BRPI0517883B1 - Complexos de fosfato de cálcio estabilizado - Google Patents

Description

"COMPLEXOS DE FOSFATO DE CÁLCIO ESTABILIZADO" A presente invenção refere-se a fosfato de cálcio amorfo e/ou fosfato de fluoreto de cálcio amorfo estabilizado por fosfopeptídeos. Os métodos para a preparação dos complexos da invenção e do tratamento e prevenção de cáries dentárias, cálculos dentários, erosão/ corrosão dentária, hipersensibilidade dentária, são fornecidos. Estes têm propriedades anticariogênicas, protegendo as estruturas do dente uma vez que eles remineralizam (reparo) estágios precoces de cárie dentária, assim como outras aplicações dentárias/ médicas (incluindo anti-cálculo, anti-erosão/ corrosão e hipersensibilidade anti-dentinária).

ANTECEDENTES A cárie dentária é iniciada pela demineralização do tecido duro do dente geralmente por ácidos orgânicos produzidos da fermentação de açúcar dietético por bactérias o-dontopatogênicas de placa dentária. A cárie dentária ainda é um problema de saúde pública principal. Além disso, as superfícies de dente restauradas podem ser suscetíveis a outras cáries dentárias ao redor das margens da restauração. Embora a prevalência de cárie dentária tenha diminuído pelo uso de fluoreto na maioria dos países desenvolvidos, a doença permanece um problema de saúde pública principal. A erosão/ corrosão dentária é a perda de mineral do dente por á-cidos dietéticos ou regurgitados. A hipersensibilidade dentária é devido aos túbulos dentinários expostos através da perda da camada mineralizada protetora, cimento e cálculo dentário é a acreção não desejada de minerais de fosfato de cálcio no dente. Todas estas condições, cárie dentária, erosão/ corrosão dentária, hipersensibilidade dentária e cálculo dentário são portanto desequilíbrios no nível de fosfato de cálcio. A cárie dentária, erosão/ corrosão dentária e hi-persensibilidade dentária podem ser tratadas com fosfato de cálcio amorfo estabilizado (ACP) ou fosfato de fluoreto de cálcio amorfo estabilizado (ACFP) fornecendo-se íons de cálcio e fosfato biodisponíveis para substituir o mineral de fosfato de cálcio perdido. 0 ACP estabilizado e ACFP estabilizado também podem se ligar à superfície de cálculo dentário e podem prevenir ou reduzir outra acreção. O ACP estabilizado e ACFP estabilizado portanto podem desempenhar um papel principal na prevenção e tratamento de doenças orais e outras condições médicas. A caseína está presente no leite na forma de mice-las, as quais acredita-se serem partículas aproximadamente esféricas com um raio de cerca de 100 nm, dispersas em uma fase contínua de água, sal, lactose e proteínas de soro do leite (Schmidt, D.G. (1982) Dev. Daíry Chem. 1 , 61-86) . As micelas de caseína servem como um portador de fosfato de cálcio fornecendo uma fonte biodisponível de íons de cálcio e fosfato para formação de dentes e ossos. A capacidade das micelas de caseína manterem os íons de cálcio e fosfato em um estado solúvel e biodisponível é retida por fragmentos de peptídeo multifosforilado das caseínas conhecidas como os fosfopeptídeos de caseína (CPP). WO 98/40406 no nome de The University of Melbourn descreve os complexos de fosfopeptí- deo de caseína- fosfato de cálcio amorfo (CPP-ACP) e complexos de CPP- fosfato de fluoreto de cálcio amorfo estabilizado (CPP-ACFP) que foram produzidos em alcalino. Tais complexos foram mostrados prevenir a desmineralização do esmalte e promover a remineralização de lesões da subsuperfície do esmalte em modelos de cáries in sito de animal e humano (Reynolds, 1998). 0 CPP que é ativo na formação dos complexos age assim quer ou não faça parte de uma proteína de caseína de tamanho de natural. Os exemplos de (CPP) ativo que podem ser isolados por digestão tríptica de caseína de tamanho natural foram especificados na Patente U.S. No. 5.015.628 e incluem peptídeos Bos [alpha] gi-caseína X-5P (f 59-79) [1], Bos jS-caseína X-4P (f 1-25) [2], Bos [alpha] s2-caseína X-4P (f46-70) [3] e Bos [alpha]s2-caseína X-4P (fl-21) [4] como segue: [1] Gln59-Met-Glu-Ala-Glu-Ser(P)-lle-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-lle-Val-Pro-ASn-Se(P)-Val-GlU-Gln-LyS79 [alpha] si (59-79) [2] Arg^Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-lle-Val-Glu-Ser(P)-Leu-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-lle-Thr-Arg25 ¢(1-25) [3] Asn46-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-lle-Gly-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser(P)-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-LyS70 [alpha] s2 (46-70) [4] Lys1-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-lie-lle-Ser(P)-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys21 [alpha] s2 (1-21) Descobriu-se agora que as formas básicas, solúveis de peptídeo estabilizado de ACP e ACFP também podem ser produzidas em um meio tendo um pH menor do que 7.0, Tais complexos demonstram um nível surpreendente de atividade para re-mineralizar as lesões da subsuperfície do esmalte dos dentes.

Também será entendido que o termo "compreende" (ou suas variantes gramaticais) quando empregado nesta especificação é equivalente ao temo "inclui" e pode ser empregado alternadamente e não deveria ser considerado como excluindo a presença de outros elementos ou características.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção fornece um complexo de ACFP ou ACP estabilizado por fosfopeptídeo (PP), onde o complexo é formado em um pH abaixo de 7,0. Preferivelmente, o complexo é formado a um pH na faixa de cerca de 5,0 até porém abaixo de 7,0. Mais preferivelmente o complexo é formado em uma faixa de pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0. Em uma modalidade preferida, o complexo é formado em um pH de cerca de 5,5. Em uma modalidade preferida, o complexo é adequado para aplicações dentárias. Em uma outra modalidade preferida, o complexo é adequado para aplicação para os dentes e/ou gengivas para promover remineralização.

Por "formado em um pH de" é entendido que o meio no qual o complexo é formado tem um pH global do valor definido. Os valores de pH localizados no meio podem variar, por exemplo, no microambiente ao redor da formação do complexo. Em outras palavras, o valor do pH relevante para o propósito da presente invenção é o pH mensurável do meio como um todo.

Preferivelmente, a fase do ACP é predominantemente uma fase básica, onde o ACP compreende predominantemente as espécies Ca2+, P043” e OH”. A fase básica de ACP pode ter a fórmula geral [Ca3 (P04) 2]x [Ca2 (P04) (OH)] onde x > 1.

Preferivelmente, a fase do ACFP é predominantemente uma fase básica, onde o ACFP compreende predominantemente as espécies Ca2+, P043” e F”. A fase básica de ACFP pode ter a fórmula geral [Ca3 (P04) 2] x [Ca2 (P04) F] y onde x > 1 quando y = 1 ou onde y > 1 quando x = 1 Acredita-se que, estruturalmente, o ACP no complexo de ACP estabilizado por PP da presente invenção contenha um ânion de hidróxido no lugar do ânion de fluoreto em ACFP. "Fosfopeptídeo" no contexto da descrição desta invenção significa uma seqüência de aminoácido na qual pelo menos 2 aminoácidos são fosforilados. Pelo menos dois dos ácidos de fosfoamino na seqüência são preferivelmente contíguos. Preferivelmente o fosfopeptídeo inclui a seqüência A-B-C-D-E, onde A, B, C, D e E são independentemente fosfosse-rina, fosfotreonina, fosfotirosina, fosfohistidina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, e pelo menos dois, preferivelmente três, do A, B, C, D e E são ácidos de fosfoamino. Em uma modalidade, os resíduos de fosfoaminoácido são fosfosse-rina, por exemplo, três resíduos de fosfosserina contíguos. Em uma modalidade preferida, o fosfopeptídeo inclui três resíduos de fosfosserina contíguos seguidos por dois resíduos de ácido glutâmico em uma seqüência representada como Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu (onde Ser(P) é fosfosserina e GIu é ácido de glutâmico).

