BR112020018534A2 - Imunoterapia com células t direcionadas por zetacina alvejada por receptor alfa 2 da il-13 - Google Patents

Imunoterapia com células t direcionadas por zetacina alvejada por receptor alfa 2 da il-13 Download PDF

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Abstract

imunoterapia com células t direcionadas por zetacina alvejada por receptor alfa 2 da il-13. algumas modalidades dos métodos e das composições fornecido(a)s nesse documento incluem células tendo receptores de zetacina direcionados por muteína da il13 afixados à membrana, tais como aqueles que se ligam especificamente ao receptor alfa 2 da il-13 (il13ra2) em uma afinidade 50 vezes maior do que a il-13 tipo selvagem, e métodos de imunoterapia baseada em células que têm como alvo células cancerosas, tais como células de tumores sólidos, usando essas composições. em algumas modalidades, os receptores incluem regiões espaçadoras, tais como, regiões espaçadoras particulares projetadas para fornecer certas vantagens.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “IMUNOTERAPIA COM CÉLULAS T DIRECIONADAS POR ZETACINA ALVEJADA POR RECEPTOR ALFA 2 DA IL-13” Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório U.S. No.62/643139 depositado em 14 de março de 2018, intitulado “IL-13 RECEPTOR ALPHA 2 TARGETED, ZETAKINE DIRECTED T CELL IMMUNOTHERAPY”, que é expressamente incorporado por referência em sua totalidade nesse documento.
Referência à Listagem de Sequências
[002] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado SCRI179WOSEQLIST, criado em 12 de março de 2019, que tem aproximadamente 35 Kb de tamanho. A informação no formato eletrônico da Listagem de Sequências é expressamente incorporada por referência em sua totalidade nesse documento.
Campo da Invenção
[003] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem células tendo receptores de zetacina direcionados por muteína da IL13 afixados à membrana, tais como aqueles que se ligam especificamente ao receptor alfa 2 da IL-13 (IL13Ra2) em uma afinidade 50 vezes maior do que a IL-13 tipo selvagem, e métodos de imunoterapia baseada em células que têm como alvo células cancerígenas, tais como células de tumores sólidos, utilizando essas composições. Em algumas modalidades, os receptores incluem regiões espaçadoras, tais como regiões espaçadoras particularmente selecionadas de comprimentos definidos, que são projetadas para fornecer características desejáveis específicas aos receptores.
Fundamentos da Invenção
[004] Apesar de avanços significativos na compreensão do câncer cerebral, durante a última década, a taxa de mortalidade permaneceu consistente e novas terapias inovadoras são urgentemente necessárias. Até o momento, a imunoterapia de células T emergiu como uma terapia de câncer promissora apoiada por dados clínicos notáveis relatando remissão completa em pacientes com malignidades de células B após a administração de células T CAR que têm como alvo CD19. Entretanto, permanece uma necessidade de imunoterapias de células T adicionais e melhoradas.
Sumário da Invenção
[005] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem um ácido nucleico que codifica um receptor de zetacina direcionado por muteína da IL-13 afixada à membrana, o receptor de zetacina compreendendo: um domínio extracelular compreendendo uma muteína da IL-13 e um espaçador; um domínio transmembranar; e uma região de sinalização intracelular, em que o espaçador é interposto entre a muteína e o domínio transmembranar.
[006] Em algumas modalidades, a muteína da IL-13 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a muteína da IL-13 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
[007] Em algumas modalidades, o espaçador é um espaçador de peptídeo.
[008] Em algumas modalidades, o espaçador de peptídeo tem 110 aminoácidos ou menos, mas não menos que 1 ou 2 aminoácidos, tal como 15 aminoácidos ou menos, mas não menos do que 1 ou 2 aminoácidos.
[009] Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4 (S) espaçador de dobradiça de IgG4-CH3 (M) ou espaçador de dobradiça de IgG4-CH2-CH3 (L).
[0010] Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4-CH3 (M).
[0011] Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4-CH2-CH3 (L).
[0012] Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
[0013] Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste na, ou consiste essencialmente na, sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
[0014] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar de CD28 (CD28tm).
[0015] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende a totalidade ou uma porção de um domínio de CD3 zeta em combinação com um domínio coestimulador selecionado do grupo que consiste em CD27, CD28, 4-1BB, OX-40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, NKG2C e B7-H3 ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende uma porção funcional de sinalização de um domínio de CD3 zeta e uma porção funcional coestimuladora de um domínio de 4-1BB.
[0016] Algumas modalidades também incluem uma sequência que codifica um marcador. Em algumas modalidades, o marcador compreende uma forma truncada de um receptor de superfície celular, opcionalmente EGFRt.
[0017] Algumas modalidades também incluem um transgene de di-hidrofolato redutase configurado para seleção de metotrexato. Em algumas modalidades, o transgene de di- hidrofolato redutase é um duplo mutante de di-hidrofolato redutase (DHFRdm). Em algumas modalidades, o mutante duplo de di-hidrofolato redutase compreende mutações de aminoácidos de L22F e F31S.
[0018] Algumas modalidades também incluem uma sequência que codifica uma sequência de salto ribossomal.
[0019] Em algumas modalidades, a sequência de salto ribossomal compreende P2A ou T2A.
[0020] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico de qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral ou adenoviral.
[0021] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem um polipeptídeo receptor quimérico codificado pelo ácido nucleico de qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento.
[0022] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico de qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento.
[0023] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula T ou um precursor de uma célula T.
[0024] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de linfócito T citotóxica CD8+ selecionada do grupo que consiste em células T CD8+ naïve, células T CD8+ de memória central, células T CD8+ de memória efetora e células T CD8+ em massa. Em algumas modalidades, a célula T citotóxica CD8+ é uma célula T de memória central e, em que a célula T de memória central é positiva para CD45RO+, CD62L+, e CD8+.
[0025] Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é uma célula de linfócito T auxiliar CD4+ selecionada do grupo que consiste em células T CD4+ naïve, células T CD4+ de memória central, células T CD4+ de memória efetora e células T CD4+ em massa. Em algumas modalidades, a célula de linfócito auxiliar CD4+ é uma célula T CD4+ naïve e, em que a célula T CD4+ naïve é positiva para CD45RA+, CD62L+ e CD4+ e negativa para CD45RO.
[0026] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula T precursora.
[0027] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula-tronco hematopoiética.
[0028] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem uma composição A compreendendo a célula hospedeira de qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0029] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem um método para preparar uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira de qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento, compreendendo: introduzir um ácido nucleico de qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento em um linfócito; cultivar o linfócito na presença de anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28 e pelo menos uma citocina homeostática; e selecionar o linfócito com um reagente de seleção, em que o reagente de seleção é configurado para enriquecer seletivamente as células transduzidas com o ácido nucleico ou vetor.
[0030] Em algumas modalidades, o reagente de seleção compreende metotrexato.
[0031] Em algumas modalidades, os linfócitos têm um fenótipo CD45RA-, CD45RO+ e CD62L+. Em algumas modalidades, os linfócitos são CD8+ ou CD4+
[0032] Em algumas modalidades, a citocina é IL-15, IL- 7 e/ou IL-21.
[0033] Algumas modalidades também incluem a introdução de um segundo polinucleotídeo na célula hospedeira, o segundo polinucleotídeo que codifica uma proteína marcadora. Em algumas modalidades, a proteína marcadora é EGFRt.
[0034] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem uma célula hospedeira de qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento para uso em um medicamento ou para uso no tratamento ou na inibição de um câncer ou um tumor sólido que expressa um receptor da IL-132 (IL-13Ra2). Em algumas modalidades, o câncer é um câncer cerebral. Em algumas modalidades, o câncer é uma malignidade positiva para IL-13R. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor de glioblastoma. Em algumas modalidades, o câncer é glioblastoma multiforme (GBM).
[0035] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem um método para tratar, inibir ou melhorar um câncer em um indivíduo,
compreendendo: administrar a célula hospedeira de qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento ao indivíduo em necessidade da mesma. Em algumas modalidades, o câncer é uma malignidade positiva para IL13R. Em algumas modalidades, o câncer é câncer cerebral. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor de glioma ou glioblastoma.
Em algumas modalidades, o câncer é um glioma. Em algumas modalidades, o câncer é glioblastoma multiforme (GBM). Em algumas modalidades, o indivíduo é mamífero. Em algumas modalidades, o indivíduo é humano.
[0036] Algumas modalidades também incluem a administração de uma terapia adicional selecionada de quimioterapia e radioterapia. Em algumas modalidades, o fármaco quimioterápico compreende eletoquimioterapia, agente alquilante, antimetabólito (por exemplo, 5- fluorouracila (5-FU), 6-mercaptopurina (6-MP), Capecitabina (Xeloda®), Cladribina, Clofarabina, Citarabina (Ara-C®), Floxuridina, Fludarabina, Gemcitabina (Gemzar®), Hidroxiureia, Metotrexato, Pemetrexede (Alimta®), Pentostatina e Tioguanina), antibiótico antitumoral, inibidor da topoisomerase, inibidor mitótico, corticosteroide, agente intercalante do DNA, ou inibidor de ponto de verificação (ponto de verificação quinase CHK1, CHK2).
Breve Descrição dos Desenhos
[0037] A Figura 1 ilustra um esquema de ácidos nucleicos que codificam certos CARs de zetacina da IL- l3(El3Y) com diferentes regiões espaçadoras. Os ácidos nucleicos que codificam os CARs de zetacina incluíram: uma sequência líder (EFlp); um polinucleotídeo que codifica uma muteína da IL-l3(El3Y); um polinucleotídeo que codifica um dos três espaçadores diferentes; um polinucleotídeo que codifica uma sequência transmembranar CD28tm; um polinucleotídeo que codifica um domínio de sinalização que inclui um domínio primário e coestimulador, que foi um domínio de 4-1BB, um domínio de CD3 zeta, respectivamente.
Os espaçadores incluíram: um espaçador "S" curto, que incluiu uma dobradiça de IgG4 modificada; um espaçador “M” médio, que incluiu uma dobradiça de IgG4 modificada e uma região CH3 de imunoglobulina (dobradiça de IgG4-CH3); e um espaçador “L” longo, que incluiu uma dobradiça de IgG4 modificada, um domínio CH2 de imunoglobulina e um domínio CH3 de imunoglobulina (dobradiça de IgG4-CH2-CH3). O espaçador L continha duas mutações no domínio CH2 (L235D, N297Q). O peptídeo 2A (T2A) de sequência de salto ribossomal autoclivável também foi incluído. Em algumas construções, o lentivetor também incluiu um transgene mutante duplo de di-hidrofolato redutase configurado para a seleção de metotrexato (DHFRdm).
[0038] A Figura 2A ilustra etapas de um método para geração de células T que expressam receptores quiméricos, incluindo etapas para seleção de CD8+ e condições de cultura. Seleção de CD8 e condições de cultura. Células T CD8 foram selecionadas de PBMC utilizando microesferas CD8.
Células selecionadas foram estimuladas com microesferas CD3/CD28 e, em seguida, transduzidas de maneira lentiviral com as construções na Figura 1. Em algumas iterações (*), as células T CD8 foram transduzidas com uma construção que também continha um T2A-DHFRdm que estava no quadro derivado do EGFRt para permitir a coexpressão, permitindo a seleção de células T resistentes ao MTX coexpressando níveis funcionalmente relevantes de CAR de zetacina da IL13.
[0039] A Figura 2B ilustra dados de citometria de fluxo para células T CD8+ contendo CARs que incluíam o espaçador S, M ou L, e corados para uma expressão de marcador substituto (EGFRt).
[0040] A Figura 3A ilustra uma análise de expressão da IL13Ra2 para as linhagens de células tumorais alvo U87, U251T e DAOY.
[0041] A Figura 3B ilustra gráficos para lise específica de células alvo (painel superior: U87; painel do meio: U251T; e painel inferior: DAOY) na presença de células T CD8+ efetoras contendo CARS com um espaçador S, M ou L, nas razões indicadas. Dados representam média ± SD de 3 doadores diferentes.
[0042] A Figura 3C ilustra gráficos de produção de citocina para células T CD8+ contendo CARs com um espaçador S, M ou L na presença de células alvo (fileira superior: U87; fileira do meio: U251T; e fileira inferior: DAOY).
Barras representam média ± SD.
