BRPI0609168A2 - método de diagnóstico in vitro de doença de alzheimer por meio de um anticorpo monoclonal - Google Patents

Abstract

MéTODO DE DIAGNóSTICO IN VITRO DE DOENçA DE ALZHEIMER POR MEIO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL. A presente invenção refere-se a um método de diagnóstico in vitro de doença de Alzheimer por meio de um anticorpo monoclonal. O dito anticorpo é capaz de se ligar pelo menos aos aminoácidos 12-16 de peptideo ~-amiIóide, especificamente a detecção das placas neuríticas que são características de doença de Alzheimer com detecção de placas difusas, que não são indicadoras da doença. Entre as placas neuríticas, o anticorpo monocIonal torna possível detectar um subgrupo que difere na composição de várias isoformas de peptídeo 13-amilóide que são depositadas, que está associada ao estágio de progressão da doença. Além do mais, o anticorpo é capaz de se ligar a isoformas de peptideo 13-amilóide em fluidos biológicos tal como urina. Correspondentemente, o anticorpo monoclonal da invenção, as linhas de células que o produzem e as composições contendo-o podem ser usadas no diagnóstico in vitro de doença de Alzheimer e a determinação do estágio de progressão da doença.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DEDIAGNÓSTICO IN VITRO DE DOENÇA DE ALZHEIMER POR MEIO DEUM ANTICORPO MONOCLONAL".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao diagnóstico de distúrbios neu-

rológicos, especialmente ao diagnóstico de doença de Alzheimer por meiode um anticorpo que é capaz de interagir com peptídeos específicos com adita doença.

Antecedentes da Invenção Doença de Alzheimer (AD) é um distúrbio neurológico que causa

a morte de neurônios no cérebro. Em geral, se desenvolve lentamente, co-meçando depois dos 50 anos de idade, e seu primeiro sintoma pode ser atri-buído à velhice ou um esquecimento comum. Uma vez que a doença se de-senvolve, há uma deterioração gradual de capacidade cognitiva, incluindo a capacidade de tomar decisões e realizar tarefas habituais, e pode haver mu-danças na personalidade, bem como problemas corpomentais. Em seus es-tágios avançados, AD leva à demência e finalmente à morte. No momento adoença é incurável e constitui uma causa principal de mortalidade.

No presente momento, doença de Alzheimer é normalmente di- agnosticada a partir da imagem clínica, uma vez que um diagnóstico definiti-vo pode apenas ser baseado em exame histológico de amostras de cérebro(autópsia ou biopsia), revelando a presença de seus aspectos característicosno tecido cerebral. Em virtude dos riscos associados à biopsia do cérebroem pacientes vivos, este procedimento é muito raramente usado, e corres- pondentemente é estimado que a taxa de erro em diagnóstico in vivo destadoença esteja em torno de 20-30%.

Os cérebros de indivíduos com doença de Alzheimer mostramdois marcadores patológicos principais: degeneração neurofibrilar (que éidentificada pela presença de entrelaçamentos neurofibrilares, neurite distró- fica e fios de neurópilo) e depósitos de substância amilóide (isto é, depósitosdo assim chamado peptídeo p-amilóide, em geral abreviado para AP), tantona forma de placas (placas difusas e placas neuríticas, estas últimas formasmencionadas sendo característico da doença, e sendo designada como taisuma vez que elas aparecem entre e dentro do neurônios), quanto na formade depósitos vasculares (que ocorrem nas paredes dos vasos sangüíneoscerebrais). Tanto degeneração neurofibrilar quanto deposição amilóide cons- tituem processos degenerativos que são também associados a envelheci-mento normal do cérebro. Em indivíduos idosos os quais não estão sofrendode demência, o peptídeo Ap é principalmente depositado na forma de placasdifusas. Este tipo de deposição é especialmente pronunciado em alguns in-divíduos com capacidades cognitivas normais, e para alguns autores consti- tui um processo de "envelhecimento patológico", que é considerado comoestando parcialmente entre o evelhecimento normal do cérebro e AD [1].Desenvolvimento prematuro, particularmente intensivo de anos de placasdifusas antes das placas neuríticas parecem também ocorrer em síndromede Down (DS), devido à trissomia do cromossoma 21 que leva à ultra- expressão da proteína precursora amilóide (P-APP). Embora uma pequenaquantidade de placas neuríticas possa ser observada nos cérebros de indi-víduos com capacidades cognitivas normais, cérebros afetados por AD bemcomo aqueles afetados por DS no idoso são caracterizados pelo desenvol-vimento de uma grande quantidade de placas neuríticas maduras [2,3]. Em contaste com as placas difusas, que contêm uma forma não fibrilar de Ap(designada "pré-amilóide") [4], tanto os depósitos amilóides vasculares quan-to as placas neuríticas contêm peptídeo Ap em forma fibrilar e reagir commanchas de substância amilóide tal como Congo Red e Tioflavina T.

O declínio cognitivo em AD é relacionado linearmente com a progressão das mudanças neurofibrilares e perda de sinapse cortical [5].Perda de sinapse local associada a placas difusas não foi observada [6]. Emcontraste com isso, placas são associadas à perda de densidade sinática,mudança neurofibrilar e ativação da microglia [7]. Tanto a mudança neurofi-brilar pura quanto a deposição de Abet seguem padrões seqüências bem estabelecidos de progressão em AD [8, 9]. No entanto, embora o grau dedeclínio cognitivo tenha melhor correlação com uma sucessão de estágioscom base em mudança neurofibrilar [5], o diagnóstico neuropatológico defini-tivo de AD é, no entanto, com base na demonstração histológica de umadensidade significativamente alta de placas neuríticas nas regiões neocorti-cais associativas, em relação àquela esperada de acordo com o grupo deidade do paciente, dentro de uma imagem clínica de demência (critérios de consenso de CERAD: Consortion to Establish a Registry for Alzheimer's Di-sease) [10]. A formação de placas neuríticas constitui o processo patogênicocentral em AD, e a composição molecular destes depósitos p-amilóides e asdiferenças das placas difusas em relação à dita composição é corresponden-temente um dos campos principais de interesse em pesquisa atual em AD. Conhecimento sobre a composição molecular dos depósitos B-

amilóides no tecido cerebral de pacientes com doença de Alzheimer mudouradicalmente durante os anos recentes. Vários estudos que empregam mé-todos bioquímicos ou imunoistoquímicos com o objetivo de identificar formasdiferentes do peptídeo AB forneceu uma imagem consistente razoável que permite uma interpretação molecular das constatações morfológicas clássi-cas. Era estes estudos que proveram a base para a teoria patogênica nãounificada da doença, chamada hipótese amilóide [11], embora a hipóteseoriginal fosse reformulada recentemente a fim de incluir uma regra emergen-te dos oligômeros AB solúveis como os agentes patogênicos principais [12]. A suposição de uma regra central ou patogênica primária dos peptídeos Apem AD está agora levando a novas estratégias terapêuticas dirigidas na pre-venção ou remoção destes depósitos.

A distribuição topográfica e a seqüência temporal da deposiçãode peptídeos Ap conhecidas em cérebros afetados por AD foram elucidadaspor meio de anticorpos dirigidos na extremidade de carboxila, na extremida-de de amino ou nos segmentos internos da molécula Ap, juntamente com oisolamento e purificação de isoformas de Ap por métodos bioquímicos. Dis-tribuição de tecido de peptídeos caracterizada pelas características de suasextremidades de carboxila mostra um padrão bem definido, razoavelmente regular. Enquanto que Apx.4o é a forma predominante nos depósitos vascula-res e é a forma principal encontrada no CSF (fluido cerebroespinhal), Apx.42é a forma principal detectada nos depósitos de tecido cerebral (placas difu-sas e placas neuríticas) [13]. Em AD, síndrome de Down (DS) [13, 14] e en-velhecimento normal [1], Apx.42 é o único componente das placas difusas e ocomponente principal das placas neuríticas. A última pode também conterA(3x-4o, predominantemente na região de seu núcleo central. Também foi es- tabelecido que A(3X.42 é a forma que é depositada nos estágios iniciais.

Embora, acredita-se que incialmente Apx.40 e Apx.42 comecemquase totalmente com Asp1 de aminoácido, foi imunoistoquimicamente ebioquimicamente bem estabelecido que uma ampla variedade de isoformasheterogêneas do peptídeo Ap, modificado ou truncado da extremidade do

aminoácido na composição tanto das placas difusas quanto neuríticas [15].Estas isoformas também tendem a mostrar um padrão regular de distribui-ção entre placas difusas e neuríticas, de modo que uma imagem completada distribuição topográfica dos vários peptídeos Ap finalmente começou aemergir. Há, no entanto, algumas discrepâncias entre os estudos, particu-

larmente com relação às características da extremidade de aminoácido dospeptídeos que formam as placas difusas, e a quantidade relativa de depósitoamilóide que cada uma delas representa.

Estas discrepâncias envolvem o peptídeo p3 (Ap17-42) em parti-cular. Enquanto que alguns estudos sugerem que Api7-42 pode ser o compo-

nente principal das placas difusas [16], outras encontraram uma quantidaderelativamente maior de formas mais longas (começando a Asp1, ou truncadona extremidade de aminoácido ou outras isoformas modificadas) neste nível[15]. Uma vez que Ap17-42 é produzido por excisão de p-APP por cc-secretase(a trajetória nonamiloidogênica assim chamada) e exibe propriedades fisico-

químicas totalmente diferentes das isoformas mais longas de Ap (a últimasendo gerada por excisão de p-APP por y-secretase), sua presença seletivaem placas difusas pode ser de significância patogênica crucial no desenvol-vimento de placas.

Growing e outros [17] foram primeiramente para isolar o peptí-

deo AP17.42 como a forma predominante recuperada a partir de cérebros afe-tados por AD rico em placas difusas. Este depósito não foi encontrado emdepósitos amilóides vasculares ou em placas neuríticas. O anticorpo mono-elonal comercial 6E10, que reconhece ApM7) não produziu imunomancha-mento de placas difusas, nem neocortical nem cerebelar, em uma série decérebros afetados por AD e DS [18]. No entanto, o corpo estriado, onde asplacas difusas são particularmente abundantes na ausência de placas neurí-5 ticas, mostraram algumas placas que são positivas para o anticorpo 6E10.Usando-se HPLC e determinações imunoistoquímicas, Lalowski e outros [19]demonstraram que Ap17-42 representa 70% do teor amilóide total em placasdifusas do cerebelo, enquanto que Api7-42 representa 12% e outras formastruncadas de Ap17-42 representam 5% ou menos. Em cérebros de pessoas

idosas afetadas por DS, Saido e outros [20] encontraram manchamentomaior de placas difusas com um anticorpo anti-Ap N3 específico (pyroGIu)do que com um anticorpo anti-Ap N(1). Iwatsubo e outros [15] estudaramplacas difusas em uma série de cérebros oriundos de pessoas idosas, afeta-das por AD e afetadas por DS com um painel de anticorpos dirigido em for- mas de reconhecimento de Ap truncado e modificado na extremidade amino.Este estudo é único pelo fato de que o tecido do cérebro empregado para ainvestigação imunoistoquímico foi fixado ou em 70% de etanol, ou em 4% deformaldeído, de modo que seja capaz de testar o efeito de fixação rotineiracom formaldeído na aparência de artefatos. Em todas as amostras de tecido fixadas em 70% de etanol, as placas difusas foram manchadas intensamen-te pela presença de Ap M (L-Asp), Ap N1 (L-isoAsp), Ap N1 (N-Asp), Ap N3(pyroGIu), e Ap X-42. Imunomanchamento fraco foi obtido com Ap N11 (p-yroGIu) e Ap N17. No entanto, no material fixo em formaldeído algumas pla-cas difusas foram manchadas com Ap N1 (L-Asp), e nenhum manchamento foi obtido com Ap N1 (L-isoAsp) ou Ap N1 (N-Asp), enquanto que o padrãode manchamento da extremidade de carboxila foi não mudada. Embora osautores demostraram que a modificação da extremidade de aminoácido po-dem alterar os resultados do imunomanchamento em tecidos fixos em for-maldeído, eles obtinham reatividade fraca para Ap N17 ainda em materialfixo em etanol. Usando-se um anticorpo monoclonal específico a p3 (Ap17.42)[16], verificou-se que a deposição deste peptídeo foi grandemente limitadapara difundir placas, neurites distróficas e as coronas de placas neuríticasnas regiões das amígdalas, hipocampo e para-hipocampo. Os autores suge-riam uma regra específica de p3 na deposição inicial de substância amilóidee na região das placas neuríticas. Tekirian e outros [21] demonstraram, emvários cérebros afetados por AD e controles, a presença de Ap N3 (peptí- deo) > Ap N1 (D) > Ap N17 (L) > Ap N1 (rD) nas placas difusas.

