CN111356444A - 用于递送编码vegf-a多肽的经修饰的rna的脂质纳米颗粒 - Google Patents

用于递送编码vegf-a多肽的经修饰的rna的脂质纳米颗粒 Download PDF

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Abstract

本披露涉及包含脂质组分和编码VEGF‑A多肽的经修饰的RNA的纳米颗粒。本披露的方面进一步涉及包含脂质组分和编码VEGF‑A多肽的经修饰的RNA的纳米颗粒用于改善受试者的伤口愈合的用途。

Description

用于递送编码VEGF-A多肽的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒
1.相关申请的交叉引用
本申请要求2017年10月31日提交的美国临时专利申请号62/579,671的优先权，将其通过引用以其整体并入本文。
2.序列表
本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2018年10月31日，名称为09963_0092-00304_SL.txt并且大小为11，396字节。
3.技术领域
本披露涉及包含脂质组分和编码VEGF-A多肽的经修饰的RNA的纳米颗粒。本披露的方面进一步涉及包含脂质组分和编码VEGF-A多肽的经修饰的RNA的纳米颗粒用于改善受试者的伤口愈合的用途。
4.背景技术
血管内皮生长因子A(VEGF-A)途径在伤口愈合过程(包括受损组织的血运重建、改善血管通透性和新血管的形成(血管生成))中起关键作用。递送药剂以增加VEGF-A途径用于潜在的治疗效果(例如改善受试者的伤口愈合)仍然具有挑战性。
已经尝试了多种方法以允许临床上易处理的方法来增加靶组织中的VEGF-A蛋白。但是，每种方法都有明显的缺点。例如，全身VEGF-A蛋白递送可导致明显的低血压，并且VEGF-A迅速降解。病毒性包封的和裸的VEGF-A DNA质粒对蛋白质表达的时间控制有限，并且体内表达的效率可以是高度可变的和非剂量依赖性的。结果是这些限制约束了增加VEGF-A水平作为治疗剂的适用性。
另一个最新发展是递送编码VEGF-A蛋白的治疗性RNA。然而，由于此类RNA分子的相对不稳定性和低细胞渗透性，将天然RNA递送至细胞可能具有挑战性。同样，天然RNA可以触发免疫激活(参见例如Kaczmarek等人，“Advances in the delivery of RNAtherapeutics：from concept to clinical reality[RNA疗法的递送进展：从概念到临床现实]，”Genome Med.[基因组医学]，2017，9：60)，这限制了它们将VEGF-A蛋白递送至靶组织的用途。
因此，仍然需要允许有效和安全地递送编码VEGF-A蛋白的RNA的组合物。另外，仍然需要替代方法来增加VEGF-A途径用于潜在的治疗效果，例如改善受试者的伤口愈合。
5.发明内容
本披露涉及包含脂质组分和编码VEGF-A多肽的经修饰的RNA的纳米颗粒。本披露的方面进一步涉及包含脂质组分和编码VEGF-A多肽的经修饰的RNA的纳米颗粒用于改善受试者的伤口愈合的用途。
在以下段落中概述了本披露的某些实施例。此列表仅是示例性的，并且不是本披露提供的所有实施例的详尽列举。
实施例1.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
(i)脂质组分，所述脂质组分包含具有结构
Figure BDA0002473325660000021
的化合物(化合物A)，和
(ii)经修饰的RNA，所述经修饰的RNA包含编码SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的SEQID NO：1和3-5中的任一个。
实施例2.如实施例1所述的纳米颗粒，其中所述脂质组分进一步包含磷脂、结构脂质和/或PEG脂质。
实施例3.如实施例2所述的纳米颗粒，其中所述磷脂选自由以下组成的组：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-双十一碳酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0二醚PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其混合物；
所述结构脂质选自下组，该组由以下组成：胆固醇、粪甾醇(fecosterol)、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、及其混合物；和/或
所述PEG脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油、及其混合物。
实施例4.如实施例1所述的纳米颗粒，其中所述脂质组分进一步包含为DSPC的磷脂、为胆固醇的结构脂质和/或为PEG-DMG的PEG脂质。
实施例5.如实施例1-4中任一项所述的纳米颗粒，其中N∶P比率为约2∶1至30∶1。
实施例6.如实施例5所述的纳米颗粒，其中N∶P比率为约5.67∶1。
实施例7.如实施例5所述的纳米颗粒，其中N∶P比率为约3∶1。
实施例8.如实施例1-4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1至约100∶1。
实施例9.如实施例8所述的纳米颗粒，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约20∶1。
实施例10.如实施例8所述的纳米颗粒，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1。
实施例11.如实施例1-4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的平均直径为约50nm至100nm。
实施例12.一种药物组合物，所述药物组合物包含
(a)至少一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含(i)脂质组分，所述脂质组分包含具有结构
Figure BDA0002473325660000041
的化合物(化合物A)，和(ii)经修饰的RNA，所述经修饰的RNA包含编码SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的SEQ ID NO：1和3-5中的任一个；和
(b)药学上可接受的赋形剂。
实施例13.如实施例12所述的药物组合物，其中所述脂质组分进一步包含磷脂、结构脂质和/或PEG脂质。
实施例14.如实施例13所述的药物组合物，其中所述磷脂选自由以下组成的组：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-双十一碳酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0二醚PC)，1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其混合物；
所述结构脂质选自下组，该组由以下组成：胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、及其混合物；和/或
所述PEG脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油、及其混合物。
实施例15.如实施例12所述的药物组合物，其中所述脂质组分进一步包含为DSPC的磷脂、为胆固醇的结构脂质和/或为PEG-DMG的PEG脂质。
实施例16.如实施例12-15中任一项所述的纳药物组合物，其中N∶P比率为约2∶1至30∶1。
实施例17.如实施例16所述的药物组合物，其中N∶P比率为约5.67∶1。
实施例18.如实施例16所述的药物组合物，其中N∶P比率为约3∶1。
实施例19.如实施例12-18中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1至约100∶1。
实施例20.如实施例19所述的药物组合物，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约20∶1。
实施例21.如实施例19所述的药物组合物，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1。
实施例22.如实施例12-21中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒的平均直径为约50nm至100nm。
实施例23.如实施例12至22中任一项所述的药物组合物，其中当向哺乳动物组织或受试者施用时，所述药物组合物导致SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的最大观察到的血浆和/或组织浓度C最大达到约450pg/ml血浆或pg/mg组织。
实施例24.如实施例12至22中任一项所述的药物组合物，其中当向哺乳动物组织或受试者施用时，所述药物组合物导致SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的浓度曲线下血浆和/或组织总面积AUC0-t达到约5,500pg*h/ml血浆或pg*h/mg组织。
实施例25.如实施例12至22中任一项所述的药物组合物，其中当向哺乳动物组织或受试者施用时，所述药物组合物导致在8小时内产生大于约400pg/mg组织的SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽。
实施例26.如实施例12至22中任一项所述的药物组合物，其中当向哺乳动物组织或受试者施用时，所述药物组合物导致长达6天产生大于约1pg/mg组织的SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽。
实施例27.如实施例12所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。
实施例28.一种用于促进和/或改善受试者的伤口愈合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施例1-11中任一项所述的纳米颗粒或如实施例12-27中任一项所述的药物组合物。
实施例29.如实施例28所述的方法，其中所述纳米颗粒的脂质组分进一步包含磷脂、结构脂质和PEG脂质。
实施例30.如实施例29所述的方法，其中所述磷脂选自由以下组成的组：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-双十一碳酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0二醚PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其混合物；
所述结构脂质选自下组，该组由以下组成：胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、及其混合物；和/或
所述PEG脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油、及其混合物。
实施例31.如实施例28所述的方法，其中所述脂质组分进一步包含为DSPC的磷脂、为胆固醇的结构脂质和/或为PEG-DMG的PEG脂质。
实施例32.如实施例28-31中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒的N∶P比率为约2∶1至约30∶1。
