BR122020012639B1

BR122020012639B1 - Métodos para a identificação de uma planta compreendendo um gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática de tipo c do milho

Info

Publication number: BR122020012639B1
Application number: BR122020012639-6A
Authority: BR
Inventors: Ruihua Ren; Bruce A. Nagel; Siva P. Kumpatla; Peizhong Zheng; Gary L. Cutter; Thomas W. Greene; Steven A. Thompson
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2010-10-06
Filing date: 2011-09-26
Publication date: 2021-04-27
Also published as: ZA201302204B; EP2625291A4; NZ707345A; AU2011312559B2; EP2625291A2; RU2603005C2; RU2747979C2; CN103249845B; US10117411B2; RU2016114532A; ES2744675T3; MX2013003917A; EP3018217B1; BR112013008387B1; US20120090047A1; EP3018217A3; UA114886C2; WO2012047595A3; RU2729107C2; AR083309A1

Abstract

a presente invenção refere-se ao mapeamento de alta reso-lução e clonagem de gene candidato de rf4, um gene restaurador de fertilidade do milho que restaura a fertilidade à esterilidade masculina citoplasmática de tipo c. a descrição também se refere a marcadores moleculares que estão firmemente ligados a ou residem dentro do ge-ne rf4. em algumas modalidades, apresentam-se métodos pelos quais sementes híbridas podem ser produzidas a partir de cruzamen-tos de uma planta masculina compreendendo marcadores moleculares de ácido nucleico que estejam ligados ou que residam dentro do gene rf4 e uma planta feminina portadora de cms tipo c.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[0001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisória Norte-americana Número de Série 61/390.526, depositado em 6 de outubro de 2010, e Pedido de Patente Não Provisória Número de Série 13/244.049, depositado em 23 de setembro de 2011 ambos para "GENE RF4 RESTAURADOR DA ESTERILIDADE MASCULINA CITOPLASMÁTICA (CMS) DE TIPO C DO MILHO, MARCADORES MOLECULARES E SEU USO." CAMPO TÉCNICO

[0002] A presente invenção refere-se a genes de fertilidade de plantas. Em algumas modalidades, a descrição se refere a Rf4, um gene restaurador de fertilidade do milho. Em modalidades particulares, a descrição se refere a composições e métodos para restaurar a fertilidade à esterilidade masculina citoplasmática de tipo C (CMS-C), por exemplo, usando marcadores moleculares ligados a, ou residindo em, o gene Rf4. Modalidades particulares se referem a métodos de uso de sequências de ácido nucleico particulares para identificar plantas que contenha o restaurador de fertilidade à CMS-C, e para a produção de sementes híbridas. Algumas modalidades particulares se referem a polipeptídios associados à restauração da fertilidade à CMS-C. FUNDAMENTOS

[0003] O desenvolvimento da criação de plantas híbridas tornou possíveis avanços consideráveis na qualidade e quantidade das colheitas produzidas. Um rendimento aumentado e a combinação de características desejáveis, como resistência a doenças e insetos, tole rância ao calor e à seca e variações na composição da planta são todos possíveis, em parte, devido a procedimentos de hibridização. Procedimentos de hibridização se baseiam na contribuição do pólen de uma planta progenitora masculina para uma planta progenitora feminina para produzir o híbrido resultante.

[0004] As plantas podem se autopolinizar se o pólen de uma flor for transferido para a mesma ou outra flor da mesma planta. As plantas podem ter polinização cruzada se o pólen se originar em uma flor de uma planta diferente. Plantas de milho (Zea mays) podem ser criadas tanto por técnicas de autopolinização, quanto de polinização cruzada. As plantas de milho têm flores masculinas, que estão localizadas no cabelo, e flores femininas, que estão localizadas na espiga da mesma planta. A polinização natural no milho ocorre quando o pólen do cabelo atinge os cabelos que são encontrados nas pontas de espigas incipientes. O desenvolvimento de híbridos de milho se baseia em sistema de esterilidade masculina.

[0005] O desenvolvimento de híbridos de milho requer o desenvolvimento de linhagens endogâmicas homozigóticas, o cruzamento dessas linhagens e a avaliação dos cruzamentos. Cruzamento de pedigree e seleção recorrente são dois métodos de criação usados para desenvolver linhagens endogâmicas a partir de populações. Os programas de criação combinam traços desejáveis de duas ou mais linhagens endogâmicas ou várias fontes de base ampla em grupos de criação a partir dos quais novas linhagens endogâmicas são desenvolvidas por autorreprodução e seleção de fenótipos desejados. Uma va-riedade de milho híbrida é um cruzamento de duas dessas linhagens endogâmicas, cada uma das quais podendo ter uma ou mais características desejáveis ausentes em uma ou complementando a outra. As novas plantas endogâmicas são cruzadas com outras linhagens en- dogâmicas, e os híbridos desses cruzamentos são avaliados para de terminar quais são desejáveis. A descendência híbrida da primeira geração é designada por Fi. No desenvolvimento de híbridos, buscam-se apenas os híbridos Fi. O híbrido Fi é tipicamente mais vigoroso que seus ascendentes endogâmicos. Esse vigor híbrido, chamado de hete- rose, leva tipicamente, por exemplo, a um crescimento vegetativo aumentado e a um rendimento aumentando.

[0006] Sementes de milho híbridas podem ser produzidas por um sistema de esterilidade masculina que incorpora remoção manual do cabelo. Para produzir sementes híbridas, o cabelo masculino é removido do ascendente endogâmico feminino em crescimento, que pode ser plantado em vários padrões de fileiras alternadas com o ascendente endogâmico masculino. Consequentemente, contanto que haja isolamento suficiente de pólen de milho estranho, as espigas do endogâmico feminino serão fertilizadas apenas com pólen do endogâmico masculino. A semente resultante é a semente Fi híbrida.

[0007] A remoção manual do cabelo é trabalhosa e cara. A remoção manual do cabelo também é frequentemente ineficaz, por exemplo, porque a variação ambiental no desenvolvimento da planta pode resultar no crescimento de cabelo nas plantas após a remoção manual do cabelo da planta ascendente feminina ser completada, ou porque um removedor de cabelos poderia não remover completamente o cabelo de uma planta endogâmica feminina. Se a remoção de cabelo for ineficaz, a planta feminina lançará pólen com sucesso, e algumas plantas femininas serão autopolinizadas. Isso resultará na colheita de sementes do endogâmico feminino, juntamente com as sementes híbridas que são normalmetne produzidas. A semente endogâmica feminina não é tão produtiva quanto a semente Fi. Além disso, a presença de sementes endogâmicas femininas pode representar um risco de segurança do germoplasma para o produtor das sementes híbridas.

[0008] Uma planta endogâmica feminina também pode ter seu ca belo mecanicamente removido por uma máquina. A remoção mecânica de cabelo é aproximadamente tão confiável quanto a remoção manual, mas é mais rápida e menos cara. Entretanto, a maioria das máquinas de remoção de cabelo produz mais danos às plantas do que a remoção manual de cabelo. Assim, nenhuma forma de remoção de cabelo atual é inteiramente satisfatória.

[0009] A esterilidade masculina genética é um método alternativo que pode ser usado na produção de sementes híbridas. O processo trabalhoso de remoção do cabelo pode ser evitado em alguns genóti- pos com o uso de plantas endogâmicas estéreis masculinas citoplas- máticas (CMS). Na ausência de um gene restaurador de fertilidade, plantas de um endogâmico CMS são estéreis masculinas como resultado de fatores resultantes do genoma citoplasmático, em oposição ao nuclear. Consequentemente, a característica de esterilidade masculina é herdada exclusivamente do ascendente feminino em lantas de milho, pois apenas a fêmea fornece citoplasma para a semente fertilizada. Plantas CMS são fertilizadas com pólen de outra endogâmica que não seja estéril masculina. O pólen da segunda endogâmica pode ou não contribuir com genes que tornem as plantas híbridas férteis masculinas. Normalmente, a semente de milho normal com cabelo removido e a semente CMS produzida do mesmo mesmo híbrido têm de ser misturadas para assegurar que haja cargas de pólen adequadas disponíveis para fertilização quando as plantas híbridas são cultivadas e para assegurar diversidade citoplasmática.

[00010] As desvantagens da CMS como um sistema para a produção de sementes híbridas incluem a associação de variantes específicas à CMS com suscetibilidade a certas doenças da colheita. Veja, por exemplo, Beckett (1971) Crop Science 11:724-6. Esse problema desencorajou especificamente o uso da variante CMS-T na produção de sementes de milho híbridas e teve um impacto negativo no uso de CMS no milho em geral.

[00011] A esterilidade masculina citoplasmática (CMS) é a incapacidade herdada por via materna de produzir pólen funcional. Mais de 40 fontes de CMS foram descobertas e classificadas em três grandes grupos por reações diferenciais de restauração de fertilidade no milho. Esses grupos são designados como CMS-T (Texas), CMS-S (USDA) e CMS-C (Charrua). Beckett (1971). No grupo CMS-T, dois genes dominantes, Rf1 e Rf2, que estão localizados nos cromossomos 3 e 9, respectivamente, são requeridos para a restauração da fertilidade do pólen. Duvick (1965) Adv. Genetics 13:1-56. O citoplasma S é restaurado por um único gene, Rf3, que foi mapeado no cromossomo 2. Laugh- nan e Gabay (1978) "Nuclear and cytoplasmic mutations to fertility in S male-sterile maize", em Maize Breeding and Genetics, pp. 427-446.

[00012] Em comparação com CMS-T e CMS-S, a restauração de fertilidade de CMS-C se mostrou muito complexa em análises anteriores. Duvick (1972), "Potential usefulness of new cytoplasmic male sterile e sterility system", em Proceeding of the 27th annual corn and sorghum research conference, pp. 197-201, descobriu que a restauração completa da fertilidade em CMS-C é controlada por um alelo dominante do gene Rf4. Khey-Pour et al. (1981) também descobriram que esse gene era suficiente para a restauração de CMS-C. Entretanto, Josephson et al. (1978), "Genetics and inheritance of fertility restoration of male sterile cytoplasms in corn", em Proceedings of the 33rd corn and sorghum research conference 7:13, propuseram que a res-tauração completa da fertilidade em CMS-C era condicionada pela ação complementar dos alelos dominantes de dois genes, Rf4 e Rf5, que foram, então, mapeados nos cromossomos 8 e 5, respectivamente. Sisco (1991) Crop Sci. 31:1263-6. Enquanto isso, Chen et al. (1979) Acta Agronom. Sin. 5(4):21-28, consideraram que dois genes restauradores dominantes em CMS-C tinham funções em duplicata. Complicando ainda mais o sistema, Vidakovic (1988), Maydica 33:5165, demonstraram a existência de três genes dominantes e complementares para a restauração completa da fertilidade em CMS-C, acrescentando o gene, Rf6. Vidakovic et al., (1997a) Maize Genet. Coop. News Lett. 71:10; (1997b) Maydica 42:313-6, relataram posteriormente que esses genes complementares, Rf4, Rf5 e Rf6, não eram, de fato, os únicos sistemas genéticos para a restauração da fertilidade em CMS-C de milho. Assim, os mecanismos de restauração da fertilidade de CMS-C continuam não resolvidos. Como resultado, é difícil selecionar linhagens restauradoras para algumas linhagens estéreis genotípicas.

[00013] Marcadores moleculares são particularmente úteis para acelerar o processo de introdução de um gene ou loci de traço quantitativo (QTL) em um cultivar de elite ou linhagem de criação mediante cruzamento retrógrado. Marcadores ligados ao gene podem ser usados para selecionar plantas que possuem o traço desejado, e marcadores por todo o genoma podem ser usados para selecionar plantas que sejam geneticamente similares ao ascendente recorrente (Young e Tanksley (1989) Theor. Appl. Genet. 77:95-101; Hospital et al. (1992) Genetics 132:1199-210).

[00014] A maioria dos genes restauradores de fertilidade de plantas foi clonada mediante uma estratégia de clonagem à base de mapa. Até agora, nove genes Rf foram isolados de várias espécies de plantas, incluindo o milho (Zea Mays L.) (Cui et al. (1996) Science 272:1334-6; Liu et al. (2001) Plant Cell 13:1063-78), petúnia (Petunia hybrida) (Bentolila et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1088792, rabanete (Raphanus sativus L.) (Brown et al. (2003) Plant J. 35:262-72; Desloire et al. (2003) EMBO Rep. 4:1-7; Koizuka et al. (2003) Plant J. 34:407-15), sorgo (Sorghum bicolor L.) (Klein et al. (2005) Theor. Appl. Genet. 111:994-1012), arroz (Oryza sativa L.) (Kazama e Toriyama (2003) FEBS Lett. 544:99-102; Akagi et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 108:1449-57; Komori et al. (2004) Plant J. 37:31525; Wang et al. (2006) Plant Cell 18:676-87; e Fujii e Toriyama (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(23):9513-8), e mimulus (Mimulus guttatus) (Barr e Fishman (2010) Genetics 184:455-65).

[00015] Todos os genes restauradores identificados, exceto Rf2 no milho e Rf17 no arroz, codificam diferentes proteínas de repetição pentatricopeptídica (PPR). Os genomas de plantas codificam várias centenas de proteínas PPR com muitas delas envolvidas na regulação da expressão de gene de organela. Lurin et al. (2004) Plant Cell 16:2089-103; e Schmitz-Linneweber e Small (2008) Trends Plant Sci. 12:663-70. Uma proteína PPR contém de 2 a 27 repetições de 35 ami- noácidos, chamados motivos PPR. Small e Peeters, (2000) Trends Bi- ochem. Sci. 25(2):46-7. Prevê-se que proteínas PPR se liguem a RNA (Delannoy et al. (2007) Biochemical Society Transactions 35:1643-7), e muitas proteínas PPR estão direcionadas a mitocôndrias, onde os genes e produtos associados a CMS estão localizados. Lurin et al. (2004), supra. As evidências sugerem que as proteínas PPR se ligam diretamente a transcritos de CMS. Akagi et al. (2004), supra; Gillman et al. (2007) Plant J. 49:217-27; e Kazama et al. (2008) Plant J. 55:619-28. Proteínas Rf reduzem a expressão de transcritos associados a CMS por alteração de seus padrões de processamento (Kazama & Toriyama (2003), supra), diminuição da estabilidade do RNA (Wang et al. (2006), supra; e Ohta et al. (2010) Plant Cell Rep. 29:359-69), ou evitando que sejam traduzidas (Kazama et al. (2008), supra).

[00016] Informações adicionais referentes a genes restauradores de fertilidade de milho, arroz, petúnia e rabanete podem ser encontradas no Pedido de Patente Norte-americana N0 de Série US2006/0253931, e nas patentes norte-americanas no 5.981.833, 5.624.842, 4.569.152, 6.951.970, 6.392.127, 7.612.251, 7.314.971, 7.017.375, 7.164.058, e 5.644.066.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[00017] Descreve-se aqui o mapeamento do locus Rf4 de milho em uma pequena região de 12 kb localizada no topo do cromossomo 8. Nessa região, o único candidato provável para Rf4 é um gene que codifica um fator de transcrição bHLH. Por clonagem do locus Rf4-bHLH de CMS-C, linhagens não restauradoras e restauradoras, foram identificadas inúmeras variações de sequência. No nível da proteína, a linhagem CMS-C e linhagens não restauradoras tinham todas a mesma sequência e são diferentes do alelo restaurador (também idênticos entre si) em 4 alterações de aminoácidos, incluindo um resíduo tirosina hidrofílico conservado dentro do domínio bHLH (Yi86@, que está trocado por um resíduo fenilalanina hidrofóbico (Fi87@ na linhagem restauradora.

