BR112020017935A2 - composições de anticorpo anti-pd-1 - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se de forma geral ao campo de formulações farmacêuticas de anticorpos. Especificamente, a presente invenção refere-se a uma formulação com alta concentração de anticorpo e seu uso e preparação farmacêutica. Esta invenção é exemplificada por uma formulação de um anticorpo anti-PD-1.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COM- POSIÇÕES DE ANTICORPO ANTI-PD-1”.

CAMPO

[1] A presente invenção refere-se ao campo de formulações farmacêuticas de anticorpos. Especificamente, a presente invenção refere-se a uma formulação de anticorpo anti-PD-1 e seu uso e prepa- ração farmacêutica.

FUNDAMENTO

[2] A terapêutica de anticorpos é tipicamente administrada em uma base regular e geralmente envolve várias doses de mg/kg por in- jeção. A administração parenteral é uma via comum de administração de anticorpo terapêutico. Formulações com concentração relativamen- te alta de anticorpo são desejáveis para administração parenteral, a fim de minimizar o volume de cada dose.

[3] O desenvolvimento de formulações de proteína altamente concentradas pode ser um desafio devido a questões relacionadas à estabilidade física e química da proteína, fabricação, armazenamento e entrega da formulação de proteína. O aumento da viscosidade de formulações de anticorpo pode causar problemas desde a fabricação do medicamento até a sua entrega ao paciente. Várias tentativas têm sido feitas para estudar o efeito de agentes redutores de viscosidade em formulações contendo proteína aquosas altamente concentradas.

[4] Foi demonstrado que o anticorpo anti-PD-1 é útil no trata- mento de distúrbios hiperproliferativos, incluindo câncer tipo 1. Há uma necessidade de uma preparação de anticorpo de alta concentração, estável de um anticorpo anti-PD-1 com viscosidade adequada para atender às necessidades médicas de pacientes que sofrem de condi- ções mediadas por PD-1, tais como câncer.

SUMÁRIO

[5] Composições compreendendo um anticorpo anti-PD-1 e excipientes capazes de reduzir a viscosidade de uma formulação compreendendo o anticorpo são fornecidos. Demonstra-se que deter- minadas formulações são eficazes para reduzir a viscosidade. Vanta- josamente, as composições providas neste documento demonstram comportamento de viscosidade adequado para alcançar concentra- ções superiores a 100 mg/ml para um produto de droga a ser usado para tratamento terapêutico.

[6] São providas neste documento composições farmacêuticas que suportam altas concentrações de anticorpo bioativo em solução e são adequadas para administração parenteral, incluindo injeção sub- cutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou intradérmica. As composições compreendem um anticorpo anti-PD-1, um dissacarí- deo, um tampão, um agente quelante e um polissorbato. Em algumas modalidades, o pH da composição pode ser entre cerca de 4,5 e 5,5. Em algumas modalidades, a composição preferencialmente tem uma viscosidade entre cerca de 1 centiPoise (cP) e cerca de 20 cP. Em al- gumas modalidades, a vida de administração preferida é injeção sub- cutânea.

[7] Em algumas modalidades, a composição pode compreen- der ou consistir essencialmente entre cerca de 100 mg/ml a cerca de 200 mg/ml de anticorpo anti-PD-1, um dissacarídeo, um tampão, um agente quelante, e um polissorbato, e tem um pH de cerca de 4,5 a cerca de 5,5. Em algumas modalidades, a composição pode consistir essencialmente em cerca de 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1, um dissacarídeo, um tampão, um agente quelante, e um polissorbato, e tem um pH de cerca de cerca de 5,0.

[8] Em algumas modalidades, a composição não compreende um antioxidante. Em algumas modalidades, a composição não com- preende metionina, tal como, por exemplo, sem limitação, L-metionina, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas moda-

lidades, a composição não compreende arginina.

[9] Em algumas modalidades, a composição pode ter uma vis- cosidade inferior a cerca de 50 cP, inferior a cerca de 40 cP, inferior a cerca de 30 cP, ou inferior a cerca de 20 cP a 20ºC. Em algumas mo- dalidades, a composição pode ter uma viscosidade de cerca de 5 a cerca de 50 cP a 20ºC. Em algumas modalidades, a composição pode ter uma viscosidade de cerca de 5 a cerca de 40 cP a 20ºC. Em algu- mas modalidades, a composição pode ter uma viscosidade de cerca de 5 a cerca de 30 cP a 20ºC. Em algumas modalidades, a composi- ção pode ter uma viscosidade de cerca de 5 a cerca de 20 cP a 20ºC. Em algumas modalidades, a composição pode ter uma viscosidade de cerca de 10 a cerca de 20 cP a 20ºC. Em algumas modalidades, a composição pode ter uma viscosidade de cerca de 14 a cerca de 16 cP a 20ºC. Em algumas modalidades, a composição pode ter uma vis- cosidade de cerca de 14 cP a 20ºC.

[10] Em algumas modalidades, a concentração de polissorbato pode ser de cerca de 0,01 a cerca de 0,3 mg/ml. Em algumas modali- dades, a concentração de polissorbato é cerca de 0,2 mg/ml. Em al- gumas modalidades, o polissorbato é polissorbato 80.

[11] Em algumas modalidades, o dissacarídeo pode ser trealo- se. Em algumas modalidades, a trealose é di-hidrato de trealose. Em algumas modalidades, a concentração de trealose pode ser cerca de 1 mg/ml a cerca de 100 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentra- ção de trealose é cerca de 84 mg/ml. Em outras modalidades, a con- centração de trealose é cerca de 50 mg/ml.

[12] Em outras modalidades, o agente de dissacarídeo pode ser sacarose. Em algumas modalidades, a concentração de sacarose po- de ser cerca de 1 mg/ml a cerca de 100 mg/ml. Em algumas modali- dades, a concentração de sacarose é cerca de 50 mg/ml.

[13] Em algumas modalidades, o tampão pode ser tampão de histidina. Em algumas modalidades, a concentração de tampão de his- tidina pode ser de cerca de 1,0 a cerca de 30 mM. Em algumas moda- lidades, a concentração de tampão de histidina é cerca de 20 mM de histidina.

[14] Em outras modalidades, o tampão pode ser tampão de ace- tato. Em algumas modalidades, a concentração de tampão de acetato pode ser de cerca de 1,0 a cerca de 30 mM. Em algumas modalida- des, a concentração de tampão de acetato é cerca de 20 mM de ace- tato.

[15] Em algumas modalidades, o agente quelante pode ser EDTA, incluindo, por exemplo, sem limitação EDTA dissódico e di- hidrato de EDTA dissódico. Em algumas modalidades, a concentração de EDTA pode ser de cerca de 0,01 a cerca de 0,3 mg/ml. Em algu- mas modalidades, a concentração de EDTA pode ser de cerca de 0,01mg/ml, cerca de 0,05 mg/ml, cerca de 0,1 mg/ml, cerca de 0,15 mg/ml, cerca de 0,2 mg/ml, cerca de 0,25 mg/ml ou cerca de 0,3 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de EDTA é cerca de 0,04, cerca de 0,045 ou cerca de 0,05 mg/ml.

[16] Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo po- de ser entre cerca de 100 mg/ml a cerca de 150 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo pode ser cerca de 130 mg/ml, cerca de 135 mg/ml e cerca de 140 mg/ml. Em algumas moda- lidades, a concentração de anticorpo é cerca de 150 mg/ml. Em algu- mas modalidades, a concentração de anticorpo é cerca de 120 mg/ml.

[17] Em algumas modalidades, a composição pode ainda com- preender arginina. Em algumas modalidades, a concentração de argi- nina é é entre cerca de 25mM a cerca de 300mM, preferencialmente cerca de 50 mM, cerca de 100 mM, cerca de 150 mM, cerca de 200 mM ou cerca de 250 mM.

[18] Em algumas modalidades, a composição pode ainda com-

preender prolina. Em algumas modalidades, a concentração de prolina é entre cerca de 25mM a cerca de 300mM, preferencialmente cerca de 100 mM ou cerca de 200 mM.

[19] Em algumas modalidades, a composição consiste essenci- almente em cerca de 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1; cerca de 20 mM de tampão de histidina; cerca de 84 mg/ml de di-hidrato de trealo- se; cerca de 0,2 mg/ml de PS80; e cerca de 0,05 mg/ml de EDTA. Em algumas modalidades, a composição tem um pH de 5,0 +/- 0,5.

[20] Em algumas modalidades, a composição consiste essenci- almente em cerca de 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1; cerca de 20 mM de tampão de histidina; cerca de 100 M de HCL de arginina, cerca de 50 mg/ml de di-hidrato de trealose; cerca de 0,2 mg/ml de PS80; e cerca de 0,05 mg/ml de EDTA. Em algumas modalidades, a composi- ção tem um pH de 5,0 +/- 0,5 e uma viscosidade de cerca de 10 cP a cerca de 16 cP a 20C. Em algumas modalidades, a composição tem uma viscosidade de cerca de 15 cP a 20C.

[21] Em algumas modalidades, a composição consiste essenci- almente em cerca de 100 mg/ml, cerca de 110 mg/ml, cerca de 120 mg/ml, cerca de 130 mg/ml, cerca de 140 mg/ml, cerca de 145 mg/ml, cerca de 148 mg/ml, cerca de 149 mg/ml, cerca de 150 mg/ml, cerca de 151 mg/ml ou cerca de 152 mg/ml de um anticorpo, cerca de 20 mM de tampão de histidina, cerca de 84 mg/ml de di-hidrato de trealo- se, cerca de 0,2 mg/ml de PS80, cerca de 0,05 mg/ml de EDTA, e a composição tem um pH de 5,0 +/- 0,5. Em algumas modalidades, a composição tem uma viscosidade de cerca de 10 cP a cerca de 16 cP a 20C.

[22] Em algumas modalidades, a composição consiste essenci- almente em cerca de 100 mg/ml, cerca de 110 mg/ml, cerca de 120 mg/ml, cerca de 130 mg/ml, cerca de 140 mg/ml, cerca de 145 mg/ml, cerca de 148 mg/ml, cerca de 149 mg/ml, cerca de 150 mg/ml, cerca de 151 mg/ml ou cerca de 152 mg/ml de um anticorpo anti-PD-1, cerca de 20 mM de tampão de histidina, cerca de 84 mg/ml de trealose, cer- ca de 0,2 mg/ml de PS80, cerca de 0,05 mg/ml de EDTA, e a compo- sição tem um pH de 5,0 +/- 0,5.

[23] Em algumas modalidades, a composição consiste essenci- almente em cerca de 150 mg/ml de um anticorpo anti-PD-1, cerca de 20 mM de tampão de histidina, cerca de 84 mg/ml de di-hidrato de tre- alose, cerca de 0,2 mg/ml de PS80, cerca de 0,05 mg/ml de EDTA, e a composição tem um pH de 5,0 +/- 0,5.

[24] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser um anticor- po humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em al- gumas modalidades, o anticorpo é de a suclasse de IgG1, IgG2, IgG2Δa, IgG3, IgG4, IgG4Δb, IgG4Δc, IgG4 S228P, IgG4Δb S228P e IgG4Δc S228P humana. Em algumas modalidades, o anticorpo é do isótipo de IgG4 e compreende uma dobradiça estabilizada, por exemplo, S228P.

[25] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser PF- 06801591, nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab ou spartalizumab. Em outras modalidades, o anticorpo pode ser uma porção de ligação a antígeno de PF-06801591, nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab ou spartalizumab.

[26] Em algumas modalidades, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma regi- ão de determinação de complementaridade 1 de VH (CDR1), uma VH CDR2, e uma VH CDR3 da sequência de VH mostrada na SEQ ID NO: 2; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3 da sequência de VL mos- trada na SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a VH CDR1 com- preende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, a VH CDR2 compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID

NO: 5, e a VH CDR3 compreende a sequência de aminoácido mostra- da na SEQ ID NO: 6, a VL CDR1 compreende a sequência de amino- ácido mostrada na SEQ ID NO: 7, a VL CDR2 compreende a sequên- cia de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 8, e a VL CDR3 compre- ende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9.

[27] Em algumas modalidades, a região VH compreende a se- quência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2, ou uma variante com uma ou várias substituições de aminoácido conservadoras em resíduos que não estão dentro de uma CDR e/ou a região VL compre- ende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3, ou uma variante da mesma com uma ou várias substituições de aminoácido em aminoácidos que não estão dentro de uma CDR. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo pode compreender uma sequência de aminoá- cido que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o anticorpo pode com- preender uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 10 e uma sequên- cia de cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoáci- do mostrada na SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o anticor- po compreende uma região VH produzida pelo vetor de expressão com Acesso ATCC Nº. PTA-121183. Em algumas modalidades, o anti- corpo compreende uma região VL produzida pelo vetor de expressão com Acesso ATCC Nº. PTA-121182. Em algumas modalidades, o anti- corpo é um anticorpo que especificamente se liga a PD-1 e compete com e/ou se liga ao mesmo epítopo PD-1 que os anticorpos conforme descrito neste documento.

[28] Em algumas modalidades, a composição consiste essenci-

almente em cerca de 150 mg/ml de PF-06801591, cerca de 20 mM de tampão de histidina, cerca de 84 mg/ml de di-hidrato de trealose, cerca de 0,2 mg/ml de PS80, e cerca de 0,05 mg/ml de EDTA; em que a composição tem um pH de 5,0 +/- 0,1 e não contém metionina ou argi- nina. Em algumas modalidades, a composição consiste essencialmen- te em cerca de 150 mg/ml de nivolumab, cerca de 20 mM de tampão de histidina, cerca de 84 mg/ml de di-hidrato de trealose, cerca de 0,2 mg/ml de PS80, e cerca de 0,05 mg/ml de EDTA; em que a composi- ção tem um pH de 5,0 +/- 0,1 e não contém metionina ou arginina. Em algumas modalidades, a composição consiste essencialmente em cer- ca de 150 mg/ml de pembrolizumab, cerca de 20 mM de tampão de histidina, cerca de 84 mg/ml de di-hidrato de trealose, cerca de 0,2 mg/ml de PS80, e cerca de 0,05 mg/ml de EDTA; em que a composi- ção tem um pH de 5,0 +/- 0,1 e não contém metionina ou arginina.

[29] Em algumas modalidades, a composição pode não ser liofi- lizada. Em outras modalidades, a composição pode ser liofilizada.

[30] São também providos neste documento métodos para tratar uma condição em um indivíduo, em que os métodos compreendem: administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantida- de eficaz da composição farmacêutica conforme descrita neste docu- mento. Em algumas modalidades, a condição é um câncer. Em algu- mas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer gástrico, sarcoma, linfoma, leucemia, câncer de cabeça e pes- coço, câncer de nasofaringe, câncer tímico, câncer epitelial, câncer de ovário epitelial, câncer salivar, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de tireoide, câncer de pulmão (incluindo, por exemplo, sem li- mitação, câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de ová- rio, câncer das trompas de falópio, câncer de mama (incluindo, por exemplo, sem limitação câncer de mama triplo negativo), câncer de próstata, câncer esofágico, câncer pancreático, glioma, leucemia, mi-

eloma múltiplo, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer cervical, coriocarcinoma, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer oral, câncer de pele, câncer peritoneal e melanoma. Em algumas mo- dalidades, o indivíduo é um paciente adulto previamente tratado com melanoma localmente avançado ou metastático, câncer de cabeça e pescoço de células escamosas (SCHNC), carcinoma de ovário, sar- coma, ou linfoma de Hodgkin clássico (cHL) ou recidivo. Em algumas modalidades, o câncer pode ser um câncer resistente à platina e/ou refratário à platina, tal como, por exemplo, câncer de ovário resistente e/ou refratário à platina, câncer de mama resistente e/ou refratário à platina, ou câncer de pulmão resistente e/ou refratário à platina.

[31] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica de anticorpo anti-PD-1 provida neste documento é administrada em uma dosagem entre cerca de 25mg a cerca de 1000mg, preferencial- mente cerca de 50 mg, cerca de 100 mg, cerca de 125 mg, cerca de 150 mg, cerca de 200 mg, cerca de 250 mg, cerca de 300 mg, cerca de 350 mg, cerca de 400 mg, cerca de 450 mg, cerca de 500 mg, cer- ca de 525 mg, cerca de 550 mg, cerca de 600 mg, cerca de 650 mg, cerca de 700 mg, cerca de 750 mg ou cerca de 800 mg. Em algumas modalidades, a composição é administrada em uma dosagem entre cerca de 0,5mg/kg a cerca de 15mg/kg, preferencialmente cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1,0 mg/kg, cerca de 3,0 mg/kg, cerca de 5,0 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg. Em algumas modalidades, a composição é ad- ministrada uma vez a cada 7, 14, 21 ou 28 dias. Em algumas modali- dades, a composição é administrada subcutaneamente. Em outras modalidades, a composição é administrada intravenosamente. Em al- gumas modalidades, a composição é administrada como uma única injeção subcutânea de 2 ml. Em algumas modalidades, a composição é administrada uma vez a cada três semanas. Em algumas modalida- des, a composição é administrada uma vez a cada quatro semanas.

Em algumas modalidades, a composição é administrada em uma dose de 300 mg subcutaneamente. Em algumas modalidades, a composi- ção é administrada como uma dose subcutânea de 300 mg uma vez a cada 28 dias.

[32] São também providos neste documento métodos de inibir crescimento ou progressão tumoral em um indivíduo que tem um tu- mor, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica conforme descrita neste documento.

[33] São também providos neste documento métodos de inibir ou prevenir metástase de células cancerosas em um indivíduo, com- preendendo administrar ao indivíduo em necessidade dos mesmos uma quantidade eficaz da composição farmacêutica conforme descrita neste documento.

[34] São também providos neste documento métodos de induzir regressão tumoral em um indivíduo que tem um tumor expressando PD-1, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica conforme descrita neste documento.

[35] Em algumas modalidades, o anticorpo neste documento pode ser administrado parenteralmente em um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano.

[36] Em algumas modalidades, o método pode ainda compre- ender administrar uma quantidade eficaz de pelo menos um outro agente terapêutico. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é, por exemplo, crizotinib, palbociclib, talazoparib, um anticorpo anti- CTLA4, um anticorpo anti-4-1BB, um anticorpo anti-OX40, um segun- do anticorpo PD-1, uma célula CAR-T, ou um agente quimioterápico.

[37] São também providos neste documento usos de qualquer uma das composições farmacêuticas de anticorpo anti-PD-1 providas neste documento na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer ou para inibir crescimento ou progressão tumoral em um indivíduo em necessidade dos mesmos.

[38] São também providas composições farmacêuticas de anti- corpo anti-PD-1 para uso no tratamento de um câncer ou para inibir crescimento ou progressão tumoral em um indivíduo em necessidade dos mesmos. Em algumas modalidades, o câncer é, por exemplo, sem limitação, câncer gástrico, sarcoma, linfoma, linfoma de Hodgkin, leu- cemia, câncer de cabeça e pescoço, câncer tímico, câncer epitelial, câncer salivar, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de tire- oide, câncer de pulmão (incluindo, por exemplo, carcinoma de pulmão de células não pequenas), câncer de ovário, câncer de mama, câncer de próstata, câncer esofágico, câncer pancreático, glioma, leucemia, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, cân- cer cervical, coriocarcinoma, câncer de cólon, câncer oral, câncer de pele, e melanoma.

[39] São também providos neste documento métodos para au- mentar a imunogenicidade ou efeito terapêutico de uma vacina para o tratamento de a câncer em um mamífero, particularmente um ser hu- mano, cujo método compreende administrar ao mamífero recebendo a vacina uma quantidade eficaz de uma composição de anticorpo anti- PD-1 provida pela presente divulgação.

[40] São também providos neste documento métodos para tratar um câncer em um mamífero, particularmente um ser humano, cujo mé- todo compreende administrar ao mamífero (1) uma quantidade eficaz de uma vacina capaz de suscitar uma resposta imune contra células do câncer e (2) uma quantidade eficaz de uma composição farmacêu- tica de anticorpo anti-PD-1 provida pela presente divulgação. Em al- gumas modalidades, a composição é administrada como uma dose bilateral subcutânea de cerca de 125 a cerca de 300 mg. Em algumas modalidades, a composição é administrada como uma dose bilateral subcutânea de 300 mg.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[41] A Figura 1 apresenta um gráfico comparando a viscosidade de formulações de anticorpo anti-PD-1 em diferentes valores de pH.

[42] A Figura 2 apresenta um gráfico comparando a viscosidade de formulações de anticorpo anti-PD-1 com diversas concentrações de HCl de arginina.

[43] A Figura 3 apresenta um gráfico comparando a viscosidade de formulação de anticorpo anti-PD-1 em diferentes valores de pH.

[44] A Figura 4 apresenta um gráfico comparando a viscosidade de formulações de anticorpo anti-PD-1 com adição de 100 M de HCL de arginina, com ou sem prolina.

[45] A Figura 5 apresenta um gráfico comparando a viscosidade de formulações de anticorpo anti-PD-1 7 e 8.

