CN108348439A - 包含羟基磷灰石结合蛋白质的口腔护理产品和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了包含HABP的口腔护理组合物，其可用于修复或抑制牙齿侵蚀、促进牙齿再矿化和/或增强氟化物的抗龋洞效应的方法。

Description

包含羟基磷灰石结合蛋白质的口腔护理产品和方法

背景

牙釉质是覆盖牙冠的钙化材料的薄而坚硬的层。牙釉质的主要矿物成分是羟基磷灰石，它是磷酸钙的结晶形式。牙釉质的化学侵蚀可能来自牙齿暴露于酸性食物和饮品以及由胃逆流引起的胃酸。由于牙本质小管的暴露增加，牙釉质的侵蚀可导致牙齿敏感性增加，并且牙本质可见度的增加也导致出现更多黄牙。唾液膜(沉积在牙齿上的唾液糖蛋白薄层)是保护牙齿免受侵蚀性挑战的必要条件之一。因此，罹患口腔干燥症的人更容易受到酸蚀损伤。

为帮助防止釉质侵蚀而开发的现有方法包括将游离氟化物源加入到口腔护理组合物中。氟化物通过形成氟磷灰石而减少对釉质的伤害，氟磷灰石在低于羟基磷灰石的pH下溶解，因此更耐酸性损伤。类似地，亚锡盐也已被掺入洁齿剂制剂中，通过形成更耐酸的矿物质层以保护釉质表面。也描述了用于涂覆和保护釉质表面的聚合物。

当含有致龋菌的菌斑代谢碳水化合物时，口腔中也会产生酸。由于斑块形成控制质子和矿物质通过釉质扩散的动力学的屏障，斑块的酸引起龋损。将氟离子掺入洁齿剂制剂中是减轻菌斑酸影响的最常见方法。氟化物降低去矿化速率并增强再矿化。已经开发了几种方法来稳定磷酸钙盐或控制菌斑pH以增强再矿化。

尽管已经开发了减轻牙齿上的非细菌和细菌产生的酸的作用的方法，但仍然需要提供改良的口腔护理组合物，其能够有效地修复由酸侵蚀和细菌酸所影响的釉质。

简述

发明人出乎意料地发现羟基磷灰石结合多肽(HABP)有效修复或减轻牙齿侵蚀的影响，促进牙齿再矿化，并增强氟化物的抗龋洞效应。

例如，在一项实施方案中，制备HABP用于含有合适的口腔可接受的载体成分的制剂，所述制备通过在缓冲液中稀释，例如磷酸盐缓冲液如Na2HPO4缓冲液(1.5mM)和CaCl₂(2.5mM)，以提供具有约中性或弱碱性pH的缓冲溶液，例如pH 7-8，例如约pH 7.5，将该溶液过滤并离心，得到包含HABP的滤液。可将杀生物剂(例如0.1％的西吡氯铵)和氟化物加入到滤液中。然后可以将HABP与口腔可接受的载体(例如牙膏或漱口剂基质)的组分组合，以提供用于修复或减轻牙齿侵蚀的影响、促进牙齿再矿化和增强氟化物的抗龋洞效应的口腔护理组合物。

本文涉及口腔护理组合物(组合物1)，例如洁齿剂，包含：

a)HABP；

b)口腔可接受的载体，

其中所述HABP以所述组合物总重量的0.01重量％至3重量％的量存在于所述组合物中。例如，本文提供了：

1.1.组合物1，其中HABP具有SEQ ID NO:1、2、3、4的多肽序列。

1.2.任何上述组合物，其包含氟化物。

1.3.任何上述组合物，其中所述HABP已例如使用磷酸盐缓冲液中和至约中性或弱碱性pH，例如pH7-8。

1.4.任何上述组合物，其中所述HABP以有效浓度、例如0.1％的滤液重量包含杀生物剂如西吡氯铵(CPC)。

1.5.任何上述组合物，其中所述HABP以组合物总重量的0.1重量％至3重量％的量存在于所述组合物中，例如0.2重量％至2重量％，例如约0.2重量％、约1重量％、约1.5重量％、约2重量％。

1.6.任何上述组合物，其中所述组合物包含有效量的氟化物。

1.7.任何上述组合物，其包含100ppm-2500ppm的氟化物的量，例如250ppm-750ppm，如约500ppm氟化物。

1.8.任何上述组合物，其包含口腔可接受的锌盐或氧化物，例如选自氧化锌、柠檬酸锌、乳酸锌、磷酸锌、乙酸锌、氯化锌、与氨基酸形成的锌复合物，以及任何前述的混合物，例如其中锌的量按锌离子重量计为0.1重量％至3重量％，例如约1至约2重量％。

1.9.任何上述组合物，其包含口腔可接受的亚锡盐，例如SnF₂或SnCl₂。

1.10.任何上述组合物，其中所述组合物为选自漱口水、牙膏、牙胶、牙粉、非研磨性凝胶、摩丝、泡沫、口腔喷雾剂和片剂的形式，例如洁齿剂，如牙膏或漱口水。

1.11.任何上述组合物，其中所述组合物还包含一种或多种选自以下的试剂：摩擦剂、pH调节剂、表面活性剂、泡沫调节剂、增稠剂、粘度调节剂、湿润剂、防牙石或牙垢控制剂、甜味剂、调味剂和着色剂。

1.12.任何上述组合物，其中所述组合物是牙膏。

1.13.任何上述组合物，其包含一种或多种可溶性磷酸盐，例如其中“可溶性磷酸盐”是指口腔可接受的磷酸盐，其在25℃下在水中的溶解度为至少1g/100ml；例如其中所述一种或多种可溶性磷酸盐是焦磷酸和/或聚磷酸的钠盐和/或钾盐，例如三聚磷酸盐；例如其中所述一种或多种可溶性磷酸盐包括焦磷酸四钠(TSPP)、三聚磷酸钠(STPP)或TSPP与STPP的组合；例如，其中所述一种或多种可溶性磷酸盐以组合物的重量计为1-20％、例如2-8％、例如约5％的量存在。

1.14.任何上述组合物，其中氟化物由选自以下的盐提供：氟化亚锡、氟化钠、氟化钾、单氟磷酸钠、氟硅酸钠、氟硅酸铵、氟化胺(例如N'-十八烷基三亚甲基二胺-N,N,N'-三(2-乙醇)-二氢氟酸盐)、氟化铵、氟化钛、六氟硫酸盐及其组合。

1.15.任何上述组合物，其为包含保湿剂例如选自甘油、山梨醇、丙二醇、聚乙二醇、木糖醇及其混合物的洁齿剂，例如包含按所述组合物重量计至少30％、例如40-50％的甘油。

1.16.任何上述组合物，其为包含一种或多种例如选自阴离子、阳离子、两性离子和非离子表面活性剂及其混合物的表面活性剂的洁齿剂，例如其中洁齿剂基质包含阴离子表面活性剂，例如选自月桂基硫酸钠、月桂基醚硫酸钠及其混合物的表面活性剂，例如其量为所述组合物重量的约0.3％至约4.5％重量、例如1-2％月桂基硫酸钠(SLS)。

1.17.任何上述组合物，其为包含两性离子表面活性剂例如甜菜碱表面活性剂、例如椰油酰胺基丙基甜菜碱的洁齿剂，例如其量为所述组合物重量的约0.1％至约4.5％重量、例如0.5-2％的椰油酰胺基丙基甜菜碱。

1.18.任何上述组合物，其为包含粘度调节量的一种或多种多糖胶质例如黄原胶或角叉菜胶、硅石增稠剂及其组合的洁齿剂。

1.19.任何上述组合物，其是包含胶质条或碎片的洁齿剂。

1.20.任何上述组合物，其包含调味剂、香料和/或着色剂。

1.21.任何上述组合物，其是包含有效量的一种或多种抗菌剂的洁齿剂，例如包含选自以下的抗菌剂：卤代二苯醚(例如三氯生)、草本提取物和精油(例如迷迭香提取物、茶提取物、木兰提取物、麝香草酚、薄荷醇、桉叶醇、香叶醇、香芹酚、柠檬醛、桧木醇、儿茶酚、水杨酸甲酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、没食子酸、牙刷树(miswak)提取物、沙棘提取物)、双胍(bisguanide)防腐剂(例如氯己定、阿来西定或奥替尼啶)、季铵化合物(例如西吡氯铵(CPC)、苯扎氯铵、十四烷基氯化吡啶(TPC)、N-十四烷基-4-乙基吡啶鎓氯化物(TDEPC))、酚类防腐剂、海克替啶、奥替尼啶、血根碱、聚维酮碘、地莫匹醇、Salifluor、金属离子(例如锌盐如柠檬酸锌、亚锡盐、铜盐、铁盐)、血根碱、蜂胶和氧化剂(例如过氧化氢、缓冲的过氧硼酸钠盐或过氧碳酸钠盐)、苯二甲酸及其盐、单过氧苯二甲酸(monoperthalic acid)及其盐和酯、抗坏血酸硬脂酸酯、油酰肌氨酸、烷基硫酸盐、磺基琥珀酸二辛酯、水杨酰苯胺、度米芬、地莫匹醇、辛哌醇及其它哌啶子基衍生物、烟酸制剂、亚氯酸盐；以及任何上述的混合物；例如包含三氯生或西吡氯铵。