实施例33.如实施例32所述的方法，其中所述纳米颗粒的N∶P比率为约5.67∶1。
实施例34.如实施例32所述的方法，其中所述纳米颗粒的N∶P比率为约3∶1。
实施例35.如实施例28-34中任一项所述的方法，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1至约100∶1。
实施例36.如实施例35所述的方法，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约20∶1。
实施例37.如实施例35所述的方法，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1。
实施例38.如实施例28-37中任一项所述的纳方法，其中所述纳米颗粒的平均直径为约70nm至约80nm。
实施例39.如实施例38所述的方法，其中所述纳米颗粒的平均直径为约72nm。
实施例40.如实施例28-39中任一项所述的方法，其中所述施用导致SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的最大观察到的血浆和/或组织浓度C最大达到约450pg/ml血浆或pg/mg组织。
实施例41.如实施例28-39中任一项所述的方法，其中所述施用导致SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的浓度曲线下血浆和/或组织总面积AUC0-t达到约5,500pg*h/ml血浆或pg*h/mg组织。
实施例42.如实施例28-39中任一项所述的方法，其中所述施用导致在8小时内产生大于约400pg/mg组织的SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽。
实施例43.如实施例28-39中任一项所述的方法，其中所述施用导致长达6天产生大于约1Pg/mg组织的SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽。
实施例44.如实施例28-39中任一项所述的方法，其中将所述纳米颗粒或所述药物组合物皮内施用。
实施例45.如实施例28-39中任一项所述的方法，其中所述经修饰的RNA的浓度为约0.01mg/kg至约10mg/kg。
实施例46.如实施例28-39中任一项所述的方法，其中与在柠檬酸盐水缓冲液中施用经修饰的RNA相比，所述施用导致SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的产生增加约5至约100倍。
实施例47.如实施例28-39中任一项所述的方法，其中所述受试者患有糖尿病。
实施例48.如实施例28-39中任一项所述的方法，其中所述伤口是手术伤口、烧伤、擦伤、皮肤活检部位、慢性伤口、损伤(例如外伤性伤口)、移植伤口、糖尿病伤口、糖尿病性溃疡(例如糖尿病足溃疡)、压迫性溃疡、褥疮及其组合。
实施例49.如实施例28-39任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂，优选地，溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。
实施例50.一种用于诱导哺乳动物组织或受试者中新生血管形成的方法，所述方法包括向所述哺乳动物组织或受试者施用有效量的如实施例1-11中任一项所述的纳米颗粒或如实施例12-27中任一项所述的药物组合物。
实施例51.一种用于诱导哺乳动物组织或受试者中血管生成的方法，所述方法包括向所述哺乳动物组织或受试者施用有效量的如实施例1-11中任一项所述的纳米颗粒或如实施例12-27中任一项所述的药物组合物。
实施例52.一种增加哺乳动物组织或受试者中毛细血管和/或小动脉密度的方法，所述方法包括向所述哺乳动物组织或所述受试者施用有效量的如实施例1-11中任一项所述的纳米颗粒或如实施例12-27中任一项所述的药物组合物。
6.附图说明
本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明的目的。附图并不旨在以任何方式限制本传授内容的范围。
图1：图1示出了实例中使用的脂质化合物(化合物A)。
图2A和图2B：经修饰VEGF-A RNA构建体的结构图(图2A)和代表性的VEGF-A的经修饰的RNA的序列(SEQ ID NO：1，图2B)。
图3：分别皮内注射100μg柠檬酸盐水中配制的VEGF-A的经修饰的RNA(三角形，虚线)和3μg脂质纳米颗粒(LNP)中配制的VEGF-A的经修饰的RNA(圆形，实线)后长达144小时，皮肤活检物中人VEGF-A蛋白含量随时间的变化。线表示每个时间点的中位数。
图4：分别皮内注射100μg柠檬酸盐水中配制的VEGF-A的经修饰的RNA(三角形，虚线)和3μg LNP中配制的VEGF-A的经修饰的RNA(圆形，实线)后长达48小时，皮肤活检物中人VEGF-A蛋白含量随时间的变化。线表示每个时间点的中位数。
图5：皮内注射以下组合物后伤口愈合的百分比：(1)包含1μg VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物(n＝6)、(2)包含3μg VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物(n＝6)、(3)包含3μg不可翻译的VEGF-A RNA(n＝6)、和(4)包含100μg VEGF-A的经修饰的RNA的柠檬酸盐水组合物(n＝7)。
图6：皮内注射以下组合物后伤口愈合的百分比：(1)包含3μg VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物(n＝5)、(2)包含3μg不可翻译的VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物(n＝5)、和(3)不包含任何经修饰的RNA的柠檬酸盐水组合物(n＝5)。
图7：皮内注射以下组合物后伤口愈合的百分比：(1)包含3μg VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物(n＝6)、(2)不包含任何经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物(n＝5)、(3)包含3μg GFP修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物(n＝6)、和(4)不包含任何经修饰的RNA(n＝6)的柠檬酸盐水组合物。
图8：皮内注射以下组合物后伤口愈合的百分比：(1)包含3μg不可翻译的VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物(n＝7)、(2)包含100μg VEGF-A的经修饰的RNA的柠檬酸盐组合物(n＝7)、(3)包含100μg不可翻译的VEGF-A修的经饰的RNA的柠檬酸盐组合物(n＝7)、和(4)不包含任何经修饰的RNA的柠檬酸盐水组合物(n＝7)。
7.具体实施方式
将本披露引用的所有参考文献通过引用以其整体通过并入本文。
本披露所属领域的技术人员可从前文描述和相关附图中获益进而想出本文阐述的披露内容的许多改进形式和其他实施例。因此，应当理解本披露不限于披露的具体实施例，并且改进和其他实施例旨在包括于所附权利要求书的范围内。尽管本文使用特殊术语，它们仅以通用和描述性意义而非限制目的使用。
单位、前缀以及符号可以它们SI公认的形式来表示。除非另有说明，否则核酸以5′至3′方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左至右书写。数值范围包括定义所述范围的数字。本文中对数值范围的描述仅旨在用作逐个提及落入所述范围内的各个独立值的一种简化方法。除非在本文中另有说明，否则将各个独立的值并入说明书中，就如同在本文中对它进行了逐个描述一样。本文中氨基酸可以通过它们的通常已知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical NomenclatureCommission)推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸可以通过它们的通常接受的单字母代码来提及。
7.1.定义
除非另外确切定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本披露所属领域的技术人员通常所理解的相同的意义。除非另有说明，本文采用或考虑的技术是本领域普通技术人员熟知的标准方法。除非另外说明，本披露的实践将使用本领域技术范围内的微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学以及重组DNA技术的常规技术。这些材料、方法、和实例仅是说明性的并且不是限制性的。以下通过说明的方式呈现，并非旨在限制本披露的范围。
在一些实施例中，在说明书中阐述的数字参数(权利要求全部并入其中)是近似值，其可以根据由特定实施例寻求获得的期望性质而变化。在一些实施例中，这些数值参数应该按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入技术(rounding technique)来解释。虽然阐述本披露的一些实施例的广泛范围的数字范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可能地精确地报道。在本披露的一些实施例中呈现的数值可含有由其各自测试测量中发现的标准偏差必然导致的某些误差。本文中对数值范围的描述仅旨在用作逐个提及落入所述范围内的各个独立值的一种简化方法。除非在本文中另有说明，否则将各个独立的值并入说明书中，就如同在本文中对它进行了逐个描述一样。
为方便，这里收集了在整个申请(包括本说明书、实例和所附权利要求书)中使用的某些术语。除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本披露所属领域的技术人员通常所理解的相同的意义。
在一些实施例中，用于描述和要求保护本披露的某些实施例的表达成分的数量、性质(例如分子量)、反应条件和结果等的数字应理解为在某些情况下被术语“约”修饰。本领域普通技术人员将在限定值的上下文中理解术语“约”的含义。在一些实施例中，术语“约”用于表示一个值包括用于确定所述值的设备或方法的平均值的标准偏差。在一些实施例中，在说明书中阐述的数字参数(权利要求全部并入其中)是近似值，其可以根据由特定实施例寻求获得的期望性质而变化。在一些实施例中，这些数值参数应该按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入技术(rounding technique)来解释。虽然阐述本披露的一些实施例的广泛范围的数字范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可能地精确地报道。在本披露的一些实施例中呈现的数值可含有由其各自测试测量中发现的标准偏差必然导致的某些误差。
如本文所用，术语“施用”是指通过导致纳米颗粒和/或组合物至少局部定位在所需部位或组织位置的方法或途径将纳米颗粒和/或包含至少一种纳米颗粒的药物组合物放置在哺乳动物组织或受试者中。在一些实施例中，可以通过皮内途径施用包含脂质组分和经修饰的RNA的纳米颗粒。在一些实施例中，由经修饰的RNA表达的蛋白质的至少一部分通过皮内施用定位到期望的靶组织或靶细胞位置。