[46] A Figura 6 apresenta um gráfico mostrando a heterogenei- dade de glicano em anticorpo anti-PD-1 mAb7.

[47] A Figura 7 apresenta um gráfico mostrando as proprieda- des térmicas de vários anticorpos anti-PD-1 na formulação 7.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[48] São divulgadas neste documento composições tendo vis- cosidade reduzida. Vantajosamente, as composições estavelmente suportam altas concentrações de anticorpo bioativo em solução e são adequadas para administração parenteral, incluindo injeção subcutâ- nea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou intradérmica.

TÉCNICAS GERAIS

[49] A prática da presente invenção irá empregar, salvo indica- ção em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (inclu- indo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquími- ca e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais téc- nicas são totalmente explicadas na literatura, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al., 1989)

Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Mo- lecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polimerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immu- nology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical ap- proach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford Universi- ty Press, 2000); Usando antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Anti- bodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publish- ers, 1995).

DEFINIÇÕES

[50] Os seguintes termos, salvo indicação em contrário, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados: o termo “molécu- la isolada” (em que a molécula é, por exemplo, um polipeptídeo, um polinucleotídeo ou um anticorpo) é uma molécula que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação (1), é não associada a componentes naturalmente associados que a acompanham em seu estado nativo, (2) é substancialmente livre de outras moléculas da mesma espécie (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza. Assim, uma molécula que é sintetizada quimica- mente, ou expressa em um sistema celular diferente da célula da qual naturalmente se origina, será “isolada” de seus componentes natural- mente associados. Uma molécula também pode se tornar substanci- almente livre de componentes naturalmente associados por isolamen- to, usando técnicas de purificação bem conhecidas na técnica. A pure- za ou homogeneidade da molécula pode ser avaliada por vários meios bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a pureza de uma amostra de polipeptídeo pode ser testada usando eletroforese em gel de polia- crilamida e manchamento do gel para visualizar o polipeptídeo usando técnicas bem conhecidas na técnica. Para certos fins, a resolução mais elevada pode ser provida usando HPLC ou outros meios bem conhecidos na técnica para purificação.

[51] Conforme usado neste documento, os termos “formulação” ou “composição”, no que se referem a um anticorpo, destinam-se a descrever o anticorpo em combinação com um excipiente farmaceuti- camente aceitável compreendendo pelo menos um agente de tonici- dade, pelo menos um tampão, pelo menos um agente quelante, pelo menos um tensoativo, em que o pH é conforme definido.

[52] Os termos “composição farmacêutica” ou “formulação far- macêutica” referem-se a preparações que estão em uma forma que permite que a atividade biológica dos ingredientes ativos seja eficaz.

[53] “Excipientes farmaceuticamente aceitáveis” (veículos, aditi- vos) são aqueles que podem ser administrados com segurança a um indivíduo para fornecer uma dose eficaz do ingrediente ativo emprega- do. O termo “excipiente” ou “veículo”, conforme utilizado neste docu- mento, refere-se a uma substância inerte, que é comumente utilizada como diluente, veículo, conservante, aglutinante ou agente estabiliza- dor para drogas. Como utilizado neste documento, o termo “diluente” refere-se a um solvente farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para a preparação das formulações líquidas aqui apresentadas. Diluentes exemplificati- vos incluem, mas sem limitação, água estéril e água bacteriostática para injeção (BWFI).

[54] Um “anticorpo” é uma molécula de imunoglobulina capaz de se ligar a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, polipeptídeo etc. através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobu- lina. Como utilizado neste documento, o termo abrange não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também, salvo indicação em contrário, qualquer porção de ligação a antígeno que compete com o anticorpo intacto por ligação específica, proteínas de fusão compreendendo uma porção de ligação a antígeno, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno. As porções de ligação a antígeno incluem, por exemplo, Fab, Fab’, F(ab’) 2, Fd, Fv, anticorpos domínio (dAbs, por exemplo, anticorpos de tubarão e came- lídeo), fragmentos incluindo regiões de determinação de complementa- ridade (CDRs), anticorpos de fragmento variável de cadeia única (scFv), maxicorpos, minicorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, te- tracorpos, v-NAR e bis-scFv, e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir liga- ção de antígeno específica ao polipeptídeo. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou subclasse dos mesmos), e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe parti- cular. Dependendo da sequência de aminoácido de anticorpo da regi- ão constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem ser ainda subdivididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2,

IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chama- das alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

[55] Uma “região variável” de um anticorpo refere-se à região variável da cadeia leve de anticorpo ou à região variável da cadeia pe- sada de anticorpo, sozinha ou em combinação. Como conhecido na técnica, as regiões variáveis das cadeias pesada e leve consistem, cada uma, em quatro regiões de quadro (FRs) conectadas por três re- giões de determinação de complementaridade (CDRs), também co- nhecidas como regiões hipervariáveis, e contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno de anticorpos. Se as variantes de uma região variável em questão forem desejadas, particularmente com substituição em resíduos de aminoácido fora de uma CDR (isto é, na região de quadro), substituição de aminoácido apropriada, preferenci- almente, substituição de aminoácido conservadora, pode ser identifi- cada por comparação da região variável em questão com as regiões variáveis de outros anticorpos que contêm sequências de CDR1 e CDR2 na mesma classe canônica que a região variável em questão (Chothia e Lesk, J Mol Biol 196 (4): 901-917, 1987).

[56] Em certas modalidades, o delineamento definitivo de uma CDR e a identificação de resíduos compreendendo o sítio de ligação de um anticorpo é realizado por meio da resolução da estrutura do an- ticorpo e/ou resolução da estrutura do complexo de anticorpo-ligante. Em certas modalidades, isso pode ser realizado por qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas pelos versados na técnica, tais como cristalografia de raios-X. Em certas modalidades, vários métodos de análise podem ser empregados para identificar ou aproximar as re- giões CDR. Em certas modalidades, vários métodos de análise podem ser empregados para identificar ou aproximar as regiões CDR. Exem- plos de tais métodos incluem, mas sem limitação, a definição de Ka- bat, a definição de Chothia, a definição de AbM, a definição de contato e a definição conformacional.

[57] A definição de Kabat é um padrão para numerar os resí- duos em um anticorpo e é tipicamente usado para identificar regiões CDR. Ver, por exemplo, Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8. A definição de Chothia é semelhante à definição de Kabat, mas a definição de Chothia leva em consideração as posições de certas regiões de loop estrutural. Ver, por exemplo, Chothia et al., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-83. A definição de AbM usa uma suíte integrada de programas de computa- dor produzida pelo Oxford Molecular Group que modela a estrutura de anticorpo. Ver, por exemplo, Martin et al., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86: 9268-9272; “AbM™, A Computer Program for Modeling Va- riable Regions of Antibodies,” Oxford, Reino Unido; Oxford Molecular, Ltd. A definição de AbM modela a estrutura terciária de um anticorpo da sequência primária usando uma combinação de bancos de dados de conhecimento e métodos ab initio, tais como aqueles descritos por Samudrala et al., 1999, “Ab Initio Protein Structure Prediction Usando a Combined Hierarchical Approach”, em PROTEINS, Structure, Func- tion and Genetics Suppl., 3:194-198. A definição de contato é baseada na análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Ver, por exemplo, MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45. Em outra abordagem, referida neste documento como “definição conformacio- nal” de CDRs, as posições das CDRs podem ser identificadas como os resíduos que fazem contribuições entálpicas para ligação a antígeno. Ver, por exemplo, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. Ainda outras definições de limite de CDR podem não seguir estritamente uma das abordagens acima, mas ainda assim se sobreporão a pelo menos uma porção das CDRs de Kabat, embora possam ser encurtadas ou alongadas à luz da previsão ou descober- tas experimentais de que resíduos ou grupos de resíduos específicos não impactam significativamente a ligação a antígeno. Conforme usa- do neste documento, uma CDR pode se referir a CDRs definidas por qualquer abordagem conhecida na técnica, incluindo combinações de abordagens. Os métodos usados neste documento podem utilizar CDRs definidas de qualquer uma dessas abordagens. Para qualquer dada modalidade contendo mais de uma CDR, as CDRs podem ser definidas de acordo com qualquer uma das definições de Kabat, Chothia, estendida, AbM, de contato e/ou conformacional.

[58] Como conhecido na técnica, uma “região constante” de um anticorpo refere-se à região constante da cadeia leve de anticorpo ou à região constante da cadeia pesada de anticorpo, sozinha ou em combinação.

[59] Tal como utilizado neste documento, “anticorpo monoclo- nal” refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais com- preendendo a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quan- tidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contras- te com preparações de anticorpos policlonais, que normalmente inclu- em diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como reque- rendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler e Milstein, 1975, Nature 256:495, ou pode ser produzido por métodos de DNA recombinante, tal como descrito na Patente dos EUA Nº. 4.816.567. Os anticorpos monoclo- nais também podem ser isolados de bibliotecas de fago geradas usan- do as técnicas descritas em McCafferty et al., 1990, Nature 348:552- 554, por exemplo. Como utilizado neste documento, anticorpo “huma- nizado” refere-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) que são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobu- linas ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subsequências de anticorpos de ligação a antígeno) que contêm a se- quência mínima derivada de imunoglobulina não humana. De prefe- rência, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anti- corpo receptor), em que os resíduos de uma CDR do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho tendo a es- pecificidade, afinidade e capacidade desejada. O anticorpo humaniza- do pode compreender resíduos que não são encontrados nem no anti- corpo receptor nem nas sequências de quadro ou CDR importadas, mas são incluídos para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo.

[60] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequên- cia de aminoácido que corresponde àquele de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou produzido usando qualquer uma das técnicas de preparação de humano como aqui divulgadas. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humaniza- do compreendendo resíduos de ligação a antígeno não humano.

[61] Como utilizado neste documento, o termo “anticorpo huma- no” destina-se a incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa hu-

mana. Essa definição de um anticorpo humano inclui anticorpos com- preendendo pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada humano ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve humano. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codi- ficados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa huma- na (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exem- plo, nas CDRs e, em particular, CDR3. No entanto, o termo “anticorpo humano”, como utilizado neste documento, não se destina a incluir an- ticorpos em que sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um rato, foram enxertadas em sequências de quadro humanas.

[62] O termo “anticorpo quimérico” é destinado a se referir a an- ticorpos em que as sequências de região variável são derivadas de uma espécie e as sequências de região constante são derivadas de outra espécie, tal como um anticorpo em que as sequências de região variável são derivadas de um anticorpo de camundongo e as sequên- cias de região constante são derivadas de um anticorpo humano.

[63] Como utilizado neste documento, anticorpo “humanizado” refere-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) que são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subse- quências de ligação a antígeno de anticorpos) que contêm a sequên- cia mínima derivada de imunoglobulina não humana. Preferencialmen- te, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticor- po receptor), em que os resíduos de uma região de determinação de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal co- mo camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de qua-

dro de Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resí- duos não humanos correspondentes. Além disso, o anticorpo humani- zado pode compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas sequências de quadro ou CDR importa- das, mas são incluídos para refinar e otimizar ainda mais o desempe- nho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos os pelo menos um, e tipicamente dois, domí- nios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina. O anticorpo humanizado idealmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Outras formas de anticorpos humanizados têm uma ou mais CDRs (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 ou CDR H3) que são alteradas em relação ao anticorpo original, que também são denominadas um ou mais CDRs “derivadas de” uma ou mais CDRs do anticorpo original.

[64] Conforme usado neste documento, o termo “mAb7” é usado para se referir a um anticorpo anti-PD-1 compreendendo a sequência de aminoácido das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente.

[65] Sequência de aminoácido de região variável de cadeia pe- sada mAb7: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVR- QAPGQGLEWMGNIYPGSSLTNYNEKFKNRVTM-

TRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSTGTFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)

[66] Sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve mAb7:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLWDSGNQKNFLTWYQQK- PGQPPKLLIYWTSYRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAED- VAVYYCQNDYFYPHTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 3)

[67] A geração e caracterização de mAb7 é descrita nos Exem- plos do WO2016/092419, sendo todo o conteúdo deste documento incorporado por referência. Em algumas modalidades, o termo “mAb7” refere-se à imunoglobulina codificada por (a) um polinucleotídeo codi- ficando região variável de cadeia leve mAb7 que tem um número de depósito de ATCC Nº. PTA-121182, e (b) um polinucleotídeo codifi- cando região variável de cadeia pesada mAb7 que tem um número de depósito ATCC nº PTA-121183.

[68] O termo “epítopo” refere-se à porção de uma molécula ca- paz de ser reconhecida por e ligada por um anticorpo em uma ou mais regiões de ligação a antígeno do anticorpo. Os epítopos geralmente consistem em um agrupamento de superfície de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm características estru- turais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Em algumas modalidades, o epítopo pode ser um epítopo de proteína. Os epítopos de proteínas podem ser lineares ou confor- macionais. Em um epítopo linear, todos os pontos de interação entre a proteína e a molécula de interação (tal como um anticorpo) ocorrem linearmente ao longo da sequência de aminoácido primária da proteí- na. Um “epítopo não linear” ou “epítopo conformacional” compreende polipeptídeos não contíguos (ou aminoácidos) dentro da proteína anti- gênica à qual um anticorpo específico para o epítopo se liga. O termo “epítopo antigênico”, conforme usado neste documento, é definido co- mo uma porção de um antígeno ao qual um anticorpo pode especifi- camente se ligar como determinado por qualquer método bem conhe- cido na técnica, por exemplo, por imunoensaios convencionais. Uma vez determinado um epítopo desejado em um antígeno, é possível ge-

rar anticorpos para esse epítopo, por exemplo, usando as técnicas descritas na presente especificação. Alternativamente, durante o pro- cesso de descoberta, a geração e caracterização de anticorpos podem elucidar informações sobre epítopos desejáveis. A partir dessas infor- mações, é então possível fazer a triagem competitiva de anticorpos para ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para conseguir isso é conduzir estudos de competição e competição cruzada para encon- trar anticorpos que competem ou competem de forma cruzada entre si para ligação a PD-1, por exemplo, os anticorpos competem para a li- gação ao antígeno.

[69] Conforme usado neste documento, os termos “anticorpo isolado” ou “anticorpo purificado” referem-se a um anticorpo que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação, tem um a quatro dos se- guintes: (1) não é associado com componentes naturalmente associa- dos que o acompanham em seu estado nativo, (2) é livre de outras proteínas da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza.

[70] Um anticorpo é “substancialmente puro”, “substancialmente homogêneo” ou “substancialmente purificado” quando pelo menos cer- ca de 60 a 75% de uma amostra exibe uma única espécie de anticor- po. Um anticorpo substancialmente puro pode compreender tipicamen- te cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% p/p de uma amostra de anti- corpo, mais geralmente cerca de 95%, e preferencialmente será mais de 99% puro. A pureza ou homogeneidade de anticorpo podem ser testadas por uma série de meios bem conhecidos na técnica, tais co- mo eletroforese em gel de poliacrilamida ou HPLC.

[71] O termo “anticorpo” refere-se a um anticorpo que se liga a um alvo e evita ou reduz o efeito biológico desse alvo. Em algumas modalidades, o termo pode denotar um anticorpo que impede o alvo, por exemplo, PD-1, ao qual está ligado de desempenhar uma função biológica.

[72] Um anticorpo que “se liga preferencialmente” ou “especifi- camente se liga” (usado indistintamente aqui) a um epítopo é um ter- mo bem conhecido na técnica, e métodos para determinar tal ligação específica ou preferencial também são bem conhecidos na técnica. Uma molécula é dita exibir “ligação específica” ou “ligação preferenci- al” se ela reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamen- te, com maior duração e/ou com maior afinidade com uma célula ou substância particular do que com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo “se liga especificamente” ou “se liga preferencialmente” a um alvo caso se ligue com maior afinidade, avidez, mais prontamen- te e/ou com maior duração do que se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que especificamente ou preferencialmente se liga a um epítopo PD-1 é um anticorpo que se liga a essa sequência de epítopo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outras sequências. É também entendi- do pela leitura desta definição que, por exemplo, um anticorpo (ou por- ção ou epítopo) que especificamente ou se liga preferencialmente a um primeiro alvo pode ou não pode especificamente ou preferencial- mente se ligar a um segundo alvo. Assim, “ligação específica” ou “liga- ção preferencial” não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, referência à ligação significa ligação preferencial.

[73] Como utilizado neste documento, ligação “imunoespecífica” refere-se à interação de ligação específica a antígeno que ocorre entre o sítio de combinação de antígeno de um anticorpo e o antígeno espe- cífico reconhecido por esse anticorpo (ou seja, o anticorpo reage com a proteína em um ELISA ou outro imunoensaio, e não reage de forma detectável com proteínas não relacionadas).

[74] O termo “competir”, conforme utilizado neste documento com relação a um anticorpo, significa que um primeiro anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, se liga a um epítopo de uma maneira suficientemente semelhante à ligação de um segundo anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de modo que o resultado da ligação do primeiro anticorpo com seu epítopo cog- nato seja detectavelmente reduzido na presença do segundo anticorpo em comparação com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, em que a ligação do segundo anti- corpo ao seu epítopo também é detectavelmente reduzida na presen- ça do primeiro anticorpo, pode, mas não precisa ser o caso. Ou seja, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo ao seu epítopo, sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do pri- meiro anticorpo ao seu respectivo epítopo. No entanto, quando cada anticorpo inibe de forma detectável a ligação do outro anticorpo com seu epítopo ou ligante cognato, seja no mesmo, em maior ou menor grau, diz-se que os anticorpos “competem de forma cruzada” entre si para ligação de seu(s) respectivo(s) epítopos(s). Ambos os anticorpos de competição e competição cruzada são abrangidos pela presente invenção. Independentemente do mecanismo pelo qual essa competi- ção ou competição cruzada ocorre (por exemplo, impedimento estéri- co, mudança conformacional ou ligação a um epítopo comum, ou por- ção do mesmo), o especialista apreciaria, com base nos ensinamentos aqui fornecidos, que tais anticorpos de competição e/ou de competição cruzada são abrangidos e podem ser úteis para os métodos aqui di- vulgados.

[75] Conforme usado neste documento, o termo “PD-1” refere- se a qualquer forma de PD-1 e suas variantes que retêm pelo menos parte da atividade de PD-1. A menos que indicado de forma diferente, tal como por referência específica a PD-1 humano, PD-1 inclui todas as espécies de mamíferos de PD-1 de sequência nativa, por exemplo,

humano, canino, felino, equino e bovino. Um PD-1 humano exemplifi- cativo é encontrado como Número de Acesso Uniprot Q15116 (SEQ ID NO: 1).

MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQI- KESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICS- RAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP

CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL (SEQ ID NO: 1).

[76] Como utilizado neste documento, um “anticorpo anti-PD-1” refere-se a um anticorpo que é capaz de inibir a atividade biológica de PD-1 e/ou evento(s) a jusante mediados por PD-1. Anticorpos anti-PD- 1 abrangem anticorpos que bloqueiam, antagonizam, suprimem ou re- duzem (em qualquer grau incluindo significativamente) a atividade bio- lógica de PD-1, incluindo eventos a jusante mediados por PD-1, tal como ligação de PD-L1 e sinalização a jusante, ligação de PD-L2e si- nalização a jusante, inibição da proliferação de células T, inibição da ativação de células T, inibição da secreção de IFN, inibição da secre- ção de IL-2, inibição da secreção de TNF, indução de IL-10, e inibição de respostas imunes antitumorais. Para os fins da presente invenção, será explicitamente entendido que o termo “anticorpo anti-PD-1” (inter- cambiavelmente denominado “anticorpo PD-1”) engloba todos os ter- mos, títulos, estados funcionais e características previamente identifi- cados pelos quais PD-1 em si, uma atividade biológica de PD-1, ou as consequências da atividade biológica, são substancialmente anuladas,

diminuídas ou neutralizadas em qualquer grau significativo. Em algu- mas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 se liga a PD-1 e sobrerregu- la uma resposta imune antitumoral. Exemplos de anticorpos anti-PD-1 são fornecidos neste documento.

[77] O termo “identidade” refere-se à “identidade” percentual de duas sequências de aminoácido ou de duas sequências de ácido nu- cleico. A identidade percentual é geralmente determinada pelo alinha- mento das sequências para fins de comparação ideal (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas na primeira sequência para melhor alinhamento com a segunda sequência) e comparando os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos nas posições correspondentes. O “melhor alinhamento” é um alinhamento de duas sequências que resulta na maior identidade percentual. A identidade percentual é determinada comparando o número de resíduos de aminoácido idênticos ou nucleo- tídeos nas sequências (isto é, % identidade = número de posições idênticas/número total de posições x 100).

