BR112021001716A2 - medicamento para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica - Google Patents

Abstract

Este medicamento é um medicamento para aliviar os sintomas de neuropatia periférica causada por oxaliplatina e/ou suprimir o início de neuropatia periférica, em um tratamento que define a administração intravenosa de oxaliplatina a um paciente humano com câncer e a retirada da administração como um ciclo, e repetição de um ciclo, e contém 0,06 mg/kg de trombomodulina a ser administrada intravenosamente, uma vez por ciclo, no primeiro dia de cada ciclo do tratamento como um ingrediente ativo.

Description

1 / 56 MEDICAMENTO PARA ALIVIAR ENFERMIDADES E/OU SUPRIMIR O

INÍCIO DE UMA NEUROPATIA PERIFÉRICA CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a um medicamento com efeitos de aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por um agente antitumor maligno.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[002] No tratamento terapêutico de cânceres (tumores malignos), cirurgia, radioterapia e quimioterapia são usadas apropriadamente independentemente ou em combinação. Agentes antitumor maligno usados para quimioterapia de câncer, entre aquelas terapias mencionadas anteriormente, apresentam citotoxicidade e causam reações colaterais, danificando não apenas células de câncer, mas também células normais.

[003] Exemplos das principais reações colaterais induzidas por agentes antitumor maligno incluem hematotoxicidade, obstruções de órgão digestivo e neuropatias periféricas. Como as enfermidades de neuropatias periféricas induzidas por agentes antitumor maligno, dores tais como dor intensa e dor ardente, dormência das extremidades, sensações anormais tais como hipersensibilidade ao frio, disestesias tais como anestesia e paralisia sensorial, ataxia sensorial, redução de força muscular e similares são desenvolvidas. Exemplos de agentes antitumor maligno que frequentemente causam tais neuropatias periféricas incluem oxaliplatina (Documento não associado à patente 1).

[004] Até o momento, contra neuropatias periféricas induzidas por agentes antitumor maligno, nenhum método eficiente para tratamentos profiláticos e terapêuticos foi estabelecido. Não existe nenhum medicamento a partir do qual indicações incluem supressão do início de uma neuropatia periférica induzida por agentes antitumor maligno, e tratamento terapêutico da mesma, no Japão ou fora do Japão. Embora a utilidade da administração

2 / 56 intravenosa de cálcio e magnésio, ou glutationa, tenha sido relatada para neuropatias periféricas induzidas por oxaliplatina, dificilmente é usada, por exemplo, em decorrência de tal terapia adicional complicar a quimioterapia de câncer, e tais substâncias exigem administração massiva. Nos campos da prática clínica, é exigido de maneira indesejável para controlar neuropatias periféricas induzidas por agentes antitumor maligno com fisioterapia, terapias complementares tais como massagem e acupuntura, ou combinação de terapias com fármaco tais como aquelas usando esteroides, antidepressivos, antiepiléticos, opioides e medicamentos ortodoxos chineses (gosyajinkigan), entretanto, a eficiência destas terapias não foi verificada, e tais terapias podem frequentemente causar reações colaterais (Documento não associado à patentes 1 e 2). Fora do Japão, uma diretriz em relação aos tratamentos profiláticos e terapêuticos de neuropatias periféricas induzidas por agentes antitumor maligno foi anunciada (Documento não associado à patente 3). Apenas duloxetina é recomendada como um agente terapêutico, e nenhum agente é recomendado como um agente para suprimir o início desta.

[005] Trombomodulina é conhecida como uma substância que atua para se ligar especificamente à trombina, de maneira a inibir a atividade de coagulação sanguínea da trombina e, ao mesmo tempo, promover significativamente a capacidade da trombina ativar proteína C, e é conhecida por apresentar potente atividade inibitória da coagulação sanguínea (Documento não associado à patente 4). Um agente terapêutico para coagulação intravascular disseminada (DIC) contendo trombomodulina de humano solúvel como um ingrediente ativo, Recomodulin (marca registrada), foi aprovado como um produto farmacêutico no Japão (Documento não associado à patente 4). Além disso, como uso pretendido de trombomodulina, usos para sepse grave, doenças hepáticas e dores relacionadas ao transplante de célula hematopoiética foram descritos (Documentos de Patente 2 a 4). Como uso pretendido de trombomodulina, uso para dor neuropática periférica

3 / 56 induzida por um agente anticâncer também foi descrito (Documento de Patente 4).

REFERÊNCIAS À TÉCNICA PRÉVIA Documentos de Patente

[006] Documento de Patente 1: WO2013/073545 Documento de Patente 2: Publicação não examinada de patente japonesa (KOKAI) No. 8-3065 Documento de Patente 3: Publicação não examinada de patente japonesa (KOKAI) No. 2011-178687 Documento de Patente 4: WO2013/179910 Documentos não associado à patente

[007] Documento não associado à patente 1: Folia Pharmacologica Japonica (Nippon Yakurigaku Zasshi), 2010, 136:275-279 Documento não associado à patente 2: EMBO Journal, 1987, 6:1891-1897 Documento não associado à patente 3: JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, 2014, Hershman et al., Prevention and Management of Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy in Survivors of Adult Cancers: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Documento não associado à patente 4: Bula de Recomodulin (marca registrada)

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Objetivo a ser Atingido pela Invenção

[008] Um objetivo de presente invenção é prover um medicamento eficiente e seguro, com efeitos para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por administração do agente antitumor maligno, oxaliplatina, usado em um tratamento antitumor maligno com oxaliplatina em um paciente humano com câncer que recebe o

4 / 56 tratamento. Meios para Atingir o Objetivo

[009] Sabe-se que trombomodulina é eficiente para uma dor neuropática periférica induzida por um agente anticâncer (Documento de Patente 4). Entretanto, documento de Patente 4 apenas descreve qualitativamente que a administração intraperitoneal de trombomodulina por mais de sete dias contíguos foi eficiente em relação a uma dor neuropática periférica, que se originou no uso de um agente anticâncer em um modelo de rato, em que neuropatia periférica foi desenvolvida administrando o agente anticâncer múltiplas vezes. Documento de Patente 4 também exemplifica administrar TMD123 (por exemplo, Recomodulin como marca registrada) 3 vezes no decorrer de cada curso de tratamento, isto é, imediatamente antes, durante, e imediatamente após a administração do agente anticâncer. Embora o documento de Patente 4 descreva em geral, adicionalmente, a frequência de administração de trombomodulina, não descreve a administração de trombomodulina uma vez no primeiro dia de cada ciclo do tratamento antitumor maligno com oxaliplatina. Além disso, não relata absolutamente nenhuma informação em relação ao método de administração ou dose de trombomodulina, com os quais a trombomodulina pode ser eficientemente e seguramente administrada a um paciente humano com câncer, que recebe o tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, para suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida pelo agente antitumor maligno.

[0010] Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas, a fim de atingir o objetivo anteriormente mencionado de aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica, eficientemente e seguramente, causada em um paciente humano com câncer que recebe tratamento antitumor maligno com oxaliplatina. Em função disso, observaram inesperadamente que o objetivo anteriormente mencionado pode ser atingido por administração única de 0,06 mg/kg de trombomodulina no

5 / 56 primeiro dia de cada ciclo do tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, e realizaram a presente invenção.

[0011] A presente invenção pode ser assim consubstanciada, por exemplo, da maneira a seguir.

[0012] [1] Um medicamento para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por um agente antitumor maligno, em um paciente humano com câncer que recebe um tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, em que o tratamento antitumor maligno compreende a etapa de repetir um único ciclo compreendendo a administração intravenosa de oxaliplatina ao paciente humano com câncer e após a retirada do fármaco, e o medicamento contém trombomodulina para administrar intravenosamente 0,06 mg/kg de trombomodulina, uma vez por cada único ciclo do tratamento antitumor maligno, no primeiro dia de cada dito ciclo como um ingrediente ativo.

[0013] [1-2] O medicamento para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por um agente antitumor maligno, em um paciente humano com câncer que recebe um tratamento antitumor maligno com oxaliplatina de acordo com [1] mencionado anteriormente, em que o tratamento antitumor maligno compreende a etapa de repetir um único ciclo compreendendo uma a seis vezes de administração intravenosa de oxaliplatina ao paciente humano com câncer e após a retirada do fármaco por pelo menos 6 dias, e o medicamento contém trombomodulina para administrar intravenosamente 0,06 mg/kg de trombomodulina, uma vez por cada único ciclo do tratamento antitumor maligno, no primeiro dia de cada dito ciclo como um ingrediente ativo.

[0014] [1-3] O medicamento de acordo com [1] mencionado anteriormente, em que o ciclo do tratamento antitumor maligno é repetido 1 a 12 vezes.

[0015] [1-4] O medicamento de acordo com [1] ou [1-2] mencionado

6 / 56 anteriormente, em que o ciclo do tratamento antitumor maligno é repetido pelo menos 8 vezes.

[0016] [1-5] O medicamento de acordo com [1] ou [1-2] mencionado anteriormente, em que o ciclo do tratamento antitumor maligno é repetido pelo menos 12 vezes.

[0017] [1-6] Um medicamento para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por oxaliplatina, em um tratamento que repete um único ciclo compreendendo a administração intravenosa de oxaliplatina a um paciente humano com câncer e após a retirada do fármaco, o qual contém trombomodulina para administrar intravenosamente 0,06 mg/kg de trombomodulina uma vez por cada único ciclo do tratamento, no primeiro dia de cada dito ciclo, como um ingrediente ativo.

[0018] [2] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [1-6] mencionados anteriormente, que é para suprimir redução da dose total de oxaliplatina no tratamento antitumor maligno.

[0019] Quando os números de itens citados são indicados como uma faixa como [1] a [1-6] da maneira mencionada anteriormente, e um item indicado com um número de item com um sub-número tal como [1-2] é incluído na faixa, isto significa que o item indicado com o número de item com um sub-número tal como [1-2] também é citado. Esta regra também se aplica às descrições a seguir.

[0020] [3] O medicamento de acordo com [1] ou [2] mencionado anteriormente, em que o tratamento antitumor maligno com oxaliplatina compreende a etapa de repetir um único ciclo, compreendendo administração intravenosa uma vez ao dia de 50 a 150 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina ao paciente humano com câncer por 1 a 3 dias, e após a retirada do fármaco por pelo menos 13 dias.

[0021] [3-2] O medicamento de acordo com [1] ou [2] mencionado

7 / 56 anteriormente, em que o tratamento antitumor maligno com oxaliplatina compreende a etapa de repetir um único ciclo, compreendendo administração intravenosa uma vez ao dia de 50 a 150 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina ao paciente humano com câncer por 1 dia, e após a retirada do fármaco por 13 a 24 dias.

[0022] [3-3] O medicamento de acordo com [1] ou [2] mencionado anteriormente, em que o tratamento antitumor maligno com oxaliplatina compreende a etapa de repetir um único ciclo, compreendendo administração intravenosa uma vez ao dia de 80 a 140 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina ao paciente humano com câncer por 1 dia, e após a retirada do fármaco por pelo menos 13 dias.

[0023] [3-4] O medicamento de acordo com [1] ou [2] mencionado anteriormente, em que o tratamento antitumor maligno com oxaliplatina compreende a etapa de repetir um único ciclo, compreendendo administração intravenosa uma vez ao dia de 80 a 90 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina ao paciente humano com câncer por 1 dia, e após a retirada do fármaco por pelo menos 13 dias.

[0024] [3-5] O medicamento de acordo com [1] ou [2] mencionado anteriormente, em que o tratamento antitumor maligno com oxaliplatina compreende a etapa de repetir um único ciclo, compreendendo administração intravenosa uma vez ao dia de 120 a 140 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina ao paciente humano com câncer por 1 dia, e após a retirada do fármaco por pelo menos 20 dias.

[0025] [3-6] O medicamento de acordo com qualquer um de [3] a [3- 5] mencionado anteriormente, em que o ciclo do tratamento antitumor maligno é repetido 1 a 12 vezes.

[0026] [3-7] O medicamento de acordo com qualquer um de [3] a [3- 5] mencionado anteriormente, em que o ciclo do tratamento antitumor maligno é repetido pelo menos 8 vezes.

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[0027] [3-8] O medicamento de acordo com qualquer um de [3] a [3- 5] mencionado anteriormente, em que o ciclo do tratamento antitumor maligno é repetido pelo menos 12 vezes.

[0028] [4] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [3-4], [3-6], e [3-7] mencionado anteriormente, em que oxaliplatina é administrada de acordo com a terapia FOLFOX.

[0029] [5] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [4] mencionado anteriormente, em que a administração de trombomodulina é iniciada antes do início da administração de oxaliplatina.

[0030] [5-2] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [4] mencionado anteriormente, em que a administração de trombomodulina é iniciada 30 minutos a 3 horas antes do início da administração oxaliplatina.

[0031] [6] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [5-2] mencionado anteriormente, que é administrado a um paciente com câncer que sofre de um ou mais tipos de cânceres selecionados a partir do grupo que consiste em câncer de intestino grosso, câncer pancreático e câncer gástrico.

[0032] [7] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [6] mencionado anteriormente, em que a neuropatia periférica é neuropatia periférica motora ou neuropatia periférica sensorial.

[0033] [8] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [7] mencionado anteriormente, em que a trombomodulina é trombomodulina solúvel.

[0034] [9] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [7] mencionado anteriormente, em que a trombomodulina é trombomodulina de humano.

[0035] [10] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [7] mencionado anteriormente, em que a trombomodulina é um peptídeo obtido a partir de uma célula transformada, preparada transfectando uma célula hospedeira com um DNA que codifica a sequência de aminoácido de (i-1) ou

9 / 56 (i-2) mencionada a seguir (o peptídeo obtido a partir de um DNA que codifica a sequência de aminoácido de (i-2) apresenta as atividades de trombomodulina); (i-1) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou 3, ou (i-2) a sequência de aminoácido de (i-1) mencionada anteriormente, incluindo adicionalmente substituição, eliminação ou adição de um ou mais resíduos de aminoácido.

