CN113061616B - 一种与油菜千粒重相关的基因及其分子标记和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种与油菜千粒重相关的基因及其分子标记和应用，属于植物基因工程和生物技术领域；在本发明中，首先通过比对分析不同千粒重油菜中千粒重相关基因BnaGRF7.C02在不同油菜种质中15bp的差异，然后通过关联分析得出这15bp的差异与油菜千粒重相关联，还设计了油菜千粒重相关的分子标记引物用于筛选油菜BnaGRF7.C02基因中是否含有15bp，并用于油菜高产育种。

Description

一种与油菜千粒重相关的基因及其分子标记和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程和生物技术领域，涉及一种与油菜千粒重相关的基因及其分子标记和应用。
背景技术
油菜是我国的第一大油料作物，占我国油料作物产油量的57.2%，是食用植物油和生物柴油的主要来源。虽然我国油菜籽年产量较高，但是油菜播种面积持续下降，油菜仍处于供应不足的阶段，我国国产植物油对外依存度已超过60%，且有继续增加的趋势，因此提高油菜籽产量是油菜育种的关键目标。
分子标记技术是通过检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反应生物个体之间的差异，随着该技术的不断发展，其在作物育种中的应用越来越广泛。RFLP是第一代分子标记技术，具有稳定可靠，重复性好以及共显性的特点；但是，该技术对DNA的样品量要求较大，操作繁琐，周期长，并且用放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全也不易自动化。AFLP结合了PCR和RFLP标记技术，在遗传多样性的检测、物种亲缘关系分析、种质资源鉴定等方面得到了较为广泛的应用，但存在这成本高、操作复杂且难度大，标记多为显性及对DNA和限制性内切酶质量要求高的缺点。第二代分子标记SSR，也称为微卫星DNA，由于其不仅能够鉴定纯合体和杂合体，而且结果更可靠、操作简单，已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域。近年来，随着测序技术的持续发展，使得基于基因组序列信息的分子标记开发成为可能，如SNP标记和InDel，但油菜中还是以分子标记辅助为主。
单株油菜产量主要由单株角果数、每角果粒数以及油菜种子大小（千粒重）三大农艺性状决定。研究表明与油菜产量显著相关的性状是角果数和千粒重，这两者之间表现为负相关，但是相关系数不大。因此可以通过提高千粒重来提高油菜产量。油菜的千粒重一般为1.4g-5.76克，极值高达8g左右，但我国审定的不同油菜种质的千粒重均值在3g左右，还有很大的提升空间，所以提高千粒重是提高油菜产量的途径之一。
在植物中，种子的大小受多种生物过程的影响，包括细胞增殖、分化和扩增，是由微效多基因控制的数量性状。目前，已有多个基因鉴定出参与千粒重的调控，但是这些基因功能的鉴定大都通过转基因进行的，操作繁琐，周期长，成功率低，难以运用到农作物的育种中。因此，可以结合测序技术分析这些基因上的SNP位点和插入/缺失（InDel），开发功能性的SNP位点和InDel，并基于此开发实用性的分子标记，有针对性的开展分子标记辅助高产育种。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种油菜千粒重相关基因及其分子标记和应用。在本发明中，首先发现了BnaGRF7.C02基因与油菜千粒重相关联，并通过比对分析得出油菜千粒重相关的分子标记，并设计了油菜千粒重相关基因BnaGRF7.C02相关的分子标记引物，将其用于油菜高产育种。
本发明中首先提供了与油菜千粒重相关的基因BnaGRF7.C02，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5 所示，所述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明中还提供了BnaGRF7.C0 2基因、或BnaGRF7.C02基因编码的蛋白、或包含BnaGRF7.C02在内的生物材料在提高油菜千粒重中的应用。
本发明中提供了油菜千粒重相关的分子标记，所述分子标记为BnaGRF7.C02基因中一段15bp的核苷酸序列，所述15bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步的，具有如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的油菜植株为千粒重低的，该植株中BnaGRF7.C02基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，缺失如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的油菜植株为千粒重高的，该植株中BnaGRF7.C02基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步的，所述分子标记由如下特异性分子标记引物扩增得到，所述引物序列为：