1.22.任何上述组合物，其是包含增白剂的洁齿剂，所述增白剂例如选自过氧化物、金属亚氯酸盐、过硼酸盐、过碳酸盐、过氧酸、次氯酸盐及其组合；例如过氧化氢或过氧化氢源，例如脲过氧化物或过氧化物盐或复合物(例如过氧磷酸盐、过氧碳酸盐、过硼酸盐、过氧硅酸盐或过硫酸盐；例如过氧磷酸钙、过硼酸钠、碳酸钠过氧化物、过氧磷酸钠和过硫酸钾)。

1.23.任何上述组合物，其是包含干扰或防止细菌附着的试剂例如对羟基苯甲酸乙酯或壳聚糖的洁齿剂。

1.24.任何上述组合物，其是包含可溶性钙盐的洁齿剂，所述可溶性钙盐例如选自硫酸钙、氯化钙、硝酸钙、乙酸钙、乳酸钙及其组合。

1.25.任何上述组合物，其是包含生理上或口腔可接受的钾盐例如硝酸钾或氯化钾的洁齿剂，所述钾盐的量为有效降低牙本质敏感性的量。

1.26.任何上述组合物，其是包含阴离子聚合物的洁齿剂，所述阴离子聚合物例如合成的阴离子聚合物型聚羧酸盐，例如其中所述阴离子聚合物选自马来酸酐或马来酸与另一种可聚合的烯属不饱和单体的1:4至4:1共聚物；例如，其中阴离子聚合物是甲基乙烯基醚/马来酸酐(PVM/MA)共聚物，其具有约30,000至约1,000,000、例如约300,000至约800,000的平均分子量(M.W.)，例如其中阴离子聚合物为组合物重量的约1-5％、例如约2％。

1.27.任何上述组合物，其是包含口气清新剂、香料或调味剂的洁齿剂。

1.28.任何上述组合物，其中所述组合物的pH约为中性，例如约pH 7。

1.29.任何上述组合物，其用于减少和抑制酸侵蚀、清洁牙齿、减少细菌产生的生物膜和斑块、减少牙龈炎、抑制蛀牙和龋洞形成，并减少牙本质过敏。

1.30.任何上述组合物，其用于减少、抑制或修复牙釉质侵蚀。

1.31.任何上述组合物，其用于促进牙釉质的再矿化。

1.32.任何上述组合物，其用于增强氟化物的抗龋洞效应。

组合物1的一项具体的新实施方案是包含以下成分的洁齿剂：

a)HABP；例如包含至少20.0％的干物质、至少2.5％的总氮、4.0-5.0的pH值以及1.0％或更低的灰分含量；其中部分水解的小麦蛋白已被中和至约中性或略微碱性pH；

b)任选的有效量的氟化物；

c)口腔可接受的载体，

例如其中HABP的量是0.1重量％至2重量，且

例如其中氟化物是以100ppm至1000ppm，例如约500ppm的量存在。

在一个方面，本公开物提供了组合物1等中的任何一种，其用于修复或抑制牙齿侵蚀、促进再矿化、和/或增强氟化物的抗龋洞效应；例如用于根据方法1等的以下方法中的任何一种。

另一方面，本公开物提供了修复或抑制牙齿侵蚀、促进牙齿再矿化和/或增强氟化物的抗龋洞效应的方法(方法1)，其包括向牙齿施用组合物，例如组合物1等中的任何一种，例如口腔护理组合物，所述组合物包含：

a)HABP

b)口腔可接受的载体，

其中所述HABP以所述组合物总重量的0.01重量％至3重量％的量存在于所述组合物中。例如，本公开物提供：

1.1.方法1，其中HABP具有SEQ ID NO:1、2、3、4的多肽序列。

1.2.任何上述方法，其中HABP包含氟化物。

1.3.任何上述方法，其中将HABP例如使用磷酸盐缓冲液中和至约中性或弱碱性pH，例如pH7-8。

1.4.任何上述方法，其中所述HABP以有效浓度、例如0.1％的滤液重量包含杀生物剂如西吡氯铵(CPC)。

1.5.任何上述方法，其中所述HABP以组合物总重量的0.1重量％至3重量％的量存在于所述组合物中，例如0.2重量％至2重量％，例如约0.2重量％、约1重量％、约1.5重量％或约2重量％。

1.6.任何上述组合物，其中所述组合物包含有效量的氟化物。

1.7.任何上述方法，其中氟化物的量是100ppm-1000ppm，例如约500ppm氟化物。

1.8.任何上述方法，其中所述组合物为选自漱口水、牙膏、牙胶、牙粉、非研磨性凝胶、摩丝、泡沫、口腔喷雾剂和片剂的形式。

1.9.任何上述方法，其中所述组合物还包含一种或多种选自以下的试剂：摩擦剂、pH调节剂、表面活性剂、泡沫调节剂、增稠剂、粘度调节剂、湿润剂、防牙石或牙垢控制剂、甜味剂、调味剂和着色剂。

1.10.任何上述方法，其中所述组合物是洁齿剂，例如牙膏。

1.11.任何上述方法，其中所述组合物是选自上文所述的组合物1等的任何一种。

1.12.任何上述方法，其是用于减少、抑制或修复牙齿侵蚀、例如釉质侵蚀的方法，例如其中将组合物施用于已被鉴定为患有牙齿侵蚀或具有牙齿侵蚀升高风险的患者的牙齿。

1.13.任何上述方法，其是用于促进牙齿再矿化、例如釉质的再矿化的方法，例如其中将组合物施用于已被鉴定为具有去矿化的患者的牙齿。

1.14.任何上述方法，其是用于增强氟化物的抗龋洞效应的方法，例如其中将组合物施用于患者的牙齿，所述患者已经被鉴定为具有蛀牙早期迹象例如早期釉质龋洞，或者被鉴定为具有活动中的侵蚀或蛀牙风险增加。

1.15.1.15所述的方法，其中所述组合物包含有效量的氟化物和/或其中所述方法还包括施用口腔护理产品，所述口腔护理产品包含有效量的氟化物口腔清洗剂或含有有效量的氟化物的牙膏。

在另一个实施方案中，本公开物提供了HABP在制备口腔护理组合物中的用途，所述组合物例如根据组合物1等中的任一项，用于例如方法1等中的任何一种的修复或抑制牙齿侵蚀、促进再矿化和/或增强氟化物的抗龋洞效应。

另一方面，本公开物提供了制备口腔护理产品的方法(方法2)，所述产品为例如用于修复或抑制牙齿侵蚀、促进牙齿再矿化和/或增强氟化物的抗龋洞作用的口腔护理产品，例如根据组合物1等任一项的产品，所述方法包括：

a)通过用缓冲水溶液例如磷酸盐缓冲溶液稀释来中和HABP以获得具有大约中性或弱碱性pH例如pH 7-8的溶液；

b)过滤并离心a)的溶液产物以获得包含HABP的滤液；

c)向b)的滤液产物中加入氟化物(例如以口腔可接受的含氟盐如氟化钠或单氟磷酸钠的形式)，并任选地加入杀生物剂(例如西吡氯铵，其有效量为例如滤液重量的0.01-1％，例如约0.1％)；

d)将c)的产物与口腔可接受的载体组分混合以获得包含HABP的口腔护理组合物，所述HABP的量为组合物总重量的0.01重量％至3重量％。

例如，本公开物提供了包含HABP的口腔护理组合物，例如根据组合物1等中任一种的组合物，其中所述口腔护理组合物通过方法2等的方法获得或可通过方法2等的方法获得。

根据下文提供的详细描述，本发明的其它应用领域将变得很明显。应该理解，详细描述和具体实例虽然说明了本发明的优选实施方案，但仅用于说明的目的，并不意图限制本发明的范围。

详细描述

优选实施方案的以下描述在本质上仅仅是示例性的，不以任何方式限制本发明、其应用或用途。

如全文所用，范围用作描述在该范围内的各个和每个值的简写。范围内的任何值都可以选择作为范围的终点。此外，本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入。如果本公开物中的定义和引用的参考文献中的定义有冲突，则以本公开物为准。

除非另有说明，否则此处和说明书其它地方表达的所有百分比和量应理解为指重量百分比。给出的量是基于物质的有效重量。

羟基磷灰石结合多肽(HABP)

根据本发明的羟基磷灰石结合多肽(HABP)是被设计用于特异性结合作为牙釉质主要成分的羟基磷灰石、用于促进牙齿再矿化并且用于增强氟化物的抗龋洞效应的多肽。

1.HABP可以由通式(I)描述：

a_0-1–b_0-10-y_1-10-c_0-10-d_0-1 (I)

其中

a、d 各自独立地代表疏水蛋白(hydrophobin)或抗冻蛋白序列或口腔护理活性成分，例如清凉化合物、抗微生物化合物、增白化合物

b、c 各自独立地代表氨基酸

y 代表以SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16所示的多肽序列。

HABP具有核心序列(“y”)，其是选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16的多肽，优选的序列y是SEQ ID NO：1、2、3、4。HABP可以具有一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个y序列。在多个y序列的情况下，y可以是相同的(“同聚物”)或不同的(“异聚物”)，或者部分相同和部分不同。例如，y₃可以代表多肽SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：11，即21个氨基酸。

