CN113846179B - 玉米C型不育胞质恢复基因Rf12及其紧密连锁标记的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了玉米C型不育胞质恢复基因Rf12及其紧密连锁标记的应用，属于基因工程技术领域。所述紧密连锁标记包括1对引物对：F：5’‑agtgcctgtgcttgcccattca‑3’；R：5’‑tcagatagctacctttgcttgcgc‑3’。所述Rf12在染色体上的位置为：B73_RefGen_v4Chr2:234057663‑234457207。本发明中的恢复基因Rf12可恢复大部分的玉米C型不育系；本发明中的显性标记SNP^‑55可对玉米C型不育胞质在2号染色体长臂的强恢复基因Rf12进行辅助选择，加快Rf12的回交转育进程，促进玉米C型不育胞质恢复基因的应用。

Description

玉米C型不育胞质恢复基因Rf12及其紧密连锁标记的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种玉米C型不育胞质恢复基因Rf12及其紧密连锁标记的应用，更具体地涉及一种玉米C型细胞质雄性不育在2号染色体长臂的育性恢复基因Rf12及其紧密连锁标记SNP^-55的应用。

背景技术

玉米作为集“粮、经、饲”于一体的多元作物，在我国国民经济发展中占据重要地位。玉米是较早开展杂种优势利用的作物。玉米杂种优势的成功利用得益于雌雄同株异花，人工去雄简单易行。目前，我国玉米杂交种子的生产仍主要依靠人工去雄。由于人工去雄的不及时、不彻底而导致的种子纯度降低，时有发生，直接影响到杂种优势的利用效率。利用雄性不育植株做母本进行杂交制种无需通过人工去雄，因而不仅可降低种子生产成本，同时可以保证杂交种子的纯度，是提高制种质量的有效途径。不育系、保持系和恢复系“三系”配套是细胞质雄性不育(CMS)应用于生产的前提。玉米C型细胞质雄性不育(CMS-C)育性稳定，利用玉米C型细胞质雄性不育系配制杂交种，在杂交制种上具有重要的应用潜力。

恢复基因可以在基因水平、转录水平、蛋白水平和代谢水平恢复细胞质雄性不育。恢复系是细胞质雄性不育不育化制种的基础，强恢复基因是恢复系创制和改良的前提，玉米C型不育胞质强恢复基因目前已经报道的有Rf4、Rf5，Rf4位于8号染色体短臂末端，Rf5位于5号染色体长臂，其中Rf5存在抑制基因RfI，限制了其在玉米C型不育胞质不育化制种中的应用，因此，新的强恢复基因的发现对于玉米C型不育胞质不育化制种及培育具有广泛恢复力的玉米C型不育胞质强恢复系具有重要意义。

分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)是指利用分子标记对目的基因或性状进行选择。分子标记辅助选择可以直接对性状的基因型进行选择，筛选目标单株，提高育种效率，缩短育种进程。分子标记辅助选择在细胞质雄性不育恢复位点的鉴定、回交转育中具有广泛的利用，是玉米C型不育胞质恢复位点的选择及不育化制种的重要工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米C型不育胞质恢复基因Rf12及其紧密连锁标记的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该标记与玉米育性紧密连锁，可鉴定玉米是否含有性别决定基因；对玉米植株的育性鉴定、筛选目标单株、玉米恢复基因的回交转育和恢复系品种的改良及克隆性分化基因各方面都具有重要的应用价值。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种玉米C型不育胞质恢复基因Rf12的紧密连锁标记SNP^-55，包括1对引物对：

F(SEQ ID NO：1)：5’-agtgcctgtgcttgcccattca-3’；

R(SEQ ID NO：2)：5’-tcagatagctacctttgcttgcgc-3’。

优选的是，利用所述的引物对扩增的目的基因片段的核苷酸序列为：Zm00001d007546基因起始密码子ATG上游76bp至ATG下游380bp共456bp的基因组序列，如SEQ ID NO：3所示：其中，所述Zm00001d007546基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

SEQ ID NO：3：

agtgcctgtgcttgcccatttatgaattgtgacattttacagccgagagttcagtcatcgtgtaaaatcagtatcaatggctaaattcacttcccaagaagtttcggcacttctagaagggggcaatgaggttcgcctaatattttattaataatttagaaaggtctgtgtgatctttacagttacctaatattctgtttcttccagcgtgctaaggaaatctatttcaagcattgggacttgcaaggccctgttattgacagtaggttagtcatctagtcctgttatttatttttcaagcatattgtagttgcacacttgatgtttgattgctttgttttcacttatagtgatgtacatagactctgaaatttcatcaagaatgtatatgttgaacggagatattcagaccaaagaattggcgaacatttagcgcaagcaaaggtagctatctga；

