BR112020007302B1 - Anticorpos ativáveis conjugados anti-cd71, método para fabrica-los, composição farmacêutica e kit que compreende os mesmos, usos dos ditos anticorpos, bem como método in vitro para detectar a presença ou ausência do agente de clivagem na amostra - Google Patents

Anticorpos ativáveis conjugados anti-cd71, método para fabrica-los, composição farmacêutica e kit que compreende os mesmos, usos dos ditos anticorpos, bem como método in vitro para detectar a presença ou ausência do agente de clivagem na amostra Download PDF

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Abstract

A invenção refere-se geralmente a anticorpos ativáveis conjugados que se ligam a CD71 em sua forma ativa e a métodos de produção e utilizaçãoa desses anticorpos ativáveis conjugados antiCD71 em uma variedade de indicações terapêuticas, de diagnóstico e profiláticas

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório n° U.S. 62/572.467, depositado em 14 de outubro de 2017, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência na sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] A “Listagem de Sequências” submetida eletronicamente de modo simultâneo, de acordo com o 37 CFR § 1.821 no formato legível por computador (CFR) via EFS-Web como nome de arquivo “CYTM056001US_12OCT2018_FINAL_ST25.txt”, é incorporada aqui por referência. A cópia eletrônica da Listagem de Sequências foi criada em 12 de outubro de 2018, e o tamanho do disco é de 96 quilobytes.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A invenção refere-se geralmente a conjugados fármaco-anticorpos ativáveis (AADC) que se ligam a CD71 em um estado ativado e a métodos para fabricar e usar esses anticorpos ativáveis conjugados anti-CD71 em uma variedade de indicações terapêuticas, de diagnóstico e profiláticas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] As terapias baseadas em anticorpos provaram tratamentos eficazes para várias doenças, mas em alguns casos, as toxicidades devido à expressão ampla do alvo limitaram sua eficácia terapêutica. Além disso, a terapêutica baseada em anticorpos exibiu outras limitações, como a rápida remoção da circulação após a administração.
[005] No campo da terapêutica de pequenas moléculas, estratégias foram desenvolvidas para fornecer pró-fármacos de uma entidade química ativa. Tais pró- fármacos são administrados em uma forma relativamente inativa (ou significativamente menos ativa). Uma vez administrado, o pró-fármaco é metabolizado in vivo no composto ativo. Tais estratégias de pró-fármacos podem proporcionar maior seletividade do fármaco para seu alvo pretendido e uma redução de efeitos adversos.
[006] Consequentemente, existe uma necessidade continuada no campo da terapêutica baseada em anticorpos para anticorpos que imitem as características desejáveis do pró-fármaco de moléculas pequenas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] A divulgação fornece anticorpos ativáveis conjugados que se ligam especificamente ao CD71, também conhecido como proteína 1 do receptor de transferrina (TfR1).
[008] Em um aspecto da invenção, é aqui fornecido um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (I) ou um sal da mesma:
Figure img0001
Fórmula (I)
[009] em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11; e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) LP1 é uma primeira porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (v) LP2 é uma segunda porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e (b) em que “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[010] Em um aspecto relacionado da invenção, é aqui proporcionado um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo um sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 7; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) LP1 é uma primeira porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (v) LP2 é uma segunda porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e (b) em que “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[011] Em um aspecto relacionado da invenção, é aqui proporcionado um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 19; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) LP1 é uma primeira porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (v) LP2 é uma segunda porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e (b) em que “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C- terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[012] Em um aspecto relacionado da invenção, é aqui fornecido um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo em que MM-LP1-CM-LP2-AB é um anticorpo ativável, em que o AB é um anticorpo que especificamente liga-se ao CD71 humano, em que o anticorpo ativável compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 169 e em que “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[013] Em um aspecto relacionado da invenção, é aqui fornecido um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo em que MM-LP1-CM-LP2-AB é um anticorpo ativável, em que o AB é um anticorpo que especificamente liga-se ao CD71 humano, em que o anticorpo ativável compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 170 em que “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[014] Em um aspecto relacionado da invenção, é fornecido neste documento um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (II) ou um sal da mesma:
Figure img0002
Fórmula (II)
[015] em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11; e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; e (iii) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) em que “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (II) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II), em que o glutamato N-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[016] Em um aspecto relacionado da invenção, é aqui proporcionado um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo um sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 7; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; e (iii) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) em que “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (II) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C- terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II), em que o glutamato N- terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[017] Em um aspecto relacionado da invenção, é fornecido neste documento um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 19; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; e (iii) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) em que “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (II) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II), em que o glutamato N-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[018] Em um aspecto relacionado da invenção, é aqui fornecido um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo em que MM-LP1-CM-LP2-AB é um anticorpo ativável, em que o AB é um anticorpo que especificamente liga-se ao CD71 humano, em que o anticorpo ativável compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 169 e em que “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (II) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II), em que o glutamato N-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[019] Em um aspecto relacionado da invenção, é aqui fornecido um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo em que MM-LP1-CM-LP2-AB é um anticorpo ativável, em que o AB é um anticorpo que especificamente liga-se ao CD71 humano, em que o anticorpo ativável compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 170 e em que “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (II) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II), em que o glutamato N-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[020] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidos métodos de fabricação de um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo, em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma variável de cadeia pesada região compreendendo uma sequência CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11; e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) LP1 é uma primeira porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (v) LP2 é uma segunda porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e (b) em que “n” é 2; o método compreendendo (i) reduzir um anticorpo ativável compreendendo MM-LP1-CM-LP2-AB com um agente redutor; e (ii) conjugar um ou mais vcMMAE com o anticorpo ativável reduzido. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[021] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidos métodos de fabricação de um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo, em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma variável de cadeia pesada região compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 7; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) LP1 é uma primeira porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (v) LP2 é uma segunda porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e (b) em que “n” é 2; o método compreendendo (i) reduzir um anticorpo ativável compreendendo MM-LP1-CM-LP2-AB com um agente redutor; e (ii) conjugar um ou mais vcMMAE com o anticorpo ativável reduzido. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[022] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidos métodos de fabricação de um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo, em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 19; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) LP1 é uma primeira porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (v) LP2 é uma segunda porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e (b) em que “n” é 2; o método compreendendo (i) reduzir um anticorpo ativável compreendendo MM-LP1-CM-LP2-AB com um agente redutor; e (ii) conjugar um ou mais vcMMAE com o anticorpo ativável reduzido. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[023] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidos métodos de fabricação de um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo em que MM-LP1-CM-LP2-AB é um anticorpo ativável, em que o AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano, em que o anticorpo ativável compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 169; e (b) em que “n” é 2; o método compreendendo (i) reduzir um anticorpo ativável compreendendo MM-LP1-CM-LP2-AB com um agente redutor; e (ii) conjugar um ou mais vcMMAE com o anticorpo ativável reduzido. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[024] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidos métodos de fabricação de um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo em que MM-LP1-CM-LP2-AB é um anticorpo ativável, em que o AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano, em que o anticorpo ativável compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 170; e (b) em que “n” é 2; o método compreendendo (i) reduzir um anticorpo ativável compreendendo MM-LP1-CM-LP2-AB com um agente redutor; e (ii) conjugar um ou mais vcMMAE com o anticorpo ativável reduzido. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[025] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidos métodos de fabricação de um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo, em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma variável de cadeia pesada região compreendendo uma sequência CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11; e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) em que “n” é 2; o método compreendendo (i) reduzir um anticorpo ativável compreendendo MM-LP1-CM-LP2-AB com um agente redutor; e (ii) conjugar um ou mais vcMMAE com o anticorpo ativável reduzido. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[026] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidos métodos de fabricação de um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo, em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma variável de cadeia pesada região compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 7; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) em que “n” é 2; o método compreendendo (i) reduzir um anticorpo ativável compreendendo MM-LP1-CM-LP2- AB com um agente redutor; e (ii) conjugar um ou mais vcMMAE com o anticorpo ativável reduzido. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós- traducionalmente para piroglutamato.
[027] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidos métodos de fabricação de um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo, em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 19; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) em que “n” é 2; o método compreendendo (i) reduzir um anticorpo ativável compreendendo MM-LP1-CM-LP2- AB com um agente redutor; e (ii) conjugar um ou mais vcMMAE com o anticorpo ativável reduzido. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós- traducionalmente para piroglutamato.
[028] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidos métodos de fabricação de um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo em que MM-LP1-CM-LP2-AB é um anticorpo ativável, em que o AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano, em que o anticorpo ativável compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 169; e (b) em que “n” é 2; o método compreendendo (i) reduzir um anticorpo ativável compreendendo MM-LP1-CM-LP2-AB com um agente redutor; e (ii) conjugar um ou mais vcMMAE com o anticorpo ativável reduzido. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[029] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidos métodos de fabricação de um anticorpo ativável conjugado compreendendo a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo em que MM-LP1-CM-LP2-AB é um anticorpo ativável, em que o AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano, em que o anticorpo ativável compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 170; e (b) em que “n” é 2; o método compreendendo (i) reduzir um anticorpo ativável compreendendo MM-LP1-CM-LP2-AB com um agente redutor; e (ii) conjugar um ou mais vcMMAE com o anticorpo ativável reduzido. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[030] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidas composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo ativável conjugado de uma iteração da Fórmula (I) ou Fórmula (II). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem compreender um veículo farmaceuticamente aceitável.
[031] Em outro aspecto da invenção, são aqui fornecidos métodos de tratamento, alívio de um sintoma ou atraso da progressão de um câncer em um indivíduo, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ativável conjugado de Fórmula (I) ou Fórmula (II), ou a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ativável conjugado de uma iteração da Fórmula (I) ou da Fórmula (II) e um opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável, para um indivíduo em necessidade do mesmo por um câncer selecionado do grupo que consiste em: câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama ER +, câncer de mama triplo negativo, câncer colorretal, melanoma, câncer de próstata, mieloma múltiplo, linfoma difuso de células B grandes, células pequenas de cabeça e pescoço carcinoma, câncer de pâncreas, mesotelioma, linfoma não Hodgkin, carcinoma hepatocelular e glioblastoma.
[032] Em outro aspecto da invenção, é aqui fornecido um anticorpo ativável conjugado compreendendo (a) um anticorpo ativável (AA) compreendendo em um estado não clivado a disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB, em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 de mamífero e compreende a sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5 e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 7; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM acoplado ao AB inibe a ligação do AB ao CD71 quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156 acoplada ao AB, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) monometil auristatina E (MMAE), em que o anticorpo ativável é conjugado com dois equivalentes de MMAE. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado em que o AB é um anticorpo com uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado em que o glutamato do N- terminal na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[033] Em outro aspecto da invenção, é aqui fornecido um anticorpo ativável conjugado com a fórmula AA-(AG) p, em que (a) AA é um anticorpo ativável compreendendo em um estado não clivado a disposição estrutural do terminal N ao terminal C, como segue: MM-CM-AB, em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 de mamífero e compreende a sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5 e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 7; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM acoplado ao AB inibe a ligação do AB ao CD71 quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156 acoplada ao AB, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) AG é um agente conjugado ao AA, em que o agente é MMAE e em que p é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado em que o AB é um anticorpo com uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado em que o glutamato do N- terminal na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[034] Em outro aspecto da invenção, é aqui fornecido um método de fabricação de um anticorpo ativável conjugado compreendendo (a) conjugação de pelo menos um MMAE a um anticorpo ativável (AA) produzindo assim uma composição compreendendo AA- (MMAE) p, em que p é 1 a 8; e (b) enriquecer a composição para as espécies de anticorpos ativáveis conjugados em que p é 2, em que AA compreende em um estado não clivado compreende a disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB em que AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 de mamífero e compreende a sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5 e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 7; (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM acoplado ao AB inibe a ligação do AB ao CD71 quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156 acoplada ao AB, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) AG é um agente conjugado ao AA, em que o agente é MMAE e em que p é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado em que o AB é um anticorpo com uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado em que o glutamato do N-terminal na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[035] Em outro aspecto da invenção, é aqui proporcionado qualquer anticorpo ativável conjugado, ou uma composição farmacêutica, como divulgada neste documento, para uso como medicamento.
[036] Em outro aspecto da invenção, é aqui fornecido qualquer anticorpo ativável conjugado, ou uma composição farmacêutica, como divulgada aqui, para uso no tratamento de câncer, opcionalmente em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em: câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama ER+, câncer de mama triplo negativo, câncer colorretal, melanoma, câncer de próstata, mieloma múltiplo, linfoma difuso de células B grandes, carcinoma de células pequenas de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas, mesotelioma, linfoma não Hodgkin, carcinoma hepatocelular e glioblastoma.
[037] Em outro aspecto da invenção, é aqui proporcionado um kit que compreende pelo menos um anticorpo ativável, como divulgado aqui. O kit pode ainda compreender um ou mais vcMMAE e/ou um agente redutor.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[038] A Figura 1, como discutido no Exemplo 5, descreve ensaios imuno- histoquímicos exemplificadores (IHC) para determinar os níveis de expressão de CD71 em vários tipos de tecido de câncer primário e metastático. Os resultados exemplificadores mostrados nesta figura e exemplo mostraram que o CD71 é expresso em altos níveis em tumores primários de uma variedade de cânceres humanos.
[039] A Figura 2, como discutido no Exemplo 5, descreve estudos exemplificadores do nível de expressão de CD71 em várias amostras de câncer metastático derivado do paciente. Os resultados exemplificadores mostrados nesta figura e exemplo mostraram que o CD71 é expresso em altos níveis em tumores metastáticos em uma variedade de cânceres humanos.
[040] As Figuras 3A e 3B, como discutido no Exemplo 4, descrevem um ensaio in vitro exemplificador da capacidade de anticorpos ativáveis anti-CD71 não conjugados e conjugados da divulgação para ligar CD71 recombinante humano ou de cinomolgo quando o anticorpo ativável estiver intacto ou ativado proteoliticamente (denotado como “AJA”). Os resultados exemplificadores mostrados nessas figuras e exemplo mostraram que o anticorpo ativável conjugado anti-CD71 se ligou a CD71 em níveis comparáveis aos seus homólogos de anticorpos ativáveis anti-CD71 não conjugados e também ambos ligaram CD71 com uma afinidade aumentada equivalente após a ativação da protease.
[041] As Figuras 3C e 3D, como discutido no Exemplo 4, descrevem um ensaio in vitro exemplar da capacidade de anticorpos ativáveis anti-CD71 não conjugados e conjugados da divulgação para ligar CD71 humano ou CD71 cinomolgo em uma superfície celular quando o anticorpo ativável está intacto ou ativado proteoliticamente (denotado como “ACT”). Os resultados exemplificadores mostrados nestas figuras e exemplo mostraram que o anticorpo ativável conjugado anti-CD71 se ligou à CD71 da superfície celular em níveis comparáveis aos seus equivalentes de anticorpo ativável anti-CD71 não conjugado e também ambos CD71 da superfície celular ligada com uma afinidade aumentada equivalente após ativação da protease.
[042] As Figuras 4A, 4B e 4C, como discutido no Exemplo 6, descrevem estudos de eficácia exemplificadores de anticorpos ativáveis conjugados com anti- CD71 (AADCs) da presente divulgação em um modelo de xenoenxerto de camundongo (anti-CD71 TF01-3011-MMAE versus anti-CD71 TF02.13-2011-MMAE). Esses resultados exemplificadores mostrados nestas figuras e no exemplo que um AADC com a porção de mascaramento de afinidade mais baixa (TF02.13) demonstrou uma eficácia mais alta do que um AADC com a porção de mascaramento de afinidade mais alta (TF01).
[043] A Figura 5, como discutido no Exemplo 7, descreve um estudo de eficácia exemplar de anticorpos ativáveis conjugados com anti-CD71 (AADCs) da presente divulgação em um modelo de xenoenxerto de camundongo. Os resultados exemplificadores mostrados nesta figura e exemplo demonstram que a eficácia do AADC indicado (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE) com um substrato menos clivável é substancialmente o mesmo que a eficácia do AADC (anti-CD71 TF02. 13-3011- vcMMAE) com um substrato mais clivável mostrado nas Figuras 4B e 4C.
[044] As Figuras 6A, 6B, 6C e 6D, como discutido no Exemplo 8, descrevem estudos de eficácia exemplificadores de anticorpos ativáveis conjugados com anti- CD71 (AADCs) com diferentes DAR (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE com DAR ~3 versus anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2 com um DAR ~2) da presente divulgação em um modelo de xenoenxerto de camundongo. Os resultados exemplificadores mostrados nessas figuras e exemplo demonstram que a eficácia de AADCs com combinação de dose (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE) com DARs diferentes mostrou eficácia comparável.
[045] As Figuras 7A, 7B e 7C, como discutido no Exemplo 9, mostram fluxos de trabalho esquemáticos exemplificadores para analisar produtos metabólicos resultantes da administração de anticorpos ativáveis conjugados anti-CD71 (AADCs) da presente divulgação.
[046] As Figuras 8A, 8B, 9A, 9B, 10 e 11, como discutido nos Exemplos 1114, representam cursos de tempo exemplificadores de subprodutos metabólicos após a administração de anticorpos ativáveis conjugados anti-CD71 (AADCs) da presente divulgação em um modelo animal. Os resultados exemplificadores mostrados nessas figuras e exemplo demonstram que a quantidade de AADC total e intacta da presente divulgação (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) é mantida nos animais durante toda a dosagem em uma quantidade proporcional à dose, e a quantidade de MMAE que é conjugada com o anticorpo ativável é substancialmente maior que a quantidade de MMAE não conjugado durante a dosagem e em todos os níveis de dosagem.
[047] A Figura 12, como discutido no Exemplo 17, descreve titulação exemplificadora dos artigos de teste indicados para o fragmento de proteína iC3b, representando sua capacidade de ativar a cascata de complemento. Os resultados exemplificadores mostrados nesta figura e exemplo demonstram que o AADC da presente divulgação (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) demonstrou uma menor capacidade de ativação do complemento em comparação com seu anticorpo ativável não conjugado.
[048] A Figura 13, como discutido no Exemplo 19, representa uma eficácia exemplar do AADC da presente divulgação (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) em um modelo de xenoenxerto de camundongo usando linhagens celulares colorretais humanas. Os resultados exemplificadores mostrados nesta figura e exemplo demonstram que o AADC da presente divulgação mostrou inibição significativa do crescimento do tumor em todas as dosagens, com regressão completa observada nas doses mais altas.
[049] A Figura 14, como discutido no Exemplo 20, descreve uma eficácia exemplificadora do AADC da presente divulgação (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) em um modelo de xenoenxerto de camundongo usando tumores humanos derivados de pacientes (DLBCL). Os resultados exemplificadores mostrados nesta figura e exemplo demonstram que o AADC da presente divulgação mostrou inibição significativa do crescimento do tumor após uma única administração, com respostas completas observadas em alguns casos.
[050] As Figuras 15A, 15B e 15C, como discutido no Exemplo 21, descrevem a eficácia exemplar do AADC da presente divulgação (anti-CD71 TF02.13-2011- vcMMAE E2) em modelos de xenoenxerto (PDX) derivado de paciente em camundongo. Os resultados exemplificadores mostrados nessas figuras e exemplo demonstram que o AADC da presente divulgação demonstrou eficácia, incluindo respostas completas em alguns casos, em modelos de PDX derivados de uma variedade de tipos de câncer humano.
[051] A Figura 16, como discutido no Exemplo 22, descreve uma eficácia exemplar do AADC da presente divulgação (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) em um modelo de xenoenxerto derivado de paciente de camundongo. Os resultados exemplificadores mostrados nesta figura e exemplo demonstram que o AADC da presente divulgação demonstrou eficácia, incluindo respostas completas em alguns casos, ao modelo de câncer de pâncreas PDX.
[052] A Figura 17, como discutido no Exemplo 10, resume os resultados que mostram anticorpos ativáveis por CD71 anti-humano com toxinas conjugadas (AADCs) da presente divulgação (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) são bem tolerados e estáveis em macacos cinomolgos, mesmo em doses relativas mais altas, em comparação com o correspondente anticorpo anti-CD71 conjugado (ADCs), os AADCs com substrato com maior clivabilidade e os AADCs com DAR mais alto.
[053] As Figuras 18A, 18B e 18C, como discutido no Exemplo 27, mostram o perfil de espécies presentes no HIC, presentes em anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE não purificado e anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2, não purificado bem como a sua taxa de depuração em ratos. Essas figuras e exemplo mostram que o anti-CD71- TF02.13-2011-vcMMAE E2 migra como uma única espécie de conjugado e tem uma taxa de depuração mais baixa.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[054] A presente divulgação fornece anticorpos ativáveis conjugados com anti-CD71 que se ligam especificamente a CD71 em um estado ativado. O CD71 também é conhecido como proteína 1 do receptor da transferrina (TfR1). Geralmente, a presente divulgação é direcionada a um anticorpo ativável conjugado com anti-CD71 compreendendo uma porção de mascaramento, uma porção clivável, um ligante vc e uma toxina MMAE. A porção de mascaramento (MM) reduz a capacidade do local de ligação do anticorpo para se ligar ao seu antígeno alvo CD71 quando o anticorpo ativável está em um estado não clivado; a porção clivável (CM) é um substrato ativável por protease que é clivado no microambiente do tumor, resultando na remoção da porção da máscara e ativação concomitante das CDRs direcionadas ao anti-CD71. Especificamente, a presente divulgação descreve a seleção de um anticorpo monoclonal ativável conjugado com anti-CD71 que possui eficácia e tolerabilidade superior a outros anticorpos monoclonais ativáveis conjugados com anti-CD71, de outro modo conhecidos na técnica, devido ao fato de possuir a combinação exclusiva de uma porção de mascaramento de afinidade mais baixa, um substrato de porção menos clivável e uma baixa carga de fármacos de 2, que coletivamente resulta em eficácia e tolerabilidade significativamente melhoradas em modelos de tumores de camundongo. Além disso, o anticorpo monoclonal ativável conjugado com anti-CD71 também surpreendentemente não possui a capacidade de se ligar ao receptor inibidor de FcYRIIb, ao contrário de outros anticorpos contendo um IgG1 Fc de tipo selvagem, o que é importante porque a ligação a esses receptores é conhecida por inibir processos dependentes de cálcio como desgranulação, fagocitose, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), liberação de citocinas e ativação pró-inflamatória, os quais seria esperado que resultassem em menor eficácia se o receptor FcYRIIb fosse ativado.
[055] CD71 é um receptor de superfície celular que é expresso em células em divisão, incluindo células cancerígenas. É expresso em altos níveis em uma ampla variedade de tipos de células cancerígenas e o CD71 é internalizado, tornando-o um alvo atraente para a terapia de câncer direcionada usando toxinas conjugadas direcionadas a anticorpos. As porções de mascaramento (MM) com afinidades mais altas e mais baixas, bem como porções cliváveis (CM) com clivabilidade menor ou maior, foram identificadas e usadas para construir uma variedade de anticorpos ativáveis e, em seguida, anticorpos conjugados vcMMAE (ou seja, conjugados fármaco-anticorpos ativáveis ou AADC). Estudos de eficácia exemplificadores desses anticorpos ativáveis conjugados em um modelo de xenoenxerto de camundongo mostraram que os AADCs com porções de mascaramento de afinidade mais altas (por exemplo, CD71-TF01-3011-vcMMAE) demonstraram menor eficácia do que aqueles com máscaras de afinidade mais baixa (por exemplo, CD71-TF02.13- 3011-vcMMAE). Além disso, outros estudos de eficácia usando AADCs com a mesma máscara de afinidade mais baixa, mas com substratos de clivabilidade diferente, mostraram que, embora a eficácia fosse a mesma, em primatas não humanos o AADC com o substrato menos clivável (CD71-TF02.13-2011-vcMMAE) foi mais bem tolerada e com níveis mais baixos de AADC circulante na forma ativada em comparação com o AADC com o substrato mais clivável (CD71-TF02.13-3011-vcMMAE), proporcionando assim um maior índice terapêutico. Estudos posteriores mostraram que os AADCs com uma proporção mais baixa de anticorpo para anticorpo ativável (por exemplo, CD71- TF02.13-3011-vcMMAE E2, em que DAR é 2) foram mais tolerados em doses mais altas em comparação ao mesmo anticorpo ativável conjugado, com DAR mais alto (ou seja, DAR ~3). Além disso, o CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2 mostrou eficácia equivalente com dosagens correspondentes à dose à DAR AADC mais alta em uma variedade de modelos de câncer humano em CDX e PDX. Finalmente, CD71- TF02.13-3011-vcMMAE E2 mostrou tolerabilidade significativa ao seu homólogo não mascarado, o que não foi tolerado em doses nem baixas.
[056] Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais ativáveis conjugados são internalizados por células contendo CD71. O uso do termo “CD71” destina-se a cobrir qualquer variação do mesmo, como, a título de exemplo não limitativo, CD-71 e/ou CD 71, e todas as variações são aqui utilizadas de forma intercambiável.
[057] CD71 é uma glicoproteína transmembranar que se liga principalmente à transferrina. CD71 é essencial para a homeostase celular. O CD71 é reciclado continuamente através da endocitose mediada por ligante, quando o ligante principal é a transferrina. Sabe-se também que o CD71 é expresso de forma ubíqua nas células em divisão.
[058] Expressão aberrante e/ou atividade de sinalização relacionada a CD71 e CD71 têm sido implicadas na patogênese de muitas doenças e distúrbios, como o câncer. O CD71 está superexpresso em muitos cânceres, incluindo cânceres sólidos e hematológicos. CD71 tem ampla expressão da superfície celular. O CD71 em células malignas medeia uma maior absorção de ferro necessária para a divisão celular. CD71 também está associado a mau prognóstico nas leucemias. O CD71 é um alvo desejável porque é predominante em várias indicações de câncer.
[059] A divulgação fornece anticorpos anti-CD71 ativáveis conjugados que são úteis em métodos de tratamento, prevenção, atraso na progressão, melhoria e/ou alívio de um sintoma de uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou atividade aberrante de CD71. Por exemplo, os anticorpos anti-CD71 ativáveis são utilizados em métodos de tratamento, prevenção, atraso na progressão, melhoria e/ou alívio de um sintoma de um câncer ou outra condição neoplásica.
[060] A divulgação fornece anticorpos anti-CD71 ativáveis conjugados que são úteis em métodos de tratamento, prevenção, atraso na progressão, melhoria e/ou alívio de um sintoma de uma doença ou distúrbio associado a células que expressam CD71. Em algumas modalidades, as células estão associadas à expressão e/ou atividade aberrante de CD71. Em algumas modalidades, as células estão associadas à expressão e/ou atividade normal de CD71. Por exemplo, os anticorpos anti-CD71 ativáveis são utilizados em métodos de tratamento, prevenção, atraso na progressão, melhoria e/ou alívio de um sintoma de um câncer ou outra condição neoplásica.
[061] A divulgação fornece anticorpos anti-CD71 ativáveis conjugados que são úteis em métodos de tratamento, prevenção, retardamento da progressão, melhoria e/ou alívio de um sintoma de uma doença ou distúrbio no qual as células doentes expressam CD71. Em algumas modalidades, as células doentes estão associadas à expressão e/ou atividade aberrante de CD71. Em algumas modalidades, as células doentes estão associadas à expressão e/ou atividade normais de CD71. Por exemplo, os anticorpos anti-CD71 ativáveis são utilizados em métodos de tratamento, prevenção, atraso na progressão, melhoria e/ou alívio de um sintoma de um câncer ou outra condição neoplásica.
[062] Os anticorpos anti-CD71 ativáveis conjugados incluem um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD71 acoplado a uma porção de mascaramento (MM), de modo que o acoplamento da MM reduz a capacidade do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno para ligar o CD71. Em algumas modalidades, a MM é acoplada por meio de uma sequência que inclui um substrato para uma protease, por exemplo, uma protease que é colocalizada com CD71 no local de tratamento de um indivíduo.
[063] Anticorpos anti-CD71 ativáveis exemplificativos da invenção incluem, por exemplo, anticorpos ativáveis que incluem uma cadeia pesada e uma cadeia leve que são, ou são derivadas das sequências variáveis da cadeia pesada e variáveis da cadeia leve mostradas abaixo (as sequências CDR são mostradas em negrito e sublinhado): muM21 VH: EVQLQESGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIG AIYPGNSETGYN Q NFKGKAKLTAVTSASTAYM DLSSLTNED SAVYYCTRENWDPGF AFWGQGTLITVSA (SEQ ID NO: 1) muM21 VL: DIVMTQTPAIMSASPGEKVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGTSPKLWIYSTS NLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRRNYPYTFGGGTKLEIKR A (SEQ ID NO: 2) cadeia pesada variável hu2vHa QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWM GAIYPGNSETGYAQ KFQGRVTMTRDTSTSTVYM ELSSLRSE DTAVYYCARENWDP GFAFWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3) cadeia pesada variável hu2vHb QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWI GAIYPGNSETGYAQ KFQGRATLTADTSTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCTRENWDP GFAFWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4) cadeia pesada variável hu2vHc QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWI GAIYPGNSETGYAQ KFQGRATLTADTSTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCTRENWDP GFAFWGQGTLITVSS (SEQ ID NO: 5) cadeia leve variável hu21vKa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWYQQKPGKAPKLLIYSTS NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 6) cadeia leve variável hu21vKb DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTS NLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 7) cadeia leve variável hu21vKc DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTS NLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 8)
[064] Anticorpos anti-CD71 ativáveis exemplificativos da invenção incluem, por exemplo, anticorpos ativáveis que incluem uma combinação de uma sequência variável da região 1 da determinação da complementaridade da cadeia pesada (VH CDR1, também aqui referida como CDRH1), uma sequência variável da região 2 de determinação da complementaridade da cadeia pesada (VH CDR2, também aqui referida como CDRH2), uma sequência variável da região 3 de determinação da complementaridade da cadeia pesada (VH CDR3, também aqui referida como CDRH3), uma sequência variável da região 1 de determinação da complementaridade da cadeia leve (VL CDR1, também aqui referida como CDRL1), uma sequência variável da região 2 de determinação da complementaridade da cadeia leve (VL CDR2, também aqui referida como CDRL2) e uma sequência variável da região 3 de determinação da complementaridade da cadeia leve (VL CDR3, também aqui referida como CDRL3), em que pelo menos uma sequência de CDR é selecionada do grupo que consiste em uma sequência de VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); uma sequência de VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); uma sequência de VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); uma sequência VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) ou CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); uma sequência VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); e uma sequência VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
[065] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação compreende uma combinação de uma sequência VH CDR1, uma sequência VH CDR2, uma sequência VH CDR3, uma sequência VL CDR1, uma sequência VL CDR2, e uma sequência VL CDR3, em que pelo menos uma sequência CDR é selecionada do grupo que consiste em uma sequência VH CDR1 que inclui uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico a uma sequência VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); uma sequência VH CDR2 que inclui uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); uma sequência VH CDR3 que inclui uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); uma sequência VL CDR1 que inclui uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos ASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) ou CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); uma sequência VL CDR2 que inclui uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14; e uma sequência VL CDR3 que inclui uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ou mais idêntico a uma sequência VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
[066] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação compreende uma combinação de uma sequência VH CDR1, uma sequência VH CDR2, uma sequência VH CDR3, uma sequência VL CDR1, uma sequência VL CDR2, e uma sequência VL CDR3, em que a sequência VH CDR1 compreende a sequência de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); a sequência VH CDR2 compreende a sequência de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); a sequência VH CDR3 compreende a sequência de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); a sequência VL CDR1 compreende a sequência de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) ou CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); a sequência VL CDR2 compreende a sequência de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); e a sequência VL CDR3 compreende a sequência de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
[067] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação compreende uma combinação de uma sequência VH CDR1, uma sequência VH CDR2, uma sequência VH CDR3, uma sequência VL CDR1, uma sequência VL CDR2, e uma sequência VL CDR3, em que a sequência VH CDR1 compreende uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); a sequência VH CDR2 compreende uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); a sequência VH CDR3 compreende uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); a sequência VL CDR1 compreende uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) ou CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); a sequência VL CDR2 compreende uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); e a sequência VL CDR3 uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a compreende a sequência de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
[068] Em algumas modalidades, o anticorpo do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação inclui um anticorpo que se liga especificamente a CD71. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado inclui um anticorpo monoclonal que se liga a CD71. Em algumas modalidades, esse anticorpo monoclonal que se liga ao CD71 é um anticorpo monoclonal humanizado ou totalmente humano.
