CN101098675B - 稳定的磷酸钙复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种磷酸肽稳定的无定形磷酸钙和/或无定形氟磷酸钙复合物，其中所述复合物在低于7.0的pH下形成。还提供一种制造这种复合物的方法。所述复合物在牙科应用中有效，尤其在牙科再矿化方面。

Description

稳定的磷酸钙复合物
技术领域
本发明涉及由磷酸肽稳定的无定形磷酸钙和/或无定形氟磷酸钙。提供制造本发明复合物和治疗或预防龋齿、牙结石、牙侵蚀/腐蚀和牙过敏的方法。由于其再矿化(修复)早期的龋齿，其具有抗龋齿性，保护牙齿结构，以及其他牙科/医药应用(包括抗结石、抗侵蚀/腐蚀和抗牙过敏)。 
背景技术
龋齿是由于通常由牙斑的牙病原菌发酵饮食糖产生的有机酸导致的牙齿的坚硬组织的去矿化引起的。龋齿仍是一个主要的公共健康问题。此外，恢复的牙齿表面易于遭受绕恢复边缘的进一步龋齿。即使在大部分发达国家通过使用氟化物降低龋齿流行，该疾病仍然是主要的公共健康问题。牙侵蚀/腐蚀是由于饮食或反胃的酸造成的牙齿矿物质的流失。牙过敏归因于保护性矿化层的流失而暴露的牙本质小管，牙骨质和牙结石是磷酸钙矿物在牙齿表面上的不想要的增生。因此所有这些情况，龋齿、牙侵蚀/腐蚀、牙过敏和牙结石是磷酸钙水平的失调。 
通过提供可生物利用的钙和磷酸根离子补充流失的磷酸钙矿物质，用稳定的无定形磷酸钙(ACP)或稳定的无定形氟磷酸钙(ACFP)治疗龋齿、牙侵蚀/腐蚀和牙过敏。稳定的ACP和稳定的ACFP还可结合至牙结石的表面并阻止或减少进一步增生。因此，稳定的ACP和稳定的ACFP在预防和治疗口腔疾病或其他医学情况中可起重要作用。 
酪蛋白以胶束形式存在于牛奶中，其被认为是半径约100nm的近球形颗粒，分散在水、盐、乳糖和乳清蛋白质的连续相中(Schmidt，D.G.(1982)Dev.Dairy Chem.1，61-86)。酪蛋白胶束作为磷酸钙的载体， 为骨和牙齿的形成提供可生物利用的钙和磷酸根离子来源。酪蛋白胶束保持可溶的和可生物利用状态的钙和磷酸根离子的能力是由被称为酪蛋白磷酸肽(CPP)的酪蛋白的多磷酸化肽片段保持。墨尔本大学申请的WO 98/40406描述了碱性pH下产生的酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙复合物(CPP-ACP)和CPP稳定的无定形氟磷酸钙复合物(CPP-ACFP)。已经显示这些复合物能预防釉质去矿化和促进动物和人原位龋齿模型(Reynolds，1998)中釉质表面下损伤的再矿化。 
有效形成复合物的CPP无论其是否为全长度的酪蛋白的部分都能起这个作用。可从全长度的酪蛋白胰蛋白酶消化物中分离的活性物(CPP)的实例列举在US 5,015,628中且包括肽Bos(牛)αs1-酪蛋白X-5P(f59-79)[1]，Bosβ-酪蛋白X-4P(f1-25)[2]，Bosαs2-酪蛋白X-4P(f46-70)[3]和Bosαs2-酪蛋白X-4P(f1-21)[4]，如下： 
Gln59-Met-Glu-Ala-Glu-Ser(P)-Ile-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Ser(P)-Val-Glu-Gln-Lys79  αs1(59-79) 
Arg1-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Ser(P)-Leu-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg25  β(1-25) 
Asn46-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser(P)-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys70  αs2(46-70) 
Lys1-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Ser(P)-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys21  αs2(1-21) 
目前发现肽稳定的可溶、碱性形式的ACP和ACFP也可在pH小于7.0的介质中产生。这些复合物显示了令人惊奇的牙齿的釉质表面下损伤的再矿化活性。 
还应当理解的是在本说明书中使用的术语“包括”(或其语法上的变体)相当于术语“包含”，并可相互交换使用，不应当认为排除其他要素或特征存在。 
发明内容
在一个方面，本发明提供一种磷酸肽(PP)稳定的ACP或ACFP复合物，其中所述复合物在低于7.0的pH下形成。优选地，所述复合物在约5.0至低于7.0的pH范围内形成。更优选地，所述复合物在约5.0至约6.0的pH范围内形成。在一个优选的实施例中，所述复合物在约5.5的pH下形成。在一个优选的实施例中，所述复合物适于牙科应用。在一个更优选的实施例中，所述复合物适于应用于牙齿和/或齿龈以促进再矿化。 
“在......pH下形成”是指所述复合物形成的介质的总pH为限定值。所述介质内的局部pH值可变化，例如围绕复合物形成的微环境。换句话说，本发明目的的相应pH值为整体介质可测量的pH。 
优选地，ACP相主要为碱性相，其中所述ACP主要包括Ca2+、PO4 3-和OH-离子。ACP的所述碱性相的通式可以为[Ca3(PO4)2]x[Ca2(PO4)(OH)]，其中x≥1。 