Em uma modalidade, o PP é um fosfopeptídeo de ca- seína (CPP) que é caseína intacta ou um fragmento de casei-na. Desse modo, o PP pode ser uma fosfoproteína de caseína ou um polífosfopeptídeo. 0 complexo formado pode ter a fórmula [CPP(ACP)s]n ou [ (CPP) (ACFP) s] n onde n é igual ou maior do que 1, por exemplo, 6. 0 complexo formado pode ser um complexo coloidal onde as partículas núcleo se agregam para formar partículas coloidais pequenas (por exemplo, cerca de 2-5 nm) e grandes (por exemplo, cerca de 100 nm) suspensas em água. 0 PP pode ser de qualquer fonte; pode estar presente no contexto de um polipeptídeo maior, incluindo um po-lipeptídeo de caseína de tamanho natural, ou pode ser isolado através de digestão tríptica ou outra digetrão enzímica ou através de hidrólise química (por exemplo, por álcali ou ácido) de caseína ou outras proteínas ricas em ácido fosfoa-mino tal como fosfitina, ou por síntese recombinante ou química, contanto que compreenda a sequência A-B-C-D-E, como definido acima. A sequência que flanqueia esta seqüência núcleo pode ser qualquer seqüência. Entretanto, essas seqüên-cias de flanqueamento em [alpha] si (59-79) [1], ¢(1-25) [2], [alpha] S2 (46-70) [3] e [alpha] s2 (1-21) [4] são preferidas. As sequências de flanqueamento podem opcionalmente ser modificada por deleção, adição ou substituição conservadora de um ou mais resíduos. A composição de aminoácido e seqüência da região de flanqueamento, não são críticas.

Em uma modalidade preferida, o PP é um ou mais fosfopeptídeos de caseína selecionados do grupo que consiste em 0!sl (59-79) [1], ¢(1-25) [2], as2 (46-70) [3] e «,2{1-21) [4].

Sem estar ligado a qualquer teoria ou modo de a-ção, acredita-se que o PP se liga ao cluster de ACP ou ACFP para produzir um complexo metastável que existe na solução. Acredita-se que esta ligação iniba o crescimento de ACP ou ACFP para um tamanho que inicia a nucleação e precipitação de fosfato de cálcio. Deste modo, o cálcio e outros íons tal como íons de fluoreto podem ser localizados, por exemplo, em uma superfície em um dente para prevenir a desmineralização e prevenir a formação de cárie dentária. Acredita-se portanto que isto fornece um mecanismo para liberar fosfato de cálcio amorfo de uma forma biodisponível que é capaz de re-mineralizar os dentes.

Em uma outra modalidade, a invenção fornece um complexo de ACFP estável ou um complexo de ACP estável como descritos acima, cujos complexos atuam como um veículo de liberação que co-localiza os íons incluindo, porém não limitado aos íons de cálcio, fluoreto e fosfato em um sítio alvo, Em uma modalidade preferida, o complexo inclui fosfato de cálcio de uma forma amorfa que produz eficácia de hiper-sensibilidade anti-dentária, anti-erosão/ corrosão anti-cáries e anti-cálculo superior. 0 sítio alvo é preferivelmente dentes ou osso.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um complexo de fluoreto de cálcio amorfo (ACFP) ou fosfato de cálcio amorfo (ACP) estabilizado por fosfopeptídeo, onde o complexo é formado em um pH de 7,0 ou abaixo, e onde o ACP ou ACFP está predominantemente em uma forma básica.

Para evitar dúvidas, os complexos de ACP ou ACFP estabilizados por fosfopeptídeo da presente invenção excluem os complexos formados em um pH acima de 7,0 como descrito em WO 98/40406.

Os complexos são preferivelmente substancialmente livres de íons exceto íons de cálcio, fosfato, fluoreto e hidróxido, embora eles contenham moléculas de água. Os com-plexos também são formulados preferivelmente com PP tal que eles sejam solúveis em água. No contexto da presente invenção, o termo "solúvel" também inclui a situação onde os complexos também podem ser descritos como estando em uma dispersão coloidal.

Em uma modalidade, o complexo de ACP consiste essencialmente em íons de hidróxido, PP, cálcio e fosfato e água.

Em uma modalidade, o complexo de ACFP consiste essencialmente em íons de hidróxido PP, cálcio, fosfato e fluoreto e água.

Em um outro aspecto, a invenção também fornece um método para produzir um complexo estável de ACP como descrito acima, compreendendo as etapas de: (i) obter uma solução compreendendo pelo menos um fosfopeptídeo e; (ii) misturar soluções compreendendo íons de cálcio, íons de fosfato e íons de hidróxido, ao mesmo tempo em que mantendo o pH em cerca de 7,0 ou abaixo.

Em uma modalidade preferida deste aspecto da presente invenção, os íons de hidróxido são titulados na solução para manter a solução de fosfopeptídeo em um pH essenci- almente constante. Em uma outra modalidade preferida, os í-ons de fosfato e cálcio são titulados na solução de fosfo-peptídeo com mistura constante e em uma taxa que evita a formação de ura precipitado de fosfato de cálcio na solução de fosfopeptídeo.

Era ura outro aspecto, a invenção fornece também um método para produzir um complexo estável de ACFP como descrito acima, compreendendo as etapas de: (i) obter uma solução compreendendo pelo menos um fosfopeptídeo e; (ii) misturar soluções de compreendendo íons de cálcio, íons de fosfato, íons de hidróxido e íons de fluore-to, ao mesmo tempo em que mantendo o pH em cerca de 7,0 ou abaixo.

Em uma modalidade preferida deste aspecto da presente invenção, os íons de hidróxido são titulados na solução para manter a solução de fosfopeptídeo em um pH essencialmente constante. Em uma outra modalidade preferida, os í-ons de cálcio, fosfato e fluoreto são titulados na solução de fosfopeptídeo com mistura constante e em uma taxa que e-vite a formação de um precipitado de fosfato de cálcio na solução de fosfopeptídeo. O pH pode ser ajustado pela adição de íons de hidrogênio (ácido) ou íons de hidróxido (base) quando requerido.

Qualquer ácido fisiologicamente compatível ou a-ceitável pode ser empregado como fonte de íons de hidrogênio que não atacam os complexos deles. Tipicamente, ácido clorídrico será empregado. Qualquer base fisiologicamente aceitá- vel, por exemplo, NaOH, pode ser empregada como uma fonte de íons de hidróxido para ajustar o pH e de outro modo fornecer íons de hidróxido quando requerido para a formação do complexo. Os ácidos e bases exatos empregados não são considerados críticos submetidos ao anterior.

Em uma modalidade preferida, as concentrações elevadas de íons de cálcio e íons de fosfato (por exemplo, 3 M de íons de cálcio e 1 M de íons de fosfato) são tituladas na solução de fosfopeptídeo empregada no método de produção de um complexo de ACP estável ou no método de produção de um complexo de ACFP estável de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, as soluções de íons de cálcio e íons de fosfato são adicionadas muito lentamente em alíquotas (por exemplo em cerca de 1% de adição de volume por minuto) com mistura completa. Em uma modalidade preferida, uma alíquota da solução de íon de fosfato é adicionada antes de uma alíquota de solução de íon de cálcio. Os íons de hidróxido são preferivelmente adicionados continuamente. Em uma modalidade preferida, os íons de hidróxido são adicionados depois de cada adição de íon de cálcio.

Em um outro aspecto da invenção é fornecido um método de produção de um complexo de fosfato de cálcio amorfo estabilizado por fosfopeptídeo (ACP) compreendendo as etapas de. (i) obter uma solução compreendendo pelo menos um fosfopeptídeo e; (ii) misturar as soluções compreendendo íons de cálcio, íons de fosfato e íons de hidróxido ao mesmo tempo em que mantendo o pH em cerca de 7,0 ou abaixo.

Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um método de produção de um complexo de fosfato de fluoreto de cálcio amorfo estabilizado por fosfopeptídeo (ACFP) compreendendo as etapas de (i) obter uma solução compreendendo pelo menos um fosfopeptídeo e; (ii) misturar as soluções compreendendo os íons de cálcio, íons de fosfato e íons de hidróxido ao mesmo tempo em que mantendo o pH em cerca de 7,0 ou abaixo.

Em um outro aspecto da invenção é fornecida uma formulação compreendendo um complexo de ACP ou ACFP estabilizado por fosfopeptídeo onde o pH da formulação é menos do que 7,0. Em uma modalidade, o pH da formulação é entre cerca de pH 5,0 e até abaixo de pH 7,0. Preferivelmente o pH da formulação é entre cerca de pH 5,0 e cerca de 6,0. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é cerca de 5,5.

Desse modo, o complexo de ACFP ou ACP estabilizado por fosfopeptídeo pode ser formado em um pH de cerca de 7,0 e abaixo, e em seguida colocado em um ambiente que tem um pH diferente, preferivelmente um pH dentre 4 e 10. Em uma modalidade o pH está entre 4,5 e 6,5, mais preferivelmente entre 5 e 6, e mais preferivelmente cerca de 5,5.

