JP7314161B2 - ゼータカインにより指向性を付与したIL-13受容体α2標的T細胞免疫療法 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年3月14日に出願された「ゼータカインにより指向性を付与したIL-13受容体α2標的T細胞免疫療法」という名称の米国仮出願第62/643139号の優先権の利益を主張するものであり、この出願は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI179WOSEQLISTのファイル名で2019年3月12日に作成された約35kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、参照によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
該受容体ゼータカインが、
IL-13のムテインとスペーサーを含む細胞外ドメイン;
膜貫通ドメイン;および
細胞内シグナル伝達領域
を含み、
前記スペーサーが、前記ムテインと前記膜貫通ドメインの間に位置すること
を特徴とする核酸を含む。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによる核酸をリンパ球に導入する工程;
抗CD3抗体および/または抗CD28抗体ならびに少なくとも1種の恒常性サイトカインの存在下で前記リンパ球を培養する工程;ならびに
前記核酸または該核酸を含むベクターで形質導入した細胞を選択的に濃縮できるように構成された選択試薬で前記リンパ球を選択する工程
を含む方法を含む。
本明細書において「核酸」または「核酸分子」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ポリヌクレオチドが挙げられ、たとえば、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得られる断片、およびライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用またはエキソヌクレアーゼ作用により得られる断片などが挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー(DNA、RNAなど)、または天然のヌクレオチドの類似体(たとえば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー)からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンまたはアジド基による1つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖または炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)結合、ホスホロアニリデート(phosphoranilidate)結合、ホスホロアミデート結合などが挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。いくつかの実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列を提供する。いくつかの実施形態において、前記核酸はRNAまたはDNAである。
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、細胞膜結合型IL-13ムテインにより指向性を付与した受容体であるゼータカインをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、
a)細胞外ドメインをコードする第1のポリヌクレオチド;
b)IL-13のムテインをコードする第2のポリヌクレオチド;
c)膜貫通ドメインをコードする第3のポリヌクレオチド;および
d)細胞内シグナル伝達ドメインをコードする第4のポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態において、前記核酸は、マーカーポリペプチド(たとえばEGFRtなど)をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、選択マーカー(たとえばDHFRdmなど)をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸はリボソームスキップ配列を含む。
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、本発明の実施形態のいずれかによる核酸または本発明の実施形態のいずれかによるベクターによってコードされるキメラ受容体ポリペプチドを含む。本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、本発明の実施形態のいずれかによる核酸または本発明の実施形態のいずれかによるベクターによってコードされる、細胞膜結合型IL13ムテインにより指向性を付与した受容体であるゼータカインを含む。
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、本発明の実施形態のいずれかによる核酸または本発明の実施形態のいずれかによる発現ベクターを含む宿主細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、遺伝子組換え細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ナイーブCD8+T細胞、セントラルメモリーCD8+T細胞、エフェクターメモリーCD8+T細胞およびバルクCD8+T細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Tリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記CD8+細胞傷害性Tリンパ球は、セントラルメモリーT細胞であり、該セントラルメモリーT細胞は、CD45RO+、CD62L+およびCD8+である