KR102357045B1 - 알츠하이머 질환에 대한 림프구-기반 형태계측 시험 - Google Patents
알츠하이머 질환에 대한 림프구-기반 형태계측 시험 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법 및 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 (a) 대상체의 림프구를 적합한 기저막 매트릭스와 함께 배양하여 림프구가 응집되도록 하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 적합한 경우, 이러한 측정치에 기반하여, 알츠하이머 질환을 진단하거나 이에 대한 소인을 결정하는 단계를 사용한다.
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Description
본 출원은 2017년 3월 31일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/479,630의 이익을 주장하며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 출원 전체에 걸쳐 다양한 공개물이 인용된다. 이들 공개물의 개시내용은 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 기술 수준을 보다 완전하게 설명하기 위해 본 출원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 림프구 응집-기반 방법 및 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 갖기 쉬운지의 여부를 결정하는 림프구 응집-기반 방법에 관한 것이다.
지난 15년에 걸쳐 알츠하이머 질환의 병리생리학은 뇌와 관련이 있을 뿐만 아니라 전신 표출을 가질 수도 있음을 나타내는 많은 데이터가 수집되었다. 예컨대, 많은 중요한 아밀로이드 및 타우 효소가 신체 전체에서 발견될 수 있다. 이에 근거하여, 예컨대 알츠하이머 질환에 대한 피부 세포를 다양한 대조군 환자로부터의 세포에 대비하여 시험하기 위한 정확한 검정법이 개발되었다. 일부 피부 세포-기반 검정법은 PKCε 및 ERK1,2와 같은 표적에 중점을 둔다.
본 발명은 (a) 증후성 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에서 적합한 기저막 매트릭스와 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에서 적합한 기저막 매트릭스와 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 증후성 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에서 적합한 기저막 매트릭스와 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치가 대상체에서 알츠하이머 질환과 서로 관련되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 (a) 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에서 적합한 기저막 매트릭스와 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치가 알츠하이머 질환을 앓기 쉬운 대상체와 서로 관련되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
도 1
알츠하이머 질환 케이스에 대한 증가된 B 림프구 응집
(AD - 패널 A, B) 연령-일치된 대조군 케이스 (AC - 패널 C 및 D) 및 비-알츠하이머의 치매 케이스 (비-ADD - 패널 E 및 F)와 비교됨. 두꺼운 마트리겔(Matrigel)® 층 (1.82mm)에 플레이팅한 후 48시간에서의 4x 이미지의 예. 패널 A, C 및 E는 세포 시딩 밀도가 125개 세포/μl인 경우에 대한 예이고, 패널 B, D 및 F는 250개 세포/μl의 세포 시딩 밀도에 대한 예이다.
도 2A 및 2B
4x 이미지에서 플레이팅한 후 48시간에서의 응집체 면적%
(도 2A) 125개 세포/μl로부터 250개 세포/μl로 시딩 세포 밀도를 2배 높이면, 비-알츠하이머의 치매 케이스 (비-ADD - 녹색 삼각형) 또는 연령-일치된 대조군 케이스 (AC - 자주색 원)와 비교하여, 알츠하이머 질환 케이스 (AD - 청색 사각형)에 대해 응집체 면적 %가 크게 증가한다. (도 2B) A로부터의 피트 라인 (fit line)에 대한 기울기 및 절편이 여기에 표시된다. 응집 비율을 나타내는 기울기는 AC 및 비-ADD 케이스와 비교하여 AD 케이스에서 약 10배 높다.
도 3
4x 이미지에서 2종의 세포 시딩 밀도 - 125개 세포/μl 및 250개 세포/μl에 대한 응집체 순위
AD 케이스 (패널 A)에 대한 자연 대수 형식, 즉 Ln (응집체 면적)의 순위 곡선은 2종의 세포 시딩 밀도에 대해 비-ADD (패널 B) 및 AD (패널 C)에 대한 순위 곡선보다 높다. (패널 D) 125개 세포/μl의 세포 시딩 밀도에 대해 비-ADD (녹색) 및 AC (청색)와 비교하여 AD 케이스 (자주색)에 대해 상승된 순위 곡선. (패널 E) 250개 세포/μl의 세포 시딩 밀도에 대해 비-ADD (녹색) 및 AC (청색)와 비교하여 AD 케이스 (자주색)에 대해 상승된 순위 곡선. (패널 F) 2종의 세포 시딩 밀도에 대한 순위 곡선들 사이의 차이, 즉 Ln (응집체 면적)250-Ln (응집체 면적)125은 비-ADD (녹색) 및 AC (청색)와 비교하여 모든 순위에서 AD 케이스 (자주색)에 대해 상승된다.
