KR102283218B1 - 통증을 치료, 예방 또는 개선하는 융합단백질 및 그의 제조방법 - Google Patents

통증을 치료, 예방 또는 개선하는 융합단백질 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

구심성통각감각의 세포외 융합장치의 단백질을 절단할 수 있는 비-세포독성 프로테아제; 구심성통각감각 내에서 엔도솜으로 통합되는 세포이물흡수를 수행하는 구심성통각감각의 결합부위에 결합 가능한 갈라닌 표적화체; 비-세포독성 프로테아제와 갈라닌 표적화체 사이에 위치한 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 융합단백질의 프로테아제 절단부위; 상기 프로테아제를 엔도솜 내에서부터 엔도솜 막을 통과하여 구심성통각감각의 세포질로 전좌시킬 수 있는 전좌도메인; 비-세포독성 프로테아제와 프로테아제 절단부위 사이에 위치한 4 내지 25 개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 제1 스페이서; 갈라닌 표적화체와 전좌도메인 사이에 위치한 4 내지 35 개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 제2 스페이서를 포함하는 단일사슬 폴리펩티드 융합단백질에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드 융합단백질을 코딩하는 핵산서열, 그들의 제조방법 및 사용에 대해서도 설명된다.

Description

통증을 치료, 예방 또는 개선하는 융합단백질 및 그의 제조방법 {Fusion proteins and methods for treating, preventing or ameliorating pain}
본 발명은 비-세포독성 융합단백질과 그의 진통제로서의 치료적인 적용에 관한 것이다.
독소는 일반적으로 그들이 표적세포에 가지는 효과의 유형에 따라 2 개의 그룹으로 나누어진다. 좀 더 자세하게는, 상기 독소의 첫째 그룹은 그들의 천연 표적세포를 죽이므로 그들은 세포독성 독소분자로 알려져있다. 이 독소그룹은 그 중에서도 리신(riciin), 아브린(abrin)과 같은 식물독소, 디프테리아(diphtheria) 독소와 같은 박테리아 독소, 및 슈도모나스(Pseudomonas)균 외독소 A와 같은 예시가 있다. 세포독성의 독소는 암과 같은 세포질환 및 상태의 치료를 위한 “마술탄알”(예를 들어, 세포독성의 독소성분과 표적세포에 특정마커가 결합할 수 있는 항체를 포함하는 면역접합)의 제조분야에서 많은 관심을 받고 있다. 전형적으로 세포독성의 독소는 단백질 합성의 세포과정을 억제함으로써 그들의 표적세포를 죽인다.
비-세포독성의 독소로 알려진 독소의 둘째 그룹은 그들의 천역 표적세포를 죽이지 않는다(그들의 이름을 확인함으로써). 비-세포독성 독소는 그들의 세포독성 상대에 비해 상업적인 관심을 덜 받고, 단백질 합성이 아닌 세포과정을 억제함으로써 표적세포에 그들의 효과를 발휘한다. 비-세포독성의 독소는 다양한 식물, 클로스트리듐 속균(Clostridium sp .) 및 네이세리아 속균(Neisseria sp.)과 같은 다양한 미생물에 의해서 생성된다.
클로스트리듐 신경독은 전형적으로 150 kDa 정도의 분자량을 가지는 단백질이다. 그들은 다양한 종류의 박테리아에 의해 생성되는데, 특히, 클로스트리듐(Clostridium)의 속(genus)인 클로스트리듐 테타니(C. tetani)가 가장 중요하고, 몇몇 계통(strains)인 클로스트리듐 보툴리눔, 클로스트리듐 부티리쿰(C. butyricum) 및 클로스트리듐 아르겐티넨스(C. argentinense)가 있다. 현재에는 8 종류의 클로스트리듐 신경독이 있는데, 테타누스 신경독과 A, B, C1, D, E, F 및 G의 혈청형 모두가 유사한 구조 및 활성모드를 공유하는 보툴리눔 신경독이다.
클로스트리듐 신경독은 비-세포독성 독소분자의 주요그룹을 대표하고, 그들은 세균숙주에 의해 이황화결합에 의해 함께 결합된 2 개의 폴리펩티드 사슬을 형성할 수 있도록 번역후에 단백질 분해절단에 의해 변형되는 단일 폴리펩티드로 합성된다. 상기 2 개의 사슬은 대략 100 kDa의 분자량을 가지는 중쇄(H-chain)와 대략 50 kDa의 분자량을 가지는 경쇄(L-chain 또는 LC)로 정의된다.
경쇄는 프로테아제 기능(아연-의존형 엔도펩티다제 활성)을 가지고, 외포과정과 관련된 단백질에 연합하는 소낭(vesicle) 및/또는 세포막에 높은 특이성을 가지는 기질을 드러낸다. 다른 클로스트리듐 종 또는 혈청형에서의 경쇄는 다른 세 개의 기질 단백질, 즉, 시냅토브레빈(synaptobrevin), 신탁신(syntaxin) 또는 SNAP-25 중 하나에서 특이적인 펩티드본드를 가수분해한다. 이러한 기질들은 신경분비(신경분비) 조직에서 중요한 성분이다.
네이세리아 임균(N. gonorrhoeae) 종에서 가장 중요한 네이세리아 속균은 기능적으로 유사한 비-세포독성 프로테아제를 생성한다. 이와 같은 프로테아제의 예로는 IgA 프로테아제가 있다(WO99/58571 참조).
독소분자는 상기 독소의 천연 표적세포가 아닌 세포를 다시 표적으로 할 수 있다는 것은 해당 기술분야에서 잘 알려져 있다. 다시 표적으로 할 때, 상기 변형된 독소는 원하는 표적세포에 결합할 수 있고, 이후에 세포질로의 연속적인 전좌는 상기 표적세포에 그 효과를 발휘할 수 있게 한다. 상기 재-표적(re-targeting)은 상기 독소의 천연 표적화체(Targeting Moiety)(TM)를 다른 TM으로 대체함으로써 이룰 수 있다. 이와 관련하여, 상기 TM은 원하는 표적세포에 결합하고, 이후에 변형된 독소가 표적세포 내 엔도솜(endosome)으로 통과될 수 있도록 하기 위해 선택된다. 또한 상기 변형된 독소는 비-세포독성 프로테아제가 세포질의 세포속으로 진입할 수 있도록 하기 위한 전좌도메인을 포함한다. 상기 전좌도메인은 독소의 천연 전좌도메인이거나 또는 전좌활성을 가지는 미생물 단백질에서 얻을 수 있는 다른 전좌도메인일 수 있다.
상기 언급된 TM 대체는 당업자에게 잘 알려진 기존의 화학적 접합기술에 의해 영향받을 수 있다. 이와 관련하여, Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, and to Wong, S.S. (1991), Chemistry of 단백질 conjugation and cross linking, CRC Press를 참조할 수 있다. 대안적으로, WO98/07864에서 설명하고 있는 재조합 기술도 적용될 수 있다. 상기의 인용문헌 모두 본 명세서에 참조로써 포함된다.
통증감지세포는 넓은 범위의 수용체 유형을 포함한다. 그러나, 모든 수용체 유형들이 수용체-매개의 세포이물흡수(endocytosis)를 위해 적합한 것은 아니다(적어도 모두 열망하는). 유사하게, 결합(binding) 속성도 상기 동일한 수용체를 위한 다른 TM 사이, 심지어 더욱 더 다른 TM 및 다른 수용체 사이에서 매우 다양할 수 있다.
따라서 하나 또는 그 이상의 상기 문제를 나타낼 수 있는 변형된 비-세포독성 융합단백질을 개발시킬 필요가 있다. 특히 관심갖는 것은 목표하는 통증치료에서의 사용을 위하여 대체/향상된 비-세포독성 융합단백질의 개발이다. 본 발명은 독특한 융합단백질을 제공함으로써 상기 문제점을 하나 또는 그 이상 해결하기 위한 것이다.
본 발명은 다음을 포함한 단일사슬, 폴리펩티드 융합단백질을 제공함으로써 상기-언급된 하나 또는 그 이상의 문제를 해결한다:
a. 구심성 통각감각(nociceptive sensory 구심성)의 세포외 융합장치 단백질을 절단하는 프로테아제인 비-세포독성 프로테아제;
b. 구심성 통각감각의 결합부위가 구심성 통각감각 내의 엔도솜으로 통합되는 구심성 통각감각에 결합가능한 갈라닌 표적화체;
c. 상기 융합단백질이 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 비-세포독성 프로테아제와 상기 갈라닌 표적화체 사이에 위치한 프로테아제 절단부위;
d. 표적화체가 상기 프로테아제 절단부위와 전좌도메인 사이에 위치하고 프로테아제를 엔도솜 내에서 엔도솜 막을 통과하여 구심성 통각감각의 세포질로 전좌시키는 전좌도메인;
e. 비-세포독성과 상기 프로테아제 절단부위 사이에 위치한 4 내지 25 개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 제1 스페이서;
f. 상기 갈라닌 표적화체와 상기 전좌도메인 사이에 위치한 4 내지 35 개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 제2 스페이서.
본 발명의 비-세포독성 프로테아제 성분은 비-세포독성 프로테아제로, 상기 프로테아제는 구심성통각감각에서 세포외 융합장치의 3 개의 기질 단백질, 즉, 시냅토브레빈, 신탁신 또는 SNAP-25의 하나에서 다르지만 특이적인 펩티드 본드를 절단할 수 있다. 이러한 기질들은 신경분비조직의 중요한 성분이다. 본 발명의 비-세포독성 프로테아제 성분은 바람직하게 네이세리아(neisserial) IgA 프로테아제이거나 또는 클로스트리듐 신경독 경쇄이다. 용어 비-세포독성 프로테아제는 기능적으로 동일한 절편과 상기 비-세포독성 프로테아제의 유도체를 포함한다. 특히 바람직한 비-세포독성 프로테아제 성분은 보툴리눔 신경독(BoNT)의 경쇄이다.
본 발명의 전좌구성은 프로테아제 활성의 기능적 발현이 표적세포의 세포질 내에서 발생하도록 상기 비-세포독성 프로테아제(또는 그의 절편)이 표적세포속으로 전좌하는 것을 가능하게 한다. 상기 전좌구성은 바람직하게 낮은 pH의 조건하에 지질막에서 이온-투과성 구멍의 형성이 가능하게 한다. 바람직하게는 오직 엔도솜 막 내의 구멍-형성을 가능하게 하는 단백질 분자부분의 사용을 발견할 수 있다. 상기 전좌구성은 미생물 단백질소스, 특히 박테리아 또는 바이러스 단백질소스에서 획득할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 전좌구성은 박테리아 독소 또는 바이러스 단백질과 같은 효소의 전좌도메인이다. 상기 본 발명의 전좌구성은 바람직하게 클로스트리듐 신경독 중쇄 또는 그의 절편이다. 가장 바람직하게는 HN 도메인(또는 그의 기능적인 구성)인데, 여기에서 HN은 클로스트리듐 신경독의 일부 또는 중쇄의 절편이 대략 중쇄의 아미노-말단 절반과 동일하거나 또는 중쇄 그대로의 절편과 대응되는 도메인을 의미한다.
상기 본 발명의 갈라닌 TM 구성은 본 발명의 융합단백질이 표적세포의 결합부위에 결합하는 것이다. 따라서 상기 갈라닌 TM 구성은 상기 구성을 통해 본 발명의 융합단백질이 선택된 표적세포에 결합할 수 있게 하는 리간드(ligand)이다.
본 발명의 맥락에서, 상기 표적세포는 구심성통각감각이고, 바람직하게 주요한 구심성통각(예를 들어, A?-섬유 또는 C-섬유와 같은 A-섬유)이다. 따라서, 상기 본 발명의 융합단백질은 신경전달물질 또는 신경조절물질[예를 들어, 글루타메이트, 물질 P, 칼시토닌-유전자 관련 펩티드(CGRP), 및/또는 뉴로펩티드 Y]을 구심성 통각감각 뉴런의 이산모집단(discrete populations)에서 방출하는 것을 저해할 수 있다. 사용 중에, 상기 융합단백질은 말초에서 중앙통증섬유까지 구심성감각신호(예를 들어, 신경전달물질 또는 신경조절물질)를 전달하는 것을 감소시키거나 예방하고, 그럼으로 해서 통증, 특히 만성통증에서의 치료를 위한 치료상 분자로 적용된다.
TM이 구심성통각감각에 결합한다는 것은 일반적으로 인정된다. 예를 들어, 간단한 방사성 변위실험은 표지가 없는 리간드가 초과된 상태에서 표지된(예를 들어 삼중수소(tritiated))로 리간드에 노출된 구심성통각감각(예를 들어 DRGs)을 대표하는 조직이나 세포에 적용된다. 이와 같은 실험에서, 비-특이적인 결합과 특이적인 결합의 상대적 비율이 평가될 수 있고, 그렇게 함으로써 상기 리간드가 구심성 통각감각 표적세포에 결합하는 것을 확인할 수 있다. 선택적으로, 상기 분석은 하나 또는 그 이상의 길항제(antagonists)를 포함하고, 또한 리간드 결합손실을 관찰하는 것도 포함한다. 실험에서의 이 같은 유형에 대한 예시들은 “Hulme, E.C. (1990), Receptor- binding studies, a brief outline, pp. 303-311, In Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press”에서 확인할 수 있다.
일반적으로 본 발명의 상기 융합단백질은 해당 ‘자유’ TM (예를 들어, gal16)과 비교할 때, 상기 갈라닌 수용체 (예를 들어 GALR1)를 위한 감소된 결합 친화력(최대 영역에서 10배)를 증명한다. 그러나, 이러한 관찰에도 불구하고, 상기 본 발명의 융합단백질은 놀랍게도 좋은 효능을 입증한다. 이는 두가지 중요한 특징에 기인할 수 있다. 첫째, 상기 비-세포독성 프로테아제 구성은 촉매이다 - 따라서, 상기 몇가지 이러한 분자의 치료적 효과는 급격하게 증폭될 수 있다. 둘째로, 구심성통각감각에 존재하는 갈라닌 수용체는 오직 치료항목에 대한 관문으로서의 역할만 필요로 하고, 필수적으로 리간드-수용체-매개의 약제학적 반응을 성취하기 위해 요구되는 수준으로 자극될 필요는 없다. 따라서 본 발명의 상기 융합단백질은 NSAIDS, 모르핀 및 가바펜틴(gabapentin)과 같은 다른 진통제 분자 유형에 적용되는 것보다 훨씬 적은 용량으로 투여될 수 있다. 전형적으로 후자 분자들은 높은 마이크로그램에서 밀리그램(심지어 수백의 밀리그램까지)의 양이 투여된 반면, 본 발명의 상기 융합단백질은 일반적으로 적어도 10 배 낮은, 보다 일반적으로는 100 배 낮은 용량이 투여될 수 있다.
또한 본 발명의 갈라닌 TM은 구심성통각감각, 좀더 바람직하게는 주요한 구심성통각에 존재하는 하나 또는 그 이상의 갈라닌 수용체에서 “작용제(agonist)”로서 활동한 분자일 수 있다. 종래, 작용제는 세포 내에서 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있는 어떤 분자, 즉 단순하게 세포활성의 변화를 일으키는 어떤 분자라고 생각되어왔다. 예를 들어, 작용제의 종래 의미는 세포에서 수용체와 결합하고, 반응 또는 활성을 개시하는 화학물질이거나 또는 수용체를 활성화시켜 세포활성에서의 증가 또는 감소를 나타내는 활성적인 반응을 유도하는 물질을 포함하였다.
그러나 본 발명의 목적에서, 작용제는 좀 더 특이적으로 표적세포에서 세포외 융합과정을 작용할 수 있는 분자로 정의되는데, 상기 과정은 표적세포에서 상기 세포외 융합장치의 단백질을 절단할 수 있는 프로테아제(또는 그의 절편)에 의해 억제되기 쉽다.
따라서 본 발명에서의 특별한 작용제 정의는 종래 작용제로 고려되던 많은 분자를 제외한다. 예를 들어, 신경성장인자(NGF)는 TrkA 수용체에 결합함으로써 신경세포의 분화를 촉진하는 능력에 대한 작용제이다. 그러나, NGF는 상기 기준에 의한 분석에서는 세포외 융합의 주요한 유도자가 아니기 때문에 작용제가 아니다. 게다가, NGF가 자극하는(예를 들어 세포분화) 과정은 비-세포독성 독소분자의 프로테아제 활성에 의해 억제되기 쉽지 않다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 융합단백질은 우선적인 수용체 결합 및/또는 내면화(internalisation) 속성을 증명한다. 차례로, 이것은 상기 프로테아제 구성의 통증감지 표적세포로의 좀더 효과적인 전달을 초래한다.
TM으로서의 작용제 사용은 부작용과 관련된 자기-제어이다. 좀 더 자세하게, 작용제 TM가 통증-감지 표적세포에 결합하는 것은 통증감각을 악화시키는 세포외 융합을 증가시킨다. 그러나 상기 작용제 결합에 의해 자극되는 세포외 과정은 이후 상기 융합단백질의 프로테아제 구성에 의해 감소되거나 저해된다.
구심성통각 위 수용체에 결합하는 TM의 작용제 특징은 실시예 9에서 설명된 방법에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 표적화체는 갈라닌 및/또는 갈라닌의 유도체를 포함하거나 그로 구성된다. 갈라닌 수용체는(예를 들어 GALR1, GALR2 및 GALR3) “DRGs (Liu & Hokfelt, (2002), Trends Pharm. Sci., 23(10), 468-74)”에서 이전- 및 이후-시냅스적으로 발견되고, 신경성 동통(neuropathic pain) 상태 동안 발현이 강화된다. “Xu 등, (2000) Neuropeptides, 34 (3&4), 137?147”는 갈라닌과 관련된 더 많은 정보를 제공한다. 상기 인용된 참조문헌 모두는 본 발명의 참조로 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서, 갈라닌 TM을 위한 목표는 GALR1, GALR2 및/또는 GALR3 수용체이다. 이러한 수용체들은 G단백질-커플링된 수용체들의 구성이고, 7 개의 막전위 도메인구조를 가진다.
일 구체예에서, 상기 갈라닌 TM은 GALR1, GALR2 및/또는 GALR3 수용체에 결합할 수 있는(바람직하게는 특이적으로 결합하는) 분자이다. 좀 더 바람직하게는, 상기 갈라닌 TM은 GALR1, GALR2 및/또는 GALR3 수용체의 “작용제”이다. 본 맥락에서 상기 용어 “작용제”는 상기와 같이 정의된다.
야생형 인간 갈라닌 펩티드는 30 개의 아미노산 펩티드로, 본 명세서에서는 “GA30”으로 축약되어 사용된다(SEQ ID NO: 7에 의해 대표된다). 일 구체예에서, 상기 갈라닌 TM은 SEQ ID NO: 7을 포함하거나 그로 구성된다.
또한, 본 발명은 상기에서 설명된 갈라닌 Tm의 절편, 변이체(variants) 및 유도체를 포함한다. 이러한 절편, 변이체 및 유도체는 대체적으로 상기 갈라닌 TM(예를 들어, 기능적으로 동일한)에 할당된 특징으로 유지된다. 예를 들어, 상기 절편, 변이체, 및 유도체들은 GALR1, GALR2 및/또는 GALR3 수용체에 결합할 수 있는 능력을 유지한다. 일 구체예에서, 본 발명의 갈라닌 TM은 총-길이 갈라닌 펩티드 16개의 아미노산 절편을 포함하거나 이로 구성되고, 본 명세서에서는 GA16(SEQ ID NO: 8로 대표된다)로 나타낸다.
일 구체예에서, 상기 갈라닌 TM은 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80% (적어도 82, 84, 85, 86, 88 또는 89%와 같은), 더 바람직하게는 적어도 90% (적어도 91, 92, 93 또는 94%와 같은), 가장 바람직하게는 적어도 95% (적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%)의 아미노산 서열 산 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
일 구체예에서, 상기 갈라닌 TM은 총-길이의 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8, 또는 적어도 그들의 아미노산 잔기가 연속적으로 적어도 10개 (적어도 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29)를 포함 또는 구성하는 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8의 절편과 적어도 70% (적어도 80, 82, 84, 85, 86, 88 또는 89%와 같은), 더 바람직하게 적어도 90% (91, 92, 93 또는 94%와 같은), 가장 바람직하게는 적어도 95% (적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%와 같은)의 아미노산 서열 산 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
일 구체예에서, 상기 갈라닌 표적화체는 SEQ ID NO. 7 또는 적어도 그들의 연속적인 아미노산 잔기를 16개 (적어도 10, 11, 12, 13, 14 또는 15)를 포함하거나 그로 구성되는 절편, 또는 상기 SEQ ID NO: 7의 변이체 아미노산 서열 또는 최대 6개(최대 5, 4, 3, 2 또는 1개)의 보존적 아미노산 치환을 가지는 상기 절편에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
본 발명의 프로테아제의 절단부위는 비-세포독성 프로테아제 구성과 TM 구성 사이 위치에서 융합단백질의 절단(바람직하게는 절단에 의해 조절되는)을 허용한다. 이 절단반응은 단일사슬 폴리펩티드를 이황화결합, 이중-사슬 폴리펩티드로 하여 융합단백질로 변환시키는 반응이다.
본 발명에서 언급된 구체예에 따라, 갈라닌 TM은 갈라닌 TM의 C-말단에서 멀리 떨어진 곳에 위치한 도메인 또는 아미노산 서열을 통해 결합한다. 예를 들어, 상기 관련있는 결합도메인은 내부 도메인이나 TM의 중간(예를 들어 선형 펩티드 서열의) 쪽에 위치한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 관련있는 결합도메인은 갈라닌 TM의 N-말단쪽으로 위치하고, 좀 더 바람직하게는 N-말단이나 그 근처에 위치한다.
