JP2019004909A - 融合タンパク質および疼痛を治療、予防または緩和するための方法 - Google Patents

融合タンパク質および疼痛を治療、予防または緩和するための方法 Download PDF

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Abstract

【課題】鎮痛性分子としての非細胞傷害性融合タンパク質の提供。【解決手段】侵害受容性感覚求心路の開口放出融合装置を構成しているタンパク質を切断することが可能な非細胞傷害性プロテアーゼ;侵害受容性感覚求心路のエンドソームに取り込まれるエンドサイトーシスを受けることが可能な侵害受容性感覚求心路の結合部位に結合することが可能なガラニンターゲティング部分;非細胞傷害性プロテアーゼとガラニンターゲティング部分の間に位置するプロテアーゼ切断部位;エンドソームからエンドソーム膜を横断して、プロテアーゼを侵害受容性感覚求心路のサイトゾル内に転位置させることが可能なトランスロケーションドメイン;非細胞傷害性プロテアーゼとプロテアーゼ切断部位の間に位置する第1のスペーサー;およびガラニンターゲティング部分とトランスロケーションドメインの間に位置する第2のスペーサーを含む、単鎖ポリペプチド融合タンパク質。【選択図】図３Ａ

Description

本発明は、非細胞傷害性融合タンパク質と、鎮痛性分子としてのその治療への応用に関する。
毒素は一般的に、それらが標的細胞に及ぼす効果の種類によって2群に分けることができる。より詳しく言うと、第一群の毒素はそれらの天然の標的細胞を死滅させる毒素であり、そのため、細胞傷害性毒素分子として知られている。なかでもこの群に含まれる毒物の例としては、植物の毒素であるリシンやアブリンなど、また細菌性の毒素であるジフテリア毒素や緑膿菌外毒素Aなどが挙げられる。細胞傷害性毒素は、細胞性疾患(cellular disorders)や癌などの状態の治療に用いる「特効薬」(例えば、細胞傷害性毒素の成分と標的細胞の特異的マーカーに結合する抗体を含む免疫抱合体)の設計において、非常な関心がもたれてきた。細胞傷害性毒素は通常、タンパク質合成の細胞内過程を阻害することによってそれらの標的細胞を死滅させる。
非細胞傷害性毒素として知られている第二群の毒素は、その名の通り、それらの天然の標的細胞を殺さない毒素である。非細胞傷害性毒素は細胞傷害性をもつそれらの対応物ほど商業的な関心はもたれていないが、非細胞傷害性毒素は、タンパク質合成以外の細胞内過程を阻害することによって標的細胞に影響を及ぼす毒素である。非細胞傷害性毒素は様々な植物や、クロストリジウム(Clostridium)菌種およびナイセリア(Neisseria)菌種等の様々な微生物によって生産される。
クロストリジウム神経毒は、通常150kDa程度の質量を有するタンパク質である。これらの神経毒は様々な種の細菌、特にクロストリジウム属の細菌、最も重要なところでは破傷風菌(c. tetani)やボツリヌス菌(c. botulinum)、クロストリジウム・ブチリカム(c. butyricum)およびクロストリジウム・アルゼンチネンス(c. argentinense)のいくつかの菌株によって生産される。現時点で、クロストリジウム神経毒には、破傷風毒素と、A、B、C1、D、E、FおよびG血清型のボツリヌス神経毒の8つの異なる種類があり、これらは全て、類似した構造と作用機序を有している。
クロストリジウム神経毒は非細胞傷害性毒素分子の主要な群を構成しており、宿主細菌によって、単一のポリペプチドとして合成される。このポリペプチドはタンパク質切断事象によって翻訳後に修飾され、ジスルフィド結合で結合している2本のポリペプチドを形成する。この2本の鎖はおよそ100kDaの質量をもつ重鎖(H鎖)、およびおよそ50kDaの質量をもつ軽鎖(L鎖またはLC)と呼ばれている。
L鎖はプロテアーゼの機能(亜鉛依存性のペプチド内部加水分解活性)を有し、かつ、開口放出過程に関与する小胞関連タンパク質および/または原形質膜関連タンパク質に対して高い基質特異性を示す。異なるクロストリジウム種または血清型に由来するL鎖は、3種類の基質タンパク質、すなわちシナプトブレビン、シンタキシンまたはSNAP-25のうちの1種に含まれる異なりはするが特異的なペプチド結合を加水分解することができる。これらの基質は神経分泌機構の重要な成分である。
ナイセリア菌種、最も重要なところでは淋菌(N. gonorrhoeae)由来の菌種は、機能が似ていて非細胞傷害性プロテアーゼを生産する。そのようなプロテアーゼの一例がIgAプロテアーゼである(国際公開第99/58571号を参照のこと)。
当該分野では、毒素分子を、その毒素の天然の標的細胞ではない細胞に対して再標的化することができることが十分に裏付けられてきた。そのように再標的化した場合、改変された毒素は所望の標的細胞に結合して、その後、サイトゾル中に移動し、次いで、標的細胞に対して効果を発揮することができる。このような再標的化は、毒素の天然のターゲティング部分(Targeting Moiety, TM)を別のTMで置き換えることによって達成される。その際には、所望の標的細胞に結合し、その後、改変された毒素が標的細胞のエンドソームを通過できるようなTMが選択される。改変された毒素も、非細胞傷害性プロテアーゼが細胞のサイトゾル中に進入できるようにするトランスロケーションドメインを含む。トランスロケーションドメインは毒素の天然のトランスロケーションドメインであっても、または転位置活性をもつ微生物のタンパク質から得られた別のトランスロケーションドメインであってもよい。
上述のTMの置き換えは、当業者に周知の標準的な化学的結合技術によって行うことができる。この点では、Hermanson、G.T.(1996)の「バイオ抱合技術(Bioconjugate techniques)」Academic Press、およびWong,S.S.(1991)の「タンパク質の結合および架橋の化学(Chemistry of protein conjugation and cross-linking)」、CRC Pressを参照のこと。あるいは、国際公開第98/07864号に記載されている組換え技術などを用いてもよい。これまでに引用した参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
国際公開第99/58571号
Hermanson、G.T.(1996)、「バイオ抱合技術(Bioconjugate techniques)」、Academic Press Wong,S.S.(1991)、「タンパク質の結合および架橋の化学(Chemistry of protein conjugation and cross-linking)」、CRC Press
痛みを感知する細胞は、多様な種類の受容体を有している。しかしながら、全ての種類の受容体が受容体介在性のエンドサイトーシスに適しているわけではない(望ましいものは僅かである)。同様に、同じ受容体に関してもTMの種類によって結合特性は変わり、別のTMと別の受容体との間の結合特性はさらに変化する場合がある。
そのため、上述の問題の1つ以上に対処する改変非細胞傷害性融合タンパク質を開発する必要がある。特に、疼痛の治療に用いるための改変/改良非細胞傷害性融合タンパク質の開発に関心が寄せられている。
本発明は、特異な融合タンパク質を提供することによって、上述の問題の1つ以上に対処することを目的とするものである。
本発明は、単鎖ポリペプチド融合タンパク質を提供することによって、上述の問題のうちの1つ以上に対処するものであり、この融合タンパク質は、以下を含んでいる:
a. 侵害受容性感覚求心路の開口放出融合装置のタンパク質を切断する非細胞傷害性プロテアーゼ;
b. 形質膜陥入して侵害受容性感覚求心路内のエンドソームに取り込まれる侵害受容性感覚求心路の結合部位に結合するガラニンターゲティング部分;
c. 非細胞傷害性プロテアーゼとガラニンターゲティング部分の間に位置し、その部位で融合タンパク質がプロテアーゼによって切断されうるプロテアーゼ切断部位;
d. プロテアーゼをエンドソーム内からエンドソーム膜を横断して、侵害受容性感覚求心路のサイトゾル内に転位置させるトランスロケーションドメイン(ここで、ターゲティング部分はプロテアーゼ切断部位とトランスロケーションドメインの間に位置している);
e. 非細胞傷害性プロテアーゼとプロテアーゼ切断部位の間に位置し、4〜25アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む第1のスペーサー;
f. ガラニンターゲティング部分とトランスロケーションドメインの間に位置し、4〜35アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む第2のスペーサー。
本発明の非細胞傷害性プロテアーゼ成分は、侵害受容性感覚求心路の開口放出融合装置を構成する3種類の基質タンパク質、すなわちシナプトブレビン、シンタキシンまたはSNAP-25のうちの1つに含まれている、異なりはするが特定のペプチド結合を切断することができる非細胞傷害性プロテアーゼである。これらの基質は神経分泌機構の重要な成分である。本発明の非細胞傷害性プロテアーゼ成分はナイセリアのIgAプロテアーゼまたはクロストリジウム神経毒L鎖であることが好ましい。非細胞傷害性プロテアーゼという用語は、前記非細胞傷害性プロテアーゼの機能的に等価な断片および誘導体をも包含する。特に好ましい非細胞傷害性プロテアーゼ成分はボツリヌス神経毒(BoNT)L鎖である。
本発明のトランスロケーション成分は、標的細胞のサイトゾル中でプロテアーゼ活性の機能的な発現が起こるように、非細胞傷害性プロテアーゼ(またはその断片)を標的細胞の中に移動させることができる。このトランスロケーション成分は、低pH条件で、脂質膜にイオン透過性の細孔を形成することができることが好ましい。エンドソーム膜中に細孔を形成することができるタンパク質分子の一部分だけの使用が好ましいことが知られている。トランスロケーション成分は、微生物のタンパク質源、具体的には細菌またはウイルスのタンパク質源から得られてもよい。従って一態様では、トランスロケーション成分は、酵素、例えば細菌性毒素またはウイルスタンパク質のトランスロケーションドメインである。本発明のトランスロケーション成分は好ましくはクロストリジウム神経毒H鎖またはその断片である。最も好ましくは、HNドメイン(またはその機能成分)であり、ここでHNとは、クロストリジウム神経毒のH鎖のアミノ末端側の半分にほぼ等しい、クロストリジウム神経毒H鎖の一部分もしくは断片、または完全なH鎖におけるその断片に対応するドメインを意味する。
本発明のガラニンTM成分は、本発明の融合タンパク質が標的細胞の結合部位に結合するのに関与している。従って、ガラニンTM成分は、本発明の融合タンパク質がそれを介して選択した標的細胞に結合するリガンドである。
本発明では、標的細胞は侵害受容性感覚求心路であり、好ましくは一次侵害受容性求心路(例えばAδ線維などのA線維またはC線維)である。従って本発明の融合タンパク質は、侵害受容性感覚求心路ニューロンの別個の集団からの神経伝達物質または神経調節物質[例えばグルタミン酸、サブスタンスP、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、および/またはニューロペプチドY]の放出を阻害することが可能である。使用した場合に、この融合タンパク質は、末梢から中心の疼痛線維への感覚求心路シグナル(例えば神経伝達物質または神経調節物質)の伝達を低減または阻止するので、疼痛の治療、特に慢性疼痛の治療用分子としての用途がある。
TMの侵害受容性感覚求心路への結合を確認する方法は確立されている。例えば、侵害受容性感覚求心路を代表する組織または細胞(例えばDRG)を、過剰量の非放射性リガンド存在下で、放射性標識した(例えばトリチウム化した)リガンドに暴露するといった単純な放射性物質の置換実験を行ってもよい。そのような実験では、非特異的な結合と特異的な結合の相対的な割合を評価することができ、それによって、リガンドが侵害受容性感覚求心路の標的細胞に結合していることを確認することができる。随意により、このアッセイは1種類以上の結合アンタゴニストを含む場合があり、また、このアッセイはリガンド結合の消失を観察することをさらに含む場合がある。この種の実験の例は、Hulme、E.C. (1990)、受容体結合の研究、その概要(Receptor-binding studies, a brief outlin)、303~311頁、「受容体生化学、実践的なアプローチ(Receptor biochemistry, A Practical Approach)」E.C. Hulme編、Oxford University Pressに見ることができる。
本発明の融合タンパク質は基本的に、対応する「遊離の」TM(例えばgal16)と比較して、ガラニン受容体(例えばGALR1)に対する結合親和性が低い(10分の1までの範囲)。しかしながら、この観察結果にもかかわらず本発明の融合タンパク質は、驚くべきことに高い効力を示す。これは主に二つの特徴に起因すると考えられる。第一に、非細胞傷害性プロテアーゼ成分は触媒的であり、そのため、そのようないくつかの分子の治療効果は素早く増幅される。第二に、侵害受容性感覚求心路に存在するガラニン受容体は、治療薬が進入するための入り口として作用する必要があるだけで、リガンド-受容体が介在する薬理学的反応を達成するための状態に必要とされるレベルまで刺激される必要はない。従って本発明の融合タンパク質は、NSAID類やモルヒネ、ガバペンチンなどの他の種類の鎮痛性分子に用いられるよりずっと低い用量で投与することができる。後者の分子は通常、百マイクログラムオーダーからミリグラム(数百ミリグラムまで)の量で投与されるが本発明の融合タンパク質は、ずっと低い用量で、一般的には少なくとも10分の1量で、より一般的には100分の1量で投与することができる。
本発明のガラニンTMは、侵害受容性感覚求心路、より具体的には一次侵害受容性求心路に存在するガラニン受容体のうちの1つ以上に「アゴニスト」といて作用する分子であってもよい。アゴニストは習慣的に、細胞内の活性を高めるまたは弱める任意の分子、すなわち細胞活性を単純に変化させる任意の分子と考えられている。例えば、アゴニストの標準的な意味には、細胞の受容体と結合し、反応もしくは活性を開始させることが可能な化学物質、または受容体を活性化させることで活性な反応を誘導する薬物(反応は細胞活性の増強でもまたは低下でもよい)が含まれる。
しかしながら本発明の目的では、アゴニストはより具体的に、標的細胞内での開口放出融合の過程を刺激することが可能な分子として定義され、この過程は前記標的細胞内の開口放出融合装置を構成するタンパク質を切断することが可能なプロテアーゼ(またはその断片)による阻害に対して感受性である。
従って本発明の特定のアゴニストの定義からは、習慣的にはアゴニストと見なされている多くの分子が除外される。例えば、神経成長因子(NGF)は、TrkA受容体との結合を介してニューロンの分化を促進するというその能力の点ではアゴニストであるが、開口放出融合の主な誘導物質ではないため、NGFは上記の基準で評価した場合にはアゴニストではない。加えて、NGFが刺激する過程(つまり細胞分化)は、非細胞傷害性毒素分子のプロテアーゼ活性による阻害の影響を受けにくい。
一態様では、本発明による融合タンパク質は、受容体との優先的な結合および/または内部移行の特性を示す。これが次に、プロテアーゼ成分の痛みを感知する標的細胞へのより効率的な送達を生じるのかもしれない。
アゴニストのTMとしての使用は、副作用の点で自己限定的である。より詳しく説明すると、アゴニストTMが痛みを感知する標的細胞に結合すると開口放出融合が増え、これによって、痛みの感覚が悪化する可能性がある。しかしながらその後、融合タンパク質のプロテアーゼ成分によって、アゴニストの結合によって刺激された開口放出過程は弱まるかまたは阻害される。
侵害受容性求心路の受容体に結合するTMのアゴニスト特性は実施例9で説明した方法によって確認することができる。
本発明のターゲティング部分は、ガラニンおよび/またはガラニン誘導体を含むかあるいはそれらからなる。ガラニン受容体(例えばGALR1、GALR2およびGALR3)はDRGのシナプス前後に見られ(LiuおよびHokfelt(2002), Trends Pharm. Sci.,23(10),468-74)、神経障害性疼痛状態にある場合、その発現が高まる。Xuら,(2000)Neuropeptides,34(3& 4),137-147はガラニンに関連してさらに詳しい情報を提供している。上で引用した参考文献は全て参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の一態様では、ガラニンTMの標的はGALR1、GALR2および/またはGALR3受容体である。これらの受容体はGタンパク質共役受容体のメンバーであり、かつ、7回膜貫通型のドメイン構造を有している。
一態様においてガラニンTMは、GALR1、GALR2および/またはGALR3受容体分子に結合する(好ましくはと特異的に結合する)分子である。より好ましくは、ガラニンTMは、GALR1、GALR2および/またはGALR3受容体の「アゴニスト」である。本明細書中において用語「アゴニスト」は、上記の通りに定義される。
野生型のヒトガラニンペプチドはアミノ酸が30個のペプチドで、本明細書では「GA30」と略す(配列番号7に示す)。一態様では、ガラニンTMは配列番号7を含むかあるいは配列番号7からなる。
本発明はまた、上述のガラニンTMの断片、変異体、および誘導体をも包含する。これらの断片、変異体、および誘導体は実質的に、前記ガラニンTMが持っているとみなされた特性を保持している(つまり機能的に等価である)。例えば、断片、変異体、および誘導体はGALR1、GALR2および/またはGALR3受容体に結合する能力を保持し得る。一態様では、本発明のガラニンTMは完全長ガラニンペプチド(本明細書ではGA16と呼ばれ、配列番号8に示した)の16アミノ酸の断片を含む又はからなる。
一態様においてガラニンTMは、配列番号7または配列番号8と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％(例えば少なくとも82、84、85、86、88または89％)、より好ましくは少なくとも90％(例えば少なくとも91、92、93または94％)、最も好ましくは少なくとも95％(例えば少なくとも96、97、98、99または100％)のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなる。
一態様においてガラニンTMは、配列番号7もしくは配列番号8の完全長アミノ酸配列、または、配列番号7もしくは配列番号8のアミノ酸残基を連続して少なくとも10個(例えば少なくとも11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29個)含む又はからなる配列番号7もしくは配列番号8の断片と、少なくとも70％(例えば少なくとも80、82、84、85、86、88または89％)、より好ましくは少なくとも90％(例えば少なくとも91、92、93または94％)、最も好ましくは少なくとも95％(例えば少なくとも96、97、98、99または100％)のアミノ酸配列同一性をもつアミノ酸配列を含む又はからなる。