Os complexos da invenção são úteis como suplementos de cálcio em indivíduos em necessidade de estimulação do crescimento do osso, por exemplo, indivíduos que sofrem de reparo de fratura, substituição de articulação, enxertos de osso, ou cirurgia craniofacial. Estes complexos também são úteis como suplementos dietéticos em indivíduos os quais por qualquer razão, tal como intolerância dietética, alergia, ou fatores culturais ou religiosos, são incapazes ou sem vontade de consumir produtos de leiteria em uma quantia suficiente para fornecer seus requerimentos de cálcio dietético.

As modalidades da invenção são descritas abaixo nas quais o ambiente para os complexos pode ser uma formulação para um propósito particular, tal como exemplificado a-baixo. 0 pH deste ambiente pode ser ajustado como apresentado acima para efeito ideal, independente do pH no qual o complexo foi formado originalmente, determinando a estabilidade dos complexos formados.

Em uma modalidade, é fornecido um método para re-mineralização de dentes compreendendo aplicar aos dentes um complexo como descrito acima, desejavelmente em um portador farmaceuticamente aceitável. 0 complexo pode conter ACP, ACFP ou ambos. 0 método é preferivelmente aplicado a um indivíduo em necessidade de tratamento.

Em uma modalidade preferida da invenção, o complexo de ACP ou ACFP estável é incorporado em composições orais tal como pasta de dentes, anti-sépticos bucais, ou formulações para a boca para ajudar no tratamento e/ou prevenção de cárie dentária ou cárie de dente. 0 complexo de ACFP ou ACP pode incluir 0,01-50% em peso da composição, preferivelmente 1,0-50%. Para composições orais, é preferido que a quantidade do PP-ACP e/ou PP-ACFP administrada seja 0,01-50% em peso, preferivelmente l,0%-50% em peso da composição. Em uma modalidade particularmente preferida, a composição oral da presente invenção contém cerca de 2% de PP-ACP, PP-ACFP ou uma mistura de ambos. A composição oral desta invenção, que contém os agentes mencionados acima, pode ser preparada e empregada de várias formas aplicáveis à boca tal como, den-tifrício incluindo pastas de dentes, pó dentifricio e denti-frício liquido, liquido para limpeza bucal, pastilhas, chicletes, pastas dentárias, cremes para massagem gengival, comprimidos de gargarejo, produtos de leiteria e outros comestíveis. A composição oral de acordo com esta invenção pode também incluir ingredientes bem conhecidos adicionais que dependem do tipo e forma de uma composição oral particular.

Em certas formas preferidas da invenção a composição oral pode ser substancialmente líquida em caráter, tal como um enxágüe ou anti-séptico bucal. Em uma tal preparação o veículo é tipicamente uma mistura de água-álcool deseja-velmente incluindo um umectante como descrito abaixo. Geralmente, a razão de peso de água para álcool está na faixa de cerca de 1 :1 a cerca de 20:1. A quantidade total de mistura de água-álcool neste tipo de preparação é tipicamente na faixa de cerca de 70 a cerca de 99,9% em peso da preparação. 0 álcool é tipicamente etanol ou isopropanol. O etanol é preferido. 0 pH de tal líquido e outras preparações da invenção geralmente está na faixa de cerca de 5 a cerca de 9 e tipicamente de cerca de 5,0 a 7,0. O pH pode ser controlado com ácido (por exemplo, ácido cítrico ou ácido benzóico) ou base (por exemplo, hidróxido de sódio) ou tamponado (como com citrato de sódio, benzoato, carbonato, ou bicarbonato, fosfato de hidrogênio de dissódio, fosfato de diidrogênio de sódio, etc).

Em uma modalidade, a composição oral de acordo com a presente invenção tem um pH de cerca de 5,5 e contém ACP ou ACFP estável.

Em outras formas desejáveis desta invenção, a composição oral pode ser substancialmente sólida ou pastosa em caráter, tal como pó dentifrício, um comprimido dental ou uma pasta de dentes (creme dental) ou dentifrício em gel. 0 veículo de tais preparações orais pastosas ou sólidas geralmente contém material de polimento dentalmente aceitável. Os exemplos de materiais de polimento são metafosfato de sódio, metafosfato de potássio, fosfato de tricálcio, fosfato de cálcio diidratado, fosfato de dicálcio anidroso, pirofosfato de cálcio, ortofosfato de magnésio, fosfato de trimagnésio, carbonato de cálcio, alumina hidratada, alumina calcinada, silicato de alumínio, silicato de zircônio, sílica, bentoni-ta insolúveis em água, e misturas destes. Outro material de polimento adequado inclui as resinas termocuráveis em partícula tal como melamina-, fenólico- e uréia-formaldeídos, e poliepóxidos e poliésteres reticulados. Os materiais de polimento incluem sílica cristalina tendo tamanhos de partícula de até cerca de 5 mícrons, um tamanho de partícula médio de até cerca de 1,1 mícron, e uma área de superfície de até cerca de 50.000 cm2/g., sílica gel ou sílica coloidal, e a-luminossilicato de metal alcalino amorfo complexo.

Quando géis visualmente claros são empregados, um agente de polimento de sílica coloidal, tal como aqueles vendidos sob a marca registrada SYLOID como Syloid 72 e S- yloid 74 ou sob a marca registrada SANTOCEL como Santocel 100, os complexos de aluminossilicato de metal alcalino são particularmente úteis uma vez que eles têm índices refrati-vos próximos dos índices refrativos de sistemas de agente de gelação-líquido (incluindo umectante e/ou água) geralmente empregados em dentifrícios.

Muitos dos então chamados materiais de polimento "insolúveis em água" são aniônicos em caráter e também incluem quantidades pequenas de material solúvel. Desse modo, o metafosfato de sódio insolúvel pode ser formado de qualquer maneira adequada, por exemplo, como ilustrado por Dic-tionary of Applied Chemistry, Volume 9, 4a Edição, pp. 510-511. As formas de metafosfato de sódio insolúvel conhecidas como o sal de Madrell e sal de Kurrol são outros exemplos de materiais adequados. Estes sais de metafosfato exibem somente um minuto de solubilidade em água, e portanto são geral-mente referidos como metafosfatos insolúveis (IMP). Há presente aqui uma quantidade menor de material de fosfato solúvel como impurezas, normalmente alguns por cento tal como até 4% em peso. A quantidade de material de fosfato solúvel, que é acreditada incluir um trimetafosfato de sódio solúvel no caso de metafosfato insolúvel, pode ser reduzida ou eliminada lavando-se com água se desejado. 0 metafosfato de metal alcalino insolúvel é tipicamente empregado na forma de pó de um tamanho de partícula tal que não mais do que 1% do material seja maior do que 37 mícrons. O material de polimento está geralmente presente nas composições sólidas ou pastosas em concentrações de peso de cerca de 10% a cerca de 99%. Preferivelmente, está presente em quantidades de cerca de 10% a cerca de 75% em pasta de dentes, e de cerca de 70% a cerca de 99% em pó dentifrí-cio. Em pastas de dentes, quando o material de polimento for silício em natura, ele está geralmente presente em uma quantidade de cerca de 10-30% em peso. Outros materiais de polimento estão tipicamente presentes em quantidades de cerca de 30-75% em peso.

Em uma pasta de dentes, o veículo líquido pode compreender água e umectante tipicamente em uma quantia que varia de cerca de 10% a cerca de 80% em peso da preparação. A glicerina, propileno glicol, sorbitol e polipropileno gli-col exemplificam umectantes/ veículos adequados. Também vantajosas são as misturas líquidas de água, glicerina e sorbitol. Em géis claros onde o índice refrativo é uma consideração importante, cerca de 2,5-30% em peso/peso de água, 0 a cerca de 70% em peso/peso de glicerina e cerca de 20-80% em peso/peso de sorbitol são preferivelmente empregados.

As pasta de dentes, cremes e géis tipicamente contêm um espessante natural ou sintético ou agente de gelação em proporções de cerca de 0,1 a cerca de 10, preferivelmente cerca de 0,5 a cerca de 5% em peso/peso. Um espessante adequado é hectorita sintética, uma argila de complexo de sili-cato de metal alcalino de magnésio coloidal sintético disponível, por exemplo, como Laponita (por exemplo, CP, SP 2002, D) comercializado por Laporte Industries Limited. A Laponita D é, aproximadamente em peso 58,00% de Si02, 25,40% de MgO, 3,05% de Na20, 0,98% de Li20, e um pouco de água e metais traço. Sua verdadeira gravidade específica é 2,53 e tem uma densidade de volume aparente de 1,0 g/ml em 8% de umidade.

