KR20200095535A - 광 산란을 사용하여 용액 중의 지단백질의 농도를 결정하는 방법 - Google Patents
광 산란을 사용하여 용액 중의 지단백질의 농도를 결정하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 용액 중의 입자의 농도를 측정하기 위한, 단일 입자 광 산란, 바람직하게는 간섭계 산란 현미경 (또한, 본 명세서에서 iSCAT로 지칭됨)의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 샘플에서 지단백질 입자를 검출하기 위한 광 산란의 사용 및 이와 관련된 진단 방법 및 치료 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 용액 중의 입자의 농도를 측정하기 위한 단일 입자 광 산란, 바람직하게는 간섭 산란 현미경 (또한, 본 명세서에서는 iSCAT 라고도 함)의 사용에 관한 것이다. 입자는 단순한 용액에 있거나, 생물학적 시료 또는 환경 시료와 같은 복잡한 용액에 있을 수 있다. 본 발명은 용액 중의 입자의 절대 농도를 결정하는데 사용될 수 있으며, 이는 용액 중의 상이한 입자 사이의 화학양론적 관계를 연구하는 수단을 제공한다. 본 발명자들이 이미 입증한 바와 같이, iSCAT은 단일 분자만큼 작은 입자의 견고하고 정확한 검출, 질량 정량화, 영상화 및 특성화를 위한 수단을 제공하므로, 농도의 측정을 위해서도 이와 같은 기술을 사용할 수 있는 점이 아주 유용하다.
또한, 본 발명의 샘플에서 지단백질 입자를 검출하기 위한 광 산란, 바람직하게는 간섭 산란 현미경(또한, 본 명세서에서는 iSCAT라고도 함)의 사용, 및 관련된 진단 및 치료 방법에 관한 것이다. 용액 중의 다양한 지단백질의 농도를 측정하는 본 방법의 능력이 특히 중요하다.
iSCAT은 고유한 시공간 해상도로 단일 입자 추적 및 단일 분자 수준까지 무표지 감도에 대해 강력한 접근방식으로 실현되어 왔다.
간섭계 산란 현미경은 표지를 첨가할 필요 없이 용액에서 다양한 질량의 입자의 상대적 분포에 대한 정보를 제공한다. 절대적 또는 상대적 농도의 입자를 추가하는 것은 분석 중인 샘플, 특히 용액이 생물학적 시료 또는 환경 시료일 때 이에 대한 유용한 추가 정보를 제공한다.
본 출원인의 초기 작업 이전에, 사용자 맞춤 현미경, 새로운 카메라, 및 복잡한 샘플 조명에 대한 요구로 인해 iSCAT의 광범위한 사용이 제한되어 왔고, iSCAT의 단일 분자 수준의 소형 대상물에 대한 강력하고 정확한 검출, 특성화 및 이미지화에 대한 역량이 제한되었다. 그러나, 단일 물체를 관찰하기 위한 강력한 수단으로 발전시키기 위한, 장비에 대한 개선이 이루어졌다. 예시적인 iSCAT장비의 설계는 in Cole 외 ACS Photonics, 2017, 4 (2), pp 211-216 and Arroyo 외. Nat Protocols 2016, 617-633에 참조로 포함되어 개시된다. 나아가, 기기에 대한 세부적 사항은 본 출원인의 WO2018/011591 이전 출원에서 제공된다.
iSCAT은 정제된 단일 단백질 검출에 관하여는 이전에 개시되었으나, (Cole 외 ACS Photonics, 2017, 4(2), pp 211-216), 복잡한 용액에서 입자의 검출은 실현 가능하지 않은 것으로 생각되어 지단백질의 검출 및 정량화에는 탐색된바 없었다.
심혈관 질환에 대한 진단 분석은 지단백질(지단백질 입자라고도 함)의 검출을 포함할 수 있다. 지단백질 검출을 위한 다양한 방법은 Circulation. 2009 May 5; 119(17): 2396-2404; Curr Opin Lipidol. 2017 Jun;28(3):261-266. 에서 검토되었다. 이 방법들은 시간이 많이 걸리고, 비용이 많이 소요되고, 지단백질에 대한 불완전한 정보를 제공하고, 및 /또는 임상 설정에 적용이 제한되는 단점이 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 단일 입자 광 산란, 바람직하게는 단일 입자 간섭계 산란 현미경을 사용하여 용액에서 입자의 농도를 결정할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 예상하지 못하게 단일 입자 광 산란 (예를 들어 iSCAT을 사용하여)에 의하여, 다른 구성 요소로부터 나오는 배경 신호에도 불구하고, 다른 구성요소에서 해당 입자를 정제하지 않고서도 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액 또는 혈장)로부터 직접적으로 입자의 농도를 결정하는 것이 가능함을 설명하였다. 이는 특히 예를 들어, 생물학적 샘플에 포함된 지단백질에 유용한 기술임이 입증되었다.
본 발명은 용액 중의 입자의 농도 측정방법으로서, 용액을 표면과 접촉시키는 단계; 및 광 산란을 이용하여 표면에 대한 상기 입자의 결합을 검출하는 단계;를 포함하는 방법을 제공한다.
입자 결합을 검출하기 위한 광 산란 방법은 바람직하게는 iSCAT이다. 상기 방법은 바람직하게는 적합한 현미경을 이용하여 수행될 수 있다. 농도는 바람직하게는 절대 농도일 수 있다. 상기 표면에의 입자의 결합은 단일 입자 광 산란을 이용하여 검출되고 가시화 될 수 있다.
본 발명 상기 용액을 측정 용액 및 표면과 접촉시키는 단계; 및 광 산란을 이용한 상기 표면에 대한 입자의 결합을 검출하는 단계;를 포함하는 용액 중의 입자의 농도를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 특징은 용액이 농축되는 것으로 생각되는 상황에 특히 유용하다. 표면에 대한 입자의 결합을 검출하기 전에 입자를 포함한 용액의 부피는 샘플 홀더의 측정 용액의 부피에 포함될 수 있다. 이 측면의 장점은 측정된 농도가 원래의, 더 농축된 용액 중의 입자 상태를 나타내도록 한다는 것이다.
본 발명은 캘리 브란트(calibrant)의 존재 하에 용액을 표면과 접촉시키는 단계; 광 산란을 사용하여 표면에 대한 결합을 검출하는 단계;를 포함하는 용액 중의 입자의 농도 결정방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 표면에 대한 결합 속도를 검출함으로써, 용액 중의 입자의 농도 측정을 가능하게 한다.
또한, 본 발명은 시간에 따른, 광 산란에 의해 검출되는 표면에 대한 입자의 결합 속도의 변화 또는 붕괴를 분석함으로써, 용액 중의 입자의 절대 농 측정을 가능하게 한다.
용액의 절대 농도는 샘플과 표면 간의 입자의 결합 이벤트를 측정함으로써 결정될 수 있고, 공지된 농도의 입자 샘플에서 관찰된 것들에 대해 보정될 수 있다. 표면은 샘플 홀더의 일부 일 수 있다. 표면 대 부피 비율이 높은 샘플 홀더에서, 표면에 대한 입자의 결합은 용액 중에 남아있는 입자 수 및 결합을 위해 접근 가능한 부위의 수에 따라 시간이 지남에 따라 감소한다. 일련의 농도에 대한 초기 결합 속도는 결합 데이터로부터 외삽할 수 있고 표준 곡선을 생성하는데 사용되어 샘플에서 측정된 초기 결합 속도를 용액 중의 입자의 각각의 절대 농도로 변환할 수 있다.
표면에 대한 결합은 광 산란, 바람직하게는 iSCAT를 사용하여 검출되거나 가시화 될 수 있다.
대안적으로, 용액 중의 농도는 부동태화 또는 활성화 표면을 사용하여 결정될 수 있으며, 따라서 표면과 입자 간의 결합 활성을 제어함으로써 결합 속도가 제어될 수 있다. 이 설정에서, 표면 활성화 또는 부동태화는 결합 친화도를 증가시켜서 측정 범위를 더 낮은 농도를, 또는 결합 친화도를 낮추어 더 높은 농도에서 측정할 수 있다.
표면은 바람직하게는 상기 용액에 대한 샘플 홀더의 일부를 형성한다. 상기 샘플 홀더는 광 산란 현미경의 요소일 수 있다. 샘플 홀더는 표면적이 큰 챔버일 수 있다.
농도를 계산하기 위해, 확산 속도에 대한 교정을 포함해야 할 수 있다. 확산 속도는 질량 및 형상과 같은 알려진 특성에 의해 쉽게 계산될 수 있다.
따라서, 본 발명은 용액 중의 입자의 농도를 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
i) 용액을 표면과 접촉시키는 단계;
ii) 광 산란에 의해 가시화된 표면에 결합하는 입자를 검출하는 단계;
iii) 검출 단계를 반복하고 표면에 대한 입자의 시간에 따른 결합 속도 및 초기 결합 속도의 변화를 계산하는 단계;
iv) 공지된 입자 농도를 갖는 용액으로부터의 데이터에 기초하여 농도에 대한 초기 결합 속도의 교정 곡선을 제공하는 단계; 및
v) 단계 (iv)의 교정 곡선을 이용하여 단계 (iii)에서의 샘플에 대해 기록된 초기 결합 속도를 용액 중 입자의 농도로 변환하는 단계;
바람직하게는, 농도는 절대 농도이다.
어떤 변형에서, 용액은 예를 들어 측정 용액 또는 캘리 브란트와 표면에 접촉하기 전 또는 동시에 전처리 될 수 있다.
용액 중의 입자는 측정 용액 및 표면과 접촉될 수 있다.
이 측면의 장점은 측정된 농도가 원래의, 더 농축된 용액에서 입자의 상태를 나타내도록 하는 점이다.
측정 용액은 완충 용액일 수 있다. 일반적으로, 측정 용액의 부피는 희석 효과의 계산을 가능하게 하도록, 알려져 있다.
농도 측정을 위한 용액을 준비하기 위해 다양한 기술이 필요할 수 있다. 예를 들어, 용액의 부피는 바람직하게는, 알려진 형상의 샘플 홀더에 배치될 수 있다. 이는 측정 용액의 도입 (또는 측정 용액으로의 입자 용액의 도입)을 가능하게 하고, 희석 거동을 사용하여, 검출된 표면에의 입자의 결합 속도를 입자의 농도로 변환될 수 있도록 한다.
표면에 대한 입자의 결합의 검출은 측정 용액의 도입 후 하나 이상의 상이한 시간 간격으로 수행될 수 있다. 상이한 시간 간격으로 측정 용액을 도입한 후 검출 단계가 반복되면, 해리와 같은 희석 효과의 교정이 가능할 것이다. 첨가 (및 희석) 후 측정이 상이한 시점에서 수행되면, 예를 들어, 더 낮은 농도에서 입자가 해리되거나 군집하는 경우, 종 분포의 변화가 가시화 될 수 있다. 따라서, 이 접근은 입자를 더욱 상세하게 볼 수 있게 하고, 농도 측정의 검증을 가능하게 한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 입자 또는 측정 용액 중 하나 또는 둘 다의 부피가 변할 수 있고, 및 /또는 샘플 홀더의 형상이 변할 수 있다. 둘 다 희석 효과를 교정할 수 있다. 검출 단계가 하나 이상의 상이한 용액 부피 및/ 또는 하나 이상의 상이한 형상의 샘플 홀더에서 반복 수행된다면, 이는 해리와 같은 희석 효과를 교정할 수도 있다.
따라서, 본 발명은 용액 중의 입자의 농도를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
i) 형상을 갖는 샘플 홀더 내 측정 용액의 표면 및 부피와 용액을 접촉시키는 단계;
ii) 광 산란에 의해 가시화된 표면에 대한 입자의 결합을 검출하는 단계;
iii) 검출 단계를 반복하고 표면에 대한 입자의 시간에 따른 결합 속도 및 초기 결합 속도 변화를 계산하는 단계;
iv) 공지된 농도의 용액으로부터 데이터에 기초하여 농도에 대한 초기 결합 속도의 교정 곡선을 제공하는 단계;
v) 단계 (iv)에서의 교정 곡선을 사용하여 단계(iii) 에서 샘플에 대해 기록된 초기 결합 속도를 용액 중의 입자의 절대 농도로 변환하는 단계;
상기 방법은 결정된 농도를 확인하기 위하여 상이한 부피의 측정 용액을 이용하거나 또는 하나 이상의 상이한 형상의 샘플 홀더를 사용하여 단계 (i) 내지 (ii)를 반복하는 단계를 더 포함할 수 있다.
대안적으로, 용액 중의 입자는 캘리 브란트의 존재 하에 표면과 접촉될 수 있다.
용액에서 캘리 브란트는 미리 정해진 농도 및 질량을 갖는다. 일단 입자 용액에 도입되면, 캘리 브란트 및 입자의 상기 표면에의 결합 속도의 검출은 개별적으로 그러나 동시에 일어난다. 표면에의 입자 및 캘리 브란트의 결합 측정은 반복 수행될 수 있고, 이는 캘리 브란트의 초기 결합 속도 및 입자의 초기 결합 속도를 결정하게 한다. 공지된 농도의 캘리 브란트의 초기 결합 속도는 입자의 초기 결합 속도를 입자의 농도로 변환할 수 있도록 한다.
일 구체예에서, 캘리 브란트는 표면에 결합하는 특성과 관련하여 입자와 유사한 것으로 선택된다. 예를 들어, 유사한 표면 특성 (예를 들어, 전하, 소수성, 친수성)을 갖는 캘리 브란트를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 선택을 통해, 다양한 종류의 입자에 대해 정확한 측정이 가능해진다. 효과적으로, 캘리 브란트 및 입자는 표면에 대한 동일한 친화력을 가져야 하므로, 공지된 농도의 캘리 브란트의 결합 속도를 결정하면 상기 입자의 결합속도를 농도로 변환할 수 있게 한다.
따라서, 본 발명은 용액 중의 입자의 농도를 측정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
i) 캘리 브란트의 존재 하에 용액을 표면과 접촉시키는 단계;
ii) 광 산란에 의해 가시화된 표면에 대해 결합하는 입자를 검출하는 단계;
iii) 광 산란에 의해 가시화된 표면에 대해 결합하는 캘리브란트를 동시에 검출하는 단계;
iv) 검출단계 (ii) 내지 (iii) 를 반복하고 표면에 대한 입자 및 캘리브란트의 시간에 따른 결합 속도 및 초기 결합 속도의 변화를 계산하는 단계;
v) 단계 (iv)에서 입자의 초기 결합 속도를 용액 중의 입자의 농도로 변환하기 위해서 캘리 브란트의 단계 (iv)에서 계산된 초기 결합 속도를 사용하는 단계;
캘리 브란트는 공지된 농도이고, 특히 표면에 대한 결합의 측면에서 입자와 유사한 특성을 갖는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명자들은 광 산란, 특히 간섭계 산란 현미경을 사용하여, 다양한 비-단백질 성분을 포함하는 다른 생체 분자들의 이종 혼합물을 나타내는 지단백질 입자를 검출할 수 있음을 확인하였다. 단일 지단백질 입자는 선택적으로 가시화될 수 있다. 이를 통해, 지단백질 입자들(및 다른 종류의 지단백질 입자들)의 개수 및 크기를 샘플에서 직접 결정할 수 있다. 샘플에서 상이한 지단백질 입자의 상대적인 비율 또한 단일 측정으로 결정될 수 있다. 본 발명의 검출 방법은 빠르고 간단한 지단백질 검출 방법을 제공하고 샘플에서 지단백질 입자의 성질 및 분포에 대한 광범위한 정보를 제공한다. 수행되는 상기 광학적 검출은 또한 비교적 저렴하고 임상 설정에 적합하며, 지단백질 검출을 위한 기존의 방법과 관련된 복잡한 처리 프로토콜을 피할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 다른 요소들로부터 형성되는 배경 신호에도 불구하고, 다른 구성 요소로부터 입자를 정제하지 않고 생물학적 샘플(예를 들어 혈액 또는 혈장)에서 직접적으로 광산란(예를 들어 iSCAT)을 사용하여 지단백질을 검출할 수 있음을 예상치 못하게 설명하였다.