HABP可以在y的氨基和/或羧基末端具有另外的氨基酸b_0-10和c_0-10。“b”和“c”代表20种天然氨基酸中的任何一种(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)，并且下标0-10代表无(0)、一(1)、两(2)、三(3)......直到十(10)个氨基酸。在例如四个氨基酸的情况下，四个氨基酸可以相同或不同。例如，b₄可代表Ala-Gly-Ser-Ser。序列“b”和“c”是间隔区或附加序列，其有时是通过克隆各基因片段(限制酶或引物的识别位点)产生，并且通常对羟基磷灰石结合或者牙齿再矿化增强没有特异性作用。如果需要，序列“b”和“c”可含有在口腔中发生的蛋白酶的切割侧。

b和c的优选氨基酸是具有非大体积侧链的不带电的氨基酸，例如Gly、Ala、Ser、Thr。

此外，HABP除了包含“y”以及“b”和/或“c”(如果希望的话)以外，还可包含可以是疏水蛋白多肽和/或抗冻蛋白(AFP)或口腔护理活性成分的其它多肽“a”和/或“d”。例如，HABP的一个实施方案可以具有与y序列融合的疏水蛋白多肽，y之后是另一疏水蛋白。HABP的另一个实施方案可以是与y序列融合的AFP多肽(“a”)，所述y序列再与另一个y序列融合，另一个y序列后面是口腔护理活性成分分子。

疏水蛋白指能够在疏水/亲水界面自组装的一类明确定义的蛋白质(Wessels,1997,Adv.Microb.Physio.38:1-45；Wosten,2001,Annu Rev.Microbiol.55:625-646)，并具有保守序列：

X_n-C-X_5-9-C-C-X_11-39-C-X_8-23-C-X_5-9-C-C-X_6-18-C-X_m

其中X代表任何氨基酸，并且n和m独立地表示整数。通常地，疏水蛋白具有多达125个氨基酸的长度。保守序列中的半胱氨酸残基(C)是二硫桥的一部分。在本发明的上下文中，术语疏水蛋白具有更宽的含义，包括功能等效的蛋白质，其仍然表现出在疏水-亲水界面处自组装的特征以产生蛋白质膜，或其部分仍显示在疏水-亲水界面处自组装的特征以导致产生蛋白质膜。根据本发明的定义，自组装可以通过将蛋白质吸附到Teflon上并使用圆二色性来确定存在二级结构(通常是α-螺旋)来检测(De Vocht等人,1998,Biophys.J.74:2059-68)。

通过在蛋白质溶液中孵育Teflon片、然后用水或缓冲液洗涤至少三次，可以形成膜(Wosten等人,1994,Embo.J.13:5848-54)。蛋白质膜可以通过任何合适的方法可视化，例如用荧光标记物标记或通过使用荧光抗体，如本领域已建立的那样。m和n通常具有范围从0到2000的值，但更通常地是m和n的总数小于200或300。本发明中疏水蛋白的定义包括疏水蛋白和另一种多肽的融合蛋白以及疏水蛋白和其它分子如多糖的缀合物。

迄今为止确定的疏水蛋白通常分为I类或II类。这两种类型已经在真菌中被鉴定为分泌蛋白，其在疏水-亲水界面自组装成两亲性膜。

疏水蛋白可以通过从天然来源例如丝状真菌中通过任何合适的方法提取而获得。例如，可通过培养将疏水蛋白分泌到生长培养基中的丝状真菌或通过用60％乙醇从真菌菌丝体中提取来获得疏水蛋白。特别优选从天然分泌疏水蛋白的宿主生物中分离疏水蛋白。优选的宿主是丝孢菌(例如木霉)、担子菌和子囊菌。特别优选的宿主是食品级生物体，例如寄生隐丛赤壳菌(Cryphonectria parasitica)，其分泌一种疏水蛋白，称为板栗疫病菌疏水蛋白(cryparin)(Maccabe和Van Alfen,1999,App.Environ.Microbiol 65:5431-5435)。

或者，疏水蛋白可以通过使用重组技术获得。例如，可以修饰宿主细胞(通常为微生物)以表达疏水蛋白，然后可以按照本发明分离和使用疏水蛋白。用于将编码疏水蛋白的核酸构建体引入宿主细胞的技术在本领域中是公知的。已经从超过16种真菌物种克隆了超过34种编码疏水蛋白的基因(参见例如WO96/41882，其给出在双孢子蘑菇(Agaricusbisporus)中鉴定的疏水蛋白序列；以及Wosten,2001,Annu.Rev.Microbiol.55:625-646)。重组技术也可用于修饰疏水蛋白序列或合成具有所需/改进的性质的新型疏水蛋白。通常，合适的宿主细胞或生物用编码所需疏水蛋白的核酸构建体转化。编码多肽的核苷酸序列可以插入合适的编码转录和翻译所必需元件的表达载体中，并以这样的方式在合适的条件下表达(例如以适当的方向和正确的阅读框和具有适当的靶向和表达序列)。构建这些表达载体所需的方法是本领域技术人员熟知的。

多种表达系统可用于表达多肽编码序列。这些包括但不限于细菌、真菌(包括酵母)、昆虫细胞系统、植物细胞培养系统和用适当的表达载体转化的植物。优选的宿主是被认为是食品级的那些-“通常被认为是安全的”(GRAS)。

合适的真菌物种包括酵母，例如(但不限于)酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、裂殖酵母属等的那些，以及丝状物种，例如(但不限于)曲霉属、木霉属、毛霉属、链孢霉属、镰刀菌属等的那些。

编码疏水蛋白的序列在氨基酸水平上优选与天然鉴定的疏水蛋白质相比至少80％相同，更优选至少95％或100％相同。然而，本领域技术人员可以进行不降低疏水蛋白的生物学活性的保守取代或其它氨基酸改变。对于本发明，这些与天然存在的疏水蛋白具有该高水平同一性的疏水蛋白也包含在术语“疏水蛋白”中。

可以通过例如WO01/57076中描述的方法从培养基或细胞提取物中纯化疏水蛋白，所述方法包括将含疏水蛋白的溶液中存在的疏水蛋白吸附到表面，然后将该表面与表面活性剂例如吐温20接触，以从表面洗脱疏水蛋白。也参见Collenet等,2002,Biochim BiophysActa.1569:139-50；Calonje等人,2002,Can.J.Microbiol.48:1030-4；Askolin等人,2001,Appl Microbiol Biotechnol.57:124-30；和De Vries et al.,1999,Eur J Biochem.262:377-85。通常地，所述疏水蛋白为分离形式，通常为至少部分纯化，例如至少10％纯(基于固体的重量)。“分离形式”是指疏水蛋白不以天然表达疏水蛋白的天然存在的有机体(如蘑菇)的一部分加入。相反，疏水蛋白通常从天然存在的来源中提取或通过在宿主生物体中重组表达获得。

疏水蛋白可分为两类：难溶于水的I类和易溶于水的II类。

优选地，所选择的疏水蛋白是I类疏水蛋白。更优选地，使用的疏水蛋白是I类疏水蛋白，例如DewA、RodA。疏水蛋白可以来自单一来源或多种来源，例如两种或更多种不同疏水蛋白的混合物。本发明组合物中疏水蛋白的总量通常为基于组合物总重的至少0.001％，更优选至少0.005或0.01％，并且通常为不超过2％的疏水蛋白总重。

本发明中使用的定义中的疏水蛋白还包含疏水蛋白和另一种蛋白质的融合蛋白。这些可以用通式(II)来描述：

X_n-C¹-X_1-50-C²-X_0-5-C³-X_1-100-C⁴-X_1-100-C⁵-X_1-50-C⁶-X_0-5-C⁷-X_1-50-C⁸-X_m (II)

其中X可以是20种天然存在的氨基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)中任何一种，并且X的下标表示氨基酸的数目，其中下标n和m是0至500之间的数，优选15-300，并且C是半胱氨酸，条件是至少一个缩写为X_n或X_m的肽序列是长度为至少20个氨基酸的肽序列，其在天然条件下不与疏水蛋白连接，该多肽在涂布玻璃表面后改变接触角至少20°。

由C¹至C⁸指定的半胱氨酸可以是还原形式或在本发明的蛋白质中彼此形成二硫键。特别优选分子内形成C-C桥，特别是具有至少一个，优选2个，特别优选3个，非常特别优选4个分子内二硫键的那些，所述分子内二硫键选自下组：C₁与C₂；C₃与C₄、C₅与C₆、C₇与C₈。

如果半胱氨酸也用于由X指定的位置，则通式中各个半胱氨酸位置的编号可以相应地改变。

特别有利的多肽是通式(III)的那些：

X_n-C¹-X_3-25-C²-X_0-2-C³-X_5-50-C⁴-X_2-35-C⁵-X_2-15-C⁶-X_0-2-C⁷-X_3-35-C⁸-X_m (III)

其中X可以是20种天然存在的氨基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)中任何一种，并且X的下标表示氨基酸的数目，其中下标n和m为2至300之间的数，C为半胱氨酸，条件是至少一个缩写为X_n或X_m的肽序列为长度至少35个氨基酸的肽序列，其在天然条件下不与疏水蛋白连接，该多肽在涂布玻璃表面后改变接触角至少20°。

非常有利的多肽是通式(IV)的那些：

X_n-C¹-X_5-9-C²-C³-X_11-39-C⁴-X_2-23-C⁵-X_5-9-C⁶-C⁷-X_6-18-C⁸-X_m (IV)

其中X可以是20种天然存在的氨基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)中任何一种，并且X的下标表示氨基酸的数目，其中下标n和m为0至200之间的数值，C为半胱氨酸，条件是至少一个缩写为X_n或X_m的肽序列为长度至少40个氨基酸的肽序列，其在天然条件下不与疏水蛋白连接，该多肽在涂布玻璃表面后改变接触角至少20°。