优选地，ACFP相主要为碱性相，其中所述ACFP主要包括Ca2+、PO4 3-和F-离子。ACFP的所述碱性相的通式可以为[Ca3(PO4)2]x[Ca2(PO4)F]y，其中当y＝1时x≥1或当x＝1时y≥1。 
人们认为，结构上来看，本发明的PP稳定的ACP复合物中的ACP含代替ACFP中氟离子的氢氧根离子。 
在本发明的说明书中的“磷酸肽”是指其中至少2个氨基酸被磷酸化的氨基酸序列。序列中至少两个磷酸氨基酸优选为相邻的。优选地，所述磷酸肽包括序列A-B-C-D-E，其中A，B，C，D和E各自为磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、磷酸组氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，且A，B，C，D和E的至少2个，优选3个为磷酸氨基酸。在一个实施例中，所述磷酸氨基酸残基为磷酸丝氨酸，例如三个连续的磷酸丝氨酸残基。在一个优选的实施例中，所述磷酸肽包括三个连续的磷酸丝氨酸残基，紧跟2个谷氨酸残基，序列表示为Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu(其中Ser(P)为磷酸丝氨酸，Glu为谷氨 酸)。 
在一个实施例中，所述PP为完整的酪蛋白磷酸肽(CPP)或酪蛋白的片段。因此，所述PP可为酪蛋白磷酸肽或磷酸多肽。形成的复合物的分子式为[CPP(ACP)8]n或[CPP(ACFP)8]n，其中n等于或大于1，例如6。形成的复合物可为胶状的复合物，其中中心颗粒集聚形成悬浮在水中的小(例如，约2-5nm)和大(例如，约100nm)胶状颗粒。 
所述PP可为任何来源的；其可存在于较大多肽中，包括全长度的酪蛋白多肽，或者其可通过对酪蛋白或其他富磷酸氨基酸蛋白质如磷蛋白(phosphitin)进行胰蛋白酶或其他酶消化或化学水解(例如通过碱或酸)进行分离，或者通过化学或重组合成，只要其包括如上限定的A-B-C-D-E序列。位于中心序列两侧的序列可为任何序列。然而，优选地为αs1(59-79)[1]，β(1-25)[2]，αs2(46-70)[3]和αs2 (1-21)[4]中的那些两侧序列。所述两侧序列任选地通过删除、增加或保守取代一个或多个残基进行修饰。所述两侧区域的氨基酸组成和序列并非关键。 
在一个优选的实施例中，所述PP是一种或多种选自αs1(59-79)[1]，β(1-25)[2]，αs2(46-70)[3]和αs2(1-21)[4]的酪蛋白磷酸肽。 
排除任何理论或作用模式的束缚，人们认为PP结合ACP或ACFP束产生存在于溶液中的亚稳态复合物。这种结合被认为阻止了ACP或ACFP长大到引起磷酸钙的成核和沉淀的尺寸。这样，钙和其他离子如氟离子可被定位，例如在牙齿的表面以预防去矿化并预防龋齿的形成。因此，人们认为这样提供了一种以可生物利用形式输送能再矿化牙齿的无定形磷酸钙的机制。 
在另外一个实施例中，本发明提供一种如上所述的稳定的ACFP复合物或稳定的ACP复合物，该复合物作为运输载体，所述运输载体在靶位点共定位离子，所述离子包括，但不限于钙、氟和磷酸根离子。在一个优选的实施例中，所述复合物包括以无定形形式的磷酸钙，其提供较好的防龋齿、防侵蚀/腐蚀、防结石和防牙过敏功效。所述靶位点优选地为牙齿或骨骼。 
本发明的另一方面提供一种磷酸肽稳定的无定形磷酸钙(ACP)或无定形氟磷酸钙(ACFP)复合物，其中所述复合物在pH7.0或更低形成，且其中所述ACP或ACFP主要为碱性形式。 
为了避免疑问，本发明所述磷酸肽稳定的ACP或ACFP复合物排除如WO 98/40406中所述的pH7.0以上形成的复合物。 
优选地，除了钙、磷酸根、氟和氢氧根离子以外所述复合物基本不含其他离子，尽管其确实含水分子。所述复合物还优选地以PP进行配制以使得其在水中可溶解。在本发明内容中，术语“可溶解的”还包括所述复合物被描述为胶体分散体的情况。 
在一个实施例中，所述ACP复合物基本由PP、钙、磷酸根和氢氧根离子和水组成。 
在一个实施例中，所述ACFP复合物基本由PP、钙、磷酸根、氟和氢氧根离子和水组成。 
在另一方面，本发明还提供一种制造如上所述ACP稳定复合物的方法，包括下列步骤： 
(i)获得包括至少一种磷酸肽的溶液，以及 
(ii)混合包括钙离子、磷酸根离子和氢氧根离子的溶液，同时保持pH约7.0或更低。 
在本发明这个方面的一个优选的实施例中，所述氢氧根离子用滴定法加入至溶液中以保持所述磷酸肽溶液在基本恒定的pH。在更优选的实施例中，所述钙和磷酸根离子伴随不断的搅拌并以避免在所述磷酸肽溶液中形成磷酸钙沉淀的速度用滴定法加入至所述磷酸肽溶液中。 
在另一方面，本发明还提供一种制造如上所述ACFP稳定复合物的方法，包括下列步骤： 
(i)获得包括至少一种磷酸肽的溶液，以及 
(ii)混合包括钙离子、磷酸根离子、氢氧根离子和氟离子的溶液， 同时保持pH约7.0或更低。 
在本发明这个方面的一个优选的实施例中，所述氢氧根用滴定法加入至溶液中以保持所述磷酸肽溶液在基本恒定的pH。在更优选的实施例中，所述钙、磷酸根和氟离子伴随不断的搅拌并以避免在所述磷酸肽溶液中形成磷酸钙沉淀的速度用滴定法加入至所述磷酸肽溶液中。 
所述pH可依需要通过加入氢离子(酸)或氢氧根离子(碱)调节。 
任何生理上相容或可接受的且不影响所述复合物本身的酸可用作氢离子的来源。典型地，可使用氢氯酸。任何生理上可接受的碱，例如NaOH，可用作氢氧根的来源以调节pH或者提供所述复合物形成所需的氢氧根离子。使用的精确的酸碱并不认为严格限于上述。 