본 발명의 검출 방법은 지단백질 입자의 크기 및 / 또는 개수와 관련된 질병 및 상태의 진단 및 치료를 돕기 위해, 환자 샘플로부터 지단백질 검출의 임상 설정에 유리하게 사용된다.
따라서, 본 발명은 광 산란에 의해, 바람직하게는 간섭계 산란 현미경에 의한 입자의 검출을 포함하는, 샘플에서 지단백질 입자를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 개체에서 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 진단하거나, 또는 상기 개체로부터 얻은 샘플에서 간섭계 산란 현미경에 의해 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수를 검출하는 단계를 포함하여, 개체가 상기 질병 또는 상태를 가질 위험을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 물질 또는 조성물이 투여되거나 요법이 처방 될 개체를 선택하는 방법으로서, 상기 물질 또는 조성물 또는 요법은 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하는데 적합하고, 본 발명의 검출 방법에 의해 상기 개체로부터 얻은 샘플의 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수를 검출하는 단계; 및 검출된 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수가 상기 질병 또는 상태, 또는 그로 인한 위험을 나타내는 경우, 상기 투여 또는 상기 요법을 위한 개체를 선택하는 단계;를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 개체에서 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법으로, 본 발명의 방법에 의해 상기 개체에서 상기 질병 또는 상태의 위험을 진단 또는 결정하는 단계, 또는 상기 개체를 선택하는 단계, 및 개체에 물질 또는 조성물을 투여하는 단계, 또는 개체에서 상기 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하기에 효과적인 요법을 수행하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 개체에서 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 물질 또는 조성물로서, 본 발명의 방법에 의하여 선택되거나, 진단되거나, 위험에 따라 결정되는 것을 특징으로 하는 물질 또는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 개체에서 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수와 관련된 질병 또는 상태의 예방을 위한 의약 제조에 있어서 물질 또는 조성물의 용도로, 상기 개체는 본 발명의 방법에 의하여 선택되거나, 진단되거나 또는 위험에 따라 결정되는 것을 특징으로 하는 용도를 제공한다.
도 1은 인간 혈액에 존재하는 상이한 유형의 지단백질 입자 및 이들 각각의 직경 (nm) 및 밀도 (g / ml)를 나타내는 그래프를 제공한다. 표는 또한 각 유형의 입자에서 단백질(proteins), 콜레스테롤(cholesterol), 인지질(phospholipids) 및 트리글리세리드 (triglycerides)의 상대적 비율에 대한 정보를 제공한다.
도 2는 혈액 샘플에서 iSCAT에 의한 지단백질 검출을 위한 예시적 체계를 나타낸 것이다.
도 3은 공간 필터를 장착한 iSCAT 현미경의 개략도이다.
도 4는 정제된 지단백질 샘플로부터의 HDL 및 LDL 지단백질 입자의 캡쳐된 이미지이고, 스케일 바는 iSCAT 신호를 나타내고, iSCAT 신호는 (I s -I p )/I s 로 정의되며, 여기서 I s 는 입자가 존재하지 않을 때 유리 표면으로부터의 반사 강도이고, I p 는 입자가 존재할 때의 동일한 측정 값이다. HDL 및 LDL 지단백질 입자의 이미지는 모든 HDL 및 LDL 이미지로부터 획득된 단일 막대그래프(histogram)와 함께 나타나며, 검출된 입자의 개수에 대한 iSCAT 신호를 플롯팅한다.
도 5는 혈청 샘플로부터 iSCAT에 의해 검출된 HDL 및 LDL 지단백질에 대해서, 도 4에 나타난 것에 상응하는 이미지 및 단일 입자 막대그래프를 제공한다.
도 6은 전체 혈액 샘플로부터 iSCAT에 의해 검출된 HDL, LDL 및 VLDL에 대한 단일 입자 막대그래프를 제공한다. 도 6a 및 도 6b는 각각 비 공복 샘플 및 공복 샘플의 막대그래프를 제공한다.
도 7은 공지된 질량/ 농도의 지단백질을 사용한 iSCAT 측정의 교정을 나타낸 그래프이다. 왼쪽 그래프는 배양 시간(초)에 대한 결합 이벤트를 표시한다. 오른쪽 그래프는 측정된 초기 결합 속도를 샘플에서의 입자의 농도로 변환하도록 하는 교정 곡선을 제공하기 위하여, 농도에 대한 결합 데이터로부터 결정되는 초기 결합 속도를 표시한다.
도 8a는 실시예 4에서 기술된 희석 방법에서, 개스켓(gasket)에 300 Nm 액틴(actin)의 랜딩 영상의 예시적인 프레임으로, 1 kHz의 프레임 속도, 유효 프레임 속도 : 25Hz로 기록한 것을 도시한다.
도 8b는 도 8a와 비교하기 위해, 도 8b는 유사한 조건 하에서 유동 챔버에서 300 nM 액틴의 랜딩 영상의 예시적인 프레임으로, 1 kHz의 프레임 속도, 유효 프레임 속도 : 25 Hz로 기록한 것을 도시한다.
도 9는 실시예 4에 기재된 실험을 4회 반복하여 축적된 질량 막대그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 혈액 샘플에서 iSCAT에 의한 지단백질 검출을 위한 예시적 체계를 나타낸 것이다.
도 3은 공간 필터를 장착한 iSCAT 현미경의 개략도이다.
도 4는 정제된 지단백질 샘플로부터의 HDL 및 LDL 지단백질 입자의 캡쳐된 이미지이고, 스케일 바는 iSCAT 신호를 나타내고, iSCAT 신호는 (I s -I p )/I s 로 정의되며, 여기서 I s 는 입자가 존재하지 않을 때 유리 표면으로부터의 반사 강도이고, I p 는 입자가 존재할 때의 동일한 측정 값이다. HDL 및 LDL 지단백질 입자의 이미지는 모든 HDL 및 LDL 이미지로부터 획득된 단일 막대그래프(histogram)와 함께 나타나며, 검출된 입자의 개수에 대한 iSCAT 신호를 플롯팅한다.
도 5는 혈청 샘플로부터 iSCAT에 의해 검출된 HDL 및 LDL 지단백질에 대해서, 도 4에 나타난 것에 상응하는 이미지 및 단일 입자 막대그래프를 제공한다.
도 6은 전체 혈액 샘플로부터 iSCAT에 의해 검출된 HDL, LDL 및 VLDL에 대한 단일 입자 막대그래프를 제공한다. 도 6a 및 도 6b는 각각 비 공복 샘플 및 공복 샘플의 막대그래프를 제공한다.
도 7은 공지된 질량/ 농도의 지단백질을 사용한 iSCAT 측정의 교정을 나타낸 그래프이다. 왼쪽 그래프는 배양 시간(초)에 대한 결합 이벤트를 표시한다. 오른쪽 그래프는 측정된 초기 결합 속도를 샘플에서의 입자의 농도로 변환하도록 하는 교정 곡선을 제공하기 위하여, 농도에 대한 결합 데이터로부터 결정되는 초기 결합 속도를 표시한다.
도 8a는 실시예 4에서 기술된 희석 방법에서, 개스켓(gasket)에 300 Nm 액틴(actin)의 랜딩 영상의 예시적인 프레임으로, 1 kHz의 프레임 속도, 유효 프레임 속도 : 25Hz로 기록한 것을 도시한다.
도 8b는 도 8a와 비교하기 위해, 도 8b는 유사한 조건 하에서 유동 챔버에서 300 nM 액틴의 랜딩 영상의 예시적인 프레임으로, 1 kHz의 프레임 속도, 유효 프레임 속도 : 25 Hz로 기록한 것을 도시한다.
도 9는 실시예 4에 기재된 실험을 4회 반복하여 축적된 질량 막대그래프를 나타낸 것이다.
본 발명은 광 산란을 이용하여 샘플 중의 입자의 표면에 대한 결합을 검출함으로써 용액 중의 입자의 농도를 측정 할 수 있다. 광 산란 현미경을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 광 산란에 의해, 특히 간섭계 산란 현미경 법을 사용하여 단일 지단백질 입자를 직접 검출하는 능력을 확인 하였다. 본 발명은 샘플 안의 상이한 형태의 지단백 입자를 포함한, 임의의 형태의 지단백 입자를 검출하는데 사용될 수 있다.
입자
본 발명의 방법에 따라 검출될 수 있는 입자는 단일 분자부터, 생물학적 거대 분자, 올리고머 어셈브리(oligomeric assembly)에 이르기까지 용액 중의 임의의 입자일 수 있다. 적합한 입자의 예로, 단일 분자, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산, 단당류, 탄수화물, 올리고당류, 다당류, 글리코 펩타이드, 당단백질, 지질, 지방산, 왁스, 스테롤, 지용성 비타민, 모노 글리세리드, 디 글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 글리세롤 지질, 글리세로 인지질, 스핑고리피드, 당질, 폴리케티드, 당지질, 지질단백질, 핵산, 뉴클레오티드, 다중 핵산, 분자 클러스터, 어셈블리, 응집체, 단백질/단백질 상호 작용, 단백질/소분자 상호 작용, 단백질-핵산 상호 작용 및 /또는 올리고머 어셈블리가 있다.
용액 중의 농도 측정을 위해, 검출 전에 입자에 표지를 달 필요는 없다. 광 산란 현미경은 입자의 질량을 결정할 수 있기 때문에, 간단히 질량으로 식별할 수 있다.
지단백질 입자
본 발명에 따라 검출될 수 있는 지단백 입자는 샘플에 존재하는 임의의 지단백질 입자일 수 있다. 지단백질 입자는 임의의 크기 또는 임의의 개수로 존재할 수 있다. 지단백질 입자는 일반적으로 사람 또는 동물의 혈액에 존재하는 지단백질 입자로부터 선택된다. 지단백질 입자는 일반적으로 트리글리세리드, 콜레스테롤, 인지질 및 하나 이상의 단백질, 예컨대 하나 이상의 아포지단백질을 포함한다. 지단백질 입자는 다양한 비율 및 /또는 밀도의 지질 및 단백질을 포함할 수 있다. 아포지단백질은 말초 또는 적분 아포지단백질일 수 있다. 아포지단백질은 임의의 클래스 또는 서브 클래스의 아포지단백질에서 선택될 수 있다. 아포지단백질은 임의의 유전자 다형성을 가질 수 있다. 아포지단백질(들)은 A, B, C, D, E 및/ 또는 H 클래스로부터 선택될 수 있다. 아포지단백질 A(apoliproteins of class A)는 아포 A-1, 아포 A-II, 아포A-IV 및 아포 A-V로부터 선택 될 수 있으며; 아포지단백질 B(apoliproteins of class B)는 아포 B48 및 아포 B100으로부터 선택 될 수 있으며; 아포지단백질 C(apoliproteins of class C)는 아포 C-1, 아포 C-II, 아포 C-III 및 아포 C-IV로부터 선택 될 수 있다. 아포지단백질 B(apoliproteins of class B)는 LDL 지단백질 입자에서 발견되며, 다른 클래스의 아포지단백질은 일반적으로HDL 지단백질 입자와 연관된다.
지단백질 입자는 전형적으로 직경이 1 nm 이상이고 직경이 1000 nm 이상 일 수 있다. 본 발명에 따라 검출되는 특정 유형의 지단백질 입자는 킬로미크론(chylomicron) (극저밀도 지단백질, ULDL이라고도 함), 초저밀도 지단백질 (VLDL), 중밀도 지단백질 (IDL), 저밀도 지단백질(LDL), 및 고밀도 지단백질 (HDL)을 포함한다. 상기 지단백질 입자의 예시적인 직경, 밀도 및 지질:단백질 비가 도 1에서 제공된다. 본 발명에 따라 검출된 지단백질은 도 1에 도시된 임의의 직경, 밀도 또는 지질:단백질 비를 가질 수 있다. 예를 들어, HDL 지단백 입자는 약 5 내지 약 15 nm 범위의 직경을 가질 수 있다. LDL 지단백질 입자는 약 18 내지 약 28 nm 범위의 직경을 가질 수 있다. IDL 지단백질 입자는 약 25 내지 약 50 nm의 직경을 가질 수 있다. VLDL 지단백질 입자의 직경은 약 30 내지 약 80 nm 일 수 있다. 킬로 미크론은 약 100 내지 약 1000 nm의 직경을 가질 수 있다. HDL 지단백질 입자는 약 200 내지 약 500 kDa의 분자량을 가질 수 있다. LDL 지단백질은 분자량이 약 3 MDA 일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 HDL 및 /또는 LDL 지단백질 입자를 검출한다. 본 발명의 방법은 VLDL 지단백질 입자의 검출을 포함 할 수 있다. 본 발명의 방법은 HDL 및 LDL; HDL 및 VLDL; HDL 및 IDL; HDL 및 UDL; LDL 및 VLDL; LDL 및 IDL; 또는 LDL 및 UDL 지단백질 입자의 검출을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 HDL, LDL 및 VLDL; HDL, LDL 및 IDL; 또는 HDL, LDL 및 UDL 지단백질 입자의 검출을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 HDL, LDL, IDL, VLDL 및 ULDL 지단백질 입자의 검출을 포함 할 수 있다. 다른 유형의 지단백질 입자와 중복되는 직경을 갖는 IDL 및 VLDL입자의 검출은 그러한 입자에 존재하는 특별한 단백질을 검출하기 위하여 추가 단계 (예를 들어, 형광 표지 된 항체)를 포함할 수 있다.
용액의 입자
용액은 액체 용매에 입자를 포함한 임의의 용액 일 수 있다. 용액은 예를 들어 입자가 물에 분산 된 간단한 용액 (예를 들어 입자의 수용액) 일 수 있고, 복잡한 용액, 예를 들어 입자에 더하여 하나 이상의 다른 용질이 포함된 용액일 수 있다. 용액은 샘플일 수 있다. 샘플은 농도를 테스트하기 위해 상업적으로 준비된 용액에서 채취할 수 있다. 체액은 전해질, 설탕 및 요소를 포함한 수많은 용질이 존재하는 복잡한 용액의 예이다. 샘플은 생물학적 또는 환경 시료를 포함한 모든 출처에서 수득할 수 있다. 샘플이 생물학적 시료인 경우, 샘플은 인간 또는 동물 신체 또는 개체로부터 채취되거나 수득될 수 있고, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 림프, 땀, 양수, 뇌척수액, 모유, 눈물, 분비물, 활액, 정액, 담즙 또는 점액일 수 있다. 샘플이 환경 시료인 경우, 물 (예를 들어, 개울, 강, 호수, 빗물, 해수 등), 음식 및 음료, 농업용 시료, 공장 및 제조 공정에서의 액체 샘플 등의 모든 출처에서 얻어질 수 있다.
표면과 접촉하기 전에 샘플이나 용액을 준비할 필요는 없지만, 용액이 농축되는 것으로 생각되는 경우, 용액은 여기서 논의된 바와 같이 측정 용액과 접촉될 수 있다.
