BR112020015519A2

BR112020015519A2 - uso de extrato de pulsatilla chinensis na preparação de fármacos para o tratamento de doenças virais e/ou bacterianas

Info

Publication number: BR112020015519A2
Application number: BR112020015519-5A
Authority: BR
Inventors: Shilin Yang; Zhetong SU
Original assignee: Sichuan Inlu Weite Pharmaceutical Technology Co., Ltd.
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2021-01-26
Also published as: EP3747445A1; US20210038623A1; US11510933B2; UA127576C2; AU2019214082A1; EP3747445A4; CA3090025A1; PL3747445T3; BR112020015536A2; US20220273685A1; MX2020008047A; CN110090221A; CA3089522C; JP2021512880A; EP3747446B1; CN110090222B; RU2020126266A; CA3090025C; AU2019214082B2; ES2964618T3

Abstract

USO DE EXTRATO DE PULSATILLA CHINENSIS NA PREPARAÇÃO DE FÁRMACOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS VIRAIS E/OU BACTERIANAS. São descritos os usos de um composto B4 de saponina de Pulsatilla ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo na preparação de um fármaco para o tratamento de doenças virais e/ou bacterianas. O composto B4 de saponina de Pulsatilla descrito pela invenção mostra uma forte atividade biológica e trata de forma eficiente a endometrite, podridão dos cascos, parvovirose felina, parvovirose canina, cinomose canina, insuficiência renal canina e nefrite aguda canina (I).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE

EXTRATO DE PULSATILLA CHINENSIS NA PREPARAÇÃO DE FÁRMACOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS VIRAIS E/OU BACTERIANAS". Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se ao uso do extrato de Pulsatilla chinensis na preparação de fármacos para o tratamento de doenças virais e/ou bacterianas. Antecedentes Técnicos

[002] A Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel pertence ao gênero Pulsatilla da família Ranunculaceae, cuja principal parte medicinal é a raiz seca. O registro mais antigo da Pulsatilla chinensis é encontrado no Shennong Herbal Classic. A P. chinensis tem um sabor amargo e refrescante na natureza, bem como no estômago, rim e intestino grosso. Sua eficácia inclui principalmente eliminar a flatulência, resfriar o sangue, interromper a diarreia e reduzir o calor interno, e é tradicionalmente usada no tratamento de disenteria bacteriana, além de ter um bom efeito terapêutico em doenças causadas pelo frio, calor, vermelhidão e dor nos olhos e assim por diante. As atividades farmacológicas da Pulsatilla chinensis são diversas e podem consistir principalmente em melhorar a capacidade do organismo de reconhecer e resistir à invasão de micróbios estranhos, reduzir a taxa de células tumorais proliferativas, reduzir o número de micro-organismos patogênicos e inibir efetivamente a reação de oxidação de radicais livres. Dentre elas, a aplicação mais potencial está no desenvolvimento de novos fármacos anti-inflamatórios e antitumorais.

[003] Feng Xiuzhi et al. estudaram o efeito da P. chinensis na apoptose celular e acreditam que ela tem uma boa ação de indução em células cancerosas gástricas. Além disso, a proliferação e replicação de DNA de células cancerosas estão relacionadas aos ingredientes ativos da P. chinensis, os quais podem inibir o crescimento de células HL 260 e a proliferação de câncer de mama (MCF-7), câncer de pulmão (PG), câncer de cólon (SW480) e células de glioma malignas (U87MG) por meio de indução de apoptose. Li Wenchao et al. usaram o extrato etanólico de P. chinensis para tratar várias bactérias patogênicas e estudaram o efeito antibacteriano de diferentes extratos de solventes, e descobriram que todos eles tinham efeito antibacteriano, porém, o efeito foi diferente.

[004] No momento, não há relato sobre o uso dos compostos da presente invenção para o tratamento de doenças virais e/ou bacterianas de acordo com a presente invenção. Conteúdo da Invenção

[005] A fim de resolver os problemas técnicos acima, a presente invenção fornece o uso do composto anemosídeo B4 de fórmula I ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo na preparação de fármacos para o tratamento de doenças virais e/ou bacterianas.

I

[006] Além disso, o dito produto farmacêutico é uma preparação obtida usando o composto anemosídeo B4 supracitado ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, tais como componentes ativos, com a adição de excipientes farmaceuticamente aceitáveis

[007] Além disso, as ditas preparações são injeção, injeção intrauterina, pó, pasta e loção.

[008] Além disso, as ditas preparações são injeção, injeção intrauterina e pó.

[009] Além disso, as ditas doenças são endometrite, podridão dos cascos, parvovirose, cinomose canina, insuficiência renal canina e nefrite aguda canina.

[0010] Além disso, a dita endometrite é endometrite clínica; a dita doença parvoviral é a doença parvoviral canina e doença parvoviral felina.

[0011] A presente invenção também fornece um produto farmacêutico para o tratamento de infecções virais e/ou doenças bacterianas o qual é uma preparação obtida usando o composto anemosídeo B4 supracitado ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo como componentes ativos, com a adição de excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0012] Além disso, as ditas preparações são injeção, injeção intrauterina, pó, pasta e loção; de preferência, as ditas preparações são injeção, injeção intrauterina e pó.

[0013] Além disso, as ditas doenças são endometrite, podridão dos cascos, parvovírus, cinomose canina, insuficiência renal canina e nefrite aguda canina.

[0014] Além disso, a dita endometrite é endometrite clínica; a dita doença parvoviral é doença parvoviral canina e a doença parvoviral felina.

[0015] O extrato de P. chinensis fornecido na presente invenção é o composto anemosídeo B4, com um número CAS 129741-57-7. Sua fórmula molecular é C59H96O26 que corresponde a um peso molecular de 1221,38, e obtido como pó branco cristalino.