[0036] [10-2] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [7] mencionado anteriormente, em que a trombomodulina é um peptídeo obtido a partir de uma célula transformada, preparada transfectando uma célula hospedeira com um DNA que codifica a sequência de aminoácido de (i-1) mencionada a seguir; (i-1) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou 3.

[0037] [11] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [7] mencionado anteriormente, em que a trombomodulina é um peptídeo contendo a sequência de aminoácido de (i-1) ou (i-2) mencionada a seguir, e o peptídeo é um peptídeo com as atividades de trombomodulina; (i-1) a sequência de aminoácido das posições 19 a 516 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou 3, ou (i-2) a sequência de aminoácido de (i-1) mencionada anteriormente, incluindo adicionalmente substituição, eliminação ou adição de um ou mais resíduos de aminoácido.

[0038] [11-2] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [7] mencionado anteriormente, em que a trombomodulina é um peptídeo contendo a sequência de aminoácido de (i-1) mencionada a seguir, e o peptídeo é um peptídeo com as atividades de trombomodulina; (i-1) a sequência de aminoácido das posições 19 a 516 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou 3.

[0039] [12] O medicamento de acordo com qualquer um de [1] a [9]

10 / 56 mencionado anteriormente, em que a trombomodulina é Trombomodulina alfa (recombinação genética).

[0040] [13] Uso de trombomodulina para fabricação de um medicamento para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por um agente antitumor maligno, em um paciente humano com câncer que recebe um tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, em que o tratamento antitumor maligno compreende a etapa de repetir um único ciclo compreendendo a administração intravenosa de oxaliplatina ao paciente humano com câncer e após a retirada do fármaco, e o uso é para administrar intravenosamente 0,06 mg/kg de trombomodulina, uma vez por cada único ciclo do tratamento antitumor maligno, no primeiro dia de cada dito ciclo.

[0041] [13-2] Uso de acordo com [13] mencionado anteriormente, que apresenta uma ou mais das características definidas em [1] a [12] mencionado anteriormente.

[0042] [14] Trombomodulina para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por um agente antitumor maligno, em um paciente humano com câncer que recebe um tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, em que o tratamento antitumor maligno compreende a etapa de repetir um único ciclo compreendendo a administração intravenosa de oxaliplatina ao paciente humano com câncer e após a retirada do fármaco, e a trombomodulina é para administrar intravenosamente 0,06 mg/kg de trombomodulina, uma vez por cada único ciclo do tratamento antitumor maligno, no primeiro dia de cada dito ciclo.

[0043] [14-2] A trombomodulina de acordo com [14] mencionado anteriormente, que apresenta uma ou mais das características definidas em [1] a [12] mencionado anteriormente.

[0044] [15] Um método para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por um agente antitumor

11 / 56 maligno, em um paciente humano com câncer que recebe um tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, em que o método compreende a etapa de administrar trombomodulina ao paciente humano com câncer, o tratamento antitumor maligno compreende a etapa de repetir um único ciclo compreendendo a administração intravenosa de oxaliplatina ao paciente humano com câncer e após a retirada do fármaco, e o método é para administrar intravenosamente 0,06 mg/kg de trombomodulina, uma vez por cada único ciclo do tratamento antitumor maligno, no primeiro dia de cada dito ciclo.

[0045] [15-2] O método de acordo com [15] mencionado anteriormente, que apresenta uma ou mais das características definidas em [1] a [12] mencionado anteriormente.

EFEITO DA INVENÇÃO

[0046] A presente invenção possibilita de maneira segura e eficiente o alívio de enfermidades e/ou supressão do início de uma neuropatia periférica induzida por administração de um agente antitumor maligno, em um paciente humano com câncer que recebe um tratamento com o agente antitumor maligno.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[0047] [Fig. 1] Fig. 1 mostra os resultados de investigação do efeito profilático de sete vezes de administração de ART-123 em hiperalgesia (diminuição do limiar de dor à pressão) causada em ratos por administração de oxaliplatina. Oxaliplatina (6 mg/kg) foi administrada intraperitonealmente no período indicado com a seta branca para todos os casos.

[0048] Seta: administração de ART-123 ou meio ●: grupo de administração de solvente ∆: grupo de administração de ART-123 0,3 mg/kg □: grupo de administração de ART-123 1 mg/kg ○: grupo de administração de ART-123 10 mg/kg

12 / 56 **: p < 0,005 (comparação com grupo de administração de solvente) ##: p < 0,01 (comparação com grupo de administração de solvente no dia anterior ao dia de administração de oxaliplatina)

[0049] [Fig. 2] Fig. 2 mostra os resultados de investigação do efeito profilático de uma, duas ou três vezes de administração de ART-123 em hiperalgesia (diminuição do limiar de dor à pressão) causada em ratos por administração de oxaliplatina. Oxaliplatina (6 mg/kg) foi administrada intraperitonealmente no período indicado com a seta branca para todos os casos.

[0050] Seta em linha sólida: Administração de ART-123 1 mg/kg Seta em linha tracejada: Administração de solvente ●: Grupo de administração de meio ∆: grupo de administração única de ART-123 □: grupo de administração dupla de ART-123 ○: grupo de administração tripla de ART-123 n.s.: Nenhuma diferença significativa *: p < 0,025 (comparação com grupo de administração de meio) **: p < 0,005 (comparação com grupo de administração de meio) ##: p < 0,01 (comparação com grupo de administração de meio no dia anterior ao dia de administração de oxaliplatina)

MODOS DE REALIZAR A INVENÇÃO

[0051] Daqui por diante, várias modalidades preferidas da presente invenção (modos preferidos para realizar a invenção, a partir daqui também referidas como "modalidades" na especificação) serão especificamente explicadas. Entretanto, o escopo da presente invenção não é limitado às modalidades específicas explicadas a seguir.

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[0052] Em relação a uma modalidade, como a trombomodulina, um peptídeo contendo pelo menos a sequência das posições 19 a 516 da sequência de SEQ ID NO: 1 ou 3, ou uma sequência homóloga mutada desta, e com as atividades de trombomodulina mencionada a seguir pode ser exemplificado. Em relação a uma outra modalidade, um peptídeo contendo pelo menos a sequência das posições 19 a 516 da sequência de SEQ ID NO: 1 pode ser exemplificado. Em relação ainda a uma outra modalidade, um peptídeo contendo uma sequência homóloga mutada da sequência de SEQ ID NO: 1 pode ser exemplificado.

[0053] Exemplos da sequência homóloga mutada incluem uma sequência de peptídeo com a sequência de aminoácido do peptídeo correspondente, que pode incluir adicionalmente substituição, eliminação ou adição de um ou mais resíduos de aminoácido. O número de resíduos de aminoácidos que podem ser substituídos, eliminados ou adicionados podem ser, por exemplo, 1 a 40, preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, preferivelmente de maneira adicional 1 a 5, particularmente preferível 1 a 3. Exemplos da sequência homóloga mutada também incluem uma sequência de peptídeo com uma homologia maior que um certo nível da sequência de aminoácido do peptídeo correspondente. A homologia maior que um certo nível é, por exemplo, uma homologia de 80 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais, preferivelmente de maneira adicional 95 % ou mais, particularmente preferível 98 % ou mais.

[0054] Como as atividades de trombomodulina, ações de (1) se ligar seletivamente à trombina (2) para promover ativação de proteína C por trombina podem ser mencionadas. (3) Uma ação de estender tempo de coagulação de trombina, (4) uma ação de suprimir agregação plaquetária induzida por trombina, e (5) ação anti-inflamatória também podem ser exemplificadas. Como as atividades de trombomodulina, por exemplo, trombomodulina apresenta as ações de (1) e (2) mencionados anteriormente,

14 / 56 ou as ações de (1) a (4) mencionados anteriormente. Em relação a uma outra modalidade, trombomodulina apresenta todas as ações de (1) a (5).

[0055] Ação de trombomodulina se ligar à trombina pode ser confirmada pelos métodos de estudo descritos em várias publicações conhecidas, tais como Thrombosis and Haemostasis, 1993, 70(3):418-422 e The Journal of Biological Chemistry, 1989, 264, 9, pp.4872-4876. Quanto à ação de promover ativação de proteína C por trombina, o grau da atividade de promover a ativação de proteína C por trombina, ou presença ou ausência da ação podem ser facilmente confirmados pelos métodos de estudo claramente descritos em várias publicações conhecidas incluindo, por exemplo, Publicação não examinada de Patente Japonesa (KOKAI) No. 64-6219. Adicionalmente, a ação de estender tempo de coagulação de trombina, e/ou a ação de suprimir a agregação plaquetária induzida por trombina podem ser similarmente e facilmente confirmada. Além disso, a ação anti-inflamatória também pode ser confirmada pelos métodos de estudo descritos em várias publicações conhecidas incluindo, por exemplo, Blood, 2008, 112:3361-3670 e The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115, 5:1267-1274.

[0056] Em relação a uma modalidade, como a trombomodulina, um peptídeo consistindo na sequência das posições 19 a 516, posições 19 a 515, posições 17 a 516, ou posições 17 a 515 na sequência de SEQ ID NO: 1 ou 3 pode ser exemplificado. A trombomodulina pode ser uma mistura dos peptídeos consistindo na sequência das posições 19 a 516, posições 19 a 515, posições 17 a 516, ou posições 17 a 515 da sequência de SEQ ID NO: 1 ou 3.

[0057] Em relação a uma modalidade, embora a trombomodulina não seja particularmente limitada, contanto que esta seja a trombomodulina descrita anteriormente, trombomodulina solúvel pode ser exemplificada. Em relação a uma outra modalidade, trombomodulina de humano pode ser exemplificada. Em relação ainda a uma outra modalidade, trombomodulina de humano solúvel pode ser exemplificada. Em relação a uma outra modalidade,

15 / 56 Trombomodulina alfa (recombinação genética) pode ser exemplificada. Trombomodulina alfa (recombinação genética) é um ingrediente ativo de Recomodulin (marca registrada), que é aprovado como um produto farmacêutico no Japão. Trombomodulina alfa (recombinação genética) também é denominada ART-123.

[0058] Exemplos do trombomodulina solúvel incluem trombomodulina solúvel em água na ausência de agente tensoativo. A solubilidade da trombomodulina solúvel em água, tal como água destilada usada para injeção (na ausência de um agente tensoativo tal como Triton X- 100 ou polidocanol, e em geral em torno da faixa de pH neutro) é preferivelmente, por exemplo, 1 mg/mL ou mais ou 10 mg/mL ou mais; preferivelmente 15 mg/mL ou mais ou 17 mg/mL ou mais; mais preferivelmente 20 mg/mL ou mais, 25 mg/mL ou mais, ou 30 mg/mL ou mais; particularmente preferível 60 mg/mL ou mais. Em alguns casos, a solubilidade é, por exemplo, 80 mg/mL ou mais, ou 100 mg/mL ou mais. Para determinar se uma trombomodulina solúvel é dissolvida satisfatoriamente ou não, entende-se que, quando a trombomodulina solúvel é dissolvida em água e a solução é observada por inspeção visual, por exemplo, apenas sob uma luz branca em uma posição que corresponde a uma iluminação de aproximadamente 1000 lux, a aparência clara da solução e a ausência de substâncias insolúveis aparentemente observáveis são identificadas como critérios simples. Pode-se confirmar também observando a presença ou ausência de qualquer resíduo após filtração da solução.

[0059] O peso molecular da trombomodulina é preferivelmente

100.000 ou menor, mais preferivelmente 90.000 ou menor, ainda mais preferivelmente 80.000 ou menor, acima de tudo preferivelmente 70.000 ou menor, e o peso molecular é preferivelmente 50.000 ou maior, acima de tudo preferivelmente 60.000 ou maior. O peso molecular da trombomodulina solúvel pode ser facilmente medido por métodos comuns para medir peso

16 / 56 molecular de proteína. A medição por espectrometria de massa é preferida, e o método MALDI-TOF-MS é mais preferido. Para obter uma trombomodulina solúvel com um peso molecular em uma faixa desejada, uma trombomodulina solúvel, que é obtida cultivando uma célula transformante preparada transfectando uma célula hospedeira com um DNA que codifica a trombomodulina solúvel usando um vetor, pode ser submetida ao fracionamento usando cromatografia em coluna ou similares, da maneira descrita anteriormente.

[0060] Da maneira descrita anteriormente, estas trombomodulinas podem ser obtidas a partir de células transformantes, preparadas transfectando células hospedeiras com um DNA que codifica qualquer um destes peptídeos (especificamente, as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 2, 4 e similares) usando um vetor.

[0061] É suficiente que estes peptídeos apresentem apenas as sequências de aminoácido anteriormente mencionadas, e uma cadeia de açúcar pode ser anexada ou não anexada, o que não é particularmente limitado. Nas técnicas de manipulação de gene, um tipo de uma cadeia de açúcar, uma posição na qual uma cadeia de açúcar é adicionada, e um nível de adição desta diferem, dependendo do tipo de células hospedeiras usadas, e quaisquer técnicas podem ser usadas. Quanto a posição de ligação de uma cadeia de açúcar e um tipo desta, informações descritas na publicação não examinada de Patente Japonesa (KOKAI) No. 11-341990 são conhecidas, e as trombomodulinas usadas em relação a uma modalidade podem ser adicionadas com a mesma cadeia de açúcar na mesma posição. Dois tipos de cadeias de açúcares ligadas ao N, aquelas do tipo fucosil biantenário e fucosil triantenário, podem se ligar à trombomodulina em uma modalidade, e razão destas é, por exemplo, 100:0 a 60:40, preferivelmente 95:5 a 60:40, mais preferivelmente 90:10 a 70:30. A razão destas cadeias de açúcares pode ser medida em um mapa de cadeia de açúcar bidimensional, descrito em

17 / 56 Biochemical Experimental Methods, Vol. 23, Methods of Researches on Glycoprotein Sugar Chains, Japan Scientific Societies Press (1990), e similares. Além disso, quando uma composição de açúcar da trombomodulina em relação a uma modalidade é examinada, sacarídeos neutros, aminossacarídeos, e ácido siálico são detectados, a partir dos quais o teor pode ser, cada qual independentemente, por exemplo, 1 a 30 %, preferivelmente 2 a 20 %, mais preferivelmente 5 a 10 %, em termos de razão de peso com base no teor de proteína. Os teores de açúcar podem ser avaliados pelos métodos descritos em Lecture of New Biochemical Experiments, Vol. 3, Sugar I, Glycoprotein (Livro 1), Tokyo Kagaku Dojin (1990) (sacarídeos neutros: método de fenol-ácido sulfúrico, aminossacarídeos: método de Elson-Morgan, ácido siálico: método de ácido periódico-resorcinol).