一態様においてガラニンターゲティング部分は、配列番号7もしくは配列番号7のアミノ酸残基を連続して少なくとも16個(例えば少なくとも10、11、12、13、14または15個)含む又はからなる断片、または前記配列番号7の変異体アミノ酸配列もしくは最大で6つの(例えば最大で5、4、3、2もしくは1つの)保存的アミノ酸置換を含む前記断片を含む又はからなる。
本発明のプロテアーゼ切断部位は、非細胞傷害性プロテアーゼ成分とTM成分との間の位置での融合タンパク質の切断(好ましくは制御された切断)を可能にする。この切断反応は、融合タンパク質を単鎖ポリペプチドからジスルフィド結合した二本鎖ポリペプチドへと変換するものである。
本発明の好ましい態様によれば、ガラニンTMは、ガラニンTMのC末端から離れて位置するドメインまたはアミノ酸配列を介して結合する。例えば、関連する結合ドメインとしては、TMの中心部(つまり直線状ペプチド配列の中心部)付近に位置している内部ドメインまたはアミノ酸配列が挙げられ得る。好ましくは、関連する結合ドメインはガラニンTMのN末端の方に、より好ましくはN末端にまたはN末端の近くに位置している。
一態様では、単鎖ポリペプチド融合体は、2箇所以上のタンパク質切断部位を含んでいてもよい。しかしながら、そのような部位が2箇所以上存在する場合、それらは異なっていて、そのことによって、単一のプロテアーゼによって複数の切断事象が生じることは実質的に防止されている。別の態様では、単鎖ポリペプチド融合体には単一のプロテアーゼ切断部位が含まれることが好ましい。
プロテアーゼ切断配列を標準的な手段によって、例えば部位特異的突然変異生成によって、DNAレベルで導入してもよい(および/または任意の固有の切断配列を除去してもよい)。切断配列の存在を確認するためのスクリーニングは手動で行っても、またはコンピューターソフトウェア(例えばDNASTAR社のMapDrawプログラム)を用いて行ってもよい。
いずれのプロテアーゼ切断部位を用いても良いが、以下のものが好ましい。
エンテロキナーゼ(DDDDK↓)
Xa因子(IEGR↓/IDGR↓)
TEV(タバコEtchウイルス)(ENLYFQ↓G)
トロンビン(LVPR↓GS)
プレシジョン(PreScission)(LEVLFQ↓GP)
一態様では、プロテアーゼ切断部位はエンテロキナーゼ切断部位(DDDDK↓)である。一態様では、エンテロキナーゼプロテアーゼを使用してエンテロキナーゼ切断部位を切断し、融合タンパク質を活性化させる。
プロテアーゼ切断部位という用語には自己切断配列であるインテインも含まれる。この自己スプライシング反応は、例えば含まれる還元剤の濃度を変化させることによって制御可能である。
使用中、プロテアーゼ切断部位が切断され、TMのN末端領域(好ましくはN末端)がむき出しになる。生じたポリペプチドは、融合タンパク質のその他の部分から実質的に遊離しているN末端ドメインまたは内部ドメインをもつTMを含む。この構成により、TMのN末端成分(または内部ドメイン)は確実に、標的細胞の結合部位と直接相互作用し得る。
一態様では、TMとプロテアーゼ切断部位は融合タンパク質の中で、最大で10アミノ酸残基分、より好ましくは最大で5アミノ酸残基分離れており、最も好ましくは離れていない。一態様では、TMとプロテアーゼ切断部位は融合タンパク質の中で、0〜10(例えば0〜9、0〜8、0〜7、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2)アミノ酸残基分、好ましくは0〜1アミノ酸残基分離れている。従って、プロテアーゼ切断部位を切断した後には、N末端ドメインが融合体のその他の部分から実質的に遊離のTMを含む融合体が生じる。この配置により、ターゲティング部分のN末端成分が確実に、標的細胞の結合部位と直接相互作用する。
上述の活性化工程に関連する利点の1つとしては、一旦融合タンパク質のタンパク質切断が生じると、TMだけがN末端分解に感受性になるということが挙げられる。さらに、特定のプロテアーゼ切断部位を選択することにより、ポリペプチド融合体を二本鎖の立体構造へと選択的に活性化することができる。
本発明の単鎖ポリペプチド融合体の構成では、プロテアーゼ切断部位をTMと非細胞傷害性プロテアーゼ成分の間に配置させる。
単鎖融合体では、TMがプロテアーゼ切断部位とトランスロケーション成分との間に位置していることが好ましい。この位置関係によって、本発明の例ではこの2つの成分の順番は天然のホロ毒素の順序とは反対であるが、TMは確実にトランスロケーションドメインに連結される(つまり天然のクロストリジウムのホロ毒素と同時に生じる)。この配置の別の利点としては、TMが融合タンパク質のむき出しになったループ領域に位置しており、融合タンパク質の構造に最小限の影響しか及ぼさないことが挙げられる。その際、前記ループは、リンカー、活性化ループ、内部ドメインリンカー、または単に表面がむき出しになったループ(Schiavoら、2000, Phys. Rev., 80, 717-766; Turtonら., 2002, Trends Biochem. Sci., 27, 552-558)などと様々に呼ばれる。
本発明の単鎖の融合タンパク質は、非細胞傷害性プロテアーゼとプロテアーゼ切断部位の間に位置している第1のスペーサーを含み、ここで前記第1のスペーサーは、4〜25(例えば6〜25、8〜25、10〜25、15〜25または4〜21、4〜20、4〜18、4〜15、4〜12または4〜10)個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む(あるいはそれらからなる)。一態様において第1のスペーサーは、少なくとも4(例えば少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む(あるいはそれらからなる)。一態様において第1のスペーサーは、最大で25(例えば最大で24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10)個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む(あるいはそれらからなる)。前記第1のスペーサーによって、融合タンパク質をプロテアーゼ切断部位で切断することができる。
本発明の第1のスペーサーがなければ、融合タンパク質のプロテアーゼ切断および活性化は著しく弱い。理論により束縛されることは望まないが、ガラニンターゲティング部分はプロテアーゼ切断部位を立体的に遮断するか、あるいはプロテアーゼ切断部位と相互作用し、その結果、本発明の第1のスペーサーを欠いた融合タンパク質の活性化が弱められると仮定される。本発明者らは、第1のスペーサーによってもたらされる柔軟性によって、本出願の融合タンパク質の高い/改善された活性化特性が生じるのだろうと考えている。堅いリンカー、例えばアルファらせんのリンカーは必要とされる柔軟性を提供しない。同じことが、プロテアーゼ切断部位を含む「天然の」スペーサー配列を有しているガラニン融合タンパク質にも言え、これは、望ましくない堅いアルファらせんリンカー構造を模倣し得る。ポリペプチドドメインの柔軟性と可動性は、X線結晶構造B因子を決定すること(例えば、参照により本明細書に組み込まれるSmithら,2003 Protein Science,12:1060-1072を参照のこと)などの複数の方法によって確認することができる。特異的に選択された本発明のスペーサー配列は、上述の「天然の」スペーサーのどれよりも高い活性化をもたらす。本明細書中において活性化とは、前記第1のスペーサーが融合タンパク質をプロテアーゼ切断部位で切断できることを意味する。第1のスペーサーに使用するのに特に好ましいアミノ酸残基としては、グリシン、スレオニン、アルギニン、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、プロリン、グルタミン酸および/またはリジンが挙げられる。前述のアミノ酸は最も柔軟なアミノ酸であると見なされている。Smithら,2003 Protein Science 2003; 12:1060-1072を参照のこと。
一態様において第1のスペーサーのアミノ酸残基は、グリシン、スレオニン、アルギニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、アスパラギン酸、プロリン、グルタミン酸、リジン、ロイシンおよび/またはバリンからなる群から選択される。一態様において第1のスペーサーのアミノ酸残基は、グリシン、セリン、アラニン、ロイシンおよび/またはバリンからなる群から選択される。一態様において第1のスペーサーのアミノ酸残基は、グリシン、セリンおよび/またはアラニンからなる群から選択される。グリシンとセリンが特に好ましい。一態様では、第1のスペーサーは、グリシン、セリン、および/またはスレオニン残基を含んでいる1つ以上のペンタペプチドを含むかまたはこれらからなる。第1のスペーサーが本出願で特許請求された融合タンパク質において必要とされる柔軟性を有しているか否かを評価するための方法の1つとしては、単純なプロテアーゼ切断アッセイを実施することが挙げられる。融合タンパク質の切断/活性化を評価することは当業者にとってはごく普通のことであろう。標準的な方法は、例えば実施例1で説明されている。
一態様では、第1のスペーサーをGS5、GS10、GS15、GS18、GS20、FL3および/またはFL4スペーサーから選択してもよく。前記スペーサーの配列を下記表1に示す。
Figure 2019004909
一態様において第1のスペーサーは、融合タンパク質をプロテアーゼ切断によって、少なくとも45％(例えば少なくとも50、55、60、65、70、75、80、90、95、98、99または100％)活性化することができる。一態様において第1のスペーサーは、融合タンパク質をプロテアーゼ切断によって、少なくとも70％活性化することができる。
一態様において第1のスペーサーは、天然に存在するスペーサー配列ではない。一態様において第1のスペーサーは、天然の(つまり野生型の)クロストリジウム神経毒、例えばボツリヌス神経毒にとって天然のアミノ酸配列を含んでもいないし、それらからなってもいない。言い換えると、第1のスペーサーは、クロストリジウムの配列でなくてもよい(つまり天然のクロストリジウム神経毒に見られなくてもよい)。一態様において融合タンパク質は、GIITSK(BoNT/A); VK(BoNT/B); AIDGR(BoNT/C); LTK(BoNT/D); IVSVK(BoNT/E); VIPR(BONT/F); VMYK(BoNT/G)および/またはIIPPTNIREN(TeNT)のアミノ酸配列を第1のスペーサーとして含んでもいないし、それらからなってもいない。
一態様において第1のスペーサーは、クロストリジウム神経毒のL鎖に保存されているシステイン残基に続く3番目のアミノ酸残基から始まる(下記表3を参照のこと)。一態様において第1のスペーサーは、保存されているシステイン残基の直後のsal1部位で改変した、クロストリジウムの非細胞傷害性プロテアーゼのL鎖のVDアミノ酸残基の後から始まる。一態様において第1のスペーサーは、上述のプロテアーゼ切断部位の開始部位を示しているアミノ酸残基で終わる。
一態様において単鎖の融合タンパク質は、ガラニンターゲティング部分とトランスロケーションドメインの間に位置している第2のスペーサーを含んでいる。前記第2のスペーサーは、4〜35(例えば6〜35、10〜35、15〜35、20〜35または4〜28、4〜25、4〜20または4〜10)個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでいてもよい(またはそれらからなっていてもよい)。本発明者らは、(使用している間に)TMのC末端とトランスロケーション成分のN末端が互いに40〜105オングストローム、好ましくは50〜100オングストローム、より好ましくは50〜90オングストローム離れるように、第2のスペーサーの大きさを選択した場合に、本発明の融合タンパク質が改善された結合活性を示し得ることを思いがけず発見した。
好適な第2のスペーサーは、Crasto, C.J.およびFeng, J.A.(2000) May, 13(5), 309-312頁に従って慣習的に同定し、得ることができる。http://www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.htmlもまた参照のこと。一態様において第2のスペーサーは、GS5、GS10、GS15、GS18、GS20またはHX27スペーサーから選択される。前記スペーサーの配列を下記表2に示す。
Figure 2019004909
発明者らは驚くべきことに、前記第1のおよび第2のスペーサーの特徴を備えている本出願に特許請求された融合タンパク質が、高い活性化特性および組換え発現の間に高い収量を示すことを発見した。加えて、特許請求された融合タンパク質は、ガラニンTMがトランスロケーションドメイン成分のC末端にある融合タンパク質と比較して、高い効力を示す。
一態様において本発明は、配列番号10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、53、56および/または59のアミノ酸配列と少なくとも80％(例えば少なくとも85、90、92、94、95、96、97、98、99または100％)の配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいる(またはそれらからなっている)単鎖ポリペプチド融合タンパク質を提供する。
一態様において本発明は、配列番号10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、53、56および/または59の完全長アミノ酸配列と少なくとも80％(例えば少なくとも85、90、92、94、95、96、97、98、99または100％)配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでいる(またはそれらからなっている)単鎖ポリペプチド融合タンパク質を提供する。
一態様では、単鎖ポリペプチドの中で非細胞傷害性プロテアーゼ成分とトランスロケーション成分はジスルフィド結合で結合している。従って、プロテアーゼ切断部位で切断すると、ポリペプチドは二本鎖の立体構造をとり、それでもプロテアーゼとトランスロケーション成分はジスルフィド結合による結合を維持する。そのためには、プロテアーゼとトランスロケーション成分が単鎖の融合タンパク質中で互いに、最大100アミノ酸残基離れていることが好ましく、より好ましくは最大80アミノ酸残基、特に好ましくは最大60アミノ酸残基、最も好ましくは最大50アミノ酸残基離れている。
一態様において非細胞傷害性プロテアーゼ成分は、融合タンパク質のトランスロケーション成分とジスルフィド結合を形成している。例えば、ジスルフィド結合を形成しているプロテアーゼ成分のアミノ酸残基は、プロテアーゼ成分のC末端から20個目までのアミノ酸残基中に、好ましくはC末端から10個目までのアミノ酸残基中に位置している。同様に、ジスルフィド結合の第2の部分を形成しているトランスロケーション成分中のアミノ酸残基は、トランスロケーション成分のN末端から20個目までのアミノ酸残基中に、好ましくはN末端から10個目までのアミノ酸残基中に位置していてもよい。
あるいは、単鎖ポリペプチドにおいて、非細胞傷害性プロテアーゼ成分とTMはジスルフィド結合で結合していてもよい。その際、ジスルフィド結合を形成しているTMのアミノ酸残基は、好ましくはTMのN末端から離れて位置しており、より好ましくはTMのC末端側に位置している。
一態様において非細胞傷害性プロテアーゼ成分は、融合タンパク質のTM成分とジスルフィド結合を形成している。その際、ジスルフィド結合を形成しているプロテアーゼ成分のアミノ酸残基は、好ましくはプロテアーゼ成分のC末端から20個目までのアミノ酸残基中に、より好ましくはC末端から10個目までのアミノ酸残基中に位置している。同様に、ジスルフィド結合の第2の部分を形成しているTM成分のアミノ酸残基は、好ましくはTMのC末端から20個目までのアミノ酸残基中に、より好ましくはTMのC末端から10個目までのアミノ酸残基中に位置している。
上述したジスルフィド結合の配置には、プロテアーゼとトランスロケーション成分が天然のクロストリジウム神経毒と同じような様式で配置されるという利点がある。比較のために天然のクロストリジウム神経毒の一次アミノ酸配列について述べると、それぞれのシステインアミノ酸残基は互いに、8〜27アミノ酸残基離れている。AloufおよびFreer編「微生物のタンパク質および毒素に関する網羅的ハンドブック(The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins)」第9章、Popoff,MRおよびMarvaud,J-C,1999,クロストリジウム神経毒の構造とゲノムの特徴(Structural & genomic features of clostridial neurotoxins)から引用。
Figure 2019004909
融合タンパク質は、プロテアーゼ成分のN末端側および/またはトランスロケーション成分のC末端側に位置している1種類以上の精製用タグを含んでいてもよい。
任意の精製用タグを用いることができるが、以下に挙げるタグが好ましい。
His-タグ(例えば6×ヒスチジン)、好ましくはC末端タグおよび/またはN末端タグとして
MBP-タグ(麦芽糖結合タンパク質)、好ましくはN末端タグとして
GST-タグ(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、好ましくはN末端タグとして
His-MBP-タグ、好ましくはN末端タグとして
GST-MBP-タグ、好ましくはN末端タグとして
チオレドキシン-タグ、好ましくはN末端タグとして
CBD-タグ(キチン結合ドメイン)、好ましくはN末端タグとして。
本発明のさらなる態様によれば、融合タンパク質は、1つ以上のさらなるペプチドスペーサー分子を含んでいてもよい。例えば、ペプチドスペーサーを、精製用タグと融合タンパク質分子のその他の部分との間に(例えば、N末端の精製用タグと本発明のプロテアーゼ成分との間および/またはC末端の精製用タグと本発明のトランスロケーション成分の間に)使用してもよい。
本発明の第2の側面は、上述した単鎖ポリペプチドをコードしているDNA配列を提供する。本発明の好ましい側面では、DNA配列はDNAベクターの一部分として調製され、ここでベクターは、プロモーターとターミネーターを含む。
好ましい態様においてベクターは、以下の表から選択されるプロモーターを有する。
Figure 2019004909
本発明のDNA構築物は、コンピューターシミュレーションで設計し、その後、標準的なDNA合成技術で合成することが好ましい。
随意により、使用する最終的な宿主細胞(例えば大腸菌)の発現系に応じて、上述したDNA配列の情報をコドン偏位(バイアス)に関して改変する。
