KR20090052483A

KR20090052483A - 심혈관 질환 진단용 바이오마커

Info

Publication number: KR20090052483A
Application number: KR1020070119003A
Authority: KR
Inventors: 김찬화; 유현석; 김현정; 김미령; 김판겸
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2007-11-21
Filing date: 2007-11-21
Publication date: 2009-05-26
Also published as: KR101040321B1

Abstract

본 발명은 혈액을 이용한 심혈관 질환의 진단용 마커로 사용 될 수 있는 단백질에 관한 것으로, 구체적으로는 정상인 혈액 보다 심혈관 질환 환자의 혈액에서 그 발현양이 감소 또는 증가되는 바이오마커 단백질과 이를 이용한 심혈관 질환의 진단 키트에 관한 것이다. 또한 그 발현양이 증가 또는 감소되는 단백질은 심혈관 질환의 치료제로서도 그 가치가 인정되는 바이다.

본 발명에 따르면, 사람의 혈액으로부터 심혈관 질환을 진단하여 그 증상의 경도를 파악할 수도 있다. 또한 본 발병의 바이오마커 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 immunoassay 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 심혈관 질환의 진단 및 진행정도를 판단하고, 치료용 목적으로는 신약 개발에 사용될 수 있다.

심혈관 질환, 바이오마커, 항체, 진단키트

Description

심혈관 질환 진단용 바이오마커 {Bio-marker for diagnosing Cardiovascular disease}

본 발명은 심혈관 질환 환자가 병이 진행됨에 따라 나타나는 단백질에 관한 것으로서, 상세하게는 심혈관 질환 환자의 혈액에서 더 많이 혹은 적게 발현되는 바이오마커 단백질과 이를 이용한 심혈관 질환의 조기진단을 위한 진단키트에 관한 것이다.

심혈관 질환은 심장질환과 혈관질환을 포함한다. 구체적인 병명으로는 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 판막질환, 선천성 심장질환, 심근증, 심낭질환 등이 중요한 심장질환이며, 혈관질환에는 뇌졸중, 말초혈관질환, 동맥류 등이 있다. 심장질환 중에 중요한 부분을 차지하는 관상동맥 질환은 대개 동맥경화에 의해서 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥이 막히거나, 좁아져서 발생한다. 심근경색증이나 협심증이 이에 해당한다. 관상동맥질환은 우리나라에서 지난 30여 년 동안에 급격히 증가하여왔다.

일반적으로는 심근경색, 뇌졸중, 협심증, 고혈압, 심부전등을 말할 수 있고, 심근경색증은 심장근육에 혈액을 공급하는 혈관이 막혀서 심장 근육조직이 죽게 되는 질병을 말한다. 심근경색 이라는 말은 심장의 근육이 산소부족으로 죽어간다는 의미가 된다. 이러한 산소부족은 심장에 산소를 공급하는 혈관(관상동맥)이 동맥경화로 좁아지거나 혈전이 생성되어 발생하는 경우가 많으며 심근경색증이 일어나면 환자는 심한 가슴의 통증, 호흡곤란 등을 느끼게 된다.

뇌졸중은 뇌에 혈액을 공급하는 동맥에 장애가 생겨 정상적인 혈액공급이 이루어지지 못해 뇌 기능이 갑작스럽게 손실되는 것으로 흔히 ‘중풍'이라고도 한다. 뇌의 일시적 혹은 지속적인 혈액공급 부족이나 출혈로 인하여 발생하며 뇌가 손상됨에 따라 언어장애, 운동장애 등 뇌의 손상된 부위에 의해 조절되는 신체 기능에 이상이 생긴다. 뇌졸중은 크게 뇌의 혈관이 막혀서 특정부위에 혈액순환이 안 되어 나타나는 허혈성 뇌졸중(뇌경색)과 뇌혈관이 터져 발생하는 출혈성 뇌졸중으로 분류할 수 있다.

협심증은 심장 근육이 일시적으로 충분한 혈액을 공급받지 못하여 흉부압박감 또는 흉통을 느끼는 것으로 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥 이 부분적으로 좁아져 발생하는 관상동맥질환 의 하나이다. 안정협심증, 불안정협심증, 이형 협심증(프린쯔메탈 협심증) 등으로 나눈다. 심장의 혈관이 막혀서 심장 근육이 죽게 되는 심근경색과는 달리 협심증의 통증은 휴식을 취하거나 협심증 약을 복용하면 수분 내에 감소된다. 협심증은 심장 근육에 충분한 양의 혈액이 공급되지 못하여 발생하는 것으로 가장 흔한 원인은 동맥경화증이다.

고혈압은 혈압이 올라가서 내려가지 않고 높은 상태가 계속되는 것이다. 혈압은 여러 가지 요인에 따라서 상당히 변동이 있을 수 있지만 고혈압이라고 하면 항상 높은 상태가 유지될 때를 말한다. 고혈압을 치료해야하는 이유는 고혈압을 치료 안해두면 고혈압에 의한 여러 가지 합병증 즉 뇌졸중, 심부전, 협심증, 급성심근경색증 등의 관상동맥질환, 신부전등이 올 수 있기 때문이다.

심장의 펌프작용이 저하되어 필요한 양의 혈액을 신체의 다른 기관에 내보내지 못하게 된 상태를 심부전 이라 한다. 많은 심장질환들이 심장의 수축능력과 이완능력에 장애를 일으켜 심부전의 원인이 될 수 있다.