[00018] O gene Rf4 de milho e seu polipeptídio codificado são aqui identificados, e moléculas de ácido nucleico compreendendo a sequência do gene Rf4 também são descritas. Surpreendentemente, o gene Rf4 não é um gene de proteína de repetição pentatricopeptídica (PPR), como quase todos os outros genes restauradores de fertilidade. Além disso, demonstra-se que a restauração de fertilidade no germo- plasma de sistema CMS-C/Rf4 da presente invenção é controlada por Rf4 como um único gene restaurador dominante, o que era inesperado devido ao recente trabalho de vários grupos. Veja, supra. O resíduo tirosina hidrofílico dentro do domínio bHLH do milho Rf4-bHLH (Yi86@, que é trocado por um resíduo fenilalanina hidrofóbico (F187) em linhagens restauradoras, é conservado entre monocotiledôneas. Assim, a identificação do gene Rf4 e de marcadores do gene Rf4 pode facilitar grandemente o desenvolvimento e a distribuição do traço de restauração de fertilidade CMS-C amplamente no germoplasma de plantas.

[00019] Em algumas modalidades, a mutação do resíduo tirosina conservado na posição 186 de Rf4-bHLH para um resíduo de aminoá- cido hidrofóbico (por exemplo, fenilalanina) é responsável pelo fenótipo restaurador no polipeptídio Rf4-bHLH. Assim, descrevem-se aqui genes Rf4-bHLH de milho ou ortólogos de genes Rf4-bHLH de milho que codifiquem um resíduo de aminoácido hidrofóbico nessa posição (conforme identificado por alinhamento de sequência), em que esses genes contribuem para um restaurador do fenótipo CMS-C quando introduzidos em uma planta.

[00020] Descrevem-se aqui marcadores moleculares de ácido nu- cleico que estão ligados a (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ou que residem dentro do gene Rf4 de milho. Em algumas modalidades, marcadores que estejam ligados a (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ou que residam dentro do gene Rf4 de milho, ou a própria sequência do gene Rf4 de milho, podem ser usados para introduzir o gene Rf4 de milho em organismos, por exemplo, plantas (por exemplo, milho e outras monocotiledôneas).

[00021] Também se descrevem aqui métodos de uso de marcadores moleculares de ácido nucleico que estejam ligados ou que residam dentro do gene Rf4, por exemplo e sem limitação, para identificar plantas com um gene restaurador funcional para CMS tipo C; para introduzir Rf4 em novos genótipos de plantas (por exemplo, mediante criação auxiliada por marcador ou transformação genética); e para produzir sementes híbridas de cruzamentos de uma planta masculina compreendendo marcadores moleculares de ácido nucleico que estejam ligados ou que residam dentro do gene Rf4 e uma planta feminina portadora de CMS tipo C.

[00022] Além disso, são descritos meios para restaurar a fertilidade no milho CMS-C, e meios para identificar plantas portadoras de um gene para restauração de fertilidade no milho CMS-C. Em alguns exemplos, um meio para restaurar a fertilidade no milho CMS-C pode ser um marcador que esteja ligado a (por exemplo, ligado, firmemente ligado ou ligado de maneira extremamente firme) ou que resida dentro do gene Rf4 de milho. Em alguns exemplos, um meio para identificar plantas portadoras de um gene para restauração de fertilidade no milho CMS-C pode ser uma sonda que hibridize especificamente com um marcador que esteja ligado a (por exemplo, ligado, firmemente ligado ou ligado de maneira extremamente firme) ou que resida dentro do gene Rf4 de milho.

[00023] Também são aqui descritos métodos pelos quais se podem produzir sementes híbridas a partir de cruzamentos de uma planta masculina compreendendo marcadores moleculares de ácido nucleico que estejam ligados a (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ou que residam dentro do gene Rf4 de milho e uma planta feminina portadora de CMS tipo C. A produção dessa semente híbrida pode resultar em uma economia de custo devido à eliminação da remoção manual ou mecânica do cabelo e também pode aumentar o rendimento de sementes.

[00024] Além disso, descrevem-se métodos de uso das moléculas de ácido nucleico aqui apresentadas para identificar sequências de Rf4 homólogas de espécies de plantas diferentes do milho (por exemplo, por comparação de sequência). Em algumas modalidades, o sistema CMS-C/Rf4 para a produção de sementes híbridas é introduzido em espécies de plantas diferentes do milho.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00025] A Figura 1 inclui 197 marcadores SNP que se determinou que estavam dentro da região do gene Rf4 e suas posições no mapa físico.

[00026] A Figura 2 inclui uma representação de trinta e quatro plantas recombinantes aleatoriamente selecionadas, com seus dados feno- típicos e dados genéticos correspondentes para 27 marcadores SNP.

[00027] A Figura 3 inclui uma representação das posições relativas de marcadores SNP para o gene Rf4 e genes dentro de uma região de 1,5 Mb no cromossomo 8.

[00028] A Figura 4 inclui uma representação das posições relativas de marcadores SNP para o gene Rf4 e genes dentro de uma região de 0,56 Mb e uma região de 100 Pb no cromossomo 8.

[00029] A Figura 5 inclui uma representação do mapeamento fino de Rf4 a uma região de 12 Pb. As letras indicam genótipos: A = homo- zigótico para BE4207 (CMS); H = Heterozigótico. As setas indicam marcadores de borda esquerda e direita de Rf4, e as duas plantas re- combinantes mais críticas.

[00030] A Figura 6 inclui uma representação em quadros da estrutura genômica de um alelo Rf4-bHLH, mostrando uma região codificadora inteira (INÍCIO até PARADA - 1,38 Pb), um 5’UTR/Promotor de 1,1 Pb, e um 3’ UTR/Terminador de 0,75 Pb.

[00031] A Figura 7 inclui alinhamentos de sequência de Rf4-bHLH dos seguintes genótipos de milho: B73, BE4207, B104, XJH58, BE9515 e MLW03. As posições de INÍCIO de Tradução, PARADA e marcador para DAS-CMS21 até DAS-CMS34 localizados dentro do gene estão marcadas. As localizações de SNPs e InDels estão sombreadas.

[00032] A Figura 8 inclui os alinhamentos de sequência previstos de cDNA de Rf4-bHLH dos seguintes genótipos de milho: B73, BE4207, B104, XJH58, BE9515 e MLW03. As posições de INÍCIO de Tradução, PARADA e marcador para DAS-CMS22-25, 28-29 e 31 localizadas dentro dos cDNAs estão marcadas.

[00033] A Figura 9 inclui os alinhamentos de sequência de proteína Rf4-bHLH previstos. As localizações do domínio bHLH conservado, sinais de localização nuclear (NLS) e posições de marcador corres- pondentes para DAS-CMS22, 23 e 28 estão marcadas A substituição Tyr por Phe no domínio bHLH é causada pela substituição de dinu- cleotideos AC por TT na posição 747 (da sequência de cDNA prevista de B73), quase adjacente ao marcador DAS-CMS24 (veja a Figura 8 e o polimorfismo ID 54 na Tabela 3).

[00034] A Figura 10 inclui dados mostrando padrões de expressão de Rf4-HLH. L1 = folha de 5 semanas, L2 = folha de 7 semanas, L3 = folha de 9 semanas, T = cabelos com anteras e pólens em desenvolvimento, P = pólens lançados. A = homozigótico para BE4207, H = He- terozigótico, B = Homozigótico para XJH58. Os dados representam médias de três plantas de cada genótipo para a F3 de segregação e 1 planta cada para os ascendentes. As barras de erro representam o desvio padrão.

[00035] A Figura 11 inclui alinhamentos de Rf4-bHLH de milho (do restaurador XJH58 e não restaurador BE4207) com seus ortólogos de outras espécies monocotiledôneas. A localização do domínio bHLH conservado está sublinhada. As quatro alterações de aminoácidos entre XJH58 Rf4-bHLH e BE4207 Rf4-bHLH estão marcadas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[00036] As sequências de ácidos nucleicos relacionadas na listagem de sequência anexa são mostradas usando abreviações de letras padronizadas para bases nucleotídicas, conforme definido em 37 C.F.R. § 1.822. Apenas uma fita de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, mas se compreende que a fita complementar está incluída por qualquer referência à fita apresentada. Por razões de simplicidade, quando se descreve um gene ou locus, o gene pode ser descrito pela forma mutante do gene (por exemplo, Rf4, em oposição a rf4), mesmo que a sequência real possa ser a forma de tipo selvagem do gene na localização genômica correspondente. Todavia, deve-se entender que ambos os alelos têm diferentes sequências, e ficará claro pelo contex to precisamente que alelo se pretende. Na listagem de sequência anexa:

[00037] As SEQ ID NOs:1-197 mostram sequências de nucleotí- deos exemplificativas de marcadores que estão ligados a (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ou que residem dentro do gene Rf4 de milho.

[00038] As SEQ ID NOs:198-211 mostram sequências de nucleotí- deos dentro de uma região de aproximadamente 0,56 Mb no topo do cromossomo 8 do milho, na qual o alelo Rf4 foi inicialmente mapeado. A SEQ ID NO:203 é o alelo Rf4-bHLH.

[00039] As SEQ ID NOs:212-216 representam diferenças de sequências de nucleotídeos exemplificativas entre as linhagens de milho CMS (BE4207) e restauradora (XJH58).

[00040] A SEQ ID NO:217 mostra a sequência de nucleotídeos do intervalo de aproximadamente 12 Pb da variedade de milho B73 na qual o alelo Rf4 foi mapeado de maneira fina.

[00041] A SEQ ID NO:218 mostra a sequência de nucleotídeos de um alelo Rf4-bHLH das variedades de milho B73 e BE4207.

[00042] A SEQ ID NO:219 mostra a sequência de nucleotídeos de um alelo bHLH da variedade de milho B104.

[00043] A SEQ ID NO:220 mostra a sequência de nucleotídeos de um alelo Rf4-bHLH das variedades de milho XJH58, BE9515 e MLW03.

[00044] A SEQ ID NO:221 mostra a sequência de nucleotídeos cDNA previsto de Rf4-bHLH das variedades de milho B73 e B4207.

[00045] A SEQ ID NO:222 mostra a sequência de nucleotídeos de um cDNA previsto de bHLH da variedade de milho B104.

[00046] A SEQ ID NO:223 mostra a sequência de nucleotídeos de um cDNA previsto de Rf4-bHLH das variedades de milho XJH58, BE9515 e MLW03.

[00047] A SEQ ID NO:224 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptidio Rf4-bHLH de milho previsto.

[00048] A SEQ ID NO:225 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptidio Rf4-bHLH de milho previsto.

[00049] A SEQ ID NO:226 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptidio Rf4-bHLH de Brachypodium distachyon previsto.

[00050] A SEQ ID NO:227 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptidio Rf4-bHLH de Sorghum bicolor previsto.

[00051] A SEQ ID NO:228 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptidio Rf4-bHLH de Oryza sativa previsto.

[00052] As SEQ ID NOs:229 e 230 mostram sinais de localização nuclear (NLSs) previstos em Rf4-bHLH.

MODO(S) PARA REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO I. Resumo das várias modalidades

[00053] Descrevem-se aqui modalidades particulares de genes com impacto na fertilidade masculina de plantas, Rf4 de milho e seus marcadores genéticos firmemente ligados, que possam ser úteis em vários sistemas para controlar a fertilidade masculina. Além disso, o polimorfismo inerente aos marcadores genéticos firmemente ligados apresentados permite que o criador da planta siga o alelo particular do gene, Rf4 ou rf4, em uma população de segregação. O gene Rf4 foi inicialmente mapeado no cromossomo 8 em três populações derivadas de cruzamentos de quatro cultivares de milho: BE4207 x BE9515; BE4207 x MLW03F e BE4207 x XJH58. O mapeamento fino e a clonagem baseada no mapa foram demonstrados a titulo de exemplo na população BE4207 x XJH58, localizando-se, por fim, o gene Rf4 a cerca de 12 Pb.

[00054] A restauração da esterilidade masculina citoplasmática (CMS) é uma prática agricola comum na produção de sementes hibri- das há muitos anos. O uso do gene restaurador de fertilidade (Rf) com a esterilidade masculina citoplasmática simplifica programas de produção de sementes e reduz os custos globais por eliminação total da remoção de cabelo manual e por máquina. Entretanto, os benefícios totais de aplicações da genética da restauração de fertilidade para esterilidade masculina citoplasmática de tipo C no milho para a produção de sementes híbridas não foram obtidos, porque estudos anteriores da genética da restauração da fertilidade para esterilidade masculina cito- plasmática de tipo C no milho produziram resultados conflitantes.

[00055] Em vista da importância prática da esterilidade masculina citoplasmática e da restauração da fertilidade do pólen na produção de sementes híbridas de milho, e da necessidade de diversificação de fontes de citoplasma, descrevem-se o mapeamento fino do gene restaurador Rf4 de milho para CMS-C em uma região muito pequena usando marcadores moleculares com uma técnica de genotipagem KASPar™ e a identificação do gene Rf4 de milho mediante clonagem baseada no mapa. Descobriu-se que o Rf4 é um gene restaurador dominante único para CMS-C em três endogâmicos de milho: BE9515, MLW03 e XJH58.

[00056] O Rf4 foi primeiro mapeado usando SSR e marcadores SNP em uma região de aproximadamente 5,0 Mb, partindo do marcador de SSR umc-1075 até o topo do braço curto do cromossomo 8. Uma população de validação F2 de BE4207 x XJH58 com 500 indivíduos foi criada e classificada quanto à fertilidade no campo. Um total de 197 marcadores SNP foram triados com a população de validação e 104 recombinantes foram identificados dentro da região de 5,0 Mb. Por comparação das classificações fenotípicas e os dados genotípicos para as linhagens recombinantes informativas, o gene Rf4 de milho foi positivamente identificado dentro de uma região de aproximadamente 0,56 Mb (14 genes), e provavelmente dentro de 100 Pb (6 genes).

[00057] Assim, o uso de modalidades dos métodos aqui apresenta- dos demonstrou que o gene Rf4 é selecionado do grupo que consiste em GRMZM2G122853 (SEQ ID NO:198); AC187051.4_FG005 (SEQ ID NO:199); GRMZM2G122851 (SEQ ID NO:200); GRMZM2G122850 (SEQ ID NO:201); GRMZM2G582028 (SEQ ID NO:202); GRMZM 2G021276 (SEQ ID NO:203); GRMZM2G381376 (SEQ ID NO:204); GRMZM2G081127 (SEQ ID NO:205); GRMZM2G085111 (SEQ ID NO:206); GRMZM2G085038 (SEQ ID NO:207); GRMZM2G317468 (SEQ ID NO:208); GRMZM2G328030 (SEQ ID NO:209); GRMZM2G 029450 (SEQ ID NO:210) e GRMZM2G077212 (SEQ ID NO:211).

[00058] Usando uma grande população de mapeamento fino de cerca de 5.000 indivíduos, o locus do Rf4 de milho foi mapeado em uma pequena região de aproximadamente 12 kb, localizada no topo do cromossomo 8. Demonstrou-se, dessa forma, que o gene Rf4 é selecionado do grupo que consiste em um elemento transponível de planta [GRMZM2G582028 (SEQ ID NO:202)] e um fator de transcrição básico-hélice-laço-hélice (bHLH) (GRMZM2G021276 (SEQ ID NO:203)). Desses dois genes, o único candidato provável para Rf4 é o fator de transcrição básico-hélice-laço-hélice (bHLH), GRMZM2G021276 (SEQ ID NO:203), é o gene Rf4. Assim, em modalidades particulares, o gene Rf4 é GRMZM2G021276 (SEQ ID NO:203), que é às vezes aqui chamado de Rf4-bHLH. Deve-se entender que um gene Rf4 também pode ser uma sequência de DNA que codifique o mesmo polipeptídio que o gene Rf4-bHLH de milho, por exemplo, a sequência codificadora de SEQ ID NO:203.