[78] A determinação da identidade percentual entre duas se- quências pode ser realizada usando um algoritmo matemático conhe- cido pelos versados na técnica. Um exemplo de um algoritmo matemá- tico para comparar duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Os programas NBLAST e XBLAST de Altschul, et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 incorporaram tal algoritmo. As pesquisas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotí- deo homólogas a moléculas de ácido nucleico da invenção. As pesqui- sas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter se- quências de aminoácido homólogas a uma molécula de proteína da invenção. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de compara- ção, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, PSI- Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa iterada que detecta relações distantes entre moléculas (Id.). Ao utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos res- pectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) pode ser usa- do. Consultar http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Outro exemplo de um algo- ritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algo- ritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989). O programa ALIGN (versão

2.0) que faz parte do pacote de software de alinhamento de sequên- cias GCG incorporou tal algoritmo. Outros algoritmos para análise de sequência conhecidos na técnica incluem ADVANCE e ADAM, con- forme descrito em Torellis e Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5; e FASTA descrito em Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. Dentro do FASTA, ktup é uma opção de controle que define a sensibilidade e velocidade da pesquisa.

[79] Conforme usado neste documento, “tratamento” é uma abordagem para obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Pa- ra os fins desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas sem limitação, um ou mais dos seguintes: reduzir a proli- feração de (ou destruir) células neoplásicas ou cancerosas, inibir me- tástase de células neoplásicas, encolhendo ou diminuindo o tamanho de um tumor, remissão do câncer, redução dos sintomas decorrentes do câncer, aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem de câncer, redução da dose de outros medicamentos necessários para tratar o câncer, retardamento da progressão do câncer, cura de um câncer, e/ou prolongamento da sobrevivência de pacientes com cân- cer.

[80] Conforme usado neste documento, uma “dosagem eficaz”

ou “quantidade eficaz” de droga, composto ou composição farmacêuti- ca é uma quantidade suficiente para efetuar qualquer um ou mais re- sultados benéficos ou desejados.

Em aspectos mais específicos, uma quantidade eficaz previne, alivia ou ameniza os sintomas da doença, e/ou prolonga a sobrevida do indivíduo em tratamento.

Para uso profi- lático, os resultados benéficos ou desejados incluem eliminar ou redu- zir o risco, diminuir a gravidade, ou retardar o início da doença, inclu- indo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da do- ença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença.

Para uso terapêu- tico, resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos, tais como redução de um ou mais sintomas de uma doença, tal como, por exemplo, câncer incluindo, por exemplo, sem limitação, câncer gástrico, sarcoma, linfoma, linfoma de Hodgkin, leucemia, câncer de cabeça e pescoço, câncer de cabeça e pescoço de células escamo- sas, câncer tímico, câncer epitelial, câncer salivar, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de tireoide, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de próstata, câncer esofágico, câncer pancreático, glioma, leucemia, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer cervical, coriocarcinoma, câncer de cólon, câncer oral, câncer de pele e melanoma, reduzir a dose de ou- tros medicamentos necessários para tratar a doença, potencializar o efeito de outro medicamento e/ou retardar a progressão do câncer em pacientes.

Uma dosagem eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações.

Para os fins desta invenção, uma dosagem efi- caz da droga, composto ou composição farmacêutica é uma quantida- de suficiente para realizar tratamento profilático ou terapêutico direta ou indiretamente.

Como é entendido no contexto clínico, uma dosa- gem eficaz de uma droga, composto ou composição farmacêutica po- de ou não ser alcançada em conjunto com outra droga, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma “dosagem eficaz” pode ser considerada no contexto de administração de um ou mais agentes te- rapêuticos, e um único agente pode ser considerado para ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agen- tes, um resultado desejável puder ser ou for alcançado.

[81] Conforme usado neste documento, o termo “indivíduo” para fins de tratamento inclui qualquer indivíduo, e é preferencialmente um indivíduo que precisa do tratamento da condição patológica alvo, por exemplo, doença autoimune. Para fins de prevenção, o indivíduo é qualquer indivíduo, e preferencialmente é um indivíduo que está em risco de, ou é predisposto a, desenvolver a condição patológica alvo. O termo “indivíduo” pretende incluir organismos vivos, por exemplo, procariontes e eucariontes. Exemplos de indivíduos incluem mamífe- ros, por exemplo, seres humanos, cães, vacas, cavalos, porcos, ove- lhas, cabras, gatos, ratos, coelhos, ratos e animais transgênicos não humanos. Em modalidades específicas da invenção, o indivíduo é um ser humano.

[82] Como utilizado neste documento, o termo “polinucleotídeo” ou “ácido nucleico”, usado intercambiavelmente aqui, significa uma forma polimérica de nucleotídeos, tanto ribonucleotídeos ou desoxinu- cleotídeos, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo e podem ser formas de filamento simples e duplo. Um “polinucleotídeo” ou uma sequência de “ácido nucleico” abrange o seu complemento, a menos que especificado de outra forma. Como utilizado neste docu- mento, o termo “polinucleotídeo isolado” ou “ácido nucleico isolado” significa um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação dos mesmos, que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação, o polinucleotídeo isolado tem um a três dos se- guintes: (1) não é associado com toda ou uma porção de um polinu- cleotídeo com o qual o “polinucleotídeo isolado” é encontrado na natu-

reza, (2) é operacionalmente ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

[83] Conforme utilizado neste documento, o termo “agente que- lante” é um excipiente que pode formar pelo menos uma ligação (por exemplo, covalente, iônica ou outra) a um íon metálico. Um agente quelante é tipicamente um ligante multidentado que pode ser usado em composições como um estabilizador para complexo com espécies, que de outra forma poderiam promover instabilidade.

[84] Conforme usado neste documento, o termo “tampão” refe- re-se a uma composição adicionada que permite a uma formulação de anticorpo líquida resistir a mudanças no pH, tipicamente por ação de seus componentes conjugados ácido-base. Quando se refere a uma concentração de um tampão, pretende-se que a concentração citada represente a concentração molar da forma de ácido livre ou base livre do tampão.

[85] “Viscosidade”, como utilizado neste documento, pode ser “viscosidade absoluta” ou “viscosidade cinemática”. “Viscosidade ab- soluta”, às vezes chamada de viscosidade dinâmica ou simples, é uma quantidade que descreve a resistência de um fluido ao fluxo. “Viscosi- dade cinemática” é o quociente entre viscosidade absoluta e densida- de de fluido. A viscosidade cinemática é frequentemente reportada ao caracterizar o fluxo resistivo de um fluido usando um viscosímetro ca- pilar. Quando dois fluidos de igual volume são colocados em viscosí- metros capilares idênticos e permitidos fluir por gravidade, um fluido viscoso leva mais tempo do que um fluido menos viscoso para fluir através do capilar. Se um fluido levar 200 segundos para completar seu fluxo e outro fluido levar 400 segundos, o segundo fluido é duas vezes mais viscoso que o primeiro em uma escala de viscosidade ci- nemática. Se ambos os fluidos tiverem densidade igual, o segundo flu-

ido é duas vezes mais viscoso que o primeiro em uma escala de vis- cosidade absoluta. As dimensões da viscosidade cinemática são L2/T, em que L representa comprimento e T representa tempo. As unidades SI de viscosidade cinemática são m2/s. Normalmente, a viscosidade cinemática é expressa em centistokes, cSt, que é equivalente a mm2/s. As dimensões de viscosidade absoluta são M/l/T, em que M represen- ta massa e L e T representam comprimento e tempo, respectivamente. As unidades SI de viscosidade absoluta são Pa·s, que é equivalente a kg/m/s. A viscosidade absoluta é comumente expressa em unidades de centiPoise, cP, que é equivalente a milipascal-segundo, mPa·s.

[86] Conforme usado neste documento, os termos “agente de tonicidade” ou “tonificador” referem-se a um excipiente que pode ajus- tar a pressão osmótica de uma formulação de anticorpo líquida. Em certas modalidades, o agente de tonicidade pode ajustar a pressão osmótica de uma formulação de anticorpo líquida para isotônica, de modo que a formulação de anticorpo seja fisiologicamente compatível com as células do tecido corporal do indivíduo. Ainda em outras moda- lidades, o “agente de tonicidade” pode contribuir para uma melhoria na estabilidade de anticorpos descritos neste documento. Uma formula- ção “isotônica” é uma que tem essencialmente a mesma pressão os- mótica que o sangue humano. As formulações isotônicas geralmente têm uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsm. O termo “hi- potônico” descreve uma formulação com uma pressão osmótica abai- xo daquela do sangue humano. Correspondentemente, o termo “hiper- tônico” é usado para descrever uma formulação com uma pressão osmótica acima daquela do sangue humano. A isotonicidade pode ser medida usando um osmômetro do tipo por pressão de vapor ou conge- lamento, por exemplo. O agente de tonicidade pode estar em uma forma enantiomérica (por exemplo, enantiômero L- ou D-) ou racêmica; isômeros, tais como alfa ou beta, incluindo alfa, alfa; ou beta, beta; ou alfa, beta; ou beta, alfa; uma forma de ácido ou base livre; uma forma hidratada (por exemplo, monohidrato), ou uma forma anidra.

[87] Como utilizado neste documento, o termo “poliol” refere-se a um excipiente com vários grupos hidroxila, e inclui açúcares (açúca- res de redução e não redução), álcoois de açúcar e ácidos de açúcar.

[88] Como utilizado neste documento, o termo “tensoativo” refe- re-se a um excipiente que pode alterar a tensão superficial de uma formulação de anticorpo líquida. Em certas modalidades, o tensoativo reduz a tensão superficial de uma formulação de anticorpo líquida. Ainda em outras modalidades, o “tensoativo” pode contribuir para uma melhoria na estabilidade de qualquer anticorpo na formulação. O ten- soativo pode reduzir a agregação do anticorpo formulado e/ou minimi- zar a formação de particulados na formulação e/ou reduzir a adsorção. O tensoativo também pode melhorar a estabilidade do anticorpo du- rante e após um ciclo de congelamento/descongelamento.

[89] Conforme usado neste documento, o termo “sacarídeo” re- fere-se a uma classe de moléculas que são derivados de álcoois polií- dricos. Os sacarídeos são comumente referidos como carboidratos e podem conter diferentes quantidades de unidades de açúcar (sacarí- deos), por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarí- deos.

[90] Como usado neste documento, o termo “açúcar de redu- ção” é aquele que contém um grupo hemiacetal que pode reduzir íons metálicos ou reagir covalentemente com lisina e outros grupos amino em proteínas e “açúcar de não redução” é aquele que não tem as pro- priedades de um açúcar de redução.

[91] Um “lioprotetor” é uma molécula que, quando combinada com uma proteína de interesse, previne ou reduz significativamente a instabilidade físico-química da proteína após a liofilização e posterior armazenamento. Lioprotetores exemplificativos incluem açúcares e seus álcoois de açúcar correspondentes; um aminoácido, tal como glu- tamato monossódico ou histidina; uma metilamina, tal como betaína; um sal liotrópico, tal como sulfato de magnésio; um poliol, tal como ál- coois de açúcar de peso molecular superior ou tri-hídrico, por exemplo, glicerina, dextranoo, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol; propileno glicol; polietileno glicol; Pluronics®; e combinações dos mesmos. Lioprotetores exemplificativos adicionais incluem glicerina e gelatina, e os açúcares melibiose, melezitose, rafinose, manotriose e estaquiose. Exemplos de açúcares de redução incluem glicose, malto- se, lactose, maltulose, iso-maltulose e lactulose. Exemplos de açúca- res de não redução incluem glicosídeos de não redução de compostos de poli-hidróxi selecionados de álcoois de açúcar e outros poliálcoois de cadeia linear. Os álcoois de açúcar preferidos são os monoglicosí- deos, especialmente aqueles compostos obtidos por redução de dis- sacarídeos, tais como lactose, maltose, lactulose e maltulose. O grupo lateral glicosídico pode ser glucosídico ou galactosídico. Exemplos adicionais de álcoois de açúcar adicionais são glucitol, maltitol, lactitol e iso-maltulose. O lioprotetor preferido são os açúcares de não redu- ção trealose ou sacarose.

[92] O lioprotetor é adicionado à formulação pré-liofilizada em uma “quantidade lioprotetora” que significa que, após a liofilização da proteína na presença da quantidade lioprotetora do lioprotetor, a prote- ína essencialmente retém sua estabilidade físico-química após a liofili- zação e armazenamento.

[93] Como utilizado neste documento, “veículo farmaceutica- mente aceitável” inclui qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha atividade bio- lógica e é não reativo com o sistema imune do indivíduo. Os exemplos incluem, mas sem limitação, quaisquer dos veículos farmacêuticos pa- drão, tal como uma solução salina tamponada com fosfato, água,

emulsões, tais como emulsão óleo/água, e vários tipos de agentes umectantes. Os diluentes preferidos para aerossol ou administração parenteral são solução salina tamponada com fosfato, solução salina normal (0,9%) ou dextrose 5%. Composições compreendendo tais veí- culos são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edição, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20ª edição, Mack Publishing, 2000).

[94] “Reduzir a incidência” significa qualquer um de reduzir a gravidade (que pode incluir reduzir a necessidade e/ou quantidade de (por exemplo, exposição a) outras drogas e/ou terapias geralmente usadas para esta condição. Como é entendido por aqueles versados na técnica, os indivíduos podem variar em termos de sua resposta ao tratamento e, assim, por exemplo, um “método de reduzir a incidência” reflete a administração do anticorpo anti-PD-1 com base em uma ex- pectativa razoável de que tal administração possa provavelmente cau- sar tal redução na incidência naquele indivíduo em particular.

[95] “Melhorar” significa diminuir ou melhorar um ou mais sinto- mas em comparação com a não administração de um anticorpo anti- PD-1. “Melhorar” também inclui encurtamento ou redução na duração de um sintoma.

[96] Referência a “cerca de” um valor ou parâmetro neste do- cumento inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referente a “cerca de X” inclui a descrição de “X”. Os intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo.

[97] Onde aspectos ou modalidades da invenção são descritos em termos de um grupo Markush ou outro agrupamento de alternati- vas, a presente invenção abrange não apenas todo o grupo listado como um todo, mas cada membro do grupo individualmente e todos os possíveis subgrupos do grupo principal, mas também o grupo principal sem um ou mais dos membros do grupo. A presente invenção também prevê a exclusão explícita de um ou mais membros do grupo na inven- ção reivindicada.

[98] Ao introduzir elementos da presente invenção ou a(s) mo- dalidade(s) preferida(s) da mesma, os artigos “um”, “uma”, “o” e “refe- rido” pretendem significar que há um ou mais dos elementos. Os ter- mos “compreendendo”, “compreendem”, “compreende”, “incluindo” e “tendo” pretendem ser inclusivos e significam que pode haver elemen- tos adicionais que não os elementos listados. É entendido que sempre que modalidades são descritas neste documento com a linguagem “compreendendo”, de outra forma, modalidades análogas descritas em termos de “consistindo em” e/ou “consistindo essencialmente em” também são fornecidas.

[99] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que co- mumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo de- finições, prevalecerá. Ao longo desta especificação e reivindicações, a palavra “compreendem” ou variações como “compreende” ou “com- preendendo” será entendida como implicando a inclusão de um núme- ro inteiro ou grupo de números inteiros declarado, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. A me- nos que exigido de outra forma pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular.

[100] Métodos e materiais exemplificativos são descritos neste documento, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento também possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes. Composições de Anticorpo Anti-PD-1

[101] Em um aspecto, a invenção fornece uma formulação com- preendendo um anticorpo anti-PD-1, a formulação tendo viscosidade entre cerca de 1 cP e cerca de 25 cP. Em outro aspecto, um método é provido para reduzir a viscosidade de uma formulação contendo anti- corpo anti-PD-1, em que o método compreende a etapa de adicionar à formulação uma uma quantidade de redução de viscosidade de um composto que é capaz de reduzir a viscosidade de uma formulação aquosa compreendendo o referido anticorpo anti-PD-1. A formulação pode ser em forma aquosa ou liofilizada. Na forma aquosa, a formula- ção pode ter uma viscosidade não superior a cerca de 150 cP, prefe- rencialmente não superior a cerca de 120 cP, preferencialmente não superior a cerca de 100 cP, preferencialmente não superior a cerca de 90 cP, preferencialmente não superior a cerca de 80 cP, preferencial- mente não superior a cerca de 70 cP, preferencialmente não superior a cerca de 60 cP, preferencialmente não superior a cerca de 50 cP, preferencialmente não superior a cerca de 40 cP, preferencialmente não superior a cerca de 30 cP, preferencialmente não superior a cerca de 20 cP, preferencialmente não superior a cerca de 10 cP, preferen- cialmente não superior a cerca de 5 cP. Em algumas modalidades, a composição compreendendo anticorpo tem uma viscosidade entre cerca de 1 cP e cerca de 500 cP, entre cerca de 1 cP e 200 cP, entre cerca de 1 cP e cerca de 150 cP, entre cerca de 1 cP e cerca de 100 cP, entre cerca de 1 cP e cerca de 90 cP, entre cerca de 1 cP e cerca de 80 cP, entre cerca de 1 cP e cerca de 70 cP, entre cerca de 1 cP e cerca de 60 cP, entre cerca de 1 cP e cerca de 50 cP, entre cerca de 1 cP e cerca de 40 cP, entre cerca de 1 cP e cerca de 30 cP, entre cerca de 1 cP e cerca de 20 cP, ou entre cerca de 1 cP e cerca de 10 cP a 20ºC. Em algumas modalidades, a formulação tem uma viscosidade de cerca de 120 cP, cerca de cerca de 115 cP, 110 cP, cerca de 105 cP, cerca de 100 cP, cerca de 95 cP, cerca de 90 cP, cerca de 85 cP, cerca de 80 cP, cerca de 75 cP, cerca de 70 cP, cerca de 65 cP, cerca de 60 cP, cerca de cerca de 55 cP, 50 cP, cerca de 45 cP, cerca de 40 cP, cerca de 35 cP, cerca de 30 cP, cerca de 25 cP, cerca de 20 cP, cerca de 15 cP ou cerca de 10 cP ou cerca de 5 cP. Em algumas mo- dalidades, a formulação tem uma viscosidade entre cerca de 10 cP e 50 cP, entre cerca de 10 cP e 100 cP, entre cerca de 20 cP e 60 cP, entre cerca de 30 cP e 60 cP, entre cerca de 40 cP e 60 cP, ou entre cerca de 50 cP e 60 cP. Em algumas modalidades, na forma aquosa, a formulação pode ter uma viscosidade entre cerca de 1 cP e 10 cP. Em algumas modalidades, na forma aquosa, a formulação pode ter uma viscosidade entre cerca de 1 cP e 15 cP. Em algumas modalidades, na forma aquosa, a formulação pode ter uma viscosidade entre cerca de 1 cP e 20 cP.

[102] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um artigo de fabricação compreendendo um recipiente contendo qualquer uma das formulações descritas neste documento.