所述发明的优选实施方案是具有通式结构式(I)、(II)或(III)的多肽，该结构式包含至少一种I类疏水蛋白，优选至少一种dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basf1、basf2、疏水蛋白或其部分或衍生物。所述疏水蛋白以下面列出的序列在结构上表征。可以有多个、优选2或3个结构相同或不同的疏水蛋白彼此连接并且与相应的合适的在天然条件下不与疏水蛋白的肽序列连接。

本发明特别优选的实施方案是具有SEQ ID NO:17(dewA)、SEQ ID NO:18(rodA)、SEQ ID NO:19(HypA)、SEQ IDNO:20(HypB)、SEQ ID NO:21(Sc3)、SEQ ID NO:22(BASF1)、SEQ ID NO:23(BASF2)所述的多肽序列的疏水蛋白。

本发明的蛋白质在至少一个缩写为X_n或X_m的位置上具有包含至少20、优选至少35、特别优选至少50、特别是至少100个氨基酸的多肽序列(下文称为融合伴侣)，其在天然条件下不与疏水蛋白连接。这旨在表达这样的事实，即本发明的蛋白质由疏水蛋白部分和融合伴侣部分组成，它们在自然界中不以这种形式一起出现。

融合伴侣部分可以选自多种蛋白质。也可以将多个融合伴侣连接至一个疏水蛋白部分，例如在疏水蛋白部分的氨基末端(X_n)和羧基末端(X_m)处。然而，也可以将例如两个融合伴侣连接至本发明蛋白质的单个位置(X_n或X_m)。

特别合适的融合伴侣是在微生物中天然存在的多肽，特别是在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中。此类融合伴侣的实例是序列yaad(SEQ ID NO：24)、yaae(SEQ ID NO：25)，导致新的疏水蛋白融合蛋白例如SEQ ID NO:26和NO:27产生。另一个优选的融合伴侣是硫氧还蛋白。非常有用的还有所述序列的片段或衍生物，其仅包含所述序列的一部分、优选70-99％、特别优选80-98％，或者其中单个氨基酸或核苷酸与所述序列相比已被改变。例如，其它氨基酸、特别是两个其它氨基酸，优选氨基酸Arg、Ser，可以连接到yaad和yaae序列的C末端。与天然存在的序列相比，可以优选将其它氨基酸，例如氨基酸2号(Gly)插入yaae或yaad序列中。

AFP是指抗冻蛋白(AFP)，其是来自生物体的蛋白质，例如某些允许其在零度以下环境中存活的脊椎动物、植物、真菌和细菌。AFP也被称为冰结构蛋白。AFP与小冰晶结合以抑制冰的生长和再结晶，否则这些冰对于生物体将是致命的。AFP的共同特征是热滞后，其是熔点和冰点之间的差异。在固体冰和液态水之间的界面处添加AFP会抑制冰晶的热力学有利的生长。AFP覆盖冰的水可接触表面，从而在动力学上抑制冰的生长。可在实验室中使用纳升渗透压计容易地测定热滞后。

来自不同生物体的AFP没有共同的共有序列，Crit Rev Biotechnol.2008；28:57-82.,Properties,potentials,and prospects of antifreeze proteins，Venketesh S1,Dayananda C.；Journal of Experimental Biology 2015；218:1846-1855.,Animal ice-binding(antifreeze)proteins and glycolipids:an overview with emphasis onphysiological function,John G Duman。

可用于本发明的AFP是来自鱼类例如美洲大绵鳚(macrozoarces americanus)的AFP，或来自植物例如多年生黑麦草(Lolium perenne)的AFP。优选的AFP是来自昆虫的。有两种已知类型的昆虫AFP，即拟步行虫属(Tenebrio)和赤翅甲(Dendroides)的AFP，它们都属于不同的昆虫科。它们彼此相似，并且由大约8.3-12.5kD的不同数目的12或13个氨基酸的重复单元组成。特别优选的来自昆虫的AFP是来自云杉色卷蛾(choristoneurafumiferana)的AFP。

特别优选的AFP是具有以下多肽序列的那些：

BM 82(SEQ ID NO:28),

BM 80(SEQ ID NO:29),

BM 83(SEQ ID NO:30)。

本发明意义上的AFP还可指融合在一起的AFP的多个拷贝(即多聚体)，例如两个或三个具有相同结构(即同聚体)或不同结构(即异聚体)的AFP形成“超级AFP”。例如，来自鱼的AFP可以与来自昆虫的AFP融合在一起，或者两个相同的鱼AFP融合在一起。

此外，除了“y”以及“b”和/或“c”(如果希望)以外，HABP还可包含可以是口腔护理活性成分的其它活性成分“a”或“d”。

口腔护理活性成分是指化合物，特别是可能对牙齿或口腔具有有益的、保护性的、治疗性的(例如氯己定)或美容作用的低分子量化合物(例如右泛醇((+)-(R)-2,4-二羟基-N-(3-羟基丙基)-3,3-二甲基丁酰胺)，维生素E)。口腔护理活性成分包括在口腔中具有抗微生物效果的物质如三氯生，或在口腔中产生凉爽感觉的化合物如薄荷醇，或甚至一些刺激剂如咖啡因。在本发明的意义上，牙齿增白化合物也可用作口腔护理活性成分。

清凉化合物如薄荷醇是本领域技术人员已知的并且描述于例如在专利申请US20150086491A1中。清凉化合物的已知实例包括薄荷醇、薄荷酮、N-乙基-对-薄荷烷甲酰胺(WS-3，也称为薄荷烷-3-甲酸-N-乙基酰胺)、N-2,3-三甲基-2-异丙基丁酰胺(WS-23)、乳酸薄荷基酯(ML)、薄荷酮甘油缩醛(MGA)、琥珀酸单薄荷基酯戊二酸单薄荷基酯、O-薄荷基甘油和薄荷基-N,N-二甲基琥珀酰胺酸酯。

因此，本发明的HABP是长度为七个氨基酸至几百个氨基酸的多肽。所有HABP都具有一个或两个或三个或多达10个y序列并且可能还有一些间隔区或末端氨基酸b和c以及可能包含一些选自疏水蛋白和/或AFP和/或口腔护理活性成分(例如清凉化合物、抗微生物化合物、增白化合物)的其它成分。只有一个y序列的最短HABP已经具有特异性的羟基磷灰石结合和牙齿再矿化性质。通过额外的序列a和或d，即疏水蛋白和/或AFP蛋白，对牙釉质/牙本质表面的附加性质分别增强这种再矿化性质。

HABP可以通过肽合成的已知方法化学制造，例如根据Merrifield的固相合成法。该方法特别优选用于较小的HABP，例如链长为7至18个氨基酸的肽。

然而，特别有用的是用于制造的基因方法，其中编码HABP的核酸序列、特别是DNA序列以这样的方式组合，使得组合的核酸序列的基因表达在宿主生物体中产生所需的蛋白质。

此处合适的宿主生物体(生产性生物)可以是原核生物(包括古细菌)或真核生物，特别是包括盐杆菌(halobacteria)和甲烷球菌(methanococci)的细菌、真菌、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，特别优选大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、米曲霉(Aspergillus oryzea)、构巢曲霉、黑曲霉、巴斯德毕赤酵母、假单胞菌物种、乳杆菌、多形汉逊酵母、里氏木霉(Trichoderma reesei)、SF9(或相关细胞)等。

本发明还涉及表达构建体，其包含在调控核酸序列的遗传控制下编码本发明多肽的核酸序列，还涉及包含至少一种所述表达构建体的载体。

优选这类本发明构建体，其包含在具体编码序列5'上游的启动子和在3'下游的终止子序列，以及在合适时还有其它常规调控元件，在每种情况下可操作地连接到所述编码序列。

“可操作的连接”指启动子、编码序列、终止子和在合适时的其它调控元件以这样的方式顺序排列，即每个调控元件能够根据其与表达编码序列相关的预期用途来实现其功能。

可操作的连接的序列实例是靶向序列和增强子、多腺苷酸化信号等。其它调控元件包含可选择的标记物、扩增信号、复制起点等。合适的调控序列的实例描述在Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,SanDiego,CA(1990)中。

除了这些调控序列之外，这些序列的天然调控可能仍然存在于实际结构基因的上游，并且在合适时已经被遗传修饰以使天然调控被关闭且基因的表达已经增加。

优选的核酸构建体还有利地包含一个或多个已经提到的增强子序列，其与启动子功能性连接并且能够使得核酸序列的表达增加。其它有利的序列例如其它调控元件或终止子也可以插入DNA序列的3'末端。

本发明的核酸可以以一个或多个拷贝存在于构建体中。在合适时，该构建体可以包含其它标记物，例如抗生素抗性或补充营养缺陷型的基因，用于选择构建体。

对于本发明方法有利的调节序列的实例存在于启动子如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、lacIq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、λ-PR或λ-P启动子，它们有利地用于革兰氏阴性菌。在革兰氏阳性菌启动子amy和SP02中、在酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中还存在有利的调节序列的其它实例。也可使用人工启动子进行调控。

为了在宿主生物体中表达，有利地将核酸构建体插入载体中，例如质粒或噬菌体，其使基因能够在宿主中最佳表达。除了质粒和噬菌体之外，载体还指技术人员已知的任何其它载体，即例如病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、粘粒以及直链或环状DNA以及农杆菌系统。