Com relação à variabilidade da extremidade de carboxila, em umestudo usando-se anticorpos dirigidos contra Apx.4o, Apx.42 ou Apx-43, Parva-thy e outros [22] encontraram um subgrupo de placas neuríticas que apenasreagem para dar o anticorpo Ap C40 e um subgrupo maior das placas que

reagem tanto para dar Ap C40 quanto para dar Ap C42.

Estudos mais recentes assim estabeleceram que as placas difu-sas mostram perfil de Ap que é altamente específico na extremidade de car-boxila e um perfil que é razoavelmente específico na extremidade de amino,o último sendo sujeito a alguma heterogeneidade entre pacientes e entre

regiões diferentes do cérebro. A presença de Api7-42 parece ser limitadagrandemente às placas difusas, embora haja variação considerável entre osestudos com relação ao conteúdo relativo deste peptídeo mais curto neles.Nos estudos conduzidos por Kida e outros [18], nenhum manchamento foiobtido para peptídeo Ap que incluía a seqüência 12-16 em placas difusas de

regiões corticais e subcorticais.

Os resultados, considerados totais no Estado da Técnica (SA)sugerem que, como proposto por Larner [23], as formas do peptídeo Ap quesão específicas de acordo com a extremidade de amino podem desempe-nhar um papel essencial no desenvolvimento das placas difusas de modo

que elas sejam convertidas em placas neuríticas. Portanto, anticorpos capa-zes de especificamente detectar formas com a extremidade de amino trun-cada e, correspondentemente, diferenciação clara entre placas difusas eplacas neuríticas são extremamente úteis como ferramentas no diagnósticode doença de Alzheimer. Entre eles, aqueles que são capazes de diferenciar

subgrupos de placas neuríticas de acordo com a proporção das formas dife-rentes de peptídeo amilóide que diferem na terminação de aminoácido daextremidade de carboxila seriam especialmente úteis, especialmente se elespudessem ser usados para a definição de subconjuntos de placas que cons-tituem um marcador de doença específico. O anticorpo monoclonal da in-venção dirigido contra a seqüência constituída de aminoácidos 12-16 depeptídeo p-amilóide e uma afinidade maior para a forma Ap42 do que a for- ma A{340, satisfaz ambas as características.

Um outro aspecto em que os anticorpos que são capazes dedetectar formas de peptídeo p-amilóide seriam particularmente úteis no di-agnóstico da doença de Alzheimer por análise da concentração de formasdiferentes deste peptídeo em fluidos biológicos, um aspecto que está sendo

investigado tanto para facilitar diagnóstico baseado nos parâmetros bioquí-micos, quanto ainda com a finalidade de identificar casos pré-clínicos ou a-queles em risco particular de desenvolvimento da doença e para a monitora-ção de pacientes arrolados em estudos clínicos. Para esta finalidade, muitosestudos focalizam o fluido cerebroespinhal (CSF), com o objetivo de detectar

se há variações nas concentrações de formas solúveis de peptídeo p-amilóide presente neste fluido que torna possível diferenciar entre pacientese controles saudáveis. No entanto, é um pouco improvável que análise doCSF, que envolve o uso de uma técnica invasiva, furo lombar, poderia seraplicada para o diagnóstico e monitoramento rotineiro de pacientes com do-

ença de Alzheimer na prática clínica. Portanto, outras linhas de pesquisafocalizaram investigação de variações na concentração no sangue e na urinade marcadores biológicos (que incluem formas solúveis de peptídeo p-amilóide) que poderiam estar correlacionadas com a aparência e o desen-volvimento da doença, apesar de poucos estudos terem sido publicados até

agora. De acordo com estes, os níveis de plasma de Apx.42 e Apx.40 parecemser aumentados se houver síndrome de Down e eles também aumentam emindivíduos normais com a idade. O níveis de plasma Apx.42> mas não de Apx.40, são elevados em pacientes com doença de Alzheimer, e diminuem quan-do a doença se desenvolve [28, 29], embora medição da concentração des-

tas espécies no plasma não possa atualmente ser aplicada no diagnóstico. Apresença de formas solúveis de peptídeo p-amilóide foi também detectadana urina [30], embora um estudo comparativo entre pacientes e controle ain-da tenha sido realizado. Embora a ordem de magnitude das concentraçõesde peptídeo p-amilóide que estejam sendo detectadas no plasma e na urinaestão tornando difíceis de definir os perfis que correspondem a indivíduossaudáveis e a pacientes em estágios diferentes da doença e a associaçãopossível das formas solúveis de peptídeo p-amilóide com outras proteínaspresentes nos ditos fluidos biológicos é uma outra dificuldade de se superar,isto é, uma abordagem sendo ativamente prosseguida, de modo a anticor-pos monoclonais que podem interargir com formas de peptídeo p-amilóidepresentes em fluidos biológicos para tornar possível detectá-los podem re-presentar uma ferramenta muito útil no diagnóstico de doença de Alzheimer.O anticorpo da invenção, que é capaz de interagir com formas solúveis depeptídeo p-amilóide e detectar sua presença em fluidos biológicos tal comourina, é um dos anticorpo que pode ser útil para a implementação destastécnicas de diagnóstico. Além do mais, o fato de que é dirigido especialmen-te contra a região próxima à extremidade de amino de peptídeo p-amilóide éuma característica de interesse na diferenciação das formas de peptídeo p-amilóide que conservam a extremidade de amino daquelas formas em que adita extremidade é truncada.

Outros anticorpos monoclonais dirigidos especificamente contraa região próxima à extremidade de amino de peptídeo p-amilóide, bem comoseu uso em métodos de diagnóstico ligados com AD, foram descritos. Porexemplo, a patente U.S. ns 4.666.829 descreve a produção de um anticorpomonoclonal gerado contra uma porção do peptídeo amilóide mais próximo àextremidade de amino. Concretamente, um peptídeo sintético foi preparadocompreendendo os primeiros dez resíduos do dito peptídeo (Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr), representados por SEQ. ID N9 1. O epitoporeconhecido por este método seria incluído nestes aminoácidos 1 a 10, en-quanto que o anticorpo reivindicado na presente invenção reconhece pelomenos um epitopo que compreende os aminoácidos oriundos de 12 a 16.Bem como diferenciação na seqüência específica que reconhece este anti-corpo monoclonal com relação àquele da presente invenção, o projeto datécnica de diagnóstico proposta é também diferente, uma vez que o que édeterminado é exclusivamente a ligação dos anticorpos usados para o que éconsiderado neste paciente como o peptídeo que é característico da doençade Alzheimer, que constituía por aminoácidos 1 a 28 do peptídeo amilóide,sem considerar ligação a outras formas do peptídeo de comprimentos dife- rentes e/ou variações nas extremidades de amino e de carboxila. Além domais, nenhuma prova experimental é dada que demonstra sua capacidadepara detecção de formas do peptídeo amilóide presente em fluidos biológi-cos.

Além do mais, pedido de patente PCT WO 90/12871 descreve a preparação do anticorpo monoclonal designado SV17-6E10. Este anticorpoé gerado por imunização com a seqüência de peptídeos Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Gln-Val-His-His-Gln-Lys-Leu, representa por SEQ.ID NO: 2, que pudesse ser considerada equivalente àquela de aminoácidos1 a 17 do peptídeo amilóide. Um outro anticorpo monoclonal dirigido contra a região que inclui aminoácidos Ia 17 é um anticorpo monoclonal 6E10 co-mercialmente acima mencionada que, como destacado na descrição da fo-lha de dados que corresponde ao produto,http://www.alexiscorp.eom/monoclonal:antibodies-Siq-9320/opfa.1.1.SIG-9320.386.4. l.html. especialmente dentro dos aminoácido 1 a 7 de peptídeoB-amilóide, reconhece o epitopo contido entre aminoácidos 3 a 8. Este epito-po corresponde a uma região diferente, mais próximo da extremidade deamino do que aquele do anticorpo monoclonal EM5 da invenção. Emboraseja capaz de produzir manchamento diferencial de placas neuríticas e de-pósitos vasculares, sem manchar as placas difusas, este anticorpo não pa- rece exibir diferenças em afinidade entre peptídeos AB42 e AB40.

Correspondentemente, o anticorpo monoclonal da invenção, quefoi designado EM5, constitui uma nova ferramenta, uma vez que ela reco-nhece pelo menos um epitopo que não é reconhecido por qualquer um dosanticorpos descritos no estado conhecido na técnica, na seqüência de peptí-deo B-amilóide. O anticorpo da invenção é, correspondentemente, útil para aaplicação no diagnóstico de doença de Alzheimer. Ele detecta placas neurí-ticas especificamente sem detectar placas difusas, que não são especifica-mente associadas à doença. Entre as placas neuríticas, o anticorpo mono-clonal da invenção torna possível detectar um subgrupo de placas neuríticasque diferem em sua composição molecular em relação aos depósitos depeptídeo p-amilóide. Além do mais, o anticorpo monoclonal da invenção écapaz de ligar a formas de peptídeo p-amilóide presentes em solução, per-mitir detecção subseqüente e quantificação dos ditos peptídeos, incluindo sea solução é um fluido biológico tal como urina.Sumário da Invenção

A invenção refere-se a um anticorpo monoclonal que reconhece,em peptídeo p-amilóide, o epitopo que corresponde à seqüência:

Val-His-His-GIn-Lys (SEQ. ID Ne 3)

e é capaz de se ligar a isoformas de peptídeo p-amilóide que contêm a ditaseqüência, independentemente de se o peptídeo está em forma solúvel,forma agregada ou desnaturada por SDS, embora exibição de afinidademaior para a isoforma Ap 42 do que para a isoforma Ap 40.

A invenção refere-se também a fragmentos do anticorpo acimamencionados que são capazes de se ligar a isoformas de peptídeo p-amilóide que contêm a dita SEQ. ID NO: 3.

A invenção também refere-se a uma linha de célula de hibridonacapaz de produzir o anticorpo monoclonal anteriormente descrito e a um mé-todo de produzir o dito anticorpo por obtenção de uma linha de célula de hi-bridoma e cultura da dita linha de célula em condições que permitem a pro-dução do anticorpo monoclonal.

Adicionalmente, a invenção refere-se a uma composição com-preendendo o anticorpo da invenção ou pelo menos um seu fragmento ca-paz de se ligar a SEQ. ID NO: 3. Uma concretização possível de uma com-posição da invenção é que o anticorpo ou fragmento do mesmo é acoplado auma substância que permite ele ser detectado, a dita substância sendo umsegundo anticorpo capaz de se ligar ao anticorpo da invenção ou ao frag-mento do mesmo e que é acoplado a uma substância que pode permitir queele seja detectado, tal como uma enzima capaz de catalisar da conversão deuma substância particular em uma outra que pode ser detectada, por exem-`pio, um cromógeno. Uma outra concretização possível de uma composiçãoda invenção é que o anticorpo ou um seu fragmento é acoplado a algumasubstância ou partícula que facilita extração de isoformas de peptídeo p-amilóide presentes em uma solução, tal como uma partícula magnética que permitirá separação da solução dos complexos de fragmento de antígeno-anticorpo ou antígeno-anticorpo formados se um campo magnético é aplica-do, assim sendo possível concentrar as isoformas de peptídeo p-amilóidepresentes na dita solução e facilitar sua detecção, indentificação e/ou quanti-ficação subseqüente.

A invenção também refere-se ao uso do anticorpo monoclonal

da invenção ou pelo menos a um fragmento do mesmo capaz de se ligar aSEQ. ID NO: 3 para a detecção de isoformas de peptídeo p-amilóide quecontêm SEQ. ID NO: 3. As isoformas de peptídeo p-amilóide a serem detec-tadas podem estar presentes em uma amostra de tecido de cérebro tirada

de um indivíduo, em uma solução tal como uma amostra de um fluido bioló-gico ou uma solução derivada a partir da mesma ou pode ainda estar contidaem alguma outro tipo não biológico de amostra, em que é similarmente de-sejado para detectar a presença possível de isoformas de peptídeo p-amilóide.

Finalmente, a invenção refere-se a um método de diagnóstico in

vitro de doença de Alzheimer com base na detecção de isoformas de peptí-deo p-amilóide por uso de anticorpo da invenção, ou de pelo menos umfragmento do mesmo capaz de se ligar a SEQ. ID NO: 3. Em uma concreti-zação preferida da invenção, as isoformas de peptídeo p-amilóide são detec-

tadas em uma amostra de tecido do cérebro tirada de um indivíduo. Nestecaso, as composições da invenção em que o anticorpo ou o fragmento domesmo é acoplado a um substrato que é capaz de permitir sua detecção, adita substância possivelmente sendo um segundo anticorpo capaz de se li-gar ao anticorpo da invenção a um seu fragmento do mesmo e é acoplado a

uma outra substância que é capaz de permitir sua detecção, pode ser parti-cularmente útil.

