ES2632470T3 - Proteínas de fusión y métodos para tratar, prevenir o mejorar el dolor - Google Patents

Proteínas de fusión y métodos para tratar, prevenir o mejorar el dolor Download PDF

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Abstract

Una proteína de fusión polipeptídica de cadena sencilla, que comprende: a. una proteasa no citotóxica, proteasa que escinde una proteína del aparato de fusión exocítica de un aferente sensorial nociceptivo; b. una fracción de direccionamiento de galanina que se une a un sitio de unión en el aferente sensorial nociceptivo, donde el sitio de unión sufre una endocitosis para ser incorporado en un endosoma dentro del aferente sensorial nociceptivo; c. un sitio de escisión de la proteasa en cuyo sitio la proteína de fusión se puede escindir por una proteasa, en el que el sitio de escisión de la proteasa está localizado entre la proteasa no citotóxica y la fracción de direccionamiento de galanina y en el que la fracción de direccionamiento y el sitio de escisión de la proteasa están separados por cero aminoácidos; d. un domino de translocación que transloca la proteasa desde dentro de un endosoma, a través de la membrana endosomal y hasta el citosol del aferente sensorial nociceptivo, en el que la fracción de direccionamiento está localizada entre el sitio de escisión de la proteasa y el dominio de translocación; e. un primer espaciador localizado entre la proteasa no citotóxica y el sitio de escisión de la proteasa, en el que dicho primer espaciador comprende una secuencia de aminoácidos de 4 a 25 restos de aminoácidos; f. un segundo espaciador localizado entre la fracción de direccionamiento de galanina y el dominio de translocación, en el que dicho segundo espaciador comprende una secuencia de 4 a 35 restos de aminoácidos.

Description

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10
15
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Los segundos espaciadores adecuados pueden identificarse rutinariamente y obtenerse de acuerdo con Crasto, C. J. and Feng, J.A. (2000) May, 13(5), pp. 309-312, véase también http://www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html. En una realización, el segundo espaciador se selecciona de un espaciador GS5, GS10, GS15, GS18, GS20 o HX27. La secuencia de dichos espaciadores se proporciona en la siguiente Tabla 2.
Tabla 2
Espaciador
Secuencia
GS5
GGGGSA
GS10
GGGGSGGGGSA
GS15
ALAGGGGSGGGGSALV
GS18
GGGGSGGGGSGGGGSA
GS20
ALAGGGGSGGGGSGGGGSALV
HX27
ALAAEAAAKEAAAKEAAAKAGGGGSALV
Se ha encontrado sorprendentemente que las proteínas de fusión actualmente reivindicadas que tienen las características de dicho primer y segundo espaciadores muestran propiedades de activación mejoradas e incrementan la producción durante la expresión recombinante. Además, las proteínas de fusión actualmente reivindicadas muestran una potencia mejorada en comparación con las proteínas de fusión en las que la TM de galanina TM es el extremo C terminal del componente dominio de translocación.
En una realización, la invención proporciona una proteína de fusión polipeptídica de cadena sencilla que comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % (tal como al menos 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 53, 56 y/o 59.
En una realización, la invención proporciona una proteína de fusión polipeptídica de cadena sencilla que comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % (tal como al menos 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de longitud completa de las SEQ ID NOs: 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 53, 56 y/o 59.
En una realización, en el polipéptido de cadena sencilla, el componente proteasa no citotóxico y el componente de translocación están unidos por un enlace disulfuro. De esta manera, después de la escisión del sitio de escisión de la proteasa, el polipéptido asume una conformación de doble cadena, en el que los componentes proteasa y de translocación permanecen unidos por el enlace disulfuro. Para este fin, se prefiere que los componentes proteasa y de translocación se encuentren distanciados uno del otro en la proteína de fusión de cadena sencilla por un máximo de 100 restos de aminoácidos, más preferiblemente un máximo de 80 restos de aminoácidos, particularmente preferiblemente por un máximo de 60 restos de 25 aminoácidos y lo más preferiblemente por un máximo de 50 restos de aminoácidos.
En una realización, el componente proteasa no citotóxico forma un enlace disulfuro con el componente de translocación de la proteína de fusión. Por ejemplo, el resto de aminoácido del componente proteasa que forma el enlace disulfuro se localiza dentro de los últimos 20, preferiblemente dentro de los últimos 10 restos de aminoácidos C terminales del componente proteasa. De forma similar, el resto de aminoácidos dentro del componente de translocación que forma la segunda parte del enlace disulfuro puede localizarse dentro de los primeros 20, preferiblemente dentro de los primeros 10 restos de aminoácidos N terminales del componente de translocación.
Como alternativa, en el polipéptido de cadena sencilla, el componente proteasa no citotóxico y la TM pueden unirse por un enlace disulfuro. A este respecto, el resto de aminoácido de la TM que forma el enlace disulfuro se localiza preferiblemente lejos del extremo N terminal de la TM, más preferiblemente hacia el extremo C terminal de la TM.
En una realización, el componente proteasa no citotóxico forma un enlace disulfuro con el componente TM de la proteína de fusión. A este respecto, el resto de aminoácido del componente proteasa que forma el enlace disulfuro se localiza preferiblemente dentro de los últimos 20, lo más preferiblemente dentro de los últimos 10 restos de aminoácidos C terminales del componente proteasa. De forma similar, el resto de aminoácido dentro del componente TM que forma la segunda parte del enlace disulfuro se localiza preferiblemente dentro de los últimos 20, más preferiblemente dentro de los últimos 10 restos de aminoácidos C terminales de la TM.
