KR101276367B1 - 당화된 인터페론 베타를 제조하기 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인터페론 베타를 생성하기 위한 방법, 및 독특한 당화 패턴을 지니는 인터페론 베타 조성물에 관한 것이다.

Description

당화된 인터페론 베타를 제조하기 위한 방법 {PROCESS FOR THE PREPARATION OF GLYCOSYLATED INTERFERON BETA}
본 발명은 혈청을 함유하지 않는 배양 조건하에서 재조합 인간 인터페론 베타를 생성하는 방법, 재조합 인간 인터페론 베타를 정제시키는 방법, 및 독특한 당화 패턴을 지니는 인터페론 베타 단백질에 관한 것이다.
단백질은 일반적으로 "생물학적 제제"로도 일컬어지는 약제로서 상업적으로 중요하게 되었다. 가장 중요한 도전중 하나는 상업적 규모로 재조합 단백질을 생성시키기 위한 경제적이고 효율적인 방법을 개발하는 것이다.
생물공학 산업은 인간의 치료를 위한 재조합 당단백질을 제조하기 위해 포유동물 세포를 광범위하게 사용한다.
폴리펩티드를 생성하기 위해 널리 사용되는 적절한 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인 것으로 판명되었다.
CHO 세포는 암컷 차이니즈 햄스터의 난소의 생검으로부터 퍼크(Puck(1958))에 의해 최초로 배양되었다. 이러한 본래의 세포로부터, 다양한 특성을 지니는 다수의 서브라인(sub-line)이 제조되었다. 이러한 CHO 세포주중 하나인 CH0-K1은 프롤린을 필요로 하며, 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자에 대해 이배체이다. 이러한 세포주로부터 유래된 또 다른 세포주는 하나의 DHFR 유전자의 돌연변이의 결과로서 DHFR 기능의 손실 및 이후 기타 유전자의 손실을 특징으로 하는, DHFR 결핍 CHO 세포주(CHO DUK B11)(PNAS 77, 1980, 4216-4220)이다.
인간에게 투여하기 위한 단백질의 생성에 종종 사용되는 추가의 세포는 인간 세포주, 예를들어 인간 섬유육종 세포주 HT1080 또는 인간 태아 신장 세포주 293, 인간 태아 망막모세포종 유래 세포주, 예를들어 PER.C6, 양막 세포 유래 세포주 또는 신경세포 유래 세포주이다.
적절한 세포주로부터의 세포는 생성되는 관심 단백질의 코딩 서열과 함께 관심 단백질의 안정적이고 정확한 발현을 보장하는 조절 서열, 예를들어 프로모터, 인핸서, 또는 폴리A 신호를 포함하는 발현 벡터에 의해 안정적으로 트랜스펙션된다. 발현 벡터에 보통 존재하는 추가 유전자는 트랜스펙션되지 않은 세포 및 일시적으로 트랜스펙션된 세포로부터 안정적으로 트랜스펙션된 세포를 선택하는 마커 유전자, 예를들어 양성 선택 마커(예를들어, neo 유전자)이다. DHFR 유전자와 같은 증폭가능한 유전자가 코딩 서열의 증폭을 위해 사용된다.
일단 관심 단백질을 발현하는 클론이 확립되면, 이러한 클론으로부터 시작되는 제조 방법은 인간 투여에 예정된 단백질에 필요한 많은 양 및 우수한 품질로 생성되도록 하는 것이 확립되어야 한다.
이러한 제조 방법은 일반적으로 생물반응기에서 수행된다. 여기에는 다양한 수행 방식이 존재한다. 오늘날, 유가배양(fed-batch culture) 및 관류 배양(perfusion culture)이 대량의 단백질을 필요로 하는 포유동물 세포 배양 방법에 대한 두개의 우세한 산업적 수행 방식이다(Hu and Aunins 1997). 어떠한 생성 기술을 선택하던지 간에, 저렴한 비용에서의 높은 부피 생산성, 생산의 일관성(batch-to-batch consistency), 균일한 생산 품질을 보장하는 생산 방법을 얻는 것을 목표로 개발 노력이 이루어진다.
유가생성 또는 관류생성 방식 사이의 결정은 주로 클론의 생물학 및 생성물의 특성에 따르고, 이는 새로운 약제 생성물의 개발의 과정 동안 케이스별로 기초하여 이루어진다(Kadouri and Spier 1997).
관류 방법이 선택되는 경우, 선택 배양 시스템중 하나는 세포가 고체 담체 상에 고정되는 정지 충진상(packed-bed) 생물반응기이다. 이러한 시스템은 작동하기가 용이하고, 적절한 담체 및 배양 조건을 이용하여 매우 높은 세포 밀도(~ 107 - 108 세포·ml-1)가 달성될 수 있다.
이러한 높은 세포 밀도의 결과는 세포 생육성 및 생산성을 유지시키기 위해 사용되어야 하는 강한 배지 관류 속도(공급 및 수거)에 필요하다. 관류 속도는 상기 방법의 중요 파리미터중 하나인 것으로 생각되며: 이는 단백질 부피 생산성, 단백질 생산 품질을 성립시키고, 생산 방법의 전반적인 경제적 측면에 매우 큰 영향력을 지닌다.
세포 배양 방법에 있어서, 과거에는 배양 배지에 생물학적 활성 생성물을 생성시키는 모든 포유동물 세포주의 성장 및 유지를 위한 보편적인 영양소로서 작용하는 혈청을 보충하였다. 혈청은 호르몬, 성장인자, 담체 단백질, 부착인자 및 확 산인자, 영양소, 미량 원소 등을 함유한다. 배양 배지는 보통 동물 혈청, 예를들어 송아지 태아 혈청(FCS)으로도 언급되는 우태아 혈청(FBS)을 약 10% 이하로 함유한다.
비록 광범위하게 사용되지만, 혈청은 많은 한계를 지닌다. 이는 세포에 의해 생산되는 요망되는 관심 단백질의 한정된 양을 간섭하는 다수의 단백질을 높은 수준으로 함유한다. 혈청으로부터 유래된 이러한 단백질은 관심 단백질의 정제와 같은 하류 공정 동안 생성물로부터 분리되어야 하고, 이는 상기 방법을 복잡하게 만들고 비용을 증가시킨다.
긴 잠복기 또는 인큐베이션 기간을 지닌 소의 전염성 신경변성 질병인 BSE(소해면양뇌증)의 출현은 생물학적 활성 생성물의 생성에서 동물 유래 혈청을 이용하는 것에 관한 제한의 중요성을 증가시켰다.
따라서, 생물학적 활성 생성물의 생성 동안 세포 성장을 지지하고 세포를 유지시키는, 동물 기원 물질을 함유하지 않는 대안적 세포 배양 배지를 개발하는 것이 매우 필요하다.
일반적으로, 세포 배양 배지는 다양한 범주의 다수의 성분, 예를들어 아미노산, 비타민, 염, 지방산 및 추가 화합물을 포함한다:
- 아미노산: 예를들어, US 6,048,728(Inlow et al.)에는 하기 아미노산이 세포 배양 배지에 사용될 수 있음이 기술되어 있다: 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 트레오닌, 및 발린.
- 비타민: 예를들어, US 2003/0096414(Ciccarone et al.) 또는 US 5,811,299(Renner et al.)에는 하기 비타민이 세포 배양 배지에 사용될 수 있음이 기술되어 있다: 비오틴, 판토테네이트, 콜린 클로라이드, 엽산, 미오-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 비타민 B12, 티아민, 푸트레신.
- 염: 예를들어, US 6,399,381(Blum et al.)에는 CaCl2, KCl, MgCl2, NaCl, 제 1 인산나트륨, 제 2 인산나트륨, 나트륨 셀레나이트, CuSO4, ZnCl2를 포함하는 배지가 기술되어 있다. 배양 배지에 사용될 수 있는 무기염을 기술하는 문서의 또 다른 예는 US 2003/0153042(Arnold et al.)로, 여기에는 CaCl2, KCl, MgCl2, NaCl, 제 1 인산나트륨, 제 2 인산나트륨, CuCl2.2H20, ZnCl2를 포함하는 배지가 기술되어 있다.
- 지방산: 배지에 사용되는 것으로 공지된 지방산은 아라키돈산, 리놀레산, 올레산, 라우르산, 미리스트산 뿐만 아니라 메틸-베타-시클로덱스트린으로, 예를들어 US 5,045,468호(Darfler)를 참조하라. 시클로덱스트린은 그 자체로 지질이 아니지만, 지질과 복합체를 형성하는 능력을 지니고, 따라서 세포 배양 배지에서 지질을 용해시키기 위해 사용된다는 것이 인지되어야 한다.
- 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지의 구성에 특히 사용되는 추가 성분은 글루코오스, 글루타민, Na-피루베이트, 인슐린 또는 에탄올아민과 같은 화합물(예를들어, EP 274 445), 또는 플루로닉 F68(Pluronic F68)과 같은 보호제이다. 플루로닉® F68(폴록사머(Poloxamer) 188로도 공지됨)은 에틸렌 옥시드(EO) 및 프로필렌 옥시드(PO)의 블록 공중합체이다.
표준 "염기 배지"가 또한 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 배지는 이미 상기 언급된 여러 배지 성분을 함유한다. 널리 적용되는 이러한 배지의 예는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM), 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지(Roswell Park Memorial Institute Medium, RPMI), 또는 햄 배지(Ham's medium)이다.
생물반응기에서 관심 단백질의 생성 후, 관심 단백질은 세포 배양 수거물로부터 정제될 필요가 있다. 세포 배양 수거물은 예를들어 세포내 단백질에 대해서는 세포 추출물, 또는 분비 단백질에 대해서는 세포 배양 상층액일 수 있다.
단백질의 대규모 제조를 위해 현재 다양한 방법이 이용가능하나, 미정제 생성물, 예를들어 세포 배양 수거물은 요망되는 생성물을 함유할 뿐만 아니라 요망되는 생성물로부터 분리되기 어려운 불순물을 또한 함유한다.
보건 당국은 인간 투여를 위한 단백질에 대해 높은 규정 순도를 요구한다. 추가의 난점으로써, 다수의 정제 방법은 낮거나 높은 pH, 높은 염 농도 또는 제공된 단백질의 생물학적 활성을 위태롭게 할 수 있는 기타 극단적인 조건을 적용하는 것을 필요로 하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 단백질에 대해 단백질의 생물학적 활성을 유지시키면서 충분한 정제를 가능케 하는 정제 방법을 확립하는 것이 시도된다.
주로 전하의 차이를 기초로 하여 단백질을 분리시키는 이온 교환 크로마토그래피 시스템이 널리 사용되고 있다. 이온 교환 크로마토그래피에서, 주위 완충용액의 이온 강도가 낮으면 용질의 표면 상의 하전된 패치(patch)가 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 반대 전하에 의해 유인된다. 용리는 일반적으로 이온 교환 매트릭스의 하전된 부위에 대해 용질과 경쟁하는 완충용액의 이온 강도(즉, 전도율)를 증가시킴으로써 달성된다. pH를 변화시킴으로써 용질의 전하를 변경시키는 것은 용질의 용리를 달성하기 위한 또 다른 방법이다. 전도율 또는 pH의 변화는 점진적(구배 용리)이거나 단계적(단계 용리)일 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피에 사용될 수 있는 수지는 다양한 작용기를 함유할 수 있고; 예를들어, 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 디에틸-(2-히드록시-프로필)아미노에틸(QAE)은 상대 이온으로 클로라이드를 지니는 반면, 카르복시메틸(CM) 및 술포프로필(SP)은 상대 이온으로 나트륨을 지닌다.
소수성 정지상을 지니는 크로마토그래피 시스템은 분리를 위한 대안적 염기를 제공하고, 이는 또한 단백질의 정제에서 광범위하게 사용되고 있다. 이러한 범주에 포함되는 것은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 및 역상 액체 크로마토그래피(RPLC)이다. HIC 및 RPLC에 의한 분리를 위한 물리화학적 기초는 소수성 효과이고, 단백질은 소수성의 차이를 기초로 하여 소수성 정지상에서 분리된다.
역상 크로마트그래피는 HIC와 밀접하게 관련된 단백질 정제 방법이며, 둘 모두는 생물분자의 표면 상의 용매가 접근가능한 비극성기와 매트릭스의 소수성 리간드 사이의 상호작용을 기초로 한다. 그러나, 역상 크로마토그래피에 사용되는 리간드는 HIC 리간드 보다 소수성 리간드로 보다 많이 치환된다. HIC 흡착제의 치환 정도는 10-50 μmoles/mL의 C2-C8 아릴 리간드의 매트릭스 범위에 존재할 수 있는 반면, 수백 μmoles/mL의 C4-C8 알킬 리간드의 매트릭스가 보통 역상 크로마토그래 피 흡착제에 사용된다.
소스(Source) 30RPC 컬럼은 중합 역상 매트릭스이다. 이는 단단한 단일크기의 30 마이크론 직경의 폴리스티렌/디비닐 벤젠 비드를 기초로 한다. 이의 특성은 하기와 같이 요약될 수 있다: 특별히 광범위한 pH 범위(1-12), 높은 선택성, 높은 화학 내성, 높은 유속에서의 높은 수용량 및 높은 용해도.
젤-투과 크로마토그래피(GPC)로도 언급되는 크기-배제 크로마토그래피(SEC)는 다양한 크기의 분자를 분리하기 위한 다공성 입자를 사용한다. 이는 일반적으로 생물학적 분자를 분리하고, 중합체의 분자량 및 분자량 분포를 결정하기 위해 사용된다. 다공 크기보다 작은 분자는 입자로 진입함으로써, 입자에 진입할 수 없는 보다 큰 분자 보다 긴 경로 및 긴 통과 시간을 지닌다. 다공 크기보다 큰 모든 분자는 보류되지 않고 함께 용리된다. 다공에 진입할 수 있는 분자는 분자의 크기 및 형태에 따라 입자에서 평균 체류 시간을 지닐 것이다. 따라서, 다양한 분자는 컬럼을 통해 다양한 전체 통과 시간을 지닌다.
블루 세파로오스(Blue Sepharose)는 염료-리간드 친화성 매트릭스를 기초로 하는 크로마토그래피 수지이다. 리간드인 시바크론 블루(Cibacron Blue) F3G-A는 클로로트리아진 고리를 통해 세파로오스™에 공유적으로 연결된다(Clonis et al., 1987).
블루 세파로오스는 인터페론 베타의 정제를 위해 사용되어 왔다(Mory et al., 1981).