도 4
알츠하이머 질환 케이스에 대한 증가된 B 림프구 응집
(AD - 패널 A 및 B) 연령-일치된 대조군 케이스 (AC - 패널 C 및 D) 및 비-알츠하이머의 치매 케이스 (비-ADD - 패널 E 및 F)와 비교됨. 두꺼운 마트리겔® 층 (1.82mm)에 플레이팅한 후 48시간에서의 10x 이미지의 예. 패널 A, C 및 E는 125개 세포/μl의 세포 시딩 밀도에 대한 예이고, 패널 B, D 및 F는 250개 세포/μl의 세포 시딩 밀도에 대한 예이다.
도 5A 및 5B
10x 이미지에서 플레이팅한 후 48시간에서의 125 및 250개 세포/μl에 대한 응집체 면적 % - 더 우수한 접근
(도 5A, 상단) 125개 세포/μl로부터 250개 세포/μl로 시딩 세포 밀도를 2배 높이면, 비-알츠하이머의 치매 케이스 (비-ADD - 녹색 삼각형) 또는 연령-일치된 대조군 케이스 (AC - 자주색 원)와 비교하여, 알츠하이머 질환 케이스 (AD - 청색 사각형)에 대해 응집체 면적 %가 크게 증가한다. Y 축 = 응집체 면적 %; x 축 = 세포 밀도 (세포/μl). (도 5B, 하단) (도 5A)로부터의 피트 라인에 대한 기울기 및 절편이 여기에 표시된다. 응집 비율을 나타내는 기울기는 AC 및 비-ADD 케이스와 비교하여 AD 케이스에서 상당히 더 높다. Y-축 = 기울기; x 축 = 절편.
알츠하이머 질환 케이스에 대한 증가된 B 림프구 응집
(AD - 패널 A, B) 연령-일치된 대조군 케이스 (AC - 패널 C 및 D) 및 비-알츠하이머의 치매 케이스 (비-ADD - 패널 E 및 F)와 비교됨. 두꺼운 마트리겔(Matrigel)® 층 (1.82mm)에 플레이팅한 후 48시간에서의 4x 이미지의 예. 패널 A, C 및 E는 세포 시딩 밀도가 125개 세포/μl인 경우에 대한 예이고, 패널 B, D 및 F는 250개 세포/μl의 세포 시딩 밀도에 대한 예이다.
도 2A 및 2B
4x 이미지에서 플레이팅한 후 48시간에서의 응집체 면적%
(도 2A) 125개 세포/μl로부터 250개 세포/μl로 시딩 세포 밀도를 2배 높이면, 비-알츠하이머의 치매 케이스 (비-ADD - 녹색 삼각형) 또는 연령-일치된 대조군 케이스 (AC - 자주색 원)와 비교하여, 알츠하이머 질환 케이스 (AD - 청색 사각형)에 대해 응집체 면적 %가 크게 증가한다. (도 2B) A로부터의 피트 라인 (fit line)에 대한 기울기 및 절편이 여기에 표시된다. 응집 비율을 나타내는 기울기는 AC 및 비-ADD 케이스와 비교하여 AD 케이스에서 약 10배 높다.
도 3
4x 이미지에서 2종의 세포 시딩 밀도 - 125개 세포/μl 및 250개 세포/μl에 대한 응집체 순위
AD 케이스 (패널 A)에 대한 자연 대수 형식, 즉 Ln (응집체 면적)의 순위 곡선은 2종의 세포 시딩 밀도에 대해 비-ADD (패널 B) 및 AD (패널 C)에 대한 순위 곡선보다 높다. (패널 D) 125개 세포/μl의 세포 시딩 밀도에 대해 비-ADD (녹색) 및 AC (청색)와 비교하여 AD 케이스 (자주색)에 대해 상승된 순위 곡선. (패널 E) 250개 세포/μl의 세포 시딩 밀도에 대해 비-ADD (녹색) 및 AC (청색)와 비교하여 AD 케이스 (자주색)에 대해 상승된 순위 곡선. (패널 F) 2종의 세포 시딩 밀도에 대한 순위 곡선들 사이의 차이, 즉 Ln (응집체 면적)250-Ln (응집체 면적)125은 비-ADD (녹색) 및 AC (청색)와 비교하여 모든 순위에서 AD 케이스 (자주색)에 대해 상승된다.