심혈관 질환은 분류에 따라 진단하는 법이 다르지만, 일반적으로 심장의 전기적인 리듬을 기록하는 심전도검사, 전산화단층촬영(CT), 핵자기공명촬영(MRI), 소량의 방사능 동위원소를 주입하여 혈액의 흐름, 심장 또는 뇌의 대사에 대한 정밀한 3차원 사진을 얻을 수 있는 양전자방출단층촬영(PET), 초음파를 이용한 혈관이 좁아진 정도를 파악하는 혈류검사, 길고 가늘고 유연한 튜브(카테터)를 오금부위 또는 팔에 있는 동맥을 통하여 삽입하여 심장의 관상동맥으로 이동시킨 후 조영제나 염료를 주입하여 X선 촬영함으로써 관상동맥의 좁아진 부위를 알아내는 관상동맥혈관 조영술과 혈액검사 방법이 있다. 혈액검사는 심근경색이나 심혈관 질환이 일어나 심장근육의 괴사가 나타나면 죽은 세포에서 효소가 혈액 중으로 흘러나오게 된다. 혈액의 이러한 효소의 양을 측정하는 것으로 크레아틴키나아제(CK-MB), AST, LDH가 심혈관 질환이 일어날 경우 상승된다. 이러한 효소치의 상승은 다른 질환에서도 나타날 수 있으므로 다른 질병 표지자와의 연관성이 높아 직접적인 심혈관 질 환의 진행정도를 판정하기가 어려운 상태이다.

현재 심혈관 질환의 진행정도를 판단하는 혈액에서의 바이오마커들은 한정적이다. 따라서 임상적으로 특이성과 민감도가 높은 신규 진단마커와 아울러 이를 검출할 수 있는 단일클론항체를 개발할 경우, 심혈관 질환의 조기진단 및 진행정도를 미리 예측 할 수 있는 형태의 키트 개발을 도모할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 2차원 전기영동기술을 이용하여 정상인의 혈액에서 보다 심혈관 질환 환자의 혈액에서 감소 및 증가하는 바이오마커 단백질들을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 심혈관 질환의 조기진단을 위한 새로운 바이오마커 또는 그 면역원성 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커 단백질에 대한 항체 및 이를 이용한 진단키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 정상인의 혈액 보다 심혈관 질환 환자의 혈액에서 발현이 상대적으로 감소하는 하기 군에서 선택된 단백질을 포함하는 심혈관 질환 진단용 바이오마커를 제공한다:

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 51-53 KD의 분자량 및 5.6-7.6의 pI를 갖는 헤모펙신 전구체(Hemopexin precusor);

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 5.6-7.6의 pI를 갖는 헵토글로빈(Haptoglobin);

서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고 39-41 KD의 분자량 및 4.9-6.9의 pI를 갖는 알파-1-마이크로글로빈(Alpha-1-microglobulin);

서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.2-6.2의 pI를 갖는 씨-타입 렉틴 도메인 패밀리 3(C-type lectin domain family 3);

서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고 20-22 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI를 갖는 콤플렉스-형성-당단백질 에이치 씨(Complex-forming glycoprotein HC);

서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고 45-47 KD의 분자량 및 5.4-7.4의 pI를 갖는 헵토글로빈 전구체(Haptoglobin precursor);

서열번호 7의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.2-6.2의 pI를 갖는 보체 요소 아이 라이트 체인(Complement factor I light chain);

서열번호 8의 아미노산 서열을 가지고 102-104 KD의 분자량 및 5.5-7.5의 pI를 갖는 인터-알파-트립신 저해제 패밀리 헤비 체인-관련된 단백질(Inter-alpha-trypsin inhibitor family heavy chain-related protein (IHRP));

서열번호 9의 아미노산 서열을 가지고 24-26 KD의 분자량 및 5.1-7.1의 pI를 갖는 프리-세럼 아밀로이드 피 컴포넌트(Pre-serum amyloid P component);

서열번호 10의 아미노산 서열을 가지고 15-17 KD의 분자량 및 4.5-6.5의 pI를 갖는 프리알부민(Prealbumin);

서열번호 11의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 6.8-8.8의 pI를 갖는 보체 요소 에이치 관련된 1(Complement factor H-related 1);

서열번호 12의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 5.4-7.4의 pI를 갖는 헵토글로빈-관련된 단밸질 전구체(Haptoglobin-related protein precursor);

서열번호 13의 아미노산 서열을 가지고 47-49 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI를 갖는 보체요소 씨4비3(Complement component C4B3); 및

서열번호 14의 아미노산 서열을 가지고 45-47 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI 를 갖는 피그먼트 상피의 차이나는 요인(Pigment epithelial-differentiating factor).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 정상인의 혈액 보다 심혈관 질환 환자의 혈액에서 상대적으로 발현이 증가하는 하기 군에서 선택된 단백질을 포함하는 심혈관 질환 진단용 바이오마커를 제공한다:

서열번호 15의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI를 갖는 레티놀 부착 단백질 4(Retinol Binding Protein 4);

서열번호 16의 아미노산 서열을 가지고 28-30 KD의 분자량 및 4.5-6.5의 pI를 갖는 프로아포-에이-아이 단백질(Proapo-A-I protein);

서열번호 17의 아미노산 서열을 가지고 15-17 KD의 분자량 및 4.5-6.5의 pI를 갖는 트랜스티레틴(Transthyretin); 및

서열번호 18의 아미노산 서열을 가지고 97-99 KD의 분자량 및 4.3-6.3의 pI를 갖는 셀롤로플라즈민(Ceruloplasmin).

본 발명에서, 상기 바이오마커는 상기 분자량 및 pI를 가지는 한 상기 서열번호를 가지는 전장 단백질의 일부일 수 있으며, 이 경우 도 3a 내지 3r의 MS/MS 결과에서 빨간색으로 표시된 트립신 분해된 펩타이드 서열들을 가진다. 상기 트립신 분해된 펩타이드란 MALDI-TOF 또는 MS/MS 분석을 위해 트립신(trypsin)으로 분해된 단백질의 펩타이드를 의미한다. 또한 상기 분자량과 pI는 2차원 전기영동(Two-dimentional electrophoresis) 상에서 확인된 값으로서 일반적으로 허용되는 실험상의 오차범위를 포함한다.

본 발명에서, 심혈관 질환(Cardiovascular Disease, CVD)은 심장질환과 혈관질환을 의미하는데, 구체적인 예로 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 판막질환, 선천성 심장질환, 심근증, 심낭질환 등의 심장질환과 뇌졸중, 말초혈관질환, 동맥류 등의 혈관진환을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 진단제를 제공한다.

본 발명에서, 상기 면역원성 단편이란 본 발명의 바이오 마커 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 바이오 마커 단백질의 단편을 의미한다.