Em uma outra concretização preferida da técnica de diagnósticoda invenção, as isoformas de peptídeo p-amilóide são detectadas em umasolução, de preferência uma amostra de um fluido biológico tal como fluidocerebroespinhal, urina ou sangue, ou ainda uma solução derivada de umfluido biológico, tal como plasma. Nesta segunda concretização da invenção,é preferido usar composições da invenção em que o anticorpo ou o fragmen-to do mesmo é acoplado a alguma substância ou partícula que facilita a ex-tração de isoformas de peptídeo p-amilóide presente em solução, tal comouma partícula magnética que permitirá a separação dos complexos de frag-mento de antígeno-anticorpo ou antígeno-anticorpo formados a partir da so-lução, se um campo magnético é aplicado, assim sendo possível concentraras isoformas de peptídeo p-amilóide presente na solução e facilitar sua de-tecção, identificação e/ou quantificação subseqüente. Correspondentemente,o método de diagnóstico da invenção compreende os estágios de:

a) adição de uma composição que compreende o anticorpo dainvenção ou pelo menos um fragmento do mesmo capaz de se ligar a SEQ.ID NO: 3 acoplado a uma partícula magnética, à amostra de fluido biológicoou à solução derivada a partir da mesma:

b) esperar um tempo suficiente para complexos de fragmento deantígeno-anticorpo ou antígeno-anticorpo para formar entre pelo menos umaisoforma de peptídeo p-amilóide e o anticorpo ou fragmento de anticorpocontido na composição;

c) aplicação de um campo magnético para a extração dos com-plexos de fragmento de antígeno-anticorpo ou antígeno-anticorpo a partir dasolução;

d) remoção da solução;

e) separação do anticorpo ou fragmento de anticorpo das molé-culas de peptídeo p-amilóide;

f) identificação e quantificação das isoformas de peptídeo p-amilóide extraídas a partir da amostra de fluido biológico ou solução deriva-da da mesma.

A solução a partir da qual as isoformas de peptídeo p-amilóidesão extraídas é de preferência uma amostra de sangue ou urina, ou comoelas são mais simples de ser obter do que no caso de amostras de fluidocerebroespinhal, ou alternativamente uma amostra de plasma derivada deuma amostra de sangue. Entre sangue ou plasma e urina, é especialmentepreferido que a amostra do fluido biológico seja uma amostra de urina, quepode ser obtida sem o uso de métodos invasivos. No entanto, é então es-sencial usar um método muito sensível para a identificação e quantificaçãode isoformas de peptídeo p-amilóide, tal como espectrometria de massaMALDI-TOF.

Os anticorpos policlonais EM2 e EM3, que foram também de-senvolvidos pelos presentes inventores, podem também ser usados comouma ferramenta adicional no método de diagnóstico da invenção.Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra as curvas de ligação dos anticorpo EM5 (partede topo) e 6E10 (parte de fundo) a peptídeos AB imobilizados. Mostra osresultados que correspodem a concentrações diferentes (abscissa; em con-centração nM) dos anticorpos tanto para dar o peptídeo AB 40 (símbolos en-chidos) quanto para dar o peptídeo AB 42 (símbolos vazios), em ambos oscasos agregados (A) ou sem agregação ( ). Cada ponto representa o valormédio das experiências realizadas em triplicata. A densidade ótica (O.D) a450 nm é mostrada sobre a ordenada.

A figura 2 mostra o resultado de análise de imunotransferênciados anticorpos EM2, EM3 e EM5 em relação a peptídeos sintéticos Ap 1-40e Ap 1-42.

A figura 3 mostra no topo, um mapa de barra para a reatividadede EMS a série de peptídeos sintéticos por meio de ELISA, com os valoresde absorbância (O.D. a 450 nm) que correspodem a 20 |^g/ml de anticorpo.A parte de fundo mostra a localização do epitopo reconhecido por EM5 deacordo com os resultados obtidos neste ELISA.1-28R = APi-28 de roedor. Entre parênteses, várias mutações.

A figura 4 mostra a localização do epitopo do peptídeo de Apreconhecido pelo anticorpo monoclonal EM5 como determinado por espec-trometria de massa de peptídeo p-amilóide imunoprecipitado digerido comvárias enzimas proteolíticas dadas na tabela na descrição (peptídeos 1-5).Seqüência 6 corresponde a peptídeo p-amilóide sem digestão.

A figura 5 mostra fotografias de imunomanchamento de tecidode cérebro afetado por doença de Alzheimer, usando-se EM2, EM3, EM5 ecombinações de EM5 como cada uma das acima mencionadas. As estrutu-ras manchadas são marcadas como V (vasos), DP (placas difusas) e NP(placas neuríticas). As fotografias correspodem a:

- (A) e (B): seções em série consecutivas da mesma zona deimunmanchamento de córtex ocipital com EM5 (A) e EM 3 (B) como anticor-po primário, usando-se tetrazólio nitroazul (NBT) como cromógeno.

- (C): micrografia a alta ampliação da técnica de imunomancha-mento duplo usando-se EM3 (cromógeno: NBT) e EM5 (cromógeno: DAB)como anticorpos primários.

- (D) e (E): seções em série consecutivas da mesma zona deimunomanchamento de córtex ocipital ou com EMS (D) ou com EM2 (E).

- (F): microfotografia à alta ampliação da técnica de imunoman-chamento duplo usando-se EM2 (cromógeno: tetrazólio nitroazul, NBT) eEM5 (cromógeno; diaminobenzidina, DAB).

A figura 6 mostra gráficos obtidos em análise por espectrometriade massa MALDI-TOF de formas de peptídeo p-amilóide de comprimentodiferente. Em cada caso, a ordenada mostra a intensidade de percentagem(% de Int.) que corresponde a cada um dos picos de massa diferente (Mas.),deduzido da razão de massa/carga (m/z). O gráfico de topo, indicado com aletra A e marcado "Ctrl" no lado direito, foi obtido a partir de uma soluçãoque continha os peptídeos compreendendo aminoácidos 12 a 29 (Pep, Ap.12-29), 1 a 40 (Pep. Ap. 1-40) e 1-42 (Pep. Ap-42) de peptídeo p-amilóide. Ográfico de fundo, indicado com a letra B e marcado "EM5+PM" no lado direi-to foi obtido depois da concentração de peptídeos da solução contendo elespor uso do anticorpo EM5 ligado covalentemente a partículas magnéticas eseparação dos complexos formados pelo uso de um campo magnético. Odesenho no fundo direito representa a região de ligação do anticorpo a cadaum dos peptídeos sob consideração.A figura 7 mostra um gráfico obtido por análise por espectrome-tria de massa MALDI-TOF de uma amostra de urina oriunda de um indivíduosaudável ao qual quantidades adicionais dos peptídeos que compreendemaminoácidos 12 a 28 (pico marcado como Pep. 12-28), 1 a 40 (pico marcadocomo Pep. 1-40) e 1-42 (pico marcado Pep. 1-42) de peptídeo p-amilóidetinham sido adicionados, depois dos quais a amostra foi tratada com o anti-corpo EM5 ligado covalentemente a partículas magnéticas e os complexosque formados foram separados por aplicação de um campo magnético. Aordenada mostra a intensidade de percentagem (% de Int.) que correspondea cada um dos picos de massa diferente (Ms.), deduzido da razão de cargade massa (m/z). Os picos que correspondem a cada uma das formas depeptídeo p-amilóide adicionado à amostra de urina são indicados.Descrição Detalhada da Invenção

Como já mencionado, a invenção refere-se a um anticorpo mo-noclonal, EM5, que reconhece, no peptídeo p-amilóide, o epitopo que cor-responde à seqüência:

Val-His-His-GIn-Lys (SEQ ID NO:3)

Esta seqüência corresponde àquela de resíduos 12-16 de peptí-deo p-amilóide humano. Conseqüentemente, deve ser esperado que o anti-corpo acima auxiliado fosse capaz de se ligar a isoformas de peptídeo p-amilóide que continha a dita seqüência, sem reconhecer aquelas que careci-am dele, por exemplo, os peptídeos p3 assim chamados (AP17.42) e outrasformas com o aminoácido truncado (APi7-x). Na caracterização do anticorpomonoclonal que é descrito em detalhes nos exemplos dados abaixo é de-monstrado que EM5 se liga a qualquer peptídeo contendo resíduos 12 a 16da seqüência de AP humano, embora tenha modificações do lado de foradesta região, e não reconhece peptídeos que carecem da dita região. Se aregião for modificada, como é o caso com peptídeo Ap-28 (roedor), que temuma mudança de aminoácido na posição 13, bem como nas posições 5 e10, o peptídeo não é mais reconhecido por EM5.

Além do mais, estudos mostram que o anticorpo é capaz de seligar a isoformas do peptídeo Ap que contêm resíduos 12 a 16 independen-temente de se eles estão em forma solúvel, em forma agregada ou densatu-rada (em SDS). Em particular, os testes descritos nos exemplos que sãoapresentados abaixo mostram que o anticorpo da invenção é capaz de seligar tanto a isoformas de peptídeo p-amilóide que se agregaram, formaruma proporção das placas presentes em amostras de tecido cerebral, quan-to a isoformas de peptídeo p-amilóide estão em solução, incluindo quando asolução é uma amostra de fluido biológico tal como urina. Portanto, uma ou-tro aspecto da invenção refere-se a uma composição que contém o anticor-po da invenção, ou pelo menos um seu fragmento capaz de se ligar a SEQID NO:3, acoplado a uma substância que permite sua detecção e/ou suaconcentração, e a seu uso no diagnóstico ou doença de Alzheimer.

Quando o anticorpo da invenção ou um fragmento do mesmo éacoplado a uma substância que permite que ele seja detectado, detecção dapresença das isoformas de peptídeo p-amilóide que tinha se ligado ao anti-corpo ou um fragmento do mesmo e/ou a quantificação do mesmo será pos-sível por detecção e/ou quantificação do anticorpo ou fragmento do mesmoligado a isoformas de peptídeo p-amilóide que contêm a seqüência específi-ca reconhecido pelo anticorpo da invenção. Em uma concretização preferidada invenção a substância à qual o anticorpo, ou um fragmento do mesmocapaz de se ligar à SEQ ID N9 3 é acoplado, é um segundo anticorpo capazde se ligar ao anticorpo monoclonal da invenção, o segundo anticorpo es-tando ligado à enzima capaz de catalisar a conversão de uma substânciaparticular em uma outra que possui características que facilitam a detecçãode sua presença. Na maior parte da concretização preferida da invenção, osegundo anticorpo ligado a uma enzima é parte do sistema Envision, da Da-ko laboratories, a substância cuja conversão é catalisada pela enzima sendoum cromógeno e a enzima que catalisa a reação sendo ou fosfatase alcalina(naquele caso usando-se tetrazólio nitroazul como cromógeno) ou peroxida-se de rábano silvestre (naquele caso usando-se diaminobenzidina comocromógeno).

Uma outra possibilidade é que o anticorpo da invenção ou umfragmento do mesmo é ligado a uma substância ou partícula que facilitaconcentração das isoformas do peptídeo p-amilóide que se tornou ligado aodito anticorpo ou ao fragmento do mesmo. Esta concretização é preferidaquando a composição da invenção deve ser usada para a detecção e/ouquantificação de isoformas de peptídeo p-amilóide que estão presentes emsolução, especialmente em uma solução em que sua concentração é baixa,tal como sangue ou plasma, urina ou fluido cerebroespinhal. A substância oupartícula será tal como permite fácil separação do complexo de antígeno-anticorpo da dita solução, por exemplo, por imunoprecipitação. Um exemplopreferido das ditas partículas são partículas magnéticas que, quando aco-pladas ao anticorpo da invenção ou a um fragmento do mesmo capaz de seligar a isoformas de peptídeo p-amilóide que contêm a seqüência específicareconhecida pelo anticorpo da invenção, permitirá que as isoformas de pep-tídeo p-amilóide se ligarem ao anticorpo ou a um fragmento do mesmo a serextraído a partir da solução se um campo magnético adequado é aplicado.Subseqüentemente, as isoformas de peptídeo p-amilóide podem ser separa-das do anticorpo ou de seu fragmento e podem então ser detectadas, identi-ficadas e/ou quantificadas. Um método que é adequado é espectrometria demassa, especialmente que conhecido como MALDI- TOF (Matrix AssistedLaser Desorption lonization Time-of-flight).