표면
입자의 농도를 결정하기 위해 입자가 결합되는 표면은 바람직하게는 검출기 표면이고 광 산란 현미경의 샘플 홀더의 일부를 형성할 수 있다.
표면은 바람직하게는 유리, 사파이어이고, 또는 투명한 중합체로 만들어진다. 샘플은 농도를 결정하기 위해 표면과 접촉시킨다. 샘플은 표면을 포함하는 샘플 홀더에 배치 될 수 있다. 전술 한 바와 같이, 현미경은 샘플을 샘플 위치에 거치하기 위한 샘플 홀더를 포함한다. 샘플은 이미지화될 입자를 포함하는 액체 샘플 일 수 있으며, 이는 아래에서 더 상세히 설명된다. 샘플 홀더는 샘플을 고정하기에 적합한 임의의 형태를 취할 수 있다. 일반적으로, 샘플 홀더는 샘플을 표면에 고정시켜 샘플 홀더와 샘플 사이의 인터페이스를 형성한다. 예를 들어, 샘플 홀더는 커버 슬립 일 수 있고 및/또는 유리로 만들어 질 수 있다. 샘플은 예를 들어, 마이크로 피펫 또는 자동 분배 시스템을 사용하여 간단한 방식으로 샘플 홀더 상에 제공 될 수 있다.
샘플 홀더는 적절한 형식을 취할 수 있다. 일부 형식에서, 샘플 홀더는 표면에 대한 접근이 용액에서의 입자의 결합을 제한하지 않도록 높은 표면적 대 부피 비를 갖도록 할 것이다. 다른 형식에서, 표면적과 부피의 비는 감소 할 수 있고, 표면적 대 부피 비가 낮아져 표면으로의 접근이 제한 될 수 있다. 샘플 홀더의 부피에 대한 표면적의 선택으로 농도가 측정 될 수 있는 방식이 변화되는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 샘플 홀더의 표면적 대 부피 비율이 낮으면 입자의 결합 속도는 시간이 지날수록 감소하지 않을 것이다. 이 상황에서, 임의의 순간에 광 산란을 이용하여 측정되는 결합 속도는 농도를 계산하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 표면은 임의의 적합한 표면일 수 있다. 예를 들어, 표면은 부동태화된 표면일 수 있다. 부동태화는 화학적 반응성을 향상 또는 감소시키기 위해 표면을 처리하거나 코팅하여 결합 이벤트의 수를 증가 또는 감소시키는 공정이다.
대안적으로, 표면은 활성화, 코팅, 유도체화 또는 처리 된 표면 일 수 있다. 표면에 실란(silane)과 같은, 개체(entity)를 고정시킴으로써 표면이 유도체화 될 수 있다. 실시예 4에서, 표면은 알콕시 실란 (alkoxysilane) 분자로 표면의 작용기화하는 것인, 실란화 하는 APTES로 코팅된다. 이는 양으로 하전된 표면을 초래하므로 일부 입자에게 유리하다. APTES를 사용한 코팅 공정은 표면과 실란 사이의 공유 결합을 형성한다. 양성자화된 아민기는 자유 공간에서 스스로 정렬되고, 입자의 음으로 하전된 그룹을(시알산기, 카르복실기, 황화 에스터기와 같은) 위한 양의 도킹 사이트를 만든다.
표면은 특이적 결합 엔티티 또는 파트너(partner)를 위해 코팅될 수 있다. 이러한 표면은 농축된 혼합물 또는 복합 혼합물에서 입자의 선택을 가능하게 한다. 이 시나리오에서 농도를 계산하려면 입자의 결합 상수 및 특정한 결합 엔티티(entity)가 요구된다.
표면이 변형되면, 이들 변형이 광 산란에 의해 검출될 수 있는 결합력의 변화를 일으키지 않도록 하는 것이 중요하다.
샘플을 표면과 접촉
상기 용액에서 입자의 농도를 결정하기 위해 용액을 표면과 접촉시킨다. 입자는 표면에 결합하고, 이 결합은 광 산란, 바람직하게는 iSCAT, 바람직하게는 현미경을 사용하여 가시화되거나 검출된다.
표면에 대한 결합은 비특이적 일 수 있고, 또는 대안적으로, 결합은 상기 논의 한 바와 같이 사용된 표면의 성질에 따라 특이적 일 수 있다. 표면이 유리인 경우 (즉, 유리 커버슬립) 결합은 비특이적이다. 표면이 처리되면, 결합은 특이적일 수 있다. 표면에 대한 결합 속도는 검출 단계를 1 회 이상 반복함으로써 계산 될 수 있거나, 단일 측정으로부터 얻어질 수 있다.
표면에 결합된 입자의 결합 및 /또는 개수는 광 산란을 사용하여 검출 될 수 있다. 표면에 대한 결합 속도 및 /또는 초기 입자의 결합 속도의 변화를 결정하기 위해 1회 이상 반복 될 수 있다. 각각의 시점에서의 결합은 결합 속도를 확립하기 위해 플롯팅 될 수 있다.
용액의 표면적 대 부피의 비가 낮은 경우, 임의의 주어진 시간에서의 결합 속도가 입자의 개수를 나타내기 때문에, 농도를 결정하기 위해 한번의 측정도 충분할 수 있다. 결합 속도는 일정하다.
일부 경우에, 결합 속도가 일정한지 또는 시간에 따라 변했는지를 결정하기 위해 결합된 입자의 검출을 반복하는 것이 바람직 할 수 있다. 결합 속도에 변화가 없는 경우(일정 속도), 임의의 시점에서 기록된 결합 속도는 절대 농도를 나타낸다. 결합 속도에 변화가 있는 경우, 농도를 계산하기 위해 이러한 결합 속도의 변화를 플로팅하고 데이터를 0 시점으로 외삽할 수 있다.
일정한 결합 속도로부터 또는 초기 결합 속도로부터 결합 속도의 변화가 있는 경우, 표면에 대한 결합 속도의 감소 또는 쇠퇴가 계산 될 수 있다. 결합 속도의 감소는 용액 중의 농도와 연관될 수 있다. 예를 들어, 표면에 대한 입자의 결합 (iSCAT에 의해 가시화 됨)은 용액에 남아있는 입자 및 접근 가능한 부위의 개수의 함수로서 시간에 따라 감소한다.
표면에 대한 결합의 검출은 시간이 지남에 따라 반복 될 수 있으며, 측정 사이의 간격은 측정이 요구되는 입자 및 용액의 성질에 따라 달라질 것이며, 용액마다 다를 것이다. 예를 들어, 샘플이 표면과 접촉한 직후, 예를 들어 1초 또는 그 미만 내에 효과적으로 측정을 추가할 수 있으며, 그 후 몇 초마다 측정이 수행될 수 있다. 예를 들어, 접촉 후 1-60, 1-30, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 45-50, 55-60 초의 간격으로 측정이 수행 될 수 있다. 측정은 초기 결합 속도를 결정하기 위해 필요한 시간 동안 반복될 수 있다.
측정 사이의 간격은 조사 중인 입자와 관련 될 수 있으며, 따라서 측정 사이의 시간이 더 길어질 수 있다. 즉, 측정 사이의 시간은 수 분 내지 수 시간 일 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 초기 측정 후 몇 분마다 (예를 들어, 접촉한 후 1-60, 1-30, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25 분의 간격으로) 측정이 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 측정은 초기 측정 이후 몇 시간 마다 수행될 수 있고, 예를 들어 접촉한 이후 1-24, 1-12, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 또는 1시간의 측정간격으로 수행될 수 있다.
실제 측정 후 몇 분 내에 해리(dissociation)가 없다는 추가적 증거를 제공하기 위해서는 더 긴 간격이 고려되고, 즉, 해리는 발생하는데 훨씬 더 오랜 시간이 걸린다는 것을 알 수 있다.
또한, 시간 간격은 하나의 분석(assay) 안에서 변할 수 있다. 예를 들어, 처음 몇 번의 측정은 몇 초마다 수행될 수 있으며 더 긴 간격으로 더 많은 측정이 수행될 수 있다. 검출 시간이 기록되는 한, 그 간격은 변할 수 있다.
결합은 초기 검출된 이후에 적어도 한번 검출되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 표면에 대한 입자의 결합은 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 7 회, 8 회, 9 회 이상 검출된다. 표면에 대한 입자의 결합의 각각의 독립적인 검출 이벤트는 전술한 바와 같이 시간 간격을 두고 분리될 수 있으며, 각 검출 이벤트 간의 시간 간격은 동일한 간격 일 수 있거나 달라질 수 있다.
결합 속도를 검출하기 위해, 실시예 4에 나타난 바와 같이, 표면에 대한 결합을 기록/ 촬영하는 것이 유용할 수 있다.
농도 결정
용액 중의 입자의 농도를 결정하기 위해, 일정한 결합 속도 또는 초기 결합 속도는 용액 중의 공지된 농도의 입자의 일정한 결합 속도 또는 초기 결합 속도와 비교될 수 있다. 이는 공지된 농도의 입자에 대해 방법이 미리 수행되었기 때문에, 방법을 교정할 수 있도록 허용한다.
일련의 공지 된 농도에 대한 초기 결합 속도는 결합 데이터로부터 외삽할 수 있고 표준 곡선을 생성하는데 사용되어 샘플에서 측정 된 초기 결합 속도를 각각의 용액 중의 입자의 각각의 절대 농도로 변환 할 수 있다. 일 실시 예에서, 알려진 질량/농도의 입자를 이용하여 광 산란 현미경을 사용해 수행된 농도 측정을 교정하는 것이 가능하다. 일 예는 그림 7에 나와 있으며 여기서는 입자는 지단백질이다. 왼쪽 패널은 배양 시간(초)에 대한 결합 이벤트를 표시한다. 오른쪽 패널은 측정된 초기 결합 속도를 샘플에서의 입자의 농도로 변환하도록 하는 교정 곡선을 제공하기 위하여, 농도에 대한 결합 데이터로부터 결정되는 초기 결합 속도를 표시한다. 이 경우, 결합 속도는 표면에 대한 입자의 결합 속도이다. 상기 표면은 용액이 거치되는 본 실시 예의 샘플 홀더에 존재한다.
시간이 지남에 따라 검출된 입자의 표면에 대한 결합 속도의 감소 또는 쇠퇴는 농도 측정을 가능하게 하는 기반을 제공할 수 있다. 방법을 교정하기 위해 공지된 농도의 입자의 결합 속도를 이용해야 할 수 있다.
농도를 계산하기 위해 확산 속도에 대한 교정을 포함해야 할 수 있다. 확산 속도는 질량 및 형상과 같은 알려진 특성에 기초하여 쉽게 계산 될 수 있다.
대안적으로, 분석(assay)은 내부의 캘리 브란트를 사용하여 교정 될 수 있다. 캘리 브란트는 표면에 결합하는 능력 (예를 들어, 전하, 소수성, 친수성)과 관련하여 입자와 유사한 특성을 가지며, 따라서 용액 중의 입자의 성질에 기초하여 선택된다. 캘리 브란트는 알려진 질량 및 농도를 갖는다. 캘리 브란트는 용액의 입자 및 표면으로 실질적으로 동시에 (즉, 동시에) 도입된다. 광 산란을 사용하여 표면에 대한 캘리 브란트 결합의 검출은 캘리 브란트의 초기 결합 속도를 결정하게 한다. 동시에, 표면에 대한 입자의 초기 속도의 결합 속도는 광 산란을 사용하여 결정된다. 입자의 초기 결합 속도는 공지된 농도의 캘리 브란트의 초기 결합 속도와 비교 될 수 있으며, 이는 입자의 농도를 계산할 수 있게 한다.
단일 입자 광 산란은 본문의 앞쪽에서 논의된 바와 같이 입자의 질량을 결정하는데 사용될 수 있으므로, 관심 질량의 입자를 식별하기 위해 질량을 사용하여, 하나의 특정 유형의 입자의 결합 속도를 결정할 수 있다. 관심 대상 입자 또는 캘리 브란트는 질량 관련 대비를 두어 선택될 수 있다. 따라서 표면에 대한 입자 또는 캘리 브란트 결합을 검출하는 것이 가능하고, 표면에 대한 다른 질량의 용질의 결합은 무시할 수 있다.
농축된 용액
용액이 농축 될 것으로 예상되면, 농도 측정이 더 복잡해질 수 있다. 본 발명의 방법을 사용한 측정이 정확한지 확인하기 위해, 본 발명자들은 측정 용액을 사용하는 방법을 개발 하였다. 이것은 실질적으로 동시에 표면과 입자 용액으로 도입된다.
측정 용액은 완충 용액 일 수 있다. 일반적으로, 희석 효과의 계산을 가능하게 하기 위해 측정 용액의 부피가 알려져 있다.
일정 부피의 용액은 바람직하게는 알려진 형상을 갖는 샘플 홀더에 배치될 수 있다. 이는 측정 용액의 도입 (또는 측정 용액으로의 입자 용액의 도입)을 가능하게 하고, 희석 거동을 사용하여, 이는 검출된 표면에의 입자의 결합 속도를 입자의 농도로 변환될 수 있도록 한다.
표면에 대한 입자의 결합의 검출은 측정 용액의 도입 후 하나 이상의 상이한 시간 간격으로 수행될 수 있다. 상이한 시간 간격으로 측정 용액을 도입한 후 검출 단계가 반복되면, 해리와 같은 희석 효과의 교정이 가능할 것이다. 첨가 (및 희석) 후 측정이 상이한 시점에서 수행되면, 예를 들어, 더 낮은 농도에서 입자가 해리되거나 군집하는 경우, 종 분포의 변화가 가시화 될 수 있다. 따라서, 이 접근은 입자를 더욱 상세하게 볼 수 있게 하고, 농도 측정의 검증을 가능하게 한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 입자 용액 또는 측정 용액 중 하나 또는 둘 다의 부피가 변할 수 있고, 및 /또는 샘플 홀더의 형상이 변할 수 있다. 둘 다 희석 효과를 교정할 수 있다. 검출 단계가 하나 이상의 상이한 용액 부피 및/ 또는 하나 이상의 상이한 형상의 샘플 홀더에서 반복 수행된다면, 이는 해리와 같은 희석 효과를 교정할 수도 있다.
방법 단계
본원에 기술 된 바와 같이, 본 발명은 용액 중의 입자의 농도를 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
i) 용액을 표면과 접촉시키는 단계;
ii) 광 산란에 의해 가시화 된 표면에 결합하는 입자를 검출하는 단계;
iii) 검출 단계를 반복하고 표면에 대한 입자의 시간에 따른 결합 속도 및 /또는 초기 결합 속도의 변화를 계산하는 단계;
iv) 공지된 입자 농도를 갖는 용액으로부터의 데이터에 기초하여 농도에 대한 초기 결합 속도의 교정 곡선을 제공하는 단계; 및
v) 단계 (iv)에서 교정 곡선을 사용하여 단계 (iii)에서 샘플에 대해 기록된 초기 결합 속도를 용액 중의 입자의 농도로 변환하는 단계;를 포함한다.