[069] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve ou ligação ao antígeno fragmento do mesmo compreendendo SEQ ID NO: 7.
[070] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 1 e 3-5 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve que é pelo menos 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 7.
[071] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 5 Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 7 Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 5, e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 7.
[072] Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma sequência de ácidos nucleicos que está em pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 7.
[073] A divulgação também fornece métodos para a produção de um anticorpo ativável de um anticorpo ativável conjugado da divulgação cultivando uma célula sob condições que levam à expressão do anticorpo ativável, em que a célula compreende uma molécula de ácido nucleico da divulgação ou um vetor da divulgação.
[074] A divulgação também fornece anticorpos ativáveis conjugados que incluem um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD71 acoplado a uma porção de mascaramento (MM), de modo que o acoplamento da MM reduz a capacidade do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno de se ligar CD71. Em algumas modalidades, a MM é acoplada por meio de uma sequência que inclui um substrato para uma protease, por exemplo, uma protease que é ativa em tecido doente e/ou uma protease que é colocalizada com CD71 no local de tratamento de um indivíduo. Os anticorpos anti-CD71 ativáveis conjugados aqui fornecidos, também referidos aqui de forma intercambiável como anticorpos ativáveis conjugados com anti-CD71 ou anticorpos ativáveis conjugados com CD71, são estáveis em circulação, ativados nos locais pretendidos de terapia e/ou diagnóstico, mas não no normal, por exemplo, tecido saudável ou outro tecido não direcionado para tratamento e/ou diagnóstico e, quando ativado, exibe ligação a CD71 que é pelo menos comparável ao anticorpo não modificado correspondente, também aqui referido como anticorpo parental.
[075] A invenção também fornece métodos de tratamento, prevenção e/ou atraso do início ou progressão ou alívio de um sintoma associado à expressão e/ou atividade aberrante de CD71 em um indivíduo que utiliza anticorpos ativáveis conjugados que se ligam a CD71, particularmente anticorpos ativáveis conjugados que se ligam e neutralizar ou inibir de outra forma pelo menos uma atividade biológica da sinalização mediada por CD71 e/ou CD71.
[076] A invenção também fornece métodos de tratamento, prevenção e/ou atraso do início ou progressão ou alívio de um sintoma associado à presença, crescimento, proliferação, metástase e/ou atividade de células que expressam CD71 ou CD71 de maneira aberrante ao indivíduo usando anticorpos ativáveis conjugados que se ligam a CD71, particularmente anticorpos ativáveis que se ligam, visam, neutralizam, matam ou inibem de outra forma pelo menos uma atividade biológica de células que estão expressando ou expressando aberrante CD71.
[077] A invenção também fornece métodos de tratamento, prevenção e/ou atraso do início ou progressão ou alívio de um sintoma associado à presença, crescimento, proliferação, metástase e/ou atividade de células que estão expressando CD71 em um indivíduo usando anticorpos ativáveis conjugados que se ligam a CD71, particularmente anticorpos ativáveis que se ligam, têm como alvo, neutralizam, matam ou de outra forma inibem pelo menos uma atividade biológica de células que estão expressando CD71.
[078] A invenção também fornece métodos de tratamento, prevenção e/ou atraso do início ou progressão ou alívio de um sintoma associado à presença, crescimento, proliferação, metástase e/ou atividade de células que expressam aberrante CD71 em um indivíduo usando conjugado anticorpos ativáveis que se ligam a CD71, particularmente anticorpos ativáveis conjugados que se ligam, visam, neutralizam, matam ou inibem de outra forma pelo menos uma atividade biológica de células que expressam abertamente CD71.
[079] Os anticorpos ativáveis conjugados em um estado ativado se ligam a CD71 e incluem (i) um anticorpo (AB) que se liga especificamente a CD71; (ii) uma porção de mascaramento (MM) que, quando o anticorpo ativável está em um estado não clivado, inibe a ligação do AB ao CD71; e (c) uma porção clivável (CM) acoplada ao AB, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease.
[080] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado no estado não clivado tem a disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB ou AB-CM-MM.
[081] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado compreende um peptídeo de ligação entre a MM e a CM.
[082] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado compreende um peptídeo de ligação entre a CM e o AB.
[083] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado compreende um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e em que o anticorpo ativável conjugado no estado não clivado tem a disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2- CM-LP1-MM. Em algumas modalidades, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos um ao outro.
[084] Em algumas modalidades, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 24) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 25), em que n é um número inteiro de pelo menos um.
[085] Em algumas modalidades, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em GGSG (SEQ ID NO: 26), GGSGG (SEQ ID NO: 27), GSGSG (SEQ ID NO: 28), GSGGG (SEQ ID NO: 29), GGGSG (SEQ ID NO: 30) e GSSSG (SEQ ID NO: 31).
[086] Em algumas modalidades, LP1 compreende a sequência de aminoácidos GGGSSGGS (SEQ ID NO: 207), GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 32), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 33), GSSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 34), GSSGSGG SEQ ID NO: 35), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 36), GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 37).
[087] Em algumas modalidades, LP2 compreende a sequência de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 38), GSSGT (SEQ ID NO: 39) ou GSSG (SEQ ID NO: 40).
[088] Em algumas modalidades, o AB tem uma constante de dissociação de cerca de 100 nM ou menos para ligação ao CD71 de mamífero. Em algumas modalidades, o AB tem uma constante de dissociação de cerca de 10 nM ou menos para ligação ao CD71 de mamífero. Em algumas modalidades, o AB tem uma constante de dissociação de cerca de 5 nM ou menos para ligação ao CD71. Em algumas modalidades, o AB tem uma constante de dissociação de cerca de 1 nM ou menos para ligação ao CD71. Em algumas modalidades, o AB tem uma constante de dissociação de cerca de 0,5 nM ou menos para ligação ao CD71. Em algumas modalidades, o AB tem uma constante de dissociação de cerca de 0,1 nM ou menos para ligação ao CD71. Em algumas modalidades, o AB tem uma constante de dissociação de 0,01 nM a 100 nM, 0,01 nM a 10 nM, 0,01 nM a 5 nM, 0,01 nM a 1 nM, 0,01 a 0,5 nM, 0,01 nm a 0,1 nM, 0,01 nm a 0,05 nM, 0,05 nM a 100 nM, 0,05 nM a 10 nM, 0,05 nM a 5 nM, 0,05 nM a 1 nM, 0,05 a 0,5 nM, 0,05 nm a 0,1 nM, 0,1 nM a 100 nM, 0,1 nM a 10 nM, 0,1 nM a 5 nM, 0,1 nM a 1 nM, 0,1 a 0,5 nM, 0,5 nM a 100 nM, 0,5 nM a 10 nM, 0,5 nM a 5 nM, 0,5 nM a 1 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 10 nM, 1 nM a 5 nM, 5 nM a 100 nM, 5 nM a 10 nM ou 10 nM a 100 nM, para ligação ao CD71 de mamífero.
[089] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado em um estado não clivado se liga especificamente ao CD71 de mamífero com uma constante de dissociação menor ou igual a 1 nM, menor ou igual a 5 nM, menor ou igual a 10 nM, menor ou igual a 15 nM, menor ou igual a 20 nM, menor ou igual a 25 nM, menor ou igual a 50 nM, menor ou igual a 100 nM, menor ou igual a 150 nM, menor ou igual a 250 nM, menor ou igual a 500 nM, menor ou igual a 750 nM, menor ou igual a 1.000 nM e/ou menor ou igual a 2.000 nM.
[090] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado em um estado não clivado se liga especificamente ao CD71 de mamífero com uma constante de dissociação na faixa de 1 nM a 2.000 nM, 1 nM a 1.000 nM, 1 nM a 750 nM, 1 nM a 500 nM, 1 nM a 250 nM, 1 nM a 150 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 50 nM, 1 nM a 25 nM, 1 nM a 15 nM, 1 nM a 10 nM, 1 nM a 5 nM, 5 nM a 2.000 nM, 5 nM a 1.000 nM, 5 nM a 750 nM, 5 nM a 500 nM, 5 nM a 250 nM, 5 nM a 150 nM, 5 nM a 100 nM, 5 nM a 50 nM, 5 nM a 25 nM, 5 nM a 15 nM, 5 nM a 10 nM, 10 nM a 2.000 nM, 10 nM a 1.000 nM, 10 nM a 750 nM, 10 nM a 500 nM, 10 nM a 250 nM, 10 nM a 150 nM, 10 nM a 100 nM, 10 nM a 50 nM, 10 nM a 25 nM, 10 nM a 15 nM, 15 nM a 2.000 nM, 15 nM a 1.000 nM, 15 nM a 750 nM, 15 nM a 500 nM, 15 nM para 250 nM, 15 nM a 150 nM, 15 nM a 100 nM, 15 nM a 50 nM, 15 nM a 25 nM, 25 nM a 2.000 nM, 25 nM a 1.000 nM, 25 nM a 750 nM, 25 nM a 500 nM, 25 nM a 250 nM, 25 nM a 150 nM, 25 nM a 100 nM, 25 nM a 50 nM, 50 nM a 2.000 nM, 50 nM a 1.000 nM, 50 nM a 750 nM, 50 nM a 500 nM, 50 nM a 250 nM, 50 nM a 150 nM, 50 nM a 100 nM, 100 nM a 2.000 nM, 100 nM a 1.000 nM, 100 nM a 750 nM, 100 nM a 500 nM, 100 nM a 250 nM, 100 nM a 150 nM, 150 nM a 2.000 nM, 150 nM a 1.000 nM, 150 nM a 750 nM, 150 nM a 500 nM, 150 nM a 250 nM, 250 nM a 2.000 nM, 250 nM a 1.000 nM, 250 nM a 750 nM, 250 nM a 500 nM, 500 nM a 2.000 nM, 500 nM a 1.000 nM, 500 nM a 750 nM, 500 nM a 500 nM, 500 nM a 250 nM, 500 nM a 150 nM, 500 nM a 100 nM, 500 nM a 50 nM, 750 nM a 2.000 nM, 750 nM a 1.000 nM ou 1.000 nM a 2.000 nM.
[091] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado em um estado ativado se liga especificamente ao CD71 de mamífero com uma constante de dissociação é menor ou igual a 0,01 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM ou 10 nM.
[092] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado em um estado ativado se liga especificamente ao CD71 de mamífero com uma constante de dissociação na faixa de 0,01 nM a 100 nM, 0,01 nM a 10 nM, 0,01 nM a 5 nM, 0,01 nM a 1 nM, 0,01 a 0,5 nM, 0,01 nm a 0,1 nM, 0,01 nm a 0,05 nM, 0,05 nM a 100 nM, 0,05 nM a 10 nM, 0,05 nM a 5 nM, 0,05 nM a 1 nM, 0,05 a 0,5 nM, 0,05 nm a 0,1 nM, 0,1 nM a 100 nM, 0,1 nM a 10 nM, 0,1 nM a 5 nM, 0,1 nM a 1 nM, 0,1 a 0,5 nM, 0,5 nM a 100 nM, 0,5 nM a 10 nM, 0,5 nM a 5 nM, 0,5 nM a 1 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 10 nM, 1 nM a 5 nM, 5 nM a 100 nM, 5 nM a 10 nM ou 10 nM a 100 nM.
[093] Em algumas modalidades, o CD71 de mamífero é selecionado do grupo que consiste em um CD71 humano, um CD71 murino, um CD71 de rato e um CD71 de macaco cinomolgo. Em algumas modalidades, o AB se liga especificamente ao CD71 humano, CD71 murino ou CD71 macaco cinomolgo com uma constante de dissociação inferior a 1 nM. Em algumas modalidades, o CD71 de mamífero é um CD71 humano.
[094] Em algumas modalidades, o AB tem uma ou mais das seguintes características: (a) o AB se liga especificamente ao CD71 humano; e (b) o AB se liga especificamente ao CD71 humano e ao macaco cinomolgo CD71.
[095] Em algumas modalidades, o AB tem uma ou mais das seguintes características: (a) o AB liga especificamente CD71 humano e CD71 macaco cinomolgo; (b) o AB inibe a ligação da transferrina ao CD71 de mamífero; (c) o AB inibe a ligação da transferrina humana ao CD71 humano; e (d) o AB inibe a ligação da transferrina do macaco cinomolgo ao CD71 do macaco cinomolgo.
[096] Em algumas modalidades, o AB bloqueia a capacidade de um ligante natural de se ligar ao CD71 de mamífero com um EC50 menor ou igual a 5 nM, menor ou igual a 10 nM, menor ou igual a 50 nM, menor ou igual a igual a 100 nM, menor ou igual a 500 nM e/ou menor ou igual a 1.000 nM. Em algumas modalidades, o AB bloqueia a capacidade de uma transferrina de se ligar ao CD71 de mamífero com um EC50 menor ou igual a 5 nM, menor ou igual a 10 nM, menor ou igual a 50 nM, menor ou igual a 100 nM, menor ou igual a 500 nM e/ou menor ou igual a 1.000 nM. Em algumas modalidades, o ligante natural de CD71 é transferrina.
[097] Em algumas modalidades, o AB bloqueia a capacidade de um ligante natural de se ligar ao CD71 de mamífero com um EC50 de 5 nM a 1.000 nM, 5 nM a 500 nM, 5 nM a 100 nM 5 nM a 50 nM, 5 nM a 10 nM, 10 nM a 1.000 nM, 10 nM a 500 nM, 10 nM a 100 nM 10 nM a 50 nM, 50 nM a 1.000 nM, 50 nM a 500 nM, 50 nM a 100 nM, 100 nM a 1.000 nM, 100 nM a 500 nM, 500 nM a 1.000 nM. Em algumas modalidades, o AB bloqueia a capacidade de uma transferrina de se ligar ao CD71 de mamífero com um EC50 de 5 nM a 1.000 nM, 5 nM a 500 nM, 5 nM a 100 nM 5 nM a 50 nM, 5 nM a 10 nM, 10 nM a 1.000 nM, 10 nM a 500 nM, 10 nM a 100 nM 10 nM a 50 nM, 50 nM a 1.000 nM, 50 nM a 500 nM, 50 nM a 100 nM, 100 nM a 1.000 nM, 100 nM a 500 nM, 500 nM a 1.000 nM. Em algumas modalidades, o ligante natural de CD71 é transferrina.
[098] Em algumas modalidades, o AB da presente divulgação inibe ou reduz o crescimento, proliferação e/ou metástase de células que expressam CD71 de mamífero. Sem pretender estar vinculado a qualquer teoria, o AB da presente divulgação pode inibir ou reduzir o crescimento, proliferação e/ou metástase de células que expressam CD71 de mamífero, ligando-se especificamente a CD71 e inibindo, bloqueando e/ou impedindo a ligação de um ligante natural para CD71 de mamífero. Em algumas modalidades, o ligante natural do CD71 de mamífero é transferrina.
[099] Em algumas modalidades, a MM tem uma constante de dissociação para ligação ao AB que é maior que a constante de dissociação do AB ao CD71.
[0100] Em algumas modalidades, a MM tem uma constante de dissociação para ligação ao AB que não é mais do que a constante de dissociação do AB ao CD71.
[0101] Em algumas modalidades, a MM tem uma constante de dissociação para ligação ao AB que é menor que a constante de dissociação do AB ao CD71.
[0102] Em algumas modalidades, a constante de dissociação (Kd) da MM em direção ao AB não é mais do que 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 vezes ou mais, ou entre 1 e 5, 5 e 10, 10 e 100, 10 e 1.000, 10 e 10.000, 10 e 100.000, 10 e 1.000.000, 10 e 10.000.000, 100 e 1.000, 100 e 10.000, 100 e 100.000, 100 e 1.000.000, 100 e 10.000.000, 1.000 e 10.000, 1.000 e 100.000, 1.000 e 1.000.000, 1.000 e 10.000.000, 10.000 e 100.000, 10.000 e 1.000.000, 10.000 e 10.000.000, 100.000 e 1.000.000 ou 100.000 e 10.000.000 vezes ou mais que a constante de dissociação do AB em direção ao alvo.
[0103] Em algumas modalidades, a MM não interfere ou compete com o AB pela ligação ao CD71 quando o anticorpo ativável está em um estado clivado.
[0104] Em algumas modalidades, a MM é um polipeptídeo de cerca de 2 a 40 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, a MM é um polipeptídeo de até cerca de 40 aminoácidos de comprimento.
[0105] Em algumas modalidades, a sequência polipeptídica MM é diferente da de CD71. Em algumas modalidades, a sequência polipeptídica de MM não é mais do que 50% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas modalidades, a sequência polipeptídica MM é diferente daquela de CD71 e não é mais que 40%, 30%, 25%, 20%, 15% ou 10% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB.
[0106] Em algumas modalidades, o acoplamento da MM ao AB reduz a capacidade do AB de se ligar ao CD71, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB, quando acoplada à MM no CD71, seja pelo menos duas vezes maior que o Kd do AB quando não acoplado à MM no CD71.
[0107] Em algumas modalidades, o acoplamento da MM ao AB reduz a capacidade do AB de se ligar ao CD71, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB, quando acoplada à MM no CD71, seja pelo menos cinco vezes maior que o Kd do AB quando não acoplado à MM no CD71.
[0108] Em algumas modalidades, o acoplamento da MM ao AB reduz a capacidade do AB de se ligar ao CD71, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB, quando acoplada à MM no CD71, seja pelo menos 10 vezes maior que o Kd do AB quando não acoplado à MM no CD71.
[0109] Em algumas modalidades, o acoplamento da MM ao AB reduz a capacidade do AB de se ligar ao CD71, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB, quando acoplada à MM no CD71, seja pelo menos 20 vezes maior que o Kd do AB quando não acoplado à MM no CD71.
[0110] Em algumas modalidades, o acoplamento da MM ao AB reduz a capacidade do AB de se ligar ao CD71, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB, quando acoplada à MM no CD71, seja pelo menos 40 vezes maior que o Kd do AB quando não acoplado à MM no CD71.
[0111] Em algumas modalidades, o acoplamento da MM ao AB reduz a capacidade do AB de se ligar ao CD71, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB, quando acoplada à MM no CD71, seja pelo menos 100 vezes maior que o Kd do AB quando não acoplado à MM no CD71.
[0112] Em algumas modalidades, o acoplamento da MM ao AB reduz a capacidade do AB de se ligar ao CD71, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB, quando acoplada à MM no CD71, seja pelo menos 1.000 vezes maior que o Kd do AB quando não acoplado à MM no CD71.
[0113] Em algumas modalidades, o acoplamento da MM ao AB reduz a capacidade do AB de se ligar ao CD71, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB, quando acoplada à MM no CD71, seja pelo menos 10.000 vezes maior que o Kd do AB quando não acoplado à MM no CD71.
[0114] Em algumas modalidades, na presença de CD71, a MM reduz a capacidade do AB de se ligar a CD71 em pelo menos 90% quando a CM não é clivada, em comparação com quando a CM é clivada quando analisada in vitro usando um ensaio de deslocamento-alvo como, por exemplo, o ensaio descrito na Publicação PCT n° WO 2010/081173, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0115] Em algumas modalidades, MM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 16 ou 18.
[0116] Em algumas modalidades, a protease que cliva a CM é ativa, por exemplo, regulada para cima ou de outra forma não regulamentada, no tecido doente, e a protease cliva a CM no anticorpo ativável quando o anticorpo ativável é exposto à protease.
[0117] Em algumas modalidades, a protease é colocalizada com CD71 em um tecido, e a protease cliva a CM no anticorpo ativável conjugado quando o anticorpo ativável é exposto à protease.
[0118] Em algumas modalidades, a CM é posicionada no anticorpo ativável conjugado, de modo que, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado não clivado, a ligação do anticorpo ativável conjugado ao CD71 é reduzida para ocorrer com uma constante de dissociação que é pelo menos duas vezes maior que a constante de dissociação de um AB não modificado que se liga ao CD71, enquanto que no estado clivado (isto é, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado clivado), o AB se liga ao CD71.
[0119] Em algumas modalidades, a CM é posicionada no anticorpo ativável conjugado, de modo que, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado não clivado, a ligação do anticorpo ativável ao CD71 é reduzida para ocorrer com uma constante de dissociação que é pelo menos cinco vezes maior que a constante de dissociação de um AB não modificado que se liga a CD71, enquanto que no estado clivado (isto é, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado clivado), o AB se liga a CD71.
[0120] Em algumas modalidades, a CM é posicionada no anticorpo ativável conjugado, de modo que, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado não clivado, a ligação do anticorpo ativável ao CD71 é reduzida para ocorrer com uma constante de dissociação que é pelo menos 10 vezes maior que a constante de dissociação de um AB não modificado que se liga a CD71, enquanto que no estado clivado (isto é, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado clivado), o AB se liga a CD71.
[0121] Em algumas modalidades, a CM é posicionada no anticorpo ativável conjugado, de modo que, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado não clivado, a ligação do anticorpo ativável conjugado ao CD71 é reduzida para ocorrer com uma constante de dissociação que é pelo menos 20 vezes maior que a constante de dissociação de um AB não modificado que se liga a CD71, enquanto que no estado clivado (isto é, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado clivado), o AB se liga a CD71.
[0122] Em algumas modalidades, a CM é posicionada no anticorpo ativável conjugado, de modo que, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado não clivado, a ligação do anticorpo ativável conjugado ao CD71 é reduzida para ocorrer com uma constante de dissociação que é pelo menos 40 vezes maior que a constante de dissociação de um AB não modificado que se liga a CD71, enquanto que no estado clivado, o AB se liga a CD71.
[0123] Em algumas modalidades, a CM é posicionada no anticorpo ativável conjugado, de modo que, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado não clivado, a ligação do anticorpo ativável conjugado ao CD71 é reduzida para ocorrer com uma constante de dissociação que é pelo menos 50 vezes maior que a constante de dissociação de um AB não modificado que se liga a CD71, enquanto que no estado clivado, o AB se liga a CD71.
[0124] Em algumas modalidades, a CM é posicionada no anticorpo ativável conjugado, de modo que, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado não clivado, a ligação do anticorpo ativável conjugado ao CD71 é reduzida para ocorrer com uma constante de dissociação que é pelo menos 100 vezes maior que a constante de dissociação de um AB não modificado que se liga a CD71, enquanto que no estado clivado, o AB se liga a CD71.
[0125] Em algumas modalidades, a CM é posicionada no anticorpo ativável conjugado, de modo que, quando o anticorpo ativável conjugado está no estado não clivado, a ligação do anticorpo ativável conjugado ao CD71 é reduzida para ocorrer com uma constante de dissociação que é pelo menos 200 vezes maior que a constante de dissociação de um AB não modificado que se liga a CD71, enquanto que no estado clivado, o AB se liga a CD71.
[0126] Em algumas modalidades, a CM é um polipeptídeo de até 15 aminoácidos de comprimento.
[0127] Em algumas modalidades, a CM é um polipeptídeo que inclui uma primeira porção clivável (CM1) que é um substrato para pelo menos uma metaloprotease de matriz (MMP) e uma segunda porção clivável (CM2) que é um substrato para pelo menos uma serina protease (SP). Em algumas modalidades, cada uma da sequência de substrato CM1 e a sequência de substrato CM2 do substrato CM1-CM2 é independentemente um polipeptídeo de até 15 aminoácidos de comprimento.
[0128] Em algumas modalidades, a CM é um substrato para pelo menos uma protease que é ou acredita-se ser regulada para cima ou, de outro modo, não regulada no câncer.
[0129] Em algumas modalidades, a CM é um substrato para pelo menos uma protease selecionada do grupo que consiste em uma metaloprotease de matriz (MMP), trombina, uma elastase de neutrófilos, uma protease de cisteína, legumaina e uma serina protease, como matriptase (MT- SP1) e uroquinase (uPA). Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que essas proteases sejam reguladas para cima ou, de outra forma, não reguladas em pelo menos uma das neoplasias.
[0130] Em algumas modalidades, a CM é selecionada para uso com uma protease específica, por exemplo, uma protease que se sabe estar colocalizada com o alvo do anticorpo ativável.
[0131] Em algumas modalidades, a CM é um substrato para pelo menos uma MMP. Em algumas modalidades, a CM é um substrato para uma protease selecionada do grupo que consiste em MMP 9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11 e MMP19. Em algumas modalidades, a CM é um substrato para MMP9. Em algumas modalidades, a CM é um substrato para MMP14.
[0132] Em algumas modalidades, a CM é um substrato que inclui a sequência TGRGPSWV (SEQ ID NO: 41); SARGPSRW (SEQ ID NO: 42); TARGPSFK (SEQ ID NO: 43); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 44); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 45); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 46); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 47); AARGPAIH (SEQ ID NO: 48); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 49); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 50); RGPATPIM (SEQ ID NO: 51); RGPA (SEQ ID NO: 52); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 53); FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 54); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 55); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 56); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 57); LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 58); SGGPLGVR (SEQ ID NO: 59); PLGL (SEQ ID NO: 60); LSGRSGNH (SEQ ID NO: 175); SGRSANPRG (SEQ ID NO: 176); LSGRSDDH (SEQ ID NO: 177); LSGRSDIH (SEQ ID NO: 178); LSGRSDQH (SEQ ID NO: 179); LSGRSDTH (SEQ ID NO: 180); LSGRSDYH (SEQ ID NO: 181); LSGRSDNP (SEQ ID NO: 182); LSGRSANP (SEQ ID NO: 183); LSGRSANI (SEQ ID NO: 184); LSGRSDNI (SEQ ID NO: 185); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 186); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 187); WATPRPMR (SEQ ID NO: 188); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 189); ISSGL (SEQ ID NO: 190); ISSGLLS (SEQ ID NO: 191); e/ou ISSGLL (SEQ ID NO: 192).
[0133] Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LSGRSDNH (SEQ ID NO: 44). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos TGRGPSWV (SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos PLTGRSGG (SEQ ID NO: 47). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 53). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 54). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 55). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos PLGL (SEQ ID NO: 60). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos SARGPSRW (SEQ ID NO: 42). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos TARGPSFK (SEQ ID NO: 43). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos GGWHTGRN (SEQ ID NO: 45). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos HTGRSGAL (SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos AARGPAIH (SEQ ID NO: 48). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos RGPAFNPM (SEQ ID NO: 49). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos SSRGPAYL (SEQ ID NO: 50). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos RGPATPIM (SEQ ID NO: 51). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos RGPA (SEQ ID NO: 52). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LSGRSGNH (SEQ ID NO: 175). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos SGRSANPRG (SEQ ID NO: 176). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LSGRSDDH (SEQ ID NO: 177). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LSGRSDIH (SEQ ID NO: 178). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LSGRSDQH (SEQ ID NO: 179). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LSGRSDTH (SEQ ID NO: 180). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LSGRSDYH (SEQ ID NO: 181). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LSGRSDNP (SEQ ID NO: 182). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LSGRSANP (SEQ ID NO: 183). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LSGRSANI (SEQ ID NO: 184). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LSGRSDNI (SEQ ID NO: 185). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos MIAPVAYR (SEQ ID NO: 186). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos RPSPMWAY (SEQ ID NO: 187). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos WATPRPMR (SEQ ID NO: 188). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos FRLLDWQW (SEQ ID NO: 189). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos ISSGL (SEQ ID NO: 190). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos ISSGLLS (SEQ ID NO: 191). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos e/ou ISSGLL (SEQ ID NO: 192).
[0134] Em algumas modalidades, a CM é um substrato para uma MMP e inclui a sequência ISSGLSS (SEQ ID NO: 61); QNQALRMA (SEQ ID NO: 62); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 63); STFPFGMF (SEQ ID NO: 64); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 65); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 66), ISSGLLSS (SEQ ID NO: 67), LKAAPRWA (SEQ ID NO: 68); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 69); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 70); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 71); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 72); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 73); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 74); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 75); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 76); e/ou PAGLWLDP (SEQ ID NO: 77).
