BR112020008404A2

BR112020008404A2 - nanopartículas lipídicas para a entrega de rna modificado codificando um polipeptídeo vegf-a

Info

Publication number: BR112020008404A2
Application number: BR112020008404-2A
Authority: BR
Inventors: Kenny Mikael Hansson; Kerry Benenato; Maria Wagberg; Annika Palsson; Regina Fritsche-Danielson
Original assignee: Modernatx, Inc.
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-11-03
Also published as: US11696892B2; KR20200081420A; HRP20220843T1; IL274230B1; CA3080592A1; IL274230B2; JP7308000B2; MA50522A; PT3703658T; CN111356444A; IL274230A; PL3703658T3; MA50522B1; DK3703658T3; JP2021508434A; EP3703658A1; EP3703658B1; SI3703658T1; US20200338004A1; SG11202003941XA

Abstract

A presente invenção refere-se a nanopartículas compreendendo um componente lipídico e um RNA modificado codificando um polipeptídeo VEGF-A. Aspectos da descrição referem-se ainda a usos de nanopartículas compreendendo um componente lipídico e um RNA modificado codificando um polipeptídeo VEGF-A para melhorar a cicatrização de feridas em um sujeito.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para “NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS PARA A ENTREGA DE RNA MODIFICADO CODIFICANDO UM POLIPEPTÍDEO VEGF-A”.

1. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos EUA N.º 62/579,671, registrado em 31 de outubro, 2017, cujos conteúdo completo é no presente documento incorporado por referência.

2. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e que é deste modo incorporada por referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, cri- ada a 31 de outubro de 2018, é denominada 09963_0092-00304_SL.txt e tem 11 396 bytes de tamanho.

3. CAMPO

[0003] A presente invenção refere-se a nanopartículas compreen- dendo um componente lipídico e um RNA modificado codificando um polipeptídeo VEGF-A. Aspectos da descrição referem-se ainda a usos de nanopartículas compreendendo um componente lipídico e um RNA modificado codificando um polipeptídeo VEGF-A para melhorar a cica- trização de feridas em um sujeito.

4. ANTECEDENTES

[0004] As vias do fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF- A) desempenham um papel central no processo de cicatrização de feri- das, incluindo a revascularização de tecidos danificados, melhorando a permeabilidade vascular e a formação de novos vasos sanguíneos (an- giogênese). Ainda é um desafio a entrega de agentes para aumentar as vias de VEGF-A para possíveis efeitos terapêuticos, tal como melho- rar a cicatrização de feridas em um sujeito.

[0005] Tem sido tentado um número diverso de métodos para per- mitir abordagens clinicamente tratáveis para aumentar as proteínas

VEGF-A em tecidos alvo. No entanto, cada uma das abordagens apre- senta desvantagens significativas. Por exemplo, a entrega de proteína sistêmica de VEGF-A pode resultar em hipotensão significativa e o VEGF-A é rapidamente degradado. Plasmídeos virais de DNA de VEGF-A encapsulados ou nus têm limitado o controle temporal da ex- pressão proteica e a eficiência da expressão in vivo pode ser altamente variável e não dependente da dose. Como resultado, essas limitações restringiram a aplicabilidade de aumentar os níveis de VEGF-A como agente terapêutico.

[0006] Outro desenvolvimento recente é o fornecimento de RNA te- rapêuticos codificando proteínas VEGF-A. No entanto, a entrega de RNA naturais às células pode ser desafiadora devido à instabilidade re- lativa e à baixa permeabilidade celular dessas moléculas de RNA. Além disso, os RNA naturais podem desencadear a ativação imune (ver, por exemplo, Kaczmarek et al., "Advances in the delivery of RNA therapeu- tics: from concept to clinical reality," Genome Med., 2017, 9: 60), que limitam seus usos para entregar proteínas VEGF-A a tecidos alvo.

[0007] Por conseguinte, permanece a necessidade de composições que permitam a entrega eficaz e segura de RNA codificando proteínas VEGF-A. Além disso, continua a haver necessidade de métodos alter- nativos para aumentar as vias de VEGF-A para efeitos terapêuticos po- tenciais, tal como melhorar a cicatrização de feridas em um sujeito.

5. SUMÁRIO

[0008] A presente invenção refere-se a nanopartículas compreen- dendo um componente lipídico e um RNA modificado codificando um polipeptídeo VEGF-A. Aspectos da descrição referem-se ainda a usos de nanopartículas compreendendo um componente lipídico e um RNA modificado codificando um polipeptídeo VEGF-A para melhorar a cica- trização de feridas em um sujeito.

[0009] Certas modalidades da presente descrição estão sumaria- das nos parágrafos que se seguem. Esta lista é apenas exemplificativa e não exaustiva de todas as modalidades fornecidas por esta descrição.

[0010] Modalidade 1. Uma nanopartícula compreendendo (i) um componente lipídico compreendendo um composto tendo a estru- tura (Composto A) e (ii) um RNA modificado compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 e 3-5, codificando um polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2.

[0011] Modalidade 2. A nanopartícula da modalidade 1, em que o componente lipídico compreende ainda um fosfolipídeo, um lipídeo estrutural e/ou um lipídeo PEG.

[0012] Modalidade 3. A nanopartícula da modalidade 2, em que o fosfolipídeo é selecionado do grupo consistindo em 1,2-distearoil-sn- glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil- sn-glicero-fosfocolina (DMPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diundeca- noil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fos- focolina (POPC), 1,2-di-O-octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Di- éter PC), 1-oleoil-2-colesteril-hemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC), 1-hexadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (C16 Liso PC), 1,2- dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fos- focolina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-difitanoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16,0 PE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dili- nolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanola- mina, sal de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) sódio

(DOPG), esfingomielina e suas misturas; o lipídeo estrutural é selecionado do grupo consistindo em colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brassicas- terol, tomatidina, ácido ursólico, alfa-tocoferol e suas misturas; e/ou o lipídeo PEG é selecionado do grupo consistindo em uma fosfatidileta- nolamina modificada com PEG, um ácido fosfatídico modificado com PEG, uma ceramida modificada com PEG, uma dialquilamina modifi- cada com PEG, um diacilglicerol modificado com PEG, um dialquilglice- rol modificado com PEG e suas misturas.

[0013] Modalidade 4. A nanopartícula da modalidade 1, em que o componente lipídico compreende ainda um fosfolipídeo que é DSPC, um lipídeo estrutural que é colesterol e/ou um lipídeo PEG que é PEG- DMG.

[0014] Modalidade 5. A nanopartícula de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, em que a razão N:P é de cerca de 2:1 a cerca de 30:1.

[0015] Modalidade 6. A nanopartícula de acordo com a modali- dade 5, em que a razão N:P é de cerca de 5,67:1.

[0016] Modalidade 7. A nanopartícula de acordo com a modali- dade 5, em que a razão N:P é de cerca de 3:1.

[0017] Modalidade 8. A nanopartícula de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, em que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modificado é de cerca de 10:1 a cerca de 100:1.

[0018] Modalidade 9. A nanopartícula da modalidade 8, em que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modificado é de cerca de 20:1.

[0019] Modalidade 10. A nanopartícula da modalidade 8, em que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modificado é de cerca de 10:1.

[0020] Modalidade 11. A nanopartícula de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, em que a nanopartícula tem um diâmetro médio de cerca de 50 nm a 100 nm.

[0021] Modalidade 12. Uma composição farmacêutica compre- endendo (a) pelo menos uma nanopartícula compreendendo (i) um componente lipídico compreendendo um composto com a estrutura (Composto A) e (ii) um RNA mo- dificado compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 e 3-5, codi- ficando um polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2; e b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0022] Modalidade 13. A composição farmacêutica da modali- dade 12, em que o componente lipídico compreende ainda um fosfolipí- deo, um lipídeo estrutural e/ou um lipídeo PEG.

[0023] Modalidade 14. A composição farmacêutica da modali- dade 13, em que o fosfolipídeo é selecionado do grupo consistindo em 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-fosfocolina (DMPC), 1,2-dioleoil-sn- glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diundecanoil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2- oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-di-O-octadecenil-sn-glicero- 3-fosfocolina (18:0 Diéter PC), 1-oleoil-2-colesteril-hemisuccinoil-sn-gli- cero-3-fosfocolina (OChemsPC), 1-hexadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (C16 Liso PC), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-diaraqui- donoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn-glicero-3- fosfocolina, 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16,0 PE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-

fosfoetanolamina, 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-di- araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina, sal de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1- glicerol) sódio (DOPG), esfingomielina e suas misturas; o lipídeo estrutural é selecionado do grupo consistindo em colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brassicas- terol, tomatidina, ácido ursólico, alfa-tocoferol e suas misturas; e/ou o lipídeo PEG é selecionado do grupo consistindo em uma fosfatidileta- nolamina modificada com PEG, um ácido fosfatídico modificado com PEG, uma ceramida modificada com PEG, uma dialquilamina modifi- cada com PEG, um diacilglicerol modificado com PEG, um dialquilglice- rol modificado com PEG e suas misturas.

[0024] Modalidade 15. A composição farmacêutica da modali- dade 12, em que o componente lipídico compreende ainda um fosfolipí- deo que é DSPC, um lipídeo estrutural que é colesterol e/ou um lipídeo PEG que é PEG-DMG.

[0025] Modalidade 16. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 12-15, em que a razão N:P é de cerca de 2:1 a cerca de 30:1.

[0026] Modalidade 17. A composição farmacêutica de acordo com a modalidade 16, em que a razão N:P é de cerca de 5,67:1.

[0027] Modalidade 18. A composição farmacêutica de acordo com a modalidade 16, em que a razão N:P é de cerca de 3:1.

[0028] Modalidade 19. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 12-18, em que a razão p/p do com- ponente lipídico para o RNA modificado é de cerca de 10:1 a cerca de 100:1.

[0029] Modalidade 20. A composição farmacêutica da modali- dade 19, em que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modi- ficado é de cerca de 20:1.

[0030] Modalidade 21. A composição farmacêutica da modali- dade 19, em que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modi- ficado é de cerca de 10:1.

[0031] Modalidade 22. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 12-21, em que a nanopartícula tem um diâmetro médio de cerca de 50 nm a 100 nm.

[0032] Modalidade 23. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 12-22, em que quando adminis- trada a um tecido de mamífero ou a um sujeito, a composição farma- cêutica resulta em uma concentração máxima observada no plasma e/ou tecido, Cmax, do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 até cerca de 450 pg/mL de plasma ou pg/mg de tecido.

[0033] Modalidade 24. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 12-22, em que, quando adminis- trada a um tecido de mamífero ou a um sujeito, a composição farma- cêutica resulta em uma área total de plasma e/ou tecido sob a curva de concentração, AUC0-t, do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 até cerca de 5,500 pg*h/mL de plasma ou pg*h/mg de tecido.

[0034] Modalidade 25. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 12-22, em que quando adminis- trada a um tecido de mamífero ou a um sujeito, a composição farma- cêutica resulta na produção de mais do que cerca de 400 pg/mg de te- cido do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 dentro de 8 horas.

[0035] Modalidade 26. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 12-22, em que quando adminis- trada a um tecido de mamífero ou a um sujeito, a composição farma- cêutica resulta na produção de mais do que cerca de 1 pg/mg de tecido do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 durante até 6 dias.

[0036] Modalidade 27. A composição farmacêutica da modali- dade 12, em que o excipiente farmaceuticamente aceitável é escolhido de um solvente, meios de dispersão, diluente, agente de dispersão, au- xiliar de suspensão, tensoativo, agente isotônico, agente espessante ou emulsionante, conservante, polímero, peptídeo, proteína, célula, hialu- ronidase e suas misturas.

[0037] Modalidade 28. Um método para promover e/ou melhorar a cicatrização de feridas em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz da nanopartícula de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11 ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 12-27.

[0038] Modalidade 29. O método da modalidade 28, em que o componente lipídico da nanopartícula compreende ainda um fosfolipí- deo, um lipídeo estrutural e um lipídeo PEG.