도 4
알츠하이머 질환 케이스에 대한 증가된 B 림프구 응집
(AD - 패널 A 및 B) 연령-일치된 대조군 케이스 (AC - 패널 C 및 D) 및 비-알츠하이머의 치매 케이스 (비-ADD - 패널 E 및 F)와 비교됨. 두꺼운 마트리겔® 층 (1.82mm)에 플레이팅한 후 48시간에서의 10x 이미지의 예. 패널 A, C 및 E는 125개 세포/μl의 세포 시딩 밀도에 대한 예이고, 패널 B, D 및 F는 250개 세포/μl의 세포 시딩 밀도에 대한 예이다.
도 5A 및 5B
10x 이미지에서 플레이팅한 후 48시간에서의 125 및 250개 세포/μl에 대한 응집체 면적 % - 더 우수한 접근
(도 5A, 상단) 125개 세포/μl로부터 250개 세포/μl로 시딩 세포 밀도를 2배 높이면, 비-알츠하이머의 치매 케이스 (비-ADD - 녹색 삼각형) 또는 연령-일치된 대조군 케이스 (AC - 자주색 원)와 비교하여, 알츠하이머 질환 케이스 (AD - 청색 사각형)에 대해 응집체 면적 %가 크게 증가한다. Y 축 = 응집체 면적 %; x 축 = 세포 밀도 (세포/μl). (도 5B, 하단) (도 5A)로부터의 피트 라인에 대한 기울기 및 절편이 여기에 표시된다. 응집 비율을 나타내는 기울기는 AC 및 비-ADD 케이스와 비교하여 AD 케이스에서 상당히 더 높다. Y-축 = 기울기; x 축 = 절편.
정의
본 출원에서, 하기에 제시된 바와 같은 의미를 가질 특정 용어가 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 증후성 인간 대상체와 관련하여 "알츠하이머 질환을 진단하는"은 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 될 가능성이 50% 초과인 것을 결정하는 것을 의미한다. 바람직하게는, "알츠하이머 질환을 진단하는"은 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 될 가능성이 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과인 것을 결정하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 문구 "대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는지의 여부를 결정하는"은 문구 "알츠하이머 질환을 진단하는"과 동의어이다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는"은 대상체가 그녀 또는 그의 생애 동안 알츠하이머 질환을 앓게 될 가능성이 평균보다 높다는 것을 결정하는 것을 의미한다. 65세 이후에는 5명 중 1명이 알츠하이머 질환을 앓고, 85세 이후에는 2명 중 1명이 알츠하이머 질환을 앓게 될 것이다. 바람직하게는, 이 소인을 결정하는 것은 대상체가 그녀 또는 그의 생애 동안 알츠하이머 질환을 앓게 될 가능성이 적어도 20%인 것을 결정하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "알츠하이머 질환"은 하기의 3종의 증상과 동시에 발생하는 고통을 의미한다: (i) 치매; (ii) 아밀로이드 플라크; 및 (iii) 신경원섬유 매듭. 치매는 일생 동안 진단될 수 있다. 예컨대, 대뇌 아밀로이드 플라크 및 신경원섬유 매듭은 부검 중에 진단될 수 있다. 알츠하이머 질환에 대한 이 정의는 국립 보건원 (NIH)의 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NINDS)에 의해 제공된 것이며, "골드 표준"으로 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 알츠하이머 질환에 대해 "증후성"인 인간 대상체는 질환의 적어도 하나의 증상, 즉 치매, 아밀로이드 플라크 및 신경원섬유 매듭 중 하나를 나타내는 대상체이다. 바람직하게는, 알츠하이머 질환에 대해 증후성인 인간 대상체는 치매를 나타내는 대상체이다. 반대로, 알츠하이머 질환에 대해 "무증후성"인 인간 대상체는 어떠한 질환 증상도 나타내지 않는 대상체이다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간 대상체"는 임의의 연령일 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 40세 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 50세 이하이다. 추가의 실시양태에서, 대상체는 40세 초과이다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 대상체는 50세 초과, 60세 초과, 70세 초과, 80세 초과 또는 90세 초과이다.