[0062] Embora o método para obter trombomodulina não seja limitado a obtê-la por manipulação genética, da maneira descrita anteriormente, quando a trombomodulina é obtida por manipulação de gene, como uma sequência sinal que pode ser usada para expressão, uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido das posições 1 a 18 na sequência de SEQ ID NO: 1, e uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido das posições 1 a 16 na sequência de SEQ ID NO: 1 podem ser usadas, e outras sequências sinal conhecidas, tal como a sequência sinal de ativador de plasminogênio tecidual humano, também podem ser usadas (Publicação internacional WO88/9811).

[0063] Quando uma sequência de DNA que codifica trombomodulina é introduzida em uma célula hospedeira, exemplos de métodos preferidos incluem um método de incorporar uma sequência de DNA que codifica trombomodulina, preferivelmente, em um vetor, mais preferivelmente um vetor de expressão capaz de ser expressas em células animais, e a seguir introduzir o DNA com o vetor. Um vetor de expressão é uma molécula de

18 / 56 DNA que é constituída por uma sequência promotora, uma sequência para adicionar um sítio de ligação ao ribossomo ao RNAm, uma sequência de DNA que codifica uma proteína a ser expressa, um sinal de splicing, uma sequência terminadora para terminação de transcrição, uma sequência de origem de replicação, e similares. Exemplos de vetor de expressão de célula animal preferidos incluem pSV2-X, relatado por Mulligan R.C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1981, 78, 2072-2076); pBP69T (69-6), relatado por Howley P.M. et al. (Methods in Emzymology, 1983, 101, 387-402, Academic Press) e similares. Adicionalmente, também existe uma outra modalidade preferida na qual o DNA é introduzido em um vetor de expressão que pode ser expresso em um micro-organismo.

[0064] Exemplos de célula hospedeira que pode ser usada na produção de tais peptídeos, da maneira mencionada anteriormente, incluem células animais. Exemplos das células animais incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células COS-1, células COS-7, células VERO (ATCC CCL-81), células BHK, células MDCK derivada de rim canino, células AV- 12-664 de hamster e similares. Além disso, exemplos de célula hospedeira derivada de humano incluem células HeLa, células WI38, células 293 de humano e células PER.C6. Destas células, células CHO são muito comuns e preferidas, e entre as células CHO, células CHO deficientes em di-hidrofolato redutase (DHFR) são mais preferidas.

[0065] Em um processo de manipulação de gene ou um processo de produção de peptídeo, micro-organismos tal como Escherichia coli também são frequentemente usados. Um sistema hospedeiro-vetor adequado para cada processo é preferivelmente usado, e um sistema de vetor apropriado também pode ser selecionado para as células hospedeiras anteriormente mencionadas. Um gene de trombomodulina usado em uma técnica de recombinação genética foi clonado. Exemplos de produção de trombomodulina por uma técnica de recombinação genética como esta foram descritos e,

19 / 56 adicionalmente, métodos para purificar trombomodulina para obter um produto purificado desta também são conhecidos (Publicação não examinada de Patente Japonesa (KOKAI) Nos. 64-6219, 2-255699, 5-213998, 5-310787, 7-155176; e J. Biol. Chem., 1989, 264:10351-10353). Portanto, a trombomodulina usada em relação a uma modalidade pode ser produzida usando os métodos descritos nos relatos anteriormente mencionados, ou por métodos similares. Por exemplo, publicação não examinada de Patente Japonesa (KOKAI) No. 64-6219 descreve a Escherichia coli K-12 cepa DH5 (Número de acesso ATCC 67283) contendo um plasmídeo pSV2TMJ2, que contém um DNA que codifica a trombomodulina de tamanho completo. Esta cepa depositada novamente no National Institute of Bioscience and Human- Technology (atualmente Independent Administrative Institution, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary) (Escherichia coli DH5/pSV2TMJ2) (FERM BP-5570) também pode ser usada. A trombomodulina usada em relação a uma modalidade pode ser preparada por uma técnica de manipulação de gene conhecida, usando um DNA que codifica a trombomodulina de tamanho completo como um material de partida.

[0066] Em relação a uma modalidade, a trombomodulina pode ser preparada por um método convencionalmente conhecido ou um método similar. Por exemplo, o método anteriormente mencionado de Yamamoto et al. (Publicação não examinada de Patente Japonesa (KOKAI) No. 64-6219) ou o método descrito em Publicação não examinada de Patente Japonesa (KOKAI) No. 5-213998 pode ser referido. Especificamente, por exemplo, um DNA que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é preparado a partir de um gene de trombomodulina derivado de humano por uma técnica de manipulação de gene, e pode ser modificado adicionalmente da maneira exigida. Para tal modificação, a fim de obter um DNA que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (que consiste especificamente na

20 / 56 sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 4), códons que codificam o aminoácido na posição 473 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 (em particular, o nucleotídeo na posição 1418 na sequência de SEQ ID NO: 2) são mutados por mutagênese sítio-direcionada, de acordo com o método descrito por Zoller M.J. et al. (Method in Enzymology, 1983, 100:468-500, Academic Press). Por exemplo, usando um DNA sintético para mutação com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 5, o nucleotídeo T na posição 1418 na sequência de SEQ ID NO: 2 pode ser convertido no nucleotídeo C para obter um DNA mutado.

[0067] O DNA preparado da maneira descrita anteriormente, é incorporado, por exemplo, nas células de ovário de hamster chinês (CHO) para obter células transformantes. Tais células são submetidas à seleção apropriada, e trombomodulina purificada por um método conhecido pode ser produzida a partir de uma solução de cultura, obtida cultivando uma célula selecionada. Da maneira descrita anteriormente, o DNA (SEQ ID NO: 2) que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é preferivelmente transfectado na célula hospedeira anteriormente mencionada.

[0068] O método para produzir trombomodulina, em relação a uma modalidade, não é limitado ao método anteriormente mencionado. Por exemplo, também é possível extrair e purificar a trombomodulina a partir da urina, sangue, outros fluidos corporais e similares, ou extrair e purificar a trombomodulina a partir de um tecido que produz trombomodulina, ou uma cultura do tecido anteriormente mencionado e similares. Adicionalmente, a trombomodulina pode ser submetida adicionalmente a um tratamento de clivagem usando uma protease, conforme exigido.

[0069] Em relação à cultura da célula transformante anteriormente mencionada, um meio usado para cultivo de célula comum pode ser usado, e é preferível cultivar a célula transformante em vários tipos de meios com antecedência para escolher um meio ideal. Por exemplo, um meio conhecido

21 / 56 tal como meio MEM, meio DMEM, e meio 199 podem ser usados como um meio de base, e um meio adicionalmente melhorado ou um meio adicionado com suplementos para vários meios pode ser usado. Exemplos do método de cultura incluem cultura de soro, em que a cultura é realizada em um meio contendo soro do sangue, e cultura livre de soro, em que a cultura é realizada em um meio que não contém soro de sangue. Embora o método de cultivo não seja particularmente limitado, a cultura sem soro é preferida.

[0070] Quando soro é adicionado a um meio no caso da cultura de soro, o soro bovino é preferido. Exemplos de soro bovino incluem soro bovino fetal, soro bovino neonatal, soro de bezerro bovino, soro de bovino adulto e similares, e quaisquer destes exemplos podem ser usados, de maneira tal que o soro seja adequado para a cultura de células. Como o meio sem soro usado na cultura sem soro, meios comercialmente disponíveis podem ser usados. Meios sem soro adequados para várias células são comercializados e, por exemplo, em relação à célula CHO, CD-CHO, CHO-S-SFMII e CHO-III- PFM são vendidos pela Invitrogen, e meio IS CHO, IS CHO-CD e similares são vendidos por Irvine Scientific. Estes meios podem ser usados sem nenhum tratamento, ou podem ser melhorados ou adicionados com suplementos e usados. Exemplos do meio sem soro adicional incluem o meio DMEM contendo 5 mg/L de cada um de insulina, transferrina e ácido selenioso. Da maneira descrita anteriormente, o meio não é particularmente limitado, de maneira tal que o meio possa ser usado para produzir a trombomodulina em relação a uma modalidade. O método de cultura não é particularmente limitado, e qualquer um de cultura em lotes, cultura em lotes repetitivos, cultura em lote alimentado, cultura em perfusão e similares pode ser usado.

[0071] Quando a trombomodulina usada em relação a uma modalidade é preparada pelo método de cultura de célula anteriormente mencionado, a diversidade pode ser observada no aminoácido da terminação

22 / 56 N, em virtude da modificação pós-traducional da proteína. Por exemplo, o aminoácido da posição 17, 18, 19 ou 22 na sequência de SEQ ID NO: 1 pode funcionar como o aminoácido na terminação N. Adicionalmente, por exemplo, o aminoácido na terminação N pode ser modificado de maneira tal que o ácido glutâmico na posição 22 é alterado para ácido piroglutâmico. É preferível que o aminoácido da posição 17 ou 19 funcione como o aminoácido na terminação N, e é mais preferível que o aminoácido da posição 19 funcione como o aminoácido na terminação N. Adicionalmente, existe também uma outra modalidade preferida em que o aminoácido da posição 17 funciona como o aminoácido na terminação N. Em relação à modificação, diversidade e similares mencionadas anteriormente, exemplos similares podem ser mencionados para a sequência de SEQ ID NO: 3.

[0072] Adicionalmente, quando a trombomodulina solúvel é preparada usando um DNA com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, diversidade do aminoácido da terminação C pode ser observada, e um peptídeo menor em um resíduo de aminoácido pode ser produzido. Especificamente, o aminoácido da terminação C pode ser modificado, de maneira tal que o aminoácido da posição 515 funciona como o aminoácido da terminação C, e adicionalmente a posição 515 é amidada. Adicionalmente, um peptídeo menor em dois resíduos de aminoácidos pode ser produzido. Especificamente, o aminoácido da posição 514 pode funcionar como o aminoácido da terminação C. Portanto, quaisquer dos peptídeos com diversidade significativa do aminoácido na terminação N e aminoácido da terminação C, ou uma mistura destes, podem ser produzidos. É preferível que o aminoácido da posição 515 ou o aminoácido da posição 516 funcione como o aminoácido da terminação C, e é mais preferível que o aminoácido da posição 516 funcione como o aminoácido da terminação C. Adicionalmente, também existe uma outra modalidade em que o aminoácido da posição 514 preferivelmente funciona como o aminoácido da terminação C. Em relação à

23 / 56 modificação, a diversidade e similares descritos anteriormente, o mesmo se aplica a um DNA com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 4.

[0073] A trombomodulina obtida pelo método descrito anteriormente pode ser uma mistura de peptídeos com diversidade na terminação N e aminoácidos da terminação C. Exemplos específicos incluem uma mistura de peptídeos com as sequências das posições 19 a 516, posições 19 a 515, posições 19 a 514, posições 17 a 516, posições 17 a 515, e posições 17 a 514 na sequência de SEQ ID NO: 1.

[0074] A seguir, isolamento e purificação de trombomodulina a partir de um sobrenadante da cultura, ou cultura obtida da maneira descrita anteriormente, podem ser realizados por métodos conhecidos [Tanpakushitsu/Koso no Kiso Jikken Ho (Fundamental Experimental Methods for Proteins and Enzymes), 1981, editado por Takeichi Horio]. Por exemplo, é preferível usar cromatografia de troca iônica ou cromatografia por adsorção, que utiliza uma interação entre trombomodulina e um carreador cromatográfico, em que grupos funcionais com uma carga aposta àquela de trombomodulina são imobilizados. Um outro exemplo preferido é cromatografia por afinidade utilizando afinidade específica com trombomodulina. Exemplos preferidos de adsorbente incluem trombina, que é um ligante de trombomodulina e um anticorpo anti-trombomodulina. Como o anticorpo, anticorpos anti-trombomodulina com propriedades apropriadas ou epítopos apropriados de reconhecimento podem ser usados. Exemplos incluem, por exemplo, aqueles descritos na publicação de Patente Japonesa (KOKOKU) No. 5-42920, publicação não examinada de Patente Japonesa (KOKAI) Nos. 64-45398 e 6-205692 e similares. Outros exemplos incluem cromatografia de filtração em gel e ultrafiltração, os quais utilizam o tamanho molecular de trombomodulina. Outros exemplos incluem adicionalmente cromatografia hidrofóbica que utiliza ligação hidrofóbica entre um carreador cromatográfico, em que grupos hidrofóbicos são imobilizados, e uma porção

24 / 56 hidrofóbico de trombomodulina. Além disso, hidroxiapatita pode ser usada como um carreador em cromatografia por adsorção, exemplos dos quais incluem, por exemplo, aqueles descritos na publicação não examinada de Patente Japonesa (KOKAI) No. 9-110900. Estes meios podem ser usados em combinação, da maneira exigida. Embora o grau de purificação possa ser selecionado, dependendo de um propósito de uso e similares, é desejável purificar trombomodulina até uma banda simples ser obtida como resultado de eletroforese, preferivelmente SDS-PAGE, ou um pico único ser obtido como um resultado da HPLC por filtração em gel ou HPLC de fase reversa dod produtos isolados e purificados. É evidente que deve ser entendido que, quando dois ou mais tipos de trombomodulinas são usados, é preferível que apenas as bandas das trombomodulinas sejam substancialmente obtidas, e não sejam exigidos para obter uma única banda.

