BR112020010860A2

BR112020010860A2 - métodos para medir a concentração de uma partícula em solução, para detectar partículas de lipoproteína em uma amostra, para diagnosticar uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo ou para determinar o risco de um indivíduo desenvolver a dita doença ou condição, para selecionar um indivíduo a quem uma substância ou composição deve ser administrada ou a quem um regime deve ser prescrito e para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, substância ou composição, e, uso de uma substância ou composição.

Info

Publication number: BR112020010860A2
Application number: BR112020010860-0A
Authority: BR
Inventors: Joanna ANDRECKA; Philipp Kukura; Gavin Young; Justin Benesch
Original assignee: Oxford University Innovation Limited
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2020-11-10
Also published as: IL275012A; JP2021508036A; JP2024029130A; RU2020122011A3; WO2019110977A1; GB201720162D0; CA3084713A1; KR20200095535A; SG11202005206RA; EP3721235A1; RU2020122011A; US20200378891A1; JP7414717B2; CN111684285A; AU2018379699A1

Abstract

A invenção refere-se ao uso de espalhamento de luz de partículas individuais, preferivelmente microscopia de espalhamento interferométrico (também referida aqui como iSCAT), para medir a concentração de uma partícula em uma solução. A invenção além disso refere-se ao uso de espalhamento de luz para detectar partículas de lipoproteína em uma amostra, e a métodos de diagnóstico e de tratamento relacionados.

Description

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MÉTODOS PARA MEDIR A CONCENTRAÇÃO DE UMA PARTÍCULA EM SOLUÇÃO, PARA DETECTAR PARTÍCULAS DE LIPOPROTEÍNA EM UMA AMOSTRA, PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO ASSOCIADA AO TAMANHO E/OU NÚMERO DE PARTÍCULAS DE LIPOPROTEÍNA EM UM INDIVÍDUO OU PARA DETERMINAR O RISCO DE UM INDIVÍDUO DESENVOLVER A DITA DOENÇA OU CONDIÇÃO, PARA SELECIONAR UM INDIVÍDUO A QUEM UMA SUBSTÂNCIA OU COMPOSIÇÃO DEVE SER ADMINISTRADA OU A QUEM UM REGIME DEVE SER PRESCRITO E PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO ASSOCIADA AO TAMANHO E/OU NÚMERO DE PARTÍCULAS DE LIPOPROTEÍNA EM UM INDIVÍDUO, SUBSTÂNCIA OU COMPOSIÇÃO, E, USO DE UMA SUBSTÂNCIA OU COMPOSIÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção refere-se ao uso de espalhamento de luz de partículas individuais, preferivelmente microscopia de espalhamento interferométrico (também referida aqui como iSCAT), para medir a concentração de uma partícula em uma solução. A partícula pode ser em uma solução simples ou complexa, tal como uma amostra biológica ou ambiental. A invenção pode ser usada para determinar a concentração absoluta da partícula em solução, e esta capacidade provê um meio para estudar as relações estequiométricas entre diferentes partículas em solução. Como os inventores já tinham demonstrado, iSCAT também provê um meio para detecção robusta e precisa, quantificação de massa, geração de imagem e distinção de partículas tão pequenas como moléculas individuais e, assim, a capacidade para também usar a mesma técnica para medições de concentração é altamente benéfica.

[002] A invenção refere-se, ademais, ao uso de espalhamento de luz, preferivelmente microscopia de espalhamento interferométrico (também

2 / 62 referida aqui como iSCAT) para detectar partículas de lipoproteína em uma amostra, e a métodos de diagnóstico e de tratamento relacionados. A capacidade dos presentes métodos para medir a concentração de diversas lipoproteínas em solução é de interesse particular.

[003] A pesquisa que originou esses resultados recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) / ERC acordo de concessão no 337757.

FUNDAMENTOS

[004] A iSCAT tem se materializado como uma abordagem poderosa tanto para o rastreamento de partículas individuais com resolução espaço-temporal e sensibilidade sem etiquetas singulares como até o nível de uma molécula individual.

[005] A microscopia de espalhamento interferométrico provê informação sobre a distribuição relativa de partículas de diferentes massas em solução, sem a exigência de adicionar uma etiqueta. A adição de concentração absoluta ou relativa de uma partícula provê informação adicional valiosa sobre uma amostra que está sendo analisada, particularmente se a solução é uma amostra biológica ou ambiental.

[006] Antes dos trabalhos anteriores das presentes requerentes, a aplicação abrangente de iSCAT foi limitada pela exigência de microscópios personalizados, câmeras não convencionais e iluminação complexa da amostra, limitando os recursos do iSCAT para a detecção, geração de imagens e distinção robustas e precisas de partículas tão pequenas como moléculas individuais. No entanto, aperfeiçoamentos no instrumento foram desenvolvidos, de forma que essa tecnologia evoluiu para um meio poderoso de observar objetos únicos. Um projeto exemplificativo de um instrumento iSCAT é descrito em Cole et al ACS Photonics, 2017, 4 (2), pp 211–216 e Arroyo et al. Nat Protocols 2016, 617-633, ambos sendo aqui incorporados

3 / 62 por referência. Detalhes adicionais sobre o instrumento são dados em um pedido anterior do presente requerente, WO2018/011591, aqui incorporado por referência.

[007] A iSCAT foi descrita previamente para detecção de proteínas individuais purificadas (Cole et al (ACS Photonics, 2017, 4(2), pp 211-216), mas a detecção e quantificação de lipoproteínas não foi previamente explorada, porque a detecção de partículas em uma solução complexa não foi pensada como sendo viável.

[008] Arranjos diagnósticos para doença cardiovascular podem incluir detecção de lipoproteínas (também descritas como partículas de lipoproteína). Diversos métodos para detecção de lipoproteínas são revistos em Circulação. 2009 May 5; 119(17): 2396–2404; Curr Opin Lipidol. 2017 Jun;28(3):261-266. Estes métodos apresentam a desvantagem de serem consumidores de tempo, caros, oferecendo informação incompleta sobre partículas de lipoproteína e/ou tendo limitada aplicação em configurações clínicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Os presentes inventores identificaram surpreendentemente que é possível usar espalhamento de luz de partículas individuais, preferivelmente microscopia de espalhamento interferométrico de partículas individuais para determinar a concentração de uma partícula em solução. Adicionalmente, os presentes inventores inesperadamente ilustraram que é possível determinar a concentração de partículas por espalhamento de luz de partículas individuais (tal como usando iSCAT) diretamente a partir de uma amostra biológica (tal como sangue ou plasma sanguíneo) sem purificação das partículas afastadas de outros componentes, apesar do sinal de fundo provido por estes outros componentes. Esta tem demonstrado ser uma técnica particularmente utilizável para lipoproteínas em amostras biológicas, por exemplo.

[0010] A presente invenção provê um método de medição da

4 / 62 concentração de uma partícula em solução, compreendendo pôr a solução em contato com uma superfície e detectar a ligação de a dita partícula a uma superfície usando espalhamento de luz.

[0011] O método de espalhamento de luz para detecção da ligação da partícula é preferivelmente iSCAT. O método pode ser preferivelmente realizado usando um microscópio apropriado. A concentração é preferivelmente concentração absoluta. A ligação da partícula para a dita superfície pode ser detectada ou visualizada usando espalhamento de luz de partículas individuais.

[0012] A presente invenção provê um método para determinar a concentração de uma partícula em solução compreendendo pôr a dita solução em contato com uma solução de medição e uma superfície, e detectar a ligação da partícula para a dita superfície usando espalhamento de luz.

[0013] Esta característica da invenção é particularmente útil para situações em que a solução é pensada como sendo concentrada. Um volume da solução contendo a partícula pode ser incluída com um volume de uma solução de medição em um suporte de amostra antes da detecção da ligação da partícula a uma superfície. A vantagem deste aspecto é assegurar que a concentração medida representa o estado da partícula na solução original, mais concentrada.

[0014] A presente invenção provê um método para determinar a concentração de uma partícula em solução compreendendo pôr a solução em contato com uma superfície na presença de um calibrante e detectar a ligação da partícula a uma superfície usando espalhamento de luz.

[0015] Assim, a presente invenção permite a medição da concentração de uma partícula em solução por meio da detecção da taxa de ligação de a dita partícula a uma superfície.

[0016] Adicionalmente, a presente invenção permite a medição da concentração absoluta de uma partícula em solução por análise das mudanças

5 / 62 ou decaimento na taxa de ligação da partícula a uma superfície como detectada por espalhamento de luz ao longo do tempo.

[0017] Concentração absoluta em solução pode ser determinada por medição de eventos de ligação entre partículas na amostra e uma superfície, e ser calibrada contra os observados com amostras de partículas de concentrações conhecidas. A superfície pode ser parte de um suporte de amostra. Em um suporte de amostra com uma elevada razão de superfície para volume, a ligação de uma partícula para a superfície diminui ao longo do tempo como uma função do número restante de partículas em solução e sítios acessíveis para ligação. Taxas de ligação iniciais para uma série de concentrações podem ser extrapoladas a partir dos dados de ligação e usadas para gerar uma curva padrão permitindo a conversão de uma taxa de ligação inicial medida na amostra para a respectiva concentração absoluta das partículas em solução.

[0018] A ligação da partícula na superfície pode ser detectada ou visualizada usando espalhamento de luz, preferivelmente iSCAT.

[0019] Alternativamente, concentração em solução pode ser determinada por uso de uma superfície passivada ou ativada, de modo que a taxa de ligação de partículas pode ser controlada por controle da atividade da ligação entre a superfície e a partícula. Nesta configuração, ativação ou passivação de superfície pode ou aumentar a afinidade de ligação e assim a faixa de medição em menores concentrações, ou abaixar a afinidade de ligação e assim ser capaz de medição em maiores concentrações.

[0020] A superfície preferivelmente forma parte de um suporte de amostra para a dita solução. o dito suporte de amostra pode ser um elemento de um microscópio de espalhamento de luz. O suporte de amostra pode ser uma câmara de elevada superfície-para-volume.

[0021] A fim de calcular a concentração, pode ser necessário incluir e correção para taxas de difusão. Taxas de difusão podem ser prontamente

6 / 62 calculadas com base em propriedades conhecidas da partícula, tal como massa e formato.

[0022] Assim, a invenção provê um método para medir a concentração de partículas de uma solução, o método compreendendo: i) pôr a solução em contato com uma superfície; ii) detectar a ligação de partícula à superfície como visualizada por espalhamento de luz; iii) repetir a etapa de detecção e calcular mudanças em taxa de ligação e a taxa de ligação inicial ao longo do tempo da partícula para a superfície; iv) prover uma curva de calibração de taxa de ligação inicial contra concentração com base em dados a partir das soluções de concentração conhecida de partícula; v) usar a curva de calibração na etapa (iv) para converter a taxa de ligação inicial registrada para a amostra na etapa (iii) a a concentração da partícula em solução.

[0023] Preferivelmente, a concentração é concentração absoluta.

[0024] Em algumas variações, a solução pode ser pré-tratada antes de ou simultaneamente ao contato com a superfície, por exemplo com uma solução de medição ou calibrante.

[0025] A partícula em solução pode ser posta em contato com uma solução de medição e uma superfície. A vantagem deste aspecto é assegurar que a concentração medida representa o estado da partícula na solução original, mais concentrada.

[0026] A solução de medição pode ser uma solução de tampão. Geralmente, o volume da solução de medição é conhecido a fim de permitir o cálculo de efeitos de diluição.

[0027] Diversas técnicas podem ser requeridas para preparar a solução para determinação da concentração. Por exemplo, um volume da

7 / 62 solução pode ser colocado em um suporte de amostra, preferivelmente com uma geometria conhecida. Isto permite a introdução de um volume de uma solução de medição (ou introdução da solução de partículas na solução de medição), e usando comportamento de diluição, isto permite a taxa de ligação detectada da partícula à superfície ser convertida em concentração da partícula.

[0028] A detecção da ligação da partícula à superfície pode ser tomada em um ou mais intervalos de tempo diferentes após a introdução da solução de medição. Se a etapa de detecção for repetida após introdução da solução de medição em diferentes intervalos de tempo, isto permitirá a correção para efeitos de diluição, tal como dissociação. Se as medições são tomadas em diferente ponto de tempo após adição (e, assim, diluição) uma mudança em, por exemplo, distribuição de espécie se a partícula dissocia ou se agrupa em menores concentrações, pode ser visualizada. Esta abordagem, assim, permite uma visão mais detalhada da partícula e permite a verificação da medição de concentração.

[0029] Alternativa ou adicionalmente, o volume de uma ou ambas as soluções (partícula ou medição) pode ser variado, e/ou a geometria do suporte de amostra podem ser variados. Ambos permitem a correção de efeitos de diluição. Se a etapa de detecção é repetida em um ou mais diferentes volumes de solução e/ou em suportes de amostra de uma ou mais diferentes geometrias, isto também pode corrigir os efeitos de diluição tal como dissociação.

[0030] Assim, a invenção provê um método para determinar a concentração de uma partícula em solução, o método compreendendo: i) pôr a solução em contato com uma superfície e um volume de solução de medição em um suporte de amostra com uma geometria; ii) detectar a ligação de partícula à superfície como visualizada por espalhamento de luz;

8 / 62 iii) repetir a etapa de detecção e calcular mudanças em taxa de ligação e a taxa de ligação inicial ao longo do tempo da partícula para a superfície; iv) prover uma curva de calibração de taxa de ligação inicial contra concentração com base em dados a partir das soluções de concentração conhecida de partícula; v) usar a curva de calibração na etapa (iv) para converter a taxa de ligação inicial registrada para a amostra na etapa (iii) para a concentração absoluta da partícula em solução.

[0031] O método pode envolver adicionalmente repetir etapas (i) a (ii) usando um ou mais de um suporte de amostra de diferente geometria ou usando um diferente volume de solução de medição a fim de verificar a concentração determinada.

[0032] Alternativamente, partícula em solução pode ser posta em contato com uma superfície na presença de um calibrante.

[0033] O calibrante em solução tem uma concentração e massa pré- determinadas. Uma vez que ele é introduzido na solução de partículas, a detecção da taxa de ligação do calibrante e da partícula para a dita superfície ocorre separadamente, mas simultaneamente. Repetidas medições de tanto a partícula e como a ligação do calibrante à superfície podem ser tomadas, permitindo a determinação da taxa de ligação inicial para a partícula e a taxa de ligação inicial para o calibrante. A taxa de ligação inicial da concentração conhecida de calibrante permite a conversão da taxa de ligação inicial da partícula para concentração de a dita partícula.