[0135] Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos ISSGLSS (SEQ ID NO: 61). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos QNQALRMA (SEQ ID NO: 62). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos AQNLLGMV (SEQ ID NO: 63). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos STFPFGMF (SEQ ID NO: 64). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos PVGYTSSL (SEQ ID NO: 65). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos DWLYWPGI (SEQ ID NO: 66). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos ISSGLLSS (SEQ ID NO: 67). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LKAAPRWA (SEQ ID NO: 68). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos GPSHLVLT (SEQ ID NO: 69). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LPGGLSPW (SEQ ID NO: 70). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos MGLFSEAG (SEQ ID NO: 71). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos SPLPLRVP (SEQ ID NO: 72). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos RMHLRSLG (SEQ ID NO: 73). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LAAPLGLL (SEQ ID NO: 74). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos AVGLLAPP (SEQ ID NO: 75). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos LLAPSHRA (SEQ ID NO: 76). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos PAGLWLDP (SEQ ID NO: 77).
[0136] Em algumas modalidades, a CM é um substrato para trombina. Em algumas modalidades, a CM é um substrato para trombina e inclui a sequência GPRSFGL (SEQ ID NO: 78) ou GPRSFG (SEQ ID NO: 79). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos GPRSFGL (SEQ ID NO: 78). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos GPRSFG (SEQ ID NO: 79).
[0137] Em algumas modalidades, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em NTLSGRSENHSG (SEQ ID NO: 80); NTLSGRSGNHGS (SEQ ID NO: 81); TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 82); TSGRSANP (SEQ ID NO: 83); VAGRSMRP (SEQ ID NO: 84); VVPEGRRS (SEQ ID NO: 85); ILPRSPAF (SEQ ID NO: 86); MVLGRSLL (SEQ ID NO: 87); QGRAITFI (SEQ ID NO: 88); SPRSIMLA (SEQ ID NO: 89); e SMLRSMPL (SEQ ID NO: 90).
[0138] Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos NTLSGRSENHSG (SEQ ID NO: 80). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos NTLSGRSGNHGS (SEQ ID NO: 81). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 82). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos TSGRSANP (SEQ ID NO: 83). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos VAGRSMRP (SEQ ID NO: 84). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos VVPEGRRS (SEQ ID NO: 85). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos ILPRSPAF (SEQ ID NO: 86). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos MVLGRSLL (SEQ ID NO: 87). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos QGRAITFI (SEQ ID NO: 88). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos SPRSIMLA (SEQ ID NO: 89). Em algumas modalidades, a CM compreende a sequência de aminoácidos SMLRSMPL (SEQ ID NO: 90).
[0139] Em algumas modalidades, a CM é um substrato para uma elastase de neutrófilos. Em algumas modalidades, a CM é um substrato para uma serina protease. Em algumas modalidades, a CM é um substrato para uPA. Em algumas modalidades, a CM é um substrato para legumaina. Em algumas modalidades, a CM é um substrato para matriptase. Em algumas modalidades, a CM é um substrato para uma protease de cisteína. Em algumas modalidades, a CM é um substrato para uma protease de cisteína, como uma catepsina.
[0140] Em algumas modalidades, a CM é um substrato CM1-CM2 e inclui a sequência ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 91); ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 92); AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 93); TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 94); VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 95); TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 96); AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 97); LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 98); VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 99); LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 100); LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 101); LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 102); ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 103); LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 104); QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 105); LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 106); QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 107); ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 108); ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 148); AVGLLAPPTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 149); AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 150); ISSGLLSGRSDDH (SEQ ID NO: 151); ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 152); ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 153); ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID NO: 154); ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID NO: 155); ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 156); ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 157); ISSGLLSGRSANI (SEQ ID NO: 158); AVGLLAPPGGLSGRSDDH (SEQ ID NO: 159); AVGLLAPPGGLSGRSDIH (SEQ ID NO: 160); AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO: 161); AVGLLAPPGGLSGRSDTH (SEQ ID NO: 162); AVGLLAPPGGLSGRSDYH (SEQ ID NO: 163); AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO: 164); AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO: 165); AVGLLAPPGGLSGRSANI (SEQ ID NO: 166), ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO: 171); AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 172); GLSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 193); e/ou GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 194).
[0141] Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 91), que também é aqui referida como substrato 2001. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 92), que também é aqui referida como substrato 1001/LP70001, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 205). Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 93), que também é aqui referida como substrato 2015 e/ou substrato 1004/LP'/0003, em que LP' conforme usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GG. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 94), que também é aqui referida como substrato 0003/LP'/1004, em que LP' como usado neste substrato CM1CM2 é a sequência de aminoácidos GG. Em algumas modalidades, o substrato CM1CM2 inclui a sequência VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 95), que também é aqui referida como substrato 1003/LP'/0003, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GG. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 96), que também é aqui referida como substrato 0003/LP'/1003, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GG. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 97), que também é aqui referida como substrato 3001 e/ou substrato 1004/LP'/0001, em que LP' conforme usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GG. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 98), que também é aqui referida como substrato 0001/LP'/1004, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GG. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 99), que também é aqui referida como substrato 1003/LP70001, em que LP', usado neste substrato CM1CM2 é a sequência de aminoácidos GG. Em algumas modalidades, o substrato CM1CM2 inclui a sequência LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 100), que também é aqui referida como substrato 0001/LP'/1003, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GG. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 101), que também é aqui referida como substrato 0001/LP'/1001, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 205). Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 102), que também é aqui referida como substrato 0002/LP'/1001, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 205). Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 103), que também é aqui referida como substrato 1001/LP'/0002, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 205). Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 104), que também é aqui referida como substrato 0001/LP'/1002, em que LP' como usado neste substrato CM1CM2 é a sequência de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 205). Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 105), que também é aqui referida como substrato 1002/LP'/0001, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 205). Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 106), que também é aqui referida como substrato 0002/LP'/1002, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 205). Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 107), que também é aqui referida como substrato 1002/LP70002, em que LP' como usado neste substrato CM1CM2 é a sequência de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 205). Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 108), que também é aqui referida como substrato 2002. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 148), que também é aqui referida como substrato 2003. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 149), que também é aqui referida como substrato 2004. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 150), que também é aqui referida como substrato 2005. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSDDH (SEQ ID NO: 151), que também é aqui referida como substrato 2006. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 152), que também é aqui referida como substrato 2007. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 153), que também é aqui referida como substrato 2008. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID NO: 154), que também é aqui referida como substrato 2009. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID NO: 155), que também é aqui referida como substrato 2010. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 156), que também é aqui referida como substrato 2011. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 157), que também é aqui referida como substrato 2012. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSANI (SEQ ID NO: 158), que também é aqui referida como substrato 2013. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPGGLSGRSDDH (SEQ ID NO: 159), que também é aqui referida como substrato 3006. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPGGLSGRSDIH (SEQ ID NO: 160), que também é aqui referida como substrato 3007. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO: 161), que também é aqui referida como substrato 3008. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPGGLSGRSDTH (SEQ ID NO: 162), que também é aqui referida como substrato 3009. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPGGLSGRSDYH (SEQ ID NO: 163), que também é aqui referida como substrato 3010. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO: 164), que também é aqui referida como substrato 3011. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO: 165), que também é aqui referida como substrato 3012. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPGGLSGRSANI (SEQ ID NO: 166), que também é aqui referida como substrato 3013. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO: 171), que também é aqui referida como substrato 2014. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 172), que também é aqui referida como substrato 3014. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência GLSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 193), que também é aqui referida como substrato 0001/LP71004, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GG. Em algumas modalidades, o substrato CM1-CM2 inclui a sequência GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 194), que também é referida aqui como substrato 0001/LP'/1003, em que LP' como usado neste substrato CM1-CM2 é a sequência de aminoácidos GG.
[0142] Em algumas modalidades, a CM é um substrato para pelo menos duas proteases. Em algumas modalidades, a CM é um substrato para pelo menos duas proteases selecionadas do grupo que consiste em uma MMP, trombina, uma elastase de neutrófilos, uma protease de cisteína, uPA, legumaina e matriptase.
[0143] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado inclui pelo menos uma primeira CM e uma segunda CM. Em algumas modalidades, a primeira CM e a segunda CM são polipeptídeos de, no máximo, 15 aminoácidos. Em algumas modalidades, a primeira CM e a segunda CM no anticorpo ativável conjugado no estado não clivado têm a disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM1-CM2-AB ou AB-CM2-CM1-MM. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a primeira CM e a segunda CM são um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease selecionada do grupo que consiste em uma MMP, trombina, elastase de neutrófilo, protease de cisteína, uPA, legumaina e matriptase. Em algumas modalidades, a primeira CM é clivada por um primeiro agente de clivagem selecionado do grupo que consiste em MMP, trombina, elastase de neutrófilo, uma protease de cisteína, uPA, legumaina e matriptase em um tecido-alvo e a segunda CM é clivada por um segundo agente de clivagem em um tecido-alvo. Em algumas modalidades, a outra protease é selecionada do grupo que consiste naqueles mostrados na Tabela (I). Em algumas modalidades, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem são a mesma protease selecionada do grupo que consiste em MMP, trombina, elastase de neutrófilo, protease de cisteína, uPA, legumaina e matriptase, e a primeira CM e a segunda CM são substratos diferentes para a enzima. Em algumas modalidades, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem são a mesma protease selecionada do grupo que consiste naqueles mostrados na Tabela (I). Em algumas modalidades, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem são diferentes proteases. Em algumas modalidades, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem são colocalizados no tecido-alvo. Em algumas modalidades, a primeira CM e a segunda CM são clivadas por pelo menos um agente de clivagem no tecido-alvo.
[0144] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado é exposto e clivado por uma protease de modo que, no estado ativado ou clivado, o anticorpo ativado conjugado inclua uma sequência de aminoácidos da cadeia leve que inclui pelo menos uma porção da sequência LP2 e/ou CM após a protease ter clivado a CM.
[0145] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é conjugado com um ou mais equivalentes de um agente. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é conjugado com um equivalente do agente. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é conjugado com dois, três ou quatro equivalentes do agente. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é parte de uma mistura de anticorpos ativáveis tendo um número homogêneo de equivalentes de agentes conjugados. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é parte de uma mistura de anticorpos ativáveis tendo um número heterogêneo de equivalentes de agentes conjugados. Em algumas modalidades, a mistura de anticorpos ativáveis é tal que o número médio de agentes conjugados a cada anticorpo ativável está entre zero e um, entre um e dois, entre dois e três ou entre três e quatro. Em algumas modalidades, a mistura de anticorpos ativáveis é tal que o número médio de agentes conjugados a cada anticorpo ativável é um, dois, três ou quatro.
[0146] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável compreende uma ou mais modificações na sequência de aminoácidos específicos do local, de modo que o número de resíduos de lisina e/ou cisteína seja aumentado ou diminuído em relação à sequência de aminoácidos original do anticorpo ativável, assim, em algumas modalidades aumentando ou diminuindo correspondentemente o número de agentes que podem ser conjugados com o anticorpo ativável ou, em algumas modalidades, limitando a conjugação dos agentes com o anticorpo ativável de uma maneira específica do local. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável modificado é modificado com um ou mais aminoácidos não naturais de uma maneira específica do local, assim, em algumas modalidades, limitando a conjugação dos agentes apenas aos locais dos aminoácidos não naturais.
[0147] Os anticorpos ativáveis conjugados aqui divulgados podem compreender moléculas de fármacos e porções de anticorpos em várias proporções molar estequiométricas, dependendo da configuração do anticorpo e, pelo menos em parte, do método usado para efetuar a conjugação.
[0148] O termo “carga de fármaco” ou “carregamento de fármaco” refere-se à razão molar de moléculas de fármaco por anticorpo em um anticorpo ativável conjugado individual. Em certas modalidades, o carregamento de fármaco pode compreender de 1 a 4 moléculas de medicamento, de 2 a 4 moléculas de medicamento, de 1 a 3 moléculas de medicamento, de 2 a 3 moléculas de medicamento ou de 1 a 2 moléculas de fármaco. Em certas modalidades, o carregamento de fármaco pode compreender 1 molécula de fármaco, 2 moléculas de fármaco, 3 moléculas de fármaco ou 4 moléculas de fármaco.
[0149] Para os fins da presente invenção, um versado na técnica entenderia que “carregamento de fármaco” e “razão entre fármaco e anticorpo” (também denominada DAR) não são as mesmas. DAR refere-se à razão molar média de moléculas de fármaco por anticorpo em uma população de pelo menos duas moléculas de anticorpo ativável conjugado, enquanto o carregamento de fármaco refere-se à razão molar de moléculas de fármaco por anticorpo em uma molécula de anticorpo ativável conjugado individual. O carregamento de fármacos tem primariamente relevância para a construção e o projeto de um anticorpo ativável conjugado, enquanto a DAR tem relevância principalmente para a composição farmacêutica do anticorpo ativável conjugado terapêutico que será administrado aos pacientes.
[0150] Em algumas modalidades, os anticorpos ativáveis da presente invenção podem ser conjugados para gerar preparações relativamente homogêneas de anticorpos ativáveis conjugados com uma distribuição DAR estreita. Em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado pode ser substancialmente homogênea em relação à sua distribuição de DAR, o que significa que dentro da preparação há uma espécie predominante de ADC específico do local com um DAR específico (por exemplo, um DAR de 2 e/ou 4). Em algumas modalidades, a preparação de anticorpo ativável conjugado substancialmente homogêneo também pode ser uniforme em relação ao local de carregamento (isto é, nas cisteínas livres).
[0151] Em algumas modalidades, a DAR de anticorpos ativáveis conjugados da divulgação será de cerca de 2 e/ou 4. Nesse contexto, o termo “cerca de” deve ser interpretado como uma preparação de anticorpo ativável conjugado contendo mais de 80% de duas espécies primárias em agregado com um DAR igual a 2 e 4 com distribuição aproximadamente igual (por exemplo, maior que 40% cada) e o restante constituído por outras espécies DAR.
[0152] Em algumas modalidades, a DAR dos anticorpos ativáveis conjugados da divulgação será enriquecida para ser de cerca de 2. Nesse contexto, o termo “cerca de” deve ser interpretado como uma preparação de anticorpo ativável conjugado contendo mais de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0153] Em algumas modalidades, a DAR dos anticorpos ativáveis conjugados da divulgação será enriquecida em cerca de 2, com o termo “cerca de” sendo interpretado como uma preparação de anticorpo ativável conjugado contendo mais de cerca de 94% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0154] Em algumas modalidades, a DAR dos anticorpos ativáveis conjugados da divulgação será enriquecida em cerca de 2, com o termo “cerca de” sendo interpretado como uma preparação de anticorpo ativável conjugado contendo mais de cerca de 95% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0155] Em algumas modalidades, a DAR dos anticorpos ativáveis conjugados da divulgação será enriquecida em cerca de 2, com o termo “cerca de” sendo interpretado como uma preparação de anticorpo ativável conjugado contendo mais de cerca de 96% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0156] Em algumas modalidades, a DAR dos anticorpos ativáveis conjugados da divulgação será enriquecida em cerca de 2, com o termo “cerca de” sendo interpretado como uma preparação de anticorpo ativável conjugado contendo mais de cerca de 97% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0157] Em algumas modalidades, a DAR dos anticorpos ativáveis conjugados da divulgação será enriquecida em cerca de 2, com o termo “cerca de” sendo interpretado como uma preparação de anticorpo ativável conjugado contendo mais de cerca de 98% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0158] Em algumas modalidades, a DAR dos anticorpos ativáveis conjugados da divulgação será enriquecida em cerca de 2, com o termo “cerca de” sendo interpretado como uma preparação de anticorpo ativável conjugado contendo mais de cerca de 99% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0159] Em algumas modalidades, a DAR de anticorpos ativáveis conjugados da divulgação será de cerca de 2 e/ou 4. Nesse contexto, o termo “cerca de” deve ser interpretado como uma preparação de anticorpo ativável conjugado contendo mais de 80% de duas espécies primárias em agregado com um DAR igual a 2 e 4 com distribuição aproximadamente igual (por exemplo, maior que 40% cada) e o restante constituído por outras espécies DAR.
[0160] Em algumas modalidades, é possível alcançar a homogeneidade desejada através do uso de anticorpos ativáveis específicos do local e/ou redução e conjugação seletiva. Em algumas modalidades, a homogeneidade desejada pode ser alcançada através do uso de construções específicas do local em combinação com redução seletiva. Em algumas modalidades, as preparações podem ser ainda mais purificadas, como usando técnicas de cromatografia analítica ou preparativa. Nestas modalidades, a homogeneidade da preparação de anticorpo ativável conjugado pode ser analisada usando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo, entre outras, espectrometria de massa, HPLC (por exemplo, HPLC de exclusão de tamanho, RP- HPLC, HIC-HPLC, etc.) ou eletroforese capilar.
[0161] No que diz respeito à purificação de preparações de anticorpos ativáveis conjugados, será apreciado que métodos preparativos farmacêuticos padrão podem ser empregados para obter a pureza desejada. Como discutido aqui, métodos de cromatografia líquida, como fase reversa (RP) e cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), podem separar compostos na mistura pelo valor de carga do medicamento. Em alguns casos, a cromatografia de troca iônica (IEC) ou de modo misto (MMC) também pode ser usada para isolar espécies com uma carga específica de fármaco.
[0162] Em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado da divulgação tendo uma DAR dada com um nível relativamente alto de homogeneidade de carga de fármaco pode realmente compreender uma mistura de conjugados com uma faixa ou distribuição de cargas de medicamento, mas quando a distribuição de cargas de medicamento na mistura está centrada em torno (ou com uma média ponderada) do valor médio de DAR. Assim, em algumas modalidades, as preparações de anticorpos ativáveis conjugados incluirão uma mistura de conjugados na qual a DAR média da mistura é de cerca de 1, 2 ou 3, cada um +/- 0,5. Será apreciado que o intervalo ou desvio pode ser menor que 0,4 em certas modalidades preferenciais. Assim, em outras modalidades, as composições compreenderão um DAR médio de 1, 2 ou 3, cada um +/- 0,3.
[0163] Em algumas modalidades, a distribuição de fármacos por anticorpo em preparações de anticorpos ativáveis conjugados a partir de reações de conjugação pode ser caracterizada por meios convencionais, como espectrofotometria UV-Vis, HPLC de fase reversa, HIC, espectroscopia de massa, ELISA e eletroforese.
[0164] Em algumas modalidades, uma mistura de anticorpos ativáveis conjugados da divulgação que inclui uma mistura de conjugados com diferentes cargas de fármaco pode ser purificada ou enriquecida para uma ou mais espécies de conjugado com uma carga específica de fármaco. Por exemplo, uma mistura de anticorpos ativáveis conjugados que inclui uma mistura de AADCs com carga de fármaco de 0, 2, 4, 6 e 8 pode ser enriquecida ou purificada para os anticorpos ativáveis conjugados com carga de fármaco de 2. Em algumas modalidades, a mistura pode ser purificada ou enriquecida apenas para as espécies de anticorpos ativáveis conjugados com uma carga de fármaco de 4. Em algumas modalidades, a mistura pode ser purificada ou enriquecida apenas para as espécies de anticorpos ativáveis conjugados com uma carga de fármaco de 2 e 4. Como usado aqui, uma preparação ou purificação ou anticorpo ativável conjugado com uma preparação relativamente homogênea de espécies de espécies conjugadas com uma carga de fármaco de 2 é referido como “E2”, que tem um DAR de cerca de 2. Como aqui utilizado, uma preparação ou purificação ou anticorpo ativável conjugado com uma preparação relativamente homogênea de espécies conjugadas com uma carga de fármaco de 4 é referido como “E4”. Como aqui utilizado, uma preparação ou purificação ou anticorpo ativável conjugado com uma mistura de espécies conjugadas com uma carga de fármaco de 2 ou 4 referida como “DE” (enriquecida com DAR), com uma DAR de aproximadamente 3. Nesse contexto, o termo “cerca de” é interpretado como significando +/- 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 da quantidade proibida.
[0165] Em algumas modalidades, um anticorpo ativável conjugado da divulgação pode ser representado pela fórmula: AA-(AG)p
[0166] em que AA é um anticorpo ativável que possui, em um estado não clivado, a disposição estrutural do terminal N ao terminal C de MM-CM-AB. AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 de mamífero e inclui a sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5 e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 7. MM é uma porção de mascaramento que inclui a sequência da SEQ ID NO: 18, e a MM é acoplada ao AB e inibe a ligação do AB ao CD71 quando o AA está em um estado não clivado. CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156, a CM é acoplada à AB e a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease. AG é um agente conjugado ao AA, em que AA-(AG)p. Em algumas modalidades, p é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, uma composição da divulgação inclui uma mistura de anticorpos ativáveis conjugados da divulgação, em que cada anticorpo ativável conjugado é representado pela fórmula AA-(AG)p, em que p é um número inteiro de 0 a 8. Em algumas modalidades, a composição inclui uma mistura de anticorpos ativáveis conjugados da divulgação em que pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% das espécies é o anticorpo ativável conjugado em que p é 2.
[0167] Em algumas modalidades, uma preparação de um anticorpo ativável conjugado que é purificado ou enriquecido para determinadas espécies de conjugado com uma carga de fármaco específica inclui pelo menos uma certa porcentagem da espécie de carga de fármaco dada. Por exemplo, em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui pelo menos 50% da preparação é o anticorpo ativável conjugado tendo uma carga de fármaco de 2. Em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui pelo menos 75% do anticorpo ativável conjugado com uma carga de fármaco de 2. Em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui pelo menos 85% do anticorpo ativável conjugado com uma carga de fármaco de 2. Em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui pelo menos 90% do anticorpo ativável conjugado com uma carga de fármaco de 2. Em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui pelo menos 95% do anticorpo ativável conjugado com uma carga de fármaco de 2. Em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui pelo menos 98% do anticorpo ativável conjugado com uma carga de fármaco de 2.
[0168] Em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado que é purificado ou enriquecido para determinadas espécies de carga de fármaco inclui mais equivalentes molares da espécie de carga de fármaco especificada do que os equivalentes molares totais de todas as outras espécies de carga de fármaco combinadas. Por exemplo, em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 é tal que os equivalentes combinados de cada uma das espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição na qual a carga do fármaco não é 2 é menor que os equivalentes do anticorpo ativável conjugado com uma carga de fármaco de 2. Em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E4 é tal que os equivalentes combinados de cada uma das espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição em que a carga de fármaco não é 4 é menor que os equivalentes do anticorpo ativável conjugado com uma carga de fármaco de 4. Em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado com DE é tal que os equivalentes combinados de cada uma das espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição na qual a carga do medicamento não é 2 ou 4 é menor que os equivalentes do anticorpo ativável conjugado que possui uma carga de fármaco de 2 ou 4.
[0169] Em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado que é purificado ou enriquecido para determinadas espécies de DAR (por exemplo, E2 ou E4, conforme discutido aqui) inclui menos de uma certa porcentagem do anticorpo ativável conjugado que não é a espécie de carga de fármaco dada. Por exemplo, em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui menos de 50% do anticorpo ativável conjugado que não é a carga de fármaco de 2 espécies. Por exemplo, em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui menos de 25% do anticorpo ativável conjugado que não é a carga de fármaco de 2 espécies. Por exemplo, em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui menos de 15% do anticorpo ativável conjugado que não é a carga de fármaco de 2 espécies. Por exemplo, em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui menos de 10% do anticorpo ativável conjugado que não é a carga de fármaco de 2 espécies. Por exemplo, em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui menos de 5% do anticorpo ativável conjugado que não é a carga de fármaco de 2 espécies. Por exemplo, em algumas modalidades, uma preparação de anticorpo ativável conjugado E2 inclui menos de 2% do anticorpo ativável conjugado que não é a carga de fármaco de 2 espécies. Em algumas outras modalidades, ou preparações enriquecidas ou purificadas (por exemplo, E4 ou DE) podem ter menos de 50%, menos de 25%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 2% que são não as espécies de carga de fármaco correspondentes na composição de anticorpo ativável conjugado enriquecido ou purificado.
[0170] Em algumas modalidades, o agente é um agente anti-inflamatório.
[0171] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável It conjugado também inclui uma porção detectável. Em algumas modalidades, a porção detectável é um agente de diagnóstico.
[0172] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado também inclui um peptídeo sinal. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é conjugado ao anticorpo ativável via um espaçador. Em algumas modalidades, o espaçador é conjugado com o anticorpo ativável na ausência de um peptídeo sinal. Em algumas modalidades, o espaçador é unido diretamente à MM do anticorpo ativável. Em algumas modalidades, o espaçador é unido diretamente à MM do anticorpo ativável na disposição estrutural do terminal N ao terminal C do espaçador-MM-CM-AB. Um exemplo de um espaçador unido diretamente ao terminal N de MM do anticorpo ativável é QGQSGQ (SEQ ID NO: 109). Outros exemplos de um espaçador unido diretamente ao terminal N da MM do anticorpo ativável incluem QGQSGQG (SEQ ID NO: 138), QGQSG (SEQ ID NO: 139), QGQS (SEQ ID NO: 140), QGQ, QG, e Q. Outros exemplos de um espaçador unido diretamente ao terminal N de MM do anticorpo ativável incluem GQSGQG (SEQ ID NO: 143), QSGQG (SEQ ID NO: 144), SGQG (SEQ ID NO: 145), GQG e G. Em algumas modalidades, nenhum espaçador é unido ao terminal N da MM. Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos a sequência de aminoácidos QGQSGQ (SEQ ID NO: 109). Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos a sequência de aminoácidos QGQSGQG (SEQ ID NO: 138). Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos a sequência de aminoácidos QGQSG (SEQ ID NO: 139). Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos a sequência de aminoácidos QGQS (SEQ ID NO: 140). Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos a sequência de aminoácidos QGQ. Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos a sequência de aminoácidos QG. Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos o resíduo de aminoácido Q. Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos a sequência de aminoácidos GQSGQG (SEQ ID NO: 143). Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos a sequência de aminoácidos QSGQG (SEQ ID NO: 144). Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos a sequência de aminoácidos SGQG (SEQ ID NO: 145). Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos a sequência de aminoácidos GQG. Em algumas modalidades, o espaçador inclui pelo menos a sequência de aminoácidos G. Em algumas modalidades, o espaçador está ausente.
[0173] Em algumas modalidades, o AB do anticorpo ativável conjugado contém naturalmente uma ou mais ligações dissulfeto. Em algumas modalidades, o AB pode ser modificado para incluir uma ou mais ligações dissulfeto.
[0174] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável do anticorpo ativável conjugado da divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável do anticorpo ativável conjugado da divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve selecionada no grupo que consiste na SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável do anticorpo ativável conjugado da divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7.
[0175] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável do anticorpo ativável conjugado da divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável do anticorpo ativável conjugado da divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável do anticorpo ativável conjugado da divulgação é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5 e uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO: 7.
[0176] A divulgação também fornece métodos para produzir um anticorpo ativável da divulgação cultivando uma célula sob condições que levam à expressão do anticorpo ativável, em que a célula compreende uma molécula de ácido nucleico da divulgação ou um vetor da divulgação.
[0177] A divulgação também fornece métodos de fabricação de um anticorpo ativável que, em um estado ativado, liga CD71, o método compreendendo: (a) cultivar uma célula compreendendo um construto de ácido nucleico que codifica o anticorpo ativável em condições que levam à expressão do anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável compreende um anticorpo ativável da divulgação; e (b) recuperar o anticorpo ativável.
[0178] Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável conjugado é maior que a do anticorpo correspondente; por exemplo, a pK do anticorpo ativável conjugado é maior que a do anticorpo correspondente. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável conjugado é semelhante à do anticorpo correspondente. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável conjugado é de pelo menos 15 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável conjugado é de pelo menos 12 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável conjugado é de pelo menos 11 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável conjugado é de pelo menos 10 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável conjugado é de pelo menos 9 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável conjugado é de pelo menos 8 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável conjugado é de pelo menos 7 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 6 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 5 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 4 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 3 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 2 dias quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 24 horas quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia- vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 20 horas quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 18 horas quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 16 horas quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 14 horas quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 12 horas quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia- vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 10 horas quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 8 horas quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 6 horas quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 4 horas quando administrada a um organismo. Em algumas modalidades, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 3 horas quando administrada a um organismo.
[0179] A divulgação também fornece métodos de produção de um anticorpo anti-CD71 e/ou polipeptídeo anticorpo ativável anti-CD71 cultivando uma célula sob condições que levam à expressão do polipeptídeo, em que a célula compreende uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um anticorpo e/ou um anticorpo ativável descrito aqui e/ou vetores que incluem essas sequências isoladas de ácido nucleico. A divulgação fornece métodos de produção de um anticorpo e/ou anticorpo ativável cultivando uma célula sob condições que levam à expressão do anticorpo e/ou anticorpo ativável, em que a célula compreende uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um anticorpo e/ou um anticorpo ativável aqui descrito e/ou vetores que incluem essas sequências isoladas de ácido nucleico.
[0180] A invenção fornece métodos para prevenir, retardar a progressão, tratar, aliviar um sintoma de ou melhorar uma doença mediada por CD71 em um indivíduo, administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD71 ativável conjugado aqui descrito para um indivíduo em necessidade disso.
[0181] A invenção também fornece métodos para prevenir, retardar a progressão, tratar, aliviar um sintoma de ou melhorar o câncer em um indivíduo, administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD71 ativável conjugado aqui descrito para um indivíduo em necessidade. Sabe-se que CD71 é expresso em uma variedade de cânceres, como, por exemplo, não limitativo, adenocarcinoma, câncer de ducto biliar (biliar), câncer de bexiga, câncer de mama, por exemplo, câncer de mama triplo-negativo e câncer de mama Her2-negativo Câncer; câncer carcinoide; câncer cervical; colangiocarcinoma; colorretal; endometrial; glioma; câncer de cabeça e pescoço, por exemplo, câncer de células escamosas de cabeça e pescoço; leucemia; câncer de fígado; câncer de pulmão, por exemplo, NSCLC, SCLC; linfoma; melanoma; câncer de osofaringe; câncer do ovário; câncer de pâncreas; câncer da próstata, por exemplo, carcinoma da próstata metastático resistente à castração; câncer renal; câncer de pele; câncer de células escamosas, câncer de estômago; câncer de testículo; câncer de tireoide; e câncer urotelial.
[0182] Em algumas modalidades, o câncer está associado a um tumor que expressa CD71. Em algumas modalidades, o câncer é devido a um tumor que expressa CD71.
