BR122017010114B1 - micro-organismo recombinante e método de produção de um éster de ácido graxo - Google Patents

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Zhihao Hu
Chris Somerville
George Church
David Berry
Lisa Friedman
Andreas Schirmer
Shane Brubaker
Stephen B. Del Cardayré
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Abstract

são providos micro-organismos geneticamente construídos que produzem produtos a partir da via biossintética de ácidos graxos (derivados de ácidos graxos), assim como métodos para seu uso.

Description

(54) Título: MICRO-ORGANISMO RECOMBINANTE E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ÉSTER DE ÁCIDO GRAXO (51) IntCI.: C12N 1/20; C12N 9/02; C12N 9/10; C12P 7/04; C12P 7/64; (...).
(30) Prioridade Unionista: 13/02/2007 US PCT/US2007/003736; 19/05/2006 US 60/802,016; 19/05/2006 US 60/801,995; 28/03/2007 US 60/908,547.
(73) Titular(es): REG LIFE SCIENCES, LLC.
(72) Inventor(es): JAY D. KEASLING; ZHIHAO HU; CHRIS SOMERVILLE; GEORGE CHURCH; DAVID BERRY; LISA FRIEDMAN; ANDREAS SCHIRMER; SHANE BRUBAKER; STEPHEN B. DEL CARDAYRÉ.
(86) Pedido PCT: PCT US2007011923 de 18/05/2007 (87) Publicação PCT: WO 2007/136762 de 29/11/2007 (85) Data do Início da Fase Nacional: 15/05/2017 (62) Pedido Original do Dividido: PI0712205-5 -18/05/2007 (57) Resumo: São providos micro-organismos geneticamente construídos que produzem produtos a partir da via biossintética de ácidos graxos (derivados de ácidos graxos), assim como métodos para seu uso.
1/112
MICRO-ORGANISMO RECOMBINANTE E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ÉSTER DE ÁCIDO GRAXO
Dividido do PI 0712205-5, depositado em 18.05.2007.
Referências Cruzadas a Aplicações Relacionadas [001] Esta aplicação reivindica o beneficio das aplicações Pedido de Patente US Provisório No. 60/802.016, depositada em 19 de maio de 2006, Pedido de Patente US Provisório No. 60/801.995 depositada em 19 de maio de 2006, Pedido de Patente US Provisório 60/908.547 depositado em 28 de março de 2007 e Pedido PCT número PCT/US2007/003736 depositado em 13 de fevereiro de 2007, todas as quais são aqui incorporadas por referência.
Campo [002] Micro-organismos geneticamente construídos que produzem produtos a partir da via de ácidos graxos biossintéticos (derivados de ácidos graxos) são providos, assim como métodos para seu uso.
Fundamentos [003] Desenvolvimentos em tecnologia foram acompanhados por uma confiança elevada em fontes de combustível e tais fontes de combustível estão se tornando cada vez mais limitadas e difíceis de adquirir. Com a queima de combustíveis fósseis ocorrendo em uma taxa sem precedentes, é provável que a demanda por combustível do mundo venha, em breve, sobrepujar os estoques atuais de combustível.
[004] Como resultado, esforços foram direcionados para captar fontes de energia renovável, tal como a luz solar, água, vento e biomassa. O uso de biomassas para
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2/112 produzir novas fontes de combustível que não são derivados de fontes de petróleo, (i.e. biocombustível) emergiu como uma opção alternativa. Biocombustível (biodiesel) é um combustível biodegradável de queima limpa feito de alcanos e ésteres de cadeias longas. Biodiesel pode ser usado na maioria dos motores de combustão interna, tanto na forma pura, a qual é referida como biodiesel limpo, ou como uma mistura em qualquer concentração com diesel derivado de petróleo regular.
Os métodos atuais de fazer biodiesel envolvem a transesterificação de triacilglicerídeos (principalmente óleo vegetal) , o que leva a uma mistura de ésteres de ácidos graxos e glicerina, o resíduo indesejado, assim, provendo um produto que é heterogêneo e um rejeito que causa ineficiências econômicas.
Sumário [005] Aqui descritos estão micro-organismos recombinantes que são capazes de sintetizar produtos derivados da via biossintética de ácidos graxos (derivados de ácidos graxos), e opcionalmente liberar tais produtos no caldo de fermentação. Tais derivados de ácidos graxos são úteis, inter alia, como biocombustíveis e químicos de especialidade. Esses biocombustíveis e químicos de especialidade podem ser usados para fazer produtos adicionais, tais como suplementos nutricionais, polímeros, substituições de parafina, e produtos de cuidado pessoal.
[006] Os micro-organismos recombinantes aqui descritos podem ser construídos para produzir vários derivados de ácidos graxos incluindo, mas não se limitando a, álcoois de cadeia pequena, tais como etanol, propanol
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3/112 isopropanol e butanol, álcoois graxos, ésteres de ácidos graxos, hidrocarbonetos e cera ésteres.
[007]
Em um exemplo, a descrição prove um método para modificar um micro-organismo de forma que este produza, e opcionalmente libere derivados de ácidos graxos gerados a partir de uma fonte de carbono renovável.
Tais micro-organismos são geneticamente construídos, por exemplo, introduzindo-se uma sequência de DNA exógena codificando uma ou mais proteínas capazes de metabolizar uma fonte de carbono renovável para produzir e, em exemplos, secretar, um derivado de ácido graxo. Os alguns microorganismos modificados podem ser, então, usados em um processo de fermentação para produzir derivados de ácidos graxos úteis usando a fonte de carbono renovável (biomassa), como material inicial. Em alguns exemplos, um micro-organismo existente geneticamente rastreável é usado por causa da facilidade de se construir suas vias para controlar o crescimento, produção e reduzir ou eliminar reações colaterais que reduzem as eficiências da via biossintética.
Além disso, tais micro-organismos modificados podem ser usados para consumir fontes de carbono renovável para gerar combustíveis que podem ser usados diretamente como biocombustíveis, sem a necessidade para métodos especiais para armazenamento, ou transporte.
Em outros exemplos, para sobre-produzir hidrocarbonetos, micro-organismos que naturalmente produzem hidrocarbonetos são construídos expressando-se sequências de ácidos nucléicos exógenas que aumentam a produção de ácidos graxos.
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4/112 [008] Aqui providos são micro-organismos que produzem derivados de ácidos graxos tendo comprimento de cadeia de carbono, ramificação, e niveis de saturação definidos.
Em exemplos em particular, a produção de produtos homogêneos diminui o custo total associado com fermentação e separação. Em alguns exemplos, microorganismos incluindo uma ou mais sequências de ácidos nucléicos exógenas codificando pelo menos uma tioesterase (EC 3.1.2.14), e pelo menos uma cera sintase (EC 2.3.1.75) são providos. Em outros exemplos, são providos microorganismos que incluem uma ou mais sequências de ácidos nucléicos exógenas codificando pelo menos uma tioesterase (EC 3.1.2.14) e pelo menos um álcool acetiltransferase (2.3.1.84). Ainda em outros exemplos, micro-organismos incluindo uma ou mais sequências de ácidos nucléicos exógenas codificando pelo menos uma tioesterase (EC 3.1.2.14), pelo menos uma acil-CoA redutase (EC 1.2.1.50) e pelo menos um álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1) são providos. Micro-organismos expressando uma ou mais sequências de ácidos nucléicos exógenas codificando pelo menos uma tioesterase (EC
3.1.2.14) e pelo menos um álcool graxo formando acil-CoA redutase (1.1.1.*) são também providos.
Os peptideos tioesterase codificados pelas sequências de ácidos nucléicos exógenas podem ser escolhidos para prover produtos homogêneos.
[009] construído
Em alguns exemplos o micro-organismo que é para produzir o derivado de ácido graxo é E.
coli, Z. mobilis, Rhodococcus opacus, Ralstonia eutropha,
Vibrio furnissii, Saccharomyces cerevisiae, Lactococcus
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5/112 lactis, Streptomycetes, Stenotrophomonas maltophila, Pseudomonas ou Micrococus leuteus e seus relacionados.
[0010] Em outros exemplos, micro-organismos que produzem hidrocarbonetos endogenamente podem ser construídos para sobre-produzir hidrocarbonetos otimizandose a via biossintética de ácidos graxos como aqui descrito. Micro-organismos exemplares que são conhecidos por produzir hidrocarbonetos e podem ser construídos para sobre-produzir hidrocarbonetos usando os ensinamentos aqui providos incluem Arthrobacter sp. , Bacillus sp. , Botryococcus braunii, Chromatium sp., Cladosporium resina (ATCC22711), Clostridium pasteurianum VKM, Clostridium tenanomorphum, Clostridium acidiurici, Corynebacterium species, espécies cianobacterianas (Nostoc muscorum, Anacystis (Synechococcus) nidulans, Phormidium luridum, Chlorogloea fritschii, Trichodesmium erythaeum, Oscillatoria williamsii, Microcoleus chthonoplaseis, Coccochloris elabens, Agmenellum quadruplicatum, Plectonema terebrans, M vaginatus, e C. scopulorum) , Desulfovibrio desulfuricans (ATCC29577), Kineococcus radiotolerans (BAA-149), Micrococcus luteus (FD533, ATCC 272, 381, 382, ISU, 540, 4698, 7468, 27141) , Micrococcus sp. (ATCC 146, 398, 401, 533), Micrococcus roseus (ATCC 412, 416, 516), Micrococcus lysodeikticus, Mycobacterium species, Penicillium sp., Aspergillus sp., Trichoderma virida, Pullularia pullulans, Jeotgalicoccus sp. (M. candicans) (ATCC 8456), Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp., Rhodospirillium rubrum (ATCC11170), Rhodomicrobium vannielii, Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637, 17444, 17445,
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17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677), Saccharomycodes ludwigii (ATCC 22711) , Saccharomyces sp. (oviformus, ludwiggi, tropicalis), Vibrio furnissii Ml, Vibrio marinus MP-1, Vibrio ponticus, Serratia marinorubra, Ustilago maydis, Ustilago nuda, Urocystis agropyri, Sphacelotheca reiliana, e Tilletia sp. (foetida, caries, controversa).
[0011] Além de ser construído para expressar sequências de ácidos nucléicos exógenas que permitem a produção de derivados de ácidos graxos, o micro-organismo pode ter, adicionalmente, um ou mais genes endógenos funcionalmente deletados ou atenuados. Por exemplo, ackA (EC 2.7.2.1), ackB (EC 2.7.2.1), adhE (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10), fabF (EC 2.3.1.179), fabR (número de acesso NP_418398), fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-), GST (EC 6.3.2.3), gpsA (EC 1.1.1.94), ldhA (EC 1.1.1.28), pflB (EC 2.3.1.54), plsB (EC 2.3.1.15), poxB (EC 1.2.2.2), pta (EC 2.3.1.8), glutationa sintase (EC 6.3.2.3) e combinações desses podem ser atenuadas.
[0012] Além de ser construído para expressar sequências de ácidos nucléicos exógenas que permitem a produção de derivados de ácidos graxos, o micro-organismo pode ter, adicionalmente, um ou mais genes adicionais super-expressos. Por exemplo, pdh, panK, aceEF (codificando o componente Elp desidrogenase e o componente E2p dihidrolipoamida aciltransferase dos complexos piruvato e 2-oxoglutarato desidrogenase, Números de acesso: NP_414656, NP_414657, EC: 1.2.4.1. 2.3.1.61, 2.3.1.12), accABCD /fabH /fabD/fabG/acpP/fabF (codificando FAS, Números de acesso: CAD85557, CAD85558, NP_842277, NP_841683, NP_415613, EC:
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2.3.1.180, 2.3.1.39, 1.1.1.100, 1.6.5.3, 2.3.1.179), genes codificando redutases de acil-CoA graxo (Números de acesso: AAC45217, EC 1.2.1.-), UdhA ou genes similares (codificando piridina nucleotideo transidrogenase, Número de acesso: CAA46822, EC:1.6.1.1) e genes codificando redutases de acil-CoA graxo (Números de acesso: AAC45217, EC 1.2.1.-).
[0013] Em alguns exemplos, os micro-organismos aqui descritos produzem pelo menos 1 mg de derivado de ácido graxo por litro de caldo de fermentação. Em outros exemplos os micro-organismos produzem pelo menos 100 mg/L,
500 mg/L, 1 g/L, 5 g/L , 10 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35
g/L, 40 g/L , 50 g/L, 100 g/L, ou 120 g/L de derivado de
ácido graxo por litro de caldo de fermentação. Em alguns
exemplos, o derivado de ácido graxo é produzido e liberado a partir do micro-organismo e, ainda em outros exemplos, o micro-organismo é lisado antes da separação do produto.
[0014] Em alguns exemplos, o derivado de ácido
graxo inclui uma cadeia de carbono que é de pelo menos 8,
10, 12, 14, 16, 18, 20 , 22, 24, 26, 28, 30, 32, ou 34
carbonos em comprimento, Em alguns exemplos, pelo menos
50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 95% do produto de derivado de ácido graxo feito contém uma cadeia de carbono que é de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, ou 34 carbonos em comprimento. Ainda em outros exemplos, pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 95% do produto de derivado de ácido graxo contém 1, 2, 3, 4, ou 5, pontos de insaturação.
[0015] Também são providos métodos de produzir derivados de ácidos graxos. Esses métodos incluem cultivar
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8/112 os micro-organismos aqui descritos e separar o produto do caldo de fermentação.
[0016] Esses e outros exemplos são melhor descritos na descrição detalhada a seguir.
Breve Descrição das Figuras [0017] Fig. 1 mostra a via biossintética FAS.
[0018] Fig. 2 mostra a via biossintética que produz ceras. Ceras podem ser produzidas em uma célula hospedeira usando álcoois produzidos na célula hospedeira ou podem ser produzidas adicionando-se álcoois exógenos no meio. Um micro-organismo projetado para produzir ceras irá produzir enzimas cera sintase (EC 2.3.1.75) usando sequências de ácidos nucléicos exógenas, assim como sequências de tioesterase (EC 3.1.2.14). Outras enzimas que podem ser também moduladas para aumentar a produção de ceras incluem enzimas envolvidas na sintese de ácidos graxos (enzimas FAS EC 2.3.1.85), acil-CoA sintase (EC 2.3.1.86), álcool graxo formando acil-CoA redutase (EC 1.1.1.*), acil-CoA redutase (1.2.1.50) e álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1).
[0019] Fig. 3 apresenta a via biossintética que produz álcoois graxos. Álcoois graxos tendo comprimentos de cadeias de carbono definidos podem ser produzidos expressando-se sequências de ácidos nucléicos exógenas codificando tioesterases (EC 3.1.2.14), e combinações de acil-CoA redutases (EC 1.2.1.50), álcool desidrogenases (EC 1.1.1.1) e álcool graxo formando acil-CoA redutases (FAR, EC 1.1.1*). Outras enzimas que podem ser também moduladas para aumentar a produção de álcoois graxos incluem enzimas
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9/112 envolvidas em síntese de ácidos graxos (enzimas FAS EC 2.3.1.85), e acil-CoA sintase (EC 2.3.1.86).
[0020] Fig. 4 mostra as vias biossintéticas que produzem ésteres de ácidos graxos. Ésteres de ácidos graxos tendo comprimentos de cadeias de carbono definidos podem ser produzidos exogenamente expressando-se várias tioesterases (EC 3.1.2.14), combinações de acil-CoA redutase (1.2.1.50), álcool desidrogenases (EC 1.1.1.1), e álcool graxo formando Acil-CoA redutase (FAR, EC 1.1.1*), assim como, acetil transferase (EC 2.3.1.84). Outras enzimas que podem ser moduladas para aumentar a produção de ésteres de ácidos graxos incluem enzimas envolvidas na síntese de ácidos graxos (enzimas FAS EC 2.3.1.85), e acilCoA sintase (EC 2.3.1.86).
[0021] Fig. 5 mostra a produção de álcoois graxos pela linhagem descrita no Exemplo 4, co-transformada com pCDFDuet-1-fadD-acrl e plasmídeos contendo vários genes de tioesterase. As linhagens foram cultivadas aerobicamente a 25°C em meio mineral M9 com 0,4% de glicose em frascos de agitação. Álcoois graxos saturados C10, C12, C14, C16 e C18 foram identificados. Pequenas quantidades de álcoois graxos C16:l e C18:l foram também detectadas em algumas amostras. Álcoois graxos foram extraídos a partir de pelotas de células usando acetato de etila e derivados com N-trimetilsilil (TMS) imidazola para aumentar a detecção.
[0022] Fig. 6 mostra a liberação de álcoois graxos da linhagem de produção. Aproximadamente 50% do álcool graxo produzido foi liberado das células quando estas foram cultivadas a 37°C.
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10/112 [0023] Figs. 7A-7D mostram o espectro GS-MS de octil octanoato (C8C8) produzido por hospedeiros de produção expressando álcool acetil transferase (AATs, EC 2.3.1.84) e hospedeiros de produção expressando cera sintase (EC 2.3.1.75). Fig. 7A mostra extrato de acetato de acetila de linhagem C41 (DE3, AfadE/pHZl.43)/pRSET B+pAS004.114B) em que o plasmideo pHZ1.43 expressou ADP1 (cera sintase). Fig. 7B mostra extrato de acetato de acetila da linhagem C41(DE3, AfadE/pHZl.43)/pRSET B+pAS004.114B) em que o plasmideo pHZ1.43 expressou SAAT. Fig. 7C mostra extrato de acetato de acetila da linhagem C41(DE3, AfadE/pHZl.43)/pRSET B+pAS004.114B) em que o plasmideo pHZ1.43 não continha ADP1 (cera sintase) ou SAAT. Fig. 7D mostra o espectro de massa e padrão de fragmentação de C8C8 produzido por C41(DE3, AfadE/pHZl.43)/pRSET B+pAS004.114B) em que o plasmideo pHZ1.43 expressou SAAT).
[0024] Fig. 8 mostra a distribuição de ésteres de etila feitos quando a cera sintase de A. baylyi ADP1 (WSadpl) foi co-expressa com gene de tioesterase de Cuphea hookeriana em um hospedeiro de produção.
[0025] Figs. 9A e 9B mostram cromatogramas de análise GC/MS. Fig. 9A mostra um cromatograma de extrato de etila da cultura de E. coli linhagem LS9001 transformada com plasmideos pCDFDuet-l-fadD-WSadpl, pETDuet-1-'tesA. Etanol foi dado para fermentações. Fig. 9B mostra um cromatograma de etil hexadecanoato e etil oleato usado como referência.
[0026] Fig. 10 mostra uma tabela que identifica vários genes que podem ser super-expressos ou atenuados
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11/112 para aumentar a produção de derivados de ácidos graxos. A tabela também identifica vários genes que podem ser modulados para alterar a estrutura do produto de derivado de ácido graxo. Um especialista na arte irá ponderar que alguns dos genes que são usados para alterar a estrutura do derivado de ácido graxo irá, também, aumentar a produção de derivados de ácidos graxos.
Abreviações e Termos [0027] As seguintes explicações de termos e métodos são aqui fornecidas para melhor descrever a presente descrição e para guiar aqueles de conhecimento na arte na prática da presente descrição. Como aqui usado, compreender significa incluir e as formas singulares um ou uma ou o(a) incluem referências plurais, a menos que o contexto claramente indique o contrário. Por exemplo, referência a compreender uma célula inclui uma ou uma pluralidade de tais células, e referência a compreender a tioesterase inclui referência a um ou mais peptideos tioesterases e equivalentes desses conhecidos daqueles de especialistas na arte, e assim por diante. O termo ou refere-se um único elemento de elementos alternativos ou uma combinação de dois ou mais elementos, e menos que o contexto claramente indique o contrário. Por exemplo, a frase atividade de tioesterase ou atividade de acil-CoA redutase formadora de álcool graxo refere-se à atividade de tioesterase, atividade de acil-CoA redutase formadora de álcool graxo, ou uma combinação de ambas atividade de acil-CoA redutase formadora de álcool graxo e atividade de tioesterase.
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12/112 [0028]
A menos que explicado de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem o mesmo significado como comumente entendido pelos especialistas na arte a qual
Apesar de métodos e materiais àqueles aqui descritos poderem esta descrição pertence.
similares ou equivalentes ser usados na prática ou teste da presente descrição, métodos e materiais adequados estão descritos abaixo. Os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitantes. Outras características da descrição são aparentes a partir da descrição detalhada e das reivindicações a seguir.
[0029] Números de acesso: Os números de acesso desta descrição são derivados da base de dados de NCBI (Centro Nacional para Informações de Biotecnologia National Center for Biotechnology Information) mantida pelo National Institute of Health, U.S.A. Os números de acesso (número de acesso) estão como providos na base de dados em 27 de março de 2007.