Como já mencionado, o anticorpo da invenção ou um fragmentodo mesmo capaz de se ligar a isoformas de peptídeo p-amilóide que contêma seqüência específica reconhecida pelo anticorpo da invenção, bem comoas composições que contêm pelo menos uma delas, pode ser usada paradiagnóstico in vitro de doença de Alzheimer. Os métodos de diagnóstico invitro de doença de Alzheimer que fazem uso do anticorpo da invenção ou deum fragmento do mesmo capaz de se ligar a isoformas de peptídeo p-amilóide que contêm a seqüência específica reconhecida pelo anticorpo dainvenção, bem como aqueles que fazem uso de composições que incluem odito anticorpo do dito fragmento estão dentro do escopo da invenção. O ditodiagnóstico pode ser realizado no tecido cerebral, em que a presença dedepósitos em que isoformas do peptídeo p-amilóide que contêm a seqüênciareconhecida pelo anticorpo monoclonal da invenção predominante (placasneuríticas e depósitos vasculares, depósitos que são característicos do de-senvolvimento de doença de Alzheimer) é seletivamente revelada, detecçãoda existência de ligação, ao dito depósito de anticorpo monoclonal da inven-ção ou de um fragmento do mesmo capaz de se ligar à seqüência específicareconhecida pelo dito anticorpo, em contraste com o que ocorrerá com osdepósitos em que as isoformas predominantes são aquelas que carecem daseqüência reconhecida pelo anticorpo monoclonal da invenção (placas difu-sas), as isoformas Ap17-x, que não exibirão ligação do anticorpo monoclonalou de fragmentos dos mesmos. Ligação do anticorpo a placas neuríticas edepósitos vasculares é revelada por meio de uma composição tal como umdaqueles que compreendem, além do anticorpo da invenção ou um fragmen-to do mesmo, um segundo anticorpo capaz de se ligar ao anticorpo mono-clonal da invenção, o segundo anticorpo estando ligado a uma enzima capazde catalisar a conversão de uma substância definida em uma outra que pos-sui - características que facilitam a detecção de sua presença, tal como umcromógeno. Na maior parte da concretização preferida da técnica de diag-nóstico da invenção no tecido cerebral, o método de diagnóstico é suple-mentado com o uso adicional dos anticorpos policlonais EM2 e EM3, quereconhecem ou ABX-42 (EM3) ou ABX.40 (EM2), ambos os anticorpos tambémtinham sido desenvolvidos anteriormente pelo grupo de autores da invenção[24].

Uma outra concretização do método de diagnóstico da invençãoé realizado em um fluido biológico que é conhecido como contendo isofor-mas de peptídeo B-amilóide, tal como fluido cerebroespinhal, urina ou san-gue ou, neste último caso mencionado, plasma derivado do mesmo. Umavez que um furo é exigido para se ober fluido cerebroespinhal; é preferívelusar plasma de urina, e especialmente o último, que pode ser obtido sem ouso de técnicas invasivas. É então preferido que o método de diagnóstico dainvenção empregaria composições que compreendem o anticorpo da inven-ção ou um fragmento do mesmo ligado a alguma substância ou partícula quefacilita a concentração das isoformas de peptídeo B-amilóide que se ligam aodito anticorpo ou a um fragmento do mesmo. Como já mencionado, as parti-cuias que facilitam a concentração das isoformas de peptídeo p-amilóide sãode preferência partículas magnéticas acopladas ao anticorpo ou a um frag-mento do mesmo, de modo que quando a solução que contém os complexosformados com as isoformas de peptídeo p-amilóide é submetida à ação deum campo magnético, o último pode ser extraído a partir da solução que po-de facilmente ser descartado usando-se um método tal como aspiração. Nocaso quando um anticorpo completo é usado, é especialmente preferívelpara o acoplamento do anticorpo à partícula magnética a ser efetuada poruma ligação covalente, para aumentar sua estabilidade, mas estabelecimen-to da dita ligação covalente de tal modo que para evitar, tanto quanto possí-vel, o sítio de ligação de antígeno, de modo a não diminuir a capacidade deligação do anticorpo, portanto métodos são preferidos em que ligação ocorrede preferência na zona rica em histidina do fragmento de Fc do anticorpo ounas cadeias de glicosídeo da dita zona. Nesta ligação, o método de ligaçãodos anticorpos a partículas magnéticas descritas por Fuentes e outros [26] éparticularmente preferido.

Uma vez que complexos de ligação das isoformas de peptídeo(3-amilóide foram separadas da solução, separação das ditas isoformas dosanticorpos ou dos fragmentos dos mesmos é preferível antes da detecçãoe/ou quantificação das isoformas de peptídeo p-amilóide extraídas, a partirdas quais acetonitrila e ácido trifluoroacético podem ser usados. Uma vezque concentração de isoformas de peptídeo p-amilóide em urina é usual-mente totalmente baixa, detecção e/ou quantificação são de preferência rea-lizados usando-se um método muito sensível tal como espectrometria demassa MALDI- TOF.

Um outro aspecto da invenção é uma linha de célula de hibrido-ma capaz de produzir o anticorpo monoclonal da invenção. Em uma concre-tização preferida da invenção, a dita linha de célula é obtida por fusão, coma linha de mieloma de camundongo P3/X63-Ag.653, de células de baço ori-undas de camundongos BALB/c imunizadas com peptídeo p^o acoplados aKLH (hemocianina do molusco "keyhole limpet").

Finalmente, ainda um outro aspecto da invenção é um métodode produção e purificação do anticorpo monoclonal da invenção que partedas células de hibridoma. Na concretização preferida da invenção o métodocompreende a produção de uma linha de célula de hibridoma como descritaanteriormente ou desenvolvendo-o como fluido ascítico em camundongosBALB/c tratados anteriormente com Pristane. O anticorpo monoclonal é puri-ficado deste fluido ascítico por cromatografia por afinidade em uma colunade Protein A-Sepharose (Pharmacia). Em uma concretização particularmen-te preferida da invenção, as células de hibridoma empregadas são da linhadesignada "clone A EM5", cuja deposição foi solicitada em 1 de março 2006na European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Porton Down, Sa-lisbury, Wiltshire, United Kingdom, e foi dado o número de acesso 06030101.

A invenção e suas concretizações preferidas são agora descritasem mais detalhes usando-se os seguintes exemplos.Exemplos

Exemplo 1.- Produção de anticorpos

Os anticorpos policlonais EM2 e EM5 usados neste estudo fo-ram produzidos do modo relatado anteriormente [24].

As seguintes etapas foram realizadas para a produção do anti-corpo monoclonal EM5:Produção de hibridomas

A camundongos BALB/c foram injetados subcutaneamente com40 |ig de peptídeo Ap-|.4o acoplados a KLH (hemocianina do molusco "keyho-le limpet") e dissolvidos em solução salina tamponada por fosfato (PBS) eemulsificadas com um volume igual de adjuvante completo de Freund. Oscamundongos receberam três injeções repetidas a cada outra semana, noadjuvante incompleto de Freund. Três dias depois da fusão, os camundon-gos receberam uma injeção intraperitoneal de 25 |ig de Api-4o-KLH em PBS.No dia de fusão, células do baço oriundas de animais imunizados com a li-nha de mieloma de camundongo P3/X63-Ag.653 foram fundidas usando-sepolietileno glicol 1400 (Sigma), após os procedimentos estabelecidos [25].As células fundidas foram distribuídas em placas de 96 cavidades estéreis auma densidade de 105 células por cavidade e foram selecionadas em meiocontendo hipoxantina, timidina e aminopterina. Os hibridomas de produçãode anticorpo foram identificados ELISA, descrito mais tarde.Triagem de hibridomas

Placas de microtítulo de poliestireno (Maxisorb, Nunc) foram co-bertas de um dia para outro a 4°C com ApY4o a 5 ng/ml em tampão de car-bonato a 50 mM, pH 9,6 (tampão de cobertura). As placas foram lavadascom Tween 20 a 0,05% em PBS (PBS-T) e os sítios de ligação não específi-cos foram bloqueados com albumina de soro bovino (BSA) a 2% em PBS-T(solução de bloqueamento) por 1 hora 37°C. Depois da lavagem, as placasforam incubadas por 1 hora com sobrenadante de cultura de tecido diluídoduas vezes na solução de bloqueamento. As placas foram lavadas nova-mente e foram incubadas com IgG de anticamundongo de cabra conjugadacom peroxidase de rábano silvestre (Sigma) por 1 hora a 37°C. Depois dalavagem, o substrato (0,05% de o-fenilenodiamina e 0,015% de peróxido dehidrogênio em tampão de citrato 100 mM, pH 5,0) foi adicionado à solução.A reação foi parada 10 minutos mais tarde com 2,5 M de ácido sulfúrico e aabsorbância a 492 nm foi determinada em uma leitora de microplaca. O hi-bridoma, cujos sobrenadantes produziram um valor de absorbância de pelomenos duas vezes que obtido com o sobrenadante oriundo de hibridomasnão relacionados (anticorpos de antigliadina) foram selecionados. Os hibri-domas que produziram anticorpos específicos foram clonados repetidamenteusando-se diluição limitante, e os isótipos dos anticorpos monoclonais foramdeterminados em sobrenadante de cultura de célula concentrado por imuno-precipitação de gel usando-se um anti-soro específico (Sigma). Os hibrido-mas selecionados foram desenvolvidos como fluido ascítico em camundon-gos BALB/c anteriormente tratados com Pristane.Purificação de anticorpos monoclonais

O anticorpo monoclonal EM5 foi purificado a partir do fluido ascí-tico por cromatografia por afinidade em uma coluna de Protein A-Sepharose(Pharmacia). Os anticorpos purificados foram dialisados profusamente emPBS e foram armazenados a -85°C até que eles fossem usados.

Exemplo 2.- Cálculo da constante de dissociação aparente: afi-22

nidade para peptídeos Api.4o e Afr.42

ELISA foi usada para a investigação da afinidade de anticorposmonoclonais 6E10 e EMS usando-se peptídeos AB^o e AB1.42 imobilizados,recentemente dissolvidos, que tinham sido sintetizados na instalação WMKeck da Vale University usando-se a metodologia de N-t- butiloxicarbonila.

Placas de microtítulo de poliestireno (Immulon 2, Dynex Techno-logy Inc. Chantilly, VA) foram cobertas por 16 horas a 4°C com 0,5 ng depeptídeo AB1.40 ou AB1.42 recentemente dissolvido ou agregado em tampãode carbonato/bicarbonato pH 9,6. Depois do bloqueamento com Superblock(Pierce Chemical Co,), concentrações crescentes de EM5 purificado (0-0,5nM em TBS-T, 100 microlitros por cavidade) foram adicionadas às cavidadescobertas com Ap, incubação por 3 horas a 37°C. O EM5 ligado foi detectadocom o fragmento de F(ab')2 de IgG de anticamundongo de cabra conjugadocom peróxidase de rábano silvestre (1:3000, Amersham). A reação foi de-senvolvida por 15 minutos com 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (BioRad.Hercules. CA.), foi parada com ácido sulfúrico a 2 M e foi quantificada emuma leitora de microplaca (Cambridge Technology, Watertown, MA) a 450nm. A afinidade do anticorpo 6E10 comercialmente disponível (Senetek,PLC) foi investigada após o procolo similar usando-se preparações de anti-corpos de IgG purificados. Análise de regressão não linear, estimação deconstantes de dissociação aparente e comparação de dados de ligação deproteína para encontrar a significância estatística por cálculo das razões deF foram avaliadas usando-se software Prism da GraphPad (GraphPad, SanDiego, CA) .

A figura 1 mostra curvas de saturação que correspondem à liga-ção, em ELISA, de anticorpos monoclonais EMS e 6E10 a peptídeos Ap a-gregados e recentemente dissolvidos. Alta afinidade foi observada em todosos casos, com constantes de dissociação aparente na faixa picomolar. Ne-nhum destes anticorpos exibiam afinidade diferencial exibida para formasagregadas ou recentemente preparadas de Ap. De modo interessante, en-quanto que 6E10 exibia afinidade equivalente para Ap^o e Ap^, EM5 exi-bia afinidade maior para Ap 42 do que para Ap 40 (p<0,01) (13,7 pM e 15,5pM para Ap 42 agregados e recentemente preparados, respectivamente; e37,5 pM e 37,0 pM para Ap 40 agregado e recentemente preparado, respec-tivamente).

Exemplo 3.- Análise de Imunotransferência

O reconhecimento específico de A^.4o e APi.42 por EM5 foi in-vestigado ou foi comparado com anticorpos policlonais EM2 e EM3 por meiode análise de imunotransferência. Para isto, peptídeo Ap (0,5 ng/raia) foramsubmetidos a eletroforese de PAGE em 16% de acrilamida, tris-tricina-SDS.Os peptídeos foram transferidos eletroforeticamente por 1 hora a 400 mA e4°C para membranas de poli(fluoreto de vinilideno) (Immobilon-P, Millipore)usando-se ácido 3-cicloexilamino-l-propanossulfônico, pH 11, contendo 10%de metanol. As membranas foram então bloqueadas por 16 h a 4°C com 5%de leite em pó desnatado contendo TBS-T e foram então incubados por 1hora à temperatura ambiente com 2 u.g/ml de IgGs EM2, EM3 ou EM5. UmaIgG de cabra anticoelho (EM2 e EM3) ou IgG de cabra anti-camundongo(EM5) acoplada a peroxidase de rábano silvestre (Amersham) e diluída de1:2000 foi usada como o segundo anticorpo. Imunotransferência foi visuali-zada por meio de quimioluminescência (Amersham) após as especificaçõesdo fabricante.