[0039] Modalidade 30. O método da modalidade 29, em que o fosfolipídeo é selecionado do grupo consistindo em 1,2-distearoil-sn-gli- cero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil- sn-glicero-fosfocolina (DMPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diundeca- noil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fos- focolina (POPC), 1,2-di-O-octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Di- éter PC), 1-oleoil-2-colesteril-hemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC), 1-hexadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (C16 Liso PC), 1,2- dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fos- focolina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-difitanoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16,0 PE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dili- nolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanola- mina, sal de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) sódio (DOPG), esfingomielina e suas misturas;

o lipídeo estrutural é selecionado do grupo consistindo em colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brassicas- terol, tomatidina, ácido ursólico, alfa-tocoferol e suas misturas; e/ou o lipídeo PEG é selecionado do grupo consistindo em uma fosfatidileta- nolamina modificada com PEG, um ácido fosfatídico modificado com PEG, uma ceramida modificada com PEG, uma dialquilamina modifi- cada com PEG, um diacilglicerol modificado com PEG, um dialquilglice- rol modificado com PEG e suas misturas.

[0040] Modalidade 31. O método da modalidade 28, em que o componente lipídico compreende ainda um fosfolipídeo que é DSPC, um lipídeo estrutural que é colesterol e/ou um lipídeo PEG que é PEG- DMG.

[0041] Modalidade 32. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-31, em que a razão N:P da nanopartícula é de cerca de 2:1 a cerca de 30:1.

[0042] Modalidade 33. O método de acordo com a modalidade 32, em que a razão N:P da nanopartícula é de cerca de 5,67:1.

[0043] Modalidade 34. O método de acordo com a modalidade 32, em que a razão N:P da nanopartícula é de cerca de 3:1.

[0044] Modalidade 35. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-34, em que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modificado é de cerca de 10:1 a cerca de 100:1.

[0045] Modalidade 36. O método da modalidade 35, em que a ra- zão p/p do componente lipídico para o RNA modificado é de cerca de 20:1.

[0046] Modalidade 37. O método da modalidade 35, em que a ra- zão p/p do componente lipídico para o RNA modificado é de cerca de 10:1.

[0047] Modalidade 38. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-37, em que a nanopartícula tem um diâmetro médio de cerca de 70 nm a cerca de 80 nm.

[0048] Modalidade 39. O método da modalidade 38, em que a na- nopartícula tem um diâmetro médio de cerca de 72 nm.

[0049] Modalidade 40. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-39, em que a administração resulta em uma con- centração máxima observada no plasma e/ou tecido, Cmax, do polipeptí- deo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 até cerca de 450 pg/mL de plasma ou pg/mg de tecido.

[0050] Modalidade 41. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-39, em que a administração resulta em uma área total de plasma e/ou tecido sob a curva de concentração, AUC0-t, do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 até cerca de 5,500 pg*h/mL de plasma ou pg*h/mg de tecido.

[0051] Modalidade 42. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-39, em que a administração resulta na produção de mais do que cerca de 400 pg/mg de tecido do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 dentro de 8 horas.

[0052] Modalidade 43. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-39, em que a administração resulta na produção de mais do que cerca de 1 pg/mg de tecido do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 durante até 6 dias.

[0053] Modalidade 44. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-39, em que a nanopartícula ou a composição far- macêutica é administrada por via intradérmica.

[0054] Modalidade 45. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-39, em que a concentração do RNA modificado é de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg.

[0055] Modalidade 46. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-39, em que a administração resulta em um au- mento da produção do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 por um fator de cerca de 5 a cerca de 100, quando comparado com uma admi- nistração do RNA modificado em um tampão salino de citrato.

[0056] Modalidade 47. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-39, em que o sujeito sofre de diabetes.

[0057] Modalidade 48. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 28-39, em que a ferida é uma ferida cirúrgica, uma queimadura, uma ferida abrasiva, um local de biópsia da pele, uma fe- rida crônica, uma lesão (por exemplo, uma ferida de lesão traumática), uma ferida de enxerto, uma ferida diabética, uma úlcera diabética (por exemplo, úlcera de pé diabético), uma úlcera por pressão, escaras e suas combinações.

[0058] Modalidade 49. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 28-39, em que a composição farmacêutica compre- ende um excipiente farmaceuticamente aceitável, preferencialmente um solvente, meios de dispersão, diluente, agente de dispersão, auxiliar de suspensão, tensoativo, agente isotônico, agente espessante ou emulsi- onante, conservante, polímero, peptídeo, proteína, célula, hialuronidase e suas misturas.

[0059] Modalidade 50. Um método para induzir neovasculariza- ção em um tecido de mamífero ou em um sujeito compreendendo admi- nistrar ao tecido de mamífero ou sujeito uma quantidade eficaz da na- nopartícula de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11 ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalida- des 12-27.

[0060] Modalidade 51. Um método para induzir angiogênese em um tecido de mamífero ou em um sujeito compreendendo administrar ao tecido de mamífero ou sujeito uma quantidade eficaz da nanopartí- cula de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11 ou a composi- ção farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 12-27.

[0061] Modalidade 52. Um método para aumentar a densidade capilar e/ou arteríola em um tecido de mamífero ou em um sujeito com- preendendo administrar ao tecido de mamífero ou sujeito uma quanti- dade eficaz da nanopartícula de acordo com qualquer uma das modali- dades 1-11 ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 12-27.

6. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0062] Os peritos na técnica compreenderão que as figuras, descri- tas abaixo, são apenas para fins ilustrativos. As figuras não se destinam de forma alguma a limitar o escopo dos presentes ensinamentos.

[0063] FIG. 1: FIG. 1 mostra o composto lipídico (composto A) usado nos exemplos.

[0064] FIG. 2A e 2B: Um diagrama da estrutura (FIG. 2A) de um construto de RNA VEGF-A modificado e a sequência (SEQ ID NO: 1, FIG. 2B) de um RNA modificado representativo de VEGF-A.

[0065] FIG. 3: Teor de proteína VEGF-A humana em biópsias de pele como uma função do tempo até 144 horas nosso após injeção in- tradérmica de 100 µg de RNA modificado de VEGF-A formulada em so- lução salina de citrato de (triângulos, linha a tracejado) e 3 µg de RNA modificado de VEGF-A formulado em nanopartículas lipídicas (LNP) (círculos, linha sólida), respectivamente. As linhas representam a medi- ana em cada ponto de tempo.

[0066] FIG. 4: Teor de proteína VEGF-A humana em biópsias de pele como uma função do tempo até 48 horas nosso após injeção intra- dérmica de 100 µg de RNA modificado de VEGF-A formulada em solu- ção salina de citrato de (triângulos, linha a tracejado) e 3 µg de RNA modificado de VEGF-A formulado em LNP (círculos, linha sólida), res- pectivamente. As linhas representam a mediana em cada ponto de tempo.

[0067] FIG. 5: Percentagem de cicatrização de feridas após injeção intradérmica das seguintes composições: (1) uma composição de nano- partículas lipídicas compreendendo 1 µg de RNA modificado de VEGF- A (n=6), (2) uma composição de nanopartículas lipídicas compreen- dendo 3 µg de RNA modificado de VEGF-A (n=6), (3) uma composição de nanopartículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA não traduzível de VEGF-A (n=6) e (4) uma composição salina de citrato compreen- dendo 100 µg de RNA modificado de VEGF-A (n=7).

[0068] FIG. 6: Percentagem de cicatrização de feridas após injeção intradérmica das seguintes composições: (1) uma composição de nano- partículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA modificado de VEGF- A (n=5), (2) uma composição de nanopartículas lipídicas compreen- dendo 3 µg de RNA modificado não traduzível de VEGF-A (n=5) e (3) uma composição salina de citrato que não compreende qualquer RNA modificado (n=5).

[0069] FIG. 7: Percentagem de cicatrização de feridas após injeção intradérmica das seguintes composições: (1) uma composição de nano- partículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA modificado de VEGF- A (n=6), (2) uma composição de nanopartículas lipídicas que não com- preende nenhum RNA modificado (n=5), (3) uma composição de nano- partículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA modificado de GFP (n=6) e (4) uma composição salina de citrato que não compreende ne- nhum RNA modificado (n=6).

[0070] FIG. 8: Percentagem de cicatrização de feridas após injeção intradérmica das seguintes composições: (1) uma composição de nano- partículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA modificado de VEGF- A não traduzível (n=7), (2) uma composição salina de citrato compreen- dendo 100 µg de RNA modificado de VEGF-A (n=7), (3) uma composi- ção salina de citrato compreendendo 100 µg de RNA modificado de VEGF-A não traduzível (n=7) e (4) uma composição salina de citrato que não compreende nenhum RNA modificado (n=7).

7. DESCRIÇÃO DETALHADA

[0071] Todas as referências referidas nesta descrição são no pre- sente documento incorporadas como referência na sua totalidade.

[0072] Muitas modificações e outras modalidades das divulgações no presente documento estabelecidas acorrerão à ideia de um perito na técnica à qual estas divulgações pertencem, tirando proveito dos ensi- namentos apresentados nas descrições acima expostas e desenhos as- sociados. Por conseguinte, deve se entender que as divulgações não são para se limitar às modalidades específicas descritas, e que se pre- tende incluir modificações e outras modalidades no escopo das reivin- dicações anexas. Embora no presente documento sejam aplicados ter- mos específicos, eles são usados num sentido genérico e descritivo apenas, e não com finalidade limitativa.

[0073] As unidades, prefixos e símbolos podem ser indicados na sua forma aceite no SI. Salvo indicação em contrário, os ácidos nuclei- cos são escritos da esquerda para a direita, na orientação 5' para 3'; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita, na orientação amino para carbóxi, respectivamente. Intervalos numéricos incluem os números que definem a gama. A enumeração de gamas de valores no presente documento pretende meramente servir como um método abreviado de fazer referência individualmente a cada valor se- parado que cai dentro da gama. Salvo indicação em contrário no pre- sente documento, cada valor individual é incorporado no relatório des- critivo como se ele no presente documento fosse individualmente enu- merado. Os aminoácidos podem ser referidos no presente documento pelos seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos sím- bolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomen- clature Commission.. Os nucleotídeos, do mesmo modo, podem ser re- feridos pelos seus códigos de uma letra comumente aceites.

7.1. Definições

[0074] Salvo definição específica em contrário, todos os termos téc- nicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo signifi- cado que o comumente entendido por um perito na técnica à qual esta descrição pertence. Salvo menção em contrário, as técnicas no pre- sente documento usadas ou contempladas são metodologias-padrão bem conhecidas de um perito na técnica. A prática da presente descri- ção usará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de mi- crobiologia, cultura de tecidos, biologia molecular, química, bioquímica e tecnologia de DNA recombinante, que se encontram dentro da capa- cidade da técnica. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilus- trativos e não limitativos. O que se segue é apresentado a título ilustra- tivo e não pretende limitar o escopo da descrição.

[0075] Em algumas modalidades, os parâmetros numéricos estabe- lecidos no relatório descritivo (no qual as reivindicações são incorpora- das na sua integralidade) são aproximações que podem variar depen- dendo das propriedades desejadas que se procura obter por uma mo- dalidade particular. Em algumas modalidades, os parâmetros numéricos devem ser interpretados à luz do número de dígitos significativos relata- dos e aplicando técnicas de arredondamento comuns. Não obstante os intervalos numéricos e os parâmetros que estabelecem o amplo escopo de algumas modalidades da presente descrição serem aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos específicos são rela- tados tão precisamente quanto o praticável. Os valores numéricos apre- sentados em algumas modalidades da presente descrição podem con- ter certos erros que resultam necessariamente do desvio-padrão encon- trado nas suas respectivas medições de teste. A enumeração de gamas de valores no presente documento pretende meramente servir como um método abreviado de fazer referência individualmente a cada valor se- parado que cai dentro da gama. Salvo indicação em contrário no pre-

sente documento, cada valor individual é incorporado no relatório des- critivo como se ele no presente documento fosse individualmente enu- merado.

[0076] Por uma questão de conveniência, certos termos usados em todo o pedido (incluindo o relatório descritivo, exemplos, e reivindica- ções anexas) são no presente documento compilados. A não ser que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente en- tendido por um perito na técnica à qual esta descrição pertence.