[0016] O anemosídeo B4 da presente invenção tem forte atividade biológica, além de excelentes efeitos terapêuticos em endometrite, podridão dos cascos, parvovírus felino, parvovírus canino, cinomose canina, insuficiência renal canina e nefrite aguda canina.

[0017] Obviamente, com base no conteúdo acima da presente invenção, de acordo com o conhecimento técnico comum e os meios convencionais no campo, sem se desviar do estado técnico básico acima, outras várias modificações, variações ou alterações podem ser adicionalmente feitas.

[0018] Seguindo exemplos específicos, o conteúdo acima da presente invenção é adicionalmente ilustrado. Porém, deve ser entendido que o escopo do assunto acima da presente invenção não está limitado aos exemplos a seguir. As técnicas realizadas com base no conteúdo acima da presente invenção estão todas dentro do escopo da presente invenção. Descrição da Figura

[0019] A Figura 1 mostra a curva padrão para determinação do teor do anemosídeo B4. Exemplos Exemplo 1. Preparação do composto de acordo com a presente invenção

[0020] 100 kg de Pulsatilla chinensis foram adicionados etanol a 70 % (1/10, V/V), aquecidos sob refluxo e extraídos 2 vezes. A solução de extração foi concentrada sob pressão reduzida a 75 ℃ e depois centrifugada a 4000 r/min durante 10 min. O sobrenadante foi passado através da coluna de resina de adsorção macroporosa polar, eluindo sucessivamente com água, etanol a 30 % e etanol a 70 %. A parte eluída com etanol a 70 % foi concentrada a 75 ℃ sob pressão reduzida, em seguida seca por pulverização se obter o extrato total de saponina de P. chinensis (3450 g). O extrato resultante foi dissolvido em água e filtrado. O filtrado foi submetido ao sistema de cromatografia preparatória axial dinâmica (empacotado com ODS de 10 μm) e eluído com metanol a 50 %. O eluente correspondente foi coletado de acordo com os picos cromatográficos. Após concentração sob pressão reduzida, foi obtido o anemosídeo B4 (1700 g), seguido de liofilização. Exemplo 2. Determinação do teor do composto de acordo com a presente invenção

1. Dispositivos e Fármacos Testados

[0021] O dispositivo Agilent 1260 HPLC e o detector DAD UV foram adquiridos a partir da Agilent Technology (China) Co., Ltda. A balança analítica eletrônica BP211D foi adquirida a partir da Sartorius Company (Alemanha). O limpador ultrassônico de controle numérico KQ-400DB foi adquirido a partir da Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltda.

[0022] Amostra de anemosídeo B4, preparada no Exemplo 1.

[0023] Substância de referência de anemosídeo B4 (lote N° 111766-201702; teor: 94,7 %), adquirida a partir do National Institutes for Food and Drug Control.

2. Condições Cromatográficas

[0024] Coluna cromatográfica: Sepax Bio-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm); fase móvel: MeOH-H2O (64:36); comprimento de onda de detecção 201 nm; vazão de 1,0 ml/min.

3. Preparação da Solução de Referência

[0025] A substância de referência de anemosídeo B4 foi pesada com precisão e colocada em um balão volumétrico de 10 mL, ao qual foi adicionada fase móvel para dissolver e, em seguida, a fase móvel foi adicionada à balança para obter a solução de referência (1 mg de anemosídeo B4/1 mL).

4. Preparação da Solução de Amostra

[0026] O anemosídeo B4 (10 mg) preparado no Exemplo 1 foi pesado com precisão e colocado em um balão volumétrico de 10 mL, ao qual foi adicionada fase móvel para dissolver e, em seguida, a fase móvel foi adicionada à balança para obter a solução de amostra.

5. Método de Determinação

[0027] 20 μL de solução de referência e solução de amostra foram medidos com precisão, respectivamente, e injetados em um cromatógrafo de líquido para registrar o cromatograma e calcular o teor de acordo com o método de padrão externo.

6. Curva Padrão e Equação de Regressão Linear

[0028] A substância de referência de anemosídeo B4 foi pesada com precisão e colocada em um balão volumétrico de 10 mL, ao qual foi adicionada fase móvel para dissolver e, em seguida, a fase móvel foi adicionada à balança para obter as soluções de referência em concentrações de 1 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL e 20 mg/mL. 20 μL de cada solução foram medidos com precisão e injetados no cromatógrafo de líquido para registrar o cromatograma. Tabela 1. Equação de regressão linear para determinação do teor de anemosídeo B4 Concentração Área de Equação de Amostra (mg/mL) pico regressão 1 0,98488 115,7 2 4,92440 529,5 Y = 100,07 + 10,721 3 9,84880 1057,8 R = 0,9999 4 14,77320 1560,3 5 19,69760 2097,9

[0029] De acordo com os resultados, a relação linear do anemosídeo B4 foi boa na faixa de concentração de 1,04 ~ 20,80 mg/mL (r = 0,9999), adequada para a determinação do teor de anemosídeo B4.

7. Determinação do Teor Para a Amostra de Anemosídeo B4

[0030] De acordo com o método descrito em "3" acima, duas partes de substâncias de referência do anemosídeo B4, 10 mg cada, foram pesadas com precisão e colocadas em frascos volumétricos de 10 mL, respectivamente, aos quais foi adicionada a fase móvel para dissolver e depois a fase móvel foi adicionada à balança para obter a solução de referência 1 e a solução de referência 2.

[0031] De acordo com o método descrito em "4" acima, duas partes de amostras de anemosídeo B4, 10 mg cada, foram pesadas com precisão e colocadas em frascos volumétricos de 10 mL, respectivamente, aos quais foi adicionada a fase móvel para dissolver e depois a fase móvel foi adicionada à balança para obter a solução de amostra 1 e a solução de amostra 2.