术语“药物组合物”是指含有一种或多种治疗活性成分和载体或赋形剂(例如本领域常规的药学上可接受的载体或赋形剂)的混合物。例如，本文所用的药物组合物通常至少包含根据本披露的脂质组分、经修饰的RNA和合适的赋形剂。
术语“化合物”包括所示结构的所有同位素和异构体。“同位素”是指具有相同原子序数但质量数不同的原子，其由核中不同数目的中子产生。例如，氢的同位素包括氚和氘。此外，本披露的化合物、盐或复合物可以与溶剂或水分子组合制备，以通过常规方法形成溶剂化物和水合物。“异构体”意指化合物的任何几何异构体、互变异构体、两性离子、立体异构体、对映异构体或非对映异构体。化合物可以包括一个或多个手性中心和/或双键，因此可以立体异构体(例如双键异构体或非对映异构体)存在。本披露涵盖本文所述化合物的任何和所有异构体，所述异构体包括立体异构纯形式以及对映体和立体异构体混合物，例如外消旋体。化合物的对映体和立体异构体混合物以及将它们分解成其组分对映体或立体异构体的方法是本领域熟知的。
术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式连接动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态例如“包含(comprises、comprising)”、“具有(has、having)”、“包括(includes、including)”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有那一个或多个步骤，并且还可以涵盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个特征的任何组合物不限于仅具有那一个或多个特征并且可以涵盖其他未列出的特征。本文关于某些实施例提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本披露，而不对另外要求保护的本披露范围做出限制。说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本披露所必需的。
术语“基本上由......组成”允许存在“不实质地影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的”其他材料或步骤。
术语“由......组成”是指如本文所述的组合物、方法、及其对应的组分，其排除在该实施例的这个说明中没有描述的任何要素。
如本文所用，术语“递送”意指向目的地提供实体。例如，向受试者递送治疗剂可涉及向受试者施用包含至少一种包含经修饰的RNA的纳米颗粒的药物组合物(例如，通过皮内途径)。向哺乳动物组织或受试者施用包含至少一种纳米颗粒的药物组合物可包括使一种或多种细胞与药物组合物接触。
术语“疾病”或“障碍”在本文中可互换使用，并且是指身体或一些器官状态的任何交替，中断或干扰功能的表现和/或引起患病的人或与人接触的那些诸如不适、功能障碍、危难、或甚至死亡的症状。疾病或障碍也可与瘟热、病态(ailing)、小病(ailment)、病疾(malady)、患病(sickness)、病(illness)、抱怨、不舒服或感染有关。
如本文所用，术语“有效量”是指足以减少疾病或障碍的至少一种或多种症状或提供期望的效果的治疗剂(例如经修饰的RNA)或药物组合物的量。例如，它可以是引起与伤口愈合有关的症状或临床标志的治疗上显著减少的量。
如本文所用，核酸序列的“表达”是指一个或多个以下事件：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如通过剪接、编辑、5′帽形成和/或3′末端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
如本文所用，术语“脂质组分”是包括一种或多种脂质的纳米颗粒的组分。例如，脂质组分可以包括一种或多种阳离子/可电离的、PEG化的、结构的或其他脂质，例如磷脂。在一个实施例中，脂质组分包含化合物A(图1)。
如本文使用的，术语“经修饰的RNA”是指与腺苷(A)((2R，3R，4S，5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)氧杂戊环-3，4-二醇)、鸟苷(G)(2-氨基-9-[3，4-二羟基-5-(羟基甲基)氧杂戊环-2-基]-3H-嘌呤-6-酮)、胞苷(C)(4-氨基-1-[3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基]嘧啶-2-酮)和尿苷(U)(1-[(3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)氧杂戊环-2-基]嘧啶-2，4-二酮)相比，或与RNA分子中的AMP、GMP、CMP和UMP或其一部分相比，包含一处、两处或多于两处核苷经修饰的RNA分子。在本说明书的其他地方提供了核苷修饰的非限制性实例。另外，当特定要求保护的RNA的核苷酸序列与天然存在的RNA分子的序列相同时，经修饰的RNA被理解为是具有与天然对应物存在的那些不同的至少一处经修饰的RNA分子。差异可在于核苷/核苷酸的化学变化或序列内所述变化的位置。在一个实施例中，经修饰的RNA是经修饰的信使RNA(或“经修饰的mRNA”)。在一些实施例中，经修饰的RNA包括至少一个被修饰以形成N1-甲基-假UMP的UMP。在一些实施例中，所有经修饰的RNA中的UMP已经被N1-甲基-假UMP替代。
如本文所用，“纳米颗粒”是包含一种或多种脂质和一种或多种治疗剂的颗粒。纳米颗粒的尺寸量级通常为微米或更小，并且可包括脂质双层。在一些实施例中，通过动态光散射测量(参见NIST特别出版物1200-6，“Measuring the Size of Nanoparticles inAqueous Media Using Batch Mode Dynamic Light Scattering[使用批量模式动态光散射测量水性介质中纳米粒子的尺寸]”)纳米颗粒的平均直径(例如，流体动力学直径)为约50nm与约100nm之间，例如直径为约60nm与约90nm之间、70nm与80nm之间。在一些实施例中，纳米颗粒的平均动力学直径为约71nm、72nm、73nm、74nm、75nm、76nm、77nm、78nm、79nm、80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm或90nm。在一些实施例中，治疗剂是经修饰的RNA。在一些实施例中，纳米颗粒包含如图1所示的化合物A和经修饰的RNA。
如本文所用，“多分散指数(pDI)”是纳米颗粒样品中纳米颗粒尺寸分布的量度(参见NIST特别出版物1200-6，“Measuring the Size of Nanoparticles in Aqueous MediaUsing Batch Mode Dynamic Light Scattering[使用批量模式动态光散射测量水性介质中纳米粒子的尺寸]”)。在一些实施例中，多分散指数为约0.10与0.20之间，例如约0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19或0.20。
如本文所用，“N∶P比率”是脂质中的可电离的(在生理pH范围内)氮原子与RNA(例如，包括脂质组分和经修饰的RNA的纳米颗粒中的RNA)中的磷酸基团的摩尔比。
如本文使用，术语“核酸”在其最广泛的意义上包括包含通过磷酸二酯键连接的核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物通常称为寡核苷酸或多核苷酸，这取决于大小。术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本文中也可互换使用。
如本文所用，“PEG脂质”或“PEG化脂质”是指包含聚乙二醇组分的脂质。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围，适合用于与人类和动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。药物审批机构(例如EMA，US-FDA)提供指导并审批药学上可接受的化合物、材料、组合物和/或剂型。实例列在药典中。
术语“药学上可接受的赋形剂”在本文中用于指代选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物的药学上可接受的物质。在一些实施例中，所述溶剂是水性溶剂。
如本文所用，“磷脂”是包括磷酸酯部分和一个或多个碳链(例如不饱和脂肪酸链)的脂质。磷脂可包括一个或多个多(例如两个或三个)键(例如一个或多个不饱和)。特定的磷脂可以促进与膜的融合。例如，阳离子磷脂可以与膜(例如，细胞或细胞内膜)的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可允许含脂质组合物的一种或多种元素穿过膜，从而允许例如将一种或多种元素递送至细胞。
如本文使用，“多肽”意指很多时候由肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然的)的聚合物。如本文使用，所述术语是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽以及肽。多肽可以是单分子或者可以是多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽例如抗体或胰岛素，并且可以缔合或连接。最常见的二硫键见于多链多肽中。术语多肽还可以适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
如本文使用，“蛋白质”是基本上由20个氨基酸中的任何氨基酸组成的聚合物。虽然“多肽”通常用于提及相对较大的多肽，而“肽”通常用于提及小多肽，但本领域中这些术语的使用重叠并且是变化的。本文中术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”有时可以互换使用。
术语“受试者”是指用本文所述的方法和组合物向其提供治疗(包括预防性治疗)的动物，例如人。对于治疗对特定的动物如人类受试者是特异性的那些病症或疾病状态，术语受试者是指所述特定的动物。
术语“组织”是指一起执行某些特定功能的类似特化细胞的组或层。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment、或treating)”是指改善或消除疾病或病症或其至少一种可识别的症状。在一些实施例中，“治疗”是指改善或消除患者不一定可识别的至少一个可测量的物理参数。
应当理解的是，本披露不限于在此所述的特定方法、方案、以及试剂等等，并且因此可以变化。本文所使用的术语的目的仅在于描述特定的实施例，并且不意在限制本披露的范围，本披露的范围仅由权利要求书限定。
7.2.脂质组分
纳米颗粒包含包括化合物A(图1)的脂质组分。另外的化合物在WO 2017/049245A2中披露(参见，例如，WO 2017/049245 A2中的化合物1-147)，其通过引用以其整体并入本文。脂质组分还可以包括多种其他脂质，例如磷脂、结构脂质和/或PEG脂质。
磷脂
纳米颗粒的脂质组分可以包括一种或多种磷脂，例如一种或多种(多)不饱和脂质。磷脂可以组装成一个或多个脂质双层。通常，磷脂可以包括磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