인터페론 베타(인터페론-β 또는 IFN-β)는 사이토카인의 부류에 속하는 천 연 발생 가용성 당단백질이다. 인터페론(IFN)은 광범위한 생물학적 활성, 예를들어 항바이러스, 항증식 및 면역조절 특성을 지닌다.
3개의 주 인터페론이 IFN-알파, IFN-베타 및 IFN-감마로서 언급된다. 이러한 인터페론은 처음에 이들의 기원 세포(백혈구, 섬유모세포 또는 T-세포)에 따라 분류되었다. 그러나, 여러 유형이 하나의 세포에 의해 생성될 수 있음이 명백해지고 있다. 그러므로, 백혈구 인터페론은 이제 IFN-알파, 섬유모세포 인터페론은 IFN-베타, 그리고 T-세포 인터페론은 IFN-감마로 언급된다. "나말와(Namalwa)" 세포주(버킷 림프종(Burkitt's lymphoma)으로부터 유래됨)에서 생성되는 림프아형(lymphoblastoid) IFN인 네번째 유형의 인터페론이 존재하고, 이는 백혈구 및 섬유모세포 IFN 둘 모두의 혼합물을 생성하는 듯 하다.
인간 섬유모세포 인터페론(IFN-베타)는 항바이러스 활성을 지니며, 이는 또한 세포의 증식을 억제하는 것으로 공지되어 있다. 이는 바이러스 및 이중가닥 RNA에 의해 유도되는 약 20,000 Da의 폴리펩티드이다. 재조합 DNA 기술(Derynck et al., 1980)에 의해 클로닝된 섬유모세포 인터페론에 대한 유전자의 누클레오티드 서열로부터 166개의 아미노산 길이인 단백질의 완전한 아미노산 서열이 추론되었다.
인터페론-β가 또한 클로닝되었다. 미국 특허 제 5,326,859호에는 인간 IFN-β, 및 대장균(E. coli)과 같은 세균에서의 이의 재조합 발현을 위한 플라스미드의 DNA 서열이 기술되어 있다. 유럽 특허 제 0 287 075호에는 인터페론-β 코딩 서열로 트랜스펙션되어 재조합 인터페론-β를 생성할 수 있는 CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포주가 기술되어 있다. 상기 단백질은 바이안테나리(biantennary, 두개의 분지된) 올리고당류로 당화되는 것으로 기술되어 있고, 이는 단일 푸코오스 부분을 특징으로 한다.
인터페론 베타는 여러 세포주, 예를들어 CHO 세포, BHK 21(새끼 햄스터 신장 세포) 및 LTK(마우스 L-티미딘 키나아제 네거티브) 세포에서 발현되었다(Reiser and Hauser, 1987). DHFR 네거티브 CHO 세포가 또한 인터페론 베타의 발현에 사용되어 왔다(Innis and McCormick, 1982),(Chernajovsky et al., 1984).
인터페론은 종종 다양한 단백당형(glycoform)으로 당화되는 것으로 공지되어 있다. 예를들어, IFN-β의 당류 구조는 바이안테나리 구조를 포함하는 것으로 나타났고, 이는 단일한 푸코오스 당류 및 말단 갈락토오스 시알릴화를 특징으로 한다(Conradt et al., 1987). 당화는 또한 가용성에 중요한 것으로 나타났는데, 이는 IFN-β가 글리코펩티다아제 F에 의한 데글리코실레이션(deglycosylation) 후에 침전되기 때문이다. 또한, 대장균에 의해 생성된 IFN-β는 세균 발현 시스템에서의 당화의 부족으로 인해 폴딩에 있어서 문제점을 나타내었다.
유럽 특허 제 0 529 300호에는 특이적 당화 패턴, 즉 올리고당류 단위당 하나의 푸코오스를 특징으로 하는 탄수화물 구조로의 당화를 지니는 재조합 인터페론-β가 기술되어 있다. 이러한 탄수화물 구조는 바이안테나리, 트리안테나리(triantennary) 및 테트라안테나리(tetraantennary)(각각 두개, 세개 및 네개의 분지된) 올리고당류이다.
PCT 출원 번호 WO 99/15193호에는 또한 바이안테나리, 트리안테나리 및 테트 라안테나리 올리고당류를 특징으로 하는 재조합 인터페론-β의 당화가 기술되어 있다. 구성을 이루는 단당류는 만노오스, 푸코오스, N-아세틸글루코사민, 갈락토오스 및 시알산을 포함하였다.
다양한 연구가 안정성에 있어서 당화의 중요성을 입증하였다. 예를들어, 재조합 인터페론-β의 당화되지 않은 형태는 현저하게 낮은 안정성 및 보다 낮은 생물학적 활성을 지니는 것으로 나타났다(Runkel et al., 1998).
기타 연구는 재조합 및 천연 인간 인터페론-β 단백질이 다양한 당화 패턴을 지니는 것을 밝혀내었다(Kagawa et al., 1988).
인터페론 베타는 다양한 질병, 예를들어 다발경화증, 암, 또는 바이러스 질병, 예를들어 SARS 또는 C형 간염 바이러스 감염에 있어서 소위 생물학적 제제인 치료 단백질 약제로 사용된다.
따라서, 인터페론 베타, 및 인터페론 베타를 대량 발현하는 세포의 효율적인 생성 및 정제를 위한 방법이 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 혈청을 함유하지 않는 배지에서 재조합 인간 인터페론 베타를 생성하기 위한 방법의 개발을 기초로 한다.
따라서, 첫번재 양태에서, 본 발명은,
- 약 10 내지 약 30 mM의 HEPES, 바람직하게는 20 mM의 HEPES;
- 약 0.5 내지 약 3 mM의 프롤린, 바람직하게는 약 1 mM의 프롤린; 및
- 약 5500 내지 약 7000 mg/L의 염화나트륨, 바람직하게는 약 6100 mg/L의 염화나트륨을 포함하는 혈청 비함유 배지에서 인터페론-β 생성 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 당화된 재조합, 바람직하게는 인간 인터페론-β를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 인터페론 베타를 생성하는 세포로부터 유래된 유체, 특히세포 배양 수거물로부터의 재조합 인터페론 베타를 정제시키는 방법의 개발을 기초로 한다.
따라서, 두번째 양태에서, 본 발명은,
- 유체를 친화성 크로마토그래피에 적용시키는 단계;
- 친화성 크로마토그래피의 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계; 및
- 양이온 교환 크로마토그래피의 용출액을 RP-HPLC에 의한 소수성 크로마토그래피에 적용시키는 단계를 포함하여, 유체로부터 재조합 인간 인터페론을 정제시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 인터페론 베타의 분석은 이러한 인터페론 베타가 특이하게 당화된 인터페론 베타, 즉 독특한 당화 패턴 또는 프로파일을 지니는 인터페론 베타의 조성물임을 나타내었다. 따라서, 세번째 양태에서, 본 발명은 2개 또는 3개의 푸코오스 당류를 포함하는 올리고당류 구조를 포함하는 인터페론 베타 조성물에 관한 것이다.
종양, 다발경화증 및 바이러스 감염의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 방법에 방법에 따라 생성된 재조합 인간 인터페론-β의 용도, 및 인터페론 베타의 생성을 위한 본 발명의 혈청 비함유 세포 배양 배지의 용도가 본 발명의 추가 양태이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 인터페론 베타 생성 세포주를 생성시키기 위해 사용된 방법의 순서도를 도시한다.
도 2는 IFN-β-1a의 새로운 정제 방법의 순서도를 도시한다.
도 3은 올리고당류 구조의 구조도가 상부에 도시된, IFN-β-1a 배치의 ES-MS 변환된 스펙트럼을 도시한다
도 4는 본원의 새로운 방법에 의해 수득된 IFN-β-1a의 ES-MS 변환된 스펙트럼을 도시하고, 여기서:
P는 단백질이고(IFN-β);
Fuc Biant는 푸코오실화된 바이안테나리 복합체형 올리고당류이고;
Fuc Triant는 푸코오실화된 트리안테나리 복합체형 올리고당류이고;
Fuc Tetrant는 푸코오실화된 테트라안테나리 복합체형 올리고당류이고;
SA는 시알산이다.
도 5는 IFN-β-1a의 올리고당류 구조를 도시하고; 여기서:
도 5A는 주 올리고당류를 도시하고:
Ⅰ. 디시알릴화된 바이안테나리 (NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc)
Ⅱ. 모노시알릴 바이안테나리 (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc)
도 5B는 부 올리고당류를 도시하고, 여기서:
Ⅰ. 시알릴화되지 않은 바이안테나리 (Hex5.HexNAc4.Fuc)
Ⅱ. 모노 및 디시알릴화된 트리안테나리 구조 또는 N-아세틸 락토사민 반복 구조를 지니는 디시알릴화된 바이안테나리 (NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc)
Ⅲ. N-아세틸 락토사민 반복 구조를 지니는 트리시알릴화된 트리안테나리 또는 트리시알릴화된 테트라안테나리 구조 (NeuAc3.Hex7.HexNAc6.Fuc)
도 5C는 2개 또는 3개의 푸코오스 잔기를 지니는 부 올리고당류를 도시한다:
Ⅰ. 2개의 푸코오스를 지니는 모노시알릴 바이안테나리 구조 (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2)
Ⅱ. 2개의 푸코오스를 지니는 디시알릴화된 바이안테나리 구조 (NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2)
Ⅲ. 3개의 푸코오스를 지니는 디시알릴화된 바이안테나리 구조 (NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3)
도 6은 극메틸화된(permethylated) 글리칸을 지니는 새로운 IFN-β-1a의 MALDI 스펙트럼을 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 첫번재 양태는 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 조건 하에서 인터페론 베타를 생성시키는 방법의 개발을 기초로 한다. 본 발명에 따르면, 당화된 재조합 인터페론 베타를 제조하는 방법은,
- 약 10 내지 약 30 mM의 HEPES, 바람직하게는 20 mM의 HEPES;
- 약 0.5 내지 약 3 mM의 프롤린, 바람직하게는 약 1 mM의 프롤린; 및
- 약 5500 내지 약 7000 mg/L의 염화나트륨, 바람직하게는 약 6100 mg/L의 염화나트륨을 포함하는 혈청 비함유 배지에서 인터페론 베타 생성 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
혈청 비함유 배지는, 예를들어 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 mM 의 HEPES(2-(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐)에탄술폰산) 완충용액을 포함할 수 있다. 이는 또한, 예를들어 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3 또는 3.1 mM 의 프롤린을 포함할 수 있다.
본 발명의 혈청 비함유 배지의 염화나트륨 농도는, 예를들어 약 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000 또는 7100 mg/L일 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, 혈청 비함유 배지는 추가로 약 10 내지 약 20, 바람직하게는 약 15 mg/L의 페놀 레드를 포함한다. 페놀 레드 농도는, 예를들어 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 mg/L일 수 있다.
본 발명의 방법의 구성에서, 상기 확인된 성분이 임의의 적절한 공지된 혈청 비함유 배지에 사용될 수 있다. 상기 혈청 비함유 배지의 예는 하기와 같다:
배지 제조업체 카탈로그 번호
EX-CELL 302 JRH 14312-1000M
EX-CELL 325 JRH 14335-1000M
CHO-CD3 시그마(Sigma) C-1490
CHO Ⅲ PFM 집코(Gibco) 96-0334SA
CHO-S-SFM Ⅱ 집코 12052-098
CHO-DHFR 시그마 C-8862
ProCHO 5 캄브렉스(Cambrex) BE12-766Q
SFM4CHO 하이클론(HyClone) SH30549.01
Ultra CHO 캄브렉스 12-724Q
HyQ PF CHO 하이클론 SH30220.01
HyQ SFX CHO 하이클론 SH30187.01
HyQ CDM4CHO 하이클론 SH30558.01
IS CHO-CD 어빈 사이언티픽 #91119
(Irvine Scientific)
IS CHO-V 어빈 사이언티픽 #9197
본 발명에 따라 배양될 수 있는 인터페론 베타 생성 세포는, 예를들어 3T3 세포, COS 세포, 인간 골육종 세포, MRC-5 세포, BHK 세포, VERO 세포, CHO 세포, CHO-S 세포, HEK 293 세포, HEK 293 세포, 정상 인간 섬유모세포, 간질(Stroma) 세포, 간세포 및 PER.C6 세포와 같은 동물 또는 인간 세포를 포함하는, 인터페론 베타를 발현하고 바람직하게는 분비하도록 변형된 임의의 포유동물 세포일 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 세포는 바람직하게는 인터페론 베타 발현 CHO 클론, 예를들어 문헌[Reiser and Hauser(1987)]에 기술된 세포주 또는 문헌[lnnis and McCormick(1982)]에 기술된 세포이다.
본원에서 사용되는 용어 "인터페론 베타"는 또한 IFN 베타, 또는 IFN-β로 언급되고, 이는 임의의 종으로부터 유래된 인터페론 베타, 바람직하게는 약 22,500 달톤의 분자량을 지니는 166개의 아미노산 당단백질인 인간 인터페론 베타를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "인터페론 베타"는 또한 IFN-베타의 기능적 유도체, 뮤테인(mutein), 유사체 또는 단편을 포함한다. 용어 "인터페론 베타 1a"는 당화된 인터페론 베타를 의미한다.
인터페론 베타의 활성은, 예를들어 세계 보건 기구의 천연 인터페론 베타 표준(Second International Standard for interferon, Human Fibroblast GB 23 902 531)에 대해 대응된 참조 표준을 이용하여 측정될 수 있다. 단위는 WISH 세포 및 수포성 구내염 바이러스를 이용하는 시험관내 세포병변 효과 생검법에서 결정된, 인터페론 베타-1a의 mg당 항바이러스 활성의 국제 단위(IU)로 표현된다.
IFN-베타의 MIU 및 mcg에 대한 전환 표
MIU 3 12 18 24
mcg 11 44 66 88
본 발명의 구성에서 사용되는 용어 "변이체" 또는 "뮤테인"은 야생형 IFN-베타와 비교하여 생성된 생성물의 활성이 상당히 감소됨이 없이, 천연 IFN-베타의 아미노산 잔기중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기로 대체되거나, 결실되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 서열의 IFN-베타에 첨가된, IFN-베타의 유사체를 의미한다. 이러한 뮤테인은 공지된 합성 및/또는 부위 특이적 돌연변이유발 기술, 또는 이에 대신한 적합한 임의의 기타 공지된 기술에 의해 제조된다.