Os resultados são mostrados na Figura 2, onde pode ser vistoque, nas experiências de imunotransferência, EM5 exibia imunorreatividade),tanto para peptídeos Ap^o quanto A$i.42 (comprovando os resultados obti-dos por ELISA), enquanto que anticorpos EM2 e EM3 foram apenas capazesde reconhecer peptídeos APmo ou Ap^, respectivamente, como descritosanteriormente [24]. Estes resultados suportam a noção que o anticorpo mo-noclonal EM5 se liga a um epitopo linear específico comum a ambos os pep-tídeos, que é conservado nas amostras tratadas com SDS. Os resultadosglobais mostram que EM5 é capaz de reconhecer peptídeos Ap na formasolúvel, na forma agregada, e na forma desntaurada (em SDS), com ligaçãolevemente preferencial a Ap 42, provavelmente como um resultado do au-mento da hidrofobicidade do peptídeo.Exemplo 4.- Localização do epitópoPara localização precisa do epitópo exato reconhecido pelo anti-corpo EM5, ligação do anticorpo a uma série de peptídeos Ap sintéticos foianalisada. Peptídeos APt-ie, h$:-2e e Ap25-35 foram obtidos a partir de Sigma(San Luís, MO); peptídeos Aft-42, Api^(E22Q)f Ap^o (E22G), Ap^0(E22Q),Api-28 (roedor), Api-28 (E22Q), Api7-4o, Api6-42 e Ap25-35 foram sintetizados nainstalação de WM Keck de Yale University usando-se a metodologia de N-t-butiloxicarbonila; Ap2i-28, Ap21.28(E22Q), Ap37-4i e Ap37-4o foram sintetizadosna Unidade de Síntese de Peptídeo (National Biotechnology Center, Madrid)usando-se metodologia de Fmoc comum. O projeto de peptídeos AP37.42 eAp37-49 incluia uma cauda na extremidade amino com um resíduo de cisteínapara o acoplamento que tinha a seqüência CSGGSGGG (SEQ ID NO: 4).Todos os peptídeos foram purificados por cromatografia de alto desempenhoem modo de fase invertida e sua pureza foi avaliada por espectrometria demassa MALDI-TOF.

a) ELISA de captura de anticorpo

Para realizar o teste, placas de microtítulos de poliestireno defundo chato (Immulon 2. Dynex Technology Inc., Chantilly. VA).foram cober-tas por 16 horas a 4°C com 1 u.g/cavidade do peptídeo Ap correspondenteem tampão de carbonato-bicarbonato a 0,1 M, pH 9,6. Depois do bloquea-mento com NaCI 150 mM, Tris 20 mM, Tween-20 a 0,05%, pH 7,4 (TBST)contendo 2% de BSA, diluições em série do anticorpo EM5 (de 20 a 0,02mg/ml da fração de IgG) foram incubadas por 1 hora a 37°C. IgG de antica-mundongo acoplada à peroxidase (Sigma, San Luis, MO) e diluída de 1:2000foi então aplicada por 30 minutos a 37°C. A reação foi desenvolvida comTMB (BioRad. CA), foi parada com ácido sulfúrico a 2 M e foi quantificada a450 nm. Ligação não específica foi determinada, omitindo os primeiros anti-corpos.

Os resultados são apresentados na figura 3, cuja parte de topomostra um mapa de barra que corresponde aos valores de absorbância obti-dos que correspondem a incubação de 20 jig/ml do anticorpo com cada umdos peptídeos. EM5 foi mostrada para se ligar a qualquer peptídeo que con-tinha resíduos 12 a 16 da seqüência de Ap humano e era incapaz de reco-nhecer peptídeos que carecem desta região. Além do mais, variantes de mu-tante com modificações do lado de fora desta região (Api.42 (E22Q), Api.40(A21G), APi-4o(E22G), ApY40 (E22Q) exibiam ligação similar quando compa-radas com o peptídeo de tipo selvagem, enquanto que o peptídeo Api-28(ro-edor), que mostra três mudanças de aminoácidos nas posições 5, 10 e 13,foi reconhecido por EM5.

b) Análise de espectrometria de massa de peptídeo p-amilóideimunoprecipitado e digerido

Para confirmar os resultados, um estudo adicional foi conduzidoem que um conjunto de peptídeos derivados de AP1-42, gerados por digestãocom tripsina ou cc-quimiotripsina, foi posta em contato com partículas magné-ticas revestidas com anticorpo EM5, realização das seguintes etapas:

Para digestão do peptídeo, 0,5 jllI de tripsina ou oc-quimiotripsinacontendo 0,025 \ig da enzima foi adicionado a uma alíquota de 10 |il de pep-tídeo p-amilóide em bicarbonato de amônio a 50 mM contendo 1 \ig de pep-tídeo. Incubação foi realizada por 2 horas a 37°C. As digestões realizadassão mostradas esquematicamente na tabela I.

Para imobilização de anticorpo monoclonal EM5 nas partículasmagnéticas, uma alíquota de 5 uJ (1,1 mg/ml) de EM5 foi incubada com 50 jilde Dynabeads M450 revestida com IgG de cabra anticamundongo à tempe-ratura ambiente por 2 horas. O complexo foi lavado 4 vezes com PBS comagitação bidirecional (em um rotor).

Para realizar imunoprecipitação, uma alíquota 10 |xl de peptídeoP-amilóide digerida com tripsina (ou a-quimiotripsina) com 50 pi de SEM i-mobilizado sobre partículas magnéticas foi incubada em rotor por 1 hora a37°C foi incubada em rotor por 1 hora a 37°C. O complexo imunoprecipitadomagnético foi lavado quatro vezes com PBS no mesmo rotor e os sobrena-dantes foram aspirados e foram descartados.

Para análise de espectrometria de massa de peptídeo p-amilóideimunoprecipitado digerido, os peptídeos imunoprecipitados contidos noscomplexos magnéticos foram liberados com 20 fxl de acetonitrila a50%/ácido trifluoroacético a 0,3%. 5 uJ desta solução foram misturados comu.1 de ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico saturado em 0,1% de ácido trifluoro-acético/acetonitrila (2:1). Um volume de 0,5 jil desta solução foi então colo-cado em uma sonda de aço inoxidável precisa e foi deixada seca à tempera-tura ambiente. As amostras foram medidas em um espectrômetro MALDI-TOF Reflex II da Bruker equipado com uma fonte de íon com ótica de visua-lização e um laser de N2 (337 nm). Os espectros de massa foram registradosem modo linear positivo a uma voltagem de aceleração de 28,5 kV e 1,5 kVno detector linear, acumulando de 200 espectros de tiro único de laser abai-xo do limiar de irradiação. Apenas sinais de massa com boa resolução, dealta intensidade, emitidos de 3-5 pontos selecionados de incidência, foramlevados em consideração. Todos os espectros de MALDI foram calibradosexternamente usando-se uma mistura padronizada de peptídeos [angioten-sina II (1047.2), 18-39 fragmentos de hormônio adrenocorticotrópico 2466.7)e insulina (5734.6); Sigma].

As características de peptídeos analisadas, bem como os dadosobtidos, são sumarizadas na seguinte tabela I:

Tabela I.- Dados de espectrometria de massa MALD-TOF para fragmentosobtidos por digestão de peptídeo B-amilóide

<table>table see original document page 27</column></row><table>

As seqüências de cada um destes peptídeos (1-5) e do peptídeo

sem digestão (6) são mostradas na figura 4, em que a zona que parece cor-responde ao epitopo reconhecido pelo anticorpo EM5 de acordo com os re-sultados de espectroscopia de massa MALDI-TOF do material imunoprecipi-tado é protegido.

Como pode ser visto na dita figura 4, análise do material imuno-precipitado por espectroscopia de massa MALDI-TOF mostra que EM5 foieapaz de extrair a partir da mistura digestiva, cada fragmento de peptídeoque continha resíduos 11-16 (regiões sombreadas). Fragmentos de peptídeoexterno desta região não foram recuperados da solução. Estes resultadosconfirmam os dados obtidos por ELISA e análise de imunotransferência.

Em conclusão, a reatividade diferencial do anticorpo a uma sériede peptídeos Ap indica que EM5 reconhece os resíduos 11-16 de peptídeoAp. Entre eles, precipitação de resíduos 12-16 é fundamental, como é de-monstrado pelo fato de que a mutação de resíduo 12 no peptídeo Api.2e deroedor (1-28 R) inibe seu reconhecimento pelo anticorpo; por sua parte, oenvolvimento de resíduo (11) (E) na conformação do epitopo não pode serexcluído, embora os dados obtidos não totalmente o confirmem.Exemplo 5 - Imunoistoquímica: reatividade de tecido dos anticorpos

Para demonstrar a validade do anticorpo EM5 para revaliação dedepósitos que são característicos de doença de Alzheimer (placas neuríticasou depósitos vasculares) em oposição a placas difusas, imunomanchamentode seções de tecido cerebral afetadas pela doença de Alzheimer foi realiza-do usando-se os anticorpos EM2 (um anticorpo policlonal dirigido para a ex-tremidade de carboxila do peptídeo Ap 40), EM3 (um anticorpo monoclonalcom especificidade demonstrada para resíduos 12-16 do peptídeo Ap). Tan-to EM2 quanto EM3 foram usados em um estudo anterior [24].

Processamento de tecido cerebral e áreas selecionadas paraimunoistoquímica

O tecido cerebral foi fornecido pelo Tissue Bank for NeurologicalInvestigations, Madri. Seis indivíduos, 3 homens e 3 mulheres, com AD bemdefinida foram incluídos no estudo. Suas idades variavam de 68 a 75 anos.Em todos os casos o diagnóstico de AD foi com base nas diretrizes clínico-patológicas (Consortium to Establish a Registry for Alzheimer'd Disease)[10]. Nenhum dos pacientes tinham outras descobertas neuropatológicasrelevantes, por exemplo, doença de Parkinson ou mudanças vasculares sig-nificativas. Todos os cérebros foram processados para exame histológicoapós os protocolos para corte, fixação, e implantação no Brain Bank. Os pe-ríodos pós-morte variou de 10 e 18 horas. Imediatamente depois da autópsiauma metade do cérebro (obtido por seção sagital média dos hemisférioscrebrais, cerebelo e tronco cerebral) foi fixada em formaldeído tamponadocom 4% de fosfato. Depois da fixação por 3-4 semanas, blocos de tecidoforam obtidos a partir de todas as áreas corticais e subcorticais com envol-vimento significativo em AD, e foram implantados em parafina depois da de-sidratação gradual em etanol, e clarificação de tecido com xileno. Em todosos casos, 5 um de seções de tecido, que correspondem ao córtex lateraltemporal, córtex lateral parieto-ocipital (estas ultimas áreas são recomenda-das pelas diretrizes CERAD) [10], hipocampo, caudado - putâmen (na cabe-ça do núcleo caudado), e córtex do hemisfério cerebelar, foram obtidos apartir dos blocos de parafina original para exame imunoistoquímico. Comocontrole de manchamento amilóide não específico. Manchamento de prata -metanamina modificado foi realizado em seções consecutivas àquelas pro-cessadas para imunoistoquímica amilóide.Anticorpos e protocolos de imunomanchamento

Os anticorpos primários empregados eram EM2, EM3 e EM5.Tanto EM2 quanto EM3 foram usados em um estudo anterior [24]. As se-ções foram incubadas com anticorpos primários à temperatura ambiente por30 minutos. Os anticorpos policlonais foram detectados com o sistema Envi-sion (Dako Laboratories) com fosfatase alcalina (Aph) usando-se tetrazólionitroazul (NBT) como cromógeno, EM5 foi detectado ou com o sistema aci-ma mencionado ou com o sistema Envision (Dako Laboratories) com peroxi-dase de rábano silvestre (HRP) usando-se diaminobenzidina (DAB) comocromógeno. No caso de técnicas de co-localização, os anticorpos policlonaisforam já detectados com o sistema de Envision com Aph (usando-se NBTcomo cromógeno), enquanto que EM5 foi detectado com o sistema de Envi-sion com HRP (usando-se DAB como cromógeno).Imunomanchamento único ou duplo

Técnicas de imunomanchamento duplo foram empregadas u-sando-se EM5 como primeiro anticorpo primário e EM2 ou EM3 como se-gundo anticorpo primário, como uma operação prelimar para a finalidade deestabelecimento do grau de co-localização de cada par de anticorpos, jun-lamente com a ótima diluição de trabalho de cada um deles. Durante estafase do estudo, que foi restrita a seções de tecido do córtex parieto-ocipitalde dois dos casos, foi etabelecido que o uso de EM5 como primeiro anticor-po primário ecluiu um efeito de mascaramento dos outros dois anticorpos,quanto eles eram empregados como primeiro anticorpo durante a técnica deimunomanchamento duplo. Em seções em série oriundas de ambos os blo-cos de parfina selecionados, diluições crescentes (1:50, 1:100, 1:500, 1:1000e 1:2000) de EM5 foram colocalizados com diluições decrescentes (1:2000,1:1000, 1:500, 1:100 e 1:50) de EM2 ou de EM3. Uma vez que verificou-seque o anticorpo EM2 foi co-localizado em um alto grau com EM5, o resto doestudo visou demonstrar o padrão diferencial de reatividade exibida por EM5e EM3. Para esta finalidade, imunomanchamento dublo subseqüente emseções de todas as áreas selecionadas foi limitado em todos os casos aouso de EM5 (a diluição de 1:1000) como primeiro anticorpo primário e EM3(A diluição de 1:1000) como um segundo anticorpo primário. Além disso,para visualização mais exata do padrão de reatividade exibida por cada anti-corpo no mesmo tecido, imumanchamento único foi realizado em seções emsérie de cada bloco usando-se EM5, EM2 ou EM3 como anticorpo primário.Como a finalidade principal desta parte do estudo é comparar qualitativa-mente padrões diferentes de imunorreatividade, ao invés de diferençasquantitativas entre anticorpos, os resultados nos manchamento não foramquantificados.Resultados

Os resultados de um dos casos pode ser visto na figura 5, apre-sentado com distribuição mencionada anteriormente, isto é:

(A) e (B): Seções em sérieS consecutivas da mesma zona deimunmanchamento de córtex ocipital com EM5 (A) e EM 3 (B) como anticor-po primário, usando-se NBT como cromógeno. Os recipientes (V) são mar-cados para facilitar localização das placas. Enquanto que EM3 (B) revelatanto placas difusas (DP) quanto placas neuríticas (NP), bem como depósi-tos nos vasos sangüíneos (V), EM5 (A) dá manchamento mais intenso tantode vasos sangüíneos quanto de placas neuríticas, embora não difundemplacas.