상기 방법은 결정된 농도를 확인하기 위해, 상이한 형상의 하나 이상의 샘플 홀더를 사용하거나 상이한 부피의 측정 용액을 사용하여 단계 (i) 내지 (ii)를 반복하는 단계를 더 포함 할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 방법은 용액 중의 입자의 농도를 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
i) 용액을 표면과 접촉시키는 단계;
ii) 광 산란에 의해 가시화된 표면에 결합하는 입자를 검출하는 단계;
iii) 검출 단계를 반복하고 표면에 대한 입자의 시간에 따른 결합 속도 및/ 또는 일정한 결합 속도(constant binding rate)의 변화를 계산하는 단계;
iv) 공지된 입자 농도를 갖는 용액으로부터의 데이터에 기초하여 농도에 대한 일정한 결합 속도의 교정 곡선을 제공하는 단계; 및
v) 단계 (iv)의 교정 곡선을 이용하여 단계 (iii)에서의 샘플에 대해 기록된 일정한 결합 속도를 용액 중 입자의 농도로 변환하는 단계;
상기 방법은 결정된 농도를 확인하기 위하여 상이한 부피의 측정 용액을 이용하거나 또는 하나 이상의 상이한 형상의 샘플 홀더를 사용하여 단계 (i) 내지 (ii)를 반복하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 내부의 캘리브란트가 사용되는 경우, 본 발명은 용액 중의 입자의 농도를 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
i) 캘리 브란트의 존재 하에 용액을 표면과 접촉시키는 단계;
ii) 광 산란에 의해 가시화된 표면에 대해 결합하는 입자를 검출하는 단계;
iii) 광 산란에 의해 가시화된 표면에 대해 결합하는 캘리브란트를 동시에 검출하는 단계;
iv) 검출단계 (ii) 내지 (iii) 를 반복하고 표면에 대한 입자 및 캘리브란트의 시간에 따른 결합 속도 및/ 또는 초기 결합 속도의 변화를 계산하는 단계;
v) 단계 (iv)에서 입자의 초기 결합 속도를 용액 중의 입자의 농도로 변환하기 위해서 캘리브란트의 단계 (iv)에서 계산된 초기 결합 속도를 사용하는 단계;
모든 변형에서, 용액 중의 입자의 농도의 결정을 가능하게 하는 것은 표면에 대해 결합하는 입자의 검출이다. 입자의 표면에 대한 결합 속도는 일정할 수 있으며, 이 경우 일정한 결합 속도는 공지된 농도의 동일 입자의 일정한 결합속도와 비교될 수 있다. 결합 속도는 다양할 수 있으며, 따라서 초기 결합 속도는 공지된 농도의 동일 입자의 초기 결합 속도와 비교하여 계산될 수 있다. 전술한 바와 같이, 표면적에 대한 부피의 비 측면의 샘플 홀더의 특성은 농도 계산을 변경할 수 있다.
지단백질 측정
위에서 논의 된 바와 같이, 본 발명의 방법은 하나 이상의 지단백질 입자의 크기 및 개수, 및 샘플에서 하나 이상의 상이한 지단백질 입자의 비율의 직접적인 측정을 허용한다. 이 방법은 동시에 2 개 이상의 상이한 유형의 지단백질 입자의 수, 크기 또는 비율을 결정하는 것을 포함 할 수 있다. 상기 방법은 샘플에서 특정 클래스의 지단백질 총 개수, 예컨대 HDL 및 /또는 LDL 지단백질 입자의 총 개수를 결정하는 단계를 포함 할 수 있다. 이 방법은 샘플에서 특정 크기의 지단백질 입자의 개수를 결정하는 것을 포함 할 수 있다. 이 방법은 샘플에서 특정 유형의 지단백질 입자에 대한 크기 분포를 결정하는 것을 포함 할 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 샘플에서 HDL 대 LDL 지단백질 입자의 비율을 결정하는 것을 포함한다. 샘플에서 하나 이상의 다른 지단백질 성분, 예를 들어 VLDL 지단백질 입자에 대한 HDL 및 /또는 LDL의 비가 또한 결정될 수 있다. 따라서, 검출된 각각의 지단백질 유형 또는 각 부분(fraction)의 입자들의 상대적인 개수를 결정할 수 있다.
본 발명의 방법은 주어진 지단백질 입자에 대해 각각의 상이한 크기의 입자의 개수를 포함하는 샘플에서 하나 이상의 지단백질 입자에 대한 단일 입자 막대그래프를 얻는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 총 벌크 지단백질 함량을 특징짓는 기존의 검출 방법과 달리 샘플의 각각의 입자가 개별적으로 검출된다. 집단에서 지단백질의 분포는 알고리즘에 의존하는 이전의 검출 방법과 달리 직접 검출될 수 있다. 이 방법은 바람직하게는 HDL 및 /또는 LDL 지단백질 입자에 대한 단일 입자 막대그래프를 얻는 단계를 포함한다.
상기 방법은 샘플에서 지단백질의 질량을 측정하는 단계를 포함 할 수 있다. 이 방법은 샘플에서 하나 이상의 유형의 지단백질의 절대 농도를 결정하는 것을 포함 할 수 있다. 지단백질의 질량 및 /또는 농도는 적합한 표준(standard)에 대한 교정에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 알려진 질량(지질 나노 디스크와 같은)의 지단백질의 범위는 광 산란, 예컨대 iSCAT에 의해 검출 될 수 있다. 적합한 정제된 지단백질의 준비는 예를 들어, 실시 예에 기재된 바와 같이 Lee Biosolutions로부터 입수 가능하다.
지단백질 질량과 iSCAT 신호 사이의 관계를 보이는 교정곡선이 생성될 수 있다. 관심 있는 샘플에서 검출된 입자에 관한 iSCAT 신호는 그들의 질량을 식별하기 위해 교정 곡선과 상관 될 수 있다.
용액 중의 절대 농도는 샘플의 지단백질 입자와 표면 사이의 결합 이벤트를 측정함으로써 결정될 수 있으며, 공지 된 농도의 지단백질의 샘플로 관찰 된 것에 대해 교정된다. 예를 들어, 표면에 대한 입자의 결합 (iSCAT에 의해 가시화 됨)은 용액에 남아있는 입자 및 접근 가능한 부위의 개수의 함수로서 시간에 따라 감소한다. 일련의 농도에 대한 초기 결합 속도는 결합 데이터로부터 외삽 될 수 있고 표준 곡선을 생성하는데 사용되어 샘플에서 측정된 초기 결합 속도를 지단백질의 각각의 절대 농도로 변환 할 수 있다. 대안적으로, 주어진 농도에서의 일정한 결합 속도는 유동 챔버에서 샘플의 일정한 공급에 의해 결정되거나 또는 그런 일시적인 입자의 결합만이 가능한 부동태화 된 표면의 사용에 의해 결정될 수 있다.
샘플에서 HDL 및 LDL 지단백질의 질량 및 농도를 측정하기 위한 예시적인 교정이 실시예에 기재되어 있다. 본 발명의 방법은 공지된 표준에 의한 교정을 포함하지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 대신에, 관심 있는 지단백질 분율에 대한 대표적인 입자의 크기/분포를 이용하여 입자의 크기들/분포들을 비교할 수 있다.
상기 방법은 또한 샘플에서 지단백질 입자의 하나 이상의 다른 파라미터를 결정하는 단계를 포함 할 수 있다. 상기 방법은 샘플에서 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 / 또는 아포지단백질 수준(level)을 검출하는 것을 포함 할 수 있다. 이들 지단백질의 수준은 하기 논의된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해, 또는 대안으로 관심 있는 지단백질 입자의 주어진 유형의 분자의 평균 개수에 대한 지식에 의해 결정될 수 있다. 따라서, iSCAT와 같이 광산란에 의해 검출 된 주어진 유형의 지단백질 입자의 개수는 이러한 지단백질 입자에서 관심 있는 지단백질 성분의 공지된 평균 분자 수에 곱하여 총 수준을 계산할 수 있다. 예를 들어, LDL 또는 VLDL 입자는 입자당 하나의 apoB 단백질만을 포함한다 (그리고 apoB 단백질은 HDL에서 존재하지 않음).
샘플의 지단백질에서 관심 있는 단백질의 수준은 면역 분석, 예를 들어, apoB100에 대한 면역 분석에 의해 결정될 수 있다. 검출된 지단백질 입자에서의 특정 단백질의 존재는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 검출 가능하게 표지된 제제의 사용에 의해 결정될 수 있다. 제제는 임의의 적합한 검출 가능한 표지를 포함 할 수 있다. 제제는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 일 수 있다. 바람직하게는, 검출 가능한 표지는 iSCAT와 같은 광 산란에 의한 단백질의 검출과 동시에 단백질의 검출을 허용한다. 바람직하게는, 상기 검출 가능한 표지는 형광 라벨이고 (예를 들어, 제제는 형광 표지 된 항체이다) 단백질을 혼입한 입자는 형광에 의해 검출된다. 따라서 본 발명의 방법은 광산란 (예를 들어 iSCAT) 및 형광에 의한 지단백질 성분의 검출을 포함 할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 하나 이상의 다른 지단백질 검출 방법을 수행하는 단계를 포함 할 수 있다. 다른 지단백질 검출 방법은 폴리아크릴아미드 구배 겔 전기 영동(polyacrylamide gradient gel electrophoresis)(예를 들어 US 5925229A 참조), 구배 밀도 초원심분리(gradient density ultracentrifugation) (예를 들어 US20140049775A1 참조), 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance) (예를 들어 US5343389A 참조), 이온-이동도 분석(ion-mobility analysis)(예를 들어 US7259018b2 참조)을 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 총 글리세리드 (TG, total glyceride); 총 콜레스테롤 (TC, total cholesterol); HDL 콜레스테롤 (HDL-C); 및 LDL- 콜레스테롤 (LDL-C) 수준을 결정하기 위해 표준 Friedewald 분석(assay)을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다. Friedewald 분석은 TC- (HDL-C + TG / 5)에 의해 계산 된 바와 같이 LDL- 콜레스테롤 수준을 측정하기 위해 VLDL 및 LDL의 침전을 필요로 한다. 이 분석의 한계는 TG> 400mg / ml 일 때 또는, VLDL TG / Chol 비율이 5 : 1에서 벗어날 경우 정확도가 제한되는 점이다. 또한, 지단백질 측정을 위한 샘플을 얻는 개체의 공복이 필요하다.
광 산란 (예: iSCAT)에 의해 얻어진 결과는 다른 방법(들)에 의해 얻어진 결과와 비교 될 수 있고, 또는 다른 방법(들)은 추가 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, iSCAT는 다른 방법에 의해 결정될 수 있는 하나 이상의 지단백질 성분의 입자 크기, 개수 및 총 농도에 관한 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
검출
청구된 방법에 따른 지단백질 입자를 포함한 입자의 검출은 광 산란, 바람직하게는 간섭계 산란 현미경(iSCAT)을 사용하여 수행된다. 이 기술은 Kukura 외, Nature Methods 2009 6:923-935 및 Ortega-Arroyo 외, Physical Chemistry Chemical Physics 2012 14:15625-15636에서 검토된다.iSCAT는 샘플에서 대상물에 의해 산란된 광과 샘플 위치로부터 반사 된 광 사이의 간섭을 결정하는 것을 포함한다. 간섭은 대상물의 산란 진폭에 (그리고 그 부피) 의존하고, iSCAT 신호로 측정된다. 따라서, 지단백질 입자에 의해 생성된 iSCAT 신호는 부피 및 직경과 상관되어, 샘플에 존재하는 지단백질 입자의 유형을 식별 할 수 있다. 교정시, iSCAT 신호를 사용하여 아래 설명 된 바와 같이, 질량 / 농도를 추정할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 일반적으로 iSCAT 신호를 결정하는 단계를 포함한다. isCAT 신호는 입자의 유무에 따라 검출된 광의 비로 기술 될 수 있다. 보다 상세하게는, 다음과 같이 정의 될 수 있다. (Is-Ip) / Is, 여기서 Is는 입자가 존재 하지 않을 때 샘플 위치 (예: 유리 표면)로부터의 반사 강도이고, Ip는 입자가 존재할 때의 동일한 측정 값이다.
상기 방법은 간섭계 산란 현미경의 사용을 포함할 수 있고, 간섭계 산란 현미경은 샘플 위치에 샘플을 거치하기 위한 샘플 홀더; 조명 광을 제공하도록 배치된 광원; 검출기; 조명 광을 샘플 위치를 향하게 하도록 배치되고 반사된 출력 광을 수집하도록 배치되고, 출력 광은 샘플 위치에서 산란된 광 및 샘플 위치에서 반사된 조명 광 두 가지를 포함하고, 검출기로 출력 광을 향하도록 배치된 광학 시스템을 포함한다. 현미경은 출력 광을 필터링하도록 배치된 공간 필터이되, 상기 공간 필터는 기설정된 개구수 내에서 더 큰 개구수 보다 더 큰 강도 감소를 갖는 출력 광을 통과시키도록 배치되는 공간 필터를 더 포함할 수 있다. 이러한 공간 필터는 본원에 참조로 포함된PCT/GB2017/052070 및 Cole 외 (ACS Photonics, 2017, 4(2), pp 211-216)에 기술된 바와 같이 유리하게 이미지 콘트라스트를 최대화한다.
사용 된 광은 자외선 (본 명세서에서 10nm 내지 380nm 범위의 파장을 갖는 것으로 정의 될 수 있음); 가시 광선 (본 명세서에서 380nm 내지 740nm 범위의 파장을 갖는 것으로 정의 될 수 있음); 적외선 (본 명세서에서 740nm 내지 300㎛ 범위의 파장을 갖는 것으로 정의 될 수 있음) 일 수 있다. 광은 바람직하게는 가시광선이다. 지단백질 입자의 높은 검출 감도를 위해서는 청색 광이 바람직하다. 적색 광은 또한 iSCAT에 의한 입자의 검출을 형광에 의한(예를 들어, 관심 단백질에 결합하는 형광 표지 된 항체를 사용하여) 특정 지단백질 성분(예를 들어, 특정 관심 단백질)의 검출과 결합하는데 유리하게 사용될 수 있다. 광은 여러 파장이 혼합된 것일 수 있다. 조명 광은 예를 들어 레이저에 의해 제공되는 간섭 광(coherent light)일 수 있다.
도 3은 다음과 같이 배열되고, (위에서 논의 된 바와 같이 공간 필터로 구성됨) 본 발명에 사용될 수 있는 iSCAT 현미경 (1)을 도시한다. 공간 필터는 콘트라스트를 개선시키기 위해 논의 된 이유로 유리하지만, 본 발명의 방법은 공간 필터가 없는 iSCAT 현미경을 대안 적으로 이용할 수 있다.
현미경 (1)은 하기에 보다 상세히 기술 된 공간 필터 이외에는, 현미경 분야에서 종래의 기술 구성을 갖는 하기의 구성 요소들을 포함한다.
현미경 (1)은 샘플 위치에 샘플 (3)을 거치하기 위한 샘플 홀더 (2)를 포함한다. 샘플 (3)은 이미지화 될 대상물을 포함하는 액체 샘플 일 수 있고, 이는 하기에 보다 상세하게 설명된다. 샘플 홀더 (2)는 샘플 (3)을 거치하기에 적절한 임의의 형태가 될 수 있다. 일반적으로, 샘플 홀더 (2)는 샘플 홀더 (2)와 샘플 (3) 사이의 계면을 형성하는 표면에 샘플 (3)을 거치한다. 예를 들어, 샘플 홀더 (2) 커버 슬립 일 수 있고 또는 유리로 제조될 수 있다. 샘플 (3)은 예를 들어 마이크로 피펫 (micropipette)을 사용하는 것처럼 간단한 방식으로 샘플 홀더 (2)에 제공될 수 있다.
현미경 (1)은 광원 (4) 및 검출기 (5)를 더 포함한다.