본 발명에 따른 용어 "변이체" 또는 "뮤테인"은 엄격한 조건하에서, 예를들어 US 4,738,931호에 기술된 바와 같은 IFN-베타를 엔코딩하는 DNA 또는 RNA에 하이브리드화되는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 의해 엔코딩된 단백질을 포함한다. 용어 "엄격한 조건"은 당업자가 통상적으로 "엄격한" 것으로 언급하는 하이브리드화 및 이후의 세척 조건을 의미한다. 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 and 6.4(1987, 1992)]을 참조하라. 제한하는 바는 아니지만, 엄격한 조건의 예는, 예를들어 5분 동안 2 x SSC 및 0.5% SDS, 15분 동안 2 x SSC 및 0.1% SDS; 30-60분 동안 37℃에서 0.1 x SSC 및 0.5% SDS 및, 이후 30-60분 동안 68℃에서 0.1 x SSC 및 0.5% SDS의 연구하에서 하이브리드의 계산된 Tm 값의 12-20℃ 아래의 세척 조건을 포함한다. 당 분야의 당업자는 엄격한 조건이 또한 DNA 서열, 올리고누클레오티드 프로브(예를들어, 10-40개의 염기) 또는 혼합된 올리고누클레오티드 프로브의 길이에 좌우된다는 것을 이해한다. 혼합 프로브가 사용되는 경우, SSC 대신 테트라메틸 암모늄 클로라이드(TMAC)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 문헌[Ausubel] 참조.
서열을 비교함으로써 결정된 동일성은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리누클레오티드 서열 사이의 관련성을 반영한다. 일반적으로, 동일성은 비교되는 서열의 길이에 걸쳐 2개의 폴리누클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 각각의 정확한 누클레오티드 대 누클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 일치를 의미한다.
정확하게 일치하지 않는 서열에 대해, "동일성 %"가 결정될 수 있다. 일반적으로, 비교되는 두개의 서열이 정렬되어 서열 사이의 최대 상관 관계가 제공된다. 이는 정렬의 정도를 향상시키기 위해 하나 또는 둘 모두의 서열에 "갭(gap)"을 삽입시키는 것을 포함할 수 있다. 동일성 %는 동일하거나 매우 유사한 길의의 서열에 특히 적합한, 비교되는 각각의 서열의 전장에 걸쳐 결정될 수 있거나(소위, 전역 정렬), 동일하지 않은 길일의 서열에 보다 적합한, 보다 짧은 규정된 길이에 걸쳐 결정될 수 있다(소위, 국소 정렬).
2개 이상의 서열의 동일성 및 상동성을 비교하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 예를들어 위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1(Devereux J et al., 1984))에서 이용가능한 프로그램, 예를들어 프로그램 BESTFIT 및 GAP가 2개의 폴리누클레오티드 사이의 동일성 % 및 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 동일성% 및 상동성 %를 결정하기 위해 사용될 수 있다. BESTFIT는 스미스 및 워터먼(Smith and Waterman (1981))의 "국소 상동성" 알고리듬을 이용하고, 2개의 서열 사이의 가장 유사한 단일 영역을 찾는다. 서열 사이의 동일성 및/또는 유사성을 결정하기 위한 기타 프로그램, 예를들어 BLAST계 프로그램(Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, www.ncbi.nlm.nih.gov의 NCBI 홈페이지를 통해 접근가능함) 및 FASTA(Pearson W R, 1990)이 또한 당 분야에 공지되어 있다.
임의의 상기 변이체 또는 뮤테인은 바람직하게는 IFN-베타와 실질적으로 유사한 활성을 지니기 위해, IFN-베타의 서열과 충분히 중복되는 아미노산의 서열을 지닌다. 임의의 변이체 또는 뮤테인이 IFN-베타와 유사한 활성을 지니는 지의 여부를 평가하기 위한 기능 분석은, 예를들어 문헌[Youcefi et al., 1985]에 기술된 WISH 세포에서의 수포성 구내염 바이러스의 세포병변 효과에 대한 인터페론의 활성을 측정하는 분석이다. 따라서, 통상적인 실험을 이용하여 임의의 주어진 뮤테인이 IFN-베타와 실질적으로 동일한 활성을 지니는 지의 여부를 결정할 수 있다.
임의의 상기 변이체 또는 뮤테인은, 예를들어 US 4,738,931호에 기술된 바와 같이 IFN-베타의 서열과 40% 이상의 동일성 또는 상동성을 지닐 수 있다. 더욱 바람직하게는, 이는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 가장 바람직하게는 90% 이상의 동일성 또는 상동성을 지닌다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 IFN-베타의 뮤테인, 또는 이를 코딩하는 핵산은 본원에 제시된 교시내용 및 안내를 기초로 하여 과도한 실험 없이 당업자에 의해 통상적으로 수득될 수 있는 치환 펩티드 또는 폴리누클레오티드에 실질적으로 유사한 서열의 한정된 세트를 포함한다.
본 발명에 따른 뮤테인에 대한 바람직한 변화는 "보존성" 치환으로 공지된 것이다. IFN-베타 폴리펩티드의 보존성 아미노산 치환은 그룹의 일원 사이의 치환이 분자의 생물학적 기능을 보존하는, 충분히 유사한 물리화학적 특성을 지니는 그룹 내의 동의적(synonymous) 아미노산을 포함할 수 있다(Grantham, 1974). 또한, 특히 삽입 또는 결실이 단지 소수의 아미노산, 예를들어 30개 이하, 바람직하게는 10개 이하의 아미노산만을 포함하고, 기능 형태에 중요한 아미노산, 예를들어 시스테인 잔기를 제거하거나 대체하지 않는 경우에, 아미노산의 삽입 및 결실이 아미노산의 기능을 변화시키지 않고 상기 규명된 서열에서 이루어질 수 있음이 명백하다. 이러한 결실 및/또는 삽입에 의해 생성된 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 범위에 해당한다.
본 발명에 사용하기 위한 IFN-베타의 뮤테인을 수득하기 위해 사용될 수 있는 단백질 내의 아미노산 치환의 예는, 예를들어 미국 특허 제 4,959,314호, 제 4,588,585호 및 제 4,737,462호(Mark et al); 제 5,116,943호(Koths et al.), 제 4,965,195호(Namen et al); 제 4,879,111호(Chong et al); 및 제 5,017,691호(Lee et al)에 제시된 바와 같은 임의의 공지된 방법의 단계; 및 미국 특허 제 4,904,584호(Shaw et al)에 제시된 리신 치환된 단백질을 포함한다.
특별한 종류의 인터페론 변이체가 최근 기술되었다. 소위 "콘센서스(consensus) 인터페론"은 IFN의 비-천연 발생 변이체이다(US 6,013,253). 콘센서스 인터페론이 또한 본 발명에 따라 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 IFN-베타의 "기능적 유도체"는 당 분야에 공지된 방법에 의해 잔기 또는 N 또는 C-말단기 상의 측쇄로서 발생하는 작용기로부터 제조될 수 있는 유도체를 포함하고, 이는 이들이 약학적으로 허용되는 한, 즉 이들이 상기 기술된 바와 같은 단백질의 생물학적 활성, 즉 상응하는 수용체에 결합하여 수용체 신호전달을 개시하는 능력을 파괴하지 않는 한, 그리고 이를 함유하는 조성물에 독성 특성을 부여하지 않는 한 본 발명에 포함된다. 유도체는 이러한 유도체가 단백질의 생물학적 활성을 보유하고 약학적으로 허용되는 경우 탄수화물 또는 포스페이트 잔기와 같은 화학적 부분을 지닐 수 있다.
예를들어, 인터페론 베타의 유도체는 단백질의 기타 특성, 예를들어 안정성, 반감기, 생체이용률, 신체에 의한 내성, 또는 면역원성을 개선시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 측쇄를 포함할 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위해, IFN-베타는, 예를들어 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 연결될 수 있다. 페길화(PEGylation)는, 예를들어 WO 92/13095호에 기술된 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 특히, PEG-IFN은 WO 99/55377호의 교시내용에 따라 제조될 수 있다.
IFN-베타의 기능적 유도체는 아미노산 잔기 상에 1개 이상의 측쇄로서 발생하는 1개 이상의 작용기에 부착된 1개 이상의 부분을 포함할 수 있다. 상기 부분이 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분인 구체예가 매우 바람직하다. 본 발명에 따르면, 여러 PEG 부분이 또한 IFN-베타에 부착될 수 있다.
기타 유도체는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 1차 또는 2차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아미드, 아실 부분과 함께 형성된 아미노산 잔기의 자유 아미노기의 N-아실 유도체(예를들어, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일기) 또는 아실 부분과 함께 형성된 자유 히드록실기(예를들어, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기)의 O-아실 유도체를 포함한다.
본 발명에 따른 "단편"은 IFN-베타의 임의의 서브셋, 즉 예를들어 상기 기술된 생물학적 검정법에서 측정가능한 요망되는 생물학적 활성을 보유하는 보다 짧은 펩티드를 의미한다. 분자의 어느 한쪽 말단으로부터 아미노산을 제거하고, 수용체 효능제로서 이의 특성에 대한 결과를 시험함으로써 단편이 용이하게 제조될 수 있다. 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단으로부터 동시에 하나의 아미노산을 제거하는 프로테아제가 공지되어 있으므로, 요망되는 생물학적 활성을 보유하는 단편을 결정하는 것은, 예를들어 통상적인 실험만을 포함하는 문헌[Youcefi et al., 1985]에 기술된 시험에서 결정될 수 있다.
본 발명의 인터페론 베타의 생성을 위한 방법은 일정한 온도, 또는 변화하는 온도에서 수행될 수 있다. 이는, 예를들어 전체 공정을 통해 37℃에서 수행될 수 있다. 이는 또한, 예를들어 성장기 동안의 최초 온도인 37℃의 온도에서 수행될 수 있고, 이후 생성기 동안 35℃, 33℃ 또는 30℃로 감소될 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 성장기 Ⅰ, 성장기 Ⅱ 및 생성기를 포함하고, 여기서 성장기 Ⅰ은 약 37℃에서 수행되고, 성장기 Ⅱ는 약 35℃에서 수행되고, 생성기는 약 33℃에서 수행된다.
상기 기들의 종료의 결정은 당업자의 지식 범위 내에 해당하고, 이는, 예를들어 세포 밀도, 글루코오스 소비 또는 임의의 기타 물질대사 지표에 기초하여 결정된다. 일반적으로, 성장기 Ⅰ은, 예를들어 10 내지 12일일 수 있다. 성장기 Ⅱ는 일반적으로 보다 짧고, 주로 낮은 온도에 세포를 적합화시키도록 한다. 성장기 Ⅱ는, 예를들어 1 내지 2일일 수 있다.
본 발명의 방법은 유가 또는 관류 방법으로 수행될 수 있다. 본 발명에 따르면, 관류가 바람직하다.
바람직하게는, 상기 방법은 하루당 약 1 내지 약 10, 바람직하게는 약 1.5 내지 약 7의 범위의 희석 속도를 이용하는 관류 방법이다.
본원에 정의된 바와 같은 용어 "희석 속도"는 하루당 전체 시스템 작업 부피(전체 부피 = 충진상 + 조절 탱크 부피)의 리터당 배지의 리터로 계산된 희석 속도 D를 의미한다. 본 발명에 따르면, 희석 속도는, 예를들어 0.5, 1, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5의 범위일 수 있다.
더욱 바람직하게는, 희석 속도는 처음 2 내지 3주의 세포 배양 기간 이내에, 특히 생성기 동안 하루당 약 1 내지 2의 최초 값에서 하루당 약 7 내지 10의 값으로 증가된다.
본 발명의 방법의 배양 단계는 임의의 적절한 환경, 예를들어 페트리 접시, T-플라스크 또는 희전 병에서 수행될 수 있으나, 바람직하게는 보다 큰 부피를 지니는 용기, 예를들어 생물반응기에서 수행된다.
관류 방법을 선택하는 경우, 시스템은, 예를들어 세포가 고체 담체에 고정되는 정지 충진상 생물반응기일 수 있다. 이러한 시스템은 작동하기 용이하고, 적절한 담체 및 배양 조건을 이용하여 매우 높은 세포 밀도(~107-108 세포·ml-1)가 달성될 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 고체 담체는, 예를들어 미세담체(microcarrier)일 수 있다. 미세담체는 세포가 현탁 배양으로 성장할 수 있는 작은 고체 입자이다. 세포는 미세담체의 표면에 부착하여 증식될 수 있다. 통상적으로, 미세담체는 90 μm 내지 300 μm의 직경을 지니는 비드로 구성된다. 미세담체는 세포 부착 및 증식에 성공적인 것으로 증명된 다양한 물질, 예를들어 유리, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 젤라틴 및 셀룰로오스로 이루어질 수 있다. 또한, 미세담체의 표면은 세포 부착 및 성장을 촉진시키는 물질, 예를들어 N,N-디에틸아미노에틸, 유리, 콜라겐 또는 재조합 단백질로 코팅될 수 있다. 매크로다공성(macroporous) 및 비-다공성 미세담체 둘 모두가 존재할 수 있다. 매크로다공성 표면은 세포가 접종 후 미세담체의 내부로 접근하는 것을 용이하게 하고, 미세담체의 내부로 접근한 후, 세포는 생물반응기에서의 기계적 교반 및 통기에 의해 생성되는 전단력으로부터 보호된다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 추가의 고체 담체는, 예를들어 디스크, 예를들어 폴리프로필렌 메시(mesh)면에 결합된 폴리에스테르 부직포 섬유로 구성된 디스크일 수 있다(예를들어, 미국 특허 제 5,266,476호 참조). 이러한 디스크는 보통 현탁 세포를 디스크에 부착시키고 섬유 시스템에 포획되는 것을 촉진시키기 위해 정전기적으로 처리되고, 여기서 이들은 배양 과정을 통해 유지된다. 디스크에서 성장한 세포를 이용하여 달성된 세포 밀도 및 생산성은 미세담체에서 성장하는 세포 보다 10배까지 높을 수 있다.
당화된 인터페론 베타의 생성을 위한 방법은 바람직하게는 인터페론 베타를 함유하는 세포 배양 수거물을 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
한 바람직한 구체예에서, 세포 배양 수거물은 정제 방법에 추가로 적용된다.
정제 방법은 요망되는 순도의 인터페론 베타를 발생시키는 임의의 방법일 수 있고, 이는 크로마토그래피에 기초한 정제 단계 및 염 등을 이용한 분획법과 같은 임의의 기타 정제 기술의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 정제는 바람직하게는 본 발명의 두번째 양태에 따라 수행된다.
두번째 양태에서, 본 발명은,
a) 유체를 친화성 크로마토그래피에 적용시키는 단계;
b) 친화성 크로마토그래피의 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계;
c) 양이온 교환 크로마토그래피의 용출액을 RP-HPLC에 의한 소수성 크로마토그래피에 적용시키는 단계를 포함하여, 유체로부터 재조합 인터페론을 정제시키는 방법에 관한 것이다.