[0030] Números de Classificação de Enzimas (EC): Os números EC providos por esta descrição são derivados da base de dados KEGG Ligand, mantida pela Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics, patrocinada em parte pela Universidade de Tóquio. Os números EC estão como providos na base de dados em 27 de março de 2007.
[0031] Atenuar: Para amenizar o impacto, atividade ou força de alguma coisa. Em um exemplo, a sensitividade de uma enzima em particular para responder à inibição ou inibição causada por uma composição que não é um produto ou um reagente (resposta não específica de via) é amenizada de
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13/112 forma que a atividade enzimática não sofra impacto pela presença de um composto. Por exemplo, o gene fabH e sua sequência de aminoácidos correspondente são sensíveis a temperatura e podem ser alterados para diminuir a sensitividade a flutuações de temperatura. A atenuação do gene fabH pode ser usada quando aminoácidos ramificados são desejados. Em outro exemplo, uma enzima que foi alterada para ser menos ativa pode ser referida como atenuada.
[0032] Uma deleção funcional de uma enzima pode ser usada para atenuar uma enzima. Uma deleção funcional é uma mutação, parcial ou deleção completa, inserção, ou outra variação feita para uma sequência gênica ou uma sequência controlando a transcrição de uma sequência gênica, que reduz ou inibe a produção do produto gênico, ou torna o produto gênico não funcional (i.e. a mutação aqui descrita para o gene plsB) . Por exemplo, a deleção funcional de fabR em E. coli reduz a repressão da via biossintética de ácidos graxos e permite que E. coli produza mais ácidos graxos insaturados (UFAs). Em algumas instâncias, uma deleção funcional é descrita como mutação knock-out.
[0033] Um especialista na arte irá ponderar que existem vários métodos de atenuar a atividade enzimática. Por exemplo, a atenuação pode ser conseguida introduzindose mudanças de sequência de aminoácidos alterando-se as sequências de ácidos nucléicos, colocando o gene sob controle de um promotor menos ativo, expressando RNA interferente, ribozimas ou sequências anti-senso que direcionam o gene de interesse, ou através de qualquer outra técnica conhecida na arte.
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14/112 [0034] Fonte de carbono: Geralmente refere-se a um substrato ou composto adequado para ser usado como fonte de carbono para crescimento celular procarionte ou eucarionte simples. Fontes de carbono podem estar em várias formas, incluindo, mas não limitadas a polímeros, carboidratos, ácidos, álcoois, aldeídos, cetonas, aminoácidos, peptídeos, etc. Esses incluem, por exemplo, vários monossacarídeos, tais como glicose, oligossacarídeos, polissacarídeos, material celulósico, xilose, e arabinose, dissacarídeos, tais como sacarose, ácidos graxos saturados ou insaturados, succinato, lactato, acetato, etanol, etc., ou misturas desses. A fonte de carbono pode ser, adicionalmente, um produto de fotossíntese, incluindo, mas não limitado a glicose.
[0035] cDNA (DNA complementar) : Um pedaço de DNA sem segmentos internos não codificadores (íntrons) e sequências reguladoras que determinam a transcrição. cDNA pode ser sintetisado por transcrição reversa a partir de RNA mensageiro extraído de células.
[0036] Deleção: A remoção de um ou mais nucleotídeos de uma molécula de ácido nucléico ou um ou mais aminoácidos de uma proteína, as regiões em ambos os lados estando juntas.
[0037] Detectável: Capaz de ter a existência ou presença investigada. Por exemplo, a produção de um produto de um reagente, por exemplo, a produção de ácidos graxos C18, é detectável usando o método provido no Exemplo abaixo.
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15/112 [0038] DNA: Ácido Desoxirribonucléico. DNA é um polímero de cadeia longa que inclui o material genético da maioria dos organismos vivos (alguns vírus possuem genes incluindo ácido ribonucléico, RNA) . As unidades que se repetem em polímeros de DNA são quatro nucleotídeos diferentes, cada qual inclui uma das quatro bases, adenina, guanina, citosina e timina ligada a um açúcar desoxirribose a qual um grupamento fosfato é anexado.
Trios de nucleotídeos, referidos como códons, em moléculas de DNA codificam um aminoácido em um peptídeo. O termo códon também usado para as sequências correspondentes (e complementares) de três nucleotídeos no mRNA no qual sequência de
DNA é transcrita.
[0039]
Endógeno: Como aqui usado com referência uma molécula de ácido nucléico e uma célula em particular ou micro-organismo refere-se a uma sequência de ácidos nucléicos ou peptídeo que está na célula e não foi introduzido na célula usando técnicas de engenharia recombinantes.
Por exemplo, um gene que esteve presente na célula quando a célula foi originalmente isolada da natureza.
Um gene é ainda considerado endógeno se as sequências controle, tal como um promotor ou sequências intensificadoras que ativam a transcrição ou tradução foram alteradas através de técnicas recombinantes.
[0040]
Exógeno: Como aqui usado com referência a uma molécula de ácido nucléico e uma célula em particular, refere-se a qualquer molécula de ácido nucléico que não se origina daquela célula em particular como encontrado na natureza.
Assim, uma molécula de ácido nucléico
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16/112 naturalmente não ocorrente é considerada como sendo exógena a uma célula, uma vez introduzida na célula. Uma molécula de ácido nucléico que é naturalmente ocorrente também pode ser exógena para uma célula em particular. Por exemplo, uma sequência codificadora inteira isolada da célula X é um ácido nucléico exógeno em relação à célula Y, uma vez que a sequência codificadora é introduzida na célula Y, mesmo que X e Y sejam o mesmo tipo de célula.
[0041] Expressão: 0 processo pelo qual a informação codificada de um gene é convertida nas estruturas e funções da uma célula, tais como uma proteína, RNA de transferência, ou RNA ribossômico. Genes expressos incluem aqueles que são transcritos em mRNA e, então, traduzidos em proteína e aqueles que são transcritos em RNA mas não traduzidos em proteína (por exemplo, RNAs de transferência e ribossômicos).
[0042] Éster graxo: Inclui qualquer éster feito de um ácido graxo. As cadeias de carbono em ácidos graxos podem conter qualquer combinação das modificações aqui descritas. Por exemplo, a cadeia de carbono pode conter um ou mais pontos de insaturação, um ou mais pontos de ramificação, incluindo ramificação cíclica, e podem ser construídos para serem curtas ou longas. Qualquer álcool pode ser usado para formar ésteres de ácidos graxos, por exemplo, álcoois derivados da via biossintética de ácidos graxos, álcoois produzidos pelo hospedeiro de produção através de outra via que não a via biossintética de ácido graxos, e álcoois que são fornecidos no caldo de fermentação.
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17/112 [0043]
Derivado de ácido graxo: Inclui produtos feitos em parte a partir da via biossintética de ácidos graxos do organismo hospedeiro.
A via biossintética de ácidos graxos inclui enzimas sintetase de ácido graxo que podem ser construídas, como aqui descrito, para produzir derivados de ácidos graxos, e em alguns exemplos podem ser expressas com enzimas adicionais para produzir derivados de ácidos graxos tendo características desejadas de cadeia de carbono. Derivados de ácidos graxos exemplares incluem, por exemplo, álcoois de cadeias curtas ou longas, hidrocarbonetos, e ésteres de ácidos graxos incluindo ceras.
[0044] Caldo de fermentação: Inclui qualquer meio que suporte vida de micro-organismos (i.e. um microorganismo que está metabolizando carbono ativamente). Um meio de fermentação usualmente contém uma fonte de carbono. A fonte de carbono pode ser qualquer coisa que possa ser utilizada, com ou sem enzimas adicionais, pelo micro organismo para energia.
[0045] Hidrocarboneto: inclui compostos químicos que contém os elementos carbono (C) e hidrogênio (H).
Todos hidrocarbonetos consistem de uma espinha dorsal de carbono e átomos de hidrogênio anexados àquela espinha dorsal. Algumas vezes, o termo é usado como uma forma encurtada do termo hidrocarboneto alifático. Existem essencialmente três tipos de hidrocarbonetos: (1) hidrocarbonetos aromáticos, que possuem pelo menos um anel aromático; (2) hidrocarbonetos saturados, também conhecidos como alcanos, que não possuem ligações duplas, triplas ou
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18/112 aromáticas; e (3) hidrocarbonetos insaturados, que possuem uma ou mais ligações duplas ou triplas entre átomos de carbono, são divididos em: alquenos, alquinos, e dienos. Hidrocarbonetos líquidos extraídos geologicamente são referidos como petróleo (literalmente óleo de pedra) ou óleo mineral, enquanto hidrocarbonetos geológicos gasosos são referidos como gás natural. Todos são significativas fontes de combustível e de matéria prima como uma matériaprima para a produção de químicos orgânicos e são comumente encontrados na subsuperfície da Terra usando as ferramentas de geologia de petróleo. As reservas de óleo em rochas sedimentares são a principal fonte de hidrocarbonetos para as indústrias de energia e de químicos. Hidrocarbonetos são de importância econômica fundamental, pois englobam os constituintes dos principais combustíveis fósseis (carvão, petróleo, gás natural, etc.) e biocombustíveis, assim como plásticos, ceras, solventes e óleos.
[0046] Isolado: Um componente biológico isolado (tal como uma molécula de ácido nucléico, proteína, ou célula) foi substancialmente separado ou purificado a parte de outros componentes biológicos nos quais o componente ocorre naturalmente, tais como outros DNA e RNA cromossômico e extracromossômico, e proteínas.
Moléculas de ácidos nucléicos e proteínas que foram isoladas incluem moléculas de ácidos nucléicos e proteínas purificadas por métodos de purificação padrão.
O termo também abrange moléculas de ácidos nucléicos e proteínas preparadas por expressão recombinante em uma célula
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19/112 hospedeira, assim como moléculas de ácidos nucléicos e proteínas quimicamente sintetizadas.
[0047] Em um exemplo, isolado refere-se a uma molécula de ácido nucléico naturalmente ocorrente que não é imediatamente contígua em relação a ambas as sequências com as quais é imediatamente contígua (uma na extremidade 5' e uma na extremidade 3') no genoma naturalmente ocorrente do organismo do qual é derivada.
[0048] Micro-organismo: Inclui espécies microbianas procariontes e eucariontes dos domínios Archaea, Bactéria e Eucarya, o último incluindo leveduras e fungos filamentosos, protozoários, algas, ou protistas superiores. Os termos células microbianas e micróbios são usados intercambiavelmente com o termo micro-organismo.
[0049] Molécula de ácido nucléico: Engloba tanto moléculas de RNA e DNA incluindo, sem limitação, cDNA, DNA genômico, e mRNA. Inclui moléculas de ácidos nucléicos sintéticas, tais como aquelas que são sintetizadas quimicamente ou produzidas de forma recombinante. A molécula de ácido nucléico pode ser de dupla fita ou fita simples. Onde a molécula de ácido nucléico de fita simples pode ser a fita senso ou a fita anti-senso. Além disso, a molécula de ácido nucléico pode ser circular ou linear.
[0050] Operacionalmente ligado: Uma primeira sequência de ácidos nucléicos é operacionalmente ligada com uma segunda sequência de ácidos nucléicos quando a primeira sequência de ácidos nucléicos é colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácidos nucléicos. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma
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20/112 sequência codifícadora se o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência codifícadora. Geralmente, sequências de DNA operacionalmente ligadas são contíguas e, onde necessário para juntar duas regiões codificadoras de proteína, no mesmo quadro de leitura. Configurações de genes separados que são transcritos in tandem como um único RNA mensageiro são conhecidas como operons. Assim, colocar genes em proximidade íntima, por exemplo, em um vetor de plasmídeo, sob a regulação transcricional de um único promotor, constitui um operon sintético.
[0051] ORF (quadro de iniciação de leitura) : Uma série de trios de nucleotídeos (códons) codificando aminoácidos sem quaisquer códons de terminação. Essas sequências são usualmente traduzíveis em um peptídeo.
[0052] Super-expresso: Quando um gene é transcrito em uma taxa elevada comparada à taxa de transcrição endógena para aquele gene. Em alguns exemplos, superexpressão inclui adicionalmente uma taxa elevada de tradução do gene comparada à taxa de tradução endógena para aquele gene. Métodos de testar a super-expressão são bem conhecidos na arte, por exemplo, níveis de RNA transcrito podem ser avaliados usando rtPCR e níveis de proteína podem ser avaliados usando análise de gel SDS page.
[0053] Purificado: O termo purificado não requer pureza absoluta; ao contrário, é pretendido como um termo relativo. Assim, por exemplo, uma preparação de derivado de ácido graxo purificado, tal como uma cerca, ou uma preparação de éster de ácido graxo, é uma na qual o produto é mais concentrado do que o produto em seu ambiente em uma
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21/112 célula. Por exemplo, uma cera purificada é uma que é substancialmente separada de componentes celulares (ácidos nucléicos, lipideos, carboidratos, e outros peptideos) que podem estar acompanhando. Em outro exemplo, uma preparação de cera purificada é uma na qual a cera é substancialmente livre de contaminantes, tais como aqueles que podem estar presentes após a fermentação.
[0054] Em um exemplo, um éster de ácido graxo é purificado quando pelo menos cerca de 50%, em peso, de uma amostra é composta do éster de ácido graxo, por exemplo, quando pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%, ou 99% ou mais de uma amostra é composta do éster de ácido graxo. Exemplos de métodos que podem ser usados para purificar ceras, álcoois graxos, e ésteres de ácidos graxos, incluem os métodos descritos no Exemplo 11 abaixo.
[0055] Recombinante: Uma molécula de ácido nucléico ou proteína recombinante é uma que possui uma sequência que não é naturalmente ocorrente, possui uma sequência que é feita por uma combinação artificial de dois segmentos de sequência separados, ou ambas. Esta combinação artificial pode ser conseguida, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação artificial de segmentos isolados de moléculas de ácidos nucléicos ou proteínas, tais como técnicas de engenharia genética. Recombinante é também usado para descrever moléculas de ácidos nucléicos que foram artificialmente manipuladas, mas contêm as mesmas sequências reguladoras e regiões codificadoras que são encontradas no organismo do qual o ácido nucléico foi isolado. Uma célula ou micro-organismo recombinante é um
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22/112 que contém uma molécula de ácido nucléico exógena, tal como uma molécula de ácido nucléico recombinante.
[0056] Liberação: o movimento de um composto a partir de dentro de uma célula (intracelular) para fora da célula (extracelular). O movimento pode ser ativo ou passivo. Quando a liberação é ativa, ela pode ser facilitada por um ou mais peptideos transportadores e, em alguns exemplos, pode consumir energia. Quando a liberação é passiva, ela pode ser difusão através da membrana e pode ser facilitada coletando continuamente o composto desejado do ambiente extracelular, promovendo, assim, difusão adicional. A liberação de um composto pode ser também alcançada lisando uma célula.
[0057] Surfactantes: Substâncias capazes de reduzir a tensão de superfície de um líquido no qual estão dissolvidas. São compostos, tipicamente, de uma cabeça solúvel em água e uma cadeia de hidrocarboneto ou cauda. O grupamento solúvel em água é hidrofílico e pode ser tanto iônico ou não iônico, e a cadeia de hidrocarbonetos é hidrofóbica. Surfactantes são usados em uma variedade de produtos, incluindo detergentes e limpadores, e são também usados como auxiliares para processos químicos de têxteis, couro e papel, em cosméticos e fármacos, na indústria de alimentos e na agricultura. Além disso, eles podem ser usados para auxiliar na extração e isolamento de óleos em estado natural que são encontrados em ambientes difíceis de acessar ou como emulsões aquosas.
[0058] Existem quatro tipos de surfactantes caracterizados por usos variados. Surfactantes aniônicos
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23/112 possuem atividade tipo detergente e são geralmente usados para limpeza.
Surfactantes catiônicos contêm hidrocarbonetos de cadeias longas e são frequentemente usados para tratar proteínas e polímeros sintéticos ou são componentes de amaciantes de tecidos e condicionadores de cabelo.
Surfactantes anfóteros também contêm hidrocarbonetos de cadeias longas e são tipicamente usados em xampus.
Surfactantes não iônicos são geralmente usados em produtos de limpeza.
[0059]
Célula transformada ou recombinante:
Uma célula na qual uma molécula de ácido nucléico foi introduzida, tal como uma molécula de ácido nucléico codificando uma acil-CoA sintase, por exemplo, por técnicas de biologia molecular.
A transformação engloba todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucléico pode ser introduzida em tal célula, incluindo, mas não se limitando a, transfecção com vetores virais, conjugação, transformação com vetores de plasmídeos, e introdução de
DNA sem histonas por eletroporação, lipofecção, aceleração por pistola de partículas.
[0060]
Sob condições que permitem a produção de produto: Quaisquer condições de fermentação que permitem que um micro-organismo produza um produto desejado, tal como ácidos graxos, hidrocarbonetos, álcoois graxos, ceras, ou ésteres de ácidos graxos.
Condições de fermentação usualmente incluem amplitudes de temperatura, níveis de aeração, seleção de meio, que, quando combinados, permitem que micro-organismo cresça.
Meios exemplares incluem caldos ou géis.
Geralmente, o meio inclui uma
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24/112 fonte de carbono, tal como glicose, frutose, celulose, ou similares, que pode ser metabolizada pelo micro-organismo diretamente, ou enzimas podem ser usadas no meio para facilitar a metabolização da fonte de carbono. Para determinar se as condições de cultura permitem a produção de produto, o micro-organismo pode ser cultivado por 24, 36, ou 48 horas e uma amostra pode ser obtida e analisada. Por exemplo, as células na amostra, ou o meio no qual as células foram crescidas, pode ser testada para a presença do produto desejado. Quando testando para a presença de um produto, testes tais como aqueles providos nos Exemplos abaixo podem ser usados.
[0061] Vetor: Uma molécula de ácido nucléico introduzida em uma célula, produzindo, dessa forma, uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácidos nucléicos que permitem que este se replique na célula, tal como uma origem de replicação. Um vetor pode incluir, também, um ou mais genes marcadores de seleção e outros elementos genéticos conhecidos na arte.
[0062] Cera: Uma variedade de ésteres de ácidos graxos que formam sólidos ou substâncias flexíveis sob um grupo de condições físicas identificadas. Ésteres de ácidos graxos que são chamados ceras geralmente possuem cadeias de carbono mais longas do que ésteres de ácidos graxos que não são ceras. Por exemplo, uma cera geralmente forma uma substância flexível em temperatura ambiente.
Descrição Detalhada
I. Produção de derivados de ácidos graxos
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25/112 [0063] O organismo hospedeiro no qual sequências de DNA exógenas são transformadas pode ser um organismo hospedeiro modificado, tal como um organismo que foi modificado para aumentar a produção de acil-ACP ou acilCoA, reduzir o catabolismo de derivados de ácidos graxos e intermediar, ou reduzir a inibição por resposta em pontos específicos na via biossintética. Além de modificar os genes aqui descritos, recursos celulares adicionais podem ser desviados para sobre-produzir ácidos graxos, por exemplo, as vias de lactato, succinato e/ou acetato podem ser atenuadas, e acetil-CoA carboxilase (ACC) pode ser super-expressa. As modificações ao hospedeiro de produção aqui descrito podem ser através de alterações genômicas, sistemas de expressão extracromossômicos, ou combinações desses. Uma revisão da via é provida nas Figs. 1 e 2.
A. Acetil-CoA - Malonil-CoA para Acil-ACP [0064] Ácido graxo sintase (FAS) é um grupo de peptídeos que catalisam a iniciação e alongamento de cadeias de acil (Marrakchi et al., Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002). A proteína carregadora de grupos acil (ACP) junto com as enzimas na via FAS controlam o comprimento, grau de saturação e ramificação dos ácidos graxos produzidos. Enzimas que podem ser incluídas em FAS incluem AccABCD, FabD, FabH, FabG, FabA, FabZ, Fabl, FabK,
FabL, FabM, FabB, e FabF. Dependendo do produto desejado,
um ou mais desses genes podem ser atenuados ou super-
expressos.