[0043] A Figura 4A ilustra gráficos de fluxo que indicam carga tumoral ao longo do tempo para camundongos injetados com diferentes doses de células T contendo CARs de zetacina da IL13 com o espaçador M ou L.
[0044] A Figura 4B ilustra uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier para camundongos injetados com diferentes doses de células T contendo CARs de zetacina da IL13 com o espaçador M ou L.
[0045] A Figura 5A ilustra etapas de um método para a preparação e análise das células contendo CARs de zetacina da IL13.
[0046] A Figura 5B ilustra dados de citometria de fluxo com células contendo um CAR de zetacina da IL13 com um espaçador M ou espaçador L mutante para expressão de CD4, CD8, EGFTt, e expressão de zetacina (como corado por anticorpo anti-IL13).
[0047] A Figura 6 ilustra uma análise para lise específica de células alvo na presença de células T
CD4+/CD8+ efetoras contendo CARs com o espaçador M ou L, nas razões indicadas.
[0048] A Figura 7 ilustra uma análise para progressão tumoral em camundongos, conforme medido por fluxo, para camundongos tratados com células contendo um CAR de zetacina da IL13 com um espaçador M ou espaçador L.
[0049] A Figura 8 ilustra uma análise para lise específica de células alvo na presença de células T CD4+/CD8+ efetoras contendo CARs com o espaçador M ou L, nas razões indicadas.
[0050] A Figura 9 ilustra uma análise de ensaio de liberação de citocina para células T CD4+/CD8+ contendo CARs de zetacina da IL13 com o espaçador M ou L.
Descrição Detalhada
[0051] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento referem-se a receptores de antígenos quiméricos (CARs) de zetacina da IL13 capazes de ou configurados para se ligar especificamente a uma subunidade do receptor alfa-2 da interleucina-13 (IL- l3R2). Algumas modalidades incluem ácidos nucleicos que codificam tais CARs, células hospedeiras contendo tais CARs e métodos terapêuticos, que utilizam as células hospedeiras tendo estes CARs, por exemplo, fornecendo estas células a indivíduos em necessidade como um medicamento, por exemplo, para tratar ou inibir doenças ou condições mediadas pela subunidade do receptor alfa-2 da interleucina-13 (IL- l3R2), tais como um câncer, por exemplo, malignidades positivas para IL-l3Ra2 incluindo um gliomas e glioblastomas.
[0052] O IL-l3R2 foi previamente encontrado para ser abundante em BLBC de estágio tardio ou metastático (Papageorgis et al. Breast Cancer Research, 2015; 17 (1); expressamente incorporado por referência em sua totalidade nesse documento). Com base nos dados disponíveis publicamente, correlações foram feitas entre, probabilidade de sobrevivência livre de progressão baseada e altos níveis da IL-l3R2. Observou-se que um subtipo de BLBC que tendeu a se espalhar rapidamente para os pulmões tem altos níveis da IL-l3R2. Descobriu-se também que IL-l3R2 estimula o crescimento de células de glioma humano e metástases através da via de sinalização Src/PI3K/Akt/mTOR. (Tu et al.
Tumour Biol. 2016 Nov; 37(11):14701-14709, expressamente incorporado por referência em sua totalidade nesse documento). Terapias alvejadas por IL13Ra2, tais como terapias baseadas em receptor quimérico, foram descritas (ver, por exemplo, Brown et al Clin Cancer Res 2015; Brown et al N Engl J Med 2016; Brown et al Mol Ther 2017; WO 2014072888-Al, descrevendo anticorpos do receptor alfa 2 de anti-IL-l3 (IL-l3-R2) e conjugados de anticorpo-fármaco para o tratamento de câncer, cada um expressamente incorporado por referência em sua totalidade). Entre tais terapias estão aquelas baseadas em ou incluindo a ligação baseada em IL13 mutante (por exemplo, El3Y) ou domínios de reconhecimento de antígeno, tais como zetacinas. Um alvo desejável para terapia de células T adaptativa é a variante 2 de cadeia do receptor alfa da interleucina-l3 (IL- l3R2). Especificamente, em glioblastoma multiforme (GBM), a expressão da IL-l3R2 é um marcador prognóstico para sobrevivência do paciente e é associada com a promoção da progressão tumoral.
[0053] Enquanto IL-l3Ra2 é expressa em > 80% de gliomas de alto grau, incluindo glioblastoma multiforme, tumores demonstram escapar da terapia alvejada pela perda de epítopo alvo ou expressão alvo geral. Consequentemente, em algumas alternativas, para superar esta limitação, terapêuticos multidirecionais são utilizados para o tratamento ou inibição de glioma. Acredita-se que o uso combinatório de zetacina da IL-13 com outras terapias alvo, tais como receptores de antígenos quiméricos, supera o escape de tumor causado pela perda do epítopo alvo. As alternativas fornecidas nesse documento foram testadas in vitro e em um modelo de xenoenxerto tumoral ortotópico. Em algumas modalidades, terapias, tais como imunoterapia dirigida à zetacina da IL-13, serão úteis como são ou como parte de uma abordagem curativa para glioblastoma e outras malignidades positivas para IL-l3Ra2 ou para certos indivíduos tendo a mesma.
[0054] Algumas modalidades fornecidas nesse documento incluem receptores quiméricos, tais como zetacinas. Em algumas modalidades, uma zetacina inclui um domínio de ligação ao ligante, uma região espaçadora, um domínio transmembranar e uma região de sinalização intracelular, tipicamente incluindo domínios de sinalização primários e coestimuladores. Algumas modalidades fornecidas nesse documento incluem a segunda geração de zetacinas da IL-13, tais como aquelas que incluem certas regiões espaçadoras selecionadas ou configuradas. Em alguns aspectos, zetacinas fornecidas nesse documento incluem aquelas que são capazes de exibir ou configuradas para exibir eficácia terapêutica melhorada ou efeitos antitumorais in vivo ou respostas.
Algumas modalidades fornecidas nesse documento são baseadas em alguns aspectos nas observações descritas nesse documento, demonstrando que certas zetacinas foram capazes de suscitar níveis mais altos de produção de citocina em resposta ao antígeno alvo, em relação aos receptores quiméricos de referência, que foram de outra forma iguais ou idênticos aos mesmos, mas diferente nas regiões espaçadoras selecionadas. Algumas modalidades fornecidas nesse documento são baseadas em alguns aspectos nas observações descritas nesse documento, demonstrando a habilidade de certas zetacinas para controlar o crescimento tumoral por um período prolongado e aumentar significativamente a sobrevivência média, tal como em um modelo de xenoenxerto tumoral ortotópico.
Definições
[0055] Conforme utilizado nesse documento, “ácido nucleico” ou “molécula de ácido nucleico” têm seu significado simples e comum quando lidos à luz do relatório descritivo, e podem incluir, mas não estão limitados a, por exemplo, polinucleotídeos, tais como ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), oligonucleotídeos, fragmentos gerados pela reação de cadeia de polimerase (PCR) e fragmentos gerados por qualquer ligação, cisão, ação de endonuclease e ação de exonuclease.
Moléculas de ácido nucléico podem ser compostas de monômeros que são nucleotídeos de ocorrência natural (tais como DNA e RNA) ou análogos de nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, formas enantioméricas de nucleotídeos de ocorrência natural) ou uma combinação de ambos.
Nucleotídeos modificados podem ter alterações nas porções de açúcar ou nas porções de base de pirimidina ou purina.
Modificações de açúcar incluem, por exemplo, substituição de um ou mais grupos hidroxila por halogênios, grupos alquila, aminas ou grupos azida, ou açúcares podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, toda a porção de açúcar pode ser substituída por estruturas estericamente e eletronicamente similares, tais como aza- açúcares ou análogos de açúcar carbocíclicos. Exemplos de modificações em uma porção base incluem pirimidinas ou purinas alquiladas, pirimidinas ou purinas aciladas ou outros substitutos heterocíclicos bem conhecidos. Monômeros de ácido nucleico podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos de tais ligações. Análogos de ligações fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoanilidato ou fosforoamidato e semelhantes. O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui os chamados “ácidos nucleicos de peptídeo”, que compreendem bases de ácido nucleico de ocorrência natural ou modificadas anexadas a uma cadeia principal de poliamida. Ácidos nucleicos podem ser de fita simples ou fita dupla. Em algumas alternativas, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína é fornecida. Em algumas alternativas, o ácido nucleico é RNA ou DNA.
[0056] Conforme utilizado nesse documento, “vetor”, “vetor de expressão” ou “construção”, têm seu significado simples e comum quando lidos à luz do relatório descritivo, e podem incluir, mas não estão limitados a, por exemplo, um ácido nucleico utilizado para introduzir ácidos nucleicos heterólogos em uma célula que tem elementos reguladores para fornecer expressão dos ácidos nucleicos heterólogos na célula. Vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmídeo, minicírculos, levedura ou genomas virais. Em algumas alternativas, os vetores são plasmídeo, minicírculos ou genomas virais. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor viral. Em algumas alternativas, o vetor viral é um lentivírus. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor lentiviral. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor viral espumoso, vetores adenovirais, vetores retrovirais ou vetores lentivírais.
[0057] Em algumas modalidades, os vetores e sequências fornecidos são modificados ou otimizados, tal como por otimização de códon, que pode incluir o processo de projeto de alteração de códons para códons conhecidos por aumentar a eficiência máxima de expressão de proteína em uma célula desejada, preferivelmente em uma célula humana. Em algumas alternativas, otimização do códon é descrita, em que otimização do códon pode ser realizada utilizando algoritmos que são conhecidos por aqueles versados na técnica, para criar transcritos genéticos sintéticos otimizados para rendimento elevado de proteína. Programas contendo algoritmos para otimização de códon são conhecidos por aqueles versados na técnica. Programas podem incluir,
por exemplo, algoritmos OptimumGeneTM ou GeneGPS®, etc.
Adicionalmente, sequências otimizadas de códon sintético podem ser obtidas comercialmente, por exemplo, a partir de Integrated DNA Technologies e outros serviços de sequenciamento de DNA comercialmente disponíveis. Em algumas alternativas, os ácidos nucleicos são descritos, em que os genes do ácido nucleico para a transcrição genética completa são códons otimizados para expressão em humanos.
Em algumas alternativas, os genes são otimizados para ter códons selecionados especificamente para expressão máxima de proteína em células humanas, o que podem aumentar a concentração de proteínas ou CARs de uma célula T.
[0058] A otimização do códon também pode ser realizada para reduzir a ocorrência de estrutura secundária em um polinucleotídeo. Em algumas alternativas, a otimização de códon também pode ser realizada para reduzir a razão total de GC/AT. A otimização estrita de códon também pode levar a estrutura secundária indesejada ou um teor de GC indesejável que leva à estrutura secundária. Como tais, as estruturas secundárias afetam a eficiência transcricional.
Programas, tais como GeneOptimizer, podem ser utilizados após otimização de emprego de códon, para evitar estrutura secundária e otimizar o teor de GC. Estes programas adicionais podem ser utilizados para otimização adicional e solução de problemas após uma otimização inicial do códon para limitar estruturas secundárias que podem ocorrer após a primeira rodada de otimização. Programas alternativos para otimização são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas alternativas, o ácido nucleico compreende sequências que são códon otimizado para expressão em humanos e/ou para remover estrutura secundária e/ou para reduzir a razão total de GC/AT. Em algumas alternativas, as sequências são otimizadas para evitar estrutura secundária. Em algumas alternativas, as sequências são otimizadas para reduzir a razão total de GC/AT.
[0059] Algumas modalidades incluem sequências de polipeptídeo ou suas variações conservativas, tais como substituições conservativas em uma sequência de polipeptídeo. Em algumas modalidades, a “substituição de aminoácidos conservativos” se refere a substituições de aminoácidos que substituem aminoácidos funcionalmente equivalentes. Mudanças de aminoácidos conservativos resultam em mudanças silenciosas na sequência de aminoácidos do peptídeo resultante. Por exemplo, um ou mais aminoácidos de uma polaridade similar atuam como equivalentes funcionais e resultam em uma alteração silenciosa dentro da sequência de aminoácidos do peptídeo.