[103] Em algumas modalidades, a formulação compreende pelo menos um anticorpo anti-PD-1. Em algumas modalidades, mais de um anticorpo pode estar presente. Pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou mais, anticorpos diferentes podem estar presentes. Geralmente, os dois ou mais anti- corpos diferentes têm atividades complementares que não afetam ad- versamente um ao outro. O, ou cada, anticorpo pode também ser usa- do em conjunto com outros agentes que servem para aumentar e/ou complementar a eficácia dos anticorpos. O anticorpo pode estar pre- sente na formulação em uma concentração variando de cerca de 0,1 a cerca de 300 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de an- ticorpo é cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 1 mg/ml, cerca de 2 mg/ml, cer-

ca de 2,5 mg/ml, cerca de 3 mg/ml, cerca de 3,5 mg/ml, cerca de 4 mg/ml, cerca de 4,5 mg/ml, cerca de 5 mg/ml, cerca de 5,5 mg/ml, cer- ca de 6 mg/ml, cerca de 6,5 mg/ml, cerca de 7 mg/ml, cerca de 7,5 mg/ml, cerca de 8 mg/ml, cerca de 8,5 mg/ml, cerca de 9 mg/ml, cerca de 9,5 mg/ml, cerca de 10 mg/ml, cerca de 11 mg/ml, cerca de 12 mg/ml, cerca de 13 mg/ml, cerca de 14 mg/ml, cerca de 15 mg/ml, cer- ca de 16 mg/ml, cerca de 17 mg/ml, cerca de 18 mg/ml, cerca de 19 mg/ml, cerca de 20 mg/ml, cerca de 21 mg/ml, cerca de 22 mg/ml, cer- ca de 23 mg/ml, cerca de 24 mg/ml, cerca de 25 mg/ml, cerca de 26 mg/ml, cerca de 27 mg/ml, cerca de 28 mg/ml, cerca de 29 mg/ml, cer- ca de 30 mg/ml, cerca de 31 mg/ml, cerca de 32 mg/ml, cerca de 33 mg/ml, cerca de 34 mg/ml, cerca de 35 mg/ml, cerca de 36 mg/ml, cer- ca de 37 mg/ml, cerca de 38 mg/ml, cerca de 39 mg/ml, cerca de 40 mg/ml, cerca de 41 mg/ml, cerca de 42 mg/ml, cerca de 43 mg/ml, cer- ca de 44 mg/ml, cerca de 45 mg/ml, cerca de 46 mg/ml, cerca de 47 mg/ml, cerca de 48 mg/ml, cerca de 49 mg/ml, cerca de 50 mg/ml, cer- ca de 51 mg/ml, cerca de 52 mg/ml, cerca de 53 mg/ml, cerca de 54 mg/ml, cerca de 55 mg/ml, cerca de 56 mg/ml, cerca de 57 mg/ml, cer- ca de 58 mg/ml, cerca de 59 mg/ml, cerca de 60 mg/ml, cerca de 70 mg/ml, cerca de 80 mg/ml, cerca de 90 mg/ml, cerca de 100 mg/ml, cerca de 101 mg/ml, cerca de 102 mg/ml, cerca de 102,5 mg/ml, cerca de 103 mg/ml, cerca de 103,5 mg/ml, cerca de 104 mg/ml, cerca de 104,5 mg/ml, cerca de 105 mg/ml, cerca de 105,5 mg/ml, cerca de 106 mg/ml, cerca de 106,5 mg/ml, cerca de 107 mg/ml, cerca de 107,5 mg/ml, cerca de 108 mg/ml, cerca de 108,5 mg/ml, cerca de 109 mg/ml, cerca de 109,5 mg/ml, cerca de 110 mg/ml, cerca de 111 mg/ml, cerca de 112 mg/ml, cerca de 113 mg/ml, cerca de 114 mg/ml, cerca de 115 mg/ml, cerca de 116 mg/ml, cerca de 117 mg/ml, cerca de 118 mg/ml, cerca de 119 mg/ml, cerca de 120 mg/ml, cerca de 121 mg/ml, cerca de 122 mg/ml, cerca de 123 mg/ml, cerca de 124 mg/ml,

cerca de 125 mg/ml, cerca de 126 mg/ml, cerca de 127 mg/ml, cerca de 128 mg/ml, cerca de 129 mg/ml, cerca de 130 mg/ml, cerca de 131 mg/ml, cerca de 132 mg/ml, cerca de 133 mg/ml, cerca de 134 mg/ml, cerca de 135 mg/ml, cerca de 136 mg/ml, cerca de 137 mg/ml, cerca de 138 mg/ml, cerca de 139 mg/ml, cerca de 140 mg/ml, cerca de 141 mg/ml, cerca de 142 mg/ml, cerca de 143 mg/ml, cerca de 144 mg/ml, cerca de 145 mg/ml, cerca de 146 mg/ml, cerca de 147 mg/ml, cerca de 148 mg/ml, cerca de 149 mg/ml, cerca de 150 mg/ml, cerca de 151 mg/ml, cerca de 152 mg/ml, cerca de 153 mg/ml, cerca de 154 mg/ml, cerca de 155 mg/ml, cerca de 156 mg/ml, cerca de 157 mg/ml, cerca de 158 mg/ml, cerca de 159 mg/ml, cerca de 160 mg/ml, cerca de 170 mg/ml, cerca de 180 mg/ml, cerca de 190 mg/ml, cerca de 200 mg/ml, cerca de 201 mg/ml, cerca de 202 mg/ml, cerca de 202,5 mg/ml, cerca de 203 mg/ml, cerca de 203,5 mg/ml, cerca de 204 mg/ml, cerca de 204,5 mg/ml, cerca de 205 mg/ml, cerca de 205,5 mg/ml, cerca de 206 mg/ml, cerca de 206,5 mg/ml, cerca de 207 mg/ml, cerca de 207,5 mg/ml, cerca de 208 mg/ml, cerca de 208,5 mg/ml, cerca de 209 mg/ml, cerca de 209,5 mg/ml, cerca de 210 mg/ml, cerca de 211 mg/ml, cerca de 212 mg/ml, cerca de 213 mg/ml, cerca de 214 mg/ml, cerca de 215 mg/ml, cerca de 216 mg/ml, cerca de 217 mg/ml, cerca de 218 mg/ml, cerca de 219 mg/ml, cerca de 220 mg/ml, cerca de 221 mg/ml, cerca de 222 mg/ml, cerca de 223 mg/ml, cerca de 224 mg/ml, cerca de 225 mg/ml, cerca de 226 mg/ml, cerca de 227 mg/ml, cerca de 228 mg/ml, cerca de 229 mg/ml, cerca de 230 mg/ml, cerca de 231 mg/ml, cerca de 232 mg/ml, cerca de 233 mg/ml, cerca de 234 mg/ml, cerca de 235 mg/ml, cerca de 236 mg/ml, cerca de 237 mg/ml, cerca de 238 mg/ml, cerca de 239 mg/ml, cerca de 240 mg/ml, cerca de 241 mg/ml, cerca de 242 mg/ml, cerca de 243 mg/ml, cerca de 244 mg/ml, cerca de 245 mg/ml, cerca de 246 mg/ml, cerca de 247 mg/ml, cerca de 248 mg/ml, cerca de 249 mg/ml, cerca de 250 mg/ml, cerca de 251 mg/ml, cerca de 252 mg/ml, cerca de 253 mg/ml, cerca de 254 mg/ml, cerca de 255 mg/ml, cerca de 256 mg/ml, cerca de 257 mg/ml, cerca de 258 mg/ml, cerca de 259 mg/ml, cerca de 260 mg/ml, cerca de 270 mg/ml, cerca de 280 mg/ml, cerca de 290 mg/ml ou cerca de 300 mg/ml.

[104] De acordo com algumas modalidades da presente inven- ção, o pH pode ser na faixa de cerca de pH 4,0 a 6,0, preferencialmen- te entre cerca de pH 5,0 e de qualquer um de cerca de pH 4,5, cerca de 4,6, cerca de 4,7, cerca de 4,8, cerca de 4,9, cerca de 5,0, cerca de 5,1, cerca de 5,2, cerca de 5,3, cerca de 5,4 ou cerca de 5,5. Ainda preferencialmente, o pH é na faixa selecionada dentre qualquer um de cerca de pH 4,9, 5,0 ou 5,1. Em algumas modalidades, o pH é pH 5,0 +/- 0,5. Valores de pH nessas faixas fornecem a composição com vis- cosidades mais baixas.

[105] Em algumas modalidades, a formulação pode compreender arginina. Em algumas modalidades, a arginina é cloridrato de arginina, ou HCl de arginina. [Bryan: embora a Formulação 7 não contenha ar- ginina, isso foi incluído para alternativas. O mesmo comentário se apli- ca aos outros excipientes etc. não presentes na formulação 7, mas in- cluídos nesta descrição]. A concentração da arginina pode variar de cerca de 0,1 milimolar (mM) a cerca de 200 mM. Em algumas modali- dades, a concentração da arginina é de cerca de 10 mM a cerca de 150 mM, cerca de 50 mM a cerca de 130 mM, cerca de 80 mM a cerca de 120 mM ou cerca de 90 mM a cerca de 110 mM. Em algumas mo- dalidades, a concentração da arginina é cerca de 1 mM, cerca de 2 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cer- ca de 11 mM, cerca de 12 mM, cerca de 13 mM, cerca de 14 mM, cer- ca de 15 mM, cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cer- ca de 19 mM, cerca de 20 mM, cerca de 21 mM, cerca de 22 mM, cer-

ca de 23 mM, cerca de 24 mM, cerca de 25 mM, cerca de 30 mM, cer- ca de 35 mM, cerca de 40 mM, cerca de 45 mM, cerca de 50 mM, cer- ca de 55 mM, cerca de 60 mM, cerca de 65 mM, cerca de 70 mM, cer- ca de 75 mM, cerca de 80 mM, cerca de 85 mM, cerca de 90 mM, a cerca de 95 mM, cerca de 100 mM, cerca de 105 mM, cerca de 110 mM, cerca de 115 mM, cerca de 120 mM, cerca de 125 mM, cerca de 130 mM, cerca de 135 mM, cerca de 140 mM, cerca de 145 mM, cerca de 150 mM, cerca de 155 mM, cerca de 160 mM, cerca de 165 mM, cerca de 170 mM, cerca de 175 mM, cerca de 180 mM, cerca de 185 mM, cerca de 190 mM, cerca de 195 mM ou cerca de 200 mM. Em al- gumas modalidades, a concentração da arginina é 100 mM.

[106] Em algumas modalidades, o agente de tonicidade pode compreender um poliol, um sacarídeo, um carboidrato, um sal, tal co- mo cloreto de sódio, ou misturas dos mesmos. O poliol pode ter um peso molecular que, por exemplo, sem limitação, é inferior a cerca de 600 kD (por exemplo, na faixa de cerca de 120 a cerca de 400 kD), e pode ser, por exemplo, sem limitação, manitol, trealose, sorbitol, eritri- tol, isomalte, lactitol, maltitol, xilitol, glicerol, lactitol, propileno glicol, polietileno glicol, inositol, ou misturas dos mesmos. O sacarídeo ou carboidrato pode ser, por exemplo, sem limitação, um monossacarí- deo, dissacarídeo ou polissacarídeo, ou misturas de quaisquer dos acima. O sacarídeo ou carboidrato pode ser, por exemplo, sem limita- ção, frutose, glucose, manose, sacarose, sorbose, xilose, lactose, mal- tose, sacarose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrinas, amido so- lúvel, amido de hidroxietila, glucanos solúveis em água, ou misturas dos mesmos. O agente de tonicidade pode compreender um sacarí- deo, tal como, por exemplo, sem limitação, um açúcar de redução ou açúcar de não redução ou misturas dos mesmos. O agente de tonici- dade pode compreender um sacarídeo que é um açúcar de não redu- ção, tal como, por exemplo, sem limitação, sacarose, trealose, e mistu-

ras dos mesmos.

[107] A concentração do agente de tonicidade na composição varia de cerca de 1 mg/ml a cerca de 300 mg/ml, de cerca de 1 mg/ml a cerca de 200 mg/ml, ou de cerca de 1 mg/ml a cerca de 100 mg/ml. Preferencialmente, a concentração de o agente de tonicidade na com- posição é cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 1 mg/ml, cerca de 2 mg/ml, cerca de 2,5 mg/ml, cerca de 3 mg/ml, cerca de 3,5 mg/ml, cerca de 4 mg/ml, cerca de 4,5 mg/ml, cerca de 5 mg/ml, cerca de 5,5 mg/ml, cer- ca de 6 mg/ml, cerca de 6,5 mg/ml, cerca de 7 mg/ml, cerca de 7,5 mg/ml, cerca de 8 mg/ml, cerca de 8,5 mg/ml, cerca de 9 mg/ml, cerca de 9,5 mg/ml, cerca de 10 mg/ml, cerca de 11 mg/ml, cerca de 12 mg/ml, cerca de 13 mg/ml, cerca de 14 mg/ml, cerca de 15 mg/ml, cer- ca de 16 mg/ml, cerca de 17 mg/ml, cerca de 18 mg/ml, cerca de 19 mg/ml, cerca de 20 mg/ml, cerca de 21 mg/ml, cerca de 22 mg/ml, cer- ca de 23 mg/ml, cerca de 24 mg/ml, cerca de 25 mg/ml, cerca de 26 mg/ml, cerca de 27 mg/ml, cerca de 28 mg/ml, cerca de 29 mg/ml, cer- ca de 30 mg/ml, cerca de 31 mg/ml, cerca de 32 mg/ml, cerca de 33 mg/ml, cerca de 34 mg/ml, cerca de 35 mg/ml, cerca de 36 mg/ml, cer- ca de 37 mg/ml, cerca de 38 mg/ml, cerca de 39 mg/ml, cerca de 40 mg/ml, cerca de 41 mg/ml, cerca de 42 mg/ml, cerca de 43 mg/ml, cer- ca de 44 mg/ml, cerca de 45 mg/ml, cerca de 46 mg/ml, cerca de 47 mg/ml, cerca de 48 mg/ml, cerca de 49 mg/ml, cerca de 50 mg/ml, cer- ca de 51 mg/ml, cerca de 52 mg/ml, cerca de 53 mg/ml, cerca de 54 mg/ml, cerca de 55 mg/ml, cerca de 56 mg/ml, cerca de 57 mg/ml, cer- ca de 58 mg/ml, cerca de 59 mg/ml, cerca de 60 mg/ml, cerca de 65 mg/ml, cerca de 70 mg/ml, cerca de 75 mg/ml, cerca de 80 mg/ml, cer- ca de 81 mg/ml, cerca de 82 mg/ml, cerca de 83 mg/ml, cerca de 84 mg/ml, cerca de 85 mg/ml, cerca de 86 mg/ml, cerca de 87 mg/ml, cer- ca de 88 mg/ml, cerca de 89 mg/ml, cerca de 90 mg/ml, cerca de 91 mg/ml, cerca de 92 mg/ml, cerca de 93 mg/ml, cerca de 94 mg/ml, cer-

ca de 95 mg/ml, cerca de 96 mg/ml, cerca de 97 mg/ml, cerca de 98 mg/ml, cerca de 99 mg/ml, cerca de 100 mg/ml, cerca de 101 mg/ml, cerca de 102 mg/ml, cerca de 103 mg/ml, cerca de 104 mg/ml, cerca de 105 mg/ml, cerca de 106 mg/ml, cerca de 107 mg/ml, cerca de 108 mg/ml, cerca de 109 mg/ml, cerca de 110 mg/ml, cerca de 111 mg/ml, cerca de 112 mg/ml, cerca de 113 mg/ml, cerca de 114 mg/ml, cerca de 115 mg/ml, cerca de 116 mg/ml, cerca de 117 mg/ml, cerca de 118 mg/ml, cerca de 119 mg/ml, cerca de 120 mg/ml, cerca de 121 mg/ml, cerca de 122 mg/ml, cerca de 123 mg/ml, cerca de 124 mg/ml, cerca de 125 mg/ml, cerca de 126 mg/ml, cerca de 127 mg/ml, cerca de 128 mg/ml, cerca de 129 mg/ml, cerca de 130 mg/ml, cerca de 131 mg/ml, cerca de 132 mg/ml, cerca de 133 mg/ml, cerca de 134 mg/ml, cerca de 135 mg/ml, cerca de 136 mg/ml, cerca de 137 mg/ml, cerca de 138 mg/ml, cerca de 139 mg/ml, cerca de 140 mg/ml, cerca de 141 mg/ml, cerca de 142 mg/ml, cerca de 143 mg/ml, cerca de 144 mg/ml, cerca de 145 mg/ml, cerca de 146 mg/ml, cerca de 147 mg/ml, cerca de 148 mg/ml, cerca de 149 mg/ml ou cerca de 150 mg/ml.

[108] O tensoativo pode ser, por exemplo, sem limitação, um po- lissorbato, poloxâmero, triton, dodecil sulfato de sódio, lauril sulfato de sódio, octil glicosídeo de sódio, lauril-sulfobetaína, miristil-sulfobetaína, linoleil-sulfobetaína, estearil-sulfobetaína, lauril-sarcosina, miristil- sarcosina, linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, linoleil-betaína, miristil- betaína, cetil-betaína, lauroamidopropil-betaína, cocamidopropil- betaína, linoleamidopropil-betaína, miristamidopropil-betaína, palmido- propil-betaína, isostearamidopropil-betaína, miristamidopropil- dimetilamina, palmidopropil-dimetilamina, isostearamidopropil- dimetilamina, metil cocoil-taurato de sódio, metil oleil-taurato dissódico, cloreto de dihidroxipropil PEG 5 linoleamônio, polietileno glicol, poli- propileno glicol, e misturas dos mesmos. O tensoativo pode ser, por exemplo, sem limitação, polissorbato 20, polissorbato 21, polissorbato

40, polissorbato 60, polissorbato 61, polissorbato 65, polissorbato 80, polissorbato 81, polissorbato 85, PEG3350 e misturas dos mesmos. Em algumas modalidades, o tensoativo é polissorbato 80 (PS80).

[109] A concentração do tensoativo geralmente varia de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 5,0 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 2,0 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 1,5 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 0,5 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 0,4 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 0,3 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 0,2 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 0,15 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 0,1 mg/ml, ou de cerca de 0,01 mg/ml, a cerca de 0,05 mg/ml. Ainda preferencialmente, a concentração do tensoativo é cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 0,05 mg/ml cerca de 0,06 mg/ml cerca de 0,07 mg/ml cerca de 0,08 mg/ml, cerca de 0,09 mg/ml cerca de 0,1 mg/ml cerca de 0,11 mg/ml cerca de 0,12 mg/ml cerca de 0,13 mg/ml cerca de 0,14 mg/ml cerca de 0,15 mg/ml cerca de 0,16 mg/ml cerca de 0,17 mg/ml cerca de 0,18 mg/ml cerca de 0,19 mg/ml, cerca de 0,2 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração do tensoativo é 0,2 mg/ml.

[110] O tampão pode ser, por exemplo, sem limitação, acetato, histidina, succinato, gluconato, citrato, ácido acético, fosfato, ácido fos- fórico, ascorbato, ácido tartárico, ácido maleico, glicina, lactato, ácido láctico, ácido ascórbico, imidazol, bicarbonato e ácido carbônico, ácido succínico, benzoato de sódio, ácido benzoico, gluconato, edetato, ace- tato, malato, imidazol, tris, fosfato e misturas dos mesmos. Em algu- mas modalidades, o tampão é um tampão de histidina, em que a histi- dina pode compreender tanto L-histidina ou D-histidina, uma forma solvatada de histidina, uma forma hidratada (por exemplo, monohidra- to) de histidina, um sal de histidina (por exemplo, cloridrato de histidi- na) ou uma forma anidra de histidina ou uma mistura dos mesmos.

Preferencialmente, o tampão é um tampão de acetato, em que o ace- tato pode compreender acetato de sódio, ácido acético, ou uma mistu- ra destes.

[111] A concentração do tampão pode variar de cerca de 0,1 mi- limolar (mM) a cerca de 100 mM. Preferencialmente, a concentração do tampão é de cerca de 0,5 mM a cerca de 50 mM, ainda preferenci- almente cerca de 1 mM a cerca de 30 mM, mais preferencialmente cerca de 1 mM a cerca de 18 mM, ainda mais preferencialmente cerca de 1 mM a cerca de 15 mM. Preferencialmente, a concentração do tampão é cerca de 1 mM, cerca de 2 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cerca de 11 mM, cerca de 12 mM, cerca de 13 mM, cerca de 14 mM, cerca de 15 mM, cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cerca de 19 mM, cerca de 20 mM, cerca de 21 mM, cerca de 22 mM, cerca de 23 mM, cerca de 24 mM, cerca de 25 mM, cerca de 30 mM, cerca de 35 mM, cerca de 40 mM, cerca de 45 mM ou cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, a con- centração do tampão é cerca de 190 mM, cerca de 200 mM, cerca de 210 mM, cerca de 220 mM, cerca de 230 mM, cerca de 240 mM, cerca de 250 mM, cerca de 260 mM, cerca de 270 mM, cerca de 280 mM, cerca de 290, cerca de 300 mM, cerca de 310 mM ou cerca de 320 mM.

[112] Em algumas modalidades, o agente quelante pode ser se- lecionado do grupo que consiste em ácidos aminopolicarboxílicos, áci- dos hidroxiaminocarboxílicos, glicinas N-substituídas, ácido 2-(2- amino-2-oxoctil) aminoetano sulfônico (BES), deferoxamine (DEF), ácido cítrico, niacinamide, e desoxicolatos e misturas dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente quelante é selecionado do grupo que consiste em ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), ácido dietileno- triamina pentaacético 5 (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido N-

2-acetamido-2-iminodiacético (ADA), bis(aminoetil)glicoléter, ácido N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido trans-diaminociclohexano tetraa- cético (DCTA), ácido glutâmico, e ácido aspártico, ácido N- hidroxietiliminodiacético (HIMDA), N,N-bis-hidroxietilglicina (bicina) e N-(trishidroximetilmetil) 10 glicina (tricina), glicilglicina, desoxicolato de sódio, etilenodiamina; propilenodiamina; dietilenotriamina; trietilenote- traamina (trieno), etilenodiaminatetraaceto EDTA; EDTA dissódico, EDTA, ácido oxálido de EDTA de cálcio, malato, ácido cítrico, monohi- drato de ácido cítrico, citrato-di-hidrato trissódico, 8-hidroxiquinolato, aminoácidos, histidina, cisteína, metionina, peptídeos, polipeptídeos, proteínas e misturas dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente quelante é selecionado do grupo que consiste em sais de EDTA inclu- indo edetato dipotássio, edetato dissódico, edetato cálcio dissódico, edetato de sódio, edetato de trissódico, e edetato de potássio; e um sal adequado de deferoxamina (DEF) é mesilato de deferoxamina (DFM), ou misturas dos mesmos. Agentes quelantes usados na inven- ção podem estar presentes, quando possível, como a forma de ácido livre ou base livre ou forma de sal do composto, também como forma anidra, solvatada ou hidratada do composto ou sal correspondente. Após a dissolução em uma solução em um dado pH e na mesma con- centração de etilenodiaminatetraacético (EDTA), várias formas de sal, ácido livre, hidratadas ou anidras de EDTA contendo sódio e água são consideradas agentes quelantes equivalentes. Por exemplo, 0,0500 g/l de di-hidrato de EDTA dissódico (FW: 372,3), 0,0393 g/l de EDTA (FW: 292,3), 0,0452 g/l de EDTA dissódico (FW: 336,2), 0,0481 g/l de EDTA trissódico (FW: 358,2), 0,0511 g/l de EDTA tetrassódico (FW: 380,2), 0,0422 g/l de EDTA de sódio (FW: 314,2), e 0,0446 g/l de hi- drato de EDTA de sódio (FW: 332,3) todos contendo 134,4 µM EDTA são considerados agentes quelantes equivalentes.