DNA骨格は、任意の固有の核酸配列に関してスクリーニングされることが好ましい。この固有の核酸配列とは、転写され、翻訳された場合に、第2のペプチドコード配列によってコードされているプロテアーゼ切断部位に対応するアミノ酸配列を生成する配列である。このスクリーニングは手動で、またはコンピューターソフトウェア(例えばDNASTAR社のMapDrawプログラム)を使って実施することができる。
本発明のさらなる態様では、以下の工程を含む、非細胞傷害性薬剤の調製方法を提供する:
a. 本発明の単鎖ポリペプチド融合タンパク質と、プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼを接触させること;
b. プロテアーゼ切断部位を切断して、二本鎖融合タンパク質を形成すること。
この側面では、基本的にクロストリジウムのホロ毒素の構造を模倣している二本鎖ポリペプチドを提供する。より詳しくは、得られる二本鎖のポリペプチドは通常、以下のような構造を有する:
a. 侵害受容性感覚求心路の開口放出融合装置を構成しているタンパク質を切断することが可能な、非細胞傷害性プロテアーゼを含む第1の鎖;
b. ガラニンTMおよび、エンドソームの中からエンドソーム膜を横断して侵害受容性感覚求心路のサイトゾルにプロテアーゼを転位置させることが可能なトランスロケーションドメインを含む第2の鎖; ここで、
第1の鎖と第2の鎖はジスルフィド結合している。
本発明の一側面では、本発明の単鎖ポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドは医薬品/治療用分子として使用されるものである。
使用中、本発明の単鎖ポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドは疼痛を治療、予防または緩和する。
使用中、治療上有効量の本発明の単鎖または二本鎖ポリペプチドを患者に投与する。
本発明のさらなる側面では、疼痛を治療、予防または緩和する医薬品の製造への、本発明の単鎖ポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドの使用を提供する。
関連する側面では、対象に治療上有効量の本発明の単鎖ポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドを投与することを含む、前記患者の疼痛を治療、予防、または緩和する方法を提供する。
本明細書に記載の化合物を、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、頭痛、体性疼痛、内臓痛、および関連痛などを含む1種類以上の慢性疼痛を煩っている患者の治療に用いてもよい。
本明細書で使用する場合「治療する」とは、医学的に対処することを意味する。それには例えば、疼痛を予防するためにまたは疼痛の重篤度を下げるために本発明の化合物を投与することが含まれる。
本明細書で使用する場合「疼痛」という用語は、全ての不愉快な知覚経験、通常は身体的な障害に関連する不愉快な知覚経験を意味する。身体的な障害は臨床医に明らかなものであっても、または明らかでないものであってもよい。疼痛には慢性と急性の2種類がある。「急性疼痛」とは、突然発症する、発症期間の短い疼痛である。急性疼痛の一つとしては例えば、切り傷または火傷などに起因する皮膚または他の表在性組織の障害に対して感じられる皮膚の疼痛がある。皮膚の侵害受容器は皮膚のすぐ下で終わっていて、また、神経末端の密度が高いため、皮膚では、はっきりと分かる局所的な疼痛が短時間生じる。「慢性疼痛」とは急性疼痛とは異なる疼痛である。慢性疼痛には、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、頭痛、体性疼痛、内臓痛および関連痛が含まれる。
I. 神経障害性疼痛
本発明の化合物は、以下に説明する神経障害性疼痛状態によって引き起こされる、さもなければそのような状態に関連がある疼痛の治療に使用することができる。「神経障害性疼痛」とは、異常な感覚入力によって、末梢神経系、中枢神経系、またはその両方から生じる不快感を意味する。
A. 神経障害性疼痛の症状
神経障害性疼痛の症状は、持続的な、自然発生的な疼痛、ならびに異痛(通常は痛くない刺激に対する痛みの反応)、痛覚過敏(普通はわずかな不快感を生じる程度の痛みを伴う刺激(例えばピン先で刺すこと)に対する過剰な反応)、またはヒペルパチー(短時間の不快感が長期にわたる重篤な疼痛になること)を伴う場合がある。
B. 神経障害性疼痛の原因
神経障害性疼痛は以下の原因のいずれかによって起こり得る。
1. 外傷性障害。例えば、神経圧迫性傷害(例えば、神経挫減、神経の延伸、神経絞扼または部分的な神経の切断); 脊髄損傷(例えば、脊髄半側切断); 四肢切断; 挫傷; 炎症(例えば、脊髄の炎症); または外科手術など。
2. 虚血性の事象。例えば、脳卒中および心臓発作など。
3. 感染病原体。
4. 有毒な物質、例えば、薬剤、アルコール、重金属(例えば、鉛、ヒ素、水銀)、産業用物質(例えば、溶媒、接着剤から発生するガス)または亜酸化窒素への暴露。
5. 疾患。例えば、炎症性障害、新生腫瘍、後天性免疫不全症候群(AIDS)、ライム病、ハンセン病、代謝性疾患、神経腫などの末梢神経障害、単神経障害または多発神経障害など。
C. 神経障害性疼痛の種類
1. 神経痛
神経痛は、1つ以上の特定の神経から、通常は神経構造に明らかな病理学的変化を伴うことなく広がる疼痛である。神経痛の原因は多種多様である。化学的な刺激、炎症、外傷(外科的なものを含む)、隣接した構造(例えば腫瘍)による圧迫、および感染も全て、神経痛を引き起こし得る。しかしながら多くの場合、その原因は不明であるかまたは同定できない。神経痛は高齢者で最も一般的であるが、しかしどの年齢層でも起こり得る。神経痛には、これらには限定されないが、三叉神経痛、帯状疱疹後神経痛、ヘルペス後神経痛、舌咽神経痛、座骨神経痛および非定型顔面痛が挙げられる。
神経痛は神経に分布する疼痛である。例としては、三叉神経痛、非定型顔面痛、およびヘルペス後神経痛(帯状疱疹またはヘルペスによって引き起こされる)が挙げられる。罹患した神経は、顔面の顎から前頭部にかけての領域で、触覚、温度、および圧力を感じる原因となる。この障害は通常、強く短時間(通常2分未満)の痛みを、顔面の片側で引き起こす。この痛みは、様々な言い方で、例えば「突き刺すような痛み」、「鋭い痛み」、「稲妻のような痛み」、「焼けるような痛み」、さらには「かゆいような痛み」とも説明することができる。非定型の三叉神経痛では、疼痛は重症なまたは僅かな痛みとして、長期間継続する場合がある。疼痛関連性の三叉神経痛は、経験する可能性のある最もひどい痛みのうちの1つと認識されている。
単純な刺激、例えば食べること、話すこと、洗顔、または任意の軽い接触または感覚が(そよ風の感覚でさえも)、発作を引き起こす可能性がある。発作は、群発する場合も単発の場合もある。
症状に含まれるのは、鋭い刺すような疼痛または一定の焼けるような疼痛であって、どの部分ででも感じられ、通常は、体表面かその近く、それぞれのエピソードについては同じ場所で感じられる疼痛; 特定の神経経路に沿った疼痛; 疼痛または随伴性運動神経障害による筋衰弱が原因の、罹患した体部位の機能不全; 皮膚の感受性の高まりまたは影響を受けた皮膚領域のしびれ(局所麻酔、例えばノボカインの投与に似た感覚); また、いかなる接触または圧迫も痛みとして解釈される。移動もまた痛みを伴う場合がある。
三叉神経痛は、神経痛の中でも最も多く見られるものである。三叉神経痛は顔面の主要な感覚神経である三叉神経に影響を及ぼす(「三叉」とは文字通り「3つの起源」を意味し、神経が3本に分岐していること指している)。この状態は、顔の片側の三叉神経に沿った部分に現れ、急性で短期間の重症疼痛の発作を伴う。疼痛発作は顔のゆがみを引き起こすのに十分なほど重症であることもあり、古典的に、痛みを伴う顔面けいれん(有痛性チック)と呼ばれている。三叉神経痛の原因は、血管または小さい腫瘍が神経を圧迫している場合もある。障害、例えば多発性硬化症(脳や脊髄に影響を及ぼす炎症性疾患)、特定の型の関節炎、および糖尿病(高血糖)も三叉神経痛の原因となり得るが、原因は必ずしも同定されない。この状態では、特定の動き、例えば噛むこと、話すこと、飲み込むこと、または顔のある部分を触ることもひどい痛みの痙攣を引き起こす可能性がある。
関連してはいるが珍しい神経痛として、喉への感覚を提供する舌咽神経に影響を及ぼすものがある。この神経痛の症状は、喉に現れる、短いショック様の疼痛症状の発現である。
神経痛は、感染、例えば、ヘルペスウイルスの一種である水痘帯状疱疹ウイルスによって生じる帯状疱疹の後に起こる場合もある。この神経痛では、帯状疱疹の発疹が治癒した後に、持続的な焼けるような痛みが生じる。疼痛は移動または罹患した部分に接触することで悪化する。帯状疱疹に罹っていると診断された患者の全員がヘルペス後神経痛を経験するわけではないが、ヘルペス後神経痛は帯状疱疹よりも痛みを伴う場合がある。疼痛および過敏な状態は数ヶ月、さらには数年も続く場合がある。疼痛は一般に、あらゆる接触に対する、とくに軽く触れられることに対する耐えがたい敏感さの形態をとる。ヘルペス後神経痛は顔面に限定されず身体のどの部分にも起こる可能性があるが、通常は、帯状疱疹の発疹がでた場所に起こる。疼痛や病気による社会的隔離を原因とする抑うつ状態は珍しくない。
ヘルペス後神経痛は、そもそものヘルペス感染の徴候が見られなくなったかなり後に治まる場合がある。神経痛を起こす可能性のある他の感染症には、梅毒やライム病がある。
神経痛に共通する別の原因としては糖尿病がある。この非常に一般的な医学的問題は成人期のアメリカ人の20人に1人に影響を及ぼしている。糖尿病は、神経に血液を循環させている細い動脈に損傷を与え、その結果、神経線維の機能不全や、時には神経の消失をもたらす。糖尿病は、三叉神経痛、手根管症候群(手と手首の疼痛やしびれ)、および異常感覚性大腿痛(外側大腿皮膚神経への傷害が原因の大腿部のしびれや疼痛)などを含む、ほとんど全ての神経痛を引き起こす可能性がある。血糖値を厳格に制御することで、糖尿病性の神経損傷を予防することができ、また、神経痛を発症した患者の回復を早めることができる。
神経痛と関連している可能性のある他の医学的状態には、慢性腎不全や、体内で血液が通常に破壊された後に生じる特定の物質を排出することができない遺伝性疾患のポルフィリン症がある。特定の薬物によってもこの問題が起こり得る。
2. 求心路遮断
求心路遮断とは、身体のある部分からの感覚入力の消失であり、末梢感覚線維または中枢神経系の神経のいずれかが遮断されることによって引き起こされる可能性がある。求心路遮断性疼痛症候群には、これらには限定されないが、脳または脊髄への損傷、脳卒中後の疼痛、幻肢痛、対麻痺、腕神経叢引き抜き損傷、腰髄神経根障害が含まれる。
3. 複合性局所疼痛性症候群(complex regional pain syndromes, CRPSs)
CRPSは、交感神経性の持続した痛みによって生じる慢性疼痛症候群であり、CRPSには2つの型がある。CRPS1型は現在では、「反射性交感神経性ジストロフィー症候群」と呼ばれている。これは、小さな傷害または大きな傷害を負った後、主に腕または脚に起こる慢性の神経障害である。CRPS1型は、重症疼痛; 爪、骨、および皮膚の変化; ならびに罹患した四肢における接触への感受性と高まりと関連している。CRPS2型は灼熱痛と呼ばれており、これは、神経に負った明らかな傷害から生じるものである。CRPSには、これらには限定されないが、I型CRPS(反射性交感神経性ジストロフィー)およびII型CRPS(灼熱痛)が含まれる。
4. 神経障害
神経障害は、神経に生じる機能的または病理学的な変化であり、臨床的には、感覚神経または運動神経の異常を呈する。
中枢性神経障害は、中枢神経系に起こる機能的または病理学的な変化である。
末梢神経障害は、1つ以上の末梢神経に起こる機能的または病理学的な変化である。末梢神経は、中枢神経系(脳および脊髄)からの情報を筋肉や他の器官に伝達し、そして、皮膚、間接、および他の器官からの情報を脳へと戻す。末梢神経障害は、末梢神経が脳と脊髄からの情報伝達ならびに脳と脊髄への情報伝達に失敗した時に起こり、疼痛、感覚の消失が起こるか、または筋肉が制御できなくなる。いくつかの例では、血管、腸、および他の器官を制御する神経が不全になった結果、血圧異常、消化不良、および他の基本的な生体過程の消失が起こる。神経障害の危険因子としては、糖尿病、度重なるアルコールの使用、および特定の化学物質や薬剤への暴露が挙げられる。神経障害の遺伝的素因をもつ人もいる。神経が長期間圧迫され続けることも神経障害を発症する別の危険要因である。圧迫による傷害は、長時間動かないこと(例えば長時間の外科手術もしくは長期にわたる病気)またはギブス、スプリント、装具、松葉杖、または他の装置による神経の圧迫によって起こる可能性がある。多発神経障害は一般的に、身体の両側に影響を及ぼす多様な過程を意味する。症状はどの種の神経が影響を受けているかによる。神経には主に、感覚、運動および自律神経の3種類がある。神経障害はこれら3種類の神経のうちのいずれか1つか、または3つ全ての組み合わせに影響を及ぼす場合がある。症状も、状態が身体全体影響をおよぼしているか、あるいは1つの神経だけに影響をおよぼしているか(傷害によるもののように)による。慢性炎症性多発神経障害の原因は異常な免疫応答である。特異的抗原、免疫過程、および誘導因子は多様であり、また、多くの例で不明である。慢性炎症性多発神経障害は、他の状態、例えばHIV、炎症性腸疾患、紅斑性狼瘡、慢性活動性肝炎、および血液細胞の異常に関連して起こる場合もある。
末梢神経障害には、単一の神経もしくは神経群に起こる機能的または病理学的な変化(単神経障害)、または複数の神経に起こる機能的または病理学的な変化(多発神経障害)が含まれる場合がある。
Figure 2019004909
a. 多発神経障害
多発神経障害は、複数の末梢神経への損傷または破壊に起因する、ある領域への運動または感覚の消失を伴う末梢神経障害である。多発神経障害性疼痛には、これらには限定されないが、ポリオ後症候群、乳房切除後症候群、糖尿病神経障害、アルコール性神経障害、アミロイド、毒素、AIDS、甲状腺機能低下症、尿毒症、ビタミン欠乏症、化学療法誘発性疼痛、2’,3’-ジデオキシシチジン(ddC)治療、ギラン・バレー症候群またはファブリー病が含まれる。
b. 単神経障害
単神経障害は、単一の末梢神経または神経群への損傷または破壊に起因する、ある領域に対する運動または感覚の消失を伴う末梢神経障害である。全身性障害が孤立した神経障害を引き起こすこともあるが(多発単神経炎と同様に)、単神経障害の大部分は、傷害または外傷に由来する限局的な損傷に起因する。一般的な原因は、直接的な外傷、神経に対する長期の圧迫、および近隣の構造の腫れまたは傷害による神経の圧縮である。損傷には、神経のミエリン鞘(被覆)または神経細胞の一部(軸索)の破壊が含まれる。この損傷により、神経を介した活動電位の伝達が遅れるかまたは遮断される。単神経障害は、身体のいずれの部位をも含む可能性がある。単神経障害性疼痛には、これらには限定されないが、座骨神経障害、一般的な腓骨神経障害、橈骨神経障害、尺骨神経障害、脳単神経障害VI、脳単神経障害VII、脳単神経障害III(圧縮型)、脳単神経障害III(糖尿病性型)、腋窩神経障害、手根管症候群、大腿神経障害、脛骨神経障害、ベル麻痺、胸部出口症候群、手根管症候群および第六(外転)神経麻痺が含まれる。
c. 全身性末梢神経障害
全身性末梢神経障害は対称的に現れ、一般に、末梢神経系全体に影響を及ぼす様々な全身性の病気や疾患過程に起因する。全身性末梢神経障害はさらにいくつかに分類される。
i. 遠位軸索症は、いくつかの代謝性または中毒性のニューロンの混乱によって起こる。これらは、代謝疾患(例えば糖尿病)、腎不全、不全症候群(例えば栄養障害やアルコール依存症)、または毒素もしくは薬物の影響によって起こる可能性がある。遠位軸索症(つまり後退性神経障害)は、いくつかの代謝性または有毒な末梢神経系(PNS)ニューロンの混乱によって起こる種類の末梢神経障害である。これは、代謝性または中毒性の撹乱に対する神経の最も一般的な反応であり、そのため、代謝疾患、例えば糖尿病、腎不全、欠乏性症候群(例えば栄養障害やアルコール依存症)、または毒素もしくは薬物の影響によって起こる場合がある。遠位軸索症に最も共通の原因は糖尿病であり、最も一般的な遠位軸索症が糖尿病神経障害である。
ii. 髄鞘障害は、活動電位伝達の急な減退を引き起こすミエリンに対する一次性の発作に起因する。最も共通した原因は急性炎症性脱髄性多発神経障害(AIDP; すなわちギラン・バレー症候群)であり、他の原因としては、慢性炎症性脱髄性症候群(chronic inflammatory demyelinating syndrome, CIDP)、遺伝的な代謝障害(例えば、白質ジストロフィー)、または毒素が挙げられる。髄鞘障害はミエリンの一次性の破壊またはシュワン細胞の有髄化に起因し、これらによって軸索は無傷に保たれるが活動電位の伝達は急に減退する。この脱髄によって、神経を通じた活動電位の伝達が遅れるか、または完全に遮断される。最もよく見られる原因は急性炎症性脱髄性多発神経障害(AIDP、ギラン・バレー症候群としてより知られている)であるが、他の原因としては、慢性炎症性脱髄性多発神経障害(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, CIDP)、遺伝的な代謝障害(例えば、白質ジストロフィーもしくはシャルコー・マリー・トゥース病)、または毒素が挙げられる。
iii. 神経細胞障害は末梢神経系(PNS)ニューロンが破壊されることに起因する。これらは、運動ニューロン疾患、感覚神経細胞障害(例えば、帯状疱疹)、毒素または自律神経障害によって引き起こされる場合がある。神経毒、例えば化学療法薬であるビンクリスチンによっても神経細胞障害が生じる場合がある。神経細胞障害は末梢神経系(PNS)のニューロンに生じた損傷に起因する機能不全であり、その結果、末梢神経障害が起こる。これは、運動ニューロン疾患、感覚神経細胞障害(例えば、帯状疱疹)、有毒物質または自律神経障害によって生じる場合がある。原因、病気が神経細胞に影響を与えている様式、および最も影響を受けている神経細胞の種類によって、患者は異なる様式の神経細胞障害を呈する場合がある。
iv. 限局性神経障害(例えば、手根管症候群)
II. 炎症性疼痛
本発明の化合物を、以下の炎症性状態を原因とする、あるいはこれらと関連がある疼痛の治療に使用することができる。
A. 関節炎
関節炎には、例えば、関節リウマチ; 若年性関節リウマチ; 全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus=SLE); 痛風関節炎; 強皮症; 変形性関節症; 乾癬性関節炎; 硬直性脊椎炎; ライター症候群(反応性関節炎); 成人のスチル病; ウイルス感染からの関節炎; 細菌感染からの関節炎、例えば、淋菌性関節炎や非淋菌性細菌性関節炎(敗血性関節炎)など; 第三期ライム病; 結核性関節炎; および真菌感染からの関節炎、例えば、ブラストミセス症などが含まれる。