Substituições que são de carga neutra e que substituem um resíduo com um resíduo menor também podem ser consideradas
“substituições conservativas”, mesmo se os resíduos estão em grupos diferentes (por exemplo, substituição de fenilalanina pela isoleucina menor). Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Diversas famílias de substituições conservativas de aminoácidos são mostradas na Tabela 1.
Tabela 1 Família Aminoácidos apolar Trp, Phe, Met, Leu, Ile, Val, Ala, Pro polar não carregado Gly, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys ácido/carregado Asp, Glu negativamente básico/carregado Arg, Lys, His positivamente Beta-ramificada Thr, Val, Ile resíduos que influenciam a Gly, Pro orientação da cadeia aromático Trp, Tyr, Phe, His
[0060] Conforme utilizado nesse documento, “receptor de antígeno quimérico” tem seu significado simples e comum quando lido à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, um receptor sinteticamente projetado que compreende um domínio de ligação ao ligante de um anticorpo ou outra sequência de proteína que se liga a uma molécula associada com a doença ou distúrbio e é ligada através de um domínio espaçador a um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma célula T ou outros receptores, tal como um domínio coestimulador. Receptor quimérico também pode ser referido como receptores de células T artificiais, receptores de células T quiméricas, imunoreceptores (“immunoreceptors”) quiméricos e receptores de antígenos quiméricos (CARs).
Estes receptores podem ser utilizados para enxertar a especificidade de um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo sobre uma célula T com transferência de sua sequência de codificação facilitada por vetores virais, tais como um vetor retroviral ou um vetor lentiviral. CARs são receptores de células T geneticamente manipulados projetados para redirecionar células T para células alvo que expressam antígenos de superfície celular específicos.
Células T podem ser removidas de um indivíduo e modificadas de modo que elas possam expressar receptores que podem ser específicos para um antígeno por um processo chamado de transferência de células adotivas. As células T são reintroduzidas no paciente onde elas podem então reconhecer e miram um antígeno. Estes CARs são receptores manipulados que podem enxertar uma especificidade arbitrária sobre uma célula receptora imunológica. O termo receptores de antígenos quiméricos ou “CARs” também são considerados por alguns investigadores por incluir o anticorpo ou fragmento de anticorpo, o espaçador, domínio de sinalização e região transmembranar. Devido aos efeitos surpreendentes de modificação dos diferentes componentes ou domínios dos CARs descritos nesse documento, tais como a região de ligação do epítopo (por exemplo, fragmento de anticorpo, scFv ou porção do mesmo), espaçador, domínio transmembranar ou domínio de sinalização), os componentes dos CARs são frequentemente distinguidos por toda esta divulgação em termos de elementos independentes. A variação dos diferentes elementos dos CARs pode, por exemplo, levar a uma afinidade de ligação mais forte para um epítopo ou antígeno específico.
[0061] Os CARs enxertam a especificidade de um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo ou scFv sobre uma célula T, com a transferência de sua sequência de codificação facilitada por vetores. A fim de utilizar CARs como uma terapia para um indivíduo em necessidade, uma técnica chamada transferência de célula adotiva é utilizada na qual células T são removidas de um indivíduo e modificadas de modo que elas possam expressar os CARs que são específicos para um antígeno. As células T, que podem então reconhecer e mirar um antígeno, são reintroduzidas no paciente.
[0062] Conforme utilizado nesse documento, “ligante” tem seu significado simples e comum quando lido à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, uma substância que pode formar um complexo com uma biomolécula. A título de exemplo e não de limitação, ligantes podem incluir substratos, proteínas, pequenas moléculas, inibidores, ativadores, ácidos nucleicos ou neurotransmissores. A ligação pode ocorrer através de forças intermoleculares, por exemplo, ligações iónicas, ligações de hidrogénio ou interações de van der walls. Ligação ao ligante para uma proteína receptora pode alterar a estrutura tridimensional e determinar seu estado funcional. A força de ligação de um ligante é referida como a afinidade de ligação e pode ser determinada por interações diretas e efeitos de solventes. Um ligante pode ser ligado por um “domínio de ligação ao ligante”. Um domínio de ligação ao ligante, por exemplo, pode se referir a uma sequência conservada em uma estrutura que pode ligar um ligante específico ou um epítopo específico em uma proteína. O domínio de ligação ao ligante ou porção de ligação ao ligante pode compreender um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo ou scFv, um ligante receptor ou mutantes do mesmo, peptídeo e/ou molécula de afinidade de polipeptídeo ou parceiro de ligação. Sem ser limitante, um domínio de ligação ao ligante pode ser um domínio de proteína específico ou um epítopo em uma proteína que é específica para um ligante ou ligantes.
[0063] Conforme utilizado nesse documento, um “fragmento variável de cadeia simples” ou scFv têm seu significado simples e comum quando lidos à luz do relatório descritivo, e podem incluir, mas não estão limitados a, por exemplo, uma proteína de fusão que compreende as regiões variáveis da cadeia pesada (VH) e as cadeias leves (VL) de uma imunoglobulina, que são conectadas entre si com um peptídeo ligante curto. Sem ser limitante, o ligante pode compreender glicina para flexibilidade e aminoácidos hidrófilos, por exemplo, serina ou treonina para solubilidade. O ligante pode conectar o terminal N do VH com o terminal C do VL ou pode conectar o terminal C do VH com o terminal N do VL. Em algumas alternativas, o domínio de ligação ao ligante presente em um CAR é um fragmento variável de cadeia simples (scFv). Em algumas alternativas, o domínio scFv presente em um CAR é específico para um receptor alfa 2 da IL-13 (IL13R2) presente em uma célula tumoral.
[0064] Em algumas alternativas, o domínio extracelular compreende pelo menos um espaçador de peptídeo. Em algumas alternativas, o espaçador de peptídeo é de 15 aminoácidos ou menos, mas não menos que 1 ou 2 aminoácidos. Em algumas modalidades, o espaçador é uma cadeia de polipeptídeo. Em alguns aspectos, a cadeia de polipeptídeo pode variar em comprimento, tal como a partir de um comprimento de 3, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,
40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,
55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,
70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,. 79, 80, 81, 82, 83,
84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,
99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110,
111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,
123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,
135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146,
147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158,
159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170,
171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182,
183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194,
195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206,
207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218,
219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230,
231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239 ou 240 aminoácidos ou um comprimento dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos comprimentos acima mencionados.
Um espaçador pode compreender quaisquer 20 aminoácidos, por exemplo, em qualquer ordem para criar um comprimento desejável de cadeia de polipeptídeo em um receptor quimérico, que inclui os aminoácidos arginina, histidina,
lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina,
asparagina, glutamina, cisteína, glicina, prolina, alanina,
valina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina ou triptofano. Em algumas alternativas, o espaçador reside entre o scFv ou domínio de ligação ao ligante e a região transmembranar do receptor quimérico. Um espaçador também pode ser personalizado, selecionado, configurado para ou otimizado para um comprimento desejado, de modo a melhorar a ligação do domínio scFv ou domínio de ligação ao ligante à célula alvo, que pode aumentar a eficácia citotóxica. Em algumas alternativas, o ligante ou espaçador entre o domínio scFv ou domínio de ligação ao ligante e a transmembrana pode ser de 25 a 55 aminoácidos em comprimento (por exemplo, pelo menos, igual a 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55 aminoácidos ou um comprimento dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos comprimentos mencionados acima).
Espaçadores de exemplo incluem dobradiça de lgG4 sozinha, dobradiça de lgG4 ligada a domínios de CH2 e CH3 ou dobradiça de lgG4 ligada ao domínio CH3. Espaçadores de exemplo incluem aqueles descritos em Hudecek et al. Clin.
Cancer Res., 19:3153 (2013), publicação do pedido de patente internacional número WO2014031687, Patente U.S. No.
8,822,647 ou pedido publicado No. US2014/0271635, aqui expressamente incorporados por referência em suas totalidades.
[0065] Em algumas modalidades, um domínio de sinalização de um CAR, tal como domínio de sinalização primário ou domínio coestimulador, inclui um domínio intracelular ou citoplásmico de uma proteína ou uma proteína receptora que interage com componentes no interior das células e é capaz de retransmitir ou participar em retransmitir um sinal.
Tais interações em alguns aspectos podem ocorrer através do domínio intracelular que se comunica através de interações específicas de proteína-
proteína ou proteína-ligante com uma molécula efetora ou uma proteína efetora, que por sua vez pode enviar o sinal ao longo de uma cadeia de sinal para seu destino.
Em algumas modalidades, o domínio de sinalização inclui um domínio coestimulador.
Em alguns aspectos, o domínio coestimulador inclui uma porção de sinalização que fornece às células T um sinal, que além do sinal primário fornecido, por exemplo, pela cadeia de CD3 zeta do complexo
TCR/CD3, aumenta a resposta, tal como uma resposta de células T efetora, tal como, por exemplo, uma resposta imune, ativação, proliferação, diferenciação, secreção de citocina, atividade citolítica, atividade de perforina ou granzima e similares.
Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular e/ou o domínio coestimulador pode incluir a totalidade ou uma porção de, mas não está limitada a, CD27, CD28, 4-1BB, 0X40, CD30, CD40, ICOS,
antígeno-l associado à função linfocitária (LFA-l), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C ou B7-H3, ou um ligante que se liga especificamente com CD83.
[0066] Em algumas modalidades, as composições, células e vetores incluem sequências marcadoras ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos, que podem incluir, por exemplo, uma proteína que serve como um rótulo para uma célula. Em algumas alternativas das células descritas nesse documento, as células coexpressam uma proteína marcadora para uma proteína quimérica específica que é expressa. Em algumas alternativas das células fornecidas nesse documento, o receptor quimérico é coexpresso com uma proteína marcadora específica. Em algumas alternativas das células fornecidas nesse documento, as células compreendem um ácido nucleico que codifica um receptor quimérico. Marcadores podem incluir uma sequência marcadora selecionável, tal como um gene introduzido em um vetor ou uma célula que confere um traço para seleção artificial. Uma sequência marcadora selecionável ou sequência marcadora pode ser um marcador rastreável para permitir um pesquisador distinguir entre células desejadas e indesejadas, ou enriquecer para um tipo de célula específica. Em algumas alternativas, é fornecido um vetor, em que o vetor codifica um receptor quimérico que compreende uma sequência marcadora, em que a dita sequência marcadora codifica um marcador selecionável de superfície celular. Nas alternativas descritas nesse documento, os CARs fornecidos podem compreender uma sequência marcadora que pode ser selecionada em experimentos, tais como citometria de fluxo. Em algumas alternativas, o marcador é a proteína Her2tG ou EGFRt.
[0067] Conforme utilizado nesse documento, “metotrexato” (MTX), tem seu significado simples e comum quando lido à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, um antimetabólito e um fármaco antifolato. Ele age inibindo o metabolismo do ácido fólico. Em algumas alternativas, é fornecido um método de geração de células T multiplexadas manipuladas para imunoterapia de células T adotivas. No sentido mais amplo, o método pode compreender o fornecimento do polinucleotídeo de entrega de genes de qualquer uma das alternativas descritas nesse documento, selecionando as células que compreendem o polinucleotídeo de entrega de genes, em que a seleção compreende a adição de um reagente de seleção. Em algumas alternativas descritas nesse documento, o reagente de seleção compreende um agente para seleção. Em algumas alternativas, o reagente de seleção é MTX.
[0068] Conforme utilizado nesse documento, “di- hidrofolato redutase”, ou DHFR, como descrito nesse documento, tem seu significado simples e comum quando lido à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, uma enzima que reduz ácido diidrofólico em ácido tetraidrofólico, utilizando NADPH como doador de elétron, que pode ser convertido em tipos de cofatores de tetrahidrofolato utilizados em química de transferência de 1-carbono. Em algumas alternativas descritas nesse documento, é fornecido um polinucleotídeo de entrega de genes. Em algumas alternativas, o polinucleotídeo de entrega de gene compreende pelo menos um cassete marcador selecionável que codifica para um mutante duplo de di-hidrofolato redutase (DHFRdm).