GRF715bp-F：GATGATCCTC ACGGGTATGGTCC，
GRF715bp-1R：TATGGATGTACTTCTTTCGTGGGAG；
GRF715bp-2R：CCTGCTTGGCATAACTTTCTCT。
本发明中还提供了用于检测上述分子标记的引物，所述引物的核苷酸序列为：
GRF715bp-F：GATGATCCTC ACGGGTATGGTCC，
GRF715bp-1R：TATGGATGTACTTCTTTCGTGGGAG；
GRF715bp-2R：CCTGCTTGGCATAACTTTCTCT。
本发明中还提供了上述分子标记或引物在油菜育种中的应用，所述应用包括：筛选油菜千粒重高的种子、淘汰油菜千粒重低的种子、培育千粒重高的油菜品种。
本发明中还提供了检测上述分子标记的方法，通过下述引物组扩增待检测油菜基因的DNA，所述引物组的核苷酸序列为：
GRF715bp-F：GATGATCCTCACGGGTATGGTCC，
GRF715bp-1R：TATGGATGTACTTCTTTCGTGGGAG；
GRF715bp-2R：CCTGCTTGGCATAACTTTCTCT。
本发明中还提供了用于检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中含有用于检测分子标记的引物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明利用通过测序技术在42个油菜种质中发现BnaGRF7.C02基因中存在15bp的差异，并且在具有324个油菜种质的自然群体进行关联分析，发现BnaGRF7.C02基因与千粒重具有较高的相关性，其关联度高达9%，该方法真实可靠、鉴定方便，具有说服力。
本发明中还提供了千粒重相关基因BnaGRF7.C02的分子标记引物GRF715bp-1和GRF715bp-2，该分子标记引物为InDel标记，属于长度多态性遗传标记，可基于PCR技术对InDel进行分型；与分型复杂的SNP标记相比，InDel检测简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，在电泳水平上即可进行。用本发明所述的分子标记引物区分BnaGRF7.C02基因中15bp(5’-TCACGGGTATGGTCC-3’) 的核苷酸序列存在与否，并预测甘蓝型油菜的千粒重特性，可以克服传统育种中依靠表型进行选择的缺点，减少育种工作量，进而快速筛选油菜种质中不含15bp的BnaGRF7.C02基因的植株，缩短育种年限，加快甘蓝型油菜高产育种的进程。
本发明中，考虑到同一亲本来源的不同油菜GRF7基因的不同拷贝间差异较小，不足以设计引物区分，在BnaGRF7.C02基因中距离BnaGRF7.C02 Δ15bp 约1000bp的下游处设计了下游引物SEQ ID NO:10，1500bp的下游处设计了下游引物SEQ ID NO:11，进而排除油菜基因组中其他GRF7拷贝对PCR扩增的干扰。
附图说明
图1为甘蓝型油菜自交系K407和甘蓝型油菜双11号ZS11中BnaGRF7.C02基因核苷酸序列对比图。
图2为甘蓝型油菜自交系K407和甘蓝型油菜双11号ZS11中BnaGRF7.C02氨基酸序列对比图。
图3为GRF715bp-1引物对扩增带型图。
图4为GRF715bp-2引物对扩增带型图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：BnaGRF7.C02基因的鉴定
（1）田间试验与油菜千粒重的表型测定：
田间试验于2017年至2018年秋季，9月下旬在镇江江苏大学对千粒重不同的42种品种不同的油菜种质进行播种，次年5月份收获，自然晾干后脱粒处理，随机取1000粒种子用电子天平进行称重，重复三次取平均值，42种油菜中包括甘蓝型油菜自交系K407和甘蓝型油菜双11号ZS11以及其他40种不同品种的油菜（编号为1~40），各品种油菜的千粒重如表1所示。
（2）提取42种甘蓝型油菜种质基因组DNA：
分别取播种1个月的42种油菜种质叶片提取基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并用One-drop（型号：OD-1000）检测DNA浓度并稀释到100ng/μL。
（3）利用引物对BnGRF7-F/R扩增分析42种油菜种质基因组DNA：
从Brassica napus Genome Browser（https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/）中获得BnaGRF7.C02基因及其上下游序列，用Primer 5软件在BnaGRF7.C02基因的上游设计一条上游引物BnGRF7-F：CAAATGTCGGAAGCATGGAGGC（SEQ IDNO:7），在其下游设计一条下游BnGRF7-R：GCTATGTTCAAGCTAAGTCGAC（SEQ ID NO:8）。