[0034] Em uma modalidade, o calibrante é selecionado para se assemelhar com a partícula com relação às suas características em ligação à superfície. Por exemplo, é desejável selecionar um calibrante com similares propriedades de superfície (por exemplo, carga, hidrofobicidade, hidrofilicidade). Tal seleção permite medições mais precisas sobre diversas

9 / 62 partículas. Efetivamente, o calibrante e a partícula devem ter a mesma afinidade para a superfície, e assim a determinação da taxa de ligação da concentração conhecida de calibrante permite a conversão da taxa de ligação da partícula em uma concentração.

[0035] Assim, a invenção provê um método para medir a concentração de partícula em solução, o método compreendendo: i) pôr a solução em contato com uma superfície na presença de um calibrante; ii) detectar a ligação de partícula à superfície como visualizada por espalhamento de luz; iii) simultaneamente detectar a ligação do calibrante à superfície como visualizada por espalhamento de luz; iv) repetir as etapas de detecção (ii) e (iii) e calcular mudanças em taxa de ligação e a taxa de ligação inicial ao longo do tempo da partícula e do calibrante para a superfície; v) usar as taxas de ligação iniciais calculadas na etapa (iv) para o calibrante para converter a taxa de ligação inicial da partícula calculada na etapa (iv) para concentração da partícula em solução.

[0036] É preferido que o calibrante seja de concentração conhecida, e tenha características similares às da partícula, particularmente em relação de ligação à superfície.

[0037] Além disso, os presentes inventores identificam surpreendentemente que é possível detectar partículas de lipoproteína, que representam misturas heterogêneas de diferentes biomoléculas incluindo diversos componentes não proteína, por espalhamento de luz, em particular usando microscopia de espalhamento interferométrico. Partículas individuais de lipoproteína são capazes de serem opticamente visualizadas. Isto permite que números e tamanho dede partículas de lipoproteína (e de diferentes classes de partículas de lipoproteína) sejam determinados diretamente em uma

10 / 62 amostra. As proporções relativas de diferentes partículas de lipoproteína em uma amostra também podem ser determinadas em uma medição única. O método de detecção da presente invenção provê, assim, um meio rápido e simples para detectar partículas de lipoproteína e provê informação extensiva sobre a natureza e distribuição de partículas de lipoproteína na amostra. A detecção óptica realizada é também relativamente barata e apropriada de modo vantajoso a configurações clínicas, e evita protocolos de processamento complexos associados com métodos anteriores para a detecção de lipoproteínas.

[0038] Adicionalmente, os presentes inventores inesperadamente ilustraram que é possível detectar partículas de lipoproteína por espalhamento de luz (tal como por usando iSCAT) diretamente a partir de uma amostra biológica (tal como sangue ou plasma sanguíneo) sem purificação das partículas afastadas de outros componentes, apesar do sinal de fundo provido por estes outros componentes.

[0039] O método de detecção da invenção é vantajosamente empregado em configurações clínicas para detecção de partículas de lipoproteína a partir de amostras do paciente, para auxiliar diagnóstico e tratamento de doenças e condições associadas com tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína.

[0040] A presente invenção assim provê um método para detecção de partículas de lipoproteína em uma amostra, compreendendo detectar a as ditas partículas por espalhamento de luz, preferivelmente por microscopia de espalhamento interferométrico. A invenção provê adicionalmente um método para diagnóstico de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, ou para determinar o risco que o indivíduo desenvolverá a dita doença ou condição, compreendendo detectar o tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em uma amostra do o dito indivíduo por microscopia de espalhamento

11 / 62 interferométrico.

[0041] A invenção provê adicionalmente um método para selecionar um indivíduo a quem uma substância ou composição deve ser administrada, ou a quem um regime deve ser prescrito, em que a dita substância ou composição ou regime é apropriada para tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína, compreendendo detectar o tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em uma amostra do o dito indivíduo por um método para detecção da invenção, e selecionar o dito paciente para a dita administração ou o dito regime se o tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína detectadas for indicativo da presença de a dita doença ou condição, ou de um risco da mesma.

[0042] A invenção também provê um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, o método compreendendo diagnosticar ou determinar risco de a dita doença ou condição em o dito indivíduo ou selecionar o dito indivíduo por um método da invenção, e administrar uma substância ou composição ao indivíduo, ou realizar um regime no mesmo, que é eficaz para tratar ou prevenir a dita doença ou condição no indivíduo.

[0043] A invenção provê adicionalmente uma substância ou composição para uso em um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, em que o dito indivíduo é diagnosticado ou determinado em risco ou selecionado por um método da invenção.

[0044] A invenção também provê uso de uma substância ou composição na fabricação de um medicamento para tratamento de prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, em que o dito indivíduo é diagnosticado ou

12 / 62 determinado em risco ou selecionado por um método da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0045] Figura 1 provê um gráfico mostrando tipos diferentes de partículas de lipoproteína presentes em sangue humano e seus respectivos diâmetros (nm) e densidade (g/ml). A tabela também provê informação sobre as proporções relativas de proteínas, colesterol, fosfolipídeos e triglicerídeos em cada tipo de partícula.

[0046] Figura 2 mostra um esquema ilustrativo para detecção de partículas de lipoproteína por iSCAT a partir de uma amostra de sangue.

[0047] Figura 3 é um diagrama esquemático de um microscópio iSCAT incorporando um filtro espacial.

[0048] Figura 4 mostra imagens capturadas de partículas de lipoproteína HDL e LDL a partir de amostras de lipoproteína purificadas, com a barra de escala mostrando o sinal iSCAT, definido como (Is-Ip)/Is,, onde Is é a intensidade refletida a partir da superfície de vidro na ausência de uma partícula, e Ip a mesma medida na presença de uma partícula. Imagens de partículas de lipoproteína HDL e LDL são mostradas juntas com histogramas de partículas individuais obtidos a partir de todas as imagens de HDL e LDL, mostrando em gráfico o sinal de iSCAT contra números de cada partícula detectada.

[0049] Figura 5 provê correspondentes imagens e histogramas de partículas individuais para os mostrados na Figura 4 para lipoproteínas HDL e LDL detectadas por iSCAT a partir de uma amostra de soro.

[0050] Figura 6 provê histogramas de partículas individuais para partículas de lipoproteína HDL, LDL, e VLDL detectadas por iSCAT a partir de amostras de sangue total. Figuras 6A e 6B mostram histogramas a partir de uma amostra sem jejum e uma amostra em jejum, respectivamente.

[0051] Figura 7 mostra calibração de medições iSCAT usando lipoproteínas de massa/concentração conhecidas. O painel à esquerda traça os

13 / 62 eventos de ligação de partículas contra tempo de incubação (segundos). O painel à direita traça taxas de ligação iniciais determinadas a partir dos dados de ligação contra concentração, para dar uma curva de calibração permitindo a conversão da taxa de ligação inicial medida para concentração de partículas na amostra.

[0052] Figura 8a mostra um quadro de imagem de exemplo de vídeo de ‘pouso’ de uma junção de 300 nM actina com o método de diluição descrito em Exemplo 4, registrado em uma frequência de quadro de imagens de 1 kHz, frequência de quadro de imagens eficaz: 25 Hz.

[0053] Figura 8b para comparação com Figura 8a, Figura 8b mostra um quadro de imagens exemplificativos de vídeo de ‘pouso’ de 300 nM actina em câmera de fluxo sob condições similares, registradas em uma frequência de quadro de imagens de 1kHz, frequência de quadro de imagens eficaz: 25 Hz.

[0054] Figura 9 mostra o histograma de massa resultante acumulado a partir de 4 repetições do experimento descrito em Exemplo 4.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0055] A presente invenção permite medição de concentração de uma partícula em solução por detecção da ligação de uma partícula em uma amostra para uma superfície usando espalhamento de luz. Preferido é o uso de um microscópio de espalhamento de luz.

[0056] Os presentes inventores identificaram particularmente a capacidade para detectar partículas individuais de lipoproteína diretamente por espalhamento de luz, particularmente por uso de microscopia de espalhamento interferométrico. A invenção pode ser usada para detectar qualquer forma de partícula de lipoproteína, incluindo formas diferentes de partículas de lipoproteína em uma amostra. Partículas

[0057] A partícula que pode ser detectada de acordo com os métodos

14 / 62 da invenção pode ser qualquer partícula dentro de uma solução, a partir de uma molécula individual, via macromoléculas biológicas, para um conjunto oligomérico. Exemplos de partículas apropriadas são moléculas singulares, proteínas, polipeptídeos, peptídeo, aminoácidos, monossacarídeos, carboidratos, oligossacarídeos, polissacarídeos, glicopeptídeos, glicoproteínas, lipídeos, ácidos graxos, ceras, esteróis, vitaminas solúveis em gorduras, monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos fosfolipídeos, glicerolipídeos, glicerofosfolipídeos, esfingolipídeos, sacarolipídeos, policetídeos, glicolipídeos, liopoproteínas, ácidos nucleicos, nucleotídeos, ácidos polinucleicos, agrupamentos de moléculas, conjuntos, agregações, interações proteína/proteína, interações proteína/ molécula pequena, interações proteína-ácido nucleico e/ou conjuntos oligoméricos.

[0058] Para a determinação de concentração das partículas em solução, não é necessário rotular uma partícula antes da detecção. Porque a microscopia de espalhamento da luz é capaz de determinar a massa da partícula, ela pode ser simplesmente identificada por massa. Partículas de lipoproteína

[0059] As partículas de lipoproteína que podem ser detectadas de acordo com a invenção podem ser quaisquer partículas de lipoproteínas presentes em uma amostra. As partículas de lipoproteína podem ser de qualquer tamanho ou presentes em qualquer número. As partículas de lipoproteína são tipicamente selecionadas a partir de partículas de lipoproteína presentes em sangue humano ou animal. A partícula de lipoproteína tipicamente compreende triglicerídeos, colesterol, fosfolipídeos e uma ou mais proteínas, tal como uma ou mais apolipoproteínas. Partículas de lipoproteína podem ter razões e/ou densidades variadas de lipídeos e proteínas. Uma apoliproteína pode ser uma apolipoproteína periférica ou integral. Uma apolipoproteína pode ser selecionada a partir de qualquer classe ou sub-classe de apolipoproteínas. A apolipoproteína pode ter qualquer

15 / 62 polimorfismo genético. A apolipoproteína(s) pode ser selecionada a partir de classes A, B, C, D, E e/ou H. Apoliproteínas de classe A pode ser selecionada a partir de apo A-I, apo A-II, apo A-IV, e apo A-V; apolipoproteínas de classe B podem ser selecionadas a partir de apo B48 e apo B100); apolipoproteínas de classe C podem ser selecionadas a partir de apo C-I, apo C-II, apo C-III, e apo C-IV. Proteínas apolipoproteínas de classe B são encontradas em partículas de lipoproteína LDL, com apolipoproteínas de outras classes tipicamente associadas com partículas HDL de lipoproteína.

[0060] A partícula de lipoproteína tipicamente tem um diâmetro de pelo menos 1 nm e pode ter um diâmetro de até 1000 nm ou maior. Tipos particulares de partículas de lipoproteína que podem ser detectadas de acordo com a invenção incluem chylomicrons (também descritas como lipoproteínas de densidade ultrabaixa, ULDL), lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL), lipoproteína de densidade baixa intermediária (IDL), lipoproteína de densidade baixa (LDL), e lipoproteína de densidade alta (HDL). Os diâmetros de partículas, densidades e razões lipídeo:proteína ilustrativos para as partículas de lipoproteína acima são dados na Figura 1. A partícula de lipoproteína detectada de acordo com a invenção pode ter qualquer diâmetro de partícula, densidade ou razão lipídeo: proteína mostrada na Figura 1. Assim, por exemplo, uma partícula de lipoproteína HDL pode ter um diâmetro de partícula na faixa de cerca de 5 a cerca de 15 nm. Uma partícula de lipoproteína LDL pode ter um diâmetro de partícula na faixa de cerca de 18 a cerca de 28 nm. Uma partícula de lipoproteína IDL pode ter um diâmetro de partícula de cerca de 25 a cerca de 50 nm. A partícula de lipoproteína VLDL pode ter um diâmetro de partícula de cerca de 30 a cerca de 80 nm. Um chylomicron pode ter um diâmetro de partícula de cerca de 100 a cerca de 1000 nm. Uma partícula de lipoproteína HDL pode ter um peso molecular na faixa de cerca de 200 a cerca de 500 kDa. Uma lipoproteína LDL pode ter um peso molecular de cerca de 3 MDA.

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[0061] Preferivelmente, o método da invenção detecta partículas de lipoproteína HDL e/ou LDL. O método da invenção pode compreender detecção de partículas de lipoproteína VLDL. O método da invenção pode compreender detecção de partículas de lipoproteína HDL e LDL; HDL e VLDL; HDL e IDL; HDL e UDL; LDL e VLDL; LDL e IDL; ou LDL e UDL. O método da invenção pode compreender detecção de partículas de lipoproteína HDL, LDL e VLDL; HDL, LDL e IDL; ou HDL, LDL e UDL. O método da invenção pode compreender detectar partículas de lipoproteína HDL, LDL, IDL, VLDL e ULDL. Detecção de partículas IDL e VLDL tendo um diâmetro de partícula de sobreposição com outros tipos de partículas de lipoproteína pode compreender uso de etapas adicionais (tal como um anticorpo fluorescentemente marcado) para detectar proteínas específicas presentes em tais partículas. Partícula em solução

[0062] A solução pode ser qualquer solução da partícula em um solvente líquido. A solução pode ser simples, por exemplo a partícula dispersa em água (uma solução aquosa da partícula) ou pode ser uma solução complexa, por exemplo a partícula mais um ou mais solutos. A solução pode ser uma amostra. Amostras podem ser tomadas a partir de soluções comercialmente preparadas a fim de testar a concentração. Fluidos corporais são exemplos de soluções complexas onde numerosos solutos estão presentes, incluindo eletrólitos, açúcar e ureia. A amostra pode ser tomada a partir de qualquer fonte, incluindo amostras biológica ou ambiental. Se a amostra é uma amostra biológica, ela pode ser tomada ou obtida a partir de um corpo ou indivíduo humano ou animal por exemplo sangue, soro, plasma, urina, saliva, linfa, suor, fluido amniótico, fluido cerebrospinal, leite materno, lágrimas, secreções, fluido sinovial, sêmen, bile ou muco. Se a amostra é uma amostra ambiental, ela pode ser tomada a partir de qualquer fonte, tal como água (por exemplo poços, correntes, rios, lagos, água da chuva, água do mar, e

17 / 62 similares, alimentos e bebidas (por exemplo bebidas), amostras agrícolas ou amostras líquidas a partir de fábricas e processos de fabricação.

