CN112499607B - 用于多磷酸肽富集及磷酸化位点鉴定的纳米磷酸钙的制备方法及其产品和应用 - Google Patents

用于多磷酸肽富集及磷酸化位点鉴定的纳米磷酸钙的制备方法及其产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于多磷酸肽富集及磷酸化位点鉴定的纳米磷酸钙的制备方法及其产品和应用，该制备方法包括以下步骤：在偏碱性溶液中，依次加入钙盐水溶液、磷酸盐水溶液，搅拌，反应结束后干燥，得到纳米磷酸钙材料。本发明中因为钙离子与磷酸根之间强的相互作用，纳米磷酸钙能够有效实现对多磷酸肽的选择性富集和磷酸化位点的鉴定；同时本发明方法制备的磷酸钙纳米材料是一种合成简单，成本低廉且稳定性高的生物功能材料，在磷酸化蛋白质组学研究中具有广阔的应用前景。

Description

用于多磷酸肽富集及磷酸化位点鉴定的纳米磷酸钙的制备方 法及其产品和应用
技术领域
本发明涉及多磷酸肽选择性富集材料，具体涉及一种用于多磷酸肽富集及磷酸化位点鉴定的纳米磷酸钙的制备方法及其产品和应用。
背景技术
蛋白质磷酸化修饰是生物体内最重要的翻译后修饰之一，调节着生命活动中许多重要过程，包括细胞增殖、分化、凋亡及新陈代谢等。蛋白质磷酸化不仅包含单磷酸化修饰还包含多磷酸化修饰，其中多磷酸化修饰及其位点的鉴定对于蛋白质的生物活性影响更加显著。例如，成人脑中微管蛋白Tau是一种重要的多磷酸化蛋白，其最长的异构体形式(Tau441)共含80个丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)残基，这些位点均是潜在的磷酸化位点。研究表明，Tau蛋白的异常多磷酸化会造成脑神经细胞中的神经元功能丧失和神经元数目减少，这将直接导致阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的发生。(Analytical ChimiaActa,2016，940:21-37)理解各个异常磷酸化位点所扮演的角色对于开发以Tau蛋白为靶标用以治疗AD的药物有重要意义。然而，Tau蛋白中存在的潜在磷酸化位点众多，因为技术手段受限目前发现的磷酸化位点非常有限，某些尚未发现的磷酸化位点以及这些位点是否存在其他未知的调控机制还不是很清楚。因此，多磷酸化蛋白及其磷酸化位点的有效鉴定能够明晰许多重要的生物学过程，为疾病治疗或者生物学行为研究提供坚实的依据。研究蛋白质多磷酸化修饰就离不开质谱分析之前对磷酸化肽段进行选择性富集这一必要前处理手段。
近年来，研究者在磷酸肽的选择性富集前处理技术方面已经开展了大量工作并取得了重要成果，包括固定金属亲和色谱、免疫沉淀反应、离子交换色谱以及金属氧化物亲和色谱等一系列技术。(Trends in Analytical Chemistry,2016,78:70-83.)然而，常规技术只能从非磷酸肽中分离得到磷酸肽(包括单磷酸肽和多磷酸肽)，并不能直接分离得到多磷酸肽。而当多磷酸肽与单磷酸肽共存时，却有着更差的离子化效率和更低的丰度，其质谱信号被强烈抑制，继而影响了多磷酸化蛋白的质谱鉴定和位点的有效分析。但多磷酸化蛋白以及位点的鉴定对于生物学过程又是如此重要，因此，非常有必要发展系列富集技术使其能够选择性地从单磷酸肽和非磷酸肽混合物中分离富集多磷酸肽，以提高多磷酸肽的质谱鉴定率进而有效地检测到更多的多磷酸化蛋白和磷酸化位点。
尽管多磷酸肽因为其独特的生物学性能，其富集研究逐渐被关注。然而，相比于从非磷酸肽的混合物中分离富集磷酸肽的研究来讲，现有报道多磷酸肽富集涉及到的功能材料种类非常有限且多为复合材料。(Nature Communications,2013,4:1656.)复合材料的制作往往需要特殊的实验装置和高超的合成技术，这将大大限制了其在有关生物，医学等研究磷酸化蛋白质组学领域的实验室正常使用，非常不利于磷酸化蛋白生物功能的深入研究。因此，寻求一些简单易制又对多磷酸肽有较高选择性的“大众”化功能材料是推进多磷酸化蛋白生物功能研究的关键。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种简易的功能材料纳米磷酸钙的制备方法，制备得到纳米磷酸钙可有效应用于多磷酸肽富集及其磷酸化位点鉴定。
本发明还提供制备得到的纳米磷酸钙和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种用于多磷酸肽富集及磷酸化位点鉴定的纳米磷酸钙的制备方法，包括以下步骤：
在偏碱性溶液中，依次加入钙盐水溶液、磷酸盐水溶液，搅拌，反应结束后干燥，得到纳米磷酸钙材料。
其中，所述钙盐选自氯化钙、硝酸钙等相关钙盐。
其中，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或者磷酸氢二铵等相关磷酸盐。
其中，所述偏碱性溶液的pH为6-12，可选用双蒸水，氨水，NaOH等碱性溶液。
作为优选，所述钙盐与磷酸盐的摩尔比1:5-5:1。