[00059] O locus bHLH foi clonado do milho CMS linhagem BE4207; milho linhagem B104 e três linhagens restauradoras de milho: XJH58, BE9515 e MLW03. Foram identificadas inúmeras variações de sequência entre diferentes endogâmicos. De maneira notável, as três linhagens restauradoras têm sequências de DNA de Rf4-bHLH idênticas, ao passo que B73 e BE4207 (que não contêm um restaurador Rf4 funcional) são idênticos. A sequência B104 4 mais similar ao alelo BE4207/B73 do que ao alelo restaurador. No nível da proteína, BE4207, B73 e B104 têm todos a mesma sequência e são diferentes do produto de gene do alelo restaurador em 4 alterações de aminoácidos, incluindo a substituição por uma fenilalanina hidrofóbica de uma tirosina hidrofílica conservada no domínio bHLH.

[00060] Consistente com a função de Rf4 na restauração da fertilidade do pólen, o alelo restaurador de Rf4-bHLH é especificamente expressado nos cabelos em desenvolvimento (com anteras e pólens) de plantas que restauram CMS-C. O milho CMS linhagem BE4207 não exerce anteras nem desenvolve pólens funcionais. Como resultado, muito pouca ou nenhuma expressão de Rf4-bHLH foi detectada em folhas e tecidos reprodutivos masculinos de plantas BE4207. Como o B73 (um endogâmico que não contém citoplasma CMS-C nem restaura CMS-C) tem expressão significativa de Rf4-bHLH, é improvável que a restauração da fertilidade seja devida a uma diferença no nível de expressão enter o alelo restaurador (Rf4-bHLH) e o alelo não restau-rador (rf4-bHLH).

[00061] Acredita-se que a restauração da fertilidade masculina seja devida a diferenças de sequência de aminoácidos entre os produtos de gene do alelo restaurador e do alelo não restaurador. Em particular, o Yi86 de Rf4-bHLH de milho está localizado na primeira hélice (Carre- tero-Paulet et al. (2010) Plant Physiol. 153:1398-412; e Pires e Dolan (2010) Mol. Biol. Evol. 27:862-74) dentro do domínio de ligação de DNA de bHLH, e esse resíduo é absolutamente conservado em B73 (não CMS, não restaurador), BE4207 (CMS, não restaurador), e em ortólogos do sorgo, arroz e Brachypodium. Esse resíduo hidrofílico é trocado por uma fenilalanina hidrofóbica (F187) nas três linhagens restauradoras de milho. Esas substituição não conservada poderia alterar significativamente a estrutura de hélice no domínio bHLH e afetar a ligação de DNA e a transcrição de gene a jusante. Em vista do exposto, prevemos que o alelo Rf4 de B104 não restaura a fertilidade CMS- C, pois B104 bHLH tem a sequência de proteína idêntica a B73 e BE4207 Rf4-bHLH, incluindo a tirosina conservada na posição 186.

[00062] Em algumas modalidades, os marcadores moleculares à base de Rf4-bHLH ou de alta produção firmemente ligados aqui descritos podem ser usados para identificação de genótipos com um restaurador Rf4, introgressão de Rf4 em novos genótipos no milho e outras plantas para conversão masculina e remoção de Rf4 de plantas femininas CMS. Com os marcadores e gene Rf4 em mãos, agora 4 possível transferir de maneira confiável Rf4 para germoplasmas de elite e aumentar a escala de uso do sistema CMS-C/Rf4 para a produção de sementes híbridas. Uma implementação completa desse sistema pode proporcionar benefícios financeiros significativos para a indústria agrícola e consumidores de seus produtos. II. Termos

[00063] Cruzamento retrógrado: Métodos de cruzamento retrógrado podem ser usados para introduzir uma sequência de ácido nucleico em plantas. A técnica de cruzamento retrógrado foi amplamente usada durante décadas para introduzir novos traços em plantas. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. Em um protocolo de cruzamento retrógrado típico, a variedade original de interesse (ascendente recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (ascendente não recorrente) portadora de um gene de interesse a ser transferido. A descendência resultante desse cruzamento é, então, novamente cruzada com o ascendente recorrente, e o processo é repetido até que se obtenha uma planta em que essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas da planta re-corrente sejam recuperadas na planta convertida, além do gene transferido do ascendente não recorrente.

[00064] Ligado, firmemente ligado e ligado de maneira extremamente firme: Conforme aqui usado, a ligação entre genes ou marcadores se refere ao fenômeno em que genes ou marcadores em um cromossomo mostram uma probabilidade mensurável de serem passados juntos para indivíduos na próxima geração. Quanto mais próximos os dois genes ou marcadores estiverem entre si, mais próxima de (1) essa probabilidade se torna. Assim, o termo "ligado" pode se referir a um ou mais genes ou marcadores que sejam passados juntamente com um gene com uma probabilidade maior que 0,5 (que é esperada de de uma seleção independente em que os marcadores/genes estejam localizados em diferentes cromossomos). Como a proximidade de dois genes ou marcadores em um cromossomo está diretamente relacionada à probabilidade de que os genes ou marcadores sejam passados juntos para indivíduos na próxima geração, o termo "ligado" também pode se referir aqui a um ou mais genes ou marcadores que estejam localizados a cerca de 2,0 Mb entre si no mesmo cromossomo do milho. Assim, dois genes ou marcadores "ligados" podem estar separados por cerca de 2,1 Mb, 2,00 Mb, cerca de 1,95 Mb, cerca de 1,90 Mb, cerca de 1,85 Mb, cerca de 1,80 Mb, cerca de 1,75 Mb, cerca de 1,70 Mb, cerca de 1,65 Mb, cerca de 1,60 Mb, cerca de 1,55 Mb, cerca de 1,50 Mb, cerca de 1,45 Mb, cerca de 1,40 Mb, cerca de 1,35 Mb, cerca de 1,30 Mb, cerca de 1,25 Mb, cerca de 1,20 Mb, cerca de 1,15 Mb, cerca de 1,10 Mb, cerca de 1,05 Mb, cerca de 1,00 Mb, cerca de 0,95 Mb, cerca de 0,90 Mb, cerca de 0,85 Mb, cerca de 0,80 Mb, cerca de 0,75 Mb, cerca de 0,70 Mb, cerca de 0,65 Mb, cerca de 0,60 Mb, cerca de 0,55 Mb, cerca de 0,50 Mb, cerca de 0,45 Mb, cerca de 0,40 Mb, cerca de 0,35 Mb, cerca de 0,30 Mb, cerca de 0,25 Mb, cerca de 0,20 Mb, cerca de 0,15 Mb, cerca de 0,10 Mb, cerca de 0,05 Mb, cerca de 0,025 Mb, cerca de 0,012 Mb e cerca de 0,01 Mb. Exemplos particulares de marcadores que estão "ligados" a Rf4 incluem sequências de nucleotídeos no topo do cromossomo 8 do genoma do milho, por exemplo, SEQ ID NOs:1-197; e os marcadores aqui chamados de polimorfismos ID n0 1-106 (Tabela 3).

[00065] Conforme aqui usado, o termo "firmemente ligado" pode se referir a um ou mais genes ou marcadores que estejam localizados a cerca de 0,5 Mb entre si no mesmo cromossomo do milho. Assim, fois genes ou marcadores "firmemente ligados" podem estar separados por cerca de 0,6 Mb, cerca de 0,55 Mb, 0,5 Mb, cerca de 0,45 Mb, cerca de 0,4 Mb, cerca de 0,35 Mb, cerca de 0,3 Mb, cerca de 0,25 Mb, cerca de 0,2 Mb, cerca de 0,15 Mb, cerca de 0,12 Mb, cerca de 0,1 Mb e cerca de 0,05 Mb. Exemplos particulares de marcadores que estão "firmemente ligados" a Rf4 incluem as SEQ ID NOs:6-9, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:115, SEQ ID NOs:118-120, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:183, SEQ ID NOs:189-191 e SEQ ID NO:197; e os marcadores aqui chamados de polimorfismo ID no 1-106 (Tabela 3).

[00066] Conforme aqui usado, o termo "ligado de maneira extremamente firme" pode se referir a um ou mais genes ou marcadores que estejam localizados a cerca de 100 Pb entre si no mesmo cromossomo de milho. Assim, dois genes ou marcadores "ligados de maneira extremamente firme" podem estar separados por cerca de 125 Pb, cerca de 120 Pb, cerca de 115 Pb, cerca de 110 Pb, cerca de 105 Pb, 100 Pb, cerca de 95 Pb, cerca de 90 Pb, cerca de 85 Pb, cerca de 80 Pb, cerca de 75 Pb, cerca de 70 Pb, cerca de 65 Pb, cerca de 60 Pb, cerca de 55 Pb, cerca de 50 Pb, cerca de 45 Pb, cerca de 40 Pb, cerca de 35 Pb, cerca de 30 Pb, cerca de 25 Pb, cerca de 20 Pb, cerca de 15 Pb, cerca de 12 kb, cerca de 10 kb, cerca de 5 kb e cerca de 1 kb. Exemplos particulares de marcadores que estão "ligados de maneira extremamente firme" a Rf4 incluem as SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:115, SEQ ID NOs:118-120, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:126 e SEQ ID NO:134, e os marcadores aqui chamados de polimorfismo ID n0 1-106 (Tabela 3).

[00067] Marcadores genéticos ligados, firmemente ligados e ligados de maneira extremamente firme de Rf4 podem ser úteis em programas de criação auxiliados por marcador para identificar um restaurador para tipos de genes de esterilidade masculina citoplasmática de tipo C do milho e para criar esse traço em variedades de milho.

[00068] Locus: Conforme aqui usado, o termo "locus" se refere a uma posição do genoma que corresponda a uma característica mensurável (por exemplo, um traço). Um locus SNP é definido por uma sonda que hibridiza ao DNA contido dentro do locus.

[00069] Marcador: Conforme aqui usado, um marcador se refere a um gene ou sequência de nucleotídeos que pode ser usada para identificar plantas com um alelo particular, por exemplo, Rf4. Um marcador pode ser descrito como uma variação em um dado locus genômico. Um marcador genético pode ser uma sequência de DNA curta, como uma sequência em volta de uma única alteração de par de bases (polimorfismo de nucleotídeo único ou "SNP"), ou uma longa, por exemplo, um minissatélite/repetição de sequência simples ("SSR"). Um "ale- lo marcador" se refere à versão do marcador que está presente em uma planta particular.

[00070] O termo marcador, conforme aqui usado, pode se referir a um segmento clonado de DNA cromossômico de milho (por exemplo, conforme definido por uma das SEQ ID NOs:1-197 ou polimorfismo ID no 1-106 (Tabela 3)), e pode, também ou alternativamente, referir-se a uma molécula de DNA que seja complementar a um segmento clona- do de DNA cromossômico de milho (por exemplo, DNA complementar a uma das SEQ ID NOs:1-197 ou polimorfismo ID n0 1-106 (Tabela 3)).

[00071] Em algumas modalidades, a presença de um marcador em uma planta pode ser detectada mediante o uso de uma sonda de ácido nucleico. Uma sonda pode ser uma molécula de DNA ou uma molécula de RNA. Sondas de RNA podem ser sintetizadas por meios conhecidos na técnica, por exemplo, usando um molde de molécula de DNA. Uma sonda pode conter toda ou uma parte da sequência de nucleotí- deos do marcador e uma sequência de nucleotídeos contígua adicional do genoma do milho. Isso é aqui chamado de "sonda contígua". A sequência de nucleotídeos contígua adicional é mencionada como "a montante" ou "a jusante" do marcador original, dependendo de se a sequência de nucleotídeos contígua do cromossomo do milho está no lado 5’ ou no 3’ marcador original, conforme convencionalmente entendido. A sequência de nucleotídeos contígua adicional pode estar localizada entre o marcador original e a região de 100 Pb no cromossomo 8 do genoma do milho que está localizada entre as posições no mapa 564,922 e 601,460. Assim, a sequência de nucleotídeos contígua pode estar localizada entre o marcador original e a região de 12 Pb no cromossomo 8 do genoma do milho que está localizada entre as posições no mapa 86247 e 98188. Conforme é reconhecido por aqueles versados na técnica, o processo de obtenção da sequência de nu- cleotídeos contígua adicional para inclusão em um marcador pode ser repetida quase indefinidamente (limitado apenas pelo comprimento do cromossomo), identificando, dessa forma, marcadores adicionais ao longo do cromossomo do milho. Todos os marcadores acima descritos podem ser usados em algumas modalidades da presente invenção.

[00072] Uma sequência de sonda oligonucleotídica pode ser preparada sinteticamente ou por clonagem. Vetores de clonagem adequados são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Uma sonda oligonucleotídica pode ser etiquetada ou não etiquetada. Existe uma ampla variedade de técnicas para etiquetar moléculas de ácido nucleico, incluindo, por exemplo e sem limitação: Radiomarcação por deslocamento de corte; priming aleatório; formação de cauda com desoxitransferase terminal; ou outra, em que os nucleotídeos empregados são etiquetados, por exemplo, com 32P radioativo. Outras etiquetadas que podem ser usadas incluem, por exemplo e sem limitação: Fluoró- foros; enzimas; substratos de enzima; cofatores de enzima; inibidores de enzima; e outros. Alternativamente, o uso de uma etiqueta que apresente um sinal detectável, por si mesma ou juntamente com outros agentes reativos, pode ser substituída por ligantes aos quais se liguem receptores, em que os receptores estão etiquetados (por exemplo, pelas etiquetas acima indicadas) para apresentar sinais de- tectáveis, por si mesmos ou juntamente com outros reagentes. Veja, por exemplo, Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9.

[00073] Uma sonda pode conter uma sequência de nucleotídeos que não seja contígua à do marcador original; essa sonda é aqui chamada de "sonda não contígua". A sequência da sonda não contígua está localizada suficientemente próximo da sequência do marcador original no genoma do milho, de modo que a sonda não contígua esteja geneticamente ligada ao mesmo gene (por exemplo, Rf4). Por exemplo, em algumas modalidades, a sonda não contígua pode estar localizada até 500 Pb, 450 Pb, 400 Pb, 350 Pb, 300 Pb, 250 Pb, 200 Pb, 150 Pb, 125 Pb, 120 Pb, 100 Pb, 0,9 Pb, 0,8 Pb, 0,7 Pb, 0,6 Pb, 0,5 Pb, 0,4 Pb, 0,3 Pb, 0,2 Pb ou 0,1 Pb do marcador original no genoma do milho.

[00074] Uma sonda pode ser uma cópia exata de um marcador a ser detectado. Uma sonda também pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo, ou consistindo em, uma sequência de nu- cleotídeos que seja substancialmente idêntica a um segmento clonado de DNA cromossômico de milho (por exemplo, conforme definido pelas SEQ ID NOs:1-197 e polimorfismo ID n0 1-106 (Tabela 3)). Conforme aqui usado, o termo "substancialmente idêntica" pode se referir a sequências de nucleotídeos que sejam mais de 85% idênticas. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica pode ser 85,5%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% idêntica à sequência de referência.

[00075] Uma sonda também pode ser uma molécula de ácido nu- cleico que seja "especificamente hibridizável" ou "especificamente complementar" a uma cópia exata do marcador a ser detectado ("DNA alvo"). "Especificamente hibridizável" e "especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementarieda- de, de modo que ocorra uma ligação estável e específica entre a molécula de ácido nucleico e o DNA alvo. Uma molécula de ácido nuclei- co não precisa ser 100% complementar a sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. Uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando há um grau suficiente de complemen- tariedade para evitar ligação não específico do ácido nucleico a sequências não alvo sob condições em que se deseje a ligação específica, por exemplo, sob condições rigorosas de hibridização.

