BRPI0520498A2 - processo para a preparação de interferon beta glicosilado - Google Patents
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Abstract
Patente de Invenção: PROCESSO PARA A PREPARAçãO DE INTER- FERON BETA GLICOSILADO. A presente invenção refere-se a um processo para a produção de interferon beta, e uma composição de interferon beta que tem um padrão singular de glicosilação.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOPARA A PREPARAÇÃO DE INTERFERON BETA GLICOSILADO".
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a processos para produzir interfe-ron beta humano recombinante sob condições isentas de soro, processospara purificar interferon beta humano recombinante, e uma proteína interfe-ron beta que tem um padrão de glicosilação singular.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As proteínas se tornaram comercialmente importantes comofármacos que são denominados também geralmente "produtos biológicos".Um dos maiores desafios é o desenvolvimento de processos econômicos eeficientes para a produção de proteínas recombinantes em escala industrial.
A indústria de biotecnologia faz uso extenso de células de mamí-feros para a fabricação de glicoproteínas recombinantes para terapia humana.
As células apropriadas que são amplamente utilizadas para aprodução de polipeptídeos vieram a ser as células do ovário do hamster chi-nês (CHO).
As células CHO foram cultivadas pela primeira vez por Puck(1958) a partir de uma biópsia de um ovário de um hamster chinês fêmea. Apartir destas células originais, foram preparadas inúmeras sublinhagens comvárias características. Uma destas linhagens de células CHO, CHO-K1, re-quer prolina e é diplóide para o gene de diidrofolato redutase (DHFR). Outralinhagem de células é derivada desta linhagem de células é uma linhagemde céllas CHO deficiente de DHFR (CHO DUK B11) (PNAS 77:4216-4220(1980)), que se caracteriza pela perda da função de DHFR como conse-qüência de uma mutação em um gene de DHFR e a subseqüente perda deoutro gene.
Outras células que são usadas freqüentemente para a produçãode proteínas intencionadas para administração a seres humanos são linha-gens de células humanas tais como a linhagem de células de fibrossarcomahumano HT1080 ou a linhagem de células de rim embrionário humano 293,uma linhagem de células derivadas de retinoblastos embrionários humanos,tal como, por exemplo, PER.C6, uma linhagem de células derivada de célu-las amnióticas ou uma linhagem de células derivada de células neuronais.
As células derivadas de uma linhagem de células apropriada sãotransfectadas de forma estável com um vetor de expressão que compreendea seqüência codificadora da proteína de interesse a ser produzida, junto comseqüências reguladoras tais como promotores, intensificadores, ou sinais depoliA que asseguram a expressão estável e correta da proteína de interesse.Outros genes usualmente presentes em vetores de expressão são genesmarcadores tais como, por exemplo, marcadores de seleções positivos (porexemplo, neo gene) que selecionam as células transfectadas de forma está-vel a partir de células não-transfectadas e transfectadas de forma transiente.Genes ampliáveis tal como o gene de DHFR são usados para ampliação dasseqüências codificadoras.
Depois que um clone que expressa a proteína de interesse foiestabelecido, um processo de fabricação partindo deste clone deve ser es-tabelecido para permitir a produção em altas quantidades e uma qualidadecomo é necessária para proteínas destinadas para administração a sereshumanos.
Tais processos de fabricação são conduzidos geralmente comobiorreatores. Existem diferente modos de operação. Atualmente, as culturaspor perfusão e batelada são os dois mmodos dominantes da operação in-dustrial para os processos de cultura de células de mamíferos, que reque-rem grande quantidade de proteínas (Hu e Aunins 1997). Qualquer que sejaa teconologia de produção de escolha, os esforços de desenvolvimento obje-tivam processos de produção que garantam alta produtividade volumetrica,consistência de lote para lote, qualidade homogênea do produto a baixo custo.
A decisão entre o modo de produção em batelada ou perfusão éditada principalmente pela biologia do clone e pela propriedade do produto, eé feita caso a caso durante o curso do desenvolvimento de um novo fármaco(Kadouri e Spier, 1997).Quando a seleção é um processo de perfusão, um dos sistemasde cultura de escolha é um biorreator de leito estacionário recheado, no qualas céulas são imobilizadas sobre veículos sólidos. Este sistema é fácil deoperar, e com veículos e condições de cultura apropriados, pode ser conse-guida uma densidade muito alta de células (de ~ 107-108 céculas/mL).
Uma conseqüência desta alta densidade de células é a necessi-dade de uma taxa intensiva de perfusão do meio (alimentação e colheita),que deveria ser usada para manter as células viáveis e produtivas. Pareceque a taxa de perfusão é um dos parâmetros fundamentais desse processo:ela impulsiona a propriedade volumétrica de proteínas, a qualidade do pro-duto protéico, e tem um impacto muito forte sobre a economia global do pro-cesso.
Para o processo de cultura de células, os meios de cultura ante-riores eram sumplementados com soro, que serve como um nutriente uni-versai para o crescimento e manutenção de todas linhagens de células demamíferos, que produzem produtos biologicamente ativos. O soro contémhormônio, fatores de crescimento, proteínas veículo, fatores de fixação edispersão, nutrientes, microelementos, etc. Os meios de cultura continhamusualmente até cerca de 10% de soro animal, tal como o soro fetal bovino(FBS), também denominado soro fetal vitelínico (FCS).
Embora amplamente utilizado, o soro tem muitas limitações. Elecontém altos níveis de inúmeras proteínas que interferem com as quantida-des limitadas da proteína de interesse desejada produzida pelas células.Estas proteínas derivadas do soro devem ser separadas do produto duranteo processamento a jusante, tal como a purificação da proteína de interesse,o que complica o processo e aumento o custo.
O surgimento da BSE (Encefalopatia Espongiforme Bovina),uma doença neurodegenerativa transmissível do gado, com um longo perío-do de latência ou incubação, gerou preocupações de fiscalização sobre ouso de soros derivados de animais na produção de produtos biologicamenteativos.
Existe, portanto, uma grande necessidade de desenvolvimentode meios de cultura alternativos isentos de fontes animais, que sustentam ocrescimento de células e mantêm as células durante a produção de produtosbiologicamente ativos.
Geralmente, os meios de cultura de células compreendem mui-tos componentes de diferentes categorias, tais como aminoácidos, vitami-nas, sais, ácidos graxos, e outros compostos:
- Aminoácidos: por exemplo, a patente US Ne 6.048.728 (Inlow etal.) descreve que os seguintes aminoácidos podem ser usados em um meiode cultura de células: Alanina, Arginina, Ácido Aspártico, Cisteína, Ácido Glu-tâmico, Glutamina, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina,Fenilalanina, Prolina, Serina, Triptofano, Tirosina, Treonina, e Valina.
- Vitaminas: O document US Ne 2003/0096414 (Ciccarone et al.)ou US 5.811.299 (Renner et al.), por exemplo, descrevem que as seguintesvitaminas podem ser usadas em um meio de cultura de células: Biotina, Pan-totenato, Cloreto de Colina, Ácido Fólico, Mioinositol, Niacinamida, Piridoxi-na, Riboflavina, Vitamina B12, Tiamina, Putrescina.
- Sais: Por exemplo, a patente US N9 6.399.381 (Blum et al.)descreve um meio que compreende CaCI2, KCI, MgCI2, NaCI, fosfato mono-básico de sódio, fosfato dibásico de sódio, selenita sódica, CuSCv, ZnCI2.
Outro exemplo de um documento que descreve os sais inorgânicos que po-dem ser usados em meios de cultura é o document ns US 2003/0153042(Arnold et al.), que descreve um meio que compreende CaCI2, KCI, MgCI2,NaCI, fosfato monobásico de sódio, fosfato dibásico de sódio, CuCl2.2H20,ZnCI2.
- Ácidos Graxos: Os ácidos graxos que reconhecidamente sãousados em meios são Ácido Araquidônico, Ácido Linoléico, Ácido Oléico,Ácido Láurico, Ácido Mirístico, bem como Metil-beta-Ciclodextrina, vide, porexemplo, patente US 5.045.468 (Darfler). Deve-se assinalar que a ciclodex-trina não é um lipídeo em si, mas tem a capacidade de formar um complexcom lipídeos, e, assim sendo, é usada para solubilizar lipídeos no meio decultura de células.
- Outros componentes, particularmente usados no quadro demeios de cultura isentos de soro, são compostos tais como glicose, glutami-na, piruvato de sódio, insulina ou etanol-amina (por exemplo, document n2EP 274 445), ou um agente protetor, tal como Pluronic F68. Pluronic® F68(também conhecido como Poloxamer 188) é um copolímero em bloco deoxido de etileno (EO) e oxido de propileno (PO).
Os "meios básicos" padrão também são conhecidos pelos ver-sados nessas técnicas. Estes meios já contêm vários dos componentes demeios mencionados acima. Os exemplos desses meios que são amplamenteaplicados são ó Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Meio doRoswell Park Memorial Institute (RPMI), ou meio de Ham.
Depois da produção da proteína de interesse no biorreator, aproteína de interesse precisa ser purificada a partir da colheita da cultura decélulas. A colheita da cultura de células pode ser, por exemplo, extratos ce-lulares para proteínas intracelulares, ou sobrenadantes de culturas de célu-las para proteínas secretadas.
Embora muitos métodos estejam agora disponíveis para a pro-dução de proteínas em larga escala, os produtos brutos, tais como colheitasde culturas de células, contêm não apenas o produto desejado, mas tambémimpurezas que são difíceis de separar do produto desejado.
As autoridades de saúde exigem altos padrões de pureza paraproteínas intencionadas para administração humana. Como uma outra difi-culdade, muitos métodos de purificação podem conter etapas que requerema aplicação de pH baixo ou alto, altas concentrações de sais ou outras con-dições extremas que podem prejudicar a atividade biológica de uma dadaproteína. Assim sendo, para qualquer proteína, é um desafio estabelecer umprocesso de purificação que permita uma pureza suficiente, e ao mesmotempo, retendo a atividade biológica da proteína.
Sistemas cromatográficos por troca iônica têm sido amplamenteutilizados para a separação de proteínas principalmente na base de diferen-ças na carga elétrica. Na cromatografia por troca iônica, esparadrapos eletri-camente carregados sobre a superfície do soluto são atraídos por cargasopostas afixadas a uma matriz de cromatografia, desde que a intensidadeiônica do tampão circundante seja baixa. A eluição é conseguida geralmenteaumentando a intensidade iônica (isto é, a condutividade) do tampão, paracompetir com o soluto pelos sítios eletricamente carregados da matriz detroca iônica. Mudar o pH e desta forma alterar a carga elétrica do soluto éoutra maneira para conseguir a eluição do soluto. A mudança na condutivi-dade ou do pH pode ser gradual (gradiente de eluição) ou escalonada (elui-ção em etapas). As resinas que podem ser usadas na cromatografia por tro-ca iônica podem conter diferentes grupos funcionais: dietil-amino-etila (DE-AE) ou dietil-(2-hidróxi-propil)-amino-etila (QAE) têm cloreto como contra-íon, enquanto que carbóxi-metila (CM) e sulfo-propila (SP) têm sódio comocontra-íon, por exemplo.
Os sistemas cromatográficos que têm uma fase estacionaria hi-drofóbica oferecem uma base alternativa para separações e também têmsido amplamente empregadas na putificação de proteínas. Estão incluídasnesta categoria a cromatografia por interação hidrofóbica (HIC) e cromato-grafia líquida em fase reversa (RPLC). A base físíco-química para a separa-ção por HIC e RPLC é o efeito hidrofóbico, as proteínas são separadas emuma fase estacionaria hidrofóbica, baseado em diferenças no caráter hidro-fóbico.
A cromatografia em fase reversa é um método de purificação deproteínas intimamente relacionado à HIC, pois ambas baseiam-se em intera-ções entre grupos polares acessíveis pelo solvente sobre a superfície debiomoléculas e ligantes hidrofóbicos da matriz. Entretanto, os ligantes usa-dos na cromatografia em fase reversa são mais altamente substituídos comligantes hidrofóbicos do que os ligantes na HIC. Embora o grau de substitui-ção de adsorventes na HIC possa ficar na faixa de 10-50 u,moles/ml_ da ma-triz de ligantes arila de C2-C8, várias centenas de u/noles/mL da matriz dealquilas de C4-C8 são usados usualmente para adsorventes de cromatogra-fia em fase reversa.
A coluna Source 30RPC é uma matriz polimérica para a fasereversa. Ela se baseia em pérolas rígidas de poliestireno/divinil-benzenocom diâmetro uniforme de 30 mícrons. Suas características podem ser re-sumidas da seguinte maneira: Faixa de pH excepcionalmente ampla (1-12),alta seletividade, alta resistência química, alta capacidade e alta resoluçãoem vazões elevadas.