进一步地，所述搅拌为磁力搅拌，条件为5-60min，200-800rpm。
作为优选，所述的钙盐水溶液、磷酸盐水溶液混合速度为0.1-10mL/min。
其中，所述干燥方法包括冷冻干燥，烘干或者自然干燥等其他相关干燥手段。
本发明所述的纳米磷酸钙的制备方法所制备的纳米磷酸钙材料。
作为优选，所述纳米磷酸钙在特定pH条件下呈现不同的形貌，但多为片状或者球状。
本发明所述的纳米磷酸钙材料在多磷酸肽富集及其磷酸化位点鉴定中的应用。
其中，所述多磷酸肽来源于β-casein，α-casein，Tau蛋白以及P53等相关磷酸化蛋白酶切产物以及牛奶，血清，尿液及细胞等生物组织里相关磷酸化蛋白酶切产物。
本发明利用钙盐和磷酸盐为原料在室温和一定pH条件下搅拌一定时间制得纳米磷酸钙材料，可用于多磷酸肽选择性富集以及根据富集的多磷酸肽借助质谱进行多磷酸化位点的鉴定。
从磷酸肽(单磷酸肽及多磷酸肽)和非磷酸肽混合物中选择性富集多磷酸肽，进而有效对多磷酸化蛋白及位点分析是磷酸化蛋白质组学研究中面临的主要瓶颈之一。目前，多磷酸肽特异性富集研究仍处于起步阶段，所用富集材料种类有限且合成方法复杂，这既不利于多磷酸肽富集机理的阐明，更不利于在生化背景强而合成背景弱的蛋白质组学实验室中推广应用。本发明利用多磷酸肽的独特性质结合纳米磷酸钙中钙离子与磷酸根之间强的相互作用，有效实现了对多磷酸肽的选择性富集和磷酸化位点的鉴定。同时，本发明方法制备的磷酸钙纳米材料是一种合成简单，成本低廉且稳定性高的生物功能材料，在磷酸化蛋白质组学研究中具有广阔的应用前景。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明制备的纳米磷酸钙材料制备方法简单，仅在一小时之内在宽的pH条件(pH＝6-12)下便可得到磷酸钙纳米材料。制备过程不需要特殊的实验装备和合成条件，这为其在生化背景强而合成背景弱的蛋白质组学实验室中推广应用奠定了条件。
2、本发明制备的纳米磷酸钙材料制备原料仅是常用的磷酸盐和钙盐。简单的原材料不仅成本低廉，且易于控制和操作，大大减少了后续质谱中来源于杂质的污染问题。
3、本发明制备的纳米磷酸钙材料性质稳定，在室温干燥环境中放置一年后对多磷酸肽的富集能力无任何变化。高稳定性的材料便于在生物，医学等蛋白质组学实验室中储存和使用。
4、本发明制备的纳米磷酸钙材料绿色无污染，有利于规模化应用。
附图说明
图1为纳米磷酸钙材料的透射电镜图，其中图1a为pH＝8条件下制备的纳米磷酸钙材料的透射电镜图，从图中可以看出本发明在此条件下磷酸钙为片层纳米材料；图1b为pH＝9条件下制备的纳米磷酸钙材料的透射电镜图，从图中可以看出本发明在此条件下磷酸钙为球状纳米材料；
图2为制备方法中纳米磷酸钙材料的X射线衍射图，与磷酸钙标准卡相比结果表明样品为磷酸钙纳米晶体；
图3为β-casein(40pmol)酶解产物(a)以及40pmol单磷酸肽(SinglePhosphopeptide,S)和40pmol多磷酸肽(Multi-phosphopeptide,M)的混合物(c)未经材料富集MALDI-TOF质谱图，(b)和(d)为纳米磷酸钙材料富集后MALDI-TOF质谱图，其中#:脱磷酸化碎片峰；
图4为纳米磷酸钙常温放置一年前(a)后(b)对多磷酸肽(M)富集性能测试；
图5为纳米磷酸钙对多磷酸肽(M)选择性富集重复利用第一次(a)，第二次(b)和第三次(c)。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行说明。
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料均可从商业途径获得。
实施例1
配制pH＝11的氨水溶液；
在锥形瓶中加入上述pH的氨水溶液10mL，100uL 0.5MCaCl2溶液，磁力搅拌(500rpm)4min得到A体系；
在另一个锥形瓶中加入上述pH的氨水溶液10mL，120uL 0.25M Na2HPO4溶液，磁力搅拌(500rpm)4min得到B体系；
将B体系在磁力搅拌状态下以5mL/min滴加至A体系中，磁力搅拌(500rpm)10min。反应结束后冻干得到水溶性磷酸钙纳米材料。
实施例2
纳米磷酸钙在多磷酸肽富集中的应用
1、洗脱液：5mL ACN+4900uL H2O+100uL体积分数10％TFA；洗提液：体积分数10％氨水溶液。
2、以典型磷酸化蛋白β-casein(40pmol)蛋白酶切产物或者40pmol单磷酸肽和40pmol多磷酸肽的肽段混合物(单磷酸肽：CSKNQI(p-S)TLDFS；多磷酸肽：CRGVHHID(p-Y)(p-Y)KKTSN，摩尔比：1:1)为代表，用10uL洗脱液溶解，将实施例1制备的1mg纳米磷酸钙材料加入其中涡旋30min；然后，用洗脱液洗脱3次，每次2min，离心获得沉淀物；最后，用洗提液加入沉淀物中超声10min，涡旋8min洗提，离心取上清，获取多磷酸肽。