본 발명의 심혈관 질환 진단제에서, 상기 항체는 폴리클로날 항체일 수도 있으나, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되면, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리·정제한다.

상기 모노클로날 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성 기술(Koeher and Milstein (1975) Nature, 256:495))에 의해 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 20 ㎍을 얻어서 Balb/C 쥐에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화 시킨다. 그 후에 쥐에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, 엘라이져(ELISA)방법을 사용하여 원하는 모노클노날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 모노클로날 항체를 분리 정제한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 진단키트를 제공한다.

본 발명의 진단키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조되며, 전형적으로 동결건조형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함한다. 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.

본 발명의 단일클론항체는 immunoassay 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 다양하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 심혈관 질환 검출 스펙트럼을 갖는 단백질 칩 개발에도 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 정상인 혈액보다 심혈관 질환 환자의 혈액에서 감소하는 하기 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 심혈 관 질환 치료 및 예방용 조성물을 제공한다:

서열번호 14의 아미노산 서열을 가지고 45-47 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI를 갖는 피그먼트 상피의 차이나는 요인(Pigment epithelial-differentiating factor).

본 발명의 바이오마커 단백질들은 심혈관 질환 환자의 혈액에서 부족한 성분들이므로 이를 환자의 혈액에 보충하여 주면 심혈관 질환의 치료 및 예방에 효과를 발휘할 수 있을 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 주사제 등의 제형으로 제조되어 정맥주사 등으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준으로 1일 0.01-1mg의 단백질을 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 시료준비 (Sample preparation)

고려대학교 구로병원에서 심혈관 질환의 공복 시 혈당 수치와 혈관의 협착 정도를 기준으로 나누어서 실험을 하였다. 심혈관 질환 환자의 수는 19명, 비교를 위한 정상군은 30명으로 하였다.

병원에서 얻은 혈청은 혈액 중에 가장 많이 차지하고 있는 단백질로 알려진 알부민 및 6가지 풍부한 양으로 존재하는 단백질 예컨대, albumin, transferrin, IgG, IgA, haptoglobin, antitrysin 등을 제거하는 칼럼(Agilent Multiple Affinity Removal Column; Agilent Technologies, Wilmington, DE, 미국)을 사용하였다. 각각의 시료는 완충액 A(완충액A[5185-5987], 조성: phosphates and 0.02% sodium azide, pH 7.4 in water, Agilent Technologies사)로 5배 희석하여 0.22 um의 spin 필터에 놓고 원심분리기(Union-55R centrifuge, 한일과학, 한국)로 4℃, 16,000× g에서 1시간 동안 돌려, 칼럼 상층부에는 부산물들이 남게 하고 하층부에는 부산물들이 제거된 용액만이 남게 하였다. 하층부의 용액을 4.6× 100 mm 면역 친화성 칼럼에 주입하여 분당 0.5 ml의 유속으로 실시하여 흘러나온 flow-through 분획을 얻었다. 이 때 적게 존재하는 단백질들은 약 3분경에 흘러나오는 분획에서 얻었고, 약 13분경에 6종의 거대 단백질들은 면역친화성 칼럼에 결합하였다. 이와 같은 방법으로 모든 시료를 처리하여, 각각의 시료는 분자량 3 kDa 이하를 제거하는 칼럼(Molecular cut-off column; Amicon, Millipore Corp., 미국)을 사용하여 HPLC 분획물에 존재하는 염과 지질을 제거하였다. 이렇게 농축된 시료에 5배의 차가운 아세톤을 넣고 -20℃에서 하루 보관하였다. -20℃에서 침전된 단백질은 원심분리기(Union-55R centrifuge, 한일과학, 한국)로 4℃, 13,000 rpm에서 10분 동안 돌려, 여분의 지질이 제거하였고 단백질만이 남겼다. 이러한 침전물을 공기 중에서 말리고 시료 완충액을 넣어 단백질 정량을 하여 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 시료 완충액의 조성은 다음과 같다: 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 40 mM Tris-Cl(pH 8.5), 65 mM DTT, 1 mM EDTA, 1% IPG buffer.

실시예 2: 이차원 전기영동(Two-Dimensional Electrophoresis)

가. 일차원 전기영동(Isoelectroforcusing, IEF)

시료 완충액으로 처리된 시료의 단백질 양을 60 ㎍으로 하여 일차원 전기영동을 실시하였다. 시료의 총 부피가 450 ㎕가 되게 rehydration 완충액(8 M urea, 2% CHAPS, 13mM DTT, 1 % IPG buffer)을 섞어 일차원 전기영동을 할 수 있는 24 ㎝ strip holder에 넣은 뒤, pH 4-7 범위의 Drystrip(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, 스웨덴)을 strip holder에 장착하였다. 20℃에서 5시간가량 strip을 rehydration 완충액으로 불려준 뒤, 다음과 같은 조건으로 일차원 전기영동을 수행하였다: 80V 5시간, 200V 30분, 500V 1분, 8000V 45분, 8000V 142000 Vhrs, 17시간 45분, 총 146 KVhr. 일차원 전기영동은 IPGphore(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, 스웨덴)로 수행하였다.

나. 이차원 전기영동

(Sodoum Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE)

일차원 전기영동이 끝난 strip을 이차원 전기영동을 하기 위해, 일차원 전기영동이 끝난 strip을 cap tube에 넣고 일차 평형화 용액(6 M urea, 50 mM Tris-cl(pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT) 10 ㎖에 15분간 반응시킨 후 버리고, 다시 이차 평형화 용액(6 M urea, 50 mM Tris-cl(pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1.5% IAA) 10 ㎖을 넣고 10분간 재반응 시켰다. 11~16%로 만들어진 Polyacylamide 젤(25× 30㎝) 위에 반응이 끝난 strip을 장착하고, 0.5% 아가로즈로 sealing하였다. 이차원 전기영동은 Ettan Dalt(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, 스웨덴)에 전기영동 완충액(24 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS)을 넣고 전기영동을 실시하였다. 전기영동 조건은 다음과 같다: 70 V 1시간, 180 V 2시간, 360 V 2시간, 430 V 3시간 30분.

