BR9712648B1

BR9712648B1 - composição compreendendo pelo menos dois compostos selecionados dentre anti-radical, antinflamatório e antialérgico.

Info

Publication number: BR9712648B1
Application number: BRPI9712648-9A
Authority: BR
Inventors: Dominique Castelli; Gerd Ries; Laurence Friteau; Elisabeth Bousigniere; Laurent Fredon
Priority date: 1996-10-22
Filing date: 1997-10-21
Publication date: 2011-02-08
Also published as: DK0955995T3; US6352698B1; ATE324863T1; DE69735814T2; US7008627B1; CA2269594C; AU4470397A; EP0955995A1; EP0955995B1; BR9712648A; ES2264170T3; KR20000052655A; AR008685A1; FR2754713B1; PT955995E; KR100544570B1; CO5070618A1; JP2001502685A; CA2269594A1; FR2754713A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÃO COMPREENDENDO PELO MENOS DOIS COMPOSTOS SELECIO-NADOS DENTRE ANTI-RADICAL, ANTIINFLAMATÓRIO E ANTIALÉRGICO".

A invenção refere-se a composições dermocosméticas e farma-cêuticas que são úteis para melhorar e tratar condições da pele hiperreativa emais geralmente reações do tipo alérgico e/ou fenômenos de intolerância, se-jam eles causados por fatores externos ou fatores intrínsecos ao indivíduo.

Números cada vez maiores de crianças e adultos estão de fatoexibindo pele descrita como "sensível". Durante um recente estudo na Fran-ça, 70% das mulheres questionadas afirmaram que elas tinham pele facialsensível. A noção de pele sensível abrange um sistema de sinais visíveisque compreendem pele reativa e pele intolerante. A pele atópica tambémpode ser incluída naquele caso. Estes tipos de pele são às vezes incorreta-mente conhecidos como "alérgicos" pelos sujeitos; entretanto, embora umcomponente alérgico possa às vezes ser evocado nos sintomas de pelesensível, este não pode estar restrito ao mesmo. Os fatores iniciadores doprocesso podem ser ambientais, tais como vento, poluição, variações detemperatura, água excessivamente dura ou produtos de higiene, cosméticosou de cuidados inadequados; estes fenômenos podem também estar asso-ciados a estresse ou emoções sentidas pelo sujeito, algumas dietas ou in-gestão de medicamentos. Além disso, existem fatores individuais de predis-posição (em particular neurológicos ou hormonais) ou fatores de predisposi-ção familiar que amplificam estas reações.

Geralmente, o sujeito sente desconforto cutâneo que pode semanifestar por sinais subjetivos e/ou objetivos. A pele facilmente provocadores lancinantes, coceiras ou pontadas e o sujeito pode experimentar sen-sações de calor, pontadas ou de queimadura sobre a pele. A pele pode ficarvermelha ou escamar. São observados xerose, dermatite seborréica, telan-giectasias, vesículas ou até mesmo edema em uma base irregular.

Nos casos mais graves, podem ser observadas queixas dermatoló-gicas do tipo imunoalérgico, tais como atopia, eczema ou neurodermatites.Este estado pode se manifestar sobre a pele, sobre as membra-nas da mucosa ou sobre o couro cabeludo. Neste último caso, pode estarassociado a um estado de formação de caspa e/ou alopecia.

Até agora, foram feitas tentativas para evitar o aparecimentodestas reações pelo fato de limitar a presença, em formulações dermocos-metológicas, de componentes dos quais se sabe serem alergizantes. Noentanto, seria desejável que se fosse capaz de ter composições ativas ver-dadeiramente disponíveis que fossem capazes de evitar ou de aliviar estessintomas por diminuição da reatividade da pele e por melhoria de sua re-sistência ao aparecimento dos fatores.

A Companhia Requerente descobriu agora, inesperadamente,que estes objetivos podiam ser alcançados pelo uso de uma composiçãoque contém uma combinação sinérgica que produz um complexo hipoaler-gênico ativo.

Um tal complexo, além disso, irá melhorar a receptividade dapele em relação a outros princípios ativos.

Por esta razão, o assunto da presente invenção é uma composi-ção dermocosmética, caracterizada pelo fato de que contém uma combina-ção sinérgica imunomoduladora ou hipoalergênica de pelo menos dois com-ponentes, cada um destes componentes exibindo pelo menos uma das se-guintes atividades:

a) anti-radical

b) predisposição-inflamatória

c) antialérgica,

os ditos componentes sendo escolhidos de modo que pelo menos duas ati-vidades a), b) ou c) estejam presentes na composição.

0 assunto da invenção é mais particularmente o uso de pelomenos dois compostos escolhidos entre os componentes que têm uma ativi-dade a) anti-radical, b) antiinflamatória e c) antialérgica para a preparaçãode uma composição, em particular uma composição imunomoduladora, queexiba pelo menos duas das atividades a), b) e c) pretendidas para o trata-mento de pele sensível e/ou alérgica; de acordo com um de seus aspectos,as atividades a), b) e c) são exercidas na composição.

Evidentemente, a Companhia Requerente foi capaz de mostrarque a combinação de princípios ativos que tenham atividades antialérgica,anti-radical e antiinflamatória torna possível combater eficazmente os fenô-menos associados com o aparecimento dos sintomas de pele sensível e/ouintolerante ou de queixas imunoalérgicas, de preferência por meio de umasinergia das atividades dos componentes.

