 관계
일련의 투여량-반응 항종양 효능 및 약물동력학적 연구를 실시하여 항종양 효능에 대한 c-Met/HGFR 표적 억제 사이의 관계를 증명하였다. 화학식 1의 화합물에 의한 c-Met/HGFR의 약물동력학적 억제를 평가하기 위해, 화학식 1의 화합물의 경구 투여 후 여러 시점에서 GTL-16 위암종 세포를 수확하였다. 종양에서의 c-Met/HGFR 포스포릴화 상태를 광범위한 투여량에서 ELISA에 의해 정량화하였다. 이러한 연구에서, 화학식 1의 화합물은 종양 성장 억제에 대해 c-Met/HGFR의 투여량- 및 시간-의존성 억제와 강한 상관관계가 있다는 것을 보여 주었다. 표적 PD의 관계를 GTL-16 모델에서의 효능으로 정의하는 경우, 하기와 같은 결론을 내릴 수 있다: 1) 24시간 동안 c-Met/HGFR 활성의 완전한 억제는 종양 성장의 완전한 억제(50mg/kg, 100% 종양 성장 억제(TGI))와 일치하고, 2) 스케쥴 중 단지 일부에서 c-Met/HGFR 활성의 유효한 억제는 차선 상태의 효능(12.5mg/kg, 60% TGI)과 일치하고, 3) c-Met/HGFR 활성(3.125, 6.25mg/kg)의 억제가 50% 초과가 되지 않는 것은, 상당한 종양 성장 억제(TGI)의 부족과 일치한다(도 2A 및 2B). 부가적인 GTL-16 연구에서는, 50 및 75mg/kg/일의 화학식 1의 화합물로 처리된 코호트(cohort)가 동일한 평균 종양 퇴화를 나타냈으며, 이것은 50mg/kg/일이 최대 유효 투여 수준을 나타낸다는 추가적인 증거의 제공을 보여준다(도 4 및 표 4). 이러한 사실은, c-Met/HGFR 억제의 지속성이 화학식 1의 화합물의 항종양 효능과 직접적으로 관련된다는 것을 시사한다.
더욱이, 모든 종양 모델(GTL-16, U87MG, 및 NCI-H441) 및 투여량 스케쥴을 사용하여 종양 성장 및 c-Met/HGFR 포스포릴화에 대해 화학식 1의 화합물의 유사한 투여량-투여량 의존 효과가 관측되었으며, 이러한 것들이 상기 관측 내용을 추가적으로 지지한다(표 4). 상기 연구 각각에서, 50mg/kg/일 투여 수준에서 완전한 종양 성장 억제 또는 종양 퇴화를 초래하였다(표 4). 또한, 완전한 효능을 달성하도록 c-Met/HGFR 억제의 정도 및 지속성을 최대화하는 개념을 추가적으로 지지하는 각각의 모델에서 c-Met/HGFR 포스포릴화의 억제와 항종양 효능 사이에 투여량-의존성 상관 관계가 관측되었다. 총괄적으로, 상기 연구들은, 투여 스케쥴 동안 c-Met/HGFR 포스포릴화의 거의 완전한 억제가 치료 이익 및 억제의 정도 및 지속성을 최대화하기 위해 필요하며, c-Met/HGFR 활성은 항종양 효능의 수준과 직접적으로 관련된다는 것을 시사하고 있다. 상기 데이터는, 화학식 1의 화합물의 의향하는 약물학적 표적인 c-Met/HGFR의 억제와 항종양 효능 정도 사이의 관련성을 지지한다.