用于组合物和方法中的磷脂可以选自由以下组成的非限制性的组：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-双十一碳酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0二醚PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16LysoPC)、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、和鞘磷脂。在一些实施例中，脂质组分包括DSPC。在一些实施例中，脂质组分包括DOPE。在一些实施例中，脂质组分包括DSPC和DOPE。
结构脂质
纳米颗粒的脂质组分可以包括一种或多种结构脂质。结构脂质可选自，但不限于胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚、及其混合物。在一些实施例中，结构脂质是胆固醇。在一些实施例中，结构脂质包括胆固醇和皮质类固醇(例如泼尼松龙、地塞米松、泼尼松和氢化可的松)、或其组合。在一些实施例中，脂质组分包括胆固醇。
PEG脂质
纳米颗粒的脂质组分可以包括一种或多种PEG或PEG修饰的脂质。可替代地，这些脂质可称为PEG化脂质。PEG脂质是用聚乙二醇修饰的脂质。PEG脂质可以选自由以下组成的非限制性组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油、及其混合物。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG(1，2-二肉豆蔻酰基-OT-甘油甲氧基聚乙二醇，从阿万蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids)，阿拉巴斯特(Alabaster)，洛杉矶获得)、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。在一些实施例中，脂质组分包括PEG-DMG。
7.3.编码VEGF-A多肽的经修饰的RNA
它在治疗剂、诊断剂、试剂和生物测定能够在细胞内(无论是体外、体内、原位或离体)递送核酸(例如核糖核酸(RNA))例如以引起核酸的细胞内翻译和所编码的感兴趣多肽的产生的领域中具有极大意义。
天然存在的RNA由四种基本核糖核苷酸合成：ATP、CTP、UTP和GTP，但可能含有转录后修饰的核苷酸。此外，在RNA中已鉴定出大约一百种不同的核苷修饰(Rozenski，J，Crain，P，and McCloskey，J.，The RNA Modification Database：1999update[RNA修饰数据库：1999更新]，Nucl Acids Res[核酸研究]，(1999)27：196-197)。
根据本披露，优选地修饰这些RNA以避免本领域其他RNA分子的缺陷(例如，激活先天免疫应答并在给予时快速降解)。因此，这些多核苷酸被称为经修饰的RNA。在一些实施例中，经修饰的RNA在给予受试者时避免了先天免疫应答。在一些实施例中，与未经修饰的RNA相比，经修饰的RNA的半衰期延长。
在优选的实施例中，所述RNA分子是信使RNA(mRNA)。如本文使用，术语“信使RNA”(mRNA)是指编码感兴趣的多肽并且能够体外、体内、原位或离体翻译产生所编码的感兴趣多肽的任何多核苷酸。
如图2A所示，传统上，mRNA分子的基本组分至少包括编码区、5′非翻译区(UTR)、3′非翻译区(UTR)、5′帽和聚(A)尾。基于这种野生型模块化结构，本披露通过提供保持模块化组织但包含一个或多个赋予多核苷酸有用性质的结构修饰和/或化学修饰或者改变(在一些实施例中，包括缺乏对细胞(其中引入多核苷酸)的先天免疫应答的实质诱导)的多核苷酸或初级RNA构建体来扩展传统mRNA分子的功能范围。
经修饰的RNA可以包括相对于标准RNA核苷酸链，对例如糖、核碱基(例如，核碱基的一个或多个修饰，例如通过用任选取代的氨基、任选取代的硫基、任选取代的烷基(例如甲基或乙基)或卤素(例如氯或氟)替换或取代嘧啶核碱基的原子))或核苷间键(例如，对磷酸二酯骨架的一个或多个修饰)的任何有用的修饰。
作为非限制性实例，在一些实施例中，经修饰的RNA可包括例如经修饰以形成N1-甲基-假UMP的至少一个单磷酸尿苷(UMP)。在一些实施例中，N1-甲基-假UMP代替UMP，以0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99.9％和100％的UMP百分比存在于序列中。在一些实施例中，所有UMP已经被N1-甲基-假UMP替代。
在一些实施例中，经修饰的RNA包含对5′帽(例如5′二鸟苷帽)的修饰。在一些实施例中，经修饰的RNA包含对编码区的修饰。在一些实施例中，经修饰的RNA包含对5′UTR的修饰。在一些实施例中，经修饰的RNA包含对3′UTR的修饰。在一些实施例中，经修饰的RNA包含对聚(A)尾的修饰。在一些实施例中，经修饰的RNA包含对编码区、5′帽、5′UTR、3′UTR或聚(A)尾的修饰的任何组合。在一些实施例中，经修饰的RNA可任选地用碱性磷酸酶处理。
在一些实施例中，修饰的RNA编码血管内皮生长因子(VEGF)多肽(通常在伤口愈合的调节中起核心作用的VEGF蛋白的大家族中的任一个)。VEGF的作用还包括一氧化氮(NO)信号传导的激活、发育性和产后血管生成、肿瘤血管生成、动脉生成、内皮细胞复制以及多潜能心血管祖细胞的细胞命运转变。
本领域技术人员将理解，对于任何特定的VEGF基因，可存在一种或多种变体或同种型。根据本披露的VEGF-A多肽的非限制性实例列于表1中。本领域技术人员将理解，表1中披露的序列含有潜在的侧翼区。这些在每个核苷酸序列中编码到开放阅读框的5′(上游)或3′(下游)。通过教示核苷酸参考序列明确且具体地披露了开放阅读框。还可以通过利用一个或多个可用数据库或算法来进一步表征5′和3′侧翼区。数据库已经注释了包含在NCBI序列的侧翼区中的所述特征，并且这些在本领域中是可用的。
表1：智人VEGF-A mRNA同种型。
Figure BDA0002473325660000221
Figure BDA0002473325660000231
本领域技术人员将理解，可以根据表1中列出的VEGF-A mRNA同种型设计编码VEGF-A多肽，例如人VEGF-A多肽的RNA分子。本领域普通技术人员通常熟悉剩余VEGF家族成员的多种同种型。
在一个实施例中，本披露提供编码VEGF-A多肽(例如SEQ ID NO：2)的经修饰的RNA。在一些实施例中，经修饰的RNA编码VEGF-A多肽，其中经修饰的RNA包含SEQ ID NO：1和3-5中的任一个。在一些实施例中，经修饰的RNA进一步包含5′帽、5′UTR、3′UTR、聚(A)尾或其任何组合。在一些实施例中，5′帽、5′UTR、3′UTR、聚(A)尾或其任何组合可以包括一个或多个经修饰的核苷酸。
在一些实施例中，编码VEGF-A多肽的经修饰的RNA可以具有如图2B所示的结构，其为SEQ ID NO：1。在一些实施例中，编码VEGF-A多肽的经修饰的RNA可以具有SEQ ID NO：3-5中任一个的序列。
7.4.包含脂质组分和经修饰的RNA的组合物
一些实施例涉及包括脂质组分和经修饰的RNA的纳米颗粒。
在一些实施例中，纳米颗粒的脂质组分可以包括化合物A(图1)。在一些实施例中，纳米颗粒的脂质组分可以进一步包括本文所披露的磷脂、结构脂质和/或PEG脂质。例如，在一些实施例中，纳米颗粒的脂质组分可包括DSPC、胆固醇、PEG-DMG及其混合物。
脂质组分的元素可以按特定的比例提供。在一些实施例中，纳米颗粒的脂质组分包括化合物A、磷脂、结构脂质和PEG脂质。在一些实施例中，纳米颗粒的脂质组分包括约30mol％至约60mol％的化合物A、约0mol％至约30mol％的磷脂、约18.5mol％至约48.5mol％的结构脂质、和约0mol％至约10mol％的PEG脂质，其条件是总摩尔％不超过100％。在一些实施例中，纳米颗粒的脂质组分包括约35mol％至约55mol％的化合物A、约5mol％至约25mol％的磷脂、约30mol％至约40mol％的结构脂质、和约0mol％至约10mol％的PEG脂质。在一些实施例中，脂质组分包括约50mol％的化合物A、约10mol％的磷脂、约38.5mol％的结构脂质和约1.5mol％的PEG脂质。在一些实施例中，磷脂可以是DOPE。在一些实施例中，结构脂质可以是胆固醇。在一些实施例中，PEG脂质可以是PEG-DMG。
在一些实施例中，纳米颗粒的经修饰的RNA组分可以包括编码本文披露的VEGF-A多肽(例如，SEQ ID NO：2)的经修饰的RNA。在一些实施例中，纳米颗粒的经修饰的RNA组分可包括包含SEQ ID NO：1和3-5中任一项的经修饰的RNA。在一些实施例中，经修饰的RNA进一步包含5’帽、5’UTR、3’UTR、聚(A)尾或其任何组合。在一些实施例中，5’帽、5’UTR、3’UTR、聚(A)尾或其任何组合可以包括一个或多个经修饰的核苷酸。
在一些实施例中，纳米颗粒中脂质组分和经修饰的RNA的相对量可以变化。在一些实施例中，纳米颗粒中脂质组分与经修饰的RNA的wt/wt比率可以为约5∶1至约100∶1，例如5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、16∶1、17∶1、18∶1、19∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1和100∶1。例如，脂质组分与经修饰的RNA的wt/wt比率可以为约10∶1至约40∶1。在一些实施例中，wt/wt比率是约20∶1。在一些实施例中，wt/wt比率是约10∶1。
在一些实施例中，纳米颗粒中脂质组分和经修饰的RNA的相对量可以以特定的N∶P比率提供。组合物的N∶P比率是指一种或多种脂质中的氮原子与RNA中磷酸基团数目的摩尔比。通常，优选较低的N∶P比率。在一些实施例中，N∶P比率可以为约2∶1至约30∶1，例如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1、22∶1、24∶1、26∶1、28∶1或30∶1。在一些实施例中，N∶P比率为约2∶1至8∶1。例如，N∶P比率可以为约3.0∶1、约3.5∶1、约4.0∶1、约4.5∶1、约5.0∶1、约5.5∶1、约5.67∶1、约6.0∶1、约6.5∶1或约7.0∶1。在一些实施例中，N∶P比率为约3∶1。在一些实施例中，N∶P比率为约5.67∶1。
脂质纳米颗粒可以使用本领域公知的方法制备(参见，例如Belliveau等人，“Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles forin vivo delivery of siRNA[用于体内递送siRNA的高效极限脂质纳米颗粒的微流体合成]，”Mol.Ther.Nucleic Acids[分子疗法核酸]，2012，1(8)：e37；Zhigaltsev等人，Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems withaqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing[使用毫秒微流控混合技术从下而上设计和合成具有水和甘油三酸酯核心的极限尺寸脂质纳米颗粒系统]，”Langmuir，2012，28(7)：3633-3640)。