Os componentes que fazem parte das formulações de acordocom a invenção podem ser moléculas purificadas ou não-purificadas, pro-dutos sintéticos ou extraídos, misturas de princípios ativos ou extratos queforam sujeitos a uma ou a alguns estágios de fracionamento a partir de ummaterial de partida de origem vegetal ou animal.

De preferência, se dois componentes presentes na formulaçãoapresentam uma atividade do mesmo tipo, esta será exercida pelo envolvi-mento de um mecanismo diferente.

No que se refere à atividade antiinflamatória, esta pode em par-ticular ser fornecida por inibidores de prostaglandina (via ciclooxigenase),inibidores de produção de citocina e inibidores da produção de Ieucotrienos(LTB, por exemplo, via lipoxigenase).

O componente ou componentes com atividade antiinflamatóriavantajosamente exibem uma atividade de inibição sobre a produção de IL-1,IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 e/ou TNF-alfa (Fator de Necrose de Tumor).

A função antiinflamatória também pode ter a conseqüência dediminuir a produção de nitro derivados reativos pelas células, limitando ageração de radicais livres.

Entretanto, é entendido que a atividade anti-radical significacomponentes que são de preferência escolhidos entre agentes de expulsãode radical livre, antilipoperoxidantes e estimulantes da produção endógenadas enzimas que degradam radicais livres.

Os radicais livres, por definição, são espécies químicas neutrasou carregadas que têm um elétron não-emparelhado. Este "elétron isolado"confere aos mesmos propriedades químicas específicas e um tempo de vidacurto. Eles são intermediários de reação que serão estabilizados por combi-nação ou transferência e podem ser a fonte de uma reação em cadeia. Podeser feita menção, entre os radicais livres, do ânion superóxido O2 o radi-cal hidroxila OH-, NO- ou peróxidos.

As enzimas que são ativas em sistemas endógenos de defesacontra radicais livres são, por exemplo, SOD (ou superóxido dismutase),catalase ou glutationa peroxidase; serão feitas tentativas para estimular aprodução destas enzimas ou elas podem ser introduzidas exogenamente.

Os componentes que fornecem a função antialérgica na compo-sição de acordo com a invenção são de preferência escolhidos entre inibi-dores de proliferação de linfócitos, inibidores da internalização das molécu-las do principal complexo de histocompatibilidade (HLA-DR, por exemplo)ou inibidores de produção de citocina. Eles são vantajosamente capazes dediminuir a produção dos mediadores da inflamação que ocorre durante osfenômenos alérgicos.

Como indicado acima, a composição irá exibir pelo menos duasdas atividades anti-radical, antiinflamatória e antialérgica. Além disso, oscomponentes do complexo hipoalergênico ativo serão escolhidos de modoque seja exercida uma sinergia por diferente mecanismos à base da mesmaatividade.

Cada componente irá de preferência contribuir, por meio de al-guns parâmetros, para a atividade global da composição de acordo com a in-venção.

A composição de acordo com a invenção vantajosamente tem umaatividade inibidora acentuada sobre a síntese e/ou a expressão de neurome-diadores, em particular em relação a células cutâneas, que resultam de umasinergia das atividades de seus componentes diferentes. Os neuromediado-res podem ser escolhidos do grupo que compreende neuroquininas A (NKA) eB (NKB), polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP), peptídeo relacionado ao ge-ne da calcitonina (CGRP), neuropeptídeo Y (NPY), neurotensina (NT), soma-tostatina (SOM), peptídeo Iiberador de gastrina (GRP), fator de crescimentodo nervo (NGF), PGP 9,5 (Produto de Gene da Proteína 9,5) e bombesina.Os componentes que tornam possível a preparação de com-posições dermocosméticas de acordo com a invenção podem vantajosa-mente ser escolhidas no seguinte grupo: Ginkgo biloba e seus extratos,iramina, D-pantenol, beta-sitosterol, moduleno, alfa-tocoferol e seus de-rivados, beta-glicano e seus derivados, ácido eicosapentanóico, ácido18beta-glicirretínico, monoglucuronídeo do ácido glicirretínico, glicirreti-nato de estearila, extrato de Scutellaria, lactoferrina, chá verde e seusextratos, vitamina C, glutationa, fator epidermal do timo, derivados deazol e lipácido.

Entretanto, a combinação de vitamina E com um extrato deScutellaria não está incluída nas composições de acordo com a invenção.

De acordo com um dos aspectos da invenção, a composiçãocontém pelo menos um componente, de preferência pelo menos dois com-ponentes, escolhidos entre o grupo acima.

Os derivados de azol usados de acordo com a invenção po-dem ser escolhidos entre imidazol ou triazol e em particular do grupocomposto de: bifonazol, butoconazol, clorodantoína, cloromidazol, cloco-nazol, clotrimazol, econazol, enilconazol, fenticonazol, flutrimazol, isoco-nazol, cetoconazol, lanoconazol, miconazol, omoconazol, oxiconazol,sertaconazol, sulconazol, tioconazol, fluconazol, itraconazol, sapercona-zol, terconazol ou elubiol.

Isto é porque foi agora possível demonstrar que estes compos-tos exibem em particular uma atividade anti-radical.

Pode ser feita menção mais particularmente, entre os deriva-dos de alfa-tocoferol que podem ser usados, de fosfato de alfa-tocoferol.

Pode ser feita menção, entre os derivados de beta-glicano, decarbóxi metil-beta-glicano e drielina.

Drielina é um poli-beta (1->3)-glucopiranose de fórmula<formula>formula see original document page 7</formula>

η = 1000

com η = 1000.

A molécula pode ser fornecida na forma de uma solução a 0,1%em água e sorbitol ou na forma de pó.