다. 염색(scanning)

이차원 전기영동이 끝난 뒤 젤을 가시화시키기 위해 은(silver) 염색을 수행 하였다. silver 염색과정은 다음과 같다. 50% methanol, 12% acetic acid로 이루어진 용액에 3시간가량 반응시켜 고정화(Fixation)한 후, 50% ethanol로 20분간 3회 세척(Washing)하였다. 이를 다시 0.2% Sodium thiosulfate 용액으로 1분간 반응시켜 민감화(Sensitizing)한 후, 증류수(Distilled Water, DW)로 세척하였다. 여기에 0.1% Silver nitrate, 0.075% formaldehyde(37%) 용액으로 20분간 반응시켜 반응화(Improving)한 후, 증류수로 다시 세척하였다. 이를 다시, 미리 차게 해둔 6% Sodium carbonate, 0.075% formaldehyde(37%) 용액으로 약 7분간 반응시켜 가시화(Developing)하였고, 50% methanol 및 12% acetic acid 용액으로 처리하여 반응을 정지시켰다.

라. 이미지 분석(Image Analysis)

실험한 젤들을 분석하기 위해, 먼저 ImageScanner(Amersham Pharmacia Bio-tech, Uppsala, 스웨덴)로 스캔하였다. 단백질 발현이 차이나는 점들을 분석하기 위해 이차원 전기영동 분석 전용 프로그램인 ImageMaster(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, 스웨덴)로 분석을 수행하였다.

실시예 3: 질량분석기를 이용한 단백질 동정(ESI-Q-TOF/MS/MS Analysis)

이미지 분석프로그램으로 찾아낸 점들을 동정하기 위해, 이차원 전기영동이 끝난 젤로부터 점(spot)들을 오려냈다. 먼저 silver를 없애기 위해 30 mM Potassium Ferricyanide와 100 mM Sodium Thiosulfate 용액이 1:1로 섞인 탈염색 용액 100 ㎕을 젤 조각에 5분간 처리하였다. 이후 400 ㎕의 물로 3번 세척하였다. 다시 200 mM ammonium bicarbonate로 반응시킨 뒤 물로 세척하였다. Acetonitrile을 넣어 젤이 하얗게 변할 때까지 탈수시킨 후, 이 젤을 진공 원심분리기(Speed vacuum centrifuge)에 넣어서 젤로부터 용액을 완전히 없앴다. 건조된 젤 조각은 0.2 ㎍의 트립신(trypsin; Promega)이 들어있는 50 mM의 ammonium bicarbonate 20 ㎕로 얼음 상에서 45분간 함수시켰다. 반응용액을 제거한 후, 50 mM의 ammonium bicarbonate 30 ㎕를 넣은 후 37℃로 밤새 반응시켰다. 그 펩타이드 용액은 C18 nano column(home made)를 이용하여 염분을 제거하였다.

Custom-made chromatographic columns은 질량분석 이전에 펩타이드 염분제거와 농축용으로 사용되었다. Poros reverse R2 material(20-30 um bead size, PerSeptive Biosystems)의 100-300 nL로 구성된 칼럼을 단단히 조여진 GELoader tip(Eppendorp, hamburg, 독일)에 팩킹하였다. 10 mL syringe는 공기압으로 칼럼을 통해 물질을 통과시켰다. 펩타이드 용액 30 ㎕는 5% formic acid 용액 내에서 희석되어 칼럼 안으로 이동되었다. 그리고 30 ㎕는 5% formic acid 용액으로 세척하였다. MS/MS분석을 위해 펩타이드는 borosilicate nanoelectrospray needle(Micromass, Manchester, UK)에 50% methnol/49% H₂0/1% formic acid와 섞여 용출시켰다.

MS/MS는 Q-TOF2 mass spectrometer(Micromass, Mancheser, 영국)상에서 nano-ESI로 수행하였다. 그 소스(source)온도는 80℃였다. 안정된 flow rate(10-30 nL/min)를 생성하기 위해 0-5 psi의 nitrogen back-pressure와 혼합한 이온 소스(ion source)에서 borosilicate nanoelectrospray needles(EconoTipTM, New Objective, 미국)에 1 kV의 전압을 적용하였다. 그 원뿔(cone) 전류는 40 V이다. Quardrupole analyser는 hexapole collision cell에서 분절화를 하기 위해 전구 이온(precursor ion)을 선택하는데 사용되었다. 충돌가스(collision gas)는 6-7 x 10-5 mbar의 아르곤(Ar)이며 출동 에너지(collision energy)는 20-30 V이다. 생성 이온은 반사기(reflector)와 작은 통로판 검사기(micro channel plate detector), 그리고 time-to-digital 변환기에 맞추어지는 TOF 분석기를 이용하여 분석되었다. 그 자료는 Mass Lynx Widows NT PC system을 이용하여 분석되었다.

단백질을 동정하기 위해 모든 MS/MS 스펙트럼은 MASCOT search program (www.matrixscience.com)을 이용하여 NCBInr 데이터베이스에서 단백질 서열을 조사하였다.

상기와 같이 심혈관 질환의 진행시 다르게 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 ESI-Q-TOF/MS/MS를 이용하여 확인하였으며, 도 3a 내지 3r에 나타내었다.

실시예 4: Western blotting

가. SDS-PAGE 전기영동

심혈관 질환 환자의 혈청 단백질 40 ㎍을 10% SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 혈청시료 5-8 ㎕(단백질 40 ㎍)에 SDS-PAGE loading 완충액 (60 mM Tris-Cl, 2% SDS, 25% Glycerol, 14.4 mM 2-Mercaptoethnol, 0.1% Bromophenol Blue, pH 6.8) 5 ㎕를 섞어 mini gel (6× 8㎝)에서 분자량별(separating gel상에서 100 V로 로딩)로 분리하였다. 이 때 사용한 running 완충액의 조성은 0.025 M Tris-Cl, 0.192 M Glycine, 1% SDS(pH 8.3)이다.