A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), também de-nominada cromatografia por permeação em gel (GPC), usa partículas poro-sas para separar as moléculas de tamanhos diferentes. Ela é usada geral-mente para separar moléculas biológicas e para determinar os pesos mole-culares e distribuições de peso molecular de polímeros. As moléculas maio-res do que o tamanho dos poros conseguem entrar nas partículas, e portan-to, têm um trajeto mais longo e tempo de trânsito mais longo do que as mo-léculas maiores que não conseguem entrar nas partículas. Todas moléculasmaiores do que o tamanho dos poros não são retidas e eluem juntas. As mo-léculas que conseguem entrar nos poros terão um tempo de residência mé-dio nas partículas, que depende do tamanho e do formato das moléculas.
Diferentes moléculas têm, portanto, tempos de trânsito totais diferentes atra-vés da coluna.
Blue Sepharose é uma resina de cromatografia baseada emuma matriz de afinidade corante/ligante. O ligante, Cibacron Blue F3G-A, ficaacoplado de forma covalente a Sepharose™ através do anel cloro-triazina(Clonis etal., 1987).
Blue Sepharose foi usada para a purificação de interferon beta(Mory etal., 1981).
Interferon beta (interferon-p or IFN-P) é uma glicoproteína solú-vel de ocorrência natural, pertencente à classe de citocinas. Os interferons(IFNs) têm uma ampla faixa de atividades biológicas, tais como propriedadesantivirais, antiproliferativas e imunomoduladoras.
Os três principais interferons são referidos como IFN-alfa, IFN-beta e IFN-gama. Estes interferons foram classificados inicialmente de acor-do com suas células de origem (leucócitos, fibroblastos ou células T). Entre-tanto, ficou evidente que vários tipos poderiam ser produzidos por uma célu-la. Assim sendo, o interferon de leucócitos é agora denominado IFN-alfa, ointerferon de fibroblastos é IFN-beta( e o interferon de células T é IFN-gama.Há também um quarto tipo de interferon, IFN linfoblastóide, produzido nalinhagem de células "Namalwa" (derivada do linfoma de Burkitt), que pareceproduzir uma mistura de IFN de leucócitos e fibroblastos.
O interferon de fibroblastos humanos (IFN-beta) tem atividadeantiviral e reconhecidamente inibe a proliferação de células. Ele é um poli-peptídeo de cerca de 20.000 Da, induzido por vírus e RNAs de filamento du-plo. A partir da seqüência de nucleotídeos do gene de interferon de fibroblas-tos, clonado por tecnologia de DNA recombinante, Derynck et ai, 1980 de-duziram a seqüência de aminoácidos completa da proteína, que tem umcomprimento de 166 aminoácidos.
Interferon-B também foi clonado. A patente US N9 5.326.859descreve a seqüência de DNA do IFN-B humano e um plasmídeo para suaexpressão recombinante em bactérias tal como E. coli. A patente européia n20 287 075 descreve uma linhagem de células CHO (ovário do hamster chi-nês), transfectada com a seqüência codificadora de interferon-B e capaz deproduzir interferon-B recombinante. A proteína é descrita como sendo glicosi-lada com um oligossacarídeo biantenário (duas ramificações), com a carac-terística de uma única porção fucose.
Interferon beta foi expressado em várias linhagens de células,tais como células CHO, BHK 21 (células do rim de filhote de hamstei) e célu-las LTK (L-timidina cinase negativas do camundongo) e (Reiser e Hauser,1987). As células CHO DHFR negativas foram usadas também para a ex-pressão de interferon beta (Innis e McCormick, 1982), (Chernajovsky et ai, 1984).
Os interferons são conhecidos como sendo glicosilados, fre-qüentemente com diferentes glicoformas. Por exemplo, a estrutura do saca-rídeo de IFN-B demonstrou incluir uma estrutura biantenária, com a caracte-rística de um único sacarídeo fucose e sialilação de galactose terminal (Con-radt et ai, 1987). A glicosilação demonstrou ser também importante para asolubilidade, pois o IFN-B precipitous depois da desglicosilação com glico-peptidase F. Além disso, IFN-B produzido por E. coli apresentou problemasde dobragem, devido à falta de glicosilação no sistema de expressão bacte-riano.
A patente européia n2 0 529 300 descreve um interferon-B re-combinante que tem um padrão de glicosilação específico, a saber, com es-truturas de carboidratos que têm como característica uma fucose por unida-de de oligossacarídeo. Estas estruturas de carboidratos são oligossacarí-deos biantenários, triantenados e quadriantenados (duas, três ou quatro ra-mificações, respectivamente).
O pedido de patente PCT n- WO 99/15193 também descreve aglicosilação de interferon-B recombinante com característica de oligossacarí-deos biantenários, triantenados e quadriantenados. Os monossacrídeosconstituintes incluíam manose, fucose, N-acetilglicosamina, galactose e áci-do siálico.
Vários estudos demonstraram a importância da glicosilação paraa estabilidade. Por exemplo, as formas não-glicosiladas de interferon-B re-combinante demonstram ter estabilidade significativamente mais baixa etambém atividade biológica mais baixa (Runkel era/., 1998).
Outros estudos demonstraram que as proteínas interferon-B hu-mano recombinante e natural têm padrões de glicosilação diferentes (Kaga-wa et ai, 1988).
Interferon beta é usado como um fármaco protéico terapêutico,um assim denominado produto biológico, em inúmeras doenças, tais como,por exemplo, esclerose múltipla, câncer, ou doenças virais, tais como, porexemplo, SARS ou infecções com o vírus da hepatie C.
Portanto, há uma necessidade de se obter processos para aprodução e purificação eficiente de interferon beta, e de células que expres-sam interferon beta em altas quantidades.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção baseia-se no desenvolvimento de um pro-cesso para produzir interferon beta humano recombinante em um meio isen-to de soro.
Portanto, em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a umprocesso para fabricar interferon-B recombinante glicosilado, de preferênciahumano, compreendendo uma etapa de cultivar uma célula produtora deinterferon-p em um meio isento de soro, sendo que o meio isento de sorocompreende:
- cerca de 10 a cerca de 30 mM de HEPES, de preferência 20mM de HEPES;
- cerca de 0,5 a cerca de 3 mM de Prolina, de preferência cercade 1 mM de Prolina; e
- cerca de 5.500 a cerca de 7.000 mg/L de cloreto de sódio, depreferência cerca de 6.100 mg/L de cloreto de sódio.
A presente invenção baseia-se ainda no desenvolvimento de umprocesso para purificar interferon beta recombinante a partir de um fluido,particularmente a partir da colheita de cultura de células, derivada de célulasque produzem interferon beta.
Portanto, em um segundo aspecto, a invenção refere-se a umprocesso para a purificação de interferon humano recombinante a partir deum fluido, compreendendo as etapas de:
- submeter o fluido a uma cromatografia por afinidade;
- submeter o eluído da cromatografia de afinidade a uma croma-tografia por troca iônica;
- submeter o eluído da cromatografia de troca iônica a uma cro-matografia hidrofóbica por RP-HPLC.
A análise do interferon beta produzido pelo process da invençãorevelou que ele é uma composição de interferon beta diferencialmente glico-silado, isto é, um interferon beta que tem um padrão ou perfil de glicosilaçãosingular. Portanto em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a uma com-posição de interferon beta que compreende uma estrutura de oligossacrídeoque compreende dois ou três sacarídeos fucose.
Os usos do interferon-p humano recombinante produzido deacordo com os processos da invenção, na fabricação de um medicamentopara o tratamento de tumores, esclerose múltipla, infecções virais, e os usosdo meio de cultura isento de soro da invenção para a produção de interferonbeta, são outros aspectos da presente invenção.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 ilustra um fluxograma do método usado para geraruma linhagem de células produtoras de interferon beta.
A Figura 2 ilustra um fluxograma do novo processo de purifica-ção de IFN- í3-1a.
A Figura 3 ilustra os espectros transformados da ES-MS de ba-teladas de IFN-f3-1a, onde um desenho esquemático da estrutura dos oli-gossacrídeos está ilustrada no topo.
A Figura 4 ilustra o espectro transformado da ES-MS do IFN-Í3-1a obtido pelo novo processo, onde:
P= proteína (IFN-(3);
Fuc Biant = oligossacarídeo do tipo complexo biantenário fucosi-lado;
Fuc Triant = oligossacarídeo do tipo complexo triantenado fuco-silado;
Fuc Tetrant = oligossacarídeo do tipo complexo quadriantenadofucosilado;
SA = ácido siálico.
A Figura 5 ilustra estruturas de oligossacarídeos em IFN-B-1a;onde:
A Figura 5A os oligossacarídeos principais:
I. Biantenário Dissialilado (NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc)
II. Biantenário Minossialilado (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc)
A Figura 5B ilustra os oligossacarídeos secundários, onde:
I.Biantenário Não-sialilado (Hex5.HexNAc4.Fuc)
II. Estrutura triantenada monossialilada e dissialilada ou biantená-ria dissililada com estrutura repetida de N-acetil-lactosamina (Neu-AC2. Hex6. HexNAcs. Fuc)
III. Estrutura triantenada trissialilada com estrutura repetida de N-acetil-lactosamina ou quadriantenada trissialilada (Neu-Ac3. Hex7. HexN Ac6. Fuc)
A Figura 5C ilustra os oligossacarídeos secundários com dois outrês residues de Fucose:
I. Estrutura biantenária monossilialiladacom duas Fucoses (Neu-Ac.Hex5.HexNAc4.Fuc2)
II. Estrutura biantenária dissialilada com duas Fucoses (Neu-Ac2-Hex5.HexNAc4.Fuc2)
III. Estrutura biantenária dissialilada com três Fucoses (Neu-Ac2.Hex5.HexNAc4.Fuc3)
A Figura 6 ilustra o espectro MALDI do novo IFN-f3-1a com gli-canos permetilados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O primeiro aspecto da presente invenção baseia-se no desen-volvimento de um processo para a produção de interferon beta sob condi-ções de cultura de células em meio isento de soro. De acordo com a presen-te invenção, o processo para a fabricação de interferon beta recombinanteglicosilado compreende uma etapa de cultivar uma linhagem de células pro-dutoras de interferon beta em um meio isento de soro, sendo que o meioisento de soro compreende:
- cerca de 10 a cerca de 30 mM de HEPES, de preferência 20mM de HEPES;
- cerca de 0,5 a cerca de 3 mM de Prolina, de preferência cercade 1 mM de Prolina; e
- cerca de 5.500 a cerca de 7.000 mg/L de cloreto de sódio, depreferência cerca de 6.100 mg/L de cloreto de sódio.
O meio isento de soro pode compreender, por exemplo, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 mM de tampão HEPES (ácido 2-(4-(2-hidróxi-etil)-1-piperazinil)-etanossulfônico). Ele pode compreender tam-bém, por exemplo, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6,1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1 mM de Prolina.
As concentrações de cloreto de sódio no meio isento de soro dainvenção podem ser, por exemplo, 5.400, 5.500, 5.600, 5.700, 5.800, 5.900,6.000, 6.100, 6.200, 6.300, 6.400, 6.500, 6.600, 6.700, 6.800, 6.900, 7.000, 7.100 mg/L.Em uma modalidade preferida, o meio isento de soro compreen-de ainda cerca de 10a cerca de 20, de preferência cerca de 15 mg/L deVermelho de Fenol. A concentração de Vermelho de Fenol pode ser, porexemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 mg/L.
No quadro do processo da presente invenção, os componentesidentificados acima podem ser usados em qualquer meio isento de soro. Osexemplos de tais meios isentos de soro estão listados abaixo:
<table>table see original document page 14</column></row><table>
A célula produtora de interferon beta que pode ser cultivada deacordo com a presente invenção pode ser qualquer célula de mamífero, in-cluindo células de animais ou humanas, tais como, por exemplo, células3T3, células COS, células do osteossarcoma humano, células MRC-5, célu-las BHK, células VERO, células CHO, células CHO-S, células HEK 293, cé-lulas de fibroblastos humanos normais, células de estroma, células de hepa-tócitos e células PER.C6 que foram modificadas para expressar, e de prefe-rência, secretar interferon beta.
A célula a ser usada no processo da invenção é, de preferência,um clone de CHO que expressa interferon beta, tal como, por exemplo, alinhagem de células descrita por Reiser e Hauser (1987) ou as células des-critas por Innis e McCormick (1982).O termo "interferon beta", como aqui utilizado, é denominadotambém IFN beta ou IFN-p e engloba interferon beta derivado de qualquerespécie, e, de preferência, interferon beta humano, uma glicoproteína de 166aminoácidos com um peso molecular de aproximadamente 22.500 dáltons.
O termo "interferon beta", como aqui utilizado, engloba também derivados,muteínas, análogos, ou fragmentos de IFN-beta. O termo "interferon beta 1a" refere-se ao interferon beta glicosilado.
A atividade de interferon beta pode ser medida, por exemplo,usando um padrão referencial calibrado contra o interferon beta natural pa-drão da Organização Mundial da Saúde ("Second International Standard forinterferon, Human Fibroblast" GB 23 902 531). A unidade é expressa emunidades internacionais (Ul) de atividade antiviral por mg de interferon beta-1 a, determinada em um bioensaio com efeito citopático in vitro, usando célu-las WISH e o virus da estomatite vesicular.