일 구체예에서, 단일사슬 폴리펩티드 융합은 하나 이상의 단백질 분해 절단부위를 포함한다. 그러나 여기에서 둘 또는 그 이상의 그러한 부위가 존재하고, 그들이 다르면, 대체적으로 단일 프로테아제의 존재 하에 다수의 절단 행위가 일어나는 것을 막는다. 또 다른 구체예에서, 단일사슬 폴리펩티드 융합은 단일 프로테아제 절단부위를 갖는다는 것은 이미 설명되었다.
상기 프로테아제 절단서열은 점변이(site-directed mutagenesis)와 같은 종래 수단에 의한 DNA 레벨에서 도입될 수 있다 (및/또는 어떤 고유의 절단서열이 제거될 수 있다). 절단서열의 존재를 확인하는 스크리닝은 수동적으로 또는 컴퓨터 소프트웨어의 도움으로 (예를 들어, DNASTAR, 사에 의한 the MapDraw program) 수행될 수 있다.
어떤 프로테아제 절단부위가 적용된다 할지라도, 하기 사항이 바람직하다:
엔테로키나아제(Enterokinase) (DDDDK↓)
인자(Factor) Xa (IEGR↓ / IDGR↓)
TEV(토바코 에치 바이러스(Tobacco Etch virus)) (ENLYFQ↓G)
트롬빈(Thrombin) (LVPR↓GS)
선절단(PreScission) (LEVLFQ↓GP).
일 구체예에서, 상기 프로테아제 절단부위는 엔테로키나아제 절단부위(DDDDK↓)이다. 일 구체예에서, 엔테로키나아제 프로테아제는 엔테로키나아제 절단부위를 절단하고, 융합단백질을 활성화하는데 사용되었다.
또한 용어 프로테아제에 포함되는 절단부위는 자가-절단 서열인 인테인(intein)이다. 예를 들어 존재하는 환원제의 농도를 다양화 시킴으로써 상기 자가-절단 반응을 조절한다.
사용에서, 상기 프로테아제 절단부위가 절단되어 TM의 N-말단영역이 노출된다. 그 결과로 폴리펩티드는 N-말단 또는 융합단백질의 나머지에서 실질적으로 유리된 인트라(intra) 도메인을 가진 TM을 가진다. 이러한 배열은 TM의 N-말단 구성 (또는 인트라 도메인)이 직접적으로 표적세포의 결합부위와 상호작용을 하도록 보장한다.
일 구체예에서, TM과 프로테아제 절단부위는 최대 10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 최대 5개의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 0개의 아미노산 잔기에 의해 융합단백질과 거리를 두고있다. 일 구체예에서, 상기 TM과 프로테아제 절단부위는 0-10개 (0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 0-2와 같은), 바람직하게는 0-1개의 아미노산 잔기에 의해 융합단백질과 거리를 두고있다. 따라서, 다음의 프로테아제 절단부위의 절단, 융합이 융합의 나머지에서 실질적으로 유리된 N-말단 도메인을 가지는 TM에 제공된다. 이런 배열은 표적화체의 N-말단 구성이 직접적으로 표적세포의 결합부위와 상호작용하도록 보장한다.
상기 언급된 활성단계와 관련된 한가지 이점은 융합단백질의 단백질 분해절단이 일어나면 TM이 오직 N-말단 분해에 취약하게 되도록 하는데 있다. 게다가, 특이적인 프로테아제 절단부위의 선택은 폴리펩테드 융합이 이중-사슬 형성으로의 선택적 활성을 가능하게 한다.
본 발명의 단일-사슬 폴리펩티드 융합의 형성은 TM과 비-세포독성 프로테아제 구성 사이의 프로테아제 절단부위에서 일어난다.
바람직하게는, 상기 단일-사슬 융합에서, TM은 프로테아제 절단부위와 전좌 구성 사이에 위치한다. 이것은 비록 본 발명의 경우 상기 2개의 구성이 천연 완전독과 반대로 서로 마주보게 배열되어 있다 할지라도, TM이 전좌도메인 (예를 들어, 천연 클로스트리듐 완전독(holotoxin))에 부착되게 한다. 이 배열의 또 다른 이점은 TM이 융합단백질의 형성에서 최소한의 구조적인 이점을 가지는 융합단백질의 노출된 루프영역에 위치하는 것이다. 이와 관련하여, 상기 루프는 링커, 활성루프, 도메인간 링커, 또는 단지 표면 노출된 루프로써 다양하게 언급된다(Schiavo 등 2000, Phys. Rev., 80, 717-766; Turton 등, 2002, Trends Biochem. Sci., 27, 552-558 참조).
본 발명의 단일사슬 융합단백질은 비-세포독성 프로테아제 및 프로테아제 절단부위 사이에 위치한 제1 스페이서(spacer)를 포함하는데, 여기에서 제1 스페이서는 4 내지 25 (6 내지 25, 8 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25 또는 4 내지 21, 4 내지 20, 4 내지 18, 4 내지 15, 4 내지 12 또는 4 내지 10과 같은)개의 아미노산 잔기를 포함(구성)한다. 일 구체예에서, 상기 제1 스페이서는 적어도 4 (적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15와 같은)개의 아미노산 잔기의 아미노산 거열을 포함(구성)한다. 일 구체예에서, 제1 스페이서는 최대 25 (최대 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10과 같은)개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함(구성)한다. 제1 스페이서는 프로테아제 절단부위에서 융합단백질의 절단을 가능하게 한다.
본 발명의 제1 스페이서 없이, 프로테아제 절단과 융합단백질의 활성은 현저하게 떨어진다. 이론에 얽매이지 않기를 바란다면, 갈라닌 표적화체가 입체적으로(sterically) 막히거나 또는 결과적으로 본 발명의 제1 스페이서가 결실된 융합단백질의 낮은 활성을 초래하는 프로테아제 절단부위와의 상호작용은 추측된다. 본 발명자들은 이것이 현재 주장된 융합단백질의 증강된/개선된 활성 속성을 제공하는 제1 스페이서에 의해 얻을 수 있는 유연성(flexibility)이다. 이것은 또한 바람직하지 않은 경연성(rigid) 알파-나선형 링커 구조를 복제할 수 있는 프로테아제 절단부위를 포함한 ‘천연’ 스페이서 서열을 가지는 갈라닌 융합단백질에 있어서도 마찬가지이다. 폴리펩티드 도메인의 유연성 및 유동성은 엑스레이 결정학상의 B-인자(X-ray crystallographic B-factor) 결정을 포함한 다양한 방법에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어, Smith 등, 2003 단백질 Science, 12:1060-1072 참조; 본 명세서에 참조로 포함된다). 본 발명에서 특이적으로 선택된 스페이서 서열은 상기 어떤 ‘천연(natural)’ 스페이서 서열 이상으로 강화된 활성을 제공한다. 이 문맥에서 활성은 제1 스페이서가 프로테아제 절단부위에서 융합단백질의 절단을 가능하게 하는 것을 의미한다. 특히 제1 스페이서에서 사용되는 바람직한 아미노산 잔기는 글리신, 트레오닌, 아르기닌, 세린, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 프롤린, 글루타민산 및/또는 리신을 포함한다. 상기 언급된 아미노산은 가장 유연한 아미노산으로 고려된다 - Smith 등. 2003 단백질 Science 2003; 12:1060-1072 참조.
일 구체예에서, 제1 스페이서의 아미노산 잔기는 글리신, 트레오닌, 아르기닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 알라닌, 아스파르트산, 프롤린, 글루타민산, 리신, 류신 및/또는 발린으로 구성된 군에서 선택된다. 일 구체예에서, 제1 스페이서의 아미노산 잔기는 글리신, 세린, 알라닌, 류신 및/또는 발린으로 구성된 군에서 선택된다. 일 구체예에서, 제1 스페이서의 아미노산 잔기는 글리신, 세린 및/또는 알라닌으로 구성된 군에서 선택된다. 특히 글리신 및 세린이 바람직하다. 일 구체예에서, 제1 스페이서의 아미노산 잔기는 글리신, 세린 및/또는 트레오닌 잔기를 가지는 하나 또는 그 이상의 펜타펩티드(pentapeptide)를 포함하거나 또는 구성한다. 제1 스페이서가 현재 주장된 융합단백질에서 필수적인 유연성을 가지는지를 평가하는 한가지 방법은 간단한 프로테아제 절단 분석을 수행하는 것이다. 융합단백질의 절단/활성을 평가하는 것은 해당기술의 당업자에게 일반적인 것이다 - 예를 들어, 표준적인 방법은 실시예 1에서 설명된다.
일 구체예에서, 제1 스페이서는 GS5, GS10, GS15, GS18, GS20, FL3 및/또는FL4 스페이서에서 선택된다. 상기 스페이서의 서열은 하기 표 1에 제공된다.
스페이서 서열
GS5 GGGGSA
GS10 GGGGSGGGGSA
GS15 ALAGGGGSGGGGSALV
GS18 GGGGSGGGGSGGGGSA
GS20 ALAGGGGSGGGGSGGGGSALV
FL3 LGGGGSGGGGSGGGGSAAA
FL4 LSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAAA
일 구체예에서, 제1 스페이서는 프로테아제 절단에 의한 융합단백질의 활성이 적어도 45% (적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 98, 99 또는 100%와 같은) 활성이 되는 것을 가능하게 한다. 일 구체예에서, 제1 스페이서는 프로테아제 절단에 의한 융합단백질의 활성이 적어도 70%가 되는 것을 가능하게 한다.
일 구체예에서, 제1 스페이서는 자연적으로-발생한 스페이서 서열이 아니다. 일 구체예에서, 제1 스페이서는 보툴리눔 신경독과 같은 천연(예를 들어 야생형) 클로스트리듐 신경독과 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 구성하지 않는다. 다시 말하면, 제1 스페이서는 비-클로스트리듐 서열(예를 들어, 천연 클로스트리듐-신경독에서 발견되지 않는)이다. 일 구체예에서, 상기 융합단백질은 제1 스페이서로서 아미노산 서열 GIITSK (BoNT/A); VK (BoNT B); AIDGR (BoNT/C); LTK (BoNT/D); IVSVK (BoNT/E); VIPR (BONT/F); VMYK (BoNT/G) 및/또는 IIPPTNIREN (TeNT)을 포함하거나 또는 구성하지 않는다.
일 구체예에서, 제1 스페이서는 하기의 클로스트리듐 신경독 경쇄(표 3 참조)에서 보존된 시스테인 잔기의 3 번째 아미노산 잔기에서 시작한다. 일 구체예에서, 제1 스페이서는 다음의 보존된 시스테인 잔기 부위를 sal1로 설계된 비-세포독성 프로테아제 클로스트리듐 경쇄의 VD 아미노산 잔기 뒤에서 시작한다. 일 구체예에서, 제1 스페이서는 상기에서 언급된 프로테아제 절단부위의 시작을 표시하는 아미노산 잔기에서 끝난다.
일 구체예에서, 상기 단일사슬 융합단백질은 제2 스페이서를 포함하는데, 이것은 갈라닌 표적화체와 전좌도메인 사이에 위치한다. 제2 스페이서는 4 내지 35 (6 내지 35, 10 내지 35, 15 내지 35, 20 내지 35 또는 4 내지 28, 4 내지 25, 4 내지 20 또는 4 내지 10과 같은)개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함(또는 구성)한다. 본 발명자들은 예상외로 본 발명의 융합단백질이 TM의 C-말단 및 전좌구성의 N-말단이 서로 40-105 옹스트롬(angstroms), 바람직하게는 50-100 옹스트롬, 가장 바람직하게는 50-90 옹스트롬으로 분리될 수 있도록 제2 스페이서의 사이즈가 선택될 때 개선된 결합활성을 가진다는 것을 증명한다.
일반적으로 적절한 제2 스페이서는 “Crasto, C.J. 및 Feng, J.A. (2000) May, 13(5), pp. 309-312”에 따라 확인되거나 얻을 수 있다 - http://www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html참조. 일 구체예에서, 상기 제2 스페이서는 GS5, GS10, GS15, GS18, GS20 또는 HX27 스페이서에서 선택된다. 상기 스페이서의 서열은 하기 표 2에 제공된다.
스페이서 서열
GS5 GGGGSA
GS10 GGGGSGGGGSA
GS15 ALAGGGGSGGGGSALV
GS18 GGGGSGGGGSGGGGSA
GS20 ALAGGGGSGGGGSGGGGSALV
HX27 ALAAEAAAKEAAAKEAAAKAGGGGSALV
놀랍게도, 발명자들은 현재 주장된 제1 및 제2 스페이서 특징으로 가진 융합단백질이 강화된 활성 속성과 재조합 발현동안 증가된 생산을 나타낸다는 것을 발견했다. 게다가, 현재 주장된 융합단백질은 일반 융합단백질과 비교할 때 강화된 효능을 나타내는데, 여기에서 갈라닌 TM은 전좌도메인 구성의 C-말단이다.
일 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NOs: 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 53, 56 및/또는 59의 아미노산 서열과 적어도 80% (적어도 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한 단일-사슬 폴리펩티드 융합단백질을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NOs: 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 53, 56 및/또는 59의 전체-길이 아미노산 서열과 적어도 80% (적어도 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%와 같은) 서열동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함(또는 구성)한 단일-사슬 폴리펩티드 융합단백질을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 단일-사슬 폴리펩티드에서, 비-세포독성 프로테아제 구성과 전좌 구성은 이황화결합에 의해 서로 연결된다. 따라서, 다음의 프로테아제 절단부위, 폴리펩티드의 절단은 이중-사슬 형성을 추정하는데, 여기에서 상기 프로테아제 및 전좌 구성은 이황화결합에 의해 서로 연결된 채로 남아있다. 이를 위해서, 프로테아제 및 전좌 구성은 최대 100 개의 아미노산 잔기, 좀 더 바람직하게는 최대 80 개의 아미노산 잔기, 특히 바람직하게는 최대 60 개의 아미노산 잔기, 및 가장 바람직하게는 최대 50 개의 아미노산 잔기에 의해 단일사슬 융합단백질에서 서로 거리를 두고 있다.
일 구체예에서, 비-세포독성 프로테아제 구성은 융합단백질의 전좌 구성과 이황화결합을 형성한다. 예를 들어, 이황화결합을 형성하는 프로테아제 구성의 아미노산 잔기는 프로테아제 구성의 C-말단 아미노산 잔기의 마지막 20 개 내에, 바람직하게는 마지막 10 개 내에 위치하고 있다. 유사하게, 이황화결합의 둘째 부분을 형성하는 전좌 구성 내의 아미노산 잔기는 전좌 구성의 N-말단 아미노산 잔기의 앞부분 20 개 내에, 바람직하게는 앞부분 10 개 내에 위치한다.
대안적으로, 단일사슬 폴리펩티드에서, 비-세포독성 프로테아제 구성과 TM은 이황화결합에 의해 서로 연결되어 있다. 이와 관련하여, 이황화결합을 형성하는 TM의 아미노산 잔기는 바람직하게, TM의 N-말단에서 떨어진 지역, 좀 더 바람직하게는 TM의 C-말단에 가까운 곳에 위치한다.
일 구체예에서, 상기 비-세포독성 프로테아제 구성은 TM 구성과 이황화결합을 형성한다. 이와 관련하여, 이황화결합을 형성하는 상기 프로테아제 구성의 아미노산 잔기는 바람직하게 프로테아제 구성의 C-말단의 아미노산 잔기의 마지막 20 개 내에, 좀 더 바람직하게는 마지막 10 개 내에 위치한다. 유사하게, 이황화결합의 둘째부분을 형성하는 TM 구성 내의 아미노산 잔기는 바람직하게 TM의 C-말단 아미노산 잔기의 마지막 20 개 내에, 좀 더 바람직하게는 마지막 10 개 내에 위치한다.
상기 이황화결합의 배열은 프로테아제와 전과 구성이 천연 클로스트리듐 신경독와 유사한 방식으로 배열된다는 이점을 가진다. 천연 클로스트리듐 신경독을 위한 주요한 아미노산 서열을 나타내는 비교의 방식에 의해, 각 시스테인 아미노산 잔기는 8 내지 27 개 사이의 아미노산 잔기에 의해 거리를 두고 있다 - MR & Marvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins, Chapter 9, in The Comprehensive Sourcebook of Bacterial 단백질 toxins. Ed. Alouf & Freer참조:
혈청형1 서열 C-C 사이의 '네이티브(Native)'길이
BoNT/A1 CVRGIITSKTKS----LDKGYNKALNDLC 23
BoNT/A2 CVRGIIPFKTKS----LDEGYNKALNDLC 23
BoNT/B CKSVKAPG-------------------IC 8
BoNT/C CHKAIDGRS----------LYNKTLDC 15
BoNT/D CLRLTK---------------NSRDDSTC 12
BoNT/E CKN-IVSVK----------GIRK---SIC 13
BoNT/F CKS-VIPRK----------GTKAPP-RLC 15
BoNT/G CKPVMYKNT----------GKSE----QC 13
TeNT CKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELC 27
1 오직 단백질 분해 계통에 관한 정보
상기 융합단백질은 하나 또는 그 이상의 정제태그를 포함하는데, 이것은 프로테아제 구성의 C-말단 및/또는 전좌구성의 C-말단에 위치한다.
어떤 정제태그도 적용 가능하나, 하기의 것이 바람직하다:
His-tag (e.g. 6 × histidine), 바람직하게 C-말단 및/또는 N-말단 태그로서 His-태그 (예를 들어, 6 × histidine)
MBP-태그 (maltose binding protein), 바람직하게 N-말단 태그로서 MBP-태그
GST-태그 (glutathione-S-transferase), 바람직하게 N-말단 태그로서 GST-태그
His-MBP-태그, 바람직하게 N-말단 태그로서 His-MBP-태그
GST-MBP-태그, 바람직하게 N-말단 태그로서 GST-MBP-태그
티오레독신-태그(Thioredoxin-tag), 바람직하게 N-말단 태그로서 티오레독신-태그(Thioredoxin-tag)
CBD-태그 (키틴(Chitin) 결합도메인), 바람직하게 N-말단 태그로서 CBD-태그 (키틴(Chitin) 결합도메인).
본 발명의 다른 구체예에 따라, 하나 또는 그 이상의 부가적인 펩티드 스페이서 분자는 상기 융합단백질에 포함될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 스페이서는 정제태그와 융합단백질 분자 (예를 들어, N-말단 정제태그 및 본 발명의 프로테아제 구성 사이; 및/또는 C-말단 정체태그 및 본 발명의 전좌구성 사이)의 나머지 사이에서 적용될 수 있다.
본 발명의 제2 측면에 따르면, 상기 언급된 단일사슬 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 제공한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 상기 DNA 서열은 DNA 벡터의 일부로서 제조되고, 여기에서 상기 벡터는 프로모터 및 터미네이터(terminator)를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 벡터는 하기에서 선택된 프로모터를 포함한다:
프로모터 유도 에이전트 일반적인 유도조건
Tac (하이브리드(hybrid)) IPTG 0.2 mM (0.05-2.0mM)
AraBAD L-아라비노오스(L-arabinose) 0.2% (0.002-0.4%)
T7-lac 오퍼레이터 IPTG 0.2 mM (0.05-2.0mM)
본 발명의 DNA 구성체(construct)는 바람직하게 인실리코(in silico)에서 제조되고, 이후 종래의 DNA 합성 기술에 의해 합성된다.
상기 언급된 DNA 서열정보는 최후 숙주세포(예를 들어, 대장균) 발현 시스템이 적용됨에 따라 선택적으로 코돈-편향(codon-biasing)을 위해 변형된다.
DNA 백본(backbone)은 바람직하게 어떤 고유의 핵산서열을 위해 스크리닝 되고, 전사 및 번역되어 둘째 펩티드-코딩 서열에 의해 코딩되는 프로테아제 절단부위와 대응된 아미노산 서열을 생산한다. 이 스크리닝은 수동적으로 또는 컴퓨터 소프트웨어 (예를 들어 DNASTAR 사에 의한 MapDraw 프로그램)의 도움에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 하기를 포함하는 비-세포독성 에이전트 제조방법이 제공된다:
a. 본 발명의 단일-사슬 폴리펩티드 융합단백질과 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제의 접촉단계;
b. 프로테아제 절단부위를 절단하는 단계, 및 그럼으로해서 이중-사슬 융합단백질을 형성하는 단계.
이러한 측면은 일반적으로 클로스트리듐 완전독의 구조를 모방한 이중-사슬 폴리펩티드를 제공한다. 좀 더 자세하게, 이중-사슬 폴리펩티드의 결과는 일반적으로 하기의 구조를 포함한다:
a. 구심성통각감각의 세포외 융합장치의 단백질을 절단할 수 있는 프로테아제인 비-세포독성 프로테아제를 포함한 제1 체인;
b. 갈라닌 TM과 상기 프로테아제를 엔도솜(endosome) 내에서 엔도솜 막을 통과하여 구심성통각감각 세포질로 이동시키는 전좌도메인을 포함한 제2 체인; 및 상기 제1 및 제2 체인이 서로 이황화결합에 의해 연결.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 단일사슬 또는 둘로나뉜-사슬(dich-chain) 폴리펩티드는 약제/치료적 분자로서 사용된다.
사용에서, 본 발명의 단일사슬 또는 이중-사슬 폴리펩티드는 통증을 치료, 예방 또는 개선시킨다.
사용에서, 본 발명의 단일사슬 또는 이중-사슬 폴리펩티드의 치료학적으로 효과적인 양은 환자에게 투여된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 본 발명의 단일사슬 또는 이중-사슬 폴리펩티드의 사용은 통증을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 약제 제조를 위해 제공된다.