[0183] Um anticorpo anti-CD71 ativável conjugado usado em qualquer uma das modalidades desses métodos e usos pode ser administrado em qualquer estágio da doença. Por exemplo, esse anticorpo anti-CD71 ativável conjugado pode ser administrado a um paciente que sofre de câncer de qualquer estágio, desde o início até o metastático. Os termos indivíduo e paciente são usados aqui de forma intercambiável.
[0184] Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero, como um primata humano ou não humano.
[0185] O anticorpo anti-CD71 ativável conjugado e suas formulações terapêuticas são administradas a um indivíduo que sofre ou é suscetível a uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou atividade aberrante de CD71. Um indivíduo que sofre ou é suscetível a uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou atividade aberrante de CD71 é identificado usando qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, indivíduos que sofrem de câncer ou outra condição neoplásica são identificados usando uma variedade de testes clínicos e/ou laboratoriais, como exame físico e análises de sangue, urina e/ou fezes para avaliar o estado de saúde. Por exemplo, indivíduos que sofrem de inflamação e/ou distúrbio inflamatório são identificados usando qualquer uma de uma variedade de testes clínicos e/ou laboratoriais, como exame físico e/ou análise de fluidos corporais, por exemplo, análise de sangue, urina e/ou fezes, para avaliar o estado de saúde.
[0186] A administração de um anticorpo anti-CD71 ativável conjugado a um paciente que sofre de uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou atividade aberrante de CD71 é considerada bem-sucedida se qualquer um de vários objetivos clínicos ou laboratoriais for alcançado. Por exemplo, a administração de um anticorpo anti-CD71 ativável conjugado a um paciente que sofre de uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou atividade aberrante do CD71 é considerada bem- sucedida se um ou mais dos sintomas associados à doença ou distúrbio forem aliviados, reduzidos, inibido ou não progride para outro estado, ou seja, pior. A administração de um anticorpo anti-CD71 ativável conjugado a um paciente que sofre de uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou atividade aberrante de CD71 é considerada bem-sucedida se a doença ou distúrbio entrar em remissão ou não progredir para outro estado, ou seja, pior.
[0187] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD71 ativável conjugado e suas formulações terapêuticas são administrados a um indivíduo que sofre ou é suscetível a uma doença ou distúrbio, como indivíduos que sofrem de câncer ou outra condição neoplásica, em que as células doentes do indivíduo estão expressando CD71. Em algumas modalidades, as células doentes estão associadas à expressão e/ou atividade aberrante de CD71. Em algumas modalidades, as células doentes estão associadas à expressão e/ou atividade normais de CD71. Um indivíduo que sofre ou é suscetível a uma doença ou distúrbio em que as células doentes expressam CD71 é identificado usando qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, indivíduos que sofrem de câncer ou outra condição neoplásica são identificados usando uma variedade de testes clínicos e/ou laboratoriais, como exame físico e análises de sangue, urina e/ou fezes para avaliar o estado de saúde. Por exemplo, indivíduos que sofrem de inflamação e/ou distúrbio inflamatório são identificados usando qualquer uma de uma variedade de testes clínicos e/ou laboratoriais, como exame físico e/ou análise de fluidos corporais, por exemplo, análise de sangue, urina e/ou fezes, para avaliar o estado de saúde.
[0188] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD71 ativável conjugado e suas formulações terapêuticas são administrados a um indivíduo que sofre ou é suscetível a uma doença ou distúrbio associado a células que expressam CD71 ou a presença, crescimento, proliferação, metástase e/ou atividade de tal células, como indivíduos que sofrem de câncer ou outras condições neoplásicas. Em algumas modalidades, as células estão associadas à expressão e/ou atividade aberrante de CD71. Em algumas modalidades, as células estão associadas à expressão e/ou atividade normal de CD71. Um indivíduo que sofre ou é suscetível a uma doença ou distúrbio associado a células que expressam CD71 é identificado usando qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, indivíduos que sofrem de câncer ou outra condição neoplásica são identificados usando uma variedade de testes clínicos e/ou laboratoriais, como exame físico e análises de sangue, urina e/ou fezes para avaliar o estado de saúde. Por exemplo, indivíduos que sofrem de inflamação e/ou distúrbio inflamatório são identificados usando qualquer uma de uma variedade de testes clínicos e/ou laboratoriais, como exame físico e/ou análise de fluidos corporais, por exemplo, análise de sangue, urina e/ou fezes, para avaliar o estado de saúde.
[0189] A administração de um anticorpo anti-CD71 ativável conjugado a um paciente que sofre de uma doença ou distúrbio associado a células que expressam CD71 é considerada bem-sucedida se qualquer um de vários objetivos clínicos ou laboratoriais for alcançado. Por exemplo, a administração de um anticorpo anti-CD71 ativável conjugado a um paciente que sofre de uma doença ou distúrbio associado a células que expressam CD71 é considerada bem-sucedida se um ou mais dos sintomas associados à doença ou distúrbio forem aliviados, reduzidos, inibidos ou não progredirem para outro estado, ou seja, pior. A administração de um anticorpo anti- CD71 ativável conjugado a um paciente que sofre de uma doença ou distúrbio associado a células que expressam CD71 é considerada bem-sucedida se a doença ou distúrbio entrar em remissão ou não progredir para outro estado, ou seja, pior.
[0190] A divulgação também fornece métodos de tratamento, alívio de um sintoma ou atraso da progressão de um distúrbio ou doença na qual as células doentes expressam CD71 compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo conjugado da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo conjugado da divulgação a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o distúrbio ou doença é câncer.
[0191] A divulgação também fornece métodos de tratamento, alívio de um sintoma ou atraso da progressão de um distúrbio ou doença associada a células que expressam CD71 compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo conjugado da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo conjugado da divulgação a um indivíduo em necessidade. Em algumas modalidades, o distúrbio ou doença associada às células que expressam CD71 é câncer. Em algumas modalidades, o câncer é um adenocarcinoma, um câncer do ducto biliar (biliar), um câncer de bexiga, um câncer ósseo, um câncer de mama, um câncer de mama triplo negativo, um câncer de mama Her2 negativo, um câncer carcinoide, um colo do útero câncer, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer endometrial, glioma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de células escamosas de cabeça e pescoço, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, célula não pequena câncer de pulmão, um câncer de pulmão de células pequenas, um linfoma, um melanoma, um câncer de orofaringe, um câncer de ovário, um câncer de pâncreas, um câncer de próstata, um carcinoma de próstata resistente à castração metastático, um câncer renal, um sarcoma, um câncer de pele, um câncer de células escamosas, um câncer de estômago, um câncer de testículo, um câncer de tireoide, um câncer urogenital ou um câncer urotelial. Em algumas modalidades, o ligante natural é transferrina. Em algumas modalidades, a expressão e/ou atividade do CD71 de mamífero é aberrante. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um agente adicional. Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente terapêutico.
[0192] A divulgação também fornece métodos para inibir ou reduzir o crescimento, proliferação ou metástase de células que expressam CD71 de mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da divulgação ou um anticorpo conjugado da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo conjugado da divulgação a um indivíduo em necessidade. Em algumas modalidades, o ligante natural é transferrina. Em algumas modalidades, a expressão e/ou atividade do CD71 de mamífero é aberrante. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um agente adicional. Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente terapêutico.
[0193] A divulgação também fornece métodos de inibição, bloqueio ou prevenção da ligação de um ligante natural ao CD71 de mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da divulgação ou um anticorpo conjugado da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo conjugado da divulgação a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o ligante natural é transferrina. Em algumas modalidades, a expressão e/ou atividade do CD71 de mamífero é aberrante. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um agente adicional. Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente terapêutico.
[0194] A divulgação também fornece métodos de tratamento, alívio de um sintoma ou atraso da progressão de um distúrbio ou doença na qual as células doentes expressam CD71 compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ativável da divulgação ou um anticorpo ativável conjugado da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ativável da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ativável conjugado da divulgação a um indivíduo em necessidade. Em algumas modalidades, o distúrbio ou doença é câncer.
[0195] A divulgação também fornece métodos de tratamento, alívio de um sintoma ou atraso da progressão de um distúrbio ou doença associada a células que expressam CD71 compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ativável conjugado da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ativável conjugado da divulgação a um indivíduo em necessidade. Em algumas modalidades, o distúrbio ou doença associada às células que expressam CD71 é câncer. Em algumas modalidades, o câncer é um adenocarcinoma, um câncer do ducto biliar (biliar), um câncer de bexiga, um câncer ósseo, um câncer de mama, um câncer de mama triplo negativo, um câncer de mama Her2 negativo, um câncer carcinoide, um colo do útero câncer, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer endometrial, glioma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de células escamosas de cabeça e pescoço, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, célula não pequena câncer de pulmão, um câncer de pulmão de células pequenas, um linfoma, um melanoma, um câncer de orofaringe, um câncer de ovário, um câncer de pâncreas, um câncer de próstata, um carcinoma de próstata resistente à castração metastático, um câncer renal, um sarcoma, um câncer de pele, um câncer de células escamosas, um câncer de estômago, um câncer de testículo, um câncer de tireoide, um câncer urogenital ou um câncer urotelial. Em algumas modalidades, o ligante natural é transferrina. Em algumas modalidades, a expressão e/ou atividade do CD71 de mamífero é aberrante. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um agente adicional. Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente terapêutico.
[0196] A divulgação também fornece métodos de inibição ou redução do crescimento, proliferação ou metástase de células que expressam CD71 de mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ativável da divulgação ou um anticorpo ativável conjugado da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ativável da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ativável conjugado da divulgação a um indivíduo em necessidade. Em algumas modalidades, o ligante natural é transferrina. Em algumas modalidades, a expressão e/ou atividade do CD71 de mamífero é aberrante. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um agente adicional. Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente terapêutico.
[0197] A divulgação também fornece métodos de inibição, bloqueio ou prevenção da ligação de um ligante natural ao CD71 de mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ativável conjugado da divulgação ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ativável conjugado da divulgação a um indivíduo em necessidade. Em algumas modalidades, o ligante natural é transferrina. Em algumas modalidades, a expressão e/ou atividade do CD71 de mamífero é aberrante. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um agente adicional. Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente terapêutico.
[0198] Em algumas modalidades desses métodos e kits, o anticorpo ativável conjugado com anti-CD71 inclui um marcador detectável. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o rótulo detectável inclui um agente de imagem, um agente de contraste, uma enzima, um rótulo fluorescente, um cromóforo, um corante, um ou mais íons metálicos ou um rótulo à base de ligante. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o agente de imagem compreende um radioisótopo. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o radioisótopo é índio ou tecnécio. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o agente de contraste compreende iodo, gadolínio ou óxido de ferro. Em algumas modalidades desses métodos e kits, a enzima compreende peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina ou β-galactosidase. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o rótulo fluorescente compreende proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciana (CFP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha modificada (mRFP), proteína fluorescente vermelha tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED ou um derivado de európio. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o rótulo luminescente compreende um derivado de N-metilacrílico. Em algumas modalidades desses métodos, o rótulo compreende um rótulo Alexa Fluor®, como Alex Fluor® 680 ou Alexa Fluor® 750. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o rótulo à base de ligante compreende biotina, avidina, estreptavidina ou um ou mais haptenos.
[0199] Em algumas modalidades desses métodos e kits, o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades desses métodos, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero não humano, como um primata não humano, animal de companhia (por exemplo, gato, cachorro, cavalo), animal de fazenda, animal de trabalho ou animal de zoológico. Em algumas modalidades, o indivíduo é um roedor.
[0200] Em algumas modalidades desses métodos e kits, o método é um método in vivo. Em algumas modalidades desses métodos, o método é um método in situ. Em algumas modalidades desses métodos, o método é um método ex vivo. Em algumas modalidades desses métodos, o método é um método in vitro.
[0201] Em algumas modalidades dos métodos e kits, o método é usado para identificar ou refinar uma população de pacientes adequada para tratamento com um anticorpo ativável conjugado anti-CD71 da divulgação, seguido de tratamento pela administração desse anticorpo anti-CD71 ativável conjugado a um indivíduo em necessidade. Por exemplo, pacientes com resultado positivo tanto para o alvo (por exemplo, CD71) quanto para uma protease que cliva o substrato na porção clivável (CM) do anticorpo ativável anti-CD71 sendo testado nesses métodos são identificados como candidatos adequados ao tratamento com tal anticorpo ativável anti-CD71 compreendendo tal CM, e o paciente é então administrado uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD71 ativável e/ou anticorpo anti-CD71 ativável conjugado que foi testado. Da mesma forma, pacientes com resultado negativo para um ou ambos os alvos (por exemplo, CD71) e a protease que cliva o substrato na CM no anticorpo ativável sendo testado usando esses métodos podem ser identificados como candidatos adequados para outra forma de terapia. Em algumas modalidades, esses pacientes podem ser testados com outros anticorpos ativáveis anti-CD71 até que um anticorpo ativável anti-CD71 adequado para tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável anti-CD71 compreendendo um CM que é clivado pelo paciente no local de doença). Em algumas modalidades, o paciente é então administrado uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD71 ativável e/ou conjugado para o qual o paciente testou positivo. AB, MM e/ou CM adequados incluem qualquer um dos AB, MM e/ou CM aqui divulgados.
[0202] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem incluir um anticorpo da invenção e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável. Essas composições farmacêuticas podem ser incluídas em kits, como, por exemplo, kits de diagnóstico.
[0203] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ativável conjugado da divulgação e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um agente adicional. Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente terapêutico.
[0204] Os anticorpos anti-CD71 e os ABs nos anticorpos ativáveis da divulgação se ligam especificamente a um alvo CD71, como, por exemplo, CD71 de mamífero e/ou CD71 humano. Também estão incluídos na divulgação os anticorpos anti-CD71 e ABs que se ligam ao mesmo epítopo CD71 que um anticorpo da divulgação e/ou um anticorpo ativável ativado aqui descrito. Também estão incluídos na divulgação os anticorpos anti-CD71 e os ABs que competem com um anticorpo anti-CD71 e/ou um anticorpo ativável anti-CD71 ativado aqui descrito para a ligação a um alvo CD71, por exemplo, CD71 humano. Também estão incluídos na divulgação os anticorpos anti-CD71 e os ABs que competem de forma cruzada com um anticorpo anti-CD71 e/ou um anticorpo ativável anti-CD71 ativado aqui descrito para a ligação a um alvo CD71, por exemplo, CD71 humano.
[0205] Os anticorpos anti-CD71 ativáveis aqui fornecidos incluem uma porção de mascaramento. Em algumas modalidades, a porção de mascaramento é uma sequência de aminoácidos que é acoplada ou de outra forma ligada ao anticorpo anti- CD71 e é posicionada dentro da construção de anticorpo ativável anti-CD71, de modo que a porção de mascaramento reduz a capacidade do anticorpo anti-CD71 de ligar especificamente CD71. Porções de máscara apropriadas são identificadas usando qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, as porções de máscara de peptídeo são identificadas usando os métodos descritos na Publicação PCT n° WO 2009/025846 de Daugherty et al., cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0206] Os anticorpos anti-CD71 ativáveis aqui fornecidos incluem uma porção clivável. Em algumas modalidades, a porção clivável inclui uma sequência de aminoácidos que é um substrato para uma protease, geralmente uma protease extracelular. Os substratos adequados são identificados usando qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, os substratos peptídicos são identificados usando os métodos descritos na Patente US n° 7.666.817 de Daugherty et al.; na Patente US n° 8.563.269 de Stagliano et al.; e na Publicação PCT n° WO 2014/026136 de La Porte et al., cujo conteúdo de cada um deles é aqui incorporado por referência na sua totalidade. (Veja também Boulware et al. “Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics”. Biotechnol. Bioeng. 106.3 (2010): 339 a 46).
[0207] Substratos exemplificadores incluem, mas não estão limitados a substratos cliváveis por uma ou mais das seguintes enzimas ou proteases listadas na Tabela (I). TABELA (I): PROTEASES E/OU ENZIMAS EXEMPLIFICADORAS
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[0208] Os anticorpos anti-CD71 ativáveis aqui descritos superam uma limitação da terapêutica de anticorpos, particularmente terapêutica de anticorpos que são conhecidas por serem tóxicas, pelo menos em algum grau, in vivo. A toxicidade mediada por alvo constitui uma grande limitação para o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos. Os anticorpos anti-CD71 ativáveis aqui fornecidos são projetados para abordar a toxicidade associada à inibição do alvo em tecidos normais por anticorpos terapêuticos tradicionais. Esses anticorpos anti-CD71 ativáveis permanecem mascarados até serem ativados proteoliticamente no local da doença. Começando com um anticorpo anti-CD71 como anticorpo terapêutico parental, os anticorpos ativáveis anti-CD71 da invenção foram manipulados acoplando o anticorpo a uma máscara inibidora através de um ligante que incorpora um substrato de protease.
[0209] Quando o AB é modificado com uma MM e está na presença do alvo, a ligação específica do AB ao seu alvo é reduzida ou inibida, em comparação com a ligação específica do AB não modificada com uma MM ou a ligação específica do AB parental ao alvo.
[0210] O Kd do AB modificado com uma MM em direção à meta é de pelo menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ou superior, ou entre 5 e 10, 10 e 100, 10 e 1.000, 10 e 10.000, 10 e 100.000, 10 e 1.000.000, 10 e 10.000.000, 100 e 1.000, 100 e 10.000, 100 e 100.000, 100 e 1.000.000, 100 e 10.000.000, 1.000 e 10.000, 1.000 e 100.000, 1.000 e 1.000.000, 1.000 e 10.000.000, 10.000 e 100.000, 10.000 e 1.000.000, 10.000 e 10.000.000, 100.000 e 1.000.000 ou 100.000 e 10.000.000 vezes maior que o Kd do AB não modificado com uma MM ou com o AB parental em direção ao alvo. Por outro lado, a afinidade de ligação do AB modificada com uma MM em relação ao destino é de pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ou mais, ou entre 5 e 10, 10 e 100, 10 e 1.000, 10 e 10.000, 10 e 100.000, 10 e 1.000.000, 10 e 10.000.000, 100 e 1.000, 100 e 10.000, 100 e 100.000, 100 e 1.000.000, 100 e 10.000.000, 1.000 e 10.000, 1.000 e 100.000, 1.000 e 1.000.000, 1.000 e 10.000.000, 10.000 e 100.000, 10.000 e 1.000.000, 10.000 e 10.000.000, 100.000 e 1.000.000 ou 100.000 e 10.000.000 vezes menor que a afinidade de ligação do AB não modificada com uma MM ou do AB parental em relação ao alvo.
[0211] A constante de dissociação (Kd) da MM para o AB é geralmente maior do que o Kd do AB para o alvo. O Kd da MM em direção ao AB pode ser pelo menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 ou até 10.000.000 vezes maior que o Kd do AB em direção ao alvo. Por outro lado, a afinidade de ligação da MM em relação ao AB é geralmente menor que a afinidade de ligação do AB em relação ao alvo. A afinidade de ligação de MM em relação ao AB pode ser pelo menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 ou até 10.000.000 vezes menor que a afinidade de ligação do AB em relação ao AB o alvo.
[0212] Em algumas modalidades, a constante de dissociação (Kd) da MM para o AB é aproximadamente igual a Kd do AB para o alvo. Em algumas modalidades, a constante de dissociação (Kd) da MM em direção ao AB não é mais do que a constante de dissociação do AB em direção ao alvo.
[0213] Em algumas modalidades, a constante de dissociação (Kd) da MM em direção ao AB é menor que a constante de dissociação do AB em direção ao alvo.
[0214] Em algumas modalidades, a constante de dissociação (Kd) da MM em direção ao AB é maior que a constante de dissociação do AB em direção ao alvo.
[0215] Em algumas modalidades, a MM tem um Kd para a ligação ao AB que não é mais do que o Kd por ligação do AB para o alvo.
[0216] Em algumas modalidades, a MM tem um Kd para a ligação ao AB que não é menos do que o Kd por ligação do AB para o alvo.
[0217] Em algumas modalidades, a MM tem um Kd para a ligação ao AB que é aproximadamente igual a Kd para a ligação do AB para o alvo.
[0218] Em algumas modalidades, a MM tem um Kd para a ligação ao AB que é menor do que o Kd por ligação do AB para o alvo.
[0219] Em algumas modalidades, a MM tem um K d para a ligação ao AB que é maior do que o Kd por ligação do AB para o alvo.
[0220] Em algumas modalidades, a MM tem um Kd para a ligação ao AB que não é mais do que 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ou 1.000 vezes maior do que o Kd por ligação do AB para o alvo. Em algumas modalidades, a MM tem um Kd para ligação ao AB que está entre 1 e 5, 2 e 5, 2 e 10, 5 e 10, 5 e 20, 5 e 50, 5 e 100, 10 e 100, 10 e 1.000, 20 e 100, 20 e 1.000 ou 100 e 1.000 vezes maior do que o Kd por ligação do AB para o alvo.
[0221] Em algumas modalidades, a MM tem uma afinidade para ligação ao AB que é menor que a afinidade de ligação do AB ao alvo.
[0222] Em algumas modalidades, a MM tem uma afinidade para ligação ao AB que não é maior do que a afinidade de ligação do AB ao alvo.
[0223] Em algumas modalidades, a MM tem uma afinidade para ligação ao AB que é aproximadamente igual à afinidade de ligação do AB ao alvo.
[0224] Em algumas modalidades, a MM tem uma afinidade para ligação ao AB que não é menor que a afinidade de ligação do AB ao alvo.
[0225] Em algumas modalidades, a MM tem uma afinidade para ligação ao AB que é maior que a afinidade de ligação do AB ao alvo.
[0226] Em algumas modalidades, a MM tem uma afinidade para ligação ao AB que é 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ou 1.000 menor que a afinidade da ligação do AB ao alvo. Em algumas modalidades, a MM tem uma afinidade para ligação ao AB que está entre 1 e 5, 2 e 5, 2 e 10, 5 e 10, 5 e 20, 5 e 50, 5 e 100, 10 e 100, 10 e 1.000, 20 e 100, 20 e 1.000 ou 100 e 1.000 vezes menor que a afinidade de ligação do AB ao alvo. Em algumas modalidades, a MM tem uma afinidade para ligação ao AB que é 2 a 20 vezes menor que a afinidade de ligação do AB ao alvo. Em algumas modalidades, uma MM não covalentemente ligada ao AB e em concentração equimolar ao AB não inibe a ligação do AB ao alvo.
[0227] Quando o AB é modificado com uma MM e está na presença da ligação específica do alvo do AB ao seu alvo, é reduzido ou inibido, em comparação com a ligação específica do AB não modificada com uma MM ou a ligação específica do AB parental para o alvo. Quando comparada com a ligação do AB não modificada com uma MM ou a ligação do AB parental ao alvo, a capacidade do AB de vincular o alvo quando modificado com uma MM pode ser reduzida em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e até 100% por pelo menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 ou 96 horas, ou 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 ou 180 dias, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses ou mais, quando medidos in vivo ou em um ensaio in vitro.
[0228] A MM inibe a ligação do AB ao alvo. A MM liga o domínio de ligação ao antígeno do AB e inibe a ligação do AB ao alvo. A MM pode inibir estericamente a ligação do AB ao alvo. A MM pode inibir alostericamente a ligação do AB ao seu alvo. Nessas modalidades, quando o AB é modificado ou acoplado a uma MM e na presença do alvo, não há ligação ou substancialmente nenhuma ligação do AB ao alvo, ou não mais que 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% ou 50% de ligação de o AB ao alvo, em comparação com a ligação do AB não modificado com uma MM, o AB parental ou o AB não acoplado a uma MM ao alvo, por pelo menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 ou 96 horas, ou 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 ou 180 dias ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses ou mais quando medidos in vivo ou em um ensaio in vitro.
[0229] Quando um AB é acoplado ou modificado por uma MM, a MM “mascara” ou reduz ou inibe a ligação específica do AB ao alvo. Quando um AB é acoplado ou modificado por uma MM, esse acoplamento ou modificação pode efetuar uma mudança estrutural que reduz ou inibe a capacidade do AB de ligar especificamente seu alvo.
[0230] Um AB acoplado ou modificado a uma MM pode ser representado pelas seguintes fórmulas (em ordem de uma região terminal amino (N) para uma região terminal carboxila (C): (MM)-(AB) (AB)-(MM) (MM)-L-(AB) (AB)-L-(MM)
[0231] em que MM é uma porção de mascaramento, o AB é um anticorpo ou seu fragmento de anticorpo e o L é um ligante. Em muitas modalidades, pode ser desejável inserir um ou mais ligantes, por exemplo, ligantes flexíveis, na composição, a fim de proporcionar flexibilidade.
[0232] Em certas modalidades, a MM não é um parceiro de ligação natural do AB. Em algumas modalidades, a MM não contém nenhuma ou praticamente nenhuma homologia com qualquer parceiro de ligação natural da AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75% ou 80% semelhante a qualquer parceiro de ligação natural da AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75% ou 80% idêntico a qualquer parceiro de ligação natural da AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 25% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 50% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 20% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 10% idêntico a qualquer parceiro de ligação natural do AB.
[0233] Em algumas modalidades, os anticorpos ativáveis incluem um AB que é modificado por uma MM e também inclui uma ou mais frações cliváveis (CM). Tais anticorpos ativáveis exibem ligação ativável/comutável ao alvo do AB. Anticorpos ativáveis geralmente incluem um anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB), modificado por ou acoplado a uma porção de mascaramento (MM) e uma porção modificável ou clivável (CM). Em algumas modalidades, a CM contém uma sequência de aminoácidos que serve como substrato para pelo menos uma protease.
[0234] Os elementos dos anticorpos ativáveis são dispostos de modo que a MM e a CM sejam posicionados de modo que, em um estado clivado (ou relativamente ativo) e na presença de um alvo, o AB se ligue a um alvo enquanto o anticorpo ativável estiver em um não clivado (ou estado relativamente inativo) na presença do alvo, a ligação específica do AB ao seu alvo é reduzida ou inibida. A ligação específica do AB ao seu alvo pode ser reduzida devido à inibição ou mascaramento da capacidade do AB de se ligar especificamente ao seu alvo pela MM.
[0235] O Kd do AB modificado com uma MM e um CM em direção ao alvo é de pelo menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ou superior, ou entre 5 e 10, 10 e 100, 10 e 1.000, 10 e 10.000, 10 e 100.000, 10 e 1.000.000, 10 e 10.000.000, 100 e 1.000, 100 e 10.000, 100 e 100.000, 100 e 1.000.000, 100 e 10.000.000, 1.000 e 10.000, 1.000 e 100.000, 1.000 e 1.000.000, 1.000 e 10.000.000, 10.000 e 100.000, 10.000 e 1.000.000, 10.000 e 10.000.000, 100.000 e 1.000.000 ou 100.000 e 10.000.000 vezes maior que o Kd do AB não foi modificado com uma MM e uma CM ou com o AB parental em direção ao alvo. Por outro lado, a afinidade de ligação do AB modificada com uma MM e um CM em relação ao alvo é de pelo menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ou superior, ou entre 5 e 10, 10 e 100, 10 e 1.000, 10 e 10.000, 10 e 100.000, 10 e 1.000.000, 10 e 10.000.000, 100 e 1.000, 100 e 10.000, 100 e 100.000, 100 e 1.000.000, 100 e 10.000.000, 1.000 e 10.000, 1.000 e 100.000, 1.000 e 1.000.000, 1.000 e 10.000.000, 10.000 e 100.000, 10.000 e 1.000.000, 10.000 e 10.000.000, 100.000 e 1.000.000 ou 100.000 e 10.000.000 vezes menor que a ligação afinidade do AB não modificado com uma MM e uma CM ou do AB parental em relação ao alvo.
[0236] Quando o AB é modificado com uma MM e uma CM e está na presença do alvo, mas não na presença de um agente modificador (por exemplo, pelo menos uma protease), a ligação específica do AB ao seu alvo é reduzida ou inibida, em comparação com a ligação específica do AB não modificada com uma MM e uma CM ou do AB parental ao alvo. Quando comparada com a ligação do AB parental ou a ligação de um AB não modificado com uma MM e uma CM ao seu alvo, a capacidade do AB de vincular o alvo quando modificado com uma MM e uma CM pode ser reduzida em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e até 100% por pelo menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 ou 96 horas ou 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 ou 180 dias ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses ou mais, quando medidos in vivo ou em um ensaio in vitro.
[0237] Como aqui utilizado, o termo estado clivado refere-se à condição dos anticorpos ativáveis após a modificação da CM por pelo menos uma protease. O termo estado não clivado, como aqui utilizado, refere-se à condição dos anticorpos ativáveis na ausência de clivagem da CM por uma protease. Como discutido acima, o termo “anticorpos ativáveis” é usado aqui para se referir a um anticorpo ativável tanto no seu estado não clivado (nativo), quanto no seu estado clivado. Será evidente para o versado na técnica que, em algumas modalidades, um anticorpo ativável clivado pode não ter uma MM devido à clivagem da CM por protease, resultando na liberação de pelo menos a MM (por exemplo, quando a MM não está unida aos anticorpos ativáveis por uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação dissulfeto entre resíduos de cisteína).
[0238] Por ativável ou comutável, entende-se que o anticorpo ativável exibe um primeiro nível de ligação a um alvo quando o anticorpo ativável está em um estado inibido, mascarado ou não clivado (isto é, uma primeira conformação) e um segundo nível de ligação ao alvo em o estado desinibido, sem máscara e/ou clivado (isto é, uma segunda conformação), em que o segundo nível de ligação ao alvo é maior que o primeiro nível de ligação. Em geral, o acesso do alvo ao AB do anticorpo ativável é maior na presença de um agente de clivagem capaz de clivar a CM, isto é, uma protease, do que na ausência desse agente de clivagem. Assim, quando o anticorpo ativável está no estado não clivado, o AB é inibido da ligação ao alvo e pode ser mascarado da ligação ao alvo (ou seja, a primeira conformação é tal que o AB não pode se ligar ao alvo) e, no estado clivado, o AB é não inibido ou é desmascarado para direcionar a ligação.