[0063] Não é necessário preparar a solução ou amostra antes do contato com a superfície, mas se a solução é destinada a ser concentrada, a solução pode ser posta em contato com uma solução de medição como discutido aqui. Superfície

[0064] A superfície usada para ligação da partícula para determinar a concentração da partícula é preferivelmente uma superfície de detector e pode formar parte de um suporte de amostra para um microscópio de espalhamento de luz.

[0065] A superfície é preferivelmente vidro, safira ou feita a partir de polímeros transparentes. A amostra é levada ao contato com a superfície a fim de determinar a concentração. A amostra pode ser colocada em um suporte de amostra que inclui a superfície. Como previamente descrito, o microscópio compreende um suporte de amostra para fixar uma amostra em um local de amostra. A amostra pode ser uma amostra líquida compreendendo partículas a serem geradas como imagem, que são descritas em maiores detalhes abaixo. Um suporte de amostra pode tomar qualquer forma apropriada para fixar a amostra. Tipicamente, o suporte de amostra retém a amostra em uma superfície, que forma uma interface entre o suporte de amostra e a amostra. Por exemplo, o suporte de amostra pode ser uma lamela e/ou pode ser feito a partir de vidro. A amostra pode ser provida sobre o suporte de amostra em um modo direto, por exemplo usando uma micropipeta ou um sistema de distribuição automatizado

[0066] O suporte de amostra pode adquirir qualquer formato apropriado. Em alguns formatos, o suporte de amostra pode permitir uma elevada razão de área de superfície para volume, de modo que acesso para a superfície não limita a ligação da partícula na solução. Em outros formatos, a

18 / 62 razão entre a área de superfície e o volume pode diminuir, de modo que se tem uma baixa razão de área de superfície para volume, que pode limitar o acesso das partículas à superfície. Será evidente para os versados na arte que a seleção de área de superfície para volume do suporte de amostra irá alterar o modo em que a concentração pode ser medida. Se o suporte de amostra tem uma baixa razão de área de superfície para volume, por exemplo, a taxa de ligação da partícula não irá diminuir ao longo do tempo. Nesta situação, a taxa de ligação em qualquer momento como detectada usando espalhamento de luz pode ser usada para calcular a concentração.

[0067] A superfície usada na invenção pode ser qualquer superfície apropriada. Por exemplo, a superfície pode ser uma superfície passivada. Passivação é o processo de tratamento ou revestimento de uma superfície a fim de intensificar ou reduzir a reatividade química, assim aumentando ou diminuindo o número de eventos de ligação.

[0068] Alternativamente, a superfície pode ser uma superfície ativada, revestida, derivatizada ou tratada. A superfície pode ser derivatizada por imobilização de uma entidade para a superfície, tal como um silano. Em Exemplo 4, a superfície é revestida com APTES, que permite a silanização, que é a funcionalização das superfícies com moléculas de alcoxissilano. Isto é vantajoso para algumas partículas como leva a uma superfície positivamente carregada. O processo de revestimento com APTES leva à formação de uma ligação covalente entre a superfície e o silano. Os grupos amina protonados se alinham eles mesmos no espaço livre e fazem sítios de ancoragem positiva para quaisquer grupos negativamente carregados (tal como ácido sialílicos, carboxila, e grupos de éster sulfato) da partícula.

[0069] A superfície pode ser revestida com uma entidade de ligação específica ou parceiro para a partícula. Uma tal superfície permite a seleção da partícula a partir de misturas concentradas ou complexas. O cálculo da concentração neste cenário requer a constante de ligação para a partícula e a

19 / 62 entidade de ligação específica a ser conhecida.

[0070] É importante que, se a superfície for modificada, estas modificações não causem quaisquer alterações na capacidade da ligação da partícula a ser detectada por espalhamento de luz. Contatando a amostra com uma superfície

[0071] A solução entra em contato com a superfície a fim de determinar concentração de uma partícula em a dita solução. A partícula se liga à superfície, e esta ligação à superfície é visualizada ou detectada usando espalhamento de luz, preferivelmente iSCAT, e preferivelmente com um microscópio.

[0072] A ligação da partícula à superfície pode ser não específica, ou alternativamente, a ligação pode ser específica, dependente da natureza da superfície usado, como discutido acima. Caso a superfície seja vidro (isto é, uma lamela de vidro) a ligação não será específica. Caso a superfície seja tratada, a ligação pode ser específica. A taxa de ligação à superfície pode ser calculada por repetição da etapa de detecção uma ou mais vezes, ou pode ser tomada a partir de uma medição individual.

[0073] A ligação e/ou número de partículas ligadas à superfície podem ser detectados usando espalhamento de luz. Isto pode ser, então, repetido uma ou mais vezes para determinar mudanças na taxa de ligação e/ou na taxa de ligação inicial da partícula à superfície. A ligação em cada ponto de tempo pode ser traçada para estabelecer a taxa de ligação.

[0074] Em casos onde a razão da área de superfície para volume da solução é baixa, uma medição pode ser suficiente a fim de determinar a concentração, porque a taxa de ligação em qualquer dado tempo é representativa do número de partículas. A taxa de ligação é constante.

[0075] Em alguns casos, pode ser desejável repetir a detecção de partículas ligadas a fim de determinar se a taxa de ligação é constante ou se ela mudou ao longo do tempo. Onde não se tem mudanças para a taxa de

20 / 62 ligação (taxa constante), a taxa de ligação registrada em qualquer ponto é representativa da concentração absoluta. Onde existem mudanças na taxa de ligação, estas mudanças podem ser traçadas em gráfico e os dados extrapolados para um ponto de tempo zero a fim de calcular a concentração.

[0076] A partir de uma taxa de ligação constante ou em caso de mudanças em taxas de ligação a partir da taxa de ligação inicial, o decaimento ou declínio na taxa de ligação da partícula para a superfície pode ser calculado. O declínio na taxa de ligação pode ser correlacionado com a concentração da partícula na solução. Por exemplo, a ligação de uma partícula para a superfície (como visualizada por iSCAT) diminui ao longo do tempo como uma função do número restante de partículas em solução e sítios acessíveis para ligação.

[0077] A detecção da ligação da partícula para a superfície pode ser repetida ao longo do tempo, e os intervalos entre medições irão depender da natureza da partícula e da solução que requer medição, e irá variar a partir de solução a solução.

[0078] De forma exemplificativa, medições podem ser tomadas em adição efetivamente imediatamente após a amostra ter sido posta em contato com a superfície, por exemplo dentro de um segundo ou fração do mesmo do contato e, então, medições podem ser tomadas a cada poucos segundos depois, por exemplo com um intervalo entre medições de 1-60, 1-30, 1-5, 5- 10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 45-50, 55- 60 segundos após contato. Medições podem ser repetidas conforme requerido a fim de determinar a taxa de ligação inicial.

[0079] Será apreciado que o intervalo entre medições pode se relacionar com a partícula sob investigação, e assim poderia ser mais longo, isto é o tempo entre medições poderia ser de minutos a horas. Assim, as medições podem ser tomadas a cada poucos minutos após a medição inicial, por exemplo com um intervalo entre medições de 1-60, 1-30, 1-5, 5-10, 10-

21 / 62 15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 45-50, 55- 60 minutos após contato. Alternativa ou adicionalmente, as medições podem ser tomadas a cada alguma hora após a medição inicial, por exemplo com um intervalo entre medições de 1-24, 1-12, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 horas ou 1 hora após contato.

[0080] Os intervalos mais longos são considerados para prover adicionalmente evidência de que não se tem nenhuma dissociação dentro de alguns minutos da medição real, porque seria possível mostrar que leva muito mais tempo para ocorrer.

[0081] Adicionalmente, os intervalos de tempo podem ser variados dentro de um ensaio. Por exemplo, as primeiras poucas medições podem ser tomadas a cada poucos segundos, e adicionalmente medições podem ser tomadas com um intervalo de tempo mais longo de minutos. Desde que o tempo de detecção seja registrado, o intervalo pode ser variado.

[0082] É preferido que a ligação seja detectada pelo menos uma vez subsequente à detecção inicial. Preferivelmente, ligação da partícula à superfície é detectada duas vezes ou mais, ainda mais preferivelmente três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes ou mais. Cada evento de detecção independente da ligação da partícula para a superfície é separado por um intervalo de tempo como discutido previamente que pode ser o mesmo intervalo de tempo entre cada evento de detecção, ou variar.

[0083] A fim de detectar a taxa de ligação, pode ser útil registrar/gravar em vídeo a ligação à superfície, como mostrado em Exemplo

4. Determinação de concentração

[0084] A fim de determinar a concentração da partícula em solução, a taxa de ligação constante ou inicial pode ser comparada à taxa de ligação constante ou inicial para uma concentração conhecida da partícula em solução. Isto permite que o método seja calibrado, porque o método foi

22 / 62 previamente realizado para uma partícula de concentração conhecida.

[0085] Taxas de ligação iniciais para uma série de concentrações conhecidas podem ser extrapoladas a partir dos dados de ligação e usadas para gerar uma curva padrão permitindo a conversão de uma taxa de ligação inicial medida na amostra para a concentração absoluta respectiva da partícula. Em uma modalidade é possível calibrar as medições de concentração feitas usando microscopia de espalhamento de luz usando partículas de conhecidas massa/concentração. Um exemplo é mostrado na Figura 7, onde a partícula é uma lipoproteína. O painel à esquerda mostra em gráfico eventos de ligação de partículas contra tempo de incubação (segundos). O painel à direita mostra em gráfico taxas de ligação iniciais determinadas a partir dos dados de ligação contra concentração, para prover uma curva de calibração permitindo a conversão de taxa de ligação inicial medida para concentração de partículas na amostra. Neste caso, a taxa de ligação é a taxa de ligação da partícula para uma superfície. Esta superfície está presente no suporte de amostra para esta modalidade, em que a solução é retida.

[0086] Análise do decaimento ou declínio na taxa de ligação detectada da partícula para uma superfície ao longo do tempo pode prover a base para permitir a medição de concentração. Pode ser necessário usar taxas de ligação de concentrações conhecidas da partícula a fim de calibrar o método.

[0087] A fim de calcular a concentração, pode ser necessário incluir correção para taxas de difusão. Taxas de difusão podem ser prontamente calculadas com base em propriedades conhecidas da partícula, tal como massa e formato.

[0088] Alternativamente, o ensaio pode ser calibrado usando um calibrante interno. O calibrante tem características similares à partícula em relação à capacidade para se ligar à superfície (por exemplo carga, hidrofobicidade, hidrofilicidade), e é assim selecionado com base na natureza

23 / 62 da partícula em solução. O calibrante tem uma massa e concentração conhecidas. O calibrante é introduzido na partícula em solução e a superfície substancialmente simultaneamente (isto é, ao mesmo tempo). Detecção da ligação de calibrante a uma superfície usando espalhamento de luz permite a determinação da taxa de ligação inicial do calibrante. Simultaneamente, a taxa de ligação inicial da partícula à superfície é determinada usando espalhamento de luz. A taxa de ligação inicial da partícula pode ser comparada à taxa de ligação inicial da concentração conhecida de calibrante, o que permite o cálculo da concentração da partícula.

[0089] Espalhamento de luz de partículas individuais pode ser usado para determinar a massa da partícula, como discutido em publicações anteriores, e assim é possível determinar a taxa de ligação de um tipo particular de partícula, usando massa para identificar as partículas de interesse. A partícula de interesse ou calibrante pode ser selecionado usando contraste, que é relacionado com a massa. Assim, é possível detectar a ligação de apenas a partícula ou o calibrante à superfície, e desconsiderar a ligação de outros solutos à superfície. Soluções concentradas

[0090] Se uma solução é suspeita de ser concentrada, isto pode tornar a medição de concentração mais complexa. A fim de assegurar que as medições determinadas usando os métodos da invenção são corretas, os inventores desenvolveram um método usando uma solução de medição. Esta é introduzida na solução de partículas com a superfície, em substancialmente o mesmo tempo.

[0091] A solução de medição pode ser uma solução de tampão. Geralmente, o volume da solução de medição é conhecido a fim de permitir o cálculo de efeitos de diluição.

[0092] Um volume da solução de partículas pode ser colocado em um suporte de amostra, preferivelmente com uma geometria conhecida. Isto

24 / 62 permite a introdução de um volume de uma solução de medição (ou introdução da solução de partículas na solução de medição), e usando comportamento de diluição, isto permite que a taxa de ligação detectada da partícula à superfície seja convertida em concentração da partícula.

[0093] A detecção da ligação da partícula à superfície pode ser tomada em um ou mais intervalos de tempo diferentes seguindo a introdução da solução de medição, como detalhado acima. Se a etapa de detecção é repetida após introdução da solução de medição em diferentes intervalos de tempo, isto permitirá a correção para efeitos de diluição, tal como dissociação. Se as medições são tomadas em diferente ponto de tempo após adição (e, assim, diluição), uma mudança em, por exemplo, distribuição de espécie se a partícula dissocia ou se agrupa em menores concentrações, pode ser visualizada. Esta abordagem, assim, permite uma vista mais detalhada da partícula e permite a verificação da medição de concentração.

[0094] Alternativa ou adicionalmente, o volume de uma ou ambas as soluções (partícula ou medição) pode ser variado, e/ou a geometria do suporte de amostra pode ser variada. Ambos permitem a correção de efeitos de diluição. Se a etapa de detecção for repetida em um ou mais diferentes volumes de solução e/ou em suportes de amostra de uma ou mais diferentes geometrias, isto também pode corrigir efeitos de diluição, tal como dissociação. Etapas do método

[0095] Como descrito aqui, a invenção provê um método para medir a concentração de partícula em solução, o método compreendendo: i) pôr a solução em contato com uma superfície; ii) detectar a ligação de partícula à superfície como visualizada por espalhamento de luz; iii) repetir a etapa de detecção e calcular mudanças em taxa de ligação e/ou em taxa de ligação inicial ao longo do tempo da partícula à

25 / 62 superfície; iv) prover uma curva de calibração de taxa de ligação inicial contra concentração com base em dados a partir das soluções de concentração conhecida de partícula; v) usar a curva de calibração na etapa (iv) para converter a taxa de ligação inicial registrada para a amostra na etapa (iii) para a concentração da partícula em solução.