광원 (4)은 조명 광을 제공하도록 배치된다. 조명 광은 간섭 광 일 수 있다. 예를 들어, 광원 (4)은 레이저 일 수 있다. 조명광의 파장은 샘플 (3)의 성질 및 /또는 조사되는 특성에 따라 선택 될 수 있다. 일 실시예에서, 조명 광은 405nm의 파장을 갖는다.
선택적으로, 조명 광은 조명 및 레이저 노이즈의 간섭성(coherent nature)으로부터 발생하는 스펙클 패턴(speckle patterns)을 제거하기 위해 공간적으로 변조 될 수 있고, 예를 들어 Kukura 외, "High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus", Nature Methods 2009 6:923-935에 기술된 바와 같다.
검출기 (5)는 샘플 위치로부터 반사 된 출력 광을 수용한다. 일반적으로, 현미경 (1)은 광-필드 모드에서 작동 할 수 있고, 이 경우 검출기 (5)는 샘플 (3)의 이미지를 캡쳐하는 이미지 센서 일 수 있다. 현미경 (1)은 대안적으로 공초점 모드에서 작동 할 수 있으며, 이 경우 검출기 (5)의 이미지는 이미지 센서 일 수 있거나 포토 다이오드와 같은 점형 검출기 일 수 있으며, 이 경우 스캐닝 장치는 샘플 (3)의 영역을 스캔하여 이미지를 형성하는데 사용될 수 있다. 검출기 (5)로 채택될 수 있는 이미지 센서의 예는 CMOS (complementary metal-oxide semiconductor) 이미지 센서 또는 CCD (charge-coupled device)를 포함한다.
현미경 (1)은 샘플 홀더 (2), 광원 (4) 및 검출기 (5) 사이에 배열 된 광학 시스템 (10)을 더 포함한다. 광학 시스템 (10)은 샘플 (3)을 밝히기 위한 샘플 위치로 조명 광이 향하게 하기와 같이 배치되고, 샘플 위치로부터 반사된 출력 광이 검출기 (5)로 향하게 한다.
광학 시스템 (10)은 샘플 홀더 (2) 의 전방에 배치된 렌즈 시스템 인 대물 렌즈 (11)를 포함한다. 또한, 광학 시스템 (10)은 집광 렌즈 (12) 및 튜브 렌즈 (13)를 포함한다.
집광 렌즈 (12)는 광원 (1)으로부터의 조명 광을 (도 1에 실선으로 도시 됨) 대물 렌즈 (11)를 통해 샘플 위치의 샘플 (3) 상에 집광한다.
대물 렌즈 (11)는 (a) 샘플 위치 (도 1에 실선으로 도시 됨)로부터 반사 된 조명광 및 (b) 샘플 위치에서 샘플 (3)로 산란 된 광(도 1에 점선으로 도시됨)을 포함하는 출력 광을 수집한다. 반사 된 광은 샘플 홀더 (2)와 샘플 (3) 사이의 계면으로부터 주로 반사된다. 일반적으로, 이는 비교적 약한 반사, 예를 들어 유리-물 반사이다. 예를 들어, 반사된 조명 광의 강도는 입사 조명 광의 강도의 약 0.5 % 정도일 수 있다. 산란 광은 샘플 (3)의 대상물에 의해 산란된다.
종래의 iSCAT과 유사한 방식으로, 샘플의 표면 또는 근방의 대상물로부터의 산란 광은 반사광을 구조적으로 방해하고 이는 검출기(5)에 의해 포착 된 이미지에서 볼 수 있다. 이 효과는 검출기에 도달하는 조명광이 샘플의 깊이로 투과되어 더 작은 이미지 콘트라스트를 초래하는 투과성으로 동작하는 현미경과는 다르다.
도 1에 도시 된 바와 같이, 반사 조명광과 산란 광은 상이한 방향성을 갖는다. 특히, 반사 조명광은 광원 (4) 및 광학 시스템 (6)에 의해 출력된 광 빔의 지오메트리(geometry)에 기인하여 개구수를 갖는다. 산란 광은 넓은 각도 범위에 걸쳐 산란되어 반사 조명광 보다 큰 개구수를 충족한다.
튜브 렌즈 (13)는 대물 렌즈 (11)로부터의 출력 광을 검출기 (5) 상에 집속시킨다.
광학 시스템 (6)은 또한 광원 (4)으로부터의 조명 광에 대한 광 경로와 검출기 (5)로 향하는 출력 광을 분리하도록 배치된 빔 스플리터 (14)를 포함한다. 빔 스플리터 (14)는 그 위에 입사되는 광의 부분 반사 및 부분 투과를 제공하는 종래의 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 빔 스플리터 (14)는 일반적으로 금속 또는 유전체 일 수 있는 필름이 제공된 플레이트 일 수 있고, 광학 경로에 대해 45 °로 배치된다. 대안적으로, 빔 스플리터 (14)는 프리즘들 사이의 계면에서 부분적으로 반사 필름을 갖는 정합된 프리즘 쌍에 의해 형성된 큐브 빔 스플리터 일 수 있다. 대안적으로, 빔 스플리터 (14)는 빔 스플리터 (14)와 샘플 (3) 사이의 1/4 파장 판과 결합하여 사용되는 편광 빔 스플리터 일 수 있다.
도 1에 도시 된 예에서는 광원 (4)이 대물 렌즈 (11)의 광 경로로부터 오프셋되어, 광원 (4)으로부터의 조명 광이 빔 스플리터 (14)에 의해 대물 렌즈 (11) 내로 반사되고, 반대로 검출기 (5)는 대물 렌즈 (11)의 광 경로와 정렬되어, 샘플 위치로부터의 출력 광은 빔 스플리터 (14)를 통해 검출기 (5)를 향해 전송된다.
종래의 구성 일 수 있는 전술 한 구성 요소들에 이외에, 현미경 (1)은 공간 필터 (20)를 포함한다. 도 1에 도시 된 예에서, 공간 필터 (20)는 빔 스플리터 (14) 상에 형성되어, 대물 렌즈 (11)의 후방 개구, 따라서 대물 렌즈 (11)의 후방 초점면 (15) 바로 뒤에 배치된다. 따라서, 공간 필터 (20)는 위상 콘트라스트 현미경에서와 같이 대물 렌즈에 들어 가지 않고 구현 될 수 있다. 공간 필터를 접합면이 아닌 대물렌즈의 입구 개구 바로 뒤에 배치하는 것은(예를 들어, 후술되는 바와 같음) 높은 개구 수 현미경 대물 렌즈 내에서 다수의 렌즈로부터 발생하는 후방 반사를 강하게 억제하는 뚜렷한 이점을 갖는다. 이는 이미징 노이즈를 줄이고 비 간섭성 배경을 낮추며, 실험 복잡성, 광학 장치 수 및 광학 경로 길이를 줄여 광학 구조의 안정성을 높이고 이미지 품질을 향상시킨다.
그러나, 상기 위치는 필수적이지 않고 동등한 기능을 갖는 공간 필터는 후술되는 바와 같이 기타 위치에 구비될 수 있다.
이에 따라, 공간 필터 (20)는 검출기 (5)로 통과하는 출력 광을 필터링하도록 배치된다. 검출기 (5)가 대물 렌즈 (11)의 광 경로와 정렬되는 도 1에 도시 된 예에서, 공간 필터 (20)는 투과성이다.
공간 필터 (20)는 부분적으로 투과성이므로, 반사 된 조명 광을 포함하는 출력 광을 통과시키지만, 강도가 감소된다. 공간 필터 (20)는 또한 광축과 정렬되고 기설정된 개구를 가지므로 기설정된 개구 수 내에서 강도의 감소를 제공한다. 여기에서, 개구 수는 일반적인 방식으로 출력 광이 시작되는 샘플 위치에 대한 각도 범위를 특징 짓는 무차원 양으로 정의된다. 구체적으로, 개구 수 (NA)는 방정식 NA = n ·sin (θ)에 의해 정의 될 수 있고, 여기서 θ는 수집의 반각이고, n은 출력 광이 통과하는 재료의 굴절률이다 (예를 들어, 광학 시스템 (6)의 구성 요소 물질).
공간 필터 (20)는 기설정된 개구수 이외의 경우에는 강도 감소를 제공하지 않는다. 원칙적으로, 바람직하지는 않더라도 공간 필터 (20)는 그 개구수 이외의 경우에 강도의 감소를 제공할 수 있지만, 기설정된 개구수 내에서 강도의 감소 보다 작은 강도의 감소를 제공할 수 있다.
공간 필터 (20)는 일반적으로 증착된 물질의 층을 포함하는 임의의 적합한 방식으로 형성될 수 있다. 재료는 예를 들어 은과 같은 금속 일 수 있다. 증착은 임의의 적합한 기술을 사용하여 수행 될 수 있다.
계면 근처의 서브-회절 크기의 대상물은 반사 된 조명 광보다 큰 개구 수로 우선적으로 광을 산란시키므로, 공간 필터 (20)에 의해 제공되는 강도의 감소는 산란 광에 대한 반사 조명 광의 검출 강도를 우선적으로 감소시킨다. 따라서, 낮은 개구 수에서 공간 필터 (20)에 의한 세기의 감소는 주로 반사 조명 광에 영향을 미치고 산란 광에 대한 영향을 최소화하여, 캡쳐 이미지에서의 콘트라스트를 최대화한다. 강화된 이미징 콘트라스트는 약한 산란체의 높은 콘트라스트 검출을 가능하게 한다.
콘트라스트 개선은 하기와 같이 이해될 수 있다. 공간 필터 (20)가 기설정된 개구 수에서 (즉, 본 예시에서는 부분적으로 투과성임), 조명광 및 산란 광의 일부들이 검출기에 도달하고 충분히 간섭성인 조명원에 간섭하게 된다. 검출기 (Idet)에 도달하는 광 강도는 Idet = |Einc|2{r2t2+|s|2+2rt|s|cosΦ}에 의해 주어지며, 여기서 Einc는 입사광 필드, r 2는 계면의 반사율이고 t2는 공간 필터 (20)의 투과도, s 는 대상물의 산란 진폭이고, Φ는 투과 된 조명 광과 산란 된 광 사이의 위상차이다. 따라서, 검출 된 총 광자 수를 희생하더라도 산란 콘트라스트는 향상된다.
따라서, 종래의 iSCAT와 유사한 방식으로 콘트라스트가 제공되지만, 공간 필터의 투과도에 의해 추가적으로 조절된다. 이는 표준 iSCAT에서와 같이 유리-물 계면의 반사도에 의해 고정되는 것이 아니라 공간 필터 (20)의 투과도 t2을 직접 선택하여 기준 필드의 진폭을 조정하는 능력을 제공한다. 공간 필터 (20)가 증착된 물질 층인 경우, 투과도 t2는 물질 및/또는 층 두께에 의해서 선택될 수 있다. 이러한 맞춤 과정은 예를 들어, 대상물의 산란, 카메라 풀 웰(full well) 용량 및 배율에 따라서 수행될 수 있다.
iSCAT의 이러한 유리한 효과들을 최대화하기 위해, 기설정된 개구수는 출력 광 내의 반사된 조명광의 개구 수가 될 수 있지만, 필수적인 것은 아니다. 예를 들어, 기설정된 개구 수가 반사 조명광의 개구수보다 약간 작거나 큰 경우에 유사한 특성의 이점이 달성될 수 있다.
지단백질을 포함한 샘플
샘플은 지단백질 입자을 포함하는 임의의 샘플 일 수 있다. 이들은 일반적으로 인간 또는 동물과 같이 생체 내에서 생성된 지단백 입자이다. 따라서, 지단백질 입자는 일반적으로 생물학적 샘플에 존재한다. 그러나, 시험관 내에서 생성 및/ 또는 정제된 형태로 제공되는 지단백질 입자도 또한 검출된다. 예를 들어 상기에서 논의한 바와 같이 교정 목적으로 검출될 수 있다. 샘플은 정제된 형태의 다수의 상이한 유형의 지단백질을 포함 할 수 있다. 샘플은 또한 다수의 상이한 이온, 단백질 및 지단백질을 포함하는 용액과 같은, 다양한 성분의 복합 혼합물 또는 다분산 용액 일 수 있다.
샘플이 인간 또는 동물로부터 수득된 생물학적 샘플인 경우, 이는 임상 샘플 일 수 있다. 샘플은 하기 기재된 본 발명의 치료 및 진단 방법의 맥락에서 임의의 대상체로부터 얻은 임상 샘플 일 수 있다. 이는 지단백질 입자를 포함하는 임의의 체액 또는 조직의 샘플 일 수 있다. 일반적으로, 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청과 같은 혈액 성분이다. 샘플은 모세관, 정맥 또는 동맥혈 또는 혈장 또는 혈청일 수 있다. 샘플은 채혈(finger prick) 또는 정맥 천자(venipuncture)를 포함한 모든 방법으로 수집될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 지단백질의 검출은 유리하게 샘플의 다른 성분으로부터 지단백질의 분리 또는 정제 없이 달성된다. 기존의 검출 방법에서 요구되는 이러한 분리 및 정제는 시간이 소요되고, 지단백질 성분의 특정 특성을 인위적으로 변화시킬 수 있다. 그러나, 혈액과 같은 생물학적 샘플은 일반적으로 입자의 밀도를 감소시키고 상이한 유형의 지단백질 입자의 최적의 분해(optimal resolution)를 지원하기 위해서 희석될 것임을 이해해야한다. 샘플은 임의의 적절한 완충액에 희석될 수 있다. 일반적으로, 적절한 완충제는 생리학적 pH 및 염 농도를 갖는다. 비-생리학적 완충 조건 또한, 지단백질 입자에의 이러한 조건의 영향을 검토하기 위해 사용될 수 있다.
당업자는 일상적인 실험에서 관심 있는 특정 지단백질 입자의 검출을 위해 주어진 샘플의 적절한 희석을 선택할 수 있다. 검출 장치의 영상화 속도 및 감도에 따라, 단일 입자의 검출을 허용하는 희석이 확인될 때까지 희석이 실험적으로 이루어질 수 있다. 희석되지 않은 샘플의 지단백질 입자의 개수를 추정하기 위해 희석 계수가 고려될 것이다.
샘플이 혈액 또는 혈장인 경우, HDL의 검출 (고농도에서의 LDL에 비해 상대적으로 밀도가 높음) 또는 HDL 및 LDL 분해의 최적의 검출을 위해, 적절한 완충액에서 10,000배 이상 희석 될 수 있다. LDL의 검출에는 더 낮은 희석 (1-5000 배)이 사용될 수 있다.
iSCAT에 의한 지단백질 검출에 필요한 샘플 부피는 작고, 샘플 유형과 수집 방법에 따라 마이크로 리터만큼 작을 수 있다. 채혈(Finger prick)은 매우 적은 양의 혈액을 수집할 수 있게 한다. 샘플은 임의의 적합한 샘플 챔버에 제공 될 수 있다. 샘플 챔버는 예를 들어, 실시 예에 기재된 바와 같이 커버 슬립상의 개스킷에 의해 제공될 수 있다. 샘플 챔버는 대안적으로 유동 챔버 또는 미세 유체 장치 또는 모세관 칩과 같은 칩일 수 있다.