[00076] As condições de hibridização que resultem em graus particulares de rigor variarão dependendo da natureza do método de hibri- dização de escolha e da composição e comprimento das sequências de ácidos nucleicos de hibridização. Genericamente, a temperatura de hibridização e a força iônica (particularmente a concentração de Nad e/ou Mg++) do tampão de hibridização determinarão o rigor da hibridi- zação, embora os tempos de lavagem também influenciem o rigor. Os cálculos referentes às condições de hibridização requeridas para atingir graus particulares de rigor são conhecidos por aqueles versados na técnica e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11; e Hames e Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instruções e orientações detalhadas adicionais com relação à hibridização de ácidos nucleicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acido probe assays", em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Greene Publishing e Wiley-Interscience, NY, 1995.

[00077] Conforme aqui usado, "condições rigorosas" englobam condições sob as quais a hibridização ocorrerá apenas se houver menos de 25% de falta de correspondência entre a molécula de hibridização e o DNA alvo. "Condições rigorosas" também incluem níveis particulares de rigors. Assim, conforme aqui usado, condições de "rigor moderado" são aquelas sob as quais moléculas com mais de 25% de falta de correspondência de se sequência não hibridizarão; condições de "médio rigor" são aquelas sob as quais moléculas com mais de 15% de falta de correspondência não hibridizarão; e condições de "alto rigor" são aquelas sob as quais sequências com mais de 10% de falta de correspondência não hibridizarão. Condições de "rigor muito alto" são aquelas sob as quais sequências com mais de 6% de falta de correspondência não hibridizarão.

[00078] Em modalidades particulares, condições rigorosas são uma hibridização a 65OC em 6x tampão de salina-citrato de sódio (SSC), 5x solução de Denhardt, 0,5% de SDS, e 100 μg de DNA de testículo de salmão cisalhado, seguido por 15-30 minutos de lavagens sequenciais a 65OC em 2x tampão SSC e 0,5% de SDS, seguido por 1x tampão SSC e 0,5% SDS e, finalmente, 0,2x tampão SSC e 0,5% de SDS.

[00079] Com relação às sondas acima discutidas, a sonda pode compreender sequências de ácidos nucleicos adicionais, por exemplo, promotores, sinais de transcrição e/ou sequências de vetor. Qualquer uma das sondas acima discutidas pode ser usada para definir adicionalmente marcadores que estejam firmemente ligados a um gene envolvido na restauração da fertilidade no milho estéril citoplasmático do tipo C (por exemplo, Rf4). Marcadores assim identificados podem ser equivalentes a marcadores exemplificativos nomeados na presente descrição e, portanto, estão dentro do âmbito da invenção.

[00080] Criação auxiliada por marcador: Conforme aqui usado, o termo "criação auxiliada por marcador" pode se referir a uma abordagem de criação direta para um ou mais traços complexos (por exemplo, restaurador de fertilidade CMS-C). Na prática atual, criadores de plantas tentam identificar facilmente traços detectáveis, como cor da flor, aparência do revestimento da semente ou variantes de isozima, que estejam ligados a um traço agronomicamente desejado. Os criadores de plantas seguem, então, o traço agronômico nas populações de segregação e criação seguindo a segregação do traço facilmente detectável. Entretanto, há muito poucas dessas relações de ligação disponíveis para uso na criação de plantas.

[00081] A criação auxiliada por marcador proporciona um processo eficiente em termos de tempo e custos para melhorar as variedades de plantas. Vários exemplos da aplicação de criação auxiliada por marcador envolvem o uso de marcadores de isozima. Veja, por exemplo, Tanksley e Orton, eds. (1983) Isozymes in Plant Breeding and Genetics, Amsterdam: Elsevier. Um exemplo é um marcador de isozima associado a um gene for para resistência a uma praga nematódica no tomate. A resistência, controlada por um gene designado por Mi, está localizada no cromossomo 6 do tomate e está muito firmemente ligada a Aps1, uma isozima fosfatase ácida. O uso do marcador de isozima Aps1 para selecionar indiretamente o gene Mi proporcionou as vantagens de que a segregação em uma população pode ser determinada inequivocamente com técnicas eletroforéticas padronizadas; o marcador de isozima pode ser contado no tecido de muda, evitando a necessidade de manter as plantas até a maturidade; e a codominância dos alelos de marcador de isozima permite a discriminação entre ho- mozigotos e heterozigotos. veja Rick (1983) em Tanksley e Orton, supra.

[00082] Operacionalmente ligado: Uma primeira sequência de nucleotídeos está operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se o promotor afetar a transcrição ou expressão da sequência codificadora. Quando produzidas de maneira recombi- nante, sequências de ácidos nucleicos operacionalmente ligadas são, em geral, contíguas e, quando necessário para unir duas regiões codificadoras de proteína, estão no mesmo quadro de leitura (por exemplo, em um ORF policistrônico). Entretanto, ácidos nucleicos não precisam ser contíguos para estarem operacionalmente ligados.

[00083] Promotor: Conforme aqui usado, o termo "promotor" se refere a uma região de DNA que pode estar a montante do início de transcrição e que pode estar envolvida no reconhecido e ligação de RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode estar operacionalmente ligado a um gene para expressão em uma célula, ou um promotor pode estar operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifique uma sequência de sinal que pode estar operacionalmente ligada a um gene para expressão em uma célula. Um "promotor de planta" pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos, como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueídes ou esclerênquima. Esses promotores são chamados de "de tecido preferencial". Promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são chamados de "específicos para tecido". Um promotor "específico para tipo de célula" ativa principalmente a expressão em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível" pode ser um promotor que possa estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbi- cas ou a presença de luz. Promotores específicos para tecidos, de tecido preferido, específicos para tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor que pode estar ativos sob a maioria das condições ambientais.

[00084] Qualquer promotor induzível pode ser usado em algumas modalidades da presente invenção. Veja Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Promotore induzíveis exemplificativos incluem, mas não se limitam a: Promotores do sistema ACEI que respondem a cobre; gene In2 do milho que responde a agentes de segurança contra herbicida de benzenossulfonamida; repressor Tet de Tn10; e o promotor induzível de um gene de hormônio esteróide, cuja atividade transcricional pode ser induzida por um hormônio glucocorticosteróide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421).

[00085] Promotores constitutivos exemplificativos incluem, mas não se limitam a: Promotores de vírus de plantas, como o promotor 35S de CaMV; promotores de genes da actina do arroz; promotores de ubiqui- tina ubiquitina; pEMU; MAS; promotor H3 histona do milho; e o promotor ALS, fragmento Xba1/Ncol 5' com relação ao gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou uma sequência de nucleotídeos similar ao dito fragmento Xba1/Ncol) (pedido PCT Internacional WO 96/30530).

[00086] Qualquer promotor específico para tecido ou de tecido preferido também pode ser utilizado em algumas modalidades da presente invenção. Plantas transformadas com um gene operacionalmente ligado a um promotor específico para tecido podem produzir exclusivamente o produto de proteína do transgene ou, de preferência, em um tecido específico. Promotores específicos para tecido ou de tecido preferido exemplificativos incluem, mas não se limitam a: Um promotor preferido por raiz, como o do gene da faseolina; um promotor específico para folha e induzido pela luz, como de cab ou rubisco; um promotor específico para antera, como de LAT52; um promotor específico para pólen, como de Zm13; e um promotor preferido por microesporo, como de apg.

[00087] Identidade de sequência: O termo "identidade de sequência" ou "identidade", conforme aqui usado no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídicas, pode se referir aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para máxima correspondência em uma janela de comparação especificada.

[00088] Quando a porcentagem de identidade de sequência é usada com referência a proteínas, reconhece-se que posições de resíduos que não sejam idênticas frequentemente difiram por substituições conservadoras de aminoácidos, em que resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, carga, hidrofobicidade ou efeitos es- téricos) e, consequentemente, não alteram as propriedades funcionais da molécula.

[00089] Consequentemente, quando as sequências diferem por substituições conservadoras, a porcentagem de identidade de sequência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição no sítio do resíduo não idêntico. Diz-se que sequências que diferem por essas substituições conservadoras têm "similaridade de sequência" ou "similaridade". Técnicas para fazer esse ajuste são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Tipicamente, essas técnicas envolvem a contagem de uma substituição conservadora como uma falta de correspondência parcial, em vez de total, aumentando, dessa maneira, a porcentagem de identidade de sequência. Por exemplo, quando um aminoácido idêntico recebe uma contagem entre 0 e 1, e uma substituição não conservadora recebe uma contagem de 0, uma contagem conservadora recebe uma contagem entre 0 e 1. A contagem das substituições conservadoras pode ser calculada, por exemplo, conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligene- tics, Mountain View, CA).

[00090] Conforme aqui usado, o termo "porcentagem de identidade de sequência" pode se referir ao valor determinado por comparação de duas sequências alinhadas de maneira ótima em uma janela de comparação, em que a parte da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, vãos) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada por determinação do número de posições em que o resíduo de nucleotídeo ou aminoácido ocorre em ambas as sequências para fornecer o número de posições correspondentes, divisão do número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicação do resultado por 100 para fornecer a por-centagem de identidade de sequência.

[00091] Polimorfismo de nucleotídeo único (SNP): Conforme aqui usado, o termo "polimorfismo de nucleotídeo único" pode se referir a uma variação de sequência de DNA que ocorre quando um único nucleotídeo no genoma (ou outra sequência compartilhada) difere entre membros de uma espécie ou cromossomos pareados em um indivíduo.

[00092] Em uma população, pode-se atribuir a uma pequena frequência de alelos de SNPs a menor frequência de alelos em um locus que se observe em uma população particular. Essa é simplesmente a menor das duas frequeências de alelos para polimorfismos de nucleotídeo único. Há variações entre populações humanas, de modo que um alelo de SNP que seja comum em um grupo geográfico ou étnico pode ser muito mais raro em outro.

[00093] Polimorfismos de nucleotídeo único podem se encontrar dentro de sequência codificadoras de genes, regiões não codificadoras de genes ou nas regiões intergênicas entre genes. SNPs dentro de uma sequência codificadora não alterarão necessariamente a sequência de aminoácidos da proteína que é produzida, devido à degeneração do código genético. Um SNP em que ambas as formas levem à mesma sequência polipeptídica é chamado de "sinônimo" (às vezes chamado de mutação silenciosa). Se for produzida uma sequência po- lipeptídica diferente, elas são chamadas de "não sinônimas". Uma alte-ração não sinônima pode ser com sentido errado ou sem sentido, em que uma alteração com sentido errado resulta em um aminoácido diferente, e uma alteração sem sentido resulta em um códon de parada prematuro. SNPs que não estejam em regiões codificadoras de proteína ainda podem ter consequências para a união de genes, ligação do fator de transcrição ou para a sequência de RNA não codificador. SNPs normalmente são bialélicos e, portanto, facilmente ensaiados em plantas e animais. Sachidanandam (2001) Nature 409:928-33.

[00094] InDel: Conforme aqui usado, o termo "InDel" é usado gene ricamente para descrever uma inserção ou uma deleção em um gene. Assim, uma "InDel" se refere simplesmente a uma mutação particular que pode ser uma inserção, uma deleção ou uma combinação dessas.

[00095] Traço ou fenótipo: Os termos "traço" e "fenótipo" são aqui usados de maneira intercambiável. Para fins da presente descrição, um traço de interesse particular é a restauração da fertilidade de CMS tipo C. III. Gene Rf4 restaurador de CMS-C de milho e seus marcadores moleculares

[00096] Apresentam-se marcadores moleculares que estão ligados (por exemplo, firmemente ligados) ao gene restaurador de CMS-C de milho, Rf4. Identificam-se segmentos de DNA contendo sequências envolvidas na restauração de fertilidade à plantas CMS-C. Esses segmentos estão localizados entre marcadores que estão ligados (por exemplo, firmemente ligados) ao gene Rf4. Assim, também se apresentam moléculas de ácido nucleico compreendendo o gene Rf4. Os segmentos identificados, e seus marcadores, são aqui descritos, em parte, por sua posição em uma região particular no topo do cromos

[00096] cadores particulares como unidades no mapa são expressadas com referência à sequência de genoma endogâmico de milho B73 pupblica- mente disponível (B73 RefGen v1 ou v2), que pode ser encontrada na rede mundial de computadores em www2.genoma.arizona.edu/geno- mas/ maize, ou ftp.maizesequence.org/current/assembly/. As sequências de genoma das variedades de milho BE4207 e XJH58 ainda não estão disponíveis. Espera-se que os números dados para segmentos e marcadores particulares como unidades no mapa possam variar de cultivar para cultivar e não sejam parte da definição essencial dos segmentos de DNA e marcadores, esses segmentos de DNA e marcadores sendo, de outra forma, descritos, por exemplo, por sequência de nucleotídeos.

[00097] O alelo dominante do gene Rf4 controla a restauração da fertilidade no sistema CMS-C/Rf4. Em algumas modalidades, determinou-se que o gene Rf4 é um gene selecionado do grupo que consiste em GRMZM2G122853 (SEQ ID NO:198); AC187051.4_FG005 (SEQ ID NO:199); GRMZM2G122851 (SEQ ID NO:200); GRMZM2G122850 (SEQ ID NO:201); GRMZM2G582028 (SEQ ID NO:202); GRMZM 2G021276 (SEQ ID NO:203); GRMZM2G381376 (SEQ ID NO:204); GRMZM2G081127 (SEQ ID NO:205); GRMZM2G085111 (SEQ ID NO:206); GRMZM2G085038 (SEQ ID NO:207); GRMZM2G317468 (SEQ ID NO:208); GRMZM2G328030 (SEQ ID NO:209); GRMZM 2G029450 (SEQ ID NO:210); e GRMZM2G077212 (SEQ ID NO:211). Em modalidades particulares, o gene Rf4 é Rf4-bHLH (SEQ ID NO:203). Por exemplo, um gene Rf4-bHLH é apresentado pela SEQ ID NO:220.

[00098] Em algumas modalidades, a invenção também inclui as sequências de nucleotídeos que são substancialmente idênticas a Rf4- bHLH. Por exemplo, em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico é um homólogo de Rf4 que seja pelo menos cerca de 85% idêntico a Rf4-bHLH. Um homólogo de Rf4 pode ser 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% idêntico a Rf4-bHLH. Esse homólogo de Rf4 pode ser prontamente identificado e isolado de quaisquer genomas completos ou parciais prontamente disponíveis para aqueles versados na técnica para uma variedade de organismos.

[00099] Algumas modalidades também incluem variantes funcionais do gene Rf4. Variantes funcionais de Rf4 incluem, por exemplo, a sequência de Rf4-bHLH compreendendo uma ou mais substituições, de- leções ou inserções de nucleotídeos, em que a variante funcional restaura a fertilidade masculina no milho CMS-C, conforme se pode medir por técnicas de rotina bem conhecidas por aqueles versados na técni ca. Por exemplo, a capacidade de uma variante particular do gene Rf4 de restaurar a fertilidade masculina no milho CMS-C pode ser determinada por introdução de rotina da mutação ou fragmento em plantas homozigóticas para um alelo estéril Rf4, seguido por observação de rotina da planta quanto a esterilidade masculina. Variantes funcionais do gene Rf4 podem ser criadas por mutagênese direcionada a sítio, mutação induzida, ou elas podem ocorrer como variantes alélicas (polimorfismos, por exemplo, SNPs). Em exemplos particulares, uma variante funcional de Rf4 é uma sequência de Rf4-bHLH compreendendo uma ou mais substituições, deleções ou inserções de nucleotídeos, de modo que a variante codifique um polipeptidio Rf4-bHLH compreendendo uma substituição de aminoácido hidrofóbico (por exemplo, Phe) para Y186 dentro do domínio bHLH.

[000100] Em algumas modalidades, portanto, variantes funcionais do gene Rf4 podem ser mutações de Rf4, ou fragmentos menores que a sequência inteira de Rf4, que retenham as propriedades de controle da esterilidade masculina do gene Rf4. Essas mutações e fragmentos são, portanto, consideradas como estando dentro do âmbito da invenção. Em vista desta descrição, aqueles versados na técnica podem determinar prontamente se uma mutação ou fragmento da sequência de Rf4 aqui apresentada retém as propriedades do gene Rf4.