在一些实施例中，当适合于所希望的具体剂型时，纳米颗粒可以另外包含药学上可接受的赋形剂，其如本文使用，包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体运载体、分散体或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等。赋形剂还可以包括但不限于聚合物、核-壳纳米粒子、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、纳米粒子模拟物及其组合。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践]，第22版，Allen，Loyd V.，Jr编辑，Pharmaceutical Press[医药出版社]；通过引用以其整体并入本文)。可以在本披露的范围内考虑使用常规赋形剂介质，除非任何常规的赋形剂介质可能与一种物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不期望的生物效应或另外以有害的方式与药物组合物的一种或多种任何其他组分相互作用。
在一些实施例中，纳米颗粒可包含药学有效量的脂质组分和经修饰的RNA，其中所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，所述药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。在一些实施例中，所述溶剂是水性溶剂。在一些实施例中，所述溶剂是非水性溶剂。
本披露还提供了药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种脂质纳米颗粒，所述纳米颗粒包含本文披露的脂质组分和经修饰的RNA、以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物组合物包含多种本文披露的脂质纳米颗粒和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，所述药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。在一些实施例中，所述溶剂是水性溶剂。在一些实施例中，所述溶剂是非水性溶剂。
7.5.改善受试者的伤口愈合
VEGF-A途径在伤口愈合过程(包括受损组织的血运重建、改善血管通透性和新血管的形成)中起关键作用。本披露的目的是治疗患有由缺陷的伤口愈合过程导致的疾病的受试者。
在一些实施例中，向患有影响血管结构的疾病的受试者施用本披露的纳米颗粒。血管结构最常因穿透性创伤、烧伤或手术而受伤。糖尿病损害伤口愈合的许多组分，并且具有糖尿病性伤口愈合的患者通常由于血管功能障碍而改变血流量。因此，患有包括糖尿病溃疡的皮肤溃疡的受试者通常伤口愈合降低或延迟。在一些实施例中，向患有糖尿病的受试者施用本文披露的纳米颗粒。在本披露的上下文中，伤口可以是例如手术伤口、烧伤、擦伤、皮肤活检部位、慢性伤口、损伤(例如外伤性伤口)、移植伤口、糖尿病伤口、糖尿病性溃疡(例如糖尿病足溃疡)、压迫性溃疡、褥疮及其组合。
在一些实施例中，包含脂质组分和经修饰的RNA(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5)的纳米颗粒可用于改善哺乳动物组织或受试者中的伤口愈合。
在一些实施例中，本文披露的纳米颗粒可用于诱导哺乳动物组织或受试者中的新血管形成。在一些实施例中，本文披露的纳米颗粒可用于诱导哺乳动物组织或受试者中的血管生成。
在一些实施例中，本文披露的纳米颗粒可用于治疗由于创伤或手术引起的血管损伤。在一些实施例中，本文披露的纳米颗粒可用于治疗涉及皮肤移植和组织移植的疾病。
本披露的其他方面涉及向有需要的受试者施用纳米颗粒。在一些实施例中，本文披露的纳米颗粒通过皮内途径施用以改善哺乳动物组织或受试者的伤口愈合。
在某些实施例中，可以按照足以递送每天约0.0001mg/kg至约100mg/kg、约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、或约1mg/kg至约25mg/kg经修饰的RNA/受试者体重的剂量水平施用本文披露的纳米颗粒，每天一次或多次，以获得所期望的治疗效果。
在一些实施例中，向患有糖尿病的受试者以单次施用的方式施用本文披露的纳米颗粒。在一些实施例中，向受试者以固定剂量多次施用的方式施用本文披露的纳米颗粒(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)。在本段的每个实施例中，“多次施用”可以彼此间隔短的(1-5分钟)、中等(6-30分钟)或长(超过30分钟，数小时或甚至数天)的时间间隔。
可以使用对治疗疾病、障碍和/或病症有效的任何施用剂量将配制品施用到受试者。根据受试者的物种、年龄、和一般状况、疾病的严重性、特定配制品、其施用方式、其活动模式等，所需的确切剂量将根据受试者的不同而不同。然而，将理解的是，组合物的总每日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体药学有效剂量水平取决于多种因素，包括疾病的严重程度，使用的具体组合物，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，施用时间，施用途径，治疗持续时间以及医学领域熟知的类似因素。
权利要求列表中的所有权利要求在本文中通过引用以其整体作为附加实施例并入本说明书中。
8.实例
8.1.实例1
纳米颗粒和柠檬酸盐水组合物的制备
脂质和经修饰的RNA：由化合物A、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，阿万蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))、胆固醇(西格玛公司(Sigma))和聚乙二醇改性的脂质(来自NOF公司(NOF Corporation)的mPEG2000-DMG)制备脂质在乙醇中的储备溶液。将脂质在99.5％的乙醇中混合至总脂质浓度为12.5mM。组合物是摩尔比为50％：10％：38.5％：1.5％的化合物A、DSPC、胆固醇、DMG-PEG。将VEGF-A的经修饰的RNA(例如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：SEQ ID NO：5)融化并在醋酸钠缓冲液和HyClone水中稀释至6.25mM，浓度与最终制剂中的5.67或3的电荷比(N∶P)相对应。稀释后的最终配方如下：
LNP 1∶11(N∶P＝3)，mRNA浓度0.06mg/mL
LNP组分 量(mg/mL)
VEGF-A的经修饰的RNA 0.06
化合物A 0.37
DSPC 0.08
胆固醇 0.16
DMG-PEG 0.04
LNP 1∶20(N∶P＝5.67)，mRNA浓度0.06mg/mL
LNP组分 量(mg/mL)
VEGF-A的经修饰的RNA 0.06
化合物A 0.70
DSPC 0.16
胆固醇 0.30
DMG-PEG 0.07
脂质纳米颗粒(LNP)组合物：通过在微流体设备上快速混合含有脂质的乙醇溶液和VEGF-A的经修饰的RNA水溶液，然后在磷酸缓冲的盐水(PBS)中进行透析，来制备LNP组合物。简而言之，使用两个注射器，以水与乙醇的体积比为3∶1，并且流速为12-14mL/min，将VEGF-A的经修饰的RNA溶液和脂质溶液注入微流体混合设备中。通过使用具有10KD截止值的膜将LNP组合物在PBS缓冲液中透析过夜来除去乙醇。通过使用具有30KD截止值的离心过滤器设备浓缩LNP组合物，并通过粒径(72nm)、VEGF-A的经修饰的RNA浓度(0.35mg/mL)、多分散指数(0.14)和包封(94％)进行表征。用PBS将LNP组合物稀释至最终浓度为0.33mg/mL，并无菌过滤。将LNP组合物冷藏保存。
柠檬酸盐水组合物：通过用HyClone水和浓缩的缓冲溶液将融化的VEGF-A的经修饰的RNA溶液稀释至pH 6.5的10mM柠檬酸钠和130mM氯化钠的最终组合物中来制备柠檬酸盐水组合物。
8.2.实例2
小鼠皮内注射人VEGF-A的经修饰的RNA后评估人VEGF-A蛋白的产生
如实施例1中所述制备包含VEGF-A的经修饰的RNA和化合物A的纳米颗粒和柠檬酸盐水组合物。在此实例中，VEGF-A的经修饰的RNA具有SEQ ID NO：3的序列。
用异氟烷麻醉雄性db/db小鼠(C57BL/6J，BKS.Cg-m+/+Leprdb/BomTac纯合子，丹麦泰克尼克公司(Taconic))。这些小鼠是II型糖尿病的确立模型，与野生型小鼠相比，伤口愈合受损。将小鼠背部剃毛，并用脱毛膏去除剩余的毛发。将柠檬酸盐水中配制的VEGF-A的经修饰的RNA(100μg)或LNP中配制的VEGF-A的经修饰的RNA(3μg)(参见实例1)以在0.785mm2的圆形面积内4次独立注射的方式(每次10μL，总体积40μL)皮内注射。在皮内注射之后的预定时间点，将小鼠麻醉，并对注射的皮肤区域取样并在液氮中速冻并储存在80℃。分析所有样品的人VEGF-A蛋白。
在注射后6、24、48、72和144小时，从用100μg在柠檬酸盐水中配制的VEGF-A的经修饰的RNA注射的db/db小鼠取样。在注射后3、6、24、48、72、144小时，收集来自用3μg在LNP中配制的VEGF-A的经修饰RNA注射的db/db小鼠的样品。
小鼠皮肤中人VEGF-A蛋白的定量
为了制备用于分析人VEGF-A蛋白含量的皮肤样品，将含有磷酸酶抑制剂I和II及蛋白酶抑制剂(中尺度发现公司(Meso Scale Discovery(MSD))，罗克维尔，马里兰州，美国)的Tris裂解缓冲液添加到冷冻的组织活组织检查物中，并在均质化之前在约20℃下冷冻。然后添加不锈钢珠粒(3mm)，并使用Precellys均化器将样品均质化。将匀浆物离心，并将上清液储存在80℃，之后分析。
使用具有电化学发光检测的夹心免疫测定法测定人VEGF-A浓度。使用
Figure BDA0002473325660000301
96-孔MULTI-
Figure BDA0002473325660000302
人VEGF-A分析试剂盒(Mesoscale公司，罗克维尔市(Rockville)，马里兰)测量组织匀浆中的VEGF-A浓度。该测定法仅检测人VEGF-A蛋白，因此仅用于测定从经修饰的RNA表达的VEGF-A。按照试剂盒说明进行所述测定。将标准品在MSD稀释剂中连续稀释。在分析之前，将高浓度的样品用MSD稀释剂稀释，以使其符合标准曲线，并在Meso ScaleDiscovery’s Sector Imager 6000上读取板。
结果
图3和图4总结了分别皮内注射在柠檬酸盐水(100μg)和LNP(3μg)中配制的VEGF-A的经修饰的RNA后，人VEGF-A蛋白产生的时间曲线和幅度。分别在6小时和3小时内产生有效的蛋白质(图4)。具体地，LNP组合物导致在8小时内产生大于约400pg/mg的VEGF-A蛋白(图4)。另外，LNP组合物导致在长达6天的时间内产生大于约1pg/mg的VEGF-A蛋白(图3)。与在柠檬酸盐水中相比，在LNP中配制VEGF-A的经修饰的RNA时，VEGF-A蛋白的产生显著增加(图3和4)。
表2总结了皮内注射在柠檬酸盐水(100μg)和LNP(3μg)中配制的VEGF-A的经修饰的RNA后获得的药代动力学参数。尽管在LNP中配制的VEGF-A的经修饰RNA的剂量仅为柠檬酸盐水中配制的VEGF-A的经修饰的RNA的3％，但LNP中配制的VEGF-A的经修饰的RNA的C最大增加了13.7倍。与在柠檬酸盐水中配制的100μg VEGF-A的经修饰的RNA相比，用LNP配制的3μg VEGF-A的经修饰的RNA的浓度曲线下总面积AUC0-t增加了6.6倍。
表2.由在两个时间序列中分别用柠檬酸盐水和LNP配制的人VEGF-A的经修饰的RNA获得的人VEGF-A浓度计算出的药代动力学参数。浓度曲线下总面积(AUC0-t)是根据剂量后直至144小时的测量数据点的中值曲线计算得出的。
Figure BDA0002473325660000321
8.3.实例3