B. 自己免疫疾患
自己免疫疾患には、例えば、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、I型糖尿病、全身性紅斑性狼、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、紅斑性狼、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群およびグレーブス病が含まれる。
C. 結合組織の障害
結合組織の障害には例えば、脊椎関節炎、皮膚筋炎、および線維筋痛症が含まれる。
D. 傷害
例えば、挫滅、穿刺、組織または間接の伸長などの傷害に起因する炎症は、慢性炎症性疼痛を引き起こす場合がある。
E. 感染
例えば、結核または角膜実質炎などの感染に起因する炎症は、慢性炎症性疼痛を引き起こす場合がある。
F. 神経炎
神経炎は、神経または神経群に影響する炎症性の過程である。症状は含まれる神経によるが、疼痛、異常知覚、不全麻痺、または触覚鈍麻(しびれ)を伴う場合がある。
例としては以下のものが挙げられる:
a. 腕神経炎;
b. 球後視神経障害(眼球のすぐ裏にある視神経の一部分に影響を及ぼす炎症性の過程);
c. 視神経障害(視神経に影響を及ぼす炎症性の過程で、罹患した眼は、突然視力が低下する。視神経炎の原因は分かっていない。視神経(眼と脳を繋いでいる神経)の急な炎症が膨張やミエリン鞘の破壊を引き起こす。この炎症はウイルス感染によって、または多発性硬化症などの自己免疫疾患によって起こることもある。危険因子は原因となる可能性のあるものに関連するものである。);
d. 前庭神経炎(前庭神経に影響を及ぼす炎症性の過程を引き起こすウイルス感染);
G. 関節部分の炎症。
骨液包炎または腱炎等に起因する関節の炎症は、例えば、慢性炎症性疼痛を引き起こす場合がある。
III. 頭痛
本発明の化合物を、以下の頭痛状態のいずれかが原因の、あるいはそれらと関連のある疼痛の治療に用いることができる。頭痛(医学的に頭痛(cephalgia)として知られている)は、頭部における軽度から重度の疼痛状態であり、時には、頸部または上背部の疼痛も頭痛として感じられることがある。頭痛が根底にある局所性または全身性の疾患を示唆していることもあり、または障害そのものであることもある。
A. 筋/筋原性頭痛
筋/筋原性頭痛は、頭頸部の筋肉の締め付けまたは緊張を伴うようであり; 前頭部に広がる場合がある。筋原性頭痛の最も一般的な形態が筋収縮性頭痛である。
筋収縮性頭痛は頭部、頭皮、または頸部の疼痛または不快感を伴う状態であり、一般に、これらの領域の筋肉の締め付けに関連がある。筋収縮性頭痛は頸部および頭皮の筋肉の収縮に起因する。この筋収縮の原因の1つに、ストレス、抑うつ状態または不安に対する反応がある。頭部を長時間、動かすことなく一カ所に固定する活動はいずれも頭痛を引き起こす可能性がある。そのような活動には、タイピングまたはコンピューターの使用、細かい手作業、および顕微鏡の使用が挙げられる。涼しい部屋で寝ることまたは頸をいつもとは違う位置にして寝ることもこの種の頭痛の誘発因子となる場合がある。筋収縮性頭痛には、これらには限定されないが、突発性の筋収縮性頭痛および慢性の筋収縮性頭痛が含まれる。
B. 血管性頭痛
血管性頭痛のうち最も多く見られるのは片頭痛である。他の種の血管性頭痛としては、強い痛みが繰り返し出現する群発頭痛や、高血圧に由来する頭痛がある。
1. 片頭痛
片頭痛は、基本的に頭痛の再発を伴う不均一(heterogeneous)な障害である。片頭痛は、他の症状、例えば、吐き気、嘔吐、または光に対する感受性などと同時に起こるという点で他の頭痛とは異なる。多くの人が、ズキズキとした痛みを頭の片側で感じる。種々の基礎的な病態生理学的および遺伝的機序を有する一群の患者では、ある種の前兆症状、前駆症状の発現、または関連症状(例えばめまい)などの臨床的特徴が見られる場合もある。片頭痛には、これらには限定されないが、前兆のない片頭痛(一般的な片頭痛)、前兆のある片頭痛(古典的片頭痛)、月経性片頭痛、片頭痛等価症(無頭痛性片頭痛)、複雑な片頭痛、腹部片頭痛および筋収縮性との複合型片頭痛が含まれる。
2. 群発頭痛
群発頭痛は、頭部の片側に影響を及ぼし(一側性)、流涙および鼻閉塞と関連がある場合がある。これらは数週間にわたって何度も毎日同じ時間に繰り返し起こり、その後緩解する。
D. 高血圧性頭痛
E. 牽引性および炎症性頭痛
牽引性および炎症性頭痛は通常、脳卒中から副鼻腔感染症にわたる他の疾患の症状である。
F. ホルモン性頭痛
G. 反跳性頭痛
薬物乱用性頭痛としても知られている反跳性頭痛は、頭痛を軽減するために医薬品を頻繁に摂取しすぎた時に起こる。反跳性頭痛は高頻度で毎日起こり、痛みが非常に強くなる可能性がある。
H. 慢性副鼻腔炎による頭痛
副鼻腔炎は、細菌性、真菌性、ウイルス性、アレルギー性または自己免疫性いずれかの副鼻腔の炎症である。慢性副鼻腔炎は、一般的な風邪に最もよく見られる合併症である。症状には、鼻閉塞; 顔面痛; 頭痛; 発熱; 全般的な不定愁訴; 粘性の高い緑色または黄色の眼脂; かがんだ際に顔の「膨満」が悪化するのを感じることが含まれる。例数は少ないが、歯に感染した細菌の蔓延から慢性上顎副鼻腔炎がもたらされる場合もある。慢性過剰増殖性好酸球性副鼻腔炎は非感染性の慢性副鼻腔炎である。
I. 器質性頭痛
J. 発作性頭痛
発作性頭痛は、てんかん発作と関連のある頭痛である。
IV. 体性疼痛
本発明の化合物を、以下に示す体性疼痛状態のいずれかに起因する、あるいはそれらと関連がある疼痛の治療に使用することができる。体性疼痛は、靱帯、腱、骨、血管、さらには神経そのものからも生じ、体性感覚受容器によって検出される。これらの領域における疼痛受容体の欠乏によって、皮膚の疼痛よりも長期間、鈍く局在していない疼痛が引き起こされる。例としては、捻挫や骨折が挙げられる。その他の例には以下のものがある。
A. 筋肉の過度の緊張
筋肉の過度の緊張は、例えば、捻挫または筋挫傷から生じる可能性がある。
B. 反復動作による障害
反復動作による障害は、手、手首、肘、肩、頸、背中、腰、膝、足、脚、または足首を使い過ぎた結果、引き起こされる可能性がある。
C. 筋肉障害
体性疼痛を引き起こす筋肉障害としては例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎、狼瘡、線維筋痛症、リウマチ性多発筋痛、および横紋筋融解症が挙げられる。
D. 筋肉痛
筋肉痛は筋肉の疼痛であり、多数の疾患や障害の症状である。筋肉痛の最も一般的な原因は、筋肉または筋肉群の過剰使用または過剰に伸展させたことのいずれかである。外傷歴を伴わない筋肉痛は、ウイルス感染によるものであることが多い。長期間の筋肉痛は、代謝性筋疾患、いくつかの栄養素の欠乏または慢性疲労症候群を示している場合がある。
E. 感染症
感染症が体性疼痛を引き起こす場合がある。そのような感染症の例としては、例えば、筋内の膿瘍、旋毛虫症、インフルエンザ、ライム病、マラリア、ロッキー山紅斑熱、鳥インフルエンザ、一般的な風邪、肺炎の市中感染、髄膜炎、サル痘、重症急性呼吸器症状、有毒性ショック症候群、旋毛虫症、腸チフス熱、および上部気道感染が挙げられる。
F. 薬物
薬物が体性疼痛を引き起こす場合がある。そのような薬物としては、例えば、コカイン、コレステロール値を下げるためのスタチン(例えばアトルバスタチン、シンバスタチン、およびロバスタチン)、ならびに血圧を下げるためのACE阻害薬(例えばエナラプリルやカプトプリル)が挙げられる。
V. 内臓痛
本発明の化合物を、以下に示す内臓痛状態のいずれかに起因する、あるいはそれらと関連がある疼痛の治療に使用することができる。内臓痛は身体の内臓または器官から生じる。内臓の侵害受容器は臓器や内部の腔に局在している。これらの領域でさらに侵害受容器が欠乏すると、一般に体性疼痛よりもより痛く、長期にわたる疼痛が引き起こされる。内臓痛の局在を特定するのは非常に難しく、また、内臓組織に対するいくつかの傷害は、傷害を受けた部位とは全く関連のない領域に感覚が局在する「関連」痛を示す。内臓痛の例を以下に示す。
A. 機能性内臓痛
機能性内臓痛には例えば、過敏性腸症候群および慢性機能性腹部疼痛(chronic functional abdominal pain, CFAP)、機能性便秘および機能性消化不良、非心臓性胸痛(non-cardiac chest pain, NCCP)および慢性腹部痛が含まれる。
B. 慢性胃腸炎
慢性の胃腸炎には、例えば、胃炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、憩室炎および胃腸炎など); 間質性膀胱炎; 腸管虚血; 胆嚢炎; 虫垂炎; 胃食道逆流症; 潰瘍、腎結石症、尿路感染症、膵炎およびヘルニアが含まれる。
C. 自己免疫疾患による疼痛
自己免疫性の疼痛には、例えば、サルコイドーシスや脈管炎が含まれる。
D. 器質的な内臓痛
器質性の内臓痛には、例えば、外傷性、炎症性もしくは退行性の消化管病変に起因する疼痛、または知覚神経に腫瘍がぶつかっていることによって引き起こされる疼痛がある。
E. 治療によって誘発される内臓痛
治療誘発性の内臓痛には、例えば、化学療法に付随する疼痛または放射線治療に付随する疼痛がある。
VI. 関連痛
本発明の化合物を、以下の関連痛状態のいずれかに起因する、あるいはそれらに関連がある疼痛の治療に用いることができる。
関連痛は、疼痛刺激のある部位とは別の領域に局在する疼痛によって生じる痛みである。しばしば関連痛は、神経がその起点または起点の近傍で圧迫された時または損傷を受けた時に生じる。この場合、損傷がどこか別の場所で起こっていたとしても、疼痛の感覚は通常、その神経が司っている領域で感じられる。よく知られている例としては、脊髄から伸びている神経根が近傍の椎間板によって圧迫される椎間板ヘルニア形成中に起こるものがある。疼痛は損傷を受けた椎間板そのものからも生じる場合があるが、圧迫された神経が司っている領域(例えば、大腿、膝、または足)でも疼痛が感じられる。恒久的な神経損傷が起きていなければ、その神経根に対する圧力を緩和することで関連痛も回復する可能性がある。おそらく、心筋虚血(心筋組織の一部に血流が行き渡らなくなること)が関連痛の中でも最もよく知られている例である。上胸部が締め付けられるような感覚、または左肩、腕、さらには手の痛みとして感じられる。
本発明は、広い範囲の疼痛状態、特に慢性疼痛状態に対処するものである。好ましい状態には、癌性のおよび非癌性の疼痛、炎症性疼痛ならびに神経障害性疼痛が含まれる。炎症性疼痛に対処するには、本出願のオピオイド融合体が特に適しているが、神経障害性疼痛に対処するにはそれほど適していない可能性がある。神経障害性疼痛に対処するには、ガラニン融合体がより好適である。
使用中、本発明のポリペプチドは通常、医薬担体、希釈剤および/または賦形剤と関連した医薬組成物の形態で用いられるが、組成物のはっきりとした形態は、投与方法に合わせることができる。投与は、好ましくは哺乳動物への、より好ましくはヒトへの投与である。
ポリペプチドを、例えば、関節内投与または頭蓋内投与用の無菌溶液の形態で用いてもよい。脊髄注入(例えば硬膜外または鞘内注入)が好ましい。
本発明のポリペプチドを投与するための用量範囲は、所望の治療効果をもたらす範囲となる。当然のことながら、必要とされる用量の範囲は、成分の正確な特質、投与経路、製剤の特質、患者の年齢、患者の状態の特質、程度または重篤度、禁忌症、ある場合には、および主治医の判断による。
一日当たりの好適な用量は、0.0001〜1mg/kgの範囲、好ましくは0.0001〜0.5mg/kg、より好ましくは0.002〜0.5mg/kg、特に好ましくは0.004〜0.5mg/kgの範囲である。単位用量は1マイクログラム未満から30mgまでと様々であってよいが、通常は、用量当たり0.01〜1mgの範囲であり、これを毎日、好ましくはより低頻度で、例えば毎週または6ヶ月ごとに投与することができる。
特に好ましい投与計画は、2.5ngの融合タンパク質を1単位用量とすることに基づくものである。その際、好ましい用量は1単位〜100単位(つまり2.5〜250ng)である。この用量範囲は、他の種類の鎮痛性分子、例えばNSAID類、モルヒネ、およびガバペンチンで用いられる用量範囲よりも有意に低い(つまり、少なくとも10分の1、通常100分の1である)。さらに、上述の違いは、同じ比較をモル換算で行ったときに著しく大きくなる。これは、本発明の融合タンパク質が、標準的な「低」分子治療薬よりもかなり大きな分子量を有するためである。
しかしながら、必要とされる用量は、成分の正確な特質や様々な投与経路の効率の差によって多様になることが予想される。
これら用量レベルの多様性は、当該分野でよく知られているように、最適化のための標準的で経験的に確立された方法によって調整することができる。
注入に適した組成物は、溶液、懸濁液もしくは乳剤、または使用前に好適な媒体に溶解もしくは懸濁する乾燥粉末の形態であってよい。
液状の単位容量形態は通常、発熱物質を含まない、無菌的な媒体を用いて調製される。活性成分は用いられる媒体および濃度に応じて、媒体に溶解または懸濁することができる。
投与可能な溶液の調製では、ポリペプチドを媒体に溶解し、必要に応じてその液体に塩化ナトリウムを加えて等張にし、次いで無菌技術によって、無菌フィルターを通すことで濾過して滅菌し、その後、適した無菌バイアルまたはアンプルに充填し、密閉することができる。あるいは、溶液が十分に安定な場合には、密閉容器に入れた溶液を高圧蒸気滅菌器で滅菌してもよい。
有益な添加剤、例えば緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、保存料または殺菌剤、懸濁剤または乳化剤を媒体に溶解させてもよい。
使用前に好適な媒体に溶解または懸濁させる乾燥粉末は、予め滅菌していた薬剤と他の成分を無菌容器に、無菌の場所で、無菌技術によって充填することで調製することができる。
あるいは、ポリペプチドと他の成分を水溶性の媒体に溶解し、この溶液を濾過によって滅菌し、無菌的の場所で、無菌技術によって好適な容器に分注してもよい。この産物をその後凍結乾燥し、容器を無菌的に密閉する。
筋内、皮下または皮内注入に適した非経口用懸濁も実質的に同じ方法で調製されるが、滅菌した成分を媒体に、溶解するのではなく懸濁させるという点が異なり、また、濾過によって滅菌することはできない。成分は無菌状態で単離してもよく、あるいは、単離した後に、例えばガンマ線照射によって滅菌してもよい。
有益な懸濁剤(例えばポリビニルピロリドン)を組成物に含め、成分の均一な分布を促す。
定義の項
ターゲティング部分(TM)とは、結合部位と機能的に相互作用し、薬剤と標的細胞表面との物理的な結合を生じる、薬剤に関連する任意の化学構造を意味する。本発明では、標的細胞は侵害受容性感覚求心路である。TMという用語は、標的細胞の結合部位に結合することが可能な全ての分子(つまり天然に存在する分子、または化学的/物理的に改変されたその変異体)を包含し、結合部位は、受容体介在性エンドサイトーシス(飲食作用)とも呼ばれる内部移行が可能である(例えばエンドソームの形成)。TMはエンドソーム膜トランスロケーション機能を有していてもよく、その場合には、別個のTM成分とトランスロケーションドメイン成分が本発明の薬剤中に存在している必要はない。
本発明のTMは、侵害受容性感覚求心路(例えば一次侵害受容性求心路)に結合する(好ましくは特異的に結合する)。その際、特異的に結合するとは、TMが侵害受容性感覚求心路(例えば一次侵害受容性求心路)に、他のニューロン、例えば非侵害受容性求心路および/または運動神経(つまりクロストリジウム神経毒のホロ毒素の天然の標的)よりも高い親和性で結合することを意味する。「特異的に結合する」という用語はまた、所与のTMが所与の受容体、例えばガラニン受容体、例えばGALR1、GALR2および/またはGALR3受容体に、106M-1以上の結合親和性(Ka)で、好ましくは107M-1以上、より好ましくは108M-1以上、最も好ましくは109M-1以上の親和性で結合することを意味する場合もある。
本発明の目的では、アゴニストは、標的細胞における開口放出融合の過程を刺激することが可能な分子として定義され、この過程は、前記標的細胞における開口放出融合装置を構成しているタンパク質を切断することが可能なプロテアーゼによる阻害の影響を受けやすい。
従って、本発明の特定のアゴニストの定義からは、慣習的にはアゴニストと見なされる多数の分子が除外される。
例えば、神経成長因子(NGF)はTrkA受容体への結合を介してニューロンの分化を促進する能力という点ではアゴニストであるが、上述の基準によって評価した場合には、NGFはアゴニストではない。なぜならば、NGFは開口放出融合の主要な誘導物質ではないからである。加えて、NGFが刺激する過程(つまり細胞分化)は非細胞傷害性毒素分子のプロテアーゼ活性による阻害の影響を受けにくい。
タンパク質に関連して使用される場合「断片」という用語は、問題となっているタンパク質のアミノ酸残基を少なくとも35、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも20、および最も好ましくは少なくとも19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6または5個有しているペプチドを意味する。
タンパク質に関連して使用される場合「変異体」という用語は、アミノ酸類似体(例えば天然にはないアミノ酸)または置換結合を1つ以上含むタンパク質のペプチドまたはペプチド断片を意味する。
タンパク質に関連して使用される場合「誘導体」という用語は、問題となっているタンパク質にさらなるペプチド配列を含むタンパク質を意味する。さらなるペプチド配列は、好ましくは、そもそものタンパク質の基本的な折り畳み、従って、立体構造を干渉してはならない。2つ以上のペプチド(または断片もしくは変異体)を結合させて誘導体を形成することもできる。あるいは、ペプチド(または断片もしくは変異体)を関連のない分子(例えば第2の関連していないペプチド)に結合させてもよい。誘導体は化学的に合成することもできるが、通常は組換え核酸方法によって調製される。その他の成分、例えば脂質、および/または多糖、および/またはポリペプチド成分を含めてもよい。
非細胞傷害性という用語は、問題となっているプロテアーゼ分子が、再標的化した標的細胞を殺さないことを意味する。
本発明のプロテアーゼは、真核細胞の開口放出融合装置を構成している1つ以上のタンパク質を切断することが可能な全ての天然に存在する非細胞傷害性プロテアーゼを包含する。
本発明の非細胞傷害性プロテアーゼは、好ましくは細菌のプロテアーゼである。一態様において非細胞傷害性プロテアーゼは、クロストリジウム属またはナイセリア属(例えばクロストリジウムのL鎖、またはナイセリアのIgAプロテアーゼ、好ましくは淋菌由来の)から選択される。プロテアーゼという用語は、その機能的に等価な断片および分子も包含する。
本発明はさらに、改変した非細胞傷害性プロテアーゼも包含し、改変した非細胞傷害性プロテアーゼは、改変されたプロテアーゼが上述のプロテアーゼ活性をなおも示す限り、天然には存在しないアミノ酸配列および/または合成したアミノ酸残基を含む。