[0239] A CM e AB dos anticorpos ativáveis são selecionados de modo que o AB represente uma porção de ligação para um determinado alvo e a CM represente um substrato para uma protease. Em algumas modalidades, a protease é colocalizada com o alvo em um local de tratamento ou local de diagnóstico em um indivíduo. Como aqui utilizado, colocalizado refere-se a estar no mesmo local ou relativamente próximo nas proximidades. Em algumas modalidades, uma protease cliva uma CM produzindo um anticorpo ativado que se liga a um alvo localizado próximo ao local de clivagem. Os anticorpos ativáveis divulgados neste documento encontram uso particular em que, por exemplo, uma protease capaz de clivar um local na CM, ou seja, uma protease, está presente em níveis relativamente mais altos no tecido que contém o alvo de um local de tratamento ou local de diagnóstico do que no tecido de locais sem tratamento (por exemplo, em tecidos saudáveis). Em algumas modalidades, uma CM da divulgação também é clivada por uma ou mais outras proteases. Em algumas modalidades, são as uma ou mais outras proteases que são colocalizadas com o alvo e são responsáveis pela clivagem da CM in vivo.
[0240] Em algumas modalidades, os anticorpos ativáveis fornecem toxicidade reduzida e/ou efeitos colaterais adversos que poderiam resultar da ligação do AB em locais de não tratamento se o AB não fosse mascarado ou inibido de outro modo pela ligação ao alvo.
[0241] Em geral, um anticorpo ativável pode ser projetado selecionando um AB de interesse e construindo o restante do anticorpo ativável de modo que, quando restrito de forma conformacional, a MM forneça o mascaramento do AB ou a redução da ligação do AB ao seu alvo. Os critérios de projeto estrutural podem ser levados em consideração para fornecer esse recurso funcional.
[0242] Anticorpos ativáveis que exibem um fenótipo comutável de uma faixa dinâmica desejada para ligação ao alvo em uma conformação inibida contra uma desinibida são fornecidos. A faixa dinâmica geralmente se refere a uma razão de (a) um nível máximo detectado de um parâmetro sob um primeiro conjunto de condições para (b) um valor mínimo detectado desse parâmetro sob um segundo conjunto de condições. Por exemplo, no contexto de um anticorpo ativável, a faixa dinâmica refere- se à razão de (a) um nível máximo detectado de ligação da proteína alvo a um anticorpo ativável na presença de pelo menos uma protease capaz de clivar a CM dos anticorpos ativáveis para (b) um nível mínimo detectado de ligação da proteína alvo a um anticorpo ativável na ausência da protease. A faixa dinâmica de um anticorpo ativável pode ser calculada como a razão da constante de dissociação de um tratamento com agente de clivagem de anticorpos ativáveis (por exemplo, enzima) para a constante de dissociação do tratamento com agentes de clivagem de anticorpos ativáveis. Quanto maior a faixa dinâmica de um anticorpo ativável, melhor o fenótipo comutável do anticorpo ativável. Anticorpos ativáveis com valores de faixa dinâmica relativamente mais altos (por exemplo, maiores que 1) exibem fenótipos de comutação mais desejáveis, de modo que a ligação às proteínas alvo pelos anticorpos ativáveis ocorre em maior extensão (por exemplo, ocorre predominantemente) na presença de um agente de clivagem (por exemplo, enzima) capaz de clivar a CM dos anticorpos ativáveis do que na ausência de um agente de clivagem.
[0243] Os anticorpos ativáveis podem ser fornecidos em uma variedade de configurações estruturais. Fórmulas exemplificadores para anticorpos ativáveis são fornecidas abaixo. É especificamente contemplado que a ordem N-terminal a C- terminal do AB, MM e CM pode ser revertida dentro de um anticorpo ativável. Também é especificamente contemplado que a CM e a MM possam se sobrepor na sequência de aminoácidos, por exemplo, de modo que a CM esteja contido na MM.
[0244] Por exemplo, os anticorpos ativáveis podem ser representados pela seguinte fórmula (em ordem de uma região terminal amino (N) para uma região terminal carboxila (C): (MM)-(CM)-(AB) (AB)-(CM)-(MM)
[0245] em que MM é uma porção de mascaramento, a CM é uma porção clivável e AB é um anticorpo ou fragmento do mesmo. Deve-se notar que, embora MM e CM sejam indicados como componentes distintos nas fórmulas acima, em todas as modalidades exemplificadores (incluindo fórmulas) divulgadas neste documento, é contemplado que as sequências de aminoácidos da MM e da CM possam se sobrepor, por exemplo, de modo que a CM está total ou parcialmente contido na MM. Além disso, as fórmulas acima fornecem sequências adicionais de aminoácidos que podem ser posicionadas no terminal N ou no terminal C dos elementos anticorpos ativáveis.
[0246] Em certas modalidades, a MM não é um parceiro de ligação natural do AB. Em algumas modalidades, a MM não contém nenhuma ou praticamente nenhuma homologia com qualquer parceiro de ligação natural da AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75% ou 80% semelhante a qualquer parceiro de ligação natural da AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75% ou 80% idêntico a qualquer parceiro de ligação natural da AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 50% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 25% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 20% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas modalidades, a MM não é mais do que 10% idêntico a qualquer parceiro de ligação natural do AB.
[0247] Em muitas modalidades, pode ser desejável inserir um ou mais ligantes, por exemplo, ligantes flexíveis, na construção de anticorpo ativável, de modo a fornecer flexibilidade em uma ou mais das junções MM-CM, junção CM-AB ou ambas. Por exemplo, AB, MM e/ou CM podem não conter um número suficiente de resíduos (por exemplo, Gly, Ser, Asp, Asn, especialmente Gly e Ser, particularmente Gly) para fornecer a flexibilidade desejada. Como tal, o fenótipo comutável de tais construções de anticorpos ativáveis pode se beneficiar da introdução de um ou mais aminoácidos para fornecer um ligante flexível. Além disso, como descrito abaixo, quando o anticorpo ativável é fornecido como uma construção restrita à conformação, um ligante flexível pode ser operacionalmente inserido para facilitar a formação e manutenção de uma estrutura cíclica no anticorpo ativável não clivado.
[0248] Por exemplo, em certas modalidades, um anticorpo ativável compreende uma das seguintes fórmulas (em que a fórmula abaixo representa uma sequência de aminoácidos na direção terminal N a C ou direção terminal C a N): (MM)-LP1-(CM)-(AB) (MM)-(CM)-LP2-(AB) (MM)-LP1-(CM)-LP2-(AB)
[0249] em que MM, CM e AB são como definidos acima; em que LP1 e LP2 são cada um independentemente e opcionalmente presente ou ausente, são os mesmos ou diferentes ligantes flexíveis que incluem pelo menos 1 aminoácido flexível (por exemplo, Gly). Além disso, as fórmulas acima fornecem sequências adicionais de aminoácidos que podem ser posicionadas no terminal N ou no terminal C dos elementos anticorpos ativáveis. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, porções de direcionamento (por exemplo, um ligante para um receptor de uma célula presente em um tecido-alvo) e porções que prolongam a meia-vida no soro (por exemplo, polipeptídeos que ligam proteínas séricas, como imunoglobulina (por exemplo, IgG) ou albumina sérica (por exemplo, albumina sérica humana (HAS)).
[0250] A CM é clivada especificamente por pelo menos uma protease a uma taxa de cerca de 0,001-1.500 x 104 M-1S-1 ou pelo menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1.000, 1.250 ou 1.500 x 104 M-1S-1. Em algumas modalidades, a CM é clivada especificamente a uma taxa de cerca de 100.000 M-1S-1. Em algumas modalidades, a CM é clivada especificamente a uma taxa de cerca de 1x10E2 a cerca de 1x10E6 M- 1S-1 (isto é, de cerca de 1x102 a cerca de 1x106 M-1S-1).
[0251] Para clivagem específica por uma enzima, é feito contato entre a enzima e a CM. Quando o anticorpo ativável compreendendo um AB acoplado a uma MM e uma CM está na presença de alvo e atividade enzimática suficiente, a CM pode ser clivada. Atividade enzimática suficiente pode se referir à capacidade da enzima de fazer contato com a CM e efetuar a clivagem. Pode-se prever facilmente que uma enzima pode estar na vizinhança da CM, mas incapaz de clivar por causa de outros fatores celulares ou modificação de proteínas da enzima.
[0252] Os ligantes adequados para uso nas composições aqui descritas são geralmente aqueles que fornecem flexibilidade do AB modificado ou dos anticorpos ativáveis para facilitar a inibição da ligação do AB ao alvo. Esses ligantes são geralmente referidos como ligantes flexíveis. Os ligantes adequados podem ser facilmente selecionados e podem ter comprimentos diferentes, como 1 aminoácido (por exemplo, Gly) a 20 aminoácidos, 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, 3 aminoácidos a 12 aminoácidos ácidos, incluindo 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos ou 7 aminoácidos a 8 aminoácidos e podem ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos de comprimento.
[0253] Ligantes flexíveis exemplificadores incluem polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 24) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 25), em que n é um número inteiro de pelo menos um), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina e outros ligantes flexíveis conhecidos na técnica. Os polímeros de glicina e glicina-serina são relativamente não estruturados e, portanto, podem servir como uma ligação neutra entre os componentes. A glicina acessa significativamente mais espaço phi-psi do que mesmo a alanina e é muito menos restrita do que os resíduos com cadeias laterais mais longas (ver Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Exemplos de ligantes flexíveis incluem, entre outros, Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 26), Gly-Gly- Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 27), Gly-Ser-Gly-Ser- Gly (SEQ ID NO: 28), Gly-Ser-Gly- Gly-Gly (SEQ ID NO: 29), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 30), Gly-Ser-Ser-Ser -Gly (SEQ ID NO: 31) e similares. O versado na técnica reconhecerá que o design de um anticorpo ativável pode incluir ligantes que são total ou parcialmente flexíveis, de modo que o ligante pode incluir um ligante flexível, bem como uma ou mais porções que conferem estrutura menos flexível para fornecer os anticorpos ativáveis desejados estrutura.
[0254] A divulgação também fornece composições e métodos que incluem um anticorpo anti-CD71 ativável que inclui um anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB) que se liga especificamente a CD71, em que o AB é acoplado a uma porção de mascaramento (MM) que diminui a capacidade do AB de vincular seu alvo. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável anti-CD71 inclui ainda uma porção clivável (CM) que é um substrato para uma protease. As composições e métodos aqui fornecidos permitem a ligação de um ou mais agentes a um ou mais resíduos de cisteína no AB sem comprometer a atividade (por exemplo, a atividade de mascaramento, ativação ou ligação) do anticorpo anti-CD71 ativável. Em algumas modalidades, as composições e métodos aqui fornecidos permitem a ligação de um ou mais agentes a um ou mais resíduos de cisteína no AB sem reduzir ou perturbar de outra forma uma ou mais ligações dissulfeto na MM. As composições e métodos aqui fornecidos produzem um anticorpo ativável anti-CD71 que é conjugado com um ou mais agentes, por exemplo, qualquer um de uma variedade de agentes terapêuticos, de diagnóstico e/ou profiláticos, por exemplo, em algumas modalidades, sem nenhum agente conjugado (ou agentes conjugados) com a MM do anticorpo ativável anti-CD71. As composições e métodos aqui fornecidos produzem anticorpos anti-CD71 ativáveis conjugados nos quais a MM retém a capacidade de mascarar eficaz e eficientemente o AB do anticorpo ativável em um estado não clivado. As composições e métodos aqui fornecidos produzem anticorpos anti-CD71 ativáveis conjugados nos quais o anticorpo ativável ainda é ativado, isto é, clivado, na presença de uma protease que pode clivar a CM.
[0255] Os anticorpos anti-CD71 ativáveis têm pelo menos um ponto de conjugação para um agente, mas nos métodos e composições aqui fornecidos menos do que todos os pontos possíveis de conjugação estão disponíveis para conjugação com um agente. Em algumas modalidades, os um ou mais pontos de conjugação são átomos de enxofre envolvidos em ligações dissulfeto. Em algumas modalidades, o um ou mais pontos de conjugação são átomos de enxofre envolvidos em ligações dissulfeto intercadeia. Em algumas modalidades, o um ou mais pontos de conjugação são átomos de enxofre envolvidos em ligações sulfeto intercadeia, mas não átomos de enxofre envolvidos em ligações dissulfeto intracadeias. Em algumas modalidades, os um ou mais pontos de conjugação são átomos de enxofre da cisteína ou outros resíduos de aminoácidos contendo um átomo de enxofre. Tais resíduos podem ocorrer naturalmente na estrutura do anticorpo ou podem ser incorporados no anticorpo por mutagênese dirigida ao local, conversão química ou incorporação incorreta de aminoácidos não naturais.
[0256] Também são fornecidos métodos para preparar um conjugado de um anticorpo anti-CD71 ativável tendo uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia no AB e uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia na MM, e é fornecido um fármaco reativo com tióis livres. O método geralmente inclui parcialmente reduzir ligações dissulfeto intercadeia no anticorpo ativável com um agente redutor, como, por exemplo, TCEP; e conjugando a fármaco reativa com tióis livres ao anticorpo ativável parcialmente reduzido. Como aqui utilizado, o termo redução parcial refere-se a situações em que um anticorpo anti-CD71 ativável é contatado com um agente redutor e menos que todas as ligações dissulfeto, por exemplo, menos que todos os locais possíveis de conjugação são reduzidos. Em algumas modalidades, menos de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou menos de 5% de todos os locais possíveis de conjugação são reduzidos.
[0257] Ainda em outras modalidades, é fornecido um método de redução e conjugação de um agente, por exemplo, um fármaco, a um anticorpo anti-CD71 ativável, resultando em seletividade na colocação do agente. O método geralmente inclui reduzir parcialmente o anticorpo ativável anti-CD71 com um agente redutor, de modo que quaisquer locais de conjugação na porção de mascaramento ou outra porção não AB do anticorpo ativável não sejam reduzidos e conjugando o agente para interligar tióis no AB. O sítio (ou sítios) de conjugação são selecionados de modo a permitir a colocação desejada de um agente para permitir que a conjugação ocorra no local desejado. O agente redutor é, por exemplo, TCEP. As condições da reação de redução, como, por exemplo, a razão do agente redutor para o anticorpo ativável, a duração da incubação, a temperatura durante a incubação, o pH da solução da reação redutora, etc., são determinadas pela identificação das condições que produzem um anticorpo ativável conjugado no qual a MM retém a capacidade de mascarar eficaz e eficientemente o AB do anticorpo ativável em um estado não clivado. A razão de agente de redução para anticorpo anti-CD71 ativável variará dependendo do anticorpo ativável. Em algumas modalidades, a razão de agente redutor para anticorpo anti- CD71 ativável estará em um intervalo de cerca de 20: 1 a 1: 1, de cerca de 10: 1 a 1: 1, de cerca de 9: 1 a 1: 1, de cerca de 8: 1 a 1: 1, de cerca de 7: 1 a 1: 1, de cerca de 6: 1 a 1: 1, de cerca de 5: 1 a 1: 1, de cerca de 4: 1 a 1: 1, de cerca de 3: 1 a 1: 1, de cerca de 2: 1 a 1: 1, de cerca de 20: 1 a 1: 1,5, de cerca de 10: 1 a 1: 1,5, de cerca de 9: 1 a 1: 1,5, de cerca de 8: 1 a 1: 1,5, de cerca de 7: 1 a 1: 1,5, de cerca de 6: 1 a 1: 1,5, de cerca de 5: 1 a 1: 1,5, de cerca de 4: 1 a 1: 1,5, de cerca de 3: 1 a 1: 1,5, de cerca de 2: 1 a 1: 1,5, de cerca de 1,5: 1 a 1: 1,5 ou de cerca de 1: 1 a 1: 1,5. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 5:1 a 1:1. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 5:1 a 1,5:1. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 4:1 a 1:1. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 4:1 a 1,5:1. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 8:1 a cerca de 1:1. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 2,5:1 a 1:1.
[0258] Em algumas modalidades, um método de redução de ligações dissulfeto entre cadeias no AB de um anticorpo ativável anti-CD71 e conjugação de um agente, por exemplo, um agente contendo tiol, como um fármaco, aos tióis de cadeias resultantes para localizar seletivamente o agente (ou os agentes) no AB é fornecido. O método geralmente inclui reduzir parcialmente o AB com um agente redutor para formar pelo menos dois tióis intercadeias sem formar todos os tióis intercadeias possíveis no anticorpo ativável; e conjugando o agente aos tióis intercadeias do AB parcialmente reduzido. Por exemplo, o AB do anticorpo ativável é parcialmente reduzido por cerca de 1 hora a cerca de 37 °C a uma razão desejada de agente redutor: anticorpo ativável. Em algumas modalidades, a proporção de agente redutor para anticorpo ativável estará em um intervalo de cerca de 20: 1 a 1: 1, de cerca de 10: 1 a 1: 1, de cerca de 9: 1 a 1: 1, de cerca de 8: 1 a 1: 1, de cerca de 7: 1 a 1: 1, de cerca de 6: 1 a 1: 1, de cerca de 5: 1 a 1: 1, de cerca de 4: 1 a 1: 1, de cerca de 3: 1 a 1: 1, de cerca de 2: 1 a 1: 1, de cerca de 20: 1 a 1: 1,5, de cerca de 10: 1 a 1: 1,5, de cerca de 9: 1 a 1: 1,5, de cerca de 8: 1 a 1: 1,5, de cerca de 7: 1 a 1: 1,5, de cerca de 6: 1 a 1: 1,5, de cerca de 5: 1 a 1: 1,5, de cerca de 4: 1 a 1: 1,5, de cerca de 3: 1 a 1: 1,5, de cerca de 2: 1 a 1: 1,5, de cerca de 1,5: 1 a 1: 1,5 ou de cerca de 1: 1 a 1: 1,5. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 5:1 a 1:1. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 5:1 a 1,5:1. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 4:1 a 1:1. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 4:1 a 1,5:1. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 8:1 a cerca de 1:1. Em algumas modalidades, a razão está em um intervalo de cerca de 2,5:1 a 1:1.
[0259] O reagente contendo tiol pode ser, por exemplo, cisteína ou N-acetil cisteína. O agente redutor pode ser, por exemplo, TCEP. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável reduzido pode ser purificado antes da conjugação, utilizando, por exemplo, cromatografia em coluna, diálise ou diafiltração. Alternativamente, o anticorpo reduzido não é purificado após redução parcial e antes da conjugação.
[0260] A invenção também fornece anticorpos anti-CD71 ativáveis parcialmente reduzidos nos quais pelo menos uma ligação dissulfeto intercadeia no anticorpo ativável foi reduzida com um agente redutor sem perturbar nenhuma ligação dissulfeto intracadeia no anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável inclui um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno (AB) que se liga especificamente a CD71, uma porção de mascaramento (MM) que inibe a ligação do AB do anticorpo ativável em um estado não clivado ao alvo CD71 e uma porção clivável (CM) acoplada ao AB, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease. Em algumas modalidades, a MM é acoplada ao AB via CM. Em algumas modalidades, uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia do anticorpo ativável não é perturbada pelo agente redutor. Em algumas modalidades, uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia da MM dentro do anticorpo ativável não é perturbada pelo agente redutor. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável no estado não clivado tem a disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB ou AB-CM-MM. Em algumas modalidades, o agente redutor é TCEP.
[0261] Em ainda outras modalidades, um método de redução e conjugação de um agente, por exemplo, um fármaco, a um anticorpo anti-CD71 ativável, resultando em seletividade na colocação do agente, fornecendo um anticorpo anti-CD71 ativável com um número definido e posições de resíduos de lisina e/ou cisteína. Em algumas modalidades, o número definido de resíduos de lisina e/ou cisteína é maior ou menor que o número de resíduos correspondentes na sequência de aminoácidos do anticorpo parental ou anticorpo ativável. Em algumas modalidades, o número definido de resíduos de lisina e/ou cisteína pode resultar em um número definido de equivalentes de agente que podem ser conjugados ao anticorpo anti-CD71 ou anticorpo ativável anti-CD71. Em algumas modalidades, o número definido de resíduos de lisina e/ou cisteína pode resultar em um número definido de equivalentes de agente que podem ser conjugados com o anticorpo anti-CD71 ou anticorpo anti- CD71 ativável de uma maneira específica do local. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável modificado é modificado com um ou mais aminoácidos não naturais de uma maneira específica do local, assim, em algumas modalidades, limitando a conjugação dos agentes apenas aos locais dos aminoácidos não naturais. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD71 ou anticorpo ativável anti-CD71 com um número definido e posições de resíduos de lisina e/ou cisteína pode ser parcialmente reduzido com um agente redutor, conforme discutido aqui, de modo que quaisquer locais de conjugação na porção de mascaramento ou outro na porção não AB do anticorpo ativável não seja reduzida e conjugue o agente para interligar tióis no AB.
[0262] A divulgação também fornece anticorpos ativáveis parcialmente reduzidos nos quais pelo menos uma ligação dissulfeto intercadeia no anticorpo ativável foi reduzida com um agente redutor sem perturbar nenhuma ligação dissulfeto intracadeia no anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável inclui um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno (AB) que se liga especificamente ao alvo, por exemplo, CD71, uma porção de mascaramento (MM) que inibe a ligação da AB do anticorpo ativável em um estado não clivado ao alvo e uma porção clivável (CM) acoplada ao AB, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para pelo menos uma protease. Em algumas modalidades, a MM é acoplada ao AB via a CM. Em algumas modalidades, uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia do anticorpo ativável não é perturbada pelo agente redutor. Em algumas modalidades, uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia da MM dentro do anticorpo ativável não é perturbada pelo agente redutor. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável no estado não clivado tem a disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB ou AB-CM-MM. Em algumas modalidades, o agente redutor é TCEP.
[0263] Em algumas modalidades, os anticorpos ativáveis descritos neste documento também incluem um agente conjugado ao anticorpo ativável. Em algumas modalidades, o agente conjugado é um agente terapêutico, como um agente anti- inflamatório e/ou antineoplásico. Em tais modalidades, o agente é conjugado com uma porção de carboidrato do anticorpo ativável, por exemplo, em algumas modalidades, em que a porção de carboidratos está localizada fora da região de ligação ao antígeno do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no anticorpo ativável. Em algumas modalidades, o agente é conjugado com um grupo sulfidrila do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no anticorpo ativável.
[0264] Em algumas modalidades, o agente é um agente citotóxico, como uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos) ou um isótopo radioativo (isto é, um rádio conjugado).
[0265] Em algumas modalidades, o agente é uma porção detectável, como, por exemplo, um rótulo ou outro marcador. Em algumas modalidades, a porção detectável é um agente de diagnóstico. Por exemplo, o agente é ou inclui um aminoácido radiomarcado, uma ou mais porções biotinila que podem ser detectadas pela avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou calorimétricos), um ou mais radioisótopos ou radionuclídeos, um ou mais marcadores fluorescentes, um ou mais marcadores enzimáticos e/ou um ou mais agentes quimioluminescentes. Em algumas modalidades, porções detectáveis são ligadas por moléculas espaçadoras.
[0266] A divulgação também se refere a imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado a um agente citotóxico, como uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou seus fragmentos) ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado). Agentes citotóxicos adequados incluem, por exemplo, dolastatinas e seus derivados (por exemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, MMAD, DMAF, DMAE). Por exemplo, o agente é monometil auristatina E (MMAE) ou monometil auristatina D (MMAD). Em algumas modalidades, o agente é uma dolastatina. Em algumas modalidades, o agente é uma auristatina ou seu derivado. Em algumas modalidades, o agente é auristatina E ou um seu derivado. Em algumas modalidades, o agente é monometil auristatina E (MMAE). Em algumas modalidades, o agente é monometil auristatina D (MMAD). Em algumas modalidades, o agente é um derivado de maitansinoide ou maitansinoide.
[0267] Em algumas modalidades, o ligante e a toxina conjugada ao AB compreendem uma porção SPDB-DM4, uma porção vc-MMAD, uma porção vc- MMAE, vc-duocarmicina ou porção PEG2-vc-MMAD. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante clivável. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante não clivável. Em algumas modalidades, o agente é uma porção detectável.
[0268] Em algumas modalidades, o agente está ligado ao AB usando um ligante de maleimida caproil-valina-citrulina ou um ligante de maleimida PEG-valina- citrulina. Em algumas modalidades, o agente está ligado ao AB usando um ligante maleimida caproil-valina-citrulina. Em algumas modalidades, o agente é monometil auristatina E (MMAE) ligado ao AB usando um ligante de maleimida caproil-valina- citrulina, e esse construto de carga útil do ligante é aqui referida como “vc-MMAE”. Em algumas modalidades, o agente está ligado ao AB usando um ligante de maleimida PEG-valina-citrulina. Em algumas modalidades, o agente é a monometil auristatina D (MMAD) ligada ao AB usando um ligante de maleimida tetra-PEG-valina-citrulina- para-aminobenziloxicarbonila, e essa construção de carga útil do ligante é aqui referida como “PEG4-vc-MMAD”. Em algumas modalidades, o agente é a monometil auristatina E (MMAE) ligada ao AB usando um ligante de maleimida tetra-PEG-valina- citrulina-para-aminobenziloxicarbonila, e esse construto de carga útil do ligante é aqui referido como “PEG4-vc-MMAE”. Em algumas modalidades, o agente está ligado ao AB usando um ligante de PEG maleimida-valina-citrulina. Em algumas modalidades, o agente é monometil auristatina D (MMAD) ligada à AB usando uma maleimida bis- PEG-valina-citrulina-aminobenziloxicarbonila, e esse construto de carga útil do ligante é aqui referido como “PEG2-vc-MMAD”. As estruturas de PEG4-vc-MMAD, PEG4-vc- MMAE, PEG2-vc-MMAD e vc-MMAE são mostradas abaixo:
Figure img0006
[0269] A divulgação também fornece anticorpos ativáveis conjugados que incluem um anticorpo ativável ligado a vcMMAE, que é uma carga útil de monometil auristatina E (MMAE) com um ligante val-cit (vc), em que o anticorpo ativável inclui um anticorpo (AB) que se liga especificamente a um alvo, uma porção de mascaramento (MM) acoplada ao AB que inibe a ligação do AB ao alvo quando o anticorpo ativável conjugado em um estado não clivado e a porção clivável (CM) acoplada ao AB, e a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease. Em algumas modalidades, os anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação têm a estrutura da Fórmula (I) ou um sal da mesma:
Figure img0007
Fórmula (I)
[0270] em que AB é um anticorpo que se liga especificamente a um alvo e inclui uma região variável da cadeia pesada, uma cadeia pesada e/ou uma ou mais regiões CDR (CDRH) da cadeia pesada. O AB também inclui uma região variável da cadeia leve, uma cadeia leve e/ou uma ou mais regiões CDR (CDRL) da cadeia leve. O anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) também inclui uma porção de mascaramento (MM), em que a MM inibe a ligação do AB ao seu alvo quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado, uma primeira porção de ligação (LP1), uma porção clivável (CM), em que a CM e uma segunda porção de ligação (LP2). Em uma modalidade específica da Fórmula (I), “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I), em que o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou na cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[0271] Em algumas modalidades, os anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação têm a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo: Fórmula (II)
Figure img0008
[0272] em que AB é um anticorpo que se liga especificamente a um alvo e inclui uma região variável da cadeia pesada, uma cadeia pesada e/ou uma ou mais regiões CDR (CDRH) da cadeia pesada. O AB também inclui uma região variável da cadeia leve, uma cadeia leve e/ou uma ou mais regiões CDR (CDRL) da cadeia leve. O anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) também inclui uma porção de mascaramento (MM) em que a MM inibe a ligação do AB ao seu alvo quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado e uma porção clivável (CM) em que a CM. Em uma modalidade específica da Fórmula (II), “n” é 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II) em que o AB compreende um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (II) em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado de Fórmula (II), em que o glutamato N-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou modificado pós-traducionalmente para piroglutamato.
[0273] Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação das Fórmulas (I) ou (II), o alvo é o CD71 de mamífero. Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação das Fórmulas (I) ou (II), o alvo é CD71 humano.
[0274] Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação das Fórmulas (I) ou (II), AB inclui uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência de CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência de CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15, uma MM incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e uma CM incluindo a sequência da SEQ ID NO: 156 e “n” é 2. Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação da Fórmula (I), AB inclui uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11, e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15, uma MM incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, um LP1 incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207, uma CM incluindo a sequência de SEQ ID NO: 156 e um LP2 incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e “n” é 2.
[0275] Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação das Fórmulas (I) ou (II), AB inclui uma região variável da cadeia pesada incluindo uma sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve incluindo uma sequência da SEQ ID NO: 7, uma MM incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e uma CM incluindo a sequência da SEQ ID NO: 156 e “n” é 2. Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação da Fórmula (I), AB inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo uma sequência de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve incluindo uma sequência de SEQ ID NO: 7, uma MM incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, um LP1 incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207, uma CM incluindo a sequência de SEQ ID NO: 156 e um LP2 incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e “n” é 2.
[0276] Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação das Fórmulas (I) ou (II), AB inclui uma cadeia pesada que inclui uma sequência de SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve que inclui uma sequência de SEQ ID NO: 19, uma MM incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e uma CM incluindo a sequência da SEQ ID NO: 156 e “n” é 2. Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação da Fórmula (I), AB inclui uma cadeia pesada incluindo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve incluindo uma sequência da SEQ ID NO: 19, uma MM incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, uma LP1 incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207, uma CM incluindo a sequência de SEQ ID NO: 156 e um LP2 incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e “n” é 2.
[0277] Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação das Fórmulas (I) ou (II), AB inclui uma cadeia pesada que inclui uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve que inclui uma sequência da SEQ ID NO: 169 e “N” é 2. Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação da Fórmula (I), AB inclui uma cadeia pesada incluindo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve que inclui uma sequência da SEQ ID NO: 169 e “n” é 2) Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação das Fórmulas (I) ou (II), AB inclui uma cadeia pesada que inclui uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve que inclui uma sequência da SEQ ID NO: 201 e “N” é 2.
[0278] Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação das Fórmulas (I) ou (II), AB inclui uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 7 Em algumas modalidades de anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação das Fórmulas (I) ou (II), AB inclui uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 7
[0279] A divulgação também fornece anticorpos ativáveis conjugados que incluem um anticorpo ativável ligado à carga útil de monometil auristatina D (MMAD), em que o anticorpo ativável inclui um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno (AB) que se liga especificamente a um alvo, uma porção de mascaramento (MM) que inibe a ligação do AB do anticorpo ativável em um estado não clivado ao alvo e a porção clivável (CM) acoplada ao AB, e a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para pelo menos uma protease de MMP.