[000101] Em algumas modalidades, a invenção também inclui poli- peptídios Rf4-bHLH (por exemplo, SEQ ID NO:225) e polipeptídios que sejam substancialmente idênticos a Rf4-bHLH. Por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídio que é substancialmente idêntico a Rf4-bHLH pode ser pelo menos cerca de 25% idêntico a Rf4-bHLH e ter um resíduo de aminoácido hidrofóbico (por exemplo, Phe) na posição correspondente a Fi87 da SEQ ID NO:225, conforme determinado por um alinhamento de sequência. Em algumas modalidades, um poli- peptídio que é substancialmente idêntico a Rf4-bHLH pode ser 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% idêntico a Rf4-bHLH. Esses polipeptídios que são substancialmente idênticos a Rf4-bHLH podem ser prontamente identificados e deduzidos de genomas completos ou parciais ou bibliotecas de cDNA prontamente disponíveis para aqueles versados na técnica para uma variedade de organismos. IV. Métodos de uso do gene Rf4

[000102] O gene Rf4 aqui descrito pode ser usado de qualquer uma das muitas maneiras conhecidas por aqueles versados na técnica para manipular um gene para causar um efeito desejado. Por exemplo e sem limitação, o gene Rf4 pode ser usado para: introduzir uma sequência Rf4 mutante em uma planta para causar esterilidade; para introduzir uma mutação na sequência de Rf4 nativa; para introduzir uma molécula de ácido nucleico antissentido direcionada para o DNA ou RNA de Rf4 em uma planta para afetar a fertilidade; para usar formações de grampo; ou para ligar sequências de Rf4 com outras sequências de ácidos nucleicos para controlar a expressão do produto do gene Rf4.

[000103] Por exemplo, em algumas modalidades, o gene Rf4 determinado a ser selecionado do grupo que consiste em GRMZM 2G122853 (SEQ ID NO:198); AC187051.4_FG005 (SEQ ID NO:199); GRMZM2G122851 (SEQ ID NO:200); GRMZM2G122850 (SEQ ID NO:201); GRMZM2G582028 (SEQ ID NO:202); GRMZM2G021276 (SEQ ID NO:203); GRMZM2G381376 (SEQ ID NO:204); GRMZM2G 081127 (SEQ ID NO:205); GRMZM2G085111 (SEQ ID NO:206); GRMZM2G085038 (SEQ ID NO:207); GRMZM2G317468 (SEQ ID NO:208); GRMZM2G328030 (SEQ ID NO:209); GRMZM2G029450 (SEQ ID NO:210); e GRMZM2G077212 (SEQ ID NO:211) pode ser usado para facilitar a utilização do sistema de fertilidade masculina CMS-C/Rf4 juntamente com outros genes ou mutantes com impacto sobre a fertilidade masculina no milho. Por exemplo, em modalidades particulares, o gene Rf4-bHLH pode ser usado para facilitar a utilização do sistema de fertilidade masculina CMS-C/Rf4 juntamente com outros genes ou mutantes com impacto sobre a fertilidade masculina no milho.

[000104] Em algumas modalidades, o gene Rf4 pode ser introduzido em uma planta de milho que seja adequada para uso em um sistema de fertilidade masculina diferente do sistema de fertilidade masculina CMS-C/Rf4. Alternativamente, um gene ou gene mutante diferente de Rf4 pode ser introduzido em uma planta de milho que seja adequada para uso no sistema de fertilidade masculina CMS-C/Rf4, de modo que o gene ou gene mutante introduzido possa ser usado para proporcionar um controle de fertilidade adicional ou complementar. Exemplos específicos de outros genes e mutações de fertilidade masculina no milho incluem: CMS-T/Rf1; CMS-T/Rf2; CMS-S/Rf3; ms1 (Singleton e Jones (1930) J. Hered. 21:266-8); ms2 e ms3 (Eyster (1931) J. Hered. 22:99-102); ms5, ms7, ms8, ms9, ms10, ms11, ms12, ms13, e ms14 (Beadle (1932) Genetics 17:413-31); ms17 (Emerson (1932) Science 75:566); ms20 (Eyster (1934) Bibliographia Genetica 11:187-392); ms23 e ms24 (West e Albertsen (1985) MNL 59:87); ms25 e ms26 (Loukides et al. (1995) Am. J. Bot. 82:1017-23); ms27 e ms38 (Albertsen et al. (1996) MNL 70:30-1); ms28 (Golubovskaya (1979) MNL 53:66-70); ms29 e ms31 (Trimnell et al. (1998) MNL 72:37-38); ms30 (Albertsen et al. (1999) MNL 73:48); ms32, ms36, e ms37 (Trimnell et al. (1999) MNL 73:48-50); ms33 e ms34 (Patterson (1995) MNL 69:126-8); ms43 (Golubovskaya (1979) Int. Rev. Cytol. 58:247-90); ms45 (Albertsen et al. (1993) Proc. Annu. Corn Sorghum Ind. Res. Conf. 48:224-33; e ms48, ms49, e ms50 (Trimnell et al. (2002) MNL 76:38-9).

[000105] Quando a sequência de ácido nucleico (por exemplo, Rf4) 4 "introduzida" em um organismo, como uma planta, a técnica ou meto dologia usada para a introdução de uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência particular não é essencial para a invenção, e pode ocorrer por qualquer técnica ou metodologia conhecida por aqueles versados na técnica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida por métodos de transformação direta, como transformação mediada por Agrobacterium de tecido vegetal; bombardeamento com microprojéteis; eletroporação e outras. Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida por cruzamento de uma planta com a sequência de nucleotídeos particular com outra planta, de modo que a descendência tenha a sequência de nucleotídeos incorporada em seu genoma. Essas técnicas de criação são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Técnicas de criação auxiliada por marcador, conforme expostas, podem facilitar grandemente a incorporação de Rf4 mediante esses cruzamentos.

[000106] Em modalidades em que o gene Rf4 é introduzido em um organismo, pode ser desejável que o gene Rf4 seja introduzido de modo que o gene Rf4 esteja operacionalmente ligado a uma ou mais sequências reguladoras, por exemplo, introdução mediante o uso de um plasmídio compreendendo o gene Rf4 operacionalmente ligado às sequências reguladoras desejadas. Sequências reguladoras utilizáveis na expressão de sequências de ácidos nucleicos heterólogas são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo e sem limitação: Promotores (por exemplo, promotores constitutivos; promotores específicos para tecido e promotores específicos para estágio de desenvolvimento); sequências de terminação; sequências intensificadoras; sequências de alvo subcelular; sequências estabilizadoras ou líderes; e íntrons.

[000107] Em algumas modalidades, o gene Rf4 pode ser introduzido em um organismo com uma ou mais sequências de ácidos nucleicos desejáveis adicionais (por exemplo, genes). Sequências de ácidos nu- cleicos desejáveis adicionais podem incluir, por exemplo: Genes que codificam proteínas estranhas; genes agronômicos; genes de resistência a doenças de plantas; genes que conferem resistência a uma praga de plantas; genes que conferem resistência a um herbicida; e genes que conferem ou contribuem para um traço de valor agregado (por exemplo, metabolismo de ácidos graxos modificado; teor diminuído de fitato; e composição de carboidratos modificada). Exemplos de todas as sequências de ácidos nucleicos acima mencionadas são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[000108] O gene Rf4 também pode ser introduzido em um organismo com um ou mais genes marcadores operacionalmente ligados a um elemento regulador (um promotor, por exemplo) que permite que células transformadas contendo o marcador sejam recuperadas por seleção negativa (isto é, inibição do crescimento de células que não contenham o gene marcador selecionável) ou por seleção positiva (isto é, triagem do produto codificado pelo marcador genético). Muitos genes marcadores selecionáveis para transformação são bem conhecidos nas técnicas de transformação e incluem, por exemplo, genes que codificam enzimas que detoxificam metabolicamente um agente químico seletivo, que pode ser um antibiótico ou um herbicida, ou genes que codificam um alvo alterado que pode ser insensível ao inibidor. Alguns métodos de seleção positiva também são conhecidos na técnica. Exemplos de genes marcadores adequados para uso em células vegetais podem incluir, por exemplo, e sem limitação: O gene de neomicina fosfotransferase II (nptll) (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803); o gene de higromicina fosfotransferase (Vanden Elzen et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:299); gentamicina acetil transferase, es- treptomicina fosfotransferase, aminoglicosida-3'-adenil transferase, e o determinante de resistência a bleomicina (veja, por exemplo, Hayford et al. (1988) Plant Physiol. 86:1216; Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86); Svab et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:197; e Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171); genes marcadores selecionáveis que conferem resistência a herbicidas, como glifosato, glufosinato ou bromoxinila (veja, por exemplo, Comai et al. (1985) Nature 317:741-744; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618; e Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); diidrofolato redutase de camundongo (Eichholtz et al. (1987) Somatic Cell Mol. Genet. 13:67); 5-enolpiru- vilshikimato-3-fosfato sintetase de planta (Shah et al. (1986) Science 233:478); acetolactato sintetase de planta (Charest et al. (1990) Plant Cell Rep. 8:643).

[000109] Outra classe de genes marcadores adequados para transformação de plantas emprega a triagem de células vegetais presumivelmente transformadas, em vez da seleção genética direta de células transformadas quanto à resistência a uma substância tóxica, como um antibiótico. Esses genes são particularmente úteis para quantificar ou visualizar o padrão espacial de expressão de um gene em tecidos específicos e são frequentemente chamados de "genes repórteres", porque podem ser fucionados a um gene ou sequência reguladora de gene para a investigação da expressão do gene. Genes comumente usados para a triagem de células transformadas incluem β-glucuroni- dase (GUS), β-galactosidase, luciferase e cloranfenicol acetiltransfera- se. veja, por exemplo, Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387; Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343; Koncz et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:131; e DeBlock et al. (1984) EMBO J. 3:1681.

[000110] Recentemente, métodos in vivo para a visualização da atividade de GUS que não requerem a destruição de tecido vegetal se tornaram disponíveis. Molecular Probes publicação 2908, Imagene Green.TM., p. 1-4, 1993; e Naleway et al. (1991) J. Cell Biol. 115:151a. Além disso, genes que codificam proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP, EGFP, EBFP, ECFP, e YFP) foram utilizados como marcadores para a expressão de gene em células procarióticas e eucarióti- cas. Veja Chalfie et al. (1994) Science 263:802. Proteínas fluorescentes e mutações de proteínas fluorescentes podem ser usadas como marcadores de triagem.

[000111] Em algumas modalidades, o gene Rf4 de milho e fragmentos ou segmentos do gene Rf4 de milho aqui apresentados podem ser usados para identificar sequências de Rf4 homólogas de organismos diferentes do milho (por exemplo, por comparação de sequência). Sequências de organismos diferentes do milho que sejam homólogas ao gene Rf4 de milho podem ser identificadas e isoladas de acordo com técnicas bem conhecidas, por exemplo, com base em sua homologia de sequência com Rf4-bHLH. Por exemplo, toda ou parte da sequência codificadora de Rf4-bHLH pode ser usada como uma sonda que hibridize especificamente com outras sequências presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados (isto é, uma biblioteca genômica) de um organismo de acordo com técnicas de roti-na. Assim, em algumas modalidades, a invenção inclui as sequências de nucleotídeos que hibridizam especificamente com uma sequência de Rf4-bHLH (por exemplo, SEQ ID NO:220).

[000112] Alternativamente, sequências de organismos diferentes do milho que sejam homólogas ao gene Rf4 de milho podem ser identificadas e isoladas por comparação de sequência. Por exemplo, o ge- noma sequenciado completo ou parcial de um organismo pode ser pesquisado de acordo com técnicas de rotina com uma sequência de Rf4-bHLH de milho (por exemplo, SEQ ID NO:220) para identificar genes com o genoma do organismo que compartilhem um alto grau de identidade de sequência com Rf4 de milho e sejam, consequentemente, prováveis homólogos de Rf4.

[000113] Por exemplo, toda ou parte de uma sequência de Rf4 de milho (por exemplo, SEQ ID NO:220) pode ser usada como uma "sequência de referência". Genericamente, sequências de ácidos nuclei- cos (por exemplo, fragmentos de DNA clonados ou genômicos de uma biblioteca genômica) que são comparadas com a sequência de referência compreendem uma "janela de comparação", que 4 um segmento contíguo específico da sequência de ácido nucleico. A janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, vãos) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. A janela de comparação tem tipicamente pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento, mas pode ter 30, 40, 50, 100 ou 200 nucleotídeos de comprimento ou mais. Para evitar uma alta similaridade com a sequência de referência devido à inclusão de deleções na janela de comparação da sequência polinucleotídica, pode-se introduzir uma "penalidade de vão" a ser subtraída do número de correspondências de nucleotídeos.

[000114] Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. A determinação da porcentagem de identidade de sequência entre quaisquer duas sequências pode ser realizada usando algoritmos matemáticos disponíveis. Exemplos não limitativos desses algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988), CABIOS 4:11-7; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443-53; o método de busca por alinhamento local de Pearson e Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, e Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7.

[000115] Um versado na técnica pode implementar esses algoritmos matemáticos em um computador para comparação de sequências a fim de determinar a identidade de sequência, ou para pesquisar uma base de dados compreendendo uma pluralidade de sequências (por exemplo, uma base de dados do genoma do organismo) de acordo com a identidade de sequência compartilhada com uma sequência de referência. Essas implementações incluem, mas não se limitam a, CLUSTAL no programa PC/Gene (Intelligenetics, Mountain View, CA); e o programa ALIGN e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no Pacote de Software GCG Wisconsin Genetics, v. 10 (Accelrys Inc., San Diego, CA). Alinhamentos de sequência usando esses programas podem ser realizados usando seus parâmetros predefinidos. Alternativamente, pode ser desejável modificar os parâmetros predefinidos em algumas buscas (por exemplo, alterar o valor de uma penalidade de vão). A seleção de uma implementação computadorizada particular de algoritmos matemáticos para o cálculo da identidade de sequência e a seleção de valores de parâmetro para uso em um algoritmo selecionado estão dentro das habilidades do versado na técnica.

[000116] Em algumas modalidades, o sistema CMS-C/Rf4 para a produção de sementes híbridas pode ser manipulado em uma variedade de milho desprovida de um gene restaurador Rf4 funcional ou em uma espécie de planta diferente do milho, por exemplo, por introdução do gene Rf4 nessa variedade de milho ou espécie de planta.

[000117] Assim, de acordo com algumas modalidades, o gene Rf4 aqui descrito pode ser usado em um método para a produção de sementes híbridas. Um método para a produção de sementes híbridas pode compreender a obtenção de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de Rf4-bHLH de milho (por exemplo, SEQ ID NO:220) ou uma sequência de nucleotídeos que hibridize especificamente com uma sequência de Rf4-bHLH de milho. Essa molécula de ácido nucleico pode ser, então, introduzida em uma célula vegetal ou tecido vegetal, em que a planta da qual a célula vegetal ou tecido vegetal é obtido pode ser Zea mays ou uma espécie de planta diferente. Subsequentemente, uma planta inteira transformada pode ser gerada a partir da célula vegetal ou tecido vegetal no qual se introduziu a molécula de ácido nucleico. Uma planta estéril masculina cito- plasmática pode ser, então, polinizada pela planta inteira transformada. Uma semente que gere uma planta fértil pode ser, então, obtida a partir da planta estéril masculina citoplasmática que tenha sido polinizada pela planta inteira transformada.