본원에 사용된 바와 같이, "림프구"는 예로서 B 림프구, T 림프구 및 이들의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 림프구는 B 림프구이다. 대상체의 혈액으로부터 림프구를 수득하는 방법은 공지되어 있으며, 예컨대 유동 세포측정, 피콜 (혈액 층을 분리시키는 친수성 다당류) 및 구배 원심분리를 포함한다. 유동 세포측정-기반 방법이 하기에 예시되어 있다. 추가로, 본 방법에서, 림프구 (예컨대, B 림프구)는 불멸화 또는 1차 (즉, 비-불멸화) 형태로 사용될 수 있다. 림프구 (예컨대, B 림프구)를 불멸화하는 방법은 공지되어 있으며, 예컨대 림프구를 엡스타인-바 바이러스 ("EBV")로 처리하는 것을 포함한다. EBV-기반 방법이 하기에 예시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "적합한 기저막 매트릭스"는 그 위에서 및/또는 그 안에서 세포의 성장을 허용하는데 유용한 임의의 고체 또는 반고체 매트릭스 (예컨대, 겔 매트릭스)이다. 이러한 세포 성장은, 제한 없이, 세포 분열, 세포 확대, 세포 형태의 변화 및 세포-세포 부착의 형성을 포함한다. 이러한 매트릭스는 공지되어 있으며, 제한 없이, 마트리겔®, 콜라겐 I 및 IV, 라미닌, 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 및 엔탁틴을 포함한다. 마트리겔® 및 다른 매트릭스, 예컨대 라미닌 및 콜라겐은 세포 성장을 촉진한다.
본원에 사용된 바와 같이, 림프구를 "림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에서" 적합한 기저막 매트릭스과 함께 배양하는 것은, 예컨대 (i) 적어도 30분 동안; (ii) 세포 성장을 허용하는 온도 및 성장 인자 환경에서; 및 (iii) 배양 초기에 적어도 일부 림프구가 다른 림프구와 물리적으로 접촉되게 하는 세포 밀도에서 배양을 수행함으로써 달성된다. 한 실시양태에서, 배양은 적어도 30분 동안 및 48시간보다 길지 않게 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 세포 성장의 허용 온도 및 단백질 환경은 성장 인자-감소된 ("GFR") 마트리겔® (코닝 (Corning), 뉴욕)의 존재 하에서의 37℃, 10% 우태 혈청 ("FBS") 및 1% 페니실린 ("PS")을 갖는 RPMI 1640 배지이다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체로부터 "림프구"를 배양하는 것은 대상체로부터 유래된 림프구를 배양하는 것을 의미하며, 여기서 배양 전에 림프구는 대상체로부터 떼어낸 후 조작되거나 (예컨대, 단리, 불멸화 및/또는 달리 변형됨) 조작되지 않았다.
바람직한 실시양태에서, 본 방법은 공지된 양의 매트릭스 (예컨대, 검정 웰 중 750 μl, 500 μl, 250 μl, 150 μl 또는 75 μl의 마트리겔®)를 시험될 공지된 양의 림프구를 함유하는 공지된 양의 용액과 접촉시키는 것을 사용한다. 이 림프구-함유 용액은 단위 부피의 용액당 특정 "밀도"의 림프구 (예컨대, 125개 세포/μl 또는 250개 세포/μl)를 갖는 것으로 기재된다. 일단 매트릭스와 접촉되면, 공지된 세포 밀도의 이 용액 중의 림프구는 매트릭스의 다공성이 허용하는 정도로 매트릭스의 표면 및 내부에 접촉하고 그들 자신을 부착시킬 수 있다. 배양 초기에 적어도 일부의 림프구가 다른 림프구와 물리적으로 접촉되게 하는 세포 밀도는, 제한 없이, 50개 세포/μl 내지 500개 세포/μl의 밀도를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 림프구 "응집"은 적어도 하나의 림프구의 적어도 하나의 다른 림프구에 대한 물리적 부착을 의미한다. 이 부착은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 또한, 예컨대, 부착은 하나 이상의 세포-세포 상호작용, 예컨대 막 부착, 막 융합 및 세포-세포 융합을 포함할 수 있다. 본 방법에 대해 고려된 조건 하에서, 림프구 응집은 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터의 림프구 및 앓고 있지 않은 대상체로부터의 림프구 모두에서 발생한다는 것을 주목해야 한다. 그러나, 이들 조건 하에서, 응집 정도는 이러한 림프구 집단 간에 상이하다. 이 예기치 않은 차이가 적어도 부분적으로 본 방법의 유용성의 기반이 된다.