진단 또는 위험 결정 방법
본 발명은 다양한 유형의 지단백질 입자의 크기, 개수, 분포 및 비율과 질병 사이의 상관 관계에 기초하여 특히 진단 응용에 유용성을 갖는다. 따라서, 본 발명은 개체의 지단백질 입자의 크기 및 / 또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 진단하거나, 간섭계 산란 현미경에 의해 상기 개체로부터 얻은 샘플에서 지단백질 입자의 크기 및 / 또는 개수를 검출하는 단계를 포함하여 개체가 상기 질병 또는 상태가 발생할 위험을 결정하는 방법을 제공한다. 검출은 본 발명의 검출 방법과 관련하여, 상술한 바와 같은 임의의 유형의 지단백질 입자(들)에 대해 상술된 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 상기 샘플에서 하나 이상의 상이한 유형의 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수를 검출하고, 상기 샘플에서 상이한 유형의 지단백질 입자의 비율을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 바람직하게는 고밀도 지단백질 (HDL) 입자 및/또는 저밀도 지단백질 (LDL) 입자를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 특히 상기 샘플에서 HDL 입자에 대한 LDL 입자의 비율을 결정하는 단계를 포함 할 수 있다. 상기 샘플은 상술한 임의의 생물학적 또는 임상 샘플, 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장 일 수 있다. 개체는 동물, 포유 동물 또는 인간일 수 있다.
특정 지단백질 농도 수준, 분포 및 크기는 질병과 관련이 있을 수 있다. 당해 기술 분야에서 "좋은 콜레스테롤"로 기술 된 HDL은 혈액, 조직 및 신체 기관으로부터 간으로 콜레스테롤을 운송하는 운송체로서 기능한다. 따라서, 정상적인 HDL 수준은 혈중 콜레스테롤 수준의 적절한 조절을 제공한다. 다른 지단백질 입자에 대한 콜레스테롤의 HDL 수준/ 재분배의 변화는 질병 또는 질병의 위험 증가와 관련 될 수 있다. 예를 들어, 남성의 경우 40 mg / dL 미만, 여성의 경우 50 mg / dL 미만의 HDL 콜레스테롤 (HDL 입자에 의해 운반되는 콜레스테롤 농도) 수준은 심장 질환의 주 위험 요소이다(Mayo Clinic, 2016). HDL 입자는 일반적으로 혈액에서 가장 흔한 지단백질 부분에 해당한다.
정상 혈액에서 그 다음으로 가장 흔한 지단백질 부분인 LDL은 HDL과 대조적으로 신체의 조직 및 기관에 콜레스테롤을 배치시키는 역할 때문에 "나쁜 콜레스테롤"로 간주된다. LDL 수치가 높으면 동맥에 플라크가 형성되어 심장병 및 뇌졸중의 위험이 증가 할 수 있다 (American Heart Association, 2014). LDL 크기는 또한 심혈관 건강과 관련이 있는 것으로 나타났다. 정상 LDL 콜레스테롤 (LDL에 의해 운반되는 콜레스테롤 농도) 수준은 100-129 mg / dL의 범위이다. LDL이 작을수록 심혈관계 질병과 상관 관계가 더 크다(Foroutan, MS, RDN, 2015).
다른 지단백질 부분(VLDL, IDL, UDL)은 LDL 보다 10-100배 덜 빈번하다.
따라서, 본 발명에 따른 검출에 의해 제공되는, HDL 및 / 또는 LDL 개수, 크기 및 비율 (및 다른 지단백질 입자의 유사한 파라미터)의 정확한 측정은 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수와 관련된 질병 또는 상태에 대한 진단적 의미의 정보를 제공한다. HDL 및 LDL 개수 / 크기의 측정은 특히 심혈관 질환에 대한 진단적 가치가 있다. Friedewald 계산에 기초하여 LDL-C 값을 결정하는 대신, 본 발명에 따라 제공되는 직접 균질 분석은 지단백질 분석을 개선하고, 특히 고지혈증으로 고통 받는 환자와 관련해 보다 정확한 LDL 값을 제공할 수 있다 (Nauck, Warnick & Rifai, 2002). 또한, 총 혈청 콜레스테롤 수준의 결정이 진단 도구로서 일상적으로 사용되지만, 증상성 관상 동맥 질환을 앓고 있는 환자의 대략 절반 정도는 표준 방법을 사용하여 측정하는 경우 정상적인 LDL- 콜레스테롤 농도를 갖는다. 통상적인 임상 실험실 콜레스테롤 측정으로는 검출되지 않는 숨겨진 위험이 있는 것으로 보이며, 이 위험은 본 발명에 따른 지단백질 입자의 개수 및 크기의 직접적인 검출에 의해 회피될 수 있다.
진단될 질병 또는 상태, 또는 그 위험이 결정되는 질병 또는 상태는 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수와 관련된 임의의 질병 또는 상태 일 수 있다. 질병 또는 상태는 HDL 및/ 또는 LDL 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수와 연관될 수 있다. 질병의 상태는 HDL 대 LDL 지단백질 입자의 비율과 관련될 수 있다. 질병 또는 상태는 대안적으로 또는 추가적으로 VLDL, IDL 및 / 또는 UDL 대 HDL 및 / 또는 LDL의 비율과 관련될 수 있다. 질병 또는 상태는 비정상적인 지단백질 분포 또는 크기와 관련될 수 있다.
질병 또는 상태는 정상 (대조군 또는 기준) 수준과 비교하여 HDL의 수가 감소한 것일 수 있다. 따라서, 대조군 샘플 또는 기준 샘플/수준과 비교하여 감소된 HDL 수는 개체가 상기 질병 또는 상태를 가졌거나 상기 질병 또는 상태가 발생할 위험이 증가 된 것을 나타낼 수 있다. 질병 또는 상태는 남성의 경우 40 mg / dL 미만 또는 여성의 경우 50 mg / dL 미만의 혈액 HDL 콜레스테롤 농도를 포함 할 수 있다. 남성의 경우 40-50mg / dL (1.0-1.3mmol / L) 또는 여성의 경우 50-59mg / dL (1.3-1.5mmol / L)의 혈액 HDL 콜레스테롤 농도는 심장병의 평균 위험도와 관련이 있다. 많은 역학 연구에 따르면, 60mg / dL (1.55mmol / L) 이상의 혈액 HDL 콜레스테롤 농도는 심장 질병의 평균 위험도보다 낮은 점과 연관이 있다. 정상적인 HDL 콜레스테롤 수준은 일반적으로 1mmol / L보다 큰 것으로 정의 될 수 있다.
질병 또는 상태는 대안적으로 또는 추가적으로 정상 수준에 비하여 LDL 수가 증가하거나 또는 더 작은 크기의 LDL 수가 증가되어 있을 수 있다. 따라서, 대조군 샘플 또는 기준 샘플/수준과 비교하여, LDL 입자의 증가된 개수 및 / 또는 크기는 개체가 상기 질병 또는 상태를 가졌거나, 또는 상기 질병 또는 상태가 발생할 위험이 증가 된 것을 나타낸다. 질병 또는 상태는 3 mmol / L를 초과하는 혈액 LDL 콜레스테롤 농도를 포함 할 수 있다. 사람이 심혈관 질병에 대한 다른 위험 요소가 없는 경우, 100 mg / dL (2.59 mmol / L) 미만의 혈액 LDL 콜레스테롤 수치가 최적; 100-129 mg / dL (2.59-3.34 mmol / L) 수치가 최적 / 최적 근처의 수준 및 130-159 mg / dL (3.37-4.12 mmol / L)이 경계선 수준인 것으로 간주될 수 있다.
HDL:LDL의 비율은 질병 또는 상태에서 감소될 수 있다.
주어진 지단백질 입자의 정상 개수 및/ 또는 크기는 아래 논의된 조건과 같은 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수와 관련된 조건을 갖지 않는 개체에서 이 유형의 입자의 기준 개수 또는 크기를 참조하여 결정된다. 이러한 개체는 iSCAT에 의해 상기 진단 방법이 수행되는 개체로부터 얻은 샘플에서 검출된 하나 이상의 지단백질 입자(들)의 개수 및/ 또는 크기와 비교될 수 있는 하나 이상의 지단백질 입자(들)의 대조군 또는 기준 개수 및/또는 크기를 제공한다. 대조군 또는 기준 크기/개수는 다수의 정상 개체로부터의 평균 값일 수 있다. 개체는 정상 HDL 혈중 콜레스테롤 및 LDL 혈중 콜레스테롤 수준을 가질 수 있다. 정상적인(건강한) 총 혈중 콜레스테롤 수치는 5 mmol/L 미만이다.
따라서 본 발명의 진단 또는 위험 결정 방법은 전형적으로 개체로부터 하나 이상의 지단백질 입자(들)의 개수 및 / 또는 크기를 상기 지단백질에 대한 대조군 개수 및/ 또는 크기와 비교하는 단계를 포함한다. 지단백질 입자(들)의 개수 및/ 또는 크기의 증가 또는 감소는 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 질병 또는 상태의 존재 또는 발생 위험을 나타낼 수 있다. 대조군 또는 기준 수준은 iSCAT에 또는 본원에 기술된 임의의 다른 공지 된 검출 방법에 의해 지단백질 성분을 검출하는 임의의 다른 방법에 의해 미리 결정될 수 있음을 이해해야 한다. 대안적으로, 대조군 샘플에서의 지단백질 입자의 개수 및 /또는 크기는 콜레스테롤 수준 또는 분포와 동시에 iSCAT에 의해 검출될 수 있다. 개체는 콜레스테롤 관련 상태를 가질 수 있다. 질병 또는 상태는 증가된 또는 높은 수준의 총 혈중 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤 및 /또는 LDL 콜레스테롤과 관련 될 수 있다. 정상 총 콜레스테롤 및 HDL 및 LDL 대조군 개수 및/ 또는 크기와 비교하는 단계를 포함한다. 지단백질 입자(들)의 개수 및 / 또는 크기의 증가 또는 감소는 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 질병 또는 상태의 존재 또는 발생 위험을 나타낼 수 있다. 대조군 또는 기준 수준은 iSCAT에 또는 본원에 기술된 임의의 다른 공지된 검출 방법에 의해 지단백질 성분을 검출하는 임의의 다른 방법에 의해 미리 결정될 수 있음을 이해해야 한다. 대안적으로, 지단백질 입자의 개수 및 /또는 크기는 대조군 샘플 콜레스테롤 수준 또는 분포와 동시에 iSCAT에 의해 검출 될 수 있다. 개체는 콜레스테롤 관련 상태를 가질 수 있다. 질병 또는 상태는 증가된 또는 높은 수준의 총 혈중 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤 및/또는 LDL 콜레스테롤과 관련될 수 있다. 정상 총 콜레스테롤 및 HDL 및 LDL 콜레스테롤 수준은 상술하였다. 질병 또는 상태는 증가되거나 높은 수준의 트리글리세리드와 관련 될 수 있다. 질병 또는 상태는 바람직하게는 심혈관계 질병이다. 질병 또는 상태는 혈관 질병일 수 있다.
심혈관 질병(CVD)은 심장 또는 혈관을 포함하는 질병의 종류를 의미한다. 혈관과 관련된 심혈관 질병은 혈관 질병으로도 알려져 있다. 질병 또는 상태는 임의의 혈관 질병일 수 있다. 질병 또는 상태는 관상 동맥 질병, 관상 동맥 심장 질병, 허혈성 심장 질병, 말초 동맥 질병, 뇌 혈관 질병, 뇌졸중, 소형 뇌졸중, 신장 동맥 협착증 및 대동맥 동맥류 중에서 선택되는 1종 일 수 있다. 질병 또는 상태는 심장과 관련된 임의의 심혈관 질병 일 수 있다. 질병 또는 병태는 고혈압, 심부전, 폐 심장병, 심 부정맥 이상, 심박동 이상, 염증성 심장병, 심내막염, 염증성 심비대증, 심근염, 판막 심장 질병, 및 류마티스 심장병으로부터 선택 되는 1종 일 수 있다. 질병 또는 상태는 가족성 고 콜레스테롤 혈증과 같은 고 콜레스테롤 혈증 일 수 있다. 질병 또는 상태는 증가된 콜레스테롤 또는 트리글리세리드와 관련된 임의의 비-심혈관 질병 또는 상태일 수 있고, 지단백질의 개수 및/ 또는 크기의 진단은 질병 또는 상태의 이러한 측면의 진단(및 치료)을 도울 수 있다. 이러한 질병 및 상태의 예에는 당뇨병, 신장 질병, 갑상선기능 저하증 또는 췌장염이 포함된다.
개체는 미리 심혈관 질병의 위험이 있는 것으로 특징될 수 있고, 및/또는 혈중 콜레스테롤 수준 시험이 권장될 수 있다. 개체는 미리 상기 질병 중 임의의 것을 포함한, 심혈관 질병이 있는 것으로 진단될 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명은 개체의 지단백질 입자의 개수 및/ 또는 크기를 정확하게 결정할 수 있도록 한다.
개체는 성별, 연령, 가족력, 체중, 체질량 지수, 식이 또는 라이프 스타일과 같은 위험 요소에 기초하여, 위험의 진단 또는 평가를 위해 선택될 수 있다. 개체는 40세 이상일 수 있다. NHS 가이드 라인에 따르면, 40 세 이상의 사람들은 정기적으로 CVD 위험 평가를 받아야 한다. 개체는 조기 심혈관 질병의 가족력이 을 수 있다(예 : 심장병을 앓고 있거나 55 세 이전에 심장 마비 나 뇌졸중을 겪은 아버지 또는 형제, 또는 그 이전에 그러한 상태를 겪은 어머니 또는 자매가 있는 경우). 개체는 가족성 고 콜레스테롤 혈증과 같은 콜레스테롤 관련 상태를 갖는 가족 구성원, 가까운 가족 구성원을 가질 수 있다. 개체는 체중이거나 비만 일 수 있다. 개체는 고혈압 또는 당뇨병이 있을 수 있다.
본 발명은 또한, 물질 또는 조성물이 투여되거나 요법이 처방될 개체를 선택하는 방법으로서, 상기 물질, 조성물 또는 요법은 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하는데 적합하고, 본 발명의 검출 방법 의해 간섭계 산란 현미경을 사용하여 상기 개체로부터 얻은 샘플의 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수를 검출하는 단계; 및 검출된 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수가 상기 질병 또는 상태, 또는 그로 인한 위험을 나타내는 경우 상기 투여 또는 상기 요법을 위한 개체를 선택하는 단계;를 포함하는 방법을 제공한다. 방법은 전술한 임의의 위험 요소에 기초하여 개체를 추가로 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
투여에 적합한 물질 또는 조성물은 후술하였다. 적합한 치료 요법은 라이프 스타일, 식이 또는 운동에서의 변화를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 지단백질 입자 검출 방법 또는 위험을 진단 또는 결정하는 방법에 사용하기에 적합한 키트 제공 수단(kit providing means)을 더 제공할 수 있다. 키트는 간섭 산란계 현미경에 의한 지단백질 입자 검출에 적합한 성분을 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 방법에 따라 키트의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 하나 이상의 지단백질 입자의 대조군 수준 크기 및 개수를 제공할 수 있고, 하나 이상의 지단백질 입자의 단일 입자 대조군 막대그래프를 제공할 수 있다. 키트는 또한 방법이 수행될 수 있는 개체에 관한 세부 사항을 포함할 수 있다. 키트는 커버슬립 및 개스킷 과 같은 샘플 챔버의 하나 이상의 구성요소, 플로우 셀, 미세 유체 장치 또는 모세관 칩과 같은 칩을 포함할 수 있다. 키트는 개체로부터 샘플(일반적으로 혈액 샘플)을 얻는 수단, 예를 들어 체액 장치, 또는 바늘을 포함하는 임의의 기구를 포함할 수 있다. 키트는 본 발명에 따른 지단백질 입자 측정의 교정을 제공하는, 하나 이상의 표준 지단백질 샘플 (본 명세서에 기재된 바와 같은 나노 디스크)을 포함할 수 있다. 키트는 다른 실험 또는 임상 파라미터를 측정하기 위한 수단을 추가로 포함 할 수 있다. 이 키트를 사용하는 절차는 임상 실험실, 실험 실험실, 의료 전문가 또는 개인이 수행 할 수 있다. 본 발명은 또한 지단백질 수의 크기 및 / 또는 수와 관련된 질병 또는 상태의 위험을 진단 또는 결정하기 위한 시험 키트의 제조에서, 간섭계 산란 현미경 법에 의한 지단백질의 검출에 적합한 구성요소의 용도를 제공한다. 구성 요소는 전술 한 바와 같이 샘플 챔버의 구성 요소일 수 있다. 시험 키트는 전술한 바와 같은 설명서, 수단 또는 표준 샘플을 포함 할 수 있다.