단계(a)는 바람직하게는 블루 세파로오스, 예를들어 블루 세파로오스 고속 유속 컬럼 상에서 수행된다. 단계(b)는 바람직하게는 카르복시메틸 수지, 예를들어 CM 세파로오스 고속 유속 컬럼 상에서 수행된다.
한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 정제 방법은 단계(a) 전에 미세여과에 의해 유체를 정화시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 정제 방법은,
d) 초여과 및 투석을 수행하는 단계;
e) 투석액을 크기 배제 크로마토그래피에 적용시키는 단계; 및
f) 크기 배제 크로마토그래피의 용출액을 여과에 적용시키는 단계를 추가로 포함한다.
단계(f)는, 예를들어 미세여과 또는 나노여과에 의해 수행될 수 있다.
상기 크로마토그래피 단계로부터 생성된 용출액 내의 소분자량 성분을 제거하기에 초여과가 유용하다. 초여과는, 예를들어 상기 단계로부터 유기 용매, TFA 및 염을 제거하여, 요망되는 완충용액 중의 인터페론 베타를 평형화시키거나, 요망되는 농도로 분자를 농축시키는 것을 가능케 한다. 이러한 초여과는, 예를들어 5 kDa 미만의 분자량을 지니는 성분을 배제시키는 초여과 배지에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 정제된 단백질을 인간에게 투여하려는 경우, 바이러스를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것이 유리하다. 바이러스 제거 여과 단계는, 예를들어 단계(d)와 (e) 사이, 또는 단계(e) 후에 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 방법은 2개의 바이러스 제거 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 정제 방법으로 수득될 수 있는 순도는 바람직하게는 > 80%, 더욱 바람직하게는 > 90%, 가장 바람직하게는 > 98%이다.
본 발명에 따른 인터페론 베타를 정제시키는 방법은 바람직하게는 정제된 인터페론 베타를, 임의로 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 약제 조성물로 제형화시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명에 따라 생성되거나 정제된 인터페론 베타는 임의의 세포주 또는 클론에 의해 발현될 수 있다. 그러나, 당화된 인터페론 베타를 제조하기 위한 숙주 세포로서 DHFR(디히드로폴레이트 환원효소) 활성이 결핍된 DUKX-B11로 명명된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주를 사용하는 것이 바람직하다. 인간 인터페론-β를 코딩하는 DNA 서열은, 예를들어 미국 특허 제 5,326,859호에 기술되어 있다.
본 발명의 한 바람직한 구체예는 특정 세포 생산성(IU/106 세포/24 시간)으로 약 100000 IU 이상의 재조합 인간 인터페론-β를 생성할 수 있는 트랜스펙션된 세포에서 재조합 인간 인터페론-β를 생성하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 세포는 약 200000 IU 이상 또는 약 200000 IU 이상 또는 약 300000 IU 이상 또는 약 400000 IU 이상 또는 약 500000 IU 이상 또는 약 600000 IU 이상의 재조합 인간 인터페론 베타 특이적 세포 생산성으로 재조합 인간 인터페론 베타를 생성할 수 있다.
바람직하게는, 인터페론 베타 생성 세포는 인간 IFN-β 유전자에 기능적으로 연결된 하나 이상의 프로모터/인핸서 성분을 포함하는 핵산 작제물로 트랜스펙션된 CHO 세포이다. 더욱 바람직하게는, 하나 이상의 프로모터/인핸서 성분은 SV40 프로모터/인핸서를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 핵산 작제물은 최소한 인간 IFN-β 유전자에 기능적으로 연결된 SV40 프로모터/인핸서로 구성된 제 1 전사 단위를 포함하고, 상기 인간 IFN-β 유전자는 SV40 T Ag 조기 폴리아데닐화 영역에 기능적으로 연결된다. 핵산 작제물이 최소한 SV40 프로모터/인핸서, 마우스 DHFR 유전자 및 SV40 T Ag 폴리A-함유 조기 폴리아데닐화 영역으로 구성된 제 2 전사 단위를 추가로 포함하는 것이 또한 매우 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구체예는 세포로 트랜스펙션되기 위한 인간 IFN-β 유전자에 기능적으로 연결된 1개 이상의 프로모터/인핸서 성분을 포함하는 핵산 작제물에 관한 것으로, 이러한 핵산 작제물은 트랜스펙션된 세포가 특정 세포 생산성 (IU/106 세포/24 시간)으로 약 100000 IU 이상, 약 200000 IU 이상 또는 약 300000 IU 이상 또는 약 400000 IU 이상 또는 약 500000 IU 이상 또는 약 600000 IU 이상의 재조합 인간 인터페론-β를 생성시킬 수 있음을 특징으로 한다.
바람직하게는, 1개 이상의 프로모터/인핸서 성분은 SV40 프로모터/인핸서를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 핵산 작제물은 최소한 인간 IFN-β 유전자에 기능적으로 연결된 SV40 프로모터/인핸서로 구성된 제 1 전사단위를 포함하고, 상기 인간 IFN-β 유전자는 SV40 T Ag 조기 폴리아데닐화 영역에 기능적으로 연결된다. 가장 바람직하게는, 핵산 작제물은 최소한 SV40 프로모터/인핸서, 마우스 DHFR 유전자 및 SV40 T Ag 폴리A-함유 조기 폴리아데닐화 영역으로 구성된 제 2 전사 단위를 추가로 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 인터페론 베타에 관한 것이다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 독특한 당화 프로파일을 지니는 인터페론 베타 조성물에 관한 것이다. 이러한 인터페론 베타는 바람직하게는 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된다.
한 구체예에서, 당화된 재조합 인간 인터페론-β 단백질은 2개 또는 3개의 푸코오스 당류를 지니는 올리고당류 구조를 함유한다. 한 바람직한 구체예에서, 올리고당류 구조는 디시알릴 바이안테나리 트리푸코오실화된 글리칸 (Neu2Ac.Hex5.HexNAc4.Fuc3)을 추가로 포함한다.
한 추가의 바람직한 구체예에서, 독특한 당화 패턴은 시알릴화되지 않은 바이안테나리 구조 (Hex5.HexNAc4.Fuc); 디시알릴화된 트리안테나리 구조 또는 N-아세틸 락토사민 반복 구조를 지니는 디시알릴화된 바이안테나리 (NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc); 트리시아릴화된 트리안테나리 구조 (NeuAc3.Hex6.HexNAc5.Fuc); N-아세틸 락토사민 반복 구조를 지니는 트리시알릴화된 트리안테나리 구조 또는 트리시알릴화된 테트라안테나리 (NeuAc3.Hex7.HexNAc6.Fuc); 2개의 푸코오스 단위를 지니는 모노 시알릴화된 및 디시알릴화된 바이안테나리 구조 (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2, NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2)를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 독특한 당화 패턴은 천연 인간 단백질 당화 패턴과 유사한 수준의 N-아세틸뉴라민산: N-글리콜릴뉴라민산을 특징으로 하는 글리칸을 포함한다.
한 추가 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인터페론 베타 조성물은 약 1 내지 약 5%의 시알릴화되지 않은 N-글리칸, 약 5 내지 약 25%의 모노-시알릴화된 글리칸, 약 55 내지 약 75%의 디-시알릴화된 N-글리칸, 및 약 10 내지 약 25%의 트리-시알릴화된 N-글리칸을 포함하는 시알릴화 프로파일을 특징으로 한다.
본 발명의 한 추가 양태는 인간 질병, 특히 다발경화증, 암 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 따른 인터페론 베타의 용도에 관한 것이다.
다발경화증은 재발성, 비재발성 및 조기 발병 다발경화증으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 재조합 인간 인터페론-β 단백질을 이를 이용한 치료가 필요한 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 본 발명에 따른 인터페론-β를 이용한 치료가 필요한 피검체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 치료는 다발경화증을 치료하기 위한 것이다. 더욱 특히, 다발경화증은 재발성, 비재발성 및 조기 발병 다발경화증으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 치료는 항종양 치료이다.
한 추가 대안에서, 치료는 항바이러스 치료이다.
본 발명의 한 추가 양태에서, 본 발명은 활성 성분으로서 본원에 기술된 단리되고 정제된 재조합 인간 인터페론-β 조성물 및 약제 조성물의 투여를 위한 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 항종양 또는 항바이러스 활성 또는 다발경화증에 대한 활성을 지니는 약제 조성물은 활성 성분으로서 본원에 기술된 단리되고 정제된 재조합 인간 인터페론-β 단백질 및 약제 조성물의 투여를 위한 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 추가 양태에서, 본 발명은 패키징 물질 및 치료적 유효량의 분리되고 정제된 재조합 인터페론-β 단백질을 포함하는 제조 물품에 관한 것으로, 상기 패키징 물질은 본원에 기술된 재조합 인간 인터페론-β 단백질이 치료를 위해 인간에게 투여될 수 있음을 나타내는 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다.
본원에 기술된 분리되고 정제된 재조합 인간 인터페론-β 단백질 또는 약제 조성물은 바람직하게는 재발성, 비재발성 및 조기 발병 다발경화증을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용된다. 특정 피검체(환자)에 대한 투여 방법은 이러한 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있으므로 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 기재와 함께 하기의 실시예를 참조로 하여, 본 발명이 비제한적인 방식으로 예시된다.
일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 본 발명에 이용된 실험 방법은 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명된다. 예를들어, 본원에 충분히 나열된 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌["Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al.,(1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes Ⅰ-Ⅲ Ausubel, R. M., ed.(1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York(1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al.(eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes Ⅰ-Ⅲ Cellis, J. E., ed.(1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y.(1994), Third Edition; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed.(1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds.(1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds.(1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed.(1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press,(1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B.,(1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA(1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press(1996)]을 참조하라.
이제까지 본 발명을 충분히 기술함에 따라, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 과도한 실험 없이, 전술한 바가 광범위한 동등한 파라미터, 농도 및 조건 내에서 수행될 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명은 이의 특정 구체예와 관련하여 기술되었으나, 추가의 변형이 있을 수 있음이 이해될 것이다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고, 본 발명이 속하는 분야에서 공지되거나 통상적인 실시에 속하고, 하기에 첨부된 청구의 범위에 기재된 상기의 본질적인 특징에 적용될 수 있는 바와 같은, 본 발명의 기재로부터의 이탈을 포함하는 본 발명의 임의의 변형, 용도 또는 적합화를 포함한다.
간행물 또는 초록, 공개되거나 공개되지 않은 미국 또는 외국의 특허 출원, 반포된 미국 또는 외국 특허 또는 임의의 기타 참고를 포함하는 본원에 인용된 모든 참고문헌은 상기 인용된 참고문헌의 모든 데이터, 표, 도면 및 본문을 포함하여 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다. 또한, 본원에 인용된 참고문헌 내에 인용된 참고문헌의 전체 내용이 또한 참조로서 본원에 포함된다.
공지된 방법의 단계, 통상적인 방법의 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 참조는 어떠한 방식으로든 본 발명의 임의의 양태, 기재 또는 구체예가 관련 분야에 기재되거나, 교시되거나, 암시된 것을 인정하는 것은 아니다.
특정 구체예의 전술한 기재는 당업자의 지식(본원에 인용된 참고문헌의 내용을 포함함)을 적용함으로써 본 발명의 일반적인 개념을 벗어나지 않고 과도한 실험 없이 상기 특정 구체예의 다양한 적용을 위해 제 3자가 용이하게 변형하고/되거나 적합화시킬 수 있는, 본 발명의 일반적인 특성을 충분히 나타낼 것이다. 따라서, 이러한 적합화 및 변형은 본원에 제시된 교시내용 및 안내를 기초로 하여 본원에 기술된 구체예와 동등한 의미의 범위에 해당하는 것을 의미한다. 본원의 표현 또는 용어는 기재를 위한 것으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 명세서의 용어 또는 표현은 본원에 제시된 교시내용 및 안내와 함께 당업자의 지식의 견지에서 당업자에 의해 판단되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1 - IFN-베타를 고수준으로 생성하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 클론의 제조
본 실시예는 인터페론 베타를 생성하는 CHO 클론의 생성을 기술한다.
특히 발현 플라스미드의 제조와 관련된 기본적인 방법은 문헌[Mory et al.(1981)]에 기술되어 있다.
클론을 생성하는 방법의 개관은 도 1에 도시되어 있다. 인간 인터페론-β 코딩 영역을 포함하는 DNA 단편을 인간 말초혈액 세포 유전체 DNA 라이브러리로부터 분리시켰다. DHFR-결핍 CHO 세포주를 인간 IFN-β 코딩 서열, 및 선택 마커 및 증폭 마커로써 마우스 DHFR 유전자 둘 모두를 함유하는 재조합 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 티미딘이 결여된 배지에서 선택한 후, 메토트렉세이트(MTX)를 이용하여 유전자를 증폭시키고, 클로닝시키고, 고수준으로 IFN-β-1a를 생성하는 세포를 분리시켰다. 세포를 유전형 및 표현형에 관해 특성규명하였다.
hIFN-β 및 mDHFR 유전자를 지니는 발현 플라스미드의 제작
유전체 인간 IFN-β 코딩 서열 및 마우스 DHFR 내성 유전자 둘 모두를 함유하는 발현 벡터를 제작하였다. 이러한 작제물은, 예를들어 문헌[Chernajovsky et al., 1984]에 공지된 바와 같이 IFN-β 코딩 서열을 포함하는 첫번째 플라스미드 및 마우스 DHFR 서열을 포함하는 두번째 플라스미드인 두개의 별개의 플라스미드를 CHO 숙주세포에 공동 트랜스펙션시킬 필요성을 배제시켰다.
IFN-β 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터는 IFN-β 3'UTR이 결여되었고, 따라서 IFN-β 폴리아데닐화 영역이 결여되었다.
따라서, 본 발명의 발현 벡터는 두개의 전사 단위인, SV40 프로모터/인핸서, 인간 IFN-β 코딩 서열 및 SV40 T Ag 조기 폴리아데닐화 영역으로 구성된 제 1 IFN-β 전사 단위, 및 SV40 프로모터/인핸서, 마우스 DHFR 유전자 및 SV40 T Ag 폴리A-함유 조기 폴리아데닐화 영역으로 구성된 제 2 DHFR 전사 단위를 함유하였다.
이러한 전사 단위는 ColEI 세균 복제 기점 및 앰피실린 내성 유전자를 지니 는 pBR322 플라스미드로부터의 서열의 뒤에 위치하였다.