[0075] Exemplos específicos do método de purificação, em relação a uma modalidade, incluem um método de purificação usando as atividades de trombomodulina como um critério, por exemplo, um método de purificação compreendendo purificar aproximadamente um sobrenadante da cultura, ou um produto de cultura, com uma coluna de troca iônica Q-Sepharose Fast Flow para coletar uma fração com as atividades de trombomodulina; a seguir purificar a fração com uma coluna de afinidade, coluna de DIP-trombina- agarose (diisopropilfosforiltrombina), como a principal etapa de purificação para recuperar uma fração com atividades potentes de trombomodulina; a seguir concentrar a fração recuperada, seguido por filtração em gel para obter uma fração ativa de trombomodulina como um produto purificado (Gomi K. et al., Blood, 1990, 75: 1396-1399). Um exemplo das atividades de trombomodulina usadas como critério é uma atividade de promover a ativação de proteína C por trombina. Outros exemplos preferidos do método de purificação serão exemplificados a seguir.

[0076] Uma resina de troca iônica purificada com boa enfermidade de

25 / 56 adsorção para trombomodulina é selecionada, e purificação por cromatografia de troca iônica é realizada. Um exemplo particularmente preferido é um método compreendendo o uso de Q-Sepharose Fast Flow equilibrada com um tampão Tris-HCl 0,02 mol/L (pH 7,4) contendo NaCl 0,18 mol/L. Após lavagem da maneira exigida, a eluição pode ser realizada com um tampão de Tris-HCl 0,02 mol/L (pH 7,4) contendo NaCl 0,3 mol/L, por exemplo, para obter trombomodulina como um produto purificado grosseiramente.

[0077] A seguir, por exemplo, uma substância com afinidade específica por trombomodulina pode ser imobilizada em uma resina, e purificação por cromatografia por afinidade pode ser realizada. Exemplos preferidos incluem uso de uma coluna de DIP-trombina-agarose, e uso de uma coluna com anticorpo monoclonal anti-trombomodulina. No caso da coluna DIP-trombina-agarose, a coluna é equilibrada antecipadamente com um tampão de Tris-HCl 20 mmol/L (pH 7,4) contendo NaCl 100 mmol/L e cloreto de cálcio 0,5 mmol/L, e o produto grosseiramente purificado anteriormente mencionado pode ser então preenchido na coluna, lavado da maneira exigida, e a seguir eluído com, por exemplo, um tampão de Tris-HCl 20 mmol/L (pH 7,4) contendo NaCl 1,0 mol/L e cloreto de cálcio 0,5 mmol/L para obter trombomodulina como um produto purificado. No caso da coluna de anticorpo monoclonal anti-trombomodulina, um exemplo do método compreende: colocar uma solução de anticorpo monoclonal anti- trombomodulina em contato com um tampão NaHCO3 0,1 mol/L (pH 8,3), contendo NaCl 0,5 mol/L com Sepharose 4FF (GE Health Care Biosciences) ativado com CNBr antecipadamente para obter a resina Sepharose 4FF acoplada com os anticorpos monoclonais anti-trombomodulina, equilibrando a resina preenchida antecipadamente em uma coluna com, por exemplo, um tampão fosfato 20 mmol/L (pH 7,3) contendo NaCl 0,3 mol/L, lavando a resina da maneira exigida, e realizando a seguir eluição com, por exemplo, um tampão de glicina-HCl 100 mmol/L (pH 3,0) contendo NaCl 0,3 mol/L.

26 / 56 Um efluente pode ser neutralizado com um tampão apropriado para obter um produto, como um produto purificado.

[0078] Subsequentemente, o produto purificado obtido é ajustado em pH 3,5, e a seguir é carregado em um trocador de cátion, preferivelmente SP- Sepharose FF (GE Health Care Biosciences) como um trocador de cátions forte, equilibrado com um tampão glicina-HCl 100 mmol/L (pH 3,5) contendo NaCl 0,3 mol/L, e a lavagem é realizada com o mesmo tampão para obter uma fração não adsortiva. A fração resultante é neutralizada com um tampão apropriado para obter um produto altamente purificado. Este produto é preferivelmente concentrado por ultrafiltração.

[0079] Adicionalmente, também é preferível trocar o tampão por filtração em gel. Por exemplo, um produto altamente purificado, concentrado por ultrafiltração pode ser preenchido em uma coluna Sephacryl S-300 ou coluna S-200, equilibrado com um tampão fosfato 20 mmol/L (pH 7,3) contendo NaCl 50 mmol/L, e a seguir desenvolvido por fracionamento com um tampão fosfato de 20 mmol/L (pH 7,3) contendo NaCl 50 mmol/L. A atividade para promover a ativação de proteína C por trombina pode ser confirmada para coletar uma fração ativa, e obter assim um produto altamente purificado com tampão alterado. A fim de melhorar a segurança, um produto altamente purificado, obtido da maneira descrita anteriormente, é preferivelmente filtrado por meio de um filtro apropriado para eliminar vírus tal como Planova 15N (Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), e a seguir o produto resultante pode ser concentrado por ultrafiltração em uma concentração desejada. Finalmente, o produto é preferivelmente filtrado por meio de uma membrana de filtração asséptica.

[0080] Em relação a uma modalidade, como a "neuropatia periférica induzida por um agente antitumor maligno", uma neuropatia periférica induzida por administração de um agente antitumor maligno como este, da maneira exemplificada anteriormente, a um paciente humano com câncer

27 / 56 pode ser exemplificada. Nesta especificação, essa também pode ser denominada "neuropatia periférica induzida por quimioterapia".

[0081] Em relação a uma modalidade, como o "agente antitumor maligno", um fármaco que exibe certa utilidade clínica em um paciente com tumor maligno, tal como supressão de crescimento ou metástase de lesão de tumor maligno, prolongamento da vida, e controle de sintomas, pode ser exemplificado. Especificamente, oxaliplatina pode ser exemplificada. Em relação a uma modalidade, como a neuropatia periférica induzida por um agente antitumor maligno, neuropatias periféricas induzidas por oxaliplatina podem ser exemplificadas.

[0082] Oxaliplatina é um agente antitumor maligno que exibe o metabolismo de ácidos nucleicos, e é classificado em agente de platina. Oxaliplatina é o ingrediente ativo de ELPLAT (marca registrada), que foi aprovado como um produto farmacêutico no Japão. Uma neuropatia periférica induzida por um agente antitumor maligno, em um paciente humano com câncer que recebe um tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, pode ser denominada neuropatia periférica induzida por oxaliplatina.

[0083] Em relação a uma modalidade, como a neuropatia periférica, dormência das extremidades, dor das extremidades, redução de reflexão profunda do tendão, redução de força muscular, alodinia, hiperalgesia e disfunção motora podem ser exemplificadas. Exemplos dos sintomas de neuropatia periférica também podem incluir dores tais como dor intensa e dor ardente, dormência das extremidades, sensação anormal tal como sensação de ardência, hiperestesia tal como hipersensibilidade ao frio, disestesia tal como anestesia, paralisia e desconforto sensorial, ataxia sensorial e redução de força muscular. A neuropatia periférica pode ser classificada aproximadamente em três tipos, neuropatia periférica motora, neuropatia periférica sensorial e neuropatia periférica autônoma, mas não é limitada a estas. Exemplos de neuropatia periférica motora incluem inflamação ou degeneração de nervos

28 / 56 motores periféricos, exemplos de neuropatia periférica sensorial incluem inflamação ou degeneração de nervos sensoriais periféricos, e exemplos de neuropatia periférica autônoma incluem inflamação ou degeneração de nervos autônomos periféricos.

[0084] Exemplos do método para avaliar efeitos para suprimir o início e/ou aliviar enfermidades de neuropatia periférica induzida por um agente antitumor maligno incluem a avaliação por um profissional médico, com base nos Critérios de Terminologia Comum para Eventos Adversos Versão 4.0, tradução japonesa JCOG (daqui por diante também abreviado como NCI- CTCAE), e avaliação por um paciente com base na Avaliação Funcional da Terapia do Câncer / Grupo de Oncologia Ginecológica - Neurotoxicidade (Version 4) (daqui por diante também abreviado como FACT/GOG-NTX-12).

[0085] De acordo com NCI-CTCAE, um profissional médico pode confirmar efeitos em neuropatia periférica motora ou neuropatia periférica sensorial, e de acordo com FACT/GOG-NTX-12, um paciente pode confirmar efeitos em neuropatia periférica induzida por oxaliplatina. De acordo com NCI-CTCAE, neuropatia periférica motora ou neuropatia periférica sensorial pode ser avaliada em 6 graus, isto é, nenhuma neuropatia, grau 1 (nenhum sintoma), grau 2 (sintomas moderados), grau 3 (sintomas graves), grau 4 (sintomas com risco de vida), e grau 5 (morte). De acordo com FACT/GOG- NTX-12, um paciente fornece pontuações de avaliação para itens de avaliação (12 itens) selecionado de 0 (não aplicado de todo), 1 (ligeiramente aplicado), 2 (um pouco aplicado), 3 (consideravelmente aplicado), e 4 (muito aplicado), e grau do efeito pode ser avaliado com as pontuações de avaliação (= 48 – Nota de avaliação fornecida pelo paciente), dos quais número maior significa efeito maior.

[0086] Em relação a uma modalidade, embora o paciente humano com câncer não seja particularmente limitado, contanto que o paciente seja um paciente humano com câncer para quem um tratamento com oxaliplatina é

29 / 56 necessário, pacientes humanos com câncer que sofrem de câncer de intestino grosso, câncer pancreático, ou câncer gástrico podem ser exemplificados. Em relação a uma outra modalidade, pacientes humanos com câncer que sofrem de câncer de intestino grosso ou câncer gástrico podem ser exemplificados. Em relação a uma outra modalidade, pacientes humanos com câncer que sofrem de câncer de intestino grosso podem ser exemplificados. Exemplos do câncer de intestino grosso incluem câncer retal e câncer de cólon.

[0087] Em relação a uma modalidade, trombomodulina também pode ser usada em uma quimoterapia adjuvante visando na supressão de recorrência pós-operatória. Também pode ser administrada a um paciente humano com câncer com câncer recorrente ou câncer metastático.

[0088] De acordo com uma modalidade, o ciclo do tratamento com um agente antitumor maligno é uma unidade de um tratamento com o agente antitumor maligno, consistindo em uma combinação de um tratamento com o agente antitumor maligno por um certo período, e retirada do agente por um certo período. O dia em que é iniciada a administração do agente antitumor maligno (oxaliplatina) é definido como o primeiro dia de um ciclo.

[0089] De acordo com uma modalidade, exemplos do tratamento com um agente antitumor maligno, que consiste na repetição de um único ciclo compreendendo a administração intravenosa de oxaliplatina a um paciente humano com câncer e após a retirada do fármaco, incluem um tratamento que consiste em repetição de um único ciclo compreendendo 1 a 6 vezes de administração intravenosa de oxaliplatina a um paciente humano com câncer e após a retirada do fármaco por pelo menos 6 dias. Oxaliplatina pode ser usada, por exemplo, de acordo com as instruções descritas na bula de ELPLAT (marca registrada) ou no rótulo de Eloxatin.

[0090] Como o número de vezes da administração de oxaliplatina em 1 ciclo do tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, 1 a 6 vezes pode ser exemplificada, 1 a 3 vezes pode ser exemplificada em relação a uma outra

30 / 56 modalidade, e 1 vez pode ser exemplificada em relação ainda a uma outra modalidade. Quando o agente antitumor maligno é administrado duas vezes ou mais em 1 ciclo, uma vez de administração em duas semanas pode ser exemplificada, uma vez de administração em uma semana pode ser exemplificada em relação a uma outra modalidade, e administração diária pode ser exemplificada em relação ainda a uma outra modalidade. O agente antitumor maligno é administrado uma vez ao dia.

[0091] Quanto ao período de retirada do fármaco do agente antitumor maligno (oxaliplatina) em um ciclo do tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, pelo menos 6 dias podem ser exemplificados, pelo menos 13 dias podem ser exemplificados em relação a uma outra modalidade, e pelo menos 20 dias podem ser exemplificados em relação ainda a uma outra modalidade. Adicionalmente, 6 a 24 dias podem ser exemplificados em relação ainda a uma outra modalidade, 13 a 24 dias podem ser exemplificados em relação ainda a uma outra modalidade, e 13 a 20 dias podem ser exemplificados em relação ainda a uma outra modalidade. Exemplos adicionais incluem 13 dias em relação ainda a uma outra modalidade, e 20 dias em relação ainda a uma outra modalidade. Quando reações colaterais graves são induzidas por administração de oxaliplatina, a retirada de fármaco de oxaliplatina de 3 a 6 semanas pode ser usada por um certo período de tempo, e uma configuração como esta também constitui uma modalidade.

[0092] Como o número de vezes de repetição do único ciclo no tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, 1 a 24 vezes pode ser exemplificado, 1 a 18 vezes pode ser exemplificado em relação a uma outra modalidade, e 1 a 12 vezes pode ser exemplificado em relação ainda a uma outra modalidade. Exemplos adicionais incluem 1 a 6 vezes em relação ainda a uma outra modalidade. Exemplos ainda adicionais incluem pelo menos 6 vezes em relação ainda a uma outra modalidade. Exemplos ainda adicionais incluem pelo menos 8 vezes em relação ainda a uma outra modalidade.

31 / 56 Exemplos ainda adicionais incluem pelo menos 12 vezes em relação ainda a uma outra modalidade. Exemplos ainda adicionais incluem pelo menos 18 vezes em relação ainda a uma outra modalidade. Exemplos ainda adicionais incluem pelo menos 24 vezes em relação ainda a uma outra modalidade.

[0093] Como a dose de oxaliplatina por administração única que inclui 50 a 150 mg/m2 de área de superfície corporal de paciente humano com câncer pode ser exemplificada, 80 a 140 mg/m2 pode ser exemplificada em relação a uma outra modalidade, e 80 a 90 mg/m2 pode ser exemplificada em relação ainda a uma outra modalidade. Exemplos adicionais incluem 90 a 110 mg/m2 em relação ainda a uma outra modalidade, 120 a 140 mg/m2 em relação ainda a uma outra modalidade, 85 mg/m2 em relação ainda a uma outra modalidade, 100 mg/m2 em relação ainda a uma outra modalidade, e 130 mg/m2 em relação ainda a uma outra modalidade.