皮内注射人VEGF-A的经修饰的RNA对伤口愈合的影响
材料和方法
如实例1中所述制备包含VEGF-A的经修饰的RNA和化合物A的脂质纳米颗粒和柠檬酸盐水组合物。在该实例中，VEGF-A的经修饰的RNA具有SEQ ID NO：4的序列。另外，如图中所示，使用不可翻译的VEGF-A的经修饰的RNA(SEQ ID NO：6)配制某些纳米颗粒或柠檬酸盐水组合物。
在4小时固定后，分析了来自美国杰克逊实验室(Jackson Lab)的雄性12周龄的db/db小鼠(B6.BKS(D)-Leprdb/J)的血糖，然后将其随机分入治疗组。用异氟烷麻醉小鼠。用电动剪毛器为每只小鼠的背表面剃毛，然后用脱毛剂去除残留的毛发。用descutan和乙醇冲洗皮肤。通过10mm活检打孔器的标记在每只小鼠的背部创建全层伤口，然后在无菌条件下切出并用Tegaderm绷带覆盖。受伤后第3天，将Tegaderm绷带摘除。纳米颗粒或柠檬酸盐水组合物在靠近伤口边缘的位置皮内注射4次(每次10μL，总体积40μL)。然后用新的Tegaderm绷带覆盖伤口。在观察期间，将小鼠分开处置以避免干扰伤口愈合。
伤口愈合是根据在固定距离和间接照明下拍摄的数字照片的时间序列(即每第3/4天至受伤后第17天)确定的。通过使用图像分析软件Image J追踪伤口边缘来确定伤口面积，然后将其计算为在刚受伤后第3天给药前基线面积的百分比面积。
用不成对的双向t检验进行统计评估，并且p值<0.05被认为是显著的。
结果
如图5所示，在第7天，与包含3μg不可翻译的VEGF-A的脂质纳米颗粒组合物以及包含100μg VEGF-A的经修饰的RNA的柠檬酸盐水组合物相比，包含1μg或3μg VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物显著改善了伤口愈合。此外，在第10天，与包含3μg不可翻译的VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物相比，包含1μg或3μg VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物显著改善了伤口愈合。在第10天，包含1μg或3μg VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物与包含100μg VEGF-A的经修饰的RNA的柠檬酸盐水组合物之间没有显著差异。
在图6中所示的单独实验中，在第7天，与包含3μg不可翻译的VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物以及不包含任何经修饰的RNA的柠檬酸盐水组合物相比，包含3μg VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物显著改善了伤口愈合。此外，在第10天，与包含3μg不可翻译的VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物相比，包含3μg VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物显著改善了伤口愈合。
图7示出了另一个伤口愈合实验。在第7天，与包含3μg GFP修饰的RNA的经的脂质纳米颗粒组合物、不包含任何经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物或不包含任何经修饰的RNA的柠檬酸盐水组合物相比，包含3μg VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物显著改善了伤口愈合。此外，在第10天，与包含3μg GFP修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物相比，包含3μg VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物显著改善了伤口愈合。
如图8显示，在第7天或第10天，皮内注射以下四种组合物后的愈合没有显著差异：(1)包含3μg不可翻译的VEGF-A的经修饰的RNA的脂质纳米颗粒组合物、、(2)包含100μgVEGF-A的经修饰的RNA的柠檬酸盐组合物(3)包含100μg不可翻译的VEGF-A的经修饰的RNA的柠檬酸盐组合物、和(4)不包含任何经修饰的RNA的柠檬酸盐水组合物。
9.序列
9.1.SEQ ID NO：1：编码VEGF-A的经修饰的RNA
Figure BDA0002473325660000341
其中：
分别地，A、C、G&U＝AMP、CMP、GMP&N1-甲基-假UMP
Me＝甲基
p＝无机磷酸盐
9.2.SEQ ID NO：2：人VEGF-A同种型VEGF-165的氨基酸序列
Figure BDA0002473325660000342
9.3.SEQ ID NO：3：编码VEGF-A的经修饰的RNA
Figure BDA0002473325660000351
其中：
分别地，A、C、G&U＝AMP、CMP、GMP&N1-甲基-假UMP
Me＝甲基
p＝无机磷酸盐
9.4.SEQ ID NO：4：编码VEGF-A的经修饰的RNA(VEGF-01-012)
Figure BDA0002473325660000352
其中：
分别地，A、C、G&U＝AMP、CMP、GMP&N1-甲基-假UMP
p＝无机磷酸盐
9.5.SEQ ID NO：5：编码VEGF-A的经修饰的RNA
Figure BDA0002473325660000361
其中：
分别地，A、C、G&U＝AMP、CMP、GMP&N1-甲基-假UMPp＝无机磷酸盐
9.6.SEQ ID NO：6：不可翻译的VEGF-A的经修饰的RNA
Figure BDA0002473325660000362
其中：
分别地，A、C、G&U＝AMP、CMP、GMP&N1-甲基-假UMP
p＝无机磷酸盐。
Figure IDA0002473325710000011
Figure IDA0002473325710000021
Figure IDA0002473325710000031
Figure IDA0002473325710000041
Figure IDA0002473325710000051
Figure IDA0002473325710000061
Figure IDA0002473325710000071
Figure IDA0002473325710000081
Figure IDA0002473325710000091
Figure IDA0002473325710000101

Claims (52)

1.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
(i)脂质组分，所述脂质组分包含具有结构
Figure FDA0002473325650000011
的化合物(化合物A)，和
(ii)经修饰的RNA，所述经修饰的RNA包含编码SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的SEQ IDNO：1和3-5中的任一个。
2.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述脂质组分进一步包含磷脂、结构脂质和/或PEG脂质。
3.如权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述磷脂选自由以下组成的组：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-双十一碳酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0二醚PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 LysoPC)、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其混合物；
所述结构脂质选自下组，该组由以下组成：胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、及其混合物；和/或
所述PEG脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油、及其混合物。
4.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述脂质组分进一步包含为DSPC的磷脂、为胆固醇的结构脂质和/或为PEG-DMG的PEG脂质。
5.如权利要求1-4中任一项所述的纳米颗粒，其中N∶P比率为约2∶1至约30∶1。
6.如权利要求5所述的纳米颗粒，其中N∶P比率为约5.67∶1。
7.如权利要求5所述的纳米颗粒，其中N∶P比率为约3∶1。
8.如权利要求1-4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1至约100∶1。
9.如权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约20∶1。
10.如权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1。
11.如权利要求1-4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的平均直径为约50nm至约100nm。
12.一种药物组合物，所述药物组合物包含
(a)至少一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含(i)脂质组分，所述脂质组分包含具有结构
Figure FDA0002473325650000021
的化合物(化合物A)，和(ii)经修饰的RNA，所述经修饰的RNA包含编码SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的SEQ ID NO：1和3-5中的任一个；和
(b)药学上可接受的赋形剂。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述脂质组分进一步包含磷脂、结构脂质和/或PEG脂质。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述磷脂选自由以下组成的组：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-双十一碳酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0二醚PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其混合物；
所述结构脂质选自下组，该组由以下组成：胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、及其混合物；和/或
所述PEG脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油、及其混合物。
15.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述脂质组分进一步包含为DSPC的磷脂、为胆固醇的结构脂质和/或为PEG-DMG的PEG脂质。
16.如权利要求12-15中任一项所述的药物组合物，其中N∶P比率为约2∶1至约30∶1。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中N∶P比率为约5.67∶1。