(C) : micrografia à alta ampliação da técnica de imunomancha-mento duplo usando-se EM3 (usando-se NBT- cor azul - como cromógeno) eEM5 (usando-se DAB - cor marrom - como cromógeno) como anticorposprimários. Imunomanchamento duplo das placas neuríticas e da parede dosvasos é observada.

(D) e (E): seções em série consecutivas da mesma zona de i-munmanchamento de córtex ocipital ou com EMS (D) ou com EM2 (E). Umavez que, os vasos (V) foram marcados para auxiliar na identificação das pla-cas. Pode ser visto que tanto os vasos quanto as placas neuríticas reagemcom ambos os anticorpos. Placas neuríticas mais raras são manchadas comEM2 do que com EM5, e nenhuma placa difusa reage com qualquer um de-les

(F): Microfotografia à alta ampliação da técnica de imunoman-chamento duplo (usando-se NBT - cor azul como cromógeno) e EM5 (usan-do-se DAB - cor marrom - como cromógeno) como anticorpos primários namesma seção de tecido oriundo de córtex cerebral. Co-localização precisada reatividade de tanto anticorpos na parede de vaso quanto as placas neu-ríticas é observada.

Todos os casos exceto um mostram depósitos amilóides vascu-lares intracorticais e leptomeningeais pronunciados que reagidos com todosos anticorpos testados. Em todos os casos positivo a imunorreatividade dosdepósitos amilóides vasculares era mais pronunciada (mais extensiva e maisintensa) tanto com EM2 (figura (5E) quanto com EM5 (figura (5A) e (5D)) doque com EM3 (figura (5B)). EM2 e EM5 são co-localizados primorosamenteneste nível (figura (5F)). Como esperado, as áreas neocorticais e o hipicam-po mostraram uma alta densidade de placas neuríticas e difusas, enquantoque o córtex do cerebelo e o corpo esfriado apenas exibia depósitos amilói-des difusos. As seções incubadas com o anticorpo EM3 exibiam reatividadecom placas difusas e neuríticas (figura (5B)). Quando elas foram compara-das com seções sucessivas manchadas com o método de prata-metanaminamodificado, foi mostrado que EM3 manchou todas as placas presentes emcada seção. Adicionalmente, o anticorpo de EM3 manchou alguns corposneuronais. Tanto EM2 quanto EM5 mancharam placas neuríticas imaturas(sem núcleo) e placas neuríticas maduras (com núcleo), novamente com umalto grau de colocalização (figura (5F)). EM2 não reagiu com quaisquer pla-cas difusas, nem na região cortical nem a região subçortical (figura (3E)).Imunomanchamento duplo com EM5 e EM3 revela a co-localização de am-bos os anticorpos em algumas placas neuríticas, mas não em placas difusas(figura (5C)), embora algumas co-localizações tenham sido encontradas nes-te nível quanto EM5 foi incubado a uma diluição muito baixa (1:50). Apenasem um caso, que exibia placas difusas positivas a EM3 abundantes em se-ções do corpo esfriado, algumas delas foram manchadas muito levementecom EM5 na diluição de trabalho (1:500). Este mesmo caso não mostrouqualquer reatividade das placas difusas como EM5 no córtex do cerebelo.Em todos ós outros casos as seções do corpo estriado e o cerebelo mostra-ram uma quantidade variável de placas difusas, nenhuma delas reativas aoanticorpo EM5. Nem EM2 nem EM5 pareceu manchar todas as placas neurí-ticas presentes (vide figura (5A, D)). No entanto, como tinha sido observadono caso da imunorreatividade dos depósitos amilóides vasculares, as placasneuríticas reativas a EM2 ou EM5 foram manchadas mais intensamente doque com EM3. Além de negatividade dos vasos a todos os anticorpos em umcaso único e a positividade leve de algumas placas difusas do corpo estriadoneste mesmo cérebro, pode ser considerado que todos os casos mostrampadrões similares para cada anticorpo testado.

Assim, em contraste com o padrão mais uniforme de mancha-mento observado nas placas difusas, o painel de anticorpos detectou hete-rogeneidade entre as placas neuríticas, que prova relevância para a indica-ção de estágios reais no processo de desenvolvimento das placas difusas esua transformação para placas neuríticas. O anticorpo EM5 deu mancha-mento intenso de todas as estruturas (placas neuríticas e paredes de vaso)manchadas por EM2 e manchadas para um grau variável por EM3. Um sub-conjunto de placas neuríticas demonstrou ter um manchamento idêntico aoamilóide vascular, com alta colocalização de reatividade a EM2 e EM5. Ainvenção mostra que EM5 deve reagir com todas as estruturas que contêmou AB<i1.4o ou AB<11.42. De fato, os resultados de ELISA aqui apresentadosmostram que o anticorpo EM5 reconhece ambas as formas do peptídeo Ap,recentemente dissolvidas e agregadas. Entretanto, em seções de tecido éencontrada notável variabilidade de manchas entre as placas neuríticas comEM5 quando comparadas com anticorpos policlonais, juntos com alta co-localização de reatividade intensa do EM5 com EM2 (Ap C4o). Manchas rela-tivamente mais intensas nessas placas positivas podem revelar um subgru-po de placas neuríticas com conteúdo particularmente alto de AB C40.' oumesmo acessibilidade especial do epítopo reconhecido por EM5 em estrutu-ras (veias ou plaquetas) que indica co-deposição de AB<11.40 e AB<11.42. Oanticorpo da invenção parece detectar o mesmo subconjunto de placas neu-ríticas Ap C40 (+) detectado anteriormente por Parvathy e outros [22]. Estesubconjunto de placas neuríticas com conteúdo particularmente alto de pep-tídeos Ap longos podem representar marco miliário importante na progres-são das lesões amilóides em AD que o anticorpo monoclonal da invenção écapaz de detectar. Portanto, o uso de EM5 pode permitir subconjuntos deplacas a serem definidas que constituem um marcador específico do estágiode progressão da doença.

Exemplo 6 - Capacidade dos anticorpos para reagir com formas de peptídeop-amilóide em urina

Para demonstrar a validade do anticorpo EM5 para detecção dapresença de formas de peptídeo p-amilóide em fluidos biológicos, um testefoi realizado para a detectá-los em amostras de urina oriundas de pacientessaudáveis, aos quais uma mistura de peptídeos sintéticos que correspondi-am a formas de comprimento diferentes de peptídeo p-amilóide tinham sidoadicionados depois que eles foram obtidos. Para isso, o anticorpo monoclo-nal, ligado a partículas magnéticas, foi adicionado às amostras de urina, e ospeptídeos ligados foram detectados usando-se espectrometria de massaMALDI-TOF. Os detalhes do método empregado são apresentados abaixo.Ligação do anticorpo a partículas magnéticas

As partículas magnéticas acopladas ao anticorpo EM5 forampreparadas após o método descrito por Fuentes e outros [26], com base emoxidação gentil dos resíduos de glicosídeo das imunoglobulinas para gerargrupos aldeído, que são reagidos com partículas magnéticas, sobre a super-fície da qual grupos amino foram gerados por modificação com etilenodiami-na. Resumidamente, oxidação do anticorpo EM5 foi induzido por incubaçãocom periodato de sódio 10 mM por 2 hs, depois do qual o anticorpo oxidadofoi dialisado em água destilada a 4°C. EM/100-30 partículas magnéticas(Merck Co. França), que têm grupos carboxila sobre sua superfície, forammodificados por incubação, a uma concentração de 10 mg/ml, com etileno-diamina a 1 M pH 4,75, por 90 minutos, depois do qual EDCI sólido (cloridra-to de 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida) foi adicionado para daruma concentração final de 10 nM e foi deixado reagir por 90 minutos, antesda lavagem copiosamente com água destilada.

O anticorpo foi imobilizado nas partículas magnéticas depois daadição de 10 mg do anticorpo EM5 oxidado, foi dissolvido em tampão defosfato de sódio a 150 mM de pH 7,5, a 2 ml de partículas magnéticas (10mg/ml) com grupos amino sobre sua superfície a 4°C e incubação de um diapara o outro. As bases de Schiff formadas e os grupos aldeídos não reagi-dos foram reduzidos por adição de boroidreto de sódio até que uma concen-tração de 1 mg/ml fosse alcançada, a pH 8,5 e 4°C. A preparação foi lavadacom quantidade copiosa de água destilada. A quantidade de anticorpo imo-bilizado foi determinada por quantificação da diferença em concentração deproteínas no sobrenadante antes e depois da imobilização, usando-se méto-do Bradford's [27].

Detecção de peptídeo p-amilóide em solução

Antes da verificação de sua validez de ligação a isoformas depeptídeo p-amilóide em amostras de fluidos biológicos tal como urina, foitestada a capacidade do anticorpo da invenção de ligação a formas de pep-tídeo p-amilóide em solução e se os anticorpos acoplados a partículas mag-néticas tornam possível a extração de formas de peptídeo de p-amilóide apartir de soluções em que eles ocorreram, para processar para sua quantifi-cação e/ou identificação subseqüente. Portanto, peptídeos sintéticos quecorrespondem às formas de peptídeo p-amilóide Ap12-29, Api.4o e AP1-42, dis-solvidos em água destilada, foram misturados entre si em água destiladapara dar uma mistura com concentrações finais de 44 |ig/|il de Ap12-29 e A(3i-42 e 0,11 jxg/p.l de Ap^o- 4 |jJ desta mistura de peptídeo foram adicionados a981 JllI de água.

A seguir, as formas de peptídeo (3-amilóide presentes em solu-ção em água foram separadas usando-se o anticorpo da invenção, acopladoa partículas magnéticas. Análise de espectrometria de massa da mistura depeptídeos separada da solução é mostrada na figura 6, em que a parte Acorresponde à análise da solução sem tratamento prévio com anticorpos(Ctrl) e a parte B corresponde ao uso do anticorpo ligado a partículas mag-néticas (EM5+PM). Como pode ser visto, o anticorpo é capaz de se ligar aformas de peptídeo p-amilóide em solução e de formação de complexos comelas, de modo que elas possam ser separadas do dita solução.Preparação da amostra de urina

Em dias separados, 10 ml de amostras de urina foram coletadosa partir de um indivíduo saudável e foram centrifugados a 3500 rpm à tempe-ratura ambiente por 5 minutos. A urina foi neutralizada para pH 7,0 com Na-OH a 1 M em tampão de PBS.

Peptídeos sintéticos que correspondiam às formas de peptídeop-amilóide Ap12-28, Ap^o e APv42 foram misturados juntos em água destiladapara dar uma mistura com concentração final 0,44 jxg/jLil de Api2.28 e APi-42e0,11 ng/|jJ de Ap^o. 4 jlxI dessa mistura de peptídeos foram adicionadas a981 uJ de urina.

A concentração final de formas de peptídeo p-amilóide em urinafoi 1,76 |ig/ml no caso de Ap12-ise de Api-42 e 0,44 ug/ml no caso de Api-4o-lmunoprecipitação

15 uJ de partículas magnéticas revestidas com o anticorpo mo-noclonal EM5 (diluído de 1:4 em tampão de PBS) foram incubados por 1 ho-ra a 37°C com 981 jllI da amostra de urina descritos acima, que continham ostrês peptídeos p-amilóide (Ap12-28, Api.4o e Ap^)-

Depois da incubação, o tubo foi colocado em um separadormagnetizado de partículas magnéticas e a urina foi extraída cuidadosamenteusando-se uma pipeta.

As partículas magnéticas com os peptídeos ligados a elas, reti-das pela ação do campo magnético do separador, foram lavadas três vezescom H20.