本発明のプロテアーゼは、好ましくはセリンプロテアーゼ活性またはメタロプロテアーゼ活性(例えばエンドペプチダーゼ活性)を示す。プロテアーゼは好ましくは、SNAREタンパク質(例えばSNAP-25、シナプトブレビン/VAMP、またはシンタキシン)に特異的である。
神経毒のプロテアーゼドメイン、例えば細菌の神経毒のプロテアーゼドメインについて特に注目している。従って本発明は、天然に存在する神経毒、ならびに前記天然に存在する神経毒を組換えて調製した神経毒の、神経毒ドメインの使用を包含する。
神経毒の例としては、クロストリジウム属によって生産されるものがあり、クロストリジウム神経毒という用語は、破傷風菌(TeNT)およびボツリヌス菌(BoNT)血清型A〜Gによって生産される神経毒、ならびにクロストリジウム・バラチ(C. baratii)およびクロストリジウム・ブチリカムによって生産される近縁のBoNT様神経毒を包含する。本明細書全体を通じて上述の略称を使用する。例えば、BoNT/Aという名前は、神経毒の供給源がBoNT(血清型A)であることを示している。対応する名称を他のBoNT血清型にも適用する。
L鎖またはLC断片という用語は、その断片がメタロプロテアーゼ活性を示し、かつ、細胞の開口放出に関与する小胞および/または原形質膜関連タンパク質をタンパク分解性に切断することが可能な、神経毒のL鎖の成分を意味する。
トランスロケーションドメインとは、標的細胞のサイトゾル内でプロテアーゼ活性が機能的に発現するように、プロテアーゼ(またはその断片)を標的細胞内に転位置させることが可能な分子である。どの分子(例えばタンパク質またはペプチド)が本発明に必須のトランスロケーション機能を有しているか否かは、いくつかの標準的な検定のうちのいずれか1つによって確認することができる。
例えば、Shone C. (1987)は、被験分子を植え付けたリポソームを用いるインビトロアッセイについて記載している。必須のトランスロケーション機能の有無は、リポソームからの容易に監視できるK+および/または標識したNADの放出によって確認される[Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180を参照のこと]。
さらなる例がBlaustein R.(1987)によって提供されており、ここでは、平らなリン脂質二重膜を用いた単純なインビトロアッセイが記載されている。この膜に被験分子を植え付け、前記膜のコンダクタンスの上昇によって必須のトランスロケーション機能を確認する[Blaustein(1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115-120を参照のこと]。
膜融合の評価、従ってトランスロケーションドメインの同定が可能な本発明での使用に好適なそのほかの方法は「酵素学の手法(Methods in Enzymology)第220号および第221号、膜融合技術パートAおよびB(Membrane Fusion Techniques, Parts A and B)」Academic Press(1993)で提供されている。
トランスロケーションドメインは、低pH条件で脂質膜にイオン透過性の細孔を形成することができることが好ましい。エンドソーム膜中に細孔を形成することができるタンパク質分子の一部分だけの使用が好ましいことが知られている。
トランスロケーションドメインは、微生物のタンパク質源、具体的には細菌またはウイルスのタンパク質源から得られてもよい。従って、一態様においてトランスロケーションドメインは、酵素、例えば細菌性毒素またはウイルスタンパク質のトランスロケーションドメインである。
細菌の毒素分子の特定のドメインがそのような細孔を形成することが可能なことが十分に立証されている。さらに、ウイルスに発現させた膜融合タンパク質の特定のトランスロケーションドメインがそのような細孔を形成することが可能なことも知られている。そのようなドメインを本発明に用いることができる。
トランスロケーションドメインは、クロストリジウム由来、すなわちHNドメイン(またはその機能的成分)であってよい。HNは、クロストリジウム神経毒の、H鎖のアミノ末端側およそ半分に対応するH鎖の一部分または断片、あるいは完全なH鎖に含まれるその断片に対応するドメインを意味する。このH鎖が、H鎖のHC成分の天然の結合機能を実質的に欠損していることが好ましい。その際、HCの機能は、HCアミノ酸配列を欠失させることで除去することができる(DNA合成のレベルまたは合成後のレベルのいずれかで、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼ処理によって)。あるいは、HCの機能を、化学的または生物学的な処理によって不活性化してもよい。従ってH鎖は、好ましくは、天然のクロストリジウム神経毒(つまりホロ毒素)が結合する標的細胞の結合部位に結合することができない。
一態様においてトランスロケーションドメインは、クロストリジウム神経毒のHNドメイン(またはその断片)である。好適なクロストリジウムのトランスロケーションドメインの例を以下に挙げる。
A型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(449〜871)
B型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(441〜858)
C型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(442〜866)
D型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(446〜862)
E型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(423〜845)
F型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(440〜864)
G型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(442〜863)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基(458〜879)
ボツリヌス菌および破傷風菌における毒素生成の遺伝的基礎の詳細については、Hendersonら(1997)「The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis(クロストリジウム属:分子生物学と病態形成)」Academic pressを参照している。
HNという用語は、天然に存在する神経毒のHN部分、および、改変HN部分が上述のトランスロケーション機能をなおも示す限りは、天然には存在しないアミノ酸配列および/または合成アミノ酸残基を有する改変したHN部分を包含する。
あるいは、トランスロケーションドメインは非クロストリジウム由来であってもよい(表4を参照のこと)。非クロストリジウム由来のトランスロケーションドメインの例としては、これらには限定されないが、ジフテリア毒素のトランスロケーションドメイン[O=Keefeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1992) 89, 6202-6206; Silvermanら、 J. Biol. Chem.(1993) 269, 22524-22532; およびLondon, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51]、シュードモナスA型外毒素のトランスロケーションドメイン[Priorら、Biochemistry(1992) 31, 3555-3559]、炭素毒素のトランスロケーションドメイン[Blankeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1996) 93, 8437-8442]、トランスロケーション機能をもつ、様々な融合性または疎水性のペプチド[Plankら、J. Biol. Chem.(1994) 269, 12918-12924; およびWagnerら(1992) PNAS, 89, pp.7934-7938]、ならびに両親媒性ペプチド[Murataら(1992) Biochem., 31, pp.1986-1992]が挙げられる。トランスロケーションドメインは天然に存在するタンパク質に含まれているトランスロケーションドメインを正確に模倣することができ、または、トランスロケーションドメインは、アミノ酸変異がトランスロケーションドメインの転位置能力を破壊しない限りにおいて、アミノ酸変異を含んでいてもよい。
本発明で使用するのに好適なウイルスのトランスロケーションドメインの具体例には、ウイルスに発現した膜融合タンパク質の特定のトランスロケーションドメインが含まれる。例えば、Wagnerら(1992)およびMurataら(1992)は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素のN末端領域から得られたいくつかの融合性かつ両親媒性のペプチドのトランスロケーション機能(つまり膜融合および小胞形成)について記載している。所望の転位置活性を有していることが知られている他のウイルスに発現させた膜融合タンパク質としては、セムリキ森林ウイルス(SFV)の融合性ペプチドのトランスロケーションドメイン、水疱性口内炎ウイルス(VSV)糖タンパク質Gのトランスロケーションドメイン、SERウイルスFタンパク質のトランスロケーションドメイン、および泡沫状ウイルス外被糖タンパク質のトランスロケーションドメインがある。ウイルスにコードされたスパイクタンパク質、例えば、SFVのE1タンパク質やVSV-Gタンパク質のGタンパク質は、本発明において特定の用途を有する。
下記の表に挙げるトランスロケーションドメインの使用には、その変異体配列の使用も含まれる。変異体は、その変異体が必須のトランスロケーション機能を有していれば、保存的核酸置換および/または核酸の欠失もしくは挿入を1つ以上含んでいてもよい。変異体はさらに、その変異体が必須のトランスロケーション機能を有している限り、アミノ酸置換および/またはアミノ酸の欠失もしくは挿入を1つ以上含んでいてもよい。
Figure 2019004909
以下に、本発明の側面および/または態様を例示する図面の簡単な説明を続ける。
LC/A-スペーサー-ガラニン-スペーサー-HN/A融合タンパク質の精製。実施例3に概要を示す方法により、LC/A-GS18-ガラニン-GS20-HN/A融合タンパク質を大腸菌BL21細胞から精製した。簡単に説明すると、細胞を破壊して得た可溶性の産物を、ニッケルを充填した親和性回収カラムにかけた。結合したタンパク質を100mMのイミダゾールで溶出し、エンテロキナーゼで処理して融合タンパク質を活性化し、その後、Xa因子で処理して麦芽糖結合タンパク質(MBP)タグを除去した。次いで、活性化した融合タンパク質を第2のニッケル充填親和性回収カラムに再びかけた。精製過程から得られた試料をSDS-PAGE(パネルA)およびウェスタンブロット(パネルB)で評価した。ウェスタンブロットでは、抗ガラニン抗血清(Abcamより入手)と抗ヒスタグ抗血清(Qiagenより入手)を一次抗体として使用した。精製した最終産物を、還元剤の非存在下および存在下で、それぞれ、パネルAの[-]および[+]の印を付けたレーンで同定した。パネルA、レーン1=基準のラダーマーカー; 2=可溶画分; 3=最初のHis産物; 4=精製し、活性化させたタンパク質; 5=2回目のHis産物; 6=最終的な精製済みタンパク質5μl; 7=最終的な精製済みタンパク質10μl; 8=最終的な精製済みタンパク質20μl; 9=最終的な精製済みタンパク質5μl+DTT; 10=最終的な精製済みタンパク質10μl+DTT。パネルBレーン1=基準のラダーマーカー; 2=可溶画分; 3=最初のHis産物; 4=精製し、活性化させたタンパク質; 5=2回目のHis産物; 6=最終的な精製済みタンパク質2μl; 7=最終的な精製済みタンパク質5μl; 8=最終的な精製済みタンパク質10μl; 9=最終的な精製済みタンパク質2μl+DTT; 10=最終的な精製済みタンパク質5μl+DTT。 LC/C-スペーサー-ガラニン-スペーサー-HN/C融合タンパク質の精製。実施例3に概要を示す方法により、LC/C-ガラニン-HN/C融合タンパク質を大腸菌BL21細胞から精製した。簡単に説明すると、細胞を破壊して得た可溶性の産物を、ニッケルを充填した親和性回収カラムにかけた。結合したタンパク質を100mMのイミダゾールで溶出し、エンテロキナーゼで処理して融合タンパク質を活性化し、その後、第2のニッケル充填親和性回収カラムに再びかけた。精製過程から得られた試料をSDS-PAGE(パネルA)およびウェスタンブロット(パネルB)で評価した。ウェスタンブロットでは、抗ガラニン抗血清(Abcamより入手)と抗ヒスタグ抗血清(Qiagenより入手)を一次抗体として使用した。精製した最終産物を、還元剤の非存在下および存在下で、それぞれ、パネルAの[-]および[+]の印を付けたレーンで同定した。パネルA、レーン1=基準のラダーマーカー; 2=可溶画分; 3=最初のカラムからの産物; 4=エンテロキナーゼで活性化したタンパク質; 5=最終産物0.1mg/ml(5μl); 6=最終産物0.1mg/ml+DTT(5μl); 7=最終産物0.1mg/ml(10μl); 8=最終産物0.1mg/ml+DTT(10μl)。パネルB、レーン1=マジックマーク(Magic mark); 2=可溶画分; 3=最初のヒスタグカラムからの産物; 4=活性化融合タンパク質; 5=精製したタンパク質0.1mg/ml(5μl); 6=精製したタンパク質0.1mg/ml+DTT(5μl); 7=精製したタンパク質0.1mg/ml+100mm DTT(10μl); 8=精製したタンパク質0.1mg/ml+100mm DTT(10μl)+DTT。 LC-スペーサー-ガラニン-スペーサー-HN融合タンパク質およびLC-HN-ガラニン融合タンパク質のSNARE切断効力の比較。パネルAおよびB:ガラニン融合体が、CHO GALR1 SNAP25細胞内でSNAP-25を切断する能力を評価した。GALR1受容体を発現するように、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を遺伝子導入した。前記細胞がSNAREタンパク質(SNAP-25)を発現するようにさらに遺伝子導入を行った。遺伝子導入細胞を、様々な濃度の異なるガラニン融合タンパク質に24時間暴露した。SDS-PAGEで細胞内タンパク質を分離し、ウェスタンブロットを行い、抗SNAP-25で探査して、SNAP-25切断の評価を促進した。切断されたSNAP-25のパーセンテージを濃度測定解析によって算出した。データから、LC-スペーサー-ガラニン-スペーサー-HN融合体(融合体1)の方がLC-HN-ガラニン融合体およびリガンド非結合LC/A-HN/A対照分子よりも強力なことが明らかである。 種々の血清型骨格を有する本発明のガラニン融合タンパク質を用いた、CHO-GALCHO-GALR1 SNAP-25切断アッセイにおけるGALR1受容体活性化試験。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞がGALR1受容体とSNAP-25を発現するように遺伝子導入した。前記細胞を用い、ガラニンリガンドで受容体が活性化した際に生じるcAMPの欠失を、FRETを使ったcAMPキット(Perkin ElmerのLANCEキット)で測定した。遺伝子導入細胞を様々な濃度の、種々の血清型骨格(つまりボツリヌス神経毒血清型A、B、CおよびDの骨格)を有するガラニン(GA16)融合タンパク質に2時間暴露した。その後、蛍光標識したcAMPトレーサー(ユーロピウム-ストレプトアビジン/ビオチン-cAMP)と蛍光(Alexa)標識した抗cAMP抗体を含む検出用混合物を添加し、室温で24時間インキュベートすることによってcAMPレベルを検出した。次いで試料を320nMで励起し、発光を665nMで測定してcAMPレベルを決定した。データは、種々の血清型骨格を有する本発明のガラニン融合タンパク質がGALR1受容体を活性化したことを示している。 CHO-GALR1 SNAP-25切断アッセイにおける、ガラニン(GA16およびGA30)融合タンパク質によるSNAREタンパク質の切断。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞がGALR1受容体を発現するように遺伝子導入した。前記細胞がSNAREタンパク質(SNAP-25)を発現するようにさらに遺伝子導入を行った。遺伝子導入細胞を様々な濃度のガラニン融合タンパク質に24時間暴露した。SDS-PAGEで細胞内タンパク質を分離し、ウェスタンブロットを行い、その後、抗SNAP-25で探査してSNAP-25切断の評価を促進した。切断されたSNAP-25のパーセンテージを濃度測定解析によって算出した。データは、ガラニン-16およびガラニン-30リガンドを有するガラニン融合タンパク質がSNAREタンパク質を切断することを示している。データはさらに、非細胞傷害性プロテアーゼ成分とプロテアーゼ切断部位との間にGS5、GS10およびGS18スペーサーを含むガラニン融合タンパク質が機能することを裏付けている。 ガラニン融合タンパク質を用いたインビボでの足引っ込め試験の結果。侵害受容性の屈曲反射(足引っ込め(paw guarding)試験としても知られている)は、生じ得る損傷から肢を保護するための、素早い引っ込め動作である。この屈曲反射は、麻酔ラットにおける低用量のカプサイシン、電気刺激またはカプサイシン感作電気応答の結果としての筋電図検査(EMG)反応を評価することで定量可能である。体重300〜380gの雄のスプラーグドーリー(SD)ラットの足底内に、本発明の融合タンパク質を前処理した(24時間)。足の引っ込めは、PBS(7.5％DMSO)に溶解した0.006％のカプサイシン(10μl)を10秒かけて注入することで誘導した。これによって、大腿二頭筋からの強固な反射反応が生じる。侵害受容性屈曲反射の低下/阻害は、被験物質が抗侵害受容作用を示すことを表す。データから、本発明のガラニン融合タンパク質の抗侵害受容作用が示された。 カプサイシン誘導性熱痛覚過敏アッセイにおけるガラニン融合タンパク質の効力。本発明の種々のガラニン融合タンパク質がカプサイシン誘導性熱痛覚過敏を阻害する能力を評価した。SDラットの足底内に融合タンパク質を前処理した24時間後に0.3％のカプサイシンを注入し、ラットを25℃のガラス板の上に置いた(アクリル製の箱に入れたラットを25℃のガラス板の上に置いた)。光線(光強度が調節可能な)を後肢に当てた。足が動いたことを感知器が検出した時点でタイマーを止めた。足引っ込め潜時(Paw Withdrawal Latency)は、ラットが熱源から足を離すまでの時間である(カットオフ値を20.48秒とした)。足引っ込め潜時の減少/阻害は、被験物質が抗侵害受容作用を示すことを表している。