Outros espessantes adequados incluem musgo irlandês, carragenana de iota, goma de tragacanto, amido, polivi-nilpirrolidona, hidroxietilpropilcelulose, hidroxibutil me-til celulose, hidroxipropil metil celulose, hidroxietil celulose (por exemplo, disponível como Natrosol), carboximetil celulose de sódio, e sílica coloidal tal como Syloid finamente moída (por exemplo, 244) . Os agentes solubilizantes também podem ser incluídos tal como polióis umectantes tal propileno glicol, dipropileno glicol e hexileno glicol, cel-losolves tal como cellosolve de metila e cellosolve de eti-la, óleos vegetais e ceras contendo pelo menos cerca de 12 carbonos em uma cadeia reta tal como azeite de oliva, óleo de rícino e petrolato e ésteres tal como acetato de amila, acetato de etila e benzoato de benzila.

Será entendido que, como são convencionais, as preparações orais devem ser vendidas ou de outro modo distribuídas em embalagens rotuladas adequadas. Desse modo, um frasco de vidro de enxãgüe bucal terá um rótulo que o descreve, em substância, como um enxágüe bucal ou anti-séptico bucal e tendo instruções para seu uso; e uma pasta de dentes, creme ou gel normalmente estarão em um tubo desmontá-vel, tipicamente alumínio, chumbo forrado ou plástico, ou outro distribuidor espremível, de bomba ou pressurizado para medir os conteúdos, tendo um rótulo que o descreve, em substância, como uma pasta de dentes, gel ou nata dental.

Os agentes tensoativos orgânicos podem ser empre- gados nas composições da presente invenção para obter ação profilãtica aumentada, auxiliar na obtenção de dispersão completa e total do agente ativo ao longo da cavidade oral, e tornar as presentes composições mais cosmeticamente aceitáveis. 0 material tensoativo orgânico é preferivelmente a-niônico, não iônico ou anfolítico em natura e preferivelmente não interage com o agente ativo. É preferido empregar como o agente tensoativo um material detersivo que dã à composição propriedades espumantes e detersivas. Os exemplos adequados de tensoativos aniônicos são sais solúveis em água de monossulfatos de monoglicerídeo de ácido graxo mais elevado, tal como o sal de sódio do monoglicerídeo monossulfatado de ácidos graxo de óleo de coco hidrogenado, sulfatos de alqui-la mais elevados, tal como sulfato de laurila de sódio, sul-fonatos de arila de alquila tal como sulfonato de benzeno de dodecila de sódio, alquílsulfo-acetatos mais elevados, éste-res de ácido graxo mais elevados de 1,2-diidróxi propano sulfonato, e as acil amidas alifáticas mais elevadas substancialmente saturadas de compostos de ácido carboxílico a-mino alifãtico mais baixos, tal como aqueles tendo 12 a 16 carbonos no ácido graxo, radicais de acila ou alquila, e outros. Os exemplos das últimas amidas mencionadas são sarco-sina de N-lauroíla, e os sais de sódio, potássio, e etanola-mina de sarcosina de N-lauroíla, N-miristoíla, ou N-palmitoíla que deveriam ser substancialmente livres de sabão ou material de ácido graxo mais elevado similar, 0 uso deste compostos de sarconita nas composições orais da presente invenção é particularmente vantajoso uma vez que estes materi- ais exibem um efeito acentuado prolongado na inibição de formação de ácido na cavidade oral devido aos carboidratos decompostos além de exercer alguma redução na solubilidade de esmalte de dentes em soluções ácidas. Os exemplos de ten-soativos não iônicos solúveis em água adequados para uso são produtos de condensação de óxido de etileno com vários compostos contendo hidrogênio reativo nele tendo cadeias hidro-fóbicas longas (por exemplo, cadeias alifáticas de cerca de 12 a 20 átomos de carbono), cujos produtos de condensação ("etoxâmeros") contêm frações de polioxietileno hidrõfilo, tal como produtos de condensação de poli(óxido de etileno) com ácidos graxos, ãlcoois graxos, amidas graxas, álcoois poliídricos (por exemplo, monoestearato de sorbitan) e poli-propilenóxido (por exemplo, materiais Pluronic). O agente tensoativo está tipicamente presente em quantidade de cerca de 0,1-5% em peso. É notável, que o a-gente tensoativo pode ajudar na dissolução do agente ativo da invenção e desse modo diminui a quantidade de umectante de solubilização necessária. Vários outros materiais podem ser incorporados nas preparações orais desta invenção tal como agentes de bran-queamento, preservativos, silicones, compostos de clorofila e/ou materiais amoniados destes, tal como uréia, fosfato de diamônio, e misturas destes. Estes adjuvantes, onde presentes, são incorporados nas preparações em quantidades que substancialmente não afetam adversamente as propriedades e características desejadas.

Qualquer material aromatizante ou adoçante adequa- do também podem ser empregado.

Os exemplos de constituintes aromatizantes adequados são óleos aromatizantes, por exemplo, óleo de hortelã, hortelã-pimenta, gualtéria, sassafrãs, cravo-da-índia, salva, eucalipto, manjerona, canela, limão, e laranja, e sali-cilato de metila. Os agentes adoçantes adequados incluem sa-carose, lactose, maltose, sorbitol, xilitol, ciclamato de sódio, perilartina, AMP (alanina de fenila de aspartila, és-ter de metila), sacarina, e outros. Adequadamente, os agentes aromatizantes e adoçantes podem cada ou juntos compreender de cerca de 0,1% a 5% a mais da preparação. A invenção também fornece o uso de uma composição como descrito acima. Ma prática preferida desta invenção uma composição oral de acordo com esta invenção, tal como antiséptico bucal ou dentifrício, contendo a composição da presente invenção é preferivelmente regularmente aplicada às gengivas e dentes, tal como diariamente ou cada segundo ou terceiro dia ou preferivelmente de 1 a 3 vezes diariamente, em um pH ácido, preferivelmente de cerca de 4,5 a cerca de 7,0, durante pelo menos 2 semanas até 8 semanas ou mais até toda vida. Em uma modalidade, o pH da composição oral é cerca de 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ou 7,0.

As composições desta invenção também podem ser incorporadas em pastilhas, ou em chiclete ou outros produtos, por exemplo, agitando-se em uma base de goma quente ou cobrindo a superfície externa de uma base de goma, ilustrativo do qual é jelutong, látex de borracha, resinas de vinilita, etc., desejavelmente com plastificantes ou amaciantes con- vencionais, açúcar ou outros adoçantes ou tal como glicose, sorbitol e outros.

Em outra modalidade, o complexo da invenção é formulado para formar um suplemento dietético compreendendo 0,1-100% em peso/peso preferivelmente, mais preferivelmente 1 - 50% peso/peso, preferivelmente 1-10% e particularmente 2% peso/peso de um comestível. O complexo também pode ser incorporado em produtos alimentícios.