利用引物对BnGRF7-F/R来PCR扩增42种油菜种质基因组DNA，得到不同油菜种质中BnaGRF7.C02基因序列。PCR反应体系如下：反应体系为50μL，其中10 × buffer for KOD-plus-neo 5μL，25mM MgCL2 3μL，2.5nm dNTP 5μL，上下引物（10μM）各1.5μL，KOD-plus-neo酶1μL，模板200ng，加水至50μL。PCR扩增程序为94℃预变性2min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，68℃延伸1min，循环34次，最后68℃延伸7min；在PCR扩增仪上进行PCR扩增，PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。该引物对扩增出的目的片段大小为1070bp左右。
（4）回收、克隆、测序引物对BnGRF7-F/R在不同油菜种质中扩增的DNA片段：
回收上步骤中获得的引物对BnGRF7-F/R在不同油菜种质中扩增的DNA片段。操作UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）从琼脂糖凝胶中回收PCR扩增产物，然后将回收到的目标DNA连接在pMD19-T载体上（TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司），连接体系为：回收到的目标DNA 4.5 μL，pMD-19T载体0.5 μL，Solution Ⅰ5 μL（宝生物工程（大连）有限公司），16℃水浴锅中连接12h。
准备LB液体培养基和LB固体培养基，LB液体培养基配制方法为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，加水至100mL，高压灭菌锅121℃，15min，冷却至室温后加入100μL100mg/mL的氨苄青霉素。LB固体培养基配制方法为在LB液体培养基放入高压灭菌锅前加入1.2g的琼脂粉，其他均相同。
待连接完成后取30μL大肠杆菌感受态细胞DH5α（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）加入2μL的连接产物，通过热激法将其转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，然后通过添加Amp抗性的LB培养基筛选阳性菌落，并挑取10个单菌，并置于37℃摇床中220rpm落震荡培养4-6 h。取2μL震荡培养的菌液作为模板，用M13引物（正向引物：5’-AGGGTTTTCCCAGTCACG-3’；反向引物5’-GAGCGGATAACAATTTCACAC-3’；来源于生工生物工程股份有限公司）进行PCR扩增，PCR反应体系如下所示：反应体系为20μL，其中10 ×rtaq mix 10μL，上下引物（10mM）各1μL，菌液模板2μL，加水至20μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，循环28次，最后72℃延伸10min。
将PCR扩增的结果在1%的琼脂糖凝胶上进行检测，如果得到的DNA片段为1200bp左右，说明转化成功，选3份转化成功的菌液各吸取100μL送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
测序结果表明，引物BnGRF7-F/R在42种油菜种质中扩增的DNA片段各3个重复，对42种油菜种质中BnaGRF7.C02基因序列用GENEDOC软件进行序列比对。比对结果显示，BnaGRF7.C02基因在不同的油菜种质中有两种序列，甘蓝型油菜自交系K407和甘蓝型油菜双11号ZS11的BnaGRF7.C02基因分别为上述两种序列的典型代表。
图1为甘蓝型油菜自交系K407和甘蓝型油菜双11号ZS11中BnaGRF7.C02基因核苷酸序列对比图。图1中，甘蓝型油菜自交系K407种质中BnaGRF7.C02基因的核苷酸序列如SEQID NO：5所示，甘蓝型油菜ZS11种质中BnaGRF7.C02基因序列如SEQ ID NO：1所示。
与核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的甘蓝型油菜自交系K407的基因BnaGRF7.C02相比，甘蓝型油菜ZS11的BnaGRF7.C02基因存在3个单碱基突变和1个15bp的缺失突变，3个单碱基突变分别为：352C→352T，441A→441G，565A→565G；缺失突变为，在序列SEQ ID NO：1的869-884处缺失15bp的核苷酸片段，缺失碱基为5’-TCACGGGTATGGTCC-3’，记为BnaGRF7.C02 Δ15bp 。
图2为甘蓝型油菜自交系K407和甘蓝型油菜双11号ZS11中BnaGRF7.C02基因氨基酸序列对比图。如图2所示，这两种序列的所对应的氨基酸序列，甘蓝型油菜自交系K407种质中BnaGRF7.C02基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，甘蓝型油菜ZS11的BnaGRF7.C02基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，可以看到甘蓝型油菜ZS11的BnaGRF7.C02基因中存在1个氨基酸的改变以及5个氨基酸的缺失，缺失的氨基酸是HGYGP。
实施例2：BnaGRF7.C02基因与油菜千粒重相关联