본원에 사용된 바와 같이, 림프구 응집을 "측정하는" 것은, 예컨대 조합된 2차원 응집체 면적을 결정할 수 있거나 조합된 응집체 부피를 결정할 수 있는 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 실시양태에서 및 본원에 예시된 바와 같이, 림프구 응집은 조합된 2차원 응집체 면적을 조사된 총 매트릭스 면적의 백분율로서 결정함으로써 측정된다. 예컨대, 이 시나리오에서, "50% 응집체 면적"의 림프구 응집 측정치는, 매트릭스-함유 검정 웰을 수직으로 볼 때 응집된 림프구 (그 자체로 쉽게 시각화됨)가 검정 웰 면적의 50%를 차지한다는 것을 의미한다. 이 유형의 측정치는 조합된 응집체 부피 또는 응집체 자체의 조합된 표면적을 고려하지 않는다. 추가의 실시양태에서, 림프구 응집을 측정하는 것은 단일 시점 (예컨대, 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간 또는 48시간)에서 및/또는 다수의 시점 (예컨대, 0시간, 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간 및 48시간)에서 총 응집을 결정하는 것을 포함한다. 따라서, 측정치는 주어진 시점에서 (예컨대, 응집 면적에 의해 측정된) 총 림프구 응집, 및/또는 적어도 2개의 시점 동안 취한 측정치로부터 유도된 림프구 응집체 형성 비율의 것일 수 있다.
또한, 미국 특허 번호 8,658,134 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 하기의 방법 중 하나 이상에 의해 및/또는 이와 함께 림프구 응집을 측정하는 것이 고려된다: (i) 통합된 점수를 결정; (ii) 응집체 수당 평균 응집체 면적을 결정; (iii) 세포 이동 분석을 수행; (iv) 프랙탈 (fractal) 분석을 수행; 및 (v) 라쿠나리티 (lacunarity) 분석을 수행. 이들 방법 중 하나 이상과 함께, 하기 단계가 또한 고려된다: 세포 및/또는 응집체 형태 특성, 예컨대 큰 덩어리의 존재 또는 부재, 덩어리에 부착된 세포의 존재 또는 부재, 큰 덩어리의 성장의 존재 또는 부재, 덩어리의 수, 이전에 형성된 덩어리의 네트워크로부터 잔여 모서리의 존재 또는 부재, 세포 이동의 수, 퍼콜레이션 근처에 있는 세포의 존재 또는 부재, 세포 덩어리 수, 세포 덩어리 크기 및 세포 덩어리 성장을 측정.
본원에 사용된 바와 같이, 동일해야 하는 본 방법을 수행하기 위한 "적합한 대조군"은, 제한 없이, 양성 대조군, 음성 대조군 또는 각각의 하나 이상을 포함한다. 예컨대, 양성 대조군은 알츠하이머 질환을 앓고 있는 인간 대상체로부터 수득된 림프구에 대해 본 방법 중 하나를 수행함으로써 수득되는 림프구 응집 데이터일 수 있다. 음성 대조군은, 예컨대 알츠하이머 질환에 앓고 있지 않은 인간 대상체 (예컨대, 어떠한 인지 증상도 없는 대상체, 경도 인지 장애를 앓고 있는 대상체 또는 비-알츠하이머의 치매를 앓고 있는 대상체)로부터 수득된 림프구에 대해 본 방법 중 하나를 수행함으로써 수득되는 림프구 응집 데이터일 수 있다. 중요하게는, 본 방법의 일부 방법에서, 관심의 인간 대상체로부터의 림프구를 시험하기 전, 동시에 또는 후에 대조군 시험 (예컨대, 양성, 음성 및/또는 둘 모두)을 수행하는 것이 고려된다. 이 경우, 이러한 대조군 시험으로부터의 데이터는 적합한 대조군으로 역할을 할 수 있다. 또한, 본 방법의 다른 방법에서, 관심의 인간 대상체로부터의 림프구를 시험하기 전, 동시에 또는 후에 어떠한 대조군 시험도 수행되지 않는 것이 고려된다. 대신에, 각각의 이러한 방법에서, 알츠하이머 질환을 앓고 있는지 또는 그에 대한 소인을 갖는지를 결정하는 것은 (해당되는 경우), 예컨대, 방법의 결과를, 해당되는 경우, 질환 상태 또는 소인과 공지된 상관 관계를 갖는 림프구 응집 파라미터 (예컨대, 250개 세포/μl의 림프구 밀도 및 48시간의 기간에서의 50% 면적)와 비교함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 실시양태
본 발명은 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 림프구-기반 방법을 제공한다. 또한, 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 림프구-기반 방법을 제공한다. 본 방법은 적어도 부분적으로, 해당되는 경우, 대상체의 림프구가 알츠하이머 질환을 진단하거나 알츠하이머 질환에 대한 소인을 결정하기 위해 형태계측 시험에 사용될 수 있다는 놀라운 발견에 기반한다.