Em um outro aspecto, a invenção fornece composições que incluem composições farmacêuticas compreendendo qualquer dos complexos ACFP e/ou ACP como descrito acima junto com um portador farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem ser selecionadas do grupo que consiste em composições anticariogênicas dentárias, composições terapêuticas e suplementos dietéticos. As composições dentárias ou composições terapêuticas podem estar na forma de um gel, líquido, sólido, pó, creme ou pastilha. As composições terapêuticas também podem estar na forma de comprimidos ou cápsulas. Em uma modalidade, os complexos ACP e/ou ACFP são substancialmente os únicos componentes ativos de reminerali-zação de uma tal composição. A invenção também inclui uma formulação descrita acima fornecida junto com instruções para seu uso para tratar ou prevenir qualquer uma ou mais cáries dentárias ou cárie de dente, erosão/corrosão dentária, hipersensibilidade dentinária e cálculo dentário.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição para restauração dentária, incluindo um material restaurativo dentário ao qual foi adicionado um complexo de ACFP e/ou ACP de acordo com a presente invenção. A base do material restaurativo dentário pode ser um cimento de ionômero de vidro, um material de compósito ou qualquer outro material restaurativo que seja compatível. É preferido que a quantidade de complexo de CPP-ACP ou complexo de CPP-ACFP incluída no material restaurativo dentário seja 0,01-80% em peso, preferivelmente 0,5-10% e mais preferivelmente 1-5% em peso. O material restaurativo dentário desta invenção que contém os agentes mencionados acima pode ser preparado e empregados de várias formas aplicáveis à prática dentária. 0 material restaurativo dentário de acordo com esta modalidade pode também incluir outros íons, por exemplo, í-ons antibacterianos Zn2+, Ag+, etc ou outros ingredientes a-dicionais que dependem do tipo e forma de um material restaurativo dentário particular. É preferível que o pH do material restaurativo dentário de acordo com esta modalidade seja entre 2-10, mais preferivelmente 5-9 e ainda mais preferivelmente 5-7. É preferível que o pH do material restaurativo dentário contendo o complexo de CPP-ACP ou complexo de ACFP está na faixa de cerca de 2 a 10, mais preferivelmente na faixa de cerca de 5 a 9 e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 5 a 7. A invenção também é voltada a um método para a fabricação de uma composição restaurativa. Preferivelmente, o método inclui a adição de um complexo de ACP e/ou ACFP como descrito acima, a um material restaurativo dentário de base. A invenção também refere-se ao uso de uma composição restau- rativa como declarado acima para a prevenção e/ou tratamento de cárie dentária. A invenção também refere-se a um kit de partes incluindo (a} material restaurativo dentário e (b) complexo de CPP-ACP ou complexo de CPP-ACFP juntos com instruções para seu uso para a preparação de uma composição contendo um complexo descrito acima para a restauração dentária. A invenção também refere-se a um kit de partes incluindo (a) material restaurativo dentário (b) fosfopeptídeo de caseína (c) íons de cálcio e (d) íons de fosfato, e (e) íons de hidróxido e opcionalmente íons de fluoreto, juntos com instruções para seu uso para a preparação de uma composição para restauração dentária.

Em um outro aspecto, é fornecido um método para tratar ou prevenir um ou mais de cada das cáries dentária ou cárie de dente, erosão/corrosão dentária, hipersensibilidade dentinãria e cálculo dentário compreendendo a etapa de administrar um complexo ou composição da invenção aos dentes ou gengivas de um indivíduo, preferivelmente um em necessidade de tais tratamentos. A administração tópica do complexo é preferida. 0 método preferivelmente inclui a administração do complexo em uma formulação como descrito acima. A invenção também fornece um método de prevenção e/ou tratamento de cárie dentária, erosão/corrosão dentária, hipersensibilidade dentária e cálculo dentário em animais incluindo fornecer a composição restaurativa dentária de a-cordo com a invenção, ou fabricada de acordo com a invenção, e aplicando aos dentes em um animal em necessidade de pre- venção e/ou tratamento.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se aos métodos para tratar uma ou mais condições relacionadas com a perda de cálcio do corpo, especialmente dos ossos, deficiência de cálcio, má absorção de cálcio, ou outros. Os exemplos de tais condições incluem, porém não estão limitados a, os-teoporose e osteomalacia. Em geral qualquer condição que possa ser melhorada através de biodisponibilidade de cálcio aumentada é contemplada.

Será entendido claramente que, embora esta especificação especificamente refira-se às aplicações em humanos, a invenção também é útil para propósitos veterinários. Desse modo, em todos os aspectos a invenção é útil para animais domésticos tal como gado vacum, ovelha, cavalos e avícula; para animais de companhia tal como gatos e cachorros; e para animais de jardim zoológico. A invenção será descrita agora com referência aos seguintes exemplos não limitantes. EXEMPLO 1 Preparação de soluções de CPP-ACFP e CPP-ACP

As soluções de matéria-prima de 3,25M de CaCl2, 1,25 M de Na2HP04, 1 M de NaOH e 1 M de NaF foram adicionadas em aproximadamente trinta alíquotas a uma digestão tríp-tica de 10-15% em peso/volume de caseína até uma concentração final de aproximadamente 78 mM de Ca2+, 48 mM de fosfato e 12 mM de concentrações de fluoreto foram obtidos. As soluções foram adicionadas lentamente (isto é, menos do que a-proximadamente 1% de adição de volume por minuto) . Uma alí- quota da solução de fosfato foi adicionada primeiro, seguida por uma alíquota da solução de cálcio. 0 pH foi mantido em 7,0, 6,5, 6,0, 5,5 e 5,0 empregando o NaOH com mistura completa. A solução de hidróxido de sódio foi adicionada automaticamente por um pH imediato com a adição dos íons de hidróxido normalmente sendo após cada adição dos íons de cálcio. Após a adição dos íons de cálcio, os íons de fosfato, íons de hidróxido e íons de fluoreto a solução foi filtrada por um filtro de 0,1 mícron para concentrar 1-2 dobras. 0 retentado pode ser lavado com água para remover sais e pep-tídeos inativos (e degustação amarga) se desejado. As soluções de CPP-ACP foram preparadas como acima sem a adição de fluoreto.

Na conclusão de cada titulação e filtração uma a-mostra de cada retentado foi tomada e menos do que 10% coletado como um filtrado empregando uma membrana de ultrafil-tração Centriprep 3 de corte de peso molecular 3000. Os Cen-tripreps contendo as amostras foram centrifugados em 1.000 g durante 15 minutos em uma centrífuga Beckman J2-21 empregando um rotor JA 10.5. A amostra original antes da centrifuga-ção de Centriprep e uma amostra do filtrado após a centrifu-gação de Centriprep foram levadas para análise de concentrações de cálcio, fosfato e fluoreto. A análise da amostra o-riginal determinou as concentrações de íon de fluoreto, fosfato e cálcio totais, e a análise do filtrado determinou concentrações de cálcio, fosfato e fluoreto livres (não ligadas). A diferença entre as concentrações de não ligadas e totais é a concentração ligada de Ca, Pi e F pelo CPP e isso é apresentado na Tabela 1 e Tabela 2.

Em uma primeira ilustração de uma modalidade da invenção, cálcio, fosfato e fluoreto ligados de 2% de CPP-ACFP foram medidos em complexos preparados em valores de pH ácido, como mostrado em Tabela 1. __________ TABELA 1 _________________________________________ Em uma segunda ilustração de uma modalidade da invenção, cálcio e fosfato ligados de 2% de CPP-ACP foram medidos em complexos preparados em valores de pH ácido, como mostrado em Tabela 2. __________TABELA 2____________________________________________ Os resultados desta experiência demonstram que na-nocomplexos ou nanofeixes de fosfato de cálcio amorfo e fosfato de fluoreto de cálcio amorfo estabilizado por fosfopep- tideos de caseína (CPP) são formados em pH ácido, quando e-les são retidos após a etapa de filtração devido à agregação em concentrações elevadas. As razões de cálcio e fosfato e fluoreto ligados, da Tabela 1 e 2, demonstram que os complexos formados contêm fosfato de cálcio amorfo básico e fosfato de fluoreto de cálcio amorfo básico (ACFP). A fase de ACP básico foi [Ca3 (P04) 2] x [Ca2 (P04) (OH)] onde x = 1-2 para todos os valores de pH. A fase de ACFP básico foi [Ca3 (P04) 2] x [Ca2 (P04) F] y onde x = 1 e y = 1-2 (pH 5,0) e onde y = 1 e x = 1-2 (pH 5,5 - 7,0). Além disso, pode ser observado que a quantidade de ions de cálcio e ions de fosfato ligados, em pH ácido permanece relativamente elevada até que o pH da formação caia para a região de cerca de 5,0.

Acredita-se, sem estar ligado a qualquer teoria ou modo de ação, que a formação dos complexos pode ser obtida em pH ácido pela adição fixa de anions de OH, tal como por adição de NaOH, preferivelmente com agitação, tal que os â-nions de OH com os ions de cálcio e ions de fosfato (P043-) forme ACP básico suficientemente para ser estabilizado pelo CPP, que então conduz a reação a formar mais ACP sob outra adição de OH. Além disso, no caso de ACFP, o F permite um ambiente de pH mais abaixo para formação complexa, e pode ser observado na Tabela 1 que uma quantidade maior de cálcio é ligada em complexos de ACFP em um determinado pH ácido do que ACP no mesmo pH. EXEMPLO 2 Comparação de remineralização de lesões da subsuperficie de esmalte in vitro por CPP-ACP e CPP-ACFP em valores do pH ácido A superfície de esmalte polida de terceiros molares humanos extraídos foi vista como uma prancha (8x4mm2) e coberta com verniz de unha resistente a ácido para formar uma janela mesiodistal meio-oclusal e meío-gengival (lx7mm2) separada por 1 mm. 0 protocolo empregado para a comparação foi aquele descrito em Reynolds (1997) Remineralization of enamel subsurface lesions by casein phosphopeptide-stabilized calcium phosphate Solutions. J Dent Res 76:1587-1595, que é conhecido por alguém versado na técnica, e os teores do qual estão incorporados aqui por referência. As lesões de esmalte da subsuperfície foram criadas destas janelas empregando o método Carbopol de White (descrito em Reynolds, 1997) . As pranchas de esmalte foram vistas em metade a blocos de 4x4mm2. A lesão meio-gengival em um bloco e a lesão meio-oclusal no outro bloco, foram seladas com verniz para criar os controles demineralizados.