[0069] Conforme utilizado nesse documento, uma “sequência de salto ribossomal”, conforme descrito nesse documento, refere-se a uma sequência que, durante a tradução, força o ribossomo a “pular” a sequência de salto ribossomal e traduzir a região após a sequência de salto ribossomal sem formação de uma ligação peptídica. Vários vírus, por exemplo, têm sequências de salto ribossomal que permitem a tradução sequencial de várias proteínas em um único ácido nucleico sem ter as proteínas ligadas através de uma ligação peptídica. Conforme descrito nesse documento, esta é a sequência de “ligante”. Em algumas alternativas dos ácidos nucleicos fornecidos nesse documento, os ácidos nucleicos compreendem uma sequência de salto ribossomal entre a sequência para o receptor quimérico e a sequência da proteína marcadora, tal que as proteínas são coexpressas e não ligadas por uma ligação peptídica. Em algumas alternativas, a sequência de salto ribossomal é uma sequência P2A, T2A, E2A ou F2A. Em algumas alternativas, a sequência de salto ribossomal é uma sequência T2A.
[0070] Conforme utilizado nesse documento, a "zetacina" pode se referir a um determinado tipo de CAR, em que um domínio de ligação ao ligante inclui uma citocina, que pode se ligar especificamente a um receptor de citocina. Em algumas modalidades, a citocina pode incluir uma citoke humana, tal como IL-13. Em algumas modalidades, a IL-13 inclui uma mutação na sequência, e tem uma alta afinidade para o receptor 2 da IL -13.
[0071] Conforme utilizado nesse documento, "muteína" tem seu significado simples e comum, quando lido à luz do relatório descritivo, podendo incluir, mas não está limitado a, por exemplo, uma proteína que surge como um resultado de uma mutação. “Muteína da IL-13” pode ser um mutante da IL -13 que pode ter pelo menos uma ou pelo menos duas substituições de aminoácidos.
[0072] Conforme utilizado nesse documento, “subunidade do receptor alfa-2 da interleucina-13 (IL-l3R2)”, também conhecida como CD213A2 (cluster de diferenciação 213A2),
tem seu significado simples e comum quando lida à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitada a, por exemplo, uma proteína ligada à membrana que em humanos é codificada pelo gene IL-13RA2. IL-l3R2 está intimamente relacionada à IL-l3Rl, uma subunidade do complexo receptor da interleucina-13. IL-l3R2 geralmente se liga a IL-13 com alta afinidade, mas carece de qualquer domínio citoplásmico significativo, e não parece funcionar como um mediador de sinal. É, entretanto, capaz de regular os efeitos tanto da IL-13 quanto da IL-4, apesar do fato de que ela é incapaz de se ligar diretamente a última. Também é relatado que desempenha um papel na internalização da IL-
13.
[0073] Conforme utilizado nesse documento, as “células T” ou linfócitos T em algumas modalidades podem incluir células T de qualquer mamífero, preferivelmente primata, espécies, incluindo macacos, cães ou humanos. Em algumas alternativas, as células T são alogênicas (da mesma espécie, mas doador diferente) à medida que o indivíduo receptor que recebe ou deve receber as células, tal como na forma de uma composição terapêutica; em algumas alternativas, as células T são autólogas (o doador e o receptor são iguais); em algumas alternativas, as células T são singênicas (o doador e os receptores são diferentes, mas são gêmeos idênticos).
[0074] Conforme utilizado nesse documento, “linfócito T citotóxico” (CTL), tem seu significado simples e comum quando lido à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, um linfócito T que expressa CD8 na sua superfície (por exemplo, uma célula T CD8+). Em algumas alternativas, tais células são, de preferência, células T de "memória" (células TM) que são experimentadas por antígeno. Em algumas alternativas, a célula é um linfócito T citotóxico. Célula T de “memória central" (ou "TCM") conforme utilizado nesse documento, refere-se a um antígeno experimentado por CTL que expressa CD62L, CCR-7 e/ou CD45RO na superfície do mesmo, e não expressa ou tem expressão diminuída de CD45RA, em comparação com células naïve. Em algumas alternativas, a célula é uma célula T de memória central (T CM). Em algumas alternativas, as células de memória central são positivas para a expressão de CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO ou CD95 ou uma combinação das mesmas, e podem ter expressão diminuída de CD54RA, em comparação com células naïve.
Célula T de "memória efetora" (ou "TEM") conforme utilizado nesse documento refere-se a uma célula t experimentada por antígeno que não expressa ou tem expressão diminuída de CD62L na superfície da mesma, em comparação com células de memória central, e não expressa ou tem uma expressão diminuída de CD45RA, em comparação com célula naïve. Em algumas alternativas, a célula é uma célula T de memória efetora. Em algumas alternativas, as células de memória efetora são negativas para expressão de CD62L e/ou CCR7, em comparação com células naïve ou células de memória central, e podem ter uma expressão variável de CD28 e/ou CD45RA.
[0075] Células T maduras expressam a proteína de superfície CD4 e são referidas como células T CD4+. Células T CD4+ são geralmente tratadas como tendo um papel pré- definido como células T auxiliares dentro do sistema imunológico. Por exemplo, quando uma célula que apresenta antígenos expressa um antígeno sobre a classe II MHC, uma célula CD4+ auxiliará aquelas células através de uma combinação de interações célula a célula (por exemplo, CD40 e CD40L) e através de citocinas. Não obstante, existem exceções raras; por exemplo, subgrupos de células T reguladoras, células exterminadoras naturais ou células T citotóxicas que expressam CD4. Todos os últimos grupos de células T que expressam CD4+ não são considerados células T auxiliares.
[0076] Conforme utilizado nesse documento, célula T de “memória central” (ou “TCM”) tem seu significado simples e comum quando lida à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitada a, por exemplo, um antígeno experimentado por CTL que expressa CD62L ou CCR-7 ou CD45RO ou qualquer combinação dos mesmos sobre a superfície dos mesmos, e não expressa ou tem expressão diminuída de CD45RA em comparação com células naïve. Em algumas alternativas, células de memória central são positivas para a expressão de CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO ou CD95 ou qualquer combinação das mesmas, e possuem expressão diminuída de CD54RA em comparação com células naïve.
[0077] Conforme utilizado nesse documento, célula T de “memória efetora” (ou “TEM”) tem seu significado simples e comum quando lida à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitada a, por exemplo, uma célula T experimentada por antígeno que não expressa ou tem expressão diminuída de CD62L na superfície da mesma em comparação com células de memória central, e não expressa ou tem expressão diminuída de CD45RA em comparação com célula naïve. Em algumas alternativas, células de memória efetora são negativas para expressão de CD62L ou CCR7 ou ambas, em comparação com células naïve ou células de memória central, e têm uma expressão variável de CD28 ou CD45RA ou ambas.
[0078] Conforme utilizado nesse documento, células T “naïve" têm seu significado simples e comum quando lidas à luz do relatório descritivo, e podem incluir, mas não estão limitadas a, por exemplo, um linfócito T não experimentado por antígeno que expressa CD62L ou CD45RA ou ambos, ou não expressa CD45RO- em comparação com células de memória central ou efetora. Em algumas alternativas, os linfócitos T CD8+ naïve são distinguidos pela expressão de marcadores fenotípicos de células T naïve, incluindo CD62L, CCR7, CD28, CD127 ou CD45RA ou qualquer combinação dos mesmos.
[0079] Conforme utilizado nesse documento, células T “efetoras” “TE” têm seu significado simples e comum quando lidas à luz do relatório descritivo, e podem incluir, mas não estão limitadas a, por exemplo, células de linfócitos T citotóxicas experimentadas por antígeno que não expressam ou tem expressão diminuída de CD62L, CCR7 ou CD28, ou são positivas para granzima B ou perforina ou qualquer combinação das mesmas, em comparação com células T de memória central ou naïve.
[0080] Conforme utilizado nesse documento, “precursores de células T” tem seu significado simples e comum quando lidos à luz do relatório descritivo, e podem incluir, mas não estão limitados a, por exemplo, células precursoras linfóides que podem migrar para o timo e tornar-se precursores de células T, que não expressam um receptor de célula T. Todas as células T se originam de células-tronco hematopoiéticas na medula óssea.
Progenitores hematopoiéticos (células progenitoras linfóides) de células-tronco hematopoiéticas povoam o timo e se expandem por divisão celular para gerar uma grande população de timócitos imaturos. Os primeiros timócitos não expressam CD4 nem CD8, e são, portanto, classificados como células duplo-negativas (CD4-CD8-). À medida que progridem em seu desenvolvimento, elas se tornam timócitos duplo- positivos (CD4+CD8+), e finalmente amadurecem para timócitos uni-positivos (CD4+CD8− ou CD4−CD8+) que são então liberados do timo para tecidos periféricos.
[0081] Conforme utilizado nesse documento, “excipiente farmacêutico”, ou veículo farmacêutico têm seu significado simples e comum quando lidos à luz do relatório descritivo, e podem incluir, mas não estão limitados a, por exemplo, um transportador ou meio inerte utilizado como um solvente no qual o agente medicinalmente ativo ou células T para tratamento ou terapia é formulado e ou administrado.
Veículos podem incluir micelas poliméricas, lipossomas, transportadores à base de lipoproteínas, transportadores de nanopartícula ou dendrímeros, ou outros veículos para células T que são conhecidos por aqueles versados na técnica. Um veículo ou excipiente ideal pode ser não tóxico, biocompatível, não imunogênico, biodegradável ou pode evitar o reconhecimento dos mecanismos de defesa do hospedeiro ou qualquer combinação dos mesmos.
[0082] Conforme utilizado nesse documento, "indivíduo" ou "paciente", conforme descrito nesse documento, refere-se a qualquer organismo sobre o qual as alternativas descritas nesse documento podem ser utilizadas ou administradas, por exemplo, para fins experimentais, diagnósticos, profiláticos e/ou terapêuticos. Indivíduos ou pacientes incluem, por exemplo, animais. Em algumas alternativas, o indivíduo é camundongo, ratos, coelhos, primatas não humanos ou humanos. Em algumas alternativas, o indivíduo é uma vaca, ovelha, porco, cavalo, cachorro, gato, primata ou um humano.
[0083] Altos níveis de receptor alfa 2 da Interleucina 13 (IL-13RA2) são encontrados em um número de células cancerígenas incluindo cânceres pancreáticos, mamários e ovarianos ou gliomas malignos, tais como glioblastoma. IL- 13RA2 também pode ser superexpressada em uma vasta maioria de pacientes humanos com astrocitomas de alto grau (veja PLoS One. de 16 de Out de 2013; 8(10):e77719; expressamente incorporado por referência em sua totalidade nesse documento). Adicionalmente, a redução da quantidade de expressão da IL13RA2 em células de câncer pode reduzir significativamente o crescimento de tumor em modelos (Breast Cancer Research, 2015; 17 (1); expressamente incorporado por referência em sua totalidade nesse documento). Contempla-se que poucos tipos de tecidos normais expressam IL-13-RA2 e, em tais casos, somente em baixos níveis. No caso de glioblastoma multiforme (GBM), a alta expressão da IL3R2 pode ser um marcador prognóstico de progressão tumoral e baixa sobrevivência do paciente.
[0084] Algumas modalidades fornecidas nesse documento incluem receptores quiméricos, tais como zetacinas, incluindo aquelas dirigidas contra tumores sólidos. Em algumas modalidades, o domínio extracelular compreende um domínio de ligação contendo uma forma mutante da IL13 (tal como IL13 E13Y), ligada ao domínio transmembranar do receptor através de uma região espaçadora. Em algumas modalidades, a região espaçadora geralmente se estende do domínio de ligação ao domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o espaçador compreende um polipeptídeo que é maior ou maior que cerca de, ou compreende pelo menos ou cerca de 12, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 aminoácidos em comprimento, tal como maior que 50 ou 100 aminoácidos em comprimento, e opcionalmente menor que 150, 200 ou 220 aminoácidos em comprimento, tal como entre 50 e 220 aminoácidos em comprimento, entre 50 e 150 aminoácidos em comprimento, ou em ou cerca de 110 aminoácidos em comprimento. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é ou compreende um trans-domínio CD28 (CD28tm), seguido por um domínio (s) coestimulador (es), tal como um domínio coestimulador derivado de um segmento intracelular de 4-1BB humano (CD137), e um domínio de sinalização primário, tal como um domínio de sinalização de CD3-zeta (CD3ζ).