1=LC-HN-GA16; 2=LC-HN-GA30; 3=LC-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN-HT; 4=LC-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN-HT; 5=ボトックス; 6=モルヒネ。データは、本発明のガラニン融合タンパク質が、C末端にリガンドをもつ融合タンパク質と比較して高い抗侵害受容作用を持つことを示している。 カプサイシン誘導性熱痛覚過敏アッセイにおけるガラニン融合タンパク質の効力。本発明の種々のガラニン融合タンパク質がカプサイシン誘導性熱痛覚過敏を阻害する能力を評価した。SDラットの足底内に融合タンパク質を前処理した24時間後に0.3％のカプサイシンを注入し、ラットを25℃のガラス板の上に置いた(アクリル製の箱に入れたラットを25℃のガラス板の上に置いた)。光線(光強度を調節可能な)を後肢に当てた。足が動いたのを感知器が検出した時点でタイマーを止めた。足引っ込め潜時は、ラットが熱源から足を離すまでの時間である(カットオフ値を20.48秒とした)。足引っ込め潜時の減少/阻害は、被験物質が抗侵害受容作用を示すことを表している。データは、異なる血清型骨格(つまりA、B、CおよびD)を有する本発明のガラニン融合タンパク質の抗侵害受容作用を示した。 単一のスペーサーまたは2つのスペーサーを有するガラニン融合タンパク質の活性化。非細胞傷害性プロテアーゼ成分とターゲティング部分成分の間に位置している本発明の第1のスペーサー(スペーサー1)を欠損しているガラニン融合タンパク質は、プロテアーゼによる活性化が弱かった(パネルAおよびB)。パネルCは、第1のスペーサー(スペーサー1)と第2の(スペーサー2)スペーサーの両方を有している本発明のガラニン融合タンパク質の活性化が高かったことを示している。パネルAおよびB:1)基準のラダーマーカー; 2)非活性化対照; 3)非活性化対照+DTT; 4)プロテアーゼで活性化したタンパク質+0.0mM ZnCl2; 5)プロテアーゼで活性化したタンパク質+0.0mM ZnCl2+DTT; 6)プロテアーゼで活性化したタンパク質+0.2mM ZnCl2; 7)プロテアーゼで活性化したタンパク質+0.2mM ZnCl2+DTT; 8)プロテアーゼで活性化したタンパク質+0.4mM ZnCl2; 9)プロテアーゼで活性化したタンパク質+0.4mM ZnCl2+DTT; 10)プロテアーゼで活性化したタンパク質+0.8mM ZnCl2; 11)プロテアーゼで活性化したタンパク質+0.8mM ZnCl2+DTT。パネルC:1)基準のラダーマーカー; 2)非活性化対照25℃; 3)非活性化対照25℃+DTT; 4)プロテアーゼで活性化したタンパク質25℃; 5)プロテアーゼで活性化したタンパク質25℃+DTT; 6)基準のラダーマーカー。
配列番号
以下に示す配列番号のいずれかに開始メチオニンアミノ酸残基または対応する開始コドンが表示されている場合、前記残基/コドンは随意選択である。
配列番号1: LC/AのDNA配列
配列番号2: HN/AのDNA配列
配列番号3: LC/BのDNA配列
配列番号4: HN/BのDNA配列
配列番号5: LC/CのDNA配列
配列番号6: HN/CのDNA配列
配列番号7: ガラニンGA30のタンパク質配列
配列番号8: ガラニンGA16のタンパク質配列
配列番号9: LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A-HTのDNA配列
配列番号10: LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A-HTのタンパク質配列
配列番号11: LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/Aのタンパク質配列
配列番号12: LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/A-HTのDNA配列
配列番号13: LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/A-HTのタンパク質配列
配列番号14: LC/A-GS5-EN-CPGA16-HN/A-GS20のタンパク質配列
配列番号15: LC/A-GS5-EN-CPGA30-GS20-HN/A-HTのDNA配列
配列番号16: LC/A-GS5-EN-CPGA30-GS20-HN/A-HTのタンパク質配列
配列番号17: LC/A-GS5-EN-CPGA30-GS20-HN/Aのタンパク質配列
配列番号18: LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/B(K191A)-HTのDNA配列
配列番号19: LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/B(K191A)-HTのタンパク質配列
配列番号20: LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/B(K191A)のタンパク質配列
配列番号21: LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/B-HTのDNA配列
配列番号22: LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/B-HTのタンパク質配列
配列番号23: LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/Bのタンパク質配列
配列番号24: LC/C-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/C-HTのDNA配列
配列番号25: LC/C-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/C-HTのタンパク質配列
配列番号26: LC/C-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/Cのタンパク質配列
配列番号27: LC/D-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/D-HTのDNA配列
配列番号28: LC/D-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/D-HTのタンパク質配列
配列番号29: LC/D-GS5-EN-CPGA16-HN/D-GS20のタンパク質配列
配列番号30: LC/A-GS5-EN-CPGA16-HX27-HN/A-HTのDNA配列
配列番号31: LC/A-GS5-EN-CPGA16-HX27-HN/A-HTのタンパク質配列
配列番号32: LC/A-GS5-EN-CPGA16-HX27-HN/A-のタンパク質配列
配列番号33: LC/A-GS10-EN-CPGA16-HN/A-GS20-HTのタンパク質配列
配列番号34: LC/A-GS10-EN-CPGA16-GS20-HN/Aのタンパク質配列
配列番号35: LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS15-HN/A-HTのタンパク質配列
配列番号36: LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS15-HN/Aのタンパク質配列
配列番号37: LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS10-HN/A-HTのタンパク質配列
配列番号38: LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS10-HN/Aのタンパク質配列
配列番号39: LC/A-GS18-EN-CPGA16-HX27-HN/A-HTのタンパク質配列
配列番号40: LC/A-GS18-EN-CPGA16-HX27-HN/Aのタンパク質配列
配列番号41: LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS15-HN/A-HTのタンパク質配列
配列番号42: LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS15のタンパク質配列
配列番号43: LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS10-HTのタンパク質配列
配列番号44: LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS10のタンパク質配列
配列番号45: LC/A-GS10-EN-CPGA16-HX27-HTのタンパク質配列
配列番号46: LC/A-GS10-EN-CPGA16-HX27のタンパク質配列
配列番号47: LC/A-GS10-EN-CPGA16-GS15-HN/A-HTのタンパク質配列
配列番号48: LC/A-GS10-EN-CPGA16-GS15-HN/Aのタンパク質配列
配列番号49: LC/A-GS10-EN-CPGA16-GS10-HN/A-HTのタンパク質配列
配列番号50: LC/A-GS10-EN-CPGA16-GS10-HN/Aのタンパク質配列
配列番号51: IgAプロテアーゼのDNA配列
配列番号52: IgA-GS5-CPGA16-GS20-HN/A融合体のDNA配列
配列番号53: IgA-GS5-CPGA16-GS20-HN/A融合体のタンパク質配列
配列番号54: DTトランスロケーションドメインのDNA配列
配列番号55: LC/A-GS5-GA16-GS20-DTのDNA配列
配列番号56: LC/A-GS5-GA16-GS20-DTのタンパク質配列
配列番号57: TeNT LCのDNA配列
配列番号58: TeNT LC-GS5--CPGA16-GS20-HN/AのDNA配列
配列番号59: TeNT LC-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/Aのタンパク質配列
実施例1-ガラニン融合タンパク質の構築と活性化
LC/AおよびHN/A骨格クローンの調製
以下の手順に従って、多ドメイン融合体を発現させるための骨格成分として使用するLC断片およびHN断片を作成する。この実施例は血清型Aを基礎とするクローン(配列番号1および配列番号2)の調製に基づいて記載するが、この手順と方法は、血清型B(配列番号3および配列番号4)ならびに血清型C(配列番号5および配列番号6)に関して配列リストに示しているその他の血清型(つまり血清型A、B、C、DおよびE)にも同様に使用することができる。
クローニングベクターと発現ベクターの調製
選択された標準的なクローニングベクターはpCR4(Invitrogen)である。選択の理由は、ベクターと構築物を簡便に確認するための隣接する配列決定プライマー部位内に制限配列を欠くからである。発現ベクターは、マルチクローニングサイト内に、挿入断片を構築するのに正しい向きで所望の制限配列を有する(BamHI-SalI-PstI-HindIII)pMAL(NEB)発現ベクターを基礎とする。発現ベクターの断片を除去して非可動性プラスミドを作成し、様々な異なる融合タグを挿入して精製の選択肢を増やした。
プロテアーゼ(例えばLC/A)挿入物の調製
LC/A(配列番号1)を2通りの方法のうちの1つで作成する。
DNA配列を、様々な逆翻訳ソフトウェアツールのうちの1つ[例えばEditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR社)、またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]を使ったLC/Aアミノ酸配列[自由に利用できるデータベース、例えばGenBank(受入番号P10845)またはSwissprot(受入遺伝子座BXA1_CLOBO)から得られる]の逆翻訳によって設計する。BamHI/SalIの認識配列を配列の5’末端と3’末端のそれぞれに、正しい読み枠を維持しながら組み込む。逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列に関してDNA配列をスクリーニングする(例えばDNASTAR社のMapDrawソフトウェアを利用して)。クローニングシステムに必要とされる切断配列と共通であることが判明した配列は全て、大腸菌に共通のコドン使用頻度を維持しながら、提案されたコード配列から手作業で除去する。大腸菌のコドン使用頻度は、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser(Geneart)を参照することで評価し、GC含量(％)とコドン使用頻度の割合は、公開されているコドン使用頻度表(例えばGenBankのリリース143、2004年9月13日)を参考に評価する。このLC/Aのオープン読み枠(ORF)を含む最適化したDNA配列を次に(例えばEntelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによって)商業的に合成し、pCR4ベクターに組み込む。
別の方法では、BamHIおよびSalI制限酵素配列を組み込んだ5’および3’PCRプライマーそれぞれを使った、既存のDNA配列のPCR増幅を利用する。相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは供給業者(例えばMWGまたはSigma-Genosys)により化学的に合成され、それぞれのプライマー対は、クロストリジウムの標的DNAに隣接している向かい合った鎖にハイブリダイズする、つまりオリゴヌクレオチドのうちの1本がDNA二本鎖のうちの片方にハイブリダイズする能力をもっている(3’末端が互いの「方を」向く)。PCR産物を生成するには、クロストリジウムのDNA配列に特異的な短いオリゴヌクレオチドプライマーの対をクロストリジウムのDNA鋳型および他の反応成分と混合し、反応チューブのインキュベーション温度を自動で変え、およそ94℃(変性)、55℃(オリゴヌクレオチドのアニーリング)、および72℃(合成)の間で循環させることのできる機械(「PCR装置」)に入れる。PCR産物の増幅に必要な他の試薬としては、DNAポリメラーゼ(例えばTaqまたはPfuポリメラーゼ)、等モル量(50〜200μM)のDNAの4種類のヌクレオチドdNTP構築ブロックのそれぞれおよびMg2+濃度が最適化されている(0.5〜5mM)酵素に適した緩衝液が挙げられる。
幅産物を、Taq PCR産物用のTOPO TAクローニングキットまたはPfu PCR産物用のZero Blunt TOPOクローニングキット(どちらのキットもInvitrogenから市販されている)のいずれかを利用してpCR4にクローニングする。得られたクローンを配列決定で確認する。その後クローニングシステムに適合しない付加的な制限配列はいずれも部位特異的突然変異生成によって除去する[例えば、Quickchange(Stratagene社)を使って]。
トランスロケーション(例えばHN)挿入の調製
HN/A(配列番号2)を2通りの方法のうちの1つで作成する。
DNA配列を、HN/Aアミノ酸配列[自由に利用可能なデータベース、例えばGenBank(受入番号P10845)またはSwissprot(受入遺伝子座BXA1_CLOBO)から得られる]の逆翻訳によって、様々な逆翻訳ソフトウェアツールのうちの1つ[例えばEditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR社)、またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]を使って設計する。正しい読み枠が維持されていることを確認しながら、PstI制限配列をN末端に、XbaI-終止コドン-HindIIIをC末端に付加する。逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列に関してDNA配列をスクリーニングする(例えばDNASTAR社のMapDrawソフトウェアを利用して)。クローニングシステムに必要とされる配列と共通であることが判明した配列は全て、大腸菌に共通のコドン使用頻度が維持されているのを確認しながら、提案されたコード配列から手作業で除去する。大腸菌のコドン使用頻度は、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser(Geneart)を参照することで評価し、GC含量(％)とコドン使用頻度の割合は、公開されているコドン使用頻度表(例えばGenBankのリリース143、2004年9月13日)を参考に評価する。次いでこの最適化したDNA配列を次に(例えばEntelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによって)商業的に合成し、pCR4ベクターに組み込む。
別の方法では、PstIおよびXbaI-終止コドン-HindIII制限酵素配列を組み込んだ5’および3’PCRプライマーそれぞれを用いる、既存のDNA配列のPCR増幅を利用する。PCR増幅は上述のように行う。PCR産物をpCR4ベクターに挿入し、配列決定で確認する。その後、クローニングシステムに適合しない付加的な制限配列はいずれも部位特異的突然変異生成によって除去する[例えば、Quickchange(Stratagene社)を使って]
LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A融合体の調製
LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A構築物を作成するために、BamHI-SalI-GS18-プロテアーゼ部位-GS20-PstI-XbaI-終止コドン-HindIIIと配置し、活性化用のエンテロキナーゼ部位を付加したA血清型リンカーを合成する。このリンカーをコードしているpCR4ベクターをBamHI+SalI制限酵素で切断する。次に切断したベクターを、これもBamHI+SalIで切断したLC/A DNA(配列番号1)の挿入およびライゲーション受け入れ先として用いる。この構築物をその後BamHI+HindIIIで切断し、発現ベクター、例えばpMALプラスミド(NEB)またはpETを基礎とするプラスミド(Novagen)に挿入する。得られたプラスミドDNAをPstI+XbaI制限酵素で切断し、次いでHN/A DNA(配列番号2)をPstI+XbaI制限酵素で切断して、同様に切断したpMALベクターに挿入してpMAL-LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A-XbaI-ヒスタグ-終止コドン-HindIIIを作成する。最終的な構築物は、配列番号10に示した配列をタンパク質として発現させるためのGS18-EN-CPGA16-GS20スペーサーORFを含む。