As meias-lesões de esmalte foram expostas a soluções de remineralização diferentes durante 10 dias a 37°C sem misturar. As soluções de remineralização foram 2% de CPP - ACP ou 2% de CPP-ACFP preparado em pH 7,0, 6,5, 6,0, 5,5 e 5,0 e mantido em soluções tendo o respectivo pH de formação.

Após remineralização, cada par de blocos foi desidratado em etanol e embutido em resina de metil-metacrilato (Paladur, Kulzer, Alemanha) . Três seções de 200-300μιτι foram cortadas perpendiculares â superfície da lesão, enroladas até 80 ± 5μίη e radiografadas ao lado de um escala de alumínio de 10χ14μΐΐΐ de incrementos de espessura como previamente descrito (Shen e outros, 2001, J., Dent. Res. 80:2066 - 2070), os teores totais do qual estão incorporados aqui por referência.

As imagens radiogrãficas das lesões foram vistas através da luz transmitida através de um microscópio Dilux 22 (Ernst Leitz Wetzlar, Alemanha). As imagens foram adquiridas por câmara de vídeo (Sony DXC 930P) e digitalizadas (Scion imaging Corporation, colour grabber 7) sob o controle do software de imageamento (Optimas 6.2). As imagens das lesões, controles e o escala de alumínio foram escaneadas como descrito previamente por Shen e outros (2001). A espessura da seção de esmalte foi medida e a porcentagem em volume de dados minerais foi determinada empregando a equação de Ang-mar (1963) como descrito previamente por Shen e outros (2001) . A porcentagem de remineralização (%R) foi também calculada como descrito previamente por Shen e outros (2001) . A remineralização das lesões de subsuperfície de esmalte por estas soluções é mostrada na Tabela 3. TABELA 3 Os resultados da Tabela 3 demonstram que 2% de so- luções de CPP-ACP e CPP-ACFP remineralizam as lesões de sub-superfície em níveis substanciais, apesar dos valores de pH ácido. Ambos CPP-ACP e CPP-ACFP produziram remineralizaçao ideal em pH 5,5. Até mesmo em pH 5,0 onde a desmineralização de esmalte normalmente de outra maneira ocorrería, 2% de CPP-ACP produziu 18% de remineralizaçao e 2% de CPP-ACFP produziu 40% de remineralizaçao demonstrando as propriedades superiores de CPP-ACFP em soluções ácidas. EXEMPLO 3 Comparação de remineralizaçao de esmalte in si tu por CPP-ACP em pH 7,0 e 5,5 Este estudo foi um projeto duplo cego e de cruzamento para avaliar a capacidade de um enxágue bucal contendo 0,5% em peso/volume de CPP-ACP preparado e mantido em pH 5,5 comparado com um enxágüe bucal contendo 0,5% em peso/volume de CPP-ACP preparado e mantido em pH 7,0 para realçar a re-mineralízação do esmalte em um modelo intra-oral. A aprovação para o estudo foi obtida de The University of Melbourne Human Research Ethics Committe e o Ryal Dental Hospital de Melbourne Ethics em Clinicai Research Commíttee. Quatro indivíduos adultos saudáveis (2 machos e 2 fêmeas) foram recrutados dos estudantes auxiliares e pós-graduados (idade 21 a 47 anos) da School of Dental Science. Todos os indivíduos tinham pelo menos 22 dentes naturais com nenhuma atividade de cárie, doença periodontal ou outra patologia oral corrente. Nenhum dos indivíduos estava usando antibiótico ou medicamentos, o que poderia ter afetado a taxa de fluxo salivar. A taxa de fluxo salivar não estimulada de cada indivíduo es- tava em excesso de 0,2 ml/min. As taxas de fluxo salivar não estimulada foram medidas instruindo-se os indivíduos a inclinar para frente com suas cabeças inclinadas para baixo, permitindo a saliva fluir em um tubo centrífugo pré-pesado durante exatamente 2 minutos. As taxas de fluxo salivar estimuladas foram medidas instruindo-se o indivíduo a consumir chiclete sem açúcar durante exatamente 2 minutos ao mesmo tempo em que permitindo toda a saliva produzida fluir em um tubo centrífugo pré-pesado.

Os aparelhos de acrílico meio-palatais removíveis cobrindo os primeiros pré-molares ao último dente na arcada foram fabricados para cada indivíduo como previamente descrito (Shen e outros, 2001).

Os terceiros molares humanos extraídos foram obtidos do Royal Dental Hospital de Melbourne. Qualquer tecido macio extraído foi removido e os dentes foram armazenados em uma solução de acetato de formalina de 18% em volume/volume. As superfícies bucais e linguais, ilesas relativamente planares e livres de rachaduras, manchas e fluorose (como observado sob um microscópio de dissecação) foram selecionadas e três vezes enxaguadas com água Milli-Q. A superfície de esmalte externa foi removida e polida úmida para a um acabamento de espelho empregando discos Soflex™ (3M) em um man-dril dental contra-ângulo de velocidade vagarosa. Cada superfície polida foi então vista do dente como uma prancha de aproximadamente 8 x 4mm, empregando uma serra de lâmina de diamante resfriada por água e a prancha total coberta com verniz de unha resistente a ácido exceto para duas janelas de mesiodistais (oclusal e gengival) (1x7 mm) separadas de cada outra por 1 mm. As lesões criadas nas janelas de esmalte montando-se cada prancha sobre a extremidade de um bastão de 3 - 4 cm de cera aderente dentaria amarela e imergindo em 40 ml de tampão de desmineralização não agitado, consistindo em 20 g/1 de Carbopol 907™ (carboxipolimetileno, BF Goodrich, Cleveland, OH) , 500 mg/1 de hidroxiapatita (Bio-gel® HTP, Laboratórios Bio-Rad, Richmond, CL), e 0,1 mol/1 de ã-cido láctico (Ajax Chemicals, Auburn, NSW) pH 4,8, durante 4 dias a 37°C. Uma alteração da solução foi feita após 2 dias tempo no qual as pranchas foram removidas da solução, enxaguadas três vezes com água Milli-Q, manchadas a seco e colocadas em tampão de desmineralização fresco. As pranchas foram similarmente enxaguadas e secadas após quatro dias de desmineralização. Este procedimento de desmineralização produziu lesões de subsuperfície consistentes de aproximadamente 80~100pm de profundidade (LDd) com camadas de superfície intactas, quando avaliadas por microrradiografia de seções das lesões artificiais. Após a desmineralização, cada prancha de esmalte foi vista através da linha mediana de cada janela em duas meias-pranchas de 4 x 4 mm e a superfície cortada de cada meia-prancha coberta com verniz de unha. Uma meia-prancha de cada par foi retida como o controle de desmineralização e armazenada em um tubo microcentrífugo de 1,5 ml rotulado junto com uma gota de água Milli-Q, desse modo criando um ambiente umedecido. A outra meia-prancha de esmalte do par foi inserida em um aparelho intra-oral e retida empregando cera dentária para o protocolo de remineraliza- ção. 0 Cuidado foi tomado para manter as janelas livres da cera. Quatro meias-pranchas de esmalte foram inseridas em cada aparelho, duas em cada lado em cubas bilaterais (e outros, Shen 2001).

Os enxãgües bucais de teste contiveram 0,5% em pe-so/volume de CPP-ACP preparado como descrito no Exemplo 1 em pH 5,5 ou pH 7,0. Os produtos foram fornecidos como produtos codificados. O código não foi liberado até que todos os dados tivessem sido adquiridos. Este estudo utilizou um projeto duplo cego, de cruzamento com dois tratamentos: (i) um enxágüe bucal contendo 0,5% (peso/volume) de CPP-ACP em pH 7,0, e (ii) um enxágüe bucal contendo 0,5% (peso/volume) de CPP-ACP em pH 5,5. Os indivíduos foram designados aleatoriamente para cada dos enxágües bucais.