[0077] Em algumas modalidades, números que expressam quanti- dades de ingredientes, propriedades tais como peso molecular, condi- ções de reação e resultados e assim por diante, usados para descrever e reivindicar certas modalidades da presente descrição, devem ser en- tendidos como sendo modificados em alguns casos pelo termo "cerca de". Alguém versado na técnica entenderia o significado do termo "cerca de" no contexto do valor que ele qualifica. Em algumas modalidades, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui o desvio pa- drão da média para o dispositivo ou método que está sendo aplicado para determinar o valor. Em algumas modalidades, os parâmetros nu- méricos estabelecidos no relatório descritivo (no qual as reivindicações são incorporadas na sua integralidade) são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se procura obter por uma modalidade particular. Em algumas modalidades, os parâme- tros numéricos devem ser interpretados à luz do número de dígitos sig- nificativos relatados e aplicando técnicas de arredondamento comuns. Não obstante os intervalos numéricos e os parâmetros que estabelecem o amplo escopo de algumas modalidades da presente descrição serem aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos espe- cíficos são relatados tão precisamente quanto o praticável. Os valores numéricos apresentados em algumas modalidades da presente descri- ção podem conter certos erros que resultam necessariamente do des- vio-padrão encontrado nas suas respectivas medições de teste.

[0078] Como usado no presente documento, o termo "administra- ção" refere-se à colocação de uma nanopartícula e/ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma nanopartícula em um te- cido de mamífero ou em um sujeito por um método ou via que resulta em pelo menos uma localização parcial da nanopartícula e/ou composi- ção em um sítio ou localização de tecido desejado. Em algumas moda- lidades, as nanopartículas compreendendo um componente lipídico e um RNA modificado podem ser administradas por uma via intradérmica. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da proteína ex- pressa pelo RNA modificado está localizada em uma localização de te- cido alvo ou célula alvo desejado via administração intradérmica.

[0079] O termo "composição farmacêutica" refere-se a uma mistura que contém um componente terapeuticamente ativo e um transportador ou excipiente, tal como um transportador ou excipiente farmaceutica- mente aceitável que é convencional na técnica. Por exemplo, uma com- posição farmacêutica como no presente documento usada geralmente compreende pelo menos um componente lipídico, um RNA modificado de acordo com a descrição e um excipiente adequado.

[0080] O termo "composto" inclui todos os isótopos e isômeros da estrutura representada. "Isótopo" refere-se aos átomos que têm o mesmo número atômico, porém, números de massa diferentes que re- sultam de um número diferente de nêutrons nos núcleos. Por exemplo, os isótopos de hidrogênio incluem o trítio e o deutério. Adicionalmente, um composto, sal ou complexo da presente revelação pode ser prepa- rado em combinação com moléculas de solvente ou água para formar solvatos e hidratos através de métodos de rotina. "Isômero" significa qualquer isômero geométrico, tautômero, zwitterion, estereoisômero,

enantiômero ou diastereoisômero de um composto. Os compostos po- dem incluir um ou mais centros quirais e/ou ligações duplas e, portanto, podem existir como estereoisômeros, tais como isômeros de ligação du- pla ou diastereoisômeros. A presente descrição abrange todo e qual- quer isômero dos compostos no presente documento descritos, inclu- indo formas estereoisomericamente puras e misturas enantioméricas e estereoisoméricas, por exemplo, racematos. Misturas enantioméricas e estereoisoméricas de compostos e meios para resolvê-las nos seus componentes de enantiômeros ou estereoisômeros são bem conheci- das na técnica.

[0081] Os termos "compreendem", "têm" e "incluem" são verbos de ligação abertos. Quaisquer formas ou tempos de um ou mais destes verbos, tais como "compreende", "compreendendo", "tem", "tendo", "in- clui" e "incluindo", também são abertos. Por exemplo, qualquer método que "compreenda", "tenha" ou "inclua" uma ou mais etapas, não se li- mita a possuir apenas aquela uma ou mais etapas e pode também cobrir outras etapas não listadas. De forma similar, qualquer composição que "compreenda", "tenha" ou "inclua" uma ou mais características, não se limita a possuir apenas aquela uma ou mais características e pode cobrir outras características não listadas. O uso de qualquer e todos os exem- plos, ou linguagem exemplificativa (por exemplo "tal como"), fornecidos relativamente a certas modalidades no presente documento pretende meramente esclarecer melhor a presente descrição e não coloca uma limitação no escopo da presente descrição de outra forma reivindicada. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da presente descrição.

[0082] O termo "consistindo essencialmente em" permite a pre- sença de materiais ou etapas adicionais que "não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção.

[0083] O termo "consistindo em" refere-se a composições, métodos, e respectivos componentes dos mesmos tais como no presente docu- mento descritos, que são exclusivos de qualquer elemento não enume- rado nessa descrição da modalidade.

[0084] O termo "entregar" significa fornecer uma entidade a um des- tino. Por exemplo, entregar uma terapêutica a um sujeito pode envolver a administração de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma nanopartícula incluindo o RNA modificado ao sujeito (por exemplo, por uma via intradérmica). A administração de uma composi- ção farmacêutica compreendendo pelo menos uma nanopartícula ao te- cido de mamífero ou um sujeito pode envolver o contato de uma ou mais células com a composição farmacêutica.

[0085] Os termos "doença" ou "distúrbio" são no presente docu- mento usados indistintamente, e referem-se a qualquer alternação no estado do corpo ou de alguns dos órgãos, interrompendo ou pertur- bando o desempenho das funções e/ou provocando sintomas tais como desconforto, disfunção, angústia, ou mesmo morte à pessoa atingida ou aos que estão em contato com uma pessoa. Uma doença ou distúrbio também se pode referir a uma enfermidade, doente, incômodo, padeci- mento, moléstia, mal, queixa, indisposição, ou fraqueza.

[0086] O termo "quantidade eficaz", tal como no presente docu- mento usado, refere-se à quantidade de agente terapêutico (por exem- plo, um RNA modificado), composição farmacêutica suficiente para re- duzir pelo menos um ou mais sintoma(s) da doença ou distúrbio, ou para fornecer o efeito desejado. Por exemplo, pode ser a quantidade que in- duz uma redução terapeuticamente significativa em um sintoma ou mar- cador clínico associado à cicatrização de feridas.

[0087] Como usado no presente documento, "expressão" de uma sequência de ácidos nucleicos refere-se a um ou mais dentre os seguin-

tes eventos: (1) produção de um modelo de RNA a partir de uma se- quência de DNA (por exemplo, por transcrição); (2) processamento de um transcrito de RNA (por exemplo, por splicing, edição, formação de extremidade 5′ e/ou processamento de extremidade 3′); (3) tradução de um RNA em um polipeptídeo ou proteína; e (4) modificação pós-tradu- ção de um polipeptídeo ou proteína.

[0088] Como no presente documento usado, o termo "componente lipídico" é o componente de uma nanopartícula que inclui um ou mais lipídeos. Por exemplo, o componente lipídico pode incluir um ou mais lipídeos catiônicos/ionizáveis, PEGuilados, estruturais ou outros, tais como fosfolipídeos. Em uma modalidade, o componente lipídico com- preende o composto A (FIG. 1).

[0089] Tal como no presente documento usado, o termo "RNA mo- dificado" refere-se a moléculas de RNA contendo uma, duas, ou mais de duas modificações nucleosídicas em comparação com a adenosina (A) ((2R,3R,4S,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-5-(hidroximetil)oxolano- 3,4-diol), guanosina (G) (2-Amino-9-[3,4-di-hidroxi-5-(hidroximetil)oxo- lan-2-il]-3H-purin-6-ona), citidina (C) (4-amino-1-[3,4-di-hidroxi-5-(hidro- ximetil)tetra-hidrofuran-2-il]pirimidin-2-ona), e uridina (U) (1- [(3R,4S,5R)-3,4-di-hidroxi-5-(hidroximetil)oxolan-2-il]pirimidino-2,4-di- ona), ou em comparação com a AMP, GMP, CMP, e UMP, em molécu- las de RNA, ou uma sua porção. Exemplos não limitativos de modifica- ções nucleosídicas são fornecidos em outro sítio neste relatório descri- tivo. Quando a sequência nucleotídica de um RNA particular reivindi- cado é de outra forma idêntica à sequência de uma molécula e RNA que existe naturalmente, o RNA modificado é compreendido como sendo uma molécula de RNA com pelo menos uma modificação diferente das existentes no homólogo natural. A diferença pode ser na mudança quí- mica no nucleosídeo/nucleotídeo ou na posição dessa mudança na se- quência. Em uma modalidade, o RNA modificado é RNA mensageiro modificado (ou "mRNA modificado"). Em algumas modalidades, um RNA modificado inclui pelo menos um UMP que é modificado para for- mar N1-metil-pseudo-UMP. Em algumas modalidades, todos os UMP em um RNA modificado foram substituídos por N1-metil-pseudo-UMP.

[0090] Como usado no presente documento, uma "nanopartícula" é uma partícula compreendendo um ou mais lipídeos e um ou mais agen- tes terapêuticos. As nanopartículas são tipicamente dimensionadas na ordem de micrômetros ou menores e podem incluir uma bicamada lipí- dica. Em algumas modalidades, a nanopartícula tem um diâmetro médio (por exemplo, um diâmetro hidrodinâmico) de entre cerca de 50 nm e cerca de 100 nm, por exemplo entre cerca de 60 nm e cerca de 90 nm, entre 70 nm e 80 nm de diâmetro, como medido por dispersão dinâmica de luz (ver Publicação Especial NIST 1200-6, "Measuring the Size of Nanoparticles in Aqueous Media Using Batch Mode Dynamic Light Scat- tering"). Em algumas modalidades, a nanopartícula tem um diâmetro hi- drodinâmico médio de cerca de 71 nm, 72 nm, 73 nm, 74 nm, 75 nm, 76 nm, 77 nm, 78 nm, 79 nm, 80 nm, 81 nm, 82 nm, 83 nm, 84 nm, 85 nm, 86 nm, 87 nm, 88 nm, 89 nm ou 90 nm. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é um RNA modificado. Em algumas modalidades, as nanopartículas compreendem o Composto A, como mostrado na FIG. 1 e um RNA modificado.

[0091] Tal como no presente documento usado, o "índice de polidis- persão (pDI)" é a medida da distribuição de tamanhos nanopartículas em uma amostra nanoparticulada (ver Publicação Especial NIST 1200- 6, "Measuring the Size of Nanoparticles in Aqueous Media Using Batch Mode Dynamic Light Scattering"). Em algumas modalidades, o índice de polidispersividade está entre cerca de 0,10 e cerca de 0,20, por exem- plo, cerca de 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19 ou 0,20.

[0092] Como no presente documento usado, a "razão N:P" é a ra- zão molar de átomos de nitrogênio ionizáveis (na gama de pH fisioló- gico) em um lipídeo para grupos de fosfato em um RNA, por exemplo, em uma nanopartícula incluindo um componente lipídico e um RNA mo- dificado.

[0093] Tal como no presente documento usado, o termo "ácido nu- cleico", no seu sentido mais lato, inclui qualquer composto e/ou subs- tância que compreende um polímero de nucleotídeos ligados através de uma ligação fosfodiéster. Estes polímeros são frequentemente referidos como oligonucleotídeos ou polinucleotídeos, dependendo do tamanho. Os termos "sequência polinucleotídica" e "sequência nucleotídica" tam- bém no presente documento são usados indistintamente.

[0094] Como no presente documento usado, um "lipídeo PEG" ou "lipídeo PEGuilado" refere-se a um lipídeo compreendendo um compo- nente de polietilenoglicol.

[0095] A frase “farmaceuticamente aceitável” é usada no presente documento para fazer referência àqueles compostos, materiais, compo- sições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do bom senso médico, adequados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais, sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alér- gica, ou outro problema ou complicação, e compatíveis com uma razão razoável benefício/risco. As agências de aprovação de fármacos (por exemplo, EMA, US-FDA) fornecem orientação e aprovam compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis. Podem são listados exemplos nas Farmacopeias.