Tabela de Conversão para MUI MIU e ng de IFN-beta
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O termo "variantes" ou "muteínas", como utilizado no quadro dapresente invenção, refere-se a análogos de IFN-beta, onde um ou mais dosresíduos de aminoácidos do IFN-beta natural são substituídos por resíduosde aminoácidos diferentes, ou são deletados, ou um ou mais resíduos deamioácidos são adicionados à seqüência natural de IFN-beta, sem diminuirconsideravelmente a atividade dos produtos resultantes, em comparaçãocom o IFN-betado tipo selvagem. Estas muteínas são preparadas por técni-cas de síntese conhecidas e/ou técnicas de mutagênese direcionadas a sí-tios, ou qualquer técnica conhecida apropriada para isso.
Os termos "variante" ou "muteína", de acordo com a presenteinvenção, incluem proteínas codificadas por um ácido nucléico, tal comoDNA ou RNA, que hibridiza para um DNA ou RNA que codifica IFN-beta,como descrito, por exemplo, na patente ne US 4.738.931 sob condições se-veras. O termo "condições severas" refere-se às condições de hibridização eàs condições de lavagem subseqüentes, as quais os versados nessas técni-cas se referem convencionalmente como "severas". Vide Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology", supra, Interscience, NY, §§6.3 e 6.4(1987, 1992). Sem limitações, os exemplos de condições severas incluem ascondições de lavagem de 12-20°C abaixo da Tm calculada do híbrido emestudo, em, por exemplo, 2 x SSC e 0.5% de SDS por 5 minutos, 2 x SSC e0,1% de SDS por 15 minutos; 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 37 °C por 30-60minutos e depois 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 68 °C por 30-60 minutos. Osversados nessas técnicas devem entender que as condições severas de-pendem também do comprimento das seqüências de DNA, sondas de oligo-nucleotídeos (tal como 10-40 bases) ou sondas de oligonucleotídeos mistas.Caso sejam usadas sondas mistas, é preferível usar cloreto de tetrametil-amônio (TMAC) em vez de SSC. Vide Ausubel, supra.
A identidade reflete a.relação entre duas ou mais seqüências depolipeptídeos ou duas ou mais seqüências de polinucleotídeos, determinadacomparando as seqüências. Geralmente, a identidade se refere à corres-pondência exata de nucleotídeo a nucleotídeo ou aminoácido a aminoácidodas seqüências dos dois polinucleotídeos ou polipeptídeos, respectivamente,cobrindo o comprimento das seqüências que estão sendo comparadas.
No caso de seqüências nas quais não há uma correspondênciaexata, uma "identidade percentual" pode ser determinada. Geralmente, asduas seqüências a serem comparadas são alinhadas para dar uma correla-ção máxima entre as seqüências. Isto pode incluir a inserção de "lacunas"em uma ou ambas seqüências, para aumentar o grau de alinhamento. Umaidentidade percentual pode ser determinada cobrindo o comprimento inteirode cada uma das seqüências que estão sendo comparadas (o assim deno-minado alinhamento global), o que é particularmente apropriado para se-qüências com o mesmo comprimento ou um comprimento muito similar, oucobrindo comprimentos mais curtos definidos (o assim denominado alinha-mento local), o que é mais apropriado para seqüências com comprimentodesigual.
Os métodos para comparar a identidade e a homologia de duasou mais seqüências são bem-conhecidos nessas técnicas. Assim sendo, porexemplo, os programas disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Pac-kage, versão 9.1 (Devereux, J. et ai, 1984), por exemplo os programasBESTFIT e GAP, podem ser usados para determinar a identidade percentualentre dois polinucleotídeos e a identidade percentual e a homologia percen-tual entre duas seqüências de polipeptídeos. BESTFIT usa o algoritmo de"homologia local" de Smith e Waterman (1981) e encontra a melhor regiãoindividual de similaridade entre duas seqüências. Outros programas paradeterminar a identidade e/ou similaridade entre seqüências também são co-nhecidos nessas técnicas, por exemplo, a família BLAST de programas(Altschul, S. F. et ai, 1990; Altschul, S. F. era/., 1997, acessíveis através dapágina do NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson, W. R., 1990).
Qualquer uma dessas variantes ou muteínas tem, de preferên-cia, uma seqüência de aminoácidos suficientemente duplicadora daquela deIFN-beta, tal como ter atividade substancialmente similar a IFN-beta. Umensaio functional para avaliar se qualquer variante ou muteína tem uma ati-vidade similar à de IFN-beta é, por exemplo, o ensaio que mede a atividadede interferon sobre o efeito citopático do virus da estomatite vesicular emcélulas WISH, como descrito, por exemplo, por Youcefi era/., 1985. Assimsendo, pode-se determinar se qualquer dada muteína tem substancialmentea mesma atividade que IFN-beta por meio de experimentação rotineira.
Qualquer uma dessas variantes ou muteínas pode ter pelo me-nos 40% de identidade ou homologia com a seqüência de IFN-beta, comodescrito, por exemplo, na patente n2 US 4.738.931. Mais preferivelmente, elatem pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%or, mais preferivelmente, pelo menos 90% de identidade ou homologia com ela.
As muteínas de IFN-beta, que podem ser usadas de acordo coma presente invenção, ou o ácido nucléico que as codificam, incluem um con-junto finito de seqüências substancialmente correspondentes orno peptídeosou polinucleotídeos de substituição que podem ser obtidos rotineiramentepelos versados nessas técnicas, sem experimentação excessiva, baseadonos ensinamentos e orientações aqui apresentadas.Ás mudanças preferidas em muteínas de acordo com a presenteinvenção são as que são conhecidas como substituições "conservativas". Assubstituições conservativas de aminoácidos de polipeptídeos de IFN-betapodem incluir aminoácidos sinonímicos dentro de um grupo, que têm propri-edades físico-químicas suficentemente similares, de tal modo que a substitu-ição entre membros do grupo preservem a função biológica da molécula(Grantham, 1974). É evidente que inserções e deleções de aminoácidos po-dem ser feitas nas seqüências definidas acima sem alterar sua função, parti-cularmente se as inserções ou deleções envolvem apenas poucos aminoá-cidos, por exemplo, menos de trinta, de preferência menos de dez, e nãoremovem ou deslocam aminoácidos que são críticos para uma conformaçãofuncional, por exemplo, resíduos de cisteína. As proteínas e muteínas pro-duzidas por tais deleções e/ou inserções estão dentro do âmbito da presenteinvenção.
Os exemplos de substituições de aminoácidos em proteínas, quepodem ser usados para obter muteínas de IFN-beta para uso na presenteinvenção, incluem quaisquer etapas do método, tais como apresentadas naspatentes n- US 4.959.314, 4.588.585 e 4.737.462, expedidas para Mark etai; 5.116.943 expedida para Koths etal.; 4.965.195 expedida para Namen etai; 4.879.111 expedida para Chong et ai; e 5.017.691 expedida para Lee etai; e as proteínas substituídas com lisina apresentadas na patente n- US4.904.584 (Shaw et ai).
Um tipo especial de variante de interferon foi descrito recente-mente. Os assim denominados "interferons de consenso" são variantes deIFN, que não ocorrem naturalmente (US 6.013.253). Os interferons de con-senso também podem ser produzidos de acordo com a invenção.
O termo "derivados funcionais" de IFN-beta, como aqui utilizado,cobre derivados que podem ser preparados a partir dos grupos funcionaisque ocorrem como cadeias laterais nos resíduos ou os grupos dos terminaisN ou C, por meios conhecidos nessas técnicas, e estão incluídos na inven-ção, desde que eles permaneçam farmaceuticamente aceitáveis, isto é, nãodestroem a atividade biológica das proteínas, como descrito acima, isto é, acapacidade de se ligarem ao receptor correspondente e iniciar a sinalizaçãodo receptor, e não confiram propriedades tóxicas às composições que oscontêm. Os derivados podem ter porções químicas, tais como resíduos decarboidratos ou fosfatos, desde que tal derivado retenha a atividade biológi-cada proteína e permaneça farmaceuticamente aceitável.
Os derivados de interferon beta podem incluir, por exemplo, ca-deias laterais de polietilenoglicol, que podem melhorar outras propriedadesda proteína, tais como a estabilidade, meia-vida, biodisponibilidade, tolerân-cia pelo corpo humano, ou o caráter imunogênico. Para conseguir este obje-tivo, IFN-beta pode ser ligado, por exemplo, a polietilenoglicol (PEG). A "pe-guilação" pode ser conduzida por métodos conhecidos, descritos no docu-mento n- WO 92/13095, por exemplo. Particularmente, PEG-IFN pode serpreparado de acordo com os ensinamentos do documento n- WO 99/55377.
Um derivado funcional de IFN-beta pode compreender pelo me-nos uma porção anexado a um ou mais grupos funcionais, que ocorrem co-mo uma ou mais cadeias laterais nos resíduos de aminoácidos. Uma moda-lidade na qual a porção é uma porção de polietilenoglicol (PEG) é altamentepreferida. De acordo com a presente invenção, vários grupamentos PEGtambém podem estar anexados ao IFN-beta.
Outros derivados incluem ésteres alifáticos dos grupos carboxila,amidas dos grupos carboxila pela reação com amônea ou com aminas pri-márias ou secundárias, derivados N-acila de grupos amino livres dos resí-duos de aminoácidos, formados com porções acila (por exemplo, gruposalcanoil- ou aroil-carbocíclicos) ou derivados de O-acila de grupos hidroxilalivres (por exemplo, aqueles de resíduos serila ou treonila) formados comporções acila.
Um "fragmento", de acordo com a presente invenção, refere-se aqualquer subconjunto de IFN-beta, isto é, um peptídeo mais curto que retéma atividade biológica desejável como mensurável, por exemplo, no bioensaiodescrito acima. Os fragmentos podem ser preparados facilmente removendoaminoácidos da extremidade da molécula e testando o resultante quanto àssuas propriedades como um agonista do receptor. As proteases para remo-ver um aminoácido de cada vez do terminal N ou do terminal C são conheci-das, e assim sendo, determinar os fragmentos que retêm a atividade biológi-ca desejada pode ser determinada, por exemplo, no teste descrito por You-cefi era/., 1985, e envolve experimentação apenas rotineira.
O processo para a produção de interferem beta da invenção po-de ser conduzido em uma temperatura constante, ou em temperaturas vari-adas. Ele pode ser coduzido, por exemplo, a 37 °C durante o processo intei-ro. Ele pode ser conduzido também em uma temperatura que é inicialmente,por exemplo, durante a fase de crescimento, de 37 °C e depois diminuídapara 35 °C, 33 °C ou 30 °C para a fase de produção.
Em uma modalidade preferida, o processo da invenção compre-ende uma fase de crescimento I, uma fase de crescimento II e uma fase deprodução, onde a fase de crescimento I é conduzida a cerca de 37 °C, a fasede crescimento II é conduzida a cerca de 35 °C, e a fase de produção é con-duzida a cerca de 33 °C.
A determinação do final das fases está dentro do conhecimentodos versados nessas técnicas e é determinado, por exemplo, na base dadensidade celular, consumo de glicose ou qualquer outra indicação metabó-lica. Geralmente, a fase de crescimento I pode ser, por exemplo, de 10 a 12dias. A fase de crescimento II é geralmente mais curta e serve principalmen-te para adaptar as células a uma temperatura mais baixa. A fase de cresci-mento II pode ser, por exemplo, de 1 a 2 dias.
O processo da invenção pode ser conduzido como um processode em batelada ou perfusão. De acordo com a presente invenção, a perfu-são é preferida.
De preferência, o processo é um processo de perfusão com umataxa de diluição na faixa entre cerca de 1 e cerca de 10, de preferência entrecerca de 1,5 e cerca de 7 por dia.
O termo "taxa de diluição", como aqui definido, refere-se à taxade diluição D, calculada como litro de meio por litro do volume operacionaltotal do sistema por dia (volume total = leito recheado + volume do tanquecondicionador). De acordo com a presente invenção, a taxa de diluição podeficar em uma faixa de, por exemplo, 0,5, 1, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3,3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5.
Mais preferivelmente, a taxa de diluição é aumentada dentro dasprimeiras duas ou três semanas de cultura de células, de um valor inicial decerca de 1 a 2 por dia para um valor de cerca de 7 a 10 por dia, particular-mente durante a fase de produção.
A etapa de cultura do processo da invenção pode ser conduzidaem qualquer ambiente apropriado, tal como placas de Petri, frascos T ougarrafas rolantes, mas de preferência em vasos que têm volumes maiores,tais como, por exemplo, biorreatores.
Quando a seleção é um processo de perfusão, o sistema podeser, por exemplo, um biorreator com leito recheado estacionário, no qual ascélulas são imobilizadas sobre veículos sólidos. Este sistema é fácil de ope-rar, e com veículos e condições de cultura apropriadas, pode-se conseguiruma densidade celular muito alta (de ~107—108 cell/mL).