18.如权利要求16所述的药物组合物，其中N∶P比率为约3∶1。
19.如权利要求12-18中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1至约100∶1。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约20∶1。
21.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1。
22.如权利要求12-21中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒的平均直径为约50nm至约100nm。
23.如权利要求12-22中任一项所述的药物组合物，其中当向哺乳动物组织或受试者施用时，所述药物组合物导致SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的最大观察到的血浆和/或组织浓度C最大达到约450pg/ml血浆或pg/mg组织。
24.如权利要求12-22中任一项所述的药物组合物，其中当向哺乳动物组织或受试者施用时，所述药物组合物导致SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的浓度曲线下血浆和/或组织总面积AUC0-t达到约5,500pg*h/ml血浆或pg*h/mg组织。
25.如权利要求12-22中任一项所述的药物组合物，其中当向哺乳动物组织或受试者施用时，所述药物组合物导致在8小时内产生大于约400pg/mg组织的SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽。
26.如权利要求12-22中任一项所述的药物组合物，其中当向哺乳动物组织或受试者施用时，所述药物组合物导致长达6天产生大于约1pg/mg组织的SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽。
27.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。
28.一种用于促进和/或改善受试者的伤口愈合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所述的纳米颗粒或如权利要求12-27中任一项所述的药物组合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述纳米颗粒的脂质组分进一步包含磷脂、结构脂质和PEG脂质。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述磷脂选自由以下组成的组：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-双十一碳酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0二醚PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 LysoPC)、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其混合物；
所述结构脂质选自下组，该组由以下组成：胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、及其混合物；和/或
所述PEG脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油、及其混合物。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述脂质组分进一步包含为DSPC的磷脂、为胆固醇的结构脂质和/或为PEG-DMG的PEG脂质。
32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒的N∶P比率为约2∶1至约30∶1。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述纳米颗粒的N∶P比率为约5.67∶1。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述纳米颗粒的N∶P比率为约3∶1。
35.如权利要求28-34中任一项所述的方法，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1至约100∶1。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约20∶1。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述脂质组分与所述经修饰的RNA的wt/wt比率为约10∶1。
38.如权利要求28-37中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒的平均直径为约70nm至约80nm。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述纳米颗粒的平均直径为约72nm。
40.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中所述施用导致SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的最大观察到的血浆和/或组织浓度C最大达到约450pg/ml血浆或pg/mg组织。
41.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中所述施用导致SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的浓度曲线下血浆和/或组织总面积AUC0-t达到约5,500pg*h/ml血浆或pg*h/mg组织。
42.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中所述施用导致在8小时内产生大于约400pg/mg组织的SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽。
43.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中所述施用导致长达6天产生大于约1pg/mg组织的SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽。
44.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中将所述纳米颗粒或所述药物组合物皮内施用。
45.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中所述经修饰的RNA的浓度为约0.01mg/kg至约10mg/kg。
46.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中与施用在柠檬酸盐水缓冲液中的经修饰的RNA相比，所述施用导致SEQ ID NO：2的VEGF-A多肽的产生增加约5至约100倍。
47.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中所述受试者患有糖尿病。
48.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中所述伤口是手术伤口、烧伤、擦伤、皮肤活检部位、慢性伤口、损伤(例如外伤性伤口)、移植伤口、糖尿病伤口、糖尿病性溃疡(例如糖尿病足溃疡)、压迫性溃疡、褥疮及其组合。
49.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂，优选溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。
50.一种用于诱导哺乳动物组织或受试者中新生血管形成的方法，所述方法包括向所述哺乳动物组织或受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所述的纳米颗粒或如权利要求12-27中任一项所述的药物组合物。
51.一种用于诱导哺乳动物组织或受试者中血管生成的方法，所述方法包括向所述哺乳动物组织或受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所述的纳米颗粒或如权利要求12-27中任一项所述的药物组合物。
52.一种增加哺乳动物组织或受试者中毛细血管和/或小动脉密度的方法，所述方法包括向所述哺乳动物组织或受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所述的纳米颗粒或如权利要求12-27中任一项所述的药物组合物。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113185421A (zh) * 2020-11-27 2021-07-30 广州市锐博生物科技有限公司 脂质化合物及其组合物
CN113941011A (zh) * 2021-10-15 2022-01-18 浙江汇科泽华生物技术有限公司 一种含可离子化阳离子脂质的纳米脂质体颗粒及制备方法
CN114173826A (zh) * 2019-05-08 2022-03-11 阿斯利康(瑞典)有限公司 使用脂质纳米颗粒用于递送编码vegf-a多肽的经修饰的rna的方法和包含其的药物组合物
CN114456081A (zh) * 2022-02-15 2022-05-10 浙江汇科泽华生物技术有限公司 一种可离子化脂质及其制备方法和应用
CN115197431A (zh) * 2022-09-15 2022-10-18 清华大学 脂质偶联完全可降解水溶性聚合物的合成及应用
WO2023279836A1 (zh) * 2021-07-07 2023-01-12 天津键凯科技有限公司 一种用于核酸递送的可电离脂质化合物及其lnp组合物
CN116474120A (zh) * 2023-04-03 2023-07-25 臻赫医药(杭州)有限公司 重编程因子抗衰老mRNA组合物、制备方法及应用

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3027221A1 (en) 2013-07-30 2016-06-08 PhaseRx, Inc. Block copolymers and their conjugates or complexes with oligonucleotides
CA2974503A1 (en) 2015-01-21 2016-07-28 Phaserx, Inc. Methods, compositions, and systems for delivering therapeutic and diagnostic agents into cells
HRP20220872T1 (hr) 2015-10-22 2022-12-23 Modernatx, Inc. Cjepiva protiv respiratornih virusa
SI3464338T1 (sl) 2016-06-07 2022-02-28 Modernatx, Inc., Modificirana RNA, ki kodira polipeptide VEGF-A, formulacije in uporabe v zvezi s tem