SEQ ID NO：4：

atattgtggccccacccgaaatatacgtattcgggtgaggaacccctaacctgtatacacatttatccgtgatatgaaaacacatgatgtatatttctttgttaagtaaccaaaaagtactcttcattaacaggggccacaatatgtatgcacaagcttctctactttcatctgtactaattgcagcgggatacagtaagtggtgatcatattgttgtttttctctttattaaaagtgcagcaatgtttcttgtttggctattacagttgtgaactcctccctataagttatataaacttctgaaccagtgcctgtgcttgcccatttatgaattgtgacattttacagccgagagttcagtcatcgtgtaaaatcagtatcaatggctaaattcacttcccaagaagtttcggcacttctagaagggggcaatgaggttcgcctaatattttattaataatttagaaaggtctgtgtgatctttacagttacctaatattctgtttcttccagcgtgctaaggaaatctatttcaagcattgggacttgcaaggccctgttattgacagtaggttagtcatctagtcctgttatttatttttcaagcatattgtagttgcacacttgatgtttgattgctttgttttcacttatagtgatgtacatagactctgaaatttcatcaagaatgtatatgttgaacggagatattcagaccaaagaattggcgaacatttagcgcaagcaaaggtagctatctgaactcatgatcactgatcaccgatagacatctatgcagtaaactagcatccacaatctcttcactgcccagaactttttttaacccgttaaacatctgaaagatccagggtaataaggactcttatggaaatagcaatgcagattcatctccaggagttttaagaagtgcatatgtcggaacttatgaagataatcacgatctaaagcgcaccaaagaaagtctctcagaaaatcaaaacaattctaatggacatccagtgagtagtacagtagaccaaaataataattctataatggcgagagaaaaggtcgaccttagaagccatctgcgtccagatgatctcttgaaaactgatggaaagtcagaaaataatcagaaggttgtgatttcatcagcttcttctgcagcacaagcttccaaagaaataaatagtaacaaggtgcttctgcccatcaaacttcctgatcctcctaggtcacagaaagcaacatcatctaatacctctactgaagcacaggtgatgcagttcttataagctttggttattttttattctgcattacctagtccatagtgttactcttcccattctagtggatccaactattcatttatgtttactatagtatgtcaaaaatagatataaaaaatccagtaacccagacaaaatgtt。

优选的是，扩增体系为：每15μl含有如下组分：擎科生物2×T5 Super PCR Mix7.5μl，ddH₂O 5.5μl，10ng/μl的上下游引物各0.6μl，DNA模板150ng；所述DNA模板使用CTAB法提取自玉米叶片。

优选的是，扩增程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35循环；72℃2min；12℃保存。

本发明还提供一种利用所述的紧密连锁标记SNP^-55培育玉米不育胞质强恢复系的方法，包括以下步骤：

以具有玉米C型不育胞质恢复基因Rf12的玉米自交系为亲本之一，通过回交、杂交、单片段代换、组织培养方法培育玉米强恢复系，在其后代中选择具有利用所述的引物对所扩增的目的基因片段的植株，经过多次重复筛选获得玉米C型不育胞质强恢复系。

优选的是，所述目的基因片段包括Zm00001d007546基因起始密码子ATG上游76bp至ATG下游380bp共456bp的基因组序列，以及与上述序列同源性达70％以上的同源基因序列。

本发明还提供一种所述的玉米C型不育胞质恢复基因Rf12的应用，应用于玉米C型不育胞质恢复基因的分离鉴定、育性连锁分析、恢复基因的回交转育和/或不育化制种。

优选的是，所述Rf12存在于热带恢复系ZH91中，与标记SNP^-55紧密连锁，在染色体上的位置为：B73_RefGen_v4 Chr2:234057663-234457207。