[0065] Por exemplo, a via biossintética de ácido
graxo no hospedeiro de produção usa os precursores acetilPetição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 34/153
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CoA e malonil-CoA (Fig. 2) . E. coli ou outros organismos hospedeiros construídos para sobre-produzir esses componentes podem servir como ponto de partida para etapas subsequentes de engenharia genética para prover o produto final específico (tal como, ésteres de ácidos graxos, hidrocarbonetos, álcoois graxos). Diversas modificações diferentes podem ser feitas, tanto em combinação ou individualmente, para a linhagem hospedeira para obter produção aumentada de acetil CoA/malonil CoA/ácido graxo e derivado de ácido graxo. Por exemplo, para aumentar a produção de acetil CoA, um plasmídeo com pdh, panK, aceEF, (codificando o componente Elp desidrogenase e o componente E2p dihidrolipoamida aciltransferase dos complexos piruvato e 2-oxoglutarato desidrogenase), fabH / fabD/ fabG/acpP/ fabF, e, em alguns exemplos, DNA adicional codificando acil-CoA graxo redutases e aldeído descarbonilases, todas sob o controle de um promotor constitutivo, ou, de outra forma, controlável, podem ser construídas. Exemplos de números de acesso do Genbank para esses genes são: pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (também conhecidos como coaA, AAC76952), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175), fabD (AAC74176), fabG (AAC74177), acpP (AAC74178), fabF (AAC74179).
[0066] Adicionalmente, fadE, gpsA, ldhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA, e/ou ackB podem passar por nocaute, ou seus níveis de expressão podem ser reduzidos, no microorganismo construído por transformação com plasmídeos condicionalmente replicativos ou não replicativos contendo mutações nulas ou de deleção dos genes correspondentes, ou
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27/112 substituindo as sequências promotoras ou intensificadoras. Exemplos de números de acesso do Genbank para esses genes são; fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), ldhA ( AAC74462), pflb (AAC73989) , adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ackA (AAC75356), e ackB (BAB81430).
[0067] Os micro-organismos construídos resultantes podem ser cultivados em um ambiente desejado, por exemplo, um com glicerol limitado (menos de 1% p/v no meio de cultura). Dessa forma, esses micro-organismos terão níveis aumentados de produção de acetil-CoA. A sobre-produção de malonil-CoA pode ser efetuada construindo-se o microorganismo como descrito acima, com DNA codificando accABCD (acetil CoA carboxilase, por exemplo número de acesso AAC73296, EC 6.4.1.2) incluído no plasmídeo sintetizado de novo. A sobre-produção de ácido graxo pode ser alcançada incluindo, ainda, DNA codificando lípase (por exemplo Números de Acesso CAA89087, CAA98876) no plasmídeo sintetisado de novo.
[0068] Em alguns exemplos, acetil-CoA carboxilase (ACC) é super-expressa para aumentar a concentração intracelular dessa em pelo menos 2 vezes, tal como pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, por exemplo, em relação a níveis de expressão nativos.
[0069] Além disso, plsB (por exemplo Número de acesso AAC77011) mutação D311E pode ser usado para remover limitações no pool de acil-CoA.
[007 0] Além disso, a super-expressão de um gene de sfa (supressor de FabA, por exemplo Número de acesso
AAN79592) pode ser incluída no hospedeiro de produção para
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28/112 aumentar a produção de ácidos graxos monoinsaturados (Rock et al.r J. Bacteriology 178:5382-5387, 1996).
B. Acil-ACP para Ácido Graxo [0071] Para construir um hospedeiro de produção para a produção de uma população homogênea de derivados de ácidos graxos, um ou mais genes endógenos podem ser atenuados ou deletados funcionalmente e uma ou mais tioesterases podem ser expressas. Por exemplo, derivados de ácidos graxos CIO podem ser produzido atenuando-se tioesterase C18 (por exemplo, números de acesso AAC73596 e P0ADA1), que usa C18:1-ACP e expressando tioesterase CIO (por exemplo, número de acesso Q39513), que usa C10-ACP. Assim, resultando em uma população relativamente homogênea de derivados de ácidos graxos que possuem um comprimento de cadeia de carbono de 10. Em outro exemplo, derivados de ácidos graxos C14 podem ser produzidos atenuando-se tioesterases endógenas que produzem ácidos graxos que não C14 e expressando-se a tioesterase de número de acesso Q39473 (que usa C14-ACP). Ainda em outro exemplo, derivados de ácidos graxos C12 podem ser produzidos expressando-se tioesterases que usam C12-ACP (por exemplo, número de acesso Q41635) e atenuando-se tioesterases que produzem ácidos graxos que não C12. A sobre-produção de acetil CoA, malonil CoA, e ácido graxo pode ser verificada usando métodos conhecidos na arte, por exemplo, usando precursores radioativos, HPLC, e GC-MS subsequente à lise celular.
Tabela 1 Tioesterases
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Número de acesso Organismo Fonte Gene Produto preferencial produzido
AAC73596 E. coli tesA sem a sequência líder C18:1
Q41635 Umbellularia california fatB C12 :0
Q39513; Cuphea hookeriana fatB2 C8:0 -C10:0
AAC49269 Cuphea hookeriana fatB3 C14:0 -C16:0
Q39473 Cinnamonum camphorum fatB C14 :0
CAA85388 Arabidopsis thaliana fatB[M141T]* C16:l
NP 189147; NP 193041 Arabidopsis thaliana fatA C18:1
CAC39106 Bradyrhiizobium japonicum fatA C18:1
AAC72883 Cuphea hookeriana fatA C18:1
*Mayer et al., BMC Plant Biology 7:1-11, 2007.
C. Ácido graxo para Acil-CoA [0072] Hospedeiros de produção podem ser construídos usando peptídeos conhecidos por produzir ácidos graxos de vários comprimentos. Um método de fazer ácidos graxos envolve aumentar a expressão de, ou expressar mais
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30/112 formas ativas de, um ou mais peptideos acil-CoA sintase (EC
2.3.1.86).
[0073] Como aqui usado, acil-CoA sintase inclui peptideos no número de classificação de enzima EC 2.3.1.86, assim como qualquer outro peptídeo capaz de catalisar a conversão de um ácido graxo para acil-CoA. Adicionalmente, um especialista na arte irá ponderar que alguns peptideos acil-CoA sintase também catalisarão outras reações, por exemplo, alguns peptideos acil-CoA sintase aceitarão outros substratos além de ácidos graxos. Tais peptideos acil-CoA sintase não específicos são, portanto, também incluídos. Sequências de peptideos acil-CoA sintase estão disponíveis publicamente. Exemplos de Números de acesso do GenBank são providos na Fig. 10.
D. Acil-CoA para álcool graxo [0074] Hospedeiros de produção podem ser construídos usando polipeptídeos conhecidos por produzir álcoois graxos a partir de acil-CoA. Um método de fazer álcoois graxos envolve aumentar a expressão de, ou expressar mais formas ativas de acil-CoA redutase formadora de álcool graxo (FAR, EC 1.1.1.*), ou acil-CoA redutases (EC
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nase (EC
Figure BR122017010114B1_D0002
Figure BR122017010114B1_D0003
•
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·
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) ·
Figure BR122017010114B1_D0006
por diante acil-CoA redutase formadora de álcool graxo (FAR, EC 1.1.1.*), acil-CoA redutases (EC 1.2.1.50) e álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1) são coletivamente referidos como peptideos formadores de álcoois graxos. Em alguns exemplos, todos os três genes formadores de álcoois graxos podem ser super-expressos em um hospedeiro de
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Figure BR122017010114B1_D0008
31/112 produção, e, ainda em outros exemplos, um ou mais dos genes formadores de álcoois graxos podem ser super-expressos.
[0075] Como aqui usado, peptideos formadores de álcoois graxos incluem peptideos nos números de classificação de enzimas EC 1.1.1.*, 1.2.1.50, e 1.1.1.1, assim como qualquer outro peptídeo capaz de catalisar a conversão de acil-CoA para álcool graxo. Adicionalmente, um especialista na arte irá ponderar que alguns peptideos formadores de álcoois graxos irão catalisar também outras reações, por exemplo, alguns peptideos acil-CoA redutase aceitarão outros substratos além de ácidos graxos. Tais peptideos não específicos são, portanto, também incluídos. Sequências de peptideos formadoras de álcoois graxos estão publicamente disponíveis. Exemplos de Números de acesso do GenBank são providos na Fig. 10.
[0076] Álcoois graxos podem ser também descritos como surfactantes baseados em hidrocarbonetos. Para a produção de surfactantes, o micro-organismo é modificado de forma a produzir um surfactante a partir de uma fonte de carbono renovável. Tal micro-organismo inclui uma primeira sequência de DNA exógena codificando uma proteína capaz de converter um ácido graxo para um aldeído graxo e uma segunda sequência de DNA exógena codificando uma proteína capaz de converter um aldeído graxo para um álcool. Em alguns exemplos, a primeira sequência de DNA exógena codifica um ácido graxo redutase. Em um avanço, a segunda sequência de DNA exógena codifica aldeído redutase microssomal ou aldeído desidrogenase de cadeia longa de mamífero. Em um exemplo adicional, a primeira e a segunda
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32/112 sequências de DNA exógenas são de um complexo multienzima de Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, Acinobacter sp linhagem M-l, ou Candida lipolytica. Em um avanço, a primeira e a segunda sequências de DNA heterólogas são de um complexo multienzima de Acinobacter sp linhagem M-l ou Candida lipolytica.
[0077] Fontes adicionais de sequências de DNA heterólogas codificando ácido graxo a álcool de cadeia longa convertendo proteínas que podem ser usadas na produção de surfactantes incluem, mas não são limitadas a, Mortierella alpina (ATCC 32222), Crytococcus curvatus, (também referidas como Apiotricum curvatum) , Alcanivorax jadensis (T9T =DSM 12718 =ATCC 700854), Acinetobacter sp. HO1-N, (ATCC 14987) e Rhodococcus opacus (PD630 DSMZ 44193).
[0078] Em um exemplo, o derivado de ácido graxo é um produto surfactante saturado ou insaturado tendo um conteúdo de átomo de carbono limitado entre 6 e 36 átomos de carbono. Em outro exemplo, o produto surfactante possui um conteúdo de átomo de carbono limitado entre 24 e 32 átomos de carbono.
[0079] Hospedeiros apropriados para produzir surfactantes podem ser tanto micro-organismos eucariontes ou procariontes. Hospedeiros exemplares incluem Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, Acinobacter sp linhagem M-l, Arabidopsis thalania, ou Candida lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, e E. coli construídos para expressar acetil CoA carboxilase. Hospedeiros que demonstram uma habilidade inata de sintetizar altos níveis
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33/112 de precursores surfactantes na forma de lipideos e óleos, tal como Rhodococcus opacus, Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins E. coli construídos para expressar acetil CoA carboxilase, e outras bactérias oleaginosas, leveduras, e fungos podem ser também usados.
E. Álcoois graxos para Ésteres graxos [0080] Hospedeiros de produção podem ser construídos usando polipeptídeos conhecidos por produzir ésteres graxos de vários comprimentos. Um método de fazer ésteres graxos inclui aumentar a expressão de, ou expressar mais formas ativas de, um ou mais peptídeos de álcool 0acetiltransferase (EC 2.3.1.84). Esses peptídeos catalisam a reação de acetil-CoA e um álcool para formar CoA e um éster acético. Em alguns exemplos os peptídeos de álcool O-acetiltransferase podem ser expressos em conjunto com peptídeos tioesterase selecionados, peptídeos FAS e peptídeos formadores de álcool graxo permitindo, assim, com que o comprimento de cadeia de carbono, saturação e grau de ramificação sejam controlados. Em alguns casos o operon bkd pode ser co-expressos para permitir que precursores de ácidos graxos ramificados sejam produzidos.
[0081] Como aqui usado, peptídeos de álcool 0acetiltransferase incluem peptídeos no número de classificação de enzimas EC 2.3.1.84, assim como qualquer outro peptídeo capaz de catalisar a conversão de acetil-CoA e um álcool para formar CoA e um éster acético. Adicionalmente, um especialista na arte irá ponderar que peptídeos de álcool O-acetiltransferase irão catalisar outras reações também, por exemplo, alguns peptídeos de
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34/112 álcool O-acetiltransferase aceitarão outros substratos além de álcoois graxos ou acetil-CoA tioéster i.e tais como outros álcoois e outros acil-CoA tioésteres. Tais peptídeos de álcool O-acetiltransferase não específicos ou divergentes são, portanto, também incluídos. Sequências peptídicas de álcool O-acetiltransferase estão publicamente disponíveis. Exemplos de Números de acesso do GenBank são providos na Fig. 10. Testes para caracterizar a atividade de peptídeos de álcool O-acetiltransferase em particular são bem conhecidos na arte. O-acetiltransferases e 0aciltransferases manipuladas que possuem novas atividades e especificidades para o grupamento acil doador ou arranjo de álcool aceptor, podem ser também criadas. Enzimas manipuladas poderíam ser geradas através de abordagens racionais e evolutivas bem documentadas na arte.
F. Acil-CoA para Ésteres graxos (biodiesel e ceras) [0082] Hospedeiros de produção podem ser construídos usando peptídeos conhecidos por produzir ésteres de ácidos graxos a partir de acil-CoA e álcoois. Em alguns exemplos, os álcoois são providos no meio de fermentação e, em outros exemplos, o hospedeiro de produção pode prover o álcool como aqui descrito. Um especialista na arte irá ponderar que estruturalmente, ésteres de ácidos graxos possuem um lado A e um lado B. Como aqui descrito, o lado A do éster é usado para descrever a cadeia de carbono contribuída pelo álcool, e o lado B do éster é usado para descrever a cadeia de carbono contribuída pelo acil-CoA. Ambas as cadeias podem ser saturadas ou insaturadas, ramificadas ou não ramificadas. 0 hospedeiro de produção
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35/112 pode ser construído para produzir álcoois graxos ou álcoois de cadeia curta. 0 hospedeiro de produção pode ser também construído para produzir moléculas de acil-CoA específicas. Como aqui usado, ésteres de ácidos graxos são ésteres derivados de um acil-tioéster graxo e um álcool, caracterizado pelo fato de que o lado A e o lado B do éster podem variar em comprimento independentemente. Geralmente, o lado A do éster é de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 carbonos em comprimento, enquanto que o lado B do éster é de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26 carbonos em comprimento. O lado A e o lado B podem ser cadeias diretas ou ramificadas, saturadas ou insaturadas.
[0083] A produção de ésteres graxos, incluindo ceras a partir de acil-CoA e álcoois pode ser manipulada usando polipeptideos conhecidos. Como aqui usado, ceras são ésteres de ácidos graxos de cadeias longas, caracterizadas pelo fato de que o lado A e o lado B do éster podem variar em comprimento independentemente. Geralmente, o lado A do éster é de pelo menos 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26 carbonos em comprimento. Similarmente o lado B do éster é de pelo menos 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26 carbonos em comprimento. O lado A e o lado B podem ser mono-, di-, tri- insaturados. A produção de ésteres graxos, incluindo ceras de acil-CoA e álcoois pode ser manipulada usando polipeptideos conhecidos. Um método de fazer ésteres graxos inclui aumentar a expressão de, ou expressar mais formas ativas de uma ou mais cera sintases (EC 2.3.1.75).
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36/112 [0084]
Como aqui usado, cera sintases incluem peptideos no numero de classificação de enzimas EC
2.3.1.75, assim como qualquer outro peptídeo capaz de catalisar a conversão de um acil-tioéster para ésteres graxos.
Adicionalmente, um especialista na arte irá ponderar que alguns peptideos de cera sintase irão catalisar outras reações também, por exemplo, alguns peptideos de cera sintase aceitarão acil-CoAs de cadeia curta e álcoois de cadeia curta para produzir ésteres graxos.
Tais cera sintases não específicas são, portanto, também incluídas.
Sequências peptídicas de cera sintase estão publicamente disponíveis.
Exemplos de Números de acesso do GenBank são providos na Fig. 10.
Métodos para identificar atividade de cera sintase são providos no pedido de patente U.S.
número 7.118.896, que é aqui incorporada por referência.
[0085]
Em exemplos em particular, se o produto desejado é um biocombustível baseado em éster graxo, o micro-organismo é modificado de forma a produzir um éster graxo gerado a partir de uma fonte de energia renovável.
Tal micro-organismo inclui uma sequência de DNA exógena codificando uma cera éster sintase que é expressa de forma a conferir em dito micro-organismo a habilidade de sintetizar um éster graxo saturado, insaturado, ou ramificado a partir de uma fonte de energia renovável.
Em alguns avanços, as proteínas de síntese de cera éster incluem, mas não são limitadas ácido graxo elongases, acil-CoA redutases, aciltransferases ou cera sintases, acil graxo transferases, diacilglicerol aciltransferases, acilPetição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 45/153
37/112 coA cera álcool aciltransferases, cera éster sintase /acilCoA:diacilglicerol aciltransferase bifuncional selecionada de um complexo multienzima de Simmondsia chinensis, Acinetobacter sp. linhagem ADP1 (previamente Acinetobacter calcoaceticus ADP1), Pseudomonas aeruginosa, Fundibacter jadensis, Arabidopsis thaliana, ou Alkaligenes eutrophus. Em um avanço, as elongases de ácidos graxos, acil-CoA redutases ou cera sintases são de um complexo multienzima de Alkaligenes eutrophus e outros organismos conhecidos na literatura por produzir cera e ésteres de ácidos graxos.
[0086] Fontes adicionais de DNA heterólogo codificando proteínas de síntese de cera úteis na produção de éster graxo incluem, mas não estão limitadas a, Mortierella alpina (por exemplo ATCC 32222), Crytococcus curvatus, (também referida como Apiotricum curvatum), Alcanivorax jadensis (por exemplo T9T =DSM 12718 =ATCC 700854), Acinetobacter sp. HO1-N, (por exemplo ATCC 14987) e Rhodococcus opacus (por exemplo PD630, DSMZ 44193).
[0087] Os métodos aqui descritos permitem a produção de ésteres graxos de comprimento variado. Em um exemplo, o produto éster graxo é um éster graxo saturado ou insaturado tendo um conteúdo de átomo de carbono entre 24 e 4 6 átomos de carbono. Em um avanço, o produto éster graxo possui um conteúdo de átomo de carbono entre 24 e 32 átomos de carbono. Em outro avanço, o produto éster graxo possui um conteúdo de carbono de 14 e 20 carbonos. Em outro avanço, o éster graxo é o éster de metila de C18:l. Em outro avanço, o éster de ácido graxo é o éster de etila de C16:l. Em outro avanço, o éster graxo é o éster de metil de
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C16:l. Em outro avanço, o éster de ácido graxo é éster de octadecila de octanol.
[0088] Hospedeiros úteis para produzir ésteres
graxos podem ser tanto micro-organismos eucariontes ou
procariontes. Em alguns avanços, tais hospedeiros incluem,
mas não são limitados a, Saccharomyces cerevisiae, Candida lipolytica, E. coli Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, Acinobacter sp linhagem M-l, Candida lipolytica e outros micro-organismos oleaginosos.
[0089] Em um exemplo a cera éster sintase de
Acinetobacter sp. ADP1 no lócus AAO17391 (descrita em
Kalscheuer and Steinbuchel, J. Biol. Chem. 278:8075-8082, 2003, aqui incorporada por referência) é usada. Em outro exemplo, a cera éster sintase de Simmondsia chinensis, no lócus AAD38041 é usada.
[0090] Opcionalmente, um exportador de cera éster, tal como um membro da família FATP pode ser usado para facilitar a liberação de ceras ou ésteres no ambiente extracelular. Um exemplo de um exportador de cera éster que pode ser usado é proteína de transporte de ácido graxo (cadeia longa) CG7400-PA, isoforma A de Drosophila melanogaster, no lócus NP_524723.
G. Acil-ACP, Acil-CoA para Hidrocarboneto [0091] Uma diversidade de micro-organismos é conhecida por produzir hidrocarbonetos, tal como alquenos, definas, e isoprenóides. Vários desses hidrocarbonetos são derivados de biossíntese de ácidos graxos. A produção desses hidrocarbonetos pode ser controlada controlando-se os genes associados com biossíntese de ácidos graxos nos
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39/112 hospedeiros nativos. Por exemplo, a biossíntese de hidrocarbonetos na alga Botryococcus braunii ocorre através da descarbonilação de aldeídos graxos. Os aldeídos graxos são produzidos pela redução de acil - tioésteres graxos por acil-CoA redutase graxo. Assim, a estrutura dos alcanos finais pode ser controlada por manipulação B. braunii para expressar genes específicos, tais como tioesterases, que controlam o comprimento de cadeia dos ácidos graxos sendo canalizados na biossíntese de alcanos. Expressar as enzimas que resultam na biossíntese de ácidos graxos de cadeia ramificada em B. braunii resultará na produção de alcanos de cadeias ramificadas. A introdução de genes efetuando a produção de dessaturação de ácidos graxos resultará na produção de definas. Combinações adicionais desses genes podem prover controle adicional sobre a estrutura final dos hidrocarbonetos produzidos. Para produzir níveis mais elevados dos hidrocarbonetos nativos ou manipulados, os genes envolvidos na biossíntese de ácidos graxos e seus precursores ou a degradação para outros produtos podem ser expressos, super-expressos, ou atenuados. Cada uma dessas abordagens pode ser aplicada à produção de alquenos em Vibrio furnissi Ml e seus homólogos funcionais, o que produz alquenos através da redução de álcoois graxos (ver acima para a biossíntese e manipulação da produção de álcoois graxos). Cada uma dessas abordagens pode ser também aplicada à produção das definas produzidas por várias linhagens de Micrococcus leuteus, Stenotrophomonas maltophilia, Jeogalicoccus sp. (ATCC8456), e micro-organismos relacionados. Esses micro-organismos
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40/112 produzem olefinas internas de cadeias longas que são derivadas a partir da cabeça para a condensação da cabeça de precursores de ácidos graxos. Controlar a estrutura e o nível dos precursores de ácidos graxos usando os métodos aqui descritos resultará na formação de olefinas de diferentes comprimentos de cadeia, ramificação, e nível de saturação.