Las disposiciones del enlace disulfuro anteriores tienen la ventaja de que los componentes proteasa y de
translocación se disponen en una forma similar a la de las neurotoxinas clostridiales nativas. A modo de comparación, con referencia a la secuencia de aminoácidos primaria para la neurotoxina clostridial nativa, los respectivos restos de aminoácidos cisteína se encuentran distanciados por entre 8 y 27 restos de aminoácidos tomados de Popoff, MR & Marvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins, Capítulo 9, en The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. Ed. Alouf & Freer:
Tabla 3
Serotipo1
Secuencia Longitud 'nativa' entre C-C
BoNT/A1
CVRG I ITSKTKS----LDKGYN KALN DLC 23
BoNT/A2
CVRGIIPFKTKS----LDEGYNKALNDLC 23
BoNT/B
CKSVKAPG-------------------IC 8
BoNT/C
CHKAIDGRS----------LYNYKTLDC 15
BoNT/D
CLRLTK---------------NSRDDSTC 12
BoNT/E
C KN-IVSVK----------G I RK---SIC 13
BoNT/F
CKS-VIPRK ----------GTKAPP-RLC 15
BoNT/G
CKPVMYKNT----------GKSE----QC 13
TeNT
CKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELC 27
1 Solo información de cepas proteolíticas
La proteína de fusión puede comprender una o más etiquetas de purificación, las cuales se localizan en el extremo N terminal en el componente proteasa y/o en el extremo C terminal en el componente de translocación. 10 Aunque puede emplearse cualquier etiqueta de purificación, se prefieren las siguientes: Etiqueta de His (por ejemplo 6 x histidina), preferiblemente como una etiqueta C terminal y/o N terminal Etiqueta de MBP (proteína de unión de maltosa), preferiblemente como una etiqueta N terminal Etiqueta de GST (glutatión-S-transferasa) preferiblemente como una etiqueta N terminal Etiqueta de His-MBP, preferiblemente como una etiqueta N terminal 15 Etiqueta de GST-MBP, preferiblemente como una etiqueta N terminal Etiqueta de tioredoxina, preferiblemente como una etiqueta N terminal
Etiqueta de CBD (Dominio de unión a quitina) preferiblemente como una etiqueta N terminal De acuerdo con una realización adicional de la presente invención una o más moléculas espaciadoras de péptido adicionales pueden incluirse en la proteína de fusión. Por ejemplo, puede emplearse un espaciador péptido entre
20 una etiqueta de purificación y el resto de la molécula de proteína de fusión (por ejemplo, entre una etiqueta de purificación N terminal y un componente proteasa de la presente invención y/o entre una etiqueta de purificación C terminal y un componente de translocación de la presente invención).
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de cadena sencilla mencionado anteriormente. En un aspecto preferido de la presente invención, la 25 secuencia de ADN se prepara como parte de un vector de ADN, en el que el vector comprende un promotor y terminador.
5
10
15
20
25
30
35
40
En una realización preferida, el vector tiene un promotor seleccionado de:
Promotor
Agente de inducción Condición de inducción típica
Tac (híbrido)
IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)
AraBAD
L-arabinosa 0,2 % (0,002-0,4 %)
Operador T7-lac
IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)
La construcción de ADN de la presente invención se diseña preferiblemente in silico y después se sintetiza por técnicas de síntesis de ADN convencionales.
La información de la secuencia de ADN mencionada anteriormente se modifica opcionalmente para seleccionar codones de acuerdo con el sistema de expresión de la célula hospedadora final (por ejemplo E. coli) que va a emplearse.
La estructura principal del ADN se selecciona preferiblemente para cualquier secuencia de ácido nucleico inherente, la cual cuando se transcribe y traduce puede producir una secuencia de aminoácidos que corresponde al sitio de escisión de la proteasa codificado por la segunda secuencia de codificación de péptido. Esta selección puede realizarse manualmente o con ayuda de software informático (por ejemplo el programa MapDraw por DNASTAR, Inc.). De acuerdo con una realización adicional de la presente descripción, se proporciona un método para preparar un agente no citotóxico que comprende:
a.
poner en contacto una proteína de fusión polipeptídica de cadena sencilla de la invención con una proteasa capaz de escindir el sitio de escisión de la proteasa;
b.
escindir el sitio de escisión de la proteasa y formar así una proteína de fusión de doble cadena.
Este aspecto proporciona un polipéptido de doble cadena, el cual imita generalmente la estructura de la holotoxina clostridial. En más detalle, el polipéptido de doble cadena resultante generalmente tiene una estructura en la que:
a.
la primera cadena comprende una proteasa no citotóxica, proteasa que es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica de un aferente sensorial nociceptivo;
b.
la segunda cadena comprende la TM de galanina y el dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa desde dentro de un endosoma, a través de una membrana endosomal y hasta el citosol del aferente sensorial nociceptivo; y
la primera y segunda cadenas están unidas entre sí por un enlace disulfuro.
En uso, el polipéptido de cadena sencilla o de doble cadena de la invención trata, previene o alivia el dolor.
En uso, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de cadena sencilla o de doble cadena de la invención se administra a un paciente.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente descripción, se proporciona el uso de un polipéptido de cadena sencilla o doble cadena de la invención, para la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o aliviar el dolor.
De acuerdo con un aspecto relacionado de la descripción, se proporciona un método para tratar, prevenir o aliviar el dolor en un sujeto, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de cadena sencilla o doble cadena de la invención.
Los compuestos descritos aquí pueden utilizarse para tratar a un paciente que sufre uno o más tipos de dolor crónico que incluyen dolor neuropático, dolor inflamatorio, cefalea, dolor somático, dolor visceral, y dolor referido.
“Tratar”, como se utiliza aquí, significa tratar médicamente. Incluye, por ejemplo, administrar un compuesto de la invención para prevenir el dolor o para disminuir su intensidad.