NPM - ALK -의존성 림프종 모델에서의 화학식 1의 화합물의 항종양 효능
카파스 299 ALCL 모델
진행된 카파스 299 종양(220㎣)이 있는 SCID-베이지 마우스에게 지정된 시간 동안 화학식 1의 화합물을 지시된 투여량으로 또는 비히클 만을 경구적으로 투여하였다. 종양 성장 억제를 평가하는 연구(도 6A)에 있어서, 종양의 부피를 8 내지 12마리의 마우스 군에서 지시된 중앙 종양 부피 ± SEM으로 지시된 날짜에 캘리퍼에 의해 측정하였다. 기재된 백분율(%) 값은 약물 처리된 마우스에서 23일째에 측정된 종양 성장 억제를 비히클로 처리된 마우스와 비교한 %값이며, 수학식 4로서 계산된다:
100*{1-[(처리일 23 - 처리일 12)/(대조일 23 - 대조일 12)]}
*는 일원 변량분석을 사용하여 측정될 때 대조군에 비하여 처리군에서 중앙 종양 부피가 상당히 적다는 것을 의미한다(P<0.001). NPM-ALK 포스포릴화의 억제를 평가하는 연구(도 6B)에서, 화학식 1의 화합물의 투여 후 4시간의 연구가 종결될 때 마 우스를 안락사시키고, 종양을 잘라내어 동결시킨 후, 비히클 및 처리된 종양에서의 ALK 포스포릴화를 ELISA에 의해 정량화하였다. 종양에서 화학식 1의 화합물에 의한 키나제 표적 포스포릴화의 억제는 하기 수학식 1에 따라 계산되었다:
수학식 1
억제% = 100-[(처리 시의 평균 OD/비처리 시의 평균 OD) x 100]
카파스 299 ALCL 모델을 사용하여, 화학식 1의 화합물이 진행된 종양(200㎣ 초과)을 뚜렷하게 퇴화시키는 능력을 갖는다는 것을 보여 주었다(도 6A). 이러한 연구에서, 100mg/kg/일로 화학식 1의 화합물을 투여하면, 화합물의 투여 개시 15일 이내에 이러한 투여 코호트 중의 모든 마우스의 종양이 완전하게 퇴화된다(도 6A). 17일 후, 화학식 1의 화합물의 처리로 인해 종양의 재성장이 중단되었다. 종양이 더 큰 크기(600㎣ 초과)로 성장된 경우, 부가적으로 13일 동안 화학식 1의 화합물의 처리가 다시 개시되었으며, 종양의 완전한 퇴화가 다시 1회 나타났다(도 6A, 표 4). 화학식 1의 화합물의 종양감축 효과는 실험실 내에서 ALCL 세포에 대한 항증식 및 아포프토틱 효과의 관측과 일치한다. 항종양 효능에 대한 종양 NPM-ALK 포스포릴화의 억제 관계가 또한 다중 투여 수준 및 시점에서 측정되었다. c-Met/HGFR-의존성 종양 모델에서의 관측과 유사하게, 전체 투여 시간(24시간) 동안 NPM-ALK 활성의 거의 완전한 억제(90% 초과의 억제)는 100mg/kg에서의 최대 항종양 효능(완전한 퇴화)과 일치한다(도 6A 및 도 6B). NPM-ALK 포스포릴화의 불완전한 억제(25 또는 50mg/kg에서의 90% 미만의 억제)는 차선 상태의 항종양 효능과 일치한다(도 6A 및 6B). c-Met/HGFR-의존성 종양 모델에서의 연구와 유사하게, 상기 데이터는 화학식 1의 화합물의 다른 의향하는 약물학적 표적인 NPM-ALK의 억제와 NPM-ALK-의존성 종양 모델에서의 항종양 효능의 정도 사이의 관계를 지지하고 있다.