在一个优选的实施例中，将高浓度的钙离子和磷酸根离子(例如，3M钙离子和1M磷酸根离子)滴入根据本发明的制造稳定ACP复合物的方法或制造稳定ACFP复合物的方法中使用的磷酸肽溶液中。优选地，以充分搅拌非常缓慢地等分加入钙离子和磷酸根离子溶液(例如每分钟约1体积％加量)。在一个优选的实施例中，在加入一等份钙离子溶液之前，加入一等份磷酸根离子溶液。优选地连续加入氢氧根离子。在一个优选的实施例中，在每次加入钙离子之后，加入所述氢氧根离子。 
本发明的另一方面提供一种制造磷酸肽稳定的无定形磷酸钙(ACP)复合物的方法，包括如下步骤： 
(i)获得包括至少一种磷酸肽的溶液，以及 
(ii)混合包括钙离子、磷酸根离子和氢氧根离子的溶液，同时保持pH约7.0或更低。 
本发明的另一方面提供一种制造磷酸肽稳定的无定形氟磷酸钙(ACFP)复合物的方法，包括如下步骤： 
(i)获得包括至少一种磷酸肽的溶液，以及 
(ii)混合包括钙离子、磷酸根离子和氢氧根离子的溶液，同时保 持pH约7.0或更低。 
本发明的另一方面提供一种包括磷酸肽稳定的ACP或ACFP复合物的配方，其中所述配方的pH低于7.0。在一个实施例中，所述配方的pH在约pH5.0至低于pH7.0之间。优选地，所述配方的pH在约pH5.0至约pH6.0之间。在一个优选的实施例中，所述配方的pH约5.5。 
因此，所述磷酸肽稳定的ACP或ACFP复合物可在约7.0及更低的pH下形成，随后置于不同pH的环境中，优选地为4至10之间的pH。在一个实施例中，所述pH在4.5和6.5之间，更优选地在5和6之间，最优选地约5.5。 
对于需要刺激骨骼生长的患者，例如经受骨折修复、关节复位、骨移植或颅面外科的治疗者，本发明的复合物有效用作钙补充剂。对于出于任何原因，例如饮食不耐受、过敏或者宗教或文化因素不能或不愿意食用足量乳制品以供应其日常钙需求的对象，这些复合物还可有效用作饮食补充剂。 
下面描述本发明的实施例，其中所述复合物的外在条件可为用于特殊目的的配方，如下面的例子。假设形成的复合物稳定，为了获得最佳效果可以如上所述调节该外在条件的pH，不考虑所述复合物最初形成的pH。 
在一个实施例中，提供了一种再矿化牙齿的方法，包括向牙齿施用如上所述的复合物，理想地在药学上可接受的载体中。所述复合物可含ACP，ACFP或两者。该方法优选地应用于需要治疗的对象。 
在本发明一个优选的实施例中，所述稳定的ACFP或ACP复合物被掺入至口腔组合物中，如牙膏、漱口水或帮助预防和/或治疗龋齿或蛀牙的口腔配方。所述ACFP或ACP复合物可占组合物0.01-50重量％，优选地1.0-50重量％。对于口用的组合物，优选地，所述PP-ACP和/或PP-ACFP的给药量为组合物的0.01-50重量％，优选地1.0％-50重量％。在特别优选地实施例中，本发明的口用组合物含约2％PP-ACP，PP-ACFP或两者混合物。含上述制剂的本发明的口用组合 物可以可应用于口腔的各种形式进行制备和使用，如包括牙膏、牙粉和牙粉和液体洁牙剂的洁牙剂、漱口水、片剂、口香糖、牙软膏、牙龈按摩膏、漱口片、奶制品和其他食品。取决于特定口用组合物的类型和形式，根据本发明的口用组合物还可包括其它已知的成分。 
在本发明某些优选的形式中，所述口用组合物本质上可基本为液体，如漱口水和漱洗水。在这样的制剂中，载体通常为理想地包括如下所述保湿剂的水醇混合物。通常地，水对醇的重量比在约1∶1至约20∶1的范围内。在这种制剂中水醇混合物的总量通常在所述制剂的约70至约99.9重量％范围内。所述醇通常为乙醇或异丙醇。优选为乙醇。 
本发明的这些液体和其他制剂的pH通常在约5至约9的范围内，典型地从约5.0至7.0。所述pH可以用酸(例如，柠檬酸和苯甲酸)或碱(例如，氢氧化钠)或缓冲化(如以柠檬酸钠、安息香酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等)进行控制。 
在一个实施例中，根据本发明的口用组合物pH为约5.5且含稳定的ACP或ACFP。 
在本发明的其它合乎需要的形式中，所述口用组合物本质上基本为固体或膏状，如牙粉、牙片或牙膏(牙乳膏)或凝胶牙粉。这些固体或膏状口用制剂的载体通常含牙齿可接受的磨光材料。磨光材料的例子为水不可溶的偏磷酸钠、偏磷酸钾、磷酸三钙，二水磷酸钙、无水磷酸二钙，焦磷酸钙、正磷酸镁、磷酸三镁、碳酸钙、水合氧化铝、煅烧氧化铝、硅酸铝、硅酸锆、二氧化硅、皂土，及其混合物。其他适合的磨光材料包括热硬化树脂微粒，如三聚氰胺-、苯酚-，和尿素-甲醛，以及交联的聚环氧化物和聚酯。优选的抛光材料包括微粒尺寸达约5微米、平均微粒尺寸达约1.1微米以及表面积达约50,000cm2/g的结晶氧化硅，硅胶或胶体氧化硅，以及复合无定形碱金属铝矽酸盐。 
当使用视觉透明的凝胶时，胶体氧化硅的磨光剂，如商标SYLOID下作为Syloid 72和Syloid 74，或商标SANTOCEL下作为Santocel 100销售的这些，碱金属铝矽酸盐复合物尤其有用，因为它们的折射率接 近通常在洁牙剂使用的凝胶剂-液体(包括水和/或保湿剂)系统的折射率。 
许多被称为“水不溶的”磨光材料为阴离子，并且还包括少量的可溶材料。同样地，不溶解的偏磷酸钠可以任何适当方式形成，例如在Thorpe’s Dictionary of Applied Chemistry，9卷，第四版，第510-511页中所举例的。被称为马得洛盐(Madrell’s salt)和库诺盐(Kurrol’ssalt)的不溶形式的偏磷酸钠为适合材料的另外例子。这些偏磷酸盐在水中仅表现出极小的溶解度，因此通常被称为不溶解的偏磷酸盐(IMP)。其中存在少量作为杂质的可溶磷酸盐物质，通常为几个百分比如达4重量％。如果需要，通过用水清洗可降低或消除可溶磷酸盐物质，在不溶的偏磷酸盐的情况下，它被认为包括可溶的三偏磷酸钠。所述不溶的碱金属铝矽酸盐通常以使得不超过1％的材料大于37微米的微粒尺寸的粉末形式使用。 