El término “dolor”, como se utiliza aquí, significa cualquier experiencia sensorial no placentera, habitualmente asociada con un trastorno fisiológico. El trastorno físico puede o no ser aparente para un médico. El dolor es de dos tipos: crónico y agudo. Un “dolor agudo” es un dolor de corta duración que tiene un inicio repentino. Un tipo de dolor agudo, por ejemplo, es sentir dolor cutáneo sobre la lesión en la piel u otros tejidos superficiales, tales como los causados por un corte o una quemadura. Los nociceptores cutáneos terminan justo debajo de la piel y debido a la alta concentración de terminales nerviosas, producen un dolor localizado de corta duración bien definido. “Dolor crónico” es un dolor distinto a un dolor agudo. El dolor crónico incluye dolor neuropático, dolor inflamatorio, cefalea, dolor somático, dolor visceral y dolor referido.
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I. Dolor neuropático
Los compuestos de la invención pueden utilizarse para tratar el dolor provocado por o de otra forma asociado con cualquiera de las siguientes afecciones de dolor neuropático. “Dolor neuropático” significa estímulo sensorial anormal, que tiene como resultado incomodidad, del sistema nervioso periférico, sistema nervioso central o ambos.
A. Síntomas del dolor neuropático
Los síntomas del dolor neuropático pueden implicar dolor espontáneo, persistente, así como también alodinia (una respuesta dolorosa a un estímulo que normalmente no es doloroso), hiperalgesia (una respuesta acentuada a un estímulo doloroso que normalmente provoca solo un malestar leve, tal como un pinchazo de un alfiler) o hiperpatía (donde una breve incomodidad se convierte en un dolor intenso prolongado).
B. Causas del dolor neuropático
El dolor neuropático puede estar causado por cualquiera de lo siguiente.
1.
Una lesión traumática, tal como, por ejemplo, una lesión de compresión de un nervio (por ejemplo, un aplastamiento de nervios, un estiramiento de nervios, un atrapamiento de nervios o una transsección nerviosa incompleta); una lesión de la médula espinal (por ejemplo, una hemisección de la médula espinal); una amputación de una extremidad; una contusión; una inflamación (por ejemplo, una inflamación de la médula espinal); o un procedimiento quirúrgico.
2.
Un acontecimiento isquémico, que incluye, por ejemplo, un ictus y un ataque al corazón.
3.
Un agente infeccioso.
4.
Exposición a un agente tóxico, que incluye, por ejemplo, un fármaco, alcohol, un metal pesado (por ejemplo, plomo, arsénico, mercurio), un agente industrial (por ejemplo, un disolvente, humo de un pegamento) u óxido nitroso.
5.
Una enfermedad, que incluye, por ejemplo, un trastorno inflamatorio, un tumor neoplásico, un síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), enfermedad de Lyme, lepra, una enfermedad metabólica, un trastorno de los nervios periféricos, semejante a neuroma, una mononeuropatía o una polineuropatía.
C. Tipos de dolor neuropático
1. Neuralgia.
Una neuralgia es un dolor que irradia a lo largo del curso de uno o más nervios específicos habitualmente sin ningún cambio patológico demostrable en la estructura del nervio. Las causas de la neuralgia son variadas. Irritación química, inflamación, traumatismo (que incluye cirugía), compresión por estructuras cercanas (por ejemplo, tumores), e infecciones pueden conducir a neuralgia. En muchos casos, sin embargo, la causa es desconocida o no identificable. La neuralgia es más común en personas de edad avanzada, aunque puede ocurrir a cualquier edad. Una neuralgia, incluye, sin limitación, una neuralgia del trigémino, una neuralgia post-herpética, una neuralgia glosofaríngea, una ciática y un dolor facial atípico.
La neuralgia es dolor en la distribución de un nervio o nervios. Los ejemplos son neuralgia del trigémino, dolor facial atípico, y neuralgia postherpética (provocada por herpes zóster o herpes). Los nervios afectados son responsables de la sensación de tacto, temperatura y presión en el área facial desde la mandíbula hasta la frente. El trastorno generalmente provoca episodios cortos de dolor insoportable, normalmente durante menos de dos minutos y en solo un lado de la cara. El dolor puede describirse de diversas formas tales como “punzante”, “agudo”, “como un rayo”, “ardiente”, e incluso “con picazón”. En la forma atípica de la NT, el dolor también puede presentarse como intenso o simplemente dolor y durar durante períodos prolongados. El dolor asociado con la NT se reconoce como uno de los dolores más insoportables que pueden experimentarse.
Estímulos simples tales como comer, hablar, lavarse la cara, o cualquier contacto ligero o sensación pueden desencadenar un episodio (incluso la sensación de una brisa suave). Los episodios pueden ocurrir en grupos o como un ataque aislado.
Los síntomas incluyen dolor agudo, punzante o dolor ardiente constante localizado en cualquier lugar, normalmente en o cerca de la superficie del cuerpo, en la misma localización en cada episodio; dolor a lo largo de la trayectoria de un nervio especifico; función deteriorada de la parte del cuerpo afectada debido al dolor o debilidad muscular debido al daño del nervio motor concomitante; sensibilidad incrementada de la piel o entumecimiento del área de la piel afectada (sensación similar a un anestésico local tal como una dosis de novocaína) y cualquier contacto o presión se interpreta como dolor. El movimiento también puede ser doloroso.