WO2018126084A1 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Phaserx, Inc. Branched peg molecules and related compositions and methods
WO2018187590A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Modernatx, Inc. Reduction or elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
WO2018232357A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Modernatx, Inc. Rna formulations
WO2019036685A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. METHODS FOR HPLC ANALYSIS
JP7408098B2 (ja) 2017-08-18 2024-01-05 モデルナティエックス インコーポレイテッド Ｒｎａポリメラーゼバリアント
EP3668977A4 (en) 2017-08-18 2021-04-21 Modernatx, Inc. HPLC ANALYTICAL PROCESSES
EP3675817A1 (en) 2017-08-31 2020-07-08 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
BR112020008404A2 (pt) 2017-10-31 2020-11-03 Modernatx, Inc. nanopartículas lipídicas para a entrega de rna modificado codificando um polipeptídeo vegf-a
CA3150061A1 (en) * 2019-08-07 2021-02-11 Modernatx, Inc. Compositions and methods for enhanced delivery of agents
MX2022009410A (es) * 2020-01-31 2022-10-18 Modernatx Inc Metodos de preparacion de nanoparticulas lipidicas.
WO2023031394A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
WO2023073228A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 CureVac SE Improved circular rna for expressing therapeutic proteins
WO2023144330A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 CureVac SE Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors
WO2023227608A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide
WO2024037578A1 (en) * 2022-08-18 2024-02-22 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Composition of lipid nanoparticles
WO2024089638A1 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004035227A1 (de) 2004-07-21 2006-02-16 Curevac Gmbh mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen
CN102245189B (zh) 2008-12-03 2015-06-17 阿莫塞特公司 改善梗死区灌注的组合物以及血管损伤修复方法
EP2370581B1 (en) 2008-12-04 2016-08-03 CuRNA, Inc. Treatment of vascular endothelial growth factor (vegf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to vegf
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
WO2012103985A2 (en) 2010-12-16 2012-08-09 Steve Pascolo Pharmaceutical composition consisting of rna having alkali metal as counter ion and formulated with dications
EP3460064B8 (en) * 2011-04-03 2024-03-20 The General Hospital Corporation d/b/a Massachusetts General Hospital Efficient protein expression in vivo using modified rna (mod-rna)
MX2014007233A (es) * 2011-12-16 2015-02-04 Moderna Therapeutics Inc Composiciones de nucleosidos, nucleotidos y acidos nucleicos modificados.
US9283287B2 (en) * 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
EP2834259A4 (en) 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
US20140275229A1 (en) * 2012-04-02 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding udp glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide a1
US10501513B2 (en) * 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
US9663564B2 (en) * 2013-03-15 2017-05-30 The Regents Of The University Of California Vectors and methods to treat ischemia
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
SG10201801428RA (en) 2013-08-21 2018-03-28 Curevac Ag Method for increasing expression of rna-encoded proteins
JP6786392B2 (ja) 2014-01-15 2020-11-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ＦｃＲｎ結合特性が改変され、プロテインＡ結合特性が保持されているＦｃ領域変異体
WO2016118725A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
RS63030B1 (sr) * 2015-09-17 2022-04-29 Modernatx Inc Jedinjenja i kompozicije za intracelularno isporučivanje terapeutskih sredstava
SI3464338T1 (sl) 2016-06-07 2022-02-28 Modernatx, Inc., Modificirana RNA, ki kodira polipeptide VEGF-A, formulacije in uporabe v zvezi s tem
WO2018104540A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rnas for wound healing
MX2016016339A (es) 2016-12-09 2018-06-08 Desarrolladora Y Com De Tecnologias Biomedicas Decotecbio S A S De C V Composicion coadyuvante de un factor de crecimiento y un neuropeptido para acelerar la cicatrizacion de heridas y la repitelizacion de organos.
BR112020008404A2 (pt) 2017-10-31 2020-11-03 Modernatx, Inc. nanopartículas lipídicas para a entrega de rna modificado codificando um polipeptídeo vegf-a
EP3965797A1 (en) 2019-05-08 2022-03-16 AstraZeneca AB Compositions for skin and wounds and methods of use thereof

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114173826A (zh) * 2019-05-08 2022-03-11 阿斯利康(瑞典)有限公司 使用脂质纳米颗粒用于递送编码vegf-a多肽的经修饰的rna的方法和包含其的药物组合物
CN113185421A (zh) * 2020-11-27 2021-07-30 广州市锐博生物科技有限公司 脂质化合物及其组合物
WO2023279836A1 (zh) * 2021-07-07 2023-01-12 天津键凯科技有限公司 一种用于核酸递送的可电离脂质化合物及其lnp组合物
CN113941011A (zh) * 2021-10-15 2022-01-18 浙江汇科泽华生物技术有限公司 一种含可离子化阳离子脂质的纳米脂质体颗粒及制备方法
CN114456081A (zh) * 2022-02-15 2022-05-10 浙江汇科泽华生物技术有限公司 一种可离子化脂质及其制备方法和应用
CN115197431A (zh) * 2022-09-15 2022-10-18 清华大学 脂质偶联完全可降解水溶性聚合物的合成及应用
CN115197431B (zh) * 2022-09-15 2022-11-29 清华大学 脂质偶联完全可降解水溶性聚合物的合成及应用
CN116474120A (zh) * 2023-04-03 2023-07-25 臻赫医药(杭州)有限公司 重编程因子抗衰老mRNA组合物、制备方法及应用

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