Em uma das modalidades preferidas da invenção, a composiçãocontém uma combinação sinérgica de um extrato de Ginkgo biloba e de umcomposto beta-glicano.

Evidentemente, a Companhia Requerente descobriu que a com-binação destes dois componentes tornou possível obter a combinação ótimadas características funcionais que fornecem a atividade das composições deacordo com a invenção.

O glicano é composto de uma cadeia de glicose beta(1-^3) quepode em particular ser extraída da parede das células de levedura. É possí-vel sujeitá-lo a modificações químicas de maneira em particular a melhorarsua solubilidade.

O beta-glicano é vantajosamente substituído por grupos carbo-ximetila; e ele pode existir em forma de sal, em particular na forma de sal desódio. Bons resultados são obtidos com um derivado em que o grau desubstituição por grupos carboximetila está dentro da faixa de desde 0,65 até0,85 e que exibe um pH de desde 5,5 até 8,5.

Ginkgo biloba é uma árvore dioécia do Extremo Oriente, cujasfolhas são usadas por certas propriedades medicinais. Elas contêm consti-tuintes, tais como hidrocarbonetos alifáticos e álcoois, polifenóis, tais comoIuteolina ou quercetol ou biflavonas derivadas de amentaflavona, e consti-tuintes mais específicos: ácido ginkgólico e derivados anacárdicos, terpenosderivados de Iimoneno ou terpenos que contêm um grupo terc-butila.

Extratos de Ginkgo foram propostos para melhorar os sintomasde deficiência mental dos idosos, de claudicação intermitente, de oblitera-ção de arteriopatias crônicas e de doença de Raynoud ou no caso de defici-ência da retina.

Eles têm sido usados em cosmetologia por seu efeito protetorem relação aos radicais livres.

A Companhia Requerente descobriu, inesperadamente, que osextratos de Ginkgo têm uma excelente atividade antiinflamatória e antialér-gica que pode ser demonstrada em células cutâneas, tais como queratinó-citos e macrófagos. Além disso, a Companhia Requerente descobriu queesta atividade é aumentada na presença de beta-glicano.

Os extratos que são particularmente adequados para a imple-mentação da invenção são obtidos a partir de folhas de Ginkgo biloba queforam sujeitas a um estágio durante o qual a concentração de terpeno foilevada até um valor menor do que aproximadamente 7% e de preferênciamenor do que aproximadamente 3% (peso/peso de extrato seco). Em umadas modalidades, esta concentração de terpeno é menor do que aproxima-damente 1 % peso/peso.

A concentração de heterosídeos de flavona no extrato seco évantajosamente maior do que 24% e de preferência maior do que aproxima-damente 28% peso/peso.

As propriedades antiinflamatória e antialérgica podem ser de-monstradas em particular em relação a modelos in vitro, para os quais existeuma correlação com modelos de animais e estudos clínicos já realizadosnos seres humanos.

É possível em particular operar em queratinócitos e em célulasde macrófago, porque estas são células que são essenciais para o desen-volvimento de uma reação inflamatória local. Além disso, os macrófagos sãocélulas particularmente vantajosas porque, em virtude do fato de que estassão células residentes na pele, elas não regulam apenas reações inflamató-rias locais, mas elas também regulam as respostas imunológicas por suacapacidade de apresentar o antígeno e de produzir um grande número de ci-tocinas que regulam a imunidade local. Estes macrófagos são também envol-vidos em comunicações com o sistema circulatório que pode, se apropriado,mobilizar diferentes tipos de célula (monócitos, neutrófilos, eosinófilos e Iin-fócitos T), aumentando desse modo o poder defensivo não-específico e es-pecífico do tecido sob consideração.

As atividades dos produtos teste são portanto investigadas emrelação a culturas de macrófago humano e de queratinócito que são ou nãoestimulados por interferon-gama + lipopolissacarídeo (inflamação não-espe-cífica). Este tipo de estímulo coloca as células no contexto de uma respostapró-oxidante (geração de NO ou de radicais livres ânion superóxido, o quepode ser avaliado pela medida da produção de derivados de nitrogênio) euma resposta imuno-inflamatória (produção de citocinas tal como TNF-alfa).

Para avaliar a inflamação alérgica, as células são ativadas porIL-4, que induz o receptor CD23 e então por complexos imunes contendoIgE. Em todos os casos, os sobrenadantes celulares são analisados após a ativação.

Além disso, é realizado um estudo de viabilidade sobre as células.

A atividade dos componentes é também confirmada sobre cultu-ras linfo-epidermais mistas (MLEC).

Na pele, as células de Langherans evidentemente representamum papel essencial na presença do antígeno e os queratinócitos geram fato-res que estão envolvidos na resposta imunológica, constituindo assim umsistema imunológico cutâneo. As MLECs tornam possível determinar aspropriedades imunomoduladoras de substâncias pela medida da prolifera-ção de linfócito induzida pela células epidermais alogênicas que apresen-tam antígeno, com ou sem tratamento pela substância.

Os resultados obtidos com ginkgo e beta-glicano estão resumidosna tabela a seguir:

<table>table see original document page 10</column></row><table>

As composições de acordo com a invenção contêm em particu-lar desde 0,001% até 10% peso/peso de um extrato de ginkgo e de prefe-rência desde 0,05 até 2%; de acordo com uma das modalidades, a concen-tração de extrato de ginkgo será desde aproximadamente 0,1 até 0,5%, masserá ajustada pelo versado na técnica.