La neuralgia del trigémino es la forma más común de neuralgia. Afecta al nervio sensorial principal de la cara, el nervio trigémino (“trigémino” literalmente significa “tres orígenes”, y hace referencia a la división del nervio en 3
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cuando estos nervios no llevan información a y desde el cerebro y la médula espinal, dando como resultado dolor, pérdida de sensación, o incapacidad de controlar los músculos. En algunos casos, la falta de actividad de los nervios que controlan los vasos sanguíneos, intestino y otros órganos tiene como resultado presión sanguínea anormal, problemas de digestión y pérdida de otros procesos corporales básicos. Los factores de riesgo de neuropatía 5 incluyen diabetes, uso excesivo de alcohol y exposición a ciertas sustancias químicas y fármacos. Algunas personas tienen una predisposición hereditaria a la neuropatía. La presión prolongada en un nervio es otro riesgo de desarrollar una lesión nerviosa. La lesión por presión puede provocarse por inmovilidad prolongada (tal como un procedimiento quirúrgico prolongado o enfermedad prolongada) o compresión de un nervio por yesos, férulas, aparatos ortopédicos, muletas u otros dispositivos. La polineuropatía implica un proceso generalizado que 10 habitualmente afecta a ambos lados del cuerpo por igual. Los síntomas dependen del tipo de nervio que está afectado. Los tres tipos principales de nervios son sensorial, motor y autónomo. La neuropatía puede afectar a cualquiera o a una combinación de los tres tipos de nervios. Los síntomas también dependen de si la afección afecta a todo el cuerpo o solo a un nervio (como de una lesión). La causa de polineuropatía inflamatoria crónica es una respuesta inmunitaria anormal. Los antígenos específicos, procesos inmunitarios y factores desencadenantes son
15 variables y en muchos casos son desconocidos. Puede ocurrir en asociación con otras afecciones tales como infección por VIH, enfermedad intestinal inflamatoria, lupus eritematoso, hepatitis activa crónica y anomalías de las células sanguíneas.
La neuropatía periférica puede implicar un cambio funcional o patológico en un solo nervio o grupo de nervios (mononeuropatía) o un cambio funcional o patológico que afecta a varios nervios (polineuropatía). 20 Neuropatías periféricas Trastornos hereditarios Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth Ataxia de Friedreich Trastornos sistémicos o metabólicos 25 Diabetes (neuropatía diabética) Deficiencias en la dieta (especialmente de vitamina B-12) Uso de alcohol excesivo (neuropatía alcohólica) Uremia (por insuficiencia renal) Cáncer 30 Afecciones infecciosas o inflamatorias SIDA Hepatitis Fiebre del colorado por garrapatas Difteria 35 Síndrome de Guillain-Barré Infección por VIH sin desarrollo de SIDA Lepra Enfermedad de Lyme Poliarteritis nodosa 40 Artritis reumatoide Sarcoidosis Síndrome de Sjögren Sífilis Lupus eritematoso sistémico
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Amiloide
Exposición a compuestos tóxicos
Inhalación de pegamento u otros compuestos tóxicos
Óxido nitroso
Agentes industriales -especialmente disolventes
Metales pesados (plomo, arsénico, mercurio, etc.)
Neuropatía secundaria a fármacos como nefropatía analgésica
Diversas causas
Isquemia (oxigeno disminuido/flujo sanguíneo disminuido)
Exposición prolongada a bajas temperaturas
a. Polineuropatía
La polineuropatía es una neuropatía periférica que implica la pérdida de movimiento o sensación en un área provocada por el daño o destrucción de varios nervios periféricos. El dolor polineuropático, incluye, sin limitación, síndrome posterior a la polio, síndrome posterior a la mastectomía, neuropatía diabética, neuropatía por alcohol, amiloide, toxinas, SIDA, hipotiroidismo, uremia, deficiencias de vitaminas, dolor inducido por quimioterapia, tratamiento con 2',3'-dideoxicitidina (ddC), síndrome de Guillain-Barré o enfermedad de Fabry.
b. Mononeuropatía
La mononeuropatía es una neuropatía periférica que implica la pérdida de movimiento o sensación en un área provocada por el daño o destrucción de un nervio o grupo de nervios periféricos. La mononeuropatía frecuentemente está causada por daño en un área local como resultado de una lesión o traumatismo, aunque ocasionalmente los trastornos sistémicos pueden provocar daño nervioso aislado (como en la mononeuritis múltiple). Las causas habituales son traumatismo directo, presión prolongada en el nervio y compresión del nervio por inflamación o lesión de estructuras corporales cercanas. El daño incluye destrucción de la vaina de mielina (cubierta) del nervio o de la parte de la célula nerviosa (el axón). Este daño enlentece o impide la conducción de impulsos a través del nervio. La mononeuropatia puede implicar cualquier parte del cuerpo. El dolor mononeuropático, incluye, sin limitación, una disfunción del nervio ciático, una disfunción del nervio peroneo común, una disfunción del nervio radial, una disfunción del nervio cubital, una mononeuropatia craneal VI, una mononeuropatia craneal VII, una mononeuropatia craneal III (de tipo compresión), una mononeuropatia craneal III (tipo diabético), una disfunción del nervio axilar, un síndrome del túnel carpiano, una disfunción del nervio femoral, una disfunción del nervio tibial, parálisis de Bell, un síndrome de la salida torácica, un síndrome del túnel carpiano y una parálisis del sexto nervio (abducente).