[113] Mais preferencialmente, o agente quelante é EDTA, tal co-

mo, por exemplo, sem limitação, EDTA dissódico, EDTA de cálcio, ou di-hidrato de EDTA dissódico.

[114] Particularmente preferível é EDTA dissódico uma vez que fornece a composição com uma melhor estabilidade de anticorpo e/ou resistência à agregação.

[115] A concentração de agente quelante geralmente varia de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, de cerca de 1 mg/ml a cerca de 10,0 mg/ml, de cerca de 5 mg/ml a cerca de 15,0 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, ou de cerca de 0,03 mg/ml a cer- ca de 0,5 mg/ml. Ainda preferencialmente, a concentração de agente quelante geralmente varia de de cerca de 0,01 mM a cerca de 2,0 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 1,5 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,5 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,4 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,3 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,2 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,15 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,1 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,09 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,08 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,07 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,06 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,05 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,04 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,03 mM, de cerca de 0,01 mM a cerca de 0,02 mM ou de cerca de 0,05 mM a cerca de 0,01 mM. Preferencialmente, a concentração de agente quelante pode ser cerca de 0,01 mg/ml, 0,02 mg/ml, 0,03 mg/ml, cerca de 0,04 mg/ml, cerca de 0,05 mg/ml, cerca de 0,06 mg/ml, cerca de 0,07 mg/ml, cerca de 0,10 mg/ml, cerca de 0,20 mg/ml. Ainda preferencialmente, a concentração de agente quelante é cerca de 0,04 mg/ml, cerca de 0,041 mg/ml, cerca de 0,042 mg/ml, cerca de 0,043 mg/ml, cerca de 0,044 mg/ml, cerca de 0,045 mg/ml, cerca de 0,046 mg/ml, cerca de 0,047 mg/ml, cerca de 0,048 mg/ml, cerca de 0,049 mg/ml, cerca de 0,05 mg/ml, cerca de 0,051 mg/ml, cerca de 0,052 mg/ml, cerca de 0,053 mg/ml, cerca de 0,054 mg/ml, cerca de 0,055 mg/ml ou cerca de 0,056 mg/ml. Most preferen- cialmente, a concentração de agente quelante é cerca de 0,05 mg/ml.

[116] Agentes quelantes podem diminuir a formação de espécies de oxigênio reduzido, reduzir a formação de espécies ácidas (por exemplo, desamidação), reduzir a agregação de anticorpos, e/ou re- duzir a fragmentação de anticorpos, e/ou reduzir a oxidação de anti- corpos nas composições da presente invenção. Esses agentes quelan- tes podem reduzir ou prevenir a degradação de um anticorpo que é formulado em comparação com o anticorpo sem a proteção de um agente quelante.

[117] Salvo indicação em contrário, as concentrações listadas neste documento são aquelas concentrações em condições ambiente, ou seja, a 25°C e pressão atmosférica.

[118] Em modalidades preferidas, a formulação não compreende nenhum antioxidante. Por exemplo, modalidades preferidas das com- posições providas neste documento não compreendem metionina, ti- ossulfato de sódio, catalase ou platina.

[119] Em algumas modalidades, a formulação pode compreender um agente antioxidante. Em algumas modalidades, o antioxidante é selecionado do grupo que compreende metionina, tiossulfato de sódio, catalase e platina.

[120] A concentração de antioxidante geralmente varia de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 10,0 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 5,0 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, ou de cerca de 0,01 mg/ml a cer- ca de 0,02 mg/ml. Preferencialmente, a concentração de antioxidante pode ser cerca de 0,01 mg/ml, 0,02 mg/ml, 0,03 mg/ml, cerca de 0,04 mg/ml, cerca de 0,05 mg/ml, cerca de 0,06 mg/ml, cerca de 0,07 mg/ml, 0,08 mg/ml, 0,09 mg/ml, cerca de 0,10 mg/ml, 0,11 mg/ml, 0,12 mg/ml, 0,13 mg/ml, cerca de 0,14 mg/ml, cerca de 0,15 mg/ml, cerca de 0,16 mg/ml, cerca de 0,17 mg/ml, 0,18 mg/ml, 0,19 mg/ml cerca de 0,20 mg/ml, cerca de 0,25 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1,0 mg/ml. Most preferencial- mente, a concentração de antioxidante é cerca de 0,01 mg/ml.

[121] Em algumas modalidades, a formulação pode compreender um conservante. Preferencialmente, o agente conservante é selecio- nado de fenol, m-cresol, álcool benzílico, cloreto de benzalcônio, clore- to de benzaltônio, fenoxietanol e metil parabeno.

[122] A concentração de conservante geralmente varia de cerca de 0,001 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, de cerca de 0,005 mg/ml a cerca de 15,0 mg/ml, de cerca de 0,008 mg/ml a cerca de 12,0 mg/ml ou de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 10,0 mg/ml. Preferencialmente, a con- centração de conservante pode ser cerca de 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, cerca de 0,4 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 0,6 mg/ml, cerca de 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml cerca de 1,0 mg/ml, 2,0 mg/ml, 3,0 mg/ml, cerca de 4,0 mg/ml, cerca de 5,0 mg/ml, cerca de 6,0 mg/ml, cerca de 7,0 mg/ml, 8,0 mg/ml, 9,0 mg/ml cerca de 9,1 mg/ml, cerca de 9,2 mg/ml, 9,3 mg/ml, 9,4 mg/ml, 9,5 mg/ml, 9,6 mg/ml, 9,7 mg/ml, 9,8 mg/ml, 9,9 mg/ml, 10,0 mg/ml. Most preferenci- almente, a concentração de conservante é cerca de 0,1 mg/ml ou 9,0 mg/ml.

[123] Em algumas modalidades, a composição não contém um antioxidante.

[124] Em algumas modalidades, a composição não contém um conservante.

[125] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada, tal como, por exemplo, IgG, IgM, IgD, IgA, e IgE; e quaisquer isótipos, tal como IgG1, lgG2, IgG3 e IgG4. Preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo de IgG2 ou IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região cons-

tante de IgG4 compreendendo as seguintes mutações (Armour et al., 2003, Molecular Immunology 40 585-593): E233F234L235 a P233V234A235 (IgG4Δc), em que a numeração é com referência a IgG4 de tipo selvagem. Ainda em outra modalidade, a Fc é IgG4 hu- mana E233F234L235 to P233V234A235 com exclusão G236 (IgG4Δb). Em algumas modalidades, a Fc é qualquer Fc de IgG4 hu- mana (IgG4, IgG4Δb ou IgG4Δc) contendo mutação de estabilização de dobradiça S228 a P228 (Aalberse et al., 2002, Immunology 105, 9- 19).

[126] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser seleciona- do do grupo que consiste em anticorpos monoclonais, anticorpos poli- clonais, fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, ScFv etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anti- corpos heteroconjugados, de cadeia simples (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo (por exemplo, um anticorpo de domínio), anticorpos humanizados, an- ticorpos humanos, e qualquer outra configuração modificada da molé- cula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno da especificidade necessária, incluindo variantes de glico- silação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácido de anti- corpos, e anticorpos covalentemente modificados. O anticorpo pode ser murino, rato, humano ou de qualquer outra origem (incluindo anti- corpos quiméricos ou humanizados). Em algumas modalidades, o an- ticorpo pode ser humano, mas é mais preferencialmente humanizado. Preferencialmente, o anticorpo é isolado, ainda preferencialmente ele é substancialmente puro. Onde o anticorpo é um fragmento de anti- corpo, este preferencialmente retém as características funcionais do anticorpo original, ou seja, a ligação de ligante e/ou atividade antago- nista ou agonista.

[127] Anticorpos anti-PD-1 ilustrativos incluem, mas sem limita-

ção, por exemplo: nivolumab (OPDIVO®, ONO-4538, BMS-936558, MDX1106, Bristol-Myers Squibb Company), pembrolizumab (KEYTRUDA®, MK-3475, lambrolizumab, Merck & Co., Inc.), BCD100 (BIOCAD Biopharmaceutical Company), BGB-A317 (BeiGene Ltd./Celgene Corporation), CBT-501 (CBT Pharmaceuticals), GLS-010 (Harbin Gloria Pharmaceuticals Co., Ltd.), IBI308 (Innovent Biologics, Inc.), AMP-224 (GlaxoSmithKline plc), BI 754091 (Boehringer Inge- lheim GmbH), PDR001 (Novartis AG), MEDI0680 (AstraZeneca PLC), PDR001 (Novartis AG), PF-06801591 (aka RN888) (Pfizer Inc.), des- crito como mAb7 na Publicação de Patente Internacional Nº. WO2016/092419, a divulgação da qual é aqui incorporada por referên- cia em sua totalidade, REGN2810 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), SHR-1210 (Incyte Corporation), TSR-042 (Tesaro, Inc.), AGEN2034 (Agenus Inc.), JNJ-63723283 (Johnson & Johnson), MGD013 (Macro- Genics, Inc.), ANA011 (AnaptysBio, Inc.), ANB011 (AnaptysBio, Inc.), AUNP-12 (Pierre Fabre Medicament S.A.), ENUM 244C8 (Enumeral Biomedical Holdings, Inc.), hAb21 (Stainwei Biotech, Inc.), J43 (Trans- gene S.A.), JTX-4014 (Jounce Therapeutics, Inc.), MCLA-134 (Merus B.V.), PRS-332 (Pieris AG), SHR-1316 (Atridia Pty Ltd.), STI-A1010 (Sorrento Therapeutics, Inc.), STI-A1110 (Les Laboratoires Servier), e XmAb20717 (Xencor, Inc.).

[128] BGB-A317 (tislelizumab), em desenvolvimento por BeiGene Ltd., é um anticorpo monoclonal de IgG4 humanizado tendo uma regi- ão Fc modificada (isto é, em que a capacidade de ligar o receptor Fc gama I foi especificamente removida). BGB-A317 se liga a PD-1 e ini- be a ligação de PD-1 a PD-L1 e PD-L2.

[129] Em uma ou mais modalidades, o antagonista de ligação ao eixo de PD-1 é selecionado de PF-06801591, nivolumab, pembrolizu- mab, spartalizumab, e BGB-A317.

[130] Em um aspecto específico, o anticorpo anti-PD-1 é PF-

06801591 (Pfizer Inc., Registro CAS Nº. 2029210-61-3). Em outro as- pecto específico, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumab (OPDIVO®, MDX- 1106, Registro CAS Nº. 946414-94-4). Em outro aspecto específico, o anticorpo anti-PD-1 é cemiplimab (LIBTAYO®, também conhecido co- mo REGN2810, Regeneron Pharmaceuticals, Inc. e sanofi-aventis U.S. LLC, Registro CAS Nº. 1801342-60-8). Em outro aspecto especí- fico, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumab (OPDIVO®, MDX-1106, Regis- tro CAS Nº. 946414-94-4). Em outro aspecto específico, o anticorpo anti-PD-1 é spartalizumab (PDR001, Novartis, Registro CAS Nº. 1935694-88-4). Em outro aspecto específico, um antagonistra de liga- ção a PD-1 é o anticorpo compreendendo uma região VH produzida pelo vetor de expressão com Acesso ATCC Nº. PTA-121 183 e tendo a região VL produzida pelo vetor de expressão com Acesso ATCC Nº. PTA-1 21 182, também conhecido como mAb7 ou mAb15 (Rinat Neu- roscience, Pfizer Inc.) conforme descrito neste documento.

[131] Em um aspecto específico, o anticorpo anti-PD-1 compre- ende uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4 (GYTFTSYWIN); (b) uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 5 (NIYPGSSLTNYNEKFKN); e (c) uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 6 (LSTGTFAY).

[132] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser um anticor- po anti-PD-1 compreendendo uma região variável de cadeia leve com- preendendo: (a) uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 7 (KSSQSLWDSGNQKNFLT); (b) uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 8 (WTSYRES); e

(c) uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9 (QNDYFYPHT).

[133] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser anticorpo anti-PD-1 compreendendo três CDRs de uma região variável de ca- deia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2. QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVR- QAPGQGLEWMGNIYPGSSLTNYNEKFKNRVTM-

TRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSTGTFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)

[134] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser anticorpo anti-PD-1 compreendendo três CDRs de uma região variável de ca- deia leve compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3. DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLWDSGNQKNFLTWYQQK- PGQPPKLLIYWTSYRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAED- VAVYYCQNDYFYPHTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 3)

[135] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de qualquer um de pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 2 e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de qual- quer um de pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoáci- do compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 3, em que o anticorpo se liga especificamente a PD-1 humano.

[136] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 e/ou pode compreender uma região variá- vel de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido com- preendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3.

[137] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 pode ser um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NOS: 2 e 3.

[138] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 pode compreender uma região de cadeia pesada compreendendo uma se- quência de aminoácido de qualquer um de pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica à sequência de aminoácido compreendendo a sequência de ami- noácido mostrada na SEQ ID NO: 10 e/ou uma região de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de qualquer um de pe- lo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido compreenden- do a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 11, em que o anticorpo se liga especificamente a PD-1 humano.

[139] Sequência de cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVR- QAPGQGLEWMGNIYPGSSLTNYNEKFKNRVTM- TRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSTGTFAYWGQGTLVTVS- SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS- GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHK- PSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 10)

[140] Sequência de cadeia leve DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLWDSGNQKNFLTWYQQK- PGQPPKLLIYWTSYRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAED- VAVYYCQNDYFYPHTFGGGTKVEIKRGTVAAPSVFIFPPS- DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE- QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR- GEC (SEQ ID NO: 11)

[141] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 pode compreender uma região de cadeia pesada compreendendo a se- quência de aminoácido compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 10 e/ou pode compreender uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido compreen- dendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, a lisina C-terminal da sequência de cadeia pe- sada mostrada na SEQ ID NO: 10 pode ser clivada; isto é, the se- quência de cadeia pesada pode não ter uma lisina C-terminal.

[142] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 pode ser um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácido mostra- das nas SEQ ID NOS: 10 e 11.

[143] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 pode competir para ligação de PD-1 com um anticorpo anti-PD-1 conforme definido neste documento. O anticorpo anti-PD-1 pode competir para ligação de PD-1 com um anticorpo compreendendo uma região variá- vel de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequên- cia de aminoácido compreendendo a sequência de aminoácido mos- trada na SEQ ID NO: 3.

[144] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 pode ser um anticorpo monoclonal, mAb7, que especificamente liga PD-1 hu-

mano. O anticorpo mAb7 é descrito em WO2016/092419, o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade. As se- quências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de mAb7 são mostradas nas SEQ ID NOs: 2 e 3, respectiva- mente. As porções de CDR de anticorpo mAb7 (incluindo Chothia e Kabat CDRs) são diagramaticamente apresentadas na Tabela 1 de WO2016/092419. O anticorpo mAb7 é altamente potente no bloqueio da atividade biológica de PD-1.

[145] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 pode tam- bém compreender um fragmento ou uma região do anticorpo mAb7. Em uma modalidade, o fragmento é uma cadeia leve do anticorpo mAb7 compreendendo a sequência de aminoácido conforme mostrada na SEQ ID NO: 11 neste documento. Em outra modalidade, o frag- mento é uma cadeia pesada do anticorpo mAb7 compreendendo a se- quência de aminoácido como mostrada na SEQ ID NO: 10 neste do- cumento. Ainda em outra modalidade, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo mAb7. Ainda em outra modalidade, o fragmento contém uma ou mais CDRs de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anti- corpo mAb7 compreendendo as sequências de aminoácido como mos- tradas na SEQ ID NOS: 11 e 10, respectivamente, neste documento.

[146] Em algumas modalidades, o anticorpo pode compreender uma ou mais (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) CDR(s) derivadas de anticorpo mAb7. Em algumas modalidades, as CDRs podem ser CDRs de Kabat, CDRs de Chothia, ou uma combinação de CDRs de Kabat e Chothia (denominadas CDRs “estendidas” ou “combinadas” neste documento). Em algumas modalidades, os polipeptídeos com- preendem quaisquer das configurações de CDR (incluindo combina- ções, variantes etc.) descritas neste documento.

[147] Em algumas modalidades da presente invenção, a lisina C-

terminal da cadeia pesada de qualquer um dos anticorpos anti-PD-1 descritos neste documento é excluída. Em vários casos, a cadeia pe- sada e/ou leve dos anticorpos anti-PD-1 descritos neste documento pode opcionalmente incluir uma sequência sinal.

[148] Em outras modalidades, o anticorpo pode ser selecionado de um anticorpo anti-PD-1 conhecido na técnica, tais como anticorpos descritos em, por exemplo, sem limitação, qualquer um dos seguintes: Patentes dos EUA Nºs. 8354509, 9084776, 9492540, 9492539, 9387247, 8779105, 8952136 e 8709416. O anticorpo pode se ligar ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-PD-1 conhecido na técnica e/ou pode competir para ligação a PD-1 com tal um anticorpo.

[149] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é pro- vida uma composição compreendendo ou consistindo essencialmente em; cerca de 140 mg/ml a cerca de 160 mg/ml de anticorpo, cerca de 10,0 mM a cerca de 30,0 mM de tampão de histidina, cerca de 40 mg/ml a cerca de 100 mg/ml de trealose, cerca de 0,01 a cerca de 0,3 mg/ml polissorbato 80 (PS80), e cerca de 0,01 a cerca de 0,1 mg/ml de EDTA dissódico, em que a referida composição tem um pH de selecionado da faixa en- tre cerca de pH 4,5 e qualquer de cerca de pH 5,5, ou alternativamente da faixa entre cerca de pH 4,5 e qualquer um de cerca de pH 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9

[150] De acordo com uma modalidade preferida, a composição compreende ou consiste essencialmente em qualquer um de cerca de 90 mg/ml, cerca de 100 mg/ml, cerca de 110 mg/ml, cerca de 120 mg/ml, cerca de 130 mg/ml, cerca de 140 mg/ml ou cerca de 150 mg/ml de anticorpo, cerca de 20 mM de tampão de histidina, cerca de 84 mg/ml de trealose,

cerca de 0,2 mg/ml de PS80, e cerca de 0,05 mg/ml de EDTA dissódico, em que a referida composição tem um pH de selecionado da faixa en- tre cerca de pH 5,0 e qualquer de cerca de pH 5,0, 5,2, 5,5 ou 5,8, ou alternativamente da faixa entre cerca de pH 4,5 e qualquer de cerca de pH 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, ou 5,5, e em que o re- ferido anticorpo compreende uma sequência de cadeia pesada variá- vel compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 2 e uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a se- quência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 3.

[151] De acordo com uma modalidade preferida, a composição compreende ou consiste essencialmente em qualquer um de cerca de 120 mg/ml, cerca de 130 mg/ml, cerca de 140 mg/ml, cerca de 150 mg/ml, cerca de 160 mg/ml, cerca de 170 mg/ml ou cerca de 180 mg/ml de anticorpo, cerca de 20 mM de tampão de histidina, cerca de 84 mg/ml de trealose, cerca de 0,2 mg/ml de PS80, e cerca de 0,05 mg/ml de EDTA dissódico, em que o pH de a referida composição é cerca de pH 5,0, +/- 0,5 e em que o referido anticorpo compreende uma sequência de cadeia pesa- da variável compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 2 e uma sequência de cadeia leve variável compreenden- do a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 3. Em algu- mas modalidades, o volume de dose usado é cerca de 0,5 ml, cerca de 1 ml, cerca de 2 ml, cerca de 3 ml, cerca de 4 ml, cerca de 5 ml, cerca de 6 ml, cerca de 7 ml, cerca de 8 ml, cerca de 9 ml, cerca de 10 ml, cerca de 11 ml, cerca de 12 ml, cerca de 13 ml, cerca de 14 ml, cerca de 15 ml, cerca de 16 ml, cerca de 17 ml, cerca de 18 ml, cerca de 19 ml, cerca de 20 ml, cerca de 21 ml, cerca de 22 ml, cerca de 23 ml, cerca de 24 ml, cerca de 25 ml, cerca de 26 ml, cerca de 27 ml, cerca de 28 ml, cerca de 29 ml, cerca de 30 ml, cerca de 31 ml, cerca de 32 ml, cerca de 33 ml, cerca de 34 ml, cerca de 35 ml, cerca de 36 ml, cerca de 37 ml, cerca de 38 ml, cerca de 39 ml, cerca de 40 ml, cerca de 41 ml, cerca de 42 ml, cerca de 43 ml, cerca de 44 ml, cerca de 45 ml, cerca de 46 ml, cerca de 47 ml, cerca de 48 ml, cerca de 49 ml ou cerca de 50 ml.

[152] Em algumas modalidades, é provida uma composição que é liofilizada e/ou foi submetida à liofilização. Em algumas modalidades, é provida uma composição que é não liofilizada e não foi submetida à liofilização.