所述磨光材料通常以约10％至约99％的重量浓度存在于固体或膏状组合物中。优选地，在牙膏中存在的量从约10％至约75％，牙粉中从约70％至约99％。在牙膏中，当磨光材料为硅物质时，通常存在的量为约10-30重量％。其他磨光材料通常存在的量为约30-75重量％。 
在牙膏中，所述液体载体可包括水和保湿剂，其含量通常在制剂的约10重量％至约80重量％的范围内。甘油、丙二醇、山梨糖醇和聚丙二醇作为适合的保湿剂/载体的例子。水、甘油和山梨糖醇的液体混合物也有优势。在反射率为重要考虑因素的透明凝胶中，优选地使用约2.5-30％w/w的水，0至约70％w/w的甘油以及约20-80％w/w的山梨糖醇。 
牙膏、霜剂和凝胶通常含约0.1至约10比例，优选地约0.5至约5％w/w的天然或合成的增稠剂或凝胶剂。适合的增稠剂为合成的锂蒙脱石、可商业获得的合成的胶体镁碱金属硅酸盐复合物粘土如由Laporte工业有限公司上市的Laponite(例如，CP，SP 2002，D)。LaponiteD含有58.00重量％SiO2，25.40重量％MgO，3.05重量％Na2O，0.98 重量％Li2O，以及一些水和痕量金属。其真比重为2.53，在8％湿度时表观总体密度为1.0g/ml。 
其他适合的增稠剂包括爱尔兰苔藓、iota-角叉菜、黄蓍胶、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基丙基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素(例如，可商业获得的Natrosol)、羧甲基纤维素钠、以及硅胶如细磨的Syloid(如244)。促溶剂也包括这些保湿的多元醇，如丙二醇、二丙二醇和己二醇，溶纤剂如甲基溶纤剂和乙基溶纤剂，直链上含至少约12个碳原子的植物油和蜡如橄榄油、蓖麻油以及矿脂和酯如乙酸戊酯、乙酸乙酯和苯甲酸苄酯。 
应当理解的是，按照惯例，口用制剂以适当的标签包装进行销售或者分配。因此，口腔漱洗液的罐体具有标签，大体描述其作为口腔漱洗液或漱口水及使用说明；牙膏，霜剂或凝胶通常在可涨缩的管中，通常为铝的、衬铅的或塑料的，或其他挤压、抽吸或加压的计量排出内容物的分配器，其具有标签，大体描述其作为牙膏，凝胶或牙用霜剂。 
有机表面活性剂可用于本发明的组合物中以达到增加的预防作用，有助于达到活性剂在口腔中的完全分散，并使速溶组合物为更加化妆品上可接受的。所述有机表面活性材料优选地为阴离子的，非离子的或两性的，且优选地不与活性剂相互作用。优选地，使用赋予组合物清洁和起泡性质的清洁材料作为表面活性剂。阴离子表面活性剂的适当例子为高级脂肪酸单甘油酯单硫酸盐的水溶性盐，如氢化椰子油脂肪酸的单甘油酯单硫酸钠盐，高级烷基硫酸盐如月桂硫酸钠，烷芳基磺酸盐如十二烷基苯磺酸钠，高级烷基磺基醋酸盐，1，2-二羟基丙烷磺酸盐的高级脂肪酸酯，以及低级脂肪族氨基羧酸化合物的基本饱和的高级脂肪酸酰胺，如脂肪酸、烷基或酰基中具有12至16个碳原子的那些，及其类似物。最后提到的酰胺的例子有N-月桂酰肌氨酸，以及基本不含皂或类似高级脂肪酸物质的N-月桂酰、N-肉豆蔻酰，或N-棕榈酰肌氨酸的钠、钾和乙醇胺盐。在本发明的口用组合物中使用这些肌氨酸化合物特别有利，因为除降低牙齿釉质在酸溶液中的溶 解度之外，在抑制口腔中由于碳水化合物分解而导致的酸形成中，这些物质还表现了延长的显著效果。适于使用的水溶性非离子表面活性剂的例子为氧乙烯和与之反应的具有长疏水链(例如，约12至20个碳原子的脂肪链)的各种活性含氢化合物的缩合产物，其中缩合产物(“氧乙烯聚合物(ethoxamers)”)含亲水的聚氧乙烯单体，如聚(氧乙烯)与脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、多羟基醇(例如，单硬脂酸山梨糖醇酐酯)的缩合产物，以及聚环氧丙烷(例如，Pluronic材料)。 
表面活性剂通常存在的量为约0.1-5重量％。显著地，所述表面活性剂可有助于本发明活性剂的溶解，因而减少了所需的促溶保湿剂的量。 
在本发明的口用制剂中可掺入各种其他材料，诸如增白剂、防腐剂、硅酮、叶绿素化合物和/或含氨的材料如尿素、磷酸氢二铵，及其混合物。当存在时，这些辅料以基本不会损害所需性质和特性的量被掺入到所述制剂中。 
还可使用任何合适的香料或甜味材料。 
适合的香料组分的例子为香料油，如荷兰薄荷、胡椒薄荷、鹿蹄草、檫木、丁香、鼠尾草、桉树、马郁兰、肉桂、柠檬、橙的油和水杨酸甲酯。适合的甜味剂包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、山梨糖醇、木糖醇、环己基氨基磺酸钠、紫苏亭、AMP(天冬氨酰苯丙氨酸甲酯)、糖精，及其类似物。合适地，香料和甜味剂各自或共同占所述制剂的约0.1％至5％。 
本发明还提供上述组合物的应用。在本发明优选的实践中，根据本发明的口用组合物，如含本发明的组合物的漱口水或洁牙剂，优选地以酸性pH，优选约4.5至约7.0，有规律地应用于齿龈和牙齿，如每天、或者每两天或三天、或者优选一天1至3次，持续至少2星期至8星期或终身使用。在一个实施例中，所述口用组合物的pH约5.0、5.5、6.0、6.5或7.0。 