[0280] Em algumas modalidades, o anticorpo ativável conjugado com MMAD pode ser conjugado usando qualquer um dos vários métodos para anexar agentes aos ABs: (a) fixação às porções de carboidratos do AB, ou (b) fixação aos grupos sulfidrila do AB, ou (c) ligação a grupos amino do AB, ou (d) ligação a grupos carboxilato do AB.
[0281] Em algumas modalidades, a carga útil da MMAD é conjugada ao AB por meio de um ligante. Em algumas modalidades, a carga útil da MMAD é conjugada com uma cisteína no AB via um ligante. Em algumas modalidades, a carga útil da MMAD é conjugada com uma lisina no AB através de um ligante. Em algumas modalidades, a carga útil da MMAD é conjugada com outro resíduo do AB por meio de um ligante, como os resíduos divulgados neste documento. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante contendo tiol. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante clivável. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante não clivável. Em algumas modalidades, o ligante é selecionado do grupo que consiste nos ligantes mostrados nas Tabelas (II) e (III). Em algumas modalidades, o anticorpo ativável e a carga útil da MMAD são ligados por meio de um ligante maleimida caproil-valina- citrulina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável e a carga útil da MMAD são ligados por meio de um ligante maleimida PEG-valina-citrulina. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável e a carga útil da MMAD são ligados por meio de um ligante maleimida caproil-valina-citrulina-para-aminobenziloxicarbonila. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável e a carga útil da MMAD são ligados por meio de um ligante maleimida PEG-valina-citrulina-para-aminobenziloxicarbonila. Em algumas modalidades, a carga útil da MMAD é conjugada ao AB usando a tecnologia de redução e conjugação parcial aqui divulgada.
[0282] Em algumas modalidades, o componente de polietileno glicol (PEG) de um ligante da presente divulgação é formado a partir de 2 monômeros de etileno glicol, 3 monômeros de etileno glicol, 4 monômeros de etileno glicol, 5 monômeros de etileno glicol, 6 monômeros de etileno glicol, 7 monômeros de etileno glicol, 7 monômeros de etileno glicol, 8 monômeros de etileno glicol, 9 monômeros de etileno glicol ou pelo menos 10 monômeros de etileno glicol. Em algumas modalidades da presente divulgação, o componente PEG é um polímero ramificado. Em algumas modalidades da presente divulgação, o componente PEG é um polímero não ramificado. Em algumas modalidades, o componente de polímero PEG é funcionalizado com um grupo amino ou seu derivado, um grupo carboxila ou seu derivado, ou ambos, um grupo amino ou seu derivado e um grupo carboxila ou seu derivado.
[0283] Em algumas modalidades, o componente PEG de um ligante da presente divulgação é um grupo amino-tetra-etileno glicol-carboxila ou seu derivado. Em algumas modalidades, o componente PEG de um ligante da presente divulgação é um grupo amino-tri-etileno glicol-carboxila ou um seu derivado. Em algumas modalidades, o componente PEG de um ligante da presente divulgação é um grupo amino-di-etileno glicol-carboxila ou um seu derivado. Em algumas modalidades, um derivado amino é a formação de uma ligação amida entre o grupo amino e um grupo carboxila ao qual está conjugado. Em algumas modalidades, um derivado carboxila é a formação de uma ligação amida entre o grupo carboxila e um grupo amino ao qual está conjugado. Em algumas modalidades, um derivado carboxila é a formação de uma ligação éster entre o grupo carboxila e um grupo hidroxila ao qual está conjugado.
[0284] As toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem a cadeia da difteria A, fragmentos ativos não vinculativos da toxina da difteria, cadeia da exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia da ricina A, cadeia da abrina A, cadeia da modecina A, alfa-sarcino, proteínas de Aleurites fordii, proteínas dianthin, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrinocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Os exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 186Re.
[0285] Os conjugados do anticorpo e do agente citotóxico são feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, como N- succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato) HCL), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutareldeído), compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p- diazoniobenzoil))-etilenodiamina), di-isocianatos (como 2,6-diisocianato de toleno) e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science 238: 1.098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionucleotídeo no anticorpo. (Ver documento WO94/11026).
[0286] Aqueles versados na técnica reconhecerão que uma grande variedade de porções possíveis pode ser acoplada aos anticorpos resultantes da divulgação. (Ver, por exemplo, “Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse e R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989), cujo conteúdo inteiro é aqui incorporado por referência).
[0287] O acoplamento pode ser realizado por qualquer reação química que ligue as duas moléculas, desde que o anticorpo e a outra parte mantenham suas respectivas atividades. Essa ligação pode incluir muitos mecanismos químicos, por exemplo, ligação covalente, ligação por afinidade, intercalação, ligação por coordenadas e complexação. Em algumas modalidades, a ligação é, no entanto, ligação covalente. A ligação covalente pode ser alcançada por condensação direta das cadeias laterais existentes ou pela incorporação de moléculas de ponte externas. Muitos agentes de ligação bivalentes ou polivalentes são úteis no acoplamento de moléculas de proteína, como os anticorpos da presente divulgação, a outras moléculas. Por exemplo, agentes de acoplamento representativos podem incluir compostos orgânicos como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldeído, diazobenzenos e hexametileno diaminas. Esta lista não pretende ser exaustiva das várias classes de agentes de acoplamento conhecidas na técnica, mas é um exemplo dos agentes de acoplamento mais comuns. (Veja Killen e Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1.335 a 2.549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62: 185 a 216 (1982); e Vitetta et al., Science 238: 1.098 (1987).
[0288] Em algumas modalidades, além das composições e métodos aqui fornecidos, o anticorpo ativável conjugado também pode ser modificado para conjugação específica do local por meio de sequências de aminoácidos modificadas inseridas ou incluídas na sequência de anticorpos ativáveis. Estas sequências de aminoácidos modificadas são projetadas para permitir a colocação controlada e/ou dosagem do agente conjugado dentro de um anticorpo ativável conjugado. Por exemplo, o anticorpo ativável pode ser manipulado para incluir substituições de cisteína em posições nas cadeias leve e pesada que fornecem grupos tiol reativos e não afetam negativamente a dobragem e montagem de proteínas, nem alteram a ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável pode ser manipulado para incluir ou de outra forma introduzir um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais dentro do anticorpo ativável para fornecer locais adequados para conjugação. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável pode ser manipulado para incluir ou introduzir sequências peptídicas ativáveis enzimaticamente dentro da sequência de anticorpos ativáveis.
[0289] Os ligantes adequados são descritos na literatura. (Ver, por exemplo, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44: 201 a 208 (1984) que descreve a utilização de MBS (éster M-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida). Ver também, Patente US n° 5.030.719, descrevendo o uso de derivado de acetil-hidrazida halogenado acoplado a um anticorpo por meio de um ligante de oligopeptídeo. Em algumas modalidades, ligantes adequados incluem: (i) cloridrato de EDC (1-etil-3- (3-dimetilamino-propil) carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridil-ditio))- tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) hexanoato de SPDP (succinimidil-6 [3- (2-piridilditio) propionamido]) (Pierce Chem. Co., n° Cat 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamida] hexanoato (Pierce Chem. Co. n° Cat. 2165-G); e (v) sulfo-NHS (N-hidroxissulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., n° Cat. 24510) conjugado com EDC. Ligantes adicionais incluem, entre outros, SMCC ((succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato), sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato), SPDB (N - succinimidil-4-(2-piridilditio) butanoato) ou sulfo-SPDB (N-succinimidil-4-(2-piridilditio)- 2-sulfo butanoato).
[0290] Os ligantes descritos acima contêm componentes que possuem atributos diferentes, levando a conjugados com diferentes propriedades físico- químicas. Por exemplo, os ésteres sulfo-NHS dos carboxilatos de alquila são mais estáveis que os ésteres sulfo-NHS dos carboxilatos aromáticos. Os ligantes contendo NHS-éster são menos solúveis que os ésteres sulfo-NHS. Além disso, o ligante SMPT contém uma ligação dissulfeto estereoquimicamente impedida e pode formar conjugados com maior estabilidade. As ligações dissulfeto são, em geral, menos estáveis que outras ligações porque a ligação dissulfeto é clivada in vitro, resultando em menos conjugado disponível. O sulfo-NHS, em particular, pode melhorar a estabilidade dos acoplamentos de carbodimida. Os acoplamentos de carbodimida (como EDC), quando usados em conjunto com o sulfo-NHS, formam ésteres mais resistentes à hidrólise do que a reação de acoplamento de carbodimida sozinha.
[0291] Em algumas modalidades, os ligantes são cliváveis. Em algumas modalidades, os ligantes não são cliváveis. Em algumas modalidades, dois ou mais ligantes estão presentes. Os dois ou mais ligantes são todos iguais, isto é, cliváveis ou não cliváveis, ou os dois ou mais ligantes são diferentes, isto é, pelo menos um clivável e pelo menos um não clivável.
[0292] A presente divulgação utiliza vários métodos para anexar agentes aos ABs: (a) fixação às porções de carboidratos do AB, ou (b) fixação aos grupos sulfidrila do AB, ou (c) fixação aos grupos amino do AB, ou (d) ligação a grupos carboxilato do AB. De acordo com a divulgação, os ABs podem ser ligados covalentemente a um agente através de um ligante intermediário com pelo menos dois grupos reativos, um para reagir com AB e outro para reagir com o agente. O ligante, que pode incluir qualquer composto orgânico compatível, pode ser escolhido de modo que a reação com AB (ou agente) não afete adversamente a reatividade e seletividade de AB. Além disso, a ligação do ligante ao agente pode não destruir a atividade do agente. Os ligantes adequados para a reação com anticorpos oxidados ou fragmentos de anticorpos oxidados incluem aqueles que contêm uma amina selecionada do grupo que consiste nos grupos amina primária, amina secundária, hidrazina, hidrazida, hidrazida, hidroxilamina, fenil-hidrazina, semicarbazida e tiossemicarbazida. Tais grupos funcionais reativos podem existir como parte da estrutura do ligante, ou podem ser introduzidos por modificação química adequada de ligantes que não contêm tais grupos.
[0293] De acordo com a presente divulgação, ligantes adequados para ligação a ABs reduzidos incluem aqueles que possuem certos grupos reativos capazes de reagir com um grupo sulfidrila de um anticorpo ou fragmento reduzido. Esses grupos reativos incluem, mas não estão limitados a: grupos haloalquila reativos (incluindo, por exemplo, grupos haloacetila), grupos p-mercuribenzoato e grupos capazes de reações de adição do tipo Michael (incluindo, por exemplo, maleimidas e grupos do tipo descrito por Mitra e Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3.097 a 3.110).
[0294] De acordo com a presente divulgação, ligantes adequados para ligação a Abs não oxidados nem reduzidos incluem aqueles que possuem certos grupos funcionais capazes de reagir com os grupos amino primários presentes em resíduos de lisina não modificados no Ab. Tais grupos reativos incluem, mas não estão limitados a, ésteres carboxílicos ou carbônicos de NHS, ésteres carbônicos ou carbônicos de sulfo-NHS, ésteres carbônicos ou 4-nitrofenilcarboxílicos ou ésteres carbônicos ou pentafluorofenilcarboxílicos, acil imidazóis, isocianatos e isotiocianatos.
[0295] De acordo com a presente divulgação, ligantes adequados para ligação a Abs não oxidados nem reduzidos incluem aqueles que possuem certos grupos funcionais capazes de reagir com os grupos ácido carboxílico presentes em resíduos de aspartato ou glutamato no Ab, que foram ativados com reagentes adequados. Reagentes de ativação adequados incluem EDC, com ou sem NHS adicionado ou sulfo-NHS, e outros agentes desidratantes utilizados para a formação de carboxamida. Nesses casos, os grupos funcionais presentes nos ligantes adequados incluem aminas primárias e secundárias, hidrazinas, hidroxilaminas e hidrazidas.
[0296] O agente pode ser anexado ao ligante antes ou depois que o ligante é anexado ao AB. Em certas aplicações, pode ser desejável produzir primeiro um intermediário de ligante AB, no qual o ligante está livre de um agente associado. Dependendo da aplicação específica, um agente específico pode ser anexado covalentemente ao ligante. Em algumas modalidades, o AB é primeiro anexado à MM, CM e ligantes associados e depois anexado ao ligante para fins de conjugação.
[0297] Ligantes ramificados: Em modalidades específicas, são utilizados ligantes ramificados que têm vários locais para ligação de agentes. Para vários ligantes de sítios, um único anexo covalente a um AB resultaria em um intermediário de ligante AB capaz de ligar um agente em vários sítios. Os sítios podem ser grupos aldeído ou sulfidrila ou qualquer local químico ao qual os agentes possam ser ligados.
[0298] Em algumas modalidades, uma atividade específica mais alta (ou uma proporção mais alta de agentes para AB) pode ser alcançada pela ligação de um único ligante de sítio em uma pluralidade de sítios no AB. Essa pluralidade de sítios pode ser introduzida no AB por um dos dois métodos. Primeiro, pode-se gerar vários grupos aldeído e/ou grupos sulfidrila no mesmo AB. Segundo, pode-se conectar a um aldeído ou sulfidrila do AB um “ligante ramificado” tendo vários locais funcionais para ligação subsequente a ligantes. Os locais funcionais do ligante ramificado ou do ligante de múltiplos locais podem ser grupos aldeído ou sulfidrila ou podem ser qualquer local químico ao qual os ligantes possam ser conectados. Atividades específicas ainda mais altas podem ser obtidas combinando essas duas abordagens, ou seja, anexando vários ligantes de sítio em vários sítios no AB.
[0299] Ligantes cliváveis: ligantes peptídicos suscetíveis à clivagem por enzimas do sistema complemento, tais como, sem limitação, ativador de u- plasminogênio, ativador de plasminogênio tecidular, tripsina, plasmina ou outra enzima com atividade proteolítica podem ser usados em uma modalidade da presente divulgação. De acordo com um método da presente divulgação, um agente é ligado através de um ligante suscetível à clivagem por complemento. O anticorpo é selecionado de uma classe que pode ativar o complemento. O conjugado anticorpo- agente, portanto, ativa a cascata do complemento e libera o agente no local-alvo. De acordo com outro método da presente divulgação, um agente é ligado por meio de um ligante suscetível à clivagem por enzimas com uma atividade proteolítica, como um ativador de u-plasminogênio, um ativador de plasminogênio tecidual, plasmina ou tripsina.
[0300] Exemplos não limitativos de sequências ligantes cliváveis são fornecidos na Tabela (II). TABELA (II): SEQUÊNCIAS DE LIGAÇÃO EXEMPLIFICADORAS PARA CONJUGAÇÃO Tipos de sequências cliváveis Sequência de Aminoácidos Sequências cliváveis de Plasmina Pró-uroquinase
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[0301] Além disso, os agentes podem ser ligados via ligações dissulfeto (por exemplo, as ligações dissulfeto em uma molécula de cisteína) ao AB. Uma vez que muitos tumores liberam naturalmente altos níveis de glutationa (um agente redutor), isso pode reduzir as ligações dissulfeto com a liberação subsequente do agente no local da entrega. Em algumas modalidades, o agente redutor que modificaria uma CM também modificaria o ligante do anticorpo ativável conjugado.
[0302] Espaçadores e Elementos Cliváveis: Em algumas modalidades, pode ser necessário construir o ligante de maneira a otimizar o espaçamento entre o agente e o AB do anticorpo ativável. Isso pode ser realizado usando um ligante da estrutura geral: W - (CH2)n - Q em que W é --NH--CH2-- ou --CH2--; Q é um aminoácido, peptídeo; e n é um número inteiro de 0 a 20.
[0303] Em algumas modalidades, o ligante pode compreender um elemento espaçador e um elemento clivável. O elemento espaçador serve para posicionar o elemento clivável longe do núcleo do AB, de modo que o elemento clivável seja mais acessível à enzima responsável pela clivagem. Alguns dos ligantes ramificados descritos acima podem servir como elementos espaçadores.
[0304] Ao longo desta discussão, deve ser entendido que a ligação do ligante ao agente (ou do elemento espaçador ao elemento clivável ou do elemento clivável ao agente) não precisa ser um modo particular de ligação ou reação. Qualquer reação que proporcione um produto de estabilidade e compatibilidade biológica adequadas é aceitável.
[0305] Complemento sérico e seleção de ligantes: De acordo com um método da presente divulgação, quando se deseja a liberação de um agente, é utilizado um AB que é um anticorpo de uma classe que pode ativar o complemento. O conjugado resultante mantém a capacidade de se ligar ao antígeno e ativar a cascata do complemento. Assim, de acordo com esta modalidade da presente divulgação, um agente é unido a uma extremidade do ligante clivável ou elemento clivável e a outra extremidade do grupo ligante é conectada a um local específico no AB. Por exemplo, se o agente tiver um grupo hidróxi ou um grupo amino, ele pode ser ligado ao terminal carbóxi de um peptídeo, aminoácido ou outro ligante adequadamente escolhido por meio de uma ligação éster ou amida, respectivamente. Por exemplo, esses agentes podem ser ligados ao peptídeo ligante através de uma reação de carbodimida. Se o agente contiver grupos funcionais que interfeririam na ligação ao ligante, esses grupos funcionais interferentes poderão ser bloqueados antes da ligação e desbloqueados quando o conjugado ou intermediário do produto for produzido. O terminal oposto ou amino do ligante é então usado diretamente ou após modificação adicional para ligação a um AB que é capaz de ativar o complemento.
[0306] Os ligantes (ou elementos espaçadores dos ligantes) podem ter qualquer comprimento desejado, cuja extremidade pode ser covalentemente ligada a locais específicos no AB do anticorpo ativável. A outra extremidade do elemento ligante ou espaçador pode ser ligada a um aminoácido ou ligante peptídico.
[0307] Assim, quando estes conjugados se ligam ao antígeno na presença de complemento, a ligação amida ou éster que liga o agente ao ligante será clivada, resultando na liberação do agente em sua forma ativa. Esses conjugados, quando administrados a um indivíduo, realizarão a entrega e liberação do agente no local-alvo e são particularmente eficazes para a entrega in vivo de agentes farmacêuticos, antibióticos, antimetabólitos, agentes antiproliferativos e similares.
[0308] Ligantes para liberação sem ativação do complemento: Em ainda outra aplicação de entrega direcionada, a liberação do agente sem ativação do complemento é desejada, pois a ativação da cascata do complemento acabará por lisar a célula-alvo. Portanto, essa abordagem é útil quando a entrega e a liberação do agente devem ser realizadas sem matar a célula-alvo. Esse é o objetivo quando se deseja a entrega de mediadores celulares, como hormônios, enzimas, corticosteroides, neurotransmissores, genes ou enzimas nas células-alvo. Estes conjugados podem ser preparados anexando o agente a um AB que não é capaz de ativar o complemento através de um ligante que é levemente suscetível à clivagem por proteases séricas. Quando este conjugado é administrado a um indivíduo, os complexos antígeno-anticorpo se formarão rapidamente, enquanto a clivagem do agente ocorrerá lentamente, resultando assim na liberação do composto no local-alvo.
[0309] Reticuladores bioquímicos: Em algumas modalidades, o anticorpo ativável pode ser conjugado com um ou mais agentes terapêuticos usando certos reticuladores bioquímicos. Os reagentes de reticulação formam pontes moleculares que unem grupos funcionais de duas moléculas diferentes. Para ligar duas proteínas diferentes de uma maneira passo a passo, podem ser utilizados reticuladores heterobifuncionais que eliminam a formação de homopolímeros indesejados.
[0310] Os ligantes peptidílicos cliváveis por proteases lisossômicas também são úteis, por exemplo, Val-Cit, Val-Ala ou outros dipeptídeos. Além disso, podem ser utilizados ligantes lábeis a ácidos cliváveis no ambiente de baixo pH do lisossomo, por exemplo: éter bis-sialílico. Outros ligantes adequados incluem substratos lábeis a catepsina, particularmente aqueles que mostram função ideal a um pH ácido.
[0311] Exemplos de reticuladores heterobifuncionais exemplificadores são referenciados na Tabela (III). TABELA (III): RETICULADORES HETEROBIFUNCIONAIS EXEMPLIFICADORES RETICULADORES HETEROBIFUNCIONAIS
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[0312] Ligantes não cliváveis ou anexo direto: Em algumas modalidades da divulgação, o conjugado pode ser projetado para que o agente seja entregue ao alvo, mas não liberado. Isso pode ser conseguido anexando um agente a um AB diretamente ou por meio de um ligante não clivável.
[0313] Esses ligantes não cliváveis podem incluir aminoácidos, peptídeos, D- aminoácidos ou outros compostos orgânicos que podem ser modificados para incluir grupos funcionais que podem subsequentemente ser utilizados em ligação a ABs pelos métodos aqui descritos. Uma fórmula geral para um ligante orgânico pode ser W - (CH2)n - Q em que W é --NH--CH2-- ou --CH2--; Q é um aminoácido, peptídeo; e n é um número inteiro de 0 a 20.
[0314] Conjugados não cliváveis: Em algumas modalidades, um composto pode ser ligado a ABs que não ativam o complemento. Ao usar ABs que são incapazes de ativação do complemento, essa conexão pode ser realizada usando ligantes suscetíveis à clivagem pelo complemento ativado ou usando ligantes que não são suscetíveis à clivagem pelo complemento ativado.
DEFINIÇÕES
[0315] A menos que definido de outra forma, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente divulgação devem ter os significados que são comumente entendidos pelos versados na técnica. O termo “uma” entidade ou “uma” entidade refere-se a uma ou mais dessas entidades. Por exemplo, um composto refere-se a um ou mais compostos. Como tal, os termos “um”, “uma”, “um ou mais” e “pelo menos um” podem ser usados de forma intercambiável. Além disso, a menos que de outra forma exigido pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão com as técnicas de cultura de células e tecidos, biologia molecular e química e hibridação de proteínas e oligo ou polinucleotídeos aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Técnicas padrão são usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, eletroporação, lipofecção). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente realizado na técnica ou como aqui descrito. As técnicas e procedimentos anteriores são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo. Veja, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). As nomenclaturas utilizadas em conexão com e os procedimentos e técnicas laboratoriais de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Técnicas padrão são usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e entrega e tratamento de pacientes.
[0316] Conforme utilizado de acordo com a presente divulgação, os seguintes termos, salvo indicação em contrário, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:
[0317] Como usado aqui, o termo “anticorpo” refere-se a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina (Ig), isto é, moléculas que contêm um local de ligação ao antígeno que se liga especificamente (imunorreage com) um antígeno. Por “ligação específica” ou “imunorreage com” ou “ligação imunoespecífica” significa que o anticorpo reage com um ou mais determinantes antigênicos do antígeno desejado e não reage com outros polipeptídeos ou se liga com afinidade muito menor (Kd > 10- 6).
[0318] Sabe-se que a unidade estrutural básica do anticorpo compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia “leve” (cerca de 25 kDa) e uma cadeia “pesada” (cerca de 50-70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante responsável principalmente pela função efetora. Em geral, as moléculas de anticorpo obtidas em humanos se relacionam com qualquer uma das classes IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que diferem uma da outra pela natureza da cadeia pesada presente na molécula. Certas classes também têm subclasses, como IgG1, IgG2 e outras. Além disso, em humanos, a cadeia leve pode ser uma cadeia capa ou uma cadeia lambda.
[0319] O termo “anticorpo monoclonal” (mAb) ou “composição de anticorpo monoclonal”, conforme usado aqui, refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que contêm apenas uma espécie molecular de molécula de anticorpo que consiste em um produto genético de cadeia leve exclusivo e um produto genético de cadeia pesada exclusivo. Em particular, as regiões determinantes da complementaridade (CDRs) do anticorpo monoclonal são idênticas em todas as moléculas da população. Os MAbs contêm um local de ligação ao antígeno capaz de imunorreagir com um epítopo particular do antígeno caracterizado por uma afinidade de ligação única para ele.
[0320] O termo “local de ligação ao antígeno” ou “porção de ligação” refere-se à parte da molécula de imunoglobulina que participa da ligação ao antígeno. O local de ligação ao antígeno é formado por resíduos de aminoácidos das regiões variáveis do terminal N (“V”) das cadeias pesada (“H”) e leve (“L”). Três trechos altamente divergentes nas regiões V das cadeias pesada e leve, denominadas “regiões hipervariáveis”, são interpostos entre trechos de flanqueamento mais conservados, conhecidos como “regiões estruturais” ou “FRs”. Assim, o termo “FR” refere-se a sequências de aminoácidos que são naturalmente encontradas entre e adjacentes a regiões hipervariáveis nas imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada são dispostas uma em relação à outra no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação ao antígeno. A superfície de ligação ao antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado, e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesada e leve são denominadas “regiões determinantes da complementaridade” ou “CDRs”. A atribuição de aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Sequências Kabat de proteínas de interesse imunológico (Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901 a 917 (1987), Chothia et al. Nature 342: 878 a 883 (1989).
[0321] Como usado aqui, o termo “epítopo” inclui qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a uma imunoglobulina, um scFv ou um receptor de célula T. O termo “epítopo” inclui qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de células T. Os determinantes epitópicos geralmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente possuem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Por exemplo, os anticorpos podem ser criados contra peptídeos N- terminais ou C-terminais de um polipeptídeo. Diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antígeno quando a constante de dissociação é < 1 μM; em algumas modalidades, < 100 nM e em algumas modalidades, < 10 nM.
[0322] Como usado aqui, os termos “ligação específica”, “ligação imunológica” e “propriedades de ligação imunológica” referem-se às interações não covalentes do tipo que ocorrem entre uma molécula de imunoglobulina e um antígeno para o qual a imunoglobulina é específica. A força, ou afinidade de interações de ligação imunológica pode ser expressa em termos da constante de dissociação (Kd) de interação, em que um Kd menor representa uma maior afinidade. As propriedades de ligação imunológica dos polipeptídeos selecionados podem ser quantificadas usando métodos bem conhecidos na técnica. Um desses métodos envolve medir as taxas de formação e dissociação do local de ligação ao antígeno/complexo antígeno, em que essas taxas dependem das concentrações dos parceiros complexos, da afinidade da interação e dos parâmetros geométricos que influenciam igualmente a taxa nas duas direções. Assim, tanto a “constante da taxa on” (Kon) quanto a “constante da taxa off” (Koff) podem ser determinadas pelo cálculo das concentrações e das taxas reais de associação e dissociação. (Consultar Nature 361: 186 a 187 (1993)). A razão de Koff/Kon permite o cancelamento de todos os parâmetros não relacionados à afinidade e é igual à constante de dissociação Kd. (Ver, geralmente, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59: 439 a 473). Um anticorpo da presente divulgação é dito que se ligam especificamente ao alvo, quando a constante de ligação (Kd) é <1 μM, em algumas modalidades <100 nM, em algumas modalidades <100 nM, e em algumas modalidades <~ 100 pM a cerca de 1 pM, conforme medido por ensaios, tais como ensaios de ligação a radioligante ou ensaios semelhantes, conhecidos dos versados na técnica.
[0323] O termo “polinucleotídeo isolado”, conforme usado aqui, significará um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação dos mesmos que, em virtude de sua origem, o “polinucleotídeo isolado” (1) não está associado a todo ou parte de um polinucleotídeo no qual o “polinucleotídeo isolado” é encontrado na natureza, (2) está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. Os polinucleotídeos de acordo com a divulgação incluem as moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de imunoglobulina da cadeia pesada mostradas aqui, e as moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de imunoglobulina da cadeia leve mostradas aqui.
[0324] O termo “proteína isolada” aqui referido significa uma proteína de cDNA, RNA recombinante ou origem sintética ou alguma combinação dos mesmos que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação, a “proteína isolada” (1) não está associada a proteínas encontradas na natureza, (2) está livre de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, livre de proteínas murinas, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza.
[0325] O termo “polipeptídeo” é usado aqui como um termo genérico para se referir a proteínas, fragmentos ou análogos nativos de uma sequência polipeptídica. Portanto, fragmentos de proteínas nativas e análogos são espécies do gênero polipeptídico. Os polipeptídeos de acordo com a divulgação compreendem as moléculas de imunoglobulina da cadeia pesada mostradas aqui, e as moléculas de imunoglobulina da cadeia leve mostradas aqui, bem como as moléculas de anticorpo formadas por combinações compreendendo as moléculas de imunoglobulina da cadeia pesada com moléculas de imunoglobulina da cadeia leve, como a imunoglobulina da cadeia leve capa moléculas e vice-versa, bem como seus fragmentos e análogos.
[0326] O termo “ocorrência natural”, conforme usado aqui, aplicado a um objeto, refere-se ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência polipeptídica ou polinucleotídica que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte natural e que não foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório ou ocorre naturalmente.
[0327] O termo “operacionalmente ligado”, conforme aqui utilizado, refere-se às posições dos componentes descritos, em um relacionamento que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Uma sequência de controle “operacionalmente ligada” a uma sequência de codificação é ligada de tal maneira que a expressão da sequência de codificação é alcançada em condições compatíveis com as sequências de controle.
[0328] O termo “sequência de controle”, conforme aqui utilizado, refere-se a sequências polinucleotídicas necessárias para efetuar a expressão e o processamento de sequências de codificação às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro nos procariotos, tais sequências de controle geralmente incluem promotor, local de ligação ribossômica e sequência de terminação da transcrição nos eucariotos, geralmente, essas sequências de controle incluem promotores e sequência de terminação da transcrição. O termo “sequências de controle” pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para expressão e processamento e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líderes e sequências de parceiros de fusão. O termo “polinucleotídeo”, como aqui referido, significa nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas de DNA de fita simples e dupla.
[0329] O termo oligonucleotídeo aqui referido inclui nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados entre si por ligações de oligonucleotídeo de ocorrência natural e não natural. Os oligonucleotídeos são um subconjunto de polinucleotídeos que geralmente compreende um comprimento de 200 bases ou menos. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos têm 10 a 60 bases de comprimento e, em algumas modalidades, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleotídeos são geralmente de cadeia simples, por exemplo, para sondas, embora os oligonucleotídeos possam ser de cadeia dupla, por exemplo, para uso na construção de um mutante genético. Os oligonucleotídeos da divulgação são oligonucleotídeos senso ou antissenso.