油菜的千粒重为1.4g-5.76g，根据收获的42种油菜的千粒重将其分为三大类：小种子（千粒重2.31g-2.71g）；大种子（千粒重5.21g-5.25g），超大种子（千粒重>6g），如表1所示。对比42种油菜中BnaGRF7.C02基因的测序结果及其千粒重，在小种子的10种油菜种质中，5种油菜种质的BnaGRF7.C02基因存在15bp核苷酸，5种油菜种质的BnaGRF7.C02基因缺失15bp核苷酸；10种大种子油菜种质的BnaGRF7.C02基因均缺失15bp核苷酸；而20种超大种子的油菜种质中， 4种油菜种质的BnaGRF7.C02基因存在15bp核苷酸，16种油菜种质的BnaGRF7.C02基因缺失15bp 核苷酸。
表1. 油菜种质编号及其千粒重
Figure 964230DEST_PATH_IMAGE001
注：“√”表示油菜种质中的BnaGRF7.C02基因中存在15bp核苷酸。
本实施案例在具有324个油菜种质的自然群体(来源于中国农业科学院油料作物研究所)中对BnaGRF7.C02基因存在的15bp差异进行千粒重的关联分析，所得结果如表2所示。
表2. BnaGRF7.C02基因中是否存在15bp与油菜千粒重的关联分析结果
Figure 412529DEST_PATH_IMAGE002
从表2中可以看出，在324个油菜种质中有123个种质的BnaGRF7.C02基因存在15bp，均千粒重为3.76g；144个种质的BnaGRF7.C02基因缺失15bp，均千粒重为3.93g。BnaGRF7.C02基因缺失15bp的油菜种质的均千粒重较BnaGRF7.C02基因存在15bp的油菜种质大，且对千粒重的贡献率高达9%，相比现有技术中公开的其他影响千粒重的基因具有更高的显著性，表明BnaGRF7.C02基因与油菜的千粒重性状相关，缺失15bp的BnaGRF7.C02基因的油菜种质产生更大的植株。
实施例3：BnaGRF7.C02的分子标记引物与千粒重的关系
利用Primer Premier 5.0软件，在序列SEQ ID NO:5中BnaGRF7.C02基因存在差异的15bp处设计了上游引物GRF715bp-F：GATGATCCTC ACGGGTATGGTCC（SEQ ID NO:9），在距离15bp约1000bp处设计了下游引物GRF715bp-1R：TATGGATGTACTTCTTTCGTGGGAG（SEQ ID NO:10）、距离15bp 约1500bp处设计了下游引物GRF715bp-2R：CCTGCTTGGCATAACTTTCTCT（SEQID NO:11）。
上游引物GRF715bp-F分别与下游引物GRF715bp-1R和下游引物GRF715bp-2R组成两对引物GRF715bp-1和GRF715bp-2。
利用GRF715bp-1和GRF715bp-2PCR扩增42种不同千粒重的油菜种质的BnaGRF7.C02基因， PCR反应体系与实施例1中相同，引物对GRF715bp-1和GRF715bp-2的复性温度分别为58℃和55℃，将扩增结果在1.2%的琼脂糖胶上检测。
如图3所示，油菜种质中BnaGRF7.C02基因存在15bp，引物对GRF715bp-1可在其DNA基因组中扩增出1013bp的片段；油菜种质中BnaGRF7.C02基因缺失15bp，引物对GRF715bp-1在其基因组中无扩增产物。
从图4中可以看出，油菜种质中BnaGRF7.C02基因存在15bp，引物对GRF715bp-2可在其DNA基因组中扩增出1405bp的片段；油菜种质中BnaGRF7.C02基因缺失15bp，引物对GRF715bp-2在其基因组中无扩增产物。
可见，上述引物对GRF715bp-1和GRF715bp-2仅能扩增存在15bp的BnaGRF7.C02基因，可以用来鉴定油菜基因组中BnaGRF7.C02基因是否含有15bp，因此1013bp的扩增片段与GRF715bp-1可共同作为油菜高千粒重性状的共隐性分子标记，筛选出油菜种质中的BnaGRF7.C02基因是否含有15bp的核苷酸。
由于实施例2中得出的结论：油菜种质中BnaGRF7.C02基因缺失15bp，其具有较高的千粒重，且本实施例中得出引物对GRF715bp-1和GRF715bp-2能够筛选油菜种质中的BnaGRF7.C02基因是否含有15bp的核苷酸，因此可以将引物对GRF715bp-1和GRF715bp-2用于油菜的高产育种。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种与油菜千粒重相关的基因及其分子标记和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1055
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 1
atggactttc tcaaagtttc tgacaagaca acaactctct atagaaataa ctctctattt 60
gggttgaatc aacaacaaat ggagattcat cctcatcctc atgtcattac tcctcgtaac 120
aatctctcct ctctgttctc ttcatttgat ttgattctca aaacatagac taacgaatgt 180