구체적으로, 본 발명은, 제1 방법에서, (a) 증후성 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에서 적합한 기저막 매트릭스와 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
이 제1 방법 및 하기에 기재된 제2, 제3 및 제4 방법에서, 림프구는 임의의 유형의 림프구일 수 있다. 바람직하게는, 림프구는 B 림프구이다. 또한, 불멸화되는 B 림프구가 바람직하다.
이 제1 방법 및 하기에 기재된 제2, 제3 및 제4 방법에 사용하기에 적합한 기저막 매트릭스는 다양하고 상업적으로 이용가능하다. 바람직한 실시양태에서, 적합한 기저막 매트릭스는 마트리겔®이다.
이 제1 방법 및 하기에 기재된 제2, 제3 및 제4 방법에서, 림프구 밀도는 필요한 응집을 허용하기에 충분히 높고, 응집이 의미있는 결과를 허용하는 양을 초과하지 않도록 충분히 낮다. 한 실시양태에서, 림프구 밀도는 50개 세포/μl 내지 500개 세포/μl이다. 또 다른 실시양태에서, 림프구 밀도는 50개 세포/μl 내지 100개 세포/μl, 100개 세포/μl 내지 150개 세포/μl, 150개 세포/μl 내지 200개 세포/μl, 200개 세포/μl 내지 250개 세포/μl, 250개 세포/μl 내지 300개 세포/μl, 300개 세포/μl 내지 350개 세포/μl, 350개 세포/μl 내지 400개 세포/μl, 400개 세포/μl 내지 450개 세포/μl, 및 450개 세포/μl 내지 500개 세포/μl이다. 추가의 실시양태에서, 림프구 밀도는 50개 세포/μl, 100개 세포/μl, 150개 세포/μl, 200개 세포/μl, 250개 세포/μl, 300개 세포/μl, 350개 세포/μl, 400개 세포/μl, 450개 세포/μl 또는 500개 세포/μl이다.
이 제1 방법 및 하기에 기재된 제2, 제3 및 제4 방법에서에서, 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간은 필요한 응집을 허용하기에 충분히 길고, 응집이 의미있는 결과를 허용하는 양을 초과하지 않도록 충분히 짧다. 바람직한 실시양태에서, 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간은 30분 내지 48시간이다. 추가의 실시양태에서, 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간은 30분 내지 2시간, 30분 내지 4시간, 30분 내지 8시간, 30분 내지 12시간, 30분 내지 24시간, 2시간 내지 4시간, 2시간 내지 8시간, 2시간 내지 12시간, 2시간 내지 24시간, 2시간 내지 48시간, 4시간 내지 8시간, 4시간 내지 12시간, 4시간 내지 24시간, 4시간 내지 48시간, 8시간 내지 12시간, 8시간 내지 24시간, 8시간 내지 48시간, 12시간 내지 24시간, 12시간 내지 48시간, 24시간 내지 48시간이다.
제1 방법의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 증후성 인간 대상체로부터의 불멸화된 B 림프구를 30분 내지 48시간 동안 50개 세포/μl 내지 500개 세포/μl의 림프구 밀도에서 마트리겔®과 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에서 적합한 기저막 매트릭스와 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 제2 방법, 즉 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
이 제2 방법 및 하기에 기재된 제4 방법에서, 대상체는 인지 장애를 앓고 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 이 장애는 경도 인지 장애이다. 대안적으로, 이 제2 방법 및 하기에 기재된 제4 방법에서, 대상체는 인지적으로 손상되지 않는다.