[153] Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo é qualquer uma de cerca de 100 mg/ml, cerca de 105 mg/ml, cerca de 110 mg/ml, cerca de 115 mg/ml, cerca de 120 mg/ml, cerca de 125 mg/ml, cerca de 130 mg/ml, cerca de 135 mg/ml, cerca de 140 mg/ml, cerca de 145 mg/ml, cerca de 150 mg/ml, cerca de 155 mg/ml ou cerca de 160 mg/ml.

[154] De acordo com outro aspecto preferido da presente inven- ção, é provida uma composição, de qualquer aspecto ou modalidade acima, para a fabricação de um medicamento para tratamento de um distúrbio hiperproliferativo, tal como, por exemplo, câncer, em um indi- víduo.

[155] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado de um ou mais de câncer gástrico, sarcoma, linfoma, linfoma de Hodgkin, leucemia, câncer de cabeça e pescoço, câncer de cabeça e pescoço de células escamosas, câncer tímico, câncer epitelial, câncer salivar, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de tireoide, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de próstata, cân- cer esofágico, câncer pancreático, glioma, leucemia, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer cervical, corio-

carcinoma, câncer de cólon, câncer oral, câncer de pele, e melanoma.

[156] De acordo com ainda outra modalidade da invenção, é pro- vida uma composição, de qualquer aspecto ou modalidade acima, pa- ra a fabricação de um medicamento para tratamento de um distúrbio hiperproliferativo, tal como, por exemplo, câncer, em um indivíduo.

[157] De acordo com uma modalidade preferida, a composição pode ser administrada diretamente na corrente sanguínea, no múscu- lo, em tecido, em gordura, ou em um órgão interno. Os meios adequa- dos para administração parenteral incluem subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, in- traesternal, intracraniana, intramuscular, intraóssea e intradérmica. Dispositivos adequados para administração parenteral incluem injeto- res de agulha (incluindo microagulha, microprojeções, agulhas solú- veis e outras técnicas de formação de microporos), injetores sem agu- lha e técnicas de infusão.

[158] Em algumas modalidades, o padrão de administração do medicamento compreende a administração de uma dose do medica- mento uma vez a cada semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada cinco semanas, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez a cada nove semanas, uma vez a cada dez semanas, uma vez a cada quinze se- manas, uma vez a cada vinte semanas, uma vez a cada vinte e cinco semanas, ou uma vez a cada vinte e seis semanas. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo anti-PD-1 é administrado uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses, ou uma vez a cada seis meses. Em algumas modalidades, o padrão de administração do me- dicamento compreende a administração de uma dose do medicamento uma vez a cada quatro ou oito semanas.

[159] Em algumas modalidades, o volume de uma dose é menor ou igual a cerca de 3 ml, cerca de 2,5 ml, cerca de 2 ml, cerca de 1,5 ml, cerca de 1 ml, cerca de 0,75 ml, cerca de 0,5 ml, cerca de 0,25 ml ou cerca de 0,1 ml.

[160] Em algumas modalidades, o volume de uma dose é cerca de 20 ml, cerca de 19 ml, cerca de 18 ml, cerca de 17 ml, cerca de 16 ml, cerca de 15 ml, cerca de 14 ml, cerca de 13 ml, cerca de 12 ml, cerca de 11 ml, cerca de 10 ml, cerca de 9 ml, cerca de 8 ml, cerca de 7 ml, cerca de 6 ml, cerca de 5 ml, cerca de 4 ml, cerca de 3 ml, cerca de 2 ml ou cerca de 1 ml. Alternativamente, o volume de uma dose é cerca de 20,5 ml, cerca de 19,5 ml, cerca de 18,5 ml, cerca de 17,5 ml, cerca de 16,5 ml, cerca de 15,5 ml, cerca de 14,5 ml, cerca de 13,5 ml, cerca de 12,5 ml, cerca de 11,5 ml, cerca de 10,5 ml, cerca de 9,5 ml, cerca de 8,5 ml, cerca de 7,5 ml, cerca de 6,5 ml, cerca de 5,5 ml, cer- ca de 4,5 ml, cerca de 3,5 ml, cerca de 2,5 ml, cerca de 1,5 ml ou cer- ca de 0,5 ml. Alternativamente, o volume de uma dose é cerca de 900 microlitros, cerca de 800 microlitros, cerca de 700 microlitros, cerca de 600 microlitros, cerca de 500 microlitros, cerca de 400 microlitros, cerca de 300 microlitros, cerca de 200 microlitros ou cerca de 100 microlitros, alternativamente cerca de 950 microlitros, cerca de 850 microlitros, cerca de 750 microlitros, cerca de 650 microlitros, cerca de 550 microlitros, cer- ca de 450 microlitros, cerca deB 350 microlitros, cerca de 250 microlitros, cerca de 150 microlitros ou cerca de 50 microlitros. Em algumas modali- dades, o volume da dose é menor ou igual a cerca de 2,0 ml.

[161] De acordo com uma modalidade preferida, a concentração de anticorpo pode variar de cerca de 0,1 a cerca de 200 mg/ml. Prefe- rencialmente, a concentração de anticorpo é cerca de 100 mg/ml, cer- ca de 101 mg/ml, cerca de 102 mg/ml, cerca de 103 mg/ml, cerca de 104 mg/ml, cerca de 105 mg/ml, cerca de 106 mg/ml, cerca de 107 mg/ml, cerca de 108 mg/ml, cerca de 109 mg/ml ou cerca de

110mg/ml, cerca de 111 mg/ml, cerca de 112 mg/ml, cerca de 113 mg/ml, cerca de 114 mg/ml, cerca de 115 mg/ml, cerca de 116 mg/ml, cerca de 117 mg/ml, cerca de 118 mg/ml, cerca de 119 mg/ml, cerca de 120 mg/ml, cerca de 121 mg/ml, cerca de 122 mg/ml, cerca de 123 mg/ml, cerca de 124 mg/ml, cerca de 125 mg/ml, cerca de 126 mg/ml, cerca de 127 mg/ml, cerca de 128 mg/ml, cerca de 129 mg/ml, cerca de 130 mg/ml, cerca de 131 mg/ml, cerca de 132 mg/ml, cerca de 133 mg/ml, cerca de 134 mg/ml, cerca de 135 mg/ml, cerca de 136 mg/ml, cerca de 137 mg/ml, cerca de 138 mg/ml, cerca de 139 mg/ml, cerca de 140 mg/ml, cerca de 141 mg/ml, cerca de 142 mg/ml, cerca de 143 mg/ml, cerca de 144 mg/ml, cerca de 145 mg/ml, cerca de 146 mg/ml, cerca de 147 mg/ml, cerca de 148 mg/ml, cerca de 149 mg/ml ou cerca de 150 mg/ml. Mais preferencialmente, a concentração de anticorpo é cerca de 100 mg/ml a cerca de 180 mg/ml e pode ser selecionada do grupo compreendendo cerca de 100 mg/ml, cerca de 105 mg/ml, cerca de 110 mg/ml, cerca de 115 mg/ml, cerca de 120 mg/ml, cerca de 125 mg/ml, cerca de 130 mg/ml, cerca de 135 mg/ml, cerca de 140 mg/ml, cerca de 145 mg/ml, cerca de 150 mg/ml, cerca de 155 mg/ml, cerca de 160 mg/ml, cerca de 165 mg/ml, cerca de 170 mg/ml, cerca de 175 mg/ml ou cerca de 180 mg/ml.

[162] De acordo com uma modalidade preferida, uma dose con- tém menos do que ou é igual a cerca de 50 mg, cerca de 51 mg, cerca de 52 mg, cerca de 53 mg, cerca de 54 mg, cerca de 55 mg, cerca de 56 mg, cerca de 57 mg, cerca de 58 mg, cerca de 59 mg, cerca de 60 mg, cerca de 70 mg, cerca de 80 mg, cerca de 90 mg, cerca de 100 mg, cerca de 110 mg, cerca de 120 mg, cerca de 130 mg, cerca de 140 mg, cerca de 150 mg, cerca de 160 mg, cerca de 170 mg, cerca de 180 mg, cerca de 190 mg, cerca de 200 mg, cerca de 210 mg, cer- ca de 220 mg, cerca de 230 mg, cerca de 240 mg, cerca de 250 mg, cerca de 260 mg, cerca de 270 mg, cerca de 280 mg, cerca de 290 mg, cerca de 300 mg, cerca de 310 mg, cerca de 320 mg, cerca de 330 mg, cerca de 340 mg, cerca de 350 mg, cerca de 360 mg, cerca de 370 mg, cerca de 380 mg, cerca de 390 mg, cerca de 400 mg, cer- ca de 410 mg, cerca de 420 mg, cerca de 430 mg, cerca de 440 mg, cerca de 450 mg, cerca de 460 mg, cerca de 470 mg, cerca de 480 mg, cerca de 490 mg, cerca de 500 mg, cerca de 510 mg, cerca de 520 mg, cerca de 530 mg, cerca de 540 mg, cerca de 550 mg, cerca de 560 mg, cerca de 570 mg, cerca de 580 mg, cerca de 590 mg, cer- ca de 600 mg, cerca de 610 mg, cerca de 620 mg, cerca de 630 mg, cerca de 640 mg, cerca de 650 mg, cerca de 660 mg, cerca de 670 mg, cerca de 680 mg, cerca de 690 mg, cerca de 700 mg, cerca de 710 mg, cerca de 720 mg, cerca de 730 mg, cerca de 740 mg, cerca de 750 mg, cerca de 760 mg, cerca de 770 mg, cerca de 780 mg, cer- ca de 790 mg, cerca de 800 mg, cerca de 810 mg, cerca de 820 mg, cerca de 830 mg, cerca de 850 mg, cerca de 850 mg, cerca de 860 mg, cerca de 870 mg, cerca de 880 mg, cerca de 890 mg, cerca de 900 mg, cerca de 910 mg, cerca de 920 mg, cerca de 930 mg, cerca de 940 mg, cerca de 950 mg, cerca de 960 mg, cerca de 970 mg, cer- ca de 980 mg, cerca de 990 mg ou cerca de 1000 mg de anticorpo.

[163] De acordo com algumas modalidades, a dose contém uma quantidade de anticorpo que é cerca de 1 µg/kg, cerca de 10 µg/kg, cerca de 20 µg/kg, cerca de 25 µg/kg, cerca de 50 µg/kg, cerca de 100 µg/kg, cerca de 200 µg/kg, cerca de 250 µg/kg, cerca de 500 µg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, cerca de 10 mg/kg ou cerca de 11 mg/kg (de massa do indivíduo ao qual a dose deve ser administrada). Em algumas modalidades, a dose contém cerca de 20 µg/kg, cerca de 25 µg/kg, cerca de 50 µg/kg, cerca de 100 µg/kg, cerca de 200 µg/kg, cerca de 250 µg/kg, 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cer-

ca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg.

[164] Os regimes de dosagem podem depender do padrão de decaimento farmacocinético que o médico deseja alcançar. Por exem- plo, em algumas modalidades, a dosagem de uma a quatro vezes por semana é contemplada. Uma dosagem ainda menos frequente pode ser usada. Em algumas modalidades, a dose é administrada uma vez por semana, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, a cada 4 sema- nas, a cada 5 semanas, a cada 6 semanas, a cada 7 semanas, a cada 8 semanas, a cada 9 semanas, a cada 10 semanas, a cada 15 sema- nas, a cada 20 semanas, a cada 25 semanas, ou mais. Em algumas modalidades, a dose é administrada uma vez por mês, a cada 2 me- ses, a cada 3 meses, a cada 4 meses, a cada 5 meses, a cada 6 me- ses ou mais. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por ensaios técnicos e convencionais. O regime de dosagem pode variar com o tempo.

[165] Para o propósito da presente invenção, a dosagem apropri- ada do medicamento dependerá do anticorpo empregado, do tipo e gravidade do distúrbio a ser tratado, se o agente é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, histórico clínico do pa- ciente e resposta ao agente, e a critério do médico assistente. Nor- malmente, o médico administrará o medicamento até que seja atingida uma dosagem que alcance o resultado desejado. As dosagens podem ser determinadas empiricamente. Por exemplo, os indivíduos recebem dosagens incrementais para avaliar a eficácia do medicamento.

[166] A dose e/ou frequência pode variar ao longo do tratamento. Considerações empíricas, tais como a meia-vida do anticorpo, geral- mente contribuirão para a determinação da dosagem. A frequência de administração pode ser determinada e ajustada ao longo do curso da terapia, e é geralmente, mas não necessariamente, com base no tra-

tamento e/ou supressão e/ou melhoria e/ou retardo de um ou mais sin- tomas da doença hiperproliferativa. Em alguns indivíduos, mais de uma dose pode ser necessária. A frequência de administração pode ser determinada e ajustada ao longo do curso da terapia. Por exemplo, sem limitação, para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da doença e sua gravidade, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas ou até que ní- veis terapêuticos suficientes sejam alcançados para tratar o câncer.

[167] A administração de um medicamento compreendendo a composição pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, se a finalidade da admi- nistração é terapêutica ou profilática, e outros fatores do conhecimento dos profissionais especializados. A administração do medicamento compreendendo uma composição pode ser essencialmente contínua ao longo de um período de tempo pré-selecionado ou pode ser em uma série de doses espaçadas.

[168] Preferencialmente, a administração da dose é uma adminis- tração parenteral preferencialmente selecionada de intravenosa, intra- arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraes- ternal, intracraniana, intramuscular, intraóssea, intradérmica e subcu- tânea. Preferencialmente, o medicamento é em uma forma de dosa- gem unitária estéril para administração parenteral.

[169] Os exemplos a seguir são oferecidos apenas para fins ilus- trativos, e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de forma alguma. De fato, várias modificações da invenção, além daque- las mostradas e descritas neste documento, se tornarão evidentes pa- ra aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e são en- globadas pelo escopo das reivindicações anexas. Os exemplos no WO2016/092419 são referidos para ilustrar os anticorpos para na pre- sente invenção. Todo o conteúdo do WO2016/092419 é aqui incorpo-

rado por referência.

EXEMPLOS Métodos

[170] Esta seção de Métodos fornece um resumo dos métodos usados nos seguintes Exemplos 1-6.

[171] A viscosidade de formulações de anticorpo foi medida em um instrumento m-VROC com base em chip, em que a diferença de pressão se correlaciona com viscosidade dinâmica da solução. As medições foram testadas em diferentes taxas de fluxo e taxas de cisa- lhamento. O tamanho da amostra foi de aproximadamente 70-100 µL. Alíquotas foram carregadas em uma seringa Hamilton de 100 µL e co- nectadas ao chip m-VROC. Medições em triplicata foram feitas a 20ºC.

[172] Para determinar a estabilidade de congelamento e descon- gelamento, o anticorpo anti-PD-1 a 100-150 mg/ml foi submetido a ci- clos de -20ºC a 2-8ºC por 5 ciclos. A estabilidade de anticorpo foi ava- liada via pH, concentração, e SEC.

[173] Para determinar a estabilidade à agitação, o anticorpo anti- PD-1 em alta concentração foi avaliado após 24 horas de agitação a 300 rpm, e temperatura ambiente e luz na posição vertical. A estabili- dade foi avaliada via pH, concentração e SEC.

[174] A estabilidade do pH de formulações de anticorpo em alta concentração foi medida de acordo com método compendial USP <791> e método compendial EP 2.2.3 usando um instrumento potenci- ômetro adequado e devidamente padronizado (medidor de pH Thermo Scientific Orion Star A111) capaz de reproduzir valores de pH para 0,02 unidades de pH usando um eletrodo indicador sensível à ativida- de de íons de hidrogênio, eletrodo de vidro e eletrodo de referência adequado (Microeletrodo de pH combinado Thermo Scientific Orion™ PerpHecT™ ROSS™). Calibrações de dois ou três pontos a 22,5- 25,4ºC foram realizadas no dia do uso para verificação da padroniza-

ção do medidor de pH, amostras equilibradas à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos, e valores de 0,01 unidades de pH regis- trados após leitura de pH estabilizado por pelo menos 60 segundos.

[175] As concentrações de proteína totais foram medidas espec- troscopicamente usando instrumento SoloVPE (C Technologies Inc.) com base no comprimento de percurso variável e lei de Beer-Lambert (A = cl, em que A = absorbância, c = concentração, l = comprimento do percurso, e  = coeficiente de extinção/coeficiente de absorbância molar em mg ml-1 cm-1). Para o anticorpo anti-PD-1 mAb7, o ε usado é 1,62 mg mg ml-1 cm-1. Para o nivolumab, o ε usado é 1,68 mg mg ml-1 cm- 1 . Para o pembrolizumab, o ε usado é 1,42 mg mg ml-1 cm-1. As amostras foram equilibradas à temperatura ambiente, adicionadas a um recipiente de amostra (C Tech Inc. #OC0009-1-P50) e carregadas no suporte de recipiente na plataforma de janela de detecção. Por amostra, uma fibreta limpa (#OC0002-P50) foi instalada no acoplador de fibreta, e o declive a 280 nm foi lido (correção de espalhamento em 320 mm).

[176] A formação de espécies de massa molecular superior (HMMS) foi analisada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em um sistema de HPLC Agilent. 50 µg de proteína foram sepa- rados com base no volume hidrodinâmico em uma coluna YMC-Pack Diol-200 (Waters, Cat. No. DL20S053008WT) mantida a 30 ± 2ºC usando um gradiente isocrático (20 mM de fosfato de sódio, 400 mM de cloreto de sódio, pH 7,2) a 0,75 mL/min. Espécies de peso molecu- lar foram eluídas e detectadas por absorção de UV a 280 nm.

[177] A heterogeneidade de carga e estabilidade de anticorpos em alta concentração para desamidação e fragmentação foram quanti- ficadas usando focagem isoelétrica capilar por imagem (iCE), que se- para espécies de proteína com base em suas diferenças de carga (va- lor pI) em um gradiente de pH. As amostras foram diluídas em uma mistura para concentração final de 0,3 mg/ml de proteína, 0,01 mg/ml de marcador pI 6.14 (Protein Simple, parte nº. 102220), 0,01 mg/ml de marcador pI 9.50 (Protein Simple, parte nº. 101996), 4% de Phar- malyte pH 3-10 (GE parte nº. 17-0456-01), 0,25% de metilcelulose (Protein Simple, parte nº. 101876)), e 2 M de ureia (Sigma-Aldrich, par- te nº. U4883). As amostras foram injetadas em uma coluna de cartu- cho cIEF revestida com fluorocarbono (Protein Simple, parte nº. 101701) instalada no instrumento iCE3 Protein Simple, focada na co- luna capilar sob alta tensão (≤3000 V), e monitorada em um sistema de detecção de imagem de coluna real (WCID) em um comprimento de onda fixo de 280 nm. Os eletroferogramas resultantes são analisa- dos com software apropriado para determinar os valores de pI e áreas de pico para cada espécie.

[178] Partículas subvisíveis foram analisadas usando imagem de microfluxo (MFI). Antes de qualquer análise de amostra, um padrão de contagem de látex Duke de 15 μm foi executado como uma verificação de adequação do sistema. Descargas de água foram usadas entre ca- da análise. Além disso, o branco de água foi analisado antes para ga- rantir que as contagens de fundo eram adequadas para o teste. As contagens cumulativas médias por ml foram relatadas. Além disso, vá- rios canais de tamanho foram monitorados para fornecer informações sobre contagens de partícula por faixa de tamanho. Exemplo 1. Impacto de Tampão e pH na Viscosidade

[179] Este exemplo ilustra o impacto do pH na viscosidade em formumação de anticorpos anti-PD-1 em alta concentração.

[180] Para preparar a formulação de anticorpo, o anticorpo anti- PD-1 mAb7 foi trocado por tampão em 20 mM de Histidina pH 5,5, 20 mM de Histidina pH 6,0, 20 mM de Histidina pH 6,5, 20 mM de Histidi- na pH 7,0, 20 mM de acetato pH 5,0, e 20 mM de acetato pH 6,0 dilu- indo repetidamente com tampão seguido de concentração a aproxima- damente 160 mg/ml até a troca do tampão estar completa. A concen-

tração final de todas as amostras teve como meta 160 mg/ml.

[181] Concentração de proteína, viscosidade e pH foram medidos para todas as amostras. Os resultados estão resumidos na Tabela 1 e Figura 1. Os resultados demonstram que as formulações com pH mais baixo têm uma viscosidade significativamente menor. Além disso, com o mesmo pH, formulações à base de histidina e acetato têm viscosida- des semelhantes. Tabela 1 Formulação (PH alvo) Concentração de anticorpo PD-1 (mg/ml) Viscosidade a 20°C (Cp) pH Medido 20 mM de Histidina pH 5,5 159,7 35,2 5,75 20 mM de Histidina pH 6,0 161,2 85,2 6,24 20 mM de Histidina pH 6,5 160,9 230,9 6,64 20 mM de Histidina pH 7,0 152,6 279,1 7,04 20 mM de acetato pH 5,0 156,4 27,9 5,44 20 mM de acetato pH 6,0 162,5 88,6 6,14 Exemplo 2. Avaliação de Arginina

[182] Este exemplo ilustra o impacto de diversas concentrações de arginina sobre a viscosidade de anticorpo anti-PD-1.