[0094] A área de superfície corporal de um paciente humano com câncer pode ser obtida a partir da altura e peso corporal do paciente humano com câncer. A área de superfície corporal pode ser calculada apropriadamente de acordo com o conhecimento técnico comum, e pode ser calculada, por exemplo, de acordo com a equação de DuBois a seguir (Dubois D. e Dubois E.F.: Arch. Intern. Med., 17, 863-871, 1916). Área de superfície corporal (m2) = [Altura corporal (cm)]0,725 x [Peso corporal (kg)]0,425 x 0,007184

[0095] Embora a taxa de administração intravenosa de oxaliplatina não seja particularmente limitada, contanto que seja a taxa de infusão de gotejamento usual, esta é, por exemplo, taxa na qual a quantidade necessária de oxaliplatina é administrada em 3 horas, ou uma taxa na qual a quantidade exigida de oxaliplatina é administrada em 2 horas em relação a uma outra modalidade.

[0096] Exemplos do tratamento antitumor maligno com oxaliplatina incluem os seguintes (a) até (f).

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[0097] (a) Um único ciclo que consiste em administração intravenosa de 80 a 90 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina uma vez ao dia, em um paciente humano com câncer, e retirada do fármaco por pelo menos 13 dias é repetido.

[0098] (b) Um único ciclo que consiste em administração intravenosa de 85 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina uma vez ao dia, em um paciente humano com câncer, e retirada do fármaco por pelo menos 13 dias é repetido.

[0099] (c) Um único ciclo que consiste em administração intravenosa de 90 a 110 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina uma vez ao dia, em um paciente humano com câncer, e retirada do fármaco por pelo menos 13 dias é repetido.

[00100] (d) Um único ciclo que consiste em administração intravenosa de 100 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina uma vez ao dia, em um paciente humano com câncer, e retirada do fármaco por pelo menos 20 dias é repetido.

[00101] (e) Um único ciclo que consiste em administração intravenosa de 120 a 140 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina uma vez ao dia, em um paciente humano com câncer, e retirada do fármaco por pelo menos 20 dias é repetido.

[00102] (f) Um único ciclo que consiste em administração intravenosa de 130 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina uma vez ao dia, em um paciente humano com câncer, e retirada do fármaco por pelo menos 20 dias é repetido.

[00103] De acordo com uma modalidade, oxaliplatina pode ser administrada em combinação com um ou vários tipos de agentes antitumor maligno de diferentes mecanismos de ação. Por exemplo, oxaliplatina pode ser administrada pela terapia FOLFOX. A terapia FOLFOX é uma classe de quimioterapia antitumor maligno que usa oxaliplatina em combinação com

33 / 56 fluorouracil e levofolinato. A terapia FOLFOX é classificada, por exemplo, em FOLFOX2, FOLFOX3, FOLFOX4, FOLFOX6, mFOLFOX6, FOLFOX7, mFOLFOX7 e similares, de acordo com o método de administração. Oxaliplatina também pode ser administrado pela terapia XELOX (terapia CapeOX), terapia FOLFOXIRI, terapia FOLFIRINOX ou terapia SOX. A terapia XELOX é um tratamento antitumor maligno que usa a oxaliplatina em combinação com capecitabina. A terapia FOLFOXIRI ou terapia FOLFIRINOX é um tratamento antitumor maligno que usa oxaliplatina em combinação com cloridrato de irinotecano hidratado, fluorouracil e levofolinato. A terapia SOX é um tratamento antitumor maligno que usa oxaliplatina em combinação com S-1 (formulação combinada de potássio de tegafur, gimeracil e oteracil).

[00104] Exemplos do agente antitumor maligno a ser administrado em combinação com oxaliplatina incluem fluorouracil, capecitabina, formulação de potássio de tegafur-gimeracil-oteracil, irinotecano, bevacizumabe, cetuximabe, panitumumabe e trastuzumabe.

[00105] De acordo com uma modalidade, oxaliplatina pode ser administrada em combinação com um agente antiemético ou um agente antialérgico.

[00106] De acordo com uma modalidade, trombomodulina pode ser administrada intravenosamente no primeiro dia de cada ciclo do agente de tratamento antitumor maligno. Trombomodulina pode ser administrada uma vez em um ciclo.

[00107] De acordo com uma modalidade, trombomodulina pode ser administrada antes do início da administração do agente antitumor maligno. Pode ser administrada também após o início da administração do agente antitumor maligno. Também é possível iniciar simultaneamente as administrações de trombomodulina e do agente antitumor maligno.

[00108] Quando a trombomodulina é administrada antes do início da

34 / 56 administração do agente antitumor maligno, o período desde a administração de trombomodulina até o início da administração do agente antitumor maligno não é particularmente limitado, contanto que os efeitos do agente antitumor maligno para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica possam ser exibidos. Entretanto, trombomodulina pode ser administrada, por exemplo, 9 dias antes do início da administração do agente antitumor maligno ou posteriormente, 7 dias antes do início da administração do agente antitumor maligno ou posteriormente, de acordo com uma outra modalidade, 5 dias antes do início da administração do agente antitumor maligno ou posteriormente, ainda de acordo com uma outra modalidade, 3 dias antes do início da administração do agente antitumor maligno ou posteriormente, ainda de acordo com uma outra modalidade, 1 dia antes do início da administração do agente antitumor maligno ou posteriormente, ainda de acordo com uma outra modalidade, ou 12 horas antes do início da administração do agente antitumor maligno ou posteriormente, ainda de acordo com uma outra modalidade.

[00109] Quando a trombomodulina é administrada após o início da administração do agente antitumor maligno, o período desde o início da administração do agente antitumor maligno até a administração de trombomodulina não é particularmente limitado, contanto que os efeitos do agente antitumor maligno para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica possam ser exibidos. Entretanto, trombomodulina pode ser administrada, por exemplo, 8 dias após o início da administração do agente antitumor maligno, ou anteriormente, 6 dias após o início da administração do agente antitumor maligno, ou anteriormente, de acordo com uma outra modalidade, 4 dias após o início da administração do agente antitumor maligno, ou anteriormente, ainda de acordo com uma outra modalidade, 2 dias após o início da administração do agente antitumor maligno, ou anteriormente, ainda de acordo com uma outra modalidade, 6

35 / 56 horas após o início da administração do agente antitumor maligno, ou anteriormente, ainda de acordo com uma outra modalidade, ou 1 hora após o início da administração do agente antitumor maligno, ou anteriormente, ainda de acordo com uma outra modalidade.

[00110] Em uma modalidade, o medicamento da presente invenção pode conter um carreador. Como o carreador usado na presente invenção, um carreador solúvel em água é preferível e, por exemplo, o medicamento da presente invenção pode ser preparado adicionando sacarose, glicerina, modificador de pH consistindo em um sal inorgânico, ou similares como aditivos. Adicionalmente, se necessário, aminoácidos, sais, carboidratos, agente tensoativos, albumina, gelatina ou similares podem ser adicionados da maneira descrita na publicação não examinada de Patente Japonesa (KOKAI) Nos. 1-6219 e 6-321805, e também é preferível adicionar um conservante. Exemplos preferidos de conservantes incluem ésteres de ácido parabenzóico, e um exemplo particularmente preferido é metil parabenzoato. A quantidade de conservante a ser adicionado é em geral 0,01 a 1,0 % (em termos de % de peso, o mesmo pode se aplicar às descrições a seguir), preferivelmente 0,1 a 0,3 %. O método para adicionar estes aditivos não é particularmente limitado. No caso de preparar um produto liofilizado, exemplos do método incluem, por exemplo, um método para misturar uma solução contendo um agente antitumor maligno e uma solução contendo trombomodulina, e a seguir para adicionar aditivos à mistura, e um método para misturar aditivos com um agente antitumor maligno dissolvido em água, água para injeção, ou um tampão apropriado previamente, adicionar uma solução contendo trombomodulina na mistura, misturar a mistura resultante para preparar uma solução, e liofilizar a solução, de maneiras tais como aquelas comumente empregadas. Como uma modalidade, o medicamento da presente invenção pode ser provido na forma de uma injeção, ou na forma de uma preparação liofilizada a ser dissolvida mediante uso.

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[00111] Exemplos do método de preparação do medicamento incluem um método de preencher uma solução contendo 0,05 a 15 mg/mL, preferivelmente 0,1 a 5 mg/mL, de trombomodulina, e os aditivos anteriormente mencionados em água, água para injeção, ou um tampão apropriado em uma ampola ou frasco em um volume de, por exemplo, 0,5 a 10 mL, congelar a solução, e secar a solução em pressão reduzida. Uma solução como esta, por si mesma, pode ser preparada como uma preparação de solução aquosa para injeção.

[00112] Embora o método de administração do medicamento da presente invenção não seja particularmente limitado, contanto que os efeitos do agente antitumor maligno para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica possam ser exibidos, em relação a uma modalidade, a administração intravenosa pode ser exemplificada.

[00113] Exemplos de método para a administração intravenosa incluem um método de administrar uma dose desejada do medicamento de uma só vez, e administração intravenosa por infusão de gotejamento.

[00114] O método de administrar uma dose desejada do medicamento de uma só vez (administração em bolo intravenosa) é preferido, a partir do ponto de vista que o método exige apenas um período curto para administração. Quando o medicamento é administrado de uma só vez, um período exigido para administração usando uma seringa injetável em geral pode variar. Em geral, o período de tempo exigido para a administração é, por exemplo, 5 minutos ou menos, preferivelmente 3 minutos ou menos, mais preferivelmente 2 minutos ou menos, ainda mais preferivelmente 1 minuto ou menos, particularmente preferível 30 segundos ou menos, embora dependa de um volume a ser administrado. Embora o tempo mínimo de administração não seja particularmente limitado, o período é preferivelmente 1 segundo ou mais, mais preferivelmente 5 segundos ou mais, ainda mais preferivelmente 10 segundos ou mais. A dose não é particularmente limitada contanto que a dose

37 / 56 esteja na faixa de dose preferida anteriormente mencionada. A administração intravenosa por infusão de gotejamento também é preferida a partir de um ponto de vista de que o nível de sangue de trombomodulina pode ser facilmente mantido constante.

[00115] Em relação a uma modalidade, a dose diária de trombomodulina é, por exemplo, 0,06 mg/kg, embora possa variar dependendo da idade, peso corporal dos pacientes, gravidade da doença, via de administração e similares.

[00116] Da maneira descrita no desenho incluído na bula de Recomodulin (marca registrada), "Farmacocinética", 1. (2), 0,06 mg/kg de Trombomodulina alfa (recombinação genética) corresponde a 380 U/kg. Isto é, "0,06 mg/kg" de trombomodulina pode ser lido como "380 U/kg".

[00117] Em uma modalidade, o medicamento da presente invenção exibe os efeitos de aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por um agente antitumor maligno. Aliviar enfermidades significa reduzir a gravidade de enfermidades que são em geral produzidas quando oxaliplatina é administrada, por exemplo, paralisia sensorial, dor de picada e desconforto das extremidades, bem como dor das extremidades sentida quando expostas à baixa temperatura. Suprimir o início significa suprimir o nível de uma neuropatia periférica, que é em geral produzida quando oxaliplatina é administrada, por exemplo, neuropatia periférica motora e neuropatia periférica sensorial, para ser um nível certo ou menor (por exemplo, grau 1 ou menor, de acordo com NCI-CTCAE). Dores das extremidades podem ser avaliadas de acordo com a escala de avaliação numérica (daqui por diante, pode ser abreviada como NRS). De acordo com NRS, a intensidade da dor pode ser avaliada em 11 estágios a partir do estágio 0, que significa completamente sem dor, até o estágio 10, que significa a dor mais forte esperada.

[00118] De acordo com uma modalidade, quando o tratamento

38 / 56 antitumor maligno com oxaliplatina é realizado com um ou mais ciclos, o medicamento da presente invenção pode suprimir a redução de dose total de oxaliplatina a ser eventualmente administrada, comparada com a dose total (A), que significa o total das doses de oxaliplatina de todos os ciclos a serem administrados em geral a um paciente humano com câncer. O grau de suprimir a redução da dose total de oxaliplatina não é particularmente limitado, contanto que a diferença entre A e a dose total de oxaliplatina a ser administrada em um ou mais ciclos do tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, usando administração do medicamento da presente invenção (B), seja menor que a diferença entre A e a dose total de oxaliplatina a ser administrada em um ou mais ciclos do tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, sem usar administração do medicamento da presente invenção (C). Em relação à supressão de redução da dose total de oxaliplatina, a razão de B para A como doses totais médias é, por exemplo, pelo menos 70 %, pelo menos 80 % em relação a uma outra modalidade, pelo menos 85 % em relação ainda a uma outra modalidade, pelo menos 90 % em relação ainda a uma outra modalidade, ou pelo menos 95 % em relação ainda a uma outra modalidade. Em relação à supressão de redução da dose total de oxaliplatina, a razão de B para C como doses totais médias é, por exemplo, pelo menos 101 %, pelo menos 102 % em relação a uma outra modalidade, pelo menos 103 % em relação ainda a uma outra modalidade, pelo menos 104 % em relação ainda a uma outra modalidade, pelo menos 105 % em relação ainda a uma outra modalidade, pelo menos 110 % em relação ainda a uma outra modalidade, pelo menos 115 % em relação ainda a uma outra modalidade, ou pelo menos 120 % em relação ainda a uma outra modalidade.

[00119] De acordo com uma modalidade, o medicamento da presente invenção pode ser usado como um medicamento seguro que provê menos reações colaterais.