Um veículo sólido que pode ser usado de acordo com a presenteinvenção pode ser um microcarreador. Os microcarreadores são partículassólidas pequenas sobre as quais as células podem ser desenvolvidas emcultura em suspensão. As células são capazes de aderir e propagar sobre asuperficie.de microcarreadores. Tipicamente, os microcarreadores consistemem pérolas cujo diâmetro é entre 90 um e 300 jim. Os microcarreadores po-dem ser feitos de vários materiais que comprovadamente são bons para afixação e propagação de células, tais como, por exemplo, vidro, poliestireno,polietileno, dextrano, gelatina e celulose. Além disso, a superfície de micro-carreadores pode ser revestida com um material que promove a fixação ecrescimento de células, tais como, por exemplo, N,N-dietil-amino-etila, vidro,colágeno, ou proteínas recombinantes. Existem microcarreadores macropo-rosos e e não-porosos. As superfícies macroporosas dão livre acesso às cé-lulas para o interior do microcarreador depois da inoculação, e depois deentrar dentro do microcarreador, as células são protegidas contra as forçasde cisalhamento geradas por agitação mecânica e aeração no biorreator.
Um outro veículo que pode ser usado de acordo com a presenteinvenção pode ser, por exemplo, um disco, sendo este disco constituído defibras de poliéster não-tecidas unidas a uma folha de malha de polipropileno(vide, por exemplo, patente n- US 5.266.476). Tais discos são usualmentetratados de forma eletrostática para possibilitar que as células em suspensãoadiram aos discos e fiquem presas no sistema fibroso, onde elas permane-cem durante o processo de cultura inteiro. A densidade e a produtividadedas células, atingidas com células desenvolvidas sobre discos podem seraté dez vezes mais altas do que as células desenvovidas sobre microcarre-adores.
O processo para a produção de interferem beta glicosilado com-preende ainda, de preferência, uma etapa de coletar a colheita de cultura decélulas que contém interferem beta.
Em uma modalidade preferida, a colheita da cultura de células ésubmetida ainda a um processo de purificação.
O processo de purificação pode ser qualquer processo que levao interferem beta até a pureza requerida e pode conter qualquer combinaçãode etapas de purificação baseadas em cromatografia ou qualquer outra tec-nologia de purificação, tal como fracionamento com sal ou similares. A purifi-cação é conduzida de preferência de acordo com um segundo aspecto dapresente invenção.
Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a um processopara a purificação de interferon recombinante a partir de um fluido, compre-endendo as etapas de:
a) Submeter o fluido a uma cromatografia por afinidade;
b) Submeter o eluído da cromatografia de afinidade a uma cro-matografia por troca caiônica;
c) Submeter o eluído da cromatografia de troca catiônica a umacromatografia hidrofóbica por RP-HPLC.
A Etapa (a) é conduzida de preferência em uma coluna Blue Se-pharose, por exemplo, uma coluna Blue Sepharose de fluxo rápido. A Etapa(b) é conduzida de preferência em uma resina de carbóxi-metila, por exem-plo, em uma coluna CM Sepharose de fluxo rápido.Em uma modalidade preferida, o processo de purificação da in-venção compreende ainda, antes da Etapa (a), uma etapa de clarificar o flui-do por microfiltração.
Em ainda outra modalidade preferida, o processo de purificaçãocompreende ainda as etapas de:
a) realizar ultrafiltração e diálise,
b) submeter o dislisado a uma cromatografia por exclusão detamanho,
c) submeter o eluído da cromatografia de exclusão de tamanho auma filtração.
A Etapa (f) pode ser conduzida, por exemplo, por microfiltraçãoou nanofiltração.
A ultrafiltração é útil para a remoção de componentes de baixopeso molecular nos eluídos resultantes das etapas cromatográficas anterio-res. A ultrafiltração permite, por exemplo, remover o solvente orgânico, TFA,e os sais da etapa anterior, para equilibrar o interferon beta no tampão re-querido, ou para concentrar a molécula até a concentração desejada. Essaultrafiltração pode ser realizada, por exemplo, sobre um meio de ultrafiltra-ção que exclui os componentes que têm pesos moleculares abaixo de 5 kDa.
Caso a proteína purificada de acordo com o processo da inven-ção seja intencionada para administração a seres humanos, é vantajoso in-cluir etapas de remoção de vírus. Uma etapa de filtração para remoção devírus pode ser conduzida, por exemplo, entre as etapas (d) e (e), ou depoisda etapa (e). Mais preferivelmente, o processo compreende duas etapas deremoção de vírus.
A pureza que pode ser obtida com o processo de purificação deacordo com a invenção é, de preferência, > 80%, mais preferivelmente > 90% e com a maior preferência, > 98%.
O processo para purificar interferon beta de acordo com a pre-sente invenção compreende ainda, de preferência, uma etapa de formularinterferon beta purificado em uma composição farmacêutica, opcionalmentejunto com um veículo farmaceuticamente aceitável.
O interferon beta a ser produzido ou purificado de acordo com apresente invenção pode ser expressado por qualquer linhagem de células ouclone. Entretanto, é preferido usar uma linhagem de células do ovário dohamster chinês (CHO), designada DUKX-B11, que carece de atividade deDHFR (diidrofolato redutase), como a célula hospedeira para a preparaçãode interferon beta glicosilada. A seqüência de DNA que codifica o interferon-P humano está descrita, por exemplo, na patente n- US 5.326.859.
Uma modalidade preferida da presente invenção refere-se a ummétodo para produzir interferon-p humano recombinante em células trans-fectadas capazes de produzir pelo menos cerca de 100.000 Ul de interferon-P humano recombinante com produtividade celular específica (UI/106 célu-las/24 horas). De preferência, as células são capazes de produzir pelo me-nos cerca de 200.000 Ul ou pelo menos cerca de 200.000 Ul ou pelo menoscerca de 300.000 Ul ou pelo menos cerca de 400.000 Ul ou pelo menos cer-ca de 500.000 Ul ou pelo menos cerca de 600.000 Ul de interferon beta hu-mano recombinante com produtividade celular específica.
De preferência, a célula produtora de interferon beta é uma célu-la CHO que é transfectada com um constructo de ácido nucléico que com-preende pelo menos um elemento promotor/intensificador funcionalmenteligado ao gene de IFN-8 humano. Mais preferivelmente, o pelo menos umelemento promotor/intensificador compreende um promotor/intensificador deSV40. Mais preferivelmente, o constructo de ácido nucléico compreende pe-lo menos uma primeira unidade de transcrição composta do promo-tor/intensificador de SV40 ligado funcionalmente ao gene de IFN-8 humano,estando o gene de IFN-8 humano ligado funcionalmente à região de polia-denilação precoce de SV40 T Ag. É também altamente preferido que o cons-tructo de ácido nucléico compreenda ainda pelo menos uma segunda unida-de de transcrição composta de um promotor/intensificador de SV40, üm ge-ne de DHFR do camundongo e uma região de poliadenilação precoce quecontém SV40 T Ag poliA.
Outra modalidade da presente invenção refere-se a um cons-tructo de ácido nucléico que compreende pelo menos um elemento promo-tor/intensificador ligado funcionalmente ao gene de IFN-Í3 humano para sertransfectado para dentro de células, sendo distinguido pelo fato de que ascélulas transfectadas são capazes de produzir pelo menos cerca de 100.000Ul, pelo menos cerca de 200.000 Ul ou pelo menos cerca de 300.000 Ul oupelo menos cerca de 400.000 Ul ou pelo menos cerca de 500.000 Ul ou pelomenos cerca de 600.000 Ul de interferon-p humano recombinante com pro-dutividade celular específica (UI/106 células/24 horas).
Preferivelmente, pelo menos um elemento promo-tor/intensificador compreende um promotor/intensificador do SV40. Maispreverivelmente, o constructo de ácido nucléico compreende pelo menosuma primeira unidade de transcrição constituída do promotor/intensificadorde SV40 ligado funcionalmente ao gene de IFN-Í3 humano, estando o genede IFN-Í3 humano ligado funcionalmente a uma região de poliadenilação pre-coce de SV40 T Ag. Mais preferivelmente, o constructo de ácido nucléicocompreende ainda pelo menos uma segunda unidade de transcrição consti-tuída de um promotor/intensificador do SV40, um gene de DHFR do camun-dongo e uma região de poliadenilação precoce que contém SV40 T Ag poliA.
A invenção refere-se ainda a um interferon beta obtenível por umprocesso de acordo com a presente invenção.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição deinterferon beta que tem um perfil de glicosilação singular. Tal interferon betaé, de preferência, produzido por um processo de acordo com a presente in-venção.
Em uma modalidade, a proteína interferon-p humana recombi-nante glicosilada contém uma estrutura de oligossacarídeo que tem dois outrês sacarídeos fucose. Em uma modalidade preferida, a estrutura de oligos-sacarídeo compreende ainda um dissialil-glicano biantenário trifucosilado(Ne U2 Ac. Hexs. HexN AC4. Fuc3).
Em outra modalidade preferida, o padrão singular de glicosilaçãocompreende ainda uma estrutura biantenária não-sialilada(Hex5.HexNAc4.Fuc); uma estrutura triantenada dissialilada ou biantenáriadissialilada com estruturas repetidas de N-acetil-lactosamina (Neu-
Ac2.Hex6.HexNAc5.Fuc); uma estrutura triantenada trissialilada (Neu-Ac3.Hex6.HexNAc5.Fuc); uma estrutura triantenada trissialilada com estrutu-ras repetidas de N-acetil-lactosamina ou quadriantenada trissialilada (Neu-Ac3.Hex7.HexNAc6.Fuc); estrutura biantenaria monossialilada ou dissialiladacom duas unidades de fucose (Neu-Ac. Hexs. HexN AC4. Fuc2, NeuAc2- Hexs. HexN AC4. FUC2).
De preferência, o padrão singular de glicosilação compreendeglicanos com característica de um nível similar de ácido N-acetilneuramínico: ácido N-glicolilneuramínico aos padrões de glicosilação da proteína huma-na natural.
Em outra modalidade preferida, a composição de interferon betada invenção se caracteriza por um perfil de sialilaçao que compreende cercade 1 a cerca de 5% de N-glicanos não-sialilados, cerca de 5 a cerca de 25%de glicanos monossialilados, cerca de cerca de 55 a cerca de 75% de N-glicanos dissialilados, e cerca de 10 a cerca de 25% de N-glicanos trissialilados.
Um outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso do in-terferon beta de acordo com a presente invenção para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de doenças humanas, particularmente es-clerose múltipla, câncer, ou infecções virais.
A esclerose múltipla pode ser selecionada no grupo que consisteem esclerose múltipla recidivante, não-recidivante e de início precoce.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para tratarum indivíduo que necessita de tratamento com interferon-(3 de acordo com ainvenção, compreendendo administrar ao indivíduo a proteína interferon-phumana recombinante como aqui descrita.
De preferência, o tratamento é para esclerose múltipla. Mais es-pecificamente, a esclerose múltipla pode ser selecionada no grupo que con-siste em esclerose múltipla recidivante, não-recidivante e de início precoce.
Alternativamente, o tratamento é um tratamento contra tumores.
Em outra alternativa, o tratamento é um tratamento antiviral.Em outro aspecto da presente invenção, a invenção refere-se auma composição farmacêutica que compreende, como um ingrediente ativo,uma composição de interferon-p humano recombinante, isolado, purificado,como aqui descrito, e um veículo farmaceuticamente aceitável, para a admi-nistração da composição farmacêutica. De preferência, a composição farma-cêutica que tem atividade antitumòral ou antiviral, ou atividade contra escle-rose múltipla, compreende, como um ingrediente ativo, uma proteína interfe-ron-p humana recombinante, isolada, purificada, como aqui descrito, e umveículo farmaceuticamente aceitável para administração da composição far-macêutica.
Em ainda outro aspecto da presente invenção, a invenção refe-re-se a um artigo manufaturado que compreende um material de embalageme uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína interferon-p hu-mana recombinante, isolada, purificada, proteína, onde o material de emba-lagem compreende um rótulo ou bula indicando que a proteína interferon-phumana recombinante, como aqui descrita, pode ser administrada a sereshumanos para seu tratamento.
A proteína interferon-p humana recombinante, isolada, purifica-da, ou a composição farmacêutica aqui descrita, é usada, de preferência,para a fabricação de um medicamento para o tratamento de esclerose múlti-pla recidivante, não-recidivante e de início precoce. Os esquemas de dosa-gem para um indivíduo (paciente) específico podem ser determinados facil-mente pelos versados nessas técnicas, pois estes esquemas são bem co-nhecidos nessas técnicas.
Faz-se agora referência aos exemplos que se seguem, os quais,em conjunto com a descrição acima, ilustram a invenção de uma maneiranão-limitativa.