[0096] A frase “excipiente farmaceuticamente aceitável” é no pre- sente documento usada para fazer referência a um material farmaceuti- camente aceitável, escolhido de um solvente, meios de dispersão, dilu- ente, agente de dispersão, auxiliar de suspensão, tensoativo, agente isotônico, agente espessante ou emulsionante, conservante, polímero,

peptídeo, proteína, célula, hialuronidase e suas misturas. Em algumas modalidades, o solvente é um solvente aquoso.

[0097] Como no presente documento usado, um "fosfolipídeo” é um lipídeo que inclui uma fração fosfato e uma ou mais cadeias de carbono, tal como cadeias de ácidos graxos insaturados. Um fosfolipídeo pode incluir uma ou mais ligações (por exemplo, uma ou mais insaturações) múltiplas (por exemplo, duplas ou triplas). Fosfolipídeos específicos po- dem facilitar a fusão com uma membrana. Por exemplo, um fosfolipídeo catiônico pode interagir com um ou mais fosfolipídeos negativamente carregados de uma membrana (por exemplo, uma membrana celular ou intracelular). A fusão de um fosfolipídeo a uma membrana pode permitir que um ou mais elementos de uma composição contendo lipídeos pas- sem através da membrana, permitindo, por exemplo, a entrega de um ou mais elementos a uma célula.

[0098] Tal como no presente documento usado, "polipeptídeo" de- signa um polímero de resíduos de aminoácidos (naturais ou não natu- rais) ligados entre si mais frequentemente por ligações peptídicas. O termo, como usado no presente documento, refere-se a proteínas, poli- peptídeos e peptídeos de qualquer tamanho, estrutura ou função. Um polipeptídeo pode ser uma única molécula ou pode ser um complexo multimolecular tal como um dímero, trímero ou tetrâmero. Eles também podem compreender polipeptídeos de cadeia única ou multicadeia tais como anticorpos ou insulina, e podem estar associados ou ligados. As ligações de dissulfeto mais comumente conhecidas são constatadas em polipeptídeos de múltiplas cadeias. O termo polipeptídeo também se pode aplicar a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um análogo químico artificial de um aminoácido correspondente que ocorre naturalmente.

[0099] Tal como no presente documento usada, "proteína" é um po- límero consistindo essencialmente em qualquer dos 20 aminoácidos.

Embora "polipeptídeo" seja frequentemente usado em referência a poli- peptídeos relativamente grandes, e "peptídeo" seja frequentemente usado em referência a polipeptideos pequenos, a usação destes termos na técnica se sobrepõe e é variada. Os termos "peptídeo(s)", "prote- ína(s)" e "polipeptídeo(s)" são por vezes no presente documento usados indistintamente.

[0100] O termo "sujeito" refere-se a um animal, por exemplo a um humano, a quem é fornecido tratamento, incluindo tratamento profilático, com métodos e composições no presente documento descritos. Para o tratamento daquelas condições ou estados patológicos que são especí- ficos de um animal específico tal como um sujeito humano, o termo "su- jeito" refere-se a esse animal específico.

[0101] O termo "tecido" refere-se a um grupo ou camada de células especializadas de forma similar, que conjuntamente efetuam certas fun- ções especiais.

[0102] Como usado no presente documento, os termos "tratar", "tra- tamento", ou "tratando" referem-se a uma melhoria ou eliminação de uma doença ou distúrbio ou, pelo menos, um sintoma perceptível dos mesmos. Em algumas modalidades, "tratamento" ou "tratando" refere- se a uma melhoria ou eliminação de pelo menos um parâmetro físico mensurável, não necessariamente discernível pelo paciente.

[0103] Deve ser entendido que esta descrição não se limita à meto- dologia particular, protocolos, e reagentes, etc., no presente documento descritos, e que como tal pode variar. A terminologia no presente docu- mento usada tem o objetivo de descrever apenas modalidades particu- lares, e não pretende limitar o escopo da presente descrição, que é de- finida apenas pelas reivindicações.

7.2. Componentes lipídicos

[0104] Nanopartículas compreendem um componente lipídico inclu- indo Composto A (FIG. 1). Compostos adicionais são descritos em WO

2017/049245 A2 (ver, por exemplo, compostos 1-147 em WO 2017/049245 A2), que é incorporado no presente documento por refe- rência na sua totalidade. Os componentes lipídicos também podem in- cluir uma variedade de outros lipídeos, tal como um fosfolipídeo, um li- pídeo estrutural e/ou um lipídeo PEG. Fosfolipídeos

[0105] O componente lipídico de uma nanopartícula pode incluir um ou mais fosfolipídeos, tal como um ou mais lipídeos (poli)insaturados. Os fosfolipídeos podem se agrupar em uma ou mais bicamadas lipídi- cas. Em geral, os fosfolipídeos podem incluir uma fração de fosfolipídeo e uma ou mais frações de ácido graxo.

[0106] Os fosfolipídeos úteis nas composições e métodos podem ser selecionados do grupo não limitativo consistindo em 1,2-distearoil- sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanola- mina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimi- ristoil-sn-glicero-fosfocolina (DMPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoco- lina (DOPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diun- decanoil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero- 3-fosfocolina (POPC), 1,2-di-O-octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Diéter PC), 1-oleoil-2-colesteril-hemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfo- colina (OChemsPC), 1-hexadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (C16 Liso PC), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-diaraquidonoil-sn-gli- cero-3-fosfocolina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16,0 PE), 1,2-distearoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanola- mina, 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-diaraquidonoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn-glicero-3-fos- foetanolamina, sal de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) só- dio (DOPG) e esfingomielina. Em algumas modalidades, um compo- nente lipídico inclui DSPC. Em algumas modalidades, um componente lipídico inclui DOPE. Em algumas modalidades, um componente lipídico inclui DSPC e DOPE. Lipídeos Estruturais

[0107] O componente lipídico de uma nanopartícula pode incluir um ou mais lipídeos estruturais. Os lipídeos estruturais podem ser selecio- nados, mas não estão limitados a, colesterol, fecosterol, sitosterol, er- gosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, tomatidina, toma- tina, ácido ursólico, alfa-tocoferol e suas misturas. Em algumas modali- dades, o lipídeo estrutural é colesterol. Em algumas modalidades, o li- pídeo estrutural inclui colesterol e um corticosteroide (tal como predniso- lona, dexametasona, prednisona e hidrocortisona) ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um componente lipídico inclui colesterol. Lipídeos PEG

[0108] O componente lipídico de uma nanopartícula pode incluir um ou mais lipídeos PEG ou PEG modificados. Tais lipídeos podem ser al- ternativamente denominados de lipídeos PEGuilados. Um lipídeo PEG é um lipídeo modificado com polietilenoglicol. Um lipídeo PEG pode ser selecionado de entre o grupo não limitativo consistindo em fosfatidileta- nolaminas modificadas com PEG, ácidos fosfatídicos modificados com PEG, ceramidas modificadas com PEG, dialquilaminas modificadas com PEG, diacilglicerós modificados com PEG, dialquilgliceróis modifi- cados com PEG e misturas dos mesmos. Por exemplo, um lipídeo PEG pode ser PEG-c-DOMG, PEG-DMG (1,2-dimiristoil-OT-glicerol metóxi- pol etilenoglicol, obtido de Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), PEG- DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, ou um lipídeo PEG-DSPE. Em algu- mas modalidades, um componente lipídico inclui PEG-DMG.

7.3. RNA Modificados Codificando Polipeptídeos VEGF-A

[0109] É de grande interesse nas áreas da terapia, diagnóstico, re- agentes e ensaios biológicos, ser possível entregar um ácido nucleico,

por exemplo, um ácido ribonucleico (RNA) no interior de uma célula, quer in vitro, in vivo, in situ, ou ex vivo, de modo a provocar a tradução intracelular do ácido nucleico e a produção de um polipeptídeo codifi- cado de interesse.

[0110] Os RNA que ocorrem naturalmente são sintetizados a partir de quatro ribonucleotídeos básicos: ATP, CTP, UTP e GTP, mas podem conter nucleotídeos modificados pós-transcricionalmente. Para além disso, foram identificadas aproximadamente cem modificações nucleo- sídicas diferentes no RNA (Rozenski, J, Crain, P, e McCloskey, J., The RNA Modification Database: 1999 update, Nucl Acids Res, (1999) 27: 196-197).

[0111] De acordo com a presente descrição, estes RNA são prefe- rencialmente modificados de modo a evitar as deficiências de outras moléculas de RNA da técnica (por exemplo, ativando a resposta imune inata e a rápida degradação após administração). Assim, estes polinu- cleotídeos são referidos como RNA modificado. Em algumas modalida- des, o RNA modificado evita a resposta imune inata após administração a um sujeito. Em algumas modalidades, a meia-vida do RNA modificado é prolongada em comparação com um RNA não modificado.

[0112] Em modalidades preferidas, a molécula de RNA é um RNA mensageiro (mRNA). Tal como no presente documento usado, o termo "RNA mensageiro" (mRNA) refere-se a qualquer polinucleotídeo que co- difica um polipeptídeo de interesse, e que é capaz de ser traduzido para produzir o polipeptídeo codificado de interesse in vitro, in vivo, in situ ou ex vivo.

[0113] Tal como representado na FIG. 2A, tradicionalmente, os componentes básicos de uma molécula de mRNA incluem pelo menos uma região codificadora, uma região não traduzida (UTR) 5', uma região não traduzida (UTR) 3', uma extremidade 5' e uma cauda poli-(A). Com base nesta estrutura modular do tipo selvagem, a presente descrição expande o escopo de funcionalidades das moléculas de mRNA tradici- onais ao fornecer polinucleotídeos ou construtos de RNA primários que mantêm uma organização modular, mas que compreendem uma ou mais modificações ou alterações estruturais e/ou químicas que confe- rem propriedades úteis ao polinucleotídeo incluindo, em algumas moda- lidades, a falta de uma indução substancial da resposta imune inata de uma célula na qual o polinucleotídeo é introduzido.

[0114] Os RNA modificados podem incluir qualquer modificação útil relativa à cadeia nucleotídica de RNA padrão, tal como ao açúcar, à nucleobase (por exemplo, uma ou mais modificações de uma nucleo- base, tal como trocando ou substituindo um átomo de uma nucleobase pirimidina por um amino opcionalmente substituído, tiol opcionalmente substituído, alquila opcionalmente substituída (por exemplo, metila ou etila), ou halogênio (por exemplo, cloro ou flúor)), ou à ligação internu- cleosídica (por exemplo, uma ou mais modificações ao esqueleto de fosfodiéster).

[0115] Como exemplos não limitativos, em algumas modalidades, um RNA modificado pode incluir, por exemplo, pelo menos uma uridina monofosfato (UMP) que é modificada para formar N1-metil-pseudo- UMP. Em algumas modalidades, o N1-metil-pseudo-UMP está presente em vez de UMP em uma percentagem dos UMP na sequência de 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99,9%, e 100%. Em algumas modalidades, todos os UMP foram substituídos por N1-metil-pseudo-UMP.

[0116] Em algumas modalidades, os RNA modificados compreen- dem uma modificação na extremidade 5′, tal como uma extremidade 5' diguanosina. Em algumas modalidades, os RNA modificados compre- endem uma modificação em uma região codificadora. Em algumas mo- dalidades, os RNA modificados compreendem uma modificação em uma UTR 5’. Em algumas modalidades, os RNA modificados compre- endem uma modificação em uma UTR 3’. Em algumas modalidades, os RNA modificados compreendem uma modificação em uma cauda poli- (A). Em algumas modalidades, os RNA modificados compreendem qual- quer combinação de modificações a uma região codificadora, extremi- dade 5', UTR 5', UTR 3', ou cauda poli-(A). Em algumas modalidades, um RNA modificado pode opcionalmente ser tratado com uma fosfatase alcalina.