β-casein酶切肽段在未经过材料富集直接质谱分析时，只有2条单磷酸肽(β1,β3)被观察到，而且大量非磷酸肽同时被检测到(图3a)。然而，纳米磷酸钙却对多磷酸肽(β3)有更加特异的选择性富集能力，而其对单磷酸肽β1和β2却呈现较低的选择性富集能力(图3b)。与β-casein酶切肽段富集结果相似，商品化单磷酸肽和多磷酸肽的混合物直接分析时，单磷酸肽质谱峰强度明显强于多磷酸肽(图3c)。然而，经过纳米磷酸钙选择性富集后，只有多磷酸肽被选择性富集而单磷酸肽质谱峰消失(图3d)。由此可见，纳米磷酸钙对多磷酸肽呈现出较高的选择性富集能力。
此外，纳米磷酸钙在放置一年后采用上述相同的方法对多磷酸肽的富集性能几乎没有任何改变(图4)，显示了纳米磷酸钙高稳定性。同时，纳米磷酸钙在选择性富集多磷酸肽时，可以进行3次及以上的重复利用，表明其较好的重复性(图5)。以上特性为纳米磷酸钙的商品化应用奠定了非常好的基础。
实施例3
实施例3与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：配制pH＝8的氨水溶液。
本实施例制备的纳米磷酸钙材料的透射电镜如图1a所示，从图中可以看出本发明在此条件下磷酸钙为片层纳米材料；
本实施例制备的纳米磷酸钙材料的X射线衍射图如图2所示，与磷酸钙标准卡相比结果表明样品为磷酸钙纳米晶体。
实施例4
实施例4与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：配制pH＝9的氨水溶液。本实施例制备的纳米磷酸钙材料的透射电镜如图1b所示，从图中可以看出本发明在此条件下磷酸钙为球状纳米材料。
实施例5
实施例5与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：采用pH为6双蒸水，CaCl2溶液改用硝酸钙溶液；Na2HPO4溶液改用磷酸氢二钠；B体系在磁力搅拌状态下按照0.1mL/min缓慢滴加至A体系中；磁力搅拌800rpm，5min；自然干燥得到水溶性磷酸钙纳米材料。
实施例6
实施例6与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：采用pH为12NaOH溶液，Na2HPO4溶液改用磷酸氢二钾；B体系在磁力搅拌状态下按照10mL/min缓慢滴加至A体系中；磁力搅拌200rpm，60min。
实施例7
实施例7与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：Na2HPO4溶液改用磷酸氢二铵。
实施例8
实施例8与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：钙盐与磷酸盐的摩尔比1:5。
实施例9
实施例9与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：钙盐与磷酸盐的摩尔比5:1。
实施例10
实施例10与实施例2的检测方法相同，不同之处在于：β-casein酶解物改用α-casein，Tau蛋白或者P53等相关磷酸化蛋白的多磷酸肽富集及多磷酸修饰位点鉴定。
实施例1
实施例11与实施例2检测方法相同，不同之处在于：β-casein酶解物改用牛奶，血清，尿液或者细胞等生物组织里相关磷酸化蛋白的多磷酸肽富集及多磷酸修饰位点鉴定。

Claims (9)

1.一种纳米磷酸钙材料在多磷酸肽富集及其磷酸化位点鉴定中的应用，所述纳米磷酸钙的制备方法，包括以下步骤：在偏碱性溶液中，依次加入钙盐水溶液、磷酸盐水溶液，搅拌，反应结束后干燥，得到纳米磷酸钙材料。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述钙盐选自氯化钙或者硝酸钙。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或者磷酸氢二铵。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述偏碱性溶液的pH为6-12。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述偏碱性溶液为氨水或者NaOH溶液。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述钙盐与磷酸盐的摩尔比1:5-5:1。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述搅拌为磁力搅拌，条件为5-60min，200-800rpm。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述干燥方法包括冷冻干燥，烘干或者自然干燥。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米磷酸钙呈现片状或者球状。
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