Geralmente, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentoslaboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares,bioquímicas, microbiologicas e de DNA recombinante. Tais técnicas estãoexplanadas inteiramente na literatura. Vide, por exemplo, "Molecular Clon-ing: A laboratory Manual" Sambrook et ai, (1989); "Current Protocols in Mo-lecular Biology" Volumes l-lll, editor Ausubel, R. M., (1994); Ausubel et ai,"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Baltimore,Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", JohnWiley & Sons, New York (1988); Watson era/., "Recombinant DNA", Scien-tific American Books, New York; editores Birren era/.; "Genome Analysis: ALaboratory Manual Series", Volumes 1-4, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York (1998); metodologias enunciadas nas patentes n25 US4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: ALaboratory Handbook", Volumes l-lll, editor Cellis, J. E., (1994); "Culture ofAnimal Cells - A Manual of Basic Technique" por Freshney, Wiley-Liss, N. Y.(1994), Terceira Edição; "Oligonucleotide Synthesis", editor Gait, M. J.,(1984) ; "Nucleic Acid Hybridization", editores Hames, B. D., e Higgins, S. J.,(1985) ; "Transcription and Translation", editores Hames, B. D., e Higgins, S.J., (1984); "Animal Cell Culture", editor Freshney, R. I. (1986); "ImmobilizedCells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Clon-ing" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Volume 1-317, AcademicPress; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", AcademicPress, San Diego, CA (1990); Marshak era/., "Strategies for Protein Purifica-tion and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press(1996); sendos todos estes documentos e publicações aqui incorporadascomo referência, como se aqui inteiramente enunciadas.
Tendo agora sido descrita esta invenção, os versados nessastécnicas devem avaliar que a mesma pode ser realizada dentro de uma am-pla faixa de parâmetros, concentrações e condições equivalentes, sem fugirdo espírito e do âmbito da invenção, e sem experimentação excessiva.
Embora esta invenção tenha sido descrita com relação a suasmodalidades específicas, deve-se entender que ela é suscetível a outrasmodificações. Este pedido de patente pretende cobrir quaisquer variações,usos ou adaptações da invenção que se segue, geralmente, os princípios dainvenção e incluindo esses afastamentos da presente descrição, conformeeles venham a ocorrer dentro da prática conhecida ou costumeira dentro dastécnicas às quais a invenção pretence, e conforme possam ser aplicadas àscaracterísticas essenciais aqui anteriormente enunciadas, como se segue noâmbito das reivindicações apensadas.
Todas referências aqui citadas, incluindo artigos ou resumos deperiódicos, pedidos de patente pubicados ou não-publicados nos EstadosUnidos ou em outros países, ou quaisquer outras referências, são aqui intei-ramente incorporadas como referência, incluindo todos os dados, tabelas,figuras e textos apresentados nas referências citadas. Adicionalmente, o teorinteiro das referências citadas dentro das referências aqui citadas tambémsão aqui inteiramente incorporadas como referência.
Uma referência a etapas dos métodos conhecidos, etapas demétodos convencionais, métodos conhecidos, ou métodos convencionais,não é de forma alguma uma admissão de que qualquer aspecto, descriçãoou modalidade da presente invenção está descrita, enunciada ou suferidanas técnicas relevantes.
A descrição precedente das modalidades específicas revelaráassim completamente a natureza genérica da invenção pode, aplicando oconhecimento existente nas técnicas anteriores (incluindo o tero das refe-rências aqui citadas), modificar e/ou adaptar facilmente para várias aplica-ções essas modalidades específicas, sem experimentação excessiva, semfugir do conceito genérico da presente invenção. Portanto, pretende-se quetais adaptações e modificações estejam dentro da amplitude do significadode equivalentes das modalidades descritas, baseado nos ensinamentos eorientações aqui apresentadas. Deve-se entender que a fraseologia ou ter-minologia aqui utilizada é com o propósito descritivo e nãó-limitativo, de talmodo que a terminologia ou fraseologia do presente relatório descritivo deveser interpretada pelos versados nessas técnicas à luz dos ensinamentos eorientações aqui apresentadas, em combinação com o conhecimento dosversados nessas técnicas.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1 - Preparação de um Novo Clone de Célula do Ovário de Hams-ter Chinês que Produz IFN-Beta em Altos Níveis
Este exemplo descreve a geração de um clone de CHO produtorde interferon beta.
O procedimento básico, particularmente com relação à prepara-ção do plasmídeo de expressão, está descrito em Mory era/. (1981).
Uma visão geral sobre o processo para gerar o clone está repre-sentada na Figura 1. Um fragmento de DNA que compreende a região codi-ficadora de interferon-B humano foi isolado a partir de uma biblioteca deDNA genômico de células do sangue periférico humano. Uma linhagem decélulas CHO deficiente em DHFR foi transfectada com um plasmídeo re-combinante que contém a seqüência codificadora de IFN-Í3 humano e o ge-ne de DHFR do camundongo como um marcador selecionável e ampliável.Depois da seleção em meio isento de timidina, a ampliação do gene commetotrexato (MTX), e clonagem, uma célula produtora de IFN-p-1a em altosníveis foi isolada. As células foram submetidas à caracterização genotípica efenotípica.
Construção do Plasmídeo de Expressão Portador do MFN-Í3 e dos Genes demDHFR
Um vetor de expressão que contém a seqüência genômica codi-ficadora do IFN-B humano e também o gene de resistência a DHFR do ca-mundongo foi construído. Esta construção eliminou a necessidade de co-transfecção das células CHO hospedeiras com dois plasmídeos separados,um que compreende a seqüência codificadora de IFN-p e o segundo quecompreende a seqüência de DHFR do camundongo, como conhecido, atra-vés de Chernalovsky et ai, 1984.
O vetor de expressão que contém a seqüência codificadora deIFN-p era destituído do IFN-p* 3'UTR, e assim sendo, da região de poliadeni-lação de IFN-p.
O vetor de expressão da invenção continha, portanto, duas uni-dades de transcrição, uma primeira unidade de transcrição de IFN-(3 do pro-motor/intensificador de SV40, a seqüência codificadora do gene de IFN-phumano IFN-Í3 e a região de poliadenilação precoce de SV40 T Ag, e umasegunda unidade de transcrição de DHFR constituída do prom-tor/intensificador do SV40, o gene de DHFR do camundongo e a região depoliadenilação precoce que contém SV40 T Ag poliA.
Estas unidades de transcrição eram seguidas de seqüências doplasmídeo pBR322 portador da origem de replicação bacteriana de ColEI edo gene de resistência à ampicilina.
A estrutura do vetor de expressão foi verificada por análise domapa de restrição e por seqüenciamento completo (seqüenciamento auto-matizado de filamento duplo. A seqüência correta dos fragmentos, usadapara sua construção, foi confirmada e mambas direções.
Descrição da Célula Hospedeira
Uma linhagem de células do ovário do hamster chinês (CHO),designada DUKX-B11, que carece de atividade de DHFR (diidrofolato redu-tase), foi usada como a célula hospedeira. A linhagem de células foi isoladaa partir da linhagem de células CHO-K1, que requer prolin (Kao e Puck,1968) por mutagênese com metanossulfato de etila, e em seguida, por radi-ação gama. Os mutantes deficientes de DHFR foram selecionados por ex-posição a uma [3H]-desoxiuridina de alta atividade específica (Urlaub e Cha-sin, 1980).
Os mutantes completamente deficientes requerem glicina, hipo-xantina e timidina para crescimento. O papel fundamental de DHFR na sín-tese de precursores do ácido nucléico, junto com a sensibilidade das célulasdeficientes de DHFR aos análogos tais como metotrexato (MTX), apresen-tam duas vantagens importantes. Em primeiro lugar, a transfecção dessascélulas deficientes em DHFR com plasmídeos que contêm um gene de DH-FR permite a seleção de células recombinantes que crescem em meio isentode timidina. Em segundo lugar, a cultura destas células em meios seletivosque contêm concentrações crescentes de MTX resulta na ampliação do ge-ne de DHFR e do DNA associado (Kaufman e Sharp, 1982; e Sambrook, J.,Fritsch, E.F., "Molecular Cloning : A Laboratory Manual", Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Geração do Clone
Como delineado na Figura 1, células CHO deficientes em DHFR,dependentes de ancoragem, foram transfectadas pelo procedimento de pre-cipitação com fosfato de cálcio (Graham, F.L. e Van Der, E.B., 1973; Buss-linger, et ai, 1981) com o plasmídeos que contém a seqüência codificadorade h-IFN-B e com o gene marcador de mDHFR, como descrito acima. Paraampliar o gene transfectado, os clones selecionados foram submetidos a umtratamento com MTX (metotrexato). Os clones foram isolados depois da se-leção de MTX.
Transfecção
A linhagem de células CHO deficiente em DHFR, DUKX-B11, foicultivada na Mistura Nutriente de Ham F12 suplementada com 10% de FBS,a 37 °C, 5% de C02.
No dia anterior à transfecção, as células CHO DUKX-B11 foramsemeadas a 5 x 105 células/9 cm de placa. Os co-precipitados CaP04-DNAforam preparados misturando o DNA do vetor, dissolvido em 0,45 ml_ deTris-HCI 10 mM, pH 7,9, EDTA 0,1 mM, com 0,05 mL de uma solução 2,5 MdeCaCI2.
A seguir, 0,5 mL de Na2HP04 280 mM, HEPES 50 mM, pH 7,1,foram adicionados sob vascolejamento suave, e a mistura foi mantida por30-40 minutos à temperatura ambiente, para permitir a precipitação. Depoisde adicionar CaP04-DNA às células por 30 minutos, 9 mL de meio de culturade células foram adicionados, e as células foram devolvidas para a incuba-dora por 4 horas. Depois disso, o meio foi removido e as células receberamum choque osmótico com 10% de glicerina no meio por 4 minutos. As célu-las foram então tripsinizadas e subcultivadas em uma razão divisória 1:4 a1:10 em um meio seletivo que consistia em Meio de Eagle Modificado deDulbecco (DMEM) sem timidina, mas suplementado com 150 ug/mL de pro-lina e 10% de FBS dialisado. As culturas foram mantidas a 37 °C e 8% deC02, e o meio seletivo foi trocado a cada 3-4 dias.
Isolamento de uma Linhagem de Células Produtoras de hlFN-B ConstitutivaCélulas produtoras de interferon beta foram isoladas depois de10-12 dias por tripsinização com discos de papel de 3 mm embebidos emtripsina. Quarenta e três clones foram apanhados, os clones individuais fo-ram desenvolvidos, e os sobrenadantes da cultura de células foram testadosquanto à produção de hlFN-í3 por ELISA. Três clones que produziram maisdo que 30.000 Ul de IFN-6/106 células/24 horas foram selecionados paraampliação gênica.
Cada um dos clones foi submetido a uma cultura com baixasconcentrações de MTX. A população inteira das células que sobreviveramao tratamento foi submetida a concentrações mais altas de MTX. A subclo-nagem e a seleção de clones foram realizadas apenas depois do último es-tágio de ampliação. Os altos produtores selecionados (mais do que 400.000UI/106 células/24 horas) foram submetidos a estudos de estabilidade de clo-ne. Um clone alto produtor relativamente estável foi selecionado e subclona-do. A partir dos clones resultantes, um clone alto produtor estável foi sele-cionado.
A ampliação aumentou os níveis de produção (produtividade es-pecífica) de IFN-p-1a de 30.000 para 500.000 UI/106 células/24 horas, de-terminado por ELISA.
Foram realizadas análises Northern blot depois do isolamentoincial dos clones com alta produtividade de IFN-í3-1a. Um único RNAm dehlFN-B de cerca de 0,9 kb, como esperado a partir do constructo de expres-são, foi expressado (dados não-ilustrados).
Para a análise Northern blot do RNA total dos clones primários,o blot foi preparado da maneira que se segue.
Vinte ug de RNA total foram separados por eletroforese sobregéis de agarose com formaldeído. O RNA foi transferido para uma membra-na de náilon e hibridizado para uma sonda do DNA de IFN-p. Os marcadoresde tamanho (M) são 28S e 18S rRNA, que correspondem a 4.700 e 1.900nucleotídeos, respectivamente (não-ilustrado).
Produtividade
A produtividade celular foi então testada da maneira que se se-gue. O meio de cultura (crescimento) de tecido foi DMEM (Meio de EagleModificado de Dulbecco), suplementado com prolina (150 mg/L) e 10% deFBS (doro fetal bovino) ou em meio isento do soro, por exemplo, Ex-Cell 302daJRH.As células do clone produtor de interferon foram semeadas emfrascos TC80 (2 x 10^ células/frasco) em 30 ml_ de meio de crescimento(DMEM e FBS, ou meio isento de soro). Quando a confluência inicial foi a-tingida, determinado por exame microscópico, o meio foi substituído por 20ml_ de meio fresco, e as culturas foram incubadas a cerca de 32 °C por24 horas. Foram obtidas amostras do meio de cultura de cada frasco. O ní-vel de IFN-f3-1a foi determinado por ELISA do meio de cultura com um kitELISA comercial (por exemplo, o kit ELISA Toray da Toray, Japão).
A produtividade celular específica foi calculada multiplicando ovalor de UI/mL de IFN-3-1a produzido por 24 horas pelo volume por frascoTC80 e dividindo pelo número total de células (em milhões) por frasco.
Resultados e Conclusões
O clone de célula produtor de interferon beta era uma linhagemde células estável, que tem uma alta capacidade de produção de interferon-phumano recombinante na faixa entre cerca de 100.000 Ul em produtividadecelular específica (UI/106 células/24 horas) e cerca de 600.000 Ul em produ-tividade celular específica. A produtividade média da nova linhagem de célu-las foi de 556.000 ± 119.000 UI/106 células/24 h.