관계되는 측면에 따라, 통증을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 방법이 피시험체에 제공되는데, 본 발명의 단일사슬 또는 이중-사슬의 치료학적으로 효과적인 양이 상기 시험체에 투여되는 단계를 포함한다.
여기에서 설명된 상기 화합물은 신경성 통증, 염증성 통증, 두통, 체성통, 내장통 및 관련통을 포함한 하나 또는 그 이상의 만성통증으로 고통받는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
여기에서 사용되는 “치료(treat)”는 의학적으로 처리되는 것을 의미한다. 예를 들어, 이것은 통증을 예방하거나 또는 그것의 괴로움을 줄이기 위한 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
여기에서 사용되는 용어 “통증”은 일반적으로 신체적인 장애와 결합된 어떤 불쾌한 감각적인 경험을 의미한다. 신체적인 장애는 임상의에게 자명할 수도 있고 자명하지 않을 수도 있다. 통증은 만성 또는 급성의 두가지 유형이다. “급성통증”은 갑작스러운 발병을 가지는 짧은 기간의 통증이다. 예를 들어, 급성 통증의 한 가지 유형은 절단 또는 화상과 같은 피부 또는 다른 표면조직의 상처에서 느껴지는 피부통증이다. 피부통각 침해수용기(nociceptors)는 단지 피부아래에서 종료되고, 신경말단에 높은 농도로 존재하며, 잘 정의되고 국소적인 짧은기간의 통증을 생산한다. “만성통증”은 급성통증 외의 통증이다. 만성통증은 신경성 통증, 염증성 통증, 두통, 체성통, 내장통 및 관련된 통증을 포함한다.
I. 신경성 통증 ( Neuropathic Pain )
본 발명의 화합물은 다음의 임의의 조건에 의해 야기되거나 연관된 신경성 통증을 치료하기 위해 사용된다. “신경성 통증”은 말초신경계, 중추신경계 또는 둘 다에서 불편함을 초래하는 이상감각입력을 의미한다.
A. 신경성 통증의 증상
신경성 통증의 증상은 이통(allodynia)(일반적으로 통증이 없는 자극에 대한 고통스런 반응), 통각과민증(hyperalgesia)(핀 찌름과 같은 오직 가벼운 불편함에 의해 일반적으로 야기되는 고통스런 자극에 대한 두드러진 자극), 통각과민(hyperpathia)(여기에서 짧은 불편함을 장기간의 심한 통증이 될 수 있음) 또는 지속적, 자발적 고통과 관련될 수 있다.
B. 신경성 통증의 원인
신경성 통증은 다음의 어떤 것에 의해 야기될 수 있다.
1. 예를 들어, 신경압박부상(예를 들어, 신경 손상, 신경신장 또는 불완전한 신경 절단); 척수 손상(예를 들어, 척수의 이등분(hemisection of the spinal cord)); 팔의 절단; 좌상; 염증(예를 들어, 척수의 염증); 또는 외과적 처치와 같은 외상성 상처.
2. 예를 들어, 뇌졸증 및 심장마비를 포함한 허혈성(ischemic) 사건.
3. 감염원.
4. 예를 들어, 약물, 알코올, 중금속(예를 들어, 납, 비소, 수은), 공업성 에이전트(예를 들어, 용매, 접착체 가스) 또는 아산화질소를 포함하는 독성 에이전트로의 노출.
5. 예를 들어, 염증성 장애, 신생물제종양(neoplastic tumor), 후천성 면역 결핍증 (AIDS), 라임병(Lymes disease), 나병, 대사성 질병, 신경종, 단발신경병증 또는 다발신경병증과 같은 말초신경장애를 포함한 질병.
C. 신경병 통증의 유형
1. 신경통(Neuralgia).
신경통은 신경구조에서 나타나는 어떤 병리학적 변화없이 하나 또는 그 이상의 특이적인 신경코스를 따라 나타내는 통증이다. 신경통의 원인은 다양하다. 화학적인 자극, 염증, 외상(수술 포함), 인근 구조물(예를 들어, 종양)에 의한 압박 및 감염등은 모두 신경통을 야기할 수 있다. 그러나 다양한 경우에, 상기 원인은 알 수 없거나 정체가 불명하다. 신경통은 노인에게 있어 일반적인 증상이나, 모든 연령대에서 발생할 수 있다. 신경통은 삼차적인 신경통, 대상포진 후 신경통(post-herpetic neuralgia), 포진후 신경통(postherpetic neuralgia), 설인신경통(glossopharyngeal neuralgia), 좌골 신경통(sciatica) 및 비정형적 안면통(atypical facial pain)을 포함한다.
신경통은 신경의 분포 또는 신경에서의 고통이다. 그 예는 삼차신경통(trigeminal neuralgia), 비정형적 안면통(atypical facial pain) 및 포진후 신경통(대상포진 또는 헤르페스에 의해 야기된)이다. 상기 영향을 받는 신경들은 턱에서 이마까지의 얼굴에서 터치, 온도 및 압력을 감지할 수 있다. 일반적으로 상기 장애들은 극심한 고통의 짧은 에피소드(short episodes)를 야기하는데, 일반적으로 2분 이하동안 얼굴의 한쪽 면만 야기한다. 상기 고통은 “찌르는 듯한”, “날카롭게”, “번개같이”, “타는 듯한” 및 심지어 “가려운”과 같은 다양한 방법으로 설명될 수 있다. 이례적인 TN의 형태에서, 상기 고통은 또한 심하게 또는 연장된 기간동안 단지 쑤시고 지속되는 것으로 존재한다. TN과 관련된 통증은 경험할 수 있는 가장 극심한 고통 중 하나로서 인식된다.
먹기, 말하기, 얼굴씻기 또는 어떤 가벼운 터치 또는 감각과 같은 가벼운 자극들은 발발의 계기가 될 수 있다 (심지어 가벼운 바람의 감각조차). 상기 발발은 뭉쳐져서 또는 개별적인 발발로 발생될 수 있다.
증상들은 어디든, 일반적으로 신체 표면 또는 그 근처, 각 에피소드(episode)에 대한 동일한 위치에서 날카로움, 찌르는 듯한 고통 또는 지속적이고 타는 듯한 고통; 특정 신경의 경로에 따른 통증; 통증에 의한 신체 일부의 손상된 기능, 또는 운동신경손상으로 유발된 근육 약화; 피부의 감각 증가 또는 영향받은 피부영역에서의 무감각(노바카인 샷(Novacaine shot)과 같은 국소 마취제와 유사한 느낌); 및 어떤 터치 또는 압력은 고통으로 해석된다. 움직임 또한 고통스러울 수 있다.
삼차 신경통은 신경통에서 가장 일반적인 형태이다. 이것은 얼굴의 주요 감각 신경, 삼차신경 에 영향을 준다 (“삼차”는 문자 그대로 “3개의 근원으로, 3개의 가지로 분할된 신경을 의미한다). 이 조건은 얼굴 한쪽 면에서 끔찍한 고통의 급작스럽고 짧은 발발과 관련되는데, 그 측면에서 삼차 신경에 의한 영역에 따른다. 상기 통증 발발은 고전적으로 고통스러운 틱(tic)(안면경련(tic douloureux))으로 나타나는 얼굴 찡그림을 유발한다. 때때로, 삼차 신경의 원인은 신경을 압박하는 혈관 또는 작은 종양이다. 다발성 경화증(뇌 및 척수에 영향을 미치는 염증성 질병)과 같은 질병, 관절염의 어떠한 형태, 및 당뇨병(높은 혈당)은 또한 삼차아민을 초래할 수 있으나, 항상 원인이 확인되는 것은 아니다. 이 상태에서, 씹기, 말하기, 삼키기 또는 얼굴영역의 터치와 같은 어떠한 움직임은 극심한 고?v의 경련을 유발할 수 있다.
관련되지만 다소 흔하지 않은 신경통은 목에 감각을 제공하는 설인신경(glosso-pharyngeal nerve)에 영향을 준다. 이 신경통의 증상은 목에 위치한 통증의 짧고, 충격과 같은 에피소드이다.
신경통은 바리셀라-조스터 바이러스, 페르페스 바이러스에 의해 야기되는 대상포진과 같은 감염 후에 발생한다. 이러한 신경통은 상기 대상포진 발진이 치유된 후에 지속적인 타는 통증을 생성한다. 이 고통은 영향을 받은 부위를 움직이거나 또는 접촉함으로써 심각해진다. 대상포진으로 진단받은 모든 것들이 대상포진보다 더 고통스러울 수 있는 포진후 신경통으로 되는 것은 아니다. 상기 통증 및 감각은 몇 달 혹은 심지어 몇 년동안 지속될 수 있다. 상기 통증은 어떤 터치나 특히 가벼운 터치와 같은 일반적으로 참을 수 없는 감각의 형태이다. 포진후 신경통은 얼굴에만 제한되지 않는다. 이것은 신체 어디든 발생할 수 있으나 일반적으로 대상포진 발진 위치에서 발생한다. 통증으로 인한 우울증과 아플 때의 사회적인 고립은 일반적이지 않다.
포진후 신경통은 원래의 헤르페스 감염의 증상이 사라진 후에 오랫동안 심신을 약화시킬 수 있다. 신경통을 유발시키는 다른 전염병들은 매독과 라임병이 있다.
당뇨병도 신경통을 유발하는 또 다른 예이다. 이것은 미국인 성인 20 명 중 거의 1 명에게 영향을 미치는 매우 일반적인 의학적 문제점이다. 당뇨병은 신경에 순환을 공급하는 작은 동맥에 손상을 입혀 신경섬유의 고장과 때때로 신경손실을 일으킨다. 당뇨병은 삼차 신경통, 손목골 증후군(손과 손목의 통증 및 마비) 및 지각이상성대퇴신경통(meralgia paresthetica)(측면 대퇴 피부신경의 손상 때문에 대퇴부에서의 마비 및 통증)을 포함한 거의 모든 신경통에 영향을 준다. 혈당의 엄격한 조절은 당뇨병 신경손상을 방지하고 신경통을 가진 환자의 회복을 가속화한다.
신경통과 관련된 다른 의학적인 상태로는 만성 신부전 및 포르피린증(porphyria)이 있다 ? 신체에서의 유전성 질환은 신체혈관의 일반적인 고장 후에 생성되는 어떤 물질 그 자체를 제거할 수는 없다. 특정 마약들 또한 하기 문제를 유발한다.
2. 구심로차단(Deafferentation)
구심로차단은 신체일부에서 감각적인 입력의 결손을 나타내는데, 말초감각신경이나 중추신경시스템 신경 모두의 중단에 의해 야기될 수 있다. 구심성차단 증후군은 뇌 또는 척수의 손상, 뇌졸증 후 통증, 헛통증(phantom pain), 양측하지마비(paraplegia), 완신경총 견열손상(brachial plexus avulsion injuries), 허리 신경근병(lumbar radiculopathies)을 포함하나, 이에 제한된 것은 아니다.
3. 복합부위 통증 증후군(CRPSs)
CRPS는 교감적으로-유지된 고통에서 초래된 만성통증 증후군으로 두가지 형태가 존재한다. 현재 CRPS 1은 용어 “반사성교감신경성이영양증(reflex sympathetic dystrophy syndrome)”으로 대체된다. 이것은 팔이나 또는 다리에서 작은 또는 큰 부상을 당한 후에 종종 발생하는 만성신경장애이다. CRPS 1은 심각한 고통과 관련된다; 손톱, 뼈, 및 피부에서의 변화; 및 영향받은 사지에서 터치로 인해 증가된 감각. CRPS 2는 용어 작열통(causalgia)으로 대체되고, 신경에 입은 동일한 상처에서 유래된다. CRPS는 CRPS 유형 I (반사성교감신경성이영양증) 및 CRPS 유형 II (작열통)을 포함하나, 이에 제한된 것은 아니다.
4. 신경장애신경장애
신경장애는 신경에서의 기능적이거나 병리학적인 변화로, 임상적으로 감각 또는 운동신경 이상에 의해 특징된다.
중추 신경장애는 중추신경시스템에서의 기능적이거나 병리학적인 변화이다.
말초 신경장애는 하나 또는 그 이상의 말초신경에서의 기능적이거나 병리학적인 변화이다. 말초신경은 당신의 중추신경시스템(뇌 및 척수)에서 근육 또는 다른 기관으로, 그리고 당신의 피부, 관절 및 다른 기관에서 당신의 뇌로 정보를 전달한다. 말초 신경장애는 이러한 신경들이 뇌 또는 척수로 및 뇌 또는 척수에서 정보를 전달하는 것을 실패할 때 발생하고, 결과적으로 통증, 감각의 손실, 또는 조절근육의 무능력을 발생시킨다. 몇가지 경우에, 혈관, 내장 및 다른 기관을 조절하는 신경의 실패는 혈압이상, 소화문제, 및 다른 기본적인 신체 프로세스의 손실을 초래한다. 신경통을 위한 위험인자는 당뇨병, 과도한 알코올 섭취 및 특정 화학물질 및 약물에의 노출을 포함한다. 일부 사람들은 신경통을 위한 유전적인 소인을 가진다. 신경에 장시간 압력을 가하는 것은 신경손상을 나타내는데 또 다른 위험요소이다. 압력손실은 장시간의 부동(예를 들어 긴 수술 또는 긴 아픔) 또는 캐스트(casts), 부목, 버팀대, 클러치 또는 다른 장치에 의한 신경압력에 의해 발생된다. 다발성신경병증은 보통 신체 두 측면에 동등하게 영향을 미치는 넓은영역의 과정을 의미한다. 상기 증상은 영향을 받는 신경 유형에 의존한다. 신경의 세 가지 주요유형은 감각, 운동 및 자율신경이다. 신경장애는 임의적인 신경의 하나 또는 세가지 유형 모두의 조합에 영향을 미칠 수 있다. 또한 증상들은 조건들이 전 신체 또는 단지 하나의 신경(부상으로부터)에 영향을 미치는지에 대해 의존한다. 만성 염증성 다발성신경병증의 원인은 비정상적인 면역반응이다. 특정 항원, 면역 프로세스 및 유발요인들은 다양하고 많은 경우가 발견되지 않았다. 이것은 HIV, 염증성 장질환, 홍반성 낭창(lupus erythematosis), 만성활성간염(chronic active hepatitis) 및 혈구기형(blood cell abnormalitie)과 같은 다른 조건과의 연관에서도 발생할 수 있다.
말초 신경장애는 단일신경 또는 신경그룹(monneuropathy)에서의 기능 또는 병리학적 변화와 관련되거나 다수의 신경(polyneuropathy)에 영향을 미치는 기능 또는 병리학적인 변화와 관련된다.
말초신경병증
유전질환(Hereditary disorders)
샤르코마리투드병(Charcot-Marie-Tooth disease)
프리드라이히운동실조증(Friedreich's ataxia)
전신 대사장애
당뇨병 (당뇨병 신경병증)
식이부족 (특히 비타민B-12)
과도한알코올 섭취 (알콜성신경병증)
요독증요독증(신장 장애에서부터)
암
감염 또는 염증상태
AIDS
간염
콜로라도진드기열(Colorado tick fever)
디프테리아(diphtheria)
게랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)
AIDS 발발없이 HIV 감염
나병
라임(Lyme)
결절성다발성동맥염(polyarteritis nodosa)
류머티스성 관절염
유육종증(sarcoidosis)
쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome)
매독
전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus)
아밀로이드(amyloid)
독성 화합물에 노출
스니핑 접착제(sniffing glue) 또는 기타 톡성 화합물
아산화질소(nitrous oxide)
공업용 에이전트 ? 특히 용매
중금속 (납, 비소, 수은 등.)
진통제 신경병증과 같은 약물에 대한 이차 신경장애
기타원인
국소빈혈(산소의 감소/혈류감소)
저온에서의 장시간 노출
a. 다발성신경병증
다발성신경병증은 다수의 말초신경의 손상 또는 파괴에 의해 발생되는 영역의 움직임 또는 감각의 손실과 관련된 말초 신경장애이다. 다발성신경병증은 폴리오 후 증후군(post-polio syndrome), 유방절제후 증후군(postmastectomy syndrome), 당뇨병신경병증, 알코올 신경병증, 아밀로이드, 독소, AIDS, 갑상선기능저하증, 요독증, 비타민 결핍증, 화학요법으로 유도된 통증, 2', 3'- didexoycytidine (ddC) 치료, 기엥-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome) 또는 파브리병(Fabry's disease)을 포함하나, 이에 제한된 것은 아니다.
b. 단발성신경병증
단발성신경병증은 단일 말초신경 또는 신경그룹의 손상 또는 파괴에 의해 발생된 영역에서의 움직임 또는 감각의 손실과 관련된 말초 신경장애이다. 대부분의 단발성신경장애는 비록 선택적으로 조직적인 장애가 고립된 신경의 손상을 초래하나(다발성단신경염(mononeuritis multiplex)과 같은), 상처 또는 트라우마에 의해 발생된 국소영역에서의 손상에 의해 발생된다. 상기 일반적인 원인들은 직접적인 트라우마, 신경에의 장기적인 압력 및 근처의 신체구조의 부종 또는 상처에 의한 신경의 압력이다. 상기 손상은 신경 또는 신경세포의 일부(축삭) (를 덮는) 미엘린초(myelin sheath)의 파괴를 포함한다. 이 손상은 신경을 통한 자극의 전도를 느리게 하거나 예방한다. 단발성신경병증은 신체의 어떤 부분과 관련된다. 단발성신경병증의 통증은 좌골신경기능장애, 비골 신경장애, 요골신경상애, 척골신경장애, 뇌 단발성신경병증 VI, 뇌 단발성신경병증 VII, 뇌 단발성신경병증 III(압력유형), 뇌 단발성신경병증 III (당뇨병 유형), 액와신경 기능장애, 손목터널증후군, 대퇴신경장애, 경골 신경장애, 안면신경마비(Bell's palsy), 흉곽출구 증후군(horacic outlet syndrome), 손목터널증후군 및 여섯째(외전신경) 중풍을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
c. 일반적인 말초신경병증
일반적인 말초신경병증은 대칭적이고, 보통 다양한 조직적인 질환과 말초신경시스템 그 전체에 영향을 주는 질병 프로세스로 유발된다. 그들은 또한 여러 종류로 세분화된다:
i. 말단 축삭병증(Distal axonopathies)은 몇몇의 대사적인 또는 뉴런의 독성교란으로 유발된다. 그들은 당뇨병, 신장장애와 같은 대사장애, 영양실조 및 알코올 중독과 같은 결핍증, 또는 독소나 약물의 영향에 의해 유발된다. 말단 축삭병증(가지 마름병 신경장애라고 알려진)은 말초신경 시스템(PNS) 뉴럽의 몇가지 대사 또는 독성교란으로 유발된 말단 신경병증의 유형이다. 이것은 대사 또는 독성 신경장애의 일반적인 반응이고, 당뇨병, 신장장애와 같은 대사장애, 영양실조 및 알코올 중독과 같은 결핍증, 또는 독소나 약물의 영향에 의해 유발된다. 말단 축삭병증의 가장 일반적인 원인은 당뇨병이고, 대부분의 일반적인 말단 축삭병증은 당뇨병 신경병증이다.
ii. 수초질환(Myelinopathies)은 수초에서 충격전도의 급성 실패를 일으키는 주요발발 때문이다. 다른 증상으로 만성 염증성 탈수질환(CIDP), 유전 대사 질환(예를 들어, 류코디스트로피), 또는 독소를 포함하나, 가장 일반적인 원인은 급성 염증성 탈수질환 다발성신경병증(AIDP; 기엥 바레 증후군으로 알려진)이다. 수초질환은 수초나 또는 축삭이 변경되지 않은 상태로 유지되게 하는 수초성 슈반세포(Schwann cells)의 파괴가 주요한 원인이고, 충격전도의 급성실패를 유발한다. 이러한 수초탈락(demyelination)은 신경을 통한 전기적인 충격의 전도를 느려지게 하거나 완전히 막아버린다. 비록 다른 원인으로 만성 염증성 탈수질환 다발성신경병증(CIDP), 유전대사질환(예를 들어 류코디스트로피 또는 샤르코마리투드명), 또는 독소가 있으나, 가장 일반적인 원인은 급성 염증성 탈수질환 다발성신경병증(AIDP, 기엥-바래 증후군으로 더 잘 알려진)이다.
iii. 신경병증은 말초신경 시스템(PNS) 뉴런의 파괴의 결과이다. 그들은 운동뉴런 질환, 감각 신경병증(예를 들어, 대상포진), 독소 또는 자율신경장애에 의해 발생된다. 신경독은 화학요법 에이전트 빈크리스틴(vincristine)과 같은 신경병증을 유발한다. 신경병증은 말단신경 시스템(PNS) 뉴런이 손상때문에 발생하는 기능장애로, 말단 신경병증을 일으킨다. 이것은 운동뉴런 질환, 감각 신경병증(예를 들어, 대상포진), 독소물질 또는 자율적인 기능장래에 의해 유발된다. 신경병증을 가진 사람은 그 원인에 의존하여 다양한 방법으로 존재하는데, 상기 방법은 신경세포와 가장 영향을 받는 신경세포 유형에 영향을 미친다.
ⅳ. 초점 포착 신경병증(예를 들어, 손목터널 증후군).
II . 염증성 통증
본 발명의 화합물은 하기의 임의적 염증성 조건에 의해 유발되는 또는 그와 관련된 통증을 치료하기 위해 사용된다.