치료 방법 및 의료 용도
본 발명은 개체에서 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법으로, 상술한 방법에 의해 상기 개체에서 상기 질병 또는 상태의 위험을 진단 또는 결정하는 단계 또는 상기 개체를 선택하는 단계, 및 개체에 물질 또는 조성물을 투여하는 단계, 또는 개체에서 상기 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하기에 효과적인 요법을 수행하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 개체에서 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 물질 또는 조성물로서, 상술한 본 발명의 방법에 의하여 선택되거나, 진단되거나, 위험에 따라 결정되는 것을 특징으로 하는 물질 또는 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 개체에서 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수와 관련된 질병 또는 상태의 예방을 위한 의약 제조에서 물질 또는 조성물의 용도로서, 상기 개체는 상술한 본 발명의 방법에 의하여 선택되거나, 진단되거나 또는 위험에 따라 결정되는 것을 특징으로 하는 용도를 제공한다.
개체는 상술된 임의의 개체, 바람직하게는 인간일 수 있다. 개체는 상술된 임의의 질병 또는 상태를 가질 위험이 있고, 상술된 임의의 위험 요소를 가질 수 있다. 바람직하게는, 개체는 심혈관 질병을 갖거나 가질 위험이 있으며, 이는 상술된 임의의 심혈관 질병일 수 있다.
물질 또는 조성물은 상기 질병의 예방 또는 치료에 효과적인 양으로 투여된다. 요법 (예: 생활 양식, 식이 요법 또는 운동에서의 변화)은 일반적으로 상기 질병의 예방 또는 치료에 효과적인 기간 동안 수행된다. 적합한 요법은 체중 감량, 흡연 또는 알코올 섭취 감소 또는 중단, 운동 증가 및/ 또는 건강한 식이를 포함 할 수 있다. 요법은 또한 관상 동맥 혈관 성형술 또는 관상 동맥 우회술과 같은 수술을 포함할 수 있다. 수술은 스텐트(stent)의 도입을 포함 할 수 있다. 질병의 예방 또는 치료는 질병의 발병의 예방 또는 지연, 또는 질병의 하나 이상의 증상의 감소 또는 제거에 의해 결정될 수 있다. 예방 또는 치료는 질병 또는 상태를 완화시키거나 완화를 유도하고, 또는 질병 또는 상태의 재발을 지연시킬 수 있다. 유효한 양의 투여 또는 효과적인 요법의 수행은 투여 또는 요법에 따른 개체로부터 얻은 샘플에서 정상 지단백질 입자의 개수, 크기 또는 비율(또는, 정상 지단백질 개수, 크기, 비율로의 이동)의 측정에 의해 결정될 수 있다.
물질 또는 조성물은 임의의 수단에 의해 지단백질 입자의 크기 및 / 또는 수와 관련된 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 적합한 임의의 물질 또는 조성물일 수 있다. 물질 또는 조성물은 LDL 농도를 감소 시키거나 LDL의 크기를 감소시킬 수 있다. 물질 또는 조성물은 HDL 농도를 증가시킬 수 있다. 물질 또는 조성물은 총 혈중 콜레스테롤 수준 또는 총 LDL 혈중 콜레스테롤 수준을 포함하여, 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다. 물질 또는 조성물은 혈압을 감소 시키거나 동맥을 넓힐 수 있다. 제제는 혈관 확장제일 수 있다. 물질 또는 조성물은 심혈관 질병의 예방 또는 치료 또는 혈압 감소를 위한 임의의 공지 된 제제를 포함 할 수 있다. 제제는 스타틴(Statin) 일 수 있다. 스타틴 (HMG-CoA 환원 효소 억제제라고도 함)은 혈액 내 LDL 콜레스테롤 수치를 낮추고 심혈관 질병과 사망률을 낮추는 것으로 알려져 있다. 제제는 베타-차단제, 질산염, ACE (안지오텐신-전환 효소) 또는 안지오텐신 수용체 II 억제제, 칼슘 채널 차단제 또는 이뇨제일 수 있다.
물질 또는 조성물은 소분자 억제제, 펩타이드, 단백질, 항체, 폴리 뉴클레오티드, 올리고 뉴클레오티드, 안티센스 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)일 수 있다.
핵산과 같은 폴리 뉴클레오티드는 2 개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 중합체이다. 뉴클레오티드는 자연적으로 발생하거나 인공적 일 수 있다. 뉴클레오티드는 전형적으로 핵 염기, 당 및 하나 이상의 연결기(linking group), 예컨대 포스페이트, 2'O- 메틸, 2 '메톡시-에틸, 포스포르 아미데이트, 메틸 포스포 네이트 또는 포스포로티오에이트를 함유한다. 핵 염기는 일반적으로 헤테로고리이다. 핵 염기는 퓨린 및 피리미딘, 보다 구체적으로는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 우라실 (U) 및 시토신 (C)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 당은 일반적으로 5탄당이다. 뉴클레오티드 당은 리보스 및 디옥시리보스를 포함 하나, 이에 제한되지는 않는다. 뉴클레오티드는 임의의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드, 일반적으로 리보 뉴클레오티드 또는 디옥시리보 뉴클레오티드 또는 이의 변형된 버전 일 수 있다. 뉴클레오티드는 일반적으로 모노 포스페이트, 디 포스페이트 또는 트리 포스페이트를 함유한다. 인산염은 뉴클레오티드의 5 '또는 3'쪽에 부착 될 수 있다. 폴리 뉴클레오티드는 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보 핵산 (RNA) 일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당 업계에 공지 된 임의의 합성 핵산, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 잠금 핵산 (LNA), 몰폴리노 핵산 또는 다른 합성 중합체일 수 있다. 뉴클레오티드 곁사슬로. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 적합한 발현 벡터로 클로닝 될 수 있다. 발현 벡터에서, 구조체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 일반적으로 숙주 세포에 의한 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 발현 벡터는 구조체를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 단백질 발현을 억제하기 위한 안티센스 및 RNA 간섭 (RNAi) 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 관심 있는 분자의 발현을 억제하기 위해 표준 방법이 사용될 수 있다. 안티센스 및 siRNA 기술 모두 mRNA를 간섭한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 한 부분에 결합(혼성화)하여 mRNA를 간섭한다. RNAi는 mRNA에 결합하여 단백질 발현을 억제할 수 있는 짧은 간섭 RNA (siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)와 같은 이중 가닥 RNA의 사용을 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 대해 우선적으로 또는 높은 친화력으로 혼성화하지만 실질적으로 혼성화하지는 않고, 다른 서열에 대해 낮은 친화력으로 혼성화하거나 혼성화되지 않을 때, 표적 서열에 "특이적으로 혼성화"된다. 혼성화를 허용하는 조건은 당 업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, Sambrook 외., 2001, Molecular Cloning : 실험실 매뉴얼, 제 3 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 및 분자 생물학의 현재 프로토콜, 제 2 장, Ausubel 외., Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1995)). 혼성화 조건은 당업계에 기재된 엄격한 조건일 수 있다.
항체는 임의의 표적 분자 (전형적으로 단백질)에 특이적으로 결합 할 수 있다. 표적 분자는 아포지단백질과 같은 지단백질 성분의 성분일 수 있다. 항체는 그 단백질에 대해 우선적으로 또는 높은 친화력으로 결합하지만 다른 단백질에 실질적으로 결합하지 않거나, 낮은 친화력으로 결합 할 때, 단백질에 "특이적으로 결합"한다. 예를 들어, 항체는 표적 분자가 그 표적에 대해 우선적으로 또는 높은 친화력으로 결합하지만 실질적으로 결합하지 않거나 다른 인간 단백질에 낮은 친화 도로 결합 할 때, 표적 분자를 "특이적으로 결합"한다.
항체가 1 x 10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하 또는 더 바람직하게는 5 x10-9 의 Kd로 결합하는 경우, 우선적 또는 높은 친화도로 결합한다. 10-9 M 이하 항체가 1 x 10-6 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-5 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-4 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-3 M 이상, 더욱 바람직하게는 1 x 10-2 M 이상의 Kd로 결합하는 경우 낮은 친화도로 결합한다.
항체는 예를 들어, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일 사슬 항체, 키메라 항체, 이중 특이적 항체, CDR-이식 항체(CDR grafted antibody) 또는 인간화 항체일 수 있다. 항체는 온전한 면역 글로불린 분자 또는 그의 단편, 예컨대 Fab, F (ab ') 2 또는 Fv 단편일 수 있다.
본원에 기재된 치료제의 특정 투여 경로, 투여량 및 투여 방법은 의사에 의해 결정될 수 있다.
본원에 기재된 치료 방법에 사용하기 위한 제제는 약제학적 조성물로 제제화 될 수 있다. 이들 조성물은 치료학적 활성 성분(들) 이외에, 제약상 허용되는 부형제, 담체, 희석제, 완충제, 안정제 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 물질을 포함 할 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안 된다. 약학적 담체 또는 희석제는 예를 들어, 등장액일 수 있다.
담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로 예를 들어, 경구, 정맥 내, 피부 또는 피하, 코, 근육 내 및 복강 내 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 적합한 조성물 및 투여 방법의 예는 Esseku and Adeyeye (2011) 및 Van den Mooter G. (2006)에 제공된다. 예를 들어, 고체 경구 형태는 활성 물질과 함께 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 사카로오스, 셀룰로오스, 옥수수 전분 또는 감자 전분); 윤활제 (예 : 실리카, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 또는 스테아르산 칼슘 및 / 또는 폴리에틸렌 글리콜); 결합제(예: 전분, 아라비아 검, 젤라틴, 메틸 셀룰로오스, 카르복시 메틸 셀룰로오스 또는 폴리비닐 피롤리 돈); 분해제 (예: 전분, 알긴산, 알기네이트 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 발포 혼합물; 물감; 감미료; 습윤제(예: 레시틴, 폴리소르베이트, 라우릴설페이트); 및 일반적으로 제약 제제에 사용되는 무독성 및 약리학적 불활성 물질을 함유할 수 있다. 이러한 약제학적 제제는 공지된 방식으로, 예를 들어, 혼합, 과립화, 정제화, 당-코팅 또는 필름-코팅 공정에 의해 제조될 수 있다.
경구 제형은 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르 산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등과 같은 통상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방형 제제 또는 분말의 형태를 취하며, 10 % 내지 95 %의 활성 성분, 바람직하게는 25 % 내지 70 %를 함유한다. 약학 조성물이 동결 건조 된 경우, 동결 건조된 물질은 투여 전에 재구성 예를 들어, 서스펜션(suspension) 될 수 있다. 재구성은 바람직하게는 완충액에서 수행된다.
개체에게 경구 투여하기 위한 캡슐, 정제 및 환제가 유드라지 "S", 유 드라지 "L", 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로스를 포함하는 장용성 코팅되어 제공될 수 있다.
경구 투여용 액체 분산액은 시럽, 에멀젼, 또는 현탁액일 수 있다. 시럽은 담체로서, 예를 들어, 글리세린 및/또는 만니톨 및/또는 소르비톨을 포함한 사카로오스 또는 사카로오스 일 수 있다.
현탁제 및 에멀젼은 담체로서, 예를 들어 천연 검, 한천, 알긴산 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로오스, 카르복시 메틸 셀룰로오스 또는 폴리비닐 알코올을 함유할 수 있다. 근육 내 주사용 현탁액 또는 용액은 활성 물질과 함께 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 멸균수, 올리브 오일, 에틸 올레에이트, 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 및 필요한 경우 적합한 양의 리도카인 히드로 클로라이드를 함유할 수 있다.
정맥 내 투여 또는 주입용 용액은 담체로서, 예를 들어, 멸균수를 함유할 수 있거나 또는 바람직하게 이들은 멸균성, 수성, 등장성 식염수 용액의 형태일 수 있다.
좌제의 경우, 전통적인 결합제 및 담체는 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함할 수 있다. 이러한 좌제는 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 2% 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
용량은 다양한 파라미터, 특히 사용되는 물질; 치료될 개체의 연령, 체중 및 상태; 투여 경로; 그리고 필요한 요법 에 따라 결정될 수 있다. 의사는 특정 개체에게 필요한 투여 경로 및 투여량을 결정할 수 있다. 일반적인 일일 투여량은 상기 언급된 조건에 따라 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 50 mg이다. 용량은 단일 용량으로 제공되거나, 또는 다중 용량으로, 예를 들어 규칙적 시간 간격, 예를 들어 2,3, 또는 4 용량으로 시간 별로 투여되도록 제공될 수 있다.
위에서 언급한 기술과 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins에서 확인할 수 있다.
상기 방법 또는 의학적 용도에 사용되는 물질 또는 조성물은 단독으로 또는 다른 치료 물질, 조성물 또는 치료제, 예를 들어 보조 요법과 함께 투여될 수 있다. 다른 치료 물질, 조성물 또는 치료제는 본 발명의 물질 또는 조성물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
실시예
실시예 1 - iSCAT을 사용한 정제된 지단백질 입자의 검출
재료/방법
기판의 준비 및 측정
붕규산 유리 커버슬립(No 1.5, 24 x 50 mm, VWR)을 MilliQ water, 이어서 에탄올, 다시 MilliQ water 순으로 순차적 헹구어 세척하였다. 이어서, 건조 질소 스트림 하에서 건조시켰다. CultureWell 실리콘 개스킷(Grace Bio-Labs)을 절단하고 동일한 기판에 4개의 독립적인 30-50 μl 샘플 챔버를 제공하는 갓 세척한 커버슬립에 놓았다.
정제된 HDL 및 LDL 샘플은, 예를 들어 https://www.leebio.com/product/984/low-density-지단백질-ldl-human-혈청-360-10에 기술된 바와 같이 Lee Biosystems (LDL cat # 360-10; HDL cat # 361-10)로부터 입수하였다. HDL 및 LDL을 초원심분리에 의해 분리하였다. 샘플을 각각 500,000 배 및 55,000 배 희석시켰다.
이어서, 지단백질의 유리 기판에 대한 비특이적 결합을 이미지화하고 기록하면서 iSCAT을 이용하여 데이터 획득 및 분석을 수행 하였다. 실험 설정은 도 4에 Cole 외에 의해 기술된 것과 동일하다. 이미지는 30 초에 걸쳐 (초당 100프레임) 획득되었고 픽셀 크기가 23.4nm 인 512x512 픽셀로 구성되었다. 이미지를 저장하기 전에 3x3로 픽셀-바이닝하여 70.2 nm의 최종 픽셀 크기를 제공하였다.