本发明的组合物还可掺入到锭剂，或者口香糖，或者其他产品中，例如，通过搅拌入热胶基或涂覆胶基的外表面，例子有明胶、胶乳、 乙烯基树脂等等，理想地还加有常规的增塑剂或软化剂、糖、或者其他甜味剂、或者如葡萄糖、山梨糖醇等等。 
在另一个实施例中，本发明的复合物被配制成饮食补充剂，优选地包括食物的0.1-100％w/w，更优选地1-50％w/w，最优选地1-10％w/w以及尤其2％w/w。所述复合物还可掺入到食品中。 
在另一方面，本发明提供包括药物组合物的组合物，所述组合物包含上述任何ACFP和/或ACP复合物和制药上可接受的载体。这些组合物可选自牙科抗龋齿组合物、治疗组合物和饮食补充剂。牙科组合物或治疗组合物可以凝胶、液体、固体、粉末、霜剂或锭剂的形式。治疗组合物还可以片剂或胶囊的形式。在一个实施例中，所述ACP和/或ACFP复合物基本是该组合物的唯一再矿化活性成分。 
本发明还包括一种如上所述的与其使用说明一起提供的配方以治疗或预防任何一种或多种的龋齿或蛀牙、牙侵蚀/腐蚀、牙过敏和牙结石。 
根据本发明的另一方面，提供一种牙科修复的组合物，包括加有根据本发明的ACFP和/或ACP复合物的牙科修复材料。所述牙科修复材料的基质可为玻璃离子粘固剂，一复合材料或可相容的任何其他修复材料。优选地，包含在所述牙科修复材料中的CPP-ACP复合物或CPP-ACFP复合物的量为0.01-80重量％，优选地0.5-10重量％及更优选地1-5重量％。含上述药剂的本发明的牙科修复材料可以可应用于牙科治疗的各种形式进行制备和使用。根据这个实施例的牙科修复材料还可包括其他离子，例如，抗菌离子Zn2+，Ag+等，或取决于特定牙科修复材料的类型和形式的其他另外的成分。根据这个实施例的牙科修复材料的优选地pH在2-10之间，更优选地5-9及还更优选地5-7。含所述CPP-ACP复合物或ACFP复合物的所述牙科修复材料的pH优选地在约2至10范围内，更加优选地在约5至9的范围内及还更优选地在约5至7的范围内。 
本发明还涉及一种制造修复组合物的方法。优选地，所述方法包括向基础牙科修复材料添加如上所述的ACP和/或ACFP复合物。本 发明还涉及如上所述修复组合物在龋齿治疗和/或预防上的应用。 
本发明还涉及一套组件，包括(a)牙科修复材料和(b)CPP-ACP复合物或CPP-ACFP复合物以及包括如上所述用于牙科修复的复合物的组合物制剂的使用说明书。 
本发明还涉及一套组件，包括(a)牙科修复材料(b)酪蛋白磷酸肽(c)钙离子和(d)磷酸根离子，和(e)氢氧根离子以及可选地氟离子，以及牙科修复的组合物制剂的使用说明。 
在另一方面，提供一种治疗或预防一种或多种龋齿或蛀牙、牙侵蚀/腐蚀、牙过敏和牙结石的方法，包括向患者，优选地为需要这种治疗的患者的牙齿或齿龈施用本发明的复合物或组合物的步骤。所述复合物的局部给药是优选的。所述方法优选地包括以如上所述配方的形式给药所述复合物。 
本发明还提供一种治疗和/或预防动物的龋齿、牙侵蚀/腐蚀、牙过敏和牙结石的方法，包括提供根据本发明的或依据本发明制造的所述牙科修复组合物，以及应用于需要治疗和/或预防的动物的牙齿。 
在另一方面，本发明涉及治疗一种或多种与从身体中，尤其从骨骼中流失钙相关的疾病、钙缺乏、钙吸收不良或类似疾病的方法。这种疾病的例子包括，但不限于骨质疏松症和骨软化。通常，可通过增加钙的生物利用度改善的任何疾病都可考虑。 
应当理解的是，尽管本说明书明确涉及在人体中的应用，本发明还有用于兽医用途。因而，本发明的所有方面都有用于家畜如牛、羊、马和家禽；有用于宠物如猫和狗；以及有用于动物园动物。 
具体实施方式
现在，将参考下面非限制性的实施例对本发明进行描述。 
实施例1 
CPP-ACFP和CPP-ACP溶液的配制 
将3.25M CaCl2，1.25M Na2HPO4，1M NaOH和1M NaF的储备 溶液以约30等份加入至10-15％w/v(重量体积比)的酪蛋白的胰蛋白酶消化物中直至所获最终浓度约78mM Ca2+，48mM磷酸盐和12mM氟化物。所述溶液被缓慢加入(即，低于约1体积％加入量每分钟)。先加入一等份的磷酸盐溶液，然后加入一等份的钙溶液。用NaOH通过混合将pH保持在7.0，6.5，6.0，5.5和5.0。氢氧化钠溶液由恒pH滴定仪自动添加，使在每次添加钙离子后加入氢氧离子。在加入钙离子、磷酸离子、氢氧离子和氟离子之后，将该溶液通过0.1微米的过滤器过滤以浓缩1-2倍。如果需要，可将滤渣用水清洗以除去盐或无活性(及苦味)肽。如上所述，不加入氟制成CPP-ACP溶液。 
在完成各滴定和过滤后，收集各滤渣的样品，使用3000分子量截止点的Centriprep3超滤膜，收集的滤液量低于10％。将含样品的离心管(Centriprep)在使用JA 10.5转子的Beckman公司J2-21型离心机上以1000g离心15min。对Centriprep离心前的原样品和离心后的滤液样品进行钙、磷酸根和氟的浓度分析。原样品的分析给出钙、磷酸根和氟的总浓度，滤液的分析给出自由(未结合)的钙、磷酸根和氟的浓度。总浓度和未结合浓度之差为被CPP结合的Ca、Pi和F的浓度，见表1和表2。 
在本发明的一个实施例的第一例证中，测量在酸性pH下制备的复合物中2％CPP-ACFP的结合钙、磷酸根和氟浓度，如表1所示。 
表1 
  pH   Ca  mM   磷酸根  mM   F  mM   摩尔比率  Ca∶P∶F
  7.0   75.9±1.7   45.6±1.3   10.8±0.4   7.0∶4.2∶1
  6.5   73.6±1.7   44.2±1.4   10.8±0.4   6.8∶4.1∶1