A. 관절염 장애
관절염 장애는 예를 들어, 류마티스 관절염; 소아 류마티스 관절염; 전신 홍반성 루프스(SLE); 통풍관절염; 경피증; 건선성관절염; 강직성 척추염; 라이터 증후군(Reiter's syndrome)(반응성 관절염); 성인형 스틸병; 바이러스 감염에 의한 관절염; 임균성관절염 및 비임균성 박테리아 관절염(화농성 관절염)과 같은 박테리아 감염에 의한 관절염; 터셔리 라임 병(Tertiary Lyme disease); 결핵성 관절염; 및 예를 들어 분아균증(blastomycosis)과 같은 균 감염에 의한 관절염을 포함한다.
B. 자가면역질환
자가면역질환은 예를 들어, 기엥-바레 증후군, 하시모토병(Hashimoto's thyroiditis), 악성빈혈, 에디슨 병(Addison's disease), 전신 홍반성 루프스, 피부근염, 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 라이터증후군 및 그레이브즈 병(Grave's disease)을 포함한다.
C. 결합조직질환
결합조직질환은 예를 들어 척추관절염(spondyloarthritis) 및 피부근염, 및 섬유근육통(fibromyalgia)을 포함한다.
D. 상처
예를 들어, 크러쉬(crush), 조직 또는 관절의 스트레치를 포함한 상처에 의해 발생한 염증은 만성 염증성 통증을 유발한다.
E. 감염
예를 들어 폐결핵 또는 간질성 각막염을 포함한 감염에 의해 유발된 감염은 만성 염증성 통증을 유발한다.
F. 신경염
신경염은 신경 또는 신경그룹에 영향을 미치는 염증성의 과정이다. 증상들은 관련된 신경에 의존하나, 통증, 감각이상, 부전마비, 또는 감각감퇴(마비)를 포함할 수 있다. 예로는 다음을 포함한다:
a. 완신경염(Brachial neuritis)
b. 교후부의(Retrobulbar) 신경장애, 안구 바로 뒤에 있는 시신경의 일부에 영향을 미치는 염증성의 과정.
c. 시신경 신경장애, 영향을 받는 눈에서 시력의 갑작스러운 감소를 일으키는 시신경에 영향미치는 염증성 과정. 시신경염의 원인은 밝혀지지 않았다. 시신경(눈 및 뇌와 연결된 신경)의 갑작스런 염증은 미엘린초의 부종 및 파괴를 이끌어낸다. 상기 염증은 선택적으로 바이러스 감염에 의해 유발되거나, 또는 다발성 경화증과 같은 자가면역질환에 의해 유발된다. 위험요소들은 가능한 원인들과 관련된다.
d. 전정 신경염(Vestibular neuritis), 전정신경에 영향을 미치는 염증 과정을 초래하는 바이러스 감염.
G. 관절염
예를 들어, 활액낭염 또는 건염에 의해 유발되는 관절염은 만성 염증성 통증을 유발한다.
III . 두통
본 발명의 화합물은 다음의 임의의 두통조건을 유발하거나 또는 이와 관련된 통증을 치료하기 위해 사용된다. 두통(의학적으로 cephalgia으로 알려진)은 머리에서 느끼는 경증에서 심한고통까지의 상태이다; 때때로 목 또는 등 상부 통증 또한 두통으로 해석될 수 있다. 이것은 국소적 또는 전신질환에 놓인 것을 나타내거나 또는 그 자체의 장애를 나타낸다.
A. 근육/근원성 두통
근육/근원성 두통은 얼굴 및 목 근육의 강화 또는 긴장과 관련된 것을 나타낸다; 그들은 이마에 방출할 수 있다. 긴장성 두통인 근육조직두통의 가장 일반적인 형태이다.
긴장성 두통은 머리, 두피 또는 목, 일반적으로 이런 영역에서의 근육 압박감과 관련된 영역에서의 통증 또는 불쾌함과 관련된 상태이다. 긴장성 두통은 목과 두피 근육의 수축으로부터 유발된다. 이 근육 수축의 한가지 원인은 스트레스, 우울증 또는 불안에 대한 반응이다. 움직임 없이 오랫동안 한 자세로 고정된 머리가 되도록 하는 모든 활동은 두통을 유발할 수 있다. 이와 같은 활동은 타이핑 또는 컴퓨터의 사용, 손으로 하는 미세작업 및 망원경의 사용을 포함한다. 추운 방에서 자거나 또는 이상한 자세로 목을 두고 자는 것 또한 이 같은 두통의 유형의 계기가 된다. 긴장성 유형의 두통은 에피소드 긴장성 두통 및 만성 긴장성 두통을 포함하나, 이에 제한된 것은 아니다.
B. 혈관 두통
이런 혈관두통으로 가장 흔한 유형은 편두통이다. 혈관두통의 다른 종류들은 클러스터 두통을 포함하는데, 이것은 심한고통의 반복된 에피소드 및 고혈압으로 인한 두통을 유발한다.
1. 편두통
편두통은 일반적으로 재발되는 두통을 포함하는 여러 다른 종류들로 이뤄진(heterogeneous) 장애이다. 편두통은 다른 두통들과 다른데 왜냐하면 그들은 메스꺼움, 구토 또는 빛에 대한 감도와 같은 다른 증상을 발생시키기 때문이다. 일반적인 사람에게, 욱신거리는 통증은 오직 머리의 한 측면에서 느껴진다. 오라 증상(aura symptoms), 전구증의 존재, 또는 현기증과 같이 관련된 증상의 유형과 같은 임상적인 특징은 병리생리학적이고 유전적인 메커니즘에 놓인 다른 경로를 가진 환자의 서브그룹에서 볼 수 있다. 편두통은 오라(aura) 없는 편두통(일반적인 편두통), 오라있는 편두통(고전적인 편두통), 월경의 편두통, 편두통 해당량(무두류의 두통), 복잡한 편두통, 복성편두통 및 혼합된 긴장성 편두통을 포함하나, 이에 제한된 것은 아니다.
2. 클러스터 두통
클러스터 두통은 머리의 한 측면(편무적인)에 영향을 주고 눈의 눈물과 코의 막힘과 관련된다. 그들은 매일 몇 주동안 동시에 반복적으로 발생하는 클러스터에서 생기고, 그 다음 없어진다.
D. 고혈압 두통
E. 견인 및 염증성 두통
견인 및 염증성 두통은 보통 뇌졸증에서 부비동 감염에 이르기까지 다른 장애의 증상을 가진다.
F. 호르몬 두통
G. 반동두통
약물과용 두통으로 알려진 반동 두통은 두통을 완화시키기 위해 약제를 너무 자주 섭취할 때 발생한다. 반동 두통은 빈번하게 매일 그리고 매우 고통스럽게 나타난다.
H. 만성 축농증 두통
축농증은 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 알레르기 또는 자가면역에 의한 부비동(paranasal sinuses) 염증이다. 만성 부비동염은 감기의 가장 흔한 합병증이다. 증상은 코막힘; 안면통증; 두통; 발열; 전신 권태감; 두꺼운 녹색 또는 노란색의 방전; 절곡(bending over)을 더 악화시키는 얼굴의 ‘풍만함(fullness)’을 느낌을 포함한다. 소수의 경우에서, 만성 상악동 부비동염은 또한 치과 감염에서 박테리아가 확산됨으로써 유발될 수 있다. 만성 증식성 호산성의 부비동염은 만성 부비동염의 비-감염적인 형태이다.
I. 기본적인 두통
J. 간질발작의 두통
간질발작두통은 발작활성과 관련된 두통이다.
IV . 체성통
본 발명의 화합물은 다음의 임의적인 체성통 상태를 유발하거나 이와 관련된 다른 통증을 치료하기 위해 사용된다. 체성통은 인대, 힘줄, 뼈, 혈관, 및 심지어 신경 그 자체에서 유래한다. 이것은 체성 외상수용기(nociceptors)로 감지된다. 이러한 영역에서 통증 수용체의 결핍은 피부고통보다 좀 더 긴 시간동안 무디고, 약한-국소적인 통증을 생성한다; 예들은 염좌와 골절을 포함한다. 부가적인 예로 다음을 포함한다.
A. 과도한 근육긴장
과도한 근육긴장은 예를 들어, 염좌 또는 변형에 의해 유발될 수 있다.
B. 반복적인 운동장애
반복적인 운동장애는 손, 손목, 팔꿈치, 어깨, 목, 등, 힙, 무릎, 발, 다리 또는 발목의 과도한 사용으로 유발될 수 있다.
C. 근육이상
체성통을 일으기는 근육이상은 예를 들어, 다발성근염, 피부근염, 루푸스, 섬유근육통, 류마티스성 다발성 근육통 및 횡문근변성(rhabdomyolysis)을 포함한다.
D. 근육통
근육통은 근육통증으로 많은 질병과 장애의 증상이다. 근육통의 가장 일반적인 원인은 근육 또는 근육집단의 과도한 사용 또는 과도한-스트레칭이다. 충격적인 사건 없이 생긴 근육통은 종종 바이러스 감염 때문이다. 장기 근육통은 대사근병증, 몇몇 영양결핍 또는 만성 피로증후군을 나타낸다.
E. 감염
감염의 예는 예를 들어, 근육에의 종기, 선모충 병, 인플루엔자, 라임병, 말라리아, 로키산 홍반열(Rocky Mountain spotted fever), 조류독감, 일반감기, 지역사회 획득 폐렴(community-acquired pneumonia), 수막염, 원두(monkeypox), 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome), 독소충격증후군(toxic shock syndrome), 선모충병, 장티푸스 및 상기도 감염을 포함한다.
F. 약물
약물은 체성통을 일으킬 수 있다. 이 같은 약물은 예를 들어, 코카인, 콜레스테롤을 낮추는 스타틴(statin)(아토르바스타틴, 심바스타틴, 로바스타틴과 같은) 및 혈압을 낮추는 ACE 억제제(에날라프릴(enalapril))와 캡토프릴(captopril))을 포함한다.
V. 내장통
본 발명의 화합물은 다음의 임의적인 내장통 상태를 유발하거나 또는 다른 관련된 통증을 치료하는데 사용할 수 있다. 내장통은 신체의 내장 또는 기관에서 유래된다. 내장의 통각수용기는 신체의 장기 및 내부 빈 부분 내에 위치한다. 이러한 영역의 통각수용기의 더 큰 결핍은 일반적으로 체성통보다 더 긴 시간동안 더 아프게하는 통증을 유발한다. 내장통은 국부적이기가 매우 어렵고, 내장 조직의 심각한 상처는 “언급된” 통증을 나타내는데, 상기 감각은 상처부위와 완전히 관련없는 영역에 국한된다. 내장통의 예는 다음을 포함한다.
A. 기능적인 내장통
기능적인 내장통은 예를 들어, 과민성 대장증후군 및 만성 기능적인 배앓이(CFAP), 기능성 변비 및 기능성 소화불량, 비-심인성 흉통(NCCP) 및 만성 이상통증을 포함한다.
B. 만성 위장관 염증
만성 위장관 염증은 예를 들어, 크론병, 궤양성대장염, 미세장염, 게실염 및 위장염과 같은 위염, 염증성 장질환; 간질성 방광염; 장 허혈; 담낭염; 충수염; 역류성 식도염; 궤양, 신장결석, 요로감염, 췌장염 및 탈장을 포함한다.
C. 자가면역 통증
자가면역통증은 예를 들어 유육종증(sarcoidosis) 및 맥관염(vasculitis)을 포함한다.
D. 유기내장통
유기내장통은 예를 들어, 외상약, 장의 염증성 또는 퇴행성 병변에 의해 유발되거나 감각신경 분포에 충돌하는 종양에 의해 생성된다.
E. 치료로 유발된 내장통
치료로 유발된 내장통은 예를 들어, 화학요법치료에 수반된 통증 또는 방사선 치료에 수반된 통증을 포함한다.
VI . 관련통
본 발명의 화합물은 하기의 임의적인 관련통 상태를 유발하거나 또는 다른 관련된 통증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 관련통은 통증자극의 부위에서 분리된 국소적인 영역의 통증에서 발생한다. 종종, 관련통은 신경이 그것의 근원에서 또는 그 근처에서 압박되거나 또는 손상을 입을 때 발생한다. 이와 같은 상황에서, 통증의 감각은 일반적으로 신경이 제공하는 영역에서 느껴지는데, 심지어 손상은 다른 곳에서 유래된다. 일반적인 예시는 척추원발탈출증(intervertebral disc herniation)에서 발생하는데, 척수에서 발생하는 신경근이 인접한 디스크 물질에 의해 압박받는다. 비록 통증이 손상된 디스크 그 자체에 의해 발생된다 할지라도, 통증 또한 압박된 신경(예를 들어, 대퇴부, 무릎, 또는 발)에 의해 영향받는 영역에서도 느낄 수 있다. 신경근에서의 압력을 덜어내는 것은 관련통을 개선할 수 있고, 영구적인 신경손상이 발생하지 않도록 할 수 있다. 심근허혈증(심장근육조직 일부로의 혈류의 손실)은 관련통으로 가장 잘 알려진 예시이다; 상기 감각은 가슴 위쪽에서 제한된 느낌으로써 발생하거나 왼쪽 어깨, 팔 또는 심지어 손에서의 통증으로써 발생한다.
본 발명은 통증 상태의 넓은 범위를 설명하는데, 특히 만성통증상태를 설명한다. 바람직한 상태는 암 및 비-암성 통증, 염증성 통증 및 신경병증성 통증을 포함한다. 본 출원의 오피오이드-융합(opioid-fusions)은 비록 신경병증성 통증을 설명하기에 덜 적합하다 할지라도, 부분적으로 염증성 통증을 설명하기 위해 적용된다. 상기 갈라닌-융합은 신경병증성 통증을 설명하기에 좀 더 적합하다.
사용에서, 본 발명의 폴리펩티드는 일반적으로 약제학적 담체, 희석제 및/또는 부형제와 관련된 약제학적 조성물의 형태로서 적용되는데, 상기 조성물의 정확한 형태는 투여 방식에 맞게 조절될 수 있다. 투여는 바람직하게 동물, 더 바람직하게는 인간에게 된다.
상기 폴리펩티드는 예를 들어 관절내 투여(intra-articular administration) 또는 두개골 내 투여(intra-cranial administration)를 위한 멸균 용액의 형태로 적용된다. 척수주사(예를 들어 경막외 또는 척수강)이 바람직하다.
본 발명의 폴리펩티드의 투여를 위한 용량범위는 원하는 치료적인 효과를 생성하기 위한 용량이다. 용량범위가 구성의 정확한 특징, 투여경로, 제형의 특성, 환자의 나이, 환자의 특성, 정도 또는 심각도, 금기시할 것들, 만약에 있다면 주치의의 판단에 의존하는 것은 이해될 수 있다.
적절한 일일 용량은 0.0001-1 mg/kg의 범위, 바람직하게 0.0001-0.5 mg/kg의 범위, 좀 더 바람직하게는 0.002-0.5 mg/kg의 범위이고, 가장 바람직하게는 0.004-0.5 mg/kg의 범위이다. 유닛용량(unit dosage)은 1 마이크로그램 이하에서 30 mg까지 다양하나, 일반적으로 용량당 0.01 내지 1 mg의 범위이고, 매일 또는 바람직하게는 매주 또는 6 개월과 같이 빈번하지 않게 투여된다.
특히 바람직한 용량 투여방식은 1X 용량으로써 융합단백질의 2.5 ng에 기초한다. 이와 관련하여, 바람직한 용량은 1X?100X(예를 들어, 2.5-250 ng)의 범위이다. 이같은 용량 범위는 NSAIDS, 모르핀 및 가바펜틴(gabapentin)과 같은 다른 진통제 분자가 적용되는 것과 비교할 때 상당히 낮다(즉, 적어도 10 배, 전형적으로 100 배 낮다). 게다가, 상기 언급된 차이점은 같은 비교가 몰을 기준으로 될 때 상당히 확대된다 ? 이것은 본 발명의 융합단백질이 종래의 ‘적은’ 분자 치료법에서 행해질 때보다 상당히 더 큰 Mw를 가지기 때문이다.
그러나 획득된 용량에서의 넓은 다양성은 구성의 정확한 특징과 다양한 투여경로의 다른 효과에 의존하여 기대된다.
이러한 용량수치에서의 다양성은 해당 기술분야에서 잘 이해되는 바와 같이, 최적화를 위한 표준실험 루틴을 이용하여 조정될 수 있다.
주입에 적절한 조성물은 용액, 현탄액 또는 에멀젼, 또는 종래에 사용된 적절한 운반자에서 용해되거나 또는 부유되는 가루 파우더의 형태일 수 있다.
액체 유닛용량 형태는 일반적으로 무 발열원(pyrogen-free) 멸균 운반자를 이용하여 제조될 수 있다. 활성성분은 사용된 운반자 및 농도에 의존하여 운반자에서 용해되거나 또는 부유될 수 있다.
투여용액의 제조에서, 상기 폴리펩티드는 운반자에서 용해될 수 있고, 상기 용액은 필요하다면 염화나트륨의 부가하여 등장성이 되도록 할 수 있으며 적절한 멸균 바이알 및 앰플에 충전 및 밀봉하기 전에 무균기술을 이용한 멸균필터를 통과하는 여과에 의해 멸균될 수 있다. 대안적으로, 만약 용액 안정성이 적절하다면, 그것의 밀봉된 용액 내의 용액은 오토 클레이브(autoclaving)에 의해 멸균될 수 있다.
버퍼링, 가용화, 안정화, 방부제 또는 산균, 부유 또는 유화 에이전트와 같은 유리첨가제가 운반자에 용해될 수 있다.
종래 사용된 적절한 운반자에서 용해되거나 또는 부유되는 가루 파우더는 미리-멸균된 약물 물질과 다른 성분들을 살균 영역에서 무균기술을 사용한 멸균 용기로 채움으로써 제조된다.
대안적으로, 상기 폴리펩티드와 다른 성분들은 수성 운반자에서 용해되고, 상기 용액은 여과에 의해 멸균되고 살균영역에서의 무균기술을 사용한 적절한 용기로 분산된다. 그런 다음 생성물은 동결 건조되고 용액은 무균적으로 밀봉된다.
근육내, 피하 또는 피내주입에 적합한 비경 현탁액은 멸균 운반자에서 부유되는 멸균성분을 제외하고 실질적으로 같은 방식으로 제조되는데, 대신 용해되는 것과 멸균은 여과에 의해 달성될 수 없다. 상기 구성은 멸균상태에서 분리되거나 또는 대안적으로 감마선 조사와 같은 멸균 후에 분리된다.
유리하게, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)과 같은 부유 에이전트가 성분구성의 균일한 분포를 용이하게 하도록 상기 조성물에 포함된다.
용어 정의
표적화체(TM)는 에이전트와 표적세포의 표면 사이에서의 물리적인 결합을 일으키기 위해 결합부위(Binding Site)와 기능적으로 상호작용하는 에이전트와 관련된 임의의 화학적인 구조를 의미한다. 본 발명의 내용에서, 상기 표적세포는 구심성통각감각이다. 용어 TM은 표적세포 결합부위에 결합할 수 있는 어떤 분자(즉, 자연적으로 발생한 분자, 또는 그의 화학적/물리적으로 변형된 변이체)를 포함하는데, 결합부위는 내부화(internalisation)(예를 들어 엔도좀 형성)할 수 있고, 또한 수용체-매개의 세포이물흡수로서 나타난다. 상기 TM은 본 발명의 에이전트에 존재할 필요가 없는 TM과 전좌도메인 구성을 분리할 수 있는 엔도솜막 전좌기능을 포함한다.
본 발명의 상기 TM은 구심성통각감각 (예를 들어, 주요한 구심성 통각)에 결합한다(바람직하게는 특이적으로 결합한다). 이와 관련하여, 특이적으로 결합한다는 것은 TM이 구심성 비-통각(non-nociceptive), 및/또는 운동뉴런(즉, 클로스트리듐 신경독 완전독을 위한 천연의 목표)과 같은 다른 뉴런에 결합하는 것보다 더 큰 친화력을 가진 구심성통각감각(예를 들어, 주요한 구심성통각)과의 결합을 의미한다. 또한 상기 용어 “특이적으로 결합한다”는 것은 주어진 TM이 예를 들어 106 M-1이거나 그 이상, 바람직하게는 107 M- 1 이거나 그 이상, 좀 더 바람직하게는 108 M- 1 이거나 그 이상, 가장 바람직하게는 109 M- 1 이거나 그 이상의 결합친화력(Ka)을 가진 GALR1, GALR2 및/또는 GALR3 수용체와 같은 갈라닌 수용체, 즉 주어진 수용체와 결합한다는 것을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, 작용제는 표적세포에서 세포외 융합과정을 자극할 수 있는 분자로 정의되는데, 상기 과정은 표적세포에서 세포외 융합장치의 단백질을 절단할 수 있는 프로테아제에 의해 저해되기 쉽다.
따라서, 본 발명의 특정 작용제에 대한 정의는 종래 작용제로서 여겨지던 많은 분자를 제외한다.
예를 들어, 신경성장인자(NGF)는 TrkA 수용체와 결합함으로써 신경적인 분화를 촉진시키는 능력과 관련된 작용제이다. 그러나 NGF는 세포외 융합의 원칙적인 유도인자가 아니기 때문에, 상기의 기준으로 분석할 때는 작용제가 아니다. 게다가, NGF가 자극하는 과정은(즉, 세포분화) 비-세포독성 독소 분자의 프로테아제 활성에 의해 저해되기가 어렵다.
단백질과의 관계에서 사용되는 용어인 “절편(fragment)”은 당해 단백질의 아미노산 잔기가 적어도 35 개, 바람직하게는 적어도 25 개, 좀 더 바람직하게는 20 개, 가장 바람직하게는 적어도 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개를 가지는 펩티드를 의미한다.