발현 벡터의 구조를 제한효소 지도 분석 및 완전 서열분석(이중가닥의 자동화된 서열분석)에 의해 확인하였다. 제작에 사용된 단편의 정확한 서열을 양 방향에서 확인하였다.
숙주 세포의 기재
DHFR(디히드로폴레이트 환원효소) 활성이 결여된 DUKX-B11로 명명된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주를 숙주 세포로 사용하였다. 에틸 메탄술페이트 이후 감마 방사선 조사를 이용한 돌연변이유발에 의해 CHO-K1 세포주로부터 프롤린을 필요로 하는 상기 세포주를 분리시켰다(Kao and Puck, 1968). 높은 특정 활성의 [3H]-데옥시유리딘에 노출시켜 DHFR 결핍 돌연변이를 선택하였다(Urlaub and Chasin, 1980).
완전 결핍 돌연변이는 성장을 위해 글리신, 하이포잔틴 및 티미딘을 필요로 한다. 핵산 전구물질의 합성에서의 DHFR의 중추적 역할과 함께 메토트렉세이트(MTX)와 같은 유사체에 대한 DHFR-결핍 세포의 민감성은 두개의 주요 이점을 제공한다. 첫째로, DHFR 유전자를 함유하는 플라스미드를 이용한 상기 DHFR-결핍 세포의 트랜스펙션은 티미딘이 결여된 배지에서 성장하는 재조합 세포의 선택을 가능케 한다. 둘째로, 증가하는 농도의 MTX를 함유하는 선택 배지에서의 상기 세포의 배양은 DHFR 유전자 및 관련된 DNA를 증폭시킨다(Kaufman and Sharp 1982, and Sambrook, J., Fritsch, E. F., Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
클론의 생성
도 1에 개설된 바와 같이, 상기 기술된 h-IFN-β 코딩 서열 및 mDHFR 마커 유전자 둘 모두를 함유하는 플라스미드를 이용하여 인산칼슘 침전 방법(Graham FL and Van Der EB, 1973; Busslinger, et al., 1981)으로 부착 의존성의 DHFR-결핍 CHO 세포를 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 유전자를 증폭시키기 위해, 선택된 클론을 MTX(메토트렉세이트) 처리하였다. 클론을 MTX 선택 후에 분리시켰다.
트랜스펙션
CHO DHFR-결핍 세포주 DUKX-B11을 37℃ 및 5% CO2에서 10% FBS가 보충된 햄 영양소 혼합물 F12에서 배양하였다.
트랜스펙션 하루 전에, CHO DUKX-B11 세포를 플레이트 9 cm당 5x105개의 세포로 시딩하였다. 0.45 ml의 10mM Tris-HCl(pH 7.9) 및 0.1 mM EDTA에 용해된 벡터 DNA를 0.05 ml의 2.5M CaCl2 용액과 혼합시킴으로써 CaPO4-DNA 공동 침전물을 제조하였다.
다음으로, 0.5 ml의 280 mM Na2HPO4 및 50 mM HEPES(pH 7.1)를 가볍게 교반시키면서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30-40분 동안 유지시켜 침전시켰다. 30분 동안 세포에 CaPO4-DNA를 첨가한 후, 9 ml의 세포 배양 배지를 첨가하고, 4시간 동안 세포를 인큐베이터로 복귀시켰다. 이후, 배지를 분리시키고, 배지내에서 4분 동안 10% 글리세롤을 이용하여 세포에 삼투적으로 충격을 주었다. 이후, 세포를 트립신 처리하고, 티미딘이 결여되었지만 150 μg/ml의 프롤린 및 10%의 투석된 FBS가 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)으로 구성된 선택 배지에서 1:4 내지 1:10의 분할 비율로 계대배양하였다. 배양을 37℃ 및 8% CO2에 유지시키고, 선택 배지를 3-4일 마다 교체시켰다.
구성적 hIFN-β 생성 세포주의 분리
인터페론 베타 생성 세포를 3mm 트립신 침지된 종이-디스크를 이용한 트립신처리 10-12일 후에 분리하였다. 43개의 클론을 채집하여, 개별적인 클론을 성장시키고, 세포 배양 상층액을 ELISA에 의해 hIFN-β 생성에 대해 시험하였다. 24시간당 106개의 세포당 30,000 이상의 IFN-β IU를 생성하는 3개의 클론을 유전자 증폭을 위해 선택하였다.
각각의 클론을 저농도의 MTX를 이용하여 배양하였다. 이러한 처리에 생존한 전체 세포 집단을 보다 높은 MTX 농도로 처리하였다. 마지막 증폭 단계 후에야 서브클로닝 및 클론 선택을 수행하였다. 선택된 높은 생성 클론(24시간당 106개의 세포당 400,000 이상의 IU)으로 클론 안정성 연구를 하였다. 비교적 안정한 고 생성 클론을 선택하고 서브클로닝시켰다. 생성된 클론으로부터, 안정한 고 생성 클론을 선택하였다.
증폭은 IFN-β-1a의 생성 수준(특정 생산성)을 ELISA로 측정시 24시간당 106개의 세포당 30,000 IU로부터 500,000 IU로 증가시켰다.
높은 IFN-β-1a 생산성의 클론을 처음 분리한 후 노던 블롯 분석을 수행하였다. 발현 작제물로부터 예상되는 바와 같이 약 0.9 kb의 단일한 hIFN-β mRNA가 발현되었다(데이터는 나타내지 않음).
첫번째 클론으로부터의 전체 RNA의 노던 블롯 분석을 위해, 블롯을 하기와 같이 제조하였다.
20 μg의 전체 RNA를 아가로오스 포름알데히드 젤에서의 전기영동에 의해 분리하였다. RNA를 나일론 막으로 옮기고, IFN-β DNA 프로브에 하이브리드시켰다. 크기 마커(M)는 4700 및 1900 누클레오티드에 각각 해당하는 28S 및 18S rRNA였다(나타내지 않음).
생산성
이후, 세포 생산성을 하기와 같이 시험하였다. 조직 배양(성장) 배지는 프롤린(150mg/l) 및 10% FBS(우태아 혈청)가 보충된 DMEM(둘베코 변형 이글 배지) 또는 혈청 비함유 배지, 예를들어 JRH사의 Ex-Cell 302였다.
인터페론 생성 클론으로부터의 세포를 30 ml 성장 배지(DMEM 및 FBS, 또는 혈청 비함유 배지)를 지닌 TC80 플라스크(2 x 106개의 세포/플라스크)에 시딩하였다. 현미경 검사로 결정시 최초 컨플루언시(confluency)에 도달하는 경우, 성장 배지를 20 ml의 새로운 배지로 대체하고, 배양물을 24시간 동안 약 32℃에서 인큐베이션시켰다. 배양 배지의 샘플을 각각의 플라스크로부터 수득하였다. 시판되는 ELISA 키트(예를들어, 토레이사(Toray, Japan)의 토레이 ELISA 키트)를 이용하여 배양 배지로부터 IFN-β-1a 수준을 ELISA로 결정하였다.
24시간당 생성된 IFN-β-1a ml당 IU에 TC80 플라스크당 부피를 곱하고, 플라스크당 전체 세포수(백만개)로 나누어서 특정 세포 생산성을 계산하였다.
결과 및 결론
인터페론 베타 생성 세포 클론은 특정 세포 생산성(IU/106개의 세포/24시간)에서 약 100,000 IU 및 특정 세포 생산성에서 약 600,000 IU의 범위로 재조합 인간 인터페론-β에 대해 높은 생산 능력을 지니는 안정한 세포주였다. 새로운 세포주의 평균 생산성은 24시간당 106개의 세포당 556,000 ± 119,000 IU였다.
시딩후 1 내지 4일 후에 위상차 현미경으로 일반적인 세포 형태를 검사하였다. 현미경 사진으로 형태를 기록하였다(나타내지 않음). 결과는 낮은 밀도(시딩후 24 내지 48시간 후)에서 세포가 둥근 형태의 방추형 형태를 나타내는 것을 보여준다(결과는 나타내지 않음). 컨플루언시에서, 세포는 연장된 방추형의 보다 작은 빈틈없이 패킹된 상피세포 유사 세포로 구성된 밀집 단층을 형성하였다(결과는 나타내지 않음). 이러한 세포에 의해 나타난 형태적 특성은 CHO 세포의 통상적인 특성이었다.
상기 클론의 세포에서의 hIFN-β 코딩 영역의 DNA 서열 결정
mRNA 서열은 RNA 전사가 정확하게 이루어졌는지에 대한 직접적인 증명을 제공하므로, hIFN-β 메신저 RNA(mRNA)로부터 유래된 PCR DNA 생성물을 사용하여 코딩 영역의 누클레오티드 서열을 결정하였다.
DNA 서열분석 절차
cDNA 및 PCR 반응
T-플라스크 배양물의 지수성장기의 세포로부터 전체 세포 RNA를 제조하였다(Chomczynski and Sacchi, 1987). 2 마이크로그램(μg)의 전체 RNA, 0.5 μM의 무작위 헥사머, 2.5 mM의 MgCl2, 1X PCR Ⅱ 완충용액 [10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 50 mM KCl], 0.5 mM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 40 유닛의 RNase 억제제, 및 200 유닛의 역전사효소를 100 μl의 최종 부피로 함유하는 반응으로 mRNA 샘플로부터 상보적 DNA(cDNA)를 합성하였다.
RNA 주형, 프라이머 및 누클레아제 제거수를 결합시키고 10분 동안 65℃에서 인큐베이션시킨 후, 얼음 수조에 두었다. 잔여 성분을 첨가하고, 반응을 60분 동안 42℃, 이후 15분 동안 70℃에서 인큐베이션시킨 후, 4℃에서 무기한으로 유지시켰다. RT 생성물(cDNA)을 추가 사용시까지 -20℃에서 보관하였다. 대조군으로써, 역전사효소를 제외한 모든 성분을 지닌 반응물을 제조하였다. "RT 결여" 대조군은 RNA 제조물이 DNA 오염을 지닐 가능성이 없도록 하였다.
cDNA 주형에 대해 프라이머 SRB 1 AP1 및 AP2를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 이러한 프라이머 서열은 하기와 같다:
Figure 112008020229311-pct00001
PCR 반응물은 하기와 같이 구성되었다: 50 μl의 반응 부피중 4.0 μl의 cDNA 반응 혼합물, 50 pmol의 각각의 프라이머쌍, 및 25 μl의 HotStarTaq™ 마스 터 믹스. 반응물을 15분 동안 95℃에서 가열한 후, (a) 30초 동안 94℃, (b) 30초 동안 55℃, 및 (c) 1분 동안 72℃의 30-35주기로 가열하였다. 이후, 처음의 30-35주기와 동일하지만 10분으로 연장된 72℃에서의 인큐베이션 시간을 지니는 최종 주기를 수행하였다.
hIFN-β PCR 생성물을 저용융점(LMP) 아가로오스 젤 전기영동 후, 키아퀵(QIAquick) 젤 추출 키트(Qiagen)를 이용한 추출에 의해 정제시켰다.
증폭된 DNA의 서열분석
PCR 생성물을 AmpliTaq® DNA 중합효소를 이용하는 빅 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 레디 리액션 키트(Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)를 이용하여 직접 서열분석하였다. 모든 서열분석 반응물을 ABI373-S 자동화 DNA 서열분석기 상의 5.75% 롱 레인저(Long Ranger™) 젤에서 분석하였다. 가공되지 않은 데이터를 탐지하고, ABD 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
결과
PCR 증폭은 예상된 약 815 bp 단편을 생성시켰다. "RT 결여" 대조군 및 기타 음성 대조군에서는 PCR 생성물이 관찰되지 않았다.
hIFN-β 유전자의 단백질 코딩 영역에 대해 완전한 서열 데이터를 수득하고; 모든 누클레오티드를 2개 이상의 전기영동도에서 판독하였다(데이터는 나타내지 않음). 서열을 발현 벡터와 비교하는 경우, 차이가 발견되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
결론
서열분석 데이터는 클론의 세포의 유전체로 통합된 hIFN-β 유전자가 hIFN-β mRNA로 정확하게 전사된 것을 입증한다.
유전자 카피수의 결정
BamHI 분해물의 서던 블롯 분석으로 유전자 카피수를 결정하였다.
유전자 카피수 분석을 위한 프로브를 제작하는데 사용된 특정 프라이머는 하기와 같다:
Figure 112008020229311-pct00002
유전체 DNA 제조 및 서던 블로팅 절차
유전체 DNA를 염석 방법의 변형을 이용하여 지수적으로 성장하는 T-플라스크 세포 배양물로부터 분리하였다(Martinez et al., 1998). 간단하게, 세포를 Tris-NaCl-EDTA 완충용액에 재현탁시키고, Tris-NaCl-EDTA-SDS 완충용액을 이용하여 용해시켰다. 이러한 현탁액을 프로테이나아제 K를 이용하여 밤새 처리하였다. 포화된 염 용액을 첨가하고 원심분리시킨 후, 이소프로판올을 수성상으로 첨가하여 유전체 DNA를 침전시켰다. 70% 에탄올로 세척한 후, DNA 펠렛을 TE/RNase A 용액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 20 μg/ml RNaseA)에 재현탁시켰다.
모든 유전체 DNA 제조물의 분취량을 AfIⅢ, BbsⅠ, BglI, DraⅠ, HincⅡ, PstⅠ, 및 XmnⅠ으로 분해하였다. 유전체 샘플에 사용된 동일한 제한 엔도누클레아제를 이용하여 발현 벡터 DNA 샘플을 분해하여 표준을 제조하였다. DNA를 아가 로오스 젤에서 전기영동에 의해 크기 분류한 후, 10X SSC 중에서 모세관 작용에 의해 나일론 막으로 옮겼다. 로딩된 유전체 DNA의 양은 0.5 μg이었다. 상기 나타낸 프라이머를 이용하여 플라스미드로부터 PCR 증폭된 32P-표지된 hIFN-β 단편에 하이브리드화시키기 위해 블롯을 제조하였다. 65℃에서 예비하이브리드화 및 하이브리드화를 수행하였다.
자가방사선술에서 32P에 의해 시각화되는 밴드의 이동을 기초로 크기 결정을 수행하였다. 발현 벡터를 대조군으로 사용하였다.
카피수 결정을 모델 445SI PhosphoImager™(Molecular Dynamics; Sunnyvale, CA)에서 양이 측정되는, 밴드에서의 상대 32P 수준을 기초로 하였다. 자가방사선술을 사진으로 찍어 결과를 기록하였다(데이터는 나타내지 않음).