  6.0   69.4±1.8   41.8±1.3   10.9±0.4   6.4∶3.9∶1
  5.5   59.6±1.8   34.6±2.0   10.9±0.4   5.5∶3.2∶1
  5.0   41.2±2.3   23.6±1.6   11.3±0.4   3.7∶2.1∶1
[0088] 在本发明的一个实施例的第二例证中，测量在酸性pH下制备的复合物中2％CPP-ACP的结合钙、磷酸根和氟浓度，如表2所示。 
表2 
  pH   Ca  mM   磷酸根  mM   摩尔比率  Ca∶P
  7.0   61.9±1.1   37.5±1.8   1.7∶1
  6.5   58.8±1.1   36.0±1.6   1.6∶1
  6.0   52.6±1.3   32.8±1.8   1.6∶1
  5.5   43.1±1.4   27.1±1.6   1.6∶1
  5.0   23.0±2.6   13.4±1.7   1.7∶1
这个实验的结果说明，由酪蛋白磷酸肽(CPP)稳定的无定形磷酸钙和无定形氟磷酸钙的纳米复合物或纳米簇在酸性pH下形成，因为其由于高浓度集聚而在过滤步骤之后被保留。表1和2中的结合钙和磷酸根和氟的比率说明所形成的复合物含碱性无定形磷酸钙和碱性无定形氟磷酸钙(ACPP)。所述碱性ACP相为[Ca3(PO4)2]x[Ca2(PO4)(OH)]，其中对所有pH值x＝1-2。所述碱性ACFP相为[Ca3(PO4)2]x[Ca2(PO4)F]y，其中x＝1和y＝1-2(pH5.0)，以及y＝1和x＝1-2(pH5.5-7.0)。还可以看出，酸性pH下结合的钙离子和磷酸根离子量保持相对较高，直到形成物的pH降至约5.0区域。 
在不被任何理论或作用方式束缚下，人们认为，在酸性pH下通过平稳加入OH阴离子，如加入NaOH，优选伴有搅拌，以使得OH阴离子与钙离子和磷酸根(PO4 3-)离子充分形成碱性ACP，其被CPP稳定，当进一步添加OH时这驱动反应形成更多的ACP，从而实现复合物的形成。然而，在ACFP的情况中，F离子允许更低的pH环境用于复合物形成，且可从表1看出，在给定的酸性pH下ACFP复合物中结合的钙量高于相同pH下的ACP。 
实施例2 
体外酸性pH下CPP-ACP和CPP-ACFP 
对牙釉质表面下损伤再矿化的比较 
取出的人第三臼齿的抛光釉质表面被锯成厚片(8×4mm2)并覆盖有抗酸指甲油以形成1mm间隔的半咬合面、半齿龈的近中远窗口(1×7mm2)。比较所用的实验方法描述于雷诺(Reynolds)(1997)酪蛋白磷酸肽稳定的磷酸钙溶液对釉质表面下损伤的再矿化，牙科研究杂志(Remineralization of enamel subsurface lesions by caseinphosphopetide-stabilized calcium phosphate solutions.J Dent Res)76：1587-1595，这为本领域普通技术人员公知，且其内容通过引用成为本说明书的一部分。用怀特(White)的Carbopol方法，在这些窗口上产生表面下釉质损伤(Reynolds描述，1997)。釉质厚片被对半锯成4×4mm2的块体。在一块体上的半齿龈损伤和另一块体上的半咬合面损伤用指甲油密封以产生去矿化的对照。 
在37℃、无搅拌，将该釉质半损伤体曝露于不同的再矿化溶液中10天。再矿化溶液为在pH7.0、6.5、6.0、5.5和5.0下制备并保存在具有形成物的相应pH的溶液中的2％CPP-ACP或2％CPP-ACFP。 
再矿化后，各对块体在乙醇中进行脱水并包埋在甲基丙烯酸甲酯树脂(Paladur，Kulzer，德国)中。与损伤表面垂直地切下三个200-300μm的片段，部分重叠80±5μm叠放，并在10×14μm厚的增量的铝制梯级旁进行放射成像，如在先的描述(Shen等人，2001，J.Dent.Res.80：2066-2070)，其全部内容通过引用成为本说明书一部分。 
经由Dilux 22显微镜(Ernst Leitz Wetzlar，德国)，通过发射光观察损伤的放射成像图像。该图像由摄像机(索尼DXC 930P)获得并在成像软件(Optimas 6.2)的控制下被数字化(Scion图像公司，colourgrabber 7)。该损伤、对照物和铝制梯级如Shen等人(2001)所述进行扫描。测定釉质片段厚度，并使用如Shen等人(2001)所述的Angmar等式(1963)测定体积百分比矿物数据。还通过Shen等人前述的方 法计算再矿化的百分比(％R)。 
这些溶液对该釉质表面下损伤的再矿化作用在表3中示出。 
表3 
Figure S05846537020070717D000171
表3的结果说明2％CPP-ACP和CPP-ACFP溶液以显著水平再矿化釉质表面下损伤，虽然在酸性pH值下。CPP-ACP和CPP-ACFP在pH5.5产生最佳的再矿化作用。即使在常规釉质去矿化发生的pH5.0，2％CPP-ACP引起18％的再矿化，2％CPP-ACFP引起40％的再矿化，说明酸性溶液中的CPP-ACFP的优越性能。 
实施例3 
CPP-ACP在pH7.0和5.5下产生的原位釉质再矿化的比较 