c. Neuropatías periféricas generalizadas
Las neuropatías periféricas generalizadas son simétricas y normalmente se deben a diversas enfermedades sistémicas y procesos patológicos que afectan al sistema nervioso periférico en su totalidad. Se subdividen adicionalmente en varias categorías:
i. Las axonopatías distales son el resultado de alguna alteración metabólica o tóxica de las neuronas. Pueden estar provocadas por enfermedades metabólicas tales como diabetes, insuficiencia renal, síndromes de deficiencia tales como malnutrición y alcoholismo, o los efectos de toxinas o fármacos. La axonopatía distal (también conocida como neuropatía por degeneración) es un tipo de neuropatía periférica que es la consecuencia de alguna alteración metabólica o tóxica de las neuronas del sistema nervioso periférico (PNS). Es la respuesta más común de los nervios a las alteraciones metabólicas o tóxicas y como tal puede estar provocada por enfermedades metabólicas tales como diabetes, insuficiencia renal, síndromes de deficiencia tales como malnutrición y alcoholismo o por los efectos de toxinas o fármacos. La causa más común de axonopatía distal es la diabetes y la axonopatía distal más común es la neuropatía diabética.
ii. Las mielinopatías son debidas a una lesión primaria en la mielina, lo que provoca la falta aguda de la conducción de impulsos. La causa más común es la polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda (AIDP; también conocida como síndrome de Guillain-Barré), aunque otras causas incluyen síndrome desmielinizante inflamatorio crónico (CIDP), trastornos metabólicos genéticos (por ejemplo, leucodistrofia) o toxinas. La mielinopatía se debe a la destrucción primaria de mielina o de las células de Schwann mielinizantes, que dejan el axón intacto, pero provocan la falta aguda de conducción de impulsos. Esta desmielinización ralentiza o bloquea completamente la conducción de impulsos eléctricos a través del nervio. La causa más común es la polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda (AIDP, mejor conocida
como síndrome de Guillain-Barré), aunque otras causas incluyen polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), trastornos metabólicos genéticos (por ejemplo, leucodistrofia o enfermedad de Charcot-Marie-Tooth) o toxinas.
iii. Las neuronopatías son el resultado de la destrucción de las neuronas del sistema nervioso periférico (SNP). Pueden ser provocadas por enfermedades de las neuronas motoras, neuronopatías sensoriales (por ejemplo, Herpes zóster), toxinas o disfunción autónoma. Las neurotoxinas pueden causar neuronopatías, como el agente de quimioterapia vincristina. La neuronopatía es la disfunción debido al daño en las neuronas del sistema nervioso periférico (SNP), que tiene como resultado una neuropatía periférica. Puede estar causada por enfermedades de las neuronas motoras, neuronopatías sensoriales (por ejemplo, Herpes zóster), sustancias tóxicas o disfunción autónoma. Puede presentarse en diferentes formas en una persona con neuronopatía, dependiendo de la causa, la forma en la que afecta a las células nerviosas y el tipo de célula nerviosa que es la más afectada.
iv. Neuropatías por atrapamientos focales (por ejemplo, síndrome del túnel carpiano).
II. Dolor inflamatorio
Los compuestos de la invención pueden utilizarse para tratar el dolor provocado por o de otra forma asociado con cualquiera de las siguientes afecciones inflamatorias
A. Trastorno artrítico
Los trastornos artríticos incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide; artritis reumatoide juvenil; lupus eritematoso sistémico (SLE); artritis gotosa; escleroderma; osteoartritis; artritis psoriásica; espondilitis anquilosante; síndrome de Reiter (artritis reactiva); enfermedad de Still en adultos; artritis por infección viral; artritis por una infección bacteriana, tal como, por ejemplo, artritis gonocócica y artritis bacteriana no gonocócica (artritis séptica); enfermedad de Lyme terciaria; artritis tuberculosa; artritis por infección fúngica, tal como, por ejemplo, una blastomicosis
B. Enfermedades autoinmunitarias
Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, por ejemplo, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, diabetes de tipo I, lupus eritematoso sistémico, dermatomiositis, síndrome de Sjögren, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, miastenia gravis, síndrome de Reiter y enfermedad de Grave.
C. Trastorno del tejido conjuntivo
Los trastornos del tejido conjuntivo incluyen, por ejemplo, espondiloartritis, dermatomiositis y fibromialgia.
D. Lesión
La inflamación provocada por una lesión, incluyendo, por ejemplo, un aplastamiento, perforación, estiramiento de un tejido o articulación, puede provocar dolor inflamatorio crónico.
E. Infección
La inflamación provocada por infección, incluyendo, por ejemplo, una tuberculosis o una queratitis intersticial pueden provocar dolor inflamatorio crónico.
F. Neuritis
La neuritis es un proceso inflamatorio que afecta un nervio o grupo de nervios. Los síntomas dependen de los nervios implicados, aunque pueden incluir dolor, parestesias, paresias, o hipoestesia (entumecimientos).
Los ejemplos incluyen:
a.
Neuritis braquial
b.
Neuropatía retrobulbar, un proceso inflamatorio que afecta a la parte del nervio óptico que queda inmediatamente por detrás del globo ocular.
c.
Neuropatía óptica, un proceso inflamatorio que afecta al nervio óptico provocando una reducción repentina de la visión en el ojo afectado. La causa de la neuritis óptica es desconocida. La inflamación repentina del nervio óptico (el nervio que conecta el ojo y el cerebro) conduce a la inflamación y destrucción de la vaina de mielina. La inflamación puede ser ocasionalmente el resultado de una infección viral o puede estar provocada por enfermedades autoinmunitarias tales como la esclerosis múltiple. Los factores de riesgo se relacionan con las causas posibles.
d.
Neuritis vestibular, una infección viral que provoca un proceso inflamatorio que afecta al nervio vestibular.
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B. Inflamación gastrointestinal crónica
La inflamación gastrointestinal crónica incluye, por ejemplo, gastritis, enfermedad inflamatoria intestinal, como, por ejemplo, la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, colitis microscópica, diverticulitis y gastroenteritis; cistitis intersticial; isquemia intestinal; colecistitis; apendicitis; reflujo gastroesofágico; úlcera, nefrolitiasis, infección del tracto urinario, pancreatitis y hernia.