결과
클론의 인터페론 베타 생성 세포에 대해 생성된 단편의 크기 결정을 모든 분해물에 대해 집계하였다.
인터페론 베타 생성 세포주로부터 추출된 DNA의 효소 분해는 BamHI, BglI, DraⅠ 및 HincⅡ 분해에 대해 발현 벡터로부터 예상된 것과 매치되는 주요 밴드를 생성시켰다. BglⅠ-분해된 유전체 DNA를 이용하여 매우 희미한 밴드(~1.77 kb)가 관찰되었고, 이는 불완전한 분해의 결과인 듯 하다. 이러한 제한 효소는 hIFN-β 발현 단위의 측면에 존재하고, 이는 온전한 기능적인 전장 단위가 유전체에 통합된 것을 나타낸다.
잔여 분해물에서, 발현 벡터와 유전체 DNA 사이에서 밴딩 패턴의 차이가 관찰되었다. 이는 원형 벡터가 CHO 세포 유전체로 통합되는 경우 약간의 재배열이 발생해야 하므로 예기치 못한 것이 아니다.
클론의 세포에 대해 결정된 카피수 수준은 세포당 대체로 96-105 카피였다. 예를들어, 하나의 그룹의 세포에 대해, 평균 유전자 카피수(n=3)는 105였고, 23의 표준 편차 및 22의 CV(%)를 지녔다.
mRNA 크기의 결정
지수적으로 성장하는 인터페론 베타 생성 세포 및 트랜스펙션되지 않은 CHO DUKX 세포로부터 전체 RNA를 분리하였다(Chomczynski and Sacchi, 1987). 사용된 프로브는 "유전자 카피수의 결정" 섹션에 기술된 바와 같이 제조된 32P-표지된 hIFN-β 프로브 및 대조군 G3PDH cDNA 프로브(Clontech; Palo Alto, CA)를 포함하였다.
절차
레인당 5 μg의 전체 RNA를 변성제로 포름알데히드를 함유한 아가로오스 젤에서의 전기영동에 의해 크기 분류하였다. 샘플을 이중 세트로 로딩하였다. RNA를 10X SSC 중에서 모세관 작용에 의해 나일론막으로 옮겼다. 예비하이브리드화 및 하이브리드화를 "제한 엔도누클레아제 지도 분석" 섹션에 기술된 변형된 처치 및 길버트(Church and Gilbert) 용액 중에서 65℃에서 수행하였다. 블롯을 32P-표지된 hIFN-β 프로브 및 대조군 G3PDH cDNA 프로브에 하이브리드화시켰다. 블롯의 자가방사선술로부터 밴드 크기를 평가하였다.
결과 및 결론
상기 세포에 대해 하나의 주요한 IFN-β mRNA 종이 관찰되었다. mRNA 크기는 0.9 kb의 mRNA인 것으로 측정되었다. 이러한 크기는 mRNA가 SV40 전사 개시 부위에서 시작되고, 폴리A 꼬리를 고려하지 않고 약 800 누클레오티드의 전사체를 생성시키는 것과 관련된다.
일반적 결론 및 요약
인터페론 베타 생성 세포에 대한 표현형 및 유전형 연구는 세포의 확인 및 일관성을 확증하였다.
hIFN-β 유전자의 CHO 세포 유전체로의 염색체 통합이 인-시츄(in-situ) 하이브리드화 연구에 의해 입증되었다.
제한 엔도누클레아제 지도화 패턴 비교시, 세포의 DNA 서열 및 mRNA 분석은 hIFN-β 유전자의 심한 DNA 재배열 또는 점 돌연변이의 증거를 나타내지 않았다.
본 발명에 따른 클론의 세포로부터 추출된 DNA의 서던 블롯 분석에 의해 hIFN-β 유전자 카피수 수준을 측정하였다. 결과는 유전자 카피수 수준이 세포수 배가 수준과는 상관없이 모든 세포에 대해 동일한 범위임을 나타내었다.
세포로부터 제조된 RNA의 노던 블롯 분석은 약 0.9 kb 크기의 단일 밴드를 나타내었다.
세포로부터의 cDNA의 서열 분석은 mRNA 서열의 정확성을 확증하면서, hIFN-β 유전자의 5' 및 3' 대조 영역의 유전체 DNA 서열은 완전한 IFN-β 전사 단위의 통합을 입증하였다.
결론적으로, 인터페론 베타 생성 세포가 정확한 단백질 코딩 영역 서열을 지니는 hIFN-β mRNA 전사체를 합성하는 것이 입증되었고, 이는 인터페론 베타 생성 세포가 정확한 일차 아미노산 서열을 지니는 인간 재조합 IFN-β(IFN-β-1a)를 생성하는 것을 나타낸다.
유전형 특성규명을 위해, 인터페론 베타 생성 세포에서 제한효소 지도 분석을 수행하였다. 다양한 분해물을 아가로오스 젤 전기영동으로 분리시키고, 나일론 막으로 옮기고, hIFN-β에 특이적인 표지된 프로브에 하이브리드화시켰다. 모든 세포 은행에서 일치하는 제한 단편 프로파일은 온전한 기능적인 hIFN-β 발현 단위의 통합을 나타내었다.
인터페론 베타 생성 세포로부터 추출된 DNA의 서던 블롯 분석으로 hIFN-β 카피수를 결정하였다(데이터는 나타내지 않음). 결과는 유전자 카피수가 세포당 약 100개의 카피인 것으로 나타났고, 이는 문헌[Chernajovsky et al., 1984]에 기술된 클론에 대한 카피수 보다 약 4배이다.
노던 블롯 분석에 의해, 클론으로부터의 세포에 대해 hIFN-β 유전자를 코딩하는 약 0.9 kb의 하나의 mRNA를 확인하였다(데이터는 나타내지 않음).
세포의 mRNA로부터 제조된 hIFN-β cDNA를 서열분석하고, 결과는 세포에 대해 hIFN-β 유전자 서열이 예상된 서열과 100% 동일한 것을 나타내었다. 따라서, hIFN-β 유전자는 mRNA로 정확하게 전사된다.
hIFN-β 유전자 측면에 위치하는 5' 및 3' 영역의 유전체 DNA 서열을 클론의 세포에 대해 결정하고, 발현 벡터의 상응 서열 및 hIFN-β 유전자의 공개된 서열과 100% 동일한 것으로 밝혀졌다.
hIFN-β 유전자의 단일한 염색체 통합이 또한 형광 인-시츄 하이브리드화(FISH, 결과는 나타내지 않음)에 의해 입증되었다.
상기 제시된 분석은 또한 생성 세포주의 안정성을 입증하였다.
따라서, 트랜스펙션된 유전자가 인터페론 베타 생성 세포의 유전체에 안정적으로 통합되는 것으로 추정될 수 있다.
실시예 2 - 인터페론 베타를 생성하기 위한 방법
이러한 실험의 전체 목적은 혈청을 함유하지 않는 조건하에서 실시예 1에 기술된 클론으로부터 IFN 베타-1a를 생성하는 방법을 개발하는 것이다.
혈청 비함유 방법을 내부 패킹된 베드 피브라-셀(bed Fibra-Cel®) 담체를 이용하여 75L 생물반응기 규모로 개발하였다.
세포를 해동시키고, 하기 변형을 지니는 시판되는 혈청 비함유 배지에서 21일에 걸쳐 확장시켰다:
표 1 - 혈청 비함유 배지의 변형
성분 조성 %(w/w)
HEPES 20 mM
프롤린 1 mM
페놀 레드 15 mg/L
염화나트륨 6150 mg/L
30 x 109개의 세포를 75L 생물반응기에 시딩하였다(고도의 시딩). 상기 과정은 하기 단계로 나누어졌다:
- 37℃에서의 성장기 Ⅰ(작업 2일 또는 작업 4일째까지 또는 글루코오스 소모 속도(GCR)가 ≥2.0±1.0 g.L-1.d-1인 경우까지);
- 35℃에서의 성장기 Ⅱ(작업 7일째까지 또는 GCR이 ≥8.0±0.5 g.L-1.d-1인 경우까지);
- 33℃에서의 생성기.
이러한 온도 방법은 하루당 생물반응기 ml당 약 6.0x106 IU의 생산성을 발생시켰다. 이러한 생산성은 혈청 함유 배지에서 문헌[Chernajovsky et al., 1984]에 기술된 클론의 생산성 보다 약 5배가 더 높다.
N-Actey-시스테인(NAC) 단독 또는 아연과의 조합물(NAC+Zn) 첨가가 생산성에 이로운 영향을 주는 지의 여부를 추가로 시험하였다. NAC 또는 NAC + Zn의 첨가는 상기 과정의 종점에서 하루당 생물반응기 ml당 약 12 x 106 IU로 생산성을 증가시켰다.
66%의 보다 낮은 시딩 세포 밀도(1.3.109 세포)를 또한 성장기 지속기간, 물질대사 및 생산성에 대한 이의 영향을 평가하기 위해 시험하였다.
물질대사 및 생산성은 낮은 시딩에 의해 영향을 받지 않았다. 적은 시딩은 단지 성장기를 2일 더 추가시켰다.
요약하면, 인터페론 베타의 생성을 위해 사용된 최종 조건은 다음과 같다:
온도 성장: 생성:
37℃⇒35℃ 33℃
희석 속도 1.6⇒7.2일-1
pH 7.0
pO2 70%
실시예 3 - 인터페론 단백질 생성물의 정제
세포 배양 상층액으로부터의 IFN-β-1a의 정제 방법은 도 2에 나타낸 바와 같이 4개의 크로마토그래피 단계 및 4개의 여과 단계를 포함하였다. 정제 단계를 하기 순서로 수행하였다:
·단계 Ⅰ: 여과에 의해 수거물 정화;
·단계 Ⅱ: 블루 세파로오스 6 고속 유속(6FF) 컬럼 상에서의 친화성 크로마토그래피;
·단계Ⅲ: 초여과;
·단계 Ⅳ: 바람직하게는 CM 세파로오스 FF 컬럼을 이용하는 양이온 교환 크로마토그래피;
·단계 Ⅴ: 소수성 크로마토그래피 RP-HPLC;
·단계 Ⅵ: 초여과 및 투석;
·단계 Ⅶ: 크기 배제(SE) 크로마토그래피; 및
·단계 Ⅷ: 미세여과.
활성 성분의 정제를 주요 정제 단계인 블루 세파로오스 6 FF(BS 6 FF) 상에서의 염료 친화성 크로마토그래피로 시작하였다. 파열된 CHO 세포로부터의 숙주 세포 유래 단백질 뿐만 아니라 DNA의 양은 수십배까지 감소되었고, 따라서 BS 6 FF 용출액 내의 IFN-β-1a가 현저하게 농축되었다. 용출액을 다음 컬럼에 로딩시키기 전에, 용액 부피를 감소시키고 저분자량 물질을 배제시키기 위해 초여과를 수행하였다.
고도로 정제된 IFN-β-1a를 수득하기 위해, 3개의 주요 유형의 컬럼 기재 단백질 분리를 선택하였다. CM-세파로오스 FF 수지 상에서의 이온-교환 크로마토그래피는 핵산 및 FBS/CHO 유래 단백질을 제거하였다. 역상 HPLC는 발열원, 잔여 숙주세포 유래 단백질 및 IFN-β-1a의 분해된 형태를 감소시켰다. 젤 여과의 최종 연마 단계를 세파크릴 S-100 HR 수지를 이용하여 수행하였다. 용출액을 미세여과(0.22 μm)시키고, -70℃ 또는 이 이하에 보관하였다.
완충용액 및 세척 용액의 제조에 사용된 모든 출발 물질은 Ph.Eur. 및/또는 USP에 따르거나, 분석 또는 시약 등급이었다.
실시예 4: 시알릴화 분석
정제된 IFN-베타를 ES-MS(전기분무-질량분석법)에 의해 시알릴화 프로파일을 분석하였고, 하기 결과를 수득하였다.
과정 1 과정 2
비-시알릴화 2% 4%
모노-시알릴화 10% 22%
디-시알릴화 69% 59%
트리-시알릴화 20% 16%
실시예 5 - 단백당형 분석
새로운 방법으로 수득된 IFN-β-1a를 추가로 분석하기 위해, 단백질의 단백당형을 분석하였다. 상기 기술된 바와 같이, 당화된 단백질은 종종 다양한 단백당형의 혼합물, 또는 당화에 있어서 다양한 당류 구조를 지니는 단백질로 발생한다. 이러한 단백당형을 분석하기 위해 전기분무 질량분석법, FAB-MS, MALDI-MS, 탠덤 질량분석법(MS/MS) 및 GC-MS(연관 연구)를 포함하는 다양한 기술을 사용하였고, 이는 하기에 보다 상세히 기술된다. 이러한 다양한 기술은 모두 연구된 다양한 당류 구조를 나타내었고, 클론으로부터 수득된 IFN-β-1a에서 하나의 이러한 구조가 새로이 제시되었다.
전기분무 질량분석법에 의한 단백당형 분포 결정
방법
인터페론 베타의 IFN-β-1a의 대량의 샘플을 전기분무 질량분석법(ES-MS)을 이용하여 클론으로부터 수득하였다. 이러한 방법은, 예를들어 문헌[Fenn, et al.,(1989)]에 기술되어 있다.
글리칸의 MS/MS. 이러한 기술은 분자 질량 수준에서 대량의 샘플의 단백당형 분포의 신속한 모니터링을 가능케 한다. 이러한 방법은, 예를들어 문헌[Domon, B. and Costello, CE(1988)]에 기술되어 있다.
결과
결과를 도 3-5에 제시하였다. 모든 도면에서, 다양한 올리고당류의 도해적 도면을 각각의 피크의 상부에 제시하였다. 도 3 및 4는 새로운 방법에 의해 수득된 인터페론 베타로부터의 여러 IFN-β-1a 배치의 ES-MS 변형된 스펙트럼을 도시한다.
모든 시험된 배치에서, 주 단백당형은 코어-푸코오실화된 디시알릴(피크 C) 및 모노시알릴(피크 B) 바이안테나리 탄수화물 구조였고, 부 단백당형은 코어-푸코 오실화된 시알릴화되지 않은 바이안테나리 구조(피크 A), 코어-푸코오실화된 트리안테나리 트리시알릴화된 구조(피크 E) 및 2개의 기타 코어-푸코오실화된 부 복합 구조(피크 D 및 F)였다.