[0096] O método pode envolver adicionalmente repetir etapas (i) a (ii) usando um ou mais de um suporte de amostra de geometria diferente ou usando um volume diferente de solução de medição a fim de verificar a concentração determinada.

[0097] Alternativamente, o método da invenção provê um método para medir a concentração de partícula em solução, o método compreendendo: i) pôr a solução em contato com uma superfície; ii) detectar a ligação de partícula à superfície como visualizada por espalhamento de luz; iii) repetir a etapa de detecção e calcular mudanças em taxa de ligação e/ou em taxa de ligação constante ao longo do tempo da partícula à superfície; iv) prover uma curva de calibração de taxa de ligação constante contra concentração com base em dados a partir das soluções de concentração conhecida de partícula; v) usar a curva de calibração na etapa (iv) para converter a taxa de ligação constante registrada para a amostra na etapa (iii) à concentração da partícula em solução.

[0098] O método pode envolver adicionalmente repetir etapas (i) a (ii) usando um ou mais de um suporte de amostra de geometria diferente ou usando um volume de solução diferente de medição a fim de verificar a

26 / 62 concentração determinada.

[0099] Se um calibrante interno for usado em um método da invenção, a invenção provê um método para medir a concentração de partícula em solução, o método compreendendo: i) pôr a solução em contato com uma superfície na presença de um calibrante; ii) detectar a ligação de partícula à superfície como visualizada por espalhamento de luz; iii) simultaneamente detectar a ligação do calibrante à superfície como visualizada por espalhamento de luz; iv) repetir as etapas de detecção (ii) e (iii) e calcular as mudanças em taxa de ligação e/ou taxa de ligação inicial ao longo do tempo da partícula e do calibrante à superfície; v) usar as taxas de ligação calculadas na etapa (iv) para o calibrante para converter a taxa de ligação inicial da partícula calculada na etapa (iv) à concentração da partícula em solução.

[00100] Em todas as variações, é a detecção da ligação de partícula à superfície que permite a determinação da concentração desta partícula em solução. A taxa de ligação da partícula à superfície pode ser constante, em cujo caso a taxa de ligação constante pode ser comparada à taxa de ligação constante para a mesma partícula de concentração conhecida. A taxa de ligação pode variar e, assim, a taxa de ligação inicial pode ser calculada para comparação com a taxa de ligação inicial da mesma partícula de concentração conhecida. Como discutido previamente, a natureza do suporte de amostra com relação à razão de área de superfície para volume pode alterar o cálculo da concentração. Medições de lipoproteínas

[00101] Como discutido acima, o método da invenção permite a medição direta de tamanho e número de uma ou mais partículas de

27 / 62 lipoproteína, e da razão de uma ou mais partículas diferentes de lipoproteína em uma amostra. O método pode compreender determinar o número, tamanho ou razão de dois ou mais tipos diferentes de partículas de lipoproteína simultaneamente ou concorrentemente. O método pode compreender determinar o número total de partículas de lipoproteína de uma classe particular na amostra, tal como o número total de partículas de lipoproteína HDL e/ou LDL. O método pode compreender determinar o número de partículas de lipoproteína de um tamanho particular na amostra. O método pode compreender determinar a distribuição de tamanhos para partículas de lipoproteína de um tipo particular na amostra. O método preferivelmente compreende determinar a razão de partículas de lipoproteína HDL para LDL na amostra. A razão de HDL e/ou LDL para uma ou mais de outras partículas de lipoproteína na amostra, tal como partículas de lipoproteína VLDL, também pode ser determinada. O número relativo de partículas de cada tipo de lipoproteína ou fração detectada assim pode ser determinado.

[00102] O método da invenção pode compreender obter um histograma de partículas individuais para uma ou mais partículas de lipoproteína na amostra, incluindo o número de partículas de cada tamanho diferente detectado para um dado tipo de partícula de lipoproteína. Cada partícula na amostra é, assim, detectada separadamente, em contraste com os métodos de detecção anteriores, distinguindo o teor total em bruto de lipoproteínas. A distribuição de lipoproteínas em uma população assim pode ser detectada diretamente em contraste com os métodos de detecção anteriores se apoiando em algoritmos. O método preferivelmente compreende obter um histograma de partículas individuais para partículas de lipoproteína HDL e/ou LDL.

[00103] O método pode compreender determinar a massa de lipoproteínas na amostra. O método pode compreender determinar concentrações absolutas de um ou mais tipos de lipoproteína na amostra. A massa e/ou concentração das lipoproteínas podem ser determinadas por

28 / 62 calibração contra padrões apropriados. Assim, uma faixa de lipoproteínas de massa conhecida (tal como nanodiscos de lipídeos) pode ser detectada por espalhamento de luz, tal como por iSCAT. As preparações apropriadas de lipoproteínas purificadas são disponíveis, por exemplo, a partir de Lee Biosolutions, como descrito nos Exemplos.

[00104] A curva de calibração com a relação entre massa de lipoproteína e sinal de iSCAT assim pode ser gerada. O sinal iSCAT obtido para partículas detectadas em uma amostra de interesse então pode ser correlacionado com a curva de calibração para identificar sua massa.

[00105] Concentração absoluta em solução pode ser determinada por medição de eventos de ligação entre partículas de lipoproteína na amostra e uma superfície, calibrada contra as observadas com amostras da lipoproteína de concentrações conhecidas. Por exemplo, a ligação de uma partícula à superfície (como visualizada por iSCAT) diminui ao longo do tempo como uma função do número restante de partículas em solução e sítios acessíveis para ligação. Taxas de ligação iniciais para uma série de concentrações podem ser extrapoladas a partir dos dados de ligação e usadas para gerar uma curva padrão permitindo a conversão de uma taxa de ligação inicial medida na amostra para a concentração absoluta respectiva da lipoproteína. Alternativamente, taxa de ligação constante a uma dada concentração pode ser determinada por alimentação constante da amostra em uma câmera de fluxo ou por uso de uma superfície passivada de modo que somente é possível a ligação transiente de partículas.

[00106] As calibrações exemplificativos para determinação da massa e concentração de lipoproteínas HDL e LDL em uma amostra são descritas em Exemplos. Deve ser entendido que os métodos da invenção também podem não incluir qualquer calibração com padrões conhecidos. Ao contrário, uma comparação de tamanhos e distribuições de partícula pode ser feita com tamanhos de partícula /distribuição representativos para uma fração de

29 / 62 interesse de lipoproteína.

[00107] O método também pode compreender determinar um ou mais de outros parâmetros de partículas de lipoproteína na amostra. O método pode compreender detectar níveis de colesterol, triglicerídeo e/ou apolipoproteína na amostra. Os níveis destes componentes de lipoproteína podem ser determinados por métodos conhecidos na arte, como discutido abaixo, ou alternativamente a partir de conhecimento dos números médios de uma molécula de um dado tipo na partícula de lipoproteína de interesse. Assim, os números de uma partícula de lipoproteína de um dado tipo como detectados por espalhamento de luz, tal como por iSCAT, podem ser multiplicados pelo número médio conhecido de moléculas de um componente de lipoproteína de interesse em uma tal partícula de lipoproteína, para calcular o nível total deste componente. Por exemplo, uma partícula LDL ou VLDL compreende apenas uma proteína apoB por partícula (e proteínas apoB estão ausentes em partículas HDL).

[00108] O nível de uma proteína de interesse em lipoproteínas na amostra pode ser determinado por imunoensaio, por exemplo, um imunoensaio para apoB100. A presença de uma proteína particular nas partículas de lipoproteína detectadas pode ser determinada por uso de um agente marcado de forma detectável, especificamente ligando a dita proteína. O agente pode compreender qualquer rótulo detectável apropriado. O agente pode ser um anticorpo especificamente se ligando à proteína. Preferivelmente, o rótulo detectável permite a detecção da proteína simultaneamente ou concorrentemente com detecção da partícula por espalhamento de luz, tal como por iSCAT. Preferivelmente, o rótulo detectável é um rótulo fluorescente (e, assim, por exemplo, o agente é um anticorpo fluorescentemente rotulado) e partículas incorporando a proteína são detectadas por fluorescência. O método da invenção assim pode compreender detecção de partículas de lipoproteína por espalhamento de luz (tal como por

30 / 62 iSCAT) e por fluorescência.

[00109] O método da invenção também pode compreender realizar um ou mais de outros métodos de detecção de lipoproteína. Outros métodos de detecção de lipoproteínas incluem eletroforese de gel gradiente poliacrilamida gel (ver por exemplo US 5925229A), ultracentrifugação de densidade de gradiente (ver por exemplo US20140049775A1), ressonância nuclear magnética (ver por exemplo US5343389A), análise de mobilidade de íons (ver por exemplo US7259018B2). O método pode adicionalmente compreender realizar o ensaio padrão de Friedewald para determinar um ou mais níveis de glicerídeo total (TG); colesterol total (TC); HDL-colesterol (HDL-C); e LDL-colesterol (LDL-C). O ensaio Friedewald requer precipitação de VLDL e LDL para medir nível de LDL-colesterol, como calculado por : TC-(HDL-C+TG/5). Limitações deste ensaio são sua precisão limitada quando TG > 400mg/ml, ou se razão TG/Chol de VLDL se desvia a partir de 5:1. Também é requerido jejum do indivíduo do qual a amostra para as medições de lipoproteína é obtida.

[00110] Os resultados obtidos por espalhamento de luz (tal como por iSCAT) podem ser comparados com resultados obtidos por para o(s) outro(s) método(s), ou o(s) outro(s) método(s) pode(m) ser usado(s) para prover informação adicional. Assim, por exemplo, iSCAT pode ser usada para prover informação sobre o tamanho da partícula e número e concentrações totais de um ou mais componentes de lipoproteína podem ser determinados por outros métodos. Detecção

[00111] A detecção de partículas, incluindo partículas de lipoproteína de acordo com os métodos reivindicados, é realizada usando espalhamento de luz, preferivelmente usando microscopia de espalhamento interferométrico (iSCAT). Esta técnica é revista, por exemplo, em Kukura et al., Nature Methods 2009 6:923–935, e em Ortega Arroyo et al., Physical Chemistry

31 / 62 Chemical Physics 2012 14:15625–15636.

[00112] iSCAT compreende determinar interferência entre luz espalhada por um objeto em uma amostra e luz refletida a partir do local da amostra. A interferência é dependente da amplitude de espalhamento do objeto (e, por sua vez, seu volume), e é medida como um sinal de iSCAT. Assim, o sinal de iSCAT gerado por uma partícula de lipoproteína pode ser correlacionado com seu volume e diâmetro para identificar o tipo de partícula de lipoproteína presente na amostra. Em calibração, o sinal de iSCAT também pode ser usado para estimar massa/concentração de partículas, como descrito abaixo. Assim, o método da invenção tipicamente compreende determinar um sinal de iSCAT. O sinal de isCAT pode ser descrito como a razão de luz detectada na presença e ausência de uma partícula. Em maiores detalhes, ele pode ser definido como (Is-Ip)/Is, onde Is é a intensidade refletida a partir de uma local de amostra (tal como uma superfície de vidro) na ausência de uma partícula, e Ip a mesma medida na presença de uma partícula.

[00113] O método pode compreender uso de um microscópio de espalhamento interferométrico compreendendo: um suporte de amostra para manter uma amostra em uma local de amostra; uma fonte de iluminação disposta para prover luz de iluminação; um detector; e um sistema óptico sendo disposto para dirigir luz de iluminação sobre o local de amostra e sendo disposto para coletar a luz de saída em reflexão, a luz de saída compreendendo tanto a luz espalhada a partir do local de amostra como a luz de iluminação refletida a partir do local de amostra, e dirigir a luz de saída para o detector. O microscópio pode compreender adicionalmente um filtro espacial posicionado para filtrar a luz de saída, o filtro espacial sendo disposto para passar luz de saída, mas com uma redução em intensidade que é maior dentro de uma abertura numérica predeterminada do que em aberturas numéricas maiores. Tal filtro espacial vantajosamente maximiza contraste de imagem, como descrito em PCT/GB2017/052070, e também em Cole et al

32 / 62 (ACS Photonics, 2017, 4(2), pp 211-216), cada incorporado por referência aqui.

[00114] A luz usada pode ser: luz ultravioleta (que pode ser definida aqui como tendo comprimentos de onda na faixa a partir de 10nm a 380nm); luz visível (que pode ser definida aqui como tendo comprimentos de onda na faixa a partir de 380nm a 740nm); luz infravermelha (que pode ser definida aqui como tendo comprimentos de onda na faixa a partir de 740nm a 300µm). A luz é preferivelmente luz visível. A luz azul é preferida para alta sensibilidade de detecção de partículas de lipoproteína. Luz vermelha também pode ser vantajosamente usada para permitir a combinação da detecção de partículas por iSCAT com detecção de componentes de lipoproteínas específicos (por exemplo uma proteína de interesse específica por fluorescência, por exemplo usando uma ligação de anticorpo fluorescentemente marcado para a proteína de interesse. A luz pode ter uma mistura de comprimentos de onda. A pode ser luz coerente, provida, por exemplo, por uma luz de iluminação a laser.

[00115] Figura 3 ilustra um microscópio de iSCAT 1 que pode ser empregado na invenção que é disposto como a seguir (e conFigurado com um filtro espacial como discutido acima). O filtro espacial é vantajoso pelas razões discutidas, para melhorar o contraste, mas o método da invenção pode empregar alternativamente um microscópio de iSCAT sem um filtro espacial.

[00116] O microscópio 1 inclui os seguintes componentes que, exceto pelo filtro espacial descrito em maiores detalhes abaixo, têm uma construção que é convencional no campo de microscopia.

[00117] O microscópio 1 compreende um suporte de amostra 2 para fixar uma amostra 3 em um local de amostra. A amostra 3 pode ser uma amostra líquida compreendendo objetos a serem gerados como imagem, que são descritos em maiores detalhes abaixo. O suporte de amostra 2 pode tomar qualquer forma apropriada para manter a amostra 3. Tipicamente, o suporte

33 / 62 de amostra 2 mantém a amostra 3 em uma superfície, que forma uma interface entre o suporte de amostra 2 e a amostra 3. Por exemplo, o suporte de amostra 2 pode ser uma lamela e/ou pode ser feito a partir de vidro. A amostra 3 pode ser provida no suporte de amostra 2 em um modo simples e direto, por exemplo usando uma micropipeta.