[0085] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica o receptor quimérico também inclui uma sequência que codifica um marcador, opcionalmente operacionalmente ligado ao mesmo promotor ao qual o ácido nucleico que codifica o receptor é ligado. Em alguns aspectos, o marcador é uma versão truncada de um receptor de superfície celular, tal como uma versão truncada do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFRt), CD19 (CDl9t) ou HER2 (Her2t) ou outro receptor. Em alguns aspectos, o ácido nucleico que codifica o marcador é separado daquele que codifica o receptor quimérico por uma sequência de salto, tal como uma sequência de salto ribossomal P2A ou T2A ou um IRES. Em alguns aspectos, o ácido nucleico também inclui um transgene duplo mutante de di-hidrofolato redutase (DHFRdm), tal como pode ser adicionado para facilitar a seleção de metotrexato de células que expressam produtos de construção, tal como em produtos de células T terapêuticas.
Certos ácidos nucleicos
[0086] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem ácidos nucleicos que codificam um receptor de zetacina direcionado por muteína da IL-13 afixada à membrana. Em algumas modalidades, um ácido nucleico compreende: a) um primeiro polinucleotídeo que codifica um domínio extracelular; b) um segundo polinucleotídeo que codifica uma muteína da IL13; c) um terceiro polinucleotídeo que codifica um domínio transmembranar; e d) um quarto polinucleotídeo que codifica um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo marcador, tal como EGFRt. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda um polinucleotídeo que codifica um marcador de selecionável, tal como DHFRdm. Em algumas modalidades, o ácido nucleico inclui uma sequência de salto de ribossomal.
[0087] Em algumas modalidades, a muteína da IL13 compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos tendo uma porcentagem de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
Em algumas dessas modalidades, a identidade de sequência com a SEQ ID NO: l6 é de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% ou uma porcentagem entre quaisquer duas das percentagens anteriores. Em algumas modalidades, a muteína da IL13 compreende, consiste em, ou consiste essencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
[0088] Em algumas alternativas, o domínio extracelular compreende pelo menos um espaçador peptídico. Em algumas alternativas, o espaçador de peptídeo é de 15 aminoácidos ou menos, mas não menos que 1 ou 2 aminoácidos. Em algumas modalidades, o espaçador é uma cadeia polipeptídica. Em algumas alternativas, o espaçador compreende uma dobradiça de lgG4 ou porção da mesma. Em algumas alternativas, o espaçador compreende uma região de dobradiça de um anticorpo humano ou porção da mesma. Em algumas alternativas do método, o espaçador compreende uma dobradiça de lgG4 ou porção da mesma. Em algumas alternativas, a região de dobradiça de lgG4 é uma dobradiça de lgG4 modificada ou porção da mesma. Uma “dobradiça de lgG4 modificada” conforme descrito nesse documento pode se referir a uma região de dobradiça que pode ter pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência ou uma identidade de sequência dentro de uma faixa definida por quaisquer duas das percentagens acima mencionadas, com uma região de dobradiça de uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em SEQ ID NO: 0l, SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06, SEQ ID NO: 07 ou SEQ ID NO:
08. Em algumas alternativas, o espaçador é um espaçador S, espaçador M ou um espaçador L. O espaçador S compreende uma sequência conforme estabelecido em SEQ ID NO: 09. O espaçador M compreende uma sequência conforme estabelecido em SEQ ID NO: 10. O espaçador L compreende uma sequência conforme estabelecido em SEQ ID NO: 11.
[0089] Em algumas alternativas, o espaçador compreende, consiste em ou consiste essencialmente em um espaçador de dobradiça de lgG4 (S), um espaçador de dobradiça de IgG4-CH3 (M) ou um espaçador de dobradiça de IgG4-CH2-CH3. Em algumas alternativas, o espaçador compreende um espaçador de lgG4-CH3 (M).
[0090] Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos tendo uma porcentagem de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
Em algumas dessas modalidades, a identidade de sequência para SEQ ID NO: 10 é de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, ou uma percentagem entre quaisquer duas das percentagens anteriores. Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[0091] Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos tendo uma percentagem de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
Em algumas dessas modalidades, a identidade de sequência para SEQ ID NO: 11 é de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, ou uma percentagem entre quaisquer duas das percentagens anteriores. Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
[0092] Em algumas modalidades, o espaçador tem pelo menos 10 a 229 aminoácidos, 10 a 200 aminoácidos, 10 a 175 aminoácidos, 10 a 150 aminoácidos, 10 a 125 aminoácidos, 10 a 100 aminoácidos, 10 a 75 aminoácidos, 10 a 50 aminoácidos, 10 a 40 aminoácidos, 10 a 30 aminoácidos, 10 a 20 aminoácidos ou 10 a 15 aminoácidos, e incluindo qualquer número inteiro entre os pontos finais de qualquer uma das faixas listadas. Em algumas modalidades, uma região espaçadora tem 12 aminoácidos ou menos, mas não zero, 119 aminoácidos ou menos, mas não zero, ou 229 aminoácidos ou menos, mas não zero. Em algumas modalidades, o espaçador tem menos de 250 aminoácidos em comprimento mas não zero, menos de 200 aminoácidos em comprimento mas não zero, menos de 150 aminoácidos em comprimento mas não zero, menos de 100 aminoácidos em comprimento mas não zero, menos de 75 aminoácidos em comprimento mas não zero, menos de 50 aminoácidos em comprimento mas não zero, menos de 25 aminoácidos em comprimento, mas não zero, menos de 20 aminoácidos em comprimento, mas não zero, menos de 15 aminoácidos em comprimento, mas não zero, menos de 12 aminoácidos em comprimento mas não zero, ou menos que 10 aminoácidos em comprimento mas não zero. Em algumas modalidades, o espaçador é de ou de 10 a 250 aminoácidos em comprimento, 10 a 150 aminoácidos em comprimento, 10 a 100 aminoácidos em comprimento, 10 a 50 aminoácidos em comprimento, 10 a 25 aminoácidos em comprimento, 10 a 15 aminoácidos em comprimento, 15 a 250 aminoácidos em comprimento, 15 a 150 aminoácidos em comprimento, 15 a 100 aminoácidos em comprimento, 15 a 50 aminoácidos em comprimento, 15 a 25 aminoácidos em comprimento, 25 a 250 aminoácidos em comprimento, 25 a 100 aminoácidos em comprimento, 25 a 50 aminoácidos em comprimento, 50 a 250 aminoácidos em comprimento, 50 a 150 aminoácidos em comprimento, 50 a 100 aminoácidos em comprimento, 100 a 250 aminoácidos em comprimento, 100 a 150 aminoácidos em comprimento ou 150 a 250 aminoácidos em comprimento.
Espaçadores exemplares incluem dobradiça de lgG4 sozinha, dobradiça de lgG4 ligada a domínios CH2 e CH3 ou dobradiça de lgG4 ligada ao domínio CH3. Espaçadores exemplares incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em Hudecek et al. Clin. Cancer Res., 19:3153 (2013), publicação do pedido de patente internacional número WO2014031687, Patente U.S. No. 8,822,647 ou pedido publicado No. US2014/0271635, aqui expressamente incorporados por referência em suas totalidades.
[0093] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é uma região de uma proteína que abrange membrana que é hidrofóbica que pode residir na bicamada de uma célula para ancorar uma proteína que está embutida na membrana biológica. Sem ser limitante, a topologia do domínio transmembranar pode ser uma alfa-hélice transmembranar. Em algumas alternativas, o domínio transmembranar compreende uma sequência transmembranar de CD28 ou um fragmento da mesma, tal como uma que tem um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ou 28 aminoácidos ou um comprimento dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos comprimentos acima mencionados. Em algumas alternativas, a sequência transmembranar de CD28 ou fragmento da mesma compreende 28 aminoácidos em comprimento.
[0094] Em algumas alternativas, o domínio de sinalização intracelular compreende a totalidade ou uma porção de um domínio de CD3 zeta em combinação com um domínio coestimulador selecionado do grupo que consiste em CD27, CD28, 4-1BB, OX-40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, NKG2C e B7-H3 ou uma combinação dos mesmos. Em algumas alternativas, o domínio de sinalização intracelular compreende uma porção funcional de sinalização de um domínio de CD3 zeta e uma porção funcional coestimuladora de um domínio de 4-1BB.
[0095] Em algumas alternativas, o ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma sequência marcadora. Em alguns aspectos, o marcador é uma versão truncada de um receptor de superfície celular, tal como uma versão truncada do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFRt), CD19 (CDl9t) ou HER2 (her2t) ou outro receptor. Em algumas alternativas, a sequência marcadora é uma forma truncada de um receptor de superfície celular, opcionalmente EGFRt.
[0096] Em algumas alternativas, o ácido nucleico também compreende um transgene de di-hidrofolato redutase configurado para seleção de metotrexato. Em algumas alternativas, o transgene de di-hidrofolato redutase é um duplo mutante de di-hidrofolato redutase (DHFRdm). Em algumas alternativas, mutante duplo de di-hidrofolato redutase (DHFRdm) compreende mutações de aminoácidos de L22F e F31S.
[0097] Em algumas alternativas, o ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma sequência de salto ribossomal. Em algumas alternativas, a sequência de salto ribossomal compreende P2A ou T2A.
[0098] Em algumas alternativas, o ácido nucleico é modificado para reduzir a razão total de GC/AT do ácido nucleico. Em algumas alternativas, o ácido nucleico é códon otimizado para expressão em seres humanos.
[0099] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico de qualquer uma das alternativas fornecidas nesse documento. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor viral. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor lentiviral ou adenoviral.
Em algumas alternativas, o receptor zetacina compreende: um domínio extracelular compreendendo uma muteína da IL-13 e um espaçador; um domínio transmembranar; e uma região de sinalização intracelular, em que o espaçador é interposto entre a muteína e domínio transmembranar.
Certos receptores quiméricos
[00100] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem polipeptídeos receptores quiméricos codificados pelo ácido nucleico de qualquer uma das alternativas nesse documento ou o vetor de qualquer uma das alternativas nesse documento. Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem receptores de zetacina direcionados por muteína da IL-13 afixada à membrana membrana codificados pelo ácido nucleico de qualquer uma das alternativas nesse documento ou o vetor de qualquer uma das alternativas nesse documento.
Certas células hospedeiras
[00101] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico de qualquer uma das alternativas nesse documento ou um vetor de expressão de qualquer uma das alternativas nesse documento. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma célula geneticamente modificada. Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula de linfócito T citotóxica CD8+ selecionada do grupo que consiste em células T CD8+ naïve, células T CD8+ de memória central, células T CD8+ de memória efetora e células T CD8+ em massa. Em algumas alternativas, a célula de linfócito T citotóxica CD8+ é uma célula T de memória central e, em que a célula T de memória central é positiva para CD45RO+, CD62L+ e CD8+. Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula de linfócito T auxiliar CD4+ selecionada do grupo que consiste em células T CD4+ naïve, células T CD4+ de memória central, células T CD4+ de memória efetora e células T CD4+ em massa. Em algumas alternativas, a célula de linfócito auxiliar CD4+ é uma célula T CD4+ naïve e, em que a célula T CD4+ naïve é positiva para CD45RA+, CD62L+ e CD4+ e negativa para CD45RO. Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula T precursora. Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula-tronco hematopoiética.
[00102] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem uma célula hospedeira de qualquer uma das alternativas nesse documento ou a composição de qualquer uma das alternativas nesse documento para uso no tratamento ou inibição de um câncer ou um tumor sólido que expressa um receptor da IL-l32, é fornecido. A composição compreende a célula hospedeira de qualquer uma das alternativas nesse documento e um excipiente farmacêutico. Em algumas alternativas, o câncer é um tumor de glioblastoma. Em algumas alternativas, o câncer é glioblastoma multiforme (GBM). Em algumas alternativas, o câncer é uma malignidade positiva para IL- 13R. Em algumas alternativas, o câncer é câncer cerebral ou tumores cerebrais. Por conseguinte, algumas modalidades se referem à célula hospedeira de qualquer uma das alternativas descritas nesse documento para uso em um medicamento ou para uso no tratamento ou inibição de um câncer, tal como um câncer cerebral incluindo, mas não limitado a uma malignidade positiva para IL-13R, GBM, glioma ou glioblastoma.