디시알릴 바이안테나리 디푸코오실화된 글리칸 (NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2)으로 추정되는 22524 Da ± 0.01%에서의 작은 신호가 새로운 방법에 의해 수득된 인터페론 베타로부터 유래된 IFN-β-1a의 샘플에서 ES-MS에 의해 검출되었다. 이러한 단백당형은 또한 시알릴 루이스(Lewis) x (Lex) 안테나를 지니는 바이안테나리 글리칸으로 규정될 수 있다. Hex.HexNAc.Fuc 구조로 구성된 루이스 x (Lex) 글리칸이 통상적으로 림프구(L-셀렉틴) 및 특정 내피세포 둘 모두의 표면 상의 당단백질에서 발견된다는 것이 인지되어야 한다(Cummings, 1999; Dell and Morris, 2001).
모든 단백당형의 4%의 평균량을 지니고 디시알릴 바이안테나리 트리푸코오실화된 글리칸 (Neu2Ac.Hex5.HexNAc4.Fuc3)으로 추정되는, 22670 Da ± 0.01%의 평균 분자량 값의 중앙에 위치하는 또 다른 부 단백당형이 생성 규모와 관계없이 새로운 방법에 의해 수득된 인터페론 베타로부터의 IFN-β-1a 배치에서 ES-MS에 의해 검출되었다. 이러한 부 단백당형의 평균량은 4%이고, 0.90의 SD를 지닌다.
결론
새로운 방법에 의해 수득된 인터페론 베타로부터 유도된 IFN-β-1a의 단백당형 패턴을 ES-MS로 분석하였다.
새로운 방법에 의해 수득된 인터페론 베타로부터의 IFN-β-1a에서 ES-MS에 의해 발견된 디푸코오실화된 글리칸으로 추정되는 작은 신호를 MALDI-MS에 의해 검출하였다. 트리푸코오실화된 구조로 추정되는 하나의 추가의 부 단백당형(전체 단백당형의 평균 4%)이 또한 새로운 방법에 의해 수득된 인터페론 베타로부터의 생성물에서 ES-MS에 의해 검출되었다.
FAB-MS, MALDI-MS, 탠덤 질량분석법(MS/MS) 및 GC-MS(연관 연구)에 의한 탄수화물 분석
새로운 방법에 의해 수득된 인터페론 베타로부터 유래된 IFN-β-1a의 대량의 샘플을 광범위한 탄수화물 특성규명 연구에 적용시켰다. 트립신 분해 및 펩티드 N-글리코시다아제 F 분해 후에 극메틸화된 IFN-β-1a의 FAB-MS, MALDI-MS, 나노분무-MS/MS 분석 및 연관 연구(GC-MS)를 이용하여 IFN-β-1a의 탄수화물 조성을 수득하였다. 트립신 및 N-글리코시다아제 F를 이용하여 미리 분해된 키모트립신 분해 펩티드의 FAB-MS 분석에 의해 당화 부위 결정을 수행하였다.
방법
IFN-β-1a로부터의 트립신 분해된 펩티드 당펩티드 혼합물에 효소 펩티드-N-글리코시다아제 F를 처리(예를들어, 문헌[Tarentino et al.1985]에 기술된 바와 같이 처리)하였다.
반응을 정지(동결-건조에 의함)시킨 후, 생성된 분해물을 C18 Sep-pak 카트리지로 정제시켰다. 5% 아세트산 분획에서 용리된 탄수화물을 문헌[Costello(1997)]에 기술된 바와 같이 NaOH/요오드화메틸을 이용하여 극메틸화시 켰다.
극메틸화된 글리칸의 부분을, 예를들어 문헌[Barber, et al.(1981) and Taylor(1983)]에 기술된 바와 같이 양성 이온 FAB-MS(단편 이온에 대해 낮은 질량 범위 및 분자 이온에 대해 높은 질량 범위로 수득됨)로 분석하였다.
MALDI-질량분석법을, 예를들어 문헌[Hillenkamp, et al., 1991]에 기술된 바와 같이 수행하였다.
나노분무-질량분석법을, 예를들어 문헌[Wilm and Mann 1996]에 기술된 바와 같이 수행하였다.
나머지 극메틸화된 올리고당류를, 예를들어 문헌[Gray, 1990]에 기술된 바와 같이 유도체화 후 기체 액체 크로마토그래피/질량분석법(GC/MS)에 의한 연관 분석에 사용하였다.
최종적으로, Asn 80 잠재적 당화 부위를 함유하는 펩티드를 관찰하기 위해, 트립신 분해된 펩티드를 펩티드-N-글리코시다아제 F로 분해하고, Sep-pak에 의해 정제시켰다. Sep-pak의 프로판올 분획(20%-40%)을 키모트립신으로 분해시키고, FAB/MS로 분석하였다.
결과
극메틸화된 탄수화물의 MALDI 및 FAB-MS
새로운 방법에 의해 수득된 인터페론 베타로부터의 단백질에 대한 연구를 수행하였다. 대표적 MALDI 스펙트럼을 도 6에 나타내었다. 극메틸화된 스펙트럼(MALDI-MS 및 FAB-MS)에서 관찰된 m/z 신호의 해당 목록을 표 3에 나타내었다.
모든 배치에서의 결과는 우세하게 NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc의 조성을 지니는 디시알릴화된 바이안테나리 구조, 및 NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc의 조성을 지니는 모노시알릴 바이안테나리 구조의 존재를 나타내었다. 푸코오실화되지 않은 글리칸은 관찰되지 않았다.
하기의 올리고당류 구조에 해당하는 듯한 작은 신호가 또한 모든 배치에서 관찰되었다:
· 시알릴화되지 않은 바이안테나리 구조 (Hex5.HexNAc4.Fuc);
· 디시알릴화된 트리안테나리 구조 또는 N-아세틸 락토사민 반복 구조를 지니는 디시알릴화된 바이안테나리 (NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc);
· 트리시알릴화된 트리안테나리 구조 (NeuAc3.Hex6.HexNAc5.Fuc);
· N-아세틸 락토사민 반복 구조를 지니는 트리시알릴화된 트리안테나리 구조 또는 트리시아릴화된 테트라안테나리 (NeuAc3.Hex7.HexNAc6.Fuc);
· 두개의 푸코오스 단위를 지니는 모노 시알릴화된 바이안테나리 구조 및 디시알릴화된 바이안테나리 구조 (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2, NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2);
· 적은 양의 트리푸코오실화된 구조 (NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3)가 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 인터페론 베타로부터 유래된 배치에서 관찰되었으 나, 참조 IFN-β-1a에서는 존재하지 않았음;
· 글리칸의 시알산의 일부로서의 적은 양의 N-글리콜릴뉴라민산.
N-글리콜릴뉴라민산의 상대 존재비를 극메틸화된 N-결합 글리칸 FAB에서의 피크 높이의 신호 및 MALDI-TOF 데이터로부터 계산하였다.
예상된 바와 같이, IFN-β-1a 단백당형은 대부분의 인간 당단백질과 같은 N-아세틸뉴라민산을 주로 함유하였다.
나노분무 MS/MS
미량의 N-결합된 다중-푸코오실화된 올리고당류 구조의 구조를 추가로 확인하기 위해, MS/MS 분석을 NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2, NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2 및 NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3 각각에 대해 3중으로 하전된 이온([M+3H]3+)과 일치하는 m/z 919, 1040 및 1098에서의 신호의 극메틸화된 올리고당류에서 수행하였다. MS/MS 스펙트럼에서 관찰된 A형 이온은 하기 구조 속성을 확증하였다:
표 2
MS 신호(m/z) 새로운 방법으로부터의 IFN 베타 MS/MS에 의한 속성
919 관찰되지 않음* NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2
1040 + NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2
1098 + NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3
* 그러나, 해당 신호가 MALDI에 의해 관찰됨.
GC/MS에 의한 연관 분석
유도 시약으로부터 기인되는 약간의 불순물 피크와 함께, 새로운 방법에 의해 수득된 인터페론 베타로부터의 모든 시험된 배치에 대해 복잡한 GC 크로마토그 램이 수득되었다. 동일한 GC 조건에서 수행된 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트의 표준 혼합물과의 GC 체류 시간 비교는 당을 함유하는 피크의 일시적인 지정을 가능케 한다.
모든 샘플의 연관 분석 결과는 본질적으로 동일하였고, 이는 4-연결된 N-아세틸글루코사민(4-GlcNAc), 4,6-연결된 N-아세틸글루코사민(4,6-Glc-NAc), 3,6-연결된 만노오스(3,6-Man), 2-연결된 만노오스(2-Man), 말단 갈락토오스(t-Gal), 3-연결된 갈락토오스(3-Gal) 및 말단 푸코오스(t-Fuc)의 존재를 나타내었고, 이는 FAB-MS 데이터를 강하게 뒷받침한다. 2,6-연결된 만노오스가 또한 모든 샘플에서 부 성분으로 관찰되었고, 이는 약간의 트리안테나리 구조의 존재를 나타낸다. IFN-β-1a의 대량의 샘플에서 관찰된 자명한 주 올리고당류 구조가 도 5에 제시되어 있다.
이러한 데이터는 주요 탄수화물 부분이 1개 및 2개의 시알산 잔기를 지니는 코어 푸코오실화된 바이안테나리 구조임을 암시한다.
키모트립신 분해된 분해물의 FAB-MS에 의한 N-당화 부위
시험된 모든 IFN-β-1a 배치에 대해, 작은 FAB-MS 신호가 펩티드 N-글리코시다아제 F를 이용한 탄수화물의 방출 후에 아스파르트산으로 전환되는 Asn-80을 지니는 소디에이팅된(sodiating) 펩티드 잔기 80-88(D.E.T.I.V.E.N.L.L + Na+)를 지정하는 것으로 관찰되었다. 이러한 실험은 Asn-80가 확실히 당화된다는 증거를 뒷받침한다.
도 6은 극메틸화된 글리칸을 지니는 IFN-β-1a의 MALDI 스펙트럼을 도시한다(표 3의 신호 목록). 또한, 표 및 수반되는 도에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로부터 수득된 IFN-β-1a는 상기 기술된 바와 같이 트리푸코오스 구조인 NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3를 함유한다.
표 3 - 트립신 분해 및 펩티드 N-글리코시다아제 F 분해 후의 새로운 방법에 의해 수득된 IFN-β-1a의 극메틸화된 스펙트럼에서의 신호 목록
신호 m/z(G6E001) 가능한 지정
적은 질량
344.2 NeuAc+(-메탄올)
376.2 NeuAc+
406.3 NeuGc+
432.3 Hex.HexNAc+(-메탄올)
464.3 Hex.HexNAc+
793.5 NeuAc.Hex.HexNAc+(-메탄올)
825.5 NeuAc.Hex.HexNAc+
855.5 NeuGc.Hex.HexNAc+
999.5 NeuAc.Hex.HexNeuAc(Fuc)+
높은 질량
2142.6 -
2227.8 단편 이온
2244.8 Hex5.HexNAc4.Fuc[M+Na]+
2387.8 Hex4.HexNAc4.Fuc3[M+Na]+
2417.8 Hex5.HexNAc4.Fuc2[M+Na]+
N/D NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc[M+Na]+(-메탄올)
N/D NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc[M+Na]+(저메틸화됨)
2605.8 NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc[M+Na]+
2635.9 NeuGc.Hex5.HexNAc4.Fuc[M+Na]+
2779.9 NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2[M+Na]+
2911.0 NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc+(A-형 이온)
2952.9 NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc[M+Na]+(저메틸화됨)
2966.9 NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc[M+Na]+
2996.9 NeuAc.NeuGc.Hex5.HexNAc4.Fuc[M+Na]+
3055.0 NeuAc.Hex6.HexNAc5.Fuc[M+Na]+
3140.9 NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2[M+Na]+
3315.9 NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3[M+Na]+
3416.1 NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc[M+Na]+
3590.9 NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc2[M+Na]+
3779.0 NeuAc3.Hex6.HexNAc5.Fuc[M+Na]+
3810.9 NeuAc2.NeuGc.Hex6.HexNAc5.Fuc[M+Na]+
3866.1 NeuAc2.Hex7.HexNAc6.Fuc[M+Na]+
4227.9 NeuAc3.Hex7.HexNAc6.Fuc[M+Na]+
결론
새로운 방법에 의해 수득된 IFN-β-1a의 대량의 샘플의 극메틸화된 N-글리칸의 MALDI-MS 및 FAB-MS 분석은 하기의 코어-푸코오실화된 탄수화물 구조를 나타내었다(푸코오실화되지 않은 글리칸은 관찰되지 않았음):
주 단백당형:
· 모노시알릴화된 바이안테나리 구조 (NeuAc Hex5.HexNAc4.Fuc)
· 디시알릴화된 바이안테나리 구조 (NeuAc2 Hex5.HexNAc4.Fuc)
부 단백당형:
· 시알릴화되지 않은 바이안테나리 구조 (Hex5.HexNAc4.Fuc)
· 디시알릴화된 트리안테나리 구조 또는 N-아세틸 락토사민 반복 구조를 지니는 디시알릴화된 바이안테나리 (NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc)
· 트리시알릴화된 트리안테나리 구조 (NeuAc3.Hex6.HexNAc5.Fuc)
· N-아세틸 락토사민 반복 구조를 지니는 트리시알릴화된 트리안테나리 또는 트리시알릴화된 테트라안테나리 구조 (NeuAc3.Hex7.HexNAc6.Fuc)
· 2개의 푸코오스 단위를 지니는 디시알릴화된 바이안테나리 구조 및 모노시알릴화된 바이안테나리 구조 (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2, 및 NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2)
· 3개의 푸코오스 단위를 지니는 디시알릴화된 바이안테나리 구조 (NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3).
극메틸화된 글리칸의 나노분무 MS/MS는 모든 샘플에서 NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2 올리고당류의 미량 수준의 검출을 확증하는 반면, NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3의 미량은 본 발명의 방법으로부터의 IFN-β-1a에서만 관찰되었다.
연관 분석은 FAB-MS 데이터를 이용하여 검출된 예상 단당류를 확증하였다.
최종적으로, 새로운 방법으로부터 수득된 IFN-β-1a 생성물에서, 트립신 및 키모트립신 분해된 펩티드의 상세한 FAB-MS 분석은 Asn-80에서 N-글리칸 연결의 존재를 나타내었다.
N-글리콜릴뉴라민산의 상대 존재비를 극메틸화된 N-연결된 글리칸 FAB에서의 피크 높이의 신호 및 MALDI-MS 데이터로부터 계산하였다.