活性化アッセイ
NuPAGE 4-12％Bis-Trisゲル(10、12および15ウェルの分注済ゲル)を使用して、プロテアーゼ処理後の融合タンパク質の活性化を解析した。タンパク質試料を、基本的には最終容量が100μlになるように、NuPAGE 4×LDS試料用緩衝液で調製した。タンパク質濃度に応じて試料を希釈するか、または希釈せずに容量を調製した(75μlの試料、25μlの試料用緩衝液)。ゲルに吸着させる前に、試料を混合し、その後95℃にした加熱器上で5分間加熱した。5〜20μlの試料を5μlのタンパク質マーカー(Benchmark(登録商標)タンパク質マーカー、Invitrogen)と共に吸着させた。ゲルは通常、50分間、200Vで泳動した。ゲルをdH2Oに浸漬し、マイクロ波を最大出力で2分間当てた。ゲルをすすぎ、マイクロ波を当てる工程を繰り返した。ゲルを染色用の箱に移し、Simply Blue SafeStain(Invitrogen)に浸漬した。これを最大出力のマイクロ波に1分間かけ、その後0.5〜2時間置いて染色した。次いで、Safestainを洗い流し、ゲルをdH2Oですすぐことで、ゲルを脱染した。ゲルをdH2O中に一晩おいて脱染し、その後GeneGnome(Syngene)撮像装置で画像を撮影した。完全長融合タンパク質(プロテアーゼ処理後)に対応する帯域の密度を比較して、非還元条件および還元条件での総活性化タンパク質を算出した。
実施例2-様々な長さのスペーサーを有するLC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A融合タンパク質ファミリーの調製
実施例1で用いたのと同じ方法で、ガラニン16と含量の異なるスペーサーをコードしているいくつかのDNAリンカーを調製した。様々な逆翻訳ソフトウェアツールのうちの1つを使い[例えばEditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR社)、またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]、スペーサー1-プロテアーゼ部位-リガンド-スペーサー2領域をコードしているDNA配列を決定する。次いでこのDNA配列に制限部位を組み込み、BamHI-SalI-スペーサー1-プロテアーゼ部位-CPGA16-NheI-スペーサー2-SpeI-PstI-XbaI-終止コドン-HindIIIと配置することが可能である。重要なことは、確実にスペーサーであるGA16および制限配列の正しい読み枠を維持すること、ならびにXbaI配列の前にDAMメチル化を引き起こすTC塩基を配置しないことである。DNA配列を組み込んだ制限配列に関してスクリーニングし、余計な配列をいずれも、一般的な大腸菌におけるコドン使用頻度を確実に維持しながら手作業で残りの配列から除去する。大腸菌のコドン使用頻度は、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser(Geneart)を参照することで評価し、GC含量(％)とコドン使用頻度の割合は、公開されているコドン使用頻度表(例えばGenBankのリリース143、2004年9月13日)を参考に評価する。次いでこの最適化したDNA配列を(例えばEntelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによって)商業的に合成し、pCR4ベクターに組み込む。
以下の表に示すスペーサー-リンカーを作成した。
Figure 2019004909
一例として、LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/A融合構築物(配列番号12)を生成するために、BamHI-SalI-GS5-プロテアーゼ部位-GS20-PstI-XbaI-終止コドン-HindIIIをコードしているpCR4ベクターから、リンカーをBamHI+SalI制限酵素で切断する。この切断したベクターをその後、これもBamHI+SalIで切断したLC/A DNA(配列番号1)の挿入およびライゲーション(連結反応)のための受け入れベクターとして用いる。得られたプラスミドDNAをBamHI+HindIII制限酵素で切断し、得られたLC/A-リンカー断片を、BamHI、SalI、PstI、およびHindIIIのための多重クローニング部位を含む同様に切断されたベクター、例えばpMALベクター(NEB)またはpETベクター(Novagen)に挿入した。次いで、HN/A DNA(配列番号2)をPstI + HindIII制限酵素で切断し、同様に切断したpMAL-LC/A-リンカー構築物に挿入した。最終的な構築物は、配列番号13に示した配列のタンパク質として発現させるためのLC/A-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/A ORFを含む。
実施例3-ガラニン融合タンパク質の精製方法
25mlのHEPES(50mM、pH7.2、200mMのNaCl含有)と約10gの大腸菌BL21細胞のペーストが入ったファルコンチューブを解凍する。解凍した細胞ペーストをHEPES(50mM、pH7.2、200mMのNaCl含有)で80mlにし、氷上で超音波処理する。試料を確実に冷やした状態で、出力22ミクロンの超音波処理を30秒、次いで30秒間処理を停止させる操作を10回繰り返す。溶解した細胞を18,000rpm、4℃で30分間遠心する。上清を、0.1MのNiSO4を充填し、HEPES(50mM、pH7.2、200mMのNaCl含有)で平衡化したキレートカラムに吸着させる(20〜30mlのカラムで十分である)。段階的に濃度勾配をかけたイミダゾール(10および40mM)を使用して非特異的な結合タンパク質を洗い流し、融合タンパク質を100mMのイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5LのHEPES(50mM、pH7.2、200mMのNaCl含有)に対して4℃で一晩透析し、透析した融合タンパク質のODを測定する。融合タンパク質が麦芽糖結合タンパク質を含む場合には、精製した融合タンパク質100μg当たり1μgのエンテロキナーゼ(1mg/ml)と精製した融合タンパク質1mgあたり10μlのXa因子を加える。25℃で一晩静置する。0.1MのNiSO4を充填し、HEPES(50mM、pH7.2、200mMのNaCl含有)で平衡化したキレートカラムに負荷する(20〜30mlのカラムで十分である)。50mMのHEPES(pH7.2、200mMのNaCl含有)を用い、カラムを基準まで洗浄する。段階的に濃度勾配をかけたイミダゾール(10および40mM)を使用して非特異的な結合タンパク質を洗い流し、融合タンパク質を100mMのイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5LのHEPES(50mM、pH7.2、200mMのNaCl含有)に対して4℃で一晩透析し、およそ2mg/mlまで濃縮し、試料を一定分量に分けて-20℃で凍結する。
実施例4-A血清型活性化配列を有するLC/C-GA16-HN/C融合タンパク質の調製
実施例1および2で用いた方法に従って、LC/C(配列番号5)およびHN/C (配列番号6)を生成して、BamHI-SalI-スペーサー1-プロテアーゼ部位-GA16-NheI-スペーサー2-SpeI-PstI-XbaI-終止コドン-HindIIIに配置されたA血清型リンカーに挿入する。最終的な構築物は、配列番号25に示した配列のタンパク質として発現させるためのLC-スペーサー1-GA16-スペーサー2-HN ORFを含有する。
実施例5-IgAプロテアーゼ-GA16-HN/A融合タンパク質の調製
IgAプロテアーゼのアミノ酸配列を、自由に利用できるデータベース、例えばGenBank(受入番号P09790)から得た。淋菌のIgAプロテアーゼ遺伝子の構造に関する情報は文献から得られる(Pohlnerら、Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease, Nature, 1987, 325(6103), 458-62)。Backtranslation tool v2.0(Entelechon)を使い、大腸菌で発現させるために改変したIgAプロテアーゼをコードしているDNA配列を決定した。BamHIの認識配列をIgA DNAの5’末端に、またシステインアミノ酸をコードしているコドンとSalI認識配列を3’末端に組み込んだ。このDNA配列を、MapDraw(DNASTAR社)を用いて、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素の切断配列に関してスクリーニングした。クローニングに必要とされる切断配列と共通であることが判明した配列は全て、大腸菌に共通のコドン使用頻度を確実に維持しながら、提案されたコード配列から手作業で除去する。大腸菌のコドン使用頻度は、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser(Geneart)を参照することで評価し、GC含量(％)とコドン使用頻度の割合は、公開されているコドン使用頻度表を参考に評価した。その後、IgAのオープンリーディングフレーム(ORF)を含むこの最適化したDNA配列(配列番号51)を商業的に合成した。
BamHIおよびSalI制限酵素を使用し、IgA(配列番号51)をLC-GS5-CPGA16-GS20-HN ORFに挿入し、LCをIgAプロテアーゼのDNAに置き換える。最終的な構築物は、配列番号53に示す配列のタンパク質として発現させるためのIgA-GS5-CPGA16-GS20-HN ORFを含む。
実施例6-破傷風由来のLCドメインを含有するガラニン標的化エンドペプチダーゼ融合タンパク質の調製
様々な逆翻訳ソフトウェアツールのうちの1つ[例えばEditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR社)、またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]を使って、破傷風毒素のLCアミノ酸配列(自由に利用できるデータベース、例えばGenBank(受入番号X04436)から得られる)を逆翻訳することでDNA配列を設計する。正しい読み枠を維持しながら、BamHI/SalI認識配列をそれぞれ配列の5’および3’末端に組み入れる(配列番号57)。このDNA配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列に関してスクリーニングする(例えばDNASTAR社のMapDrawソフトウェアを利用して)。クローニングシステムに必要とされる切断配列と共通であると判明した配列は全て、大腸菌に共通のコドン使用頻度を確実に維持しながら、提案されたコード配列から手作業で除去する。大腸菌のコドン使用頻度は、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser(Geneart)を参照することで評価し、GC含量(％)とコドン使用頻度の割合は、公開されているコドン使用頻度表(例えばGenBankのリリース143、2004年9月13日)を参考に評価する。その後、破傷風毒素LC読み取り枠(open reading frame = ORF)を含有するこの最適化したDNA配列を(例えばEntelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによって)商業的に合成し、pCR4ベクター(Invitrogen)に組み込む。TeNT LCをコードしているpCR4ベクターをBamHIとSalIで切断する。次いでこのBamHI-SalI断片を、これもBamHIとSalIで切断しておいたLC/A-GA16-HN/Aベクターに挿入する。最終的な構築物は、配列番号58に示す配列のタンパク質として発現するためのTeNT LC-GS5-GA16-GS20-HN ORF配列を含む。
実施例7-CHO-K1 GALR1の構築、GALR2受容体活性化アッセイ、およびSNAP-25切断アッセイ
細胞株の生成
ヒトガラニン1受容体(CHO-K1-Gal-1R; 製品番号ES-510-C)またはヒトガラニン2受容体(CHO-K1-Gal-2R; 製品番号ES-511-C)のいずれかを安定に発現しているCHO-K1細胞をPerkin-Elmer(バックス、英国)から購入した。必要に応じて、Lipofectamine(登録商標)2000を使用して細胞にSNAP-25のDNAを遺伝子導入し、4時間インキュベートし、その後培地を交換した。24時間後、細胞をT175フラスコに移した。さらに24時間後、100μg/mlのゼオシンを添加してSNAP-25を発現している細胞の選抜を開始し、受容体への選択圧を維持するために5μg/mlのブラストサイジンを添加した。細胞を、コンフルエンス(集密度)を30〜70％に維持するために2〜3日おきに継代しながら、選択剤を含有している培地中で2週間維持した。その後細胞を、96ウェルのマイクロプレートの1ウェルにつき0.5細胞になるように選択培地で希釈した。数日後、プレートを顕微鏡で調べ、コロニーを1つだけ含むウェルに印を付けた。これらのウェルの培地を1週間ごとに交換した。ウェル内で細胞が集密になったら、細胞をT25フラスコに移した。十分に増えたらそれぞれのクローンを96ウェルプレートに24ウェルずつ播種し、その他に凍結保存用のバイアルも作成した。細胞に、本発明のガラニン融合タンパク質およびLC/A-HNAを24時間加え、その後ウェスタンブロットを行ってSNAP-25の切断を検出した。SNAP-25の帯域が強く検出され、融合体の切断レベルも高かったクローンをその後の解析のために維持した。これらについて完全な容量曲線を作成し、ガラニン融合タンパク質とLC/A-HNA切断レベルとの差が最も大きいクローンを選抜した。
GALR1受容体活性化アッセイ
GALR1受容体活性化アッセイでは、FRETに基づくcAMP(Perkin ElmerのLANCE cAMPキット)を使用してフォルスコリンで刺激した細胞内cAMPの減少を定量して、遺伝子導入したCHO-K1細胞におけるGALR1受容体に対するリガンドの有効性ならびに固有の効力を測定する。刺激後、蛍光標識したcAMPトレーサー(ユーロピウム-ストレプトアビジン/ビオチン-cAMP)と蛍光(Alexa)標識した抗cAMP抗体を、細胞を含む溶解緩衝液に添加する。細胞由来のcAMPは、抗体の結合部位でcAMPトレーサーと競合する。測定時には320nmの光パルスでcAMPトレーサーの蛍光部分(ユーロピウム)を励起する。ユーロピウムから生じたエネルギーはトレーサーに結合しているAlexa fluor標識抗体に転移し、665nmの時間分解蛍光共鳴エネルギー転移(TR-FRET)のシグナルを発する(TR-FRETは、特異的な結合反応によってもたらされる、ドナーの標識であるユーロピウムとアクセプターの標識であるAlexa fluorの近接に基づくものである)。ユーロピウムからの残留エネルギーによって615nmの光が発生する。アゴニストを処理した細胞ではトレーサーと競合するcAMPの量が低下し、フォルスコリンだけを処理した試料と比較して、665nmのシグナルの用量依存的な増加が観察される。665nmのシグナルを各実験に含まれるcAMPの検量線に当てはめて、cAMP濃度に換算する。
ギルソン社のピペットとSigmacoteで処理したチップまたは低吸着性のチップを用い、エッペンドルフ社の500μl深型低吸着プレートの最初の2つのカラム中で、試験材料と標準物質を10μMフォルスコリンを含むアッセイ緩衝液で適切な濃度に希釈した。1番目のカラムと2番目のカラムで選択された濃度は対数単位の半分(half a log unit)離れている。ここから段階的に1:10で希釈し、プレート内に100.5倍間隔で11種類の濃度を作成した(電動の8チャネルピペットをsigmacoteまたは低吸着性のチップと共に使用)。12番目のカラムにはアッセイ緩衝液のみを加えて「基準」とした。12チャネルのデジタルピペットを使用し、低吸着プレートから試料を10μlずつ、optiplate(96ウェルのマイクロプレート)に移した。
多チャネルのデジタルピペットを使用して検量線用のウェルに10μlのアッセイ緩衝液を添加した。被験物質の入ったウェルには、アッセイ緩衝液に溶解した適切な濃度の細胞を10μl加えた。プレートを密閉し、室温で120分間インキュベートした。最初1時間は、IKA MTS 2/4回転振とう器上で、最高速度で撹拌した。
LANCE Eu-W8044で標識したストレプトアビジン(Eu-SA)とビオチン-cAMP(b-cAMP)をcAMP検出用緩衝液(どちらもPerkin ElmerのLANCE cAMPキット)で希釈し、希釈率がそれぞれ1:17および1:5の保存液を作成した。これら2種の保存液を検出用緩衝液で1:125倍に希釈することで、最終的な検出用混合物を調製した。この混合物を室温で15〜30分間インキュベートし、その後、1:200に希釈したAlexa Fluor(登録商標)647-抗cAMP抗体(Alexa-Fluor Ab)を加えた。ボルテックスで短時間混合した後、そのうちの20μlを、多チャネルのデジタルピペットを使ってすぐに各ウェルに加えた。マイクロプレートを密閉し、室温で24時間インキュベートした(最初1時間は、IKA MTS 2/4回転振とう器上で、最高速度で撹拌した)。プレートのシールをはがし、その後、Envisionで測定した。
GALR2受容体活性化アッセイ
GALR2受容体活性化アッセイでは、受容体が活性化された時に生じるカルシウムの移動を測定して、遺伝子導入したCHO-K1細胞におけるGALR2受容体に対するリガンドの有効性と固有の効力を測定する。処理の前に、遺伝子導入した細胞にカルシウム感受性色素(FLIPR)を予め吸着させておく。Flexstation 3マイクロプレートリーダー(Molecular devices)による測定時には485nmの光パルスにより蛍光色素が励起され、525nmの発光が生じる。これによって、細胞内カルシウムの変化がリアルタイムの蛍光データとして得られる。アゴニストで処理した細胞では受容体が活性化され、カルシウムの移動が増加する。この変化は、525nMの相対蛍光単位(RFU)の上昇として測定される。
受容体活性化アッセイ用の細胞培養
Glutamax、10％のウシ胎仔血清、5μg/mlのブラストサイジンおよび100μg/mlのゼオシンを含むHam F12の入ったT175フラスコに細胞を播種し、培養した。フラスコを集密度が60〜80％になるまで、37℃、5％CO2の湿潤環境でインキュベートした。回収日に培地を除去し、細胞を25mlのPBSで2回洗浄した。10mlのTryple Expressを添加して37℃で10分間インキュベートし、その後フラスコを軽く叩いて、細胞をフラスコから取り出した。取り出した細胞を50mlの遠心管に移し、フラスコを10mlの培地で2回洗浄して、この培地を細胞懸濁液に加えた。遠心管を1300×gで3分間遠心し、上清を除去した。細胞を、10mlの培地(細胞が凍結している場合)またはアッセイ緩衝液(アッセイに「新鮮な」細胞を使用する場合)で丁寧に再懸濁し、試料を取り出してnucleocounter(ChemoMetec)で計数した。「新鮮な」状態でアッセイに使用する細胞は、適切な濃度になるまでアッセイ緩衝液でさらに希釈した。凍結用に回収した細胞は再度遠心し(1300×gで3分間)、上清を除去した後、細胞を4℃で3×106細胞/mlになるようにSynth-a-freezeに再度懸濁した。細胞懸濁液を1mlずつ含む凍結用バイアルを、凍らせておいたNalgene社のMr Frosty凍結容器(冷却速度:-1℃/分)に入れ、一晩、-80℃の冷凍庫に置いた。翌日、バイアルを液体窒素保存タンクの気相に移した。