단백질과 관련하여 사용되는 용어 “변이체(variant)”는 하나 또는 그 이상의 유사체(analogues) 아미노산 (예를 들어, 천연이 아닌 아미노산) 또는 치환된 연결을 포함하는 단백질의 펩티드 또는 펩티드 절편을 의미한다.
단백질과 관련하여 사용되는 용어 “유도체(derivative)”는 당해 단백질을 포함하는 단백질과 펩티드 서열을 더 포함한 단백질을 의미한다. 또한 펩티드 서열은 바람직하게는 염기성 접힘과 결과적으로 원래 단백질의 형태적 구조가 방해받지 않도록 해야 한다. 두개 또는 그 이상의 펩티드(또는 절편, 또는 변이체)는 유도체(derivative)를 형성하기 위해 서로 결합할 수 있다. 대안적으로, 펩티드(또는 절편, 또는 변이체)는 관련없는 분자(예를 들어, 제2, 관련없는 펩티드)와 결합할 수 있다. 유도체는 화학적으로 합성되나, 일반적으로 재조합 핵산방법에 의해 제조될 것이다. 지방, 및/또는 다당류, 및/또는 폴리펩티드 성분과 같은 추가적 성분이 포함될 수 있다.
용어 비-세포독성(non-cytotoxic)은 당해 프로테아제 분자가 다시 목표로 잡은 표적세포를 죽이지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명의 프로테아제는 진핵세포에서 세포외 융합장치의 하나 또는 그 이상의 단백질을 절단할 수 있는 천연적으로 발생한 모든 비-세포독성 프로테아제를 포함한다.
본 발명의 비-세포독성 프로테아제는 바람직하게는 박테리아 프로테아제이다. 일 구체예에서, 상기 비-세포독성 프로테아제는 클로스트리듐 속(genera Clostridium)이나 나이세리아(Neisseria)(예를 들어, 클로스트리듐 경쇄, 또는바람직하게는 나이세리아 임질(N. gonorrhoeae)의 나이세리아 IgA 프로테아제)에서 선택된다. 용어 프로테아제는 기능적으로 동등한 절편 및 그들의 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 변형된 비-세포독성 프로테아제를 포함하는데, 이것은 변형된 프로테아제가 여전히 상기 언급된 프로테아제 활성을 나타내기만 하면 천연 및/또는 합성 아미노산 잔기에서 발생하지 않는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 프로테아제는 바람직하게 세린 또는 금속단백질분해효소(metalloprotease) 활성(예를 들어, 엔도펩티다제 활성)을 나타낸다. 상기 프로테아제는 바람직하게 SNARE 단백질(예를 들어, SNAP-25, 시냅토브레빈/VAMP, 또는 신탁신)에 특이적이다.
박테리아 신경독의 프로테아제 도메인과 같은 신경독의 프로테아제 도메인에 대해 특별하게 언급되어 있다. 따라서, 본 발명은 천연에서의 신경독 도메인의 사용을 포함할 뿐 아니라 천연적으로 발생한 신경독의 재조합적으로 제조된 버전도 포함한다.
대표적인 신경독은 클로스트리디아에 의해 생성되고, 용어 클로스트리듐 신경독은 클로스트리듐 테타니(TeNT), 및 클로스트리듐 보툴리눔(BoNT) 혈청형 A-G에서 생성된 신경독을 포함할 뿐 아니라 BoNT와 매우 유사한 신경독인 클로스트리듐 바라티(C. baratii) 및 클로스트리듐 부티리쿰(C. butyricum)에 의해서도 생성된다. 상기 언급된 약어들은 본 출원 전반에 걸쳐 사용된다. 예를 들어, BoNT/A 명명법은 BoNT (혈청형 A)로서의 신경독의 출처를 드러낸다. 해당명칭은 다른 BoNT 혈청형에도 적용된다.
용어 경쇄(L-chain) 또는 LC 절편은 신경독의 경쇄의 구성을 의미하는다. 상기 절편은 금속단백질분해효소 활성을 나타내고, 운발자 및/또는 세포외 엑소사이토시스(cellular exocytosis)와 관련된 단백질과 결합한 원형질 막을 단백질 가수분해적으로 절단할 수 있다.
전좌도메인은 표적세포의 세포질 내에서 발생하는 프로테아제 활성의 기능적인 발현되도록 프로테아제가 표적세포로 전좌되는 것을 가능하게 하는 분자이다. 임의의 분자(예를 들어 단백질 또는 펩티드)가 본 발명의 필수적인 전좌기능을 포함하는지 여부는 다수의 종래 분석법 중 하나에 의해 확인할 수 있다.
예를 들어, “Shone C. (1987)”는 시험분자와 실험한 리포좀(liposomes)에 적용하는 시험관내 분석을 설명한다. 필수적인 전좌기능의 존재는 리포좀에서 쉽게 관찰될 수 있는 K+ 및/또는 표지된 NAD를 방출시킴으로써 확인할 수 있다(Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180 참조).
평면 인지질 이중막에 적용하는 간단한 시험관내 분석에 대해 설명하는 “Blaustein R. (1987)”에 의해 설명되는 또 다른 예가 제시된다. 상기 막은 시험분자에 의해 바뀔 수 있고 상기 필수적인 전좌기능은 상기 막을 통과한 전도도(conductance)의 증가로 확인할 수 있다(Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115-120 참조).
막 융합의 평가와 본 발명에서 사용하기에 적합한 전좌 도메인의 식별을 가능하게 하는 추가적인 방법들도 “Methods in Enzymology Vol 220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993”에 의해 제공된다.
바람직하게 전좌도메인은 낮은 pH 조건 하에서 지질막에 있는 이온-투과성 모공(ion-permeable pores)을 형성할 수 있다. 바람직하게는 오직 엔도솜 막 내의 모공을 형성할 수 있는 단백질 분자의 일부만 사용하는 것이 발견된다.
전좌도메인은 미생물 단백질 소스, 특히 박테리아나 바이러스 단백질 소스에서 얻을 수 있다. 따라서 일 구체예에서, 전좌도메인은 박테리아 독소 또는 바이러스 단백질과 같은 효소를 전좌시키는 도메인이다.
박테리아 독소 분자의 특정 도메인이 이와 같은 구멍을 형성할 수 있다는 것은 잘 설명되어 있다. 또한 바이러스로 발현된 막 융합단백질의 특정 전좌도메인이 이와 같은 구멍을 형성할 수 있다는 것도 잘 알려져 있다. 이 같은 도메인은 본 발명에 적용될 수 있다.
전좌도메인은 클로스트리듐 근원, 즉 HN 도메인(또는 그들의 기능적인 구성)이다. HN은 대략 중쇄 또는 고유 중쇄에서 절편에 대응되는 도메인의 아미노 말단 반과 동일한 클로스트리듐 신경독 중쇄의 일부 또는 절편이다. 중쇄는 실질적으로 중쇄의 HC 구성의 천연 결합기능이 결실된 것이 바람직하다. 이와 관련하여, HC 기능은 HC 아미노산 서열의 삭제에 의해 제거된다 (또한 DNA 합성 단계에서, 또는 뉴클레아제(nuclease)나 프로테아제 처리에 의한 합성-후 (post-synthesis) 단계에서). 대안적으로, HC 기능은 화학적이거나 생물학적인 처리에 의해 불활성화된다. 따라서, 중쇄는 바람직하게는 천연 클로스트리듐 신경독(즉, 완전독)에 결합하는 표적세포의 결합부위에 결합할 수 없다.
일 구체예에서, 전좌도메인은 클로스트리듐 신경독의 HN 도메인(또는 그들의 절편)이다. 적절한 클로스트리듐 전좌도메인의 예가 포함된다:
보툴리눔 유형 A 신경독 - 아미노산 잔기 (449-871)
보툴리눔 유형 B 신경독 - 아미노산 잔기 (441-858)
보툴리눔 유형 C 신경독 - 아미노산 잔기 (442-866)
보툴리눔 유형 D 신경독 - 아미노산 잔기 (446-862)
보툴리눔 유형 E 신경독 - 아미노산 잔기 (423-845)
보툴리눔 유형 F 신경독 - 아미노산 잔기 (440-864)
보툴리눔 유형 G 신경독 - 아미노산 잔기 (442-863)
테타누스 신경독 - 아미노산 잔기 (458-879)
클로스트리듐 보툴리눔과 클로스트리듐 테타니에서의 독소생성과 관련한 좀 더 자세한 유전적 기초는 “Henderson 등 (1997)에 의한 The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press”를 나타난다.
용어 HN 은 천연적으로 발생하는 신경독 HN 일부를 포함하고, 상기 변형된 HN 일부가 여전히 이미 설명된 전좌기능을 나타내는 동안은 천연 및/또는 합성 아미노산 잔기에서 발생되지 않는 아미노산 서열을 가지는 변형된 HN 일부를 포함한다.
대안적으로, 전좌도메인은 비-클로스트리듐 근원(표 4 참조)일 수도 있다. 비-클로스트리듐 전좌 도메인의 근원의 예는 디프테리아 독소의 전좌도메인(O=Keefe 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman 등, J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; 및 London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51 참조), 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 유형 A의 전좌도메인(Prior 등. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559 참조), 탄저병(anthrax) 독소의 전좌도메인(Blanke 등. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442 참조), 다양한 융해성(fusogenic) 또는 전좌기능의 소수성 펩티드(Plank 등 l. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; and Wagner 등. (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938], 및 양친성 펩티드[Murata 등 (1992) Biochem., 31, pp.1986-1992 참조]를 포함하나, 이에 제한된 것은 아니다. 상기 전좌도메인은 자연적으로 발생한 단백질에 존재하는 전좌단백질을 보여줄 수 있거나, 변이들이 전자도메인의 전좌시키는 효능을 파괴하지 못하는 한 아미노산 변이를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되기에 적합한 바이러스 전좌도메인의 특정 예시들은 바이러스로 발현된 막 융합단백질의 특정 전좌시키는 도메인을 포함한다. 예를 들어, “Wagner 등. (1992)과 Murata 등. (1992)”은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(haemagglutini)의 N-말단 영역에서 유도된 다수의 융해성 및 양쪽 친매성(amphiphilic) 펩티드의 전좌기능(즉, 막 융합 및 소포형성)을 설명한다. 원하는 전좌시키는 활성을 가지는 것으로 알려진 다른 바이러스로 발현된 막 융합단백질은 셈리키삼림열바이러스(Semliki Forest Virus, SFV)의 융해성 펩티드의 전좌시키는 도메인, 수포성 구내염 바이러스(VSV) 당단백질 G의 전좌시키는 도메인, SER 바이러스 F 단백질의 전좌시키는 도메인 및 당단백질을 감싸는 포미바이러스(Foamy virus)의 전좌도메인이다. 바이러스로 코딩된 아스파이크(Aspike) 단백질은 SFV의 E1 단백질과 VSV의 G 단백질의 G단백질과 같은 본 발명의 내용에서의 특정 적용을 가진다.
하기 표에 실린 전좌도메인의 사용은 그들의 서열 변이체의 사용을 포함한다. 변이체는 변이체가 필요한 전좌시키는 기능을 포함하는 것을 조건으로, 하나 또는 그 이상의 보존적인 핵산치환 및/또는 핵산삭제 또는 삽입을 포함한다. 또한 변이체는 변이체가 필요한 전좌기능을 포함하는 한, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환 및/또는 아미노산 결실 또는 삽입을 포함한다(표 4).
전좌 도메인 소스 아미노산잔기 참조
디프테리아독소 194-380 Silverman 등, 1994, J. Biol. Chem. 269, 22524-22532
London E., 1992, Biochem. Biophys. Acta., 1113, 25-51
슈도모나스균 외독소의 도메인 II 405-613 Prior 등, 1992, Biochemistry 31, 3555-3559
Kihara & Pastan, 1994, Bioconj Chem. 5, 532-538
인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG, 및 그들의 변이체 Plank 등, 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924
Wagner 등, 1992, PNAS, 89, 7934-7938
Murata 등, 1992, Biochemistry 31, 1986-1992
단백질셈리키삼림열바이러스 융해성 바이러스 전좌도메인 Kielian 등, 1996, J Cell Biol. 134(4), 863-872
수포성 구내염바이러스 단백질당단백질 G 118-139 Yao 등, 2003, Virology 310(2), 319-332
SER 바이러스 F 단백질단백질 전좌도메인 Seth 등, 2003, J Virol 77(11) 6520-6527
당단백질을 감싸는 포미바이러스 단백질 전좌도메인 Picard-Maureau 등, 2003, J Virol. 77(8), 4722-4730
본 발명의 구체예 및/또는 그 구체예를 설명하는 도면에 대하여 간단히 설명한다.
도면 1 - LC /A- 스페이서 - 갈라닌 - 스페이서 - HN /A 융합단백질의 정제
실시예 3에서 요약된 방법을 사용하여, LC/A-GS18-갈라닌-GS20-HN/A 융합단백질이 대장균 BL21세포에서 정제되었다. 간략하게, 다음의 세포파괴로 얻어진 수용성 생성물이 니켈-충전된 친화력 고정칼럼에 적용되었다. 결합된 단백질이 100 mM의 이미다졸(imidazole)로 용출되고, 융합단백질을 활성화하기 위해 엔테로키나아제로 처리되며, 말토오스-결합 단백질(MBP) 태그를 제거하기 위해 인자 Xa로 처리된다. 이후 활성화된 융합단백질은 니켈-충전된 친화력 고정칼럼으로 두 번째 다시 적용된다. 정제과정의 샘플들은 SDS-PAGE (Panel A)와 웨스턴 블로팅(Panel B)에 의해 분석된다. 항-갈라닌(Anti-galanin) 항혈청(antisera)(Abcam에서 획득한)과 항-히스태그(Anti-histag) 항혈청(Qiagen에서 획득한)이 웨스턴 블로팅을 위한 주요한 항체로서 사용된다. 환원제의 부재 및 존재 하에 최종 정제된 물질들은 각각 [-]와 [+]로 표시된 Panel A의 레인에서 식별된다. Panel A, 레인 1= 벤크마크(Benchmark) 래더; 2= 가용분; 3= 1st 생성물 His 생성물; 4= 단백질활성 정제된 단백질; 5= 두번째 His 생성물; 6= 최종정제된 단백질 5 ㎕; 7= 최종 정제된 단백질 10 ㎕; 8= 최종 정제된 단백질 20 ㎕; 9= 최종 정제된 단백질 5 ㎕ + DTT; 10= 최종 정제된 단백질 10 ㎕ + DTT. Panel B Lane 1= 벤크마크 래더; 2= 가용분; 3= 1st His 생성물; 4= 활성정제된단백질; 5= 두번째 His 생성물; 6= 최종 정제된 단백질 2 ㎕; 7= 최종 정제된 단백질 5 ㎕; 8= 최종 정제된 단백질 10 ㎕; 9= 최종 정제된 단백질 2 ㎕ + DTT; 10= 최종 정제된 단백질 5 ㎕ + DTT.
도면 2 - LC /C- 스페이서 - 갈라닌 - 스페이서 - HN /C 융합단백질의 정제
실시예 3에서 요약된 방법을 사용하여, LC/A-GS18-갈라닌-GS20-HN/A 융합단백질이 대장균 BL21세포에서 정제되었다. 간략하게, 다음의 세포파괴로 얻어진 수용성 생성물이 니켈-충전된 친화력 고정칼럼에 적용되었다. 결합된 단백질이 100 mM의 이미다졸(imidazole)로 용출되고, 융합단백질을 활성화하기 위해 엔테로키나아제로 처리되며, 이후 두번째 니켈-충전된 친화력 고정칼럼에 다시 적용되었다. 정제과정의 샘플들은 SDS-PAGE (Panel A)와 웨스턴 블로팅(Panel B)에 의해 분석된다. 항-갈라닌 항혈청 (Abcam에서 획득한)과 항-히스태그 항혈청(Qiagen에서 획득한)이 웨스턴 블로팅을 위한 주요한 항체로서 사용된다. 환원제의 부재 및 존재 하에 최종 정제된 물질들은 각각 [-]와 [+]로 표시된 Panel A의 레인에서 식별된다. Panel A, 레인 1= 벤크마크(Benchmark) 래더; 2= 가용분; 3= 생성물 1st 칼럼; 4= 엔테로키나아제 활성 단백질; 5= 최종 생성물 0.1 mg/ml (5 ㎕); 6= 최종 생성물 0.1 mg/ml + DTT (5 ㎕); 7= 최종 생성물 0.1 mg/ml (10 ㎕); 8= 최종 생성물 0.1 mg/ml + DTT (10 ㎕). Panel B, 레인 1= 매직마크; 2= 가용분; 3= 생성물 1st His-태그 칼럼; 4=활성화 융합; 5=정제된 @ 0.1 mg/ml (5 ㎕); 6= 정제된 @ 0.1 mg/ml + DTT (5 ㎕); 7 정제된 @ 0.1 mg/ml + 100mm DTT (10 ㎕); 8= 정제된 @ 0.1 mg/ml + 100mm DTT (10 ㎕) + DTT.
도면 3 - LC - 스페이서 - 갈라닌 - 스페이서 - HN 융합단백질의 SNARE 절단효능의 비교 및 LC - HN - 갈라닌 융합단백질
Panels A & B: CHO GALR1 SNAP25세포에서 측정된 SNAP-25를 절단하기 위한 갈라닌 융합 효능. 중국햄스터난소(CHO) 세포는 그것들이 GALR1 수용체를 발현시키기 위해 형질감염되었다. 상기 세포들은 SNARE 단백질 (SNAP-25)을 발현시키기 위해 또 형질감염되었다. 상기 형질감염된 세포들은 24 시간동안 다양한 농도의 다른 갈라닌 융합단백질에 노출되었다. 세포의 단백질은 SNAP-25 절단의 평가를 촉진시키기 위하여 항-SNAP-25를 가지고 SDS-PAGE, Western blotted, 및 표지되었다. 절단된 SNAP-25의 퍼센트가 농도계의 분석에 의해 계산되었다. LC-스페이서-갈라닌-스페이서-HN 융합(융합 1)이 LC-HN-갈라닌 융합과 비리간드의(unliganded) LC/A-HN/A 조절분자보다 좀 더 강력하다.
도면 4 - 다른 혈청형 백본을 포함한 본 발명의 갈라닌 융합단백질을 가지는 CHO-GALCHO-GALR1 SNAP -25 절단분석에서의 GALR1 수용체 활성 연구
중국햄스터난소(CHO) 세포는 그것들이 GALR1 수용체와 SNAP-25를 발현시키도록 형질감염되었다. 상기 세포들은 FRET-기초 cAMP 키트(Perkin Elmer에서의 LANCE 키트)를 사용하여 상기 수용체가 갈라닌 리간드로 활성화될 때 발생하는 cAMP의 결실을 측정하기 위해 사용되었다. 상기 형질감염된 세포들은 2시간동안 다양한 혈??형 백본(즉, 보툴리눔 신경독 혈청형 A, B, C 및 D)를 가진 다양한 농도의 갈라닌(GA16) 융합단백질에 노출되었다. 이후 cAMP 수치는 형광으로 표지된 cAMP 추적자(tracer) (Europium-streptavadi/biotin-cAMP)과 형광으로(Alexa) 표지된 항-cAMP 항체를 포함한 검출 혼합의 부가와 24시간동안 상온에서 배양함으로써 검출된다. 이후 샘플들은 cAMP 수치를 측정하기 위해 320 nM에서 들뜨고 665 nM에서 측정되는 빛을 방출한다. 상기 데이터는 다른 혈청형 백본을 가지는 본 발명의 갈라닌 융합단백질이 GALR1 수용체를 활성화시킨다는 것을 증명한다.
도면 5 - CHO - GALR1 SNAP -25 절단분석에서 갈라닌 ( GA16 및 GA30 ) 융합단백 질에 의한 SNARE 단백질 절단
중국햄스터난소(CHO) 세포는 그것들이 GALR1 수용체를 발현시키기 위해 형질감염되었다. 상기 세포들은 SNARE 단백질 (SNAP-25)을 발현시키기 위해 또 형질감염되었다. 상기 형질감염된 세포들은 24시간동안 다양한 농도의 다른 갈라닌 융합단백질에 노출되었다. 세포의 단백질은 SNAP-25 절단의 평가를 촉진시키기 위하여 항-SNAP-25 가지고 SDS-PAGE, 웨스턴 블랏 및 표지에 의해 분리되었다. 상기 데이터는 갈라닌-16과 갈라닌-30 리간드 절단 SNARE 단백질을 포함한 갈라닌 융합단백질을 증명한다. 게다가, 상기 데이터는 비-세포독성 프로테아제 구성과 프로테아제 절단부위 사이의 GS5, GS10 및 GS18을 포함한 갈라닌 융합단백질이 기능적이라는 것을 증명한다.
도면 6 - 갈라닌 융합단백질에 적용하는 시험관내 포우가딩분석( paw guarding assay )의 결과
침해굴곡반사(또는 포우가딩분석이라 알려진)는 가능한 사지손상에 대항한 보호 메커니즘인 움직임의 급격한 철회이다. 이것은 저용량 캡사이신(캡사이신), 전기자극 또는 캡사이신-감응 전기반응의 결과로 마취된 쥐에서 근전도 (electromyography, EMG) 반응을 분석함으로써 정량화될 수 있다. 본 발명의 융합단백질의 발바닥내(발바닥내) 전처리(24시간)는 숫컷 웅성 흰쥐(웅성흰쥐)에서 300-380 g이다. 포우 가딩의 유도는 10 초동안 0.006 %의 캡사이신, 10 ㎕의 PBS(7.5%DMSO)에 의해 주입되어 달성된다. 이것은 대퇴이두근(biceps femoris muscle)에서의 강력한 반사반응을 만들어낸다. 통각 굴곡반사의 감소/저해는 시험물질이 통각억제효과(antinociceptive effect)를 증명한다는 것을 나타낸다. 상기 데이터는 본 발명의 갈라닌 융합단백질의 통각억제효과를 증명하였다.