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ナイーブCD4+T細胞、セントラルメモリーCD4+T細胞、エフェクターメモリーCD4+T細胞およびバルクCD4+T細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーTリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記CD4+ヘルパーリンパ球は、ナイーブCD4+T細胞であり、該ナイーブCD4+T細胞は、CD45RA+、CD62L+およびCD4+であり、かつCD45RO-である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は前駆T細胞である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、本発明の実施形態のいずれかによる宿主細胞と薬学的に許容される添加剤を含む組成物を含む。
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、本発明の実施形態のいずれかによる宿主細胞を作製する方法を含む。このような実施形態のいくつかは、
a)本発明の実施形態のいずれかによる核酸または本発明の実施形態のいずれかによる発現ベクターをリンパ球に導入する工程;
b)抗CD3抗体または抗CD28抗体および少なくとも1種の恒常性サイトカインの存在下で、前記リンパ球を培養する工程;ならびに
c)前記核酸または前記ベクターで形質導入した細胞を選択的に濃縮できるように構成された選択試薬で前記リンパ球を選択する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記選択試薬はメトトレキサートである。いくつかの実施形態において、前記リンパ球は、CD45RA-、CD45RO+もしくはCD62L+の表現型、またはこれらの任意の組み合わせを有する。いくつかの実施形態において、前記リンパ球は、CD8+またはCD4+である。いくつかの実施形態において、前記サイトカインは、IL-15、IL-7もしくはIL-21またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記方法は、マーカータンパク質をコードする第2の核酸を前記宿主細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記マーカータンパク質はEGFRtである。いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、本発明の実施形態のいずれかによる核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、治療方法における本発明の宿主細胞の使用を含む。このような実施形態のいくつかは、IL-13受容体α2(IL-13Ra2)を発現するがんまたは固形腫瘍の治療、抑制または緩和における細胞の使用を含む。いくつかの実施形態において、前記がんは神経膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記がんは多形膠芽腫(GBM)である。いくつかの実施形態において、前記がんはIL-13Rα陽性悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記がんは脳がんまたは脳腫瘍である。
スペーサー領域が異なる様々なIL-13(E13Y)ゼータカインCARを構築した。図1に示すように、IL-13(E13Y)ゼータカインCARをコードする核酸は、リーダー配列(EF1p);IL-13のムテイン(E13Y)をコードするポリヌクレオチド;3種のスペーサーのうちのいずれか1つをコードするポリヌクレオチド;CD28tm膜貫通配列をコードするポリヌクレオチド;および第1シグナル伝達ドメインである4-1BBドメインと共刺激ドメインであるCD3ζドメインを含むシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含んでいた。前記3種のスペーサーは、改変IgG4ヒンジを含む短い「S」スペーサー;改変IgG4ヒンジと免疫グロブリンのCH3領域(IgG4ヒンジ-CH3)を含む中程度の長さの「M」スペーサー;および改変IgG4ヒンジと免疫グロブリンのCH2ドメインと免疫グロブリンのCH3ドメイン(IgG4ヒンジ-CH2-CH3)を含む長い「L」スペーサーであった。Lスペーサーは、CH2ドメインに2つの変異(L235D、N297Q)を含んでおり、これらの変異によって、CARとFc受容体(FcR)が相互作用して望ましくない作用が起こる可能性を低減することができる。さらに、CARは、自己切断型リボソームスキップ配列2Aペプチド(T2A)を含んでいた。いくつかの構築物において、lentivectorは、メトトレキサートにより選択できるように構成されたジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体(DHFRdm)をコードする導入遺伝子をさらに含んでいる。IL-13のムテインを配列番号16に示す。IL-13のムテインの配列の一例は、Kahlonらによる文献(Kahlon KS et al., Cancer Res. 2004;この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される)に記載されている。本明細書で述べるように、E13Y変異により、IL-13Rα2に対する選択的な結合性が向上した。
図2Aに示した方法に従って、CARが異なる様々なT細胞を作製した。まず、マイクロビーズを使用して、末梢血単核細胞(PBMC)からCD8+T細胞を選択した。選択した細胞をCD3/CD28マイクロビーズで刺激した後、レンチウイルスを使用して前記構築物を形質導入した。いくつかの反復実験(*)では、EGFRtの下流にインフレームに挿入したT2A-DHFRdmをさらに含む構築物を前記CD8 T細胞に形質導入してT2A-DHFRdmを共発現させ、機能的意義のある量でIL13ゼータカインCARを共発現しているMTX耐性T細胞の選択を可能とした。次に、細胞をフローサイトメトリー染色してゼータカインCARを発現している細胞を同定し、さらにEGFRtマーカーを使用して細胞を選択した。図2Bに示す代表的なフローサイトメトリーデータから、CD8+T細胞が効率的に選択され、次いで、サロゲートマーカー(EGFRt)の発現を利用することにより、ほぼ純粋なIL13ゼータカインCAR発現CD8+T細胞を濃縮または選択することができたことが示された(*)。