[0092] Hidrocarbonetos podem ser também produzidos usando oxido/redutases desenvolvidas para a redução de álcoois primários. Álcoois graxos primários são conhecidos por serem usados para produzir alcanos em micro-organismos, tais como Vibrio furnissii Ml (Myong-Ok, J. Bacteriol., 187:1426-1429, 2005). Uma óxido/redutase dependente de NAD(P)H é o catalisador responsável. Oxidoredutases dependentes de NAD(P)H sintéticas podem ser produzidas através do uso de manipulação evolutiva e ser expressas em hospedeiros de produção para produzir derivados de ácidos graxos. Um especialista na arte irá ponderar que o processo de desenvolver um álcool graxo redutase para ter a atividade desejada é bem conhecido (Kolkman and Stemmer Nat Biotechnol. 19:423-8, 2001, Ness et al., Adv Protein Chem. 55:261-92, 2000, Minshull and Stemmer Curr Opin Chem Biol. 3:284-90, 1999, Huisman and Gray Curr Opin Biotechnol. Aug;13:352-8, 2002, e ver pedido de patente U.S. 2006/0195947). Uma biblioteca de oxidoredutases dependentes de NAD(P)H é gerada por métodos padrão, tal como PCR de error prone, mutagênese aleatória sítioespecífica, mutagênese de saturação sítio-específica, ou mutagênese direcionada sítio-específica. Adicionalmente,
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41/112 uma biblioteca pode ser criada através do embaralhamento de sequências codificadoras de oxidoredutase dependente
NAD(P)H naturalmente ocorrentes.
A biblioteca é expressa em um hospedeiro adequado, tal como E. coli.
Colônias individuais expressando um membro diferente da biblioteca de oxido/redutase é, então, analisado para sua expressão de uma oxido/redutase que pode catalisar a redução de um álcool graxo. Por exemplo, cada célula pode ser testada como uma bioconversão celular inteira, um extrato de células, uma célula impermeabilizada, ou uma enzima purificada. Álcool graxo redutases são identificadas pelo monitoramento da oxidação de NAD(P)H dependente de álcool graxo espectrofotometricamente ou fluorometricamente. A produção de alcanos é monitorada por GC/MS, TLC, ou outros métodos. Uma óxido/redutase identificada dessa maneira é usada para produzir alcanos, alquenos e hidrocarbonetos ramificados relacionados. Isto é conseguido tanto in vitro ou in vivo. 0 último é alcançado expressando o gene de álcool graxo desenvolvido em um organismo que produza álcoois graxos, tal como aqueles aqui descritos. Os álcoois graxos atuam como substratos para a álcool redutase que produziria alcanos. Outras oxidoredutases podem ser também construídas para catalisar esta reação, tais como aquelas que usam hidrogênio molecular, glutationa, FADH, ou outras coenzimas redutoras.
II. Engenharia Genética de Linhagem de Produção para
Aumentar a Produção de Derivados de Ácidos graxos [0093] Sequências de DNA heterólogas envolvidas e uma via biossintética para a produção de derivados de
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42/112 ácidos graxos podem ser introduzidas estavelmente ou transientemente em uma célula hospedeira usando técnicas bem conhecidas na arte, por exemplo, eletroporação, precipitação por fosfato de cálcio, transfecção mediada por
DEAE-dextran, transfecção mediada por lipossomo, conjugação, transdução, e similares.
Para transformação estável, uma sequência de DNA pode incluir ainda um marcador de seleção, tal como, genes de resistência a antibióticos, por exemplo, resistência a neomicina, tetraciclina, cloranfenicol, canamicina, que complementam deficiências auxotróficas, e similares.
[0094]
Vários avanços desta descrição utilizam um vetor de expressão que inclui uma sequência de
DNA heteróloga codificando uma proteína envolvida em uma via metabólica ou biossintética.
Vetores de expressão adequados incluem, mas não são limitados a, vetores virais, tais como vetores de bacilovírus, vetores fago, tais como vetores bacteriófagos, plasmídeos, fagemídeos, cosmídeos, fosmídeos, cromossomas bacterianos artificiais, vetores virais (e.g. vetores virais baseados em vírus de vacinia, poliovírus, adenovírus, vírus adeno-associado,
SV40, vírus simples de herpes, e similares), cromossomos artificiais baseados em Pl, plasmídeo de leveduras, cromossomos artificiais de leveduras, e quaisquer outros vetores específicos para hospedeiros específicos de interesse (tais como E.
coli ,
Pseudomonas pisum e
Saccharomyces cerevisiae) .
[0095]
Vetores de expressão úteis podem incluir um ou mais genes marcadores de seleção para prover um traço
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43/112 fenotipico para seleção de células hospedeiras transformadas. 0 gene marcador de seleção codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas crescidas em um meio de cultura seletivo. Células hospedeiras não transformadas com o vetor contendo o gene marcador de seleção não sobreviverão no meio de cultura.
Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas,
e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meio complexo, e.g., o gene codificando D-alanina racemase para Bacilli. Em avanços alternativos, o gene marcador de seleção é um que codifica dihidrofolato redutase ou confere resistência a neomicina (para uso em cultura de células eucariontes), ou um que confere resistência a tetraciclina ou ampicilina (para uso em uma célula hospedeira procarionte, tal como E. coli) .
[0096] A sequência de DNA codificando o produto gênico da via biossintética no vetor de expressão é operacionalmente ligada a uma sequência controle de expressão apropriada, (promotores, intensificadores, e similares) para direcionar a síntese do produto gênico codificado. Tais promotores podem ser derivados de fontes microbianas ou virais, incluindo CMV e SV40. Dependendo do sistema hospedeiro/vetor, qualquer número de elementos de controle de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzidos, elementos
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44/112 intensificadores de transcrição, terminadores de transcrição, etc. podem ser usados no vetor de expressão (ver e.g., Bitter et al., Methods in Enzymology, 153:516544, 1987).
[0097] Promotores adequados para uso em células hospedeiras procariontes incluem, mas não são limitados a, promotores capazes de reconhecer as polimerases T4, T3, Sp6 e T7, os promotores Pr e Pl de bacteriófago lambda, os promotores de trp, recA, choque térmico, e lacZ de E. coli, os promotores de alfa-amilase e sigma-especificos de B. subtilis, os promotores dos bacteriófagos de Bacillus, promotores de Streptomyces, o promotor int de bacteriófago lambda, o promotor bla do gene de beta-lactamase de pBR322, e o CAT promotor do gene de cloranfenicol acetil transferase. Promotores procariontes são revisados por
Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277, 1987; Watson et al.,
MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4th Ed., Benjamin Cummins (1987); e Sambrook et al., supra.
[0098] Exemplos não limitantes de promotores eucariontes adequados para uso em um hospedeiro eucarionte são virais em origem e incluem o promotor do gene de metalotioneina I de camundongo (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273, 1982); o promotor TK de vírus de Herpes (McKnight, Cell 31:355, 1982); o promotor inicial SV40 (Benoist et al., Nature (London) 290:304, 1981); o promotor
Rous de vírus sarcoma;
o promotor de citomegalovírus (Foecking et al., Gene 45:101, 1980); o promotor gênico gal4 de leveduras (Johnston, et al., PNAS (USA) 79:6971,
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1982; Silver, et al., PNAS (USA) 81:5951, 1984); e o promotor de IgG (Orlandi et al., PNAS (USA) 86:3833
1989).
[0099] A célula hospedeira microbiana pode ser geneticamente modificada com uma sequência de DNA heteróloga codificando um produto gênico de via biossintética que é operacionalmente ligado a um promotor induzido. Promotores induzidos são bem conhecidos na arte.
Promotores induzidos adequados incluem, mas não são limitados a, promotores que são afetados por proteínas, metabólitos, ou químicos.
Esses incluem: um promotor de vírus de leucemia bovina, um promotor de metalotioneina, um promotor de MMTV induzido por dexametasona, um promotor SV40, um promotor MRP polIII, um promotor de CMV induzido por tetraciclina (tal como o promotor de CMV humano intermediário-inicial) assim como aqueles dos operons trp e [00100] Em alguns exemplos uma célula hospedeira geneticamente modificada é geneticamente modificada com uma sequência de DNA heteróloga codificando um produto gênico de via biossintética que é operacionalmente ligado a um promotor constitutivo. Promotores constitutivos adequados são conhecidos na arte e incluem, promotor constitutivo de adenovírus principal tardio, um promotor constitutivo de MPSV, e um promotor constitutivo de CMV.
[00101] Em alguns exemplos, uma célula hospedeira
modificada é uma que é geneticamente modificada com uma
sequência de DNA exógena codificando uma única proteína
envolvida em uma via de biossíntese. Em outros avanços,
uma célula hospedeira modificada é uma que é geneticamente
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46/112 modificada com sequências de DNA exógenas codificando duas ou mais proteínas envolvidas em uma via de biossíntese -por exemplo, a primeira e a segunda enzimas em uma via biossintética.
[00102] Onde a célula hospedeira é geneticamente modificada para expressar duas ou mais proteínas envolvidas em uma via biossintética, aquelas sequências de DNA podem, cada uma, estar contidas em um único ou em vetores de expressão separados. Quando aquelas sequências de DNA estão contidas em um único vetor de expressão, em alguns avanços, as sequências de nucleotídeos serão operacionalmente ligadas a um elemento controle em comum (e.g., um promotor), e.g., o elemento controle em comum controla a expressão de todas as sequências de DNA codificando proteínas da via biossintética no único vetor de expressão.
[00103] Quando uma célula hospedeira modificada é geneticamente modificada com sequências de DNA heterólogas codificando duas ou mais proteínas envolvidas em uma via de biossíntese, uma das sequências de DNA pode ser operacionalmente ligada a um promotor induzido, e uma ou mais das sequências de DNA podem ser operacionalmente ligadas a um promotor constitutivo.
[00104] Em alguns avanços, a concentração intracelular (e.g., a concentração do intermediário na célula hospedeira geneticamente modificada) do intermediário da via biossintética pode ser aumentada para elevar ainda mais a produção do produto final. A concentração intracelular do intermediário pode ser
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47/112 aumentada de diversas maneiras, incluindo, mas não se limitando a, aumentar a concentração no meio de cultura de um substrato para uma via biossintética; aumentar a atividade catalítica de uma enzima que está ativa na via biossintética; aumentar a quantidade intracelular de um substrato (e.g., um substrato primário) para uma enzima que está ativa na via biossintética; e similares.
[00105] Em alguns exemplos o derivado de ácido graxo ou intermediário é produzido no citoplasma da célula. A concentração citoplasmática pode ser aumentada de diversas maneiras, incluindo, mas não se limitando a, ligação do ácido graxo a coenzima A para formar um acil-CoA tioéster. Adicionalmente, a concentração de acil-CoAs pode ser aumentada elevando-se a biossíntese de CoA na célula, tal como super-expressar genes associados com a biossíntese de pantotenato (panD) ou derrubar os genes associados com a biossíntese de glutationa (glutationa sintase).
III. Características de Cadeia de carbono [00106] Usando os ensinamentos aqui providos, uma gama de produtos pode ser produzida. Esses produtos incluem hidrocarbonetos, álcoois graxos, ésteres de ácidos graxos, e ceras. Alguns desses produtos são úteis como biocombustíveis e químicos de especialidade. Esses produtos podem ser projetados e produzidos em microorganismos. Os produtos podem ser produzidos de forma que contenham pontos de ramificação, níveis de saturação, e comprimento de cadeia de carbono, fazendo, assim, esses produtos desejáveis materiais iniciais para uso em várias aplicações (a Fig. 10 fornece uma descrição das várias
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48/112 enzimas que podem ser usadas sozinhas ou em combinação para fazer vários derivados de ácidos graxos).
[00107] Em outros exemplos, a expressão de genes de FAS exógenos, se originando a partir de diferentes espécies ou variantes construídos, pode ser introduzida na célula hospedeira para resultar na biossíntese de metabólitos de ácidos graxos estruturalmente diferentes (em comprimento, ramificação, grau de insaturação, etc.) como aqueles do hospedeiro nativo. Esses produtos gênicos heterólogos podem ser também escolhidos ou construídos de forma que não sejam afetados pelos complexos mecanismos reguladores naturais na célula hospedeira e, portanto, funcionar de uma maneira que é mais controlável para a produção do produto comercial desejado. Por exemplo, as enzimas FAS de Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces spp, Ralstonia, Rhodococcus, Corynebacteria, Brevibacteria,
Mycobacteria, leveduras oleaginosas, e similares podem ser expressas no hospedeiro de produção.
[00108] Um especialista na arte irá ponderar que quando um hospedeiro de produção é construído para produzir um ácido graxo a partir da via biossintética de ácido graxo que contem um nível especifico de insaturação, ramificação, ou comprimento de cadeia construído resultante pode derivados de ácidos graxos. graxos gerados a partir do de carbono, o ácido graxo ser usado na produção dos
Assim, derivados de ácidos hospedeiro de produção podem apresentar as características do ácido graxo construído.
Por exemplo, um hospedeiro de produção pode ser manipulado para fazer ácidos graxos ramificados de cadeias curtas e,
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49/112 então, usar os ensinamentos aqui providos relacionados a produção de álcoois graxos (i.e. incluindo enzimas formadoras de álcool, tais como FAR) o hospedeiro de produção produz álcoois graxos ramificados de cadeias curtas. Similarmente, um hidrocarboneto pode ser produzido manipulando um hospedeiro de produção para produzir um ácido graxo tendo um nivel definido de ramificação, insaturação, e/ou comprimento de cadeia de carbono, produzindo, assim, uma população de hidrocarbonetos homogênea. Por outro lado, quando um álcool insaturado, éster de ácido graxo, ou hidrocarboneto é biossintética de ácido graxo pode ser produzir níveis baixos de ácidos graxos dessaturase adicional pode ser expressa desejado, a via manipulada para saturados e uma para amenizar a produção de produto saturado.
A. Saturação [00109] Hospedeiros de produção podem ser construídos para produzir ácidos graxos insaturados manipulando-se o hospedeiro de produção para superexpressar fabB, ou cultivando-se o hospedeiro de produção em temperaturas baixas (por exemplo menos de 37°C). FabB possui preferência a cis-õ3decenoil-ACP e resulta na produção de ácidos graxos insaturados em E. coli. A superexpressão de FabB resultou na produção de uma porcentagem significativa de ácidos graxos insaturados (de Mendoza et al., J. Biol. Chem., 258:2098-101, 1983). Esses ácidos graxos insaturados podem ser então usados como intermediários em hospedeiros de produção que são manipulados para produzir derivados de ácidos graxos, tais
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50/112 como álcoois graxos, ésteres, ceras, olefinas, alcanos, e similares. Um especialista na arte irá ponderar que atenuando fabA, ou super-expressando FabB e expressando tioesterases específicas (descritas abaixo), derivados de ácidos graxos insaturados tendo um comprimento de cadeia de carbono desejado podem ser produzidos. Alternativamente, o repressor da biossíntese de ácidos graxos, FabR (Número de acesso do Genbank NP_418398) , pode ser deletado, o que irá resultar também na produção aumentada de ácidos graxos insaturados em E. coli (Zhang et al., J. Biol. Chem. 277:pp. 15558, 2002.). Um aumento adicional em ácidos graxos insaturados pode ser alcançado pela super-expressão de FabM (trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerase, Número de acesso do Genbank DAA05501) e expressão controlada de FabK (trans-2-enoil-ACP redutase II, Número de acesso do Genbank NP_357969) de Streptococcus pneumoniae (Marrakchi et al., J. Biol. Chem. 277: 44809, 2002), enquanto deletando E. coli Fab I ((trans-2-enoil-ACP redutase, Número de acesso do Genbank NP_415804). Adicionalmente, aumentar a porcentagem de ésteres de ácidos graxos insaturados, o micro-organismo pode ter também fabB (sintase I codificando β-cetoacil-ACP, Números de acesso: BAA16180, EC:2.3.1.41), Sfa (codificando um supressor de fabA, Número de acesso: AAC44390) e gnsA e gnsB (ambos codificando supressores de proteínas de choque de calor a.k.a., secG mutantes nulas, Número de acesso: ABD18647.1, AAC74076.1) super-expressos.
[00110] Em alguns exemplos, o gene fabF endógeno pode ser atenuado, aumentando, assim, a porcentagem de palmitoleato (C16:l) produzido.
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B. Ramificações incluindo Arranjos cíclicos [00111] Podem ser produzidos derivados de ácidos graxos que contenham pontos de ramificação, arranjos cíclicos e combinações desses, usando os ensinamentos aqui providos.
[00112] Micro-organismos que produzem naturalmente ácidos graxos (sFAs) sem ramificação podem ser manipulados para produzir ácidos graxos de cadeia ramificada (brFAs) expressando uma ou mais sequências de ácidos nucléicos exógenas. Por exemplo, E. coli produz naturalmente ácidos graxos sem ramificação (sFAs). Para manipular E. coli para produzir brFAs, diversos genes podem ser introduzidos e expressos para prover precursores ramificados (operon bkd) e permitir a iniciação da biossíntese de ácidos graxos a partir de precursores ramificados (fabH). Adicionalmente, o organismo pode expressar genes para o alongamento de brFAs (e.g. ACP, FabF) e/ou deletar os genes de E. coli correspondentes que normalmente levam a sFAs e deveríam competir com os genes introduzidos (e.g. FabH, FabF).
[00113] As acil-CoAs
2-metil-buturil-CoA, isovaleril-CoA e isobuturil-CoA ramificadas são os precursores de brFA.
Na maioria dos micro-organismos contendo brFA, elas são sintetizadas em duas etapas (descritas em detalhe abaixo) a partir de aminoácidos ramificados (isoleucina, leucina valina) (Kadena,
Microbiol.
Rev. 55: pp. 288, 1991)
Para manipular um micro-organismo para produzir brFAs, ou para super-produzir brFAs, a expressão ou super-expressão de uma ou mais das enzimas nessas duas etapas pode ser manipulada.
Por
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52/112 exemplo, pode ter em algumas instâncias, o hospedeiro de produção uma enzima endógena que pode realizar uma etapa e, portanto, apenas as enzimas envolvidas na segunda etapa necessitam ser expressas de forma recombinante.
[00114] A primeira etapa na formação de ácidos graxos ramificados produção dos a-ceto ácidos correspondentes por uma aminotransferase de aminoácido de cadeia ramificada.
E.
coli possui tal enzima, IlvE (EC
2.6.1.42; Número de acesso do Genbank
YP 026247).
Em alguns exemplos, uma aminotransferase de aminoácido de cadeia ramificada heteróloga pode ser expressa. Contudo,
E. coli IlvE ou qualquer outra aminotransferase de aminoácido de cadeia ramificada, e.g.
ilvE de Lactococcus lactis (Número de acesso do Genbank
AAF34406) , ilvE de
Pseudomonas putida (Número de acesso do Genbank NP_745648) ou ilvE de Streptomyces coelicolor (Número de acesso do Genbank NP_629657) pode ser super-expressa em um microorganismo hospedeiro, se a reação da aminotransferase se tornar limitante para a taxa de biossintese brFA no organismo hospedeiro escolhido para produção de derivado de ácido graxo.