제2 방법의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 인간 대상체로부터의 불멸화된 B 림프구를 30분 내지 48시간 동안 50개 세포/μl 내지 500개 세포/μl의 림프구 밀도에서 마트리겔®과 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 증후성 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에서 적합한 기저막 매트릭스와 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치가 대상체에서 알츠하이머 질환과 서로 관련되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 제3 방법, 즉 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
이 제3 방법에서, 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계는 응집체 면적 백분율을 측정하는 단계 및 응집체 면적 백분율이 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체에서 예상되는 응집체 면적 백분율과 서로 관련되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
제3 방법의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 증후성 인간 대상체로부터의 불멸화된 B 림프구를 30분 내지 48시간 동안 50개 세포/μl 내지 500개 세포/μl의 림프구 밀도에서 마트리겔®과 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치가 대상체에서 알츠하이머 질환과 서로 관련되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 (a) 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에서 적합한 기저막 매트릭스와 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치가 알츠하이머 질환을 앓기 쉬운 대상체와 서로 관련되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 제4 방법, 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
이 제4 방법에서, 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계는 임의의 적합한 접근법을 통해 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계는 응집체 면적 백분율을 측정하는 단계 및 응집체 면적 백분율이 알츠하이머 질환을 앓기 쉬운 대상체에서 예상되는 응집체 면적 백분율과 서로 관련되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
제4 방법의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 인간 대상체로부터의 불멸화된 B 림프구를 30분 내지 48시간 동안 50개 세포/μl 내지 500개 세포/μl의 림프구 밀도에서 마트리겔®과 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치가 알츠하이머 질환을 앓기 쉬운 대상체와 서로 관련되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 별도의 구획 또는 단일 구획에 (i) 성장 배지 (예컨대, 10% FBS 및 1% PS를 갖는 RPMI 1640 배지) 및 (ii) 기저막 매트릭스 (예컨대, 마트리겔® 또는 3D 매트릭스, 예컨대 콜라겐 또는 라미닌)를 포함하고, 여기서 성장 배지 및 매트릭스는 함께 적합한 조건 하에서 림프구 응집을 허용하는, 본 방법의 임의의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 추가로 응집된 림프구 (예컨대, EBV-불멸화된 B 림프구) 및 적합한 기저막 매트릭스 (예컨대, 마트리겔®)를 포함하는 물질의 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명을 (i) 임의의 비-림프구 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 (ii) 재프로그래밍된 EBV-불멸화된 B 림프구로부터 유래된 임의의 다능성 줄기 세포 (iPSC)에 적용하는 것이 고려된다 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3158714/; 및 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2596471/). 이 실시양태에서, 이러한 세포는 림프구가 본 발명에서 처리되는 것과 같이 필요한 변경을 가하여 처리된다.
또한, 본 진단 방법 각각을, 대상체의 림프구 응집 측정치를 적합한 대조군과 명시적으로 비교하는 단계 없이, 적용하는 것이 고려된다. 즉, 본 발명은 대상체의 림프구 응집 측정치가 알츠하이머 질환을 나타내는 미리 결정된 역치를 충족시키거나 충족시키지 않는 4종의 본 진단 방법 각각의 버전을 제공한다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 것이지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 열거된 특정 실시예가 이후의 청구범위에서 보다 완전하게 기재되는 본 발명을 단지 예시하는 것임을 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1
PBMC 준비. 나트륨 헤파린 (BD 바이오사이언즈 (BD Bioscience), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)을 갖는 BD 진공채혈관 (Vacutainer) CPTTM 세포 준비 튜브에 샘플링된 전혈을 PBS 중에 1:2로 희석하고, 저온 피콜-파크 PLUS (GE 헬스케어 (GE Healthcare), 영국 리틀 찰폰트) 위에 조심스럽게 층을 형성하게 하고, 얼음에 보관한 후, 18-20℃에서 브레이크 없이 900 x g에서 20분 동안 원심분리하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로 이루어진 피콜-파크 PLUS 상단의 세포층을 수집하고, PBS 중에 희석하였다. PBMC를 18 내지 20℃에서 450 x g에서 7분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 5 ml PBS 중에 재현탁시키고, 계수한 후, 18-20℃에서 7분 동안 350 x g에서 원심분리하였다. 마지막으로, 세포를 동결 배지 (열-불활성화된 우태 혈청 (FBS) 중 10% DMSO) (노르딕 바이오랩스 AB (Nordic Biolabs AB), 스웨덴 타바이)에 재현탁시키고, 적어도 3시간 동안 엠알. 프로스티 (Mr. Frosty)TM 냉동 용기 (써모 피셔 (Thermo Fisher))에 -70℃에서 둔 후, 연장된 저장을 위해 액체 질소로 옮겼다.
유동 세포측정. 각각의 개별 세포 샘플에 대해, 5 x 106개의 PBMC를 37℃에서 신속하게 해동시키고, 40 ml의 저온 세척 완충액 (2.5% FBS (라이프 테크놀로지스 엘티디. (Life Technologies Ltd.), 영국 페이즐리) 및 0.1% 아지드화나트륨으로 보충된 PBS)으로 희석하였다. 세포 현탁액을 5분 동안 250 x g에서 원심분리하고, 상청액을 버린 후, 펠렛을 400 ml 세척 완충액 중에 재현탁시켰다. 각각의 샘플을 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 700 (BD 바이오사이언시즈)으로 표지된 적정된 양의 항-CD19로 2℃에서 광-보호된 환경에서 1시간 동안 염색하였다. 샘플을, BD FACSDiva 6.0 소프트웨어 (BD 바이오사이언시즈)에 의해 제어되는, BD LSR II 특별 주문 시스템을 이용하여 분석하였다. 예비 포워드 스캐터 (FSC) 대 사이드 스캐터 (SSC) 게이트를 사용하여 림프구를 식별하고, 샘플 크기에 따라 총 100,000개 이하의 인-게이트 이벤트를 기록하였다. 추가 게이팅 및 분석을 위해 모든 데이터세트를 플루오조 (FlowJo) 7.6.5 (트리스타 인크. (Treestar Inc.), 미국 오레곤주 애쉬랜드)로 이동하였다.