[00118] O microscópio 1 adicionalmente compreende uma fonte de iluminação 4 e um detector 5.

[00119] A fonte de iluminação 4 é disposta para prover luz de iluminação. A luz de iluminação pode ser luz coerente. Por exemplo, a fonte de iluminação 4 pode ser um laser. O comprimento de onda da luz de iluminação pode ser selecionado dependendo da natureza da amostra 3 e/ou das propriedades a serem examinadas. Em um exemplo, a luz de iluminação tem um comprimento de onda de 405nm.

[00120] Opcionalmente, a iluminação luz pode ser modulada espacialmente, para remover padrões de salpicos que surgem a partir da natureza coerente do ruído de laser e iluminação, por exemplo como detalhado em Kukura et al., “High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus”, Nature Methods 2009 6:923–935.

[00121] O detector 5 recebe luz de saída em reflexão a partir do local de amostra. Tipicamente, o microscópio 1 pode operar em um modo de campo ampla, em cujo caso o detector 5 pode ser um sensor de imagem que captura uma imagem da amostra 3. O microscópio 1 pode operar alternativamente em um modo confocal, em cujo caso o detector 5 pode ser um sensor de imagem ou pode ser um detector tipo ponto, tal como um foto- diodo, em cujo caso uma disposição de varredura pode ser usada para varrer uma região da amostra 3 para construir uma imagem. Exemplos de sensores de imagem que podem ser empregados como o detector 5 incluem um sensor de imagem CMOS (semicondutor complementar de óxido metálico) ou um CCD (dispositivo acoplado a carga).

34 / 62

[00122] O microscópio 1 adicionalmente compreende um sistema óptico 10 disposto entre o suporte de amostra 2, a fonte de iluminação 4 e o detector 5. O sistema óptico 10 é disposto como a seguir para dirigir luz de iluminação sobre o local de amostra para iluminar a amostra 3, e para coletar a luz de saída em reflexão a partir do local de amostra e para dirigir a luz de saída para o detector 5.

[00123] O sistema óptico 10 inclui uma lente objetiva 11 que é um sistema de lente disposto em frente do suporte de amostra 2. O sistema óptico 10 também inclui uma lente de condensador12 e uma lente de tubo13.

[00124] A lente de condensador 12 condensa a luz de iluminação a partir da fonte de luz 11 (mostrada por linhas contínuas na Figura 1) através da lente objetiva 11 sobre a amostra 3 no local de amostra.

[00125] A lente objetiva 11 coleta a luz de saída que compreende tanto (a) luz de iluminação refletida a partir do local de amostra (mostrada por linhas contínuas na Figura 1), e (b) luz espalhada a partir da amostra 3 no local de amostra (mostrada por linhas pontilhadas na Figura 1). A luz refletida é predominantemente refletida a partir da interface entre o suporte de amostra 2 e a amostra 3. tipicamente, esta é uma reflexão relativamente fraca, por exemplo uma reflexão vidro-água. Por exemplo, a intensidade da luz de iluminação refletida pode ser da ordem de 0,5% da intensidade da luz de iluminação incidente. A luz espalhada é espalhada por objetos na amostra 3.

[00126] Em um modo similar a iSCAT convencional, luz espalhada a partir de objetos em ou próximo da superfície da amostra construtivamente interferem com a luz refletida e, assim, são visíveis na imagem capturada por detector 5. Esse efeito difere a partir de um microscópio operando em transmissão em que a luz de iluminação que alcança o detector é transmitida através da profundidade da amostra levando a um contraste na geração de imagem bem menor.

[00127] Como mostrada na Figura 1, a luz de iluminação refletida e a

35 / 62 luz espalhada têm diferentes direcionalidades. Em particular, a luz de iluminação refletida tem uma abertura numérica resultante a partir da geometria do feixe de saída de luz pela fonte de luz 4 e o sistema óptico 6. A luz espalhada é espalhada sobre uma ampla faixa de ângulos e, assim, preenche uma abertura numérica maior do que a luz de iluminação refletida.

[00128] A lente de tubo 13 focaliza a luz de saída a partir da lente objetiva 11 sobre o detector 5.

[00129] O sistema óptico 6 também inclui um divisor de feixe 14 que é disposto para dividir os trajetos ópticos para a luz de iluminação a partir da fonte de luz 4 e da luz de saída dirigida para o detector 5. Exceto pela provisão de um filtro espacial como descrito abaixo, o divisor de feixe 14 pode ter uma construção convencional que provê reflexão parcial e transmissão de luz parcial incidente no mesmo. Por exemplo, o divisor de feixe 14 pode ser uma placa, tipicamente provida com uma película, que pode ser metálica ou dielétrica, disposta a 45° para os trajetos ópticos. Alternativamente, o divisor de feixe 14 pode ser um divisor de feixe de cubo formado por um par casado de prismas tendo uma película parcialmente refletiva na interface entre os prismas. Alternativamente, o divisor de feixe 14 pode ser um divisor de feixe polarizante, usado em combinação com uma placa de quarto de onda entre o divisor de feixe 14 e a amostra 3.

[00130] No exemplo mostrado na Figura 1, a fonte de luz 4 é desviada a partir do trajeto óptico da lente objetiva 11 de modo que a luz de iluminação a partir da fonte de luz 4 é refletida pelo divisor de feixe 14 dentro da lente objetiva 11, e inversamente o detector 5 é alinhado com o trajeto óptico da lente objetiva 11 de modo que a luz de saída a partir do local de amostra é transmitida através do divisor de feixe 14 em direção ao detector 5.

[00131] Além dos componentes descritos acima que podem ser de uma construção convencional, o microscópio 1 inclui um filtro espacial 20. No exemplo mostrado na Figura 1, o filtro espacial 20 é formado no divisor de

36 / 62 feixe 14 sendo, assim, posicionado atrás da abertura traseira da lente objetiva 11, e assim diretamente atrás do plano focal traseiro 15 da lente objetiva 11. Assim, o filtro espacial 20 pode ser implementado sem entrar na lente objetiva, como é o caso na microscopia de contraste de fase. Colocar o filtro espacial diretamente atrás da abertura de entrada do plano objetivo, em vez de em um plano conjugado (por exemplo, como descrito abaixo), tem a vantagem distinta de suprimir fortemente as retro-reflexões que se originam a partir das numerosas lentes dentro das objetivas do microscópio com elevada abertura numérica. Isto, por sua vez, reduz o ruído na geração de imagem, diminui o fundo não interferométrico e reduz a complexidade experimental, número de dispositivos ópticos e comprimento do trajeto óptico levando a uma aumentada estabilidade da configuração óptica e, assim, a qualidade da imagem.

[00132] No entanto, esse local não é essencial e um filtro espacial tendo uma função equivalente pode ser provido em algum ponto, como descrito abaixo.

[00133] O filtro espacial 20 é assim posicionado para filtrar a luz de saída passando para o detector 5. No exemplo mostrado na Figura 1 em que o detector 5 é alinhado com o trajeto óptico da lente objetiva 11, o filtro espacial 20 é assim transmissivo.

[00134] O filtro espacial 20 é parcialmente transmissivo e assim passa a luz de saída, que inclui a luz de iluminação refletida, mas com uma redução em intensidade. O filtro espacial 20 é também alinhado com o eixo óptico e tem uma abertura predeterminada de modo que possibilita uma redução em intensidade dentro de uma abertura numérica predeterminada. Aqui, abertura numérica é definida em seu modo normal como sendo uma quantidade sem dimensão que distingue uma faixa de ângulos com relação ao local de amostra a partir de que a luz de saída se origina. Especificamente, a abertura numérica NA pode ser definida pela equação NA=n•sin(θ), onde θ é o meio-ângulo de

37 / 62 coleta e n é o índice refrativo do material através de que a luz de saída passa (por exemplo o material dos componentes do sistema óptico 6).

[00135] O filtro espacial 20 não provê redução de intensidade fora da abertura numérica predeterminada. Em princípio, o filtro espacial 20 poderia prover alternativamente uma redução em intensidade fora de sua abertura predeterminada, mas uma redução em intensidade que é menor do que a redução em intensidade dentro da abertura numérica predeterminada, embora isto seja menos desejável.

[00136] O filtro espacial 20 pode ser formado em qualquer modo apropriado, tipicamente compreendendo uma camada de material depositado. O material pode ser, por exemplo, um metal tal como prata. A deposição pode ser realizada usando qualquer técnica apropriada.

[00137] Como os objetos de tamanho de sub-difração próximo de uma interface difundem luz preferivelmente em uma abertura numérica maior do que a luz de iluminação refletida, a redução em intensidade provida pelo filtro espacial 20 preferivelmente reduz a intensidade em detecção da luz de iluminação refletida sobre a luz espalhada. Consequentemente, a redução em intensidade pelo filtro espacial 20 em aberturas numéricas baixas predominantemente afeta a luz de iluminação refletida e tem um efeito mínimo sobre a luz espalhada, assim maximizando o contraste na imagem de captura. O contraste intensificado na geração de imagem permite uma detecção de alto contraste de objetos que são espalhadores fracos.

[00138] A intensificação do contraste pode ser entendida como a seguir. Como o filtro espacial 20 passa parte da luz de saída na abertura numérica predeterminada (isto é, é parcialmente transmissivo neste exemplo), frações de luz de iluminação e campos de luz espalhada alcançam o detector e interferem para uma fonte de iluminação suficientemente coerente. A intensidade de luz alcançando o detector Idet é então dada por Idet = |Einc|2{r2t2+|s|2+2rt|s|cosΦ}, onde Einc é o campo de luz incidente, r2 é a

38 / 62 refletividade da interface e t2 é a transmissividade do filtro espacial 20, s é a amplitude de espalhamento do objeto, e Φ é a diferença de fase entre luz de iluminação transmitida e a luz espalhada. Assim, o contraste de espalhamento é intensificado, albeit às custas do número total de fótons detectados.

[00139] Assim, contraste é obtido em um modo similar a iSCAT convencional, mas controlado adicionalmente pela transmissividade do filtro espacial. Isto provê a capacidade de sintonizar a amplitude do campo de referência diretamente através de seleção da transmissividade t2 do filtro espacial 20, como oposto a ser fixado pela refletividade de uma interface vidro-água como em iSCAT padrão. No caso em que o filtro espacial 20 é uma camada de material depositado, a transmissividade t2 pode ser selecionada por escolha do material e/ou espessura da camada. Esta sintonização pode ser realizada de acordo com, por exemplo, o objeto de espalhamento de interesse, a capacidade pela da câmera e ampliação.

[00140] Para maximizar estes efeitos benéficos para iSCAT, a abertura numérica predeterminada pode ser a abertura numérica da luz de iluminação refletida dentro da luz de saída, mas que não é essencial. Por exemplo, benefícios de uma natureza similar poderiam ser obtidos se a abertura numérica predeterminada fosse levemente menor do que, ou maior do que a abertura numérica da luz de iluminação refletida. Amostra incluindo lipoproteínas

[00141] A amostra pode ser qualquer amostra compreendendo partículas de lipoproteína. As partículas são tipicamente partículas de lipoproteína produzidas in vivo, tal como em um humano ou animal. Assim, as partículas de lipoproteína estão tipicamente presentes em uma amostra biológica. No entanto, partículas de lipoproteína produzidas in vitro e/ou providas em forma purificada também pode ser detectadas, por exemplo para fins de calibração, como discutido acima. A amostra pode compreender tipos múltiplos diferentes de lipoproteínas em forma purificada. A amostra também

39 / 62 pode ser uma mistura complexa ou solução polidispersa de diversos componentes, tal como uma solução compreendendo múltiplos e diferentes ions, proteínas e lipoproteínas.

[00142] Onde a amostra é uma amostra biológica obtida a partir de um humano ou um animal, ela pode ser uma amostra clínica. A amostra pode ser uma amostra clínica a partir de qualquer indivíduo, como descrito abaixo em contexto dos métodos de tratamento e diagnóstico da invenção. Ela pode ser uma amostra de qualquer fluido ou tecido corporal compreendendo partículas de lipoproteína. Tipicamente, a amostra é sangue ou um componente de sangue, tal como plasma ou soro. A amostra pode ser sangue capilar, venoso ou arterial ou plasma ou soro do mesmo. A coleta de amostras pode ser realizada por qualquer meio, incluindo por picada no dedo ou venopunção.

[00143] Como discutido acima, a detecção de lipoproteínas de acordo com a invenção é vantajosamente obtida sem separação ou purificação de lipoproteínas a partir de outros componentes de uma amostra. Tal separação e purificação, como requerido nos métodos anteriores de detecção, são consumidoras de tempo e também podem mudar artificialmente algumas propriedades de partículas de lipoproteína. No entanto, deve ser entendido que uma amostra biológica, tal como sangue, será tipicamente diluída a fim de reduzir a densidade de partículas e auxiliar na resolução ótima de tipos diferentes de partículas de lipoproteína. A amostra pode ser diluída em qualquer tampão apropriado. Tipicamente, um tampão apropriado tem um pH fisiológico e concentração de sal. As condições de tampão não fisiológico também podem ser usadas para examinar os efeitos destas condições em partículas de lipoproteína.

[00144] O versado é capaz de selecionar uma diluição apropriada de uma dada amostra para detecção de partículas de lipoproteína particulares de interesse por experimentação de rotina. A diluição pode ser feita empiricamente até uma diluição ser identificada que permite a detecção de

40 / 62 partículas individuais, de acordo com a velocidade da geração de imagem e sensibilidade do instrumento de detecção. O fator de diluição então será levado em conta para extrapolar para o número das partículas de lipoproteína na amostra não diluída.

[00145] Onde a amostra é sangue ou plasma, ela pode ser diluída 10 000 vezes ou mais em um tampão apropriado para permitir a detecção de HDL (que é relativamente denso, comparada com LDL em alta concentração) ou para detecção de resolução ótima de HDL e LDL ao mesmo tempo. Uma diluição menor (1-5000 vezes) pode ser usada para detecção de LDL.