[00120] De acordo com uma modalidade, o medicamento da presente

39 / 56 invenção pode ser administrado junto com um ou mais tipos de outros medicamentos usados para tratar neuropatias periféricas causadas por agentes antitumor maligno, por exemplo, um, ou dois ou mais tipos de medicamentos selecionados de medicamentos ortodoxos chineses, esteroides, antidepressivos, antiepiléticos, opioides e similares, ou pode ser preparado como uma mistura com tais um, ou dois ou mais tipos de medicamentos, da maneira mencionada anteriormente, e administrado. Adicionalmente, trombomodulina pode ser administrada com a realização de fisioterapia, terapias complementares tais como massagem e acupuntura, e similares. Exemplos

[00121] Daqui por diante, a presente invenção será explicada em mais detalhes com referência aos exemplos da presente invenção, exemplo comparativo, e exemplos de preparação. Entretanto, a presente invenção não é limitada a estes exemplos de maneira alguma. [Explicação de Listagem de Sequência]

[00122] SEQ ID NO: 1: Sequência de aminoácido codificada pelo gene usado na produção de ART-123 SEQ ID NO: 2: Sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3: Sequência de aminoácido codificada pelo gene usado na produção de ART-123M SEQ ID NO: 4: Sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5: DNA sintético para mutação usado para realizar mutagênese sítio-direcionada

[00123] A trombomodulina para a presente invenção, usada nos exemplos e exemplos comparativos, foi preparada de acordo com o método anteriormente mencionado de Yamamoto et al. (o método descrito na publicação não examinada de Patente Japonesa (KOKAI) No. 64-6219).

40 / 56 Exemplos de preparação desta são descritos a seguir. A segurança das trombomodulinas obtidas nestes exemplos de preparação foi confirmada por testes de administração venosa única e repetitiva usando ratos e macacos, teste de reprodução de camundongo, teste de irritação local, teste de segurança farmacológica, teste de inativação de vírus e similares. [Exemplo de preparação 1] <Obtendo trombomodulina>

[00124] Um produto altamente purificado foi obtido pelo método anteriormente mencionado. Especificamente, células de ovário de hamster chinês (CHO) foram transfectadas com um DNA que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 (que consistiu especificamente na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2). A partir da cultura das células transformantes anteriores, um produto altamente purificado foi obtido coletando uma fração ativa com um tampão fosfato 20 mmol/L (pH 7,3) contendo NaCl 50 mmol/L, de acordo com o método de purificação convencional anteriormente mencionado. O produto foi concentrado adicionalmente por ultrafiltração para obter uma solução de trombomodulina (ART-123) com uma concentração de 11,2 mg/mL. <Preparação de solução aditiva>

[00125] Cloridrato de arginina (480 g, Ajinomoto) foi pesado, colocado em um vaso de aço inoxidável com volume de 10 L, adicionado com água para injeção (5 L), e dissolvido. A solução foi ajustada em pH 7,3 adicionando uma solução de hidróxido de sódio 1 mol/L. <Preparação e preenchimento de solução de fármaco >

[00126] O volume total da solução aditiva obtido anteriormente foi colocado em um vaso de aço inoxidável de 20 L, e adicionado com a solução de ART-123 obtida anteriormente (2.398 mL, que corresponde a 26,88 g de proteína trombomodulina solúvel, adicionada em uma quantidade em excesso de 12 %), e a mistura foi agitada. A mistura foi adicionada mais uma vez com

41 / 56 água para injeção para obter um volume total de 12 L, e a mistura se tornou uniforme por agitação. Esta solução de fármaco foi submetida à esterilização por filtração usando um filtro com um diâmetro de poro de 0,22 µm (MCGL10S, fabricado por Millipore). O filtrado foi preenchido em frascos, em um volume de 1 mL cada, e os frascos foram fechados pela metade com rolhas de borracha. <Liofilização>

[00127] Uma etapa de liofilização foi realizada nas enfermidades a seguir, na ordem de liofilização → preencher com nitrogênio → fechar completamente com rolha de borracha → rosquear a tampa para obter uma preparação contendo ART-123 que contém 2 mg de trombomodulina solúvel e 40 mg de cloridrato de arginina em um frasco. <Enfermidades de liofilização >

[00128] Resfriamento preliminar (a partir da temperatura ambiente até 15 °C durante 15 minutos) → refrigeração principal (de 15 °C a -45 °C durante 2 horas) → retenção (-45 °C por 2 horas) → início da aspiração (-45 °C por 18 horas) → aumento da temperatura (de -45 °C a 25 °C durante 20 horas) → retenção (25 °C por 15 horas) → aumento da temperatura (de 25 °C a 45 °C durante 1 hora) → retenção (45 °C por 5 horas) → temperatura ambiente (de 45 °C a 25 °C durante 2 horas) → recuperação de pressão e preenchimento com nitrogênio (até -100 mmHg) → fechamento completo com rolha → rosqueamento da tampa [Exemplo de preparação 2]

[00129] Células de ovário de hamster chinês (CHO) são transfectadas com um DNA que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (que consiste especificamente da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 4), uma solução de trombomodulina purificada a partir de uma cultura das células transformantes anteriores (daqui por diante também abreviada como ART- 123M na especificação) pelo método de purificação convencional

42 / 56 anteriormente mencionado é obtida, e uma preparação liofilizada de ART- 123M é obtida da mesma maneira que aquela descrita anteriormente. [Exemplo 1] Efeito de administração única de ART-123 em um ciclo, em neuropatia periférica induzida por oxaliplatina em paciente humano com câncer <Método de teste>

[00130] Um teste controlado com placebo foi realizado, a fim de examinar a eficiência de ART-123 no início de neuropatia periférica induzida por oxaliplatina, no momento da realização da quimioterapia adjuvante pós- operatória, usando oxaliplatina em pacientes com câncer de cólon de estágio patológico II ou III após operação de cura radical (operação R0), e segurança da mesma.

[00131] A quimioterapia adjuvante pós-operatória usando oxaliplatina foi realizada de acordo com o método mFOLFOX6 (administração é repetida pela repetição de um único ciclo, que consiste em administração intravenosa de 85 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina por infusão de gotejamento uma vez ao dia por 2 horas, e o fármaco foi retirado por pelo menos 13 dias), e o ciclo foi repetido 12 vezes. Os sujeitos do teste foram divididos aleatoriamente em três grupos, grupo placebo, grupo de administração única de ART-123, e grupo de administração tripla de ART-

123. No grupo placebo, um placebo foi administrado no primeiro, segundo e terceiro dias de cada ciclo. No grupo de administração única de ART-123, 0,06 mg/kg de ART-123 foi administrado no primeiro dia de cada ciclo, e o placebo foi administrado no segundo e terceiro dias de cada ciclo. Em o grupo de administração tripla de ART-123, 0,06 mg/kg de ART-123 foi administrado no primeiro, segundo e terceiro dias de cada ciclo. No primeiro dia, a administração de ART-123 como o fármaco teste ou o placebo por administração intravenosa por infusão de gotejamento iniciou 2 horas a 30 minutos antes a administração de oxaliplatina, continuou por 30 minutos, e

43 / 56 finalizou antes do início da administração com oxaliplatina. No segundo e terceiro dias, a administração de ART-123 ou o placebo iniciou no mesmo fuso horário como aquele do primeiro, tanto quanto possível, e a administração intravenosa por infusão de gotejamento foi realizada durante 30 minutos.

[00132] Durante o período de administração, o uso combinado de outros fármacos de teste, Recomodulin (marca registrada), agentes antitumor maligno sem ser o fármaco usado na quimioterapia adjuvante pós-operatória especificado neste teste, e agentes trombolíticos (t-PA preparação, uroquinase, etc.) foi inibido. Adicionalmente, com exceção para um período durante o qual a neuropatia periférica motora ou neuropatia periférica sensorial é avaliada para estar em grau 2 ou grau maior por um profissional médico responsável pelo teste, ou um profissional médico designado para o teste de acordo com Critérios de Terminologia Comum para Eventos Adversos Versão 4.0, tradução japonesa JCOG (daqui por diante abreviado como NCI-CTCAE), o uso combinado de fármacos considerados por afetar neuropatias periféricas foi inibido.

[00133] Para a avaliação de neuropatias periféricas por pacientes, Avaliação Funcional da Terapia do Câncer / Grupo de Oncologia Ginecológica - Neurotoxicidade (Versão 4) (daqui por diante também abreviado como FACT/GOG-NTX-12) e NRS (dor) foram usados, e para a avaliação por profissionais médicos, critérios de neuropatia periférica motora e neuropatia periférica sensorial definidos em NCI-CTCAE foram usados. <Resultados>

1. Efeito para aliviar enfermidades de neuropatia periférica

[00134] Mudanças nas médias dos mínimos quadrados avaliados a partir do início da administração do fármaco teste até a finalização do teste, de acordo com FACT/GOG-NTX-12 para os grupos, e diferenças destas entre o grupo placebo e o grupo de administração única de ART-123, ou grupo de

44 / 56 administração tripla de ART-123, são mostradas na tabela 1. Valores obtidos subtraíndo pontuações de avaliação fornecidas pelos pacientes de 48 foram usados como pontuações de avaliação. As pontuações obtidas após 12 ciclos para ambos os grupos de administração de ART-123 foram maiores que aquelas do grupo placebo e, assim, ART-123 reduziu as enfermidades de neuropatias periféricas. Adicionalmente, o grupo de administração única de ART-123 mostrou maior efeito para aliviar enfermidades de neuropatias periféricas comparado com o grupo de administração tripla de ART-123.

[00135] Quando dores das extremidades foram avaliadas de acordo com NRS, o efeito analgésico observado no grupo de administração única de ART-123 foi maior que aquele observado no grupo de administração tripla de ART-123. [Tabela 1] Enfermidade de neuropatias periféricas avaliadas por pacientes FACT/GOG-NTX-12 Diferença na média do mínimo quadrado Grupo placebo Grupo de Grupo de Grupo de Grupo de (N=28) administração administração administração administração única de ART- tripla de ART- única de ART-12 tripla de ART-12 123 (N=27) 123 (N=24) vs grupo Placebo vs grupo Placebo Média do Média do Média do Média do Média do mínimo mínimo mínimo mínimo mínimo quadrado (erro quadrado (erro quadrado (erro quadrado (erro quadrado (erro padrão) padrão) padrão) padrão) padrão) [intervalo de [intervalo de [intervalo de [intervalo de [intervalo de confiança de 95 confiança de 95 confiança de 95 confiança de 95 confiança de 95 %] %] %] %] %] Linha de base 46,4 (0,4) 46,7 (0,5) 46,3 (0,5) 0,3 (0,6) -0,1 (0,7) [45,5, 47,3] [45,8, 47,6] [45,4, 47,3] [-1,0, 1,6] [-1,4, 1,3] Ciclo 1 42,3 (0,9) 43,0 (0,9) 43,9 (1,0) 0,8 (1,3) 1,6 (1,3) [40,5, 44,0] [41,2, 44,8] [42,0, 45,8] [-1,8, 3,3] [-1,0, 4,2] Ciclo 2 38,0 (1,4) 41,9 (1,5) 41,7 (1,5) 3,8 (2,0) 3,6 (2,1) [35,2, 40,9] [39,0, 44,7] [38,6, 44,7] [-0,3, 7,9] [-0,6, 7,8] Ciclo 3 36,2 (1,5) 40,0 (1,5) 40,6 (1,6) 3,8 (2,2) 4,4 (2,2) [33,2, 39,2] [36,9, 43,0] [37,4, 43,9] [-0,5, 8,1] [0,0, 8,8] Ciclo 4 34,6 (1,7) 38,7 (1,7) 40,2 (1,8) 4,2 (2,4) 5,6 (2,5) [31,2, 38,0] [35,3, 42,1] [36,5, 43,8] [-0,6, 9,0] [0,6, 10,6] Ciclo 5 33,9 (1,8) 37,9 (1,8) 39,2 (1,9) 4,0 (2,5) 5,3 (2,6) [30,3, 37,5] [34,3, 41,5] [35,4, 43,0] [-1,0, 9,0] [0,1, 10,5] Ciclo 6 36,1 (1,5) 39,1 (1,5) 38,3 (1,6) 3,0 (2,1) 2,2 (2,2) [33,1, 39,1] [36,1, 42,1] [35,1, 41,5] [-1,3, 7,2] [-2,2, 6,6] Ciclo 7 34,5 (1,6) 38,6 (1,6) 38,3 (1,6) 4,1 (2,2) 3,8 (2,3) [31,4, 37,6] [35,5, 41,7] [35,0, 41,6] [-0,3, 8,5] [-0,7, 8,3] Ciclo 8 34,1 (1,8) 37,6 (1,8) 37,7 (1,9) 3,5 (2,5) 3,6 (2,6) [30,6, 37,6] [34,1, 41,1] [34,0, 41,4] [-1,4, 8,5] [-1,5, 8,7] Ciclo 9 31,9 (1,8) 36,9 (1,8) 36,8 (1,9) 5,1 (2,6) 4,9 (2,6) [28,2, 35,5] [33,3, 40,6] [33,0, 40,6] [-0,1, 10,2] [-0,4, 10,2]

45 / 56 Ciclo 10 31,1 (1,8) 36,7 (1,8) 36,6 (1,9) 5,6 (2,6) 5,5 (2,6) [27,5, 34,7] [33,1, 40,3] [32,8, 40,4] [0,5,10,7] [0,2,10,7] Ciclo 11 29,1 (1,9) 36,8 (1,9) 33,3 (2,0) 7,7 (2,7) 4,2 (2,8) [25,3, 33,0] [33,0, 40,7] [29,3, 37,3] [2,3, 13,2] [-1,3, 9,7] Ciclo 12 28,9 (1,9) 36,3 (1,9) 32,3 (2,0) 7,3 (2,7) 3,4 (2,8) [25,0, 32,8] [32,4, 40,1] [28,4, 36,3] [1,9, 12,8] [-2,1, 9,0] Após ciclo 12 30,4, (2,1) 35,4, (2,0) 34,1 (2,1) 5,0 (2,9) 3,7 (3,0) [26,3, 34,5] [31,3, 39,5] [29,9, 38,4] [-0,8, 10,8] [-2,2, 9,6]