[00115] A segunda etapa, a descarboxilação oxidativa dos α-cetoácidos, para a acil-CoA de cadeia ramificada correspondente, é catalisada por complexos de α-ceto ácido de cadeia ramificada desidrogenase (bkd; EC 1.2.4.4.) (Denoya et
J. Bacteriol.
177:pp. 3504, 1995), o que consiste de subunidades
Ela/β(descarboxilase), E2 (dihidrolipoil transacilase) e E3 (dihidrolipoil desidrogenase) são similares a piruvato e complexos aPetição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 61/153
53/112 cetoglutarato desidrogenase. A Tabela 2 mostra genes bkd em potencial de diversos micro-organismos, que podem ser expressos em um hospedeiro de produção para prover precursores de acil-CoA de cadeia ramificada. Basicamente, cada micro-organismo que possui brFAs e/ou cresce em aminoácidos de cadeia ramificada pode ser usado como fonte para isolar genes bkd para expressão em hospedeiros de produção tais como, por exemplo, E. coli. Adicionalmente, E. coli possui o componente E3 (como parte de seu complexo piruvato desidrogenase; lpd, EC 1.8.1.4, Número de acesso do Genbank NP_414658), e pode, portanto, ser suficiente para expressar apenas os genes de Ela/β e E2 bkd.
Tabela 2
Genes Bkd de micro-organismos selecionados
Organismo Gene Número de Acesso no Genbank #
Streptomyces bkdAl (Ela) NP 628006
coelicolor bkdBl (Εΐβ) NP 628005
bkdCl (E2) NP 638004
Streptomyces bkcLA2 (Ela) NP_733618
coelicolor bkdB2 (Εΐβ) NP 628019
bkdC2 (E2) NP 628018
Streptomyces bkdA (Ela) BAC72074
avermitilis bkdB (Elb) BAC72075
bkdC (E2) BAC72076
Streptomyces bkdF (Ela) BAC72088
avermitilis bkdG (Εΐβ) BAC72089
bkdH (E2) BAC72090
Bacillus subtilis bkdAA (Ela) NP 390288
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bkdAB (Εΐβ) NP 390288
bkdB (E2) NP 390288
Pseudomonas putida bkdAl (Ela) AAA65614
bkdA2 (Εΐβ) AAA65615
bkdC (E2) AAA65617
[00116] Em outro exemplo, isobuturil-CoA pode ser feito em um hospedeiro de produção, por exemplo, em E. coli, através da co-expressão de uma crotonil-CoA redutase (Ccr, EC 1.1.1.9) e isobuturil-CoA mutase (IcmA de subunidade grande, EC 5.4.99.2; IcmB de subunidade pequena, EC 5.4.99.13) (Han and Reynolds J. Bacteriol. 179:pp. 5157, 1997) . Crotonil-CoA é um intermediário na biossintese de ácidos graxos em E. coli e outros micro-organismos. Exemplos para genes ccr e icm de micro-organismos selecionados são dados na Tabela 3.
Tabela 3
Genes Ccr e icm de micro-organismos selecionados
Organismo Gene Número de Genbank # Acesso no
Streptomyces ccr NP 630556
coelicolor icmA NP 629554
icmB NP 630904
Streptomyces ccr AAD53915
cinnamonensis icmA AAC08713
icmB AJ246005
[00117] Além de expressão dos genes bkd (ver acima), a iniciação da biossintese de brFA utiliza sintase III de proteína carregadora de β-cetoacil-acil (FabH, EC 2.3.1.41) com especificidade para acilCoAs de cadeia ramificada (Li
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55/112 et al. J. Bacteriol. 187:pp. 3795, 2005). Exemplos de tais FabHs estão listados na Tabela 4. Genes FabH que estão envolvidos na biossintese de ácidos graxos de qualquer micro-organismo contendo brFA podem ser expressos em um hospedeiro de produção. As enzimas Bkd e FabH de hospedeiros de produção que não fazem brFA naturalmente podem não suportar a produção de brFA e, portanto, Bkd e FabH podem ser expressos de forma recombinante. Similarmente, o nível endógeno da produção de Bkd e FabH pode não ser suficiente para produzir brFA, portanto, elas podem ser super-expressas. Adicionalmente, outros componentes do maquinário de biossintese de ácidos graxos podem ser expressos, tais como proteínas carregadoras de acil (ACPs) e candidatas sintase II de proteína carregadora de β-cetoacil-acil são proteínas carregadoras de acil (ACPs) e sintase II de proteína carregadora de β-cetoacilacil (fabF, EC 2.3.1.41) (candidatos estão listados na Tabela 4) . Além de expressar esses genes, alguns genes na via de biossintese de ácidos graxos endógenos podem ser atenuados no hospedeiro de produção. Por exemplo, em E. coli, os candidatos mais prováveis de interferirem com a biossintese de brFA são os genes fabH (Número de acesso do Genbank # NP_415609) e/ou fabF (Número de acesso do Genbank # NP_415613) .
[00118] Como mencionado acima, através da combinação de genes de expressão que suportam a síntese de brFA e síntese de álcool, álcoois de cadeia ramificada podem ser produzidos. Por exemplo, quando uma álcool redutase, tal como Acrl de Acinetobacter baylyi ADP1 é co-expressa com um
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56/112 operon de bkd, E. coli pode sintetizar isopentanol, isobutanol ou 2-metil butanol. Similarmente, quando Acrl é co-expresso com os genes ccr/icm, E. coli pode sintetizar isobutanol.
[00119] Para converter um hospedeiro de produção, tal como E. coli, em um organismo capaz de sintetizar ácidos graxos ω-ciclicos (cyFAs), diversos genes que provêm o precursor ciclico ciclohexilcarbonil-CoA precisam ser introduzidos e expressos (Cropp et al. Nature Biotech. 18:pp. 980, 2000). Os genes listados na Tabela 4 {fabH, ACP e fabF) podem ser, então, expressos para permitir a iniciação e alongamento de ácidos graxos ω-ciclicos. Alternativamente, os genes podem homólogos podem ser isolados a partir de micro-organismos que fazem cyFAs e expressaram em E. coli.
Tabela 4
Genes FabH, ACP e fabF de micro-organismos selecionados com brFAs
Organismo Gene Número de Acesso no Genbank #
Streptomyces fabHl NP 626634
coelicolor ACP NP 626635
FabF NP 626636
Streptomyces fabH3 NP_823466
avermitilis fabC3 (ACP) NP_823467
fabF NP 823468
Bacillus subtilis fabH A NP_389015
fabH B NP 388898
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ACP NP 389474
FabF NP 389016
Stenotrophomonas SmalDRAFT 0818 (FabH) ZP_01643059
maltophilia SmalDRAFT 0821 (ACP) ZP_01643063
SmalDRAFT 0822 (FabF) ZP 01643064
Legionella FabH YP_123672
pneumophila ACP YP_123675
FabF YP 123676
[00120] A expressão dos seguintes genes é suficiente para prover ciclohexilcarbonil-CoA em E. coli: ansJ, ansK, ansL, chcA e ansM a partir do agrupamento gênico de ansatrienina de Streptomyces collinus (Chen et al., Eur. J. Biochem. 261:pp. 1999, 1999) ou plmJ, plmK, plmL, chcA e plmM do agrupamento gênico B de foslactomicina de Streptomyces sp. HK803 (Palaniappan et al. , J. Biol. Chem. 278:pp. 35552, 2003) junto com o gene chcB (Patton et al. Biochem., 39:pp. 7595, 2000) de S. collinus, S. avermitilis ou S. coelicolor (ver Tabela 5 para os números de acesso no Genbank).
Tabela 5
Genes para a síntese de ciclohexilcarbonil-CoA
Organismo Gene Número de Acesso
no Genbank #
Streptomyces ansJK U72144*
collinus ansL
chcA
ansL
ch cB AF268489
Streptomyces sp. pmlJK AAQ84158
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HK803 pmlL chcA pmlM AAQ84159 AAQ84160 AAQ84161
Streptomyces coelicolor chcB/caiD NP 629292
Streptomyces avermitilis chcB/caiD NP 629292
Apenas chcA é anotado com a entrada no Genbank U72144. ansJKLM estão de acordo com Chen et al.
(Eur. J. Biochem. 261:pp. 1999, 1999) [00121] Os genes listados na Tabela 4 (fabH, ACP e fabF) são suficientes para permitir a iniciação e alongamento de ácidos graxos ω-ciclicos, pois eles podem ter uma ampla especificidade de substrato. No caso da coexpressão de qualquer desses genes com os genes ansJKLM/chcAB ou pmlJKLM/chcAB da Tabela 5 não produzir cyFAs, fabH, ACP e/ou fabF, homólogos de micro-organismos que fazem cyFAs podem ser isolados (e.g. usando primers de PCR degenerados ou sondas de DNA heterólogo) e coexpressos. A Tabela 6 lista micro-organismos selecionados que contém ácidos graxos ω-ciclicos.
Tabela 6
Exemplos de micro-organismos que contêm ácidos graxos ω-ciclicos
Organismo Referência
Curtobacterium pusillum ATCC19096
Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC49025
Alicyclobacillus ATCC27009
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acidocaldarius
Alicyclobacillus cycloheptanicum* Moore, J. Org. Chem. 62:pp. 2173, 1997.
*usa cicloheptilcarbonil-CoA e não ciclohexilcarbonil-CoA como precursor para a biossíntese de cyFA
C. Características de Éster [00122] Um especialista na arte irá ponderar que um éster inclui um lado A e um lado B. Como aqui descrito, o lado B é contribuído por um ácido graxo produzido a partir de síntese de novo no organismo hospedeiro. Em algumas instâncias onde o hospedeiro é adicionalmente manipulado para fazer álcoois, incluindo álcoois graxos, o lado A é também produzido pelo organismo hospedeiro. Ainda em outros exemplos o lado A pode ser provido no meio. Como aqui descrito, selecionando-se os genes de tioesterase desejados o lado B, e quando álcoois graxos estão sendo feitos o lado A, pode ser projetado para ter certas características de cadeia de carbono. Essas características incluem pontos de insaturação, ramificação, e comprimentos desejados de cadeia de carbono. Exemplos de métodos de fazer ésteres de ácidos graxos de cadeia longa, caracterizados pelo fato de que o lado A e o lado B são produzidos pelo hospedeiro de produção são providos no Exemplo 6, abaixo. Similarmente, o Exemplo 5 provê métodos de fazer ésteres de ácidos graxos de cadeia média. Quando tanto o lado A e o lado B são contribuídos pelo hospedeiro de produção e são produzidos usando intermediários da via biossintética de ácido graxo, eles terão características similares de cadeia de carbono. Por exemplo, pelo menos
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50%, 60%, 70%, ou 80% dos ésteres de ácidos graxos produzidos terão lados A e lados B que variam em 6, 4, ou 2 carbonos em comprimento. 0 lado A e o lado B também apresentarão ramificação e níveis de saturação similares.
[00123] Além de produzir álcoois graxos para contribuição para o lado A, o hospedeiro pode produzir outros álcoois de cadeia curta, tais como etanol, propanol, isopropanol, isobutanol, e butanol para incorporação no lado A usando técnicas bem conhecidas na arte. Por exemplo, butanol pode ser feito pelo organismo hospedeiro. Para criar células produtoras de butanol, a linhagem LS9001 (descrita no Exemplo 1, abaixo) pode ser adicionalmente manipulada para expressar atoB (acetil-CoA acetiltransferase) de Escherichia coli
K12, □hídroxibutiríl-CoA desidrogenase de
Butyrivibrio fibrisolvens, crotonase de Clostridium beijerinckii, butiril
CoA desidrogenase de Clostridium beijerinckii, aldeído fulvum, desidrogenase CoA-aciladora (ALDH) de Cladosporium e adhE codificando uma álcool aldeído desidrogenase de Clostridium acetobutilicum no vetor de expressão pBAD24 sob o sistema promotor prpBCDE. Similarmente, etanol pode ser produzido em um hospedeiro de produção usando os métodos ensinados por Kalscheuer et al., Microbiology
152:2529-2536, 2006, os quais são aqui incorporados por referência.
IV. Fermentação [00124] A produção e o isolamento de derivados de ácidos graxos podem ser intensificados empregando técnicas de fermentação específicas. Um método para maximizar a
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61/112 produção enquanto reduzindo custos é aumentar a porcentagem da fonte de carbono que é convertida para produtos hidrocarbonetos. Durante os ciclos de vida celulares normais, carbono é usado em funções celulares incluindo produzir lipídeos, sacarideos, proteínas, ácidos orgânicos, e ácidos nucléicos. Reduzir a quantidade de carbono necessário para atividades relacionadas com crescimento pode aumentar a eficiência de conversão da fonte de carbono para produto final. Isso pode ser alcançado primeiro cultivando-se micro-organismos em uma densidade desejada, tal como uma densidade alcançada no pico da fase log de crescimento. Em tal ponto, os genes de replicação podem ser capturados para parar o crescimento das células. Especificamente, mecanismos sensíveis a quórum (revisto em Camilli and Bassler Science 311:1113, 2006; Venturi FEMS Microbio Rev 30:274-291, 2006; e Reading and Sperandio FEMS Microbiol Lett 254:1-11, 2006) podem ser usados para ativar genes tais como p53, p21, ou outros genes checkpoint. Genes que podem ser ativados para interromper a replicação e crescimento celular em E. coli incluem genes umuDC, a super-expressão dos quais interrompe o progresso a partir da fase estacionária para o crescimento exponencial (Murli et al., J. of Bact. 182:1127, 2000). UmuC é uma DNA polimerase que pode conduzir a síntese translesão em lesões não codificadoras - a base mecanicista da maioria das mutagênese de UV e químicas. Os produtos gênicos de umuDC são usados para o processo de síntese translesão e também servem como um ponto de checagem de dano de DNA. Produtos gênicos de UmuDC incluem UmuC, UmuD, umuD' , UmuD^C, UmuD'2
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62/112 e UmuD2. Simultaneamente, os genes produzindo produto seria ativados, minimizando, assim, a necessidade para que vias de replicação e manutenção fosse usadas enquanto o derivado de ácido graxo está sendo feito.
[00125] A porcentagem de carbonos inseridos convertidos para produtos hidrocarbonetos é um medidor de custos. Quanto mais eficiente (i.e. quanto maior for a porcentagem), menos custoso é o processo. Para fontes de carbonos contendo oxigênio (i.e. glicose e outras fontes baseadas em carboidratos), o oxigênio deve ser liberado na forma de dióxido de carbono. Para cada 2 átomos de oxigênio liberados, um átomo de carbono é também liberado levando a uma máxima eficiência metabólica teórica de ~34% (p/p) (para produtos derivados de ácidos graxos). Essa Figura, contudo, muda para outros produtos hidrocarbonetos e fontes de carbonos. Eficiências típicas na literatura são ~<5%. Micro-organísmos manipulados que produzem produtos hidrocarbonetos podem ter eficiência maior do que 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25, e 30%. Em um exemplo, microorganismos exibirão uma eficiência de cerca de 10% a cerca de 25%. Em outros exemplos, tais micro-organismos exibirão uma eficiência de cerca de 25% a cerca de 30%, e em outros exemplos, tais micro-organismos exibirão eficiência de >30%.
[00126] Em alguns exemplos, onde o produto final é liberado a partir da célula, um processo contínuo pode ser empregado. Nesta abordagem, um reator com organismos produzindo derivados de ácidos graxos pode ser combinado de múltiplas maneiras. Em um exemplo, uma porção do meio é
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63/112 removida e deixada descansando. Derivados de ácidos graxos são separados da camada aquosa, os quais serão, por sua vez, retornados à câmara de fermentação.
[00127] Em um exemplo, a câmara de fermentação incluirá uma fermentação que está passando por redução contínua. Neste exemplo, um ambiente redutor estável seria criado. O equilíbrio de elétrons seria mantido pela liberação de dióxido de carbono (na forma gasosa). Esforços para aumentar o equilíbrio de NAD/H e NADP/H pode também facilitar na estabilização do equilíbrio de elétrons.
[00128] A disponibilidade de NADPH intracelular pode ser também intensificada manipulando o hospedeiro de produção para expressar uma NADH:NADPH transidrogenase. A expressão de uma ou mais NADH:NADPH transidrogenases converte o NADH produzido na glicólise para NADPH que intensifica a produção de derivados de ácidos graxos.
[00129] Aqui descrito está um sistema para produzir continuamente e exportar derivados de ácidos graxos para fora de micro-organismos hospedeiros recombinantes via uma proteína de transporte. Várias proteínas de transporte e de efluxo servem para excretar uma ampla variedade de compostos e podem ser desenvolvidas para serem seletivas para um tipo de derivado de ácido graxo em particular. Assim, em alguns avanços uma sequência de DNA exógena codificando um transportador ABC será funcionalmente expressa pelo micro-organismo hospedeiro recombinante, de forma que o micro-organismo exporte o derivado de ácido graxo para o meio de cultura. Em um exemplo, o
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64/112 transportador ABC é um transportador ABC de Caenorhabd.itis elegans, Arabidopsis thalania, Alkaligenes eutrophus ou Rhodococcus erythropolis (lócus AAN73268). Em outro exemplo, o transportador ABC é um transportador ABC escolhido de CER5 (loci AtlgõlõOO ou AY734542), AtMRPõ, AmiS2 e AtPGPl. Em alguns exemplos, o transportador ABC é CER5. Ainda em outro exemplo, o gene CER5 é de Arabidopsis (loci AtlgõlõOO, AY734542, At3g21090 e Atlg51460).
[00130] A proteína de transporte, por exemplo, pode ser também uma proteína de efluxo selecionada de: AcrAB, TolC e AcrEF de E. coli, ou tlll618, tlll619 e tll0139 de Thermosynechococcus elongatus BP-1.
[00131] Além disso, a proteína de transporte pode ser, por exemplo, uma proteína de transporte de ácido graxo (FATP) selecionada de Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mycobacterium tuberculosis ou Saccharomyces cerevisiae ou qualquer uma das FATP's de mamíferos. As FATPs podem adicionalmente ser ressintetizadas com as regiões membranosas invertidas para inverter a direção do fluxo de substrato. Especificamente, as sequências de aminoácidos compondo os domínios hidrofílicos (ou domínios de membrana) da proteína, poderíam ser invertidas enquanto mantendo os mesmos códons para cada aminoácido em particular. A identificação dessas regiões é bem conhecida na arte.
[00132] Hospedeiros de produção podem ser também escolhidos por sua habilidade endógena para liberar derivados de ácidos graxos. A eficiência de produção de produto e liberação no caldo de fermentação pode ser
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65/112 expressa como uma razão de produto intracelular para produto extracelular. Em alguns exemplos a razão pode ser 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, ou 1:5.
[00133] O hospedeiro de produção pode ser adicionalmente manipulado para expressar celulossomas recombinantes, tais como aqueles descritos no pedido PCT número PCT/US2007/003736, que permitirão ao hospedeiro de produção usar material celulósico como fonte de carbono. Por exemplo, o hospedeiro de produção pode ser adicionalmente manipulado para expressar invertases (EC 3.2.1.26) de forma que sacarose possa ser usada como fonte de carbono.
[00134] Similarmente, o hospedeiro de produção pode ser manipulado usando os ensinamentos descritos nos pedidos de patente U.S. números 5.000.000, 5.028.539, 5.424.202, 5.482.846, e 5.602.030 para Ingram et al. de forma que o hospedeiro de produção possa assimilar carbono eficientemente e usar materiais celulósicos como fontes de carbonos.
IV. Processamento pós-produção [00135] Os derivados de ácidos graxos produzidos durante a fermentação podem ser separados do meio de fermentação. Qualquer técnica conhecida para separar derivados de ácidos graxos de meio aquoso pode ser usada. Um processo de separação exemplar aqui provido é um processo de separação de duas fases (bifásico). Este processo envolve fermentar os hospedeiros de produção geneticamente construídos sob condições suficientes para produzir um derivado de ácido graxo, permitindo ao derivado
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66/112 coletar em uma fase orgânica e separar a fase orgânica do caldo de fermentação aquoso. Este método pode ser praticado tanto em grupo e fermentação contínua.
[00136] A separação bifásica usa a imiscibilidade relativa de derivados de ácidos graxos para facilitar a separação. Imiscível refere-se à inabilidade relativa de um composto se dissolver em água e é definido pelo coeficiente de partição dos compostos. O coeficiente de partição, P, é definido como a concentração de equilíbrio de composto em uma fase orgânica (em um sistema bifásico, a fase orgânica é usualmente a fase formada pelo derivado de ácido graxo durante o processo de produção, contudo, em alguns exemplos uma fase orgânica pode ser provida (tal como uma camada de octano para facilitar a separação de produto) divida pela concentração em equilíbrio em uma fase aquosa (i.e. caldo de fermentação). Quando descrevendo um sistema de duas fases, o P é usualmente discutido em termos de logP. Um composto com um logP de 10 particionaria a 10:1 para a fase orgânica, enquanto um composto de logP de 0,1 particionaria a 10:1 para a fase aquosa. Um especialista na arte irá ponderar que escolhendo um caldo de fermentação e a fase orgânica de forma que o derivado de ácido graxo sendo produzido possui um alto valor de logP, o derivado de ácido graxo irá separar na fase orgânica, mesmo em concentrações muito baixas na veia de fermentação.