[00146] O volume de amostra requerido para detecção de lipoproteínas por iSCAT é mínimo, e pode ser tão pequeno como um microlitro, dependendo do tipo de amostra e meio de coleta. A picada no dedo permite a coleta de volumes muito pequenos de sangue. A amostra pode ser provida em qualquer câmara apropriada de amostra. A câmara de amostra pode ser provida por uma junção em uma lamela, por exemplo, como descrito nos Exemplos. A câmara de amostra pode ser alternativamente uma câmera de fluxo ou dispositivo micro-fluídico ou chip, tal como um chip capilar. Método de diagnóstico ou determinação de risco

[00147] A invenção tem utilidade particular em aplicações diagnósticas, com base na correlação entre tamanho, número, distribuição e razão de tipos diferentes de partículas de lipoproteína com doença. A invenção provê, consequentemente, um método para diagnóstico de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, ou para determinar o risco que o indivíduo desenvolverá a dita doença ou condição, compreendendo detectar o tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em uma amostra do o dito indivíduo por microscopia de espalhamento interferométrico. A detecção pode ser realizada em qualquer modo descrito acima em conexão com os métodos de detecção da invenção, e para qualquer tipo de partícula(s) de lipoproteína

41 / 62 como descrito acima. Assim, o método pode compreender detectar o tamanho e/ou número de mais do que um tipo diferente de partícula de lipoproteína, ou a razão de tipos diferentes de partícula de lipoproteína, na dita amostra. O método preferivelmente compreende detectar partículas de lipoproteína de alta densidade (HDL) e/ou partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL). O método pode compreender particularmente determinar a razão de partículas HDL para LDL na dita amostra. A amostra pode ser qualquer amostra biológica ou clínica descrita acima, preferivelmente sangue, soro ou plasma. O indivíduo pode ser um animal, mamífero ou humano.

[00148] Os níveis particulares de partículas de lipoproteína, distribuições e tamanhos podem estar correlacionados com doença. HDL, descrito na técnica como “bom colesterol”, funciona como o trânsito do colesterol para longe do sangue, tecidos, e órgãos do corpo em direção ao fígado. Assim, níveis normais de HDL fornecem uma regulação apropriada de níveis no sangue de colesterol. Mudanças em nível/redistribuição de HDL de colesterol para outras partículas de lipoproteína podem estar associadas com doença ou risco aumentado de doença. Por exemplo, tendo níveis de colesterol HDL (concentração de colesterol carregado por partículas HDL) menores do que 40 mg/dL para homens e menores que 50 mg/dL para mulheres é um fator de risco importante para doença cardíaca. (Mayo Clinic, 2016). Partículas HDL são normalmente a fração de lipoproteína a mais frequente em sangue.

[00149] LDL, a próxima fração de lipoproteína mais frequente em sangue normal, é, em contraste, considerada com frequência como “colesterol ruim”, devido ao seu papel em disposição de colesterol em tecidos e órgãos do corpo. Ter níveis elevados de LDL pode levar à formação de placas nas artérias, possivelmente aumentando o risco de doença cardíaca e acidente vascular cerebral (American Heart Association, 2014). O tamanho de LDL também tem sido mostrado como ligado à saúde cardiovascular. O nível de

42 / 62 colesterol LDL normal (concentração de colesterol carregado por partículas de LDL) está na faixa de 100-129 mg/dL. Quanto menores as partículas de LDL, maior será a correlação para um evento cardiovascular. (Foroutan, MS, RDN, 2015).

[00150] Outras frações de lipoproteínas (VLDL, IDL, UDL) são 10- 100 vezes menos frequentes do que LDL.

[00151] Consequentemente, a medição precisa dos números, tamanhos e razões de HDL e/ou LDL (e de parâmetros similares para outras partículas de lipoproteína), como oferecida por detecção de acordo com a invenção, provê informação de valor diagnóstico para doenças ou condições associadas com tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína. Medição de números/tamanhos de HDL e LDL, em particular, é de valor diagnóstico para doença cardiovascular. Um ensaio homogêneo direto, como provido de acordo com a invenção, em vez de determinar os valores de LDL-C com base em cálculo de Friedewald, também pode melhorar as análises de lipoproteínas e permitir obter um valor de LDL mais preciso, especialmente com relação aos pacientes sofrendo de hiperlipidemia (Nauck, Warnick, & Rifai, 2002). Também, embora a determinação de níveis de colesterol em soro total seja usada como rotina como uma ferramenta diagnóstica, aproximadamente metade dos pacientes que sofrem de doença da artéria coronária sintomática apresentam concentrações de colesterol LDL normais, medidas usando métodos padrões. Assim, parece existir um risco escondido não detectado por medições de colesterol em laboratórios clínicos convencionais, que é vantajosamente evitado por detecção direta de números e tamanhos de partículas de lipoproteína de acordo com a invenção.

[00152] A doença ou condição a ser diagnosticada, ou para a qual risco deve ser determinado, pode ser qualquer doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína. A doença ou condição pode ser associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína

43 / 62 HDL e/ou LDL. A doença de condição pode ser associada com razão de partículas de lipoproteína HDL para LDL. A doença ou condição pode ser Alternativa ou adicionalmente associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína VLDL, IDL e/ou UDL, ou a razão de VLDL, IDL e/ou UDL para HDL e/ou LDL. A doença ou condição pode ser associada com distribuição ou tamanho anormal de lipoproteínas.

[00153] A doença ou condição pode ser uma em que um número diminuído de partículas HDL está presente comparado com um nível normal (controle ou referência). Assim um número diminuído de partículas HD, quando comparado com uma amostra de controle ou amostra de referência/nível, pode ser indicativo de que o indivíduo tem a dita doença ou condição, ou tem um risco aumentado de desenvolver a dita doença ou condição. A doença ou condição pode compreender uma concentração de colesterol HDL no sangue de menos do que 40 mg/dL para homens ou menos do que 50 mg/dL para mulheres. A concentração de colesterol HDL no sangue de 40-50 mg/dL (1,0-1,3 mmol/L) para homens ou entre 50-59 mg/dL (1,3-1,5 mmol/L) para mulheres está associada com risco médio de doença cardíaca). Com base em muitos estudos epidemiológicos, concentração de colesterol HDL no sangue de 60 mg/dL (1,55 mmol/L) ou maior é associada com um risco abaixo da média de doença cardíaca. Um nível normal de colesterol HDL pode ser mais geralmente definido como maior do que 1 mmol/L.

[00154] A doença ou condição pode Alternativa ou adicionalmente ser uma em que um número aumentado de partículas LDL, ou um número aumentado de partículas LDL de menor tamanho, estão presentes comparado com um nível normal. Assim, um número e/ou tamanho aumentados de partículas LDL quando comparado com uma amostra de controle ou amostra de referência/nível, são indicativos de que o indivíduo tem a dita doença ou condição, ou tem um risco aumentado de desenvolver a dita doença ou

44 / 62 condição. A doença ou condição pode compreender uma concentração de colesterol LDL no sangue de mais do que 3 mmol/L. Se uma não tem outros fatores de risco para doença cardiovascular, um nível de colesterol LDL no sangue de menos do que 100 mg/dL (2,59 mmol/L) pode ser considerado como ótimo; um nível de 100-129 mg/dL (2,59-3,34 mmol/L) próximo de ótimo/acima de ótimo, e um nível de 130-159 mg/dL (3,37-4,12 mmol/L) linha de limite elevado.

[00155] A razão de HDL:LDL pode ser diminuída na doença ou condição.

[00156] Um número e/ou tamanho normal para uma dada partícula de lipoproteína são determinados por referência para um número e/ou tamanho de linha de base para partículas desse tipo em um indivíduo que não apresenta qualquer condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína, tal como uma condição discutida abaixo. Um tal indivíduo assim provê um número e/ou tamanho de controle ou referência de uma ou mais partícula(s) de lipoproteína que podem ser comparados com o número e/ou tamanho de uma ou mais partícula(s) de lipoproteína detectada(s) por iSCAT em uma amostra a partir do indivíduo em que o método diagnóstico acima é realizado. O tamanho/número de controle ou referência podem ser uma média dos valores a partir de múltiplos indivíduos normais. O indivíduo pode ter nível normal de colesterol em sangue total, preferivelmente um nível normal de colesterol HDL no sangue e colesterol LDL no sangue, como discutido acima. Um nível normal de colesterol no sangue total (saudável) está abaixo 5 mmol/L.

[00157] O método de diagnóstico ou determinação de risco da invenção assim tipicamente compreende uma etapa de comparar o número e/ou tamanho de uma ou mais partículas de lipoproteína(s) na amostra a partir do indivíduo com um número de controle e/ou tamanho para a dita(s) partícula(s) de lipoproteína. Um número e/ou tamanho aumentados ou

45 / 62 diminuídos para a(s) partícula(s) de lipoproteína podem ser indicativos de presença da doença ou condição, ou um risco da mesma, como discutido adicionalmente abaixo. Deve ser entendido que o nível de controle ou referência pode ser previamente determinado por iSCAT ou por qualquer outro método de detectar partículas de lipoproteína, tal como qualquer outro método conhecido de detecção descrito aqui. Alternativamente, número e/ou tamanho de partículas de lipoproteína podem ser detectados por iSCAT em uma amostra de controle simultaneamente com o nível ou distribuição de colesterol. O indivíduo pode ter qualquer condição relacionada com colesterol. A doença ou condição pode estar associada com níveis aumentados ou altos de colesterol no sangue total, colesterol HDL e/ou colesterol LDL. Os níveis normais de colesterol total e colesterol HDL e LDL são discutidos acima. A doença ou condição pode estar associada com níveis aumentados ou altos de triglicerídeos. A doença ou condição é preferivelmente uma doença cardiovascular. A doença ou condição pode ser uma doença vascular.

[00158] Doença cardiovascular (DCV) refere-se a uma classe de doenças que envolvem o coração ou os vasos sanguíneos. As doenças cardiovasculares que envolvem os vasos sanguíneos também são conhecidas como doenças vasculares. A doença ou condição pode ser qualquer doença vascular. A doença ou condição pode ser selecionada a partir de qualquer doença arterial coronariana, doença cardíaca coronária, doença isquêmica do coração, doença arterial periférica, doença cerebrovascular, acidente vascular cerebral, mini-acidente vascular cerebral, estenose da artéria renal e aneurisma da aorta. A doença ou condição pode ser qualquer doença cardiovascular que envolva o coração. A doença ou condição pode ser selecionada de qualquer doença cardíaca hipertensiva, secundária a pressão alta, hipertensão, insuficiência cardíaca, doença cardíaca pulmonar, disritmias cardíacas, anormalidades do ritmo cardíaco, doença cardíaca inflamatória, endocardite, cardiomegalia inflamatória, miocardite, doença cardíaca valvular

46 / 62 e doença cardíaca reumática. A doença ou condição pode ser hipercolesterolemia, como hipercolesterolemia familiar. A doença ou condição pode ser qualquer doença ou condição não cardiovascular associada ao aumento do colesterol ou triglicerídeos, de modo que o diagnóstico do número e/ou tamanho das partículas de lipoproteínas possa auxiliar no diagnóstico (e tratamento) desse aspecto da doença ou condição. Exemplos de tais doenças e condições incluem diabetes, doença renal, tireóide subativa ou pâncreas inflamado (pancreatite).

[00159] O indivíduo pode ser previamente distinguido como tendo risco de doença cardiovascular, e/ou recomendado para um teste de níveis de colesterol no sangue. O indivíduo pode ser previamente diagnosticado como tendo uma doença cardiovascular, incluindo qualquer uma das doenças acima. Nesse aspecto, a invenção proporciona uma determinação mais precisa de número e/ou tamanho de partículas de lipoproteína no indivíduo.

[00160] O indivíduo pode ser selecionado para diagnóstico ou avalição de risco com base em qualquer fator de risco tal como gênero, idade, histórico familiar, peso, índice de massa corporal, dieta ou estilo de vida. O indivíduo pode ter idade acima de 40; de acordo com as diretrizes do NHS, pessoas acima de 40 devem ter sua estimativa de risco de CVD revista regularmente. O indivíduo pode ter um histórico familiar de doença cardiovascular prematura – por exemplo, tendo um pai ou irmão que desenvolveu doença cardíaca ou teve um ataque do coração ou acidente vascular cerebral antes da idade de 55, ou uma mãe ou irmã que teve tal condição antes da idade de 65. O indivíduo pode ter um membro da família, tipicamente um membro da família próximo, que tem uma condição relacionada com colesterol, tal como hipercolesterolemia familiar. O indivíduo pode ser sobrepeso ou ser obeso. O indivíduo pode ter pressão alta ou diabete.

[00161] A invenção adicionalmente provê um método de seleção de um indivíduo a quem uma substância ou composição deve ser administrada,

47 / 62 ou a quem um regime deve ser prescrito, em que a dita substância ou composição ou regime é apropriado para tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína, compreendendo detectar o tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em uma amostra do o dito indivíduo por microscopia de espalhamento interferométrico de acordo com o método de detecção da invenção, e selecionar o dito paciente para a dita administração ou o dito regime se o tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína detectadas forem indicativos da presença de a dita doença ou condição, ou de um risco da mesma. O método pode compreender adicionalmente selecionar o indivíduo com base em qualquer fator de risco descrito acima.

[00162] As substâncias e composições apropriadas para administração são descritas abaixo. Um regime de tratamento apropriado pode compreender uma mudança em estilo de vida, dieta ou exercícios.

[00163] A invenção adicionalmente provê um kit que provê meios apropriados para uso nos métodos de detecção de partículas de lipoproteína, ou de diagnóstico ou determinação de risco, de acordo com a invenção. O kit pode compreender componentes apropriados para detecção de partículas de lipoproteína por microscopia de espalhamento interferométrico. O kit pode compreender instruções para uso do kit de acordo com métodos da invenção. As instruções podem dar níveis de referência para números e tamanhos de uma mais partículas de lipoproteína, e histogramas de referência de partículas individuais para uma ou mais partículas de lipoproteína. O kit também pode compreender detalhes com relação com quais indivíduos os métodos podem ser realizados. O kit pode compreender um ou mais componentes de uma câmara de amostra, tal como uma lamela e junção, uma célula de fluxo, um dispositivo microfluídico ou um chip, como um chip capilar. O kit pode compreender um meio para obter uma amostra (tipicamente uma amostra de sangue) do indivíduo, como um dispositivo de coleta de sangue capilar, um

48 / 62 dispositivo de coleta de picadas no dedo ou qualquer instrumento compreendendo uma agulha. O kit pode compreender uma ou mais amostras de lipoproteínas padrão (como nanodiscos como aqui descrito) que proporcionam a calibração de medições de partículas de lipoproteínas de acordo com a invenção. O kit pode adicionalmente compreender meios para a medição de outros parâmetros laboratoriais ou clínicos. Os procedimentos usando esses kits podem ser realizados por laboratórios clínicos, laboratórios experimentais, médicos ou indivíduos particulares. A invenção provê ainda o uso de componentes adequados para a detecção de partículas de lipoproteínas por microscopia de espalhamento interferométrico na fabricação de um kit de teste para diagnóstico ou determinação do risco de doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteínas. Os componentes podem ser componentes de uma câmara de amostra como descrito acima. O kit de teste pode compreender instruções, meios ou amostras padrão, como descrito acima. Métodos de tratamento e usos médicos

[00164] A invenção adicionalmente provê um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, o método compreendendo selecionar o dito indivíduo, ou diagnosticar ou determinar risco de a dita doença ou condição em o dito indivíduo por um método como descrito acima, e administrar uma substância ou composição para o indivíduo, ou realizar um regime no mesmo, que é eficaz para tratar ou prevenir a dita doença ou condição no indivíduo.