[0117] Em algumas modalidades, um RNA modificado codifica um polipeptídeo Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), qual- quer um de uma grande família de proteínas VEGF que desempenham uma função central na regulação da cicatrização de feridas em geral. As funções do VEGF também incluem a ativação da sinalização do óxido nítrico (NO), desenvolvimento e angiogênese pós-natal, angiogênese tumoral, arteriogênese, replicação endotelial, e interruptor do destino ce- lular para progenitores cardiovasculares multipotentes.

[0118] Será reconhecido pelos peritos na técnica que para qualquer gene VEGF particular pode existir uma ou mais variantes ou isoformas. Exemplos não limitativos de polipeptídeos VEGF-A de acordo com a presente descrição estão listados na Tabela 1. Será reconhecido pelos peritos na técnica que as sequências descritas na Tabela 1 contêm po- tenciais regiões flanqueadoras. Estas estão codificadas em cada se- quência nucleotídica para 5' (a montante) ou 3' (a jusante) do quadro de leitura aberta. O quadro de leitura aberta é definitiva e especificamente descrito ensinando a sequência nucleotídica de referência. Também é possível caracterizar adicionalmente as regiões flanqueadoras 5′ e 3′ usando uma ou mais bases de dados ou algoritmos disponíveis. As ba- ses de dados têm anotadas as características contidas nas regiões flan- queadoras das sequências NCBI, e estas estão disponíveis na técnica. Tabela 1: Isoformas de mRNA do VEGF-A de Homo sapiens.

Descrição Ref. NM Ref. NP Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001171623,1 NP_001165094,1 sapiens, variante 1 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001025366,2 NP_001020537,2 sapiens, variante 1 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001171624,1 NP_001165095,1 sapiens, variante 2 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_003376,5 NP_003367,4 sapiens, variante 2 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001171625,1 NP_001165096,1 sapiens, variante 3 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001025367,2 NP_001020538,2 sapiens, variante 3 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001171626,1 NP_001165097,1 sapiens, variante 4 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001025368,2 NP_001020539,2 sapiens, variante 4 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001317010,1 NP_001303939,1 sapiens, variante 4 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001171627,1 NP_001165098,1 sapiens, variante 5 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001025369,2 NP_001020540,2 sapiens, variante 5 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001171628,1 NP_001165099,1 sapiens, variante 6 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001025370,2 NP_001020541,2 sapiens, variante 6 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001171629,1 NP_001165100,1 sapiens, variante 7 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001033756,2 NP_001028928,1 sapiens, variante 7 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001171630,1 NP_001165101,1 sapiens, variante 8 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001171622,1 NP_001165093,1 sapiens, variante 8 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001204385,1 NP_001191314,1 sapiens, variante 9 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001204384,1 NP_001191313,1 sapiens, variante 9 do transcrito, mRNA Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) de Homo NM_001287044,1 NP_001273973,1 sapiens, variante 10 do transcrito, mRNA

[0119] Será reconhecido pelos peritos na técnica que as moléculas de RNA codificando polipeptídeos VEGF-A, por exemplo, um polipeptí-

deo VEGF-A humano, podem ser concebidas de acordo com as isofor- mas de mRNA de VEGF-A listadas na Tabela 1. Um comum perito na técnica está geralmente familiarizado com as múltiplas isoformas dos restantes membros da família VEGF.

[0120] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um RNA modificado codificando um polipeptídeo VEGF-A (por exemplo, SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, um RNA modificado codifica um po- lipeptídeo VEGF-A, em que o RNA modificado compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 e 3-5. Em algumas modalidades, o RNA modifi- cado compreende ainda uma extremidade 5', uma UTR 5', uma UTR 3', uma cauda poli(A), ou qualquer suas combinações. Em algumas moda- lidades, a extremidade 5', a UTR 5', a UTR 3', a cauda poli(A), ou qual- quer suas combinações pode incluir um ou mais nucleotídeos modifica- dos.

[0121] Em algumas modalidades, um RNA modificado codificando um polipeptídeo VEGF-A pode ter a estrutura tal como apresentada na FIG. 2B, que é a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um RNA modificado codificando um polipeptídeo VEGF-A pode ter a sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 3-5.

7.4. Composições Compreendendo Componente Lipídico e RNA Modificado

[0122] Algumas modalidades referem-se a nanopartículas que in- cluem um componente lipídico e um RNA modificado.

[0123] Em algumas modalidades, o componente lipídico de uma na- nopartícula pode incluir o Composto A (FIG. 1). Em algumas modalida- des, o componente lipídico de uma nanopartícula pode ainda incluir um fosfolipídeo, um lipídeo estrutural e/ou um lipídeo PEG, como no pre- sente documento descrito. Por exemplo, em algumas modalidades, o componente lipídico de uma nanopartícula pode incluir DSPC, coleste- rol, PEG-DMG e suas misturas.

[0124] Os elementos do componente lipídico podem ser fornecidos em frações específicas. Em algumas modalidades, o componente lipí- dico de uma nanopartícula inclui o Composto A, um fosfolipídeo, um li- pídeo estrutural e um lipídeo PEG. Em algumas modalidades, o compo- nente lipídico da nanopartícula inclui de cerca de 30% molar a cerca de 60% molar de Composto A, de cerca de 0% molar a cerca de 30% molar de fosfolipídeo, de cerca de 18,5% molar a cerca de 48,5% molar de lipídeo estrutural, e de cerca de 0% molar a cerca de 10% molar de lipídeo PEG, desde que a % molar total não exceda 100%. Em algumas modalidades, o componente lipídico da nanopartícula inclui de cerca de 35% molar a cerca de 55% molar de Composto A, de cerca de 5% molar a cerca de 25% molar de fosfolipídeo, de cerca de 30% molar a cerca de 40% molar de lipídeo estrutural, e de cerca de 0% molar a cerca de 10% molar de lipídeo PEG. Em algumas modalidades, o componente lipídico inclui cerca de 50% molar de Composto A, cerca de 10% molar de fosfolipídeo, cerca de 38,5% molar em lipídeos estruturais e cerca de 1,5% molar de lipídeo PEG. Em algumas modalidades, o fosfolipídeo pode ser DOPE. Em algumas modalidades, o lipídeo estrutural pode ser colesterol. Em algumas modalidades, o lipídeo PEG pode ser PEG- DMG.

[0125] Em algumas modalidades, o componente de RNA modifi- cado de uma nanopartícula pode incluir um RNA modificado codificando um polipeptídeo VEGF-A, como no presente documento descrito (por exemplo, SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o componente de RNA modificado de uma nanopartícula pode incluir o RNA modificado compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 e 3-5. Em algumas mo- dalidades, o RNA modificado compreende ainda uma extremidade 5', uma UTR 5', uma UTR 3', uma cauda poli(A), ou qualquer suas combi- nações. Em algumas modalidades, a extremidade 5', a UTR 5', a UTR 3', a cauda poli(A), ou qualquer suas combinações pode incluir um ou mais nucleotídeos modificados.

[0126] Em algumas modalidades, as quantidades relativas do com- ponente lipídico e o RNA modificado em uma nanopartícula pode variar. Em algumas modalidades, a razão em p/p do componente lipídico para o RNA modificado em uma nanopartícula pode ser de cerca de 5:1 a cerca de 100:1, tal como 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, e 100:1. Por exemplo, a razão em p/p do compo- nente lipídico para o RNA modificado pode ser de cerca de 10:1 a cerca de 40:1. Em algumas modalidades, a razão em p/p é de cerca de 20:1. Em algumas modalidades, a razão em p/p é de cerca de 10:1.

[0127] Em algumas modalidades, as quantidades relativas do com- ponente lipídico e o RNA modificado em uma nanopartícula podem ser fornecidas por uma razão N:P específica. A razão N:P da composição refere-se à razão molar de átomos de nitrogênio em um ou mais lipídeos e ao número de grupos fosfato em um RNA. Em geral, uma razão de N:P menor é preferencial. Em algumas modalidades, a razão N:P pode ser de cerca de 2:1 a cerca de 30:1, tal como 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 12:1, 14:1, 16:1, 18:1, 20:1, 22:1, 24:1, 26:1, 28:1, ou 30:1. Em algumas modalidades, a razão N:P pode ser de cerca de 2:1 a cerca de 8:1. Por exemplo, a razão N:P pode ser de cerca de 3,0:1, cerca de 3,5:1, cerca de 4,0:1, cerca de 4,5:1, cerca de 5,0:1, cerca de 5,5:1, cerca de 5,67:1, cerca de 6,0:1, cerca de 6,5:1 ou cerca de 7,0:1. Em algumas modalidades, a razão N:P pode ser de cerca de 3:1. Em algumas modalidades, a razão N:P pode ser de cerca de 5,67:1.

[0128] Nanopartículas lipídicas podem ser preparadas usando mé- todos bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Belliveau et al., "Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA," Mol. Ther. Nucleic Acids, 2012, 1(8):e37; Zhi-

galtsev et al., Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanopar- ticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond mi- crofluidic mixing," Langmuir, 2012, 28(7):3633-3640).

[0129] Em algumas modalidades, as nanopartículas podem com- preender adicionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável, que, tal como no presente documento usado, inclui, mas não se limita a, qualquer e todos de solventes, meios de dispersão, diluentes, ou ou- tros veículos líquidos, auxiliares de dispersão ou suspensão, agentes tensoativos, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsionan- tes, conservantes, e outros similares, tal como adequado para a forma de dosagem particular desejada. Os excipientes também podem incluir, sem limitação, polímeros, nanoparticulas core-shell, peptídeos, proteí- nas, células, hialuronidase, miméticos de nanopartículas e suas combi- nações. Vários excipientes para formular composições farmacêuticas e técnicas para a preparação da composição são conhecidos na técnica (ver Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22ª Edição, Edi- tado por Allen, Loyd V., Jr, Pharmaceutical Press; no presente docu- mento incorporado como referência na sua integralidade). O uso de um meio excipiente convencional pode ser contemplado dentro do escopo da presente descrição, exceto na medida em que, como qualquer meio excipiente convencional, possa ser incompatível com uma substância ou seus derivados, tal como produzindo qualquer efeito biológico inde- sejável ou de outra forma interatuando de modo prejudicial com qual- quer/quaisquer outro(s) componente(s) da composição farmacêutica.

[0130] Em algumas modalidades, as nanopartículas podem com- preender uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um componente lipídico e um RNA modificado, em que as composições compreendem ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modali- dades, o excipiente farmaceuticamente aceitável é escolhido de um sol- vente, meios de dispersão, diluente, agente de dispersão, auxiliar de suspensão, tensoativo, agente isotônico, agente espessante ou emulsi- onante, conservante, nanopartículas core-shell, polímero, peptídeo, pro- teína, célula, hialuronidase, e misturas dos mesmos. Em algumas mo- dalidades, o solvente é um solvente aquoso. Em algumas modalidades, o solvente é um solvente não aquoso.

[0131] A presente descrição também fornece uma composição far- macêutica compreendendo uma ou mais nanopartículas lipídicas com- preendendo um componente lipídico e um RNA modificado, como des- crito no presente documento, e um excipiente farmaceuticamente acei- tável. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas com- preendem uma pluralidade de nanopartículas lipídicas como no pre- sente documento descritas e um excipiente farmaceuticamente aceitá- vel. Em algumas modalidades, o excipiente farmaceuticamente aceitá- vel é escolhido de um solvente, meios de dispersão, diluente, agente de dispersão, auxiliar de suspensão, tensoativo, agente isotônico, agente espessante ou emulsionante, conservante, nanopartículas core-shell, polímero, peptídeo, proteína, célula, hialuronidase, e misturas dos mes- mos. Em algumas modalidades, o solvente é um solvente aquoso. Em algumas modalidades, o solvente é um solvente não aquoso.

7.5. Melhorando a Cicatrização de Feridas em um Sujeito

[0132] As vias de VEGF-A desempenham um papel central nos pro- cessos de cicatrização de feridas, incluindo a revascularização de teci- dos danificados, melhorando a permeabilidade vascular e a formação de novos vasos sanguíneos. É um objetivo da presente descrição para o tratamento de sujeitos que sofrem de doenças resultantes de proces- sos deficientes de cicatrização de feridas.