[000118] Em modalidades particulares, variantes ou homólogos funcionais do gene Rf4-bHLH de milho podem ser usados em lugar de uma sequência de Rf4-bHLH de milho (por exemplo, SEQ ID NO:220), ou da sequência de nucleotídeos que hibridiza especificamente com a sequência de Rf4-bHLH de milho, em um método para a produção de sementes híbridas. Uma planta inteira transformada que seja gerada, por exemplo, pelos métodos acima descritos pode ser capaz de produzir sementes. Entretanto, essas sementes podem ou não ser capazes de crescer como plantas férteis. Portanto, algumas modalidades dos métodos para a produção de sementes híbridas envolvem técnicas de cultura de tecido vegetal. Essas técnicas são rotineiras e am-plamente conhecidas por aqueles versados na técnica.

[000119] Em modalidades em que o sistema CMS-C/Rf4 para a produção de sementes híbridas é manipulado em espécies de plantas diferentes do milho, pode ser necessário também introduzir moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico envolvidas no sistema de esterilidade masculina CMS-C nas espécies de plantas. Por exemplo, o alelo Rf4-bHLH recessivo pode ser introduzido para substituir um ortólogo de Rf4-bHLH nas espécies de plantas a fim de gerar uma planta rf4/rf4 estéril masculina, na qual o gene Rf4-bHLH possa ser introduzido para manipular o sistema CMS- C/Rf4 para a produção de sementes híbridas na espécie.

[000120] Em algumas modalidades, o gene Rf4 aqui descrito pode ser usado em um método para a produção de sementes híbridas com preendendo a fertilização de uma planta feminina com o traço de esterilidade masculina CMS tipo C com pólen de uma planta masculina compreendendo o gene Rf4. Nessa e em outras modalidades, pode-se usar uma sequência de Rf4-bHLH de milho (por exemplo, SEQ ID NO:220), uma sequência de nucleotídeos que hibridize especificamente com a sequência de Rf4-bHLH de milho ou variantes ou homólogos funcionais da sequência de Rf4-bHH de milho.

[000121] Em algumas modalidades, um método para a produção de sementes híbridas compreende a geração de uma primeira planta compreendendo Rf4, por exemplo, por cruzamento retrógrado; muta- gênese; transformação; ou recombinação homóloga. Uma segunda planta com o traço de esterilidade masculina CMS tipo C pode ser, então, obtida ou gerada, por exemplo, por cruzamento retrógrado; muta- gênese; ou recombinação homóloga. A segunda planta pode ser, então, cruzada com a primeira planta para se obterem sementes híbridas férteis a partir da segunda planta. Em algumas modalidades, a primeira planta pode ser uma planta masculina, e a segunda planta pode ser uma planta feminina.

[000122] Em exemplos particulares de métodos para a produção de sementes híbridas, a planta pode ser uma planta de milho. Em exemplos adicionais, podem-se usar plantas diferentes do milho. Modalidades de métodos para a produção de sementes híbridas de acordo com a invenção são aplicáveis a qualquer planta, como plantas de reprodução sexuada, incluindo plantas de valor agronômico, por exemplo e sem limitação: milho; soja; alfalfa; trigo; colza; arroz; sorgo; beterraba; Brachypodium; monocotiledôneas; dicotiledôneas; vários legumes, incluindo pepino, tomate, pimentas e outros; várias árvores, incluindo maçã, pera, pêssego, cereja, sequóia, pinho, carvalho e outras; e várias plantas ornamentais. V. Métodos de uso de marcadores moleculares de Rf4

[000123] Métodos de uso de marcadores moleculares de ácido nu- cleico que estejam ligados ou que residam dentro do gene Rf4 para identificar plantas com um gene restaurador funcional para CMS tipo C podem resultar em economia de custo para desenvolvedores de plantas, porque esses métodos podem eliminar a necessidade de cruzar plantas compreendendo um gene restaurador funcional com linhagens de plantas CMS e, então, fenotipar as descendências do cruzamento.

[000124] Marcadores adicionais podem ser identificados como equivalentes a qualquer um dos marcadores exemplificativos aqui nomeados (por exemplo, SEQ ID NOs:1-197 e polimorfismo ID n0 1-106 (Tabela 3)), por exemplo, por determinação da frequência de recombina- ção entre o marcador adicional e um marcador nomeado exemplificati- vo. Essas determinações podem utilizar um método aperfeiçoado de constrastes ortogonais baseado no método de Mather (1931), The Measurement of Linkage in Heredity, Methuen & Co., London, seguido por um teste de probabilidade máxima para determinar uma frequência de recombinação. Allard (1956) Hilgardia 24:235-78. Se o valor da frequência de recombinação for menor que ou igual a 0,10 (isto é, 10%) em qualquer cultivar de milho, então, o marcador adicional é considerado equivalente ao marcador de referência particular para fins de uso nos métodos aqui apresentados.

[000125] Um meio para restaurar a fertilidade no milho CMS-C pode incluir uma sequência de ácido nucleico de uma planta, cuja detecção do ácido nucleico fornece pelo menos uma forte indicação de que a planta compreendendo a sequência de ácido nucleico compreende um restaurador funcional do gene CMS-C. Em alguns exemplos, um meio para restaurar a fertilidade no milho CMS-C é um marcador que esteja ligado a (por exemplo, ligado; firmemente ligado ou ligado de maneira extremamente firme) ou que resida dentro do gene Rf4-bHLH.

[000126] Um meio para identificar plantas de milho portadoras de um gene para restauração de fertilidade no milho CMS-C pode ser uma molécula que apresente um sinal detectável quando adicionado a uma amostra obtida a partir de uma planta portadora de um gene para restauração de fertilidade no milho CMS-C. A hibridização específica de ácidos nucleicos é um sinal detectável, e uma sonda de ácido nucleico que hibridize especificamente com um gene restaurador de CMS-C, ou uma sequência de ácido nucleico genômico diferente que seja um indicador da presença de um gene restaurador de CMS-C funcional, pode ser, portanto, um meio para identificar plantas de milho portadoras de um gene para restauração de fertilidade no milho CMS-C. Em alguns exemplos, um meio para identificar plantas portadoras de um gene para restauração de fertilidade no milho CMS-C é uma sonda que hibridize especificamente com um marcador que esteja ligado a (por exemplo, ligado, firmemente ligado ou ligado de maneira extremamente firme) ou que resida dentro do gene Rf4-bHLH de milho.

[000127] Em algumas modalidades, marcadores flanqueando o gene Rf4 podem ser usados para transferir segmentos de DNA ascendente doador que contenham inequivocamente do gene Rf4. Em modalidades particulares, os marcadores são selecionados do grupo de marcadores que compreende as SEQ ID NOs:1-197 e polimorfismo ID n0 1106 (Tabela 3), ou de marcadores equivalentes aos marcadores selecionados do grupo de marcadores que compreende as SEQ ID NOs:1- 197 e polimorfismo ID no 1-106 (Tabela 3). Em algumas modalidades, um método de uso de marcadores flanqueando o gene Rf4 para transferir segmentos de DNA ascendente doador que contenham inequivocamente o gene Rf4 pode compreender a análise do DNA genômico de duas plantas ascendentes com sondas que sejam especificamente hibridizáveis com marcadores ligados (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ao gene Rf4; cruzamento sexuado dos dois genótipos de plantas ascendentes para se obter uma população descendente e análise dessa descendência quanto à presença dos marcadores ligados (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ao gene Rf4; cruzamento retrógrado da descendência que contém os marcadores ligados (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ao gene Rf4 com o genótipo receptor para produzir uma primeira população de cruzamento cruzado e, então, continuação com um programa de cruzamento retrógrado até se obter uma descendência final que compreenda qualquer(quaisquer) traço(s) desejado(s) exibido(s) pelo genótipo ascedente e o gene Rf4. Em modalidades particulares, a descendência individual obtida em cada etapa de cruzamento e cruzamento retrógrado é selecionada por análise de marcador de Rf4 em cada geração. Em algumas modalidades, a análise do DNA genômico das duas plantas ascendentes com sondas que sejam especificamente hibridizáveis com marcadores ligados (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ao gene Rf4 revela que uma das plantas ascendentes compreende menos dos marcadores ligados aos quais as sondas hibridizam especificamente ou nenhum dos marcadores ligados com os quais as sondas hibridizam especificamente.

[000128] Em algumas modalidades, marcadores que estejam ligados a (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ou que residam dentro do gene Rf4-bHLH de milho, ou a própria sequência de gene Rf4-bHLH de milho, podem ser usados para introduzir o gene Rf4 de milho em uma planta de milho por transformação genética. Em modalidades particulares, os marcadores são selecionados do grupo de marcadores compreendendo as SEQ ID NOs:1-197 e polimorfismo ID n0 1-106 (Tabela 3), ou de marcadores equivalentes aos marcadores selecionados do grupo de marcadores compreendendo as SEQ ID NOs:1-197 e polimorfismo ID no 1-106 (Tabela 3). Em algumas modalidades, um método para a introdução do gene Rf4 de milho em uma planta de milho por recombinação genética pode compreender a análise do DNA genômico de uma planta (por exemplo, uma planta de milho) com sondas que sejam especificamente hibridizáveis com marcadores ligados (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ao gene Rf4 ou ao próprio gene Rf4 para identificar o gene Rf4 na planta; o isolamento de um segmento do DNA genômico da planta compreendendo o gene Rf4, por exemplo, por extração do DNA genômico e digestão do DNA genômico com uma ou mais enzimas endonuclease de restrição; opcionalmente, a amplificação do segmento isolado de DNA; a introdução do segmento isolado de DNA em uma célula ou tecido de uma planta de milho hospedeira; e a análise do DNA da planta de mi-lho hospedeira com sondas que sejam especificamente hibridizáveis com marcadores ligados (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ao gene Rf4 ou ao próprio gene Rf4 para identificar o gene Rf4 na planta de milho hospedeira. Em modalidades particulares, o segmento isolado de DNA pode ser introduzido na planta de milho hospedeira de modo que fique integrado de maneira estável no genoma da planta de milho hospedeira.

[000129] Em algumas modalidades, marcadores que estejam ligados a (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ou que residam dentro do gene Rf4-bHLH de milho, ou a própria sequência de gene Rf4-bHLH de milho, podem ser usados para introduzir o gene Rf4 de milho em outros organismos, por exemplo, plantas. Em modalidades particulares, os marcadores são selecionados do grupo de marcadores compreendendo as SEQ ID NOs:1-197 e polimorfismo ID n0 1-106 (Tabela 3), ou de marcadores equivalentes aos marcadores selecionados do grupo de marcadores compreendendo as SEQ ID NOs:1-197 e polimorfismo ID no 1-106 (Tabela 3). Em algumas modalidades, um método para a introdução do gene Rf4 de milho em um organismo diferente do milho pode compreender a análise do DNA genômico de uma planta (por exemplo, uma planta de milho) com sondas que sejam especificamente hibridi- záveis com marcadores ligados (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ao gene Rf4 ou ao próprio gene Rf4 para identificar o gene Rf4 na planta; o isolamento de um segmento do DNA genômico da planta compreendendo o gene Rf4, por exemplo, por extração do DNA genômico e digestão do DNA genômico com uma ou mais enzimas endonuclease de restrição; opcionalmente, a amplificação do segmento isolado de DNA; a introdução do segmento isolado de DNA em um organismo diferente do milho; e a análise do DNA do organismo diferente do milho com sondas que sejam especificamente hibridizáveis com marcadores ligados (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ao gene Rf4 ou ao próprio gene Rf4 para identificar o gene Rf4 no organismo. Em modalidades particulares, o segmento isolado de DNA pode ser introduzido no organismo de modo que fique integrado de maneira estável no genoma do organismo.

[000130] Em algumas modalidades, marcadores que estejam ligados a (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ou que residam dentro do gene Rf4, ou a própria sequência do gene Rf4, podem ser usados para identificar uma planta com um gene restaurador funcional para esterilidade masculina CMS- C. Em modalidades particulares, a planta é uma planta de milho. Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico (por exemplo, DNA genômico ou mRNA) podem ser extraídas de uma planta. As moléculas de ácido nucleico extraídas podem, então, ser contactadas com uma ou mais sondas que sejam especificamente hibridizáveis com marcadores ligados (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou liga- dos de maneira extremamente firme) ao gene Rf4 ou ao próprio gene Rf4. A hibridização específica da uma ou mais sonda às moléculas de ácido nucleico extraídas é indicativa da presença de um gene restaurador funcional para esterilidade masculina CMS-C na planta.

[000131] Em algumas modalidades, marcadores que estejam ligados a (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ou que residam dentro do gene Rf4, ou a própria sequência do gene Rf4, podem ser usados para produzir sementes híbridas. A produção de sementes híbridas de acordo com esses métodos pode resultar em uma economia de custos devido à eliminação da remoção manual ou mecânica do cabelo e também pode aumentar o rendimento de sementes. Em modalidades particulares, o método pode compreender o cruzamento de uma planta masculina compreendendo marcadores moleculares de ácido nucleico que estejam ligados a (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ou que residam dentro do gene Rf4 e uma planta feminina com o fenótipo de esterilidade masculina CMS tipo C. VI. Organismos compreendendo o gene Rf4

[000132] Algumas modalidades da presente invenção também apresenta um organismo que inclui uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de Rf4-bHLH (por exemplo, SEQ ID NO:220), uma sequência de ácido nucleico que seja especificamente hibridizável a uma sequência de Rf4-bHLH, ou uma variante funcional de uma sequência de Rf4-bHLH. Um organismo adequado pode ser qualquer planta, levedura ou bactéria adequada. A título de exemplo não limitativo, uma planta compreendendo as sequências acima mencionadas pode ser uma planta de valor agronômico, por exemplo e sem limitação: milho; soja; alfalfa; trigo; colza; arroz; sorgo; beterraba; Brachypodium; monocotiledôneas; dicotiledôneas; vários legumes, incluindo pepino, tomate, pimentas, e outros; várias árvores, incluindo ma çã, pera, pêssego, cereja, sequoia, pinho, carvalho, e outras; e várias plantas ornamentais. Em modalidades particulares, o organismo pode ser uma planta de reprodução sexuada. Uma planta produtora de sementes que compreenda uma sequência de ácido nucleico particular pode produzir sementes que compreendam a sequência de ácido nucleico.

[000133] Células vegetais compreendendo uma sequência de Rf4- bHLH (por exemplo, SEQ ID NO:220), uma sequência de ácido nucleico que seja especificamente hibridizável a uma sequência de Rf4- bHLH, ou uma variante funcional de uma sequência de Rf4-bHLH, podem ser cultivadas e mantidas como células em cultura de tecido vegetal, ou certos hormônios vegetais conhecidos na técnica podem ser acrescentados ao meio de cultura, fazendo, dessa forma, com que as células em cultura de tecido vegetal se diferenciem e formem uma nova variedade de planta, essa nova variedade de planta podendo ser fértil ou estéril. Métodos de cultura de plantas utilizáveis nessas e em outras modalidades são rotineiros e bem conhecidos na técnica.

[000134] Algumas modalidades da invenção apresentam um vírus (por exemplo, um bacteriófago ou vírus de planta) compreendendo uma sequência de Rf4-bHLH (por exemplo, SEQ ID NO:220), uma sequência de ácido nucleico que seja especificamente hibridizável a uma sequência de Rf4-bHLH, ou uma variante funcional de uma sequência de Rf4-bHLH.

[000135] Os exemplos a seguir são apresentados para ilustrar certas características e/ou modalidades particulares. Os exemplos não devem ser tomados como limitando a descrição às características ou modalidades particulares exemplificadas. EXEMPLOS Exemplo 1: Materiais e Métodos População de validação.