As concentrações de beta-glicano, em particular de beta-glicanocarboximetilado, que são adequadas para a implementação da invençãoestão dentro da faixa de desde 0,001% até 10% peso/peso total da compo-sição.

Outras composições que são particularmente adequadas para ainvenção compreendem a combinação de Iactoferrina e drielina, pantenol eextrato de chá verde ou pantenol e beta-sitosterol. Uma combinação de alfa-tocoferol (ou de um de seus sais) e de um extrato de ginkgo pode tambémser usada de acordo com a invenção. Tais combinações produzem um com-plexo hipoalergênico ativo que diminui o limite de reatividade da pele e docouro cabeludo e diminui a grandeza de intolerância ou das possíveis rea-ções imunoalérgicas.

O extrato de chá verde é obtido de folhas secas de Camelliaoleifera e contém, em particular, teofilina, cafeína e teobromina.Um outro assunto da invenção é um processo para a prepara-ção de um complexo ativo hipoalergênico, caracterizado pelo fato de quesão selecionadas substâncias pertencentes a pelo menos um dos grupos:anti-radical livre, antiinflamatória e princípio ativo imunomodulador e pelofato de que duas substâncias que tenham atividades complementares sejamentão combinadas de modo a aumentar as funções anti-radical, antiinfla-matória e antialérgica da combinação.

A combinação das substâncias que constituem o complexo ativohipoalergênico de preferência diminui a síntese ou a expressão dos neuro-mediadores, tais como VIP, PGP 9,5 ou CGRP, que estão correlacionados àchamada pele "sensível" ou irritável.

Um outro assunto da invenção é um processo para o tratamentocom cosmético de pele sensível que compreende a aplicação à pele do cor-po ou da face, uma ou várias vezes ao dia, de complexos ativos hipoalergê-nicos e/ou composições como definido antes.

Em particular, a invenção refere-se a um processo para o trata-mento de alopecia que compreende a aplicação semanal, duas vezes porsemana, diariamente ou duas vezes ao dia ao couro cabeludo de uma com-binação de componentes anti-radical, antiinflamatórios e antialérgicos. Ascombinações podem estar em diferentes formulações, tais como xampus ouloções, que podem ser aplicados simultaneamente, separadamente ou se-qüencialmente, opcionalmente com outros princípios ativos que são ativosem relação a alopecia, condições de caspa e/ou condições seborréicas.

Um outro dos assuntos da invenção é o uso de um complexohipoalergênico como definido acima para a preparação de um medicamentoimunomodulador, em particular pretendido para o tratamento de uma queixaescolhida entre atopia, psoríase, eritema multiforme, xerodermatitides, Iupuseritematosus, pênfigo, dermatitides, rosácea, acne, eczemas e neuroderma-titides.

As combinações hipoalergênicas de acordo com a invenção se-rão vantajosamente formuladas dentro de composições que também contêmagentes hidratantes e/ou agentes que melhoram a penetração cutânea, queirá promover a atividade do complexo de acordo com a invenção. Pode serfeita menção, para fins de exemplos, de uréia, propileno glicol ou ácido oléi-co, o versado na técnica sendo capaz de usar promotores de penetraçãoadequados para o tipo de formulação.

As composições de acordo com a invenção conterão ainda exci-pientes farmaceuticamente e/ou cosmetologicamente aceitáveis conhecidosdo versado na técnica adequados para sua formulação, em particular naforma de soluções, loções, cremes, xampus, emulsões e similares.

Pode ser feita menção, de uma maneira não-limitativa, de pig-mentos, corantes, conservantes, agentes texturizantes, espessantes, emul-sificadores ou fragrâncias. Eles também podem conter agentes filtros sola-res ou bloqueadores ou um outro princípio ativo.

Finalmente, os complexos hipoalergênicos que contêm as com-binações de acordo com a invenção podem ser introduzidos em composi-ções que contêm pelo menos um princípio ativo pela via tópica, em particu-lar quando este princípio ativo é capaz de provocar uma reação cutânea.

Pode ser mais particularmente feita menção, entre tais princípi-os ativos, a retinóides e agentes ativos de despigmentação.

É entendido que os retinóides significam em particular ácidoretinóico ou tretinoína, retinol, retinaldeídos, seus sais e seus ésteres. Ossais de metal alcalino, de amônio e de C2-C30 amônio são sais típicos. Ossais de sódio, de potássio, de trietanolamônio e de amônio são particular-mente preferidos. As combinações de todos os compostos acima podem estarpresentes nas composições. Além disso, deve ser entendido que os termos"retinol" e "ácido retinóico" incluem os isômeros hidrogenados e não-hidroge-nados, tais como o 9-cis-retinol, didesidro-retinol, ácido 13-cis-retinóico, ácido13-trans-retinóico e ácido didesidro-retinóico.

Os agentes de despigmentação compreendem, por exemplo,ácido kójico, hidroquinona, vitamina C, fosfato de vitamina C e magnésio,carotenóides, arbutin e similares.

Os exemplos a seguir pretendem ilustrar a invenção.

Nestes exemplos, será feita referência às seguintes figuras:Figura 1: Efeito da dose de carboximetil-beta-glicano em relação às fun-ções inflamatórias dos queratinócitos.

Figura 2: Sinergia entre um extrato de Ginkgo biloba (H37) e carboximetil-beta-glicano (K18) em suas funções antiinflamatórias em rela-ção aos queratinócitos.