tcctctcatg atttgtaaca gatgcaggaa atggagttat gggatgttac tattattacc 240
ctttcacaaa cgcgcaacta aaggagctcg agagacaagc gatgatctac aagtacatga 300
tcgcatccat tcccgttcct tttgatctcc ttgtctcatc atcctatgca cttccctgta 360
ataataaaaa cgctgtcgga gacttagagc cggggagatg tcggagaaca gacgggaaga 420
aatggagatg ctcgaaagag gtagtctcta atcacaaata ctgtgagaga cacttgcaca 480
gaggccgtcc tcgttcaaga aagcatgtgg aacttcctta ctctcgccct agcaacattg 540
gtggtggttc cgagaaaaac agagttctta gctctataaa agacacaaca gtcgtcgagc 600
caaaggaggt ttcatcagcc ctctcaaact acagaggaat cgagatcttt cctgcatcgg 660
cgtcaaacga gcaagaaaac aagtatctga actttataga tgtgtggtcc gatggagtaa 720
gatcatctga gaaactgagt acccctgctt cttcttcccc caatggcaat ccttctcttt 780
actcgcttga tctctctatg ggaggaaaca gcttaatggg ccacgatgaa atgggcttaa 840
gggtaattgg gccgggccgt gatgatccat atggcgctgt cgtgtcttct tcacttgatg 900
agatgtcgag atggcttgct cccacttccg ccacgcccgg gggaccatta gcggagatac 960
tgaggccgaa cccgagttca gcgttttctg gcgaaatgga agcgaatagc ttgacggcga 1020
ctcctactcc gagctcgtcg ccgttgtcga cttag 1055
<210> 2
<211> 322
<212> PRT
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 2
Met Asp Phe Leu Lys Val Ser Asp Lys Thr Thr Thr Leu Tyr Arg Asn
1 5 10 15
Asn Ser Leu Phe Gly Leu Asn Gln Gln Gln Met Glu Ile His Pro His
20 25 30
Pro His Val Ile Thr Pro His Ala Gly Asn Gly Val Met Gly Cys Tyr
35 40 45
Tyr Tyr Tyr Pro Phe Thr Asn Ala Gln Leu Lys Glu Leu Glu Arg Gln
50 55 60
Ala Met Ile Tyr Lys Tyr Met Ile Ala Ser Ile Pro Val Pro Phe Asp
65 70 75 80
Leu Leu Val Ser Ser Ser Tyr Ala Leu Pro Cys Asn Asn Lys Asn Ala
85 90 95
Val Gly Asp Leu Glu Pro Gly Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly Lys Lys
100 105 110
Trp Arg Cys Ser Lys Glu Val Val Ser Asn His Lys Tyr Cys Glu Arg
115 120 125
His Leu His Arg Gly Arg Pro Arg Ser Arg Lys His Val Glu Leu Pro
130 135 140
Tyr Ser Arg Pro Ser Asn Ile Gly Gly Gly Ser Glu Lys Asn Arg Ile
145 150 155 160
Leu Ser Ser Ile Lys Asp Thr Thr Val Val Glu Pro Lys Glu Val Ser
165 170 175
Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Leu Glu Ile Phe Pro Ala Ser Ala
180 185 190
Ser Asn Glu Gln Glu Asn Lys Tyr Leu Asn Phe Ile Asp Val Trp Ser
195 200 205
Asp Gly Val Arg Ser Ser Glu Lys Leu Ser Thr Pro Ala Ser Ser Ser
210 215 220
Pro Asn Gly Asn Pro Ser Leu Tyr Ser Leu Asp Leu Ser Met Gly Gly