[000136] Uma linhagem estéril masculina de CMS tipo C, BE4207, e uma linhagem restauradora estéril masculina que responde a CMS tipo C, XJH58, foram usadas como ascendentes para gerar uma descendência Fi. A descendência Fi foi, então, cruzada consigo mesma para gerar uma população F2. A população F2, consistindo em 500 indivíduos, foi usada para a identificação do gene Rf4 e marcadores ligados (por exemplo, ligados, firmemente ligados ou ligados de maneira extremamente firme) ao gene Rf4. Mapeamento fino da população F3 de BE4207/XJH58

[000137] Um total de 5.465 sementes selecionadas de 15 famílias F2 heterozigóticas da população F2 de validação, segregando para diferentes fragmentos dentro da região de 4,2 Mb no topo do cromossomo 8, foram plantadas em um viveiro de versão em 2010 em Arlington, Wisconsin. Amostras de folhas foram coletadas de 5.104 mudas germinadas para genotipagem. Classificação da fertilidade.

[000138] As 500 plantas nessa população F2 foram fenotipicamente classificadas de acordo com o pólen lançado pelo cabelo. As plantas que lançaram pólen foram classificadas como férteis. As plantas que não lançaram pólen foram classificadas como estéreis. A restauração de Rf4 nessa população foi completa; nenhuma planta fértil parcial foi observada. Extração e quantificação de DNA.

[000139] 8 punções de tecido de folha foram coletadas de cada planta da população F2, e o DNA foi extraído usando o Biocel™ 1800 (Agilent Inc., Santa Clara, CA). O processo de extração de DNA usado foi: (1) Adicionar um glóbulo de liga de tungsténio de ~0,32 cm de diâmetro a cada tubo; (2) adicionar 300 μL de tampão de lise RLT (Qiagen Inc., Germantown, MD) a cada tubo; (3) tampar e triturar durante 6 minutos a 1.500 golpes/minuto em um SPEX 2000 Geno/Grinder® (OPS Diagnostics, LLC, Lebanon, NJ); (4) centrifugar as amostras a 6.000 rpm durante 5 minutos; (5) destampar os tubos; as etapas seguintes são realizadas no Biocel™ 1800: (6) Transferir 200 μL de sobrenadan- te a uma planta de ensaio de poço quadrado e fundo redondo de 1,1 mL contendo 10 μL de Blóbulos G de Suspensão MagAttract® (Qiagen Inc.); (7) incubar durante 2 minutos; (8) agitar a 1.200 rpm durante 40 segundos; (9) incubar durante 2 minutos; (10) colocar a placa de ensaio sobre a prateleira magnética e deixar que os glóbulos se separarem durante 40 segundos; (11) remover o sobrenadante; (12) primeira lavagem - adicionar 190 μL de tampão de lavagem RPW™ pré- misturado com RNase e Isopropanol, e agitar a 1.200 rpm durante 40 segundos; (13) colocar a placa de ensaio sobre a prateleira magnética e deixar que os glóbulos se separem durante 20 segundos; (14) remover o sobrenadante; (15) segunda lavagem - adicionar 190 μL de tampão de lavagem etanol a 100%, e agitar a 1.200 rpm durante 40 segundos; (16) colocar a placa de ensaio sobre a prateleira magnética e deixar que os glóbulos se separem durante 20 segundos; (17) terceira lavagem - adicionar 190 μL tampão de lavagem etanol a 100%; (18) agitar a 1.200 rpm durante 40 segundos; (19) colocar a placa de ensaio sobre a prateleira magnética e deixar que os glóbulos se separem durante 20 segundos; (20) remover o sobrenadante; (21) incubar a placa durante 5 minutos à temperatura ambiente; (22) adicionar 100 μL de tampão de eluição AE™ (Qiagen Inc.); (23) agitar durante 2 minutos; (24) colocar a placa de ensaio sobre a prateleira magnética e deixar que os glóbulos se separem durante 30 segundos; e (25) transferir o sobrenadante para uma placa limpa etiquetada e lacrar. O DNA foi armazenado a 40C. O DNA foi quantificado usando PicoGreen® (Invi- trogen Inc., Carlsbad, CA), e a concentração foi normalizada a 5 - 6 ng/μL para uso no sistema de genotipagem KASPar™ (KBioscience Inc., Hoddesdon, UK). Sistema de Genotipagem de SNP KASPar™.

[000140] O sistema de de genotipagem por PCR específico para alelo competitivo (KASPar™) é um sistema de detecção de SNP que usa uma técnica baseada em oligoextensão específica para alelo e transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) para geração de sinal. Cada marcador SNP em um ensaio KASPar™ requer apenas dois componentes: A mistura de ensaio (uma mistura de três primers não etiquetados: dois oligo específicos para alelo e um oligo específico para locus reverso comum); e a mistura de reação (os outros componentes requerido para PCR, incluindo o sistema repórter fluorescente universal e Taq polimerase).

[000141] Usou-se o Sistema de Controle de Informação Laboratorial KBioscience (KLIMS™) (KBioscience Inc.) para o projeto do primer, e os oligonucleotídeos foram sintetizados pela Integrated DNA Technology (Coralville, IA). As reações KASPar™ foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. A PCR começou com desnaturação a 94OC durante 15 minutos, seguido por 20 ciclos de 10 segundos de desnaturação a 94OC, 5 segundos de anelamento a 57OC, então, 10 segundos de extensão a 72OC, esses 20 ciclos sendo seguidos por 22 ciclos com 10 segundos de desnaturação a 94OC, 20 segundos de anelamento a 57OC, então, 40 segundos de extensão a 72OC. Os sinais fluorescentes após o término das reações KASPar™ foram lidos em um espectrofluorômetro (Tecan GENios™, Mannedorf, Suíça) com um comprimento de onda de excitação a 485 nm, e um comprimento de onda de emissão a 535 nm para o fluoróforo FAM; e um comprimento de excitação a 525 nm, e um comprimento de onda de emissão a 560 nm para o fluoróforo VIC. Os dados foram analisados usando o software Klustercaller™ (KBiosciences Inc.) para determinar os genó- tipos de cada marcador SNP em uma população. Extração de RNA e PCR em tempo real (RT-PCR)

[000142] Ascendentes e plantas F3 segregando para a região Rf4 foram cultivados em uma estufa. Tecidos de folha foram coletados de plantas com 5 semanas, 7 semanas e 9 semanas de idade. Tecidos de cabelo com anteras/pólens em desenvolvimento e pólens lançados (em plantas férteis) também foram coletados. O RNA total foi extraído usando um Mini Kit Para Plantas RNeasy™ (Qiagen Inc.). O cDNA foi sintetizado usando o Kit de Transcrição Reversa QuantiTect™ (Qiagen Inc.). Para RT-PCR, primers específicos para o gene Rf4, primers de controle de invertase do milho e sondas duplamente etiquetadas com FAM ou VIC e corantes Minor Groove Binding Non Fluorescence Quencher™ I (MGBNFQ) foram sintetizados pela Applied Biosystems (Foster City, CA). Usou-se a mistura mestra de genotipagem TaqMan™ (Applied Biosystems) para estabelecer reações de PCR de 10 μL, e a PCR foi realizada em um LightCycler™ 480 (Roche). O programa de PCR incluiu: 10 minutos de ativação a 95OC, seguido por 50 ciclos de 95OC durante 10 segundos e 58OC durante 38 segundos. Os sinais de fluorescência foram registrados ao término de cada ciclo. O nível de expressão relativa foi calculado usando-se o método Delta CT, que usa invertase como o controle. Exemplo 2: Mapeamento do gene Rf4 Análise de segregação de fertilidade.

[000143] A razão de segregação de fertilidade na população F2 foi de 3:1. Tabela 1. Os resultados demonstraram que a restauração da fertilidade no sistema CMS-C/Rf4 é controlada por um gene restaurador dominante, Rf4. Tabela 1: Dados de fenótipo da população de validação.

[000144] Mapeamento genético preliminar de Rf4 na população F2 usando marcadores SNP.

[000145] 101 marcadores SNP localizados próximo ao topo do cro- mossomo do milho 8 foram usados na triagem de ascendentes com 5 populações de mapeamento de Rf4 diferentes, e se determinou que estavam dentro da região de Rf4 de 5,0 Mb. Um conjunto de 12 marcadores eram polimórficos em todas as cinco populações, ao passo que 27, incluindo os 12 marcadores polimórficos comuns, mostravam polimorfismo entre os ascendentes da população F2 de BE4207 x XJH58. Os 12 marcadores comuns foram inicialmente usados para genotipos todos os 500 indivíduos na população F2 para identificar linhagens recombinantes dentro da região de 5,0 Mb. Os 15 marcadores polimórficos restantes foram, então, usados para genotipar todas as 104 linhagens recombinantes. Trinta e quatro recombinantes aleatoriamente selecionados são mostrados na Figura 2, com seus dados fenotípicos e dados genotípicos correspondentes para os 27 marcadores como exemplos. Uma análise mais detalhada das 42 linhagens re-combinantes mais informativas revelou que o gene Rf4 está localizado em uma região de aproximadamente 1,505 Mb no topo do cromossomo 8, definida pelo marcador SNP DAS-PZ-40624 (SEQ ID NO:8). Dentro dessa região, há aproximadamente 30 genes (dados não mostrados).

[000146] De maneira interessante e inesperada, em vista do fato de que todos os genes restauradores anteriormente identificados, exceto o Rf2 de milho e o Rf17 de arroz, codificam proteínas de repetição pentatricopeptídica (PPR), não há nenhum gene PPR previsto na região de 1,505 Mb que contém Rf4, embora haja três genes PPR localizados em 1,509, 4,288 e 4,748 Mb respectivamente. Figura 3.

[000147] Mapeamento genético fino de Rf4 com recombinantes informativos e marcadores SNP adicionais.

[000148] Para um mapeamento fino adicional da localização no cromossomo do gene restaurador, Rf4, 96 marcadores SNP localizados das posições de nucleotídeos 12.507 a 1.504.526 no cromossomo 8 foram selecionados para um levantamento do polimorfismo de ascendentes. 28 marcadores SNP eram polimórficos entre os dois ascendentes de mapeamento. 93 recombinantes, incluindo alguns recombi- nantes informativos em potencial não incluídos na rodada de triagem anterior, foram selecionados para genotipagem com os 28 marcadores. Utilizando a mesma comparação de fenótipo/genótipo acima descrita, o gene Rf4 foi positivamente mapeado em uma região de 0,56 Mb usando os 19 recombinantes mais informativos, definidos por plantas S-301 e S-115 e o marcador SNP PZE-108000459 (SEQ ID NO:134) como a borda direita, conforme mostrado na Figura 4. Com base nos dados genotípicos e fenotípicos da S-378 (estéril), o gene Rf4 pode residir dentro de uma região de menos de 100 Pb, definida pelo marcador SNP PZE-108000086 (SEQ ID NO:105). Veja a Figura 4. Consequentemente, Rf4 foi mapeado em uma região de 0,56 Mb que contém aproximadamente 14 genes, e também mapeado em uma região de de menos de 100 Pb que contém seis genes em potencial. Veja a Tabela 2. A sequência do gene Rf4 é selecionada do grupo que consiste em GRMZM2G122853 (SEQ ID NO:198); AC187051.4_F G005 (SEQ ID NO:199); GRMZM2G122851 (SEQ ID NO:200); GRMZM2G122850 (SEQ ID NO:201); GRMZM2G582028 (SEQ ID NO:202); GRMZM2G021276 (SEQ ID NO:203); GRMZM2G381376 (SEQ ID NO:204); GRMZM2G081127 (SEQ ID NO:205); GRMZM2G 085111 (SEQ ID NO:206); GRMZM2G085038 (SEQ ID NO:207); GRMZM2G317468 (SEQ ID NO:208); GRMZM2G328030 (SEQ ID NO:209); GRMZM2G029450 (SEQ ID NO:210); e GRMZM2G077212 (SEQ ID NO:211). Tabela 2. Genes previstos dentro da região de Rf4.

[000149] Esses resultados são consistentes com aqueles relatados em um quadro intitulado "Restauração da esterilidade masculina cito- plasmática de tipo C no milho: Mapeamento fino de Rf4", recentemen- te apresentado por Kohls et al. na Conferência de Genética do Milho de 2010. Kohls et al. alegadamente mapearam um gene Rf4 em uma região de 0,5 Mb próxima ao topo do cromossomo 8 usando um núme- ro limitado de marcadores. Entretanto, os materiais genéticos usados por Kohls et al. eram muito diferentes dos usados no trabalho aqui descrito. De maneira importante, Kohls et al. descobriram porcenta- gens significativas de indivíduos Rf4 apenas semiférteis, ao passo que a restauração da fertilidade na presente população F2 foi completa (nenhum indivíduo semifértil foi encontrado). Além disso, usou-se uma melhor resolução de mapa (<100 Pb versus 500 Pb) para identificar Rf4, e também para descrever muitos marcadores mais úteis, incluindo aqueles que ligados de maneira extremamente firme a Rf4.

[000150] Os resultados aqui apresentados demonstram o mapeamento do locus Rf4 em um fragmento cromossômico muito pequeno e identificam o gene Rf4. Diferentemente da maioria dos genes Rf até agora clonados, Rf4 quase certamente não é um gene PPR. Os marcadores moleculares ligados aqui descritos (incluindo marcadores firmemente ligados e ligados de maneira extremamente firme) podem ser usados para facilitar a seleção auxiliada por marcador de linhagens restauradoras no sistema CMS-C/Rf4 e para promover o desenvolvimento de milho híbrido usando apenas esse sistema ou juntamente com outros sistemas. Exemplo 3: Mapeamento fino do gene Rf4

[000151] Uma grande população de mapeamento fino F3 de BE4207/ XJH58 com 5.104 indivíduos derivados das linhagens recombinantes acima descritas foi gerada.

[000152] Na população F2, Rf4 foi mapeado em uma região de menos de 100 Pb no topo do cromossomo 8. Entretanto, não há nenhum marcador molecular existente dentro dessa região, exceto PZE-108000086, com um SNP na posição de nucleotídeo 98.468. Duas abordagens foram realizadas para identificar polimorfismos para marcadores adicionais dentro desse intervalo. Na primeira abordagem, projetou-se um experimento de Captura de Sequência NimbleGen™ (Roche Inc.) (Fu et al. (2010) Plant J. 62:898-909) para capturar todos os polimorfismos em torno da região de 6,0 Mb no topo do cromossomo 8 entre a linhagem CMS BE4207 e a linhagem restauradora XJH58, juntamente com duas linhagens restauradoras adicionais BE9515 e MLW03. A captura de sequência, o sequenciamento dos alvos capturados e a chamada de SNP foram realizados pelo NimbleGen™ de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante. Paralelamente aos experimentos de captura NimbleGen™, sequências de DNA não repetitivas na região Rf4 (os 100 kb do tipo do cromossomo 8) foram recuperadas do genoma de B73, e foram projetados primers de PCR para amplificação dos fragmentos genômicos dos dois ascendentes de mapeamento, BE4207 e XJH58. Os fragmentos de PCR foram sequenciados de ambos os ascendentes, e os polimorfismos (tanto SNPs, quanto InDels) foram identificados.

[000153] Com base nos resultados de ambos os experimentos, vários milhares de SNPs e InDels entre a linhagem CMS BE4207 e a linhagem restauradora XJH58 foram identificados dentro da região capturada de 6 Mb, incluindo 77 SNPs e 29 InDels nas primeiras 100 kb. Tabela 3. O experimento de amplificação por PCR estava voltado para as primeiras 100 kb, com ênfase particular nos dois genes expressados nessa região, uma peroxidase de planta (GRMZM2G122853 (SEQ ID NO:198)) e um fator de transcrição básico-hélico-laço-hélice (bHLH) (GRMZM2G021276 (SEQ ID NO:203)). O sequenciamento dos produtos de PCR identificou 35 SNPs e 24 InDels. Tabela 3. De maneira notável, a maioria das alterações identificadas nos fragmentos de PCR também foram encontradas no projeto de captura de sequência (50 de 59, ou 84,7%). Juntos, os dois métodos descobriram 106 alterações únicas (Polimorfismos ID 1-106) entre os dois ascendentes de mapeamento, incluindo 77 SNPs e 29 InDels na região Rf4 alvo de 100 kb. Tabela 3.