[0330] O termo “nucleotídeos de ocorrência natural” referido aqui inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo “nucleotídeos modificados” referido aqui inclui nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e similares. O termo “ligações oligonucleotídicas” referido aqui inclui ligações oligonucleotídicas, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselerloato, fosforodiselenoato, fosforananotioato, fosforaniladato, fosforonmidato e similares. Consultar, por exemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9.081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6.077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3.209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, páginas 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (1991)); Stec et al. Patente n° U.S. 5.151.510; Uhlmann e Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990). Um oligonucleotídeo pode incluir um marcador para detecção, se desejado.
[0331] Como aqui utilizado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem o uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2a Edição, E.S. Golub e D.R. Green, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Os estereoisômeros (por exemplo, aminoácidos D) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais como aminoácidos α-, a-dissubstituídos, aminoácidos N- alquila, ácido lático e outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para polipeptídeos da presente divulgação. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4 hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, ε-N, N, N-trimetilisina, ε-N-acetilisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3- metil-histidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação polipeptídica aqui utilizada, a direção à esquerda é a direção do terminal amino e a direção à direita é a direção do terminal carbóxi, de acordo com o uso e a convenção padrão.
[0332] Do mesmo modo, salvo indicação em contrário, a extremidade esquerda das sequências polinucleotídicas de fita simples é a extremidade 5'; a direção esquerda das sequências polinucleotídicas de fita dupla é referida como a direção 5'. A direção da adição de 5' a 3' dos transcritos de RNA nascentes é referida como as regiões da sequência da direção da transcrição na fita de DNA que tem a mesma sequência que o RNA e que são de extremidade 5' a 5' do transcrito de RNA como “sequências a montante”, as regiões de sequência na cadeia de DNA com a mesma sequência que o RNA e que estão na extremidade 3' a 3' da transcrição do RNA são denominadas “sequências a jusante”.
[0333] Conforme aplicado aos polipeptídeos, o termo “identidade substancial” significa que duas sequências de peptídeos, quando perfeitamente alinhadas, como nos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de gap padrão, compartilham pelo menos 80% de identidade de sequência, em algumas modalidades, pelo menos 90% identidade de sequência, em algumas modalidades, pelo menos 95% de identidade de sequência e, em algumas modalidades, pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0334] Em algumas modalidades, as posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservadoras.
[0335] Como discutido aqui, pequenas variações nas sequências de aminoácidos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina são contempladas como abrangidas pela presente divulgação, desde que as variações na sequência de aminoácidos mantenham pelo menos 75%, em algumas modalidades, pelo menos 80%, 90%, 95% e, em algumas modalidades, 99%. Em particular, são contempladas substituições conservadoras de aminoácidos. Substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos relacionados em suas cadeias laterais. Os aminoácidos codificados geneticamente são geralmente divididos em famílias: (1) aminoácidos ácidos são aspartato, glutamato; (2) aminoácidos básicos são lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos não polares são alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano e (4) aminoácidos polares não carregados são glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Os aminoácidos hidrofílicos incluem arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina e treonina. Os aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina. Outras famílias de aminoácidos incluem (i) serina e treonina, que são a família alifática-hidróxi; (ii) asparagina e glutamina, que são a família contendo amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que são a família alifática; e (iv) fenilalanina, triptofano e tirosina, que são a família aromática. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina ou uma substituição semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado não tenha um efeito importante na ligação ou nas propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido dentro de um local da estrutura. Se uma mudança de aminoácido resulta em um peptídeo funcional pode ser prontamente determinado através do teste da atividade específica do derivado polipeptídico. Os ensaios são descritos em detalhes aqui. Fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser prontamente preparados por aqueles versados na técnica. Os terminais amino e carbóxi adequados de fragmentos ou análogos ocorrem perto dos limites dos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados de sequência de nucleotídeos e/ou aminoácidos com bancos de dados de sequência públicos ou proprietários. Em algumas modalidades, métodos de comparação computadorizados são usados para identificar motivos de sequência ou domínios de conformação de proteínas previstos que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou função conhecidas. São conhecidos métodos para identificar sequências de proteínas que se dobram em uma estrutura tridimensional conhecida. Bowie et al. Science 253: 164 (1991). Assim, os exemplos anteriores demonstram que aqueles versados na técnica podem reconhecer motivos de sequência e conformações estruturais que podem ser usados para definir domínios estruturais e funcionais de acordo com a divulgação.
[0336] Substituições de aminoácidos adequadas são aquelas que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexos proteicos, (4) alteram as afinidades de ligação e (5) conferem ou modificam outras propriedades físico- químicas ou funcionais desses análogos. Os análogos podem incluir várias muteínas de uma sequência diferente da sequência peptídica de ocorrência natural. Por exemplo, substituições únicas ou múltiplas de aminoácidos (por exemplo, substituições conservadoras de aminoácidos) podem ser feitas na sequência que ocorre naturalmente (por exemplo, na porção do polipeptídeo fora do domínio (ou domínios) formando contatos intermoleculares. Uma substituição conservadora de aminoácidos não deve alterar substancialmente as características estruturais da sequência parental (por exemplo, um aminoácido substituto não deve tender a quebrar uma hélice que ocorre na sequência parental ou interromper outros tipos de estrutura secundária que caracterizam a sequência parental). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeos reconhecidos na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., WH Freeman and Company, Nova York (1984)); Introdução à estrutura proteica (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova York, NY (1991)); e Thornton et al. Nature 354: 105 (1991).
[0337] O termo “fragmento de polipeptídeo”, conforme usado aqui, refere-se a um polipeptídeo que possui uma exclusão de terminal amino e/ou terminal carbóxi e/ou uma ou mais deleções internas, mas quando a sequência de aminoácidos restante é idêntica às posições correspondentes na sequência de ocorrência natural deduzida, por exemplo, de uma sequência de cDNA completa. Os fragmentos tipicamente têm pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, em algumas modalidades, pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, em algumas modalidades, pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, geralmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento e em algumas modalidades, pelo menos 70 aminoácidos. O termo “análogo”, conforme usado neste documento, refere-se a polipeptídeos que são constituídos por um segmento de pelo menos 25 aminoácidos que possui identidade substancial com uma porção de uma sequência deduzida de aminoácidos e que possui ligação específica ao alvo, sob condições de ligação adequadas. Tipicamente, os análogos polipeptídicos compreendem uma substituição conservadora de aminoácidos (ou adição ou deleção) em relação à sequência que ocorre naturalmente. Os análogos tipicamente têm pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, em algumas modalidades, pelo menos 50 aminoácidos de comprimento ou mais e podem frequentemente ser tão longos quanto um polipeptídeo de ocorrência natural de comprimento total.
[0338] O termo “agente” é usado aqui para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extrato feito de materiais biológicos.
[0339] Conforme usado neste documento, os termos “marcador” ou “marcado” se referem à incorporação de um marcador detectável, por exemplo, pela incorporação de um aminoácido radiomarcado ou ligação a um polipeptídeo de porções biotinila que podem ser detectadas pela avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou calorimétricos). Em certas situações, o rótulo ou marcador também pode ser terapêutico. Vários métodos de marcação de polipeptídeos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser utilizados. Exemplos de marcas para polipeptídios incluem, mas não estão limitados a, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanídeos), marcadores enzimáticas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, p-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, biotinila, epítopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, zíper de leucina) sequências de pares, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, marcadores de epítopo). Em algumas modalidades, as marcadores são fixadas por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o potencial impedimento estérico. O termo “agente farmacêutico ou medicamento”, conforme aqui utilizado, refere-se a um composto ou composição química capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando administrado adequadamente a um paciente.
[0340] Outros termos químicos aqui utilizados são utilizados de acordo com o uso convencional na arte, como exemplificado pelo Dicionário de Termos Químicos de McGraw-Hill (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
[0341] Como usado aqui, “substancialmente puro” significa que uma espécie de objeto é a espécie predominante presente (ou seja, em uma base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição) e, em algumas modalidades, uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie objeto compreende pelo menos cerca de 50% (em base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes.
[0342] Geralmente, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 80% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, em algumas modalidades, mais de cerca de 85%, 90%, 95% e 99%. Em algumas modalidades, a espécie de objeto é purificada para homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular.
[0343] O termo paciente inclui indivíduos humanos e veterinários.
[0344] Os anticorpos e/ou anticorpos ativáveis da divulgação se ligam especificamente a um determinado alvo, por exemplo, uma proteína-alvo humana, como CD71 humano. Também incluídos na divulgação estão anticorpos e/ou anticorpos ativáveis que se ligam ao mesmo epítopo que os anticorpos e/ou anticorpos ativáveis descritos neste documento. Também estão incluídos na divulgação os anticorpos e/ou anticorpos ativáveis por anticorpos que competem com um anticorpo anti-CD71 e/ou um anticorpo ativável por anti-CD71 aqui descritos para ligação a CD71, por exemplo, CD71 humano. Também estão incluídos na divulgação os anticorpos e/ou anticorpos ativáveis por anticorpos que competem com um anticorpo anti-CD71 e/ou um anticorpo ativável por anti-CD71 aqui descritos para ligação a CD71, por exemplo, CD71 humano.
[0345] Os versados na técnica reconhecerão que é possível determinar, sem experimentação indevida, se um anticorpo monoclonal (por exemplo, um anticorpo monoclonal de murino ou humanizado) tem a mesma especificidade que um anticorpo monoclonal usado nos métodos aqui descritos, verificando se o primeiro impede que o último se ligue ao alvo. Se o anticorpo monoclonal que está sendo testado competir com o anticorpo monoclonal da divulgação, como mostrado por uma diminuição na ligação pelo anticorpo monoclonal da divulgação, os dois anticorpos monoclonais se ligam ao mesmo, ou a um epítopo estreitamente relacionado. Um método alternativo para determinar se um anticorpo monoclonal tem a especificidade de um anticorpo monoclonal da divulgação é pré-incubar o anticorpo monoclonal da divulgação com o alvo e depois adicionar o anticorpo monoclonal que está sendo testado para determinar se o anticorpo monoclonal que está sendo testado é inibido em sua capacidade de ligar o alvo. Se o anticorpo monoclonal em teste for inibido, com toda a probabilidade, ele tem a mesma especificidade epitópica, ou funcionalmente equivalente, que o anticorpo monoclonal da divulgação.
USO DE ANTICORPOS ATIVÁVEIS CONJUGADOS
[0346] Será apreciado que a administração de entidades terapêuticas de acordo com a divulgação será administrada com veículos, excipientes e outros agentes farmaceuticamente aceitáveis adequados, que são incorporados nas formulações para proporcionar transferência, liberação, tolerância e similares aprimorados.
[0347] As formulações terapêuticas da divulgação, que incluem a título de exemplo não limitativo, um anticorpo ativável conjugado, são usadas para prevenir, tratar ou melhorar de outra forma uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou atividade aberrante do alvo. Por exemplo, formulações terapêuticas da divulgação, que incluem um anticorpo ativável conjugado, são usadas para tratar ou de outro modo melhorar um câncer ou outra condição neoplásica, inflamação, um distúrbio inflamatório e/ou uma doença autoimune. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido ou uma malignidade hematológica em que o alvo é expresso. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido onde o alvo é expresso. Em algumas modalidades, o câncer é uma neoplasia hematológica em que o alvo é expresso. Em algumas modalidades, o alvo é expresso no parênquima (por exemplo, no câncer, a porção de um órgão ou tecido que frequentemente desempenha função (ou funções) do órgão ou tecido). Em algumas modalidades, o alvo é expresso em uma célula, tecido ou órgão. Em algumas modalidades, o alvo é expresso no estroma (isto é, a estrutura de suporte conectiva de uma célula, tecido ou órgão). Em algumas modalidades, o alvo é expresso em um osteoblasto. Em algumas modalidades, o alvo é expresso no endotélio (vasculatura). Em algumas modalidades, o alvo é expresso em uma célula-tronco de câncer. Em algumas modalidades, o agente ao qual o anticorpo e/ou o anticorpo ativável está conjugado é um inibidor de microtúbulos. Em algumas modalidades, o agente ao qual o anticorpo e/ou o anticorpo ativável está conjugado é um agente prejudicial ao ácido nucleico.
[0348] A eficácia da prevenção, melhoria ou tratamento é determinada em associação com qualquer método conhecido para diagnosticar ou tratar a doença ou distúrbio associado à expressão e/ou atividade alvo, como, por exemplo, expressão e/ou atividade aberrante do alvo. Prolongar a sobrevivência de um indivíduo ou atrasar a progressão da doença ou distúrbio associado à expressão e/ou atividade alvo, por exemplo, expressão e/ou atividade alvo aberrante, em um indivíduo indica que o anticorpo, anticorpo conjugado, anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado confere um benefício clínico.
[0349] Um anticorpo, um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo ativável conjugado podem ser administrados na forma de composições farmacêuticas. Em algumas modalidades em que os fragmentos de anticorpo são usados, o menor fragmento que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína-alvo é selecionado. Por exemplo, com base nas sequências de região variável de um anticorpo, podem ser projetadas moléculas peptídicas que retêm a capacidade de se ligar à sequência proteica-alvo. Tais peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por tecnologia de DNA recombinante. (Consultar, por exemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 7.889 a 7.893 (1993)).
[0350] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.
[0351] Em algumas modalidades, o anticorpo, o anticorpo conjugado, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo ativável conjugado contém um marcador detectável. Um anticorpo intacto, ou um fragmento do mesmo (por exemplo, Fab, scFv ou F(ab)2) é usado. O termo “marcado”, em relação à sonda ou anticorpo, destina-se a abranger a marcação direta da sonda ou anticorpo por acoplamento (isto é, ligação física) de uma substância detectável à sonda ou anticorpo, bem como a marcação indireta da sonda ou anticorpo por reatividade com outro reagente diretamente marcado. Exemplos de marcação indireta incluem a detecção de um anticorpo primário usando um anticorpo secundário marcado com fluorescência e a marcação final de uma sonda de DNA com biotina, de modo que possa ser detectada com estreptavidina marcada com fluorescência. O termo “amostra biológica” pretende incluir tecidos, células e fluidos biológicos isolados de um indivíduo, bem como tecidos, células e fluidos presentes dentro de um indivíduo. Incluído no uso do termo “amostra biológica”, portanto, está o sangue e uma fração ou componente de sangue, incluindo soro, plasma sanguíneo ou linfa. Ou seja, o método de detecção da divulgação pode ser usado para detectar um mRNA, proteína ou DNA genômico do analito em uma amostra biológica in vitro, bem como in vivo. Por exemplo, técnicas in vitro para detecção de um mRNA de analito incluem hibridizações Northern e hibridizações in situ. As técnicas in vitro para detecção de uma proteína de analito incluem ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), Western blots, imunoprecipitações, coloração imunoquímica e imunofluorescência. As técnicas in vitro para detecção de um DNA genômico de analito incluem hibridizações de Southern. Os procedimentos para a realização de imunoensaios são descritos, por exemplo, em “ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, vol. 42, JR Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis e T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; e “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdã, 1985. Além disso, as técnicas in vivo para a detecção de uma proteína analítica incluem a introdução no indivíduo de um anticorpo de proteína antianalito marcado. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um marcador radioativo cuja presença e localização em um indivíduo podem ser detectadas por técnicas de imagem padrão.
[0352] Os anticorpos, anticorpos conjugados, anticorpos ativáveis e/ou anticorpos ativáveis conjugados da divulgação também são úteis em uma variedade de formulações de diagnóstico e profiláticas. Em uma modalidade, um anticorpo ativável conjugado é administrado a pacientes que correm o risco de desenvolver um ou mais dos distúrbios mencionados acima. A predisposição de um paciente ou órgão a um ou mais dos distúrbios mencionados acima pode ser determinada usando marcadores genotípicos, sorológicos ou bioquímicos.
[0353] Em algumas modalidades da divulgação, um anticorpo ativável conjugado é administrado a indivíduos humanos diagnosticados com uma indicação clínica associada a um ou mais dos distúrbios mencionados acima. Após o diagnóstico, um anticorpo ativável conjugado é administrado para mitigar ou reverter os efeitos da indicação clínica.
[0354] Um anticorpo, um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo ativável conjugado da divulgação também são úteis na detecção de um alvo em amostras de pacientes e, consequentemente, são úteis como diagnóstico. Por exemplo, os anticorpos e/ou anticorpos ativáveis e suas versões conjugadas da divulgação são usados em ensaios in vitro, por exemplo, ELISA, para detectar níveis de alvo em uma amostra de paciente.
[0355] Em uma modalidade, um anticorpo, um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo ativável conjugado da divulgação são imobilizados em um suporte sólido (por exemplo, o poço (ou poços) de uma placa de microtitulação). O anticorpo imobilizado, anticorpo conjugado, anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado serve como um anticorpo de captura para qualquer alvo que possa estar presente em uma amostra de teste. Antes de entrar em contato com o anticorpo imobilizado e/ou anticorpo ativável e/ou suas versões conjugadas, com uma amostra de paciente, o suporte sólido é enxaguado e tratado com um agente de bloqueio, como proteína do leite ou albumina, para evitar a adsorção não específica do analito.
[0356] Posteriormente, os poços são tratados com uma amostra de teste suspeita de conter o antígeno, ou com uma solução contendo uma quantidade padrão do antígeno. Essa amostra é, por exemplo, uma amostra de soro de um indivíduo suspeito de ter níveis de antígeno circulante considerados como diagnóstico de uma patologia. Depois de enxaguar a amostra ou padrão de teste, o suporte sólido é tratado com um segundo anticorpo que é marcado de forma detectável. O segundo anticorpo marcado serve como um anticorpo de detecção. O nível do marcador detectável é medido e a concentração do antígeno alvo na amostra de teste é determinada por comparação com uma curva padrão desenvolvida a partir das amostras padrão.
[0357] Será apreciado que, com base nos resultados obtidos usando os anticorpos e anticorpos ativáveis da divulgação e suas versões conjugadas, em um ensaio de diagnóstico in vitro, é possível encenar uma doença em um indivíduo com base nos níveis de expressão do antígeno-alvo. Para uma dada doença, são colhidas amostras de sangue de indivíduos diagnosticados como estando em vários estágios da progressão da doença e/ou em vários pontos do tratamento terapêutico da doença. Usando uma população de amostras que fornece resultados estatisticamente significativos para cada estágio de progressão ou terapia, é designada uma faixa de concentrações do antígeno que pode ser considerada característica de cada estágio.
[0358] Um anticorpo, um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo ativável conjugado também podem ser utilizados em métodos de diagnóstico e/ou imagem. Em algumas modalidades, esses métodos são métodos in vitro. Em algumas modalidades, esses métodos são métodos in vivo. Em algumas modalidades, esses métodos são métodos in situ. Em algumas modalidades, esses métodos são métodos ex vivo. Por exemplo, anticorpos ativáveis possuindo uma CM enzimaticamente clivável podem ser usados para detectar a presença ou ausência de uma enzima que é capaz de clivar a CM. Tais anticorpos ativáveis podem ser utilizados em diagnósticos, que podem incluir a detecção in vivo (por exemplo, qualitativa ou quantitativa) da atividade enzimática (ou, em algumas modalidades, um ambiente de maior potencial de redução, como aquele que pode proporcionar a redução de uma ligação dissulfeto) através do acúmulo medido de anticorpos ativados (isto é, anticorpos resultantes da clivagem de um anticorpo ativável) em uma determinada célula ou tecido de um determinado organismo hospedeiro. Tal acúmulo de anticorpos ativados indica não apenas que o tecido expressa atividade enzimática (ou um potencial de redução aumentado dependendo da natureza da CM), mas também que o tecido expressa alvo ao qual o anticorpo ativado se liga.
[0359] Por exemplo, a CM pode ser selecionado para ser substrato para pelo menos uma protease encontrada no local de um tumor, no local de uma infecção viral ou bacteriana em um local confinado biologicamente (por exemplo, como em um abscesso, em um órgão e similares) e similares. O AB pode ser aquele que liga um antígeno-alvo. Utilizando métodos como aqui divulgados, ou quando apropriado, métodos familiares a um versado na técnica, um rótulo detectável (por exemplo, um rótulo fluorescente ou rótulo radioativo ou radiotraçador) pode ser conjugado com um AB ou outra região de um anticorpo e/ou ativável anticorpo. Marcadores detectáveis adequados são discutidos no contexto dos métodos de triagem acima e exemplos específicos adicionais são fornecidos abaixo. Usando um AB específico para uma proteína ou peptídeo do estado da doença, juntamente com pelo menos uma protease cuja atividade é elevada no tecido da doença de interesse, os anticorpos ativáveis exibirão uma taxa aumentada de ligação ao tecido da doença em relação aos tecidos nos quais a CM é específica. A enzima não está presente em um nível detectável ou está presente em um nível mais baixo do que no tecido da doença ou é inativa (por exemplo, na forma de zimogênio ou em complexo com um inibidor). Como pequenas proteínas e peptídeos são rapidamente eliminados do sangue pelo sistema de filtração renal, e porque a enzima específica para a CM não está presente em um nível detectável (ou está presente em níveis mais baixos nos tecidos que não são da doença ou está presente na conformação inativa)), a acumulação de anticorpos ativados no tecido da doença é aumentada em relação aos tecidos que não são da doença.
[0360] Em outro exemplo, anticorpos ativáveis podem ser usados para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em uma amostra. Por exemplo, quando os anticorpos ativáveis contêm uma CM suscetível à clivagem por uma enzima, os anticorpos ativáveis podem ser usados para detectar (qualitativa ou quantitativamente) a presença de uma enzima na amostra. Em outro exemplo, quando os anticorpos ativáveis contêm uma CM suscetível à clivagem pelo agente redutor, os anticorpos ativáveis podem ser usados para detectar (qualitativamente ou quantitativamente) a presença de condições redutoras em uma amostra. Para facilitar a análise nesses métodos, os anticorpos ativáveis podem ser marcados de forma detectável e podem ser ligados a um suporte (por exemplo, um suporte sólido, como um slide ou cordão). A marcador detectável pode ser posicionada em uma porção do anticorpo ativável que não é liberado após a clivagem, por exemplo, a marcador detectável pode ser uma marcador fluorescente extinta ou outra marcador que não é detectável até que ocorra a clivagem. O ensaio pode ser realizado por, por exemplo, contato dos anticorpos ativáveis marcados de forma detectável e imobilizados com uma amostra suspeita de conter uma enzima e/ou agente redutor por um tempo suficiente para ocorrer a clivagem, depois lavando para remover o excesso de amostra e contaminantes. A presença ou ausência do agente de clivagem (por exemplo, enzima ou agente redutor) na amostra é então avaliada por uma alteração no sinal detectável dos anticorpos ativáveis antes de entrar em contato com a amostra, por exemplo, a presença e/ou um aumento na detecção sinal devido à clivagem do anticorpo ativável pelo agente de clivagem na amostra.
[0361] Tais métodos de detecção podem ser adaptados para também proporcionar a detecção da presença ou ausência de um alvo que seja capaz de se ligar ao AB dos anticorpos ativáveis quando clivados. Assim, os ensaios podem ser adaptados para avaliar a presença ou ausência de um agente de clivagem e a presença ou ausência de um alvo de interesse. A presença ou ausência do agente de clivagem pode ser detectada pela presença e/ou um aumento no marcador detectável dos anticorpos ativáveis, conforme descrito acima, e a presença ou ausência do alvo pode ser detectada pela detecção de um complexo alvo-AB por exemplo, pelo uso de um anticorpo anti-alvo marcado de forma detectável.
[0362] Os anticorpos ativáveis também são úteis na geração de imagens in situ para a validação da ativação do anticorpo ativável, por exemplo, por clivagem de protease e ligação a um alvo específico. A imagem in situ é uma técnica que permite a localização da atividade proteolítica e do alvo em amostras biológicas, como culturas de células ou seções de tecidos. Usando esta técnica, é possível confirmar a ligação a um determinado alvo e a atividade proteolítica com base na presença de um marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente).
[0363] Essas técnicas são úteis com qualquer célula ou tecido congelado derivado de um local da doença (por exemplo, tecido tumoral) ou tecidos saudáveis. Essas técnicas também são úteis com amostras de células ou tecidos frescos.
[0364] Nestas técnicas, um anticorpo ativável é marcado com um marcador detectável. O rótulo detectável pode ser um corante fluorescente (por exemplo, um fluoróforo, isotiocianato de fluorescência (FITC), isotiocianato de rodamina (TRITC), um rótulo Alexa Fluor®), um corante de infravermelho próximo (NIR) (por exemplo, nanocristais Qdot®), um coloidal metal, hapteno, marcador radioativo, biotina e reagente de amplificação como estreptavidina ou enzima (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina).
[0365] A detecção do marcador em uma amostra que foi incubada com o anticorpo ativável marcado indica que a amostra contém o alvo e contém uma protease específica para a CM do anticorpo ativável. Em algumas modalidades, a presença da protease pode ser confirmada usando inibidores de protease de amplo espectro, como os aqui descritos, e/ou usando um agente que é específico para a protease, por exemplo, um anticorpo como A11, que é específico para a protease matriptase e inibe a atividade proteolítica da matriptase; ver, por exemplo, Publicação Internacional n° WO 2010/129609, publicado em 11 de novembro de 2010. A mesma abordagem do uso de inibidores de protease de amplo espectro, como os aqui descritos, e/ou usando um agente inibidor mais seletivo pode ser usada para identificar uma protease específica para a CM do anticorpo ativável. Em algumas modalidades, a presença do alvo pode ser confirmada usando um agente que é específico para o alvo, por exemplo, outro anticorpo ou o marcador detectável pode ser competido com o alvo não marcado. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável não marcado pode ser usado, com detecção por um anticorpo secundário marcado ou por um sistema de detecção mais complexo.
[0366] Técnicas semelhantes também são úteis para imagens in vivo em que a detecção do sinal fluorescente em um indivíduo, por exemplo, um mamífero, incluindo um humano, indica que o local da doença contém o alvo e contém uma protease específica para a CM do anticorpo ativável.
[0367] Essas técnicas também são úteis em kits e/ou como reagentes para a detecção, identificação ou caracterização da atividade da protease em uma variedade de células, tecidos e organismos com base na CM específico da protease no anticorpo ativável.
[0368] A divulgação fornece métodos de uso dos anticorpos e/ou anticorpos ativáveis em uma variedade de indicações de diagnóstico e/ou profiláticas. Por exemplo, a divulgação fornece métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem e um alvo de interesse em um indivíduo ou uma amostra por (i) entrar em contato com um indivíduo ou amostra com um anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável compreende uma porção de mascaramento (MM), uma porção clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, por exemplo, uma protease e um domínio de ligação ao antígeno ou um seu fragmento (AB) que se liga especificamente ao alvo de interesse, em que o anticorpo ativável em um componente não clivado não o estado ativado compreende uma disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo e em que a MM não possui uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação que ocorre naturalmente do AB e não é uma forma modificada de um parceiro de ligação natural do AB; e (b) em que, em um estado não clivado, não ativado, a MM interfere na ligação específica do AB ao alvo e, em um estado ativado clivado, a MM não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo; e (ii) medir um nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem e o alvo estão presentes no indivíduo ou amostra e em que nenhum nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem, o alvo ou ambos, o agente de clivagem e o alvo estão ausentes e/ou não estão suficientemente presentes no indivíduo ou na amostra. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual um agente terapêutico é conjugado. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável não é conjugado com um agente. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, a marcador detectável é posicionada no AB. Em algumas modalidades, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada usando um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, o reagente secundário é um anticorpo compreendendo um marcador detectável.
[0369] A divulgação também fornece métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em um indivíduo ou amostra ao (i) entrar em contato com um indivíduo ou amostra com um anticorpo ativável na presença de um alvo de interesse, por exemplo, o alvo, em que o ativável o anticorpo compreende uma porção de mascaramento (MM), uma porção clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, por exemplo, uma protease e um domínio de ligação ao antígeno ou seu fragmento (AB) que se liga especificamente ao alvo de interesse, em que o ativável o anticorpo em um estado não clivado e não ativado compreende um arranjo estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo e em que a MM não possui uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação que ocorre naturalmente do AB e não é uma forma modificada de um parceiro de ligação natural do AB; e (b) em que, em um estado não clivado, não ativado, a MM interfere na ligação específica do AB ao alvo e, em um estado ativado clivado, a MM não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo; e (ii) medir um nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra e em que nenhum nível detectável de ativável ativado o anticorpo no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou na amostra. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual um agente terapêutico é conjugado. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável não é conjugado com um agente. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, a marcador detectável é posicionada no AB. Em algumas modalidades, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada usando um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, o reagente secundário é um anticorpo compreendendo um marcador detectável.
[0370] A divulgação também fornece kits para uso em métodos de detecção da presença ou ausência de um agente de clivagem e o alvo em um indivíduo ou uma amostra, em que os kits incluem pelo menos um anticorpo ativável compreende uma porção de mascaramento (MM), uma porção clivável (CM) que é clivado pelo agente de clivagem, por exemplo, uma protease e um domínio de ligação ao antígeno ou fragmento do mesmo (AB) que se liga especificamente ao alvo de interesse, em que o anticorpo ativável em um estado não clivado e não ativado compreende uma disposição estrutural de Terminal N para terminal C, como se segue: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo e em que a MM não possui uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação que ocorre naturalmente do AB e não é uma forma modificada de um parceiro de ligação natural do AB; e (b) em que, em um estado não clivado, não ativado, a MM interfere na ligação específica do AB ao alvo e, em um estado ativado clivado, a MM não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo; e (ii) medir um nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra e em que nenhum nível detectável de ativável ativado o anticorpo no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou na amostra. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual um agente terapêutico é conjugado. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável não é conjugado com um agente. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, a marcador detectável é posicionada no AB. Em algumas modalidades, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada usando um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, o reagente secundário é um anticorpo compreendendo um marcador detectável.