[0032] De acordo com as condições cromatográficas acima, 20 μL de cada solução foram precisamente medidos e injetados no cromatógrafo de líquido para registrar o cromatograma. Tabela 2. Resultados da determinação do teor da amostra de anemosídeo B4 Teor Quantidade Área de Concentração Teor Amostra médio (mg) pico (mg/mL) (%) (%) Solução de 1039,6 10,22 0,968 // // referência 1 1044,4 Solução de 1025,6 10,05 0,952 // // referência 2 1022,5 Solução de 1081,8 10,13 1,013 99,7 amostra 1 1092,6 99,4 Solução de 1075,1 10,10 1,010 99,1 amostra 2 1079,2

[0033] De acordo com os resultados experimentais, o teor de anemosídeo B4 obtido neste experimento foi de 99,4 %. Exemplo 3. Preparação da Injeção de Anemosídeo B4 de Acordo com a Presente Invenção

[0034] 1) Fórmula: Foi preparada uma injeção de 1000 mL ao adicionar água a 50 g de anemosídeo B4.

[0035] 2) Método preparativo: 50 g de anemosídeo B4 preparado no Exemplo 1 foram pesados e 800 mL de água para injeção adicionados para dissolver completamente. A solução foi filtrada e ajustada para um pH de 7,0 à qual foram, então, adicionados 1000 mL de água para injeção. A solução resultante foi filtrada com precisão, enchida, selada e esterilizada a 100 °C durante 30 min para obter a injeção. Exemplo 4. Preparação de Pó de Anemosídeo B4 de Acordo com a Presente Invenção

[0036] 1) Fórmula: 1000 g de anemosídeo B4 foram preparados como 1000 g de pó.

[0037] 2) Método preparativo: 1000 g de anemosídeo B4 preparado no Exemplo 1 foram pesados, triturados em um pó fino, passados por uma peneira de malha 100 e bem misturados para obter o pó. Exemplo 5. Preparação da Injeção Intrauterina de Anemosídeo B4 de Acordo com a Presente Invenção

[0038] 1) Fórmula: 50 g de anemosídeo B4 foram preparados como 1000 mL de injeção intrauterina.

[0039] 2) Método preparativo: 50 g de anemosídeo B4 preparado no Exemplo 1 foram pesados e água destilada (800 mL) adicionada para dissolver completamente. A solução foi filtrada e ajustada para um pH de 7,0 à qual foram, então, adicionados 1000 mL de água destilada. A solução resultante foi filtrada com precisão, enchida, selada e esterilizada a 100 °C durante 30 min para obter a injeção intrauterina.

[0040] O efeito benéfico da presente invenção foi ilustrado por meio de exemplos experimentais. Exemplo Experimental 1. Experimento em Endometrite

1. Fármacos de Teste

[0041] Injeção de Anemosídeo B4 preparada no Exemplo 3, com uma concentração de 50 mg/mL; Injeção intrauterina de Anemosídeo B4 preparada no Exemplo 5, com uma concentração de 50 mg/mL.

[0042] Fármaco positivo: injeção intrauterina de cloridrato de doxiciclina (24 g/injeção, produzida pela Zhengzhou Bairui Animal Pharmaceutical Co., Ltda., lote N°: 170901).

2. Animais de Teste

[0043] 130 vacas doentes foram divididas aleatoriamente em 13 grupos, 10 vacas para cada grupo.

[0044] As vacas selecionadas neste experimento estavam todas com endometrite clínica. Durante o experimento, a temperatura, o estado e dieta das vacas foram normais.

3. Dosagem e Modo de Administração Tabela 3. Dosagem e modo de administração Grupos Dosagem de Modo de administração administração (mL/hora) Grupo de controle em branco Solução salina / fisiológica Grupo com fármaco positivo 1 Infusão intrauterina Grupo com baixa dose de injeção 10 injeção intramuscular de anemosídeo B4 intramolecular Grupo com dose média de 20 injeção injeção intramuscular de intramolecular anemosídeo B4 Grupo com alta dose de injeção 30 injeção intramuscular de anemosídeo B4 intramolecular Grupo com baixa dose de injeção 20 injeção intravenosa de anemosídeo B4 intravenosa Grupo com dose média de 40. injeção injeção intravenosa de intravenosa anemosídeo B4 Grupo com alta dose de injeção 60 injeção intravenosa de anemosídeo B4 intravenosa Grupo com baixa dose de injeção 10 injeção intrauterina intrauterina de anemosídeo B4

Grupo com dose média de 20 injeção intrauterina injeção intrauterina de anemosídeo B4 Grupo com alta dose de injeção 30 injeção intrauterina intrauterina de anemosídeo B4

[0045] Administração através de injeção intramolecular: administração do anemosídeo B4 através de injeção intramuscular, duas vezes por dia, uma pela manhã e outra à noite, durante quatro dias sucessivos.

[0046] Administração através de infusão intrauterina: administração de anemosídeo B4 e fármaco positivo cloridrato de doxiciclina através de infusão intrauterina, uma vez a cada dois dias, por 4 vezes.

[0047] Um grupo controle em branco foi criado para as diferentes vias de administração e a mesma dose de solução salina normal foi administrada.