Figure 112008048510808-PCT00006
화학식 1의 화합물의 합성
PLE는 PLE-AS(바이오캐탈리틱스 인코포레이티드(Biocatalytics Inc.)로부터 ICR-123으로서 구매, 황산 암모늄 현탁액으로서 판매)로서 주로 공지된 돼지의 간으로부터의 조질 에스테라제 제제로서, 로슈(Roche)에 의해 생산되고 바이오캐탈리틱스 인코포레이티드에 의해 판매되고 있는 효소이다. 상기 효소는 CAS 원부에서 "카복실-에스터 하이드로라제("carboxylic-ester hydrolase", CAS no. 9016-18-6)로서 분류되고 있다. 대응하는 효소 분류 번호는 EC 3.1.1.1이다. 효소는 광범위한 에스터의 가수분해에 대해 광범위한 기질 특이성을 갖는 것으로 알려졌다. 리파제 활성은 pH 적정기에서 에틸 뷰티레이트의 가수분해에 기초한 방법을 사용하여 측정된다. 1LU(리파제 단위)는 22℃ 및 8.2의 pH에서 분당 1μmol의 적정가능한 뷰티르산을 유리시키는 효소의 양이다. 본원에 기재된 제제((PLE-AS, 현탁액으로서)는 일반적으로 45LU/mg 이상의 신고된 활성(약 40mg/㎖의 단백질 함량)을 갖는 불투명한 갈녹색 액체로서 수송되고 있다.
(1S) 1-(2,6- 다이클로로 -3- 플루오로페닐 )에탄올
하기 반응식들에서 화합물(S-1)로서 도시된 (1S)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에탄올을 반응식 B에 따라 라세미체 1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에틸 아세테이트의 촉매 가수분해, 에스터화 및 전환된 화학 가수분해의 조합에 의해 제조하였다. 라세미체 1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에틸 아세테이트(화합물 A2)는 반응식 A에 따라 제조되었다.
Figure 112008048510808-PCT00007
1-(2,6- 다이클로로 -3- 플루오로페닐 )에탄올(A1): 나트륨 보로 하이드라이드(90mg, 2.4mmol)를 2㎖의 무수 CH3OH 중의 2',6'-다이클로로-3'-플루오로-아세토페논(알드리치(Aldrich), 카탈로그 # 52,294-5)(207mg, 1mmol) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반시킨 후, 증발시켜 무색 오일성 잔유물을 수득하였다. 잔유물을 플래시 크로마토그래피(헥세인 중의 0->10% EtOAc로 용리)에 의해 정제하여 화합물(A1)을 무색 오일로서 수득하였다(180mg; 0.88mmol; 86.5% 수율); MS(APCI)(M-H)- 208; 1H NMR(400 MHz, 클로로폼-D) δ ppm 1.64(d, J=6.82 Hz, 3H), 3.02(d, J=9.85 Hz, 1H), 6.97-7.07(m, 1H), 7.19-7.33(m, 1H).
1-(2,6- 다이클로로 -3- 플루오로페닐 )에틸 아세테이트(A2): 아세트산 무수물(1.42㎖, 15mmol) 및 피리딘(1.7㎖, 21mmol)을 20㎖의 CH2Cl2 중의 화합물(A1)(2.2g, 10.5mmol) 용액에 연속하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 12시간 동안 실온에서 교반시킨 후 증발시켜 황색 오일성 잔유물을 수득하였다. 잔유물을 플래시 크로마토그래피(헥세인 중의 7->9% EtOAc로 용리)에 의해 정제하여 화합물(A2)을 무색 오일로서 수득하였다(2.26g; 9.0mmol; 85.6% 수율); 1H NMR(400 MHz, 클로 로폼-D) δ ppm 1.88(d, J=6.82 Hz, 3H), 2.31(s, 3H), 6.62(q, J=6.82 Hz, 1H), 7.25(t, J=8.46 Hz, 1H), 7.49(dd, J=8.84, 5.05 Hz, 1H).
Figure 112008048510808-PCT00008
pH 전극, 오버헤드 교반기 및 염기 첨가 라인(1M NaOH)이 구비된 자켓이 있는 50㎖의 플라스크에 1.2㎖의 100mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0) 및 0.13㎖의 PLE AS 현탁액을 첨가하였다. 이어서, 화합물(A2)(0.13g, 0.5mmol, 1.00eq)을 적하시키고, 결과의 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반시킨 후, 1M의 NaOH를 사용하여 반응의 pH를 7.0으로 일정하게 유지시켰다. 반응의 전환 및 ee 둘다를 RP-HPLC에 의해 모니터하고, 출발 물질의 50%가 소비된 후, 반응을 중단시켰다(이러한 조건에서 약 17시간). 이어서, 혼합물을 10㎖의 에틸 아세테이트로 3회 추출하여 에스터 및 알콜 모두를 화합물(R-1) 및 (S-2)의 혼합물로서 회수하였다.