本实验是双盲交叉设计，以评估与含在pH7.0下制备和保存的0.5％w/v CPP-ACP的漱口水相比，含在pH5.5下制备和保存的0.5％w/v CPP-ACP的漱口水在口腔内模型中提高釉质再矿化的能力。本研究得到墨尔本大学人类研究伦理委员会和墨尔本皇家牙科医院临床研究伦理委员会的批准。四个健康成人受试者(2名男性和2名女性)从牙科科学学院的工作人员和研究生(年龄从21至47岁)中征募。所有的受试者最少有22颗天然齿，并无龋齿、牙周疾病或其他口腔病状。没有受试者使用抗生素或可能影响唾液流速的药物。各受试者的非刺激唾液流速超过0.2ml/min。通过指示受试者向下倾斜地探出 头部，允许唾液流入预称重的离心管中正好2min，测量非刺激唾液流速。通过指示受试者食用无糖咀嚼口香糖正好2min，同时使产生的全部唾液流入预称重的离心管中，测量刺激唾液流速。 
如以前的描述(Shen等人，2001)，为各受试者制作覆盖第一前臼齿至齿弓上最后一颗牙齿的可移除中腭丙烯酸器具。 
取出的人第三颗臼齿从墨尔本皇家牙科医院获得。除去任何被取出的软组织并将牙齿保存在18％v/v福尔马林醋酸溶液中。选择无裂缝、污斑和氟中毒(在解剖显微镜下观察)的健全的、相对平的颊面和舌面，并用Milli-Q纯净水冲洗三次。取下外层釉质表面并用慢速牙钻机弯机头上的SoflexTM(3M)磨盘湿法抛光成镜面。随后，使用水冷却的金钢石刀片锯，以约8×4mm厚片从牙齿上锯下各抛光表面，并且除了两个相互间隔1mm的(咬合面的和齿龈的)近中远窗口(1×7mm)，整个厚片覆盖了抗酸性的指甲油。通过将各厚片装配在3×4cm黄色牙科粘蜡棒的末端并浸没在40ml不搅拌的去矿化缓冲液中在37℃保持4天，在釉质窗口中产生损伤，所述去矿化缓冲液包括20g/l Carbopol 907TM(聚羧乙烯，BF Goodrich，克利夫兰，俄亥俄州)，500mg/l羟磷灰石( 
Figure S05846537020070717D000181
，Bio-Rad Laboratories，里士满，加利福尼亚)，以及0.1mol/l pH4.8的乳酸(Ajax Chemicals，奥本，新南威尔士)。2天后替换溶液，替换时将厚片从溶液中取出，用Milli-Q纯净水冲洗三次，吸干水份并置于新鲜的去矿化缓冲液中。类似地，去矿化作用四天后将厚片冲洗和干燥。由人工损伤片段的X射线显微照相进行评估，这个去矿化步骤造成约80-100μm深度(LDd)的一致表面下损伤，表面层完好无缺。去矿化后，各釉质厚片通过各窗口的中心线被锯成两个4×4mm的半厚片并使各半厚片的切面覆盖上指甲油。各对半厚片之一保留为去矿化对照物并保存在含一滴Milli-Q纯净水的带标记的1.5ml微型离心管中，从而制造一个潮湿的环境。将各对的另一个釉质半厚片插入到口腔内器具中，并用再矿化方案的牙科蜡保持。小心使窗口无蜡。将四个釉质半厚片插入到各器具内，双边槽体的各边两个(Shen等人，2001)。 
试验的漱口水含0.5％w/v如实施例1中描述在pH5.5或pH7.0下制备的CPP-ACP。产品以编号产品提供。该编号保密直至获得所有的数据。这个实验以两种处理使用了双盲交叉设计：(i)含0.5％(w/v)pH7.0下的CPP-ACP的漱口水，以及(ii)含0.5％(w/v)pH5.5下的CPP-ACP的漱口水。受试者被随机分配每一种漱口水。 
在实验的开始，向全体受试者提供足够供应的标准氟化物洁牙剂，并指示他们在实验期间使用。指示受试者清晨和就寝时用氟化物洁牙剂刷牙。还指示他们在插入口腔内器具之前用水冲洗口腔。受试者戴上含亚表去矿化损伤的四个人釉质半厚片插入物的可拆卸的颚部器具。一旦将器具插入口腔后，各受试者被指示用5ml漱口水冲洗60秒。受试者继续戴用该器具另外40分钟。这样做一天4次，连续10天，在以下时刻：上午10:00；上午11:30；下午2:00和3:30。当戴上该器具的期间，告诉受试者不能吃或饮用任何东西。10天的实验期之后，有一个星期的冲洗期。然后，受试者转至其它处理。当从口腔中移出该器具时，用Milli-Q纯净水简单冲洗并保持在密封的潮湿塑料袋中，在室温保存。告知受试者不刷洗含釉质块的区域。受试者每日记录产品使用和器具佩戴次数。在实验期间，不改变受试者的饮食或口腔卫生方式。各治疗期后，移出釉质半厚片，与各自的去矿化对照釉质半厚片配对，包埋、切片，进行X射线显微照相和计算机辅助密度图像分析以测定再矿化的水平。 
每一处理后，釉质半厚片与其各自对照的半厚片配对，随后在无水乙醇中脱水。如Shen等人(2001)的描述，将各对半厚片包埋、切片，并进行X射线显微照相和计算机辅助密度图像分析。用提供0至256之间的灰度值读数的程序的线亮度功能，扫描损伤和健康釉质的附近区域的X射线图像。通过无人工制品和裂缝的区域将各损伤扫描6次。各次扫描包括从损伤至健康釉质的牙齿表面得到的200个读数。扫描每一胶片(slide)上的铝制梯级图像，绘制平均梯级灰度值读数与铝厚度的图。牙齿截面图像的读数位于梯级曲线的线性部分，线性回归用于将灰度值数据转化为同等厚度的铝的值。测量截面的厚 度，并用Angmar等人的等式以及铝，有机物质加水和磷灰石矿物的线性吸收系数(分别为131.5，11.3和260.5)计算vol％(体积百分比)矿物数据。将两损伤间的中间带的图像进行6次扫描并取平均值以给出健康釉质的对照密度曲线。中间带的牙龈面和咬合面的损伤图像(治疗窗口和去矿化对照窗口)类似地尽可能接近中间带但避免任何常在损伤边缘出现的不规则态进行扫描，计算％矿物曲线。 
各釉质半厚片的去矿化和处理过的损伤的vol％矿物曲线与相同截面的中间健康釉质vol％矿物曲线进行比较。去矿化对照损伤和中间健康釉质的密度曲线下面积的差由梯形积分法计算，表示为ΔZd。处理过的损伤和中间健康釉质的密度曲线下面积的差由梯形积分法计算，表示为ΔZr。随后，这些参数转化成处理后的％变化值，同样地，％矿物变化(％MC)表示ΔZ值的％变化： 
% MC = ΔZd - ΔZr ΔZd × 100 .