[00165] A invenção também provê uma substância ou composição para uso em um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, em que o dito indivíduo é diagnosticado ou determinado em risco ou selecionado por um método da invenção como descrito acima.

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[00166] A invenção adicionalmente provê uso de uma substância ou composição na fabricação de um medicamento para tratamento de prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, em que o dito indivíduo é diagnosticado ou determinado em risco ou selecionado por um método da invenção como descrito acima.

[00167] O indivíduo pode ser qualquer indivíduo descrito acima, preferivelmente um indivíduo humano. O indivíduo pode ter ou estar em risco de qualquer doença ou condição descrito acima, e ter qualquer fator de risco descrito acima. Preferivelmente, o indivíduo pode ter ou estar em risco de uma doença cardiovascular, que pode ser qualquer doença cardiovascular específica descrita acima.

[00168] A substância ou composição é administrada em uma quantidade eficaz para prevenção ou tratamento da a dita doença. Um regime (como mudança no estilo de vida, dieta ou exercício) é normalmente realizado por um período eficaz para a prevenção ou tratamento da a dita doença. Um regime adequado pode incluir perda de peso, redução ou cessação do tabagismo ou ingestão de álcool, aumento do exercício e/ou dieta saudável. O regime também pode incluir cirurgia, como angioplastia coronária ou ponte de artéria coronária. A cirurgia pode compreender a introdução de um stent. A prevenção ou tratamento da doença pode ser determinada por referência à prevenção ou atraso no início da doença ou pela redução ou eliminação de um ou mais sintomas da doença. A prevenção ou tratamento pode induzir ou prolongar a remissão ou retardar a recaída ou recorrência da doença ou condição. A administração de uma quantidade eficaz ou a realização de um regime eficaz pode ser determinada pela medição de um número, tamanho ou razão de partículas de lipoproteína normais em uma amostra do indivíduo (ou uma mudança para número, tamanho ou razão de partículas de lipoproteínas normais) após a administração ou regime.

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[00169] A substância ou composição pode ser qualquer substância ou composição apropriada para tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína, por qualquer meio. A substância ou composição pode reduzir a concentração de LDL ou reduzir o tamanho de partículas de lipoproteínas LDL. A substância ou composição pode aumentar a concentração de HDL. A substância ou composição pode reduzir os níveis de colesterol no sangue, incluindo níveis de colesterol no sangue total, ou níveis de colesterol LDL no sangue total. A substância ou composição pode reduzir a pressão do sangue ou ampliar as artérias. O agente pode ser um vasodilator. A substância ou composição pode compreender qualquer agente conhecido para prevenção ou tratamento de doença cardiovascular ou redução de pressão do sangue. O agente pode ser uma estatina. Estatinas (também conhecidas como inibidores de HMG-CoA redutase) são um grupo de remédios que são capazes de abaixar o nível de colesterol LDL no sangue, e que foram verificadas como reduzindo doença cardiovascular e mortalidade nas pessoas em alto risco. O agente pode ser um beta-bloqueador, nitrato, um ACE (enzima de conversão de angiotensina) ou inibidor de receptor II de angiotensina, um bloqueador do canal de cálcio ou um diurético.

[00170] A substância ou composição pode ser um inibidor de molécula pequena, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um polinucleotídeo, um oligonucleotídeo, um RNA antisenso, RNA interferência pequena (siRNA) ou RNA‘grampo de cabelo’ pequeno (shRNA).

[00171] Um polinucleotídeo, tal como um ácido nucleico, é um polímero compreendendo dois ou mais nucleotídeos. Os nucleotídeos podem ser de ocorrência natural ou artificiais. Um nucleotídeo tipicamente contém uma nucleobase, um açúcar e pelo menos um grupo de ligação, tal como um grupo fosfato, 2’O-metil, 2’ metoxi-etil, fosforamidato, metilfosfonato ou fosforotioato. A nucleobase é tipicamente heterocíclica. Nucleobases incluem,

51 / 62 mas não são limitadas a, purinas e pirimidinas e mais especificamente adenina (A), guanina (G), timina (T), uracila (U) e citocina (C). O açúcar é tipicamente um açúcar pentose. Os açúcares de nucleotídeo incluem, mas não são limitados a ribose e deoxirribose. O nucleotídeo pode ser qualquer nucleotídeo ou nucleotídeo modificado, tipicamente um ribonucleotídeo ou deoxirribonucleotídeo ou uma versão modificada do mesmo. O nucleotídeo tipicamente contém um monofosfato, difosfato ou trifosfato. Fosfatos podem ser fixados no lado 5’ ou 3’ de um nucleotídeo. O polinucleotídeo pode ser um ácido nucleico, tal como ácido deoxirribonucleico (DNA) ou um ácido ribonucleico (RNA). O polinucleotídeo pode ser qualquer ácido nucleico sintético conhecido na arte, tal como ácido nucleico peptídeo (PNA), ácido nucleico glicerol (GNA), ácido nucleico treose (TNA), ácido nucleico travado (LNA), ácido nucleico morfolino ou outros polímeros sintéticos com cadeias laterais de nucleotídeos. O polinucleotídeo pode ser de fita única ou fita dupla.

[00172] A sequência de polinucleotídeo pode ser clonada em qualquer vetor de expressão apropriado. Em um vetor de expressão, a sequência de polinucleotídeo codificando um construto é tipicamente ligada operacionalmente a uma sequência de controle que é capaz de prover a expressão da sequência de codificação para a célula hospedeira. Tais vetores de expressão podem ser usados para expressar um construto. As tecnologias de RNAs antisenso e interferência (RNAi) para nocaute da expressão de proteína são bem conhecidas na arte e os métodos padrão podem ser empregados para nocautear a expressão de uma molécula de interesse. Ambas as tecnologias de RNAs antisenso e interferência (RNAi) interferem com mRNA. Os oligonucleotídeos antisenso interferem com mRNA por ligação a (hibridização) uma seção do mRNA. RNAi envolve o uso de RNA fita dupla, tal como RNA interferência pequena (siRNA) ou RNA ‘grampo de cabelo’ pequeno (shRNA), que podem se ligar ao mRNA e inibir a expressão da

52 / 62 proteína.

[00173] Um oligonucleotídeo “especificamente hibridiza” para uma sequência alvo quando ele hibridiza com afinidade preferencial ou elevada para a sequência alvo, mas não hibridiza substancialmente, não hibridiza ou hibridiza com somente baixa afinidade para outras sequências. Condições que permitem a hibridização são bem conhecidas na arte (por exemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press; e Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing e Wiley-lnterscience, New York (1995)). As condições de hibridização podem ser condições estringentes, como descrito na arte.

[00174] Um anticorpo pode especificamente se ligar a qualquer molécula alvo (tipicamente uma proteína). A molécula alvo pode ser um componente de uma partícula de lipoproteína, tal como uma apolipoproteína. Um anticorpo “especificamente se liga” a uma proteína quando ele se liga com afinidade preferencial ou alta para a proteína, mas não se liga substancialmente, não se liga ou se liga apenas com baixa afinidade para outras proteínas. Por exemplo, um anticorpo “especificamente se liga” a uma molécula alvo quando ele se liga com afinidade preferencial ou alta ao alvo, mas não se liga substancialmente, não se liga ou se liga com somente baixa afinidade para outras proteínas humanas.

[00175] Um anticorpo se liga com afinidade preferencial ou alta se ele se liga com um Kd de 1 x 10-7 M ou menor, mais preferivelmente 5 x 10-8 M ou menos, mais preferivelmente 1 x 10-8 M ou menos ou mais preferivelmente 5 x 10-9 M ou menos. Um anticorpo se liga com baixa afinidade se ele se liga com um Kd de 1 x 10-6 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-5 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-4 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-3 M ou mais, ainda mais preferivelmente 1 x 10-2 M ou mais.

53 / 62

[00176] O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo enxertado com CDR ou um anticorpo humanizado. O anticorpo pode ser uma molécula de imunoglobulina intacta ou um fragmento da mesma, tal como um fragmento Fab, F(ab’)2 ou Fv.

[00177] As vias, dosagens e métodos de administração específicos dos agentes terapêuticos descritos aqui podem ser determinadas por rotina pelo médico atendente.

[00178] Os agentes para uso nos métodos de tratamento aqui descritos podem ser formulados em composições farmacêuticas. Estas composições podem compreender, além do(s) ingrediente(s) terapeuticamente ativo(s), um excipiente, carreador, diluente, tampão, estabilizador ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos dos versados na técnica. Esses materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir na eficácia do ingrediente ativo. O carreador ou diluente farmacêutico pode ser, por exemplo, uma solução isotônica.

[00179] A natureza precisa do carreador ou outro material pode depender da via de administração, por exemplo, vias oral, intravenosa, cutânea ou subcutânea, nasal, intramuscular e intraperitoneal. Exemplos de composições e métodos de administração adequados são providos em Esseku e Adeyeye (2011) e Van den Mooter G. (2006). Por exemplo, as formas orais sólidas podem conter, junto com a substância ativa, diluentes, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose, celulose, amido de milho ou amido de batata; lubrificantes, por exemplo, sílica, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio ou cálcio e/ou polietileno glicóis; agentes ligantes; por exemplo. amidos, goma arábica, gelatina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou polivinilpirrolidona; agentes desagregadores, por exemplo, amido, ácido algínico, alginatos ou amido glicolato de sódio; misturas efervescentes;

54 / 62 corantes; adoçantes; agentes umectantes, tais como lecitina, polissorbatos, laurilsulfatos; e, em geral, substâncias não tóxicas e farmacologicamente inativas usadas em formulações farmacêuticas. Tais preparações farmacêuticas podem ser fabricadas de modo conhecido, por exemplo, por meio de processos de mistura, granulação, formação de comprimidos, revestimento com açúcar ou revestimento com película.

[00180] As formulações orais incluem excipientes normalmente empregados como, por exemplo, tipos farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e similares. Estas composições assumem a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação sustentada ou pós e contêm 10% a 95% de ingrediente ativo, preferivelmente 25% a 70%. Quando a composição farmacêutica é liofilizada, o material liofilizado pode ser reconstituído antes da administração, por exemplo, uma suspensão. A reconstituição é preferivelmente efetuada em tampão.

[00181] Cápsulas, comprimidos e pílulas para administração oral para um indivíduo podem ser obtidos com um revestimento entérico compreendendo, por exemplo, Eudragit “S”, Eudragit “L”, acetato de celulose, ftalato acetato de celulose ou hidroxipropilmetil celulose.

[00182] As dispersões líquidas para administração oral podem ser xaropes, emulsões ou suspensões. Os xaropes podem conter, como carreadores, por exemplo, sacarose ou sacarose com glicerina e/ou manitol e/ou sorbitol.

[00183] As suspensões e emulsões podem conter como carreador, por exemplo, goma natural, ágar, alginato de sódio, pectina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou álcool polivinílico. As suspensões ou soluções para injeções intramusculares podem conter, junto com a substância ativa, um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água estéril, azeite, oleato de etilo, glicóis, por exemplo, propileno glicol e, se desejado, uma quantidade

55 / 62 apropriada de cloridrato de lidocaína.

[00184] Soluções para administração ou infusão intravenosa podem conter como carreador, por exemplo, água estéril ou, preferivelmente, podem estar na forma de soluções salinas isotônicas, aquosas e estéreis.

[00185] Para supositórios, ligantes e carreadores tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos; esses supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, preferencialmente 1% a 2%.

[00186] A dose pode ser determinada de acordo com diversos parâmetros, especialmente de acordo com a substância usada; a idade, peso e condição do indivíduo a ser tratada; a via de administração; e o regime requerido. Um médico será capaz de determinar a via requerida de administração e dosagem para qualquer indivíduo particular. Uma dose diária típica é a partir de cerca de 0,1 a 50 mg por kg de peso corporal dependente das condições mencionadas acima. A dose pode ser dada como uma dose única ou pode ser dada como múltiplas doses, por exemplo dada em intervalos regulares, por exemplo 2, 3 ou 4 doses administradas por hora.

[00187] Exemplos das técnicas e protocolos mencionados acima podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 20ª ed. 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.

[00188] A substância ou composição usada nos métodos e usos médicos acima pode ser administrada sozinha ou em combinação com outras substâncias, composições ou tratamentos terapêuticos, por exemplo como terapia adicional. As outras composições ou tratamentos terapêuticos podem ser administrados ou simultaneamente ou sequencialmente com a substância ou composição ou tratamento da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1 – Detecção de partículas de lipoproteína purificadas por iSCAT

56 / 62 Materiais/Métodos Preparação do substrato e medição

[00189] As lamelas de vidro de boro silicato (no. 1,5, 24 x 50 mm, VWR) foram limpas por lavagem sequencial com água MilliQ, seguida por etanol e novamente água MilliQ. Eles foram então secadas sob uma corrente de nitrogênio seco. As juntas de silicone CultureWell (Grace Bio-Labs) foram cortadas e colocadas na lamela recém-limpa, fornecendo quatro câmaras de amostra independentes de 30 a 50 µl no mesmo substrato.

[00190] Amostras de HDL e LDL purificadas foram obtidas da Lee Biosystems (LDL cat # 360-10; HDL cat # 361-10), conforme descrito, por exemplo, em: : https://www.leebio.com/product/984/low-density-lipoprotein- ldl-human-serum-360-10. HDL e LDL foram separados por ultracentrifugação. As amostras foram diluídas 500.000 e 50.000 vezes, respectivamente.