4. Critérios para Diagnóstico e Efeito Terapêutico Sobre a Endometrite Tabela 4. Critérios para diagnóstico e efeito terapêutico sobre a endometrite Tipo de Critérios para julgar o efeito Critério de diagnóstico endometrite terapêutico Ocorrência frequente a partir Após 3 ciclos de tratamento, de 7 a 25 dias após o parto, a secreção do útero estava com perda de apetite, clara ou levemente branca, diminuição da produção de sem pus e sintomas clínicos leite, aumento da temperatura, óbvios, e o útero voltou à Endometrite depressão mental, andando resposta contrativa normal. clínica para trás, elevação da cauda, O acasalamento bem- contração do abdômen, sucedido dentro de 3 geralmente com postura períodos de cio após o parto urinária; descarga de exsudato foi eficaz. mucinoso ou purulento através Após 3 ciclos de tratamento,

da vulva, algumas vezes fragmentos ou flocos de pus misturado com sangue; ainda estavam misturados quando deitado, mais exsudato nos excrementos do útero e descarregado, acompanhado os sintomas clínicos não por um odor de peixe. Através desapareciam. A contração de palpação retal, o colo do incompleta quando de útero não estava palpação do útero ou do completamente fechado e o corno uterino grosso e duro tamanho do útero falhou em não foi eficaz. retornar ao normal. Após 3 ciclos de tratamento, a contração uterina estava normal, a secreção estava A mucosa vaginal e cervical clara ou levemente branca, das vacas estava sem abscesso, os sintomas congestionada e inchada, clínicos das vacas doentes havia descarga de secreção e desapareceram e a prenhez odor. O exame direto mostrou foi eficaz em três períodos que o lúmen do colo do útero de cio. Endometrite estava incompleto, danificado Após 3 ciclos de tratamento, subclínica e proliferado, a parede uterina detritos ou abscessos estava espessada, a floculentos estavam morfologia do corno uterino misturados nos estava alterada e o corpo excrementos do útero. Os uterino estava caído. Palpação sintomas clínicos não leva à dor. desapareceram e a contração uterina incompleta por palpação foi inviável.

5. Resultados Experimentais

[0048] Os resultados experimentais do anemosídeo B4 para o tratamento de endometrite clínica em vacas são mostrados na Tabela

5.

Tabela 5. Resultados experimentais do anemosídeo B4 para o tratamento de endometrite clínica em vacas através de injeção intramuscular (X ± DP, n = 10) Grupos Paridade Tempo médio Taxa de Taxa de prenhez para o cios (%) em três períodos primeiro cio de cio após o após a parto (%) medicação (dia) Grupo de controle 2,2 ± 0,5 22 ± 5,1 35 31 em branco Grupo com 2,6 ± 0,6 26 ± 6,6 58* 50* fármaco positivo Grupo com baixa 2,4 ± 0,8 27 ± 5,8 54 42 dose de injeção intramuscular de anemosídeo B4 Grupo com dose 2,6 ± 0,4 26 ± 4,6 60 52 média de injeção intramuscular de anemosídeo B4 Grupo com alta 2,7 ± 0,6 25 ± 5,5 65* 56* dose de injeção intramuscular de anemosídeo B4 Nota: * denota a diferença óbvia comparado com o grupo de controle em branco, p < 0,05.

Tabela 6. Resultados experimentais da injeção de anemosídeo B4 no tratamento de endometrite clínica em vacas através de injeção intravenosa (X ± DP, n = 10)

Tempo médio Taxa de prenhez para o primeiro Taxa de em três períodos Grupos Paridade cio após a cios (%) de cio após o medicação (dia) parto (%) Grupo de controle em 2,2 ± 0,5 22 ± 5,1 35 31 branco Grupo com fármaco 2,6 ± 0,6 26 ± 6,6 58* 50* positivo Grupo com baixa dose de injeção 2,5 ± 0,5 27 ± 6,4 57 46 intramuscular de anemosídeo B4 Grupo com dose média de injeção 2,6 ± 0,7 26 ± 4,3 63 52 intramuscular de anemosídeo B4 Grupo com alta dose de injeção 2,7 ± 0,4 24 ± 5,2 68* 58* intramuscular de anemosídeo B4 Nota: * denota a diferença óbvia comparado com o grupo de controle em branco, p < 0,05.

Tabela 7. Resultados experimentais de anemosídeo B4 para o tratamento de endometrite clínica em vacas através de infusão intrauterina (X± SD, n = 10)

Tempo Taxa de médio para o Taxa prenhez em primeiro cio Grupos Paridade de cios três períodos após a (%) de cio após o medicação parto (%) (dia) Grupo de controle em 2,2 ± 0,5 22 ± 5,1 35 31 branco Grupo com fármaco 2,6 ± 0,6 26 ± 6,6 58* 50* positivo Grupo com baixa dose de injeção 2, 5 ± 0,8 25 ± 5,4 64 52 intramuscular de anemosídeo B4 Grupo com dose média de injeção 2,7 ± 0,5 24 ± 7,3 74* 70* intramuscular de anemosídeo B4 Grupo com alta dose de injeção 2,9 ± 0,3 23 ± 6,2 78* 75* intramuscular de anemosídeo B4 Nota: * denota a diferença óbvia comparado com o grupo de controle em branco, p < 0,05.

[0049] De acordo com os resultados experimentais, após administração, no grupo com alta dose de injeção intramuscular de anemosídeo B4, no grupo com alta dose de injeção intravenosa de anemosídeo B4, no grupo com dose média de infusão intrauterina de anemosídeo B4 e no grupo com alta dose de infusão intrauterina de anemosídeo B4, bem como no grupo com fármaco positivo, a taxa de cios nas vacas e a taxa de prenhez em três períodos de cio após o parto foram significativamente maiores do que aquelas no grupo de controle em branco, indicando que o anemosídeo B4 tem um efeito significativo no tratamento de endometrite clínica e é superior à injeção uterina de cloridrato de doxiciclina. Exemplo Experimental 2. Experimento na Podridão dos Cascos

1. Fármacos de Teste

[0050] Injeção de Anemosídeo B4 preparada no Exemplo 3, com uma concentração de 50 mg/mL; pó de Anemosídeo B4 preparado no Exemplo 4, com um teor de 99,4 %.

[0051] Fármaco positivo: Penicilina em pó (North China Pharmaceutical Co., Ltda.).