나. Blotting

SDS-PAGE가 끝난 뒤 gel의 단백질을 Semi-dry 형태의 transfer kit(GE Healthcare)을 이용하여 NitroCellulose 막으로 옮겨(transfer), 45 mA에서 1시간 30분 동안 실시하였다.

다. 항체반응

Retinol binding protein 4(RBP4)를 대상으로 하여 실시하였다. Membrane을 5% w/v nonfat dry milk로 실온에서 1시간 30분 동안 블로킹(blocking)시켰다. 일차 항체로는 Retinol binding protein 4를 사용하였고, 이 때 Retinol binding protein 4는 다클론항체(polyclonal antibody)이다. Retinol binding protein 4의 antibody를 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 일차항체의 희석농도는 1/2000으로 하였다. T-TBS(0.1%, Tris-buffered saline-tween 20)로 세척한 후에 이차 항체로 실온에서 1시간 반응시켰다. 이차항체는 anti-rabbit을 사용하였고, 희석농도는 anti-rabbit은 1/10,000 이었다. 이차항체 반응 후에 T-TBS로 세척하고 난 뒤, ECL (Pierce Biotechnology, Inc., 미국)로 가시화 시켰다.

실시예 5: ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 시험법

정상인 및 심혈관 질환 환자, 총 66명의 혈청샘플 및 Retino binding protein 4 표준물질 100 μl를 각 웰(well)에 넣는다. 이 때 기준물질의 단백질 농도는 300, 150, 75, 37.5, 18.75, 9.4, 4.7 ng/ml로 하여 연속 희석하였다. 뚜껑을 덮고 실온에서 1시간 동안 반응시켜 다클론 항체가 붙어있는 플레이트(plate)에 항원을 붙였다. 1시간 후 플레이트를 비운 뒤 세정완충용액으로 세 번 세척하고, 희석된 이차 항체 anti-Retinol binding protein 4 용액 100 μl을 각 웰에 넣었다. 그 다음 뚜껑을 잘 덮어 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후 플레이트를 비운 뒤 세정완충용액으로 다섯 번 세척하고, Streptavidin-PAL 용액 100 μl을 각 웰에 넣었다. 그 다음 뚜껑을 잘 덮어 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 20분 동안 섞은 뒤 플레이트를 비우고 세정완충용액으로 다섯 번 세척하였다. 기질반응용액 pNPP 100 μl을 각 웰에 넣은 다음 뚜껑을 잘 덮어 37℃에서 표준물질농도가 300 ng/ml인 흡광도가 1.5-2.0 units에 이를 정도(약 20분)로 반응시켜 색깔 변화를 유도하였고, 여기에 50 μl의 반응 정지용액을 각각의 웰에 넣고 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 광흡수도를 측정하였다. 표준물질의 농도로 구해진 표준곡선을 이용하여 각 혈청샘플에 존재하는 Retinol binding protein 4의 양을 구하였다.

상기 이차원 전기영동실험을 수행한 결과, 심혈관 질환 환자의 혈청에서 새롭게 발현되거나 발현양이 감소 또는 증가하는 단백질들이 동정되었다.

1. 심혈관 질환 환자의 혈청에서 발현되는 단백질

심혈관 질환 환자군을 대상으로 전기영동을 수행한 결과 15개의 발현이 감소한 단백질(# 3, # 15, # 18, # 28, # 84, # 125, # 132, # 153, # 162, # 196, # 228, # 232, # 259, # 300, # 3182)과 4개의 증가하는 단백질(# 66, # 69, # 74, # 104)을 찾을 수 있었다(도 1a). 발현이 감소한 단백질은 비교를 위한 정상군의 단백질보다 유의확률 0.05를 만족하는 수준에서 약 45% 이상 감소하였으며, 증가한 단백질은 유의확률 0.05를 만족하는 수준에서 약 100% 이상 증가하였다. 또한, ESI-Q-TOF를 수행하여 심혈관 질환이 진행시 발현이 감소 또는 증가하는 단백질을 하기 표 1에서와 같이 동정하였다.

[표 1]. 심혈관 질환 환자의 혈청에서 발현되는 단백질

2. 단백질의 아미노산 서열의 결정

상기와 같이 심혈관 질환의 진행시 다르게 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 ESI-Q-TOF/MS/MS를 이용하여 동정하여 도 3a 내지 3r의 결과를 얻었다. 도면에서 빨간색은 매치된 트립신 분해된 펩타이드 서열을 나타낸다. 이들 단백질의 아미노산 서열은 NCBInr 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm,nih.gov/)를 서치하여 헤모펙신 전구체(Hemopexin precusor)(서열번호 1), 헵토글로빈(Haptoglobin)(서열번호 2), 알파-1-마이크로글로빈(Alpha-1-microglobulin)(서열번호 3), 씨-타입 렉틴 도메인 패밀리 3(C-type lectin domain family 3)(서열번호 4), 콤플렉스-형성-당단 백질 에이치 씨(Complex-forming glycoprotein HC)(서열번호 5), 헵토글로빈 전구체(Haptoglobin precursor)(서열번호 6), 보체 요소 아이 라이트 체인(Complement factor I light chain)(서열번호 7), 인터-알파-트립신 저해제 패밀리 헤비 체인-관련된 단백질(Inter-alpha-trypsin inhibitor family heavy chain-related protein (IHRP)(서열번호 8), 프리-세럼 아밀로이드 피 컴포넌트(Pre-serum amyloid P component)(서열번호 9), 프리알부민(Prealbumin)(서열번호 10), 보체 요소 에이치 관련된 1(Complement factor H-related 1)(서열번호 11), 헵토글로빈-관련된 단밸질 전구체(Haptoglobin-related protein precursor)(서열번호 12), 보체요소 씨4비3(Complement component C4B3)(서열번호 13), 피그먼트 상피의 차이나는 요인(Pigment epithelial-differentiating factor)(서열번호 14), 레티놀 부착 단백질 4(Retinol Binding Protein 4)(서열번호 15), 프로아포-에이-아이 단백질(Proapo-A-I protein)(서열번호 16), 트랜스티레틴(Transthyretin)(서열번호 17), 및 셀롤로플라즈민(Ceruloplasmin)(서열번호 18) 서열을 가짐을 확인하였다.