Exemplo 1

1. Materiais e Processos

Produtos

Foram usados os seguintes produtos durante este estudo:Escherichia coli LPS (Sigma), usado a 1 μg / mL. IFN-gama e IL-4 são pro-venientes de Immugenex (Los Angeles CA) e são usados respectivamente a1000 U/mL e 10 ng/mL, os IgEs monoclonais são provenientes de Stallerge-ne (Fresnes, França) e os anti-lgEs são da Nordic (Tilburg, Holanda).

Cultura de queratinócito

As culturas primárias de queratinócito são obtidas de prepúciosde recém-nascidos e são mantidos em proliferação ex vivo em um meio quenão contém soro de bezerro. As culturas confluentes de queratinócito sãotripsinizadas e transferidas para placas de 24 cavidades em meio novo àdensidade celular de 10^ células / mL / cavidade. Se apropriado, no caso deestímulo por IL-4, a presença do receptor IgE (CD23) na superfície das cé-lulas é verificada por imunomarcação.

Cultura de macrófaqo

As células de macrófago são obtidas a partir de sangue periféri-co de doadores normais (não alérgicos). As células mononucleares sãoisoladas sobre um gradiente ficoll e o anel das células linfóides é recupera-do e lavado três vezes e as células são então cultivadas de modo a fazercom que as células de macrófago fiquem aderidas. Estas células são recu-peradas após aderirem durante 1 hora e são cultivadas (10® células / mL /cavidade). Se apropriado, no caso de estímulo por IL-4, a presença do re-ceptor de IgE (CD23) na superfície das células é verificada por imunomar-cação.Ativação da célula

As células são ativadas pela combinação de IFN-gama e LPSdurante 3 a 4 dias e os sobrenadantes destas culturas são então recupera-dos de forma a determinar quantitativamente os derivados de nitrogênio eTNF-alfa. De modo similar, durante o estímulo por IgE1 as células são pri-meiro ativadas por IL-4, de modo a induzir o CD23 e são então subseqüen-temente cultivadas e estimuladas pelos complexos imunológicos que contêmIgE durante 3 a 5 dias antes de recuperar os diferentes sobrenadantes. Emtodos os casos, é conseguida viabilidade celular sobre a conclusão destasculturas. No caso específico de macrófagos, foi realizado um estudo de via-bilidade a longo termo (7 a 12 dias) de modo a determinar os efeitos prote-tores destes produtos. É realizada a determinação quantitativa dos deriva-dos de nitrogênio usando-se a abordagem de Griess e é medido o nível deTNF usando-se kits de determinação quantitativa de Medgénix (Fleurus,Bélgica).

2. Resultados

2.1. Efeito de um extrato de Ginkao biloba sobre os queratinócitos e os ma-crófagos estimulados por IFN-gama + LPS

Folhas de Ginkgo biloba foram sujeitas a extração contínua poruma mistura de acetona / água sob vácuo e então a vários estágios de re-moção de solvente assim como de clorofila, de lipídeos, de ceras, de Iecti-nas e de certas substâncias resultam em um extrato subseqüentemente re-presentado por H37.

Este existe na forma de um pó fino correspondente às seguintesespecificações:

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É 6% (peso/peso) solúvel em PEG 400 e 4% (peso/peso) solú-vel em etanol a 90°.

Neste estudo, o produto H37 (10 mg/mL) é adicionado 30 minu-tos antes do estímulo por IFN-gama + LPS. Este produto não apresentouatividade citotóxica.

Tabela 1A: Produção de nitro derivados (NO2" μΜ) após estímulo por IFN-gama + LPS +/-10 mg/mL H37

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Os valores entre parênteses são aqueles de células que não foram estimu-ladas por IFN-gama + LPS

Tabela 1B: Produção de TNF (pg/mL) após estímulo por IFN-gama + LPS+/-10 mg/mL H37

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* Os valores entre parênteses são aqueles de células que não foram esti-muladas por IFN-gama + LPS1 ND = não detectável.

Por meio destes experimentos, parece que os macrófagos esti-mulados por IFN-gama + LPS não produzem nitro derivados até uma exten-são significativa enquanto que os queratinócitos produzem o mesmo reprc-dutivelmente. De fato, foi demonstrado recentemente que, durante um talestímulo, os macrófagos produzem uma NO síntase truncada que podia teruma diminuição significativa em sua atividade, o que aparentemente não é ocaso para os queratinócitos.

Nos queratinócitos, H37 inibe a produção de NO após o estímulo.

O produto H37 exibe uma leve atividade "antiinflamatória". Alémdisso, durante a avaliação do efeito da dose de H37 sobre esta produção pe-los queratinócitos, é mostrado que o efeito máximo é observado a 10 mg/mL.

Além disso, o H37 protege as células de macrófago da morte dacélula induzida por produtos radicais. O fato de que os macrófagos estimu-lados não produzem quantidades significativas de nitro derivados não excluio fato de que estas células não são sujeitas a um choque de oxidação quepode resultar na morte da célula.

Isto é alcançado por comparações dos efeitos sobre a viabilidadeda célula a longo termo a 10 dias ou com as culturas a curto termo (2 dias).Parece que H37, a 10 mg/mL, protege as células de macrófago da morte dacélula induzida na maioria das vezes pelos produtos radicais.

Tabela 2: Efeito de H37 sobre a viabilidade dos macrófagos

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2.2. Efeito do produto H37 sobre os macrófagos e queratinócitos estimula-dos por IL-4.