도면 7 - 캡사이신 -유도된 열의 통각과민증( hyperalgesia ) 분석에서의 갈라 닌 융합단백질 효능
캡사이신-유도된 열의 통각과민증을 억제하기 위해 본 발명의 다른 갈라닌 융합단백질의 효과가 측정되었다. 웅성흰쥐에게 융합단백질을 발바닥내 전처리하고 24 시간 후에 0.3 % 캡사이신이 주입한 후 25 ℃ 유리판에 쥐들을 두었다(25 ℃ 유리판 위의 아크릴 상자에 있는 쥐도 포함). 전자빔(조절되는 빛 강도)을 발 아래로 초점을 맞추었다. 센서로 발의 움직임, 정지 시간을 측정하였다. 발움추림 잠복기(Paw Withdrawal Latency Latency)는 빛의 원천으로부터 발을 제거하는 시간이다(20.48 초의 제거). 발움추림 잠복기의 감소/억제는 시험물질이 통각억제효과를 증명한다는 것을 나타낸다. No. 1= LC-HN-GA16; No. 2= LC-HN-GA30; No. 3= LC-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN-HT; No. 4= LC-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN-HT; No. 5= BOTOX; No. 6= 모르핀.
상기 데이터는 C-말단에 존재하는 리간드를 가지는 융합단백질과 비교할 때 본 발명의 갈라닌 융합단백질이 강화된 통각억제효과가 있음을 증명한다.
도면 8 - 캡사이신 -유도된 열의 통각과민증 분석에서 갈라닌 융합단백질 효능
캡사이신-유도된 열의 통각과민증을 억제하기 위해 본 발명의 다른 갈라닌 융합단백질의 효과가 측정되었다. 웅성흰쥐에게 융합단백질을 발바닥내 전처리하고 24 시간 후에 0.3 % 캡사이신이 주입한 후 25 ℃ 유리판에 쥐들을 두었다(25 ℃ 유리판 위의 아크릴 상자에 있는 쥐도 포함). 전자빔(조절되는 빛 강도)을 발 아래로 초점을 맞추었다. 센서로 발의 움직임, 정지 시간을 측정하였다. 발움추림 잠복기(Paw Withdrawal Latency Latency)는 빛의 원천으로부터 발을 제거하는 시간이다(20.48 초의 제거). 발움추림 잠복기의 감소/억제는 시험물질이 통각억제효과를 증명한다는 것을 나타낸다.
상기 데이터는 다른 혈청형 백본(즉, A, B, C 및 D)를 가지는 본 발명의 갈라닌 융합단백질의 통각억제효과를 증명한다.
도면 9 - 단일 및 이중- 스페이서를 가지는 갈라닌 융합단백질의 활성
비-세포독성 프로테아제 구성과 표적화체 구성 사이에 위치한 본 발명의 제1 스페이서(스페이서 1)이 결실된 갈라닌 융합단백질은 프로테아제를 가진 약한 활성을 보여준다(Panels A 및 B). Panel C는 제1(스페이서 1) 및 제2 second (스페이서 2) 모두를 포함한 본 발명의 갈라닌 융합단백질의 강화된 활성을 증명한다. Panels A&B: 1) 벤크마크 래더; 2) 불활성화된 조절; 3) 불활성화된 조절+ DTT; 4) 프로테아제 활성 단백질 + 0.0 mM ZnCl2; 5) 프로테아제 활성 단백질 + 0.0 mM ZnCl2 + DTT; 6) 프로테아제 활성 단백질 + 0.2 mM ZnCl2; 7) 프로테아제 활성 단백질 + 0.2 mM ZnCl2 + DTT; 8) 프로테아제 활성 단백질 + 0.4 mM ZnCl2; 9) 프로테아제 활성 단백질 + 0.4 mM ZnCl2 + DTT; 10) 프로테아제 활성 단백질 + 0.8 mM ZnCl2; 11) 프로테아제 활성단백질 + 0.8 mM ZnCl2 + DTT. Panel C: 1) 벤크마크 래더; 2) 불활성화된 조절 25 ℃; 3) 불활성화된 조절 25 ℃ + DTT; 4) 프로테아제 활성 단백질 25 ℃; 5) 프로테아제 활성 단백질 25 ℃ + DTT; 6) 벤크마크 래더.
SEQ ID NOs
처음 아미노산 잔기의 위치나 처음 코돈 대응은 임의적인 다음의 SEQ ID NOs을 표시하고, 상기 잔기/코돈은 선택사항이다.
SEQ ID NO 1 LC/A의 DNA 서열
SEQ ID NO 2 HN/A의 DNA 서열
SEQ ID NO 3 LC/B의 DNA 서열
SEQ ID NO 4 HN/B의 DNA 서열
SEQ ID NO 5 LC/C의 DNA 서열
SEQ ID NO 6 HN/C의 DNA 서열
SEQ ID NO7 갈라닌 GA30의 단백질 서열
SEQ ID NO8 갈라닌 GA16의 단백질 서열
SEQ ID NO9 LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A-HT의 DNA 서열
SEQ ID NO10 LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20- HN/A-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO11 LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A의 단백질 서열
SEQ ID NO12 LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/A-HT의 DNA 서열
SEQ ID NO13 LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS20- HN/A-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO14 LC/A-GS5-EN-CPGA16-HN/A-GS20의 단백질 서열
SEQ ID NO15 LC/A-GS5-EN-CPGA30-GS20-HN/A-HT의 DNA 서열
SEQ ID NO16 LC/A-GS5-EN-CPGA30-GS20- HN/A-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO17 LC/A-GS5-EN-CPGA30-GS20- HN/A의 단백질 서열
SEQ ID NO18 LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/B(K191A)-HT의 DNA 서열
SEQ ID NO19 LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/B(K191A)-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO20 LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/B(K191A)의 단백질 서열
SEQ ID NO21 LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/B-HT의 DNA 서열
SEQ ID NO22 LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/B-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO23 LC/B-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/B의 단백질 서열
SEQ ID NO24 LC/C-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/C-HT의 DNA서열
SEQ ID NO25 LC/C-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/C-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO26 LC/C-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/C의 단백질 서열
SEQ ID NO27 LC/D-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/D-HT의 DNA 서열
SEQ ID NO28 LC/D-GS5-EN-CPGA16-GS20- HN/D-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO29 LC/D-GS5-EN-CPGA16-HN/D-GS20의 단백질 서열
SEQ ID NO30 LC/A-GS5-EN-CPGA16-HX27-HN/A-HT의 DNA 서열
SEQ ID NO31 LC/A-GS5-EN-CPGA16-HX27- HN/A-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO32 LC/A-GS5-EN-CPGA16-HX27- HN/A-의 단백질 서열
SEQ ID NO33 LC/A-GS10-EN-CPGA16-HN/A-GS20-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO34 LC/A-GS10-EN-CPGA16-GS20- HN/A의 단백질 서열
SEQ ID NO35 LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS15- HN/A-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO36 LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS15- HN/A의 단백질 서열
SEQ ID NO37 LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS10- HN/A-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO38 LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS10-HN/A의 단백질 서열
SEQ ID NO39 LC/A-GS18-EN-CPGA16-HX27- HN/A-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO40 LC/A-GS18-EN-CPGA16-HX27-HN/A의 단백질 서열
SEQ ID NO41 LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS15-HN/A-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO42 LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS15의 단백질 서열
SEQ ID NO43 LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS10-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO44 LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS10의 단백질 서열
SEQ ID NO45 LC/A-GS10-EN-CPGA16-HX27-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO46 LC/A-GS10-EN-CPGA16-HX27의 단백질 서열
SEQ ID NO47 LC/A-GS10-EN-CPGA16-GS15-HN/A-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO48 LC/A-GS10-EN-CPGA16-GS15- HN/A의 단백질 서열
SEQ ID NO49 LC/A-GS10-EN-CPGA16-GS10- HN/A-HT의 단백질 서열
SEQ ID NO50 LC/A-GS10-EN-CPGA16-GS10-HN/A의 단백질 서열
SEQ ID NO51 IgA 프로테아제의 DNA의 서열
SEQ ID NO52 IgA-GS5-CPGA16-GS20-HN/A fusion의 DNA의 서열
SEQ ID NO53 IgA-GS5-CPGA16-GS20-HN/A fusion의 단백질 서열
SEQ ID NO54 DT 전좌 도메인의 DNA의 서열
SEQ ID NO55 LC/A-GS5-GA16-GS20-DT의 DNA의 서열
SEQ ID NO56 LC/A-GS5-GA16-GS20-DT의 단백질 서열
SEQ ID NO57 TeNT LC의 DNA의 서열
SEQ ID NO58 TeNT LC-GS5--CPGA16-GS20-HN/A의 DNA의 서열
SEQ ID NO59 TeNT LC-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/A의 단백질 서열
실시예
실시예 1 - 갈라닌 융합단백질의 구조 및 활성
LC /A 및 HN /A 백본 클론의 제조
다음의 과정은 멀티도메인 융합 발현을 위한 구성백본으로서의 사용을 위한 LC 및 HN 절편을 생산한다. 혈청형 B(SEQ ID NO3 및SEQ ID NO4)와 혈청형 C (SEQ ID NO5 및 SEQ ID NO6)]를 위한 서열 리스트에 의해 설명되는 것과 같이 비록 상기 과정과 방법들이 다른 혈청형(즉, A, B, C, D 및 E)에 동일하게 적용될 수 있다 하더라도, 이 실시예는 클론(SEQ ID NO1 및 SEQ ID NO2)에 근거한 혈청형 A의 제조를 기반으로 한다.
클로닝의 제조 및 발현벡터
표준 클로닝 벡터로 선택된 pCR 4(인비트로젠(Invitrogen))은 벡터 내에 제한서열의 결실과 쉬운 구조의 확인을 위한 인접한 서열 프라이머 사이트 때문에 선택된다. 발현벡터는 삽입구성(BamHI-SalI-PstI-HindIII)을 위한 올바른 방향에서 다수의 클로닝 사이트 내에 원하는 제한서열을 가진 pMAL (NEB) 발현벡터를 기반으로 한다. 발현벡터 절편은 비-유동적인 플라스미드와 정제선택을 증가시키기 위해 주입되는 다양하고 다른 융합태그를 만들기 위해 제거된다.
프로테아제 (예를 들어, LC /A)삽입의 제조
LC/A (SEQ ID NO1)가 두 가지 방법 중 하나에 의해 만들어진다:
DNA 서열이 LC/A 아미노산 서열의 역전사에 의해 디자인된다[다양한 역변환 소프트웨어 툴 중 하나(예를 들어, EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR 사), 또는 Backtranslation tool v2.0 (Entelechon))를 이용하여, GenBank (접근번호 P10845) 또는 Swissprot (접근위치 BXA1_CLOBO)와 같이 자유롭게 사용할 수 있는 데이터베이스에서 얻음]. BamHI/SalI 인식서열은 정확한 리딩 프레임을 유지하면서, 각각 서열의 5’ 및 3’ 끝에서 삽입된다. DNA 서열은 역전사동안 삽입된 제한효소 절단서열을 위해 스크리닝된다(MapDraw, DNASTAR사의 소프트웨어를 이용). 클로닝 시스템에 의해 요구되어 일반적으로 발견되는 임의의 절단서열은 공통 대장균 코돈의 사용이 유지되도록 보장하는 제안된 코딩서열에서 수동적으로 제거된다. 대장균 코돈사용은 Graphical Codon Usage Analyser (Geneart)와 같은 소프트웨어 프로그램을 참조로하여 분석되고, %GC 함유량과 코돈사용비는 출판된 코돈사용테이블(codon usage tables)을 참조로 하여 분석된다(예를 들어, GenBank Release 143, 2004년 9월 13일). 이후 LC/A 오픈리딩프레임(ORF)을 포함하는 최적화된 DNA 서열은 통상 합성되고(예를 들어, Entelechon, Geneart 또는 Sigma-Genosys에 의해), pCR 4 벡터에 제공된다.
대안적인 방법은 5’ 및 3’ PCR 프라이머로 각각 통합된 BamHI 및 SalI 제한효소 서열과 함께 존재하는 DNA 서열을 PCR 증폭을 하는 것이다. 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 페어가 반대편 가닥(strands)(서로 3'의 끝 방향으로) 측면에 클로스트리듐 타겟 DNA가 늘어나게 하여 잡종화하는 능력을 가지도록 각각 서플라이어(supplier)에 의해 두 개의 DNA 가닥 각각에 대해 하나의 올리고뉴클레오티드를 두어 화학적으로 합성한다(예를 들어, MWG 또는 Sigma-Genosys). PCR 생성물을 만들기 위해 클로스트리듐 DNA 서열에 특이적인 짧은 올리고뉴클레오티드 프라이머 한 쌍이 클로스트리듐 DNA 주형과 기타 다른 구성과 혼합되어야 하고 자동적으로 반응튜브의 배양온도를 대략 94 ℃ (변성), 55 ℃ (올리고뉴클레오티드 어닐링), 및 72 ℃ (합성)의 순환으로 변화시키는 기계(PCR 기계)에 넣는다. PCR 생성물의 증폭을 위한 다른 시약들은 DNA 폴리머레이즈(Taq나 Pfu 폴리머레이즈와 같은), 등몰량 (50-200 μM)에서 DNA를 구성하는 각각의 네종류의 뉴클레오티드 dNTP와 Mg2+ 농도(0.5-5 mM)로 최적화된 효소에 적합한 버퍼를 포함한다. 증폭 생성물은 Taq PCR 생성물을 위한 TOPO TA 클로닝 또는 Pfu PCR 생성물을 위한 Zero Blunt TOPO 클로닝 또는 둘 다를 이용하여 pCR 4에서 복제된다(두 키트는 인비트로젠에서 통상 사용된다). 복제의 결과는 시퀀싱(sequencing)에 의해 확인된다. 이후 클로닝 시스템과 호환되지 않는 어떤 추가적인 제한서열은 부위 특이적 돌연변이 유도를 사용하여 제거된다(예를 들면 Quickchange(Stratagene 사)를 이용).
전좌 (예를 들어, HN ) 삽입의 제조
HN/A (SEQ ID NO2)는 두 가지 방법 중 하나에 의해 만들어진다:
DNA 서열이 HN/A 아미노산 서열의 역전사에 의해 디자인된다[다양한 역변환 소프트웨어 툴 중 하나(예를 들어, EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR 사), 또는 Backtranslation tool v2.0 (Entelechon))를 이용하여, GenBank (접근번호 P10845) 또는 Swissprot (접근위치 BXA1_CLOBO)와 같이 자유롭게 사용할 수 있는 데이터베이스에서 얻음]. PstI 제한서열이 N-말단과 C-말단이 옳은 리딩프레임을 유지하는 것을 보장하는 XbaI-stop codon-HindIII 에 추가된다. DNA 서열은 역전사동안 삽입된 제한효소 절단서열을 위해 스크리닝된다(MapDraw, DNASTAR사의 소프트웨어를 이용). 클로닝 시스템에 의해 요구된 것들에 공통되는 것으로 발견된 임의의 절단서열은 공통 대장균 코돈의 사용이 유지되도록 보장하는 제안된 코딩서열에서 수동적으로 제거된다. 대장균 코돈 사용은 Graphical Codon Usage Analyser (Geneart)와 같은 소프트웨어 프로그램을 참조로하여 분석되고, %GC 함유량과 코돈사용비는 출판된 코돈사용테이블(codon usage tables)을 참조로 하여 분석된다(예를 들어, GenBank Release 143, 2004년 9월 13일). 이후 최적화된 DNA 서열은 통상적으로 합성되고(예를 들어, Entelechon, Geneart 또는 Sigma-Genosys에 의해), pCR 4 벡터에 제공된다.
대안적인 방법은 5’ 및 3’ PCR 프라이머로 각각 통합된 PstI 및 XbaI-stop codon-HindIII 제한효소 서열과 함께 존재하는 DNA 서열을 PCR 증폭을 하는 것이다. PCR 증폭은 상기에서 설명된 바와 같이 수행된다. 상기 PCR 생성물은 pCR 4로 주입되고 시퀀싱에 의해 확인된다. 이후 클로닝 시스템과 호환되지 않는 어떤 추가적인 제한서열은 부위 특이적 돌연변이 유도를 사용하여 제거된다(예를 들면 Quickchange(Stratagene 사)를 이용).
LC /A- GS18 - EN - CPGA16 - GS20 - HN /A 융합의 제조
LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A 구성을 만들기 위해, 활성을 위한 엔테로키나아제 사이트가 부가된 A 혈청형 링커는 BamHI-SalI-GS18 -프로테아제 사이트-GS20-PstI-XbaI-stop codon-HindIII가 합성된 것과 같이 배치된다. 링커를 코딩하는 pCR 4 벡터는 BamHI + SalI 제한효소로 절단된다. 이후이 절단된 벡터는 마찬가지로 BamHI + SalI로 절단된 LC/A DNA (SEQ ID NO1)의 삽입 및 라이게이션(ligation)을 위한 수령자로 제공된다. 이후 이 구조는 BamHI + HindIII로 절단되고 pMAL 플라스미드 (NEB) 또는 pET 기초 플라스미드 (Novagen)와 같은 발현벡터로 삽입된다. 이후 얻어진 플라스미드 DNA는 PstI + XbaI 제한효소로 절단되고, 이후 HN/A DNA (SEQ ID NO2)는 PstI + XbaI로 절단된 후, pMAL-LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A-XbaI-His-tag-stop codon-HindII를 만들기 위해 우사하게 절단된 pMAL 벡터로 삽입된다. 상기 최종 구성은 SEQ ID NO10에서 설명되는 서열의 단백질 발현을 위한 GS18-EN-CPGA16-GS20 스페이서 ORF를 포함한다.
활성 분석
NuPAGE 4-12 % Bis-Tris 겔 (10, 12 및 15의 미리 잘 부어진 겔)은 프로테아제로 처리된 후에 융합단백질 활성을 분석하기 위해 사용된다. NuPAGE 4X LDS 샘플 버퍼로 제조된 단백질 샘플들은 일반적으로 최종 100 ㎕의 부피에 다다른다. 샘플들은 단백질 농도에 의존하여 희석되거나 샘플 75 ㎕, 샘플버퍼 25 ㎕로 깔끔하게 구성된다. 상기 샘플든은 혼합되고 이후 겔로 들어가기 전에 5 분간 95 ℃의 열블락에서 가열된다. 5-20 ㎕의 샘플들은 5 ㎕의 단백질 마커(인비트로젠에서의 Benchmark™ 단백질 마커)에 따라 로딩된다. 상기 겔은 일반적으로 200 V에서 50 분간 로딩된다. 상기 겔은 dH2O에 푹 담가지고 전체 전력에서 2 분간 데워진다(microwaved). 상기 겔은 세척되고 마이크로웨이브 단계가 반복된다. 상기 겔은 염색상자로 옮겨져 Simply Blue SafeStain(Invitrogen)에 담가진다. 전체전력에서 1 분간 데워지고 염색을 위해 0.5-2 시간동안 그냥 둔다. 이후 상기 겔은 Safestain을 쏟아내어 탈색시키고 dH2O로 겔을 세척한다. 상기 겔을 탈색하기 위해 밤새 dH2O에 담가두고 GeneGnome (Syngene) 분광복사계(imager)로 이미지를 촬영한다. 전체 활성단백질은 비-감소된 및 감소된 상태에서의 전체-길이 융합단백질(프로테아제 처리 후에)에 대응하는 밴드의 농도를 비교함으로써 측정한다
실시예 2 - 다양한 스페이서 길이를 가지는 LC /A- GS18 - EN - CPGA16 - GS20 - HN /A 융합단백질 패밀리의 제조
실시예 1에 적용되는 것과 같은 전략을 사용하여, DNA 링커의 범위는 코딩된 갈라닌 16과 다양한 스페이서 컨텐트(content)로 제조된다. 다양한 역번역 소프트웨어 툴 중 하나를 이용하여[예를 들어 EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR 사), 또는 Backtranslation tool v2.0 (Entelechon)], 스페이서 1-프로테아제 사이트-리간드-스페이서 2 영역을 코딩하는 DNA 서열이 결정된다. 이 후 제한 사이트가 DNA 서열로 삽입되고, BamHI-SalI-스페이서 1-프로테아제 사이트-CPGA16-NheI-스페이서 2-SpeI-PstI-XbaI-stop codon-HindIII로 배열될 수 있다. 옳은 리딩프레임이 스페이서, GA16 및 제한 서열를 위해 유지되도록 보장하는 것과 XbaI 서열이 DAM 메틸화에 의해 발생하는 염기 TC에 의해 선행되지 않도록 하는 것은 중요하다. DNA 서열은 제한서열 통합에 의해 스크리닝되고 임의의 삽입된 서열은 보통의 대장균 코돈 사용이 유지되도록 보장하는 남은 서열에서 수동적으로 제거된다. “Graphical Codon Usage Analyser (Geneart)”와 같은 소프트웨어 프로그램을 참조로하여 분석되고, %GC 함유량과 코돈사용비는 출판된 코돈사용테이블(codon usage tables)을 참조로 하여 분석된다(예를 들어, GenBank Release 143, 2004년 9월 13일). 이후 최적화된 DNA 서열은 통상적으로 합성되고 (예를 들어, Entelechon, Geneart 또는 Sigma-Genosys에 의해), pCR 4 벡터에 제공된다.