[0133] Em algumas modalidades, as nanopartículas de acordo com esta descrição são administradas a um sujeito que sofre de uma doença que afeta estruturas vasculares. As estruturas vasculares são mais fre-

quentemente lesionadas por trauma penetrante, queimaduras ou cirur- gia. A diabetes prejudica numerosos componentes da cicatrização de feridas, e um paciente com cicatrização de feridas diabéticas tem geral- mente um fluxo sanguíneo alterado devido a disfunção vascular. Con- sequentemente, um sujeito com úlcera de pele incluindo úlceras diabé- ticas tem normalmente uma cicatrização de feridas diminuída ou retar- dada. Em algumas modalidades, as nanopartículas como no presente documento descritas são administradas a um sujeito que sofre de dia- betes. No contexto desta descrição, uma ferida pode ser, por exemplo, uma ferida cirúrgica, uma queimadura, uma ferida abrasiva, um local de biópsia da pele, uma ferida crônica, uma lesão (por exemplo, uma ferida de lesão traumática), uma ferida de enxerto, uma ferida diabética, uma úlcera diabética (por exemplo, úlcera de pé diabético), uma úlcera por pressão, escaras e suas combinações.

[0134] Em algumas modalidades, as nanopartículas compreen- dendo um componente lipídico e um RNA modificado (por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5) podem ser usadas para melhorar a cicatrização de feridas em um tecido de mamífero ou em um sujeito.

[0135] Em algumas modalidades, as nanopartículas como no pre- sente documento descritas podem ser usadas para induzir neovascula- rização em um tecido de mamífero ou em um sujeito. Em algumas mo- dalidades, as nanopartículas como no presente documento descritas podem ser usadas para induzir angiogênese em um tecido de mamífero ou em um sujeito.

[0136] No entanto, em algumas modalidades, as nanopartículas como no presente documento descritas podem ser usadas para tratar uma lesão vascular de trauma ou cirurgia. Em algumas modalidades, as nanopartículas como no presente documento descritas podem ser usa- das para tratar uma doença que envolve enxerto de pele e enxerto de tecido.

[0137] Outros aspectos da descrição referem-se à administração das nanopartículas a sujeitos em sua necessidade. Em algumas moda- lidades, as nanopartículas como no presente documento descritas são administradas por uma via intradérmica para melhorar a cicatrização de feridas de um tecido ou de um mamífero.

[0138] Em certas modalidades, as nanopartículas como no presente documento descrito podem ser administradas a níveis de dosagem su- ficientes para entregar cerca de 0,0001 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,005 mg/kg a cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 0,005 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 25 mg/kg, de RNA modificado por peso corporal do sujeito por dia, uma ou mais vezes ao dia, para se obter o efeito terapêutico desejado.

[0139] Em algumas modalidades, as nanopartículas como no pre- sente documento descritas são administradas a um sujeito em uma única administração. Em algumas modalidades, as nanopartículas, como no presente documento descritas, são administradas ao sujeito, a uma dosagem fixa em múltiplas (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezes- seis, dezessete, dezoito, dezanove, vinte, ou mais) administrações. Em cada uma das modalidades neste parágrafo, as "administrações múlti- plas" podem ser separadas umas das outras por intervalos de tempo curtos (1-5 min), médios (6-30 minutos), ou longos (mais de 30 minutos, horas, ou mesmo dias).

[0140] As nanopartículas podem ser administradas a um sujeito usando qualquer dosagem de administração eficaz para tratar uma do- ença, distúrbio e/ou afeção. A dosagem exata necessária irá variar de sujeito para sujeito, dependendo da espécie, idade, e condição geral do sujeito, da gravidade da doença, da formulação particular, seu modo de administração, seu modo de atividade, e outros similares. Será enten- dido, porém, que o uso diário total das composições pode ser decidido pelo médico assistente dentro do escopo do bom senso médico. O nível de dose farmaceuticamente eficaz específico para qualquer paciente em particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a gravidade da doença, a composição específica aplicada, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente, o tempo de administração, via de administração, a duração do tratamento e fatores similares bem conhe- cidos nas técnicas médicas.

[0141] Todas as reivindicações na listagem de reivindicações são no presente documento incorporadas como referência no relatório des- critivo, na sua integralidade como modalidades adicionais.

8. EXEMPLOS

8.1. EXEMPLO 1 Preparação de Nanopartículas e Composições Salinas de Citrato

[0142] Lipídeos e RNA modificados: Solução estoque de lipídeos em etanol foi preparada a partir de um Composto A, fosfatidilcolina de distearoílo (DSPC, Avanti Polar Lipids), colesterol (Sigma) e um lipídeo de polietilenoglicol modificado (mPEG2000-DMG de NOF Corporation). Os lipídeos foram misturados em etanol 99,5% até uma concentração lipídica total de 12,5 mM. A composição foi o Composto A, DSPC, co- lesterol, DMG-PEG na razão de 50:10:38,5:1,5% mol. O RNA modifi- cado de VEGF-A (por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5) foi descongelado e diluído para 6,25 mM em tampão acetato de sódio e água HyClone em concentrações correspon- dendo a uma razão de carga (N:P) de 5,67 ou 3 na formulação final. As formulações finais após a diluição foram as seguintes: LNP 1:11 (N:P=3), concentração de mRNA de 0,06 mg/mL Componente LNP Quantidade (mg/mL) RNA modificado de VEGF-A 0,06 Composto A 0,37 DSPC 0,08 Colesterol 0,16 DMG-PEG 0,04 LNP 1:20 (N:P=5,67), concentração de mRNA de 0,06 mg/mL Componente LNP Quantidade (mg/mL) RNA modificado de VEGF-A 0,06 Composto A 0,70 DSPC 0,16 Colesterol 0,30 DMG-PEG 0,07

[0143] Composições nanopartículas lipídicas (LNP): As composi- ções LNP foram preparadas misturando-se rapidamente uma solução de etanol contendo os lipídeos e solução aquosa de RNA modificado de VEGF-A em um dispositivo de microfluidos, seguido por diálise em so- lução salina tamponada com fosfato (PBS). Resumidamente, a solução de RNA modificado de VEGF-A e a solução lipídica foram injetadas em um dispositivo de mistura microfluídica em uma razão volumétrica de aquosa para etanol 3:1 e taxas de fluxo de 12-14 mL/min usando duas seringas, que foram controladas por bombas de seringa. O etanol foi removido por diálise das composições de LNP contra tampão PBS du- rante a noite usando membranas com 10 KD de ponto de corte. Com- posições de LNP foram concentradas usando dispositivos de filtragem por centrifugação com 30 KD de ponto de corte e caracterizado pelo tamanho de partícula (72 nm), a concentração de RNA modificado de

VEGF-A (0,35 mg/mL), o índice de polidispersidade (0,14) e encapsula- ção (94%). Composições de LNP foram diluídas para a concentração final de 0,33 mg/mL com PBS e esterilizadas por filtração. As composi- ções de LNP foram armazenadas sob refrigeração.

[0144] Composições salinas de citrato: Composições salinas de ci- trato foram preparadas diluindo solução de RNA modificado de VEGF- A descongelada com água HyClone e uma solução tampão concentrada a uma composição final de citrato de sódio 10 mM e cloreto de sódio 130 mM a pH 6,5.

8.2. EXEMPLO 2 Avaliação de Produção de Proteína VEGF-A Humana Após Injeção Intradérmica de RNA Modificado de VEGF-A Humana em Camun- dongo

[0145] Nanopartículas e composições salinas de citrato compreen- dendo um RNA Modificado de VEGF-A e Composto A foram preparados como no Exemplo 1. Neste exemplo, o RNA Modificado de VEGF-A ti- nha a sequência de SEQ ID NO: 3.

[0146] Camundongos machos db/db (C57BL/6J, BKS.Cg- m+/+Leprdb/BomTac homozigóticos, Taconic Dinamarca) foram anes- tesiados com isoflurano. Estes camundongos são um modelo estabele- cido de diabetes do Tipo II e têm a cicatrização de feridas comprome- tida, em comparação com os camundongos de tipo selvagem. Os ca- mundongos foram rapados e o pelo restante foi removido com creme depilatório. Tanto o RNA modificado de VEGF-A (100 µg) formulado em solução salina de citrato ou o RNA modificado de VEGF-A (3 µg) formu- lado em LNP (Ver Exemplo 1) foi injetado por via intradérmica de 4 inje- ções separadas (10 µL cada, volume total de 40 µL) dentro de uma área circular de 0,785 mm2. Em pontos de tempo pré-definidos após as inje- ções intradérmicas, os camundongos foram anestesiados e as áreas da pele injetada foram amostradas e congeladas rapidamente em nitrogê- nio líquido e armazenadas a 80 °C. Todas as amostras foram analisadas quanto à proteína VEGF- A humana.

[0147] As amostras de camundongo db/db injetados com 100 µg de RNA modificado de VEGF-A formulado em solução salina de citrato fo- ram tiradas 6, 24, 48, 72, e 144 horas após a injeção. As amostras de camundongos db/db injetados com 3 µg de RNA modificado de VEGF- A formulado em LNP foram colhidas às 3, 6, 24, 48, 72, 144 horas após a injeção. Quantificação da Proteína VEGF-A Humana em Pele de Camun- dongo

[0148] Para preparar as amostras de pele para análise do conteúdo de proteína VEGF-A humana, foi adicionado tampão de lise Tris con- tendo inibidores da fosfatase I e II e inibidor da protease (Meso Scale Discovery (MSD), Rockville, MD, EUA) às biópsias de tecidos congela- das e se congelou a aproximadamente 20 °C antes da homogeneização. Adicionou-se de seguida esferas de aço inoxidável (3 mm) e as amos- tras foram homogeneizadas usando o instrumento de homogeneização Precellys. Os homogenatos foram centrifugados e os sobrenadantes ar- mazenados a 80°C antes de análise.

[0149] As concentrações de VEGF-A humana foram determinadas usando um imunoensaio do tipo sanduíche com detecção eletroquímica luminescente. O kit de ensaio de VEGF-A humana MSD® 96-poços MULTI-ARRAY® (Mesoscale, Rockville, Maryland) foi usado para medir a concentração de VEGF-A nos homogenatos de tecido. Este ensaio detecta apenas a proteína VEGF-A humana e, portanto, serve para tes- tar apenas a VEGF-A expressa a partir do RNA modificado. O ensaio foi efetuado de acordo com as instruções do kit. Os padrões foram diluídos em série em diluentes de MSD. As amostras com elevada concentração foram diluídas com diluentes MSD antes da análise para se ajustar no interior da curva padrão e as placas foram lidas no Meso Scale Disco- very's Sector Imager 6000. Resultados

[0150] FIG. 3 e 4 resumem os perfis de tempo e magnitude da pro- dução de proteína VEGF-A humana após injeção intradérmica de RNA modificado de VEGF-A formulado em solução salina de citrato (100 µg) e LNP (3 µg), respectivamente. Houve uma produção eficiente de pro- teínas em 6 e 3 horas, respectivamente (FIG. 4). Em particular, a com- posição de LNP resultou na produção de mais de cerca de 400 pg/mg de proteína VEGF-A dentro de 8 horas (FIG. 4). Além disso, a composi- ção de LNP resultou na produção de mais de cerca de 1 pg/mg de pro- teína VEGF-A até 6 dias (FIG. 3). Produção de proteína VEGF-A foi substancialmente aumentada quando o RNA modificado de VEGF-A foi formulado em LNP em comparação com a solução salina de citrato de (FIGs. 3 e 4).

[0151] A Tabela 2 resume os parâmetros farmacocinéticos obtidos após a injeção intradérmica de RNA modificado de VEGF-A, formulado em solução salina de citrato (100 µg) e LNP (3 µg). A Cmax foi aumentada 13,7 vezes para RNA modificado de VEGF-A formulado em LNP apesar do facto de que a dose foi de apenas 3% do RNA modificado de VEGF- A formulado em solução salina de citrato. A área total sob a curva de concentração, AUC0-t, foi aumentada 6,6 vezes com 3 µg de RNA modi- ficado de VEGF-A formulado em LNP em comparação com 100 µg de RNA modificado de VEGF-A formulado em solução salina de citrato. Tabela 2. Parâmetros farmacocinéticos calculados a partir das concen- trações de VEGF-A humana obtidas nas duas séries temporais com RNA modificado de VEG F-A humana formulado em solução salina de citrato e em LNP, respectivamente. A área total sob a curva de concen- tração AUC0-t) foi calculada com base no perfil mediano nos pontos de dados medidos até 144 horas após a dose.