No começo do estudo todos os indivíduos foram fornecidos com um fornecimento adequado de um dentifrício de fluoreto padrão que eles foram instruídos a usar durante a duração do estudo. Os indivíduos foram instruídos a escovar seus dentes com um dentifrício de fluoreto no começo da manhã e na hora de dormir. Eles foram também instruídos a enxaguar suas bocas com água antes da inserção do aparelho in-tra-oral. Os indivíduos usaram os aparelhos palatais removíveis com quatro inserções de meia-prancha de esmalte humano contendo lesões desmineralizadas da subsuperfície. Cada indivíduo foi instruído a enxaguar com 5 ml de enxágüe bucal durante 60 segundos logo que o aparelho fosse inserido na boca. Os indivíduos continuaram usando a aparelho durante outros 40 minutos. Isto foi feito 4 vezes por dia durante 10 dias consecutivos nos seguintes tempos: 10:00 am; 11 :30 am; 2:00 pm e 3:30 pm. Ao mesmo tempo em que o aparelho foi sendo usado, os indivíduos foram instruídos a não comer ou beber qualquer coisa. Seguinte o período de 10 dias de teste, houve um período de lavagem de uma semana. Os indivíduos então cruzaram com os outros tratamentos. Quando o aparelho foi removido da boca, ele foi enxaguado brevemente com água Mili-Q e mantido em um saco de plástico úmido selado e armazenado em temperatura ambiente. Os indivíduos informados não para escovar a área contendo os blocos de esmalte. Os indivíduos possuíram um diário do uso do produto e tempos de uso do aparelho. Nenhuma alteração foi feita à dieta do indivíduo ou procedimentos de higiene oral durante a duração do estudo. Após cada período do tratamento as meias-pranchas de esmalte foram removidas, juntadas com suas respectivas mei-as-pranchas de controle desmineralizadas, embutidas, secio-nadas, e submetidas a microrradiografia e análise de imagem densitométrica auxiliada por computador para determinar o nível de remineralização.

Após cada tratamento, as meias-pranchas de esmalte foram juntadas com suas respectivas meias-pranchas de controle e então desidratadas em álcool absoluto. Cada par da meias-pranchas foi embutido, secionado, e submetido a microrradiografia e análise como descrito por Shen e outros, (2001) . As imagens radiográficas das lesões e as áreas vizinhas do esmalte ileso foram escaneadas empregado a função de luminância de linha do programa que determina as leituras em valores cinza entre 0 e 256. Cada lesão foi seis vezes esca- neada através de uma área livre de artefatos ou rachaduras. Cada escaner compreendeu 200 leituras tomadas da superfície do dente através da lesão ao esmalte ileso. Uma imagem de escala de alumínio em cada lâmina foi escaneada e as leituras do valor cinza da etapa de média foram plotadas contra a espessura do alumínio. As leituras da imagem de seção dos dentes apresentadas dentro da porção linear da curva de escala e regressão linear foram empregadas para converter os dados de valor cinza em valores de espessura equivalentes de alumínio. As espessuras de seção foram medidas e o % em volume dos dados de mineral foram computados empregando a e-quação de Angmar e outros, (1963) e os coeficientes de absorção linear de alumínio matéria orgânica mais água e mineral apatítico (131,5, 11,3 e 260,5 respectivamente). A imagem da tira mediana entre as duas lesões foi seis vezes escaneada e tirada a média para determinar um perfil densito-métrico de controle de esmalte ileso. As imagens de lesão (janelas tratadas e janelas controle de desmineralização) ao lado gengival e oclusal da tira mediana foram similarmente escaneadas, tão próximas quanto possível da faixa mediana porém evitando qualquer irregularidade comumente encontrada nas bordas das lesões, e o % de perfis de mineral foram computados . 0 % em volume do perfil do mineral de cada meia-prancha de esmalte desmineralizada e lesão tratada foram comparados com o % em volume do perfil do mineral de esmalte ileso mediano da mesma seção. A diferença entre as áreas sob o perfil densitométrico da lesão de controle desmineralizada e do esmalte ileso mediano, calculado por integração trape-zoidal, é representada por AZd. A diferença entre as áreas sob o perfil densitométrico da lesão tratada e do esmalte ileso mediano, calculadas por integração trapezoidal, é representado por AZr. Estes parâmetros foram então convertidos para % de valores de alteração após tratamento, tal como, % de mineral alterado (% de MC) representa o % da alteração nos valores ΔΖ: % MC = AZd - AZr x 100 Azd Os dados para os três tratamentos foram testados estatisticamente empregando análise de variação (ANOVA) para um projeto de bloco completo aleatorizado (Norusis M.1993). A homogeneidade de variação foi confirmada empregando o teste de Levene e a normalidade dos dados foi confirmada empregando gráficos de probabilidade normal e o teste de Kolmogo-rov-Smirnov. Todas as análises estatísticas foram realizadas empregando o software SPSS versão 11,0 (Norusis M.1993).

Na obtenção dôo grupo de dados completos de valor de remineralização de esmalte o código foi liberado e os dados decodificados foram analisados. Os resultados na Tabela 4 representam o % de valores de MC médios para os 4 indivíduos e os dados para cada indivíduo obtidos de 12 escaners (6 cada das lesões gengivais e oclusais) realizado em cada seção das quatro meias-pranchas de esmalte em cada aparelho. O uso do enxágüe bucal contendo 0,5% (peso/volume) de CPP-ACP em pH 5,5 produziu 14,16 ± 1,90% de remineralização das lesões da subsuperfície de esmalte enquanto o uso do enxágüe bucal contendo 0,5% (peso/volume) de CPP-ACP era pH 7,0 resultou em somente 10,31 ± 2,28% de remineralização de subsu-perfície de esmalte. Esta diferença foi estatisticamente significante {p < 0,01). Estes dados mostram que CPP-ACP formado em pH 5,5 tem 37% de maior eficácia de remineralização de esmalte in situ do que CPP-ACP formado em pH 7,0 desse modo confirmando os resultados in vitro obtidos no Exemplo 3. TABELA 4 Remineralização de lesões de subsuperfície de esmalte in si tu por um enxágüe bucal contendo 0,5% ____________(peso/volume) de CPP-ACP em pH 7,0 ou pH 5,5.________ a. Percentual de remineralização aumentada em enxágüe bucal de pH 7,0 EXEMPLO 4 Neste exemplo, várias formulações são fornecidas para exemplificar os modos nos quais os complexos da invenção podem ser formulados para composições de propósitos diferentes como descrito mais geralmente acima. Estes são somente exemplos do tipo de formulações que podem ser fornecidas empregando várias modalidades da invenção.

Formulações de pasta de dente contendo CPP-ACP ou CPP-ACFP.