MスペーサーまたはLスペーサーを含むIL13ゼータカインCARのインビボにおける抗腫瘍活性を試験した。0日目に、ffLucで標識したU87神経膠芽腫細胞(0.2×106個)をNSGマウスの前脳に頭蓋内注射した。7日目に、中程度の長さのスペーサーまたは長いスペーサーを含む第2世代IL13ゼータカインCARを形質導入したCD8+T細胞を様々な投与量(2×106個または1×106個)でマウス(1群あたりn=5)に投与するか、Mock T細胞をマウスに投与した。
図5Aに示した方法と実質的に同様の方法で、MスペーサーまたはLスペーサーを有するIL13ゼータカインCARを含む細胞を作製した。簡潔に述べると、CD4+T細胞およびCD8+T細胞を単離し、共培養した。2日後、Mスペーサーを有するIL-13ゼータカインまたはLスペーサーを有するIL-13ゼータカインをこれらのT細胞に形質導入した。刺激の終了後(S1D13)、CD4:CD8の比率、マーカーの発現、抗IL-13抗体を使用した染色によるゼータカインの直接発現について細胞を分析した(図5B)。
図7に示すように、Mスペーサーを有するIL-13ゼータカインおよびLスペーサーを有するIL-13ゼータカインは、神経膠芽腫(GBM)モデルにおいて、腫瘍の増殖を抑制することが観察された。実施例4で作製した細胞および刺激した15日目(S1D15)の細胞を、同所性異種移植片腫瘍モデルにおいて試験した。このモデルは、GFP:ffluc発現U87神経膠芽腫細胞をNOD-Scid IL2yR-nullマウスに頭蓋内注射することにより作製した。7日後、IL-13ゼータカインにより指向性を付与したT細胞を、GFP:ffluc発現U87腫瘍と同側に注射した。ffluc発現U87腫瘍から生じた流束を評価したところ、MスペーサーまたはLスペーサーを有するIL-13ゼータカイン発現T細胞によりインビボでの腫瘍負荷が減少したことが示されたことから、これらのIL-13ゼータカイン発現T細胞が腫瘍の増殖を抑制することが観察された(図7)。腫瘍の接種から26日後の流束の変化量を統計分析したところ、MスペーサーまたはLスペーサーを有するIL-13ゼータカイン発現T細胞は、(IL-13ゼータカインを含まない)Mock T細胞と比べて流束の発生を有意に抑制したことが示された。
IL-13ゼータカインにより指向性を付与したT細胞を、クロム放出アッセイで分析した。このアッセイでは、急速培養した14日目(S1R1D14)のT細胞を様々な標的細胞株と共培養し、この際、エフェクター細胞と標的細胞の比率を様々に変えた。K562-OKT3細胞は、TCR複合体の誘導によりT細胞を活性化させたポジティブコントロールとして使用し、これ以外の細胞株は、様々な程度でIL-13Ra2を発現するものであった(上部の表を参照されたい)。IL-13Ra2に特異的な溶解を実証するため、ゼータカインの発現のための形質導入を行っていないMock T細胞をネガティブコントロールとしてこの試験に組み込んだ。下部の表は、T細胞におけるCD4とCD8の比率、およびサロゲートマーカーの陽性率を示す。アッセイは、マーカー陽性細胞の総数を正規化することによって行った。試験の結果、Mスペーサーを有するゼータカインおよびLスペーサーを有するゼータカインのいずれでも、IL-13Ra2陽性標的細胞に対する溶解が誘導されたことが示された(図8)。
Claims (47)
- IL-13ムテインにより指向性を付与した受容体であるゼータカイン(zetakine)をコードする核酸であって、
該受容体ゼータカインが、
IL-13のムテインを含む細胞外ドメイン;
スペーサー;
膜貫通ドメイン;および
細胞内シグナル伝達領域
を含み、
前記スペーサーが、119アミノ酸長からなり、かつ配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むIgG4ヒンジ-CH3からなり、
前記スペーサーが、前記ムテインを前記膜貫通ドメインに連結し、前記膜貫通ドメインが、前記スペーサーを前記細胞内シグナル伝達領域に連結する、
核酸。 - 前記ムテインが、配列番号17に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記ムテインが、配列番号17に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の核酸。
- 前記膜貫通ドメインが、CD28膜貫通ドメインを含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記細胞内シグナル伝達領域が、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C、B7-H3およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、CD3ζドメインの全体またはその一部との組み合わせを含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記細胞内シグナル伝達領域が、CD3ζドメインの一部と、4-1BBドメインの共刺激部分を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の核酸。
- マーカータンパク質をコードする配列をさらに含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記マーカータンパク質が、末端切断型の上皮成長因子受容体またはジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)を含む、請求項7に記載の核酸。
- 前記DHFRが、DHFRの二重変異体(DHFRdm)である、請求項8に記載の核酸。