本发明还提供一种所述的紧密连锁标记SNP^-55的应用，应用于玉米C型不育胞质恢复基因的分离鉴定、育性连锁分析、恢复基因的回交转育和/或不育化制种。

优选的是，所述紧密连锁标记SNP^-55还包括与碱基序列相似度达70-100％的分子标记。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明所述玉米C型不育胞质恢复基因Rf12是不同于Rf4、Rf5的强恢复基因，它可以恢复大部分玉米C型不育系，对于改良玉米恢复系资源和培育优良玉米恢复系及其不育化制种具有重要作用，可节约大量人力物力，降低种子成本。

(2)本发明提供的玉米C型不育胞质恢复基因Rf12的紧密连锁标记SNP^-55可用于鉴定含有恢复基因Rf12的玉米植株，加快Rf12的回交转育进程，为Rf12的分子育种奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为恢复系ZH91对玉米CMS-C不育系材料的测交F1育性鉴定；

图2为5对Rf12连锁标记在(C478×ZH91)F2群体部分不育株中的扩增结果；

图3为不育系C478与恢复系ZH91的Zm00001d007546基因差异SNP位点(“_”：差异SNP)；

图4为标记SNP^-55对(C478×ZH91)F2群体不育植株和恢复植株的基因分型分析结果；

图5为Rf12基因连锁图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

一、恢复系ZH91对玉米CMS-C不育系的恢复力测定

2017-2020年在四川崇州和云南景洪种植玉米CMS-C不育系(包括不育系C478、C黄早四(CHZS)、C48-2、CMo17)(供试不育系材料均由四川农业大学玉米研究所提供)与ZH91(由青青种业提供)组配的测交F₁，育性鉴定结果表明：ZH91对玉米CMS-C同质异核不育系C478、C黄早四、C48-2、CMo17均表现为育性完全恢复，花药饱满，可正常散粉，花粉粒均被I₂-IK染成黑色(图1)。

二、含有恢复基因Rf12的玉米自交系ZH91的遗传分析

将遗传分析群体(C478×ZH91)F2、C478×(C478×ZH91)分别种植于四川崇州和云南景洪。育性调查结果见表1，由表1可以看出(C478×ZH91)F2群体，其可育株与不育株的分离比经χ²检验均完全符合3:1的理论比例；回交群体C478×(C478×ZH91)，其可育株与不育株的分离比经χ²检验完全符合1:1的理论比例，以上结果表明恢复系ZH91对C478的育性恢复受一对显性基因控制。

表1育性调查结果

三、恢复基因Rf12的精细定位

以(C478×ZH91)F₂群体为定位群体对ZH91恢复基因进行基因定位。用均匀覆盖玉米全基因组的1050对引物对双亲C478、ZH91基因组DNA进行基因分型分析，共筛选到365对在C478、ZH91之间具有多态性的引物。

然后，经分离群体的BSA混池筛选，获得5对多态性引物。用5对具有多态性的引物对定位群体中的不育单株进行基因分型分析，发现5对多态性引物扩增基因型与育性表型连锁(图2)，于是将恢复基因定位在第2染色体长臂末端。通过不断扩大定位单株至10600株，并在目标区域进一步开发新的分子标记，引物设计原则：长度20-24bp，目标条带长度150-250bp。

上述5对多态性引物如下：

InDel-5-F：5’-ctccttgagattgtcccctg-3’；

InDel-5-R：5’-ctctgtgaagatgatggaaggg-3’；

InDel-6-F：5’-tcctcacttcttctaccaagcg-3’；

InDel-6-R：5’-aggtgctcttcgctgtcaag--3’；

InDel-7-F：5’-tttccctgttgtgcgaaacc-3’；

InDel-7-R：5’-ctgctcacagaaggaagctct-3’；

SSR-1-F：5’-tgggtttgggatgtttgttt-3’；

SSR-1-R：5’-ttgaggctagggacaagctc-3’；

SSR-4-F：5’-ctagttaacattggtcggttgcca-3’；

SSR-4-R：5’-ctagctcgaaacaaccaaccacac-3’。

扩增体系为：每15μl含有如下组分：擎科生物2×T2 PCR Mix 7.5μl，ddH₂O 5.5μl，10ng/μl的上下游引物各0.5μl，DNA模板150ng；所述DNA模板使用CTAB法提取自玉米叶片。扩增程序为：94℃5min；94℃50s，65℃(^△-1℃)30s，72℃40s，10循环；94℃50s，58℃30s，72℃40s，35循环；72℃2min；12℃保存。目前已将ZH91的恢复基因Rf12精细定位于玉米第2染色体长臂末端标记InDel-1和InDel-2之间约400Kb的物理区间内。对该区段的候选基因进行克隆测序分析，发现Zm00001d007546基因的启动子和基因组序列在不育系和恢复系中存在独有的SNP差异，于是针对SNP差异设计了显性SNP标记SNP^-55，基因分型分析结果显示，所有交换单株与SNP^-55共分离(图5)。