2. Animais de Teste

[0052] 130 vacas com podridão dos cascos foram divididas aleatoriamente em 13 grupos, 10 vacas para cada grupo.

3. Dosagem e Modo de Administração Tabela 8. Dosagem e modo de administração Dose de Modo de Grupos administração administração Solução salina Grupo de controle em branco / fisiológica 1,60 × 106 Grupo com fármaco positivo Aplicação externa unidades Grupo com baixa dose de injeção subcutânea de 5 mL Injeção subcutânea anemosídeo B4 Grupo com dose média de injeção subcutânea de 10 mL Injeção subcutânea anemosídeo B4 Grupo com alta dose de injeção 15 mL Injeção subcutânea subcutânea de anemosídeo B4 Grupo com baixa dose de injeção intravenosa de 20 mL injeção intravenosa anemosídeo B4

Grupo com dose média de injeção intravenosa de 40 mL injeção intravenosa anemosídeo B4 Grupo com alta dose de injeção 60 mL injeção intravenosa intravenosa de anemosídeo B4 Grupo com baixa dose de pó 0,5 g Aplicação externa de anemosídeo B4 Grupo com dose média de pó 1,0 g Aplicação externa de anemosídeo B4 Grupo com alta dose de pó de 1,5 g Aplicação externa anemosídeo B4

[0053] Administração através de injeção subcutânea: a injeção de anemosídeo B4 foi administrada por via subcutânea nos membros afetados uma vez ao dia durante 4 dias.

[0054] Administração através de injeção intravenosa: a injeção de anemosídeo B4 foi administrada através de injeção intravenosa uma vez ao dia durante 4 dias.

[0055] Administração por meio de aplicação externa: o pó de anemosídeo B4 e o fármaco positivo penicilina em pó foram administrados através de curativos, uma vez a cada dois dias, por um total de 4 vezes. A ferida foi enxaguada com solução de KMnO4 a 5 % e o tecido necrótico foi removido até o sangue escorrer. O pó foi aplicado na ferida e depois envolvido com 8-10 camadas de gaze estéril.

[0056] Um grupo controle em branco foi criado com diferentes maneiras de administração e a mesma dose de solução salina normal foi administrada.

4. Sintomas e Critérios de Avaliação do Tratamento de Vacas com Podridão dos Cascos

4.1 Sintomas de Vacas com Podridão dos Cascos

[0057] Vacas com podridão dos cascos preferem se deitar, levantam por um curto período de tempo, não estão dispostas a colocar peso totalmente em seus cascos, sentem dor nos membros afetados e mancam; em um ataque agudo, a coroa do casco e a superfície entre os dedos ficam irritadas, inchadas, sensíveis, quentes e doloridas ao toque ou pressão da área afetada. Depois, uma ferida pode ser observada. Após a ferida aumentar, um líquido preto em decomposição flui e uma superfície ulcerativa é formada entre os dedos, a qual é coberta por uma necrose fétida. A vaca afetada perde o apetite, perde peso gradualmente, tem pelos grossos nas costas e produção de leite reduzida.

4.2 Critérios de Avaliação do Tratamento

[0058] Cura completa: o estado, a dieta e a temperatura corporal da vaca afetada retornam ao normal; os sintomas clínicos na área afetada desaparecem completamente e a produção de leite se torna normal.

[0059] Cura clínica: o estado, a dieta e a temperatura corporal da vaca afetada retornam ao normal; os sintomas clínicos na área afetada desaparecem basicamente e a produção de leite basicamente se torna normal.

[0060] Inválido: os sintomas clínicos na área afetada não melhoram significativamente ou pioram, ou se repetem duas semanas após a interrupção do fármaco e ambos são considerados ineficazes.

[0061] O número total de vacas curadas é a soma do número de vacas completamente curadas e o número de vacas clinicamente curadas.

5. Resultados Experimentais Tabela 9. Resultados experimentais da injeção de anemosídeo B4 no tratamento da podridão dos cascos em vacas através de injeção subcutânea (X ± DP, n = 10)

Produção de leite Número total de Grupos (produção diária) vacas curadas kg/vaca Grupo de controle em branco 1 14,8 ± 2,2 Grupo com fármaco positivo 7 21,2 ± 1,3 Grupo com baixa dose de injeção 5 20,4 ± 1,9 subcutânea de anemosídeo B4 Grupo com dose média de injeção 7 22,1 ± 1,6 subcutânea de anemosídeo B4 Grupo com alta dose de injeção 8 25,6 ± 2,8* subcutânea de anemosídeo B4 Nota: * denota a diferença óbvia comparado com o grupo controle em branco, p < 0,05.

Tabela 10. Resultados experimentais da injeção de anemosídeo B4 no tratamento da podridão dos cascos em vacas através de injeção intravenosa (X ± DP, n = 10) Número total Produção de leite Grupo de vacas (produção diária) curadas kg/vaca Grupo de controle em branco 1 14,8 ± 2,2 Grupo com fármaco positivo 7 21,2 ± 1,3 Grupo com baixa dose de injeção intravenosa de 4 18,2 ± 1,4 anemosídeo B4 Grupo com dose média de injeção intravenosa de 5 20,8 ± 2,2 anemosídeo B4 Grupo com alta dose de injeção 6 22,2 ± 1,5 intravenosa de anemosídeo B4 Nota: * denota a diferença óbvia comparado com o grupo controle em branco, p < 0,05.

Tabela 11. Resultados experimentais do pó de anemosídeo B4 no tratamento da podridão dos cascos em vacas (X ± DP, n = 10) Número total de Produção de leite Grupos vacas curadas (produção diária) kg/vaca Grupo de controle em 1 14,8 ± 2,2 branco Grupo com fármaco 7 21,2 ± 1,3 positivo Grupo com baixa dose de pó de anemosídeo 6 22,6 ± 2,5 B4 Grupo com dose média de pó de anemosídeo 8 24,2 ± 1,7* B4 Grupo com alta dose de 9 25,9 ± 2,4* pó de anemosídeo B4 Nota: * denota a diferença óbvia comparado com o grupo controle em branco, p < 0,05.