- 前記DHFRdmが、L22Fアミノ酸変異およびF31Sアミノ酸変異を含む、請求項9に記載の核酸。
- リボソームスキップ配列をさらに含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記リボソームスキップ配列が、P2AまたはT2Aを含む、請求項11に記載の核酸。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- ウイルスベクターである、請求項13に記載の発現ベクター。
- レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項13または14に記載の発現ベクター。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の核酸によってコードされるIL-13ムテインにより指向性を付与した受容体であるゼータカイン。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の核酸を含む細胞。
- リンパ球である、請求項17に記載の細胞。
- 前記リンパ球が、CD45RA-、CD45RO+およびCD62L+の表現型を有する、請求項18に記載の細胞。
- ナイーブCD8+T細胞、セントラルメモリーCD8+T細胞、エフェクターメモリーCD8+T細胞またはCD45RO+CD62L+CD8+T細胞である、請求項17~19のいずれか一項に記載の細胞。
- ナイーブCD4+T細胞、セントラルメモリーCD4+T細胞、エフェクターメモリーCD4+T細胞またはCD45RA+CD62L+CD4+CD45RO-T細胞である、請求項17~19のいずれか一項に記載の細胞。
- 前駆T細胞である、請求項17に記載の細胞。
- 前記前駆T細胞が、造血幹細胞である、請求項22に記載の細胞。
- 請求項17~23のいずれか1項に記載の細胞と薬学的に許容されるキャリアを含む組成物。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の核酸を含む遺伝子操作された細胞を作製する方法であって、
遺伝子操作された細胞を産生するために請求項1~12のいずれか1項に記載の核酸を細胞に導入する工程;
抗CD3抗体および/または抗CD28抗体ならびに少なくとも1種の恒常性サイトカインの存在下で前記遺伝子操作された細胞を培養する工程;ならびに
培養後の前記遺伝子操作された細胞を濃縮するする工程
を含む方法。 - 前記核酸が、マーカータンパク質をコードする配列をさらに含み、前記濃縮する工程が、マーカータンパク質の発現を選択する試薬と培養後の前記遺伝子操作された細胞を培養する工程を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記細胞がリンパ球である、請求項25または26に記載の方法。
- 前記リンパ球が、CD45RA-、CD45RO+およびCD62L+の表現型を有する、請求項27に記載の方法。
- 前記細胞が、ナイーブCD8+T細胞、セントラルメモリーCD8+T細胞、エフェクターメモリーCD8+T細胞またはCD45RO+CD62L+CD8+T細胞である、請求項25~28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、ナイーブCD4+T細胞、セントラルメモリーCD4+T細胞、エフェクターメモリーCD4+T細胞またはCD45RA+CD62L+CD4+CD45RO-T細胞である、請求項25~28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が前駆T細胞である、請求項25または26に記載の方法。
- 前記前駆T細胞が、造血幹細胞である、請求項31に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の恒常性サイトカインが、IL-15、IL-7、IL-21またはこれらの組み合わせである、請求項25~32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マーカータンパク質が、末端切断型の上皮成長因子受容体である、請求項26~33のいずれか一項に記載の方法。
- IL-13受容体α2(IL-13Ra2)を発現するがんの治療または抑制用の医薬品の製造における、請求項17~23のいずれか1項に記載の細胞の使用。
- 前記がんが脳がんを含む、請求項35に記載の使用。
- 前記脳がんが神経膠腫、神経膠芽腫または多形膠芽腫である、請求項36に記載の使用。
- 前記がんがIL-13Rα陽性の悪性腫瘍である、請求項35~37のいずれか一項に記載の使用。
- がんの治療用である、請求項24に記載の組成物。
- 前記がんがIL13Rα陽性の悪性腫瘍である、請求項39に記載の組成物。
- 前記がんが脳がんを含む、請求項39または40に記載の組成物。
- 前記脳がんが、神経膠腫、神経膠芽腫または多形膠芽腫である、請求項41に記載の組成物。
- 化学療法および放射線療法から選択される療法を受けている対象への投与用である、請求項39~42のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記化学療法が、電気化学療法、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、分裂阻害薬、コルチコステロイド、DNAインターカレーター、チェックポイント阻害薬またはこれらの組み合わせを含む、請求項43に記載の組成物。
- 前記化学療法が、5-フルオロウラシル(5-FU)、6-メルカプトプリン(6-MP)、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、ペメトレキセド、ペントスタチン、チオグアニンまたはこれらの組み合わせを含む、請求項43に記載の組成物。
- 哺乳動物への投与用である、請求項43~45のいずれか1項に記載の組成物。
- ヒトへの投与用である、請求項43~46のいずれか1項に記載の組成物。
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