図4は、それぞれのガラニンリガンド(つまりガラニン-16とガラニン-30)および種々の血清型骨格(つまりLC/A-HN/A、LC/B-HN/B、LC/C-HN/CおよびLC/D-HN/D)を有する本発明のガラニン融合タンパク質がGALR1受容体を活性化することを示している。
CHO-K1 GALR1 SNAP-25切断アッセイ
培養した細胞を様々な濃度のガラニン融合タンパク質に24時間暴露した。細胞内タンパク質をSDS-PAGEで分離し、抗SNAP-25抗体を用いるウェスタンブロットを行ってSNAP-25切断の評価を促進した。SNAP-25の切断は濃度測定解析(Syngene)によって算出した。
細胞のプレーティング
細胞を2×10e5個細胞/mlに調製し、96ウェルプレートの各ウェルに125μlずつ播種する。以下の培地を使用する:Glutamax(製品番号31765068)、50mlのFBS、5μg/mlのブラストサイジン(250μlずつ小分けにして冷凍庫に入れた箱に入れておいたもの、G13)(Calbiochem#203351、10ml、10mg/ml)、100μg/mlのゼオシン(500μl、冷凍庫に入れた箱に入れておいたもの、G35)(フィッシャー社のInvitrogenのもの。8本の1.25mlチューブに100mg/mlの濃度で1gずつ入っている。製品番号VXR25001)を含む500mlのGibco Ham F12培地。細胞を24時間生育させる(37℃、5％CO2、湿潤雰囲気)。
細胞の処理
各被験タンパク質の容量範囲に応じて被験タンパク質を希釈する(各ウェルに入れておいた125μlの培地に125μlの試料を直接のせるため、所望の最終濃度の2倍のものを準備する)。希釈用にCHO GALR1栄養培地を濾過滅菌する(20mlシリンジ、0.2μmシリンジフィルター)。ギルソン社のピペットまたはマルチステッパーを使って、濾過した培地を0.9mlずつ、表示付ビジュー容器5本(7mlのチューブ)に加える。被験タンパク質のストックを2000nM(標準ストック溶液1)および600nM(標準ストック溶液2)に希釈する。ギルソン社のピペットを使い、次の濃度に段階的に100μlを加えることで、各標準ストックの10分の1段階希釈液を調製する。ピペットで吸ったり吐いたりしながらしっかりと混合する。溶液1については4種類の段階希釈液、溶液2については3種類の段階希釈液が得られるまで繰り返す。それぞれプレートに、0nMの対照(栄養培地を濾過しただけのもの)も陰性対照として準備する。上述の工程をそれぞれの被験タンパク質について繰り返す。それぞれの実験には、「標準」バッチ物質（リガンドが結合していないLC/A-HN/A）を、対照/基準物質として含めなければならない。
CHO GALR1プレートに希釈した試料を加える
各ウェルに125μlの被検試料(2倍の濃度)を加える。それぞれの被検試料を3つ組で準備しておいたウェルに加え、かつ、それぞれの容量範囲には0nMの対照を含める。24時間インキュベートする(37℃、5％CO2、湿潤雰囲気)。
細胞の溶解
25％(4×)NuPAGE LDS試料緩衝液、65％のdH2Oおよび10％の1M DTTを用い、溶解緩衝液を新たに調製する(プレート1枚につき20ml)。使用済容器をひっくり返して、CHO GALR1プレートから培地を除去する。先の細いチップを付けたピペットを使用して、それぞれのウェルから残った培地を吸い出す。マルチステッパーピペットを使って各ウェルに125μlの溶解緩衝液を加え、細胞を溶解する。最低でも20分間置いた後、緩衝液をそれぞれのウェルから1.5mlの微量遠心管に移す。ブロットの工程全体を通じてCHO GALR1の処理が追えるように、遠心管には番号をふっておかなくてはならない。A1-A3からH1-H3には1から24の、A4-A6からH4-H6までは25から48の、A7-A9からH7-H93には49から72の、A10-A12からH10-H12には73〜96の番号をふった。各試料をボルテックスし、余熱しておいた加熱器で、90℃で5〜10分間加熱する。-20℃で保存するか、その日のうちにSDSゲルに使用する。
ゲル電気泳動
試料を一晩かそれ以上保存しておいた場合には余熱しておいた加熱器で、90℃で5〜10分間加熱する。SDSページ用のゲルを準備し(1枚のゲルに試料を12個のせる)、泳動用緩衝液をゲル容器1つにつきおよそ800ml準備する(1×、InvitrogenのNuPAGE MOPS SDS泳動用緩衝液(20×)(NP0001))。上側の緩衝液室に500μlのNuPAGE酸化防止剤を加える。15μlの試料をゲルの左側のレーンから右側に向かって負荷し、2.5μlのMagic Marker XP(Invitrogen)および5μlのSee Blue Plus 2着色標準物質(Invitrogen)および15μlの未処理対照を負荷する。SDS-PAGEの分離能を最大にすることが重要であり、これは、12％bis-trisゲルを200Vで1時間25分(ピンク色のマーカー(17kDa)がタンクの底に到達するまで)泳動することで達成できる。
ウェスタンブロット
InvitrogenのiBlotを用いて(iBlot Programme 3を6分間)半乾燥トランスファーを終了する。ニトロセルロース膜を個別の小さいトレーに入れる。膜をブロッキング緩衝液(100mlの0.1％PBS/ツイーンに5gのMarvel脱脂粉乳を加えたもの)に入れ、室温、振とう器上で1時間インキュベートする。一次抗体(抗SNAP-25、1:1000希釈)を加え、膜を室温で振とうしながら1時間、一次抗体(ブロッキング緩衝液で希釈したもの)と共にインキュベートする。PBS/ツイーン(0.1％)で3回すすいで膜を洗浄する。次いで二次抗体(抗ウサギ-HRP結合抗体、1:1000希釈)を加え、膜を室温で振とうしながら1時間、二次抗体(ブロッキング緩衝液で希釈したもの)と共にインキュベートする。PBS/ツイーン(0.1％)で3回すすいで膜を洗浄する。最後の洗浄時には、膜を最低でも20分間放置する。Syngeneを使用して結合した抗体を検出する:PBS/ツイーンの水滴を吸い取り、WestDura試薬を1:1の割合で混合してブロットに5分間加える。確実に、膜を完全に覆うのに十分な量の溶液を加える。Syngeneトレーに膜を入れ、Syngeneソフトウェアの暴露時間を5分に設定する。
図3および5は、本発明のガラニン融合タンパク質がSNAP-25を効果的に切断することを示している。
実施例8-ガラニン融合体のインビボにおける効力の評価
侵害受容性の屈曲反射(足引っ込め試験としても知られている)は、生じ得る損傷から肢を保護するための、素早い引っ込め動作である。この屈曲反射は、低用量のカプサイシン、電気刺激またはカプサイシン感作電気応答の結果としての麻酔ラットにおける筋電図検査(EMG)反応を評価することで定量可能である。体重300〜380gの雄のスプラーグドーリー(SD)ラットの足底内への、本発明の融合タンパク質を前処理(24時間)。足の引っ込めは、PBS(7.5％DMSO)に溶解した0.006％のカプサイシン(10μl)を10秒かけて注入することで誘導した。これによって、大腿二頭筋からの強固な反射反応が引き起こされる。侵害受容性屈曲反射の低下/阻害は、被験物質が抗侵害受容作用を示すことを表す。データは、本発明のガラニン融合タンパク質の抗侵害受容作用をパーセンテージで示した(図6)。
本発明の種々のガラニン融合タンパク質がカプサイシン誘導性熱痛覚過敏を阻害する能力を評価した(図7および8)。SDラットの足底内に融合タンパク質を前処理し、その24時間後に0.3％のカプサイシンを注入し、ラットを25℃のガラス板の上に置いた(アクリル製の箱に入れたラットを25℃のガラス板の上に置いた)。光線(光の強度を調整できる)を後肢に当てた。足が動いたことを感知器が検出した時点でタイマーを止めた。足引っ込め潜時は、ラットが熱源から足を離すまでの時間である(カットオフ値を20.48秒とした)。足引っ込め潜時の減少/阻害は、被験物質が抗侵害受容作用を示すことを表している。データから、本発明のガラニン融合タンパク質がC末端にリガンドをもつ融合タンパク質と比較して高い抗侵害受容作用を持つことが示された。
実施例9-ニューロン細胞培養からのP物質の放出を測定することによる、TMアゴニスト活性の確認
材料
P物質EIAはR&D Systems(英国)から入手する。
方法
既に記述のあるように、eDRGの一次ニューロン培養を確立する(Dugganら、2002)。これまでの記述と本質的に同様に(Dugganら、2002)、培養からのP物質の放出をEIAによって評価する。目的のTMをニューロン培養(処理の少なくとも2週間前に確立する)に加える; 並行して、TMの代わりに媒体を加える対照の培養を実施する。対照とTMを処理した培養の両方から、刺激(100mM KCl)した場合のP物質の放出、基準となる放出、併せて総細胞可溶化液を得る。P物質酵素免疫アッセイキット(Cayman Chemical Company、米国、またはR& D Systems、英国)を使用し、製造業者の説明に従って、P物質の免疫反応性を測定する。
目的のTMが存在する場合のニューロン細胞からのP物質の放出量を、100mM KClの存在下および非存在下で得られた放出量と比較する。目的のTMによって刺激されたP物質の放出が基準の放出を上回る場合には、この目的のTMは、本明細書で定義する「アゴニストリガンド」として確立される。所望ならば、目的のTMで刺激したP物質の放出を、天然のORL-1受容体リガンドであるノシセプチン(Tocris)を使用して生成した、標準的なP物質の放出曲線と比較することができる。
実施例10
対象に有効量の融合タンパク質を投与することを含む、悪性疾患から生じる慢性疼痛および悪性疾患から生じるものではない慢性疼痛(末梢神経障害)からなる群から選択される前記患者における疼痛を治療、予防または緩和する方法。
患者A
ヘルペス後神経痛に由来する重症疼痛を患っている73才の女性を、神経終末のシナプスにおける神経伝達物質の放出を低減させて疼痛を和らげるために、融合タンパク質の末梢注入によって治療する。患者は、前記注入の2時間以内にすぐれた鎮静効果を感じる。
患者B
自動車事故が原因で左腕を切断し、その後幻肢痛を訴えている32才の男性を、疼痛を和らげるために、融合タンパク質の末梢注入によって治療する。患者は、前記注入の1時間以内にすぐれた鎮静効果を感じる。
患者C
糖尿病神経障害を患っている55才の男性を、神経終末のシナプスにおける神経伝達物質の放出を低減させて疼痛を和らげるために、融合タンパク質の末梢注入によって治療する。患者は、前記注入の4時間以内にすぐれた鎮静効果を感じる。
患者D
癌性疼痛を患っている63才の女性を、神経終末のシナプスにおける神経伝達物質の放出を低減させて疼痛を和らげるために、融合タンパク質の末梢注入によって治療する。患者は、前記注入の4時間以内にすぐれた鎮静効果を感じる。
本明細書で引用した全ての文書、本、マニュアル、論文、特許、公開されている特許出願、指針、要旨および他の参考文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。前述の明細書では、例示する目的のために提供した実施例とともに本発明の原理を教示しているが、当然のことながら、当業者は本開示を読むことで、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細に様々な変更を施すことが可能である。

Claims (20)

  1. 以下を含む、単鎖ポリペプチド融合タンパク質:
    a. 侵害受容性感覚求心路の開口放出融合装置を構成しているタンパク質を切断する非細胞傷害性プロテアーゼ;
    b. 前記侵害受容性感覚求心路の結合部位に結合するガラニンターゲティング部分、ここで、当該結合部位は、形質膜陥入して前記侵害受容性感覚求心路のエンドソームに取り込まれる;
    c. その部位で前記融合タンパク質がプロテアーゼによって切断されうるプロテアーゼ切断部位、ここで、当該プロテアーゼ切断部位は、前記非細胞傷害性プロテアーゼおよび前記ガラニンターゲティング部分の間に位置する;
    d. 前記プロテアーゼを、エンドソーム内からエンドソーム膜を横断して前記侵害受容性感覚求心路のサイトゾル内へと転位置させるトランスロケーションドメイン、ここで、前記ターゲティング部分は前記プロテアーゼ切断部位および当該トランスロケーションドメインとの間に位置する;
    e. 前記非細胞傷害性プロテアーゼおよび前記プロテアーゼ切断部位の間に位置する第1のスペーサー、ここで、当該第1のスペーサーは、4〜25アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む;
    f. 前記ガラニンターゲティング部分および前記トランスロケーションドメインの間に位置する第2のスペーサー、ここで、当該第2のスペーサーは、4〜35アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む。
  2. 前記第1のスペーサーが6〜16アミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでいる、請求項1に記載の融合タンパク質。
  3. 前記第1のスペーサーの前記アミノ酸残基がグリシン、スレオニン、アルギニン、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、プロリン、グルタミン酸および/またはリジンからなる群から選択される、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
  4. 前記第1のスペーサーの前記アミノ酸残基がグリシン、セリンおよびアラニンからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  5. 前記第1のスペーサーがGS5、GS10、GS15、GS18またはGS20スペーサーから選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  6. 前記ガラニンターゲティング部分がGALR1、GALR2および/またはGALR3受容体に特異的に結合する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記ガラニンターゲティング部分が配列番号7または配列番号8と少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  8. 前記ガラニンターゲティング部分が配列番号7のアミノ酸配列、または少なくとも14または16個の連続したそのアミノ酸残基を含む又はからなる断片、あるいは前記配列番号7の変異体アミノ酸配列または最大5または6個の保存的アミノ酸置換を有する前記断片を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  9. 前記非細胞傷害性プロテアーゼがクロストリジウム神経毒のL鎖またはIgAプロテアーゼである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  10. 前記トランスロケーションドメインがクロストリジウム神経毒のHNドメインである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  11. 前記融合タンパク質が、配列番号10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、53、56および/または59からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  12. 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチド融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子。
  13. プロモーター、当該プロモーターの下流に位置している請求項12に記載のポリヌクレオチド分子、および前記ポリヌクレオチド分子の下流に位置しているターミネーターを含む発現ベクター。
  14. a. 宿主細胞に請求項13に記載の発現ベクターを遺伝子導入すること、および
    b. 前記発現ベクターによるポリペプチド融合タンパク質の発現を促進する条件で前記宿主細胞を培養すること
    を含む、単鎖ポリペプチド融合タンパク質の調製方法。
  15. a. 請求項1〜11のいずれか1項に記載の単鎖ポリペプチド融合タンパク質を、プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼと接触させること;
    b. 前記プロテアーゼ切断部位を切断すること; およびそれによって二本鎖融合タンパク質を形成すること
    を含む、非細胞傷害性薬剤の調製方法。
  16. 請求項15に記載の方法によって得られた非細胞傷害性二本鎖ポリペプチドであって、
    a. 第1の鎖が、侵害受容性感覚求心路の開口放出融合装置を構成しているタンパク質を切断することが可能な非細胞傷害性プロテアーゼを含み;
    b. 第2の鎖が、ガラニンTMおよび、前記プロテアーゼをエンドソームからエンドソーム膜を横断して前記侵害受容性感覚求心路のサイトゾル内へと転位置させることが可能なトランスロケーションドメインを含み; ならびに
    前記第1の鎖および第2の鎖が互いにジスルフィド結合している、
    二本鎖の非細胞傷害性ポリペプチド。
  17. 治療上有効量の請求項1〜11のいずれか1項に記載の融合タンパク質を患者に投与すること含む、対象の疼痛を治療、予防または緩和する方法。
  18. 前記疼痛が、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、頭痛、体性疼痛、内臓痛、および関連痛から選択される慢性疼痛である、請求項17に記載の方法。
  19. 治療上有効量の請求項16に記載のポリペプチドを患者に投与することを含む、対象の疼痛を治療、予防または緩和する方法。
  20. 前記疼痛が、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、頭痛、体性疼痛、内臓痛、および関連痛から選択される慢性疼痛である、請求項19に記載の方法。
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