As células são estimuladas durante 48 horas na presença de IL-(10 ng/mL), de modo a induzir o receptor com uma baixa afinidade pelosIgEs (CD23) em sua superfície. Completado este período de cultura, 30 a80% dos queratinócitos e dos macrófagos expressam CD23. As variaçõesindividuais não são em caso algum reflexão de uma situação alérgica dife-rente entre estes indivíduos. Qualquer que seja a situação, nesta fase deindução, o produto testado não modifica esta indução de CD23; de fato, nãopode ser observada uma diminuição menor do que 5% (n=8'j.Tabela 3: Indução da expressão de CD23 pelas diferentes células estimula-das por IL-4 na presença de ou na ausência de 10 mg/mL de H37

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As células são estimuladas durante 48 horas na presença ou naausência de 10 ng/mL de IL-4 e na presença ou na ausência de diferentesprodutos, ND = não detectável.

Depois que o CD23 foi retirado pelos complexos imunes quecontêm IgE1 é induzida a produção de um grande número de mediadores ecitocinas (em particular TNF) e de produtos que resultam do metabolismooxidativo, tais como derivados de nitrogênio. Este estímulo redefine in vitrouma reação inflamatória do tipo alérgico.

Neste caso, os resultados observados são em cada aspectocomparáveis com aqueles obtidos com IFN-gama e LPS, o que tende a de-monstrar que H37 exibe certas atividades antiinflamatórias (não-específicase alérgicas), provavelmente por meio de sua capacidade de regular as ca-pacidades oxidantes das células "inflamadas". Os resultados obtidos sãoresumidos nas seguintes duas tabelas:

Tabela 4A: Produção de nitro derivados (NO2", μΜ) após estímulo por IL-4 +LPS +/-10 mg/mL H37

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* Os valores entre parênteses são aqueles de células que não foram esti-muladas pelos complexos imunológicos que contêm IgE.O produto H37 exibe uma boa capacidade ce inibir a pioduçãode nitro derivados pelos macrófagos e pelos queratinócitos estimulados porIL-4.

Tabela 4B: Produção de TNF (pg/mL) após estímulo por IL-4 +/- 10 mg/mLH37

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Os valores entre parênteses são aqueles de células que não foram estimula-das pelos complexos imunológicos que contêm IgE1 ND = não detectável.

O produto H37 induz uma leve diminuição na produção de TNF-alfa pelos macrófagos e pelos queratinócitos estimulados por IL-4.

Apenas como durante o estímulo não-específico, parece queH37 aumenta a viabilidade a longo termo dos macrófagos e dos queratinó-citos estimulados pelos complexos imunológicos que contêm IgE1 o que, denovo, sugere muito fortemente que o produto H37 exerce sua ligeira ativida-de antiinflamatória por meio de uma atividade antioxidante em relação àscélulas alvo.

Portanto, parece que o produto H37 exibe uma atividade antiin-flamatória (alérgica ou não alérgica). Esta característica é muito importanteporque a seriedade das respostas inflamatórias, sejam ou não de origemalérgica, resulta do desequilíbrio no metabolismo oxidativo destas células. Éem particular deste desequilíbrio que é a fonte, pelo menos em parte, daregulagem dos fenômenos imunológicos associados com estas reações:este é o caso para reações alergênicas específicas e para a produção decitocinas.

2.3. Efeito dos produtos K17 e K18 sobre os queratinócitos e os macrófagosestimulados por IFN-qama + LPS

Drielina é representada por K17. Drielina é um poli-beta(1-3)-glicopiranose purificada a partir de membranas de levedura Saccharomycescerevisiae; ela está em solução em uma mistura de água / sorbitol.

O carboximetil-beta-glicano (vendido sob o nome comercial CMGlucan pela companhia Arnaud) é representado por K18.

Neste estudo, os produtos (10 mg/mL ou 1/00 v/v) são adiciona-dos 30 minutos antes do estímulo por IFN-gama + LPS. Em nenhum doscaso estes produtos apresentaram uma atividade citotóxica.

Tabela 5A: Produção de nitro derivados (NO2" em μΜ) após estímulo porIFN-gama + LPS +/- 10 mg/mL dos produtos K17 e K18

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* Os valores entre parênteses são aqueles de células que não foram esti-muladas por IFN-gama + LPS.

Os produtos K17 e K18 têm uma grande capacidade de inibir aprodução de nitro derivados pelos macrófagos e pelos queratinócitos esti-mulados por IFN-gama e LPS.

Tabela 5B: Produção de TNF (pg/mL) após estímulo por IFN-gama + LPS+/- 10 mg/mL dos produtos K17 e K18

<table>table see original document page 19</column></row><table>* Os valores entre parênteses são aqueles de células que não foram esti-muladas por IFN-gama + LPS, ND = não detectável.

A produção de TNF-alfa pelos macrófagos e pelos queratinóci-tos estimulados por IFN-gama + LPS é também afetada prejudicialmente napresença dos diferentes produtos em uma maneira comparável àquela ob-servada para os nitro derivados. Os produtos K17 e K18 inibem eficazmentea produção de TNF.

2.3. Efeito dos produtos K17 e K18 sobre os macrófagos e os queratinócitosestimulados por IL-4.

As células são estimuladas durante 48 horas na presença de IL-4 (10 mg/mL), de modo a induzir no receptor uma baixa afinidade pelos IgEs(CD23) em sua superfície. Completado este período de cultura, 30 a 80%dos queratinócitos e dos macrófagos expressam CD23. As variações indivi-duais não são em caso algum a reflexão de uma diferente situação alérgicaentre estes indivíduos. Qualquer que seja a situação, nesta fase de induçãonenhum dos produtos testados modifica esta indução de CD23; de fato nãopode ser observada uma diminuição menor do que 5% (n=8).