메테인설폰일 클로라이드(0.06㎖, 0.6mmol)를 질소 대기 하에 4㎖의 피리딘 중의 화합물(R-1) 및 (S-2)의 혼합물(0.48mmol) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시킨 후 증발시켜 오일을 수득하였다. 물(20㎖)을 혼합물에 첨가한 후 EtOAc(20㎖ x 2)를 첨가하여 수성 용액을 추출하였다. 유기 층들을 조합시키고 건조시킨 후, 여과시키고 증발시켜 화합물(R-3) 및 (S-2)의 혼합물을 수득하였다. 상기 혼합물을 추가의 정제없이 다음 단계에 사용하였다. 1H NMR(400 MHz, 클로로폼-D) δ ppm 1.66(d, J=7.1 Hz, 3H), 1.84(d, J=7.1 Hz, 3H), 2.09(s, 3H), 2.92(s, 3H), 6.39(q, J=7.0 Hz, 1H), 6.46(q, J=6.8 Hz, 1H), 6.98-7.07(m, 1H), 7.07-7.17(m, 1H), 7.23-7.30(m, 1H), 7.34(dd, J=8.8, 4.80 Hz, 1H).
아세트산 칼륨(0.027g, 0.26mmol)을 질소 대기 하에 4㎖의 DMF 중의 화합물(R-3) 및 (S-2)의 혼합물(0.48mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 12시간 동안 100℃로 가열시켰다. 물(20㎖)을 반응 혼합물에 첨가하고, EtOAc(20㎖ x 2)를 첨가하여 수성 용액을 추출하였다. 조합된 유기 층들을 건조시키고 여과시킨 후 증발시켜 화합물(S-2)의 오일을 수득하였다(72mg, 두 단계에서의 수율 61%). 키랄성 ee: 97.6%. 1H NMR(400 MHz, 클로로폼-D) δ ppm 1.66(d, J=7.1 Hz, 3H), 2.09(s, 3H), 6.39(q, J=6.8 Hz, 1H), 7.02(t, J=8.5 Hz, 1H), 7.22-7.30(m, 1H).
나트륨 메톡사이드(19mmol; 메탄올 중의 0.5M)를 질소 대기 하에 0℃에서 화합물(S-2)(4.64g, 18.8mmol)에 천천히 첨가하였다. 결과의 혼합물을 실온에서 4시 간 동안 교반시켰다. 용매를 증발시키고, H2O(100㎖)를 첨가하였다. 냉각된 반응 혼합물을 아세트산 나트륨-아세트산 완충 용액으로 pH 7로 중화시켰다. 에틸 아세테이트(100㎖ x 2)를 첨가하여 수성 용액을 추출하였다. 조합된 유기층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시킨 후 증발시켜 화합물(S-1)을 백색 고체로서 수득하였다(4.36g, 94.9% 수율); SFC-MS: 97%ee. 1H NMR(400 MHz, 클로로폼-D) δ ppm 1.65(d, J=6.8 Hz, 3H), 5.58(q, J=6.9 Hz, 1H), 6.96-7.10(m, 1H), 7.22-7.36(m, 1H).
5- 브로모 -3-[1-(2,6- 다이클로로 -3- 플루오로 - 페닐 )- 에톡시 -피리딘-2- 일아민 (라세미체)
Figure 112008048510808-PCT00009
1. 2,6-다이클로로-3-플루오로아세토페논(15g, 0.072mol)을 아이스 배스를 사용하여 0℃에서 10분 동안 THF(150㎖, 0.5M)에서 교반시켰다. 리튬 알루미늄 하이드라이드(2.75g, 0.072mol)를 천천히 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 3시간 동안 교반시켰다. 반응을 아이스 배스에서 냉각시키고, 물(3㎖)을 적하시킨 후, 15% NaOH(3㎖)를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 30분 동안 교반시켰다. 15% NaOH(9㎖) 및 MgSO4를 첨가하고, 혼합물을 여과시켜 고체를 제거하였다. 고체를 THF(50㎖)로 세척하고 여액을 농축시켜 1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에탄올(14.8gm, 95% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 1.45(d, 3H), 5.42(m, 2H), 7.32(m, 1H), 7.42(m, 1H).