实施例2

一种玉米C型不育胞质恢复基因Rf12的紧密连锁标记SNP^-55在不育系制种中的应用

设计SNP^-55扩增引物对：

F：5’-agtgcctgtgcttgcccattca-3’；

R：5’-tcagatagctacctttgcttgcgc-3’。

扩增体系为：每15μl含有如下组分：擎科生物2×T5 Super PCR Mix7.5μl，ddH₂O5.5μl，10ng/μl的上下游引物各0.6μl，DNA模板150ng；所述DNA模板使用CTAB法提取自玉米叶片。扩增程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35循环；72℃2min；12℃保存。

利用上述扩增条件扩增目的片段，即SNP^-55扩增序列：扩增的目标序列为Zm00001d007546基因起始密码子ATG上游55bp至ATG下游379bp的基因组序列，序列中存在玉米C型不育胞质恢复系ZH91与不育系C478、C698-3、C黄早四、C48-2之间独有的SNP变异位点(图3)。图3中下划线的碱基在恢复系ZH91中均为纯合A碱基，在(C478×ZH91)F2群体杂合恢复单株中均为杂合A/C碱基，在玉米C型不育系及(C478×ZH91)F2群体不育单株中均为纯合C碱基。SNP^-55的F引物覆盖该碱基设计，在恢复系ZH91和(C478×ZH91)F2群体恢复植株中可以扩增出456bp的目的条带，在不育系C478和(C478×ZH91)F2群体不育植株中扩增不出条带(图4)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 四川农业大学 广西青青农业科技有限公司

<120> 玉米C型不育胞质恢复基因Rf12及其紧密连锁标记的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtgcctgtg cttgcccatt ca 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcagatagct acctttgctt gcgc 24

<210> 3

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtgcctgtg cttgcccatt tatgaattgt gacattttac agccgagagt tcagtcatcg 60

tgtaaaatca gtatcaatgg ctaaattcac ttcccaagaa gtttcggcac ttctagaagg 120

gggcaatgag gttcgcctaa tattttatta ataatttaga aaggtctgtg tgatctttac 180

agttacctaa tattctgttt cttccagcgt gctaaggaaa tctatttcaa gcattgggac 240

ttgcaaggcc ctgttattga cagtaggtta gtcatctagt cctgttattt atttttcaag 300

catattgtag ttgcacactt gatgtttgat tgctttgttt tcacttatag tgatgtacat 360

agactctgaa atttcatcaa gaatgtatat gttgaacgga gatattcaga ccaaagaatt 420

ggcgaacatt tagcgcaagc aaaggtagct atctga 456

<210> 4

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atattgtggc cccacccgaa atatacgtat tcgggtgagg aacccctaac ctgtatacac 60