Depois que o CD23 foi retirado por complexos imunológicoscontendo IgE, é induzida a produção de um grande número de mediadorese de citocinas (em particular TNF) e de produtos resultantes do metabolismooxidativo, tais como derivados de nitrogênio. Este estímulo redefine in vitrouma reação inflamatória do tipo alérgico.

Tabela 6A: Produção de nitro derivados (NO2" em μΜ) após estímulo por com-plexos imunológicos contendo IgE (IL-4) +/-10 mg/mL dos produtos K17 e K18

<table>table see original document page 20</column></row><table>

* Os valores entre parênteses são aqueles de células que não foram esti-muladas por complexos imunológicos contendo IgE.

O produto K18 exibe uma atividade inibidora sobre a geração denitro derivados pelos queratinócitos e pelos macrófagos estimulados por IL-4.

Tabela 6B: Produção de TNF (pg/mL) após estímulo por IL-4 +/- K17 e K18

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* Os valores entre parênteses são aqueles de células que não foram esti-muladas por complexos imunológicos contendo IgE1 ND = não detectável.

O produto K18 exibe uma atividade inibidora sobre a geração deTNF pelos macrófagos e pelos queratinócitos estimulados por IL-4.

Parece, portanto, que K18 possui uma atividade antiinflamatórianão-específica e do tipo alérgico enquanto que o produto K17 tem apenasuma atividade antiinflamatória não-específica.

Conseqüentemente, os efeitos do produto K18 foram avaliadoscomo uma função da dose. Os resultados são ilustrados na Figura 1.

O K18 portanto inibe, em uma maneira que depende da dose, ageração de nitro derivados e também de TNF. Os resultados assim obtidosdemonstram que K18 exibe uma atividade antiinflamatória geralmente van-tajosa e que esta atividade é similar à de H37.Exemplo 2: Demonstração de uma sinergia de atividade entre CM-beta-glicano (K18) e extrato de ginkgo (H37)

São determinadas respectivamente as atividades antiinflamató-rias de K18 e de H37 e de sua combinação.

Os testes são realizados em um modelo de queratinócito, comoindicado no Exemplo 1 (Materiais e Processos) após estímulo, por um lado,por uma combinação de IFN-gama + LPS e, por outro lado, por IL-4 e com-plexos imunológicos contendo IgE.

Como mostrado na Figura 2, os produtos K18 e H37 agem emsinergia em suas funções antiinflamatórias.

Devia ser lembrado que esta atividade antiinflamatória abrangea atividade antiinflamatória não-específica e alérgica.

Exemplo 3: Análise da prevenção de mudanças cutâneas prejudiciais obti-das por irradiação UV A e UV B da pele humana

São produzidas culturas de órgão de acordo com o seguinteprotocolo: 10 fragmentos de pele de diferentes doadores (fonte: cirurgiaplástica) são colocados em inserções que são elas mesmas posicionadassobre cavidades de cultura. É adicionado meio de cultura (antibióticos, FCS)ao fundo das cavidades, a passagem entre os dois compartimentos sendoconseguida por difusão lenta através de uma membrana porosa (0,45 μιτι).

Antes de cada irradiação, cada creme cosmético (2 mg/cm2) édepositado diretamente sobre a pele durante 2 horas (as peles de controlesem tratamento serão analisadas em paralelo). Os 3 cremes e o excipientesão renovados três vezes por semana sobre as peles:

- creme 1: CM-glicano a 0,5%

- creme 2: Ginkgo biloba a a 0,05%

- creme 3: CM-glicano + extrato de Ginkgo biloba (H37)

- creme 4: excipiente (placebo Carbopol)

Após ter removido o excesso de creme, a pele é então irradiadacom 12 J/cm2 de UV A e 6 J/cm2 de UV B (lâmpada Vilber Lourmat T40M),equivalente a 20 DEM, as doses determinadas por um estudo preliminar quetorna possível obter rapidamente lesões no nível da epiderme e da dermecom, em particular, mudanças prejudiciais no colágeno e nas fibras elásti-cas. Estas doses são, além disso, equivalentes às doses usadas para ostestes de fotoemplastro e às doses usadas em modelos murinos sem pêlospara gerar células de queimadura solar.

É realizada irradiação todo dia. São realizadas três sessões deexposição e então os fragmentos de pele são coletados para as análises aseguir.A produção de derivados de oxigênio, tal corno oxido nítrico(NO), mostra ataque por radiação UV.

A possível proteção contribuída pelo creme será medida quan-titativamente por avaliação da diminuição na quantidade de nitritos e doaumento em SOD.

1) Determinação quantitativa de oxido nítrico e de nitritos

O óxido nítrico, NO, é um importante mediador fisiológico, nãosomente como vasodilatador e neurotransmissor mas também como agentepró-inflamatório. Sua síntese é mediada por uma enzima, NO síntase, que éexpressada por muitos tipos de célula e em particular pelos queratinócitos,quando eles são ativados.

O NO, obtido por oxidação de L-arginina por NO síntase, é umproduto instável que é rapidamente degradado a nitritos (NO2") e a nitratos(NO3"). Ele é a determinação espetrofotométrica quantitativa dos nitritos nosobrenadante da cultura na presença de reagente de Griess que revela aatividade da NO síntase.

Os resultados são apresentados na tabela a seguir.