상기 만들어진 스페이서-링커들은 표 5(하기 참조)에서 포함한다:
스페이서 1-프로테아제 부위-GA16-스페이서 2 링커의 SEQ ID NO

GS5-EN-CPGA16-GS20		 12,13,14,18,19, 20, 21,22, 23,24,25,26,27, 28, 29
GS10-EN-CPGA16-GS20 33, 34
GS5-EN-CPGA16-HX27 30,31,32
GS5-EN-CPGA16-GS15 35,36
GS5-EN-CPGA16-GS10 37,38
GS18-EN-CPGA16-HX27 39, 40
GS18-EN-CPGA16-GS15 41,42
GS18-EN-CPGA16-GS10 43,44
GS10-EN-CPGA16-HX27 45,46
GS10-EN-CPGA16-GS15 47,48
GS10-EN-CPGA16-GS10 49,50
그 예로써, LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/A 융합 구성(SEQ ID NO12)을 만들기 위해, BamHI-SalI-GS5-프로테아제 사이트- GS20-PstI-XbaI-stop codon-HindIII 링커를 코딩하는 pCR 4 벡터는 BamHI + SalI 제한효소로 절단된다. 이후 이 절단된 벡터는 마찬가지로 BamHI + SalI로 절단된 LC/A DNA (SEQ ID NO1)의 삽입 및 라이게이션(ligation)을 위한 수령자로 제공된다. 이후 얻어진 플라스미드 DNA는 BamHI + HindIII 제한효소로 절단되고, LC/A-linker 절편이 상기와 유사하게 절단된 pMAL 벡터 (NEB) 또는 pET 벡터 (Novagen)와 같은 BamHI, SalI, PstI 및 HindIII을 위한 독특한 다수의 클로닝 사이트를 포함하는 벡터로 삽입된다. 이후 HN/A DNA (SEQ ID NO2)는 PstI + HindIII로 절단된 후, 유사하게 절단된 pMAL-LC/A-링커 구조로 삽입된다. 상기 최종 구성은 SEQ ID NO13에서 설명되는 서열의 단백질 발현을 위한 LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/A ORF를 포함한다.
실시예 3 - 갈라닌 융합단백질의 정제방법
25 ml 50 mM HEPES pH 7.2, 200 mM NaCl 와 대략 10 g의 대장균 BL21 세포 페이스트(paste)를 포함하는 팔콘 튜브(falcon tube)를 해동시킨다. 50 mM HEPES pH 7.2, 200 mM를 포함한 80 ml의 해동된 세포 페이스트를 만들고 얼음위에서 30 초동안 초음파를 쬐어 분해하고, 샘플이 차갑게 유지되도록 22 마이크론의 전력에서 30 초마다 10 번의 사이클을 한다. 용해세포를 18 000 rpm, 4 ℃에서 30 분간 원심분리한다. 50 mM HEPES pH 7.2, 200 mM NaCl로 평형화된 킬레이트(Chelating) 칼럼으로 충전된 (20-30 ml 칼럼이 충분하다) 0.1 M NiSO4상의 상층액을 로드(load)한다. 10 내지 40 mM의 이미다졸의 단계적 변화를 이용하여, 비-특이적인 결합 단백질을 세척하고, 100 mM의 이미다졸을 가진 융합단백질을 용출한다. 50 mM HEPES pH 7.2, 200 mM NaCl의 5 L에 대항하여 용출된 융합단백질을 4 ℃에서 밤새도록 투석시키고, 투석된 융합단백질의 OD를 측정한다. 만약 융합 단백질인 말토오스 결합 단백질을 포함한다면 100 μg의 정제된 융합단백질마다 그리고 정제된 융합단백질의 10 ㎕의 인자 Xa 1 μg마다 1 μg의 엔테로키나아제를 첨가한다. 25?C의 정적 상태에서 밤새도록 배양한다. 50 mM HEPES pH 7.2, 200 mM NaCl로 평형화된 킬레이트 칼럼(20-30 ml의 칼럼이 충분하다)로 충전된 0.1 M NiSO4로 로드한다. 칼럼을 기준치까지 50 mM HEPES pH 7.2, 200 mM NaCl으로 세척한다. 10 내지 40 mM의 이미다졸의 단계적 변화를 이용하여, 비-특이적인 결합 단백질을 세척하고, 100 mM의 이미다졸을 가진 융합단백질을 용출한다. 50 mM HEPES pH 7.2, 200 mM NaCl의 5 L에 대항하여 용출된 융합단백질을 4 ℃에 밤새도록 투석시키고, 약 2 mg/ml의 융합, 부분표본으로 농축시키고 -20 ℃에서 동결시킨다.
실시예 4 - 혈청형 A 활성서열을 포함한 LC /C- GA16 - HN /C 융합단백질의 제조
실시예 1 및 2에서 사용된 방법에 따라, 상기 LC/C (SEQ ID NO5)와 HN/C (SEQ ID NO6)가 만들어지고 BamHI-SalI-스페이서 1-프로테아제 사이트-GA16-NheI-스페이서 2-SpeI-PstI-XbaI-stop codon-HindIII 로 배치된 A 혈청형 링커로 삽입된다. 상기 최종 구성은 SEQ ID NO25에서 설명된 서열의 단백질 발현을 위한 LC-스페이서 1-GA16-스페이서 2-HN ORF를 포함한다.
실시예 5 - IgA 프로테아제- GA16 - HN /A 융합단백질의 제조
상기 IgA 프로테아제 아미노산 서열은 진뱅크(접근번호 P09790)와 같은 자유롭게 사용할 수 있는 데이터베이스 소스에서 획득된다. 나이세리아 임질 IgA 프로테아제 유전자의 구조와 관련된 정보는 책에서 알 수 있다(Pohlner 등., Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease, Nature, 1987, 325(6103), 458-62 참조). “Backtranslation tool v2.0 (Entelechon)”을 사용하여, 대장균 발현을 위해 변형된 IgA 프로테아제를 코딩하는 DNA 서열이 결정된다. BamHI 인식서열은 5’ 끝과 시스테인 아미노산을 코딩하는 코돈에 포함되고 SalI 인식서열은 IgA DNA의 3’ 끝에 포함된다. 상기 DNA 서열은 역번역동안 통합된 제한효소 절단서열을 위해 “MapDraw, (DNASTAR 사)”를 이용하여 스크리닝된다. 클로닝 시스템에 의해 요구된 것들에 공통되는 것으로 발견된 임의의 절단서열은 공통 대장균 코돈의 사용이 유지되도록 보장하는 제안된 코딩 서열에서 수동적으로 제거된다. 대장균 코돈사용은 Graphical Codon Usage Analyser (Geneart)에 의해 분석되고, %GC 함유량과 코돈사용비는 출판된 코돈사용테이블(codon usage tables)을 참조로 하여 분석된다. 이후 IgA 오픈 리딩 프레임을 포함하는 최적화된 DNA 서열(SEQ ID NO51)은 통상적으로 합성된다.
상기 IgA (SEQ ID NO51)는 BamHI 및 SalI 제한효로를 이용하여 IgA 프로테아제 DNA를 포함한 LC를 대체함으로써 LC-GS5-CPGA16?GS20-HN ORF로 삽입된다. 최종 구성은 SEQ ID NO 53에서 설명된 서열의 단백질을 발현하기 위한 IgA-GS5-CPGA16-GS20-HN ORF을 포함한다.
실시예 6 - 테타누스에서 유도된 LC 도메인을 포함하는 갈라닌 목표 엔도펩 티다제 융합단백질의 제조
DNA 서열이 테타누스 독소 LC 아미노산 서열의 역전사에 의해 디자인된다[다양한 역변환 소프트웨어 툴 중 하나(예를 들어, EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR 사), 또는 Backtranslation tool v2.0 (Entelechon))를 이용하여, GenBank (접근번호 X04436)와 같이 자유롭게 사용할 수 있는 데이터베이스에서 얻음]. BamHI/SalI 인식서열은 정확한 리딩 프레임(SEQ ID NO57)을 유지하면서, 각각 서열의 5’ 및 3’ 끝에 삽입된다. DNA 서열은 역번역동안 삽입된 제한효소 절단서열을 위해 스크리닝된다(MapDraw, DNASTAR사의 소프트웨어를 이용). 클로닝 시스템에 의해 요구되어 일반적으로 발견되는 임의의 절단서열은 공통 대장균 코돈의 사용이 유지되도록 보장하는 제안된 코딩서열에서 수동적으로 제거된다. 대장균 코돈사용은 “Graphical Codon Usage Analyser (Geneart)”와 같은 소프트웨어 프로그램을 참조로 하여 분석되고, %GC 함유량과 코돈사용비는 출판된 코돈사용테이블(codon usage tables)을 참조로 하여 분석된다(예를 들어, GenBank Release 143, 2004년 9월 13일). 이후 테타누스 독소 LC 오픈리딩프레임(ORF)을 포함하는 최적화된 DNA 서열은 통상적으로 합성되고(예를 들어, Entelechon, Geneart 또는 Sigma-Genosys에 의해), pCR 4 벡터에 제공된다(invitrogen). 상기 TeNT LC를 코딩하는 pCR 4 벡터는 BamHI 및 SalI로 절단된다. BamHI ? SalI절편은 이후 마찬가지로 BamHI 및 SalI에 의해 절단된 LC/A-GA16-HN/A에 삽입된다. 최종 구성은 SEQ ID NO58에서 설명된 서열의 단백질을 발현하기 위한 TeNT LC-GS5-GA16-GS20-HN ORF 서열을 포함한다.
실시예 7 - CHO - K1 GALR1 & GALR2 수용체 구조의 활성분석과 SNAP -25 절단분석
세포계 창조( creation )
안정적으로 인간 갈라닌 1 수용체 (CHO-K1-Gal-1R; 생성물 번호 ES-510-C) 또는 인간 갈라닌 2 수용체 (CHO-K1-Gal-2R; 생성물 번호 ES-511-C) 을 발현시키는 CHO-K1 세포는 Perkin-Elmer (Bucks, UK)에서 구입할 수 있다. 요구된대로, 세포들은 Lipofectamine™ 2000을 사용하여 SNAP-25 DNA로 형질감염되고 배양이 교체되기 전에 4 시간동안 배양된다. 24 시간 후에, 세포들은 T175 플라스크로 이동된다. 다시 24 시간 후에 세포를 발현시키는 SNAP-25를 선택하기 위해서 100ug/ml의 Zeocin을 첨가하고 수용체의 선택적 압력을 유지하기 위해 5 ug/ml의 Blasticidin을 첨가한다. 세포들은 2 주동안 선택 에이전트를 포함한 배지에 두고, 30-70 % 합류를 유지하기 위해 매 2-3 일마다 세포를 계대(passaging)한다. 이 후 세포들은 96 웰(well) 마이크로 플레이트(microplate)에서의 웰마다 0.5 세포가 달성되기 위해 선택적 배지에서 희석된다. 며칠 후에, 상기 플레이트는 현미경에서 조사되고, 단일 콜로니를 포함한 플레이트들이 표시된다. 이러한 웰(well)에서 배지는 매주 체인지된다. 세포가 웰에서 합쳐질 때마다 그들은 T25 플라스크로 옮겨진다. 그것들이 충분히 확대되었을 때, 각 클론들은 96 웰 플레이트의 24 웰로 배정되고, 더하여 냉동보관 유리병이 만들어진다. 본 발명의 갈라닌 융합단백질과 LC/A-HNA는 24 시간동안 세포에 적용되고 이후 SNAP-25 절단을 검출하기 위해 웨스턴 블랏이 수행된다. SNAP-25 밴드가 융합과 함께 강하고 절단수치가 높은 클론은 추가적인 조사를 위해 유지된다. 전투여(Full dose) 곡선이 실행되고, 갈라닌 융합단백질과 LC/A-HNA 절단 수치 사이의 가장 높은 격차를 가진 클론이 선택된다.
GALR1 수용체 활성 분석
GALR1 수용체 활성 분석은 FRET-기초 cAMP를 사용하여 포스콜린-자극된 (forskolin-stimulated) 세포내 cAMP의 감소를 정량화 함으로써 옮겨진 CHO-K1 세포에서 GALR1 수용체에서의 리간드 잠재력과 고유의 효능을 측정한다. 자극 후에, 형광적으로 표지된 cAMP 추적자 (Europium-streptavadin/biotin-cAMP)와 형광적으로 (Alexa) 표지된 항-cAMP 항체가 용해버퍼 세포에 첨가된다. 세포에서의 cAMP는 항체 결합사이트를 위한 cAMP 추적자와 경쟁한다. 읽을 때 320 nm의 광 파장은 cAMP 추적자의 형광부분(Europium)을 들뜨게 한다. 유로퓸(europium)에서 방출된 에너지는 665 nm에서 TR-FRET 신호를 발생시키는 추적자에 결합한 Alexa 불소-표지된 항체로 이동된다 (시간-분해 형광 공명 에너지 전달은 특이적 결합 반응에 의해 소집된 도너(donor) 라벨의 근접도, 유로퓸, 및 상기 어셉터 라벨, Alexa 형광을 근거로 한다). 유로품에서의 잔여 에너지는 615 nm의 빛을 생성한다. 이 작용제로 처리된 세포에서는 추적자와 경쟁하기 위해 cAMP가 더 적게 있을 것이고 그래서 665 nm의 신호에서 포스콜린 단독으로 처리된 샘플과 비교할 때 농도의존 증가가 관찰될 것이다. 665 nm 신호에서의 신호는 각 실험에 포함된 cAMP 표준 곡선으로 보간(interpolation)함으로써 cAMP 농도로 변환된다.
글리손(Gilson) 피펫과 Sigmacoted 또는 lo-bind tips, 테스트물질을 이용하여 표준이 10μM 의 포스콜린을 포함한 분석버퍼에서 에펜도르프(eppendorf) 500μl의 심정 lo-bind 플레이트의 첫째 두개의 칼럼의 웰에서 적절한 농도로 희석된다. 칼럼 한 개 및 두개에서 선택된 농도는 반 로그 유닛 떨어졌다. 이로부터, 시리얼 1:10 희석은 반 로그 간격으로 열한개의 농도가 만들어질때까지 플레이트를 통과하여 만들어졌다(sigmacote 또는 lo-bind tips를 가진 전자의 8개 채널 피펫을 이용하여). 12번째 칼럼에서, 분석버퍼는 오직 ‘기초(basal)’로써 첨가되었다. 12 채널 디지털 피펫을 이용하여, the lo-bind 플레이트에서의 10 μl의 샘플은 96 웰 마이크로플레이트로 이동되었다.
표준곡선을 포함하는 웰은, 10 ul의 분석버퍼가 멀티채널(multichannel) 디지털 피펫을 이용하여 첨가되었다. 테스트 물질을 포함한 웰은 적정한 농도상태인 분석버퍼에의 10 ul 세포가 첨가되었다. 플레이트는 “IKA MTS 2/4 orbital shaker”를 최대 속도로 설정하여 한시간동안 밀봉하고 상온에서 120 분간 배양되었다. 스트렙타비딘(streptavidin)으로 표시된 LANCE Eu-W8044 (Eu-SA)와 Biotin-cAMP (b-cAMP)는 cAMP 검출버퍼(둘다 Perkin Elmer LANCE cAMP kit)에서 서브-스탁(sub-stocks)을 만들기 위해 각각 1:17 및 1:5의 희석비로 희석되었다. 최종 검출 혼합은 1:125의 비로 2 개의 서브 스탁에서 검출버퍼로 희석됨으로써 제조되었다. 상기 혼합은 1:200 Alexa Fluor® 647-anti cAMP Antibody (Alexa-Fluor Ab)의 첨가 전에 상온에서 15-30 분 동안 배양되었다. 간단히 와류혼합 후에, 디지털 멀티채널 피펫을 이용하여 20 ㎕을 각 웰에 즉시 첨가하였다. 마이크로플레이트 실러(sealer)가 적용되었고 플레이트는 상온에서 24 시간동안 배양되었다(IKA MTS 2/4 orbital shaker가 최대 속도로 설정되어 한 시간 동안). 플레이트 실러는 미래를 읽기 전에 제거되었다.
GALR2 수용체 활성 분석
GALR2 수용체 활성 분석은 상기 수용체가 활성화될 때 발생하는 칼슘 이동을 측정함으로써 옮겨진 CHO-K1 세포에서 GALR2 수용체에서의 리간드 잠재력과 고유의 효능을 측정한다. 상기 옮겨진 세포들은 처리되기 전에 칼슘 민감 염색(FLIPR)로 미리 설치된다. Flexstation 3 마이크로 플레이트 리더(분자장치)을 이용하여 읽을 때 485 nm의 광파장이 상기 형광염색을 들뜨게 하고 525 nm에서 방출을 일으킨다. 이것은 세포내 칼슘의 변화에서 실시간 형광 데이터를 제공한다. 작용제로 처리된 세포에서는 칼슘 이동에서의 증가로 이어지는 수용체의 활성이 있을 것이다. 이것은 525 nM에서 상대적인 형광 유닛(RFU)의 증가로 측정될 것이다.
수용체 활성 분석을 위한 세포의 배양:
세포들은 Glutamax, 10% 태아의 소혈청, 5 μg ml-1 블라스티사이딘(Blasticidin) 및 100 μg ml-1 Zeocin을 가진 Ham F12를 포함한 T175 플라스크로 배분되고 배양된다. 상기 플라스크는 60-80 %의 합류가 될 때까지 5% CO2를 포함한 가습적인 환경에서 37 ℃에서 배양된다. 수확의 날에는 배지가 제거되고 세포들은 25 ml PBS로 두 번 세척된다. 상기 세포들은 Tryple Express 10 ml를 첨가함으로써 플라스크에서 제거되고, 플라스크의 부드러운 두드림에 의해 10 분 동안 37 ℃에서의 배양이 이어진다. 제거된 세포들은 50 ml의 원심분리기 튜브로 이동되고 상기 플라스크는 세포 부유액에 부가된 10 ml의 배지로 두 번 세척된다. 상기 튜브들은 3 분 동안 1300 x g에서 원심분리되고 상기 상층액은 제거된다. 세포들은 10 ml의 배지(만약 동결세포라면), 또는 분석버퍼(만약 분석에서 ‘신선한’ 세포를 사용하면)에서 부드럽게 다시 재현탁되고, 샘플들은 nucleocounter(ChemoMetec)를 사용하여 제거된다. 분석에서 ‘신선한’의 사용을 위한 세포는 분석 버퍼를 적절한 농도로 다시 희석한다. 동결을 위해 수확된 세포는 다시 원심분리되고(1300 x g; 3 분), 상기 상층액은 제거되며 세포는 4 ℃, 3x 106 cells/ml의 Synth-a-freeze에서 다시 현탁된다. 각각 1 ml의 현탁액을 포함한 크리오 바이알(Cryovials)은 냉각된 algene Mr Frosty 냉동 용기(-1 ℃/분의 냉각속도)에 놓이고, -80 ℃의 냉각장치에서 밤새 놓아둔다. 다음날 바이알(vials)은 액체질소 저장탱크의 증기상태로 이동한다.
도면 4는 다른 갈라닌 리간드(즉, 갈라닌-16과 갈라닌-30) 및 다른 혈청형 백본(즉 LC/A-HN/A, LC/B-HN/B, LC/C-HN/C 및 LC/D-HN/D)을 가지는 본 발명의 갈라닌 융합단백질이 GALR1 수용체를 활성화시킨다는 것을 증명한다.
CHO - K1 GALR1 SNAP -25 절단분석
세포의 배양은 24시간동안 다양한 농도의 갈라닌 융합단백질에 노출된다. 세포의 단백질들은 SNAP-25 절단의 분석을 촉진시키기 위해 SDS-PAGE 및 항- SNAP-25 항체를 가진 웨스턴 블랏에 의해 분리된다. SNAP-25 절단은 농도계 분석(Syngene)에 의해 계산된다.
세포도금
2x10e5 cells/ml 에 세포를 준비하고 96 웰 플레이트의 웰마다 125 ㎕를 배분한다. 다음의 배지를 사용한다: 500 ml Gibco Ham F12 with Glutamax (생성물 코드 31765068), 50 ml FBS, 5ug/ml 블라스틴사이딘(냉동실의 상자에서의 250 ㎕ 분액, G13) (Calbiochem #203351, 10 ml at 10 mg/ml), 100 ug/ml Zeocin (500 ㎕ from 냉동상자에서, G35). (인비트로젠from Fisher, 1 g in 8x 1.25 ml tubes at 100 mg/ml 생성물 코드 VXR25001). 24 시간 동안 세포들이 성장하게 둔다(37 ℃, 5 % CO2, 습한 환경)
세포처리
각 테스트 단백질의 용량범위를 위한 테스트 단백질의 희석을 준비한다(2배(2x)의 원하는 최종 농도로 구성-그 이유는 이미 각 웰마다 배지의 125 ㎕에 125 ㎕가 직접적으로 적용되었기 때문에) 필터 CHO GALR1 공급 매체(20 ml 주사기, 0.2 μm 주사기 필터) 멸균한다. Gilson 피펫 또는 멀티-스테퍼(multi-stepper)를 이용하여 여과된 배지를 각 5 labelled bijoux’s (7 ml tubes)로 0.9 ml를 첨가한다. 2000 nM(작업용액 1) 및 600 nM (작업용액 2)로 저장 테스트 단백질을 희석한다. Gilson 피펫을 이용하여 연속적으로 다음농도까지 100 ㎕ 첨가함으로써 각 작업용액을 10 배 희석한다. 최대 완전히 혼합될 때까지 피펫을 위 아래로 넣는다. 용액 1을 위한 4 개의 연속적인 희석과 용액 2를 위한 3 개의 희석을 얻을 때까지 반복한다. 0 nM 조절(오직 공급매체에 의해 여과된)은 또한 각 플레이트에 대한 음성 대조군으로서 제조되어야 한다. 각 테스트 단백질을 위해 상기 내용을 반복한다. 각 실험에서, 물질의 ‘표준’ 집단은 대조군/참조 물질로서 유도되어야 하고, 이것은 비리간드된 LC/A-HN/A이다.