하기 표 2 및 표 3은 심혈관 질환 환자에서 다르게 발현하는 단백질들의 트립신 분해된 펩타이드 서열을 나타낸다.

[표 2]. 발현이 감소한 단백질의 트립신 분해된 펩타이드 서열

[표 3]. 발현이 증가한 단백질의 트립신 분해된 펩타이드 서열

3. Western blotting 및 ELISA 시험결과

상기 발현이 변화된 단백질 등 중 심혈관 질환 환자의 혈액에서 동정된 단백질인 Retinol binding protein 4(RBP4)를 western blot을 한 실험 결과를 도 4a에 나타내고, 그 상대적인 강도를 도 4b에 나타내었다. 또한, 심혈관 질환 환자의 혈액에서 동정된 단백질인 Ceruloplasmin을 Western blot을 한 실험 결과를 도 6a에 나타내고, 그 상대적인 강도를 도 6b에 나타내었다. 결과에서 보는 바와 같이, 정상인 보다 심혈관 질환 환자에서 RBP4 및 Ceruloplasmin의 양이 증가하였다. 이러한 결과는 2차 전기영동의 결과와 같은 결과를 나타내었다. 도 5는 정상인 및 심혈관 질환 환자, 총 66명의 혈액으로 RBP4를 ELISA한 실험 결과이며, 2차 전기영동의 결과 및 western blot을 한 결과와 마찬가지로 심혈관 질환 환자에서 증가하였다. 이것으로 보아 RBP4 및 Ceruloplasmin는 심혈관 질환의 진단에 매우 유용할 것으로 생각되며, 또한 심혈관 질환 치료 및 예방용 조성물로서의 가능성을 나타내는 것이다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 결과로 얻어진 심혈관 질환에서 발현이 감소한 단백질 15개와 발현이 증가한 단백질 4개는 심혈관 질환의 조기진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있다. 본 발명의 바이오마커 단백질은 심혈관 질환 환자의 혈액에서 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오마커 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 심혈관 질환의 조기진단을 위한 immunoassay 키트에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 심혈관 질환 조기진단을 위한 검출 스펙트럼을 갖는 단백질 칩 개발에 이용될 수도 있다.

도 1은 정상인 혈액에서 보다 심혈관 질환 환자의 혈액에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이이다.

도 2는 도 1에서 나타난 단백질들을 상세하게 보여주는 확대 이미지이다. 여기서, Healthy는 정상인, CVD는 심혈관 질환(Cardiovascular Disease) 환자를 나타낸다.

도 3a 내지 3r은 각각 헤모펙신 전구체, 헵토글로빈, 알파-1-마이크로글로빈, 씨-타입 렉틴 도메인 패밀리 3, 콤플렉스-형성-당단백질 에이치 씨, 헵토글로빈 전구체, 보체 요소 아이 라이트 체인, 인터-알파-트립신 저해제 패밀리 헤비 체인-관련된 단백질, 프리-세럼 아밀로이드 피 컴포넌트, 프리알부민, 보체 요소 에이치 관련된 1, 헵토글로빈-관련된 단밸질 전구체, 보체요소 씨4비3, 피그먼트 상피의 차이나는 요인, 레티놀 부착 단백질 4, 프로아포-에이-아이 단백질, 트랜스티레틴, 및 셀롤로플라즈민의 ESI-Q-TOF/MS/MS 결과이다.

도 4a는 정상인과 심혈관 질환 환자의 혈액에서 동정된 단백질인 Retinol binding protein 4를 Western blot 결과이다.

도 4b는 도 4a의 상대적인 강도를 나타낸 결과이다.

도 5는 정상인 47명 및 심혈관 질환 환자 19명의 혈액으로 Retinol binding protein 4 를 ELISA를 한 실험 결과이다.

도 6a는 정상인과 심혈관 질환 환자의 혈액에서 동정된 단백질인 Ceruloplasmin을 Western blot 결과이다.

도 6b는 도 6a의 상대적인 강도를 나타낸 결과이다.