Determinação quantitativa dos nitritos(nmol/mL) % de proteção

Peletratadacomcremel 21,6 ±7,3 14,7% ±8,2

Pele tratada com creme 2 21,4 ±3,6 13,5% ±5,8

Pele tratada com creme 3 16,4 ±2,9* 33,8% ±2,3*

Pele tratada com creme 4 24,9 ±5,3

* Resultado estatisticamente significativo (p < 0,05; teste de Student)

A percentagem de proteção foi calculada da seguinte maneira:(A-B/A) χ 100 em que A é o resultado com o creme N0. 4 e B o resultadocom o creme 1, 2 ou 3.

As peles tratadas com os cremes 1 e 2 exibem um ligeiro de-créscimo (não significativo) na produção de nitritos. O maior decréscimo éobtido com as peles tratadas com o creme 3, uma diferença que é estatisti-camente significativa em relação ao excipiente. O cálculo da percentagemde proteção confirma estes resultados, o creme 3 tendo ern particular umaproteção de 34%.

2) Determinação quantitativa de SOD

O ataque por radiação U.V. é refletido por uma diminuição no5 nível de SOD.

A atividade da superóxido dismutase é determinada pela técnicade McCord e Fridovich. Em resumo, os ânions superóxidos são geradospela ação de xantina oxidase sobre xantina. A SOD presente nas amostraspode então inibir a redução de citocromo C por estes ânions superóxidos. Aatividade da SOD está relacionada à quantidade de citocromo C reduzidaque resta no meio da reação.

Os resultados são expressados por percentagens de inibiçãoem relação ao excipientes (creme N0 4): a SOD hidrolisa uma porção dosradicais livres gerados pelo ataque U.V. e pelo sistema xantina / xantinaoxidase. Desse modo, a diminuição na densidade óptica (proporcional àquantidade de radicais livres) tornará possível avaliar quantitativamente di-retamente o nível de SOD.

Determinação quantitativa de SOD% de inibição

Peletratadacomcremel 11,1% ±3,4

Pele tratada com creme 2 7,04% ± 2,9

Pele tratada com creme 3 15,1% ± 3,3*

* Resultado estatisticamente significativo (p < 0,05; teste de Student)

Em relação ao excipiente, as peles tratadas com os cremes 1 e2 apresentam uma leve proteção (não significativa) contra o decréscimo naatividade de SOD induzida por radiação UV. Esta proteção é maior com aspeles tratadas com o creme 3, uma diferença que é estatisticamente signifi-cativa em relação ao excipiente.

Conclusão

A determinação quantitativa dos nitritos foi demonstrada, paraas peles tratadas com o creme N0. 3, um aumento significativo em suaquantidade em relação ao excipiente. Estes resultados tomam possível con-siderar a atividade protetora do creme N0. 3 em relação às variações der-mais prejudiciais geradas por componentes inflamatórios. As peles tratadascom os cremes 1 e 2 têm uma tendência apenas à proteção. Existe portantouma sinergia entre os componentes do creme N0. 3.

A determinação quantitativa de SOD parece confirmar esta aná-lise com proteção de peles tratadas com creme N0. 3 em relação às varia-ções de radical prejudiciais geradas por radiação U.V. As peles tratadascom os cremes 1 e 2 têm uma tendência apenas à proteção, mais acentua-da no caso do creme N0. 1.

Exemplo 4: Composições contendo combinações de acordo com a invençãoA) Formulação com agentes despiqmentadores

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Β) Formulação com retinol

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Claims

1. Composição para o tratamento de pele sensível e/ou alérgica,caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois compostos se-lecionados dentre:a) um composto anti-radical selecionado dentre: agentes de ex-pulsão de radical livre, antilipoperoxidantes e estimulantes da produção en-dógena das enzimas que degradam radicais livres;b) um composto antiinflamatório selecionado dentre: inibidoresde prostaglandina, inibidores de produção de citocina e inibidores da produ-ção de leucotrieno; ec) um composto antialérgico selecionado dentre: inibidores deproliferação de linfócito, inibidores da internalização de receptores de HLA einibidores de produção de citocina,com excipientes dermatologicamente ou cosmetologicamenteaceitáveis,com a condição de que:d) pelo menos um dos compostos tem a atividade aumentadaquando de sua combinação;e) a composição compreende pelo menos um, e de preferênciapelo menos dois, compostos escolhidos do grupo consistindo em: Ginkgobiloba e seus extratos, iramina, D-pantenol, moduleno, alfa-tocoferol e seusderivados, beta-glicano e seus derivados, ácido eicosapentanóico, ácido18beta-glicirretínico, monoglucuronídeo do ácido glicirretínico, glicirretinatode estearila, extrato de Scutellaria, lactoferrina, extrato de chá verde, vitami-na C, glutationa, fator epidermal do timo, derivados de azol e lipácido,e com a condição de que está excluída a combinação de vitamina E com umextrato de Scutellaria.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que compreende uma combinação sinérgica de um extrato deGingko biloba e de beta-glicano ou de um de seus derivados.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri-zada pelo fato de que o beta-glicano é substituído por grupos carboximetila.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a concentração de terpeno no extratode Gingko biloba é menor do que 1% peso/peso de matéria seca.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a concentração de extrato de Gingkobiloba está entre 0,001% e 10% peso/peso.

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a concentração de beta-glicano estáentre 0,001% e 10% peso/peso.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que ela compreende uma combinação escolhida dentre drielina+ lactoferrina, pantenol + extrato de chá verde ou D-pantenol + beta-sitoesterol.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que ela compreende pelo menos um outroprincípio ativo que é ativo pela via tópica cutânea.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizadapelo fato de que ela compreende pelo menos um princípio ativo escolhido dogrupo de retinóides e agentes despigmentadores.