[00137] Os derivados de ácidos graxos produzidos pelos métodos aqui descritos serão relativamente imiscíveis no caldo de fermentação, assim como no citoplasma.
Portanto, o derivado de ácido graxo irá coletar em uma fase
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67/112 orgânica tanto intracelularmente ou extracelularmente. A coleta dos produtos em uma fase orgânica irá amenizar o impacto do derivado de ácido graxo na função celular e permitirá que o hospedeiro de produção produza mais produto. Dito de outro jeito, a concentração do derivado de ácido graxo não terá um impacto tão significativo na célula hospedeira.
[00138] Os álcoois graxos, ésteres de ácidos graxos, ceras, e hidrocarbonetos produzidos, como aqui descritos, permitem a produção de compostos homogêneos, caracterizados pelo fato de que pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% dos álcoois graxos, ésteres de ácidos graxos, e ceras produzidos terão comprimentos de cadeia de carbono que variam em menos de 4 carbonos, ou menos de 2 carbonos.
Esses compostos podem ser também produzidos de forma que possuam um grau de saturação relativamente uniforme, por exemplo, pelo menos
60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% dos álcoois graxos, ésteres de ácidos graxos, hidrocarbonetos e ceras serão mono-, di-, ou triinsaturados.
Esses compostos podem ser usados diretamente como combustíveis, aditivos de cuidado pessoal, suplementos nutricionais. Esses compostos podem também usados como matéria-prima para reações subsequentes, por exemplo, transesterificação, hidrogenação, quebra catalítica tanto via hidrogenação, pirólise, ou ambas ou reações de epoxidação para fazer outros produtos.
V. Composições Combustíveis [00139] Os derivados de ácidos graxos aqui descritos podem ser usados como combustível. Um especialista na arte
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68/112 irá ponderar que dependendo do propósito pretendido do combustível, diferentes derivados de ácidos graxos podem ser produzidos e usados. Por exemplo, para combustível de automóveis que deve ser usado em climas frios, um derivado de ácido graxo ramificado pode ser desejável e usando os ensinamentos aqui providos, hidrocarbonetos ramificados, ésteres de ácidos graxos, e álcoois podem ser feitos. Usando os métodos aqui descritos, combustíveis compreendendo derivados de ácidos graxos relativamente homogêneos que possuem qualidades combustíveis desejadas podem ser produzidos. Tais combustíveis podem ser caracterizados por impressão digital de carbono, sua falta de impurezas quando comparados aos combustíveis derivados de petróleo ou biodiesel derivado de triglicerídeos e, além do mais, os combustíveis baseados em derivados de ácidos graxos podem ser combinados com outros combustíveis ou aditivos combustíveis para produzir combustíveis tendo propriedades desejadas.
A. Impressão digital de Carbono [00140] Derivados de ácidos graxos biologicamente produzidos representam uma nova matéria-prima para combustíveis, tais como álcoois, diesel e gasolina. Alguns biocombustíveis feitos usando derivados de ácidos graxos não foram produzidos a partir de fontes renováveis e, sendo assim, são novas composições de matéria. Esses novos combustíveis podem ser distinguidos de combustíveis derivados de carbono petroquímico com base em fingerprinting dual de isótopos de carbono.
Adicionalmente, a fonte específica de carbono de fonte
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69/112 biológica (e.g. glicose vs. glicerol) pode ser determinada por fingerprinting dual de isótopos de carbono (ver, Patente US número 7.169.588, que é aqui incorporada por referência).
[00141] Este método útil distingue materiais quimicamente idênticos, e divide proporcionalmente carbono em produtos por fonte (e possivelmente ano) de crescimento
do componente biosférico (planta). Os isótopos, 14C e 13C,
trazem informações complementares para este problema. 0
isótopo de datação de radiocarbono (14C) , com sua meia-vida
nuclear de 5730 anos, claramente permite dividir
proporcionalmente o espécime de carbono entre fóssil (morto ) e biosfenco (vivo ) matérias-primas [Currie, L.
A. Source Apportionment of Atmospheric Particles,
Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and
Η. P. van Leeuwen, Eds., Environmental Analytical Publishers, Inc) (1992) 3 datação de radiocarbonos é c de 14C na atmosfera leva à of Vol. I of the IUPAC Chemistry Series (Lewis
74]. A suposição básica na : a constância de concentração nstância de 14C em organismos vivos. Quando lidando com uma amostra isolada, a idade de uma amostra pode ser deduzida aproximadamente pela relação t=(-5730/0,693)ln(A/A.sub.O) (Equação 5) onde t=idade, 5730
anos é a meia-vida de radiocarbono, e A e A.sub.O são a
atividade específica de 14C da amostra e do padrão moderno,
respectivamente [Hsieh, Υ-Λ Soil Sei. Soc. Am J., 56, 460,
(1992)]. Contudo, por causa de testes nucleares
atmosféricos desde 1950 e da queima de combustíveis fósseis desde 1850, 14C adquiriu uma segunda característica de tempo
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70/112 geoquímica. Sua concentração em C02 atmosférico - e dessa forma na biosfera viva --aproximadamente duplicou no pico de testes nucleares, em meados dos anos de 1960. Ele foi, desde então, gradualmente retornando à razão de isótopos (14C /12C) de linha de base de estado inicial cosmogênico (atmosférico) de cerca de l,2xl012, com um relaxamento aproximado de meia-vida de 7-10 anos. (Esta última meiavida não deve ser tomada literalmente; ao invés, deve-se usar a função de entrada/decaimento atmosférica nuclear detalhada para rastrear a variação de 14C atmosférico e biosférico desde o início da era nuclear.) É esta última característica de tempo de 14C biosférico que carrega a promessa de datação anual de carbono biosférico recente. 14C pode ser medido por espectrometria de massa por acelerador (AMS), com resultados dados em unidades de fração de carbono moderno (ím) . ím é definida pelo National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference
Materiais (SRMs) 4990B e 4990C, conhecido como padrões de ácidos oxálicos HOxI e HOxII, respectivamente. A definição fundamental está relacionada a 0,95 vezes a razão de isótopos 14C /12C HOxI (referenciado para AD
1950). Isto é grossamente equivalente à madeira antes da revolução industrial de decaimento corrigido.
Para a biosfera viva atual (material vegetal) , ím aprox. 1,1.
[00142]
A razão de isótopos estáveis de carbono (13C /12C) provê uma rota complementar para discriminação e partilha. A razão 13C /12C em um dado material de origem biológica é uma consequência da razão 13C /12C no dióxido de carbono atmosférico no tempo em que o dióxido de carbono é
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71/112 fixado e também reflete a via metabólica precisa. Variações regionais também ocorrem. Petróleo, plantas C3 (as plantas de folhas largas), plantas C.sub.4 (as gramineas), e carbonatos marinhos, todos apresentam diferenças significativas em 13C /12C e os valores delta13C correspondentes. Adicionalmente, matéria de lipideos de plantas C3 e C4 são analisadas de forma diferente do que materiais derivados dos componentes carboidratos das mesmas plantas como consequência da via metabólica. Na precisão de medida, 13C apresenta grandes variações devido a efeitos de fracionamento isotópico, o mais significativo dos quais para a presente invenção é o mecanismo fotossintético. A principal causa de diferenças na razão de isótopos de carbono em plantas é proximamente associada com diferenças na via do metabolismo de carbono fotossintético nas plantas, particularmente a reação ocorrendo durante a carboxilação primária, i.e., a fixação inicial de CO2 atmosférico. Duas classes grandes de vegetação são aquelas que incorporam o ciclo fotossintético C3 (ou CalvinBenson) e aquelas que incorporam o ciclo fotossintético C4 (ou Hatch-Slack) . Plantas C3, tais como madeiras-de-lei e coníferas, são dominantes nas zonas de clima temperado. Em plantas C3, a fixação de CO2 primário ou reação de carboxilação envolve a enzima ríbulose-1,5disfosfato carboxilase e o primeiro produto estável é um composto de 3 carbonos. Plantas C4, por outro lado, incluem plantas como gramineas tropicais, milho e cana-de-açúcar. Em plantas C4, uma reação de carboxilação adicional envolvendo outra enzima, fosfoenol-piruvato carboxilase, é
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a reação de carboxilação primária. 0 primeiro composto de
carbono estável é um ácido de 4 carbonos que é
subsequentemente descarboxilado. 0 CO2 assim liberado é
refixado pelo ciclo C3.
[00143] Tanto plantas C4 e C3 exibem uma variação de
razões isotópicas 13C /12C, mas valores típicos são ca. -10 a -14 por mil (C4) e -21 a -26 por mil (C3) [Weber et al., J. Agric. Food Chem., 45, 2942 (1997)]. Carvão e petróleo geralmente caem nesta última variação. A escala de medição de 13C foi originalmente definida por uma definição zero por calcário belemnita (PDB), onde valores são dados em partes por mil desvios deste material. Os valores de A13C são em partes por mil (por mil) , % abreviado, e são calculados como a seguir:
Ó13C = (13c/12 - <13 c/12 x 100% (Equation 6) [00144] Como o material de referência (RM) de PDB foi exaurido, uma serie de RMs alternativos foram desenvolvidos em cooperação com IAEA, USGS, NIST, e outros laboratórios de isótopos internacionais. Notações para os desvios por mil de PDB são A13C. Medições são feitas em CO2 por espectrometria de massa de abundância isotópica de alta precisão (IRMS) em ions moleculares de massas 44, 45 e 46.
[00145] Os derivados de ácidos graxos e os biocombustiveis associados, químicos, e misturas podem ser completamente distinguidas de suas cópias derivadas de petroquímicos na base de 14C (fM) e dual fingerprinting de
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73/112 isótopos de carbono, indicando novas composições de matéria.
[00146] Os derivados de ácidos graxos aqui descritos possuem utilidade na produção de biocombustiveis e químicos. As novas composições baseadas em derivados de ácidos graxos providas pela presente invenção podem ser adicionalmente distinguidas com base em dual fingerprinting de isótopos de carbono a partir daqueles materiais derivados apenas de fontes petroquímicas. A habilidade de distinguir esses produtos é benéfica no rastreamento desses materiais no comércio. Por exemplo, combustíveis ou químicos compreendendo tanto perfis de isótopos de carbono novos e antigos podem ser distinguidos de combustíveis e químicos feitos apenas de materiais antigos. Assim, os presentes materiais podem ser seguidos no comércio com base em seu perfil único e para os propósitos de definir competição, e para determinar a validade.
[00147] Em alguns exemplos, é feita uma composição biocombustível que inclui um derivado de ácido graxo tendo õ13C de a partir de cerca de -10,9 a cerca de -15,4, em que o derivado de ácido graxo é responsável por pelo menos cerca de 85% de material de fonte biológica (derivado de um recurso renovável, tal como materiais celulósicos e açúcares) na composição. Em outros exemplos, a composição biocombustível inclui um derivado de ácido graxo tendo a fórmula
X---(CH(R))nCH3 em que X representa CH3, -CH2OR1; -C(O)OR2; ou C (O)NR3R4;
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R é, para cada n, independentemente ausente, H ou alifático inferior;
n é um número inteiro de 8 a 34, tal como de 10 a 24; e
R1, R2, R3 e R4 independentemente são selecionados de H e alquil inferior. Tipicamente, quando R é um alifático inferior, R representa um alquil inferior ramificado, não ramificado ou cíclico ou arranjo de alquenil inferior. Exemplos de grupamentos R incluem, sem limitação, metil, isopropil, isobutil, sec-butil, ciclopentenil e similares. O derivado de ácido graxo é adicionalmente caracterizado como tendo um õ13C de cerca de -10,9 a cerca de -15,4; e o derivado de ácido graxo é responsável por pelo menos cerca de 85% de material de fonte biológica na composição. Em alguns exemplos o derivado de ácido graxo na composição biocombustível é caracterizado por ter uma fração de carbono moderno (ím 14C) de pelo menos cerca de 1,003,
1,010, ou 1,5.
B. Derivados de ácidos graxos [00148] O número de centano (CN), viscosidade, ponto de derretimento, e calor de combustão para vários ésteres de ácidos graxos foram caracterizados em, por exemplo,
Knothe, Fuel Processing Technology 86:1059-1070, 2005, que é aqui incorporada por referência. Usando os ensinamentos aqui providos, um hospedeiro de produção pode ser manipulado para produzir qualquer um dos ésteres de ácidos graxos descritos em Knothe, Fuel Processing Technology
86:1059-1070, 2005.
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75/112 [00149] Álcoois (de cadeia curta, cadeia longa, ramificados ou insaturados) podem ser produzidos pelos hospedeiros de produção aqui descritos. Tais álcoois podem ser usados como combustíveis diretamente ou podem ser usados para criar um éster, i.e. o lado A de um éster como descrito acima. Tal éster sozinho ou em combinação com os outros derivados de ácidos graxos aqui descritos são úteis como combustíveis.
[00150] Similarmente, hidrocarbonetos produzidos a partir dos micro-organismos aqui descritos podem ser usados como biocombustíveis. Tais combustíveis baseados em hidrocarbonetos podem ser projetados para conter pontos de ramificação, graus definidos de saturação, e comprimentos de cadeia de carbono específicos.
Quando usados como biocombustíveis sozinhos ou em combinação com outros derivados de ácidos graxos, os hidrocarbonetos podem ser adicionalmente combinados com aditivos outros combustíveis tradicionais (álcoois, diesel derivado de triglicerídeos, e combustíveis baseados em petróleo).
C. Impurezas [00151] Os derivados de ácidos graxos aqui descritos são úteis para fazer biocombustíveis. Esses derivados de ácidos graxos são feitos diretamente a partir de ácidos graxos e não do processamento químico de triglicerídeos. Consequentemente, combustíveis compreendendo os derivados de ácidos graxos descritos conterão menos das impurezas que são normalmente associadas com biocombustíveis derivados de triglicerídeos, tais como combustíveis derivados de óleos vegetais e gorduras.
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76/112 [00152] Os biocombustiveis crus derivados de ácidos graxos aqui descritos (antes de se misturar o derivado de ácido graxo com outros combustíveis, tais como combustíveis tradicionais) conterão menos catalisador para transesterificação do que diesel petroquímico ou biodiesel. Por exemplo, o derivado de ácido graxo pode conter menos de cerca de 2%, 1,5%, 1,0%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 0,05%, ou 0% de um catalisador para transesterificação ou uma impureza resultante de um catalisador para transesterificação. Catalisadores para transesterificação incluem, por exemplo, catalisadores hidróxidos, tais como NaOH, KOH, LiOH, e catalisadores acídicos, tais como catalisadores ácidos minerais e catalisadores ácidos de Lewis. Catalisadores e impurezas resultando de catalisadores para transesterificação incluem, sem limitação, estanho, chumbo, mercúrio, cádmio, zinco, titânio, zircônio, háfnio, boro, alumínio, fósforo, arsênio, antimônio, bismuto, cálcio, magnésio, estrôncio, urânio, potássio, sódio, lítio, e combinações desses.
[00153] Similarmente, os biocombustiveis crus derivados de ácidos graxos aqui descritos (antes de se misturar o derivado de ácido graxo com outros combustíveis, tais como diesel petroquímico ou biodiesel) conterão menos glicerol (ou glicerina) do que biocombustiveis feitos a partir de triglicerídeos. Por exemplo, o derivado de ácido graxo pode conter menos do que cerca de 2%, 1,5%, 1,0%,
0,5%, 0,3%, 0,1%, 0,05%, ou 0% de glicerol.
[00154] O biocombustível cru derivado de derivados de ácidos graxos também conterá menos álcool livre (i.e.
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77/112 álcool que é usado para criar o éster) do que biodiesel feito a partir de triglicerídeos. Isto é, em parte, devido à eficiência de utilização do álcool pelo hospedeiro de produção. Por exemplo, o derivado de ácido graxo conterá menos do que cerca de 2%, 1,5%, 1,0%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 0,05%, ou 0% de álcool livre.
[00155] Biocombustível derivado dos derivados de ácidos graxos descritos pode ser adicionalmente caracterizado por sua baixa concentração de enxofre comparado a diesel derivado de petróleo. Por exemplo, biocombustível derivado de derivados de ácidos graxos pode ter menos do que cerca de 2%, 1,5%, 1,0%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 0,05%, ou 0% de enxofre.
D. Aditivos [00156] Aditivos combustíveis são usados para intensificar o desempenho de um combustível ou motor. Por exemplo, aditivos combustíveis podem ser usados para alterar o ponto de congelamento/formação de gel, ponto de névoa, lubricidade, viscosidade, estabilidade oxidativa, qualidade de ignição, nível de octano, e ponto de inflamação. Nos Estados Unidos, todos aditivos combustíveis devem ser registrados na Agência de Proteção Ambiental (Environmental Protection Agency) e as companhias que vendem o aditivo combustível e o nome do aditivo combustível são publicamente disponibilizados no sítio
eletrônico da agência e também entrando em contato com a
agência. Um especialista na arte irá ponderar que os
derivados de ácidos graxos aqui descritos podem ser
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78/112 misturados com um ou mais tais aditivos para causar a qualidade desejada.
[00157] Um especialista na arte também irá ponderar que os derivados de ácidos graxos aqui descritos podem ser misturados com outros combustíveis, tais como biodiesel derivado de triglicerídeos, vários álcoois, tais como etanol e butanol, e produtos derivados de petróleo, tal como gasolina. Em alguns exemplos, um derivado de ácido graxo, tal como éster de etila C16:l ou éster de etila C18:l, é produzido, o que possui um baixo ponto de formação de gel. Este derivado de ácido graxo de baixo ponto de formação de gel é misturado com biodiesel feito a partir de triglicerídeos para amenizar o ponto de formação de gel geral do combustível. Similarmente, um derivado de ácido graxo, tal como éster de etila C16:l ou éster de etila C18:l, pode ser misturado com diesel derivado de petróleo para prover uma mistura que é pelo menos e, frequentemente maior do que 5% de biodiesel. Em alguns exemplos, a mistura inclui pelo menos 20% ou mais do derivado de ácido graxo.
[00158] Por exemplo, pode ser feita uma composição biocombustível que inclui pelo menos cerca 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de um derivado de ácido graxo que inclui uma cadeia de carbono que é 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 ou 22:3. Tais composições biocombustíveis podem adicionalmente incluir pelo menos um aditivo selecionado de um aditivo de baixo ponto de nevo que pode diminuir o ponto de névoa para menos de cerca de
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5°C, ou 0°C, um surfactante, ou uma microemulsão, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%, 85%, 90%, ou 95% de diesel combustível de triglicerídeos, gasolina derivada de petróleo ou diesel combustível de petróleo.
EXEMPLOS [00159] Fig. 1 é um diagrama da via de FAS demonstrando as enzimas diretamente envolvidas na síntese de acil-ACP. Para aumentar a produção de ceras/ésteres de ácido graxo, e álcoois graxos, uma ou mais das enzimas podem ser super-expressas ou mutadas para reduzir a inibição por resposta. Adicionalmente, enzimas que metabolizam os intermediários para fazer produtos não baseados em ácidos graxos (reações laterais) podem ser funcionalmente deletadas ou atenuadas para aumento do fluxo de carbono através da via biossintética de ácido graxo. Os Exemplos 1, 2 e 8 abaixo provêm hospedeiros produtores exemplares que tenham sido modificados para aumento da produção de ácido graxo.
[00160] Figs. 2, 3 e 4 demonstram vias biossintéticas que podem ser construídas para fazer, respectivamente, álcoois graxos e cera/ésteres de ácido graxo. Conforme ilustrado na Fig. 2, a conversão de cada substrato (acetil-CoA, malonil-CoA, acil-ACP, ácido graxo, e acil-CoA) para cada produto (acetil-CoA, malonil-CoA, acil-ACP, ácido graxo, e acil-CoA) pode ser obtida utilizando-se diversos polipeptídeos que são membros das classes enzimáticas indicadas. Os Exemplos abaixo descrevem micro-organismos que tenham sido construídos ou podem ser
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80/112 construídos para produzir álcoois graxos específicos e cera/ésteres de ácido graxo e hidrocarbonetos.