<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Bio-marker for diagnosing Cardiovascular disease <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Arg Val Leu Gly Ala Pro Val Ala Leu Gly Leu Trp Ser Leu Cys 1 5 10 15 Trp Ser Leu Ala Ile Ala Thr Pro Leu Pro Pro Thr Ser Ala His Gly 20 25 30 Asn Val Ala Glu Gly Glu Thr Lys Pro Asp Pro Asp Val Thr Glu Arg 35 40 45 Cys Ser Asp Gly Trp Ser Phe Asp Ala Thr Thr Leu Asp Asp Asn Gly 50 55 60 Thr Met Leu Phe Phe Lys Gly Glu Phe Val Trp Lys Ser His Lys Trp 65 70 75 80 Asp Arg Glu Leu Ile Ser Glu Arg Trp Lys Asn Phe Pro Ser Pro Val 85 90 95 Asp Ala Ala Phe Arg Gln Gly His Asn Ser Val Phe Leu Ile Lys Gly 100 105 110 Asp Lys Val Trp Val Tyr Pro Pro Glu Lys Lys Glu Lys Gly Tyr Pro 115 120 125 Lys Leu Leu Gln Asp Glu Phe Pro Gly Ile Pro Ser Pro Leu Asp Ala 130 135 140 Ala Val Glu Cys His Arg Gly Glu Cys Gln Ala Glu Gly Val Leu Phe 145 150 155 160 Phe Gln Gly Asp Arg Glu Trp Phe Trp Asp Leu Ala Thr Gly Thr Met 165 170 175 Lys Glu Arg Ser Trp Pro Ala Val Gly Asn Cys Ser Ser Ala Leu Arg 180 185 190 Trp Leu Gly Arg Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Asn Gln Phe Leu Arg Phe 195 200 205 Asp Pro Val Arg Gly Glu Val Pro Pro Arg Tyr Pro Arg Asp Val Arg 210 215 220 Asp Tyr Phe Met Pro Cys Pro Gly Arg Gly His Gly His Arg Asn Gly 225 230 235 240 Thr Gly His Gly Asn Ser Thr His His Gly Pro Glu Tyr Met Arg Cys 245 250 255 Ser Pro His Leu Val Leu Ser Ala Leu Thr Ser Asp Asn His Gly Ala 260 265 270 Thr Tyr Ala Phe Ser Gly Thr His Tyr Trp Arg Leu Asp Thr Ser Arg 275 280 285 Asp Gly Trp His Ser Trp Pro Ile Ala His Gln Trp Pro Gln Gly Pro 290 295 300 Ser Ala Val Asp Ala Ala Phe Ser Trp Glu Glu Lys Leu Tyr Leu Val 305 310 315 320 Gln Gly Thr Gln Val Tyr Val Phe Leu Thr Lys Gly Gly Tyr Thr Leu 325 330 335 Val Ser Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Glu Lys Glu Val Gly Thr Pro His 340 345 350 Gly Ile Ile Leu Asp Ser Val Asp Ala Ala Phe Ile Cys Pro Gly Ser 355 360 365 Ser Arg Leu His Ile Met Ala Gly Arg Arg Leu Trp Trp Leu Asp Leu 370 375 380 Lys Ser Gly Ala Gln Ala Thr Trp Thr Glu Leu Pro Trp Pro His Glu 385 390 395 400 Lys Val Asp Gly Ala Leu Cys Met Glu Lys Ser Leu Gly Pro Asn Ser 405 410 415 Cys Ser Ala Asn Gly Pro Gly Leu Tyr Leu Ile His Gly Pro Asn Leu 420 425 430 Tyr Cys Tyr Ser Asp Val Glu Lys Leu Asn Ala Ala Lys Ala Leu Pro 435 440 445 Gln Pro Gln Asn Val Thr Ser Leu Leu Gly Cys Thr His 450 455 460 <210> 2 <211> 345 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Leu Gly Ala Val Ile Ala Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu Phe Ala 1 5 10 15 Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly Cys Pro 20 25 30 Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr 35 40 45 Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr 50 55 60 Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys 65 70 75 80 Leu Pro Glu Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn 85 90 95 Pro Val Gln Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Ile Gly Ser Phe 100 105 110 Pro Trp Gln Ala Lys Met Val Ser Arg His Asn Leu Thr Thr Gly Ala 115 120 125 Thr Leu Ile Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe 130 135 140 Leu Asn His Ser Glu Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro Thr Leu 145 150 155 160 Thr Leu Tyr Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val 165 170 175 Leu His Pro Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys 180 185 190 Gln Lys Val Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser 195 200 205 Lys Asp Tyr Ala Glu Val Gly Arg Leu Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly 210 215 220 Arg Asn Ala Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu 225 230 235 240 Pro Val Ala Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr 245 250 255 Val Pro Glu Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile 260 265 270 Leu Asn Lys His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp 275 280 285 Thr Cys Tyr Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu 290 295 300 Glu Asp Thr Trp Tyr Ala Ala Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys 305 310 315 320 Ala Val Ala Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp 325 330 335 Trp Val Gln Lys Thr Ile Ala Glu Asn 340 345 <210> 3 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Arg Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala Cys Leu Ala 1 5 10 15 Val Ser Ala Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln 20 25 30 Glu Asn Phe Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala 35 40 45 Ile Gly Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr 50 55 60 Val Ser Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser 65 70 75 80 Met Thr Ser Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly 85 90 95 Ala Tyr Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser 100 105 110 Lys Trp Asn Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp 115 120 125 Glu Tyr Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro 130 135 140 Thr Ile Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr 145 150 155 160 Leu Leu Gln Asp Phe Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu 165 170 175 Asp Ser Ile Phe Thr Met 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Ala Ile Gly Ser 20 25 30 Thr Cys Pro Leu Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val Ser Thr Leu Val 35 40 45 Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser Thr Arg 50 55 60 Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu Lys Thr 65 70 75 80 Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asx Ile Thr 85 90 95 Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala Ile Phe 100 105 110 Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr Ala Lys 115 120 125 Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe 130 135 140 Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile Phe Thr 145 150 155 160 Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro Glu Pro 165 170 175 Ile Leu Ile Pro Arg 180 <210> 6 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Ala Leu Gly Ala Val Ile Ala Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu 1 5 10 15 Phe Ala Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly 20 25 30 Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val 35 40 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Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Asp Tyr 260 265 270 Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Asn Ala 275 280 285 Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala 290 295 300 Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr Val Pro Glu 305 310 315 320 Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn Glu 325 330 335 His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp Thr Cys Tyr 340 345 350 Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu Glu Asp Thr 355 360 365 Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys Ala Val Ala 370 375 380 Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp Trp Val Gln 385 390 395 400 Lys Thr Ile Ala Glu Asn 405 <210> 7 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Val Gly Gly Lys Arg Ala Gln Leu Gly Asp Leu Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ala Ile Lys Asp Ala Ser Gly Ile Thr Cys Gly Gly Ile Tyr Ile Gly 20 25 30 Ile Ile Phe His Glu Asn Tyr Asn Ala Gly Glu Thr Tyr Gln Asn Asp 35 40 45 Ile Ala Leu 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Leu 675 680 685 Lys Val Phe Asn Pro Arg Arg Lys Leu Glu Phe Ala Leu Leu Phe Leu 690 695 700 Val Phe Asp Glu Asn Glu Ser Trp Tyr Leu Asp Asp Asn Ile Lys Thr 705 710 715 720 Tyr Ser Asp His Pro Glu Lys Val Asn Lys Asp Asp Glu Glu Phe Ile 725 730 735 Glu Ser Asn Lys Met His Ala Ile Asn Gly Arg Met Phe Gly Asn Leu 740 745 750 Gln Gly Leu Thr Met His Val Gly Asp Glu Val Asn Trp Tyr Leu Met 755 760 765 Gly Met Gly Asn Glu Ile Asp Leu His Thr Val His Phe His Gly His 770 775 780 Ser Phe Gln Tyr Lys His Arg Gly Val Tyr Ser Ser Asp Val Phe Asp 785 790 795 800 Ile Phe Pro Gly Thr Tyr Gln Thr Leu Glu Met Phe Pro Arg Thr Pro 805 810 815 Gly Ile Trp Leu Leu His Cys His Val Thr Asp His Ile His Ala Gly 820 825 830 Met Glu Thr Thr Tyr Thr Val Leu Gln Asn Glu Gly Glu Tyr Pro Asp 835 840 845 Thr Lys Ser Gly 850