A morfologia celular geral também foi examinada por microsco-pia em contraste de fase um a quatro dias depois da semeadura. A morfolo-gia foi documentada com fotomicrografias (não-ilustradas). Os resultadosindicam que em baixa densidade (24 a 48 h depois da semeadura) as célu-las apresentavam morfologia arredondada fusiforme (resultados não-ilustrados). Na confluência, as células formam monocamadas densas quecompreendem células semelhantes a epitélios, alongadas fusiformes e me-nores, firmemente compactadas (resultados não-ilustrados). As característi-cas morfológicas apresentadas por estas células eram típicas de células CHO.
Determinação da Seqüência do DNA da Região Codificadora de hlFN-B emCélulas do Clone
Os produtos da PCR do DNA derivados do RNA mensageiro(RNAm) de hlFN-(3 foram usados para determinar as seqüências de núcleo-tídeos da região codificadora, pois a seqüência do RNAm fornece compro-vação direta que os transcritos do RNA estão processados corretamente.Procedimento para o Seqüenciamento do DNA
DNAc e Reações PCR
O RNA celular total foi preparado a partir das células no estágioexponencial de crescimento em culturas em frascos T (Chomczynski e Sac-chi, 1987). O DNA complementar (DNAc) foi sintetizado a partir de amostrasdo RNAm em uma reação que continha 2 microgramas (jxg) de RNA total,hexâmeros aleatórios 0,5 ^M, MgCI22,5 mM, tampão "IX PCR II [Tris-HCI 10mM (pH 8,3), KCI 50 mM], 0,5 mM de cada um entre dATP, dCTP, dGTP, edTTP, 40 unidades de Inibidor de RNase, e 200 unidades de TranscriptaseReversa em um volume final de 100 uJ.
O modelo de RNA, o iniciador e água isenta de nuclease foramcombinados e incubados a 65°C por 10 minutos e foram então colocados emum banho de gelo. Os componentes remanescentes foram adicionados e areação foi incubada a 42°C por 60 minutos, depois a 70°C por 15 minutos efoi depois mantida a 4°C indefinidamente. Os produtos TR (transcriptase re-versa) (DNAc's) foram estocados a -20°C até uso posterior. Como um con-trole, uma reação com todos componentes, exceto a transcriptase reversa,foi preparada. O controle "sem TR" é para excluir a possibilidade improvávelque as preparações de RNA tivessem contaminação de DNA.
A ampliação por PCR foi feita usando os iniciadores SRB1 AP1e AP2 para os modelos de DNAc. As seqüências destes iniciadores são asseguintes:
SRB1 AP1: CCTCGGCCTCTGAGCTATTC (SEQ IP NO: 1)
SRB1 AP2: CACAAATAAAGCAI I I I I I I (SEQ ID NO: 2)
As reações da PCR consistiram no seguinte: 4,0 u.L de misturade reação de DNAc, 50 pmol de cada para de iniciadores, e 25 uL de HotS-tarTaq™ Master Mix em um volume de reação de 50 jiL. As reações foramaquecidas a 95°C por 15 minutos, e em seguida, 30-35 ciclos de: (a) 94°Cpor 30 segundos, (b) 55°C por 30 segundos, e (c) 72°C por 1 minuto. Umciclo final, idêntico ao primeiro 30-35, mas com o tempo de incubação a72°C prolongado até 10 minutos, foi então feito.
Os produtos da PCR de hlFN-3 foram purificados por eletrofore-se em gel de agarose com baixo ponto de fusão (LMP), e em seguida, extra-ção usando o /c/f de extração em gel QIAquick (Qiagen).
Seaüenciamento do DNA Ampliado
Os produtos da PCR foram seqüenciados diretamente com o KitBig Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction com AmpliTaq®DNA Polimerase. Todas reações de seqüenciamento foram analisadas sobregéis 5,75% Long Ranger™ em seqüenciadores de DNA automatizados A-BI373-S. Os dados brutos foram rastreados e analisados usando o softwareABD Analysis.
Resultados
A amplicação por PCR resutou na geração do fragmento previs-to de aproximadamente 815 pb. Nenhum produto da PCR foi observado parao controle "sem TR" nem para os outros controles negativos.
Os dados completos do seqüenciamento foram obtidos para aregião codificadora da proteína do gene de hlFN-B; todos nucleotídeos foramlidos em dois ou mais eletroferogramas (dados não-ilustrados). Quando asseqüências foram comparadas com o vetor de expressão, nenhuma diferen-ça foi encontrada (dados não-ilustrados).
Conclusões
Os dados do seqüenciamento demonstram que o gene de hlFN-B integrado dentro das células do genoma do clone está corretamente trans-crito no RNAm de hlFN-3.
Determinação do Número de Cópias do Gene
O número de cópias do gene foi determinado por análise Sou-thern blotde digestões com BamHI.
Os iniciadores específicos usados para construer as sondas pa-ra a análise do número de cópias do gene são os seguintes:
(i) 5': PR221626: ATGACCAACAAGTGTCTCCTCC (SEQ ID NO: 3)
(ii) 3': PR231217 ACTTACAGGTTACCTCCGAAAC (seq id no: 4)Procedimentos para a Preparação do DNA qenômico e Southern blottina
O DNA genômico foi isolado a partir de culturas em frascos T emcrescimento exponencial das células, usando uma modificação do métodode precipitação com sal (Martinez era/., 1998). Resumidamente, as céluasforam colocadas em suspensão em um tampão de Tris-NaCI-EDTA e depoislisados co um tampão de Tris-NaCI-EDTA-SDS. Esta suspensão foi tratadade um dia para o outro com proteinase K. Depois da adição de uma soluçãosaturada de sal e centrifugação, o DNA genômico foi precipitado pela adiçãode isopropanol à fase aquosa. Depois de uma lavagem com etanol a 70%, op'lete de DNA foi recolocado em suspensão em solução de TE/RNase A(Tris-HCI10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, 20 ng/mL de RNaseA).
Alíquotas de todas preparações de DNA genômico foram digeri-das com Afllll, Bbsl, Bgll, Dral, Hincll, Pstl, e Xmnl. Padrões foram prepara-dos por digestão da amostra de DNA do vetor de expressão com as mesmasedoncleases de restrição usadas para as amostras genômicas. O DNA foifracionado por tamanho por eletroforese em géis de agarose e depois trans-ferido em 10X SSC para membranas de náilon por ação capilar. A quantida-de de DNA genômico carregada foi de 0,5 |xg. As manchas for preparadaspara hibridização para um fragmento de hlFN-p marcado com 32P que foiampliado por PCR a partir do plasmídeo, usando os iniciadores indicadosacima. A pré-hibridização e a hibridização foram feitas a 65°C.
As determinações do tamanho foram feitas baseado na migra-ção das bandas visualizada por 32P em uma auto-radiografia. O vetor de ex-pressão foi usado como controle.
As determinações do número de cópias basearam-se nos níveisrelativos de 32P nas bandas, quantificados em um Phospholmager™ modelo445SI (Molecular Dynamics; Sunnyvale, CA). As auto-radiografias foram fo-tografadas para fornecer um registro dos resultados (dados não-ilustrados).
Resultados
As determinações dos tamanhos dos fragmentos gerados paraas células produtoras de interferon beta do clone foram compliadas para to-da digestões.A digestão com enzima do DNA extraído a partir da linhagem decélulas produtoras de interferon beta resultou na produção de bandas proe-minentes que eqüivaliam àquelas previstas a partir do vetor de expressãopara as digestões com BamHI, Bgll, Dral e Hincll. Uma banda muito fraca(-1,77 kb) foi observada com os DNAs genômicos digeridos com Bgll, muitopossivelmente um resultado de digestão incompleta. Estas enzimas de res-trição flanqueiam a unidade de expressão de hlFN-p, indicando que umaunidade intact, functional e de comprimento inteiro se integrou dentro do genoma.
Nas digestões remanescentes, foram observadas diferenças nospadrões de formação de bandas entre o vetor de expressão e os DNAs ge-nômicos. Isso não é inesperado pois algum rearranjo deve ocorrer quando ovetor circular se integra dentro do genoma de células CHO.
Os níveis do número de cópias determinados para as células doclone foram em média 96-105 cópias por célula. Por exemplo, para um gru-po de células, o número médio de cópias do gene (n=3) foi de 105, com umdesvio-padrão de 23 e uma CV (%) de 22.
Determinação do Tamanho do RNAm
O RNA total foi isolado a partir de células CHO DUKX produtorasde interferon beta em crescimento exponencial e não transfectadas(Chomczynski e Sacchi, 1987). As sondas usadas incluíam uma sonda dehlFN-p marcado com 32P, preparada como descrito na Seção "Determinaçãodo Número de Cópias do Gene" e uma sonda de controle do DNAc G3PDH(Clontech; Paio Alto, CA).
Procedimento
O RNA total, 5 jug por fileira, foi fracionado o tamanho por eletro-forese em géis de agarose que continham formaldeído como denaturante.As amostras foram carregadas em conjuntos de duplicatas. O RNA foi trans-ferido em 10X SSC para membranas de náilon por ação capilar. A pré-hibridização e a hibridização foram feitas a 65°C na solução de Church eGilbert modificada descrita na Seção "Análise do Mapa de Endonucleasesde Restrição". Os blots foram hibridizados para uma sonda de hlFN-p mar-cado com P e uma sonda de controle do DNAc G3PDH. Os tamanhos dasbandas foram estimados a partir de uma auto-radiografia dos blots.
Resultados e Conclusões
Uma espécie importante de RNAm de IFN-p foi observada paraas células. O tamanho do RNAm foi estimado como sendo um RNAm de 0,9.
Este tamanho se correlaciona com um RNAm iniciando no sítio de iniciaçãoda transcrição de SV40, e resultando em um transcrito de cerca de 800 nu-cleotídeos sem considerar a cauda poliA.
Conclusões Gerais e Sumário
Os estudos fenotípicos e genotípicos sobre as células produto-ras de interferon beta conformaram a identidade a a consistência das células.
A integração cromossômica do gene de hlFN-B dentro do geno-ma de células CHO foi demonstrada por estudos de hibridização in situ.
A comparação dos padrões de mapeamento de endonucleasesde restrição, seqüências de DNA e análises do RNAm das células não indi-cou qualquer evidência de rearranjos de DNA significativos ou mutaçõespontuais do gene de hlFN-B.
Os níveis do número de cópias do gene de hlFN-p foram medi-dos por análise Southern blotáo DNA extraído das células do clone de acor-do com a presente invenção. Os resultados indicaram que os níveis do nú-mero de cópias do gene ficavam nas mesmas faixas para todas as células,independentemente dos níveis duplicados da população.
A análise Northern blot do RNA preparado a partir das célulasindicou uma única banda com um tamanho de aproximadamente 0,9 kb.
As análises das seqüências do DNAc das células confirmaram aexatidão da seqüência do RNAm, enquanto que as seqüências do DNA ge-nômico das regiões de controle 5' e 3' do gene de hlFN-p comprovaram aintegração da unidade de transcrição complete de IFN-B.
Em conclusão, demonstrou-se que as células produtoras de in-terferon beta sintetizaram os transcritos do RNAm de hlFN-B com a seqüên-cia correta da região codificadora de proteína, indicando que as células pro-dutoras de interferon beta produzem o IFN-Í3 humano recombinante (IFN-Í3-1a) com a seqüência correta de aminoácidos primários.
Para a caracterização genotípica, foram realizadas análises domapa de restrição nas células produtoras de interferon beta. Múltiplas diges-toes foram separadas por eletroforese em gel de agarose, transferidas paramembranas de náilon e hibridizadas para sondas marcadas específicas parao hlFN-B. Os perfis dos fragmentos de restrição consistentes indicaram aintegração de uma unidade de expressão de hlFN-B intacta funcional, emtodos os bancos de células.
Os números de cópias do gene de hlFN-p foram determinadospor análise Southern blot do DNA extraído das células produtoras de interfe-ron beta (dados não-ilustrados). Os resultados indicam que os números decópias do gene são de cerca de 100 cópias por célula, o que é cerca dequarto vezes mais alto do que para o clone descrito na literatura (Chema-jovsky et ai, 1984).
Por análise Northern blot, um RNAm de cerca de 0,9 kb, quecodifica o gene de hlFN-8, foi identificado para as células a partir do clone(dados não-ilustrados).
Os DNAcs de hlFN-B preparados a partir dos RNAm s das célu-las foram seqènciados e os resultados indicaram que para as células, a se-qüência do gene de hlFN-B era 100% idêntica às seqüências esperadas.Assim sendo, o gene de hlFN-B está corretamente transcrito dentro doRNAm.
A seqüência do DNA genômico das regiões 5' e 3' que flanquei-am o gene de hlFN-B gene foi determinada para as células do clone e era100% idêntica às seqüências correspondentes do vetor de expressão e àseqüência publicada do gene de hlFN-B.
A única integração cromossômica do gene de hlFN-B foi de-monstrada também por hibridização fluorescente in situ (FISH, resultadosnão-ilustrados).