atttatccgt gatatgaaaa cacatgatgt atatttcttt gttaagtaac caaaaagtac 120

tcttcattaa caggggccac aatatgtatg cacaagcttc tctactttca tctgtactaa 180

ttgcagcggg atacagtaag tggtgatcat attgttgttt ttctctttat taaaagtgca 240

gcaatgtttc ttgtttggct attacagttg tgaactcctc cctataagtt atataaactt 300

ctgaaccagt gcctgtgctt gcccatttat gaattgtgac attttacagc cgagagttca 360

gtcatcgtgt aaaatcagta tcaatggcta aattcacttc ccaagaagtt tcggcacttc 420

tagaaggggg caatgaggtt cgcctaatat tttattaata atttagaaag gtctgtgtga 480

tctttacagt tacctaatat tctgtttctt ccagcgtgct aaggaaatct atttcaagca 540

ttgggacttg caaggccctg ttattgacag taggttagtc atctagtcct gttatttatt 600

tttcaagcat attgtagttg cacacttgat gtttgattgc tttgttttca cttatagtga 660

tgtacataga ctctgaaatt tcatcaagaa tgtatatgtt gaacggagat attcagacca 720

aagaattggc gaacatttag cgcaagcaaa ggtagctatc tgaactcatg atcactgatc 780

accgatagac atctatgcag taaactagca tccacaatct cttcactgcc cagaactttt 840

tttaacccgt taaacatctg aaagatccag ggtaataagg actcttatgg aaatagcaat 900

gcagattcat ctccaggagt tttaagaagt gcatatgtcg gaacttatga agataatcac 960

gatctaaagc gcaccaaaga aagtctctca gaaaatcaaa acaattctaa tggacatcca 1020

gtgagtagta cagtagacca aaataataat tctataatgg cgagagaaaa ggtcgacctt 1080

agaagccatc tgcgtccaga tgatctcttg aaaactgatg gaaagtcaga aaataatcag 1140

aaggttgtga tttcatcagc ttcttctgca gcacaagctt ccaaagaaat aaatagtaac 1200

aaggtgcttc tgcccatcaa acttcctgat cctcctaggt cacagaaagc aacatcatct 1260

aatacctcta ctgaagcaca ggtgatgcag ttcttataag ctttggttat tttttattct 1320

gcattaccta gtccatagtg ttactcttcc cattctagtg gatccaacta ttcatttatg 1380

tttactatag tatgtcaaaa atagatataa aaaatccagt aacccagaca aaatgtt 1437

Claims (7)

1.一种玉米C型不育胞质恢复基因Rf12的紧密连锁标记SNP^-55的扩增引物对，其特征在于，包括1对引物对：

F：5’-agtgcctgtgcttgcccattca-3’；

R：5’-tcagatagctacctttgcttgcgc-3’。

2.如权利要求1所述的玉米C型不育胞质恢复基因Rf12的紧密连锁标记SNP^-55的扩增引物对，其特征在于，利用所述的引物对扩增的目的基因片段的核苷酸序列为：Zm00001d007546基因起始密码子ATG上游76bp至ATG下游380bp共456bp的基因组序列；其中，所述Zm00001d007546基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.如权利要求2所述的玉米C型不育胞质恢复基因Rf12的紧密连锁标记SNP^-55的扩增引物对，其特征在于，扩增体系为：每15μl含有如下组分：擎科生物2×T5 Super PCR Mix 7.5μl，ddH₂O 5.5μl，10ng/μl的上下游引物各0.6μl，DNA模板150ng；所述DNA模板使用CTAB法提取自玉米叶片。

4.如权利要求2所述的玉米C型不育胞质恢复基因Rf12的紧密连锁标记SNP^-55的扩增引物对，其特征在于，扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，35循环；72℃2min；12℃保存。

5.一种利用权利要求1-4任一项所述的紧密连锁标记SNP^-55的扩增引物对培育玉米不育胞质强恢复系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以具有玉米C型不育胞质恢复基因Rf12的热带恢复系ZH91为亲本之一，通过回交、杂交、单片段代换、组织培养方法培育玉米强恢复系，在其后代中选择具有利用所述的引物对所扩增的目的基因片段的植株，经过多次重复筛选获得玉米C型不育胞质强恢复系；

所述目的基因片段包括Zm00001d007546基因起始密码子ATG上游76bp至ATG下游380bp共456bp的基因组序列，该序列如SEQ ID NO：3所示，且所述玉米C型不育胞质恢复系中SEQID NO：3所示序列的第22位为a碱基。

6.一种如权利要求1-4任一项中所述的玉米C型不育胞质恢复基因Rf12的应用，其特征在于，应用于玉米C型不育胞质恢复基因的分离鉴定、育性连锁分析、恢复基因的回交转育和/或不育化制种；

所述Rf12存在于热带恢复系ZH91中，与标记SNP^-55紧密连锁，在染色体上的位置为：B73_RefGen_v4 Chr2:234057663-234457207；所述标记SNP^-55为Zm00001d007546基因起始密码子ATG上游55bp至ATG下游379bp的基因组序列，该序列如SEQ ID NO：3所示，且所述玉米C型不育胞质恢复系中SEQ ID NO：3所示序列的第22位为a碱基。

7.一种如权利要求1-4任一项所述的紧密连锁标记SNP^-55的应用，其特征在于，应用于玉米C型不育胞质恢复基因的分离鉴定、育性连锁分析、恢复基因的回交转育和/或不育化制种；

所述标记SNP^-55为Zm00001d007546基因起始密码子ATG上游55bp至ATG下游379bp的基因组序列，该序列如SEQ ID NO：3所示，且所述玉米C型不育胞质恢复系中SEQ ID NO：3所示序列的第22位为a碱基。

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