[183] Para avaliar o impacto de arginina na viscosidade, o anti- corpo anti-PD-1 mAb7 foi formulado em 20 mM de acetato pH 5,0, 50 g/l de sacarose, 0,05 g/l de di-hidrato de Na2EDTA, e 0,2 g/l de PS80 por diálise (sem PS80) com cassetes de diálise MWCO de 20 kDa, concentrando a aproximadamente 200 mg/ml de anticorpo anti-PD-1 com filtros centrífugos Amicon de 50 kDa, e pico em alta concentração de PS80. As formulações com diversas concentrações de arginina fo- ram feitas por adições de uma solução de cloridrato de arginina (HCl) em alta concentração.

[184] A concentração de proteína e o pH foram medidos para to- das as amostras. Os resultados estão resumidos na Tabela 2 e na Fi- gura 2. As viscosidades de formulações de anticorpo anti-PD-1 com 0, 50, 100, 150, 200 e 250 mM de Arginina em uma faixa de concentra- ções de anticorpo anti-PD-1 são mostradas (Tabela 2, Figura 2). Os resultados demonstram que a adição de 50 mM de Arginina diminui a viscosidade de formulações com alta concentração de anticorpo anti- PD-1. Além disso, o aumento incremental da concentração de arginina em até 250 mM reduz ainda mais a viscosidade. Tabela 2 Arginina (mM) Concentração de anticorpo anti-PD-1 (mg/ml) Viscosidade a 20°C (cP) 153 17,0 0 178 38,6 205 97,0 150 15,0 50 174 30,1 200 64,1 151 14,5 100 176 23,7 196 47,3 151 11,7 179 25,0 150 195 42,0 165 21,7 148 11,2 200 171 18,9 192 32,5 154 11,0 250 171 18,5 187 27,8 Exemplo 3. Avaliação de Formulações Contendo Arginina

[185] Este exemplo ilustra o impacto de excipientes adicionais na viscosidade e estabilidade de anticorpo anti-PD-1.

[186] Para preparar as formulações de anticorpo contendo argini- na, anticorpo anti-PD-1 mAb7 foi formulado em cada uma das formula- ções 1-6 (Tabela 3) por diálise de mAb7 em cada formulação (sem PS80) com cassetes de diálise MWCO de 20 kDa, concentrando para 150-200 mg/ml de anticorpo anti-PD-1 com filtros centrífugos Amicon de 50 kDa, e picos em alta concentração de PS80.

Tabela 3 Formulação Nº Tampão/pH Sacarose Di-hidrato de PS80 HCl de Prolina Na2EDTA arginina 1 20 mM de acetato pH 4,5 50 g/l 0,05 g/l 0,2 g/l 150 mM Nenhum 2 20 mM de acetato pH 5,0 50 g/l 0,05 g/l 0,2 g/l 150 mM Nenhum 3 20 mM de acetato pH 5,5 50 g/l 0,05 g/l 0,2 g/l 150 mM Nenhum 4 Nenhum pH 5,0 Nenhum Nenhum 0,2 g/l 100 mM 200 mM 5 20 mM de acetato pH 5,0 50 g/l 0,05 g/l 0,2 g/l 100 mM 100 mM 6 20 mM de acetato pH 5,0 50 g/l 0,05 g/l 0,2 g/l 100 mM Nenhum

[187] As formulações 1, 2 e 3 avaliam o impacto do pH em formu- lações contendo arginina. A Tabela 4 e a Figura 3 resumem a viscosi- dade das formulações 1, 2 e 3 em uma faixa de concentrações de anti- PD-1. Os resultados demonstram que, em formulações contendo 150 mM de Arginina, reduzir o pH de 5,5 para 4,5 significantivamente reduz a viscosidade. Tabela 4 Formulação Concentração de Anticorpo (mg/ml) Viscosidade a 20°C (cP) 154,6 10,5 1 193,3 26,8 151 11,7 179 25 2 195 42 165,4 21,7 149 15,6 3 163,5 28,9

[188] As formulações 4, 5 e 6 avaliaram o impacto da adição de prolina a formulações contendo 100 mM de Arginina a pH 5,0. A Tabe- la 5 e a Figura 4 resumem a viscosidade das formulações 4, 5 e 6 em uma faixa de concentrações de anticorpo anti-PD-1. Os resultados demonstram que não há diferença significativa para a viscosidade de formulações com alta concentração de anticorpo anti-PD-1 contendo 0, 100 ou 200 mM de prolina. Tabela 5 Formulação Concentração de Anticorpo (mg/ml) Viscosidade a 20°C (cP) 151 11,6 171 21,7 4 197 41,4 215 60,9

149 12,6 165 18,0 5 183 29,8 199 42,0 230 104,0 151 14,5 6 176 23,7 196 47,3

[189] A estabilidade das formulações 1, 2, 3, 4 e 5 a 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1 foi determinada colocando amostras em estabi- lidade a 5ºC, 25ºC e 40ºC. A estabilidade de proteína foi avaliada com relação à agregação (SEC), isoformas de carga (iCE), concentração e pH. As Tabelas 6, 7, 8, 9 e 10 resumem a estabilidade térmica das formulações 1, 2, 3, 4 e 5, respectivamente. Tabela 6. Estabilidade de Temperatura da Formulação 1 5ºC 25ºC 40ºC T=0 Teste 4W 10W 2W 4W 10W 2W 4W 10W Concentração de anticorpo 154,6 156,0 154,1 NS 155,0 156,7 NS 153,6 162, anti-PD-1 (mg/ml) 9 pH 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,6 4,6 4,7 SEC: HMMS Total (%) 0,6 0,6 0,6 NS 0,8 1,0 NS 2,6 1,9 ICE: Ácido (%) 25,5 23,4 23,8 26,0 24,5 28,5 20,8 19,3 11,6 ICE: Básico (%) 12,9 13,4 16,6 14,4 14,5 17,3 40,3 49,4 68,3 ICE: Principal (%) 61,6 62,4 59,6 59,6 61,0 54,2 39,0 31,2 16,2 Tabela 7. Estabilidade de Temperatura da Formulação 2 5ºC 25ºC 40ºC T=0 Teste 4W 10W 2W 4W 10W 2W 4W 10W Concentração de anticorpo 151,0 149,7 148,6 NS 150,3 151,7 NS 151,0 152,6 anti-PD-1 (mg/ml) pH 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 SEC: HMMS Total (%) 0,6 0,6 0,6 NS 0,7 0,8 NS 2,3 2,4 ICE: Ácido (%) 24,4 22,9 24,3 26,7 23,6 27,9 29,1 31,3 40,6 ICE: Básico (%) 13,1 13,8 14,5 13,0 14,3 17,0 17,6 16,3 22,2 ICE: Principal (%) 62,5 63,4 61,2 60,3 62,0 55,1 53,3 52,4 37,2

Tabela 8. Estabilidade de Temperatura da Formulação 3 5ºC 25ºC 40ºC T=0 Teste 4W 10W 2W 4W 10W 2W 4W 10W Concentração de anticorpo 149,0 153, 149,9 NS 148,7 147,6 NS 148,4 156,0 anti-PD-1 (mg/ml) 4 pH 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 SEC: HMMS Total (%) 0,6 0,6 0,6 NS 0,7 0,7 NS 1,3 2,2 ICE: Ácido (%) 27,1 23,9 24,5 25,8 23,2 24,9 30,3 33,7 46,0 ICE: Básico (%) 13,9 13,5 14,6 14,3 14,2 16,4 15,8 14,0 13,1 ICE: Principal (%) 59,0 62,6 60,9 59,9 62,6 58,7 54,0 52,3 41,0 Tabela 9. Estabilidade de Temperatura da Formulação 4 5ºC 25ºC 40ºC T=0 Teste 4W 2W 4W 2W 4W Concentração de anticorpo anti-PD-1 (mg/ml) 151,5 154,2 NS 150,6 NS 154,0 pH 5,1 5,0 5,1 5,0 5,1 5,1 SEC: HMMS Total (%) 1,0 0,9 NS 1,0 NS 2,5 ICE: Ácido (%) 26,5 23,1 25,8 22,4 29,1 31,2 ICE: Básico (%) 12,9 14,0 14,1 14,5 17,5 16,9 ICE: Principal (%) 60,6 62,9 60,1 63,1 53,4 51,8 Tabela 10. Estabilidade de Temperatura da Formulação 5 5ºC 25ºC 40ºC T=0 Teste 4W 2W 4W 2W 4W Concentração de anticorpo anti-PD-1 148,8 148,1 NS 145,9 NS 148,6 (mg/ml) pH 5,0 5,0 5,1 5,0 5,0 5,0 SEC: HMMS Total (%) 0,6 0,6 NS 0,7 NS 2,0 ICE: Ácido (%) 21,9 23,1 25,4 23,7 29,6 32,5 ICE: Básico (%) 12,3 13,8 15,2 14,4 16,7 17,5 ICE: Principal (%) 65,8 63,0 59,4 61,8 53,7 50,0

[190] Para todas as formulações 1-5, não há mudança significati- va após 10 semanas (4 semanas para as formulações 4 e 5) para as espécies e agregados de carga (HMMS) a 5ºC e 25ºC. A 40ºC, a for- mulação 1 (pH 4,5) aumentou significativamente em espécies básicas, enquanto as formulações 2, 3, 4 e 5 (pH > 4,5) aumentaram em espé- cies ácidas. Os agregados (HMMS) aumentaram em quantidade se- melhante para todas as formulações após armazenamento a 40ºC, po- rém o aumento é considerado aceitável para formulações líquidas com condições de armazenamento pretendidas de 5ºC. Exemplo 4. Avaliação de Formulações Contendo Trealose

[191] Este exemplo ilustra o efeito da trealose na estabilidade e viscosidade de formulações de anticorpo anti-PD-1.

[192] Di-hidrato de trealose foi avaliado como um estabilizador em formulações contendo arginina e livres de arginina (Tabela 11). Tabela 11 Formulação Nº Tampão/pH Di-hidrato de Di-hidrato de PS80 HCl de arginina trealose Na2EDTA 20 mM de Histidina pH 5,0 84 g/l 0,05 g/l 0,2 g/l Nenhum 7 20 mM de Histidina pH 5,0 50 g/l 0,05 g/l 0,2 g/l 100 mM 8

[193] Para preparar as formulações de anticorpo contendo trealo- se, anticorpo anti-PD-1 mAb7 foi trocado por tampão em 20 mM de Histidina e 50 g/l de di-hidrato de trealose usando filtração de fluxo tangencial com cartuchos de ultrafiltração de 50 kDa. A concentração de anticorpo anti-PD-1 mAb7 foi elevada usando ultrafiltração, seguida pela adição de excipientes usando soluções em alta concentração, e diluição conforme necessário. Anticorpo anti-PD-1 mAb7 foi formulado na formulação 7 nas seguintes concentrações: 104 mg/ml, 154 mg/ml, 174 mg/ml, e 200 mg/ml. Anticorpo anti-PD-1 mAb7 foi formulado na formulação 8 nas seguintes concentrações: 150 mg/ml, 170 mg/ml, e 200 mg/ml. A viscosidade foi medida conforme descrito acima. Os re- sultados são resumidos na Tabela 12 e na Figura 5. Table 12. Viscosidades de Formulações Contendo Trealose Formulação Concentração de Anticorpo (mg/ml) Viscosidade a 20°C (cP) 104 5,3 154 16,9 7 174 32,6 200 67,6 150 14,1 8 170 25,0 200 54,4

[194] A viscosidade da formulação 7 contendo 104 mg/ml, 154 mg/ml, 174 mg/ml e 200 mg/ml de mAb7 é 5,3, 16,9, 32,5 e 67,6 cP,

respectivamente a 20ºC. A viscosidade da formulação 8 contendo 150 mg/ml, 170 mg/ml e 200 mg/ml de mAb7 é 14,1, 25,0 e 54,4 cP, res- pectivamente a 20ºC.

[195] Os resultados demonstram que a formulação 8 (contendo arginina) tem uma viscosidade inferior à formulação 7 em concentra- ções de anticorpo anti-PD-1 ≥ 175 g/l. A viscosidade da formulação 7 e 8 em cerca de 150 mg/ml foi similar (Figura 5).

[196] As estabilidades das formulações de anticorpo anti-PD-1 7 e 8 foram avaliadas a 5ºC, 25ºC e 40ºC. A formulação 7 foi testada usando 100 mg/ml e 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1, e a formulação 8 usando 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1. As amostras foram colo- cadas a 5ºC, 25ºC e 40ºC, e a estabilidade foi avaliada pode medição de agregação (SEC), isoformas de carga (iCE), concentração, pH, e particulados subvisíveis (MFI) conforme descrito acima. Os resultados são resumidos nas Tabelas 13-21 (NT = não testado).

[197] As Tabelas 13, 14, e 15 resumem estabilidade térmica para a formulação 7 a 150 mg/ml de anti-PD-1 a 5ºC, 25ºC e 40ºC, respec- tivamente. Tabela 13. Formulação 7 (150 mg/ml) Estabilidade de temperatura 5°C Teste T0 T2W T4W T6W T10W T14W Concentração de anticorpo anti-PD-1 154,2 NT 153,5 156,5 153,8 154,1 (mg/ml) pH 5,1 NT 5,0 5,0 5,0 5,0 SEC:HMMS Total (%) 0,6 NT 0,6 0,6 0,6 0,6 ICE: Ácido (%) 23,0 NT 24,2 23,8 26,4 26,2 ICE: Básico (%) 13,1 NT 12,5 13,9 12,2 13,3 ICE: Principal (%) 63,9 NT 63,3 62,3 61,3 60,5 MFI: Cumulativo ≥ 10µm (partícula/ml) 330 NT 38 8 57 11 MFI: Cumulativo ≥ 25µm (partícula/ml) 83 NT 0 4 11 8

Tabela 14. Formulação 7 (150 mg/ml) Estabilidade de temperatura 25°C Teste T0 T2W T4W T6W T10W T14W Concentração de anticorpo anti-PD-1 154,2 150,4 154,1 156,0 155,1 153,9 (mg/ml) pH 5,1 5,1 5,0 5,0 5,1 5,0 SEC:HMMS Total (%) 0,6 0,6 0,7 0,7 0,8 0,9 ICE: Ácido (%) 23,0 22,7 24,5 24,9 29,9 29,6 ICE: Básico (%) 13,1 15,5 12,9 13,8 13,5 13,9 ICE: Principal (%) 63,9 61,8 62,5 61,3 56,6 56,5 MFI: Cumulativo ≥ 10µm (partícula/ml) 330 23 11 76 92 31 MFI: Cumulativo ≥ 25µm (partícula/ml) 83 4 4 0 23 8 Tabela 15. Formulação 7 (150 mg/ml) Estabilidade de temperatura 40°C Teste T0 T2W T4W T6W T10W T14W Concentração de anticorpo anti-PD-1 (mg/ml) 154,2 152,6 156,7 154,2 154,6 NT pH 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 NT SEC:HMMS Total (%) 0,6 1,1 1,8 2,2 3,4 NT ICE: Ácido (%) 23,0 28,5 35,0 39,0 49,5 NT ICE: Básico (%) 13,1 15,9 15,8 15,6 13,4 NT ICE: Principal (%) 63,9 55,7 49,2 45,3 37,1 NT MFI: Cumulativo ≥ 10µm (partícula/ml) 330 23 157 23 88 NT MFI: Cumulativo ≥ 25µm (partícula/ml) 83 0 4 0 11 NT

[198] As Tabelas 16, 17, e 18 resumem a estabilidade térmica para a formulação 7 a 10 mg/ml de anti-PD-1 a 5ºC, 25ºC, e 40ºC, res- pectivamente. Tabela 16. Formulação 7 (100 mg/ml) Estabilidade de temperatura 5°C Teste T0 T2W T4W T6W T10W T14W Concentração de anticorpo anti-PD-1 (mg/ml) 104,4 NT 104,7 104,2 107,0 104,0 pH 5,0 NT 5,0 5,1 5,0 5,0

SEC:HMMS Total (%) 0,6 NT 0,6 0,6 0,6 0,6 ICE: Ácido (%) 23,2 NT 28,2 25,0 27,7 26,4 ICE: Básico (%) 13,0 NT 12,3 13,5 13,1 13,6 ICE: Principal (%) 63,8 NT 59,5 61,5 59,1 60,0 MFI: Cumulativo ≥ 10µm (partícula/ml) 84 NT 126 19 19 15 MFI: Cumulativo ≥ 25µm (partícula/ml) 4 NT 11 0 8 8 Tabela 17. Formulação 7 (100 mg/ml) Estabilidade de temperatura 25°C Teste T0 T2W T4W T6W T10W T14W Concentração de anticorpo anti-PD-1 (mg/ml) 104,4 103,4 104,0 104,5 104,0 104,6 pH 5,0 5,1 5,0 5,0 5,0 5,0 SEC:HMMS Total (%) 0,6 0,6 0,6 0,7 0,7 0,7 ICE: Ácido (%) 23,2 23,1 27,2 25,6 30,7 29,7 ICE: Básico (%) 13,0 14,8 12,6 13,7 13,3 13,6 ICE: Principal (%) 63,8 62,2 60,2 60,7 56,0 56,7 MFI: Cumulativo ≥ 10µm (partícula/ml) 84 11 0 23 183 23 MFI: Cumulativo ≥ 25µm (partícula/ml) 4 4 0 8 11 4 Tabela 18. Formulação 7 (100 mg/ml) Estabilidade de temperatura 40°C Teste T0 T2W T4W T6W T10W T14W Concentração de anticorpo anti-PD-1 (mg/ml) 104,4 104,3 105,7 NT NT NT pH 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 NT SEC:HMMS Total (%) 0,6 1,0 1,5 1,9 3,2 NT ICE: Ácido (%) 23,2 27,6 36,3 39,5 49,1 NT ICE: Básico (%) 13,0 18,5 14,7 15,8 13,5 NT ICE: Principal (%) 63,8 53,9 49,0 44,6 37,5 NT MFI: Cumulativo ≥ 10µm (partícula/ml) 84 31 643 27 50 NT MFI: Cumulativo ≥ 25µm (partícula/ml) 4 4 46 0 8 NT

[199] As Tabelas 19, 20 e 21 resumem a estabilidade térmica pa- ra a formulação 8 a 150 mg/ml de anti-PD-1 a 5ºC, 25ºC, e 40ºC, res- pectivamente.

Tabela 19. Formulação 8 (150 mg/ml) Estabilidade de temperatura 5°C

Teste T0 T2W T4W T6W T10W T14W

Concentração de anticorpo anti-PD-1 148,8 NT 151,0 150,4 NT NT (mg/ml)

pH 5,1 NT 5,1 5,1 NT NT

SEC:HMMS Total (%) 0,6 NT 0,6 0,6 NT NT

ICE: Ácido (%) 22,8 NT 27,3 24,8 NT NT

ICE: Básico (%) 12,8 NT 12,6 13,2 NT NT

ICE: Principal (%) 64,4 NT 60,1 62,0 NT NT

MFI: Cumulativo ≥ 10µm (partícula/ml) 508 NT 61 23 NT NT

MFI: Cumulativo ≥ 25µm (partícula/ml) 37 NT 8 8 NT NT

Tabela 20. Formulação 8 (150 mg/ml) Estabilidade de temperatura 25°C

Teste T0 T2W T4W T6W T10W T14W

Concentração de anticorpo anti-PD-1 (mg/ml) 148,8 152,0 153,8 152,0 NT NT pH 5,1 5,1 5,1 5,1 NT NT

SEC:HMMS Total (%) 0,6 0,6 0,7 0,7 NT NT

ICE: Ácido (%) 22,8 24,1 25,1 24,6 NT NT

ICE: Básico (%) 12,8 14,9 13,7 13,7 NT NT

ICE: Principal (%) 64,4 61,1 60,1 61,7 NT NT

MFI: Cumulativo ≥ 10µm (partícula/ml) 508 332 2637 134 NT NT

MFI: Cumulativo ≥ 25µm (partícula/ml) 37 4 573 11 NT NT

Tabela 21. Formulação 8 (150 mg/ml) Estabilidade de temperatura 40°C

Test T0 T2W T4W T6W T10W T14W

Concentração de anticorpo anti-PD-1 (mg/ml) 148,8 149,0 152,8 153,0 NT NT pH 5,1 5,1 5,0 5,1 NT NT

SEC:HMMS Total (%) 0,6 1,1 2,0 1,9 NT NT

ICE: Ácido (%) 22,8 27,9 NT 37,8 NT NT

ICE: Básico (%) 12,8 18,0 NT 16,1 NT NT ICE: Principal (%) 64,4 54,1 NT 46,2 NT NT MFI: 508 4 27 65 NT NT Cumulativo ≥ 10µm (partícula/ml) MFI: 37 0 8 8 NT NT Cumulativo ≥ 25µm (partícula/ml)

[200] Nenhuma alteração significativa na concentração de proteí- nas, pH, ou particulados subvisíveis foi observada para todas as for- mulações em todas as condições estudadas (Tabelas 13-21). Além disso, nenhuma mudança significativa na agregação ou espécie de carga a 5ºC ou 25ºC foi observada. Agregados (HMMS) e espécies de ácido aumentam para todas as formulações após armazenamento a 40ºC, porém o aumento é o mesmo em todas as formulações e o au- mento relativo é considerado aceitável para formulações líquidas com uma condição de armazenamento pretendida de 5ºC.