C. Dolor autoinmunitario
El dolor autoinmunitario incluye, por ejemplo, sarcoidosis y vasculitis.
D. Dolor visceral orgánico
El dolor visceral orgánico incluye, por ejemplo, dolor resultante de una lesión traumática inflamatoria o degenerativa del intestino o producida por un tumor que afecta a la inervación sensorial.
E. Dolor visceral inducido por el tratamiento
El dolor visceral inducido por el tratamiento incluye, por ejemplo, un dolor concurrente con quimioterapia o un dolor concurrente con radioterapia.
VI. Dolor referido
Los compuestos de la invención pueden utilizarse para tratar el dolor provocado por o de otra forma asociado con cualquiera de las siguientes afecciones de dolor referido.
El dolor referido tiene su origen en un dolor localizado en un área alejada del sitio de estimulación dolorosa. Con frecuencia, el dolor referido surge cuando un nervio se encuentra comprimido o dañado en o cerca de su origen. En esta circunstancia, la sensación de dolor generalmente se sentirá en el área que inerva el nervio, incluso cuando el daño se origina en otra parte. Un ejemplo común ocurre en la hernia del disco intervertebral, en la cual una raíz nerviosa que surge de la médula espinal se comprime por el material de disco adyacente. Aunque el dolor puede surgir del propio disco dañado, el dolor también se sentirá en la región inervada por el nervio comprimido (por ejemplo, el muslo, rodilla, o pie). La liberación de la presión de la raíz nerviosa puede aliviar el dolor referido, siempre que no haya ocurrido un daño nervioso permanente. La isquemia miocárdica (la pérdida del flujo sanguíneo en una parte del tejido muscular del corazón) posiblemente es el mejor ejemplo conocido de dolor referido; la sensación puede ocurrir en la parte torácica superior como una sensación restringida, o como un dolor en el hombro izquierdo, el brazo o incluso la mano.
La presente invención aborda un amplio abanico de afecciones que cursan con dolor, en particular afecciones que cursan con dolor crónico. Las afecciones preferidas incluyen dolor oncológico y no oncológico, dolor inflamatorio y dolor neuropático. Las fusiones de opioides de la presente invención son particularmente adecuadas para abordar el dolor inflamatorio, aunque pueden ser menos adecuadas para abordar el dolor neuropático. Las fusiones de galanina son más adecuadas para abordar el dolor neuropático.
En uso, los polipéptidos de la presente invención se emplean generalmente en la forma de una composición farmacéutica en asociación con un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéutico, aunque la forma exacta de la composición puede adaptarse al modo de administración. La administración es preferiblemente a un mamífero, lo más preferiblemente a un ser humano.
Los polipéptidos, por ejemplo, pueden emplearse en la forma de una solución estéril para administración intraarticular o administración intra-craneal. Se prefiere la inyección raquídea (por ejemplo, epidural o intratecal).
Los intervalos de dosificación para la administración de polipéptidos de la presente invención son aquellos destinados a producir el efecto terapéutico deseado. Se apreciará que el intervalo de dosificación requerido depende de la naturaleza precisa de los componentes, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la edad del paciente, la naturaleza, grado de severidad de la afección del paciente, contraindicaciones, si las hay y el juicio del médico.
Las dosificaciones diarias adecuadas se encuentran en el intervalo de 0,0001-1 mg/kg, preferiblemente 0,0001-0,5 mg/kg, más preferiblemente 0,002-0,5 mg/kg y particularmente preferiblemente 0,004-0,5 mg/kg. La dosificación unitaria puede variar de menos de 1 microgramo a 30 mg, aunque generalmente estará en la región de 0,01 a 1 mg por dosis, la cual puede administrarse diariamente o preferiblemente menos frecuentemente, tal como semanalmente o cada seis meses.
Un régimen de dosificación particularmente preferido se basa en 2,5 ng de proteína de fusión como la dosis 1X. En este sentido, las dosificaciones preferidas se encuentran en el intervalo de 1X-100X (es decir, 2,5-250 ng). Este intervalo de dosificación es significativamente inferior (es decir, al menos 10 veces, generalmente 100 veces menor) que el que podría emplearse con otros tipos de moléculas analgésicas tales como AINE, morfina y gabapentina. Además, la diferencia antes mencionada se aumenta considerablemente cuando la misma comparación se hace en
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una base molar, esto es debido a que las proteínas de fusión de la presente invención tienen un peso molecular Mw considerablemente mayor que los fármacos de molécula 'pequeña' convencionales.
Cabe esperar que amplias variaciones en la dosis requerida dependan de la naturaleza precisa de los componentes y de las diferentes eficacias de las diversas vías de administración.
Las variaciones en estos niveles de dosis pueden ajustarse utilizando rutinas empíricas estándar para la optimización, como se conoce bien en la técnica.
Las composiciones adecuadas para inyección pueden estar en la forma de soluciones, suspensiones o emulsiones o polvos secos los cuales se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes de usar.
Las formas farmacéuticas unitarias líquidas se preparan generalmente utilizando un vehículo estéril libre de pirógeno. Los principios activos, dependiendo del vehículo y concentración utilizados, pueden ser ya sea disueltos o suspendidos en el vehículo.
En la preparación de soluciones administrables, los polipéptidos pueden disolverse en un vehículo, haciéndose la solución isotónica si es necesario por la adición de cloruro de sodio y esterilizándose por filtración a través de un filtro estéril utilizando técnicas asépticas antes de llenado en frascos o ampollas estériles adecuadas y sellando. En otra alternativa, si la estabilidad de la solución es adecuada, la solución en sus envases sellados puede esterilizarse en autoclave.