这些载体可以在宿主生物体中自主复制或者可以在染色体中复制。这些载体构成本发明的另一个实施方案。适合的质粒实例是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III”3-B1、tgt11或pBdCl，链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽孢杆菌中的pUB110、pC194或pBD214，棒杆菌中的pSA77或pAJ667，真菌中的pALS1、pIL2或pBB116，酵母中的2α、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23，或植物中的pLGV23、pGHIac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述质粒是可能的质粒的一小部分。其它质粒对技术人员来说是熟知的并可在例如“克隆载体”书中找到(Pouwels P.H.等人编辑，Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)。

有利地是，为了表达存在的其它基因，核酸构建体另外还包含用于增加表达的3'-和/或5'-末端调控序列，其根据宿主生物体和所选基因的最佳表达进行选择。

这些调控序列旨在使基因和蛋白质表达能够特异性表达。根据宿主生物体，这可能意味着，例如该基因仅在诱导后才表达或过表达，或者其立即表达和/或过表达。

就此而言，调控序列或因子可以优选地对引入的基因的基因表达具有有益影响并由此增加基因表达。因此，通过使用强转录信号如启动子和/或增强子可以有利地在转录水平上增强调控元件。然而，除此之外，例如也可以通过改善mRNA稳定性来增强翻译。

在载体的另一个实施方案中，包含本发明的核酸构建体或本发明的核酸的载体还可以有利地以直链DNA的形式引入微生物中并通过异源或同源重组的方式整合到宿主的基因组中。所述直链DNA可以由直链化载体如质粒组成，或者仅由本发明的核酸构建体或核酸组成。

为了实现生物体中异源基因的最佳表达，根据生物体中所用的特定密码子选择来修饰核酸序列是有利的。密码子选择可以根据计算机分析所述生物体的其它已知的基因来容易地确定。

本发明的表达盒是通过将合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止子信号或聚腺苷酸化信号融合来制备。为此目的，使用文献中所描述的熟悉的重组和克隆技术，例如T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)以及T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)以及Ausubel,F.M.等人,Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience(1987)中所述。

为了在合适的宿主生物体中表达，有利地将重组核酸构建体或基因构建体插入到宿主特异性载体中，其使得基因能够在宿主中最佳表达。载体对于本领域技术人员是熟知的并且可以在例如“克隆载体”中找到(Pouwels P.H.等人编辑，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)。

本发明的载体可以用于制备重组微生物，其例如用至少一种本发明的载体转化并且可以用于制备本发明的多肽。有利地，将本发明的上述重组构建体引入合适的宿主系统中并在合适的宿主系统中表达。在此优选使用本领域技术人员已知的常规克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，以便在特定表达系统中表达所述核酸。合适的系统如以下文献中所述，例如Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel等人编辑，Wiley Interscience,New York 1997，或Sambrook等人MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989。

根据本发明也可以制备同源重组微生物。为此目的，制备包含至少一部分本发明基因或编码序列的载体，在合适时，引入至少一个氨基酸缺失、添加或取代以修饰，例如功能性地破坏本发明的序列(敲除载体)。所引入的序列可以是例如同样来自相关微生物的同源物或来源于哺乳动物、酵母或昆虫来源。或者，可以将用于同源重组的载体设计使其内源基因突变或在同源重组过程中以某种其它方式被修饰，但仍编码功能性蛋白质(例如，上游调节区可能已经以修饰内源蛋白质表达的方式被修饰)。本发明基因的修饰片段位于同源重组载体中。用于同源重组的合适载体的构建例如在Thomas,K.R.和Capecchi,M.R.(1987)Cell 51:503中所述。

任何原核生物或真核生物原则上都适合用作本发明核酸或核酸构建体的重组宿主生物体。有利使用的宿主生物体是微生物，如细菌、真菌或酵母。有利地使用革兰氏阳性或革兰氏阴性菌，优选以下菌科：肠杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、链霉菌科或诺卡尔菌科，特别优选以下菌属：埃希氏菌属、假单胞菌属、链霉菌属、诺卡尔菌属、伯克霍尔德氏菌属、沙门氏菌属、农杆菌属或红球菌属。

根据宿主生物体，本发明方法中使用的生物体以本领域技术人员已知的方式生长或培养。微生物通常在液体培养基中生长，所述液体培养基包含通常为糖形式的碳源、通常以有机氮源如酵母提取物或盐如硫酸铵形式的氮源、微量元素如铁、锰、镁盐以及合适的话还包含维生素，在0-100℃、优选10-60℃的温度下生长，同时用氧气充气。营养液的pH可以在此处保持或不保持在固定值，即在生长期间调节。生长可能会按批次、半批次或连续发生。营养素可在发酵开始时首先引入或随后半连续或连续进料。酶可以使用实施例中描述的方法从生物体中分离或将其以粗提物用于反应。

本发明还涉及重组生产本发明的多肽或其功能性的生物活性片段的方法，所述方法包括培养产生多肽的微生物，在合适时诱导所述多肽的表达并从培养物中分离它们。以此方式，多肽也可在需要时以工业规模生产。重组微生物可以通过已知方法培养和发酵。例如，细菌可以在TB培养基或LB培养基中并且在20至40℃的温度和6至9的pH下繁殖。合适的培养条件详细描述于例如T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)。

如果多肽不分泌到培养基中，则将细胞破碎并通过已知的分离蛋白质的方法从裂解物中分离产物。细胞可以任选地通过高频超声波，高压例如在法国压力室中，通过渗透压裂解，通过洗涤剂作用，水解酶或有机溶剂的作用，通过使用匀浆器或所列出的这几种方法的组合进行破碎。

多肽可以通过已知的色谱方法例如分子筛色谱(凝胶过滤)如Q-琼脂糖色谱、离子交换色谱和疏水色谱，以及还可通过其它常规方法如超滤、结晶、盐析、透析和天然凝胶电泳进行纯化。合适的方法例如Cooper,F.G.,Biochemische Arbeitsmethoden[原标题：Thetools of biochemistry],Verlag Water de Gruyter，Berlin，New York或Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin中所述。

本发明的另一个实施方案是根据式I的新型HABP：

a_0-1-b_0-10-y_1-10-c_0-10-d_0-1 (I)

其中

a、d 各自独立地代表疏水蛋白或抗冻蛋白序列或口腔护理活性成分

b、c 各自独立地代表氨基酸

y 代表以SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：61所述的多肽序列。

优选的HABP是其中y代表SEQ ID NO：1、2、3、4的那些。

SEQ ID NO：1 IDDYTRA

SEQ ID NO：2 HPPLHHA

SEQ ID NO：3 SPSTHWK

SEQ ID NO：4 GSPATAA

SEQ ID NO：5 GKVQAQS

SEQ ID NO：6 YPVTPSI

SEQ ID NO：7 IPTLPSS

SEQ ID NO：8 YQGASEN

SEQ ID NO：9 EHITTSN

SEQ ID NO：10 RILITIP

SEQ ID NO：11 IPITNLR

SEQ ID NO：12 TTSTRHI

SEQ ID NO：13 NERALTL

SEQ ID NO：14 MQTVEVT

SEQ ID NO：15 SWGTQTD

SEQ ID NO：16 TLPASSV

在一些实施方案中，HABP以组合物总重量的0.01重量％至3重量％的量存在于组合物中。在一些实施方案中，HABP以组合物总重量的0.1重量％至3重量％、或0.1重量％至2重量％、或0.1重量％至1重量％的量存在于组合物中。在其它实施方案中，HABP以组合物总重量的0.05重量％至1重量％、或0.1重量％至0.5的量存在于组合物中。在其它的实施方案中，HABP以组合物总重量的0.5重量％至3重量％、或0.5重量％至2重量％、或0.5重量％至1重量％的量存在于组合物中。在更进一步的实施方案中，HABP以组合物总重量的1重量％至3重量％，或1重量％至2重量％的量存在于组合物中。

口腔护理活性成分可以以“HBAP肽-口腔护理活性成分-杂合分子”的形式与所述HBAP肽偶联。优选形成“HBAP肽-清凉化合物杂合分子”。本领域技术人员熟悉口腔护理活性成分例如清凉化合物与HBAP肽的偶联。各种方法的适用性取决于口腔护理活性成分、优选清凉化合物上的官能团的可用性。HBAP肽上的活性基团包括氨基、羧基、羟基和巯基。优选通过HBAP肽的末端氨基或末端羧基的偶联。

在一个实施方案中，口腔护理活性成分、优选清凉化合物直接与HBAP肽偶联。

在一个实施方案中，口腔护理活性成分、优选清凉化合物通过双官能连接体/交联剂/间隔物与HBAP肽偶联。多种分子是可用的，并且本领域技术人员能够选择最合适的分子。

交联剂可以选自同双官能交联剂和异双官能交联剂。同双官能交联剂是具有两个相同反应基团的交联剂，并且通常用于一步反应过程以使蛋白质/肽/口腔护理活性成分相互交联。

本发明的异双官能交联剂具有能够先后(两阶段)缀合的两个不同的反应性基团，有助于最小化不希望的聚合或自身缀合。可能的部分如胺、巯基、羧基、酚和碳水化合物可能是反应的靶标。这种两步策略允许修饰具有不同可接近基团的分子。这种两步策略允许修饰具有不同的可接近基团的分子。合适的交联剂的非限制性实例包括在一端为胺反应性且在另一端为巯基反应性的那些。在顺序操作中，异双官能试剂可以与一个反应伙伴反应，例如首先使用交联剂的最具反应性的基团。除去过量的未反应的交联剂后，可以将改变后的第一反应伙伴加入到含有第二反应伙伴的溶液中，其中可以发生通过交联剂的第二反应基团的反应。