[00191] A aquisição e análise dos dados foram realizadas pelo iSCAT, com a ligação não específica das lipoproteínas ao substrato de vidro sendo gerada em imagem e registrada. A configuração experimental foi idêntica à descrita na Figura 4 por Cole et al. supra. As imagens foram adquiridas ao longo de 30 segundos (a 100 quadros/s) e consistiam em 512x512 pixels com um tamanho de pixel de 23,4 nm. As imagens foram armazenadas em pixels 3x3 antes de salvar, resultando em um tamanho final de pixel de 70,2 nm.

[00192] Pilhas de imagem ratiométricas foram geradas a partir do filme bruto, como descrito em Cole et al. As partículas pousando na superfície do vidro foram identificadas nas imagens ratiométricas por uma rotina automatizada de detecção de pontos com base no ajuste gaussiano 2D da função de espalhamento de pontos.

[00193] Os resultados são mostrados na Figura 4, fornecendo imagens de HDL e LDL detectadas por iSCAT e histogramas correspondentes obtidos de uma série completa de imagens.

57 / 62 Exemplo 2 – Detecção de partículas de lipoproteína purificadas a partir de sangue e soro por iSCAT

[00194] Um método iSCAT como descrito em Exemplo 1 foi realizado em amostras de soro e sangue a partir de um indivíduo humano. Para obter sangue soro, sangue foi deixado coagular em uma posição ereta pelo menos 30 minutos, antes da centrifugação (30 minutos, 1500 x g). Soro foi transferido para um frasquinho de plástico com tampa de rosca. As amostras de sangue e soro foram preparadas como a seguir: 1 µl de amostra de sangue ou soro de picada no dedo foi diluída 2 000 vezes em tampão HEPES/KCl contendo 5 mM EDTA (para evitar coagulação) (ver abaixo). 10 µl da amostra diluída foram adicionados em 40 µl de tampão 25 mM HEPES pH

7.4, contendo 100 mM KCl, resultando em uma diluição final de 10 000 vezes de sangue.

[00195] Figura 5 mostra detecção de HDL e LDL em uma amostra de plasma. Geração de imagem da amostra de plasma descreveu ambos os sinais correspondendo a HDL e LDL simultaneamente. Como esperado, partículas HDL foram mais frequentes do que LDL (ver histograma abaixo).

[00196] Figuras 6A e 6B mostram detecção de HDL e LDL em sangue total, com resultados similares a Figura 5. Os requerentes também usaram tanto a “amostra em jejum” como a amostra coletada após uma refeição. A diferença entre condições em jejum / não em jejum pode ser notada no sinal maior de regime iSCAT (insertos), que corresponde a lipoproteínas maiores, tal como VLDL. Como esperado, estas apareceram após uma refeição. Como discutido previamente, a exigência da fração VLDL é a razão principal porque os pacientes devem jejuar antes de um teste padrão de colesterol. VLDLs contém colesterol, mas principalmente triglicerídeos (TG), e se os níveis de TG são tão elevados, o método padrão Friedewald) não pode ser usado. Assim, detecção de lipoproteínas (incluindo HDL, LDL e VLDL) é possível de acordo com a invenção sem qualquer exigência para jejum no indivíduo

58 / 62 fornecendo a amostra. Exemplo 3 – Calibração para calcular concentrações de HDL e LDL

[00197] Para permitir o cálculo da massa/concentração de HDL e LDL nas amostras de sangue de Exemplo 2, os requerentes estabeleceram uma curva de calibração onde proteínas de massa/concentração conhecidas foram medidas dando uma relação linear entre peso molecular e contraste de iSCAT.

[00198] Para a calibração de concentração, os requerentes usaram nanodiscos de MSP1D1 DMPC lipídeos de concentração conhecida. Os nanodiscos são sistemas de membranas de modelo sintético compostos de uma bi-camada de lipídeos de fosfolipídeos com a borda hidrofóbica triada por duas proteínas anfipáticas. Estas proteínas são chamadas proteínas de andaime de membrana (MSP) e se alinham em formação de corrente dupla. A amostra de nanodiscos foi diluída diminuindo para a faixa de nM e adicionada ao tampão. A ligação não específica dos nanodiscos ao vidro foi registrada usando iSCAT, com resultados mostrados na Figura 7. A frequência de ligação cai à medida que o número de partículas em soluções diminui, assim como o número de sítios acessíveis para ligação (como mostrada à esquerda na Figura: número de eventos de ligação como função de tempo para 4 diferentes concentrações). Os requerentes adaptaram o decaimento exponencial e conhecendo quando a amostra foi adicionada (t=0) extrapolaram a taxa de ligação inicial.

[00199] As taxas de ligação iniciais foram então traçadas em gráfico como função de concentração (Figura à direita). O declive do ajuste linear é o fator de conversão, que pode ser usado para determinar a concentração absoluta de uma amostra usando a seguinte relação: [concentração de amostra] = [taxa inicial medida] / [fator de conversão] x [diluição da amostra]

[00200] Usando essa curva de calibração, concentração de partículas de

59 / 62 lipoproteína HDL e LDL foi calculada a partir de amostras de sangue total em experimentos preliminares e verificada como se correlacionando com os valores esperados. Exemplo 4 - Medição da concentração para solução de actina

[00201] As etapas genéricas realizadas em cálculo da concentração para esse Exemplo:

[00202] 1. Adicionar a amostra ao suporte de amostra, que é uma câmara de superfície-para-volume elevada

[00203] 2. Iniciar o registro dos eventos de ligação individuais para um retardo de tempo fixo e bem controlado após a amostra ser aplicada como indicado na Figura 7.

[00204] 3. Computar a frequência de ligação como uma função de tempo após adição da amostra

[00205] 4. Ajustar o decaimento observado em frequência de ligação como uma função de tempo para uma função de decaimento exponencial única

[00206] 5. Extrair o intercepto de tempo zero para determinar a frequência de ligação quando da adição da amostra.

[00207] 6. Repetir o procedimento como uma função de concentração de amostra

[00208] 7. Ajustar a frequência de ligação inicial observada versus concentração de amostra para obter uma correlação linear.

[00209] Uma vez a correlação estabelecida, para qualquer dada amostra, a concentração pode ser estimada por repetição das etapas 1-5 e estabelecimento da frequência de ligação inicial, que pode ser convertida em uma concentração de amostra a partir da relação na etapa 7.

[00210] O declive do ajuste linear é o fator de conversão, que pode ser usado para determinar concentração absoluta de uma amostra usando a

60 / 62 seguinte relação: [concentração da amostra] = [taxa inicial medida] / [fator de conversão] x [diluição da amostra] Protocolo para método de diluição em gotas em actina:

[00211] – Preparar as lamelas revestidas com (3-aminopropil) trietoxissilano (APTES) como descrito em algum ponto (estas lamelas são específicas para actina, outas proteínas devem usar vidro limpo, simples e não tratado) – cortar furos 2x2 de junções de PDMS de 3 mm de diâmetro (Grace Bio-Labs GBL103250, disponíveis através de Sigma Aldrich) com um bisturi limpo – enxaguar as junções com água milliQ (MQ), isopropanol, água MQ, isopropanol, água MQ e secar com sopro com uma corrente de nitrogênio – fixar as junções no centro de uma lamela revestida com APTES (contato do PDMS com a superfície de vidro é suficiente para manter a fixação) - no microscópio, adicionar uma gota de 37 ul de tampão F- actina a uma das junções na lamela de APTES e ajustar a posição de foco na superfície de vidro nesta junção cheia com tampão – diluír uma solução de estoque de 11,4 uM de proteína actina (42 kDa que polimeriza em filamentos) a 333,33 nM em tampão G-actina - misturar 90 ul da carga de actina 333,33 nM com 10 ul de um concentrado 10x de tampão F-actina (destinado a iniciar a polimerização, específico para experimento com actina)  300 nM concentração de actina final - após 15 min de polimerização, retirar uma alíquota de 3 ul a partir da solução de actina 300 nM com uma pipeta, empurrar e criar uma gotícula pequena na ponta da pipeta, então fundir a gota de actina com a gota

61 / 62 do tampão na junção – iniciar o registro das moléculas pousando imediatamente após perturbações terem passado por 1 min.

[00212] Este método funciona bem para sistemas onde o equilíbrio de oligomerização muda lentamente em comparação com o tempo que leva para diluir a amostra e gravar o vídeo. Tampões Tampão G-actina 2 mM Tris(hidroximetil)aminometano (base Tris) 0,2 mM CaCl2 0,2 mM Adenosina trifosfato (ATP) 2 mM Ditiotreitol (DTT) Ajustado a pH 8,0 com HCl Tampão F-actina 10 mM ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico (HEPES) 100 mM KCl 2 mM MgCl2 1 mM Ácido -bis(β-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetraacético de etileno glicol (EGTA) Ajustado a pH 7,5 com KOH

[00213] Resultados são mostrados na Figuras 8A e 8B. 8A mostram um quadro de imagens exemplificativos de vídeo de ‘pouso’ de 300 nM actina em guarnição com método de diluição descrito acima, registrado em uma frequência de quadro de imagens de 1 kHz, frequência de quadro de imagens eficaz: 25 Hz. Para comparação, quadro de imagens exemplificativos de vídeo de ‘pouso’ de 300 nM actina em câmera de fluxo sob condições similares, registrado em uma frequência de quadro de imagens de 1kHz, frequência de quadro de imagens eficaz: 25 Hz, é mostrado como 8B.

62 / 62

[00214] O experimento foi repetido 4 vezes e o histograma resultante de massa acumulada é mostrado como Figura 9.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para medir a concentração de uma partícula em solução, caracterizado pelo fato de que compreende pôr a solução em contato com uma superfície e detectar a ligação de a dita partícula a uma superfície usando espalhamento de luz.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita superfície é passivada, ativada, revestida, tratada ou derivatizada.

3.Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a ligação de detecção da partícula à superfície é repetida após um ou mais intervalos de tempo.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as medições repetida permitem o cálculo da taxa inicial de ligação da partícula à superfície.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a taxa de ligação inicial da partícula é comparada à taxa de ligação inicial para uma concentração da partícula conhecida.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as medições permitem o cálculo da taxa de ligação constante da partícula, e opcionalmente esta é comparada à taxa de ligação constante para uma concentração conhecida da partícula.

7. Método para medir a concentração de partícula de uma solução de acordo com a reivindicação 1, o dito método caracterizado pelo fato de que compreende: i) pôr a solução em contato com uma superfície; ii) detectar a ligação de partícula à superfície como visualizada por espalhamento de luz; iii) repetir a etapa de detecção e calcular as mudanças em taxa de ligação e/ou taxa de ligação inicial ao longo do tempo da partícula na superfície; iv) prover uma curva de calibração de taxa de ligação inicial contra concentração com base em dados a partir das soluções de concentração conhecida de partícula; v) usar a curva de calibração na etapa (iv) para converter a taxa de ligação inicial registrada para a amostra na etapa (iii) para a concentração da partícula em solução.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a concentração é concentração absoluta.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita partícula também entra em contato com com uma solução de medição.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dita solução entra em contato com a dita superfície na presença de um calibrante e a ligação de o dito calibrante para a dita superfície é detectada usando espalhamento de luz.

11. Método para detectar partículas de lipoproteína em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende detectar as a as ditas partículas por espalhamento de luz, opcionalmente microscopia de espalhamento interferométrico.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a dita detecção compreende determinar o tamanho e/ou número das a as ditas partículas.

13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que compreende detectar o tamanho e/ou número de mais do que um tipo diferente de partícula de lipoproteína na dita amostra, e opcionalmente detectar a razão de tipos diferentes de partícula de lipoproteína na dita amostra.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende detectar partículas de lipoproteína de alta densidade (HDL) e/ou partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL).

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende determinar a razão de partículas HDL para LDL na dita amostra.

16. Método para diagnosticar uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, ou para determinar o risco de um indivíduo desenvolver a dita doença ou condição, caracterizado pelo fato de que compreende detectar o tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em uma amostra do o dito indivíduo por espalhamento de luz, opcionalmente por microscopia de espalhamento interferométrico.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende detectar o tamanho e/ou número de mais do que um tipo diferente de partícula de lipoproteína, ou a razão de tipos diferentes de partícula de lipoproteína, na dita amostra.

18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que compreende detectar partículas de lipoproteína (HDL) de alta densidade e/ou partículas de lipoproteína (LDL) de baixa densidade, opcionalmente compreendendo determinar a razão de partículas HDL para LDL na dita amostra.

19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que um número diminuído de partículas HDL quando comparado com uma amostra de controle ou amostra de referência/nível, é indicativo de que o indivíduo tem a dita doença ou condição, ou tem um risco aumentado de desenvolver a dita doença ou condição.

20. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que um número aumentado e/ou um tamanho diminuído de partículas LDL, quando comparado com uma amostra de controle ou amostra de referência/nível, é indicativo de que o indivíduo tem a dita doença ou condição, ou tem um risco aumentado de desenvolver a dita doença ou condição.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que a dita doença é doença cardiovascular.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a dita solução ou amostra é uma amostra biológica, opcionalmente obtida a partir de um indivíduo humano.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a dita amostra biológica é sangue, plasma ou soro, opcionalmente obtida a partir de um indivíduo humano.

24. Método para selecionar um indivíduo a quem uma substância ou composição deve ser administrada, ou a quem um regime deve ser prescrito, caracterizado pelo fato de que a dita substância ou composição ou regime é apropriada para tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína, em que compreende detectar o tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em uma amostra do o dito indivíduo por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 15, e selecionar o dito paciente para a dita administração ou o dito regime se o tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína detectadas for indicativo da presença da a dita doença ou condição, ou de um risco da mesma.

25. Método para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de que compreende diagnosticar ou determinar risco de a dita doença ou condição em o dito indivíduo ou selecionar o dito indivíduo por um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 23, e administrar uma substância ou composição ao indivíduo, ou realizar um regime no mesmo, que é eficaz para tratar ou prevenir a dita doença ou condição no indivíduo.

26. Substância ou composição, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, em que o dito indivíduo é diagnosticado ou determinado em risco ou selecionado por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 23.

27. Uso de uma substância ou composição, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento de prevenção de uma doença ou condição associada ao tamanho e/ou número de partículas de lipoproteína em um indivíduo, em que o dito indivíduo é diagnosticado ou determinado em risco ou selecionado por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 23.