[000154] Com base em sua localização física no mapa e no cotnexto da sequência, 33 das alterações únicas (24 SNPs e 9 InDels) foram usadas para projetar primers para genotipagem de alta produção das populações de mapeamento F3 usando ensaios KASPar™ (Tabela 3), essencialmente conforme descrito no Exemplo 1. Tabela 3. Polimorfismos entre as linhagens CMS (BE4207) e restauradora (XJH58) e marcadores KASPar™ para mapeamento de Rf4. A posição do nucleotídeo B73 se baseia no milho B73 Ref- Gen_v1, mas v2 tem uma sequência idêntica dentro das 100 kb do cromossomo 8. ID Posição de B73 no Crom. 8 Captura NimbleGen™ Sequenciamento por PCR Marcador KASPar™

[000155] No Exemplo 2, Rf4 foi mapeado em uma região de menos de 100 kb no topo do cromossomo 8 do milho, definido pelo marcador SNP PZA108000086. Para mapear Rf4 em um intervalo muito menor, quatro marcadores de flanco (DAS-CMS1 e DAS-CMS3 à esquerda, e PZE-108000378 e PZE-108000459 à direita) foram selecionados para genotipar todas as 5104 plantas F3de BE4207/XJH58. Figura 5. A planta S-378 era de F2 e estéril. O DNA dessa planta foi preservado para genotipagem com novos marcadores. Um total de 307 recombinantes dentro da região maior de 0,56 Mb de Rf4 foram identificados. Essas plantas foram selecionadas para contagem de fertilidade no campo, e todas as plantas férteis foram autopolinizadas. Além disso, marcadores adicionais dentro do intervalo de 0,56 Mb foram usados para genotipar o DNA dos 307 recombinantes, e a planta S378 da geração F2, para definir adicionalmente sítios de recombinação. O mapeamento fino foi realizado por comparação dos dados fenotípicos e genotípicos dos recombinantes informativos. Os dados dos 12 recombinantes mais informativos mostram que Rf4 está limitado ao intervalo entre DAS-CMS19 e DAS-CMS31, definido pelas plantas 468-5048 e 4684977. Figura 5.

[000156] Usando o genoma do milho B73 como uma referência, DAS-CMS19 (InDel -/T; posição de nucleotídeo 86.247) e DAS-CMS31 (SNP C/A; posição de nucleotídeo 98.188) estão a aproximadamente 12 kb de distância e estão localizados no mesmo clone BAC; ZMMBBb0329M04 (n0 de acesso AC187051). A sequência do intervalo entre DAS-CMS19 e DAS-CMS31 (em ambas B73 RefSeq v1 e v2) é apresentada na Listagem de Sequência como SEQ ID NO:217. Como a versão mais atualizada de B73 RefGen (v2) ainda tem dois vãos não resolvidos (nucleotídeos 88.058-88.157 e 94.849-94.948) entre os dois marcadores, o comprimento exato não é conhecido. Entretanto, esses vãos são mais provavelmente resultados de dificuldades de montagem devido a sequências repetitivas, em vez de vãos físicos reais, pois ambos os marcadores foram localizados no mesmo clone BAC que foi sequenciado. Exemplo 4: Caracterização do qene Rf4 de milho

[000157] Rf4 codifica um fator de transcrição bHLH

[000158] No qenoma de B73, o intervalo de 12 Pb entre DAS-CMS19 e DAS-CMS31 contém dois qenes previstos; GRMZM2G582028 (SEQ ID NO: 202) (nucleotídeos 93.160-93.850) e GRMZM2G021276 (SEQ ID NO:203) (nucleotídeos 95.823-98.367). O primeiro fraqmento de 9,4 Pb (nucleotídeos 86.247-95.642) do intervalo de 12 Pb consiste princi-palmente em sequências repetitivas, incluindo GRMZM2G582028. GRMZM2G582028 é indicada como um novo elemento transponível em B73 RefGen v2, e se prevê que codifique uma pequena proteína de 68 aminoácidos que não tem nenhum acerto siqnificativo nas bases de dados de proteínas. Além disso, a própria sequência de GRMZM2G 582028 é altamente repetitiva, e muitas cópias idênticas ou quase idênticas são encontradas em todos os 10 cromossomos do milho. Consequentemente, é improvável que GRMZM2G582028 seja Rf4.

[000159] O candidato restante para Rf4 é o único outro qene previsto nessa reqião, GRMZM2G021276. Esse qene codifica um fator de transcrição básico-hélice-laço-hélice (bHLH) de 365 aminoácidos, com um domínio bHLH conservado localizado aproximadamente na parte média da proteína. O promotor/5’UTR e a reqião codificadora inteira, assim como uma 3’ UTR de 82 bp, desse qene estão localizados dentro do intervalo de 12 Pb, com o marcador da borda direita (DAS- CMS31) residindo na reqião de 3’ UTR. Resultados de BLAST indicam que GRMZM2G021276 (daqui por diante chamado de Rf4-bHLH) é mais provavelmente um qene de cópia única no qenoma de B73. Esse qene e seu produto de qene não haviam sido anteriormente caracterizados. Variações alélicas de Rf4-bHLH

[000160] A sequência do genoma de B73 indica que o gene Rf4- bHLH tem 4 éxons e três introns (Figura 6), incluindo um íntron 1 de 635 bp localizado na 5’ UTR. Com base nessa informação, foram projetados primers de PCR para amplificar um locus de Rf4-bHLH de 3,2 kb da linhagem CMS, BE4207, e três linhagens restauradoras (XJH58, BE9515 e MLW03), assim como do endogâmico não CMS, B104. Os resultados de sequenciamento indicam que há variações alélicas significativas entre diferentes endogâmicos. Figura 7. O alelo não restaurador rf4-bHLH de BE4207 (CMS; não tem um gene restaurador funcional) é idêntico ao de B73, um endogâmico bem conhecido que também não restaura CMS-C. Interessantemente, as três linhagens restauradoras conhecidas (XJH58, BE9515 e MLW03) têm um alelo Rf4-bHLH (restaurador) idêntico que difere do alelo B73/BE4207 (CMS). As linhagens restauradoras XJH58 e MLW03 compartilham um ancestral comum 2 - 3 gerações atrás. Entretanto, BE9515, um en- dogâmico que não compartilha nenhum ancestral comum com XJH58 ou MLW03 também tem a sequência de Rf4-bHLH idêntica, sugerindo que esse alelo particular estejá talvez conservado entre as linhagens que restauram o citoplasma CMS-C. Entre o alelo restaurador (Rf4- bHLH) e o alelo não restaurador CMS/B73 (rf4-bHLH), há 20 SNPs e 16 InDels. Figura 7. De maneira notável, há apenas um SNP C/T entre o alelo CMS/B73 e o alelo restaurador na região 5’UTR/promotor de 1,1 kb. Quando os cDNAs previstos dos 6 alelos são comparados, há apenas 6 SNPs e 2 InDels apresentados entre o alelo CMS/B73 e o alelo restaurador. Figura 8.

[000161] B104 é uma linhagem endogâmica que não tem citoplasma CMS-C. Há experimentos em progresso para determinar se B104 é um retaurador da fertilidade para CMS-C. Das 44 variações de sequência encontradas no alelo B104, 28 delas têm a mesma sequência que o alelo CMS/B73, 8 são as mesmas do alelo restaurador, e 8 são únicas para B104 (Figura 7), indicando que o alelo B104 é mais similar ao alelo CMS/B73. De maneira interessante, todas as variações de cDNA em B104 têm a mesma sequência que o alelo CMS/B73, com exceção da deleção única de 12 pb (12 Cs) encontrada apenas na 5’ UTR de B104. Figura 8.

[000162] Alinhamentos das sequências de proteínas previstas de Rf4-bHLH são mostrados na Figura 9. Conforme esperado, todas as três linhagens restauradoras têm sequências de proteínas idênticas, ao passo que B73, BE4207 e B104 compartilham sequências de proteínas idênticas. Entre as duas variantes, há apenas quatro alterações de aminoácidos nas linhagens restauradoras: uma substituição de His por Asn (H103 por N103; Polimorfismo ID 52; DAS-CMS22), uma inserção de Ala (A130; Polimorfismo ID 53; DAS-CMS23), uma substituição de Pro por Leu (P266 por L267; Polimorfismo ID 62; DAS-CMS28), e uma substituição de Tyr por Phe (Y186 por F187; Polimorfismo ID 54). Apenas a substituição de Tyr por Phe ocorre no domínio bHLH conservado. Figura 9.

[000163] Rf4-bHLH é especificamente expressado nos cabelos/pólens em desenvolvimento

[000164] O padrão de expressão de Rf4-bHLH foi examinado para fornecer provas adicionais de que esse fator de transcrição não de-sempenha um papel na restauração de fertilidade CMS-C. O RNA total foi extraído dos dois ascendentes de mapeamento, BE4207 e XJH58, assim como de indivíduos F3 derivados de uma espiga F2 que segrega para a primeira região de 0,56 Mb do cromossomo 8. Oligonucleotí- deos específicos de Rf4-bHLH e de controle de invertase (primers e sondas) projetados para RT-PCR são mostrados na Tabela 4. Tabela 4. Oligonucleotídeos para RT-PCR

[000165] Os dados de PCR em tempo real quantitativa demonstram que, em plantas XJH58 ascendentes restauradoras e plantas homozi- góticas ou heterozigóticas F3 para o alelo restaurador, Rf4-bHLH mostra a expressão mais forte em cabelos com anteras/pólens em desen-volvimento, uma expressão fraca nos pólens lançados e quase nenhuma expressão em folhas com diferentes estágios de desenvolvimento. Esses padrões de expressão são consistentes com o papel de Rf4-bHLH na restauração da fertilidade do pólen.

[000166] Inversamente, rf4-bHLH mostra expressão muito baixa ou nenhuma em folhas, assim como em cabelos em desenvolvimento, no ascendente CMS BE4207 e em plantas homozigóticas F3 para o alelo não restaurador BE4207. Figura 10. Entretanto, a falta de expressão de rf4-bHLH nos cabelos em desenvolvimento de plantas homozigóticas para o alelo não restaurador BE4207 é mais provavelmente condicionada pelo próprio CMS (nenhuma tentativa de anteras nem desenvolvimento de pólens funcionais), em vez da diferença alélica entre XJH58 e BE 4207. Isso é sustentado pelo fato de que rf4-bHLH (alelo não restaurador) é aparentemente expressado em um nível significativo em B73, pois há 25 clones EST independentes (por exemplo: acessos BT043393, BT 064392, e outros) especificamente desse endogâmico em bases de dados de EST disponíveis. Conforme anteriormente mencionado, o endogâmico B73 não restaura CMS-C e tem o alelo rf4-bHLH idêntico ao endogâmico CMS BE4207, que obviamente também não tem um Rf4 funcional. Exemplo 5: Caracterização do qene Rf4-bHLH em outras Plantas Mo- nocotiledõneas

[000167] Ortóloqos de Rf4-bHLH em monocotiledõneas foram recu-perados de sorqo (Sb03q011940), Brachypodium (BRADI2G11260) e arroz (Os01q11870), que estão todos disponíveis no Centro Nacional de Informações de Biotecnoloqia (NCBI). Esses ortóloqos foram comparados com as sequências de milho. Conforme mostrado na Fiqura 11, o resíduo Tyr (Yw6) dentro do domínio bHLH está conservado em todas as espécies, com a notável exceção da substituição Phe (F187) no alelo restaurador de milho. As outras três alterações estão localizadas em diferentes reqiões variáveis e, em qeral, não são tão conservadas quando comparadas entre as espécies. Fiqura 11. Esses resultados suqerem que F187 em um alelo restaurador pode desempenhar um papel crucial na restauração da fertilidade do citoplasma CMS-C.

[000168] A sequência da proteína bHLH de milho é altamente similar aos ortóloqos de monocotiledõneas de Sorqhum bicolor (Sb03q011940; 84% de identidade), Oryza sativa (Os01q18870; 64%) e Brachypodium distachyon (BRADI2G11260, 63%), e, em menor medida, às proteínas de domínio bHLH de espécies dicotiledõneas (At2q31210 de Arabi- dopsis thaliana; 24%, por exemplo). De acordo com Pires e Dolan (2010), supra, a família de proteínas bHLH de plantas pode ser classificada em 26 subfamílias com base em homoloqias de sequência identificadas entre 544 proteínas bHLH de nove espécies de plantas terrestres (não incluindo o milho) e alqas. Se incluído na análise, Rf4-bHLH de milho se enquadraria na subfamília II, que consiste na proteína de arroz, OS01q18870 (descrita acima) e 10 outras proteínas. Da mesma forma, Carretero-Paulet et al. (2010), supra, identificaram 32 bHLH subfamílias, e Rf4-bHLH de milho pode ser classificado em sua sub- família 9, que também consiste em OS01q18870 e 10 outras proteí nas. A maioria dos membros na subfamília 9 de Pires e Dolan e na subfamília 9 de Carretero-Paulet são as mesmas sequências.

[000169] Rf4-bHLH é um fator de transcrição e sua destinação esperada é o núcleo. De fato, vários programas de predição, incluindo Pre- dictNLS™, identificam dois fortes sinais de localização nuclear (NLSs) em Rf4-bHLH: 153-GRKRGRA-159 (SEQ ID NO:229) e 229-KKRRRR- 234 (SEQ ID NO:230) (de acordo com a posição de aminoácidos do Rf4-bHLH XJH58). Figura 9.

[000170] Todos os genes Rf clonados até agora codificam proteínas direcionadas para mitocôndrias (Liu et al. (2001), supra; Akagi et al. (2004), supra; Fujii e Toriyama (2009), supra), e presumivelmente intera-gem diretamente com os transcritos de C=S. Entretanto, a localização nuclear esperada de Rf4-bHLH torna improvável que a Rf4-bHLH esteja direcionada para mitocôndrias e tenha uma interação direta com transcri-tos de C=S-C. Rf4-bHLH provavelmente também funciona a montante para ativar ou aumentar a expressão de um gene nuclear que codifique uma proteína direcionada para mitocôndrias, que, por sua vez, leva a in-terferência com a expressão do transcrito de C=S-C para restaurar a fer-tilidade masculina. Essa suposta proteína mitocondrial poderia ser um membro da família de proteínas PPR, ou algo similar à Rf2 de milho, RF17 de arroz, ou uma nova proteína. Imunoprecipitação de cromatina, formação de redes de genes ou outras abordagens moleculares poderiam ser usadas para identificar os alvos diretos de Rf4-bHLH. Exemplo 6: Introdução do gene Rf4-bHLH em milho CMS por trans-formação

[000171] Um gene restaurador de Rf4-bHLH (por exemplo, SEQ ID NO:220) é transformado em uma linhagem CMS de milho. Uma planta de milho transformada expressa o polipeptídio Rf4-bHLH de SEQ ID NO:225, e a Rf4-bHLH é suficiente para restaurar a fertilidade masculina no citoplasma CMS-C.

Claims

1. Método para a identificação de uma planta compreendendo um gene restaurador funcional para esterilidade masculina ci- toplasmática de tipo C do milho, caracterizado pelo fato de que com-preende: o isolamento de moléculas de ácido nucleico de uma planta; e a triagem das moléculas de ácido nucleico isoladas quanto a um polimorfismo no gene Rf4-bHLH de SEQ ID NO: 220 da planta, em que o polimorfismo está localizado nas posições 1664 a 1665 de SEQ ID NO: 220 e o polimorfismo codifica uma substituição de tirosina por fenilalanina.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ácido nucleico isoladas são DNA ou RNA.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a triagem das moléculas de ácido nucleico isoladas é realizada usando-se reação em cadeia de polimerase competitiva alelo específica.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a triagem da presença de uma substituição de AC para TT nas posições 1664 a 1665 de SEQ ID NO: 220 ou nas posições 750 a 751 de SEQ ID NO: 223.