2. Efeito para suprimir o início de neuropatia periférica (neuropatia periférica sensorial)

[00136] Razões de observação de grau cumulativo 2 ou grau maior (razões de casos que mostraram a neuropatia do grau 2 ou grau maior pelo menos uma vez a cada ciclo) dos grupos de administração, avaliadas de acordo com NCI-CTCAE (neuropatia periférica sensorial), no período desde o início da administração do fármaco teste até a finalização do teste, e diferenças destas entre o grupo placebo e o grupo de administração única ou grupo de administração tripla de ART-123 são mostradas na tabela 2. No momento do ciclo 12, ambas as razões de observação de grau cumulativo 2 ou grau maior dos grupos de administração de ART-123 foram menores que aquelas do grupo placebo e, assim, ART-123 suprimiu o início da neuropatia periférica. Adicionalmente, maior efeito de suprimir o início da neuropatia periférica foi observado para o grupo de administração única de ART-123, comparado ao grupo de administração tripla de ART-123. [Tabela 2] Enfermidade de neuropatia periférica (neuropatia periférica sensorial) avaliada por profissionais médicos NCI-CTCAE (neuropatia periférica sensorial) Grupo placebo Grupo de administração única de Grupo de administração tripla de (N=28) ART-123 (N=27) ART-123 (N=24) Sem Razão Sem Razão cumulativa de grau 2 Sem Razão cumulativa de grau 2 sintoma cumulati sintoma ou grau maior sintoma ou grau maior ou grau va de ou grau 1 ou grau 1 grau 2 ou 1 grau maior

46 / 56 n(%) n(%) n(%) n(%) Diferenç Valor de n(%) n(%) Diferenç Valor de a com P a com P relação relação ao grupo ao grupo placebo placebo [interval [interval o de o de confianç confianç a de 95 a de 95 %] %] Linha de 28 0 (0,0) 27 0 (0,0) - - 24 0 (0,0) - - base (100,0) (100,0) (100,0) Ciclo 1 27 (96,4) 1 (3,6) 27 0 (0,0) -3,6 (- 1,0000 24 0 (0,0) -3,6 (- 1,0000 (100,0) 29,4, (100,0) 30,6, 22,5) 23,9) Ciclo 2 26 (92,9) 2 (7,1) 27 0 (0,0) -7,1 (- 0,4909 24 0 (0,0) -7,1 (- ,04932 (100,0) 32,8, (100,0) 33,9, 19,0) 20,4) Ciclo 3 25 (89,3) 3 (10,7) 27 0 (0,0) -10,7 (- 0,2364 23 (95,8) 1 (4,2) -6,5 (- 0,6146 (100,0) 36,1, 33,2, 15,4) 20,9) Ciclo 4 23 (82,1) 5 (17,9) 23 (85,2) 4 (14,8) -3,0 (- 1,0000 22 (91,7) 2 (8,3) -9,5 (- 0,4300 29,4, 35,9, 22,5) 17,8) Ciclo 5 22 (78,6) 6 (21,4) 22 (81,5) 5 (18,5) -2,9 (- 1,0000 22 (91,7) 2 (8,3) -13,1 (- 0,2315 29,4, 39,2, 22,5) 14,2) Ciclo 6 21 (75,0) 7 (25,0) 22 (81,5) 5 (18,5) -6,5 (- 0,7458 21 (87,5) 3 (12,5) -12,5 (- 0,3087 32,8, 38,8, 19,0) 15,0) Ciclo 7 17 (60,7) 11 (39,3) 22 (81,5) 5 (18,5) -20,8 (- 0,1379 20 (83,3) 4 (16,7) -22,6 (- 0,1238 46,0, 47,9, 4,6) 5,2) Ciclo 8 16 (57,1) 12 (42,9) 21 (77,8) 6 (22,2) -20,6 (- 0,1516 19 (79,2) 5 (20,8) -22,0 (- 0,1389 46,0, 47,3, 4,6) 5,8) Ciclo 9 15 (53,6) 13 (46,4) 18 (66,7) 9 (33,3) -13,1 (- 0,4121 18 (75,0) 6 (25,0) -21,4 (- 0,1516 39,3, 46,6, 13,4) 6,2) Ciclo 10 11 (39,3) 17 (60,7) 16 (59,3) 11 (40,7) -20,0 (- 0,1810 16 (66,7) 8 (33,3) -27,4 (- 0,0581 45,3, 52,1, 7,5) 0,3) Ciclo 11 11 (39,3) 17 (60,7) 16 (59,3) 11 (40,7) -20,0 (- 0,1810 13 (54,2) 11 (45,8) -14,9 (- 0,4033 45,3, 41,0, 7,5) 12,9) Ciclo 12 10 (35,7) 18 (64,3) 16 (59,3) 11 (40,7) -23,5 (- 0,1078 13 (54,2) 11 (45,8) -18,5 (- 0,2635 48,4, 44,2, 4,0) 9,4) Após 10 (35,7) 18 (64,3) 15 (55,6) 12 (44,4) -19,8 (- 0,1799 11 (45,8) 13 (54,2) -10,1 (- 0,5735 ciclo 12 45,0, 36,4, 47,8) 17,4)

3. Efeito para suprimir o início de neuropatia periférica (neuropatia periférica motora)

[00137] Razões de observação de grau cumulativo 2 ou grau maior (razões de casos que mostraram a neuropatia do grau 2 ou grau maior pelo

47 / 56 menos uma vez a cada ciclo) dos grupos de administração, avaliadas de acordo com NCI-CTCAE (neuropatia periférica motora), no período desde o início da administração do fármaco teste até a finalização do teste, e diferenças destas entre o grupo placebo e o grupo de administração única ou grupo de administração tripla de ART-123 são mostradas na tabela 3. No momento do ciclo 12, as razões de observação de grau cumulativo 2 ou grau maior de ambos os grupos de administração de ART-123 foram menores que aquelas do grupo placebo e, assim, ART-123 suprimiu o início da neuropatia periférica.

Adicionalmente, maior efeito de suprimir o início da neuropatia periférica foi observado para o grupo de administração única de ART-123, comparado com o grupo de administração tripla de ART-123. [Tabela 3] Enfermidade de neuropatia periférica (neuropatia periférica motora) avaliada por profissionais médicos NCI-CTCAE (neuropatia periférica motora) Grupo placebo Grupo de administração única de Grupo de administração tripla de (N=28) ART-123 (N=27) ART-123 (N=24) Sem Razão Sem Razão cumulativa de grau 2 Sem Razão cumulativa de grau 2 sintoma cumulati sintoma ou grau maior sintoma ou grau maior ou grau va de ou grau 1 ou grau 1 grau 2 ou 1 grau maior n(%) n(%) n(%) n(%) Diferenç Valor de n(%) n(%) Diferenç Valor de a com P a com P relação relação ao grupo ao grupo placebo placebo [interval [interval o de o de confianç confianç a de 95 a de 95 %] %] Linha de 28 0 (0,0) 27 0 (0,0) - - 24 0 (0,0) - - base (100,0) (100,0) (100,0) Ciclo 1 27 (96,4) 1 (3,6) 27 0 (0,0) -3,6 (- 1,0000 24 0 (0,0) -3,6 (- 1,0000 (100,0) 29,4, (100,0) 30,6, 22,5) 23,9) Ciclo 2 26 (92,9) 2 (7,1) 27 0 (0,0) -7,1 (- 0,4909 24 0 (0,0) -7,1 (- ,04932 (100,0) 32,8, (100,0) 33,9, 19,0) 20,4) Ciclo 3 26 (92,9) 2 (7,1) 27 0 (0,0) -7,1 (- 0,4909 24 0 (0,0) -7,1 (- 0,4932 (100,0) 32,8, (100,0) 33,9, 19,0) 20,4) Ciclo 4 25 (89,3) 3 (10,7) 27 0 (0,0) -10,7 (- 0,2364 23 (95,8) 1 (4,2) -6,5 (- 0,6146 (100,0) 36,1, 33,2, 15,4) 20,9)

48 / 56 Ciclo 5 25 (89,3) 3 (10,7) 27 0 (0,0) -10,7 (- 0,2364 23 (95,8) 1 (4,2) -6,5 (- 0,6146 (100,0) 36,1, 33,2, 15,4) 20,9) Ciclo 6 25 (89,3) 3 (10,7) 27 0 (0,0) -10,7 (- 0,2364 23 (95,8) 1 (4,2) -6,5 (- 0,6146 (100,0) 36,1, 33,2, 15,4) 20,9) Ciclo 7 25 (89,3) 3 (10,7) 27 0 (0,0) -10,7 (- 0,2364 23 (95,8) 1 (4,2) -6,5 (- 0,6146 (100,0) 36,1, 33,2, 15,4) 20,9) Ciclo 8 25 (89,3) 3 (10,7) 27 0 (0,0) -10,7 (- 0,2364 23 (95,8) 1 (4,2) -6,5 (- 0,6146 (100,0) 36,1, 33,2, 15,4) 20,9) Ciclo 9 25 (89,3) 3 (10,7) 27 0 (0,0) -10,7 (- 0,2364 23 (95,8) 1 (4,2) -6,5 (- 0,6146 (100,0) 36,1, 33,2, 15,4) 20,9) Ciclo 10 25 (89,3) 3 (10,7) 27 0 (0,0) -10,7 (- 0,2364 23 (95,8) 1 (4,2) -6,5 (- 0,6146 (100,0) 36,1, 33,2, 15,4) 20,9) Ciclo 11 23 5 (17,9) 27 0 (0,0) -17,9 (- 0,0515 23 (95,8) 1 (4,2) -13,7 (- 0,1994 982,1) (100,0) 42,7, 39,6, 8,2) 13,9) Ciclo 12 22 (78,6) 6 (21,4) 27 0 (0,0) -21,4 (- 0,0232 23 (95,8) 1 (4,2) -17,3 (- 0,1072 (100,0) 46,0, 42,9, 4,6) 10,3) Após 21 (75,0) 7 (25,0) 26 (96,3) 1 (3,7) -21,3 (- 0,0511 22 (91,7) 2 (8,3) -16,7 (- 0,1525 ciclo 12 46,0, 42,5, 4,6) 10,8)

4. Efeito supressor da redução de dose total de oxaliplatina

[00138] Doses cumulativas como as doses totais de oxaliplatina, a partir do início da administração do fármaco teste até a finalização do teste, para os grupos de administração são mostradas na tabela 4. As doses cumulativas do grupo de administração única e grupo de administração tripla de ART-123 foram ambas maiores que aquelas do grupo placebo, tanto para o valor médio quanto valor mediano. [Tabela 4] Dose cumulativa de oxaliplatina Grupo placebo Grupo de administração Grupo de administração única de ART-123 tripla de ART-123 Dose cumulativa de oxaliplatina (mg/m2) N 28 27 24 Média (desvio padrão) 719,89 (264,40) 817,51 (182,58) 850,90 (189,41) Mediana 819,07 849,24 920,68 Valores mínimo e 83,7 : 999,7 331,2 : 1.036,6 255,1 : 1.012,3 máximo Primeiro quartil, terceiro 578,18, 905,50 692,06, 952,81 787,00, 980,46 quartil

5. Segurança

[00139] Quanto aos eventos adversos observados no período desde o

49 / 56 início da administração do fármaco teste até a finalização do teste, números e razões dos eventos adversos observados para os grupos de administração, e diferenças das razões entre o grupo placebo e o grupo de administração única, ou grupo de administração tripla de ART-123 são mostradas na tabela 5, as quais são categorizadas de acordo com presença ou ausência de relação com o fármaco teste, gravidade e relação à hemorragia.

Diferenças acentuadas de razões dos eventos adversos observados não foram observadas entre o grupo placebo e tanto o grupo de administração única quanto o grupo de administração tripla de ART-123, independente da presença ou ausência da relação ao fármaco teste, gravidade e relação à hemorragia e, portanto, foi confirmado que o fármaco pode ser administrado de maneira segura. [Tabela 5] Enfermidade dos eventos adversos observados após administração de fármaco teste Grupo placebo Grupo de Grupo de Diferença de Diferença de (N= 28) administração administração razões de razões de única de ART- tripla de ART- eventos adversos eventos adversos 123 (N= 27) 123 (N= 24) observados entre observados entre grupo de grupo de administração administração única de ART- tripla de ART- 123 e grupo 123 e grupo placebo placebo [intervalo de 95 [intervalo de 95 % de confiança] % de confiança] n (%) n (%) n (%) Eventos adversos Eventos 28 (100,0) 27 (100,0) 24 (100,0) - - adversos totais Eventos 0 (0,0) 2 (7,4) 3 (12,5) 7,4 (-19,0, 32,8) 12,5 (-15,0, adversos 38,8) relacionados ao fármaco teste Eventos adversos graves Eventos 2 (7,1) 5 (18,5) 3 (12,5) 11,4 (-15,4, 5,4 (-21,7, 32,1) adversos graves 36,1) totais Eventos 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) - - adversos graves relacionados ao fármaco teste

50 / 56 Eventos adversos graves relacionados à hemorragia Eventos 2 (7,1) 3 (11,1) 6 (25,0) 4,0 (-22,5, 29,4) 17,9 (-9,9, 43,5) adversos relacionados à hemorragia totais Eventos 0 (0,0) 1 (3,7) 2 (8,3) 3,7 (-22,5, 29,4) 8,3 (-19,2, 35,0) adversos relacionados à hemorragia [Exemplo comparativo 1] Efeito de administração única de ART-123 em um ciclo em neuropatia periférica induzida por oxaliplatina no modelo animal

[00140] No caso de neuropatias periféricas induzidas por um agente antitumor maligno, é um problema que as enfermidades das neuropatias periféricas sejam desenvolvidas e agravadas por repetição de administração do agente antitumor maligno, e torna-se difícil continuar o tratamento com o agente antitumor maligno. É importante continuar o tratamento com o agente antitumor maligno aliviando enfermidades e/ou suprimindo o início de neuropatia periférica induzida pelo tratamento com o agente antitumor maligno. A fim de examinar o número de vezes de administração de ART-123 em um ciclo de tratamento com oxaliplatina, com relação ao efeito profilático de ART-123 para neuropatia periférica induzida por oxaliplatina, um sistema de avaliação modelo de neuropatia periférica induzida por oxaliplatina em rato foi construído por administração única do agente antitumor maligno. Usando hiperalgesia (diminuição do limiar de dor por pressão) desenvolvida no pé de rato por administração única intraperitoneal de oxaliplatina como índice de neuropatia periférica, e administrando ART-123 uma vez ao dia, a partir do dia da administração de oxaliplatina, o número de vezes de administração que pode suprimir o início de hiperalgesia durante 14 dias ou 21 dias, que corresponde ao período de um ciclo do tratamento, foi investigado.