[0062] De acordo com os resultados experimentais, quando o anemosídeo B4 foi usado para o tratamento da podridão dos cascos em vacas leiteiras, sua temperatura corporal, estado mental e dieta em cada grupo de tratamento foram bastante melhorados e a produção de leite também aumentou. Dentre eles, o grupo com alta dose de injeção de anemosídeo B4 através de injeção subcutânea, o grupo com dose média de pó de anemosídeo B4 e o grupo com alta dose de pó de anemosídeo B4 tiveram uma produção de leite significativamente maior do que o grupo de controle em branco, e o efeito foi melhor do que aquele do grupo com fármaco positivo. A taxa de cura foi superior a 80%. Exemplo Experimental 3. Experimento em Parvovírus Canino

1. Fármaco de Teste

[0063] Injeção de Anemosídeo B4 preparada no Exemplo 3, com uma concentração de 50 mg/mL.

2. Animais de Teste

[0064] Cães que sofrem de parvovírus canino são casos recebidos por vários hospitais veterinários em Chengdu.

3. Sintomas de Cães que Sofrem de Parvovirose Canina

[0065] No início, os cães têm alta temperatura e vomitam violentamente. O vômito muda de branco para amarelo e, finalmente, para verde, com uma pequena quantidade de sangue; congestão conjuntival dos olhos e lágrimas; gostam de beber água e vomitam após de beber; jatos fecais são como com aparência de molho de tomate, fedorentos e desagradáveis; preferem ficar deitados; o número de glóbulos brancos cai acentuadamente, juntamente com desidratação grave, insuficiência cardíaca e choque até a morte.

4. Dosagem e Modo de Administração

[0066] A injeção de anemosídeoo B4 foi injetada por via intravenosa, 2 mL/vez no grupo com baixa dose, 4 mL/vez no grupo com dose média, 8 mL/vez no grupo com alta dose, uma vez ao dia; a injeção de anemosídeo B4 foi injetada por via intramuscular, 1 mL/vez no grupo com baixa dose, 2 mL/vez no grupo com dose média, 4 mL/vez no grupo com alta dose, duas vezes ao dia; o tratamento foi mantido por 14 dias.

5. Resultados Experimentais Tabela 12. Resultados de pesquisa do anemosídeo B4 para o tratamento de parvovírus canino (X ± DP, n = 10) Números Contagem de Taxa de Grupos tratados Temperatura glóbulos Mortalidade corporal (℃) brancos (× (cães) 109) (%) Grupo de controle em 10 39,5 ± 0,4 2,1 ± 0,2 90 branco Grupo com baixa dose 10 39,2 ± 0,5 3,3 ± 0,3 80 de injeção intramuscular Grupo com dose média 10 38,4 ± 0,3 4,6 ± 0,8 60 de injeção intramuscular

Grupo com altas doses 10 37,8 ± 0,4* 6,2 ± 0,5* 50 de injeção intramuscular Grupo com baixa dose 10 38,2 ± 0,5* 6,3 ± 0,4* 50 de injeção intravenosa Grupo com dose média 10 37,6 ± 0,3* 7,6 ± 0,6* 40 de injeção intravenosa Grupo com altas doses 10 37,4 ± 0,2* 8,2 ± 0,7* 30 de injeção intravenosa Nota: * denota a diferença óbvia comparado com o grupo controle em branco, p < 0,05.

[0067] De acordo com os resultados experimentais, o anemosídeo B4 mostrou um certo efeito terapêutico no parvovírus canino. Conforme o aumento da dose terapêutica, a taxa de mortalidade de cães doentes apresenta tendência decrescente. Exemplo Experimental 4. Experimento em Parvovírus Felino

1. Fármaco de Teste

[0068] Injeção de Anemosídeo B4 preparada no Exemplo 3, com uma concentração de 50 mg/mL.

2. Animais de Teste

[0069] Gatos que sofrem de parvovírus felino são casos recebidos por vários hospitais veterinários em Chengdu.

3. Sintomas de Gatos que Sofrem de Parvovirose Felina

[0070] Os gatos têm ocasionalmente febre, vômitos severos e diarreia; as fezes mudam de cinza para amarelo e finalmente para branco leitoso, acompanhadas de um muco gelatinoso; jatos fecais são como com aparência de molho de tomate, fedorentos e desagradáveis; têm uma tendência a ficarem deitados; o número de glóbulos brancos cai bruscamente, membros gelados, estado altamente deprimido e depois choque até a morte.

4. Dosagem e Modo de Administração

[0071] A injeção de anemosídeo B4 foi injetada por via intravenosa, 2 mL/vez no grupo com baixa dose, 4 mL/vez no grupo com dose média, 8 mL/vez no grupo com alta dose, uma vez ao dia; a injeção de anemosídeo B4 foi injetada por via intramuscular, 1 mL/vez no grupo com baixa dose, 2 mL/vez no grupo com dose média, 4 mL/vez no grupo com alta dose, duas vezes ao dia; o tratamento foi mantido por 14 dias.

5. Resultados Experimentais Tabela 13. Resultados de pesquisa do anemosídeo B4 para o tratamento de parvovírus felino (X ± DP, n = 10) Contagem de Números Taxa de glóbulos Grupos tratados mortalidade brancos (gatos) (%) (× 109) Grupo de controle em branco 10 2,5 ± 0,4 90 Grupo com baixa dose de 10 4,7 ± 0,3 90 injeção intramuscular Grupo com dose média de 10 7,8 ± 0,6* 70 injeção intramuscular Grupo com altas doses de 10 9,1 ± 0,5* 50 injeção intramuscular Grupo com baixa dose de 10 7,7 ± 0,4* 80 injeção intravenosa Grupo com dose média de 10 8,8 ± 0,7* 60 injeção intravenosa Grupo com altas doses de 10 9,3 ± 0,9* 40 injeção intravenosa Nota: * denota a diferença óbvia comparado com o grupo controle em branco, p < 0,05.