Grupo Dose Tmax Cmax AUC(0-t) t1/2 (µg) (h) (pg/mg tecido) (pg*h/mg tecido) (h) LNP 3 6 424 5296 50 Solução sa- 100 24 31 806 40 lina de citrato

8.3. EXEMPLO 3 Efeitos na Cicatrização de Feridas Após Injeção Intradérmica de RNA Modificado de VEGF-A humana Materiais e Métodos

[0152] Nanopartículas lipídicas e composições salinas de citrato compreendendo um RNA Modificado de VEGF-A e Composto A foram preparados como no Exemplo 1. Neste exemplo, o RNA Modificado de VEGF-A tinha a sequência de SEQ ID NO: 4. Além disso, um RNA mo- dificado de VEGF-A não traduzível (SEQ ID NO: 6) foi usado para for- mular certas nanopartículas ou composições salinas de citrato, como indicado nas figuras.

[0153] Os camundongos db/db machos com 12 semanas de idade (B6.BKS(D)-Leprdb/J) da Jackson Lab USA foram analisados quanto à glicemia após 4 h de jejum e depois randomizados em grupos de trata- mento. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano. A super- fície dorsal de cada camundongo foi rapada com uma máquina de cortar cabelo elétrica seguida de um agente depilatório para remover os pelos restantes. A pele foi lavada com descutan e etanol. Uma ferida de es- pessura total na parte de trás de cada camundongo foi criada por uma marca com uma punção de biópsia de 10 mm e, em seguida, cortada em condições esterilizadas e coberta com uma bandagem de Tega- derm. No dia 3 após o ferimento, a bandagem de Tegaderm foi remo- vida. A nanopartícula ou a composição salina de citrato foi injetada in- tradermicamente como 4 injeções separadas (10 µL cada, volume total 40 µL) em posições próximas à margem da ferida. A ferida foi então coberta por uma nova bandagem Tegaderm. Durante o período de ob-

servação, os camundongos foram mantidos separados para evitar inter- ferência na cicatrização de feridas.

[0154] A cicatrização da ferida foi determinada a partir de uma série temporal (isto é, todos os 3/4 dias até ao dia 17 após o ferimento) de fotografias digitais tiradas a uma distância fixa e com uma iluminação indireta. A área da ferida foi determinada traçando a margem da ferida usando o software de análise de imagem Image J e depois calculada como uma área percentual da área da linha de base no dia 3 após o ferimento, imediatamente antes da dosagem.

[0155] A avaliação estatística foi realizada com um teste t não-pa- reado de dois lados, e valores de p<0,05 foram considerados significa- tivos. Resultados

[0156] Como mostrado na FIG. 5, no dia 7, uma composição de na- nopartículas lipídicas compreendendo 1 µg ou 3 µg de RNA modificado de VEGF-A melhorou significativamente a cicatrização de feridas quando comparada a uma composição de nanopartícula lipídica com- preendendo 3 µg de VEGF-A não traduzível, bem como uma composi- ção salina de citrato compreendendo 100 µg de RNA modificado de VEGF-A. Adicionalmente, no dia 10, a composição de nanopartículas lipídicas compreendendo 1 µg ou 3 µg de RNA modificado de VEGF-A melhorou significativamente a cicatrização de feridas quando compa- rada à composição de nanopartícula lipídica compreendendo 3 µg de RNA modificado de VEGF-A não traduzível. No dia 10, não foi obser- vada diferença significativa entre a composição de nanopartículas lipí- dicas compreendendo 1 µg ou 3 µg de RNA modificado de VEGF-A e a composição salina de citrato compreendendo 100 µg de RNA modifi- cado de VEGF-A.

[0157] Em uma experiência separada, como mostrado na FIG. 6, no dia 7, uma composição de nanopartículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA modificado de VEGF-A melhorou significativamente a cica- trização de feridas quando comparada a uma composição de nanopar- tícula lipídica compreendendo 3 µg de RNA modificado de VEGF-A não traduzível, bem como uma composição salina de citrato que não com- preende qualquer RNA modificado de VEGF-A. Adicionalmente, no dia 10, a composição de nanopartículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA modificado de VEGF-A melhorou significativamente a cicatrização de feridas quando comparada à composição de nanopartícula lipídica compreendendo 3 µg de RNA modificado de VEGF-A não traduzível.

[0158] A FIG. 7 mostra outra experiência de cicatrização de feridas. No dia 7, uma composição de nanopartículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA modificado de VEGF-A melhorou significativamente a ci- catrização de feridas quando comparada a uma composição de nano- partículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA modificado de GFP, uma composição de nanopartículas lipídicas que não compreende RNA modificado ou composição salina de citrato que não compreende ne- nhum RNA modificado. Além disso, no dia 10, a composição de nano- partículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA modificado por VEGF- A melhorou significativamente a cicatrização de feridas quando compa- rada com a composição de nanopartículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA modificado de GFP.

[0159] Como mostrado na FIG. 8, no dia 7 ou no dia 10, não houve diferenças significativas na cicatrização de feridas após injeções intra- dérmicas das quatro composições a seguir: (1) uma composição de na- nopartículas lipídicas compreendendo 3 µg de RNA modificado de VEGF-A não traduzível, (2) uma composição salina de citrato compre- endendo 100 µg de RNA modificado de VEGF-A, (3) uma composição salina de citrato compreendendo 100 µg de RNA modificado de VEGF- A não traduzível e (4) uma composição salina de citrato que não com- preende nenhum RNA modificado.

9. SEQUÊNCIAS

[0160] 9.1. SEQ ID NO: 1: Um RNA modificado codificando VEGF-A 5'7MeGpppG2'OMeGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGA- GUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGAACUUUCUG-

CUGUCUUGGGUGCAUUGGAGCCUUGCCUUGCUGCUCUACCUCC ACCAUGCCAAGUGGUCCCAGGCUGCACCCAUGGCAGAAGGAGG AGGGCAGAAUCAUCACGAAGUGGUGAAGUUCAUGGAUGUCUAU CAGCGCAGCUACUGCCAUCCAAUCGAGACCCUGGUGGACAUCU UCCAGGAGUACCCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCAAGCCAUCC UGUGUGCCCCUGAUGCGAUGCGGGGGCUGCUGCAAUGACGAG GGCCUGGAGUGUGUGCCCACUGAGGAGUCCAACAUCACCAUGC AGAUUAUGCGGAUCAAACCUCACCAAGGCCAGCACAUAGGAGAG AUGAGCUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAAAGAA AGAUAGAGCAAGACAAGAAAAUCCCUGUGGGCCUUGCUCAGAGC GGAGAAAGCAUUUGUUUGUACAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUG UUCCUGCAAAAACACAGACUCGCGUUGCAAGGCGAGGCAGCUU GAGUUAAACGAACGUACUUGCAGAUGUGACAAGCCGAGGCGGU GAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUG GGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCC CGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAGO H3' (SEQ ID NO: 1) Em que: A, C, G & U= AMP, CMP, GMP & N1-metil-pseudoUMP, respectivamente Me = metila p = fosfato inorgânico

[0161] 9.2. SEQ ID NO: 2: Sequência de aminoácidos da iso- forma de VEGF-A humana VEGF-165

MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMD VYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLE CVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQE

NPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCR CDKPRR (SEQ ID NO: 2)

[0162] 9.3. SEQ ID NO: 3: Um RNA modificado codificando VEGF-A 5'7MeGpppG2'OMeAGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGA- GUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGAACUUUCUG-

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAGO H3' (SEQ ID NO: 3)

Em que: A, C, G & U= AMP, CMP, GMP & N1-metil-pseudoUMP, respectivamente Me = metila p = fosfato inorgânico

[0163] 9.4. SEQ ID NO: 4: Um RNA modificado codificando VEGF-A (VEGF-01-012) 5'7MeGpppGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGA- GUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGAACUUU-

CUCCUUUCUUGGGUGCAUUGGAGCCUUGCCUUGUUACUCUACC UCCACCACGCCAAGUGGUCCCAGGCCGCACCCAUGGCAGAAGG AGGAGGGCAGAAUCAUCACGAAGUGGUGAAGUUCAUGGACGUC UAUCAGCGCAGCUACUGCCAUCCAAUCGAGACACUGGUGGACA UCUUCCAGGAGUACCCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCAAGCCA UCCUGUGUGCCCCUGAUGCGAUGCGGCGGCUGCUGCAAUGACG AGGGCCUGGAGUGUGUGCCUACUGAGGAGUCCAACAUCACCAU GCAGAUUAUGCGGAUCAAACCUCACCAAGGCCAGCACAUAGGAG AGAUGAGCUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAAAG AAAGAUAGAGCAAGACAAGAGAAUCCCUGUGGGCCUUGCUCAGA GCGGAGAAAGCAUUUGUUUGUACAAGAUCCGCAGACGUGUAAA UGUUCCUGCAAGAACACAGACUCGCGUUGCAAGGCGAGGCAGC UUGAGUUAAACGAACGUACUUGCAGAUGUGACAAGCCGAGGCG GUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCU UGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACC CCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUA G3' (SEQ ID NO: 4) Em que: A, C, G & U= AMP, CMP, GMP & N1-metil-pseudoUMP,

respectivamente p = fosfato inorgânico

[0164] 9,5. SEQ ID NO: 5: Um RNA modificado codificando VEGF-A 5'7MeGpppAGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGA- GUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGAACUUU-

CUGCUGUCUUGGGUGCAUUGGAGCCUUGCCUUGCUGCUCUACC UCCACCAUGCCAAGUGGUCCCAGGCUGCACCCAUGGCAGAAGG AGGAGGGCAGAAUCAUCACGAAGUGGUGAAGUUCAUGGAUGUC UAUCAGCGCAGCUACUGCCAUCCAAUCGAGACCCUGGUGGACA UCUUCCAGGAGUACCCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCAAGCCA UCCUGUGUGCCCCUGAUGCGAUGCGGGGGCUGCUGCAAUGAC GAGGGCCUGGAGUGUGUGCCCACUGAGGAGUCCAACAUCACCA UGCAGAUUAUGCGGAUCAAACCUCACCAAGGCCAGCACAUAGGA GAGAUGAGCUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAAA GAAAGAUAGAGCAAGACAAGAAAAUCCCUGUGGGCCUUGCUCAG AGCGGAGAAAGCAUUUGUUUGUACAAGAUCCGCAGACGUGUAAA UGUUCCUGCAAAAACACAGACUCGCGUUGCAAGGCGAGGCAGC UUGAGUUAAACGAACGUACUUGCAGAUGUGACAAGCCGAGGCG GUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCU UGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACC CCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUA G3' (SEQ ID NO: 5) Em que: A, C, G & U= AMP, CMP, GMP & N1-metil-pseudoUMP, respectivamente p = fosfato inorgânico

[0165] 9,6. SEQ ID NO: 6: Um RNA modificado de VEGF-A não traduzível 5'7MeGpppGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGA- GUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCACGAACUUU-

GUGCUCUCUUGGGUGCAUUGGAGCCUUGCCUUGCUGCUCUACC UCCACCACGCCAAGUGGUCCCAGGCCGCACCCACGGCAGAAGG AGGAGGGCAGAAUCAUCACGAAGUGGUGAAGUUCACGGACGUC UAUCAGCGCAGCUACUGCCAUCCAAUCGAGACCCUCGUGGACA UCUUCCAGGAGUACCCUCACGAGAUCGAGUACAUCUUCAAGCCA UCCUGUGUGCCCCUGACGCGACGCGGGGGCUGCUGCAACGAC GAGGGCCUCGAGUGUGUGCCCACCGAGGAGUCCAACACCACCA CGCAGAUUACGCGGAUCAAACCUCACCAAGGCCAGCACAUAGGA GAGACGAGCUUCCUACAGCACAACAAACGUGAACGCAGACCAAA GAAAGAUAGAGCAAGACAAGAAAAUCCCUGUGGGCCUUGCUCAG AGCGGAGAAAGCAUUUGUUUGUACAAGAUCCGCAGACGUGUAAA CGUUCCUGCAAAAACACAGACUCGCGUUGCAAGGCGAGGCAGC UUGAGUUAAACGAACGUACUUGCAGACGUGACAAGCCGAGGCG GUGAUAAUAGGUUGGAGCCUCGGUGGCCACGCUUCUUGCCCCU UGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACC CCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3' (SEQ ID NO: 6) Em que: A, C, G & U= AMP, CMP, GMP & N1-metil-pseudoUMP, respectivamente p = fosfato inorgânico

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Nanopartícula, caracterizada pelo fato de compreender (i) um componente lipídico compreendendo um composto tendo a estrutura (Composto A) e (ii) um RNA modificado compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 e 3-5, codificando um polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2.

2. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que o componente lipídico compreende ainda um fosfolipídeo, um lipídeo estrutural e/ou um lipídeo PEG.

3. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 2, caracte- rizada pelo fato de que o fosfolipídeo é selecionado do grupo consistindo em 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-gli- cero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-fosfocolina (DMPC), 1,2-dioleoil-sn- glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diundecanoil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2- oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-di-O-octadecenil-sn-glicero- 3-fosfocolina (18:0 Diéter PC), 1-oleoil-2-colesteril-hemisuccinoil-sn-gli- cero-3-fosfocolina (OChemsPC), 1-hexadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (C16 Liso PC), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-diaraqui- donoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn-glicero-3- fosfocolina, 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16,0 PE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina, 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-di- araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina, sal de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1- glicerol) sódio (DOPG), esfingomielina e suas misturas;

o lipídeo estrutural é selecionado do grupo consistindo em colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, tomatidina, ácido ursólico, alfa-tocoferol e suas misturas; e/ou o lipídeo PEG é selecionado do grupo consistindo em uma fosfatidiletanolamina modificada com PEG, um ácido fosfatídico modifi- cado com PEG, uma ceramida modificada com PEG, uma dialquilamina modificada com PEG, um diacilglicerol modificado com PEG, um dial- quilglicerol modificado com PEG e suas misturas.

4. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que o componente lipídico compreende ainda um fosfolipídeo que é DSPC, um lipídeo estrutural que é colesterol e/ou um lipídeo PEG que é PEG-DMG.

5. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a razão N:P é de cerca de 2:1 a cerca de 30:1.

6. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 5, caracte- rizada pelo fato de que a razão N:P é de cerca de 5,67:1.

7. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 5, caracte- rizada pelo fato de que a razão N:P é de cerca de 3:1.

8. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modificado é de cerca de 10:1 a cerca de 100:1.

9. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 8, caracte- rizada pelo fato de que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modificado é de cerca de 20:1.

10. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 8, carac- terizada pelo fato de que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modificado é de cerca de 10:1.

11. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula tem um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 100 nm.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender (a) pelo menos uma nanopartícula compreendendo (i) um componente lipídico compreendendo um composto com a estrutura (Composto A) e (ii) um RNA modificado compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 e 3-5, codificando um polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2; e b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.

13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizada pelo fato de que o componente lipídico compre- ende ainda um fosfolipídeo, um lipídeo estrutural e/ou um lipídeo PEG.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 13, caracterizada pelo fato de que o fosfolipídeo é selecionado do grupo consistindo em 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-gli- cero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-fosfocolina (DMPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dipalmitoil- sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diundecanoil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-di-O- octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Diéter PC), 1-oleoil-2-coleste- ril-hemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC), 1-hexadecil-sn- glicero-3-fosfocolina (C16 Liso PC), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoco- lina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-didocosa-hexae- noil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina

(ME 16,0 PE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinole- oil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoeta- nolamina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dido- cosa-hexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal de 1,2-dioleoil-sn-gli- cero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) sódio (DOPG), esfingomielina e suas mistu- ras; o lipídeo estrutural é selecionado do grupo consistindo em colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, tomatidina, ácido ursólico, alfa-tocoferol e suas misturas; e/ou o lipídeo PEG é selecionado do grupo consistindo em uma fosfatidiletanolamina modificada com PEG, um ácido fosfatídico modifi- cado com PEG, uma ceramida modificada com PEG, uma dialquilamina modificada com PEG, um diacilglicerol modificado com PEG, um dial- quilglicerol modificado com PEG e suas misturas.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizada pelo fato de que o componente lipídico compre- ende ainda um fosfolipídeo que é DSPC, um lipídeo estrutural que é colesterol e/ou um lipídeo PEG que é PEG-DMG.

16. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, 13, 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que a razão N:P é de cerca de 2:1 a cerca de 30:1.

17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 16, caracterizada pelo fato de que a razão N:P é de cerca de 5,67:1.

18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 16, caracterizada pelo fato de que a razão N:P é de cerca de 3:1.

19. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizada pelo fato de que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modificado é de cerca de 10:1 a cerca de 100:1.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 19, caracterizada pelo fato de que a razão p/p do componente lipí- dico para o RNA modificado é de cerca de 20:1.

21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 19, caracterizada pelo fato de que a razão p/p do componente lipí- dico para o RNA modificado é de cerca de 10:1.

22. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 21, caracterizada pelo fato de que a nanopartí- cula tem um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 100 nm.

23. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 22, caracterizada pelo fato de que, quando ad- ministrada a um tecido de mamífero ou a um sujeito, a composição far- macêutica resulta em uma concentração máxima observada no plasma e/ou tecido, Cmax, do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 até cerca de 450 pg/mL de plasma ou pg/mg de tecido.

24. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 22, caracterizada pelo fato de que, quando ad- ministrada a um tecido de mamífero ou a um sujeito, a composição far- macêutica resulta em uma área total de plasma e/ou tecido sob a curva de concentração, AUC0-t, do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 até cerca de 5,500 pg*h/mL de plasma ou pg*h/mg de tecido.

25. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 22, caracterizada pelo fato de que, quando ad- ministrada a um tecido de mamífero ou a um sujeito, a composição far- macêutica resulta na produção de mais do que cerca de 400 pg/mg de tecido do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 dentro de 8 horas.

26. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 22, caracterizada pelo fato de que, quando ad- ministrada a um tecido de mamífero ou a um sujeito, a composição far- macêutica resulta na produção de mais do que cerca de 1 pg/mg de tecido do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 durante até 6 dias.

27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizada pelo fato de que o excipiente farmaceuticamente aceitável é escolhido de um solvente, meios de dispersão, diluente, agente de dispersão, auxiliar de suspensão, tensoativo, agente isotô- nico, agente espessante ou emulsionante, conservante, polímero, pep- tídeo, proteína, célula, hialuronidase e suas misturas.

28. Método para promover e/ou melhorar a cicatrização de feridas em um sujeito, caracterizado pelo fato de compreender adminis- trar ao sujeito uma quantidade eficaz da nanopartícula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou a composição farma- cêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 27.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o componente lipídico da nanopartícula compreende ainda um fosfolipídeo, um lipídeo estrutural e um lipídeo PEG.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o fosfolipídeo é selecionado do grupo consistindo em 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-fosfocolina (DMPC), 1,2-dioleoil-sn- glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diundecanoil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2- oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-di-O-octadecenil-sn-glicero- 3-fosfocolina (18:0 Diéter PC), 1-oleoil-2-colesteril-hemisuccinoil-sn-gli- cero-3-fosfocolina (OChemsPC), 1-hexadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (C16 Liso PC), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-diaraqui- donoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn-glicero-3- fosfocolina, 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16,0 PE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-

fosfoetanolamina, 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-di- araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-didocosa-hexaenoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina, sal de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1- glicerol) sódio (DOPG), esfingomielina e suas misturas; o lipídeo estrutural é selecionado do grupo consistindo em colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, tomatidina, ácido ursólico, alfa-tocoferol e suas misturas; e/ou o lipídeo PEG é selecionado do grupo consistindo em uma fosfatidiletanolamina modificada com PEG, um ácido fosfatídico modifi- cado com PEG, uma ceramida modificada com PEG, uma dialquilamina modificada com PEG, um diacilglicerol modificado com PEG, um dial- quilglicerol modificado com PEG e suas misturas.

31. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o componente lipídico compreende ainda um fosfolipí- deo que é DSPC, um lipídeo estrutural que é colesterol e/ou um lipídeo PEG que é PEG-DMG.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizada pelo fato de que a razão N:P da nanopartícula é de cerca de 2:1 a cerca de 30:1.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a razão N:P da nanopartícula é de cerca de 5,67:1.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a razão N:P da nanopartícula é de cerca de 3:1.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34, caracterizada pelo fato de que a razão p/p do componente lipí- dico para o RNA modificado é de cerca de 10:1 a cerca de 100:1.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modifi- cado é de cerca de 20:1.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a razão p/p do componente lipídico para o RNA modifi- cado é de cerca de 10:1.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 37, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula tem um diâmetro médio de cerca de 70 nm a cerca de 80 nm.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula tem um diâmetro médio de cerca de 72 nm.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 39, caracterizada pelo fato de que a administração resulta em uma concentração máxima observada no plasma e/ou tecido, Cmax, do poli- peptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 até cerca de 450 pg/mL de plasma ou pg/mg de tecido.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 39, caracterizada pelo fato de que a administração resulta em uma área total de plasma e/ou tecido sob a curva de concentração, AUC0-t, do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 até cerca de 5,500 pg*h/mL de plasma ou pg*h/mg de tecido.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 39, caracterizada pelo fato de que a administração resulta na pro- dução de mais do que cerca de 400 pg/mg de tecido do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 dentro de 8 horas.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 39, caracterizada pelo fato de que a administração resulta na pro- dução de mais do que cerca de 1 pg/mg de tecido do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 durante até 6 dias.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 39, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula ou a composição farmacêutica é administrada por via intradérmica.

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 39, caracterizada pelo fato de que a concentração do RNA modifi- cado é de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 39, caracterizada pelo fato de que a administração resulta em um aumento da produção do polipeptídeo VEGF-A da SEQ ID NO: 2 por um fator de cerca de 5 a cerca de 100, quando comparado com uma admi- nistração do RNA modificado em um tampão salino de citrato.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 39, caracterizada pelo fato de que o sujeito sofre de diabetes.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 39, caracterizada pelo fato de que a ferida é uma ferida cirúrgica, uma queimadura, uma ferida abrasiva, um local de biópsia da pele, uma ferida crônica, uma lesão (por exemplo, uma ferida de lesão traumática), uma ferida de enxerto, uma ferida diabética, uma úlcera diabética (por exemplo, úlcera de pé diabético), uma úlcera por pressão, escaras e suas combinações.

49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 39, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica com- preende um excipiente farmaceuticamente aceitável, preferencialmente um solvente, meios de dispersão, diluente, agente de dispersão, auxiliar de suspensão, tensoativo, agente isotônico, agente espessante ou emulsionante, conservante, polímero, peptídeo, proteína, célula, hialu- ronidase e suas misturas.

50. Método para induzir neovascularização em um tecido de mamífero ou em um sujeito, caracterizado pelo fato de compreender ad- ministrar ao tecido de mamífero ou sujeito uma quantidade eficaz da nanopartícula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou a composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 27.

51. Método para induzir angiogênese em um tecido de ma- mífero ou em um sujeito, caracterizado pelo fato de compreender admi- nistrar ao tecido de mamífero ou sujeito uma quantidade eficaz da na- nopartícula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou a composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 12 a 27.

52. Método para aumentar a densidade capilar e/ou arteríola em um tecido de mamífero ou em um sujeito, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao tecido de mamífero ou sujeito uma quanti- dade eficaz da nanopartícula, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 11, ou a composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 27.