Formulação 1 Ingrediente______________________% em peso/peso_______________ Sorbitol 22,0 Musgo Irlandês 1,0 Gantrez 19,0 Água Purificada Equilíbrio Monofluorofosfato de Sódio 0,76 Sacarina de Sódio 0,3 Pirofosfato 2,0 Alumina Hidratada 47,0 Aromatizante 0,95 CPP-ACP {preparado em pH 5,5) 2,0 Sulfato de Laurila de Sódio 2,0 pH ajustado para 5,5 com NaOH_________________________________ Formulação 2 Ingrediente______________________% em peso/peso_______________ Diidrato de Fosfato de Dicãlcio 50,0 Sorbitol 10,0 Glicerol 10,0 Carboximetil celulose de sódio 1,0 Sulfato de Laurila de Sódio 1,5 Sarcosinato de Laurila de Sódio 0,5 Aromatizante 1,0 Sacarina de Sódio 0,1 Monofluorofosfato de Sódio 0,3 Glíconato de Clorexidina 0,01 Dextranase 0,01 CPP-ACF (preparado em pH 5,5) 2,0 Água Purificada Equilíbrio pH ajustado para 5,5 com NaOH_________________________________ Formulação 3 Ingrediente____________________% em peso/peso_________________ Sorbitol 22,0 Musgo Irlandês 1,0 Gantrez 19,0 Água Purificada Equilíbrio Sacarina de Sódio 0,3 Pirofosfato 2,0 Alumina Hidratada 48,0 Aromatizante 0,95 CPP-ACP (preparado em pH 5,5) 2,0 Sulfato de Laurila de Sódio 2,0 pH ajustado para 5,5 com NaOH_________________________________ Formulação 4 Ingrediente______________________% em peso/peso_______________ Diidrato de Fosfato de Dicálcio 50,0 Sorbitol 10,0 Glicerol 10,0 Carboximetil celulose de Sódio 1,0 Sulfato de Laurila de Sódio 1,5 Sarcosinato de Laurila de Sódio 0,5 Aromatizante 1,0 Sacarina de Sódio 0,1 Gliconato de Clorexidina 0,01 Dextranase 0,01 CPP-ACF (preparado em pH 5,5) 2,0 Água Purificada Equilíbrio pH ajustado para 5,5 com NaOH_________________________________ Formulação 5 % em peso/peso Ingrediente____________________________1_______ 2 Sorbitol 58,0 58,0 Sílica (Zeodent 119) 20,0 20,0 Água Purificada Equilíbrio Equilíbrio Sulfato de Laurila de Sódio 4,0 4,0 CPP-ACP (preparado em pH 5,5) 2,0 CPP-AFCP (preparado em pH 5,5) - 2,0 Fosfato de Diidrogênio de Sódio 1,45 1,45 Aromatizante 1,0 1,0 Carbóximetil celulose de sódio 0,75 0,75 Dióxido de Titânio (Rutile) 0,525 0,525 Goma Xantam 0,475 0,475 Sacarina de Sódio 0,350 0,350 Fluoreto de Sódio 0,243 pH ajustado com ácido fosfórico/NaOH 5,5___________5^5________ Formulação 6 % em peso/peso Ingrediente______________________________1_________2__________ Sorbitol (70% de solução) 31,0 31,0 Água Purificada Equilíbrio Equilíbrio Sílica 22,0 22,0 Glicerol 8,0 8,0 Sulfato de Laurila de Sódio 4,0 4,0 Polietileno Glicol 300 1,0 1,0 Fluoreto de Sódio 0,243 Dióxido de Titânio (Rutile) 0,525 0,525 Goma Xantam 0,475 0,475 Carboximetil Celulose de Sódio 0,5 0,5 Sacarina de Sódio 0,286 0,286 Pirofosfato Ácido de Sódio 2,4 2,4 Pirofosfato de Tetra Sódio 2,2 2,2 Aromatizante 1,0 1,0 CPP-ACP (preparado em pH 5,5) 2,0 CPP-AFCP (preparado em pH 5,5) - 2,0 Ph 5,5 5,5 pH ajustado com ácido fosfórico/NaOH 5,5___________5^5________ Formulações de Anti-Séptico Bucal Formulação 1 Ingrediente____________________________% em peso/peso_________ Etanol 10,0 Aromatizante 1,0 Sacarina de Sódio 0,1 Monofluorofosfato de Sódio 0,3 Gliconato de Clorexidina 0,01 Dietanolamida de Lauroíla 0,3 CPP-ACF (preparado em pH 5,5) 0,5 Água Equilíbrio pH ajustado para 5,5 empregando ácido fosfórico/NaOH_____________________________________ Formulação 2 Ingrediente____________________________% em peso/peso_________ Gantrez S-97 2,5 Glicerina 10,0 Sacarina de Sódio 0,1 Óleo Aromatizante 0,4 Gliconato de Clorexidina 0,01 Dietanolamida de Lauroíla 0,2 CPP-ACF (preparado em pH 5,5) 0,5 Água Equilíbrio pH ajustado para 5,5 empregando ácido fosfórico/NaOH________________________________________________ Formulação de Pastilhas Ingrediente____________________________% em peso/peso Açúcar/ álcool de açúcar 75-80 Xarope de milho 1-20 Óleo Aromatizante 1-2 CPP-ACFP (preparado em pH 5,5) 0,5-2,0 Estearato de Mg 1-5 Água Equilíbrio pH ajustado para 5,5 empregando ácido fosfórico/NaOH________________________________________________ Formulação de Chiclete Ingrediente____________________________% em peso/peso_________ Base de Goma 30 Carbonato de Cálcio 2,0 Sorbitol Cristalino 53,0 Glicerina 0,5 Óleo Aromatizante 0,1 CPP-ACP (preparado em pH 5,5) 1,0 Água Equilíbrio pH ajustado para 5,5 empregando ácido fosfórico/NaOH________________________________________________ Será entendido que a invenção descrita e definida nesta especificação se estende a todas as combinações alternativas de duas ou mais características individuais mencionadas ou evidentes a partir do texto ou desenhos. Todas essas combinações diferentes constituem vários aspectos alternativos da invenção.

Claims (21)

1. Complexo de fosfato fluoreto de cálcio amorfo (ACFP) ou de fosfato de cálcio amorfo (ACP) estabilizado por fosfopeptídeo, CARACTERIZADO pelo fato de que o complexo ACP ou ACFP tem cálcio ligado e não ligado, em que o cálcio ligado no complexo é inferior ao cálcio ligado em um complexo ACP ou ACFP formado em um pH de 7,0, e onde o ACP ou ACFP está predominantemente em uma forma básica.

2. Complexo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o fosfopeptídeo inclui a se-qüência A-B-C-D-E onde A, B, C, D e E são independentemente fosfosserina, fosfotreonina, fosfotirosina, fosfohistidina, ácido glutâmico ou ácido de aspártico.

3. Complexo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o fosfopeptídeo inclui a se-qüência de Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu onde Ser(P) é fosfo-sserina e Glu é ácido glutâmico.

4. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o complexo é formado em um pH na faixa de cerca de 5,0 até porém abaixo de 7,0, de preferência 5,5.

5. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o fosfo-peptídeo é um fosfopeptídeo de caseína.

6. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o fosfoli-pídeo de caseína é selecionado do grupo que consiste em oísi (59-79), β (1-25) [2], as2(46-70) [3] eas2(l-21).

7. Método para produzir um complexo de fosfato de cálcio amorfo estabilizado por fosfopeptideos (ACP), CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (i) obter uma solução compreendendo pelo menos um fosfopeptideo e; (ii) misturar as soluções compreendendo ions de cálcio, ions de fosfato e ions de hidróxido ao mesmo tempo em que mantendo o pH abaixo de cerca de 7,0.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que os ions de hidróxido são titulados na solução de fosfopeptideo para manter um pH essencialmente constante, e onde os ions de cálcio e ions de fosfato são titulados na solução de fosfopeptideos com mistura constante e em uma taxa que evita a formação de um precipitado de fosfato de cálcio na solução de fosfopeptideos.

9. Método para produzir um complexo de fosfato de fluoreto de cálcio amorfo estabilizado por fosfopeptideos (ACFP), CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas d: (i) obter uma solução compreendendo pelo menos um fosfopeptideo e; (ii) misturar as soluções compreendendo ions de cálcio, ions de fosfato e ions, hidróxido e ions de flúor ao mesmo tempo em que se mantém o pH abaixo de cerca de 7,0.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que os ions de hidróxido são titulados na solução de fosfopeptideo para manter um pH essencialmente constante, e onde ions de cálcio e ions de fosfato são titulados na solução de fosfopeptideo com mistura constante e em uma taxa que evita a formação de um fosfato de cálcio precipitado na solução de fosfopeptideo.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o fosfopep-tídeo inclui a seqüência A-B-C-D-E onde A, B, C, D e E são independentemente fosfosserina, fosfotreonina, fosfotirosi-na, fosfohistidina, ácido glutâmico ou ácido aspártico.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o fosfopeptideo inclui a seqüência Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu onde Ser(P) é fosfosse-rina e Glu é ácido glutâmico.

13. Uso de um complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir a cárie dentária mediante sua administração nos dentes ou gengivas de indivíduos em necessidade de tal tratamento.

14. Uso de um complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para remineralização de esmalte de dente mediante sua administração aos dentes ou gengivas de um indivíduo em necessidade de tal tratamento.

15. Uso de um complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir cálculo dentário mediante sua administração aos dentes ou gengivas de um indivíduo em necessidade de tal tratamento .

16. Uso de um complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir hipersensibilidade dentária mediante sua administração aos dentes ou gengivas do indivíduo em necessidade de tal tratamento.

17. Uso de um complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir erosão/corrosão dentária mediante sua administração aos dentes ou gengivas de um indivíduo em necessidade de tal tratamento.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um humano, animal doméstico, animal de companhia ou animal de jardim zoológico.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal doméstico é selecionado do grupo que consiste em gado, ovelha, cavalos e aves.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal de companhia é selecionado do grupo que consiste em gatos e cachorros.

21. Uso de um complexo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar or prevenir osteoporose ou osteomalária.