Ventajosamente, los aditivos tales como agentes de regulación, solubilización, estabilización, conservantes o bactericidas, de suspensión o emulsión pueden disolverse en el vehículo.
Los polvos secos los cuales se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes de su uso pueden prepararse llenando el fármaco pre-esterilizado y otros ingredientes en un envase estéril utilizando técnicas asépticas en un área estéril.
Como alternativa, los polipéptidos y otros componentes pueden disolverse en un vehículo acuoso, la solución se esteriliza por filtración y se distribuye en envases adecuados utilizando técnicas asépticas en un área estéril. El producto se liofiliza a continuación y los envases se sellan asépticamente.
Las suspensiones parenterales, adecuadas para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica, se preparan en sustancialmente la misma forma, excepto que los componentes estériles se suspenden en el vehículo estéril en lugar de ser disueltos y la esterilización no puede lograrse por filtración. Los componentes pueden aislarse en un estado estéril o en otra alternativa pueden esterilizarse después del aislamiento, por ejemplo, por irradiación gama.
Ventajosamente, una agente de suspensión, por ejemplo, polivinilpirrolidona se incluye en la o las composiciones para facilitar la distribución uniforme de los componentes.
Sección de definiciones
La fracción de direccionamiento (TM) significa cualquier estructura química asociada con un agente que interactúa funcionalmente con un sitio de unión para provocar una asociación física entre el agente y la superficie de la célula diana. En el contexto de la presente invención, la célula diana es un aferente sensorial nociceptivo. El término TM abarca cualquier molécula (es decir, una molécula de origen natural, o una variante química/físicamente modificada de la misma) que es capaz de unirse a un sitio de unión en la célula diana, sitio de unión que es capaz de internalización (por ejemplo, formación de endosomas), también denominada como una endocitosis mediada por receptor. La TM puede poseer una función de translocación de membrana endosomal, en cuyo caso los componentes TM y domino de translocación individuales no necesitan estar presentes en un agente de la presente invención.
La TM de la presente invención se une (preferiblemente se une específicamente) a un aferente sensorial nociceptivo (por ejemplo, un aferente nociceptivo primario). En este sentido, se une específicamente significa que la TM se une a un aferente sensorial nociceptivo (por ejemplo un aferente nociceptivo primario) con una mayor afinidad que lo que se une a otras neuronas, tales como aferentes no nociceptivos y/o a neuronas motoras (es decir, la diana natural de la neurotoxina clostridial holotoxina). La expresión “se une específicamente” también puede significar que una TM determinada se une a un receptor determinado, por ejemplo, receptores de galanina, tales como los receptores GALR1, GALR2 y/o GALR3, con una afinidad de unión (Ka) de 106 M-1 o mayor, preferiblemente 106 M-1 o mayor, más preferiblemente 106 M-1 o mayor y lo más preferiblemente, 106 M-1 o mayor.
Para el propósito de esta invención, un agonista se define como una molécula que es capaz de estimular el proceso de fusión exocítico en una célula diana, proceso que es susceptible a la inhibición por una proteasa capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica en dicha célula diana.
Por consiguiente, la definición de agonista particular de la presente invención excluiría muchas moléculas que podrían considerarse convencionalmente como agonistas.
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Por ejemplo, el factor de crecimiento nervioso (NGF) es un agonista con respecto a su capacidad para promover la diferenciación neuronal mediante la unión a un receptor TrkA. Sin embargo, el NGF no es un agonista cuando se evalúa por el criterio anterior debido a que no es un inductor principal de la fusión exocítica. Además, el proceso que estimula el NGF (es decir, la diferenciación celular) no es susceptible a la inhibición por la actividad proteasa de una molécula de toxina no citotóxica.
El término “fragmento”, cuando se utiliza en relación con una proteína, significa un péptido que tiene al menos treinta y cinco, preferiblemente al menos veinticinco, más preferiblemente al menos veinte y lo más preferiblemente al menos 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 restos de aminoácidos de la proteína en cuestión.
El término “variante”, cuando se utiliza en relación con una proteína, significa un péptido o fragmento de péptido de la proteína que contiene uno o más análogos de un aminoácido (por ejemplo, un aminoácido no natural), o un enlace sustituido.
El término “derivado”, cuando se utiliza en relación con una proteína, significa una proteína que comprende la proteína en cuestión, y una secuencia de péptido adicional. La secuencia de péptido adicional preferiblemente no debe interferir con el plegamiento básico y de esta manera con la estructura conformacional de la proteína original. Dos o más péptidos (o fragmentos, o variantes) pueden unirse entre sí para formar un derivado. Como alternativa, un péptido (o fragmento, o variante) puede unirse a una molécula no relacionada (por ejemplo, un segundo péptido no relacionado). Los derivados pueden sintetizarse químicamente, aunque se prepararán generalmente por métodos de ácido nucleico recombinante. Los componentes adicionales tales como los componentes lípido y/o polisacárido y/o polipéptido pueden incluirse.
El término no citotóxico significa que la molécula de proteasa en cuestión no destruye las células diana a las cuales se ha redirigido.
La proteasa de la presente invención abarca todas las proteasas no citotóxicas de origen natural que son capaces de escindir una o más proteínas del aparato de fusión exocítica en células eucarióticas.
La proteasa no citotóxica de la presente invención preferiblemente es una proteasa bacteriana. En una realización, la proteasa no citotóxica se selecciona del género Clostridium o Neisseria (por ejemplo, una cadena L clostridial o una IgA proteasa neisserial, preferiblemente de N. gonorrhoeae). El término proteasa abarca fragmentos funcionalmente equivalentes y moléculas de la misma.