Claims

정상인의 혈액 보다 심혈관 질환 환자의 혈액에서 발현이 상대적으로 감소하는 하기 군에서 선택된 단백질을 포함하는 심혈관 질환 진단용 바이오마커:

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 51-53 KD의 분자량 및 5.6-7.6의 pI를 갖는 헤모펙신 전구체(Hemopexin precusor);

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 5.6-7.6의 pI를 갖는 헵토글로빈(Haptoglobin);

서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고 39-41 KD의 분자량 및 4.9-6.9의 pI를 갖는 알파-1-마이크로글로빈(Alpha-1-microglobulin);

서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.2-6.2의 pI를 갖는 씨-타입 렉틴 도메인 패밀리 3(C-type lectin domain family 3);

서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고 20-22 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI를 갖는 콤플렉스-형성-당단백질 에이치 씨(Complex-forming glycoprotein HC);

서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고 45-47 KD의 분자량 및 5.4-7.4의 pI를 갖는 헵토글로빈 전구체(Haptoglobin precursor);

서열번호 7의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.2-6.2의 pI를 갖는 보체 요소 아이 라이트 체인(Complement factor I light chain);

서열번호 8의 아미노산 서열을 가지고 102-104 KD의 분자량 및 5.5-7.5의 pI를 갖는 인터-알파-트립신 저해제 패밀리 헤비 체인-관련된 단백질(Inter-alpha- trypsin inhibitor family heavy chain-related protein (IHRP));

서열번호 9의 아미노산 서열을 가지고 24-26 KD의 분자량 및 5.1-7.1의 pI를 갖는 프리-세럼 아밀로이드 피 컴포넌트(Pre-serum amyloid P component);

서열번호 10의 아미노산 서열을 가지고 15-17 KD의 분자량 및 4.5-6.5의 pI를 갖는 프리알부민(Prealbumin);

서열번호 11의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 6.8-8.8의 pI를 갖는 보체 요소 에이치 관련된 1(Complement factor H-related 1);

서열번호 12의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 5.4-7.4의 pI를 갖는 헵토글로빈-관련된 단밸질 전구체(Haptoglobin-related protein precursor);

서열번호 13의 아미노산 서열을 가지고 47-49 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI를 갖는 보체요소 씨4비3(Complement component C4B3); 및

서열번호 14의 아미노산 서열을 가지고 45-47 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI를 갖는 피그먼트 상피의 차이나는 요인(Pigment epithelial-differentiating factor).
정상인의 혈액 보다 심혈관 질환 환자의 혈액에서 상대적으로 발현이 증가하는 하기 군에서 선택된 단백질을 포함하는 심혈관 질환 진단용 바이오마커:

서열번호 15의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI를 갖는 레티놀 부착 단백질 4(Retinol Binding Protein 4);

서열번호 16의 아미노산 서열을 가지고 28-30 KD의 분자량 및 4.5-6.5의 pI를 갖는 프로아포-에이-아이 단백질(Proapo-A-I protein);

서열번호 17의 아미노산 서열을 가지고 15-17 KD의 분자량 및 4.5-6.5의 pI를 갖는 트랜스티레틴(Transthyretin); 및

서열번호 18의 아미노산 서열을 가지고 97-99 KD의 분자량 및 4.3-6.3의 pI를 갖는 셀롤로플라즈민(Ceruloplasmin).
제 1항 또는 제 2항의 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 진단제.
제 3항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 진단제.
제 1항 또는 제 2항의 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 진단키트.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 정상인 혈액보다 심혈관 질환 환자의 혈액에서 감소하는 하기 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 치료 및 예방용 조성물:

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 51-53 KD의 분자량 및 5.6-7.6의 pI를 갖는 헤모펙신 전구체(Hemopexin precusor);

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 5.6-7.6의 pI를 갖는 헵토글로빈(Haptoglobin);

서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고 39-41 KD의 분자량 및 4.9-6.9의 pI를 갖는 알파-1-마이크로글로빈(Alpha-1-microglobulin);

서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.2-6.2의 pI를 갖는 씨-타입 렉틴 도메인 패밀리 3(C-type lectin domain family 3);

서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고 20-22 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI를 갖는 콤플렉스-형성-당단백질 에이치 씨(Complex-forming glycoprotein HC);

서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고 45-47 KD의 분자량 및 5.4-7.4의 pI를 갖는 헵토글로빈 전구체(Haptoglobin precursor);

서열번호 7의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.2-6.2의 pI를 갖는 보체 요소 아이 라이트 체인(Complement factor I light chain);

서열번호 8의 아미노산 서열을 가지고 102-104 KD의 분자량 및 5.5-7.5의 pI를 갖는 인터-알파-트립신 저해제 패밀리 헤비 체인-관련된 단백질(Inter-alpha-trypsin inhibitor family heavy chain-related protein (IHRP));

서열번호 9의 아미노산 서열을 가지고 24-26 KD의 분자량 및 5.1-7.1의 pI를 갖는 프리-세럼 아밀로이드 피 컴포넌트(Pre-serum amyloid P component);

서열번호 10의 아미노산 서열을 가지고 15-17 KD의 분자량 및 4.5-6.5의 pI를 갖는 프리알부민(Prealbumin);

서열번호 11의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 6.8-8.8의 pI를 갖는 보체 요소 에이치 관련된 1(Complement factor H-related 1);

서열번호 12의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 5.4-7.4의 pI를 갖는 헵토글로빈-관련된 단밸질 전구체(Haptoglobin-related protein precursor);

서열번호 13의 아미노산 서열을 가지고 47-49 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI를 갖는 보체요소 씨4비3(Complement component C4B3); 및

서열번호 14의 아미노산 서열을 가지고 45-47 KD의 분자량 및 4.8-6.8의 pI를 갖는 피그먼트 상피의 차이나는 요인(Pigment epithelial-differentiating factor).