Exemplo 1, Construção de Hospedeiro de Produção [00161] Um hospedeiro de produção exemplar é LS9001. LS9001 foi produzido através da modificação de C41(DE3) da Overexpress.com (Saint Beausine, France) para deletar funcionalmente o gene fadE (acil-CoA desidrogenase).
[00162] Resumidamente, a linhagem de E.coli nocauteada em fadE foi feita utilizando-se os iniciadores
YafV Notl e Ivry 01 para amplificar cerca de 830 pb acima
de fadE e os iniciadores Lpcaf ol e LpcaR Bam para
amplificar cerca de 960 pb abaixo de fadE. PCR de
sobreposição foi utilizado para criar um constructo para
deleção completa do gene fadE em mesmo quadro de leitura. 0 constructo de fadE deletado foi clonado no plasmídeo sensível a temperatura pK0V3, que contém um gene SacB para seleção por contagem, e uma deleção cromossômica de fadE foi feita de acordo com o método de Link et al., J. Bact. 179:6228-6237, 1997. A linhagem resultante não era capaz de degradar ácidos graxos e acil-CoAs graxos (essa deleção funcional é aqui designada como AfadE) [00163] Modificações adicionais que podem ser incluídas em um hospedeiro produtor incluem introduzir um plasmídeo carreando os quatro genes que são responsáveis pela atividade de acetil-CoA carboxilase em E. coli (accA, B, C, e D, Números de acesso: NP_414727, NP_417721, NP_417722, NP_416819, EC 6.4.1.2). Os genes accABCD foram clonados em duas etapas na forma de operons bicistrônicos nos sítios NcoT/HindTTT e NdeT/AvrTT do pACYCDuet-1
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81/112 (Novagen, Madison, WI) o plasmídeo resultante foi denominado pAS004.126.
[00164] Modificações adicionais podem ser incluídas em um hospedeiro produtor incluindo as seguintes: superexpressão de aceEF (codificando o componente desidrogenase Elp e o componente desidrolipoamido aciltransferase E2p dos complexos piruvato e 2-oxoglutarato desidrogenase); e fabH/fabD/fabG/acpP/fabF (codificando FAS) de qualquer organismo conhecido na arte de codificar estas proteínas, incluindo por exemplo E. coli, Nitrosomonas europaea (ATCC 19718), Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces spp, Ralstonia, Rhodococcus, Corynebacteria, Brevibacteria, Mycobacteria, levedura oleaginosa, e similares podem ser expressos no hospedeiro produtor. Similarmente, hospedeiros produtores podem ser manipulados para expressar accABCD (codificando acetil-CoA carboxilase) de Pisum savitum ao invés de, ou além dos homólogos de
E.coli. Entretanto, quando o hospedeiro produtor também está produzindo butanol, torna-se menos desejável para expressar o homólogo de Pisum savitum.
[00165] Em alguns hospedeiros produtores exemplares, genes podem ser nocauteados ou atenuados utilizando-se o método descrito por Link, et al. , J. Bacteriol. 179:62286237, 1997. Por exemplo, genes que podem ser nocauteados ou atenuados incluem gpsA (codificando sn-glicerol 3fosfato desidrogenase biossintética, acesso: NP_418065, EC: 1.1.1.94); ldhA (codificando lactato desidrogenase, acesso NP_415898, EC: 1.1.1.28); pflb (codificando formato acetiltransferase 1, números de acesso: P09373, EC:
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2.3.1.54); adhE (codificando álcool desidrogenase, números de acesso: CAA47743, EC: 1.1.1.1, 1.2.1.10); pta (codificando fosfotransacetilase, números de acesso: NP_416800, EC: 2.3.1.8); poxB (codificando piruvato oxidase, números de acesso: NP_415392, EC: 1.2.2.2); ackA (codificando acetato quinase, números de acesso: NP_416799, EC: 2.7.2.1) e combinações destes.
[00166] Similarmente, a mutação de PlsB[D311E] pode ser introduzida no LS9001 para atenuar PlsB utilizando-se o método descrito acima para deleção de fadE. Uma vez introduzida, essa mutação irá diminuir a quantidade de carbono sendo desviado para produção de fosfato (see, Fig. 1) . Resumidamente, um alelo codificando PlsB[D311E] é feito através da reposição do códon GAC para aspartato 311 pelo códon GAA para glutamato. O alelo alterado é feito através da síntese gênica e o alelo plsB cromossômico de tipo selvagem é trocado pelo alelo plsB[D311E] mutante usando-se o método de Link et al. (ver acima).
Exemplo 2, modificações de hospedeiro de produção [00167] Os seguintes plasmídeos foram construídos para a expressão de várias proteínas que são utilizadas na síntese de derivados de ácidos graxos. Os constructos foram feitos utilizando-se biologia molecular padrão e todos os genes clonados foram introduzidos sob o controle de promotores induzidos por IPTG (promotores T7, tac ou lac).
[00168] O gene 'tesA (gene de tioesterase A, acesso
NP_415027 sem sequência líder (Cho e Cronan, The J. of
Biol. Chem., 270:4216-9, 1995, EC: 3.1.1.5, 3.1.2.-) de E.
coli foi clonado em pETDuet-1 digerido com NdeT/AvrlI
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83/112 (pETDuet-1 descrito aqui é disponibilizado pela Novagen, Madison, WI). Genes codificando tioesterases vegetais FatB-type (TEs) de Umbellularía Califórnia, Cuphea hookeriana e Cinnamonum camphorum (números de acesso: UcFatBl=AAA34215, ChFatB2=AAC49269, ChFatB3=AAC72881, CcFatB=AAC49151 foram individualmente clonados em três diferentes vetores: (i) pETDuet-1 digerido com NdeT/AvrlI, (ii) pBluescript KS+ digerido com XhoT/HindTTT (Stratagene, La Jolla, CA) (usado para criar proteínas de fusão lacZ::TE N-terminais) e (iii) pMAL-c2X digerido com XbaT/HindTTT (New England Lab, Ipswich, MA) (usado para criar fusões MalE::TE n-terminais). 0 gene fadD (codificando acil-CoA
sintetase) de E. coli foi clonado em um derivado de
pCDFDuet-1 digerido com NcoT/HindTTT, contendo o gene acrl
(acil-CoA redutase) de Acinetobacter baylyi ADP1 entre os
sítios NdeT/AvrTT. A Tabela 7 fornece um resumo dos plasmídeos gerados para fazer diversas linhagens produtoras exemplares, aquele de conhecimento na arte irá compreender que diferentes modificações plasmidiais e genômicas podem ser usadas para se obter linhagens similares.
Tabela 7
Resumo dos Plasmídeos utilizados em hospedeiros Produtores
Plasmídeo Organismo fonte Produto gênico No. de acesso, número EC
pETDuet-1-tesA E. coli TesA Números de acesso: NP 415027, EC: 3.1.1.5, 3.1.2.-
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pETDuet-l-TEuc pBluescript-TEuc Pmal-c2X-TEuc Umbellularia Califórnia UcFatBl Q41635 AAA34215
pETDuet-l-TEch pBluescript-TEch pMAL-c2X-TEch Cuphea hookeriana ChFatB2 ChFatB3 ABB71581 AAC49269 AAC72881
pETDuet-l-TEcc pBluescript-TEcc TEci Cinnamonum camphorum CcFatB AAC49151
pCDFDuet-l-fadD- acrl E. coli fadD: números de acesso NP 416319, EC 6.2.1.3 acrl: números de acesso YP 047869
[00169] O plasmideo de expressão escolhido contém replicons compatíveis e marcadores de resistência a antibióticos, de forma que um sistema de expressão de quatro plasmídeos possa ser estabelecido. Sendo assim,
LS9001 pode ser co-transformado com (i) qualquer um dos plasmídeos expressando TE, FadD, que também expressa expressão da cera sintase.
(ii) o plasmideo expressando acrl e (iii) o plasmideo de
Quando induzido com IPTG, a linhagem resultante irá produzir concentrações crescentes de álcoois graxos de fontes de carbono como sacarose e glicose. O tamanho da cadeia de carbono e o grau de
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85/112 saturação do álcool graxo produzido são dependentes do gene da tioesterase que é expresso.
Exemplo 3, Produção de álcoois graxos na linhagem recombinante de E. coli [00170] Álcoois graxos foram produzidos expressandose de forma exógena um gene para tioesterase e um gene para acil-CoA redutase (FAR) em um hospedeiro produtor.
especificamente, os plasmideos pCDFDuet-1-fadD-acrl
Mais (acilCoA redutase) e pETDuet-1-'tesA (tioesterase) foram transformados para a linhagem de E.
coli LS9001 (descrito no Exemplo 1) e os transformantes correspondentes foram selecionados em placas de LB suplementadas com 100 mg/L de espectinomicina e 50 mg/L de carbenicilina.
Quatro transformantes de
LS9001/pCDFDuet-l-fadD-acrl foram inoculados independentemente em 3 mL de meio M9 suplementado com 50 mg/L de carbenicilina e 100 mg/L de espectinomicina). As amostras contendo os transformantes eram crescidas a 25°C em um agitador (250 rpm) até atingirem 0,5 ODôoo. 1.5 mL de cada amostra foi transferido para um frasco de 250 mL contendo 30 mL do meio descrito acima. A cultura resultante foi crescida a 25°C em um agitador até atingir entre 0,5 - 1,0 ODôoo . Adicionou-se então IPTG para uma concentração final de 1 mM e o crescimento continuou por 40 horas.
[00171] As células foram então centrifugadas a 4000 rpm e o precipitado celular foi suspenso em 1,0 mL de metanol. 3 mL de acetato de etila foi então misturado com as células suspensas. 3 mL de H2O foram então adicionados a mistura e a mistura foi sonicada por 20 minutos. A
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86/112 amostra resultante foi centrifugada a 4000 rpm por 5 minutos e a fase orgânica (fase de cima), a qual continha álcoois graxos, foi submetida a análise GC/MS. Álcool total (incluindo tetradecanol, hexadecanol, hexadecenol e octadecenol) produzido foi em torno de 1-10 mg/L. Quando uma linhagem de E. coli carregando apenas vetores vazios foi cultivada da mesma forma, apenas 0,2 - 0,5 mg/L de álcoois graxos foram encontrados no extrato de acetato de etila.
Exemplo 4, Produção e liberação de álcoois graxos a partir de hospedeiros produtores [00172] Acrl (acil-CoA redutase) foi expresso em E. coli crescida com glicose como única fonte de carbono e energia. Esta E. coli produziu pequenas quantidades de álcoois graxos, como dodecanol (C12:0-OH), tetradecanol (C14:0-OH) e hexadecanol (C16:0-OH). Em outras amostras, FadD (acil-CoA sintetase) foi expresso junto com acrl em E. coli e um aumento de cinco vezes na produção de álcoois graxos foi observado.
[00173] Em outras amostras, acrl, fadD, accABCD (acetil-CoA Carboxilase) (construção de plasmídeo carreando accABCD conforme descrito no Exemplo 1) foi expresso em conjunto com várias tioesterases (TEs) individuais na E. coliC41 (DE3) selvagem e na E. coli C41 (DE3 AfadE) , uma linhagem sem acil-CoA desidrogenase. Isto resultou em aumentos adicionais na produção de álcoois graxos modulando os perfis de álcoois graxos (ver Fig. 5) . Por exemplo, super-expressão do 'tesA (pETDuet-1-'tesA) de E. coli nesse sistema alcançou aproximadamente um aumento de 60-vezes no
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C12:0-OH, C14:0-OH e C16:0-OH com C14:0-OH sendo o maior álcool graxo. Um resultado muito similar foi obtido quando a enzima ChFatB3 (FatB3 de Cuphea hookeriana em pMAL-c2XTEcu) foi expressa. Quando a enzima UcFatBl (FatBl de Umbellularia californicain em pMAL-c2X-TEuc) foi expressa, a produção de álcoois graxos aumentou aproximadamente 20 vezes e C12:0-OH foi o álcool graxo predominante.
[00174] A expressão de ChFatB3 e UcFatBl também levou à produção de quantidades significantes de álcoois graxos insaturados C16:1-OH e C14:1-OH, respectivamente. A presença de álcoois graxos também foi detectada em sobrenadantes das amostras geradas a partir da expressão de tesA (Fig. 6) . A 37°C, quantidades aproximadamente iguais de álcoois graxos foram encontradas nos sobrenadantes e no precipitado celular, enquanto que a 25°C, aproximadamente 25% dos álcoois graxos foram encontrados no sobrenadante.
Exemplo 5, ésteres de ácido graxo de cadeia média [00175] Álcool acetil transferases (AATs, EC 2.3.1.84), as quais são responsáveis pela produção de acil acetato em várias plantas, podem ser usadas para produzir ceras com cadeia de tamanho médio, como octanoato de octila, octanoato de decila, decanoato de decila, e similares. Ésteres graxos, sintetizados a partir de álcool de cadeia média (como C6, C8) e acil-CoA de cadeia média (ou ácidos graxos, como C6 ou C8) tem um ponto de derretimento relativamente baixo. Por exemplo, hexanoato de hexila tem um ponto de derretimento de -55°C e octanoato de octila tem um ponto de derretimento de -18 a -17°C. O
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88/112 baixo ponto de derretimento destes componentes faz deles bons candidatos para uso como biocombustiveis.
[00176] Neste exemplo, um gene SAAT foi co-expresso em um hospedeiro produtor C41(DE3, AfadE) com fadD de E. coli e acrl (álcool redutase de A. baylyi ADP1) e ácido octanóico foi fornecido no caldo de fermentação. Isso resultou na produção de octanoato de octila. Similarmente, quando o gene para cera sintase de A. baylyi ADP1 foi expresso no hospedeiro produtor, ao invés do gene SAAT octanoato de octila foi produzido.
[00177] Um gene SAAT recombinante foi sintetizado utilizando-se DNA 2.0 (Menlo Park, CA 94025). O DNA sintetizado foi baseado na sequência gênica publicada (número de acesso AF193789) e modificado para eliminar o sitio NcoT. O gene SAAT sintetizado (como um fragmento BamHI-HindIII) foi clonado em pRSET B (Invitrogen, Calsbad, Califórnia), linearizado com BamHI e HindTTT. O plasmideo resultante, pHZ1.63A foi co-transformado em uma E. coli hospedeira produtora com pAS004.114B, o qual carrega o gene fadD de E. coli e o gene acrl de A. baylyi ADP1. Os
transformantes foram crescidos em 3 mL de meio M9 com 2% de
glicose. Após indução por IPTG e da adição de 0,02% de
ácido octanóico, continuou-se o cultivo a 25°C por
horas. Após isso, 3 mL de acetato de acetila foram adicionados a cultura total e homogeneizado com um misturador. A fase do acetato de acetila foi analisada por GC/MS.
[00178] Surpreendentemente, no extrato de acetato de acetila, não se encontrou acetato de acila. Entretanto, um
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89/112 novo composto foi encontrado e este composto era octanoato de octila. Da mesma forma, a linhagem controle sem o gene SAAT [C41(DE3, AfadE)/pRSET B+pAS004.114B] não produziu octanoato de octila. Além disso, a linhagem [C41(DE3, AfadE)/pHZl.43 B+pAS004.114B], na qual o gene de cera sintase de A. baylyi ADP1 foi carregado por pHZ1.43, produziu octanoato de octila (ver Figs. 7B).
[00179] A descoberta de que a atividade de SAAT produz octanoato de octila não foi relatada anteriormente e faz com que seja possível a produção de ceras de cadeia média tais como octanoato de octila, decanoato de octila, as quais têm ponto de derretimento baixo e são boas candidatas para serem utilizadas como biocombustível para reposição de biodiesel baseado em triglicerídeo.
Exemplo 6, Produção de ésteres de cera na linhagem de E. coli LS9001 [00180] Ésteres de cera foram produzidos por uma E. coli hospedeira produtora construída para expressão de uma acil-CoA redutase formadora de álcool graxo, tioesterase, e uma cera sintase. Assim, o hospedeiro produtor produziu ambos os lados A e B do éster e a estrutura de ambos os lados foi influenciada pela expressão do gene de tioesterase.
[00181] Mais especificamente, a cera sintase de A. baylyi ADP1 (denominada WSadpl, números de acesso AA017391, EC: 2.3.175) foi amplificada com os iniciadores que seguem, utilizando-se o DNA genômico de A. baylyi ADP1 como molde. Os iniciadores foram (1) WSadpl_NdeI, 5'TCATATGCGCCCATTACATCCG -3' e (2) WSadpl_Avr, 5'Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 98/153
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TCCTAGGAGGGCTAATTTAGCCCTTTAGTT-3' . O produto de PCR foi digerido com NdeT e AvrTI e clonado no pCOALDeut-1 para gerar pHZ 1.43. O plasmídeo carregando WSadpl foi então co-transformado para a linhagem de E. coli LS9001 com ambos pETDuet-1'tesA e pCDFDuet-1-fadD-acrl e transformantes foram selecionados em placas LB suplementadas com 50 mg/L de canamicina, 50 mg/L de carbenicilina e 100 mg/L de
espectinomicina. Três transformantes foram inoculados em 3
mL de LBKCS (caldo LB suplementado com 50 mg/L de
canamicina, 50 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de
espectinomicina e 10 g/i de glicose) e cultivados sob
agitação a 37°C (250 rpm) . Quando as culturas atingiram
0,5 Οϋδοο, 1,5 mL de cada cultura foi transferido para
frascos de 250 mL contendo 50 mL de LBKCS e os frascos foram crescidos sob agitação (250 rpm) a 37°C até a cultura atingir 0,5 - 1,0 ODôoo . IPTG foi adicionado para a concentração final de 1 mM. As culturas induzidas foram crescidas sob agitação a 37°C por outras 40-48 horas.
[00182] A cultura foi então transferida para tubos cônicos de 50 mL e as células foram centrifugadas a 3500 X g por 10 minutos. O precipitado celular foi então misturado com 5 mL de acetato de etila. O extrato de acetato de etila foi analisado por GC/MS. As ceras intracelulares produzidas (incluindo C16C16, C14:1C16,
C18:1C18:1, C2C14, C2C16, C2C16:1, C16C16:1 e C2C18:1) foi em torno de 10 mg/L. Quando uma linhagem de E. coli carregando apenas vetores vazios foi cultivada da mesma maneira, apenas 0,2 mg/L de cera foram encontrados no extrato de acetato de etila.
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Exemplo 7, Produção e liberação de ésteres de etila graxos a partir de hospedeiros produtores [00183] A linhagem LS9001 foi modificada através da transformação desta com os plasmideos carreando o gene para cera sintase de A. baylyi (plasmídeo pHZ1.43), o gene para tioesterase de Cuphea hookeriana (plasmídeo pMAL-c2X-TEcu) e o gene fadD de E. coli (plasmídeo pCDFDuet-l-fadD). Esta linhagem recombinante foi crescida a 25°C em 3 mL de meio M9 com 50 mg/L de canamicina, 100 mg/L de carbenicilina e 100 mg/L de espectinomicina. Após indução por IPTG, o meio foi ajustado para uma concentração final de 1% etanol e 2% glicose. A cultura foi incubada para crescimento por mais 40 horas após a indução por IPTG. As células foram separadas do meio por centrifugação a 3500 X g por 10 minutos). O precipitado celular foi re-suspenso com 3 mL de meio M9. A suspensão celular e o meio foram então extraídos com 1 volume de acetato de etila. A fase de acetato de etila resultante da suspensão de células e do sobrenadante foram submetidos a análise GC-MS. O resultado demonstrou que o éster de etila C16 foi a mais proeminente espécie de éster (conforme esperado para esta tioesterase, ver Tabela 1) , e que 2 0% do éster de ácido graxo produzido foi liberado das células (ver Fig. 8) . Uma linhagem de E. coli controle C41 (DE3, AfadE) contendo pCOLADuet-1 (vetor vazio para o gene da cera sintase), pMAL-c2X-TEuc (contendo fatB de U. california) e pCDFDuet-l-fadD (gene fadD de E. coli) falhou em produzir quantidades detectáveis de ésteres de ácido graxo. Os ésteres de ácido graxo foram quantificados utilizando-se éster etílico de ácido
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92/112 palmítico comercial como referência. Esteres de ácido graxo também foram feitos utilizando-se os métodos aqui descritos com a exceção de que metanol, ou isopropanol foi adicionado ao meio de fermentação e de que os ésteres de ácido graxo esperados foram produzidos.
Exemplo 8, A influência de várias tioesterases na composição de ésteres graxo-etilicos produzidos por linhagens recombinantes E. coli.