As análises apresentadas acima demonstraram também a esta-bilidade da linha de produção.Pode-se presumir, assim, que o gene transfectado está integra-do de forma estável no genoma das células produtoras de interferon beta.
EXEMPLO 2 - Proceso para a Produção de Interferon beta
O objetivo global deste experimento foi desenvolver um proces-so para produzir IFN beta-1a a partir do clone descrito no Exemplo 1 sobcondições isentas de soro.
O processo isento de soro foi desenvolvido em escala de biorre-ator de 75L com veículos Fibra-Cel® do leito interno recheado.
As células foram descongeladas e expandidas durante 21 diasem um meio isento de soro disponível comercialmente, que tem as seguintesmodificações:
Tabela 1
Modificação do Meio Isento de Soro
<table>table see original document page 41</column></row><table>
30 x 10 células foram semeadas no biorreator de 75 L (alta se-meadura).
As corridas foram divididas nas seguintes fases:
- uma fase de crescimento I a 37 °C (até o dia de funcionamento2 ou dia de funcionamento 4 ou até quando a taxa de consumo de glicose(GCR) for > 2,0 ± 1,0 g/L/dia);
- uma fase de crescimento II a 35 °C (até o dia de funcionamento7 ou até aquando a texa de consumo de glicose (GCR) > 8,0 ± 0,5 g/L/dia);
- uma fase de produção a 33°C.
Esta estratégia de temperatura resultou em uma produtividadede cerca de 6,0 x 106 UI/mL bio por dia. Esta produtividade é cerca de cincovezes mais alta do que a produtividade do clone descrito na literatura (Cher-najovsky et ai, 1984) em meio que contém soro.
Foi testado ainda se a adição de N-acetil-cisteína (NAC) isola-damente ou em combinação com zinco (NAC+Zn) tinha um efeito benéficosobre a produtividade. A adição de NAC ou NAC + Zn aumentou a produtivi-dade para cerca de 12 x 106 UI/mL de bio por dia no final da corrida.
Uma densidade de células 66% mais baixa (1,3 x 109 células)também foi testada para avaliar seu impacto sobre a duração da fase decrescimento, metabolismo e produtividade.
O metabolismo e a produtividade não foram afetados pela baixasemeadura. O único impacto da baixa semeadura foi a adição de dois dias àfase de crescimento.
Resumindo, as condições finais usadas para a produção de in-terferon beta foram as seguintes:
<table>table see original document page 42</column></row><table> EXEMPLO 3 - Purificação do Produto Proteíco Interferon
O processo de purificação do IFN-|3-1a a partir do sobrenadanteda cultura de células incluiu quatro estágios cromatográficos e quatro está-gios de filtração, como ilustrado na Figura 2. Os estágios de purificação fo-ram realizados na seguinte ordem:
• Estágio I: Clarificação da colheita por filtração
• Estágio II: Cromatografia de afinidade em uma coluna BlueSepharose 6 fast flow (6 FF);
• Estágio III: Ultrafiltração
• Estágio IV: Cromatografia de troca catiônica, usando, de prefe-rência, uma coluna CM Sepharose FF;
• Estágio V: Cromatografia hidrofóbica RP-HPLC;
• Estágio VI: Ultrafiltração e diálise;
• Estágio VII: Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SE);
• Estágio VIII: Microfiltração.
A purificação do ingrediente ativo começou com cromatografiade afinidade com corante em coluna Blue Sepharose 6 FF (BS 6 FF), que foio estágio de purificação principal. A quantidade de proteínas derivadas dascélulas hospedeiras, bem como do DNA das células CHO rompidas, foi re-duzida em várias ordens de grandeza, e portanto, o IFN-p-1a no eluído daBS 6 FF foi enriquecido significativamente. Antes de o eluído ser carregadona próxima coluna, realizou-se uma ultrafiltração para reduzir o volume dasolução e excluir o material de baixo peso molecular.
Para obter IFN-(3-1a altamente purificado, três tipos principais deseparação de proteínas baseados em colunas foram escolhidos. A cromato-grafia de troca iônica na resina CM-sepharose FF resin remove o ácido nu-cléico e proteínas derivadas de FBS/CHO. A HPLC em fase reversa reduziupirogênios, proteínas residuais derivadas de células hospedeiras e as formasdegradadas de IFN-f}-1a. Um estágio final de polimento da filtração em gelfoi realizado usando a resina Sephacryl S-100 HR. O eluído foi microfiltrado(0,22 fim) e estocado a -70 °C ou menos.
Todos os materiais de partida usados para a preparação detampões e soluções de limpeza obedecem à Farmacopeia Européia e/ouUSP ou são de grau analítico ou reagente.
EXEMPLO 4: Análise da Sialilacão
O IFN-beta purificado foi sumetido à análise do perfil de sialila-cão por ES-MS (Espectrometria de Massas por Eletrospray), com os seguin-tes resultados:
<table>table see original document page 43</column></row><table>
EXEMPLO 5 - Análise de glicoformas
Para analisar ainda mais o IFN-í3-1a obtido pelo novo processo,as glicoformas da proteína foram analisadas. Como descrito anteriormente,as proteínas glicosiladas ocorrem freqüentemente como uma mistura de di-ferentes glicoformas, ou proteínas que têm estruturas de sacarídeos diferen-tes em sua glicosilação. Várias técnicas foram usadas para analisar estasglicoformas, como descrito mais detalhadamente abaixo, incluindo espec-troscopia de massas por eletropulverização, FAB-MS, MALDI-MS, espec-troscopia de massas tandem (MS/MS) e GC-MS (estudos de ligação). Estasdiferentes técnicas indicaram todas que das estruturas de sacarídeos dife-rentes estudadas, uma dessas estruturas estava recém-presente no IFN-8-1 a obtido a partir do clone.
Determinação da Distribuição de Glicoformas por Espectroscopia Massaspor Eletropulverização
Método
Amostras por volume de IFN-3-1a foram obtidas pelo clone, u-sando espectrometria de massas por eletropulverização (ES-MS). O métodoestá descrito, por exemplo, por Fenn, et ai, (1989).
MS/MS de glicanos. Esta técnica permitiu um rápido monitora-mento da distribuição de glicoformas das amostras a granel no nível demassa molecular. Este método está descrito, por exemplo, por Domon, B. eCostello, CE. (1988).
Resultados
Os resultados estão apresentados nas Figuras 3-5. Em todasfiguras, os desenhos esquemáticos dos vários oligossacarídeos estão ilus-trados no topo de cada pico. As Figuras 3 e 4 ilustram os espectros de ES-MS transformados de várias bateladas lotes de IFN-B-1a a partir do interfe-ron beta obtido pelo novo processo.
Em todas as bateladas testadas, as principais glicoformas eramestruturas de carboidratos biantenários dissialilados (pico C) e monossialila-dos (pico B) fucosilados no núcleo, e as glicoformas minoritárias correspon-diam ao biantenário não-sialilado fucosilado no núcleo (pico A), ao trissialila-do fucosilado no núcleo (pico E) e 2 outras estruturas complexas minoritáriasfucosiladas no núcleo (picos D e F).
Os sinais menores a 22.524 Da ± 0,01%, atribuídos aos glicanosbiantenários dissialilados difucosilados (NeuAc2.Hex5.HexNAc4. Fuc2), fo-ram detectados por ES-MS em amostras do IFN-(3-1a derivado do interferonbeta obtaido pelo novo processo. Esta glicoforma pode ser definida tambémcomo glicano biantenário com antena de sialila Lewis (Lex). Deve-se assina-lar que o glicano de Lewis x (Lex), constituído da estrutura Hex. HexNAc.Fuc,encontrado comumente em glicoproteínas sobre as superfícies de linfócitos(L-selectina) e também células endoteliais (Cummings, 1999; Dell e Morris,2001).
Outra glicoforma minoritária centrada em um valor médio de pe-so molecular de 22.670 Da ± 0,01%, com quantidade média de 4% de todasglicoformas e atribuída a um glicano biantenário dissialilado trifucosilado(Neu2Ac.Hex5.HexNAc4.Fuc3) foi detectada por ES-MS nos lotes deIFN-8-1a do interferon beta obtido pelo novo processo, independentementeda escala de produção. A quantidade média desta glicoforma minoritária éde 4%, com uma SD de 0,90.
Conclusões
O padrão de glicoformas do IFN-í3-1a derivado do interferon betaobtido pelo novo processo foi analisado por ES-MS.
Os sinais menores, atribuídos a glicanos difucosilados, encon-trados por ES-MS no IFN-f3-1a do interferon beta obtido pelo novo processo,foram detectados por MALDI-MS. Uma glicoforma minoritária adicional (mé-dia de 4% das glicoformas totais), atribuída a uma estrutura trifucosilada, foidetectada por ES-MS no produto do interferon beta obtido também pelo novoprocesso.
Análise de Carboidratos por FAB-MS. MALDI-MS, espectroscopia de mas-sas tandem (MS/MS) e GC-MS (estudos de ligação)
Amostras de IFN-B-1a a granel derivadas do interferon beta ob-tido pelo novo processo foram submetidas a estudos extensos de caracteri-zação de carboidratos. A composição de carboidratos de IFN-B-1a foi obtidausando análises FAB-MS, MALDI-MS, Nanospray-MS/MS e estudos de liga-ção (GC-MS) de IFN-8-1a permetilado após digestão tríptica e com do pepti-de com N-glicosidase F. A determinação do sítio de glicosilação foi realizadapor análises FAB-MS de peptídeos quimiotrípticos digeridos previamentecom tripsina e N-glicosidase F.Método
A mistura de glicopeptídeos clivados de forma tríptica do IFN-Í3-1a foi tratada com a enzima peptídeo-N-glicosidase F (como descrito, porexemplo, por Tarentino et ai, 1985).
Depois de interromper a reação (por secagem por congelamen-to), o digerido resultante foi purificado por um cartucho C18 Sep-pak. Oscarboidratos que eluíram na fração de 5% de ácido acético foram permetila-dos usando NaOH/iodeto de metila, como descrito, por exemplo, por Costel-lo(1997).
Uma parte do glicano permetilado foi analisada por FAB-MS iô-nica positiva (obtida em faixas baixas de massa para íons de fragmentos efaixas altas de massa para íons moleculares), como descrito, por exemplo,por Barber, et ai (1981) e Taylor (1983).
A espectrometria de massas MALDI foi realizada como descrito,por exemplo, por Hillenkamp, et ai, 1991.
A espectrometria de massas por nanospray foi realizada comodescrito, por exemplo, por Wilm e Mann 1996.
Os oligossacarídeos permetilados remanescentes foram usadospara análise de ligações por cromatografia gás-líquido/Espectrometria demassas (GC/MS) depois de derivação, como descrito, por exemplo, porGray, 1990.
Finalmente, para observar o peptídeo que contém o sítio poten-cial de glicosilação Asn 80, os peptídeos trípticos foram digeridos com peptí-deo N-glicosidase F e purificados por Sep-pak. As frações em propanol(20%-40%) do Sep-pak foram subdigeridas com quimiotripsina e analisadaspor FAB/MS.
Resultados
MALDI e FAB-MS dos Carboidratos Permetilados
Foi conduzido o estudo sobre proteína do interferon beta obtidopelo novo processo. Um espectro MALDI representativo está ilustrado naFigura 6. A lista correspondente dos sinais m/z observados nos espectrospermetilados (MALDI-MS e FAB-MS) está indicada na Tabela 3.Os resultdos de todas bateladas indicaram a presença de umaestrutura predominante biantenária dissialilada que tem a composição deNeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc, e uma estrutura biantenária monossialilada quetem a composição de NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc. Glicanos não-fucosiladosnão foram observados.
Os sinais menores, possivelmente correspondentes às seguintesestruturas de oligossacarídeos, também foram observados em todas bateldas:
• Estrutura biantenária não-sialilada (Hex5.HexNAc4.Fuc)
• Estrutura triantenada dissialilada ou biantenária dissialiladacom estruturas repetidas de N-acetil-lactosamina (Neu-
Ac2.Hex6.HexNAc5.Fuc)
• Estrutura triantenada trissialilada (NeuAc3.Hex6.HexNAc5.Fuc)
• Estrutura triantenada trissialilada com estruturas repetidas deN-acetil-lactosamina ou triantenada trissialilada (NeuAc3.Hex7.HexNAce.Fuc)
• Estrutura biantenária monossialilada e dissialilada com duasunidades de fucose (Neu-
Ac. Hexs. HexN AC4. FUC2, NeuAc2-Hex5. HexN AC4. FUC2)
• Quantidades menores de estruturas trifucosiladas (Neu-Ac2.Hex5.HexNAc4.Fuc3) também foram observadas nas bateladas deriva-das do interferon beta obtido pelo processo de acordo com a invenção.masestavam ausentes com relação a IFN-í3-1a
• Uma quantidade menor de ácido N-glicolilneuramínico comoparte dos ácidos siálicos dos glicanos.
A abundância relativa de ácido N-glicolilneuramínico foi calcula-da a partir das Alturas dos picos de sinais nos dados de FAB de MALDI-TOPde glicanos permetilados ligados em N.