Cole 등의 문헌에 기술된 바와 같이, 원시 영상으로부터 비율 측정 이미지 스택이 생성되었다. 유리 표면 위에 입자는 포인트 스프레드 기능의 2D 가우스 피팅(Guassian fitting)을 기반으로 한 자동 스팟 감지 루틴에 의해 비율 측정 이미지에서 측정되었다.
결과는 도 4에 도시하였고, iSCAT에 의해 검출한 HDL 및 LDL 이미지와 전체 이미지에서 얻은 해당 막대그래프를 제공하였다.
실시예 2 - iSCAT 에 의한 혈장 및 혈청에서 정제된 지단백질 입자의 검출
인간 개체로부터 수득한 혈청 및 혈액 샘플에 대해 실시예 1에 기재된 바와 같은 iSCAT 방법을 수행 하였다. 혈청을 얻기 위해, 원심 분리(30 분, 1500 x g) 전에 혈액을 적어도 30 분 동안 수직 위치에서 응고시켰다. 혈청을 플라스틱 스크류 캡 바이알(plastic screw-cap vial)로 옮겼다. 혈액 및 혈청 샘플을 다음과 같이 제조하였다: 1 ㎕의 채혈 혈액(finger prick blood) 또는 혈청 샘플을 5 mM EDTA를 함유하는(응집 방지 위해)(하기 참조) HEPES / KCl 완충액으로 2000배 희석시켰다. 희석된 샘플 10 ㎕를 100 mM KCl을 함유하는 40 ㎕의 25 mM HEPES 완충액(pH 7.4)에 첨가하여 혈액을 최종적으로 10,000 배 희석하였다.
도 5는 혈장 샘플에서 HDL 및 LDL의 검출을 나타낸다. 이미징 혈장 샘플은 HDL 및 LDL에 상응하는 두 신호를 동시에 나타내었다. 예상대로, HDL은 LDL보다 빈번하였다(막대그래프 참조).
도 6a 및 도 6b는 전체 혈액에서 HDL 및 LDL의 검출을 나타내며, 도 5와 유사한 결과를 나타낸다. "공복 샘플" 및 식사 후 얻은 샘플을 모두 사용하였다. 공복/ 비 공복 조건의 차이는 더 높은 iSCAT 신호 체계(삽입물)에서 확인할 수 있었는데, 이는 VLDL과 같은 더 큰 지단백질에 해당한다. 예상대로 이들은 식사 후 샘플에서 나타났다. 앞에서 논의한 바와 같이, VLDL 부분의 존재는 환자가 표준 콜레스테롤 검사 전에 금식 해야 하는 주된 이유다. VLDL에는 콜레스테롤이 포함되어 있지만 주로 트리글리세리드(TG)가 있으며 TG 수치가 너무 높으면 표준 (Friedewald) 방법을 사용할 수 없다. 반면 본 발명에 따르면, 지단백질 (HDL, LDL 및 VLDL 포함)의 검출은 샘플을 제공하는 개체의 단식 요구없이 가능하다.
실시예3 -HDL 및 LDL 농도를 계산하기 위한 교정(calibration)
실시예 2의 혈액에서 HDL 및 LDL의 질량 /농도를 계산하기 위해, 본 발명자들은 공지된 질량 /농도의 단백질이 측정되어 분자량과 iSCAT 콘트라스트 사이의 선형 관계를 제공하는 교정 곡선을 수립하였다.
농도 교정을 위해, 공지된 농도의 MSP1D1 DMPC 지질 나노 디스크를 사용하였다. 나노 디스크는 2개의 양쪽 친매성 단백질에 의해 스크린 된 소수성 에지를 갖는 인지질의 지질 이중층으로 구성된 합성 모델 막 시스템이다. 이러한 단백질을 막 스캐폴딩 단백질 (MSP)이라고 하며 이중 벨트 모양으로 정렬한다. 나노 디스크 샘플을 nM 범위로 희석하고 완충액에 첨가 하였다. 유리에 대한 나노 디스크의 비특이적 결합은 iSCAT를 사용하여 기록되었으며, 결과는 도 7에 도시하였다. 용액 중의 입자 수와 결합을 위한 접근 가능한 부위의 수가 감소함에 따라 결합 빈도는 감소하였다(왼쪽에 표시됨: 4가지 다른 농도에 대한 시간의 함수로서의 결합이벤트 수). 지수적 감쇠를 적용하고 샘플이 추가된 시점(t = 0)으로 초기 결합 속도를 추정하였다.
그 다음, 초기 결합 속도를 농도의 함수로 플로팅 하였다(오른쪽 도면). 선형 피팅의 기울기는 변환 계수이며, 다음 관계를 사용하여 샘플의 절대 농도를 결정할 수 있다.
[샘플 농도] = [측정된 초기 속도] / [변환 계수] x [샘플 희석]
이 교정 곡선을 사용하여, 예비 실험에서 전체 혈액 샘플로부터 HDL 및 LDL 지단백질의 농도를 계산하였고, 이는 예상 값과 상관 관계가 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4 - 액틴 용액의 농도 측정
실시예에 대한 농도를 계산하기 위해 수행된 일반적인 단계:
1. 부피에 대해 높은 표면적을 갖는 샘플 홀더에 샘플을 추가하였다.
2. 그림 7에 도시된 바와 같이, 샘플을 적용한 후 시간을 일정하게 잘 제어하여 지연하며 개별 결합 이벤트 기록을 시작하였다.
3. 샘플을 첨가 한 후 시간의 함수로서 결합 빈도를 계산하였다.
4. 관측된 결합 빈도의 감쇠를 시간의 함수로서 단일 지수 감쇠 함수로 피팅하였다.
5. 샘플의 첨가시 결합 빈도를 결정하기 위해 시간= 0 일때의 교점(intercept)을 추출하였다.
6. 샘플 농도에 따라 절차를 반복하였다.
7. 관측된 초기 결합 빈도 대 샘플 농도를 피팅하여 선형 상관 관계를 얻었다.
일단 상관관계가 확립되면, 주어진 샘플에 대해, 단계 1-5를 반복하고 단계 7의 관계로부터 샘플 농도로 변환될 수 있는 초기 결합 빈도를 설정함으로써, 그 농도를 측정할 수 있다.
선형 피팅의 기울기는 변환 계수이며, 다음 관계를 사용하여 샘플의 절대 농도를 결정할 수 있다.
[샘플 농도] = [측정된 초기 속도] / [변환 계수] x [샘플 희석]
액틴의 낙하 희석 방법(drop dilution)에 대한 프로토콜:
·
APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane)가 코팅된 커버 슬립을 준비하였다. (이 커버슬립은 액틴에 특정하고, 다른 단백질은 간단하고, 처리되지 않은 깨끗한 유리를 사용한다.)
·
깨끗한 메스로 3mm 직경의 PDMS 개스킷 (Grarace Bio-Labs GBL103250, Sigma Aldrich를 통해 제공됨)에 2x2 구멍을 잘라냈다.
·
milliQ(MQ) 물, 이소프로판올, MQ 물, 이소프로판올, MQ물로 가스켓을 순차로 헹구고, 질소 스트림 하에 건조하였다.
·
APTES 코팅 커버 슬립의 중앙에 개스킷을 부착하였다(PDMS를 이와 부착되기 충분한 유리 표면과 접촉함).
·
APTES 커버슬립의 개스킷 중 하나에 37ul의 F- 액틴 완충액을 드롭하여 추가하고 완충액으로 채워진 개스킷에서 유리 표면에 초점 위치를 조정하였다.
·
액틴 (필라멘트로 중합되는 42 kDa 단백질)의 11.4 uM 저장용액(stock solution)을 G- 액틴 완충액에서 333.33 nM로 희석하였다.
·
333.33 nM 액틴 스톡 용액 90 ul과 10배 농축된 F- 액틴 완충액을 혼합하여(중합 시작을 의미, 액틴 실험에 특화됨) -> 300 nM 최종 액틴 농도를 얻었다.
·
15 분의 중합 후, 피펫으로 300 nM 액틴 용액에서 3ul 분취량을 빼내어 피펫의 끝 부분에 작은 액적을 만든 다음, 액틴 액적을 개스킷의 완충 액적과 융합시켰다.
·
1분 동안 섭동이 사라진 후 즉시 랜딩 분자 기록을 시작하였다.
이 방법은 샘플을 희석하고, 영상을 기록하는 시간에 비해 올리고머화 평형이 천천히 변화하는 시스템에 적합하다.
완충액
G- 액틴 완충액
2 mM 트리스 (하이드록시 메틸) 아미노 메탄 (Tris 염기)
0.2 mM CaCl2
0.2 mM 아데노신 트리 포스페이트 (ATP)
2mM 디티오트레이톨 (DTT)
HCl을 사용하여 pH 8.0으로 조정
F- 액틴 완충액
10 mM 4- (2- 하이드록시 에틸) -1- 피페라진 에탄설폰산 (HEPES)
100 mM KCl
2 mM MgCl2
1 mM 에틸렌 글리콜-비스 (β- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N ', N'- 테트라 아세트산(EGTA)
KOH로 pH 7.5로 조정
결과는 도 8a 및 8b에 도시하였다. 도8a 는 상술한 희석 방법에 따른, 개스켓(gasket)에서 300 Nm 액틴(actin)의 랜딩 영상의 예시적인 프레임이며, 1 kHz의 프레임 속도, 유효 프레임 속도: 25 Hz로 기록한 것을 도시하였다. 도8b는 유사한 조건 하에서 유동 챔버에서 300 nM 액틴의 랜딩 영상의 예시적인 프레임으로, 1 kHz의 프레임 속도, 유효 프레임 속도: 25 Hz로 기록한 것을 도시한 것이다.
실험을 4회 반복하였고, 축적된 질량 막대그래프를 도 9에 도시하였다.
Claims (27)
- 용액을 표면과 접촉시키는 단계; 및 광 산란을 이용하여 표면에 대한 입자의 결합을 검출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 용액 중의 입자의 농도 측정방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 표면은 부동태화, 활성화, 코팅, 처리 또는 유도체화 되는 것을 특징으로 하는 용액 중의 입자의 농도 측정방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
표면에 대한 상기 입자의 결합을 검출하는 단계를 하나 이상의 시간 간격 후에 반복하는 것을 특징으로 하는 용액 중의 입자의 농도 측정방법.
- 제 3항에 있어서,
반복 측정이 표면에 대한 입자의 초기 결합 속도의 계산을 허용하는 것을 특징으로 하는 용액 중의 입자의 농도 측정방법.
- 제 4항에 있어서,
입자의 초기 결합 속도를 입자의 공지된 농도에 대한 초기 결합 속도와 비교하는 것을 특징으로 하는 용액 중의 입자의 농도 측정방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 측정은 일정한 입자의 결합 속도(constant binding rate)의 계산을 허용하고, 선택적으로 입자의 공지된 농도의 일정한 결합 속도와 비교하는 것을 특징으로 하는 용액 중의 입자의 농도 측정방법.
- 제 1항에 있어서,
i) 용액을 표면과 접촉시키는 단계;
ii) 광 산란에 의해 가시화된 표면에 결합하는 입자를 검출하는 단계;
iii) 검출 단계를 반복하고 표면에 대한 입자의 시간에 따른 결합 속도 및/ 또는 초기 결합 속도의 변화를 계산하는 단계;
iv) 공지된 입자 농도를 갖는 용액으로부터의 데이터에 기초하여 농도에 대한 초기 결합 속도의 교정 곡선을 제공하는 단계; 및
v) 단계 (iv)의 교정 곡선을 이용하여 단계 (iii)에서의 샘플에 대해 기록된 초기 결합 속도를 용액 중 입자의 농도로 변환하는 단계;
를 포함하는 용액 중 입자의 농도 측정방법.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
농도는 절대 농도인 것을 특징으로 하는 용액 중 입자의 농도 측정방법.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 입자는 또한 측정 용액과 접촉되는 것을 특징으로 하는 용액 중 입자의 농도 측정방법.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 용액은 캘리브란트(calibrant)의 존재 하에 상기 표면과 접촉하고 상기 캘리브란트의 상기 표면에 대한 결합은 광 산란을 사용하여 검출되는 것인 방법.
- 광 산란, 선택적으로 간섭계 산란 현미경에 의해 입자를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플에서 지단백질 입자를 검출하는 방법.
- 제 11항에 있어서,
상기 검출 단계는 상기 입자의 크기 및/ 또는 개수를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플에서 지단백질 입자를 검출하는 방법.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서,
상기 샘플에서 하나 이상의 상이한 유형의 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수를 검출하고, 선택적으로 상기 샘플에서 상이한 유형의 지단백질 입자의 비율을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 샘플에서 지단백질 입자를 검출하는 방법.
- 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
고밀도 지단백질(HDL) 입자 및/ 또는 저밀도 지단백질(LDL) 입자를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플에서 지단백질 입자를 검출하는 방법.
- 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플에서 HDL입자에 대한 LDL 입자의 비율을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플에서 지단백질 입자를 검출하는 방법.
- 광 산란, 선택적으로 간섭계 산란 현미경에 의해 개체로부터 얻은 샘플에서 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수를 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 진단하거나, 상기 개체가 질병 또는 상태가 발생할 위험을 결정하는 방법.
- 제 16항에 있어서,
상기 샘플에서 하나 이상의 상이한 유형의 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수, 또는 상이한 유형의 지단백질 입자의 비율을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16항 또는 제 17항에 있어서,
상기 샘플에서 고밀도 지단백질(HDL) 입자 및/또는 저밀도 지단백질(LDL) 입자를 검출하는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 샘플에서 HDL입자에 대한 LDL 입자의 비율을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17항 또는 제 18항에 있어서,
대조군 샘플 또는 기준 샘플/수준과 비교하여, HDL 입자 수의 감소는 개체가 상기 질병 또는 상태가 발생할 위험이 증가된 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17항 또는 제 18항에 있어서,
대조군 샘플 또는 기준 샘플/수준과 비교하여 LDL 입자 수의 증가는 개체가 상기 질병 또는 상태를 갖거나 발생할 위험이 증가한 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 질병은 심혈관 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 용액 또는 샘플이 선택적으로 인간 개체로부터 수득된 생물학적 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항에 있어서,
상기 생물학적 샘플은 선택적으로 인간 개체로부터 수득된 피, 혈장, 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
- 물질 또는 조성물이 투여되거나 요법이 처방될 개체를 선택하는 방법으로서, 상기 물질, 조성물 또는 요법은 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하는데 적합하고, 제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 상기 개체로부터 얻은 샘플의 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수를 검출하는 단계; 및 검출된 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수가 상기 질병 또는 상태, 또는 그로 인한 위험을 나타내는 경우 상기 투여 또는 상기 요법을 위한 개체를 선택하는 단계;를 포함하는 방법.
- 개체에서 지단백질 입자의 크기 및/또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법으로, 제 16항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 상기 개체에서 상기 질병 또는 상태의 위험을 진단 또는 결정하는 단계 또는 상기 개체를 선택하는 단계, 및 개체에 물질 또는 조성물을 투여하는 단계, 또는 개체에서 상기 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하기에 효과적인 요법을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
- 개체에서 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수와 관련된 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 물질 또는 조성물로서, 제 16항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 선택되거나, 진단되거나, 위험에 따라 결정되는 것을 특징으로 하는 물질 또는 조성물.
- 개체에서 지단백질 입자의 크기 및/ 또는 개수와 관련된 질병 또는 상태의 예방을 위한 의약 제조에 있어서 물질 또는 조성물의 용도로, 상기 개체는 제 16항 내지 23항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 선택되거나, 진단되거나 또는 위험에 따라 결정되는 것을 특징으로 하는 용도.
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