세포를 코리엘 세포 저장소 (Coriell Cell Repository) 사양에 따라, 즉 즉 37℃에서 워터 재킷 CO2 인큐베이터에서 10% FBS 및 1% PS를 갖는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 코닝으로부터의 성장 인자 감소된 (Growth Factor Reduced: GFR) 마트리겔®을 +4℃에서 밤새 해동시키고, 750 μl/웰을 사용하였다. 세포 시딩 전에 37℃에서 30분 인큐베이션을 사용하였다.
실시예 2
알츠하이머 질환에 대한 기존 진단 방법의 부정확성은 치료 개입을 어렵게 했었다. 이는 중요한 신경변성 및 인지 기능장애를 방지하기에 충분히 이른 치료적 개입과 관련하여 특히 사실이다.
본 발명은 알츠하이머 질환을 갖는 것으로 의심되는 환자를 위한 정확한 진단 방법을 제공한다. 이들 방법은 인간 불멸화된 B 림프구의 응집 비율을 정량적으로 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 기초는, 알츠하이머 질환에서 증가하는 림프구 밀도와 상관 관계에 있는 상승되는 시험관내 림프구 응집 (즉, 본원에서 측정된 "바이오 마커")이다.
이 새로운 바이오 마커는 제2의 상이한 바이오마커의 불균형에 기반한 상이한 검정법으로 성공적으로 검증되었으며, 제2의 바이오마커와 완전한 진단 중복을 나타내었다.
본 방법을 사용하여 시험된 림프구는 코리엘 세포 저장소에 기탁된 세포였다. 이들 기탁된 세포의 질환-관련 "가계"는 알츠하이머 환자 (AD) 또는 비-알츠하이머의 치매 환자 (비-ADD) 및 비-치매 연령-일치된 대조군 (AC)으로 부검을 통해 검증되고/되거나 유전적으로 확인되었다.
본 방법의 정확성을 고려할 때, 이들은 알츠하이머 질환을 진단하여 시기적절하게 치료적 개입을 허용하는데 유용하다.
Claims (34)
- (a) 증후성 인간 대상체로부터의 B 림프구를 125개 세포/μl 내지 250개 세포/μl의 림프구 밀도에서 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에 적합한 기저막 매트릭스와 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는지의 여부에 연관된 정보를 수득하는 단계를 포함하는, 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서, B 림프구가 불멸화된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 적합한 기저막 매트릭스가 마트리겔®인 방법.
- 제1항에 있어서, 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간이 30분 내지 48시간인 방법.
- (a) 증후성 인간 대상체로부터의 불멸화된 B 림프구를 30분 내지 48시간 동안 125개 세포/μl 내지 250개 세포/μl의 림프구 밀도에서 마트리겔®과 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는지의 여부에 연관된 정보를 수득하는 단계를 포함하는, 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
- (a) 증후성 인간 대상체로부터의 B 림프구를 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에서 적합한 기저막 매트릭스와 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치가 대상체에서 알츠하이머 질환과 서로 관련되는지의 여부에 연관된 정보를 수득하는 단계를 포함하며, 림프구 밀도가 125개 세포/μl 내지 250개 세포/μl인, 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제6항에 있어서, 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계가 응집체 면적 백분율을 측정하는 단계 및 응집체 면적 백분율이 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체에서 예상되는 응집체 면적 백분율과 서로 관련되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, B 림프구가 불멸화된 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 적합한 기저막 매트릭스가 마트리겔®인 방법.
- 제6항에 있어서, 림프구가 응집되도록 하기에 충분한 기간이 30분 내지 48시간인 방법.
- (a) 증후성 인간 대상체로부터의 불멸화된 B 림프구를 2시간 내지 48시간 동안 125개 세포/μl 내지 250개 세포/μl의 림프구 밀도에서 마트리겔®과 함께 배양하는 단계; (b) 생성된 림프구 응집을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치가 대상체에서 알츠하이머 질환과 서로 관련되는지의 여부에 연관된 정보를 수득하는 단계를 포함하는, 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
E601 | Decision to refuse application | ||
X091 | Application refused [patent] | ||
AMND | Amendment | ||
X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
GRNT | Written decision to grant |