1. Correlação de doses de ART-123 para modelo de humano e de rato

[00141] Quando ART-123 é administrada intravenosamente aos ratos

51 / 56 em uma dose de 0,25 mg/kg, os parâmetros farmacocinéticos são da maneira a seguir: concentração plasmática inicial (C0) é 6,14 µg/mL, e meia-vida (t1/2β) é 7,2 horas (Resumo de requerimento de novo fármaco de Recomodulin (marca registrada), parágrafo 2.6.4.3.1.1). Quando ART-123 é administrada intravenosamente a um humano em uma dose de 0,06 mg/kg, que é a dose clínica de ART-123, a concentração plasmática mais elevada de ART-123 é 0,9 a 1,7 µg/mL (Resumo de requerimento de novo fármaco de Recomodulin (marca registrada), parágrafo 2.5.3.2.1), e a meia-vida é cerca de 20 horas (Resumo de requerimento de novo fármaco de Recomodulin (marca registrada), parágrafo 2.5.3.3). Uma vez que as meias-vidas em humano e rato foram significativamente diferentes, da maneira mostrada por comparação com base na administração intravenosa da maneira descrita anteriormente, considera-se que é difícil atingir a mudança de concentração plasmática próxima àquela observada em humano em rato por administração intravenosa. Portanto, os parâmetros farmacocinéticos observados quando o fármaco foi administrado intraperitonealmente em ratos foram examinados. <Método de teste>

[00142] ART-123 foi administrada intraperitonealmente em uma dose de 1 mg/kg em ratos machos Sprague Dawley com 7 a 8 semanas, e o plasma foi coletado ao longo do tempo. A concentração plasmática do fármaco foi avaliada por ELISA, e parâmetros farmacocinéticos foram analisados em um modelo não compartimental. <Resultados>

[00143] Quando ART-123 foi administrada intraperitonealmente em uma dose de 1 mg/kg, a concentração plasmática mais elevada (Cmax) foi 5,47 µg/mL, tempo exigido para obter a concentração plasmática mais elevada (tmax) foi 6,00 horas, e meia-vida (t1/2) foi 14,1 horas, da maneira calculada a partir da mudança da concentração plasmática.

[00144] Em consideração à meia-vida de 14,1 horas e tmax de 6 horas

52 / 56 observada quando ART-123 foi administrada intraperitonealmente em ratos, em uma dose de 1 mg/kg, considera-se que a alteração da concentração plasmática próxima àquela observada em humano por administração intravenosa, em que a meia-vida é cerca de 20 horas, pode ser atingida em ratos por administração intraperitoneal. Adicionalmente, uma vez que Cmax de 5,47 µg/mL atingida em ratos por administração intraperitoneal de 1 mg/kg de ART-123 é cerca de 3 a 6 vezes da concentração plasmática mais elevada (0,9 a 1.7 µg/mL), obtida em humanos por administração intravenosa de 0,06 mg/kg de ART-123, considera-se que a administração intravenosa de 0,06 mg/kg de ART-123 a um humano corresponde substancialmente à administração intraperitoneal de cerca de 0,15 a 0,3 mg/kg a um rato.

[00145] 2. Efeito de administração de ART-123 over 7 dias for suprimir o início de neuropatia periférica induzida por oxaliplatina em modelo de rato <Método de teste> (1) Produção de modelo de rato com neuropatia periférica induzida por oxaliplatina

[00146] O model foi preparado administrando intraperitonealmente oxaliplatina uma vez, em uma dose de 6 mg/kg, aos ratos machos Sprague Dawley com 7 semanas como animais de laboratório. (2) Administração de fármaco teste

[00147] Aos ratos administrados com oxaliplatina, ART-123 foi administrada intraperitonealmente 7 vezes no total, em uma frequência de uma vez ao dia, a partir do dia da administração de oxaliplatina. A dose foi 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, ou 10 mg/kg (os grupos destas doses são referidos como grupos 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, e 10 mg/kg, respectivamente). O meio também foi administrado intraperitonealmente uma vez ao dia, por 7 dias, como um controle negativo (grupo médio). (3) Teste de Randall-Selitto

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[00148] Em relação aos ratos anteriormente mencionados, foram realizadas avaliações de acordo com o método de dor à pressão no pé (teste de Randall-Selitto), descrito em Randall LO. et al., Arch. Int. Pharmacodyn. Ther., 1957, 111, 409-419. Isto é, a pata traseira direita foi pressurizada gradualmente com um medidor de analgesia de dor à pressão, e a pressão observada quando o animal mostrou uma resposta de fuga foi determinada como o limiar de escape de dor à pressão. (4) Análise estatística

[00149] Quanto à ação de ART-123, os limiares de fuga de dor à pressão determinados nos 14º e 21º dias após a administração de oxaliplatina foram analisados estatisticamente. Usando o grupo médio como um controle, o teste paramétrico de Williams (direção ascendente) foi realizado em um nível de significância unilateral de 2,5 % ou menos para os limiares de fuga de dor à pressão observados nos grupos de 0,3 mg/kg, 1 mg/kg e 10 mg/kg (*: p < 0,05, e **: p < 0,01 na Fig. 1). Adicionalmente, um teste t pareado foi realizado em um nível de significância bilateral de 5 % para os limiares de fuga de dor à pressão do grupo médio, determinados um dia antes da administração de oxaliplatina nos 14º ou 21º dia após a administração de oxaliplatina (##: p < 0,01 na Fig. 1). <Resultados>

[00150] Os resultados da administração profilática de ART-123 a ratos uma vez ao dia, por 7 dias a partir do dia da administração de oxaliplatina, são mostrados na Fig. 1. No grupo controle, o limiar de fuga de dor à pressão foi diminuído significativamente no 14º e no 21º dia após a administração de oxaliplatina, comparado com aquele observado no dia anterior ao dia da administração de oxaliplatina e, assim, hiperalgesia foi desenvolvida. Nos grupos de administração de ART-123, tal queda do limiar de fuga de dor à pressão observada no grupo médio foi significativamente suprimida a partir da dose de 0,3 mg/kg, de uma maneira dose-dependente.

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3. Efeito para suprimir o início de neuropatia periférica induzida por administração de ART-123 por 1 a 3 dias em modelo de rato <Método de teste> (1) Preparação de modelo de rato com neuropatia periférica induzida por oxaliplatina

[00151] Ratos modelos foram preparados da mesma maneira como descrito na seção 2 do teste anteriormente mencionado, por administração única intraperitoneal de oxaliplatina em uma dose de 6 mg/kg a ratos machos Sprague Dawley com 7 semanas. (2) Administração de fármaco teste

[00152] Como o grupo de administração única de ART-123, ART-123 foi administrada intraperitonealmente uma vez aos ratos, aos quais a oxaliplatina foi administrada, no dia da administração de oxaliplatina, e o meio foi administrado intraperitonealmente uma vez em cada dia seguinte e no dia após o dia seguinte. Como grupo de administração dupla de ART-123, ART-123 foi administrada intraperitonealmente uma vez aos ratos, aos quais a oxaliplatina foi administrada, em cada dia da administração de oxaliplatina e no dia seguinte, e o meio foi administrado intraperitonealmente no dia após o dia seguinte. Como grupo de administração tripla de ART-123, ART-123 foi administrada intraperitonealmente uma vez aos ratos, aos quais a oxaliplatina foi administrada, em cada dia da administração de oxaliplatina, no dia seguinte e no dia após o dia seguinte. A dose de administração de ART-123 foi 1 mg/kg. Como o controle negativo (grupo médio), o meio foi administrado intraperitonealmente uma vez ao dia por 3 dias. (3) Teste de Randall-Selitto

[00153] Da mesma maneira como descrito na seção 2 do teste anteriormente mencionado, a pata traseira direita foi pressurizada gradualmente com um medidor de analgesia de dor à pressão, e a pressão observada quando o animal mostrou uma resposta de fuga foi determinada

55 / 56 como o limiar de fuga de dor à pressão. (4) Análise estatística

[00154] Quanto à ação de ART-123, os limiares de fuga de dor à pressão determinados nos 14º e 21º dias após a administração de oxaliplatina foram analisados estatisticamente. Usando o grupo médio como um controle, o teste paramétrico de Williams (direção ascendente) foi realizado em um nível de significância unilateral de 2,5 % ou menos para os limiares de fuga de dor à pressão observados para os grupos de administração única, dupla ou tripla de ART-123 (*: p < 0,05, e **: p < 0,01 na Fig. 2). Adicionalmente, um teste t pareado foi realizado em um nível de significância bilateral de 5 % para os limiares de fuga de dor à pressão determinados para o grupo médio um dia antes da administração de oxaliplatina, nos 14º ou 21º dia após a administração de oxaliplatina (##: p < 0,01 na Fig. 2). <Resultados>

[00155] No grupo controle, o limiar de fuga de dor à pressão foi diminuído significativamente nos 14º e 21º dias após a administração de oxaliplatina, comparado com aquele observado no dia antes da administração de oxaliplatina e, assim, a hiperalgesia foi desenvolvida. Quando ART-123 foi administrada em uma dose de 1 mg/kg uma vez ao dia em cada dia da administração de oxaliplatina, no dia seguinte e no dia após o dia seguinte, isto é, total de três vezes, a hiperalgesia foi suprimida significativamente no 14º dia ou no 21º dia, o que corresponde ao último dia de um ciclo de tratamento com oxaliplatina. Por outro lado, quando ART-123 foi administrada uma vez no único dia da administração de oxaliplatina, o efeito de manter a supressão de hiperalgesia até o 14º dia ou o 21º dia, que corresponde ao último dia de um ciclo de tratamento com oxaliplatina, foi fraco ou não foi observado. Os resultados são mostrados na Fig. 2.

[00156] Isto é, mesmo com a administração intraperitoneal de ART- 123 no modelo de rato em uma dose de 1 mg/kg, que corresponde a cerca de 3

56 / 56 a 6 vezes da dose de 0,06 mg/kg de ART-123 para administração intravenosa a um humano, o efeito de suprimir o início de uma neuropatia periférica não pode ser mantido por um período de 14 dias ou 21 dias, o que corresponde a um ciclo do tratamento com oxaliplatina.

Especificamente, considera-se que, em humanos, três vezes de administrações intravenosas de ART-123 em uma dose de 0,06 mg/kg, em um ciclo do tratamento com oxaliplatina, são necessárias para suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por oxaliplatina, ao passo que a administração única intravenosa de ART-123 em uma dose de 0,06 mg/kg, em um ciclo do tratamento com oxaliplatina, pode não ser esperada para suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por oxaliplatina.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Medicamento para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica induzida por um agente antitumor maligno, em um paciente humano com câncer que recebe um tratamento antitumor maligno com oxaliplatina, caracterizado pelo fato de que o tratamento antitumor maligno compreende a etapa de repetir um único ciclo compreendendo administração intravenosa de oxaliplatina ao paciente humano com câncer e após a retirada do fármaco, e o medicamento contém trombomodulina para administrar intravenosamente 0,06 mg/kg de trombomodulina, uma vez por cada único ciclo do tratamento antitumor maligno, no primeiro dia de cada dito ciclo como um ingrediente ativo.

2. Medicamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para suprimir redução da dose total de oxaliplatina no tratamento antitumor maligno.

3. Medicamento de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o tratamento antitumor maligno com oxaliplatina o tratamento que repete um único ciclo compreendendo administração intravenosa uma vez ao dia de 50 a 150 mg/m2 (área de superfície corporal) de oxaliplatina ao paciente humano com câncer por 1 a 3 dias, e após a retirada do fármaco por pelo menos 13 dias.

4. Medicamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que oxaliplatina é administrada conforme a terapia FOLFOX.

5. Medicamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a administração de trombomodulina é iniciada antes do início da administração de oxaliplatina.

6. Medicamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é administrado a um paciente com câncer que sofre de um ou mais tipos de cânceres selecionados a partir do grupo que consiste em câncer de intestino grosso, câncer pancreático e câncer gástrico.

7. Medicamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a neuropatia periférica é neuropatia periférica motora ou neuropatia periférica sensorial.

8. Medicamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a trombomodulina é trombomodulina solúvel.

9. Medicamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a trombomodulina é trombomodulina de humano.

10. Medicamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a trombomodulina é um peptídeo obtido a partir de uma célula transformada, preparada transfectando uma célula hospedeira com um DNA que codifica a sequência de aminoácido de (i-1) ou (i-2) mencionada a seguir (o peptídeo obtido a partir de um DNA que codifica a sequência de aminoácido de (i-2) apresenta as atividades de trombomodulina); (i-1) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou 3, ou (i-2) a sequência de aminoácido de (i-1) mencionada anteriormente, incluindo adicionalmente substituição, eliminação ou adição de um ou mais resíduos de aminoácido.

11. Medicamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a trombomodulina é um peptídeo contendo a sequência de aminoácido de (i-1) ou (i-2) mencionada a seguir, e o peptídeo é um peptídeo com as atividades de trombomodulina; (i-1) a sequência de aminoácido das posições 19 a 516 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou 3, ou (i-2) a sequência de aminoácido de (i-1) mencionada anteriormente, incluindo adicionalmente substituição, eliminação ou adição de um ou mais resíduos de aminoácido.

12. Medicamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a trombomodulina é Trombomodulina alfa (recombinação genética).