[0072] De acordo com os resultados experimentais, o anemosídeo B4 mostrou algum efeito terapêutico no parvovírus felino e pode reduzir significativamente a mortalidade de gatos doentes e melhorar a taxa de sobrevida de gatos doentes. Exemplo Experimental 5. Experimento no Tratamento de Cinomose Canina

1. Fármaco de Teste

[0073] Injeção de Anemosídeo B4 preparada no Exemplo 3, com uma concentração de 50 mg/mL.

2. Animais de Teste

[0074] Cães que sofrem de cinomose canina são casos recebidos por vários hospitais veterinários em Chengdu.

3. Sintomas de Cães que Sofrem de Cinomose Canina

[0075] De acordo com os sintomas clínicos, a cinomose canina pode ser dividida em estágios inicial, médio e tardio. Estágio inicial: o cão está deprimido, não gosta de interagir e se mover e tem uma pequena quantidade de líquido nasal seroso e secreções oculares serosas; estágio intermediário: se manifesta como aumento do líquido nasal seroso e secreções oculares serosas e diminuição do apetite; estágio final: se manifesta como fluido nasal purulento, nariz seco ou até rachado, secreções mucosais nos cantos da boca, estado altamente deprimido, apetite reduzido ou mesmo nenhum apetite, mas sente muita sede, temperatura corporal de 39,5 ℃ ~ 41,5 ℃ , respiração acelerada, sons ásperos provenientes da respiração, geralmente acompanhados de irregularidades da frequência cardíaca e até vômitos e diarreia. O vômito é um muco ou líquido amarelo, enquanto que as fezes são marrom-escuras ou cobertas com muco. À medida que o curso da doença progride, os cães com cinomose canina geralmente desenvolvem infecções bacterianas secundárias em virtude de sua resistência reduzida.

4. Dosagem e Modo de Administração

[0076] A injeção de anemosídeo B4 foi injetada por via intravenosa, 2 mL/vez no grupo com baixa dose, 4 mL/vez no grupo com dose média, 8 mL/vez no grupo com alta dose, uma vez ao dia; a injeção de anemosídeo B4 foi injetada por via intramuscular, 1 mL/vez no grupo com baixa dose, 2 mL/vez no grupo com dose média, 4 mL/vez no grupo com alta dose, duas vezes ao dia; o tratamento foi mantido por 14 dias.

5. Resultados Experimentais Tabela 14. Resultados de pesquisa do anemosídeo B4 para o tratamento de cinomose canina (X ± DP, n = 10) Números Cura Morte Grupos tratados (cães) (cães) (cães) Grupo de controle em branco 10 1 9 Grupo com baixa dose de injeção 10 3 7 intramuscular Grupo com dose média de injeção 10 4 6 intramuscular Grupo com altas doses de injeção 10 5 5 intramuscular Grupo com baixa dose de injeção 10 4 6 intravenosa Grupo com dose média de injeção 10 5 5 intravenosa Grupo com altas doses de injeção 10 6 4 intravenosa

[0077] De acordo com os resultados experimentais, o anemosídeo B4 mostrou um efeito terapêutico melhor em cinomose canina. Exemplo Experimental 6. Insuficiência Renal Canina

1. Fármaco de Teste

[0078] Injeção de anemosídeo B4 preparada no Exemplo 3, com uma concentração de 50 mg/mL.

2. Animais de Teste

[0079] Cães que sofrem de cinomose canina são casos recebidos por vários hospitais veterinários na cidade de Chengdu.

3. Sintomas de Cães Doentes

[0080] O cão doente tem pouco apetite, depressão, letargia, vômito repetidamente, odor fétido na boca, diminuição da temperatura corporal e foi vacinado com um teste de CPV negativo. Os exames bioquímicos sanguíneos para ureia, creatinina e fósforo inorgânico são 2 vezes mais que o valor normal, e os indicadores bioquímicos de outros órgãos eram normais, e o exame B-ultrassônico abdominal do cão doente mostrou alterações no tamanho e na forma do rim.

4. Dosagem e Modo de Administração

[0081] A injeção de anemosídeo B4 foi injetada por via intravenosa, 2 mL/vez no grupo com baixa dose, 4 mL/vez no grupo com dose média, 8 mL/vez no grupo com alta dose, uma vez ao dia; a injeção de anemosídeo B4 foi injetada por via intramuscular, 1 mL/vez no grupo com baixa dose, 2 mL/vez no grupo com dose média, 4 mL/vez no grupo com alta dose, duas vezes ao dia; o tratamento foi mantido por 14 dias.

5. Resultados Experimentais Tabela 15. Resultados de pesquisa do anemosídeo B4 para o tratamento de insuficiência renal canina (X ± DP, n = 10) Números Temperatur Creatini- Fosfato Taxa de Ureia Grupos tratados a corporal na inorgânico mortali- (mmol/L) (cães) (℃) (μmol/L) (mmol/L) dade (%) Grupo de controle 35,0 ± 10 37,1 ± 0,4 412 ± 41 9,1 ± 0,8 80 em branco 0,6 Grupo com baixa 20,8 ± dose de injeção 10 37,8 ± 0,3 130 ± 19* 1,6 ± 0,02* 60 0,5 intramuscular Grupo com dose 17,5 ± média de injeção 10 38,2 ± 0,4 120 ± 26* 2,0 ± 0,03* 50 0,7* intramuscular Grupo com altas 14,2 ± doses de injeção 10 38,5 ± 0,2 100 ± 30* 1,4 ± 0,08* 40 0,4* intramuscular Grupo com baixa 11,8 ± dose de injeção 10 38,3 ± 0,5* 117 ± 25* 1,1 ± 0,05* 40 0,6* intravenosa Grupo com dose 10 38,5 ± 0,3* 9,9 ± 0,8* 115 ± 12* 1,5 ± 0,04* 30 média de injeção intravenosa Grupo com altas doses de injeção 10 38,6 ± 0,4* 8,7 ± 0,3* 109 ± 20* 0,9 ± 0,06* 20 intravenosa Nota: * denota a diferença óbvia em comparação com o grupo controle em branco, p < 0,05.