[201] Estes resultados demonstram que a formulação 7 contendo 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1 mAb7, 20 mM de histidina, 84 mg/ml de di-hidrato de trealose, 0,05 mg/ml de di-hidrato de EDTA dissódico, e 0,2 mg/ml de PS80, a pH 5,0-5,1, é estável após 14 semanas de ar- mazenamento a 5ºC ou 25ºC (Tabelas 13 e 14). Esses resultados também demonstram que a formulação 7 contendo 100 mg/ml de anti- corpo anti-PD-1 mAb7, 20 mM de histidina, 84 mg/ml de di-hidrato de trealose, 0,05 mg/ml de di-hidrato de EDTA dissódico, e 0,2 mg/ml de PS80, a pH 5,0-5,1, é estável após 14 semanas de armazenamento a 5ºC ou 25ºC (Tabelas 16 e 17). Esses resultados também demonstram que a formulação 8 contendo 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1 mAb7, 20 mM de histidina, 100 mM de Arginina, 50 mg/ml de di-hidrato de trealose, 0,05 mg/ml de di-hidrato de EDTA dissódico, e 0,2 mg/ml de PS80 a pH 5,0, é estável após 6 semanas de armazenamento a 5ºC ou 25ºC (Tabelas 19 e 20).

[202] A estabilidade de congelamento-descongelamento e agita-

ção da formulação 7 a 100 e 150 mg/ml de anti-PD-1 e da formulação 8 a 150 mg/ml de anti-PD-1 foi determinada estressando as formula- ções em 5 ciclos de congelamento/descongelamento (FT) ou 24 horas de agitação (AG). Os resultados estão resumidos na Tabela 22. Tabela 22. Formulação 7 (100 mg/ml e 150 mg/ml) e Formulação 8 Estabilidade de Congelamento/Descongelamento e Agitação Formulação 7 (150 mg/ml) Formulação 7 (100 mg/ml) Formulação 8 (150 mg/ml) Teste Inicial AG FT Inicial AG FT Inicial AG FT Concentração de anticorpo anti-PD-1 154,2 152,9 152,1 104,4 104,4 102,8 148,8 148,7 151,7 (mg/ml) pH 5,1 5,0 5,1 5,0 5,0 5,0 5,1 5,1 5,1 SEC: HMMS Total (%) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

[203] Similarmente, baixos níveis de formação de agregados após o estresse por congelamento/descongelamento ou agitação fo- ram observados para a formulação 7 e formulação 8, isto é, 0,6%, (Tabela 22).

[204] Esses resultados demonstram que a formulação 7 contendo 100 ou 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1 mAb7, 20 mM de histidina, 84 mg/ml de di-hidrato de trealose, 0,05 mg/ml de di-hidrato de EDTA dissódico, e 0,2 mg/ml de PS80, a pH 5,0-5,1, é estável após 5 ciclos de congelamento/descongelamento ou 24 horas de agitação. A formu- lação 8 contendo 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1 mAb7, 20 mM de histidina, 100 M de HCL de arginina, 50 mg/ml de di-hidrato de trealo- se, 0,05 mg/ml de di-hidrato de EDTA dissódico, 0,2 mg/ml de PS80, pH 5,0) é também estável após 5 ciclos de congelamen- to/descongelamento ou 24 horas de agitação. Exemplo 5. Padrão de glicosilação de anticorpo anti-PD-1 mAb7

[205] Este exemplo ilustra o padrão de glicosilação de anticorpo anti-PD-1 mAb7.

[206] O mapeamento de peptídeos por LC/MS confirmou um sítio de N-glicosilação localizado no peptídeo de cadeia pesada contendo a sequência de consenso N294ST. A sequência de consenso N294ST está essencialmente totalmente ocupada. O perfil de oligossacarídeo N-

ligado observado para mAb7 compreende os dois principais N- glicanos, G0F e G1F, ambos com núcleo fucosilado de estruturas bian- tenárias do tipo complexo. Além disso, N-glicanos menos abundantes, correspondentes a estruturas biantenárias do tipo complexo truncadas e/ou afucosiladas, estrutura Man5 do tipo manose alta e oligossacarí- deos biantenários do tipo complexo fucosilados ao núcleo, sialilados, também são detectados e identificados.

[207] O perfil de oligossacarídeo N-ligado de mAb7 envolveu a marcação com 2-aminobenzamida (2-AB) de oligossacarídeos N- ligados liberados pelo peptídeo-N-glicosidase F (PNGaseF). Os oli- gossacarídeos N-ligados marcados com 2-AB foram separados por cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) com detecção de fluorescência e elucidação estrutural por espectrometria de massa. A heterogeneidade de glicano em mAb7 é mostrada no gráfico na Figura

6. Exemplo 6. Avaliação de Anticorpos Anti-PD-1 na Formulação 7

[208] Este exemplo avalia a viabilidade do uso da formulação 7 com KEYTRUDA® (pembrolizumab) e OPDIVO® (nivolumab).

[209] Pembrolizumab e nivolumab foram, cada um, formulados em 20 mM de tampão de histidina, 84 mg/ml de di-hidrato de trealose, pH 5,0. Alta concentração de polisborato 80 e di-hidrato de EDTA dis- sódico tiveram um pico nas amostras para uma formulação final de 20 mM de histidina, 84 mg/ml de di-hidrato de trealose, 0,05 mg/ml de di- hidrato de EDTA dissódico, e 0,2 mg/ml de PS80, a pH 5,0 (formula- ção 7). Todas as formulações foram então filtradas usando filtros PES de 0,22 um e diluídas para concentrações necessárias usando formu- lação 7 livre de proteínas.

[210] Pembrolizumab foi formulado na formulação 7 a 129, 150, 175 e 193 mg/ml. Nivolumab foi formulado na formulação 7 a 125, 148 e 179 mg/ml. A viscosidade a 20ºC foi medida conforme descrito aci-

ma. Os resultados estão resumidos na Tabela 23. Tabela 23. Viscosidades de Anticorpos Anti-PD-1 na formulação 7 Anticorpo Concentração de nticorpo (mg/ml) Viscosidade a 20°C (cP) 129 7,1 150 11,7 Pembrolizumab 175 24,2 193 41,4 125 7,1 Nivolumab 148 13,9 179 35,1

[211] Os resultados demonstram que as viscosidades como uma função da concentração de protéina de pembrolizumb e nivolumab na formulação 7 são comparáveis à viscosidade de anticorpo anti-PD-1 mAb7 na formulação 7 (Tabela 12).

[212] A estabilidade térmica de pembrolizumb, nivolumab, e anti- corpo anti-PD-1 mAb7 na formulação 7 foi avaliada medindo a tempe- ratura de fusão por calorimetria de varredura diferencial. Todos os três anticorpos foram diluídos para 1 mg/ml usando solução de formulação 7 livre de proteína antes da análise. Uma varredura térmica foi realiza- da de 10ºC a 110ºC a uma taxa de rampa de 100ºC / hora. Os termo- gramas são mostrados na Figura 7 e o início do desdobramento térmi- co (Tinício) e temperaturas de fusão (Tm1,m,2) são mostrados na Tabela

24. Tabela 24. Propriedades Térmicas de Anticorpos Anti-PD-1 na Formulação 7 Anticorpo Tinício (°C) T m1 (°C) Tm2 (°C) Pembrolizumab 52,2 62,5 74,1 Nivolumab 52,7 61,4 69,0 Anticorpo anti-PD-1 mAb7 51,8 60,5 71,9

[213] Os resultados de estabilidade térmica demonstram que pembrolizumb, nivolumab, e anticorpo anti-PD-1 mAb7 na formulação 7 têm perfis térmicos, temperaturas de início de fusão e temperaturas de fusão comparáveis.

[214] As estabilidades de pembrolizumb e nivolumab a 150 mg/ml na formulação 7 foram avaliadas a 40ºC por 2 semanas medindo agregação (SEC), isoformas de carga (iCE), concentração, pureza por eletroforese em gel reduzida (rCGE), e pH. Os resultados são resumi- dos nas Tabelas 25 e 26. Tabela 25. Formulação 7 (150 mg/ml de pembrolizumab) Estabilidade de temperatura 40°C Teste T0 T2W Concentração de Anticorpo Pembrolizumb (mg/ml) 154,0 150,7 pH 5,0 5,1 SEC:HMMS Total (%) 0,3 1,5 ICE: Ácido (%) 28,3 26,9 ICE: Básico (%) 13,4 16,4 ICE: Principal (%) 53,6 54,6 rCGE: Pureza (%) 99,6 99,2 Tabela 26. Formulação 7 (150 mg/ml de nivolumab) Estabilidade de temperatura 40°C Teste T0 T2W Concentração de Anticorpo Nivolumab (mg/ml) 150,2 153,3 pH 5,1 5,2 SEC:HMMS Total (%) 0,7 1,9 ICE: Ácido (%) 36,9 38,3 ICE: Básico (%) 5,1 12,7 ICE: Principal (%) 54,7 47,9 rCGE: Pureza (%) 99,0 99,1

[215] Esses resultados demonstram que a formulação 7 contendo 150 mg/ml de pembrolizumb, 20 mM de histidina, 84 mg/ml de di- hidrato de trealose, 0,05 mg/ml de di-hidrato de EDTA dissódico, e 0,2 mg/ml de PS80 , a pH 5,0-5,1, é estável após 2 semanas de armaze- namento a 40ºC. Esses resultados também demonstram que a formu- lação 7 contendo 150 mg/ml de nivolumab, 20 mM de histidina, 84 mg/ml de di-hidrato de trealose, 0,05 mg/ml de di-hidrato de EDTA dis- sódico, e 0,2 mg/ml de PS80, a pH 5,1-5,2, é estável após 2 semanas de armazenamento a 40ºC.

[216] Todas as referências citadas neste documento, incluindo patentes, pedidos de patentes, artigos, livros de texto, e semelhantes, e as referências aí citadas, na medida em que já não o sejam, são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. No caso de uma ou mais da literatura incorporada e materiais semelhantes diferirem ou contradizerem este pedido, incluindo, mas não se limitando a termos definidos, uso de termos, técnicas descritas, ou similares, este pedido prevalece.

[217] A descrição acima e os exemplos detalham certas modali- dades específicas da invenção e descrevem o melhor modo contem- plado pelos inventores. Será apreciado, no entanto, que não importa quão detalhado o precedente possa aparecer no texto, a invenção po- de ser praticada de muitas maneiras e a invenção deve ser interpreta- da de acordo com as reivindicações anexas e quaisquer equivalentes das mesmas.

Claims (63)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: um anticorpo anti-PD-1, em que a concentração de anticor- po é entre cerca de 100 mg/ml a cerca de 300 mg/ml; um dissacarídeo; um tampão; um agente quelante; e um polissorbato, em que o pH da referida composição farmacêutica é de cerca de 4,5 a cerca de 5,5, e em que a referida composição farma- cêutica tem uma viscosidade entre cerca de 1 centiPoise (cP) e cerca de 20 cP.

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que o polissorbato é polissorbato 80 (PS80).

3. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que a concentra- ção de polissorbato é de cerca de 0,01 a cerca de 0,3 mg/ml.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 3, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende 0,2 mg/ ml de PS80.

5. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o tampão é um tampão de histidina.

6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que a concentração de histidina é cerca de 20 mM.

7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o tampão é um tampão de acetato.

8. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o agente que- lante é EDTA, e/ou em que a concentração de agente quelante varia de cerca de 0,01 a cerca de 0,3 mg/ml.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que o EDTA compreende EDTA dis- sódico, di-hidrato de EDTA dissódico, ou uma combinação de EDTA dissódico e di-hidrato de EDTA dissódico.

10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que a concentração de EDTA é cerca de 0,04 mg/ml, cerca de 0,045 mg/ml ou cerca de 0,05 mg/ml.

11. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o dissa- carídeo é sacarose.

12. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o dissa- carídeo é trealose.

13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que a trealose é di-hidrato de trealo- se.

14. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a con- centração de dissacarídeo é entre cerca de 25 mg/ml a cerca de 100 mg/ml, cerca de 50 mg/ml ou cerca de 84 mg/ml.

15. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que ainda compreende arginina em uma concentração entre cerca de 25 mM a cerca de 300 mM, cerca de 50 mM, cerca de 100 mM, cerca de 150 mM, cerca de 200 mM ou cerca de 250 mM.

16. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que ainda compreende prolina.

17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que a concentração de prolina é en- tre cerca de 25 mM a cerca de 300 mM ou cerca de 100 mM ou cerca de 200 mM.

18. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a con- centração de anticorpo é selecionada do grupo que consiste em cerca de 140 mg/ml, cerca de 145 mg/ml, cerca de 150 mg/ml, cerca de 155 mg/ml, cerca de 160 mg/ml, cerca de 165 mg/ml, cerca de 170 mg/ml, cerca de 175 mg/ml, cerca de 180 mg/ml, cerca de 185 mg/ml, cerca de 190 mg/ml, cerca de 195 mg/ml, e cerca de 200 mg/ml.

19. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a con- centração de anticorpo é cerca de 140 mg/ml a cerca de 200 mg/ml, 145 mg/ml a cerca de 160 mg/ml ou cerca de 148 mg/ml a cerca de 152 mg/ml.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste em: cerca de 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1; cerca de 20 mM de tampão de histidina; cerca de 84 mg/ml de trealose; cerca de 0,2 mg/ml de PS80; e cerca de 0,45 ou cerca de 0,5 mg/ml de EDTA, em que a referida composição farmacêutica tem pH 5,0 +/- 0,5.

21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que a viscosidade da composição é entre cerca de 10 cP e cerca de 18 cP a 20ºC.

22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que a viscosidade da composição é cerca de 15 cP a 20ºC.

23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste essen- cialmente em: cerca de 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1; cerca de 20 mM de tampão de histidina; cerca de 100 M de HCL de arginina; cerca de 50 mg/ml de trealose; cerca de 0,2 mg/ml de PS80; e cerca de 0,45 ou cerca de 0,5 mg/ml de EDTA, em que a referida composição farmacêutica tem pH 5,0 +/- 0,5.

24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que a viscosidade da composição é entre cerca de 10 cP e cerca de 18 cP a 20ºC.

25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que a viscosidade da composição é cerca de 15 cP a 20ºC.

26. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, caracterizada pelo fato de que o EDTA compreende EDTA dissódico, di-hidrato de EDTA dissódico, ou uma combinação de EDTA dissódico e di-hidrato de EDTA dissódico.

27. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que o anti- corpo é um anticorpo monoclonal humano ou humanizado.

28. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que o anti-

corpo é um anticorpo de IgG4.

29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de IgG4 S228P.

30. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que o anti- corpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) com- preendendo uma região de determinação de complementaridade 1 de VH (CDR1), uma VH CDR2, e uma VH CDR3 da sequência de VH mostrada na SEQ ID NO: 2; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3 da sequência de VL mostrada na SEQ ID NO: 3.

31. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que a VH CDR1 compreende a se- quência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, a VH CDR2 com- preende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 5, e a VH CDR3 compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 6, a VL CDR1 compreende a sequência de aminoácido mos- trada na SEQ ID NO: 7, a VL CDR2 compreende a sequência de ami- noácido mostrada na SEQ ID NO: 8, e a VL CDR3 compreende a se- quência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9.

32. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que o anti- corpo compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 2, e uma sequência de ami- noácido que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoá- cido de região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 3.

33. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que o anti-

corpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) com- preendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2, ou uma variante com uma ou várias substituições de aminoácido con- servadoras em resíduos que não estão dentro de uma CDR e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3, ou uma variante da mesma com uma ou várias substituições de aminoácido em aminoácidos que não estão dentro de uma CDR.

34. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizada pelo fato de que o anti- corpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 10, com ou sem a lisina C- terminal de SEQ ID NO: 10; e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 11.

35. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que o anticorpo exibe glicosilação em Asn294 compreendendo G0F e G1F como a espécie de glicano princi- pal.

36. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que a glicosilação ainda compreende como estruturas biantenárias do tipo complexas truncadas e/ou afuco- siladas de espécies de glicano menores, uma estrutura Man5 do tipo manose alta, e oligossacarídeos bianteários do tipo complexo fucosila- dos ao núcleo, sialilados.

37. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizada pelo fato de que a com- posição farmacêutica é liofilizada ou é não liofilizada.

38. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, 23, ou 27 a 37, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica tem uma viscosidade de cerca de

10 a cerca de 18 cP a 20ºC.

39. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que o anti- corpo é PF-06801591, nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab ou spartalizumab, ou uma porção de ligação a antígeno de qualquer um dos anteriores.

40. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste essencialmente em: cerca de 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1, em que o anti- corpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 10, com ou sem a lisina C- terminal de SEQ ID NO: 10; e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 11; cerca de 20 mM de tampão de histidina; cerca de 84 mg/ml de trealose; cerca de 0,2 mg/ml de PS80; e cerca de 0,45 ou cerca de 0,5 mg/ml de EDTA, em que a referida composição farmacêutica tem pH 5,0 +/- 0,5 e tem uma viscosidade de cerca de 10 a cerca de 18 cP a 20ºC.

41. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste essencialmente em: cerca de 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1, em que o anti- corpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 10, com ou sem a lisina C- terminal de SEQ ID NO: 10; e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 11; cerca de 20 mM de tampão de histidina; cerca de 84 mg/ml de trealose; cerca de 0,2 mg/ml de PS80; e cerca de 0,45 ou cerca de 0,5 mg/ml de EDTA,

em que a referida composição farmacêutica tem pH 5,0 +/- 0,5 e tem uma viscosidade de cerca de 10 a cerca de 18 cP a 20ºC.

42. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 40 ou 41, caracterizada pelo fato de que o EDTA compreende EDTA dissódico, di-hidrato de EDTA dissódico, ou uma combinação de EDTA dissódico e di-hidrato de EDTA dissódico.

43. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 42, caracterizada pelo fato de que a trea- lose é di-hidrato de trealose.

44. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizada pelo fato de que a com- posição farmacêutica não compreende um antioxidante.

45. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 0, caracterizada pelo fato de que o antioxidante é L-metionina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

46. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizada pelo fato de que a com- posição farmacêutica não compreende metionina.

47. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou 27 a 46, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica não compreende arginina.

48. Método de tratar uma doença, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47, a um indivíduo tendo tal doença.

49. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende 150 mg/ml de anticorpo anti-PD-1.

50. Método para tratar câncer em um indivíduo em necessi- dade do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo (1) uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47, e (2) uma quantidade eficaz de uma vacina capaz de suscitar uma resposta imune contra células do câncer.

51. Método para aumentar a imunogenicidade ou efeito te- rapêutico de uma vacina administrada a um indivíduo para o tratamen- to de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo recebendo a vacina uma quantidade eficaz da composi- ção farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 47.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 48 a 51, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêu- tica é administrada como uma única injeção subcutânea de 2 ml.

53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 48 a 52, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêu- tica é administrada uma vez a cada três semanas.

54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 48 a 52, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêu- tica é administrada uma vez a cada quatro semanas.

55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 48 a 54, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêu- tica é administrada em uma dose de 300 mg subcutaneamente.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 48 a 55, caracterizado pelo fato de que, ao indivíduo, é adminis- trado pelo menos um outro agente terapêutico selecionado do grupo que consiste em: crizotinib, palbociclib, talazoparib, um anticorpo anti- CTLA4, um anticorpo anti-4-1BB, um anticorpo anti-OX40, um segun- do anticorpo PD-1, um agonista CD40, um agonista TLR, uma célula CAR-T, e um agente quimioterápico.

57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 48 a 56, caracterizado pelo fato de que a doença é câncer.

58. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer gástrico, sarcoma, linfoma, linfoma de Hodgkin, leucemia, cân- cer de cabeça e pescoço, câncer de cabeça e pescoço de células es- camosas, câncer tímico, câncer epitelial, câncer salivar, câncer de fí- gado, câncer de estômago, câncer de tireoide, câncer de pulmão, cân- cer de ovário, câncer de mama, câncer de próstata, câncer esofágico, câncer pancreático, glioma, leucemia, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer cervical, coriocarcinoma, cân- cer de cólon, câncer oral, câncer de pele e melanoma.

59. Uso da composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratamento de câncer em um indivíduo.

60. Uso da composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratamento de câncer em um indivíduo, em que o padrão de administração do medicamento compreende a administração de uma dose do medicamento uma vez a cada oito semanas.

61. Uso, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o volume da dose é menor ou igual a cerca de 2,5 ml, 2,0 ml, 1,5 ml ou 1,0 ml.

62. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, caracterizado pelo fato de que a administração da dose é subcutânea.

63. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 62, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.