Certas composições
[00103] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem composições compreendendo uma célula hospedeira de qualquer uma das alternativas nesse documento, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Certos métodos de preparação de células hospedeiras
[00104] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem métodos para a preparação de uma célula hospedeira de qualquer uma das alternativas nesse documento. Algumas dessas modalidades incluem: a) introduzir um ácido nucleico de qualquer uma das alternativas nesse documento ou um vetor de expressão de qualquer uma das alternativas nesse documento em linfócitos; b) cultivar os linfócitos na presença de anticorpos anti-CD3 ou anti CD28 e pelo menos uma citocina homeostática; e c) selecionar os linfócitos com um reagente de seleção, em que o reagente de seleção é configurado para enriquecer seletivamente as células transduzidas com o ácido nucleico ou vetor. Em algumas alternativas, o reagente de seleção é metotrexato. Em algumas alternativas, os linfócitos têm um fenótipo CD45RA-, CD45RO+ ou CD62L+ ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas alternativas, os linfócitos são CD8+ ou CD4+. Em algumas alternativas, a citocina é IL-15, IL-7 ou IL-21 ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas alternativas, o método compreende ainda a introdução de um segundo ácido nucleico na célula hospedeira, o segundo ácido nucleico que codifica uma proteína marcadora. Em algumas alternativas, a proteína marcadora é EGFRt. Em algumas alternativas, o vetor de expressão compreende o ácido nucleico de qualquer uma das alternativas é fornecido nesse documento. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor viral. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor lentiviral ou adenoviral.
[00105] Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula de linfócito T citotóxica CD8+ selecionada do grupo que consiste em células T CD8+ naïve, células T CD8+ de memória central, células T CD8+ de memória efetora e células T CD8+ em massa. Em algumas alternativas, a célula de linfócito T citotóxica CD8+ é uma célula T de memória central e, em que a célula T de memória central é positiva para CD45RO+, CD62L+ ou CD8+ ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula de linfócito T auxiliar CD4+ selecionada do grupo que consiste em células T CD4+ naïve, células T CD4+ de memória central, células T CD4+ de memória efetora e células T CD4+ em massa. Em algumas alternativas, a célula de linfócito auxiliar CD4+ é uma célula T CD4+ naïve e, em que a célula T CD4+ naïve é positiva para CD45RA+, CD62L+ ou CD4+ ou qualquer combinação das mesmas e negativa para CD45RO. Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula T precursora. Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula-tronco hematopoiética.
Certos métodos de terapia
[00106] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem usos de uma célula hospedeira fornecida nesse documento em métodos terapêuticos. Algumas dessas modalidades incluem o uso de uma célula no tratamento, inibição ou melhora de um câncer ou um tumor sólido que expressa um receptor da IL-l32 (IL-l3Ra2). Em algumas alternativas, o câncer é um tumor de glioblastoma. Em algumas alternativas, o câncer é glioblastoma multiforme (GBM). Em algumas alternativas, o câncer é uma malignidade positiva para IL-13R. Em algumas alternativas, o câncer é câncer cerebral ou tumores cerebrais.
[00107] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem métodos para realizar imunoterapia celular em um indivíduo tendo um câncer ou um tumor que compreende: administrar a célula hospedeira de qualquer uma das alternativas nesse documento ou a composição das alternativas nesse documento, é fornecida ao indivíduo.
A composição compreende uma célula hospedeira de qualquer uma das alternativas aqui, e um excipiente farmaceuticamente aceitável é fornecido.
Em algumas alternativas, o câncer é tumor de glioblastoma.
Em algumas alternativas, o câncer é glioblastoma multiforme
(GBM). Em algumas alternativas, o câncer é uma malignidade positiva para IL13R. Em algumas alternativas, o câncer é câncer cerebral.
Em algumas alternativas, o sujeito é selecionado para receber terapia de combinação.
Em algumas alternativas, a terapia de combinação compreende a administração de um fármaco quimioterápico.
Em algumas alternativas, a terapia de combinação compreende a administração da radioterapia.
Em algumas alternativas, o fármaco quimioterápico compreende eletoquimioterapia,
agente alquilante, antimetabólito (por exemplo, 5-
fluorouracila (5-FU), 6-mercaptopurina (6-MP), Capecitabina
(Xeloda®), Cladribina, Clofarabina, Citarabina (Ara-C®),
Floxuridina, Fludarabina, Gemcitabina (Gemzar®),
Hidroxiureia, Metotrexato, Pemetrexede (Alimta®),
Pentostatina e Tioguanina), antibiótico antitumoral,
inibidor da topoisomerase, inibidor mitótico,
corticosteroide, agente intercalante do DNA, ou inibidor de ponto de verificação (ponto de verificação quinase CHK1, CHK2). Em algumas alternativas, o câncer é um glioma.
EXEMPLOS Exemplo 1 - Construção de CARs de zetacina de IL-l3(El3Y)
[00108] Vários CARs de zetacina da IL-l3(El3Y) com diferentes regiões espaçadoras foram construídos. Como ilustrado na Figura 1, os ácidos nucleicos que codificam os CARs de zetacina incluíram: uma sequência líder (EFlp); um polinucleotídeo que codifica uma muteína da IL-l3(El3Y); um polinucleotídeo que codifica um dos três espaçadores diferentes; um polinucleotídeo que codifica uma sequência transmembranar de CD28tm; um polinucleotídeo que codifica um domínio de sinalização que inclui um domínio primário e coestimulador, que foi um domínio de 4-1BB, um domínio de CD3 zeta, respectivamente. Nos espaçadores estão incluídos: um espaçador "S" curto, que incluiu uma dobradiça de IgG4 modificada; um espaçador “M” médio, que incluiu uma dobradiça de IgG4 modificada e uma região CH3 de imunoglobulina (dobradiça de IgG4-CH3); e um espaçador “L” longo, que incluiu uma dobradiça de lgG4 modificada, um domínio CH2 de imunoglobulina e um domínio CH3 de imunoglobulina (dobradiça de IgG4-CH2-CH3). O espaçador L continha duas mutações no domínio CH2 (L235D, N297Q), que pode mitigar os potenciais efeitos indesejados resultantes de potenciais interações do receptor com receptores Fc (FcRs). O peptídeo 2A (T2A) de sequência de salto ribossomal autoclivável também foi incluído. Em algumas construções, o lentivetor também compreende um transgene duplo mutante de di-hidrofolato redutase configurado para seleção de metotrexato (DHFRdm). SEQ ID NO: 16 lista a muteína da IL-13. Uma sequência exemplar de uma muteína da IL-13 pode ser encontrada em Kahlon el al. (Kahlon KS el al., Cancer Res. 2004; incluída por referência em sua totalidade). Como descrito nesse documento, a mutação E13Y conferiu uma ligação seletiva melhorada à IL-l3R2.
Exemplo 2 - Comparação in vitro de CARs incluindo espaçadores diferentes
[00109] [0109] Células T contendo os vários CARs foram geradas de acordo com o método representado na Figura 2A. Células T CD8+ foram selecionadas a partir de células mononucleadas de sangue periférico (PBMCs) utilizando micropérolas. Células selecionadas foram estimuladas com micropérolas CD3/CD28 e então transviralmente transduzidas com as construções. Em algumas iterações (*), as células T CD8 foram transduzidas com uma construção que também continha um T2A-DHFRdm que estava no quadro derivado do EGFRt para permitir a coexpressão, permitindo a seleção de células T resistentes ao MTX coexpressando níveis funcionalmente relevantes de CAR de zetacina da IL13. As células foram então submetidas a coloração de fluxo para identificar células que carregam o CAR de zetacina e selecionadas utilizando-se o marcador de EGFRt. Dados de fluxo representativos demonstraram que as células T CD8+ foram eficientemente selecionadas e então subsequentemente enriquecidas ou selecionadas (*) até a pureza próxima da expressão do marcador substituto (EGFRt) como mostrado na Figura 2B.
[00110] [0110] Células T CD8 + contendo os CARs de zetacina com um espaçador S, M ou L foram ainda distinguidos para lise específica de células alvo que expressam IL3Ra2, e a expressão de citocina das células T CD8+ na presença de células alvo. Células alvo U87, U251T e células DAOY foram analisadas por IL13Ra2 (Figura 3A). Em um ensaio de citotoxicidade de 51Cr de 4h, linhagens de células tumorais U87, U251T e DAOY rotuladas foram cocultivadas com células T CAR variantes espaciais de 2ª geração de zetacina da IL13 ou simuladas (Figura 3B). Tanto o espaçador M quanto o L de células T CAR de zetacina da IL13 suscitaram lise específica enquanto o espaçador curto foi incapaz de mirar eficazmente ILl3Ra2. Dados representaram a média ± SD de 3 diferentes doadores.
[00111] Em um ensaio de liberação de citocina, células T contendo os CARs de zetacina foram cultivadas com alvos durante um período de 24 horas. Sobrenadantes livres de células foram coletados para medir a secreção de TNF, IFN e IL-2. Células T CD8+ contendo os CARs de zetacina com o espaçador M ou L tiveram altos níveis de produção de citocina, enquanto o CAR de zetacina com um espaçador S teve substancialmente nenhuma produção de citocina (Figura 3C).
Exemplo 3 - Atividade antitumoral in vivo de CARs de zetacina de IL13
[00112] Atividade antitumoral in vivo de CARs de zetacina da IL13 contendo o espaçador M ou o espaçador L foi testada. Células de glioblastoma U87 rotuladas com ffLuc (0,2 x 106) foram injetadas intracranialmente no cérebro anterior de camundongos NSG no Dia 0. No dia 7, camundongos (n=5 por grupo) receberam células T simuladas ou administração com diferentes doses (células T 2 x 106, 1 X 106) de células T CD8+ CAR transduzidas de 2a geração de zetacina da IL13 de espaçador longo ou médio.
[00113] Fluxo Total (fótons/seg) das células U87 foi medido como uma indicação da carga tumoral. Como ilustrado na Figura 4A, carga tumoral em camundongos tratados com células contendo o CAR de zetacina da IL13 contendo o espaçador L diminuiu com tempo, em comparação com camundongos tratados simuladas, e camundongos tratados com
CAR de zetacina da IL13 contendo o espaçador L. Uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier demonstrou sobrevivência melhorada para camundongos administrados com diferentes doses de células contendo o CAR de zetacina da IL13 contendo o espaçador L (Figura 4B).
Exemplo 4 - Análise in vitro de CARS de zetacina de IL13
[00114] Células contendo CAR de zetacina da IL13 com espaçador M ou o espaçador L foram preparadas de acordo com um método substancialmente similar ao método representado na Figura 5A. Resumidamente, células T CD4+ e CD8+ foram isoladas e cocultivadas. Dois dias mais tarde as células T foram transduzidas com o espaçador M de zetacina da IL-13 ou espaçador L de zetacina da IL-13. As células foram analisadas no final da estimulação (S1D13) para razões CD4:CD8, expressão de marcador, e a expressão de zetacina direta como coradas pelo anticorpo anti-IL-l3 (Figura 5B).
[00115] Células foram testadas em uma análise funcional in vitro (Figura 6). Células T direcionadas por zetacina da IL-13 foram submetidas a um ensaio de liberação de cromo para avaliar o grau de lise específica após a cultura com células alvo que expressam IL-l3Ra2. Neste ensaio estimulado, células T do dia quinze (S1D15) foram cocultivadas com diferentes linhagens de células alvo no efetor variável para razões alvo. Células K562-OKT3 foram utilizadas como um controle positivo para ativação de célula T conduzidas pelo complexo TCR enquanto todas as linhagens celulares restantes expressam IL-l3Ra2 em níveis variáveis (ver tabela do topo). A tabela inferior representa a razão de CD4 para CD8 das células T e positividade do marcador substituto. O ensaio foi realizado normalizando o total de células positivas de marcador substituto. Resultados demonstram que tanto o espaçador M quanto o espaçador L de zetacinas suscitaram a lise contra alvos positivos da IL-l3Ra2 Exemplo 5 - Atividade antitumoral in vivo de CARs de zetacina de IL13
[00116] Conforme mostrado na Figura 7, observou-se que o espaçador M e espaçador L de zetacinas da IL-13 inibem o crescimento tumoral em um modelo de glioblastoma (GBM). Células do Exemplo 4 e células S1D15, foram submetidas a um modelo de xenoenxerto tumoral ortotópico.