2. THF(200㎖) 중의 트라이페닐 포스핀(8.2g, 0.03mol) 및 DEAD(톨루엔 중의 40% 용액 13.65㎖)의 교반된 용액에 0℃에서 THF(200㎖) 중의 1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에탄올(4.55g, 0.021mol) 및 3-하이드록시-나이트로피리딘(3.35g, 0.023mol)의 용액을 첨가하였다. 결과의 밝은 오렌지색 용액을 질소 대기 하에 주위 온도에서 모든 출발물질이 소비될 때까지 4시간 동안 교반시켰다. 용매를 제거하고, 조질의 물질을 건조 조건 하에 실리카겔 상에 충전시키고, 에틸 아세테이트-헥세인(20:80)으로 용리시켜 3-(2,6-다이클로로-3-플루오로-벤질옥시)-2-나이트로-피리딘(6.21g, 0.021mol, 98%)을 핑크색 고체로서 수득하였다. 1H NMR(CDCl3, 300 MHz) δ 1.8-1.85(d, 3H), 6.0-6.15(q, 1H), 7.0-7.1(t, 1H), 7.2-7.21(d, 1H), 7.25-7.5(m, 2H), 8.0-8.05(d, 1H).
3. AcOH(650㎖) 및 EtOH(500㎖)의 교반된 혼합물에 3-(2,6-다이클로로-3-플루오로-벤질옥시)-2-나이트로-피리딘(9.43g, 0.028mol) 및 철조각(15.7g, 0.28mol)을 현탁시켰다. 반응을 환류 온도까지 천천히 가열시키고, 1시간 동안 교반시켰다. 반응을 실온으로 냉각시킨 후, 다이에틸 에터(500㎖) 및 물(500㎖)을 첨가하였다. 탄산 나트륨을 첨가하여 용액을 주의 깊게 중화시켰다. 조합된 유기 추출 물들을 포화 NaHCO3(2 x 100㎖), H2O(2 x 100㎖) 및 염수(1 x 100㎖)로 세척하고 건조(Na2SO4)시킨 후, 여과시키고 진공 하에 무수 시까지 농축시켜 3-(2,6-다이클로로-3-플루오로-벤질옥시)-피리딘-2-일아민(9.04g, 0.027mol, 99%)을 밝은 핑크색 고체로서 수득하였다. 1H NMR(CDCl3, 300 MHz) δ 1.8-1.85(d, 3H), 4.9-5.2(brs, 2H), 6.7-6.84(q, 1H), 7.0-7.1(m, 1H), 7.2-7.3(m, 1H), 7.6-7.7(m, 1H).
4. 아세토나이트릴 중의 3-(2,6-다이클로로-3-플루오로-벤질옥시)-피리딘-2-일아민(9.07g, 0.03mol)의 교반된 용액을 아이스 배스를 사용하여 0℃로 냉각시켰다. 상기 용액에 N-브로모석신이미드(NBS)(5.33g, 0.03mol)를 분획식으로 첨가하였다. 반응을 0℃에서 15분 동안 교반시켰다. 반응을 진공 하에 무수 시까지 농축시켰다. 결과의 암색 오일을 EtOAc(500㎖)에 용해시키고 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이어서, 용매를 진공에서 제거하여 5-브로모-3-(2,6-다이클로로-3-플루오로-벤질옥시)-피리딘-2-일아민(5.8g, 0.015mol, 51%)을 백색 결정질 고체로서 수득하였다. 1H NMR(CDCl3, 300 MHz) δ 1.85-1.95(d, 3H), 4.7-5.0(brs, 2H), 5.9-6.01(q, 1H), 6.8-6.95(d, 1H), 7.01-7.2(t, 1H), 7.4-7.45(m, 1H), 7.8-7.85(d, 1H).