N-아세틸뉴라민산:N-글리콜릴뉴라민산 비는 샘플에서 31.7:1.0이었고, 이는 시알산의 3.1%가 N-글리콜릴뉴라민산임을 암시한다. 이러한 결과는 인간 섬유모세포에 의해 생성된 천연 인간 인터페론에 대해 수득된 수준(5%)과 유사하다. 예상되는 바와 같이, IFN-β-1a 단백당형은 대부분의 인간 당단백질과 같이 주로 N-아세틸뉴라민산을 함유한다.
참고문헌
Figure 112008020229311-pct00003
Figure 112008020229311-pct00004
SEQUENCE LISTING <110> APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V. <120> PROCESS FOR THE PREPARATION OF GLYCOSYLATED INTERFERON BETA <130> WO941-2 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 1 cctcggcctc tgagctattc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 2 cacaaataaa gcattttttt 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 3 atgaccaaca agtgtctcct cc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 4 acttacaggt tacctccgaa ac 22

Claims (32)

  1. - 10 내지 30 mM의 HEPES;
    - 0.5 내지 3 mM의 프롤린; 및
    - 5500 내지 7000 mg/L의 염화나트륨을 포함하는 혈청 비함유 배지에서 인간 인터페론 베타 생성 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 당화된 재조합 인간 인터페론 베타를 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은 성장기 Ⅰ, 성장기 Ⅱ 및 생성기를 포함하고, 여기서 성장기 Ⅰ이 37℃에서 수행되고, 성장기 Ⅱ가 35℃에서 수행되고, 생성기가 33℃에서 수행되는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 혈청 비함유 배지가 10 내지 20 mg/L의 페놀레드를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법이 하루당 1 내지 10의 희석 속도를 이용하는 관류(perfusion) 방법인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 희석 속도가 처음 2 내지 3주의 세포 배양 기간 이내에 하루당 1 내지 2의 최초값에서 하루당 7 내지 10의 값으로 증가되는 방법.
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Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101282990B (zh) 2005-08-26 2013-04-03 阿雷斯贸易股份有限公司 糖基化干扰素-β的制备方法
JP5199112B2 (ja) * 2005-12-09 2013-05-15 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｆｓｈ又はｆｓｈ変異体を精製するための方法
KR20090074040A (ko) 2006-09-13 2009-07-03 아보트 러보러터리즈 세포 배양의 개선
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
AU2008247815B2 (en) 2007-05-02 2012-09-06 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
AU2008314687A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying Fc-fusion proteins
WO2009053360A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying an fc-containing protein
DE102008051574A1 (de) * 2008-10-14 2010-04-15 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Herstellung von Interferon-beta und deren Varianten
SG10201702951RA (en) 2008-10-20 2017-06-29 Abbvie Inc Viral inactivation during purification of antibodies
SG10201702922VA (en) 2008-10-20 2017-06-29 Abbvie Inc Isolation and purification of antibodies using protein a affinity chromatography
WO2010089126A2 (en) * 2009-02-09 2010-08-12 Roche Glycart Ag Immunoglobulin glycosylation pattern analysis
US20120177603A1 (en) * 2009-07-07 2012-07-12 Biogenerix Ag Method for the purification of interferon-b
DE102009032179A1 (de) * 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta
EP2507627A2 (en) * 2009-12-04 2012-10-10 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Antennary fucosylation in glycoproteins from cho cells
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
BR112014007766B1 (pt) * 2011-10-01 2022-05-10 Glytech, Inc Polipeptídeo glicosilado, método para fabricação do mesmo e composição farmacêutica
CN102533658B (zh) * 2011-12-08 2014-06-04 深圳新鹏生物工程有限公司 制备人干扰素β1a的细胞的培养方法和培养基及其应用
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9505833B2 (en) 2012-04-20 2016-11-29 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same
US9334319B2 (en) 2012-04-20 2016-05-10 Abbvie Inc. Low acidic species compositions
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
CN102757937B (zh) * 2012-07-05 2014-04-16 复旦大学附属中山医院 一种培养神经元的含酚红无血清培养体系以及酚红新用途
US9206390B2 (en) 2012-09-02 2015-12-08 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9169331B2 (en) 2012-12-21 2015-10-27 Dionex Corporation Separation of glycans by mixed-mode liquid chromatography
US9310344B2 (en) 2013-06-14 2016-04-12 Dionex Corporation HILIC/anion-exchange/cation-exchange multimodal media
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
EP3052640A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
LT6164B (lt) 2013-10-15 2015-06-25 Uab Biotechnologinės Farmacijos Centras "Biotechpharma" Sulieti interferono-alfa 5 baltymai su kitu citokinu ir jų gamybos būdas
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
AU2015239104B2 (en) * 2014-04-04 2018-12-20 Ares Trading S.A. Novel IFN beta protein analogs
EA027609B9 (ru) * 2015-04-29 2017-11-30 Тютор С.А.С.И.Ф.И.А. Способ получения интерферона бета-1альфа и фармацевтическая композиция, содержащая интерферон бета-1альфа
US10844416B2 (en) * 2015-06-01 2020-11-24 Biogen Ma Inc. Manganese supplementation for control of glycosylation in mammalian cell culture process
KR20210009982A (ko) * 2019-07-18 2021-01-27 에이비온 주식회사 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법
CN111563198B (zh) * 2020-04-16 2023-07-25 百度在线网络技术（北京）有限公司 一种物料召回方法、装置、设备及存储介质
CN117024561B (zh) * 2023-10-10 2024-02-20 哈药集团生物工程有限公司 一种聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030017550A1 (en) * 2001-01-22 2003-01-23 Pang Danny Zhong Der DNA sequences encoding fusion proteins comprising IFN-beta and TM-alpha1
US20040115168A1 (en) * 2001-10-10 2004-06-17 Neose Technologies, Inc. Interferon beta: remodeling and glycoconjugation of interferon beta
EP1482031A1 (en) * 1996-08-30 2004-12-01 Invitrogen Corporation Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5326859A (en) 1979-10-30 1994-07-05 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research DNA and recombinant plasmid
CH648331A5 (de) 1979-07-31 1985-03-15 Hoffmann La Roche Homogenes fibroblasten-interferon und dessen herstellung.
EP0070906B1 (en) 1981-02-04 1986-10-15 Juridical Foundation Japanese Foundation For Cancer Research Human interferon-beta gene
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4966843A (en) * 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US5266476A (en) 1985-06-18 1993-11-30 Yeda Research & Development Co., Ltd. Fibrous matrix for in vitro cell cultivation
US5017691A (en) 1986-07-03 1991-05-21 Schering Corporation Mammalian interleukin-4
US4879111A (en) 1986-04-17 1989-11-07 Cetus Corporation Treatment of infections with lymphokines
US5045468A (en) 1986-12-12 1991-09-03 Cell Enterprises, Inc. Protein-free culture medium which promotes hybridoma growth
NO162160C (no) 1987-01-09 1989-11-15 Medi Cult As Serumfritt vekstmedium, samt anvendelse derav.
DE3712564A1 (de) 1987-04-14 1988-11-24 Bioferon Biochem Substanz Verfahren zur konstruktion einer animalen zellinie fuer die herstellung von humanem interferon-beta
IT1206302B (it) 1987-06-26 1989-04-14 Serono Cesare Ist Ricerca Ormone follicolo-stimolante urinario
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
CA2053864C (en) * 1989-02-21 2001-11-20 Irving Boime Modified forms of reproductive hormones
US5338835A (en) * 1989-02-21 1994-08-16 Washington University CTP-extended form of FSH
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5665868A (en) 1990-09-14 1997-09-09 Vittal Mallya Scientific Research Foundation Chromatographic agent and its use for the separation or proteins, polypeptides of metals
GEP20002142B (en) 1991-01-18 2000-06-25 Amgen Inc Method for Treatment and Prevention of TNF Mediated Diseases
US5508261A (en) * 1991-06-18 1996-04-16 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Analogs of glycoprotein hormones having altered receptor binding specificity and activity and methods for preparing and using same
DE4128319A1 (de) 1991-08-27 1993-03-04 Bioferon Biochem Substanz Neues rekombinantes human-ifn-beta, verfahren zu dessen herstellung und dieses enthaltende pharmazeutische zubereitungen
SE9201073D0 (sv) * 1992-04-03 1992-04-03 Kabi Pharmacia Ab Protein formulation
CA2147623C (en) 1992-10-23 2005-05-03 Glenn R. Larsen Novel p-selectin ligand protein
EP0666312A1 (en) 1994-02-08 1995-08-09 Wolfgang A. Renner Process for the improvement of mammalian cell growth
US5545723A (en) * 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
US6183987B1 (en) 1995-02-17 2001-02-06 Stichting Institut Voor Dierhouderij En Diergezonheld Production of biologically active recombinant bovine follicle stimulation hormone (rec bFSH) in the baculovirus expression system
AUPN801296A0 (en) 1996-02-12 1996-03-07 Csl Limited Stabilised growth hormone formulation and method of preparation thereof
DE69623109T2 (de) 1996-04-19 2002-12-12 Nestle Sa Menschliche immortalisierte Colon-Epithelialzellen
IT1287138B1 (it) 1996-11-07 1998-08-04 Ibsa Inst Biochimique Sa Procedimento per la separazione e purificazione di fsh e lh
US6162905A (en) * 1996-11-07 2000-12-19 Ibsa Institut Biochimique S.A. FSH and LH separation and purification process
NZ335207A (en) 1996-11-15 2000-09-29 Genentech Inc Process to isolate recombinant human neurotrophin using hydrophobic chromatography resin
US5883073A (en) * 1997-04-03 1999-03-16 Washington University Single-chain double-alpha peptide
US6013253A (en) 1997-08-15 2000-01-11 Amgen, Inc. Treatment of multiple sclerosis using consensus interferon and IL-1 receptor antagonist
EP1426058A3 (de) 1997-09-23 2004-07-28 Dr. Rentschler Biotechnologie GmbH Flüssige Interferon-Beta Formulierungen
US5990288A (en) * 1997-10-21 1999-11-23 Vitro Diagnostics, Inc. Method for purifying FSH
US6414123B1 (en) 1997-10-21 2002-07-02 Vitro Diagnostics, Inc. Method for purifying FSH
JP4574007B2 (ja) 1998-04-28 2010-11-04 メルク・セローノ・ソシエテ・アノニム ポリオール−ｉｆｎ−ベータ複体
US20030153042A1 (en) 1998-07-28 2003-08-14 California Institute Of Technology Expression of functional eukaryotic proteins
JP4574865B2 (ja) 1999-04-16 2010-11-04 インスチチュート マッソーネ エス．エイ． 高度に精製されたゴナドトロピン組成物およびそれらの製造方法
US7431921B2 (en) * 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
AU2001231531A1 (en) 2000-02-11 2001-08-20 Maxygen Aps Follicle stimulating hormones
UA78676C2 (en) * 2000-02-22 2007-04-25 Applied Research Systems Purified lh
CA2405709A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
YU48703A (sh) * 2001-02-27 2006-05-25 Maxygen Aps Novi interferonu beta-slični molekuli
US20030096414A1 (en) 2001-03-27 2003-05-22 Invitrogen Corporation Culture medium for cell growth and transfection
AU784808B2 (en) 2001-04-02 2006-06-29 Kedrion Melville Inc. Prion and viral clearance process
EP1414498A2 (en) * 2001-06-29 2004-05-06 Maxygen Aps Stabilized formulations of interferons with sulfoalkyl ether cyclodextrins
AU2002368265B2 (en) 2001-10-22 2007-06-07 Merck Serono Sa Mutant glycoproteins
CA2471363C (en) * 2001-12-21 2014-02-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
IL163577A0 (en) * 2002-03-12 2005-12-18 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of stroke
US20070025965A1 (en) 2002-07-17 2007-02-01 Lobb Roy R Therapies for renal failure using interferon-beta
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
UA88879C2 (en) 2003-09-02 2009-12-10 Эплайд Рисерч Системз Эрс Холдинг Н.В. Fsh glycosylation mutant
KR100524872B1 (ko) * 2003-12-04 2005-11-01 씨제이 주식회사 인터페론 베타의 정제방법
KR100524871B1 (ko) * 2003-12-04 2005-10-31 씨제이 주식회사 인터페론 베타의 정제방법
CN100554277C (zh) 2003-12-22 2009-10-28 阿雷斯贸易股份有限公司 Fsh的纯化方法
US7598356B2 (en) 2004-07-08 2009-10-06 Board of Regents of the University of Nebraska by and on behalf of the University of Nebraska Medical Center Method for purifying a protein of the cystine-knot superfamily
TWI384069B (zh) * 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
ATE408624T1 (de) 2004-11-09 2008-10-15 Ares Trading Sa Verfahren zur reinigung von fsh
CN101282990B (zh) 2005-08-26 2013-04-03 阿雷斯贸易股份有限公司 糖基化干扰素-β的制备方法
JP5199112B2 (ja) * 2005-12-09 2013-05-15 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｆｓｈ又はｆｓｈ変異体を精製するための方法
EP1981908B1 (en) * 2006-01-17 2010-11-10 Merck Serono SA Novel fsh glycosylation variant d3n
AU2008314687A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying Fc-fusion proteins
WO2009053360A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying an fc-containing protein

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1482031A1 (en) * 1996-08-30 2004-12-01 Invitrogen Corporation Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
US20030017550A1 (en) * 2001-01-22 2003-01-23 Pang Danny Zhong Der DNA sequences encoding fusion proteins comprising IFN-beta and TM-alpha1
US20040115168A1 (en) * 2001-10-10 2004-06-17 Neose Technologies, Inc. Interferon beta: remodeling and glycoconjugation of interferon beta

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JBC Vol.263:17508-17515(1988) *

Also Published As

Publication number Publication date
IL189738A (en) 2012-07-31
BRPI0520498B8 (pt) 2021-05-25
US20110305669A1 (en) 2011-12-15
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EA200800669A1 (ru) 2008-12-30
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CN101282990B (zh) 2013-04-03
AU2005335900B2 (en) 2012-03-29
EP1917276A1 (en) 2008-05-07
AU2005335900A1 (en) 2007-03-01
RS57549B1 (sr) 2018-10-31
US8993724B2 (en) 2015-03-31
HRP20180579T1 (hr) 2018-05-18
JP2009505645A (ja) 2009-02-12
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US20080219952A1 (en) 2008-09-11
SG155183A1 (en) 2009-09-30
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EA015901B1 (ru) 2011-12-30
BRPI0520498B1 (pt) 2018-11-06
JP4944112B2 (ja) 2012-05-30
LT1917276T (lt) 2018-05-25
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BRPI0520498A2 (pt) 2010-07-13
HK1120052A1 (en) 2009-03-20
CN101282990A (zh) 2008-10-08
IL189738A0 (en) 2008-08-07

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