CHO GALR1 플레이트에 희석된 샘플 적용
웰마다 테스트 샘플(2 배의 농도) 125 ㎕를 넣는다. 각 테스트 샘플은 웰이 3 배가 되도록 적용되어야 하고 각 용량범위는 0 nM 대조군을 포함해야 한다. 24 시간동안 배양한다(37 ℃, 5 % CO2, 습한환경).
세포용해
25 % (4x) NuPAGE LDS 샘플 버퍼, 65 % dH2O 및 10 % 1 M DTT를 포함한 신선한 용해 버퍼(플레이트마다 20 mls)를 준비한다. 폐기물 용기로 바꿈으로써 CHO GALR1 플레이스에서 배지를 제거한다. 각 웰에서 끝이 뾰족한 피펫을 이용하여 남은 배지를 배출한다. 멀티-스테퍼 피펫을 이용하여 웰마다 용해 버퍼를 125 ㎕ 첨가함으로써 세포를 용해시킨다. 최소한 20 분 후에, 각 웰에서 1.5 ml의 마이크로 원심분리 튜브로 상기 버퍼를 제거한다. 튜브들은 전반적인 블로팅 과정에 걸쳐 CHO GALR1 처리의 추적을 할 수 있도록 번호가 매겨져 있어야 한다. 아래 A1-A3에서 H1-H3은 1-24의 번호로, 아래 A4-A6에서 H4-H6는 25-48의 번호로, 아래 A7-A9에서 H7-H93는 49-72의 번호로, 아래 A10-A12에서 H10-H12는 73-96의 번호로. 각 샘플을 돌리고 90 ℃에서 5-10 분간 데워진 열 블락에서 열처리 한다. -20 ℃에서 저장하거나 SDS 젤에서 같은 날 사용한다.
젤 전기영동
만약 샘플들이 바로 또는 더 길게 저장되면, 90 ℃까지 데워진 열 블락에 5-10 분간 둔다. SDS 페이지 겔을 설정하고, 12 샘플마다 1 개의 겔을 사용하고, 겔 탱크마다 실행버퍼 (1x, Invitrogen NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) (NP0001)) 약 800 ml를 만든다. 500 ㎕의 NuPAGE 항산화제를 버퍼 챔버의 상층에 첨가한다. 15 ul의 샘플들은 왼쪽부터 오른쪽으로 겔 레인에 두고 2.5 ul의 Invitrogen Magic Marker XP와 5 ul의 Invitrogen을 둔다. Blue Plus 2 사전염색된 표준과 15 ul의 비-처리된 대조군을 본다. SDS_PAGE동안 분리의 해상도를 최대화시키는 것은 중요하다. 이것은 1 시간 및 25 분 동안 200 V에서 12 % bis-tris gels을 실행시킴으로써 달성될 수 있다(핑크마커(17 kDa)가 탱크의 바닥에 도달할 때까지).
웨스턴 블로팅
반-건조된 트랜스퍼(Semi-dry transfer)를 완성: Invitrogen iBlot (6분동안 iBlot Programme 3 사용)을 사용. 각 작은 트레이에 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막을 넣는다. 블로킹 버퍼 용액(5 g Marvel milk powder per 100 ml 0.1 %PBS/Tween)를 가진 막을 상온에서, 로커에서, 1시간동안 배양한다. 주요 항체(Anti-SNAP-25 1:1000 희석)를 넣고 주요 항체(블로킹 버퍼에서 희석된)를 가진 막을 로커에서 상온에서 1 시간동안 배양한다. PBS/Tween (0.1 %)으로 3 회 세척함으로써 막을 세척한다. 그런다음 두번째 항체(1:1000으로 희석된 Anti-Rabbit-HRP 콘주게이트)를 넣고 두번째 항체(블로킹 버퍼에서 희석된)를 가진 막을 로커에서 상온에서 1 시간동안 배양한다. PBS/Tween (0.1 %)으로 3 회 세척함으로써 막을 세척하고, 마지막 막 세척은 최소 20 분을 한다. 동계(Syngene)를 이용한 결합된 항체 검출: PBS/Tween을 빼내고, WestDura 시약을 1:1로 혼합하고 5 분동안 블랏을 첨가한다. 그들을 완전히 덮을 수 있도록 막에 충분한 확인 용액을 첨가한다. 동계 트레이에 막을 놓고, 5 분간 노출 시간을 위한 동계 소프트웨어를 설정한다.
도면 3 및 5는 본 발명의 갈라닌 융합단백질이 효과적으로 SNAP-25를 절단하는 것을 증명한다.
실시예 8 - 갈라닌 융합의 시험관내 효능 분석
침해굴곡반사(또는 포우가딩 분석이라 알려진)는 가능한 사지 손상에 대항한 보호 메커니즘인 움직임의 급격한 철회이다. 이것은 저용량 캡사이신(캡사이신), 전기자극 또는 캡사이신-감응 전기반응의 결과로 마취된 쥐에서 근전도 (electromyography, EMG) 반응을 분석함으로써 정량화될 수 있다. 본 발명의 융합단백질의 발바닥내(발바닥내) 전처리(24 시간)는 숫컷 웅성 흰쥐(웅성흰쥐)에서 300-380 g이다. 포우 가딩의 유도는 10 초동안 0.006 %의 캡사이신, 10 μl의 PBS(7.5% DMSO)에 의해 주입되어 달성된다. 이것은 대퇴이두근(biceps femoris muscle)에서의 강력한 반사반응을 만들어낸다. 통각 굴곡반사의 감소/저해는 시험물질이 통각억제효과(antinociceptive effect)를 증명한다는 것을 나타낸다. 상기 데이터는 본 발명의 갈라닌 융합단백질의 통각억제효과를 퍼센트로서 증명하였다(도면 6). 캡사이신-유도된 열의 통각과민증을 억제하기 위해 본 발명의 다른 갈라닌 융합단백질의 효과가 측정되었다(도면 7 및 8). 웅성흰쥐에게 융합단백질을 발바닥내 전처리하고 24 시간 후에 0.3 % 캡사이신이 주입한 후 25 ℃ 유리판에 쥐들을 두었다(25 ℃ 유리판 위의 아크릴 상자에 있는 쥐도 포함). 전자빔(조절되는 빛 강도)을 발 아래로 초점을 맞추었다. 센서로 발의 움직임, 정지시간을 측정하였다. 발움추림 잠복기(Paw Withdrawal Latency Latency)는 빛의 원천으로부터 발을 제거하는 시간이다(20.48 초의 제거). 발움추림 잠복기의 감소/억제는 시험물질이 통각억제효과를 증명한다는 것을 나타낸다. 상기 데이터는 C-말단에 존재하는 리간드를 가지는 융합단백질과 비교할 때 본 발명의 갈라닌 융합단백질이 강화된 통각억제효과가 있음을 증명한다.
실시예 9 - 물질 P가 신경 세포배양에서 방출되는 것을 측정함으로써 TM 작용제 활성의 형성
재료
물질 P EIAsms R&D 시스템(영국)에서 획득된다.
방법
eDRG의 주요한 신경단위의 배양균은 이전에 설명된대로 달성할 수 있다(Duggan 등, 2002 참조) 배양균에서 방출되는 물질 P는 EIA, 특히 이전에 설명된 것과 같이 분석된다(Duggan 등, 2002 참조). 관심있는 TM이 신경단위의 배양균에 첨가된다(적어도 처리전 2 주 동안 자리잡은); 동시에 대조군 배양균은 TM의 장소에 운반자를 첨가함으로써. 자극되고(100 mM KCl) 기초의 방출, 물질 P의 총 세포 용해물 함유량 모두 대조 및 TM 처리된 배양균 모두에서 얻을 수 있다. 물질 P면역반응성은 제조업체의 지시에 따라 물질 P 효소 면역학적 키트 (Cayman Chemical Company, USA or R&D Systems, UK)를 이용하여 측정할 수 있다.
관심있는 TM의 존재하에서 신경단위의 세포에 의해 방출된 물질 P의 양은 100 mM KCl의 존재 및 부재 하에 얻을 수 있는 방출과 비교된다. 상기 기본 방출에서 관심있는 TM에 의해 방출되는 물질P의 자극은 관심있는 TM이 본 명세서에서 정의된 것과 같은 “작용자 리간드”인 것을 나타낸다. 만약 원한다면 관심있는 TM에 의한 물질 P 방출의 자극은 천연적인 ORL-1 수용체 리간드, 노시셉틴(nociceptin)(Tocris)를 이용하여 표준 물질 P 방출-곡선과 비교될 수 있다.
실시예 10
환자에게 융합단백질의 치료의 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함한 피시험체의 통증을 치료, 예방 또는 개선하는 방법으로, 여기에서 상기 통증은 악성질환에서 발생하는 만성통증, 악성질환(말초 신경병증)에 의해 발생하지 않는 만성통증으로 구성된 군에서 선택된다.
환자 A
간후부(posthepatic) 신경통으로 발생한 심각한 통증으로 고통받는 73 세의 여성은 통증의 감소를 위해 신경말단의 시냅스에서 신경전달물질의 방출을 감소시키기 위한 융합단백질의 말초주입에 의해 치료받고 있다 상기 환자는 상기 주입의 2 시간 이내에 좋은 진통효과를 보이고 있다.
환자 B
차 사고에 따른 왼쪽 팔의 말단결손 후에 환상지통으로 고통받는 32 세의 남성은 상기 통증을 감소시키기 위해 융합단백질을 말단주입으로 치료받고 있다. 상기 환자는 상기 주입의 1 시간 이내에 좋은 진통효과를 경험하고 있다.
환자 C
당뇨병 신경장애로 고통받는 55 세 남성은 통증을 감소시키기 위해 신경말단의 시냅스에서 신경전달물질의 방출을 줄이는 융합단백질의 말단주입에 의해 치료받고 있다. 상기 환자는 상기 주입 후 4 시간 이내에 좋은 진통효과를 경험하고 있다.
환자 D
종양 통증으로 고통받는 63 세의 여성은 통증을 감소시키기 위해 신경말단의 시냅스에서 신경전달물질 방출을 줄이기 위한 융합단백질의 말단주입을 치료받고 있다. 상기 환자는 상기 주입의 4 시간 이내에 좋은 진통효과를 경험하고 있다.
모든 보고, 책, 매뉴얼, 페이퍼, 특허, 공고된 특허출원, 가이드, 요약 및 본 명세서에서 인용된 다른 참조들은 그들 내용 전체로 참조로 포함된다.
설명하기 위해 제공된 실시예는 상기 명세서에서 설명하는 본 발명의 원리를 설명하고, 해당기술의 당업자가 본 명세서를 읽고 형태 및 세부사항에서의 다양한 변화를 본 발명의 진정한 범위를 벗어남 없이 수행할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Peter James Keith Foster John Chaddock Kei Roger Aoki Lance Steward Joseph Francis Syntaxin Limited Allergan, Inc. <120> Fusion Proteins <130> P37541WO-MRM <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1302 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg ac 1302 <210> 2 <211> 1257 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 ctgcagtgta tcaaggttaa caactgggat ttattcttca gcccgagtga agacaacttc 60 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ccgaggaaga aaaaaacaac atcaacttca acatcgacga tctgtcctct 960 aaactgaacg aatccatcaa caaagctatg atcaacatca acaagttcct gaaccagtgc 1020 tctgtaagct atctgatgaa ctccatgatc ccgtacggtg ttaaacgtct ggaggacttc 1080 gatgcgtctc tgaaagacgc cctgctgaaa tacatttacg acaaccgtgg cactctgatc 1140 ggtcaggttg atcgtctgaa ggacaaagtg aacaatacct tatcgaccga catccctttt 1200 cagctcagta aatatgtcga taaccaacgc cttttgtcca ctctagacta gaagctt 1257 <210> 3 <211> 1323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 ggatccatgc cggttaccat caacaacttc aactacaacg acccgatcga caacaacaac 60 atcattatga tggaaccgcc gttcgcacgt ggtaccggac gttactacaa ggcttttaag 120 atcaccgacc gtatctggat catcccggaa cgttacacct tcggttacaa acctgaggac 180 ttcaacaaga gtagcgggat tttcaatcgt gacgtctgcg agtactatga tccagattat 240 ctgaatacca acgataagaa gaacatattc cttcagacta tgattaaact cttcaaccgt 300 atcaaaagca aaccgctcgg tgaaaaactc ctcgaaatga ttatcaacgg tatcccgtac 360 ctcggtgacc gtcgtgtccc gcttgaagag ttcaacacca acatcgcaag cgtcaccgtc 420 aacaaactca tcagcaaccc aggtgaagtc gaacgtaaaa aaggtatctt cgcaaacctc 480 atcatcttcg gtccgggtcc ggtcctcaac gaaaacgaaa ccatcgacat cggtatccag 540 aaccacttcg caagccgtga aggtttcggt ggtatcatgc agatgaaatt ctgcccggaa 600 tacgtcagtg tcttcaacaa cgtccaggaa aacaaaggtg caagcatctt caaccgtcgt 660 ggttacttca gcgacccggc actcatcctc atgcatgaac tcatccacgt cctccacggt 720 ctctacggta tcaaagttga cgacctcccg atcgtcccga acgagaagaa attcttcatg 780 cagagcaccg acgcaatcca ggctgaggaa ctctacacct tcggtggcca agacccaagt 840 atcataaccc cgtccaccga caaaagcatc tacgacaaag tcctccagaa cttcaggggt 900 atcgtggaca gactcaacaa agtcctcgtc tgcatcagcg acccgaacat caatatcaac 960 atatacaaga acaagttcaa agacaagtac aaattcgtcg aggacagcga aggcaaatac 1020 agcatcgacg tagaaagttt cgacaagctc tacaaaagcc tcatgttcgg tttcaccgaa 1080 accaacatcg ccgagaacta caagatcaag acaagggcaa gttacttcag cgacagcctc 1140 ccgcctgtca aaatcaagaa cctcttagac aacgagattt acacaattga agagggcttc 1200 aacatcagtg acaaagacat ggagaaggaa tacagaggtc agaacaaggc tatcaacaaa 1260 caggcatacg aggagatcag 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ggtccgcacg ctgttgcgct agcgggcggt 1440 ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtatc 1500 aaggttaaca actgggattt attcttcagc ccgagtgaag acaacttcac caacgacctg 1560 aacaaaggtg aagaaatcac ctcagatact aacatcgaag cagccgaaga aaacatctcg 1620 ctggacctga tccagcagta ctacctgacc tttaatttcg acaacgagcc ggaaaacatt 1680 tctatcgaaa acctgagctc tgatatcatc ggccagctgg aactgatgcc gaacatcgaa 1740 cgtttcccaa acggtaaaaa gtacgagctg gacaaatata ccatgttcca ctacctgcgc 1800 gcgcaggaat ttgaacacgg caaatcccgt atcgcactga ctaactccgt taacgaagct 1860 ctgctcaacc cgtcccgtgt atacaccttc ttctctagcg actacgtgaa aaaggtcaac 1920 aaagcgactg aagctgcaat gttcttgggt tgggttgaac agcttgttta tgattttacc 1980 gacgagacgt ccgaagtatc tactaccgac aaaattgcgg atatcactat catcatcccg 2040 tacatcggtc cggctctgaa cattggcaac atgctgtaca aagacgactt cgttggcgca 2100 ctgatcttct ccggtgcggt gatcctgctg gagttcatcc cggaaatcgc catcccggta 2160 ctgggcacct ttgctctggt ttcttacatt gcaaacaagg ttctgactgt acaaaccatc 2220 gacaacgcgc tgagcaaacg taacgaaaaa 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Ile Asp Ile Lys Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys 290 295 300 Ala Ile Ala Asn Lys Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn 305 310 315 320 Ile Asp Ile Asp Ser Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe 325 330 335 Asp Lys Asp Ser Asn Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln 340 345 350 Ile Leu Tyr Asn Ser Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly 355 360 365 Lys Lys Phe Asn Ile Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His 370 375 380 Asp Pro Val Lys Ile Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp 385 390 395 400 Thr Glu Gly Phe Asn Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys 405 410 415 Gly Gln Asn Met Arg Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly 420 425 430 Ser Gly Leu Val Ser Lys Leu Ile Gly Leu Cys Val Asp Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Ser Ala Asp Asp Asp Asp Lys Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly 450 455 460 Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser 465 470 475 480 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gln Cys 485 490 495 Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn 500 505 510 Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn 515 520 525 Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gln Gln Tyr 530 535 540 Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile Glu 545 550 555 560 Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu Glu Leu Met Pro Asn Ile 565 570 575 Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met 580 585 590 Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg Ile 595 600 605 Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val 610 615 620 Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys Ala Thr 625 630 635 640 Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu Gln Leu Val Tyr Asp Phe 645 650 655 Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala Asp Ile 660 665 670 Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met 675 680 685 Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Val 690 695 700 Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu Gly Thr 705 710 715 720 Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gln Thr 725 730 735 Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr 740 745 750 Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln Ile Asp 755 760 765 Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala Glu Ala 770 775 780 Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu 785 790 795 800 Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn 805 810 815 Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln 820 825 830 Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys 835 840 845 Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr 850 855 860 Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gln Val Asp Arg Leu Lys 865 870 875 880 Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gln Leu Ser 885 890 895 Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr Leu Glu Ala Leu Ala 900 905 910 Ser Gly His His His His His His 915 920

Claims (22)

  1. a. 구심성통각감각 세포외 융합장치의 단백질을 절단하는 비-세포독성 프로테아제;
    b. 결합부위 세포이물흡수(endocytoses)가 구심성통각감각 내의 엔도솜에 통합된 구심성통각감각 결합부위에 결합하는 갈라닌 표적화체;
    c. 비-세포독성 프로테아제와 갈라닌 표적화체 사이에 위치하고 프로테아제에 의해 융합단백질이 절단될 수 있는 프로테아제 절단부위;
    d. 표적화체가 프로테아제 절단부위와 전좌도메인 사이에 위치하고 프로테아제를 엔도솜 내에서부터 엔도솜 막을 통과하여 구심성통각감각의 세포질 내로 전좌시키는 전좌도메인;
    e. 비-세포독성 프로테아제와 프로테아제 절단부위 사이에 위치하고, 4 내지 25 개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 제1 스페이서; 및
    f. 갈라닌 표적화체와 전좌도메인 사이에 위치하고, 4 내지 35 개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 제2 스페이서
    를 포함하는 단일사슬 폴리펩티드 융합단백질로서,
    비-세포독성 프로테아제는 클로스트리듐 신경독 혈청형 A, B, C 또는 D의 경쇄이고, 갈라닌 표적화체는 SEQ ID NO: 8로 대표되는 GA16이며, 프로테아제 절단부위는 엔테로키나아제 절단부위이고, 전좌도메인은 클로스트리듐 신경독의 HN 도메인이며, 제1 스페이서는 GS5, GS10 또는 GS18 스페이서로부터 선택되고, 제2 스페이서는 GS20 스페이서이며, 상기 단일사슬 폴리펩티드 융합단백질은 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 잔기로 구성되는 폴리펩티드를 제외하는 것인 단일사슬 폴리펩티드 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합단백질이 SEQ ID NOs: 10, 11, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29 또는 34로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단일사슬 폴리펩티드 융합단백질.
  3. 제1항에 따른 폴리펩티드 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자.
  4. 프로모터, 상기 프로모터 하류에 위치하는 제3항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자, 및 상기 폴리뉴클레오티드 분자 하류에 위치하는 터미네이터를 포함하는 발현벡터.
  5. a. 제4항의 발현벡터로 숙주세포를 형질감염시키는 단계; 및
    b. 상기 숙주세포를 발현벡터에 의해 폴리펩티드 융합단백질의 발현을 촉진시키는 조건 하에서 배양하는 단계
    를 포함하는 단일사슬 폴리펩티드 융합단백질 제조방법.
  6. a. 제1항에 따른 단일사슬 폴리펩티드 융합단백질을 프로테아제 절단부위를 절단할 수 있는 프로테아제와 접촉시키는 단계; 및
    b. 프로테아제 절단부위를 절단하고, 그럼으로 해서 이중-사슬 융합단백질을 형성하는 단계
    를 포함하는 비-세포독성 에이전트 제조방법.
  7. 제6항의 방법에 의해 얻어지는, 이중-사슬 폴리펩티드인 비-세포독성 폴리펩티드이며, 여기서
    a. 제1 사슬은 구심성통각감각의 세포외 융합장치 단백질을 절단할 수 있는 비-세포독성 프로테아제를 포함하고;
    b. 제2 사슬은 갈라닌 TM, 및 상기 프로테아제를 엔도솜 내에서 엔도솜 막을 통과시켜 구심성통각감각의 세포질로 전좌시킬 수 있는 전좌도메인을 포함하고;
    상기 제1 및 제2 사슬은 함께 이황화결합으로 연결된 것인 비-세포독성 폴리펩티드.
  8. 제1항에 따른 융합단백질의 치료학적으로 효과적인 양을 포함하는, 피시험체의 통증을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 통증이 신경성 통증, 염증성 통증, 두통, 체성통, 내장통 및 관련통에서 선택된 만성통증인 약제학적 조성물.
  10. 제7항에 따른 폴리펩티드의 치료학적으로 효과적인 양을 포함하는, 피시험체의 통증을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 통증이 신경성 통증, 염증성 통증, 두통, 체성통, 내장통 및 관련통에서 선택된 만성통증인 약제학적 조성물.
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