5- 브로모 -3-[1(R)-(2,6- 다이클로로 -3- 플루오로 - 페닐 )- 에톡시 ]-피리딘-2- 일아민
Figure 112008048510808-PCT00010
라세미체에 대해 상술된 바와 따르지만, 거울상이성질체적으로 순수한 출발 물질을 사용하여 거울상이성질체적으로 순수한 R 이성체를 제조하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 1.74(d, 3H), 6.40(m, 1H), 6.52(br s, 2H), 7.30(m, 1H), 7.48(m, 1H), 7.56(s, 1H); MS m/z 382(M+1).
4- 메테인설폰일옥시 -피페리딘-1- 카복실산 3급- 뷰틸 에스터(2)
Figure 112008048510808-PCT00011
0℃로 냉각된 CH2Cl2(100㎖) 중의 4-하이드록시-피페리딘-1-카복실산 3급-뷰틸 에스터(7.94g, 39.45mmol)의 교반된 용액에 NEt3(5.54㎖, 39.45mmol)를 천천히 첨가하고, 이어서 메테인설폰일 클로라이드(3.06㎖, 39.45mmol) 및 DMAP(48mg, 0.39mmol)를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 혼합물에 물(30㎖)을 첨가하였다. CH2Cl2(3 x 30㎖)로 추출한 후 건조(Na2SO4)시키고, 진공에 서 용매를 제거하여 4-메테인설폰일옥시-피페리딘-1-카복실산 3급-뷰틸 에스터를 백색 고체로서 수득하였다(11.00g, >99% 수율). 1H NMR(CDCl3, 400 MHz) δ 4.89(m, 1H), 3.69(m, 2H), 3.31(m, 2H), 3.04(s, 3H), 1.95(m, 2H), 1.83(m, 2H), 1.46(s, 9H).
3급- 뷰틸 -4-[4-(4,4,5,5- 테트라메틸 -1,3,2- 다이옥사보로란 -2-일)-1H- 피라졸 -1-일]피페리딘-1- 카복실레이트
Figure 112008048510808-PCT00012
3급- 뷰틸 4-(4-요오도-1H- 피라졸 -1-일)피페리딘-1- 카복실레이트(3)
NaH(1.2eq., 0.68mmol)를 4℃에서 DMF(2ℓ) 중의 4-요오도피라졸(0.57mmol)의 교반된 용액에 적하하였다. 결과의 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 교반시킨 후, 4-메테인설폰일옥시-피페리딘-1-카복실산 3급-뷰틸(화합물 2)(1.1eq., 0.63mmol)을 첨가하였다. 결과의 혼합물을 12시간 동안 100℃로 가열시켰다. 반응을 H2O로 급냉시키고, EtOAc로 수회 추출하였다. 조합된 유기층들을 건조시키고, 여과시킨 후, 농축시켜 오렌지색 오일을 수득하였다. 잔유물을 실리카겔 크로마토그래피(펜테인 중의 5% EtOAc로 용리)에 의해 정제하여 화합물(3)을 백색 고체로서 수득하였다(140g, 66%).
3급- 뷰틸 -4-[4-(4,4,5,5- 테트라메틸 -1,3,2- 다이옥사보로란 -2-일)-1H- 피라졸 -일]피페리딘-1- 카복실레이트(4)
비스(피나콜라토)다이보론(1.4eq., 134g, 0.52mol) 및 아세트산 칼륨(4eq., 145g, 1.48mol)을 1.5ℓ의 DMSO 중의 화합물(3)(140g, 0.37mol)의 용액에 연속적으로 첨가하였다. 혼합물을 질소로 여러번 세정한 후, 다이클로로비스(트라이페닐포스피노) 팔라듐(II)(0.05eq., 12.9g, 0.018mol)을 첨가하였다. 결과의 혼합물을 2시간 동안 80℃에서 가열시켰다. 결과의 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 셀라이트 베드를 통해 여과시키고 EtOAc로 세척하였다. 여액을 포화 NaCl(500㎖ x 2)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시킨 후, 여과시키고 농축시켰다. 잔유물을 실리카겔 크로마토그래피(헥세인 중의 5% EtOAc로 용리)에 의해 정제하여 화합물(4)을 백색 고체로서 수득하였다(55g, 40%).