合适的异双官能交联剂包括在一端具有胺反应性琥珀酰亚胺酯(例如NHS-酯)而在另一端具有巯基反应性基团的那些。巯基反应性基团通常是马来酰亚胺、吡啶基二硫化物和α-卤代乙酰基。NHS-酯反应性在水溶液中可能较不稳定，因此可能首先在顺序交联程序中反应。NHS-酯可以与胺反应形成酰胺键。

碳二亚胺是零长度交联剂(例如EDC)并且可以影响羧酸盐(-COOH)和伯胺(-NH₂)之间的直接偶联。其它合适的异双官能试剂可以具有一个反应性基团，其是光反应性的而不是热反应性的。这种反应性可首先允许热反应性基团的特异性连接；随后，可以用紫外光激活通过光反应性基团引发与任何相邻N-H或C-H位点的缀合。光化学试剂的反应性可以允许形成用基团特异性试剂可能不能实现的缀合物。SFAD(磺基琥珀酰亚胺基(全氟代叠氮基苯甲酰氨基＝乙基-1,3'-二硫代丙酸酯)是含有插入效率约70％的全氟苯基叠氮化物的可光活化试剂的实例。

其他合适的连接体/间隔物/交联剂可商购获得(例如在网站上(www.thermo.com/pierce)交联剂选择指南以相关参数和特征“交联技术手册”列出)。非限制性实例包括反应性交联剂基团及其官能团靶标和/或胺/羧基、胺/巯基、磺基-SMCC胺/巯基、MBS胺/巯基、磺基-MBS胺/巯基、SMPB胺/巯基、磺基-SMPB胺/巯基、GMBS胺/巯基和磺基-GMBS胺/巯基。本领域技术人员很熟悉选择合适的化合物和相应的偶联反应。

合适的交联剂包括聚(乙二醇)(PEG)，因为已知其通常是惰性的并且在肽和感兴趣的活性分子之间提供亲水间隔基。连接体的间隔区链的长度可以根据连接体远端连接的肽或其它分子的大小而变化。然而，优选一至二十个乙二醇单元的长度。

合适的连接体/间隔物/交联剂包括二羧酸(例如草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、癸二酸、十三碳二酸、十六烷二酸)和二胺(例如乙二胺和相关衍生物包括N-烷基化化合物、1,1-二甲基乙二胺、1,1-二甲基乙二胺、乙胺丁醇和TMEDA；1,3-二氨基丙烷；腐胺(丁烷-1,4-二胺)；尸胺(戊烷-1,5-二胺)；六亚甲基二胺；亚苯基二胺；2,5-二氨基甲苯；二甲基-4-亚苯基二胺、N,N'-二-2-丁基-1,4-亚苯基二胺；4,4'-二氨基联苯；1,8-二氨基萘)。

所描述的通过交联剂与肽结合的清凉化合物包括但不限于薄荷醇和薄荷醇衍生物(例如L-薄荷醇、D-薄荷醇、外消旋薄荷醇、异薄荷醇、新异薄荷醇、新薄荷醇)、薄荷酮、薄荷酮甘油缩醛(MGA)、琥珀酸单薄荷基酯戊二酸单薄荷基酯、O-薄荷基甘油或N,N-二甲基琥珀酰胺酸薄荷酯)、薄荷基醚(例如(1-薄荷氧基)-1,2-丙二醇、(1-薄荷氧基)-2-甲基-1,2-丙二醇、1-薄荷基-甲基醚)、薄荷基酯(例如甲酸薄荷酯、乙酸薄荷酯、异丁酸薄荷酯、乳酸薄荷酯、L-薄荷基-L-乳酸酯、L-薄荷基-L-乳酸酯、L-薄荷基-D-乳酸酯、薄荷基-(2-甲氧基)乙酸酯、薄荷基-(2-甲氧基乙氧基)乙酸酯、薄荷基焦谷氨酸酯)、薄荷基碳酸酯(例如薄荷基丙二醇碳酸酯、薄荷基乙二醇碳酸酯、薄荷基甘油碳酸酯或其混合物)、薄荷醇与二羧酸或其衍生物的半酯(例如琥珀酸单薄荷基酯、戊二酸单薄荷基酯、丙二酸单薄荷基酯、琥珀酸O-琥珀酸酯-N,N-(二甲基)酰胺、O-薄荷基琥珀酸酯酰胺)、薄荷烷甲酸酰胺(例如薄荷烷羧酸-N-乙基酰胺[WS3]、Nα-(薄荷烷-羰基)甘氨酸乙酯[WS5]、薄荷烷甲酸-N-(4-氰基苯基)酰胺、薄荷烷甲酸-N-(烷氧基烷基)酰胺)、薄荷酮和薄荷酮衍生物(例如L-薄荷酮甘油缩酮)、2,3-二甲基-2-(2-丙基)-丁酸衍生物(例如2,3-二甲基-2-(2-丙基)-丁酸-N-甲基酰胺[WS23]、异胡薄荷醇或其酯(1-(-)-异胡薄荷醇、I-)-异胡薄荷醇乙酸酯)、薄荷烷衍生物(例如对薄荷烷-3,8-二醇)、荜澄茄醇(cubebol)或含有荜澄茄醇的合成或天然混合物、环烷基二酮衍生物的吡咯烷酮衍生物(例如3-甲基-2(1-吡咯烷基)-2-环戊烯-1-酮)或四氢嘧啶-2-酮(例如Icilin或相关化合物，例如描述于WO2004/026840)。其他实例可以在US 20150086491A1中公开并且被认为是本文合适的清凉化合物。优选薄荷醇和薄荷醇衍生物，例如5-甲基-2-(丙-2-基)环己烷-1-甲酸。

本发明的另一个实施方案是结合或靶向于釉质和/或牙本质表面的方法，包括向牙齿施用口腔护理组合物，其包含：

a.HABP；

b.口腔可接受的载体，

其中HABP以组合物总重量的0.01重量％至3重量％的量存在于组合物中。

本发明的另一个实施方案是修复或抑制牙齿侵蚀的方法，其包括向牙齿施用口腔护理组合物：

a.HABP；

b.口腔可接受的载体，

其中HABP以组合物总重量的0.01重量％至3重量％的量存在于组合物中。

在一个实施方案中，“HBAP肽-口腔护理活性成分-杂合分子”与釉质表面的结合在性质上是非共价的。优选地，清凉化合物通过HABP非共价结合至牙釉质。因此，清凉化合物可以通过机械力和/或酶促裂解和/或自发脱落随时间从釉质表面释放。与未结合HABP的清凉化合物相比，清凉化合物的缓慢释放形式可能由于不同的动力学而导致持久的清凉效果。

本发明的另一个实施方案是促进牙齿再矿化和/或增强氟化物的抗龋洞效应的方法，包括向牙齿施用口腔护理组合物，所述组合物包含：

a.HABP；

b.口腔可接受的载体，

其中HABP以组合物总重量的0.01重量％至3重量％的量存在于组合物中。

如本文所用的表述“口腔可接受的载体”表示以预期的量和浓度用于口腔使用是安全和可接受的材料制成的载体，例如在常规牙膏和漱口水中可发现的材料。这样的材料包括水或其它可含有保湿剂例如甘油、山梨醇、木糖醇等的溶剂。在某些方面，术语“口腔可接受的载体”包括口腔护理组合物的除水解植物蛋白质和氟化物之外的所有组分。在其它方面，该术语是指用于将水解植物蛋白和/或任何其它功能性成分递送至口腔的惰性或无活性的成分。

用于本发明的口腔可接受的载体包括用于制备漱口水或口腔清洗剂、牙膏、牙胶、牙粉、锭剂、口香糖、珠、可食用条、片剂等的常规和已知载体。应当选择载体以便彼此相容并与组合物的其它成分相容。

提供以下非限制性实例。在牙膏组合物中，载体通常是提供组合物重量的主要部分的水/湿润剂体系。或者，牙膏组合物的载体组分可包含水、一种或多种湿润剂以及除水解小麦蛋白或水解大米蛋白之外的其它功能组分。在漱口剂和口腔清洗剂制剂中，载体通常是水解小麦蛋白或水解大米蛋白溶解或分散于其中的水/醇液体混合物。在可溶性锭剂中，载体通常包含在口腔中缓慢溶解的固体基质材料。在口香糖中，载体通常包含胶质基，而在可食用条中，载体通常包含一种或多种成膜聚合物。

本文提供的口腔护理组合物可进一步包含一种或多种其他成分，其选自摩擦剂、pH调节剂、表面活性剂、泡沫调节剂、增稠剂、粘度调节剂、湿润剂、防牙石或牙垢控制剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。这些成分也可以被视为载体材料。下面提供非限制性的实例。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种摩擦剂，可用作例如抛光剂。可以使用任何口腔可接受的摩擦剂，但应选择摩擦剂的类型、细度(粒度)和量以使得在正常使用组合物时牙齿釉质不会过度磨损。合适的摩擦剂包括但不限于硅石，例如以硅胶、水合二氧化硅或沉淀二氧化硅的形式，氧化铝、不溶性磷酸盐、碳酸钙、树脂摩擦剂如脲-甲醛缩合产物等。可用作摩擦剂的不溶性磷酸盐是正磷酸盐、聚偏磷酸盐和焦磷酸盐。说明性实例是二水合正磷酸二钙、焦磷酸钙、β-焦磷酸钙、磷酸三钙、聚偏磷酸钙和不溶性聚偏磷酸钠。在本发明的口腔护理组合物中，任选存在以组合物总重量的1重量％至5重量％的量的一种或多种摩擦剂。摩擦剂(如果存在的话)的平均粒度通常为0.1至30μm，并且优选5至15μm。