[0082] De acordo com os resultados experimentais, o anemosídeo B4 mostrou algum efeito terapêutico na insuficiência renal canina e, com o aumento da dose terapêutica, a mortalidade de cães doentes apresentou uma tendência decrescente. Exemplo Experimental 7. Nefrite Aguda Canina

1. Fármaco de Teste

[0083] Injeção de anemosídeo B4 preparada no Exemplo 3, com uma concentração de 50 mg/mL.

2. Animais de Teste

[0084] Cães que sofrem de nefrite aguda são casos recebidos por vários hospitais veterinários na cidade de Chengdu.

3. Sintomas de Cães Doentes

[0085] Os cães doentes são caracterizados por perda de apetite, indigestão, depressão e um ligeiro aumento da temperatura corporal. Quando de palpação da área renal, o cão sentiu dor e a frequência de micção aumentou significativamente, mas o débito urinário era pequeno, mostrando uma quantidade pequena, mas frequente. Além disso, surgiu uma hematúria vermelho- escura. O exame de urina foi positivo para proteínas. O exame microscópico do sedimento de urina mostrou glóbulos brancos, glóbulos vermelhos e um grande número de células epiteliais renais.

4. Dosagem e Modo de Administração

[0086] A injeção de anemosídeo B4 foi injetada por via intravenosa, 2 mL/vez no grupo com baixa dose, 4 mL/vez no grupo com dose média,

8 mL/vez no grupo com alta dose, uma vez ao dia; a injeção de anemosídeo B4 foi injetada por via intramuscular, 1 mL/vez no grupo com baixa dose, 2 mL/vez no grupo com dose média, 4 mL/vez no grupo com alta dose, duas vezes ao dia; o tratamento foi mantido por 14 dias.

5. Resultados Experimentais Tabela 16. Resultados de pesquisa do anemosídeo B4 para o tratamento de nefrite aguda canina (X ± DP, n = 10) Grupos Números Tempera- Taxa de Gravidade Taxa de Taxa de de tura positivos específica positivos mortalida- tratamento corporal para da urina para de (%) (cães) (℃) proteínas glóbulos na urina brancos (+++, %) (+++, %) Grupo de 10 39,7 ± 0,3 100 1,220 ± 100 80 controle em 0,63 branco Grupo com 10 39,5 ± 0,3 80 1,123 ± 80 60 baixa dose de 0,01 injeção intramuscular Grupo com dose 10 39,3 ± 0,4 70 1,094 ± 80 60 média de injeção 0,04* intramuscular Grupo com altas 10 39,0 ± 60 1,064 ± 70 50 doses de injeção 0,2* 0,02* intramuscular Grupo com 10 38,7 ± 0,5 50. 1,017 ± 60 50 baixa dose de 0,25 injeção intravenosa Grupo com dose 10 38,8 ± 40. 1,005 ± 40. 40 média de injeção 0,3* 0,09* intravenosa Grupo com altas 10 38,5 ± 30 1,003 ± 30 30 doses de injeção 0,4* 0,01* intravenosa Nota: * denota a diferença óbvia em comparação com o grupo controle em branco, p < 0,05.

[0087] De acordo com os resultados experimentais, o anemosídeo B4 mostrou algum efeito terapêutico na nefrite aguda canina e, com o aumento da dose terapêutica, a mortalidade de cães doentes apresentou uma tendência decrescente.

[0088] Em suma, o anemosídeo B4 da presente invenção tem atividade biológica mais forte e tem excelentes efeitos terapêuticos na endometrite, podridão dos cascos, parvovírus felino, parvovírus canino, cinomose canina, insuficiência renal canina e nefrite aguda canina.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso do composto anemosídeo B4 de fórmula I ou sais aceitáveis farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de fármacos para o tratamento de doenças virais e/ou bacterianas: Fórmula I

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito produto farmacêutico ser uma preparação obtida utilizando o composto anemosídeo B4 como definido na reivindicação 1 ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo como componentes ativos, com adição de excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as ditas preparações são injeção, injeção intrauterina, pó, pasta e loção.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as ditas preparações são injeção, injeção intrauterina e pó.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas doenças são endometrite, podridão dos cascos, parvovirose, cinomose canina, insuficiência renal canina e nefrite aguda canina.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita endometrite é endometrite clínica; a dita doença parvoviral é doença parvoviral canina e doença parvoviral felina.

7. Produto farmacêutico para o tratamento de doenças virais e/ou bacterianas, caracterizado pelo fato de que é uma preparação obtida usando o composto anemosídeo B4 como definido na reivindicação 1 ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo como componentes ativos, com a adição de excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

8. Produto farmacêutico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as ditas preparações são injeção, injeção intrauterina, pó, pasta e loção; de preferência, as ditas preparações são injeção, injeção intrauterina e pó.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as ditas doenças são endometrite, podridão dos cascos, parvovirose, cinomose canina, insuficiência renal canina e nefrite aguda canina.

10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a dita endometrite é endometrite clínica; a dita doença parvoviral é doença parvoviral canina e doença parvoviral felina.