3-{(R)-1-(2,6- 다이클로로 -3- 플루오로 - 페닐 )- 에톡시 ]-5-(1-피페리딘-4-일-1H-피라졸-4-일)-피리딘-2- 일아민 (1)
Figure 112008048510808-PCT00013
DME(143㎖) 중의 3-[(R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에톡시]-5-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]다이옥사보로란-2-일)-피리딘-2-일아민(15.22g, 35.64mmol) 및 4-(4-브로모-피라졸-1-일)-피페리딘-1-카복실산 3급-뷰틸 에스터(14.12g, 42.77mmol)의 교반된 용액에 물(36㎖) 중의 Na2CO3(11.33g, 10692mmol)의 용액을 첨가하였다. 용액을 탈기시키고 질소로 3회 충전시켰다. 상기 용액에 Pd(PPh3)2Cl2(1.25mg, 1.782mmol)를 첨가하였다. 반응 용액을 탈기시키고, 질소로 다시 3회 충전시켰다. 반응 용액을 87℃의 오일 배스에서 약 16시간(또는 보레인 피나콜 에스터가 소비될 때까지)동안 교반시키고, 주위 온도로 냉각시킨 후, EtOAc(600㎖)로 희석시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과시키고, EtOAc로 세척하였다. EtOAc 용액을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시킨 후 농축시켰다. 조질의 생성물을 EtOAc/헥세인 시스템(바이오테이지(Biotage) 90+ 칼럼: 평형 600㎖ 100% 헥세인, 분절 1: 2250㎖ 50% EtOAc/헥세인 선형, 분절 2: 4500㎖ 75% EtOAc/헥세인 선형, 분절 3: 4500㎖ 100% EtOAc)으로 용리시키는 실리카겔 칼럼 상에서 정제하여 0.15의 Rf(50% EtOAc/헥세인)을 갖는 4-(4-{6-아미노-5-[(R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에톡시]-피리딘-3-일}-피라졸-1-일)-피페리딘-1-카복실산 3급-뷰틸 에스터(11.8g, 60% 수율, 약 95% 순도)를 수득하였다. MS m/e 550(M+1)+.
CH2Cl2(59㎖, 0.2M) 중의 4-(4-{6-아미노-5-[(R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에톡시]-피리딘-3-일}-피라졸-1-일)-피페리딘-1-카복실산 3급-뷰틸 에스터(11.8g, 21.45mmol)의 용액에 4N HCl/다이옥세인(21㎖)을 첨가하였다. 용액을 밤새 교반시켜 고체를 형성시켰다. 고체를 유리 막대로 철저하게 분쇄시킨 후, 초음파처리하여 고체 중에 포획된 출발 물질을 탈리시켰다. 부가의 4N HCl/다이옥세인(21㎖)을 첨가하고 실온에서 다시 2시간 동안 교반시키면 LCMS가 출발 물질에 보이지 않는다. 필터지가 있는 뷰흐너(Buchner) 깔대기에서 현탁액을 여과시켰다. 모액이 5% 미만의 생성물을 함유하고 있기 때문에 모액을 남겨두었다. 고체를 500㎖의 비이커로 옮기고, 고체가 완전하게 용해될 때까지 HPLC 물을 첨가하였다. 고체 Na2CO3를 첨가하여 pH를 10으로 조정하였다. LCMS이 수성 층에서 생성물로서 나타나지 않을 때까지 수용액을 CH2Cl2(5 x 200㎖)로 추출하였다. CH2Cl2 용액을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. CH2Cl2(10㎖) 및 MeOH(1㎖)에 재용해된 조질의 생성물을 CH2Cl2/MeOH/NEt3 시스템(바이오테이지 40+ 칼럼: 평형 600㎖ CH2Cl2 100%(부산물 생성), 분절 1: 1200㎖ 10% MeOH/CH2Cl2 선형, 분절 2: 2400㎖ 10% MeOH/CH2Cl2 단계, 분절 3: 2400㎖ 9% MeOH/1% NEt3/CH2Cl2)으로 용리시키는 실리카겔 칼럼 상에서 정제하였다. 목적 분액을 수집하여 3-[(R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일-1H-피라졸-4-일)-피리딘-2-일아민(7.19g, 75% 합한 수율, 백색 고체)을 수득하였다. MS m/e 450(M+1)+. 1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.92(s, 1H), 7.76(s, 1H), 7.58(m, 1H), 7.53(s, 1H), 7.45(m, 1H), 6.90(s, 1H), 6.10(m, 1H), 5.55(bs, 2H), 4.14(m, 1H), 3.05(m, 2H), 2.58(m, 2H), 1.94(m, 2H), 1.80(d, 3H), 1.76(m, 2H).