在另一个实施方案中，本发明的口腔护理组合物包含至少一种碳酸氢盐，用于例如由于泡腾和释放二氧化碳而赋予牙齿和牙龈“清洁感”。可以使用任何口腔可接受的碳酸氢盐，包括但不限于碱金属碳酸氢盐如碳酸氢钠和碳酸氢钾、碳酸氢铵等。一种或多种碳酸氢盐任选地以组合物的1重量％至10重量％的总量存在。

在另一个实施方案中，本发明的口腔护理组合物包含至少一种pH调节剂。这些试剂包括降低pH的酸化剂、提高pH的碱化剂和缓冲剂，以将pH控制在期望的范围内。例如，可以包括一种或多种选自酸化剂、碱化剂和缓冲剂的化合物以提供2-10的pH，或者在各种示例性实施方案中，pH为2-8、3-9、4-8、5-7、6-10或7-9。可以使用任何口腔可接受的pH调节剂，包括但不限于羧酸、磷酸和磺酸、酸式盐(例如柠檬酸单钠、柠檬酸二钠、苹果酸一钠)、碱金属氢氧化物例如氢氧化钠、碳酸盐如碳酸钠、碳酸氢盐、硼酸盐、硅酸盐、磷酸盐(如磷酸一钠、磷酸三钠、焦磷酸盐)、咪唑等。一种或多种pH调节剂任选地以有效维持组合物在口腔可接受的pH范围内的总量存在。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种表面活性剂，例如用于为组合物和其中所含的组分提供增强的稳定性，帮助通过洗涤剂作用清洁牙齿表面，并且在搅拌时提供泡沫(例如，在用本发明的洁齿剂组合物刷牙期间)。可以使用任何口腔可接受的表面活性剂，包括阴离子、非离子或两性表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于C_8-20烷基硫酸盐的水溶性盐、C_8-20脂肪酸的磺酰化甘油单酯、肌氨酸盐、牛磺酸盐等。合适的非离子表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、叔胺氧化物、叔膦氧化物、二烷基亚砜等。合适的两性表面活性剂包括但不限于具有阴离子基团例如羧酸根、硫酸根、磺酸根、磷酸根或膦酸根的C_8-20脂族仲胺和叔胺的衍生物。一个合适的例子是椰油酰胺基丙基甜菜碱。一种或多种表面活性剂任选地以组合物总重量的0.01重量％至10重量％，例如0.05重量％至5重量％或0.1重量％至2重量％的总量存在。

在另一个实施方案中，本发明的口腔护理组合物包含至少一种泡沫调节剂，其可用于例如增加组合物在搅拌时产生的泡沫的量、厚度或稳定性。可以使用任何口腔可接受的泡沫调节剂，包括但不限于聚乙二醇(PEG)。一种或多种PEG任选地以组合物总重量的0.1重量％至10重量％的总量存在。

在另一个实施方案中，本发明的口腔护理组合物包含至少一种增稠剂，可用于例如赋予组合物所需的稠度和/或口感。可以使用任何口腔可接受的增稠剂，包括但不限于卡波姆(羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素聚合物如羟乙基纤维素、羧甲基纤维素(CMC)及其盐、天然树胶如刺梧桐胶、黄原胶、阿拉伯胶和黄蓍胶、胶体硅酸镁铝、胶体二氧化硅等。一种或多种增稠剂任选以组合物总重量的0.01重量％至15重量％的总量存在。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种粘度调节剂，其可用于例如抑制成分的沉降或分离或在搅拌液体组合物时促进成分的再分散。可以使用任何口腔可接受的粘度调节剂，包括但不限于矿物油、凡士林、粘土、二氧化硅等。一种或多种粘度调节剂任选以组合物总重量的0.01重量％至10重量％的总量存在。

在另一个实施方案中，本发明的口腔护理组合物包含至少一种湿润剂，其可用于防止牙膏在暴露于空气时硬化。可以使用任何口腔可接受的湿润剂，包括但不限于多元醇如甘油、山梨醇、木糖醇或低分子量PEG。大多数湿润剂也可用作甜味剂。一种或多种湿润剂任选地以组合物总重量的1重量％至50重量％的总量存在。

在另一个实施方案中，本发明的口腔护理组合物包含增强组合物味道的至少一种甜味剂。包括但不限于右旋糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、甘露糖、木糖、核糖、果糖、左旋糖、半乳糖、玉米糖浆、部分水解的淀粉、氢化淀粉水解产物、山梨醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、阿斯巴甜、纽甜、糖精及其盐、基于二肽的强力甜味剂、甜蜜素等。一种或多种甜味剂任选地以组合物总重量的0.005重量％至5重量％的总量存在。

在另一个实施方案中，本发明的口腔护理组合物包含至少一种改善组合物味道的调味剂。可以使用任何口腔可接受的天然或合成调味剂，包括但不限于香草醛、鼠尾草、马郁兰、欧芹油、留兰香油、肉桂油、冬青油(水杨酸甲酯)、薄荷油、丁香油、月桂油、茴香油、桉树油、柑橘油、果油和香精等。调味剂还包括在口腔中提供香味和/或其它感官效果的成分，包括冷或热效果。这些成分示例性地包括薄荷醇、乙酸薄荷基酯、乳酸薄荷基酯、樟脑、桉树油、桉叶脑、丁香酚、肉桂、氧杂环己酮(oxanone)、α-紫罗兰酮、麝香草酚、芳樟醇、苯甲醛、肉桂醛、N-乙基对薄荷烷-3-甲酰胺、N,2,3-三甲基-2-异丙基丁酰胺、3-(1-薄荷基氧基)-丙烷-1,2-二醇、肉桂醛甘油缩醛(CGA)、薄荷酮甘油缩醛(MGA)等。一种或多种调味剂任选地以组合物总重量的0.01重量％至5重量％的总量存在。

在另一个实施方案中，本发明的口腔护理组合物包含至少一种着色剂。着色剂可用于许多功能。这些功能包括在牙齿表面上提供白色或浅色涂层，指示已被组合物有效接触的牙齿表面上的位置，和/或改变组合物的外观以增强对消费者的吸引力。可以使用任何口腔可接受的着色剂，包括但不限于滑石、云母、碳酸镁、碳酸钙、硅酸镁、硅酸镁铝、硅石、二氧化钛、氧化锌、氧化铁、亚铁氰化铁铵、锰紫、钛化云母、氯化氧铋等。一种或多种着色剂任选以组合物总重量的0.001重量％至20重量％的总量存在。

在另一个实施方案中，本发明的口腔护理组合物包含防腐剂。防腐剂可以选自对羟基苯甲酸酯、山梨酸钾、苯甲醇、苯氧乙醇、聚氨基丙基双胍、辛酸、苯甲酸钠和西吡氯铵。在一些实施方案中，防腐剂以组合物总重量的约0.001至约1重量％的浓度存在。

在另一个实施方案中，本发明的口腔护理组合物是包含胶质基、香料、甜味剂和HABP的口香糖。胶质基存在量为约4.8％至约90％，风味剂为约0.1％至约10％，甜味剂为约0.1％至约95％，HABP为约0.01％至约0.5％。

以下实施例说明了本发明的组合物及其用途。示例性的组合物是说明性的，并不限制本发明的范围。

实施例

实施例1：结合试验

i.肽/蛋白质标记

对于结合研究，通过使用相应的琥珀酰亚胺基酯(Invitrogen,Darmstadt,Germany)将5(6)-羧基荧光素缀合至肽/蛋白质的N末端。标记反应根据制造商方案(Invitrogen,Darmstadt,Germany)进行。缀合之后，标记的肽/蛋白质用PD-10脱盐柱纯化大于5kDa的蛋白质或用PD MidiTrap G-10(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)纯化较小蛋白质，或在RP18柱上用HPLC纯化肽类。

ii.肽/蛋白质结合

对于结合实验，N-末端标记的肽/蛋白质以2μM的终浓度使用。结合在HBS-T缓冲液(150mM NaCl,50mM HEPES pH 7.5,0.1％吐温20)中进行。37℃下将肽/蛋白质暴露于10mg羟基磷灰石粉末(Fluka)中2小时。用HBS-T缓冲液洗涤5次后，用适当的滤光片(激发475/50；发射525/50)通过荧光显微镜观察结合的肽/蛋白质。为了结合的定量，用FluostarGalaxy(BMG,Ortenberg,Germany)测量溶液在结合之前(Fi)和之后(Ff)的荧光强度并估计结合的肽/蛋白质的量(c_结合＝[1-(Ff/Fi)]xc0)。将描述为羟基磷灰石的非结合肽的肽LIKHILHRL用作阴性对照[Yarbrough DK,Hagerman E,Eckert R,He J,Choi H,Cao N等人，Specific binding and mineralization of calcified surfaces by smallpeptides.Calcif Tissue Int 2010；86(1):58–66.]。所有结合实验一式三份进行。