225 230 235 240
Asn Ser Leu Met Gly His Asp Glu Met Gly Leu Arg Val Ile Gly Pro
245 250 255
Gly Arg Asp Asp Pro Tyr Gly Ala Val Val Ser Ser Ser Leu Asp Glu
260 265 270
Met Ser Arg Trp Leu Ala Pro Thr Ser Ala Thr Pro Gly Gly Pro Leu
275 280 285
Ala Glu Ile Leu Arg Pro Asn Pro Ser Ser Ala Phe Ser Gly Glu Met
290 295 300
Glu Ala Asn Ser Leu Thr Ala Thr Pro Thr Pro Ser Ser Ser Pro Leu
305 310 315 320
Ser Thr
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 3
tcacgggtat ggtcc 15
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 4
His Gly Tyr Gly Pro
1 5
<210> 5
<211> 1070
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 5
atggactttc tcaaagtttc tgacaagaca acaactctct atagaaataa ctctctattt 60
gggttgaatc aacaacaaat ggagattcat cctcatcctc atgtcattac tcctcgtaac 120
aatctctcct ctctgttctc ttcatttgat ttgattctca aaacatagac taacgaatgt 180
tcctctcatg atttgtaaca gatgcaggaa atggagttat gggatgttac tattattacc 240
ctttcacaaa cgcgcaacta aaggagctcg agagacaagc gatgatctac aagtacatga 300
tcgcatccat tcccgttcct tttgatctcc ttgtctcatc atcctatgca cctccctgta 360
ataataaaaa cgctgtcgga gacttagagc cggggagatg tcggagaaca gacgggaaga 420
aatggagatg ctcgaaagaa gtagtctcta atcacaaata ctgtgagaga cacttgcaca 480
gaggccgtcc tcgttcaaga aagcatgtgg aacttcctta ctctcgccct agcaacattg 540
gtggtggttc cgagaaaaac agaattctta gctctataaa agacacaaca gtcgtcgagc 600
caaaggaggt ttcatcagcc ctctcaaact acagaggaat cgagatcttt cctgcatcgg 660
cgtcaaacga gcaagaaaac aagtatctga actttataga tgtgtggtcc gatggagtaa 720
gatcatctga gaaactgagt acccctgctt cttcttcccc caatggcaat ccttctcttt 780
actcgcttga tctctctatg ggaggaaaca gcttaatggg ccacgatgaa atgggcttaa 840
gggtaattgg gccgggccgt gatgatcctc acgggtatgg tccatatggc gctgtcgtgt 900
cttcttcact tgatgagatg tcgagatggc ttgctcccac ttccgccacg cccgggggac 960
cattagcgga gatactgagg ccgaacccga gttcagcgtt ttctggcgaa atggaagcga 1020
atagcttgac ggcgactcct actccgagct cgtcgccgtt gtcgacttag 1070
<210> 6
<211> 327
<212> PRT
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 6
Met Asp Phe Leu Lys Val Ser Asp Lys Thr Thr Thr Leu Tyr Arg Asn
1 5 10 15
Asn Ser Leu Phe Gly Leu Asn Gln Gln Gln Met Glu Ile His Pro His
20 25 30
Pro His Val Ile Thr Pro His Ala Gly Asn Gly Val Met Gly Cys Tyr
35 40 45
Tyr Tyr Tyr Pro Phe Thr Asn Ala Gln Leu Lys Glu Leu Glu Arg Gln
50 55 60