La presente invención también abarca proteasas no citotóxicas modificadas, que incluyen secuencias de aminoácidos que no existen en la naturaleza y/o restos de aminoácidos sintéticos, siempre y cuando las proteasas modificadas demuestren aún la actividad proteasa antes mencionada.
La proteasa de la presente invención preferiblemente demuestra una actividad de serina o metaloproteasa (por ejemplo, actividad endopeptidasa). La proteasa preferiblemente es específica para una proteína SNARE (por ejemplo, SNAP-25, sinaptobrevina/VAMP o sintaxina).
Se hace mención particular a los dominios de proteasa de las neurotoxinas, por ejemplo los dominios de proteasa de neurotoxinas bacterianas. De esta manera, la presente invención abarca el uso de dominios de neurotoxina, la cual se encuentra en la naturaleza, así como también versiones recombinantemente preparadas de las neurotoxinas de origen natural.
Ejemplos de neurotoxinas son las producidas por clostridia y el término neurotoxina clostridial abarca neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT) y por C. botulinum (BoNT) serotipos A-G, así como también las neurotoxinas de tipo BoNT estrechamente relacionadas producidas por C. baratii y C. butyricum. Las abreviaturas antes mencionadas se utilizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, la nomenclatura BoNT/A indica la fuente de neurotoxina como BoNT (serotipo A). La nomenclatura correspondiente se aplica a otros serotipos BoNT.
El término fragmento de cadena L o LC significa un componente de la cadena L de una neurotoxina, cuyo fragmento demuestra una actividad de metaloproteasa y es capaz de escindir proteolíticamente una vesícula y/o membrana plasmática asociada con la proteína implicada en la exocitosis celular.
Un dominio de translocación es una molécula que permite la translocación de una proteasa (o fragmento de la misma) a una célula diana de tal manera que se produce una expresión funcional de la actividad proteasa dentro del citosol de la célula diana. La posesión por cualquier molécula (por ejemplo, una proteína o péptido) de la función de translocación requerida de la presente invención puede confirmarse por medio de cualquiera de los diferentes ensayos convencionales.
Por ejemplo, Shone C. (1987) describe un ensayo in vitro que emplea liposomas, los cuales son expuestos a una molécula de ensayo. La presencia de la función de translocación requerida se confirma por la liberación de los liposomas de K+ y/o NAD marcado, lo cual puede controlarse fácilmente [véase Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180].
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Ejemplos particulares de dominios de translocación vírica adecuados para su uso en la presente invención incluye ciertos dominios de translocación de proteínas de fusión de membrana viralmente expresadas. Por ejemplo, Wagner et al. (1992) y Murata et al. (1992) describen la función de translocación (es decir, la fusión a la membrana y la formación de la vesícula) de varios péptidos fusogénicos y anfifílicos derivados de la región N terminal de la 5 hemaglutinina del virus de la gripe. Otras proteínas de fusión de membrana viralmente expresadas que se sabe que tienen la actividad de translocación deseada son un dominio de translocación de un péptido fusogénico del virus del bosque de Semliki (SFV), un dominio de translocación de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV), un dominio de translocación de la proteína F del virus SER y un dominio de translocación de la glicoproteína de la envoltura del virus espumoso. Las proteínas Aspike viralmente codificadas tienen aplicación particular en el
10 contexto de la presente invención, por ejemplo, la proteína E1 del SFV y la proteína del VSV.
El uso de los dominios de translocación indicados en la Tabla (siguiente) incluye el uso de variantes de secuencia de los mismos. Una variante puede comprender una o más sustituciones de ácidos nucleicos conservadoras y/o deleciones o inserciones de ácidos nucleicos, con la condición de que la variante posea la función de translocación requerida. Una variante también puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos y/o deleciones o
15 inserciones de aminoácidos, con la condición de que la variante posea la función de translocación requerida.
Fuente del dominio de translocación
Restos de aminoácidos Referencias
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Dominio II de la exotoxina de Pseudomonas
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Hemaglutinina del virus de la gripe
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Proteína fusogénica del virus del bosque Semlik
Dominio de translocación Kielian et al., 1996, J Cell Biol. 134(4), 863-872
Glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular
118-139 Yao et al., 2003, Virology 310(2), 319-332
Proteína F del virus SER
Dominio de translocación Seth et al., 2003, J Virol 77(11) 6520-6527
Glicoproteína de la envoltura del virus espumoso
Dominio de translocación Picard-Maureau et al., 2003, J Virol. 77(8), 4722-4730
A continuación se hace una breve descripción de las Figuras, que ilustra aspectos y/o realizaciones de la presente invención.
Figura 1 -Purificación de una proteína de fusión LC/A-espaciador-galanina-espaciador-HN/A
20 Utilizando la metodología señalada en el Ejemplo 3, se purificó una proteína de fusión LC/A-GS18-galanina-GS20HN/A de células de E. coli BL21. Brevemente, los productos solubles obtenidos después de la ruptura celular se aplicaron a una columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las proteínas unidas se eluyeron con imidazol, 100 mM, se trataron con enteroquinasa para activar la proteína de fusión y se trataron con el factor Xa para eliminar la etiqueta de la proteína de unión a maltosa (MBP). La proteína de fusión activada se aplicó entonces a una
25 segunda columna de captura de afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se evaluaron por SDS-PAGE 10 (Panel A) y transferencia Western (Panel B). El antisuero anti-galanina (obtenido de Abeam) y el antisuero anti-histag (obtenido de Qiagen) se utilizaron como el anticuerpo primario para la transferencia Western. El material purificado final en la ausencia y presencia del agente de reducción se identifica en los carriles
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