评估：+：HAP上结合30-50％的肽；++：HAP上结合50-100％的肽

实施例2：羟基磷灰石成核测定

为了确定未标记的肽/蛋白质的抗侵蚀/HAP成核能力，测量了Ca²⁺浓度的降低。成核在人造唾液中进行[Panich M，Poolthong S.The effect of casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate and a cola soft drink on in vitro enamelhardness.J Am Dent Assoc 2009；140：455-60.]。简言之，制备一种46.2mM K₂HPO₄、26.8mMKH₂PO₄和第二种87.2mM KCl、6.1mM MgCl₂、14.9mM CaCl₂的10倍储备溶液。对于成核实验，制备含有8.7mM KCl、0.6mM MgCl₂、1.5mM CaCl₂、4.6mM K₂HPO₄、2.7mM KH₂PO₄和25μM肽/蛋白质的人造唾液，最终体积为1mL。作为阴性对照，仅使用没有任何肽/蛋白质的成核溶液。在使用之前，所有溶液都被过滤(0.2μm)以避免由于小颗粒引起的不受控制的成核。定期地，每小时取样30μL，总共5小时，离心2分钟，13000rpm，并测定上清液的钙浓度。为了检测钙，将30μM邻甲酚酞、2.7mM 8-羟基喹啉、20mM 2-氨基-2-甲基-1-丙醇pH 10.5和20μL样品混合，并使用Spectramax(Molecular Devices,Biberach,德国)在575nm处监测吸光度。所有的成核实验都在37℃下进行，一式三份。添加未标记的肽(SEQ NO：1至16)导致成核增加1.3-2倍。

实施例3：HABP肽-清凉化合物杂合分子

SEQ ID NO：1至16的肽可以通过使用例如草酸盐(式A)、戊二酸盐(式B)或琥珀酸盐(式C)作为交联剂与清凉化合物偶联：

实施例4：HABP肽-薄荷醇杂合分子

在树脂结合的SEQ ID No：6、7、8和16的HBAP肽的N-末端进行5-甲基-2-(丙-2-基)环己烷-1-甲酸的偶联以形成式D的分子：

实施例5：从磷酸钙盘中释放HABP肽-薄荷醇杂合分子

将实施例4的杂合分子(5μM，在pH 8的Tris缓冲液中)与磷酸钙盘(来自Himed的HA-盘)在37℃下温育1小时。通过用Tris缓冲液洗涤3次除去未结合的分子。

已包被的磷酸钙盘用缓冲液作为对照并与合并的人唾液(5个供体；37℃，2小时)平行温育。将上清液离心并通过特异性激活人冷感觉受体TRPM8评估清凉活性。

实施例6：来自磷酸钙盘(HA盘)的HABP肽-薄荷醇杂合分子孵育

将实施例4的HABP肽-清凉化合物-杂合分子(1μM，在pH 8的Tris缓冲液中)与1：1的合并人唾液(5个供体)或作为参照的1：1的37℃、pH8的Tris缓冲液在37℃下温育2小时。将样品冷冻直到在基于细胞的测定中评估人TRPM8受体的活化。

实施例7：对TRPM8激活的测定

进行与以前由Behrendt H.J.等人,Br.J.Pharmacol.141,2004,737-745在文献中描述的测试相当的测试(还参见US 20150086491A1)。通过Ca²⁺敏感染料(例如FURA、Fluo-4等)来定量受体的激动作用或拮抗作用。激动剂本身会导致Ca²⁺信号的增加；拮抗剂在例如薄荷醇存在下引起Ca²⁺信号的减少(在每种情况下通过Fluo-4染料检测，其由于Ca²⁺具有其它荧光性质)。

首先，以本身已知的方式，在细胞培养瓶中制备转化的HEK细胞的新鲜培养物。HEK293-TRPM8测试细胞使用胰蛋白酶从细胞培养瓶中取出，并将40000个细胞/孔与100μl培养基在96孔板(Greiner#655948聚-D-赖氨酸包被)中一起接种。为了诱导TRPM8受体，将生长培养基、四环素在(DMEM/HG、10％FCS(无四环素)、4mM L-谷氨酰胺、15μg/ml杀稻瘟素、100μg/ml潮霉素B、1μg/ml四环素)中混合。第二天，将细胞用Fluo-4染料(非荧光的乙酰氧基甲基酯Fluo-4AM；2,2'-((2-(2-(2-(双(羧基甲基)氨基)-5-(2,7-二氟-6-羟基-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯氧基)乙氧基)-4-甲基苯基)氮烷二基)二乙酸)处理，并进行测试。步骤如下：每100μl培养基(DMEM/HG、10％FCS(无四环素)、4mM L-谷氨酰胺、15μg/ml杀稻瘟菌素、100μg/ml潮霉素B、1μg/ml四环素)中加入100μl/孔染料溶液Ca-4试剂盒(RB 141，Molecular Devices)。

在培养箱中孵育30分钟/37℃/5％CO₂，30分钟/20℃。

制备测试样品＝磷酸钙盘或肽活性成分杂合体+唾液孵育的上清液，一式三份(不同稀释度的样品：在200μl HBSS缓冲液中1/5/10μl)，阳性对照(在200μl HBSS缓冲液中不同浓度的薄荷醇或Icilin或离子霉素)和阴性对照(仅200μl HBSS缓冲液)。

加入50μl/孔的测试样品并在485nm激发、520nm发射下测量荧光变化(例如在FLIPR测定装置，Molecular Devices或NovoStar，BMG中)，并评估各种物质/浓度的有效强度并测定EC50值。

对TRPM8受体的评估结果(清凉感)：

评估显示，参照分子薄荷醇对人冷感觉受体TRPM8(用唾液孵育之前和之后)具有生物活性，但没有任何物质结合在羟基磷灰石上。薄荷醇的肽修饰导致了性质的变化：该杂合分子结合在羟基磷灰石上并在与人唾液温育后作为清凉活性成分释放。

虽然已经说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见，可以在不背离如所附权利要求所限定的本发明的范围的情况下进行各种改变和修改。

Claims (19)

1.结合或靶向于釉质或牙本质表面、修复或抑制牙齿侵蚀、促进牙齿再矿化和/或增强氟化物的抗龋洞效应的方法，其包括向牙齿施用口腔护理组合物，所述组合物包含和/或通过增加釉质/牙本质表面的局部浓度来增强活性成分的生物学活性：

a)HABP

b)口腔可接受的载体，

其中HABP以所述组合物总重量的0.01重量％至3重量％的量存在于所述组合物中。

2.根据权利要求1的方法，其中HABP具有式(I)描述的多肽序列：

a_0-1–b_0-10-y_1-10-c_0-10-d_0-1 (I)

其中

a、d各自独立地代表疏水蛋白或抗冻蛋白序列或口腔护理活性成分，

b、c各自独立地代表氨基酸

y代表以SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16所示的多肽序列。

3.根据权利要求1的方法，其中具有以下含义：

a、d＝0

b、c＝0

y＝SEQ ID NO:1、2、3、4。

4.根据权利要求1的方法，其中HABP已被中和为大约中性或弱碱性pH。

5.根据权利要求1的方法，其中所述口腔护理组合物还包含有效量的氟化物。

6.根据上述权利要求任一项的方法，其中HABP以所述组合物总重量的0.1重量％至3重量％的量存在于所述组合物中。

7.根据上述权利要求任一项的方法，其中氟化物的量为约500ppm氟化物。

8.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述组合物是洁齿剂。

9.根据上述权利要求任一项的方法，其是用于减少、抑制或修复牙齿侵蚀的方法。

10.根据上述权利要求任一项的方法，其是用于促进牙齿再矿化的方法。

11.根据上述权利要求任一项的方法，其是用于增强氟化物的抗龋洞效应的方法。

12.洁齿剂，其包含：

a)HABP，其已被中和为大约中性或弱碱性pH；

b)有效量的氟化物；和

c)口腔可接受的载体。

13.口腔护理组合物，其包含：

a)HABP；

b)任选的有效量的氟化物；

c)口腔可接受的载体，

其中HABP以组合物总重量的0.01重量％至3重量的量存在于组合物中，所述组合物用于修复或抑制牙釉质侵蚀、促进牙釉质再矿化和/或增强氟化物的抗龋洞效应。

14.HABP在制备口腔护理组合物中的用途，所述组合物用于修复或抑制牙齿侵蚀、促进牙齿再矿化和/或增强氟化物的抗龋洞效应。

15.制备包含HABP的口腔护理产品的方法，所述方法包括：

a)通过用缓冲水溶液稀释来中和HABP以获得具有大约中性或弱碱性pH的溶液；

b)过滤并离心a)的溶液产物以获得包含HABP的滤液；

c)向b)的滤液产物中加入氟化物和任选的杀生物剂；

d)将c)的产物与口腔可接受的载体组分混合。

16.包含HABP的口腔护理组合物，其中所述口腔护理组合物通过权利要求15的方法获得或可通过权利要求15获得。

17.通式(I)的羟基磷灰石结合多肽：

a_0-1–b_0-10-y_1-10-c_0-10-d_0-1 (I)

其中

a、d各自独立地代表疏水蛋白或抗冻蛋白序列或口腔护理活性成分，

b、c各自独立地代表氨基酸

y代表SEQ ID NO:1、2、3、4所示的多肽序列。

18.通式(I)的羟基磷灰石结合多肽：

a_0-1–b_0-10-y_1-10-c_0-10-d_0-1 (I)

其中

a、d各自独立地代表0或口腔护理活性成分

b、c＝0

y代表SEQ ID NO:6、7、8、16所示的多肽序列。

19.口香糖组合物，其包含：

a)胶质基；

b)香料；

c)甜味剂，和

占口香糖组合物重量约0.01％到约0.5％的HABP。