3-[(R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일-1H-피라졸-4-일)-피리딘-2-일아민의 고체 생성물을 다이클로로메테인에 용해시키고, 용매를 천천히 증발시켜 미세 결정질 고체를 수득하였다. 높은 진공에서 건조시킨 후, 샘플이 194℃의 융점을 갖는 단결정 다형체 형태 A임을 확인하였다.

Claims (13)

  1. (R)-3-[1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일-1H-피라졸-4-일)-피리딘-2-일아민 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량을 비정상 세포 성장의 치료가 필요한 포유류에게 투여함을 포함하는, 상기 치료가 필요한 포유류에서 비정상 세포 성장을 치료하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    포유류가 사람인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    포유류가 개인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비정상 세포 성장이 유전적으로 변경된 하나 이상의 티로신 키나제에 의해 조절되는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비정상 세포 성장이 간세포 성장 인자 수용체(c-Met/HGFR) 키나제 또는 퇴행성 림프종 키나제(ALK)에 의해 조절되는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    비정상 세포 성장이 간세포 성장 인자 수용체(c-Met/HGFR) 키나제에 의해 조절되는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    비정상 세포 성장이 퇴행성 림프종 키나제(ALK)에 의해 조절되는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비정상 세포 성장이 암인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    암이 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 결장암, 유방암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계의 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관의 암, 신세포 암종, 신우의 암종, 중추신경계(CNS)의 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 제 2 경추 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    암이 비-소세포 폐암(NSCLC), 편평 세포 암종, 호르몬-불응성 전립선암, 유두형 신세포 암종, 결장직장 선암종, 신경아세포종, 퇴행성 대세포 림프종(ALCL) 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물 또는 이것의 약학적으로 허용되는 염이 (R)-3-[1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일-1H-피라졸-4-일)-피리딘-2-일아민 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물로서 투여되는 방법.
  12. (R)-3-[1-(2,6-다이클로로-3-플루오로-페닐)-에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일-1H-피라졸-4-일)-피리딘-2-일아민을 투여하여 세포에서 c-Met/HGFR 키나제 활성을 억제하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    세포가 A549 사람의 폐암종, GTL-16 사람의 위암종, HT29 사람의 결장 암종, Colo205 사람의 결장 암종, A498 사람의 신암종, 786-O 사람의 신암종, MBA-MD-231 사람의 유방 암종, 매들린-다비 개의 신장(Madlin-Darby Canine Kidney; MDCK) 상 피 세포, P-글라이코프로테인을 발현하도록 유전자조작된 MDCK 세포(MDCK-MDR1), mIMCD3 마우스 신장 상피 세포, HUVEC(사람의 제대 정맥 내피 세포), Caki-1 신암종, 및 HGFR-V1092I, HGFR-H1094R, HGFR-Y1230C 및 HGFR-M1250T를 비롯한 사람의 야생형 c-Met/HGFR 및 돌연변이된 c-Met/HGFR을 발현하도록 유전자조작된 NIH-3T3 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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