Neste modelo, células de tumor de glioblastoma U87 GFP:ffluc foram injetadas intracranialmente em camundongos NOD-Scid IL2yR-null. Sete dias depois, células T direcionadas por zetacina da IL-13 foram injetadas nas mesmas coordenadas que o tumor U87 GFP:ffluc. Foram observadas células T que expressam zetacina da IL-13 com espaçadores M e L para inibir o crescimento tumoral, como demonstrado pela redução na carga tumoral in vivo, como avaliado pelo fluxo emitido pelo tumor U87 expressando ffluc (Figura 7). Análise estatística das diferenças de delta fluxo 26 dias após a inoculação tumoral demonstrou que o espaçador M e o espaçador L inibiram significativamente o início do fluxo relativo às células T (sem zetacina da IL-13) simuladas.
Exemplo 6 - Análise in vitro de CARs de zetacina de IL13
[00117] Células T direcionadas por zetacina da IL-13 foram submetidas a um ensaio de liberação de cromo. Neste ensaio rapidamente expandido, células T do dia quatorze (SlRlDl4) foram cocultivadas com diferentes linhagens celulares alvo no efetor variável para as razões alvo.
K562-OKT3 foram utilizados como um controle positivo para ativação de célula T conduzidas pelo complexo TCR enquanto todas as linhagens celulares restantes expressam IL-l3Ra2 em níveis variáveis (ver tabela do topo). Células T simuladas não transduzidas para expressar qualquer uma das zetacinas foram incorporadas neste estudo como um controle negativo, demonstrando a lise específica da IL-l3Ra2. A tabela inferior representa a razão de CD4 para CD8 das células T e positividade do marcador substituído. O ensaio foi realizado normalizando o total de células positivas de marcador. Resultados demonstraram que tanto o espaçador M quanto o espaçador L de zetacinas suscitam a lise contra alvos positivos da IL13Ra2. (Figura 8)
[00118] Em outro estudo, células T que expressam zetacina da IL-13 foram cocultivadas por 24 horas com diferentes linhagens celulares alvo em uma razão efetora- alvo de 2:1. Dados demonstraram que zetacinas testadas foram capazes de suscitar a liberação de citocina após a ligação da IL-l3Ra2 de uma maneira específica para o alvo (Figura 9).
[00119] A Tabela 2 lista certas sequências de aminoácidos e nucleotídeos para modalidades fornecidas nesse documento.
Tabela 2 SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência SEQ ID IgG1 humana EPKSCDKTHTCPPCP NO:01 SEQ ID IgG2 humana ERKCCVECPPCP NO:02 SEQ ID IgG3 humana ELKTPLGDTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP NO:03 EPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP SEQ ID IgG4 humana ESKYGPPCPSCP NO:04 SEQ ID IgG4 humana ESKYGPPCPPCP NO:05 modificada SEQ ID IgG4 humana YGPPCPPCP NO:06 modificada SEQ ID IgG4 humana KYGPPCPPCP NO:07 modificada SEQ ID IgG4 humana EVVKYGPPCPPCP
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência NO:08 modificada SEQ ID Espaçador S ESKYGPPCPPCP NO:09 SEQ ID Espaçador M ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS NO:10 LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSLGK SEQ ID Espaçador L ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS NO:11 RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHN
HYTQKSLSLSLGK SEQ ID Sequência de GTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTA NO:12 vetores ACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTT incluindo: GCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTT zetacina de GTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTT IL13- TTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCG dobradiça de AACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAG IgG4-CH3- CTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGC CD28tm/4- ACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACG 1BB-zeta- CCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGA T2A-EGFRt GATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGA
ATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGG Zetacina de GGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATG IL13 está GGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCC sublinhada TGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAAT
ACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATC AGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAAC CCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGA CACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCA AAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGC TGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTA CCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACA TCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGT AAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGT GATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCAC CCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGG GGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGAC CATCAATGAGGAAGCTGCAGGCAAAGAGAAGAGTGG TGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTT TGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTA TGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCA GACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACA
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
ATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGT TGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGG CAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATC AACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAAC TCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGATCTACAAAT GGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGG GATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGA CATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACA AAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTA TTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGGGATCAAT TGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCG CTGCTTCGCGAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCG TCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGA GAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGC CTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGG GGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAA CGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACA GCTGGGCTAGCGTTTAAACGGGCCCTCTAGAGCCGC CACCATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTG TGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGG CCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGTACCTCAT TGAGGAGCTGGTCAACATCACCCAGAACCAGAAGGC TCCGCTCTGCAATGGCAGCATGGTATGGAGCATCAA CCTGACAGCTGGCATGTACTGTGCAGCCCTGGAATC CCTGATCAACGTGTCAGGCTGCAGTGCCATCGAGAA GACCCAGAGGATGCTGAGCGGATTCTGCCCGCACAA GGTCTCAGCTGGGCAGTTTTCCAGCTTGCATGTCCG AGACACCAAAATCGAGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGA CCTGCTCTTACATTTAAAGAAACTTTTTCGCGAGGG ACGGTTCAAGAATCTAAGTACCGGACCGCCCTGCCC CCCTTGCCCTGGCCAGCCTAGAGAACCCCAGGTGTA CACCCTGCCTCCCAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAA CCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA CCCCAGCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGG CCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGT GCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCCG GCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAA CGTCTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCA CAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCT GGGCAAGATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGAGG CGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTCACCGTGGC CTTCATCATCTTTTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAA ACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACC AGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTG CCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACT GCGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGC
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
CTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCT GAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGA TAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAA GCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAA CGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAG CGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAA GGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGC CACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGC CCTGCCCCCAAGGCTCGAGGGCGGCGGAGAGGGCAG AGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAA TCCCGGCCCTAGGATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCT TCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCT GATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGG TGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAA TATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGG CGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGA CTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGA ACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGG GTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGAC GGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACG CGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGC AGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACG CTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAAT TTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAAT AAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAA AACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTG CAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTC CCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTG CGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATG CGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAG GGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCA CCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTG CACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGC CCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTG CCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGT CTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCT GTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCC AGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGAT CCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCT CTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTT CATGTGAGCGGCCGCTCTAGACCCGGGCTGCAGGAA TTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGAT TACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAAC TATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCT TTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATG GCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTG CTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGG
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
CAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCA ACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAG CTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATT GCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGC TGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAAT TCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCT TGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGC GGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAAT CCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCT CTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAG ACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCAT CGATACCGTCGACTAGCCGTACCTTTAAGACCAATG ACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTA AAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCC CAAAGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCCTGTACTGGG TCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTC TCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAA TAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCC CGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTC AGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGA ATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGA GGGGGGGCCCGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCC AGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGG CGGCCACTCAAGTCTGGAGGGCACGTTAAAACCCGC TGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACC CTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAA AATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGT CATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGC AAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCT GGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGG TTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTG GGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAG TAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGAT GGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGAT GAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGC ACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTAT TCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCT CTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGC GCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTG CCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTAT CGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTG TGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGC TGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGT CATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCA TGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATC CGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATC
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
GCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTC TTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGG GGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGG CGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCC ATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAA ATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGC TGGGTGTGGCAGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGG CTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAAT GGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCG CTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTC TTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATT TCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCG GTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGG AAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTA AATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGACCAAAAT CCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGA CCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCC TTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAA AAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGA TCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGG CTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCT AGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTC TGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCT GTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTG TCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGA TAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTG CACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGA ACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGC CACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAG GGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAG TCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCG ATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATG GAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCC TGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTAC CGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCG AACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGC GGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAG GTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGC AATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCA GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTG TGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAA CAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATTAA CCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCG CGGTGGCGGCCTCGAGGTCGAGATCCGGTCGACCAG
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
CAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGC CCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCC ATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCG AGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAA AGCTTCGACGGTATCGATTGGCTCATGTCCAACATT ACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTA ATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCC ATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCC ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAAC GCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGA GTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCA AGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGT CAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCA GTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTA CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGAT GCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCG GTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCAT TGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCA ACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCC ATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGAATTC GGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGC
TGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTG SEQ ID Sequência de GTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTA NO:13 vetores ACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTT incluindo: GCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTT zetacina de GTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTT IL13- TTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCG dobradiça de AACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAG IgG4-CH3- CTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGC CD28tm/4- ACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACG 1BB-zeta- CCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGA T2A-EGFRt GATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGA
ATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGG Zetacina de GGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATG IL13 está GGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCC sublinhada TGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAAT
ACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATC AGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAAC CCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGA CACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCA AAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGC TGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTA CCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACA TCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGT
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
AAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGT GATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCAC CCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGG GGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGAC CATCAATGAGGAAGCTGCAGGCAAAGAGAAGAGTGG TGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTT TGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTA TGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCA GACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACA ATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGT TGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGG CAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATC AACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAAC TCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGATCTACAAAT GGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGG GATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGA CATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACA AAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTA TTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGGGATCAAT TGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCG CTGCTTCGCGAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCG TCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGA GAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGC CTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGG GGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAA CGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACA GCTGGGCTAGCGTTTAAACGGGCCCTCTAGAGCCGC CACCATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTG TGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGG CCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGTACCTCAT TGAGGAGCTGGTCAACATCACCCAGAACCAGAAGGC TCCGCTCTGCAATGGCAGCATGGTATGGAGCATCAA CCTGACAGCTGGCATGTACTGTGCAGCCCTGGAATC CCTGATCAACGTGTCAGGCTGCAGTGCCATCGAGAA GACCCAGAGGATGCTGAGCGGATTCTGCCCGCACAA GGTCTCAGCTGGGCAGTTTTCCAGCTTGCATGTCCG AGACACCAAAATCGAGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGA CCTGCTCTTACATTTAAAGAAACTTTTTCGCGAGGG ACGGTTCAAGAATCTAAGTACCGGACCGCCCTGCCC CCCTTGCCCTGGCCAGCCTAGAGAACCCCAGGTGTA CACCCTGCCTCCCAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAA CCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA CCCCAGCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGG CCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGT GCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCCG GCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAA
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
CGTCTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCA CAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCT GGGCAAGATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGAGG CGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTCACCGTGGC CTTCATCATCTTTTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAA ACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACC AGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTG CCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACT GCGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGC CTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCT GAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGA TAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAA GCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAA CGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAG CGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAA GGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGC CACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGC CCTGCCCCCAAGGCTCGAGGGCGGCGGAGAGGGCAG AGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAA TCCCGGCCCTAGGATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCT TCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCT GATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGG TGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAA TATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGG CGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGA CTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGA ACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGG GTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGAC GGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACG CGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGC AGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACG CTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAAT TTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAAT AAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAA AACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTG CAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTC CCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTG CGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATG CGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAG GGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCA CCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTG CACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGC CCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTG CCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGT CTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCT GTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCC AGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGAT
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
CCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCT CTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTT CATGTGAGCGGCCGCTCTAGACCCGGGCTGCAGGAA TTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGAT TACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAAC TATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCT TTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATG GCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTG CTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGG CAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCA ACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAG CTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATT GCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGC TGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAAT TCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCT TGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGC GGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAAT CCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCT CTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAG ACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCAT CGATACCGTCGACTAGCCGTACCTTTAAGACCAATG ACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTA AAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCC CAAAGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCCTGTACTGGG TCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTC TCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAA TAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCC CGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTC AGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGA ATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGA GGGGGGGCCCGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCC AGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGG CGGCCACTCAAGTCTGGAGGGCACGTTAAAACCCGC TGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACC CTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAA AATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGT CATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGC AAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCT GGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGG TTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTG GGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAG TAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGAT GGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGAT GAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGC ACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTAT TCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCT
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
CTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGC GCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTG CCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTAT CGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTG TGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGC TGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGT CATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCA TGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATC CGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATC GCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTC TTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGG GGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGG CGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCC ATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAA ATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGC TGGGTGTGGCAGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGG CTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAAT GGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCG CTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTC TTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATT TCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCG GTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGG AAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTA AATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGACCAAAAT CCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGA CCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCC TTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAA AAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGA TCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGG CTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCT AGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTC TGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCT GTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTG TCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGA TAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTG CACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGA ACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGC CACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAG GGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAG TCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCG ATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATG GAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCC TGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTAC CGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCG AACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGC
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
GGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAG GTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGC AATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCA GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTG TGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAA CAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATTAA CCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCG CGGTGGCGGCCTCGAGGTCGAGATCCGGTCGACCAG CAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGC CCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCC ATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCG AGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAA AGCTTCGACGGTATCGATTGGCTCATGTCCAACATT ACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTA ATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCC ATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCC ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAAC GCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGA GTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCA AGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGT CAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCA GTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTA CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGAT GCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCG GTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCAT TGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCA ACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCC ATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGAATTC GGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGC
TGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTG SEQ ID DHFRdm MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDFPWPPLRNESRYFQ NO:14 RMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPLKGRI
NLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELAN KVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFE SDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKYKF
EVYEKND SEQ ID DHFRdm ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCC NO:15 CAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCC
TGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAG AGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAG AATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCC ATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATT AATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCA
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
CAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGAT GCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAAT AAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCT GTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTT AAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAA AGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAA TATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCT GATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTT
GAAGTATATGAGAAGAATGATTAA SEQ ID Zetacina de ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAG NO:16 IL13 TTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGGCCCT
GTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGTACCTCATTGAG GAGCTGGTCAACATCACCCAGAACCAGAAGGCTCCG CTCTGCAATGGCAGCATGGTATGGAGCATCAACCTG ACAGCTGGCATGTACTGTGCAGCCCTGGAATCCCTG ATCAACGTGTCAGGCTGCAGTGCCATCGAGAAGACC CAGAGGATGCTGAGCGGATTCTGCCCGCACAAGGTC TCAGCTGGGCAGTTTTCCAGCTTGCATGTCCGAGAC ACCAAAATCGAGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGACCTG CTCTTACATTTAAAGAAACTTTTTCGCGAGGGACGG
TTCAAG SEQ ID Zetacina de MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPGPVPPSTALRYLIE NO:17 IL13 ELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESL
INVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRD
TKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFK SEQ ID CD28tm MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV NO:18 SEQ ID GMCSFss ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAG NO:19 Leader TTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCA SEQ ID CD28tm ATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGAGGCGTGCTG NO:20 GCCTGCTACAGCCTGCTGGTCACCGTGGCCTTCATC
ATCTTTTGGGTG SEQ ID 41-BB AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAA NO:21 CAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAG
GAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAA
GAAGGAGGATGTGAACTG SEQ ID CD3ζ CGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCC NO:22 TACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTG
AACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGAT AAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAG CCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAAC GAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGC GAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAG GGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCC
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência
ACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCC
CTGCCCCCAAGG SEQ ID T2A CTCGAGGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTA NO:23 ACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGG SEQ ID EGFRt CGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTT NO:24 AAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAA
CACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTC CACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTC ACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGAT ATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTG CTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTC CATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGG ACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTC AGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTC AAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGA AACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGG AAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAA ATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCC ACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAG GGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCT TGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGAC AAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTT GTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAG TGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGA CGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTAC ATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCA GGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAG TACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCAT CCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTT GAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCC ATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTG
CTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATG SEQ ID Espaçador S GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT NO:25 SEQ ID Espaçador M GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT NO:26 GGCCAGCCTAGAGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCT
CCCAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGAT ATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAG AACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGC GACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCCGGCTGACCGTG GACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCAGC TGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTAC
ACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAG SEQ ID Espaçador L ATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCTGC
SEQ ID NO: Elemento(s) Sequência NO:27 CCCCGAGTTCGACGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTT
CCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCG GACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGT GGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCC CAGAGAGGAACAGTTCCAGAGCACCTACCGGGTGGT GTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAA CGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGG CCTGCCCAGCAGCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGC CAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCTCCCTCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGT GTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAG CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCC TGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGA CAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGAC CGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTT TAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCA CTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAA G
[00120] O termo “compreendendo”, conforme utilizado nesse documento, é sinônimo de "incluindo”, “contendo” ou “distinguido por” e é inclusivo ou em aberto e não exclui elementos ou etapas de métodos adicionais, não solicitados.
[00121] A descrição acima revela diversos métodos e materiais da presente invenção. Esta invenção é suscetível a modificações nos métodos e materiais, bem como alterações nos equipamentos e métodos de fabricação. Tais modificações tornar-se-ão evidentes para aqueles versados na técnica a partir de uma consideração desta descrição ou prática da invenção apresentada nesse documento. Consequentemente, não se pretende que esta invenção seja limitada às modalidades específicas descritas nesse documento, mas que cubram todas as modificações e alternativas que se enquadrem dentro do verdadeiro escopo e espírito da invenção.
[00122] Todas as referências citadas nesse documento, incluindo, mas não limitadas a pedidos publicados e não publicados, patentes e referências de literatura, são incorporadas nesse documento por referência em sua totalidade e são aqui feitas como parte deste relatório descritivo. Para a extensão de publicações e patentes ou pedidos de patente incorporados por referência contradizendo a revelação contida no relatório descritivo, pretende-se que o relatório descritivo substitui e/ou tem precedência sobre qualquer tal material contraditório.

Claims (57)

REIVINDICAÇÕES
1. Ácido nucleico que codifica um receptor de zetacina direcionado por muteína da IL-13 afixada à membrana, o receptor de zetacina caracterizado pelo fato de que compreende: um domínio extracelular compreendendo uma muteína da IL-13 e um espaçador; um domínio transmembranar; e uma região de sinalização intracelular, em que o espaçador é interposto entre a muteína e o domínio transmembranar.
2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a muteína da IL-13 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
3. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a muteína da IL-13 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
4. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o espaçador é um espaçador de peptídeo.
5. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4 (S)
espaçador de dobradiça de IgG4-CH3 (M) ou espaçador de dobradiça de IgG4-CH2-CH3 (L).
6. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4-CH3 (M).
7. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4-CH2-CH3 (L).
8. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
9. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende a, consiste na, ou consiste essencialmente na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
10.
10. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
11. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende a, consiste na, ou consiste essencialmente na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11.
12. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar de CD28 (CD28tm).
13. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende a totalidade ou uma porção de um domínio de CD3 zeta em combinação com um domínio coestimulador selecionado do grupo que consiste em CD27, CD28, 4-1BB, OX-40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, NKG2C, e B7-H3 ou uma combinação dos mesmos.
14. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização intracelular compreende uma porção funcional de sinalização de um domínio de CD3 zeta e uma porção funcional coestimuladora de um domínio de 4-1BB.
15. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma sequência que codifica um marcador.
16. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o marcador compreende uma forma truncada de um receptor de superfície celular, opcionalmente EGFRt.
17. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um transgene de di-hidrofolato redutase configurado para seleção de metotrexato.
18. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o transgene de di-hidrofolato redutase é um duplo mutante de di-hidrofolato redutase (DHFRdm).
19. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o mutante duplo de di- hidrofolato redutase compreende mutações de aminoácidos de L22F e F31S.
20. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma sequência que codifica uma sequência de salto ribossomal.
21. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a sequência de salto ribossomal compreende P2A ou T2A.
22. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
23. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral.
24. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor lentiviral ou adenoviral.
25. Polipeptídeo receptor quimérico, caracterizado pelo fato de ser codificado pelo ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
26. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
27. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula T ou um precursor de uma célula T.
28. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de linfócito T citotóxica CD8+ selecionada do grupo que consiste em células T CD8+ naïve, células T CD8+ de memória central, células T CD8+ de memória efetora e células T CD8+ em massa.
29. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a célula T citotóxica CD8+ é uma célula T de memória central e, em que a célula T de memória central é positiva para CD45RO+, CD62L+, e CD8+.
30. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de linfócito T auxiliar CD4 + selecionada do grupo que consiste em células T CD4 + naïve, células T CD4 + de memória central, células T CD4+ de memória efetora e células T CD4+ em massa.
31. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a célula de linfócito auxiliar CD4+ é uma célula T CD4+ naïve e, em que a célula T CD4+ naïve é positiva para CD45RA+, CD62L+ e CD4+ e negativa para CD45RO.
32. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 31, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula T precursora.
33. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 32, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula-tronco hematopoiética.
34. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 26 a 32, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
35. Método para preparar uma célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 26 a 32, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 em um linfócito; cultivar o linfócito na presença de anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28 e pelo menos uma citocina homeostática; e selecionar o linfócito com um reagente de seleção, em que o reagente de seleção é configurado para enriquecer seletivamente as células transduzidas com o ácido nucleico ou vetor.
36. Método para preparar uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 em um linfócito; cultivar o linfócito na presença de anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28 e pelo menos uma citocina homeostática; e selecionar o linfócito com um reagente de seleção, em que o reagente de seleção é configurado para enriquecer seletivamente as células transduzidas com o ácido nucleico ou vetor.
37. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o reagente de seleção é metotrexato.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, caracterizado pelo fato de que o linfócito tem um fenótipo CD45RA-, CD45RO+ e CD62L+.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de que o linfócito é CD8+ ou CD4+.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 39, caracterizado pelo fato de que a citocina é IL-15, IL-7 e/ou IL-21.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 40, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a introdução de um segundo ácido nucleico na célula hospedeira, o segundo ácido nucleico que codifica uma proteína marcadora.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a proteína marcadora é EGFRt.
43. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 32, caracterizado pelo fato de ser para uso em um medicamento ou para uso no tratamento ou na inibição de um câncer ou tumor sólido que expressa um receptor da IL-13 2 (IL-13Ra2).
44. Uso, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer cerebral.
45. Uso, de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o câncer é uma malignidade positiva para IL-13R .
46. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizado pelo fato de que o câncer é um tumor de glioblastoma.
47. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizado pelo fato de que o câncer é glioblastoma multiforme (GBM).
48. Método para tratar, inibir ou melhorar um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 26 a 32, ao indivíduo em necessidade da mesma.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o câncer é uma malignidade positiva para IL13R .
50. Método, de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer cerebral.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizado pelo fato de que o câncer é um tumor de glioma ou glioblastoma.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 51, caracterizado pelo fato de que o câncer é um glioma.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 51, caracterizado pelo fato de que o câncer é glioblastoma multiforme (GBM).
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 53, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a administração de uma terapia adicional selecionada de quimioterapia e radioterapia.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o fármaco quimioterápico compreende eletoquimioterapia, agente alquilante, antimetabólito (por exemplo, 5-fluorouracila (5-FU), 6- mercaptopurina (6-MP), Capecitabina (Xeloda®), Cladribina, Clofarabina, Citarabina (Ara-C®), Floxuridina, Fludarabina, Gemcitabina (Gemzar®), Hidroxiureia, Metotrexato, Pemetrexede (Alimta®), Pentostatina e Tioguanina), antibiótico antitumoral, inibidor da topoisomerase, inibidor mitótico, corticosteroide, agente intercalante do DNA, ou inibidor de ponto de verificação (ponto de verificação quinase CHK1, CHK2).
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 55, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é mamífero.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2024041650A1 (en) * 2022-08-25 2024-02-29 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric antigen receptors targeting interleukin 13 receptor subunit alpha 2 and methods of use thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090257994A1 (en) * 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US20090098142A1 (en) * 2004-06-09 2009-04-16 Kasaian Marion T Methods and compositions for treating and monitoring treatment of IL-13-associated disorders
PT3006459T (pt) * 2008-08-26 2021-11-26 Hope City Método e composições para funcionamento melhorado de efetores antitumorais de células t
SI2496698T1 (sl) 2009-11-03 2019-07-31 City Of Hope Skrajšan epiderimalni receptor faktorja rasti (EGFRt) za selekcijo transduciranih T celic
CN105408473B9 (zh) 2013-05-14 2021-09-17 得克萨斯州大学系统董事会 工程化嵌合抗原受体(car)t细胞的人应用
IL308324A (en) * 2014-09-19 2024-01-01 Hope City IL13RA2-targeted chimeric antigen receptor T cells
US11747346B2 (en) * 2015-09-03 2023-09-05 Novartis Ag Biomarkers predictive of cytokine release syndrome
KR20180105709A (ko) * 2016-02-05 2018-09-28 시티 오브 호프 중추 신경계의 암의 치료를 위한 조작된 t 세포의 투여
MX2019001185A (es) * 2016-07-29 2019-10-21 Juno Therapeutics Inc Polipeptidos inmunomoduladores y composiciones y metodos relacionados.
CN109963590B (zh) 2016-09-02 2024-03-15 加利福尼亚大学董事会 涉及白介素-6受体α结合单链可变片段的方法和组合物

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