Ala Met Ile Tyr Lys Tyr Met Ile Ala Ser Ile Pro Val Pro Phe Asp
65 70 75 80
Leu Leu Val Ser Ser Ser Tyr Ala Pro Pro Cys Asn Asn Lys Asn Ala
85 90 95
Val Gly Asp Leu Glu Pro Gly Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly Lys Lys
100 105 110
Trp Arg Cys Ser Lys Glu Val Val Ser Asn His Lys Tyr Cys Glu Arg
115 120 125
His Leu His Arg Gly Arg Pro Arg Ser Arg Lys His Val Glu Leu Pro
130 135 140
Tyr Ser Arg Pro Ser Asn Ile Gly Gly Gly Ser Glu Lys Asn Arg Ile
145 150 155 160
Leu Ser Ser Ile Lys Asp Thr Thr Val Val Glu Pro Lys Glu Val Ser
165 170 175
Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Leu Glu Ile Phe Pro Ala Ser Ala
180 185 190
Ser Asn Glu Gln Glu Asn Lys Tyr Leu Asn Phe Ile Asp Val Trp Ser
195 200 205
Asp Gly Val Arg Ser Ser Glu Lys Leu Ser Thr Pro Ala Ser Ser Ser
210 215 220
Pro Asn Gly Asn Pro Ser Leu Tyr Ser Leu Asp Leu Ser Met Gly Gly
225 230 235 240
Asn Ser Leu Met Gly His Asp Glu Met Gly Leu Arg Val Ile Gly Pro
245 250 255
Gly Arg Asp Asp Pro His Gly Tyr Gly Pro Tyr Gly Ala Val Val Ser
260 265 270
Ser Ser Leu Asp Glu Met Ser Arg Trp Leu Ala Pro Thr Ser Ala Thr
275 280 285
Pro Gly Gly Pro Leu Ala Glu Ile Leu Arg Pro Asn Pro Ser Ser Ala
290 295 300
Phe Ser Gly Glu Met Glu Ala Asn Ser Leu Thr Ala Thr Pro Thr Pro
305 310 315 320
Ser Ser Ser Pro Leu Ser Thr
325
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caaatgtcgg aagcatggag gc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctatgttca agctaagtcg ac 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatgatcctc acgggtatgg tcc 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tatggatgta cttctttcgt gggag 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cctgcttggc ataactttct ct 22

Claims (4)

1.一组用于检测油菜千粒重相关的分子标记的引物，其特征在于，含有3条引物，其核苷酸序列为：
GRF715bp-F：GATGATCCTC ACGGGTATGGTCC，
GRF715bp-1R：TATGGATGTACTTCTTTCGTGGGAG；
GRF715bp-2R：CCTGCTTGGCATAACTTTCTCT。
2.权利要求1所述的引物在油菜育种中的应用，所述应用包括：筛选油菜千粒重高的种子、淘汰油菜千粒重低的种子、培育千粒重高的油菜品种，若有扩增片段则油菜千粒重低，若无扩增片段则油菜千粒重高。
3.一种检测油菜千粒重相关的分子标记的方法，其特征在于，通过下述引物组扩增待检测油菜基因的DNA，所述引物组的核苷酸序列为：
GRF715bp-F：GATGATCCTCACGGGTATGGTCC，
GRF715bp-1R：TATGGATGTACTTCTTTCGTGGGAG；
GRF715bp-2R：CCTGCTTGGCATAACTTTCTCT。
4.一种用于检测油菜千粒重相关的分子标记的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。
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