Como esperado, as glicoformas de IFN-í3-1a contêm principal-mente ácido N-acetilneuramínico, tal como na maioria de glicoproteínas hu-manas.
MS/MS por Nanopulverizacão
Para confirmar ainda mais as estruturas dos traços de estruturasde oligossacarídeos multifucosilados ligados em N, a análise por MS/MS foiconduzida no oligossacarídeos permetilados de sinais em m/z 919, 1.040 e1.098 que são consistentes com os íons triplamente carregados ([M+3H]3+)para NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2, NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2 e Neu-Ac2.Hex5.HexNAc4.Fuc3, respectivamente. Os íons do tipo A foram obser-vados no espectro de MS/MS confirmaram as seguintes atribuições de estru-turas:
Tabela 2
<table>table see original document page 48</column></row><table>
*Um sinal correspondente foi, entretanto, observado por MALDI
Análise de Ligações por GC/MS
Os cromatogramas complexos de GC foram obtidos para todasbateladas testadas do interferon beta obtido pelo novo processo com algunspicos de impurezas originadas dos reagentes de derivação. A comparaçãodo tempo de retenção na GC com uma mistura padrão de acetatos de alditolparcialmente metilados operada sob as mesmas condições da GC permitiudesignações provisórias dos picos que contêm açúcares.
As análises das ligações de todas as amostras foram essencial-mente iguais, indicando a presença de N-acetilglicosamina ligada na posição4 (4-GlcNAc), N-acetilglicosamina ligada nas posições 4,6 (4,6-Glc-NAc),manose ligada nas posições 3,6 (3,6-Man), manose ligada na posição 2 (2-Man), galactose terminal (t-Gal), galactose ligada na posição 3 (3-Gal) e fu-cose terminal (t-Fuc), sustentando fortemente os dados de FAB-MS. A ma-nose ligada nas posições 2,6 também foi observada como um componenteminoritário em todas amostras, indicando a presença de algumas estruturastriantenadas. As estruturas de oligossacarídeos principais postuladas obser-vadas nas amostras a granel de IFN-Í3-1 a estão ilustradas na Figura 5.
Estes dados sugerem que a principal porção de carboidrato éum núcleo com estrutura biantenária fucosilada com um ou dois resíduos deácido siálico.
Sítio de N- qlicosilação por FAB-MS dos Digeridos Quimiotrípticos
Para todas as bateladas testadas, foi observado um sinal pe-queno da FAB-MS que foi designado aos resíduos de peptídeos sodados 80-88 (D.E.T.I.V.E.N.LL + Na+) com Asn-80 convertido em ácido aspártico de-pois da liberação do carboidrato com peptídeo N-glicosidase F. Este experi-mento fornece evidência fundamentadora de que Asn-80 está realmente gli-cosilado.
A Figura 6 ilustra o espectro MALDI de IFN-l3-1a com glicanospermetilados (lista de sinais na Tabel 3). Novamente, como indicado na Ta-bela e na figura anexa, o IFN-í3-1a obtido pelo processo de acordo com apresente invenção contém a estrutura trifucose, Neu-Ac2.Hex5.HexNAc4.Fuc3 as previously described.
Tabela 3 - Lista de Sinais nos Espectros Permetilados de IFN-í3-1a Obtidopelo Novo Processo Depois de Digestão Tríptica e com Peptídeo Nglicosidase F
<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>
Conclusões
As análises por IvÍALDI-MS e FAB-MS dos N-glicanos permetila-dos de amostras a granel de IFN-B-1a pelo novo processo indicaram as se-guintes estruturas de carboidratos fucosiladas no núcleo (glicanos não-fucosilados não foram observados):
Glicoformas Principais:
• Estrutura biantenária monossialilada (NeuAcHexs. HexNAc4. Fuc)
• Estrutura biantenária dissialilada (NeuAc2 Hexs.HexNAC4.Fuc)Glicoformas Minoritárias:
• Estrutura biantenária não-sialilada (Hex5.HexNAc4.Fuc)
• Estrutura triantenada dissialilada ou biantenária dissialiladacom estruturas repetidas de N-acetil-lactosamina (Neu-Ac2.Hex6.HexNAc5.Fuc)
• Estrutura Triantenada trissialilada (NeuAc3.Hex6.HexNAc5.Fuc)
• Triantenada trissialilada com estruturas repetidas de N-acetil-lactosamina ou estruturas triantenadas trissialiladas (Neu-Ac3.Hex7.HexNAc6.Fuc)
• Estrutura biantenária dissialilada e monossialilada com duasunidades de fucose (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2, and Neu-Ac2.Hex5.HexNAc4.Fuc2)
• Estrutura biantenária dissialilada com três unidades de fucose(NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3)
A MS/MS por nanopulverização dos glicanos permetilados con-firmaram a detecção de traços de oligossacrídeos Neu-Ac2.Hex5.HexNAc4.Fuc2 em todas amostras enquanto que traços de Neu-Ac2-Hex5.HexNAc4.Fuc3 foram observados apenas em IFN-f3-1a do proces-so da presente invenção.
As análises de ligações confirmaram os monossacarídeos espe-rados detectados com os dados da FAB-MS.
Finalmente, no produto IFN-6-1a obtido pelo novo processo, aanálise detalhada por FAB-MS dos peptídeos trípticos e quimiotrípticos indi-cou a presença de ligação de N-glicano em Asn-80.
A abundância relativa de ácido N-glicolilneuramínico foi calcula-da a partir das Alturas dos picos dos sinais nos dados de FAB e MALDI-MSde glicanos permetilados ligados em N.
A razão de ácido N-acetilneuramínico:ácido N-glicolilneuramínicofoi de 31,7:1,0 em uma amostra e sugere que 3,1% do ácido siálico são áci-do N-glicolilneuramínico. Estes resultados estão em concordância com ní-veis similares (5 %) obtidos para interferon humano natural produzido porfibroblastos humanos. Como esperado, as glicoformas de IFN-3-1a contêmprincipalmente ácido N-acetilneuramínico, tal como a maioria das glicoprote-ínas humanas.1. Altschul S F et aí, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador
<400> 4
acttacaggt tacctccgaa ac 22
Claims (32)
1. Processo para a fabricação de interferon beta humano recom-binante glicosilado, compreendendo uma etapa de cultivar uma célula produ-tora de interferon beta humano em um meio isento de soro, sendo que omeio isento de soro compreende:- cerca de 10 a cerca de 30 mM de HEPES, de preferência 20mM de HEPES;- cerca de 0,5 a cerca de 3 mM de prolina, de preferência cercade 1 mM de prolina; e- cerca de 5.500 a cerca de 7.000 mg/L de cloreto de sódio, depreferência cerca de 6.100 mg/L de cloreto de sódio.
2. Processo, de acrodo com a reivindicação 1 ou 2, sendo que omeio isento de soro compreende ainda cerca de 10 a cerca de 20 mg/L devermelho de fenol, de preferência cerca de 15 mg/L de vermelho de fenol.
3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, compreendendo uma fase de crescimento I, uma fase de cres-cimento II e uma fase de produção, onde a fase de crescimento I é conduzi-da a cerca de 37 °C, a fase de crescimento II é conduzida a cerca 35 °C, e afase de produção é conduzida a cerca de 33 °C.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, onde o processo é um processo de perfusão com uma taxa dediluição na faixa entre cerca de 1 e cerca de 10, de preferência entre cercade 1,5 e cerca de 7 por dia.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, onde a taxa dediluição é aumentada dentro das primeiras duas ou três semanas da culturade células de um valor inicial de cerca de 1 a 2 por dia para um valor de cer-ca de 7 a 10 por dia.
6. Processo para a purificação de interferon beta humano re-combinante a partir de um fluido, de preferência um substrato de cultura decélulas, compreendendo as etapas de:a) Submeter o fluido a uma cromatografia de afinidade;b) Submeter o eluído da cromatografia de afinidade a uma cro-matografia e troca catiônica;c) Submeter o eluído da cromatografia de troca catiônica a umacromatografia hidrofóbica por RP-HPLC.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, compreendendo,antes da etapa (a), clarificar o fluido por filtração.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, compreen-dendo ainda as etapas de:d) realizar ultrafiltração e diálise,e) submeter o dialisado a uma cromatografia por exclusão detamanho,f) submeter o eluído da cromatografia por exclusão de tamanhoà microfiltração.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6a 8, onde a etapa (a) é conduzida em Sepharose Azul, e a etapa (b) é con-duzida em Carbóxi-metil Sepharose.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 5, seguido de um proceso de acordo com qualquer uma das reivindições 6a 9.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, compreenden-do ainda a etapa de formular o interferon beta purificado em uma composi-ção farmacêutica, opcionalmente junto com um veículo farmaceuticiamenteaceitável.
12. Composição de interferon beta recombinante glicosilado, ob-tenível por um processo como definido em qualquer uma das reividicaçõesprecedentes.
13. Composição de interferon beta, de acordo com a reivindica-ção 12, compreendendo uma estrutura de oligossacarídeo que compreendedois ou três sacarídeos fucose.
14. Composição de interferon beta, de acordo com a reivindica-ção 12 ou 13, onde a dita estrutura de oligossacarídeo compreende um gli-cano trifucosilado dissialil-biantenário (Neu2Ac.Hex5.HexNAc4.Fuc3).
15. Composição de interferon beta, de acordo com qualquer umadas reivindicações 12 a 14, compreendendo ainda uma ou mais das seguin-tes estruturas de oligossacarídeos:- uma estrutura não-sialilada biantenária (Hex5.HexNAc4.Fuc);- uma estrutura dissialilada triantenada dissialilada biantenáriacom estruturas repetidas de N-acetil-lactosamina (Neu-Ac2.Hex6.HexNAc5.Fuc);uma estrutura trissialilada triantenada (Neu-Ac3.Hex6.HexNAc5.Fuc);- uma estrutura trissialilada triantenada com estruturas repetidasde N-acetil-lactosamina, ou trissialilada tetrantenada (Neu-Ac3.Hex7.HexNAc6.Fuc);- uma estrutura monossialilada e dissialilada biantenária comduas unidades de fucose (Neu-Ac. Hexs. HexNAc4. FUC2, NeuAc2-Hex5. HexNAc4. FUC2).
16. Composição de interferon beta, de acordo com qualquer umas reivindicações 12 a 15, caracterizada por uma sialilação que compreen-de cerca de 1 a cerca de 5% de N-glicanos não-sialilados, cerca de 5 a cer-ca de 25% de glicanos monossialilados, cerca de 55 a cerca de 75% de N-glicanos dissialilados, e cerca de 10 a cerca de 25% de N-glicanos trissialilados.
17. Uso de intererferon beta humano recombinante como defini-do em qualquer uma das reivindicações 12 a 16 para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de esclerose múltipla.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, onde a dita esclero-se múltipla é selecionada no grupo que consiste em esclerose múltipla reci-divante, não-recidivante e de início precoce.
19. Uso de um interferon beta humano recombinante, como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 12 a 16, para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de câncer.
20. Uso de um interferon beta humano recombinante como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 12 a 16, para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de infecções virais.
21. Uso de um meio de cultura isento de soro que compreende- cerca de 10 a cerca de 30 mM de HEPES, de preferência 20mM de HEPES;- cerca de 0,5 a cerca de 3 mM de prolina, de preferência cercade 1 mM de prolina; e- cerca de 5.500 a cerca de 7.000 mg/L de cloreto de sódio, depreferência cerca de preferência cerca de 6.100 mg/L de cloreto de sódio,para o cultivo de uma célula produtora de interferon beta humano recombi-nante.
22. Artigo manufaturado que compreende um material de emba-lagem e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um interferon beta re-combinante purificado isolado como definido em qualquer uma das reivindi-cações 12 a 16, ou obtido em um processo como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 11, onde o ditto material de embalagem compreendeum rótulo ou bula indicando que o dito interferon beta humano recombinantepode ser adiministrado a um ser humano para seu tratamento.
23. Ácido nucléico que compreende o interferon beta humanoque codifica a seqüência funcionalmente ligada à região SV40 T Ag de poli-adenilação precoce, onde o ácido nucléico não compreende o sinal de polia-denilação do interferon beta.
24. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 23, onde ogene de interferon beta humano não compreende a 3' UTR de interferon beta.
25. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 23 ou 24,compreendendo ainda o promotor/intensificador SV40 ligado funcionalmenteà seqüência codificadora de interferon beta.
26. Ácido nucléico, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 23 a 25, compreendendo ainda um gene de DHFR do camundongo.
27. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 26, onde ogene de DHFR do camundongo está ligado funcionalmente a uma região depoliadeninalção precoce que contém SV40 T Ag poli-A.
28. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 26 ou 27,compreendendo ainda o promoter/intensificador SV40 ligado funcionalmenteao gene de DHFR do camundongo.
29. Plasmideo que compreende o ácido nucléico como definidoem qualquer uma das reivindicações 23 a 28.
30. Célula hospedeira transformada com o vetor de expressãocomo definido na reivindicação 29.
31. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 30, sendouma célula do ovário do hamster chinês (CHO).
32. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 11, onde a célula produtora de interferon beta é uma célula hospedeiracomo definido na reivindicação 30 ou 31.
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