Os peptídeos ligados a elas foram separados das partículasmagnéticas com 12 (xl de uma solução de uma matriz de ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico em 30% (v/v) de acetonitrila aquosa contendo 0,1% (v/v) deácido trifluoroacético (TFA) e foram analisados por espectrometria de massaMALDI-TOF.

Detecção dos peptídeos imunoprecipitados por espectrometria de massa

1,5 jil da mistura de amostra que resultam de imunoprecipitaçãona matriz de ácido oc-ciano-4-hidroxicinâmico foram colocados em uma son-da de aço inoxidável com capacidade para 100 amostras e foram deixadossecar à temperatura ambiente por 5 minutos.

As amostras foram medidas em uma estação de trabalho paraespectrometria de massa MALDI-TOF Voyager DE-PRO de PE Biosystemusando-se configuração padrão do instrumento. Os espectros de massa fo-ram registrados em modo de refletor positivo a uma voltagem de aceleraçãode 20 kV e uma voltagem de coletor de 75%, 0,002% de filamento guia e 0 nanossegundos de tempo de atraso, acúmulo de 200 espectros de dis-paros de laser individuais abaixo da irradiação limiar. Apenas sinais de mas-sa com boa resolução, de alta intensidade, de 3-5 pontos selecionados deincidência, foram considerados. O equipamento foi calibrado externalmenteusando-se mistura de calibração 2, fornecida por Applied Biosystems (TresCantos, Madri, Espanha), composta de angiotensina (1297 Da), ACTH 1-17(2094 Da), ACTH 18-39 (2466 Da), ACTH 7-38 (3660 Da) e insulina bovina(2867 Da).

A figura 7 mostra o gráfico obtido com uma das amostras, que érepresentativa das outras. Picos podem ser vistos que correspondem aospeptídeos adicionados à amostra de urina, que demonstra a capacidade doanticorpo da invenção para a ligação deles em amostras de urina. Uma vezque a análise tenha sido realizada com uma amostra de um fluido biológico,outros picos podem também ser vistos, que correspodem a outras moléculasnaturalmente presentes na amostra e que também se tornou ligada ao anti-corpo acoplado a partículas magnéticas. Deposição do hibridoma

O hibridoma que produz o anticorpo EM5 foi depositado na Eu-ropean Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire,Reino Unido. Os dados de deposição e o número de acesso são como sesegue: Designação do hibridoma Prazo de deposição ng de acesso

Clone A EM5 03.01.2006 06030101

Como observado anteriormente, estas células de hibridoma fo-ram obtidas por fusão de dois tipos de células: a) linfócitos de baço de ca-mundongo BALB/c, obtidos depois da imunização de camundongos usando- se, como imunógeno, a forma de peptídeo p-amilóide designado ApY4o, com-preendendo aminoácidos 1 a 40 do dito peptídeo, acoplado a KLH (hemoci-anina do molusco "keyhole limpet"); b) células da linha de mieloma de ca-mundongo P3/X63-Ag653, que agiu como a parte imortal da fusão. Váriosclones foram obtidos, a partir dos quais foi selecionado o clone designado "clone A EM5", que produz o anticorpo monoclonal designado "EM5", umanticorpo de tipo lgG1 capaz de especificamente reconhecer o antígeno u-sado para a imunização, o peptídeo Afr-40, como verificado por testes decaptura de anticorpo do tipo ELISA. Este clone foi desenvolvido em meio decultura de RPMI 1640 com 10% de soro de bezerro fetal, 10% de DMSO,glutamina a 2 mM e piruvato de sódio a 1 mM, a 37°C e em uma atmosferacom 5% de C02l condições em que 95% das células desenvolvidas em sus-pensão e os 5% restantes aderidos ao recipiente de cultura. As células fo-ram clonadas duas vezes por meio de diluição limitante, depois da qual alí-quotas de 4 x 106 células foram tiradas, e foram colocadas em frascos, vá- rios desses frascos foram enviados ao European Collection of Cell Cultures(ECACC), requerendo permissão para sua deposição.Referências

1. Dickson DW, Crystal HA, Mattiace LA, Masur DM, Blau AD, Davies P, Yen S. and Aronson MK. Identification of normal and pathological aging in prospectively studied nondemented elderly humans. Neurobiol Aging 13:1-11 (1992).

2. Iwatsubo T, Mann DAM, Odaka A, Suzuki N and lhara Y. Amy-loid p protein (Ap) deposition: Ap42(43) precedes Ap40 in Down's sydrõme. Ann Neurol 37: 294-299 (1995).

3. Fukumoto H, Asami-Okada A, Suzuki N, Shimada H, lhara Y and Iwatsubo T. Amyloid p protein deposition in normal aging has the same characteristics as that in Alzheimer's disease. Am J Pathol 148: 259-265 (1996).

4. Giaccone G, Tagliavini F, Linoli G, Bouras C, Frigerior L, Frangione B and Bugiani O. Down syndrome patients: extracellular preamy-loid deposits precede neuritic degeneration and senile plaques. Neurosci Lett 97:232-238(1989).

5. Terry RD, Masliah E, Salmon DP, Butters N, De Teresa R, Hill R, Hansen LA, Katzman R. Physical basis of cognitive alterations in Alz-heimer's disease: synapse loss in the major correlate of cognitive impair-ment. Ann Neurol 30: 572-580 (1991).

6. Masliah E, Terry RD, Mallory M, Alford M and Hansen LA. Dif-fuse plaques do not accentuate synapse loss in Alzheimer Disease. Am J Path 137: 1293-97 (1990)

7. Dickson DW. The pathogenesis of senile plaques. J Neuropa-thol Exp Neurol 56: 321 -339 (1997).

8. Braak H and Braak E. Neuropathological staging of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica (Berl) 82:239-259 (1991).

9. Thal DR, Rüb U, Schultz ch, Sassin I, Ghebremedhin S, Del Tredici K, Braak E and Braak H. Sequence of Ap-protein deposition in the human mediai temporal lobe. J. Neuropathol Exp Neurol 59 (8): 733-748 (2000).

10. Mirra, SS, Heyman A, McKeel D, Sumi SM, Crain BJ, Brown-`lee LM, Vogel FS, Hughes JP, van Belle G and Berg L. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardiza-tion of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology 41:479-486(1991).

11. Selkoe DJ. Alzheimer's disease: genotypes, phenotype and treatments. Science 275(5300):630-1 (1997).

12. Hardy J, and Selkoe DJ. The amyloid hypothesis of Alz-heimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297: 353-356 (2002).

13. Vigo-Pelfrey C, Lee D, Keim P, Lieberberg I and Schenk DB. Characterization of B-amyloid peptide from human cerebrospinal fluid. J. Neurochem 61: 1965-1968 (1993).

14. Iwatsubo T, Mann DAM, Odaka A, Suzuki N and lhara Y. Amyloid B protein (AB) deposition: AB42(43) precedes AB40 in Down's syn-drome. Ann Neurol 37: 294-299 (1995).

15. Iwatsubo T, Saido TC, Mann DAM, Lee V M-Y and Troja-nowski JQ. Full-length amyloid B (1-42 (43)) e amino-terminally modified and truncated amyloid-B42(43) deposit in diffuse plaques. Am J Pathol 149: 1823-1830(1996).

16. Higgins L, Murphy Jr GM, Forno LS, Catalano R and Cordell B. P3 8-amyloid peptide has a unique and potentially pathogenic immunohis-tochemical profile in Alzheimer's disease brain. Am J Path 149: 585-596 (1996).

17. Gowing E, Roher AE, Woods AS, Cotter RJ, Chaney M, Little SP and Bali MJ. Chemical characterization of AB 17-42 peptide, a component of diffuse amyloid deposits of Alzheimer disease. J Biol Chem 269:10987-10990(1994).

18. Kida E, Wisniewski KE and Wisniewski HM. Early amyloid-B deposits show different immunoreactivity to the amino- and carboxy-terminal regions of B-peptide in Alzheimer's disease and Down's syndrome brain. Neurosci Lett 193: 105-108 (1995).

19. Lalowski M, Golabek A, Lemere A, Selkoe DJ, WisniewskiHM, Beavis RC, Frangione B and Wisniewski T. The "nonamyloidogenic" p3 fragment (amyloid p17-42) is a major constituent of Down's syndrome cere-bellar preamyloid. J. Biol Chem 271:33623-33631 (1994).

20. Saido TC, Iwastsubo T, Mann DMA, Shimada H, lhara Y and Kawashima S. Dominant and differential deposition of distinct p-amyloid pep-tide species, A0N3 (peptide) in senile plaques. Neuron, 14: 457-466 (1995).

21. Tekirian TL, Saido TC, Markesberry WR, Russell MJ, Wek-stein DR, Patel E and Geddes JW. N-terminal heterogeneíty of parenchymal and cerebrovascular Ap deposits. J. Neuropathol Exp Neurol 57: 76-94 (1998).

22. Parvathy S, Davis P, Haroutunian V, Purohit DP, Davis KL, Mohs RC, Park H, Moran TM, Chan JY and Buxbaum JD. Correlation be-tween A(3x-40-, A(3x-42-, and Apx-43- containing amyloid plaques and cogni-tive decline, Arch Neurol 58: 2025-2032 (2001).

23. Larner AJ. Hypothesis: amyloid (3-peptides truncated at the N-terminus contribute to the pathogenesis of Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 20: 65-69(1999).

24. Jimenez-Huete A, Alfonso P, Soto C, Alvar JP, Rabano A, Ghiso J, Frangione B and Mendez E. Antibodies directed to the carboxyl ter-minus of amyloid (3-peptide recognize sequence epitopes and distinct immu-noreactive deposits in Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Reports 1:41-48(1998).

25. Campell A. Monoclonal antibody technology In: 'Laboratory techniques in Biochemistry and Molecular Biology* (Eds: Burdon RH, Knip-penberg PH) Elsevier, Amsterdam, p. 120-134 (1984).

26. Fuents M, Mateo C, Guisan JM, Fernandez-Lafuente R. Preparation of inert magnetic nano-particles for the directed immobilization of antibodies. Biosensors and Bioelectronics 20: 1380-1387. (2005)

27. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantifica-tion of microgram quantities of protein using the principie of protein-dye bind-ing. Anal Biochem. 72: 278-254 (1976)

28. Mayeux R, Ong LS, Tang M-X, Manly J, Stern Y, Schupf N,Mehta PD. Plasma A(340 and A(342 and Alzheimer disease. Relation to age, mortality and risk. Neurology 61: 1185-1190. (2003)

29. Vandersthichele H, van Kerschaver E, Hesse C, Davidsson P, Buyse M, Andreasen N, Minthon L, Tallin A, Blennow K, Vanmechelen E, Standardization of measurement of beta-amyloid (1-42) in cerebrospinal fluid and plasma. Amyloid 7: 245-258.(2000).

30. Ghiso J, Calero M, Matsubara E, Governale s, Chuba J, Be-avis R, Wisniewski T, Frangione B. Alzheimer's soluble amyloid beta is a normal component of human urine. FEBS Lett 408: 105-108 (1997).Listagem de Seqüência <110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS <120> "MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE DOENÇA DE AL-ZHEIMER POR MEIO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL".

<130> PCT-258 <160>4 <210> 1 <211> 10 <212> peptídeo <213> artificial <310> US4666829 <311> 15.05.85 <312> 19.05.87 <400>

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

<210>2 <211> 17 <212> peptídeo <213> artificial <220> <222>1-17

<223> peptídeo p-amilóide <223>6E10, SV17-6E10 <310>WO 90/12871 <311> 13.04.90 <312> 01.11.90 <400>

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gln Vai His His Gln Lys Leu

<210>3 <211>5 <212> peptídeo <213> humano<200>

<222> 12-16

<223> Seqüência reconhecida por EM5 em peptídeo p-amilóide <400>

Vai His.His Gln Lys

<210>4 <211>8 <212> peptídeo <213> artificial <220>

<223> União de cauda para domínio f do amino terminal fim do Ap37-42y

Ap37-49

<400>

Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly

Claims (52)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal que reconhece no peptídeo p-amilóide pelo menos o epítopo correspondente à seqüência:Val-His-His-GIn-Lys (SEQ ID NO:3) e que é capaz de ser ligado a isoformas do peptídeo p-amilóide humano que contenham a dita seqüência.

2. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1,capaz de ser ligado a depósitos de peptídeo p-amilóide humano no tecido cerebral de pessoas afetadas pela doença de Alzheimer.

3. Fragmento de anticorpo monoclonal que reconhece no peptídeo p-amilóide pelo menos o epitopo correspondente à seqüência:Val-His-His-GIn-Lys (SEQ ID NO:3) e que é capaz de ser ligado a isoformas do peptídeo p-amilóide que contenham a dita seqüência.

4. Fragmento de anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 3, capaz de ser ligado a depósitos de peptídeo p-amilóide humano no tecido cerebral de pessoas afetadas pela doença de Alzheimer.

5. Linha celular de hibridoma capaz de produzir o anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, ou um fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 3.