[00184] As tioesterases FatB3 (C. hookeriana) , TesA {E. coli), e FatB {U. california) foram expressas simultaneamente com a cera sintase (A. baylyi). Um plasmídeo denominado pHZ1.61 foi construído substituindo-se o fragmento NotT-AvrlI (carreando o gene acrl) pelo fragmento NotT-AvrlI de pHZ1.43 de forma que fadD e a cera sintase ADP1 estivessem em um plasmídeo e ambas sequências codificadoras estivessem sob o controle de promotores T7 distintos. A construção de pHZ1.61 tornou possível utilizar um sistema de dois plasmídeos ao invés de um sistema de três plasmídeos conforme descrito no Exemplo 6. pHZ1.61 foi então co-transformado em E. coli C41(DE3, AfadE) com um dos vários plasmídeos carregando os diferentes genes para tioesterase descritos acima.
[00185] O total de ésteres etílicos de ácido graxo (ésteres etílicos de ácido graxo de sobrenadante e intracelulares) produzidos por estes transformantes foram avaliados usando a técnica descrita aqui. As produções e as composições dos ésteres etílicos de ácido graxo estão resumidas na Tabela 8.
Tabela 8
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As produções (mg/L) e a composição dos ésteres etilicos de ácido graxo por E. coli recombinante C41(DE3, ÁfadE)/pHZl.61 e plasmideos carreando vários genes para tioesterase.
Tioesteras C2C1 C2C12: C2C1 C2C14: C2C1 C2C16: C2C1 C2C18: Tota
es 0 1 2 1 4 1 6 1 1
'TesA 0,0 0, 0 6,5 0,0 17,5 6,9 21, 6 18,1 70,5
ChFatB3 0,0 0, 0 0, 0 0,0 10,8 12,5 11,7 13, 8 48,8
ucFatB 6,4 8,5 25,3 14,7 0, 0 4,5 3,7 6,7 69,8
pMAL 0,0 0, 0 0, 0 0,0 5, 6 0, 0 12,8 7,6 26,0
Nota: 'TesA, pETDuet-1-'tesA; chFatB3, pMAL-c2X-TEcu; ucFatB, pMAL-c2X-TEuc; pMAL, pMAL-c2X, o vetor vazio para genes de tioesterase utilizados neste estudo.
Exemplo 9, Construção de Hospedeiros Produtores [00186] Os genes que controlam a produção de ácido graxo são conservados entre micro-organismos. Por exemplo, a Tabela 9 identifica os homólogos de vários dos genes descritos aqui, os quais são sabidamente expressos em micro-organismos que produzem hidrocarbonetos. Para aumentar a produção de ácidos graxos e, assim, produção de hidrocarbonetos em micro-organismos como esses identificados na Tabela 9, genes heterólogos, como aqueles de E. coli podem ser expressos. Alguém com conhecimento na arte também irá ponderar que genes que são endógenos aos micro-organismos providos na Tabela 9 também podem ser super-expressos, ou atenuados, utilizando-se os métodos descritos aqui. Além do mais, os genes descritos na Fig. 10 podem ser expressos ou atenuados nos micro-organismos que produzem hidrocarbonetos endogenamente para permitir a
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94/112 produção de hidrocarbonetos específicos com comprimento de cadeia de carbono definido, pontos de saturação, e pontos de ramificação.
[00187] Por exemplo, sequências de ácidos nucléicos exógenos codificando acetil-CoA carboxilase são introduzidas em K. radiotolerans. Os genes seguintes compreendem o produto protéico acetil-CoA carboxilase em K. radiotolerans; acetil-CoA carboxilase, subunidade alfa (accA/ ZP_00618306) , acetil-CoA carboxilase, proteína carregadora de carboxil biotina (accB/ ZP_00618387), acetil-CoA carboxilase, subunidade biotina carboxilase (accC / ZP_00618040), e acetil-CoA carboxilase, subunidade beta (carboxiltransferase) (accD/ ZP_00618306). Estes genes são clonados em um plasmídeo de forma que fazem um operon acetil-CoA carboxilase sintético (accABCD) sob controle de um sistema de expressão de K. radiotolerans
como o sistema de expressão divulgado por Ruyter et al.,
Appl Environ Microbiol. 62 :3662-3667, 1996. A
transformação do plasmídeo para K. radiotolerans irá
aumentar a produção de ácido graxo. A linhagem de K. radiotolerans produtora de hidrocarbonetos também pode ser construída para fazer hidrocarbonetos insaturados ramificados, com cadeias de carbono de tamanhos específicos utilizando-se os métodos aqui descritos.
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Cs]
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Exemplo 10, Linhagens produtoras exemplares adicionais [00188] A Tabela 10 abaixo provê linhagens produtoras exemplares adicionais. Duas vias biossintéticas exemplares são descritas para produção de ácidos graxos, álcoois graxos, e ésteres de cera. Um hospedeiro geneticamente construído pode ser produzido clonando-se a expressão dos genes accABCD de E. coli, o gene 'tesA de E. coli, e o gene fadD de E. coli em uma célula hospedeira. Células hospedeiras podem ser selecionadas a partir de E. coli, leveduras, adicionadas a lista. Estes genes também podem ser transformados para células hospedeiras que são modificadas para conter uma ou mais das manipulações descritas nos Exemplos 1 e 2, acima. Conforme provido na Tabela 10, hospedeiros produtores adicionais podem ser criados usando-se os genes exógenos indicados.
Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 113/153 η Φ Μ Ο μ
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Figure BR122017010114B1_D0078
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Figure BR122017010114B1_D0087
Figure BR122017010114B1_D0088
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Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 115/153
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Figure BR122017010114B1_D0097
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Arabidopsis
Descarboxilase thaliana cerl
Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 116/153
Figure BR122017010114B1_D0099
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X
cerl Cer5
Oryza sativa Acinetobacter sp. H01-N Arabidopsis thaliana
Transportador
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109/112
Exemplo 11, Fermentação [00189] Micro-organismos hospedeiros também podem ser construídos para expressar umuC e umuD de E. coli em pBAD24 sob o sistema promotor prpBCDE através da síntese de novo deste gene com os genes apropriados para produção dos produtos finais. Para uma produção de hidrocarbonetos em pequena escala, células de E. coli BL21(DE3) carregando pBAD24 (com resistência a ampicilina e a via de síntese do produto final) assim como pUMVCl (com resistência a canamicina e o sistema de super-expressão do produto final acetil-CoA/malonil-CoA) são incubados durante a noite sob agitação >200 rpm e a 37°C em frascos de 2L com 500 ml de meio LB suplementado com 75 Cg/mL de ampicilina e 50 Dg/ml de canamicina até as culturas atingirem uma ODôoo de > 0,8. Uma vez atingindo uma ODôoo de > 0,8, as células são suplementadas com 25 mM de proprionato de sódio (pH 8,0) para ativação dos sistemas gênicos construídos para produção, assim como para parar a proliferação celular (através da ativação das proteínas umuC e umuD). A indução é realizada por seis horas a 30°C. Após incubação, o meio é examinado para o produto utilizando-se GC-MS (como descrito abaixo).
[00190] Para produção do produto em larga escala, os micro-organismos construídos são crescidos em 10 L, 100 L ou lotes maiores, fermentados e induzidos a expressar os produtos desejados baseando-se nos genes específicos codificados nos plasmídeos apropriados. Células de E. coli BL21(DE3) carregando pBAD24 (com resistência a ampicilina e com a via de síntese do produto final) assim como pUMVCl
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110/112 (com resistência a canamicina e o sistema de superexpressão de acetil-CoA/malonil-CoA) são incubados de culturas iniciais de 500 mL para fermentações de 10 L (5 L para fermentações de 100 L) em meio LB (livre de glicerol) sob agitação a >200 rpm e 37°C até que as culturas alcancem uma ODôoo de > 0,8 (16 horas tipicamente) incubados com 50 □g/mL de canamicina e 75 Cg/mL de ampicilina. O meio é tratado com suplementação contínua para que se mantenha 25 mM de proprionato de sódio (pH 8,0) para ativar o que foi construído nos sistemas gênicos para produção, assim como para parar a proliferação celular (através da ativação das proteínas umuC e umuD). O meio é continuamente suplementado com glicose para manutenção da concentração de 90g/100 mL. Após a primeira hora de indução, alíquotas de não mais que 10% do total do volume celular são removidas a cada hora e deixadas estagnadas sem agitação de forma a permitir que a produção de hidrocarbonetos chegue a superfície e sofra separação de fase espontânea. O componente hidrocarboneto é então coletado, e a fase aquosa retornada à câmara de reação. A câmara de reação é continuamente operada. Quando a ODôoo é reduzida a menos de 0,6, as células são
substituídas por um novo lote de crescimento a partir de
uma cultura inicial.
[00191] Para a produção de ésteres de cera,
subsequentemente ao isolamento, os ésteres de cera são
rapidamente lavados em 1 M HC1 para separar a ligação
éster, e retornado ao pH 7 com lavagem extensiva com água destilada.
Exemplo 12, Caracterização do Produto
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111/112 [00192] Para caracterizar e quantificar os álcoois graxos e ésteres de ácido graxo, foi utilizada cromatografia gasosa (GC) acoplada a espectrometria de massa (MS) com detecção de impacto de elétrons. Amostras de álcoois graxos foram primeiramente derivadas com um excesso de N-trimetilsilil imidazol (TMS) para aumento da sensibilidade de detecção. Ésteres de ácido graxo não requerem derivação. Ambos derivativos de álcoois graxos TMS e ésteres de ácido graxo foram dissolvidos em um solvente volátil apropriado, como acetato de etila. As amostras foram analisadas em uma coluna de capilar de 30m DP-5 utilizando-se o método a seguir. Após uma injeção de 1 pL sem divisão na coluna do GC/MS, o forno é aquecido a 100°C por 3 minutos. A temperatura foi aumentada até 320°C numa taxa de 20°C/minuto. O forno foi mantido a 320°C por mais 5 minutos. A taxa de fluxo do gás carreador hélio foi de 1,3 mL/minuto. Os rastreamentos da MS quadripolar foram de 50 a 550 m/z. Os tempos de retenção e os padrões de fragmentação dos picos dos produtos foram comparados com referências autênticas para confirmação da identidade do pico.
[00193] Por exemplo, éster etilico de ácido hexadecanóico eluido a 10.18 minutos (Figs. 9A e 9B). O íon parental com 284 unidades de massa foi prontamente observado. Mais abundantes foram os íons filhos produzidos durante a fragmentação de massa. Isto inclui o íon filho mais abundante de 80 unidades de massa. O álcool graxo hexadecanóico-TMS derivado eluido a 10.29 minutos e o íon
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112/112 parental de 313 puderam ser observados. 0 íon mais prevalente foi o ion M-14 de 299 unidades de massa.
[00194] A quantificação foi realizada injetando-se diversas concentrações das referências autênticas apropriadas utilizando-se o método GC/MS descrito acima. Esta informação foi utilizada para gerar uma curva padrão com resposta (contabilidade de ion total integrada) versus concentração.
EQUIVALENTES [00195] Enquanto exemplos específicos das atuais invenções são aqui descritos explicitamente, a especificação e exemplos acima são ilustrativos e não restritivas. Várias variações das invenções se tornarão aparentes àqueles especialistas na arte com a revisão desta especificação incluindo os exemplos. O escopo completo das invenções deveria ser determinado por referência aos exemplos, junto com o escopo completo de equivalentes, e a especificação, junto com tais variações.
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1/5

Claims (4)

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Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 142/153
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Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 139/153
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Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 138/153
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FIGURA 1
Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 128/153
1. Micro-organismo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucléicos heteróloga codificando um polipeptídeo definido por uma cera éster sintase de EC 2.3.1.75, uma sequência de ácidos nucléicos heteróloga codificando uma tioesterase de EC 3.1.2.- ou EC 3.1.1.- e uma sequência de ácidos nucléicos heteróloga codificando um polipeptídeo definido por uma acetil-CoA carboxilase de EC 6.4.1.2, em que as ditas sequências de ácidos nucléicos são superexpressas;
e em que o referido microorganismo é uma bactéria ou uma levedura.
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Álcool aciltransferase( EC 2.3.1.84) ou cera sintase (EC 2.3.1.75) álcool graxo formando acil-CoA redutase referencias: Kalscheurer 2006; Metz 2000; Cheng 2004a
FIGURA 2
Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 129/153
2/5
EC 4.2.1.-, e combinações das mesmas, em que o derivado de ácido graxo é ramificado.
5. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que expressa uma ou mais sequências de ácidos nucléicos heterólogas codificando uma enzima selecionada de fabB de EC 2.3.1.41, fabK de EC 1.2.1.9, fabL de EC 1.2.1.9, fabM de EC 5.3.3.14, fadE de EC 1.3.99.3 ou 1.3.99.-, e combinações das mesmas, em que o derivado de ácido graxo é insaturado.
6. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que fadE é atenuada.
7. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que fadD é superexpressa.
8. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que está em um recipiente compreendendo um caldo de fermentação compreendendo pelo menos 10 mg/L de éster de ácido graxo, ou pelo menos 10 mg/L de cera.
9. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido graxo compreende de 1 a 5 ligações duplas.
10. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido graxo compreende um comprimento de cadeia de carbono de 8 a 30.
11. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido graxo compreende de 1 a 5 pontos de ramificação.
12. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um
Petição 870180058817, de 06/07/2018, pág. 7/16
2. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é uma E.coli.
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Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 143/153
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Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 144/153
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Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 145/153
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Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 146/153
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Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 147/153
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3/23
Acetil-CoA carboxilase
Malonil-CoA
Glucose
EC 2.3.1.85
FAS
Acil-ACP
EC 3.1.2.14
I Tiosterase
Ácido graxo álcool graxo formando acil-CoA redutase (FAR)
EC1.1.1.* _______ Acil-CoA
Acil-CoA redutase
Aldeído graxo
Álcool desidrogenase
EC 1.1.1.1 r Álcool graxo
FIGURA 3
Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 130/153
4/23
Glucose
Acetil-CoA | carboxilase
Malonil-CoA
-ACP
EC 2.3.1.85 FAS '
| Tiosterase
Ácido graxo
E.C.2.3.1.86
J Acil-CoA sintase
Acil-CoA
Cera sintase
EC 2.3.1.75
Esteres graxo 4—™—,
Álcoois de cadeia curta produzido por hospedeiro de produção ou álcool adicionado através de meio de produção
FIGURA 4
Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 131/153
5/23 álcool graxo produzido
FIGURA 5
Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 132/153
6/23
Resposta alvo TIC
4000000 r
OHs Comum total
Cl 0, C12, Cill, CH, CliT, Clflj, C16:1, Cl fti
14000000
12000000'-J
10000000
8000000
60000002000000 células vetor sup vetor células sup
25°C 37BC
FIGURA 6
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7/23
FIGURA 7A
800000
750000'
700000’
650000’
600000
550000
500000 '
C8C8 /
450000
400000
350000
300000:
250000 i
200000
150000
100000
50000
FIGURA 7B
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8/23
FIGURA 7C
Abundância
FIGURA 7D
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300.0
Rendimento (mg/L) õ
250.0
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0
Distribuição de éster etílico total
C2C14 C2C16:1 C2C16:0 C2C18:1
FIGURA 8
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10/23 •Xrafaio· iwxu t<mo li-OOW I?Í*W IICflOQ mox
Ethyl Tetradecanoate
Ethyl
Hexadetónoatc ►
Ethyl
Oleate
Ethyl Hexadecenoatt
Ethyl Tetradecenoate
Ethyl DodeconatE
FIGURA 9A
Abundância
750000 700000 Etil 650000 hexadecanoato 600000 550000 Etil 500000 Oleato 450000 V 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 1 1 ............*----------1 |-----1---------1----^_L
7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50
FIGURA 9B
Petição 870170031839, de 15/05/2017, pág. 137/153
CO Cs]
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C*1 °i
3/5 éster de ácido graxo ou cera tendo um lado A contribuído por um álcool e um lado B contribuído por uma acil-CoA.
13. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o lado A e o lado B são produzidos pelo micro-organismo.
14. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o lado A, o lado B, ou ambos os lados A e B, compreendem de 1 a 5 ligações duplas.
15. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o lado A, o lado B, ou ambos os lados A e B, compreendem um comprimento de cadeia de carbono de 1 a 26.
16. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o lado A, o lado B, ou ambos os lados A e B, compreendem de 1 a 5 pontos de ramificação.
17. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o lado A, o lado B, ou ambos os lados A e B, compreendem entre 1 e 5 porções ciclopropil.
18. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é Arthrobacter sp., Bacillus sp. , Botryococcus braunii, Chromatium sp., resina Cladosporium (ATCC22711), Clostridium pasteurianum VKM, Clostridium tenanomorphum, Clostridium acidiurici, espécies de Corynebacterium, espécies de cyanobacterial (Nostoc muscorum, Anacystis (Synechococcus) nidulans, Phormidium luridum, Chlorogloea fritschii, Trichodesmium erythaeum, Oscillatoria williamsii, Microcoleus chthonoplaseis, Coccochloris elabens, Agmenellum quadruplicatum, Plectonema terebrans, M vaginatus, e C. scopulorum), Desulfovibrio desulfuricans (ATCC29577), Kineococcus radiotolerans (BAAPetição 870180058817, de 06/07/2018, pág. 8/16
4/5
149)
Micrococcus luteus (FD533, ATCC 272, 381, 382,
ISU,
540,
4698,
7468, 27141),
Micrococcus sp. (ATCC 146,
398,
401,
533) ,
Micrococcus roseus (ATCC 412, 416,
516) ,
Micrococcus lysodeikticus, espécies de Mycobacterium,
Penicillium sp. , Aspergillus sp.,
Trichoderma virida,
Pullularia pullulans, Jeotgalicoccus sp.
{M. candicans) (ATCC 8456), Rhodopseudomonas spheroids
Chlorobium sp. ,
Rhodospirillium rubrum (ATCC11170) ,
Rhodomicrobium vannielii, Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637, 17444,
17445, 17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677),
Saccharomycodes ludwigii (ATCC 22711), Saccharomyces sp. (oviformus,ludwiggi, tropicalis) , Vibrio furnissii Ml, Vibrio marinus MP-1, Vibrio ponticus, Serratia marinorubra, Ustilago maydis, Ustilago nuda, Urocystis agropyri, Sphacelotheca reiliana, ou Tilletia sp. (foetida, caries, controversa).
19. Método de produção de um éster de ácido graxo, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo do microorganismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, com uma fonte de carbono de carboidrato para produzir um éster de ácido graxo; e separação do éster de ácido graxo.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o éster de ácido graxo é uma cera éster.
21. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que expressa adicionalmente uma enzima selecionada de um álcool acetiltransferase de EC 2.3.1.84, um álcool desidrogenase de EC 1.1.1.1, e um álcool graxo formando acil-CoA redutases de EC 1.1.1.*.
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5/5
22. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que expressa uma ou mais sequências de ácido nucleico codificando uma enzima selecionada de um ou mais componentes do complexo de ceto ácido de cadeia ramificada desidrogenase de EC 1.2.4.4, llve de EC 2.6.1.42, lpd de EC 1.8.1.4, ccr de EC 1.1.19, IcmA de EC 5.4.99.2, IcmB de EC 5.4.99.13, fabH de EC 2.3.1.180, ACP de acesso NP_626635, fabF de EC 2.3.1.179, fabH3 de EC 2.3.1.180, fabC3 de acesso NP_823468, beta-cetoacil-ACP sintase II de EC 2.3.1.180, enoil-CoA redutase de EC 1.3.1.34, enoil-CoA isomerase de EC 4.2.1.-, e combinações das mesmas, em que o derivado de ácido graxo é ramificado.
23. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18, 21 e 22, caracterizado pelo fato de que expressa uma ou mais sequências de ácidos nucléicos exógenas codificando uma tioesterase de EC 3.1.2.- ou EC 3.1.1.-.
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3. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um derivado de ácido graxo, em que o referido derivado de ácido graxo é escolhido dentre ácidos graxos, ésteres graxos, álcoois graxos, e aldeídos graxos.
4. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que expressa uma ou mais sequências de ácidos nucléicos heterólogas codificando uma enzima selecionada de um ou mais componentes do complexo de ceto ácido de cadeia ramificada desidrogenase de EC 1.2.4.4, llve de EC 2.6.1.42, lpd de EC 1.8.1.4, Ccr de EC 1.1.19, IcmA de EC 5.4.99.2, IcmB de 5.4.99.13, fabH de EC 2.3.1.180, fabF de EC 2.3.1.179, fabH3 de EC 2.3.1.180, fabC3 de acesso NP_823468, beta-cetoacil-ACP sintase II de EC 2.3.1.180, enoil-CoA redutases de EC 1.3.1.34, enoil-CoA isomerase de
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