使用随机完全区组设计(Norusis M.1993)的方差分析(ANOVA)统计学检验3种处理的数据。用Levene′s检验确定方差的均匀性，用正态概率图和Kolmogorov-Smimov检验确定数据的正态性。所有的统计学分析用SPSS version 11.0软件(Norusis M.1993)进行。 
一旦获得釉质再矿化值的全部数据，揭开编号并对去编号数据进行分析。表4中的结果表示4位受试者的平均％MC值，各受试者的数据是从各器具中的四个釉质半厚片的各片段进行的12次扫描获得(牙龈和咬合面的损伤各6次)。使用含0.5％(w/v)pH5.5的CPP-ACP的漱口水产生14.16±1.90％釉质表面下损伤的再矿化，而使用含0.5％(w/v)pH7.0的CPP-ACP的漱口水仅造成10.31±2.28％釉质亚表表面的再矿化。该差异具有统计学意义(p＜0.01)。这些数据显示在pH5.5形成的CPP-ACP比在pH7.0形成的CPP-ACP具有高37％的原位釉质再矿化效率，从而验证了实施例3获得的体外结果。 
表4 
含0.5％(w/v)pH7.0或pH5.5的CPP-ACP的 
漱口水的原位釉质表面下损伤的再矿化作用 
治疗 ΔZd  LDd ΔZd-ΔZr ％MC
 0.5％CPP-ACP(pH5.5) 1726±368  100.5±9.1  246.2±68.2  14.2±1.99(37％)a
 0.5％CPP-ACP(pH5.5) 1104±340  82.4±10.4  115.4±46.0  10.3±2.3
a.高出pH7.0漱口水的增加的再矿化百分比 
实施例4 
在这个实施例中，提供了许多配方以举例说明本发明的复合物可配成前面一般描述的不同目的的组合物的方式。这些仅是使用各种本发明的实施例提供的配方类型的例子。 
含CPP-ACP或CPP-ACFP的牙膏配方 
配方1
配方2
Figure S05846537020070717D000221
配方3
Figure S05846537020070717D000222
Figure S05846537020070717D000231
配方4
Figure S05846537020070717D000232
配方5
Figure S05846537020070717D000233
Figure S05846537020070717D000241
配方6
Figure S05846537020070717D000242
漱口水配方 
配方1
配方2
锭剂配方 
Figure S05846537020070717D000253
Figure S05846537020070717D000261
口香糖配方 
Figure S05846537020070717D000262
应当理解的是在本说明书中公开和限定的发明覆盖一个或多个正文或附图提及或示出的单独技术特征的结合。所有这些不同的结合构成本发明各种可选择的方案。 

Claims (19)

1.一种酪蛋白磷酸肽稳定的无定形磷酸钙复合物，其中所述复合物在5.0至低于7.0的pH下形成，以及其中所述复合物中的无定形磷酸钙主要包括Ca2+、PO4 3-和OH-，所述复合物由包括下列步骤的方法制备：
（i）获得包括至少一种酪蛋白磷酸肽的溶液，其中所述酪蛋白磷酸肽包括序列A-B-C-D-E，其中A，B，C，D和E独立地为磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸，磷酸酪氨酸，磷酸组氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，以及
（ii）混合包括钙离子、磷酸根离子和氢氧根离子的溶液，同时保持pH 5.0至低于7.0。
2.一种酪蛋白磷酸肽稳定的无定形氟磷酸钙复合物，其中所述复合物在5.0至低于7.0的pH下形成，以及其中所述复合物中的无定形氟磷酸钙主要包括Ca2+、PO4 3-和F-，所述复合物由包括下列步骤的方法制备：
（i）获得包括至少一种酪蛋白磷酸肽的溶液，其中所述酪蛋白磷酸肽包括序列A-B-C-D-E，其中A，B，C，D和E独立地为磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸，磷酸酪氨酸，磷酸组氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，以及
（ii）混合包括钙离子、磷酸根离子、氟离子和氢氧根离子的溶液，同时保持pH 5.0至低于7.0。
3.根据权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述酪蛋白磷酸肽从通过酶或化学水解的全长度酪蛋白中分离。
4.根据权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述酪蛋白磷酸肽选自：αs1(59-79)，β(1-25)，αs2(46-70)和αs2(1-21)。
5.根据权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述复合物在pH 5.0至6.0的范围下形成。
6.根据权利要求5所述的复合物，其特征在于，所述复合物在5.5的pH下形成。
7.根据权利要求1或2所述的复合物，其还包括药学上可接受的载体。
8.一种制造权利要求1所述的酪蛋白磷酸肽稳定的无定形磷酸钙复合物的方法，包括下列步骤：
（i）获得包括至少一种酪蛋白磷酸肽的溶液，其中所述酪蛋白磷酸肽包括序列A-B-C-D-E，其中A，B，C，D和E独立地为磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸，磷酸酪氨酸，磷酸组氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，以及
（ii）混合包括钙离子、磷酸根离子和氢氧根离子的溶液，同时保持pH 5.0至低于7.0。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氢氧根离子用滴定法加入至磷酸肽溶液中以保持基本恒定的pH。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述钙和磷酸根离子伴随不断的搅拌和以避免在所述磷酸肽溶液中形成磷酸钙沉淀的速度用滴定法加入至所述磷酸肽溶液中。
11.一种制造权利要求2所述的酪蛋白磷酸肽稳定的无定形氟磷酸钙复合物的方法，包括下列步骤：
（i）获得包括至少一种酪蛋白磷酸肽的溶液，其中所述酪蛋白磷酸肽包括序列A-B-C-D-E，其中A，B，C，D和E独立地为磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸，磷酸酪氨酸，磷酸组氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，以及
（ii）混合包括钙离子、磷酸根离子、氟离子和氢氧根离子的溶液，同时保持pH 5.0至低于7.0。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述氢氧根离子用滴定法加入至磷酸肽溶液中以保持基本恒定的pH。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述钙和磷酸根离子伴随不断的搅拌并以避免在所述磷酸肽溶液中形成磷酸钙沉淀的速度用滴定法加入至所述磷酸肽溶液中。
14.根据权利要求8或11所述的方法，其特征在于，所述酪蛋白磷酸肽通过酶或化学水解从全长度酪蛋白中分离。
15.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的复合物在制备一种用于治疗或预防龋齿的药剂中的应用。
16.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的复合物在制备一种用于再矿化牙齿釉质的药剂中的应用。
17.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的复合物在制备一种用于治疗或预防牙结石的药剂中的应用。
18.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的复合物在制备一种用于治疗或预防牙过敏的药剂中的应用。
19.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的复合物在制备一种用于治疗或预防牙侵蚀/腐蚀的药剂中的应用。
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