6. Linha celular de hibridoma, de acordo com a reivindicação 5, obtida mediante a fusão com a linha de mieloma de camundongo P3/X63-A.653 de células do baço de camundongos BALB/c imunizados com pelo menos um peptídeo que contenha a seqüência Val-His-His-GIn-Lys (SEQ ID NO:3).

7. Linha celular de hibridoma, de acordo com a reivindicação 6, obtida mediante a fusão com a linha de mieloma de camundongo P3/X63-Ag.653 de células do baço de camundongos BALB/c imunizados com o peptídeo Api-40-

8. Linha celular de hibridoma, de acordo com a reivindicação 7, obtida mediante a fusão com a linha de mieloma de camundongo P3/X63-Ag.653 de células do baço de camundongos BALB/c imunizados com o pep-tídeo A(3i-4o acoplado a KLH.

9. Uso do anticorpo monocional, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou de pelo menos um fragmento do dito anticorpo monocional, como definido na reivindicação 3 ou 4, no diagnóstico in vitro da doença de Al- zheimer a partir de uma amostra do tecido cerebral tirada de uma pessoa que sofre da dita doença.

10. Uso do anticorpo monocional, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou de pelo menos um fragmento do dito anticorpo monocional, como definido na reivindicação 3 ou 4, em combinação com pelo menos outro anti- corpo específico para pelo menos uma zona de seqüência diferente do pep-tídeo p-amilóide, no diagnóstico da doença de Alzheimer a partir de uma amostra do tecido cerebral tirada de uma pessoa que sofre da dita doença.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, do anticorpo monocional, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou de pelo menos um frag- mento do dito anticorpo monocional, como definido na reivindicação 3 ou 4, em combinação com o anticorpo EM2 e/ou com o anticorpo EM3.

12. Composição que compreende um anticorpo monocional, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou pelo menos um fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 3 ou 4, acoplado a uma substância que permite a detecção do dito anticorpo ou do fragmento do mesmo.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, na qual a substância à qual é acoplado o anticorpo monocional ou o fragmento do mesmo é um segundo anticorpo capaz de ser ligado ao dito primeiro anticorpo ou fragmento de anticopo, este segundo anticorpo sendo ligado a uma enzima capaz de catalisar a transformação de uma determinada substância em outra que possa ser detectada.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, na qual a substância cuja transformação catalisa a enzima é um cromógeno.

15. Composição, de acordo com as reivindicações 13 e 14, na 30 qual o segundo anticorpo é ligado à fosfatase alcalina e o cromógeno utilizado é azul de nitrotetrazólio.

16. Composição, de acordo com as reivindicações 13 e 14, naqual o segundo anticorpo é ligado à peroxidase de rábano e o cromógeno utilizado é diaminobenzidina.

17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, que compreende pelo menos outro anticorpo específico para pelo menos uma zona de seqüência diferente do peptídeo p-amilóide.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, que compreende o anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou um fragmento do dito anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 3 ou 4, acoplado a uma substância que pode ser detectada e outro ou outros anticorpos específicos para uma òu mais zonas de seqüência diferentes do peptídeo p-amilóide, acoplados a substâncias diferentes que também podem ser detectadas.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, na qual o segundo anticorpo dirigido a uma zona de seqüência diferente do peptídeo p-amilóide é o anticorpo EM2.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, na qual o anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou o fragmento do dito anticorpo, como definido na reivindicação 3 ou 4, é acoplado a um segundo anticorpo ligado à peroxidase de rábano, sendo utilizado o cromó- geno diaminobenzidina (DAB) como uma substância a ser transformada que pode ser detectada, enquanto que o anticorpo EM2 é acoplado a um segundo anticorpo ligado à fosfatase alcalina, sendo utilizado o cromógeno azul de nitrotetrazólio como uma substância a ser transformada que pode ser detectada.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 18, na qual osegundo anticorpo dirigido a uma zona de seqüência diferente do peptídeo P-amilóide é o anticorpo EM3.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, na qual o anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou o fragmento do dito anticorpo, como definido na reivindicação 3 ou 4, é acoplado a um segundo anticorpo ligado à peroxidase de rábano, sendo utilizado o cromógeno diaminobenzidina (DAB) como uma substância a ser transformada quepode ser detectada, enquanto que o anticorpo EM3 é acoplado a um segundo anticorpo ligado à fosfatase alcalina, sendo utilizado o cromógeno azul de nitrotetrazólio como uma como substância a ser transformada que pode ser detectada.

23. Uso de uma composição, como definido na qualquer umadas reivindicações 12 a 22, no diagnóstico da doença de Alzheimer a partir de uma amostra do tecido cerebral tirada de uma pessoa que sofre da mesma.

24. Método de diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer a par-10 tir de uma amostra do tecido cerebral tirada de uma pessoa que sofre damesma, que compreende a detecção a partir da dita amostra de pelo menos uma isoforma do peptídeo p-amilóide que contenha pelo menos a seqüência Val-His-His-GIn-Lys (SEQ ID NO:3) graças a sua ligação a um anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou a um fragmento do 15 mesmo, como definido na reivindicação 3 ou 4.

25. Método de diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer a partir de uma amostra do tecido cerebral tirada de uma pessoa que sofre da mesma, que compreende a detecção a partir da dita amostra de pelo menos uma isoforma do peptídeo p-amilóide que contenha pelo menos a seqüência Val-His-His-GIn-Lys (SEQ ID NO:3) graças a sua ligação a um anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou a um fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 3 ou 4, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo compreendido em uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações de 12 a 22.

26. Método de diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer a par-tir de uma amostra do tecido Cerebral tirada de uma pessoa que sofre da mesma, que compreende a detecção a partir da dita amostra de pelo menos uma isoforma do peptídeo p-amilóide que contenha pelo menos a seqüência Val-His-His-GIn-Lys (SEQ ID NO:3) graças a sua ligação a um anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou a um fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 3 ou 4, assim como a detecção de pelo menos uma segunda forma do peptídeo p-amilóide graças a sua ligaçãoa pelo menos um segundo anticorpo dirigido contra uma região diferente do peptídeo B-amilóide, ambos os anticorpos ou o fragmento do anticorpo mo-noclonal, como definido na reivindicação 1 ou 2, e o segundo anticorpo ou qualquer outro anticorpo adicional sendo dirigidos contra uma região diferen-5 te do peptídeo amilóide, compreendidos em uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 22.

27. Método de diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, no qual é detectada no tecido cerebral a presença de depósitos de peptídeo B-amilóide aos quais pode ser ligado o anticorpo monoclonal da invenção.

28. Método de diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer, de acordo com a reivindicação 27, no qual é detectada no tecido cerebral a presença de depósitos de peptídeo B-amilóide aos quais pode ser ligado o anticorpo monoclonal da invenção mediante o uso de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 23.

29. Método de diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer, de acordo com a reivindicação 28, no qual é detectada no tecido cerebral a presença de depósitos de peptídeo B-amilóide aos quais pode ser ligado o anticorpo monoclonal da invenção, assim como a presença adicional de depósi- tos que contêm pelo menos uma isoforma adicional do peptídeo B-amilóide aos quais pode ser ligado pelo menos um segundo anticorpo dirigido contra uma zona diferente do dito peptídeo, mediante o uso de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 22.

30. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, ca-25 paz de ser ligado a formas solúveis do peptídeo B-amilóide humano nas a-mostras de fluidos biológicos ou soluções derivadas dos mesmos.

31. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 30, capaz de ser ligado a formas solúveis do peptídeo B-amilóide humano em amostras de líquido cefalorraquiano, sangue, plasma ou urina.

32. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 31,capaz de ser ligado a formas solúveis do peptídeo B-amilóide humano em amostras de urina

33. Fragmento de anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 3, capaz de ser ligado a formas solúveis do peptídeo p-amilóide humano em amostras de fluidos biológicos ou soluções derivadas dos mesmos.

34. Fragmento de anticorpo monoclonal, de acordo com a reivin-dicação 33, capaz de ser ligado a formas solúveis do peptídeo p-amilóide humano em amostras de líquido cefalorraquiano, sangue, plasma ou urina.

35. Fragmento de anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 34, capaz de ser ligado a formas solúveis do peptídeo p-amilóide humano em amostras de urina.

36. Composição que compreende um anticorpo monoclonal, como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 32, ou pelo menos um fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 33 a 35, na qual o anticorpo ou o fragmento do mesmo é acoplado a uma subs- tância ou partícula que facilita a extração de complexos de antígeno-anticorpo ou de antígeno-fragmento de anticorpo da solução na qual se encontram.

37. Composição, de acordo com a reivindicação 36, na qual a substância ou partícula que facilita a extração de complexos de antígeno- anticorpo ou de antígeno-fragmento de anticorpo da solução na qual se encontram é uma partícula magnética.

38. Composição, de acordo com a reivindicação 37, na qual a ligação entre o anticorpo ou o fragmento do mesmo e a partícula magnética é uma ligação covalente.

39. Uso do anticorpo monoclonal, como definido em qualqueruma das reivindicações 30 a 32, ou do fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 33 a 35, no diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer a partir de uma amostra de um fluido biológico ou de uma solução derivada do mesmo.

40. Uso, de acordo com a reivindicação 39, no qual o anticorpomonoclonal ou o fragmento do mesmo está compreendido em uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 36 a 38.

41. Uso, de acordo com a reivindicação 40, no qual o anticorpo monoclonal ou o fragmento do mesmo está compreendido em uma composição, como definida na reivindicação 38.

42. Uso, de acordo com a reivindicação 41, no qual a composi-5 ção, como definida na reivindicação 38, é acrescentada à amostra de fluidobiológico ou solução derivada do mesmo para que sejam formados complexos de antígeno-anticorpo ou de antígeno-fragmento de anticorpo còm as formas do peptídeo p-amilóide presentes na amostra de fluido biológico ou na solução derivada do mesmo.

43. Uso, de acordo com a reivindicação 42, no qual é provocadaa extração de complexos de antígeno-anticorpo ou de antígeno-fragmento de anticorpo formados do fluido biológico ou da solução na qual se encontram mediante o uso de um campo magnético.

44. Uso, de acordo com a reivindicação 43, no qual as formas do 15 peptídeo p-amilóide extraídas de um fluido biológico ou de uma solução derivada do mesmo na forma de complexos de antígeno-anticorpo ou de antígeno-fragmento de anticorpo são separadas do anticorpo ou fragmento de anticorpo posteriormente à extração do fluido biológico ou da solução na qual se encontravam e antes de proceder a sua identificação e/ou quantifi- cação.

45. Uso, de acordo com a reivindicação 44, no qual as formas do peptídeo p-amilóide são identificadas e/ou quantificadas mediante a espec-trometria de massas MALDI-TOF.

46. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 45, no qual a amostra de fluido biológico é uma amostra de urina.

47. Método de diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer a partir de uma amostra de um fluido biológico ou de uma solução derivada do mesmo, que compreende a detecção a partir da dita amostra de pelo menos uma isoforma do peptídeo p-amilóide que contenha pelo menos a seqüência Val-His-His-GIn-Lys (SEQ ID NO:3) graças a sua ligação a um anticorpo monoclonal, como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 32, ou a um fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindica-ções 33 a 35, que compreende as etapas de:a) acrescentar à amostra de fluido biológico ou solução derivada do mesmo uma composição, como definida na reivindicação 37 ou 38;b) deixar transcorrer tempo suficiente para que sejam formados complexos de antígeno-anticorpo ou de antígeno-fragmento de anticorpo entre pelo menos uma isoforma do peptídeo p-amilóide e o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreendido na composição;c) aplicar um campo magnético para extrair os complexos de antígeno-anticorpo ou de antígeno-fragmento de anticorpo da solução;d) retirar a solução;e) separar o anticorpo ou fragmento de anticorpo das moléculas de peptídeo p-amilóide;f) identificar e quantificar as isoformas de peptídeo p-amilóide extraídas das amostras de fluido biológico ou solução derivada do mesmo.

48. Método de diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer, de acordo com a reivindicação 47, no qual a amostra de fluido biológico é uma amostra de urina.

49. Método de diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer, de acordo com a reivindicação 48, no qual a composição que é acrescentada na etapa a) compreende um anticorpo monoclonal, como definido em qualquer das reivindicações 30 a 32, ligado covalentemente às partículas magnéticas correspondentes mediante a modificação de um ou mais resíduos presentes na zona Fc do dito anticorpo.

50. Método de diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer, de acordo com a reivindicação 49, no qual a identificação e a quantificação das isoformas do peptídeo p-amilóide extraídas da amostra de urina são realizadas mediante a espectrometria de massas MALDI-TOF.

51. Método de diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer, de acordo com a reivindicação 50, no qual a etapa e) de separação do anticorpo ou fragmento do anticorpo das moléculas do peptídeo p-amilóide é realizada em ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico em acetonitrila aquosa que contém ácido trifluoroacético.

52. Linha celular de hibridoma, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de consistir em uma amostra substancialmente pura de ECACC 06030101.