[0371] A divulgação também fornece métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em um indivíduo ou uma amostra por (i) entrar em contato com um indivíduo ou amostra com um anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável compreende uma porção de mascaramento (MM), uma porção clivável (CM) que é clivado pelo agente de clivagem, por exemplo, uma protease, um domínio de ligação ao antígeno (AB) que se liga especificamente ao alvo e um marcador detectável, em que o anticorpo ativável em um estado não clivado e não ativado compreende uma disposição estrutural de Terminal N para terminal C, como se segue: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo e em que a MM não possui uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação que ocorre naturalmente do AB e não é uma forma modificada de um parceiro de ligação natural do AB; em que, em um estado não clivado, não ativado, a MM interfere com a ligação específica do AB ao alvo e, em um estado ativado, clivado, a MM não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo; e em que o marcador detectável é posicionado em uma porção do anticorpo ativável que é liberado após a clivagem da CM; e (ii) medir um nível de marcador detectável no indivíduo ou amostra, em que um nível detectável da marcador detectável no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou amostra e em que não nível detectável do rótulo detectável no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual um agente terapêutico é conjugado. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável não é conjugado com um agente. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, a marcador detectável é posicionada no AB. Em algumas modalidades, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada usando um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, o reagente secundário é um anticorpo compreendendo um marcador detectável.
[0372] A divulgação também fornece kits para uso em métodos de detecção da presença ou ausência de um agente de clivagem e o alvo em um indivíduo ou uma amostra, em que os kits incluem pelo menos um anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado (por exemplo, um anticorpo ativável para que um agente terapêutico é conjugado) aqui descrito para uso em contato com um indivíduo ou amostra biológica e meios para detectar o nível de anticorpo ativável ativado e/ou anticorpo ativável conjugado no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado em o indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem e o alvo estão presentes no indivíduo ou amostra biológica e em que nenhum nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem, o alvo ou o agente de clivagem e o alvo estiver ausente e/ou não estiver suficientemente presente no indivíduo ou na amostra biológica, no alvo de ligação e/ou clivagem de protease do anticorpo ativável não pode ser detectado no indivíduo ou na amostra biológica.
[0373] A divulgação também fornece métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em um indivíduo ou uma amostra (i) contatando um indivíduo ou amostra biológica com um anticorpo ativável na presença do alvo e (ii) medindo um nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra biológica e em que nenhum nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou biológico A amostra indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou na amostra biológica em um nível detectável, de modo que a clivagem de protease do anticorpo ativável não possa ser detectada no indivíduo ou na amostra biológica. Tal anticorpo ativável inclui uma porção de mascaramento (MM), uma porção clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, por exemplo, uma protease e um domínio de ligação ao antígeno ou seu fragmento (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que o anticorpo ativável em um estado não clivado (isto é, não ativado) compreende uma disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo e em que a MM não possui uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação que ocorre naturalmente no AB; e (b) em que a MM do anticorpo ativável em um estado não clivado interfere com a ligação específica do AB ao alvo, e em que a MM de um anticorpo ativável em um estado clivado (isto é, ativado) não interfere ou compete com específicos ligação do AB ao alvo. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual um agente terapêutico é conjugado. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável não é conjugado com um agente. Em algumas modalidades, a marcador detectável é anexada à porção de mascaramento. Em algumas modalidades, o marcador detectável é anexado ao terminal N da porção clivável ao local de clivagem da protease. Em algumas modalidades, um único local de ligação ao antígeno do AB é mascarado. Em algumas modalidades em que um anticorpo da divulgação tem pelo menos dois locais de ligação ao antígeno, pelo menos um local de ligação ao antígeno é mascarado e pelo menos um local de ligação ao antígeno não é mascarado. Em algumas modalidades, todos os locais de ligação ao antígeno são mascarados. Em algumas modalidades, a etapa de medição inclui o uso de um reagente secundário compreendendo um rótulo detectável.
[0374] A divulgação também fornece kits para uso em métodos de detecção da presença ou ausência de um agente de clivagem e o alvo em um indivíduo ou uma amostra, em que os kits incluem pelo menos um anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado aqui descrito para uso em contato com um indivíduo ou amostra biológica com um anticorpo ativável na presença do alvo e medir um nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem é presente no indivíduo ou amostra biológica e em que nenhum nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou amostra biológica em um nível detectável, de modo que a clivagem por protease do anticorpo ativável não pode ser detectado no indivíduo ou na amostra biológica. Tal anticorpo ativável inclui uma porção de mascaramento (MM), uma porção clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, por exemplo, uma protease e um domínio de ligação ao antígeno ou seu fragmento (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que o anticorpo ativável em um estado não clivado (isto é, não ativado) compreende uma disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo e em que a MM não possui uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação que ocorre naturalmente no AB; e (b) em que a MM do anticorpo ativável em um estado não clivado interfere com a ligação específica do AB ao alvo, e em que a MM de um anticorpo ativável em um estado clivado (isto é, ativado) não interfere ou compete com específicos ligação do AB ao alvo. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual um agente terapêutico é conjugado. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável não é conjugado com um agente. Em algumas modalidades, a marcador detectável é anexada à porção de mascaramento. Em algumas modalidades, o marcador detectável é anexado ao terminal N da porção clivável ao local de clivagem da protease. Em algumas modalidades, um único local de ligação ao antígeno do AB é mascarado. Em algumas modalidades em que um anticorpo da divulgação tem pelo menos dois locais de ligação ao antígeno, pelo menos um local de ligação ao antígeno é mascarado e pelo menos um local de ligação ao antígeno não é mascarado. Em algumas modalidades, todos os locais de ligação ao antígeno são mascarados. Em algumas modalidades, a etapa de medição inclui o uso de um reagente secundário compreendendo um rótulo detectável.
[0375] A divulgação também fornece kits para uso em métodos de detecção da presença ou ausência de um agente de clivagem em um indivíduo ou uma amostra, em que os kits incluem pelo menos um anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado aqui descrito para uso em contato com um indivíduo ou biológico amostra e meios para detectar o nível de anticorpo ativável ativado e/ou anticorpo ativável conjugado no indivíduo ou amostra biológica, em que o anticorpo ativável inclui um marcador detectável que é posicionado em uma porção do anticorpo ativável que é liberado após a clivagem da CM, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou amostra biológica, de modo que a ligação ao alvo e/ou clivagem de protease do anticorpo ativável não possa ser detectado no indivíduo ou amostra biológica e em que nenhum nível detectável de ativação anticorpo ativável no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra biológica em um nível detectável.
[0376] A divulgação fornece métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem e o alvo em um indivíduo ou uma amostra por (i) entrar em contato com um indivíduo ou amostra biológica com um anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável inclui um marcador detectável que está posicionado em um porção do anticorpo ativável que é liberada após a clivagem da CM e (ii) medir um nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem, o alvo ou o agente de clivagem e o alvo estão ausentes e/ou não estão suficientemente presentes no indivíduo ou na amostra biológica, de modo que a ligação ao alvo e/ou a clivagem de protease do anticorpo ativável não possam ser detectados no indivíduo ou na amostra biológica, e em que um nível detectável reduzido de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou na amostra biológica indica que o agente de clivagem e o alvo estão presentes no indivíduo ou na amostra biológica. Um nível reduzido de marcador detectável é, por exemplo, uma redução de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% e/ou cerca de 100%. Tal anticorpo ativável inclui uma porção de mascaramento (MM), uma porção clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem e um domínio de ligação ao antígeno ou um fragmento do mesmo (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que o anticorpo ativável em uma fenda não clivada (isto é, não ativado) compreende uma disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo e em que a MM não possui uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação que ocorre naturalmente no AB; e (b) em que a MM do anticorpo ativável em um estado não clivado interfere com a ligação específica do AB ao alvo, e em que a MM de um anticorpo ativável em um estado clivado (isto é, ativado) não interfere ou compete com específicos ligação do AB ao alvo. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual um agente terapêutico é conjugado. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável não é conjugado com um agente. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, a marcador detectável é posicionada no AB. Em algumas modalidades, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada usando um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, o reagente secundário é um anticorpo compreendendo um marcador detectável.
[0377] A divulgação também fornece kits para uso em métodos de detecção da presença ou ausência de um agente de clivagem e o alvo em um indivíduo ou uma amostra, em que os kits incluem pelo menos um anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado aqui descrito para uso em contato com um indivíduo ou amostra biológica e meios para detectar o nível de anticorpo ativável ativado e/ou anticorpo ativável conjugado no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem, o alvo ou o agente de clivagem e o alvo estão ausentes e/ou não estão suficientemente presentes no indivíduo ou na amostra biológica, de modo que a ligação ao alvo e/ou a clivagem de protease do anticorpo ativável não possam ser detectados no indivíduo ou na amostra biológica e em que uma redução nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem te alvo estão presentes no indivíduo ou na amostra biológica. Um nível reduzido de marcador detectável é, por exemplo, uma redução de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% e/ou cerca de 100%.
[0378] A divulgação também fornece métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em um indivíduo ou amostra ao (i) entrar em contato com um indivíduo ou amostra biológica com um anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável inclui um marcador detectável que está posicionado em uma porção de o anticorpo ativável que é liberado após a clivagem da CM; e (ii) medir um nível de marcador detectável no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável do rótulo detectável no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou amostra biológica em um nível detectável, de modo que a clivagem de protease do anticorpo ativável não possa ser detectada no indivíduo ou na amostra biológica e em que um nível detectável reduzido do marcador detectável no indivíduo ou na amostra biológica indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra biológica. Um nível reduzido de marcador detectável é, por exemplo, uma redução de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% e/ou cerca de 100%. Tal anticorpo ativável inclui uma porção de mascaramento (MM), uma porção clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem e um domínio de ligação ao antígeno ou um fragmento do mesmo (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que o anticorpo ativável em uma fenda não clivada (isto é, não ativado) compreende uma disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo e em que a MM não possui uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação que ocorre naturalmente no AB; e (b) em que a MM do anticorpo ativável em um estado não clivado interfere com a ligação específica do AB ao alvo, e em que a MM de um anticorpo ativável em um estado clivado (isto é, ativado) não interfere ou compete com específicos ligação do AB ao alvo. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual um agente terapêutico é conjugado. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável não é conjugado com um agente. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, a marcador detectável é posicionada no AB. Em algumas modalidades, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada usando um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, o reagente secundário é um anticorpo compreendendo um marcador detectável.
[0379] A divulgação também fornece kits para uso em métodos de detecção da presença ou ausência de um agente de clivagem de interesse em um indivíduo ou uma amostra, em que os kits incluem pelo menos um anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado aqui descrito para uso em contato com um indivíduo ou amostra biológica e meios para detectar o nível de anticorpo ativável ativado e/ou anticorpo ativável conjugado no indivíduo ou amostra biológica, em que o anticorpo ativável inclui um marcador detectável que é posicionado em uma porção do anticorpo ativável que é liberado após a clivagem da CM, em que um nível detectável do marcador detectável no indivíduo ou na amostra biológica indica que o agente de clivagem, o alvo ou o agente de clivagem e o alvo estão ausentes e/ou não estão suficientemente presentes no indivíduo ou na amostra biológica, como que a ligação ao alvo e/ou clivagem de protease do anticorpo ativável não pode ser detectada no indivíduo ou amostra óptica e em que um nível detectável reduzido do marcador detectável no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem e o alvo estão presentes no indivíduo ou na amostra biológica. Um nível reduzido de marcador detectável é, por exemplo, uma redução de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% e/ou cerca de 100%.
[0380] Em algumas modalidades desses métodos e kits, o anticorpo ativável inclui um marcador detectável. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o rótulo detectável inclui um agente de imagem, um agente de contraste, uma enzima, um rótulo fluorescente, um cromóforo, um corante, um ou mais íons metálicos ou um rótulo à base de ligante. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o agente de imagem compreende um radioisótopo. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o radioisótopo é índio ou tecnécio. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o agente de contraste compreende iodo, gadolínio ou óxido de ferro. Em algumas modalidades desses métodos e kits, a enzima compreende peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina ou β-galactosidase. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o rótulo fluorescente compreende proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciana (CFP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha modificada (mRFP), proteína fluorescente vermelha tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED ou um derivado de európio. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o rótulo luminescente compreende um derivado de N- metilacrílico. Em algumas modalidades desses métodos, o rótulo compreende um rótulo Alexa Fluor®, como Alex Fluor® 680 ou Alexa Fluor® 750. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o rótulo à base de ligante compreende biotina, avidina, estreptavidina ou um ou mais haptenos.
[0381] Em algumas modalidades desses métodos e kits, o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero não humano, como um primata não humano, animal de companhia (por exemplo, gato, cachorro, cavalo), animal de fazenda, animal de trabalho ou animal de zoológico. Em algumas modalidades, o indivíduo é um roedor.
[0382] Em algumas modalidades desses métodos, o método é um método in vivo. Em algumas modalidades desses métodos, o método é um método in situ. Em algumas modalidades desses métodos, o método é um método ex vivo. Em algumas modalidades desses métodos, o método é um método in vitro.
[0383] Em algumas modalidades, a imagem in situ e/ou a imagem in vivo são úteis em métodos para identificar quais pacientes tratar. Por exemplo, na imagem in situ, os anticorpos ativáveis são usados para rastrear amostras de pacientes para identificar aqueles pacientes com a protease (ou proteases) e alvo (ou alvos) apropriado no local apropriado, por exemplo, no local do tumor.
[0384] Em algumas modalidades, a imagem in situ é usada para identificar ou refinar uma população de pacientes adequada para tratamento com um anticorpo ativável da divulgação. Por exemplo, são identificados pacientes com teste positivo tanto para o alvo (por exemplo, o alvo) quanto para uma protease que cliva o substrato na porção clivável (CM) do anticorpo ativável que está sendo testado (por exemplo, acumula anticorpos ativados no local da doença) como candidatos adequados para o tratamento com um anticorpo ativável que compreende tal CM. Da mesma forma, pacientes com resultado negativo para um ou ambos os alvos (por exemplo, o alvo) e a protease que cliva o substrato na CM no anticorpo ativável sendo testado usando esses métodos podem ser identificados como candidatos adequados para outra forma de terapia. Em algumas modalidades, esses pacientes que testam negativo em relação a um primeiro anticorpo ativável podem ser testados com outros anticorpos ativáveis compreendendo CMs diferentes até que um anticorpo ativável adequado para tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável compreendendo uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença). Em algumas modalidades, o paciente é então administrado uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ativável para o qual o paciente testou positivo.
[0385] Em algumas modalidades, a imagem in vivo é usada para identificar ou refinar uma população de pacientes adequada para tratamento com um anticorpo ativável da divulgação. Por exemplo, são identificados pacientes com teste positivo tanto para o alvo (por exemplo, o alvo) quanto para uma protease que cliva o substrato na porção clivável (CM) do anticorpo ativável que está sendo testado (por exemplo, acumula anticorpos ativados no local da doença) como candidatos adequados para o tratamento com um anticorpo ativável que compreende tal CM. Da mesma forma, pacientes com resultado negativo podem ser identificados como candidatos adequados para outra forma de terapia. Em algumas modalidades, esses pacientes que testam negativo em relação a um primeiro anticorpo ativável podem ser testados com outros anticorpos ativáveis compreendendo CMs diferentes até que um anticorpo ativável adequado para tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável compreendendo uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença). Em algumas modalidades, o paciente é então administrado uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ativável para o qual o paciente testou positivo.
[0386] Em algumas modalidades dos métodos e kits, o método ou kit é usado para identificar ou refinar uma população de pacientes adequada para tratamento com um anticorpo ativável da divulgação. Por exemplo, pacientes com resultado positivo tanto para o alvo (por exemplo, o alvo) quanto para uma protease que cliva o substrato na porção clivável (CM) do anticorpo ativável sendo testado nesses métodos são identificados como candidatos adequados para o tratamento com tal anticorpo ativável compreendendo tal CM. Da mesma forma, os pacientes que testam negativo para ambos os alvos (por exemplo, o alvo) e a protease que quebra o substrato na CM no anticorpo ativável sendo testado usando esses métodos podem ser identificados como candidatos adequados para outra forma de terapia. Em algumas modalidades, esses pacientes podem ser testados com outros anticorpos ativáveis até que um anticorpo ativável adequado para tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável compreendendo uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença). Em algumas modalidades, os pacientes que testam negativo para qualquer um dos alvos (por exemplo, o alvo) são identificados como candidatos adequados para o tratamento com um anticorpo ativável que compreende tal CM. Em algumas modalidades, os pacientes que testam negativo para qualquer um dos alvos (por exemplo, o alvo) são identificados como não sendo candidatos adequados para o tratamento com um anticorpo ativável que compreende tal CM. Em algumas modalidades, esses pacientes podem ser testados com outros anticorpos ativáveis até que um anticorpo ativável adequado para tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável compreendendo uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença). Em algumas modalidades, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual um agente terapêutico é conjugado. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável não é conjugado com um agente. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, a marcador detectável é posicionada no AB. Em algumas modalidades, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada usando um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas modalidades, o reagente secundário é um anticorpo compreendendo um marcador detectável.
[0387] Em algumas modalidades, um método ou kit é usado para identificar ou refinar uma população de pacientes adequada para tratamento com um anticorpo ativável anti-alvo e/ou anticorpo ativável conjugado (por exemplo, anticorpo ativável ao qual um agente terapêutico é conjugado) da divulgação, seguida de tratamento pela administração desse anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado a um indivíduo em necessidade. Por exemplo, pacientes com teste positivo tanto para os alvos (por exemplo, o alvo) quanto para uma protease que cliva o substrato na porção clivável (CM) do anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado sendo testado nesses métodos são identificados como adequados candidatos ao tratamento com esse anticorpo e/ou um anticorpo ativável conjugado que compreende essa CM, e o paciente é então administrado uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado que foi testado. Da mesma forma, pacientes com resultado negativo para um ou ambos os alvos (por exemplo, o alvo) e a protease que quebra o substrato na CM no anticorpo ativável sendo testado usando esses métodos podem ser identificados como candidatos adequados para outra forma de terapia. Em algumas modalidades, esses pacientes podem ser testados com outro anticorpo e/ou anticorpo ativável conjugado até que um anticorpo adequado e/ou anticorpo ativável conjugado para tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado compreendendo uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença). Em algumas modalidades, o paciente é então administrado uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado para o qual o paciente testou positivo.
[0388] Em algumas modalidades desses métodos e kits, a MM é um peptídeo com um comprimento de cerca de 4 a 40 aminoácidos. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o anticorpo ativável compreende um peptídeo ligante, em que o peptídeo ligante é posicionado entre a MM e a CM. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o anticorpo ativável compreende um peptídeo ligante, em que o peptídeo ligante é posicionado entre o AB e a CM. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o anticorpo ativável compreende um primeiro peptídeo ligante (LP1) e um segundo peptídeo ligante (LP2), em que o primeiro peptídeo ligante é posicionado entre a MM e a CM e o segundo peptídeo ligante é posicionado entre o AB e a CM. Em algumas modalidades desses métodos e kits, cada um de LP1 e LP2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento e em que cada um de LP1 e LP2 não precisa ser o mesmo ligante. Em algumas modalidades desses métodos e kits, um ou ambos de LP1 e LP2 compreendem um polímero de glicina-serina. Em algumas modalidades desses métodos e kits, pelo menos um de LP1 e LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 24) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 25), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas modalidades desses métodos e kits, pelo menos um de LP1 e LP2 compreende uma sequência de aminoácidos com a fórmula (GGS)n, em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas modalidades desses métodos e kits, pelo menos um de LP1 e LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 26), Gly-Gly-Ser-Gly- Gly (SEQ ID NO: 27), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 28), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 29), Gly-Gly-Gly-Ser -Gly (SEQ ID NO: 30) e Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 31).
[0389] Em algumas modalidades desses métodos e kits, o AB compreende uma sequência de anticorpo ou fragmento de anticorpo selecionada a partir das sequências de anticorpos reativas cruzadas aqui apresentadas. Em algumas modalidades desses métodos e kits, o AB compreende um fragmento Fab, um scFv ou um anticorpo de cadeia única (scAb).
[0390] Em algumas modalidades desses métodos e kits, o agente de clivagem é uma protease que é colocalizada no indivíduo ou amostra com o alvo e a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para a protease, em que a protease cliva a CM em o anticorpo ativável quando o anticorpo ativável é exposto à protease. Em algumas modalidades desses métodos e kits, a CM é um polipeptídeo de até 15 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades desses métodos e kits, a CM é acoplada ao terminal N do AB. Em algumas modalidades desses métodos e kits, a CM é acoplada ao terminal C do AB. Em algumas modalidades desses métodos e kits, a CM é acoplada ao terminal N de uma cadeia VL do AB.
[0391] Os terminais N e C das cadeias polipeptídicas do anticorpo da presente invenção podem diferir das sequências aqui descritas devido a modificações pós- traducionais comumente observadas. Por exemplo, frequentemente faltam resíduos de lisina C-terminal nas cadeias pesadas de anticorpos. Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100: 1.132. Os resíduos de glutamina no terminal N e, em menor grau, os resíduos de glutamato, são frequentemente convertidos em resíduos de piroglutamato nas cadeias leve e pesada de anticorpos terapêuticos. Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97: 544; Liu et al. (2011) JBC 28611211; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286: 11.211. Por conseguinte, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) e/ou Fórmula (II) pode ter um anticorpo (AB) em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não possui um ou mais aminoácidos no terminal, não possui o A lisina C-terminal, remove a lisina C-terminal devido ao processamento pós-tradução, ou a lisina C-terminal é um aminoácido diferente da lisina. Se o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada for um aminoácido diferente de lisina, em uma modalidade, é um aminoácido geralmente não passível de formar uma ligação dissulfeto ou de outro modo não passível de conjugação com um agente citotóxico.
[0392] Em certas modalidades, o anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) e/ou Fórmula (II) pode ter um anticorpo (AB) no qual o glutamato do terminal N na cadeia pesada e/ou cadeia leve é opcionalmente piroglutamato ou pós-traducional modificado para piroglutamato.
[0393] Em certas modalidades, a região constante da cadeia pesada do anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) e/ou Fórmula (II) compreende uma lisina ou outro aminoácido no terminal C, por exemplo, compreende os seguintes últimos aminoácidos: PGK para a cadeia pesada. Em certas modalidades, a região constante da cadeia pesada não possui um ou mais aminoácidos no terminal C e possui, por exemplo, a sequência C-terminal PG ou P.
[0394] Em certas modalidades, as regiões variáveis da cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo ativável conjugado da Fórmula (I) e/ou Fórmula (II) compreendem um aminoácido glutamato ou piroglutamato no terminal N, por exemplo, compreende o seguinte últimos aminoácidos: pQGQ para a cadeia leve e/ou pQVQ para a cadeia pesada, em que “pQ” representa piroglutamato.
[0395] Os anticorpos, anticorpos conjugados, anticorpos ativáveis e/ou anticorpos ativáveis conjugados da divulgação são utilizados em formulações de diagnóstico e profiláticas. Numa modalidade, um anticorpo ativável é administrado a pacientes que correm o risco de desenvolver uma ou mais das inflamações, distúrbios inflamatórios, câncer ou outros distúrbios mencionados acima.
[0396] A predisposição de um paciente ou órgão a um ou mais dos distúrbios mencionados acima pode ser determinada usando marcadores genotípicos, sorológicos ou bioquímicos.
[0397] Em algumas modalidades da divulgação, um anticorpo, um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo ativável conjugado são administrados a indivíduos humanos diagnosticados com uma indicação clínica associada a um ou mais dos distúrbios mencionados acima. Após o diagnóstico, um anticorpo, um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo ativável conjugado são administrados para mitigar ou reverter os efeitos da indicação clínica.
[0398] Anticorpos, anticorpos conjugados, anticorpos ativáveis e/ou anticorpos ativáveis conjugados da divulgação também são úteis na detecção do alvo em amostras de pacientes e, portanto, são úteis como diagnóstico. Por exemplo, os anticorpos, anticorpos conjugados, anticorpos ativáveis e/ou anticorpos ativáveis conjugados da divulgação são usados em ensaios in vitro, por exemplo, ELISA, para detectar níveis de alvo em uma amostra de paciente.
[0399] Em uma modalidade, um anticorpo e/ou anticorpo ativável da divulgação é imobilizado em um suporte sólido (por exemplo, o poço (ou poços) de uma placa de microtitulação). O anticorpo imobilizado e/ou anticorpo ativável serve como um anticorpo de captura para qualquer alvo que possa estar presente em uma amostra de teste. Antes de entrar em contato com o anticorpo imobilizado e/ou anticorpo ativável com uma amostra do paciente, o suporte sólido é lavado e tratado com um agente bloqueador, como proteína do leite ou albumina, para evitar a adsorção não específica do analito.
[0400] Posteriormente, os poços são tratados com uma amostra de teste suspeita de conter o antígeno, ou com uma solução contendo uma quantidade padrão do antígeno. Essa amostra é, por exemplo, uma amostra de soro de um indivíduo suspeito de ter níveis de antígeno circulante considerados como diagnóstico de uma patologia. Depois de enxaguar a amostra ou padrão de teste, o suporte sólido é tratado com um segundo anticorpo que é marcado de forma detectável. O segundo anticorpo marcado serve como um anticorpo de detecção. O nível do marcador detectável é medido e a concentração do antígeno alvo na amostra de teste é determinada por comparação com uma curva padrão desenvolvida a partir das amostras padrão.
[0401] Será apreciado que, com base nos resultados obtidos usando os anticorpos e/ou anticorpos ativáveis da divulgação em um ensaio de diagnóstico in vitro, é possível encenar uma doença em um indivíduo com base nos níveis de expressão do antígeno-alvo. Para uma dada doença, são colhidas amostras de sangue de indivíduos diagnosticados como estando em vários estágios da progressão da doença e/ou em vários pontos do tratamento terapêutico da doença. Usando uma população de amostras que fornece resultados estatisticamente significativos para cada estágio de progressão ou terapia, é designada uma faixa de concentrações do antígeno que pode ser considerada característica de cada estágio.
[0402] Anticorpos, anticorpos conjugados, anticorpos ativáveis e/ou anticorpos ativáveis conjugados também podem ser utilizados em métodos de diagnóstico e/ou imagem. Em algumas modalidades, esses métodos são métodos in vitro. Em algumas modalidades, esses métodos são métodos in vivo. Em algumas modalidades, esses métodos são métodos in situ. Em algumas modalidades, esses métodos são métodos ex vivo. Por exemplo, anticorpos ativáveis possuindo uma CM enzimaticamente clivável podem ser usados para detectar a presença ou ausência de uma enzima que é capaz de clivar a CM. Tais anticorpos ativáveis podem ser utilizados em diagnósticos, que podem incluir a detecção in vivo (por exemplo, qualitativa ou quantitativa) da atividade enzimática (ou, em algumas modalidades, um ambiente de maior potencial de redução, como aquele que pode proporcionar a redução de uma ligação dissulfeto) através do acúmulo medido de anticorpos ativados (isto é, anticorpos resultantes da clivagem de um anticorpo ativável) em uma determinada célula ou tecido de um determinado organismo hospedeiro. Tal acúmulo de anticorpos ativados indica não apenas que o tecido expressa atividade enzimática (ou um potencial de redução aumentado dependendo da natureza da CM), mas também que o tecido expressa alvo ao qual o anticorpo ativado se liga.
[0403] Por exemplo, a CM pode ser selecionado para ser um substrato de protease para uma protease encontrada no local de um tumor, no local de uma infecção viral ou bacteriana em um local confinado biologicamente (por exemplo, como em um abscesso, em um órgão e similares) e similares. O AB pode ser aquele que liga um antígeno-alvo. Utilizando métodos familiares de um versado na técnica, um marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente ou marcador radioativo ou radiotraçador) pode ser conjugado com um AB ou outra região de um anticorpo ativável. Marcadores detectáveis adequados são discutidos no contexto dos métodos de triagem acima e exemplos específicos adicionais são fornecidos abaixo. Usando um AB específico para uma proteína ou peptídeo do estado da doença, juntamente com uma protease cuja atividade é elevada no tecido da doença de interesse, os anticorpos ativáveis exibem uma taxa aumentada de ligação ao tecido da doença em relação aos tecidos em que a enzima específica da CM é não está presente em um nível detectável ou está presente em um nível mais baixo do que no tecido da doença ou é inativo (por exemplo, na forma de zimogênio ou em complexo com um inibidor). Como pequenas proteínas e peptídeos são rapidamente eliminados do sangue pelo sistema de filtração renal, e porque a enzima específica para a CM não está presente em um nível detectável (ou está presente em níveis mais baixos nos tecidos que não são da doença ou está presente na conformação inativa)), a acumulação de anticorpos ativados no tecido da doença é aumentada em relação aos tecidos que não são da doença.
[0404] Em outro exemplo, anticorpos ativáveis podem ser usados para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em uma amostra. Por exemplo, quando os anticorpos ativáveis contêm uma CM suscetível à clivagem por uma enzima, os anticorpos ativáveis podem ser usados para detectar (qualitativa ou quantitativamente) a presença de uma enzima na amostra. Em outro exemplo, quando os anticorpos ativáveis contêm uma CM suscetível à clivagem pelo agente redutor, os anticorpos ativáveis podem ser usados para detectar (qualitativamente ou quantitativamente) a presença de condições redutoras em uma amostra. Para facilitar a análise nesses métodos, os anticorpos ativáveis podem ser marcados de forma detectável e podem ser ligados a um suporte (por exemplo, um suporte sólido, como um slide ou cordão). A marcador detectável pode ser posicionada em uma porção do anticorpo ativável que não é liberado após a clivagem, por exemplo, a marcador detectável pode ser uma marcador fluorescente extinta ou outra marcador que não é detectável até que ocorra a clivagem. O ensaio pode ser realizado por, por exemplo, contato dos anticorpos ativáveis marcados de forma detectável e imobilizados com uma amostra suspeita de conter uma enzima e/ou agente redutor por um tempo suficiente para ocorrer a clivagem, depois lavando para remover o excesso de amostra e contaminantes. A presença ou ausência do agente de clivagem (por exemplo, enzima ou agente redutor) na amostra é então avaliada por uma alteração no sinal detectável dos anticorpos ativáveis antes de entrar em contato com a amostra, por exemplo, a presença e/ou um aumento na detecção sinal devido à clivagem do anticorpo ativável pelo agente de clivagem na amostra.
[0405] Tais métodos de detecção podem ser adaptados para também proporcionar a detecção da presença ou ausência de um alvo que seja capaz de se ligar ao AB dos anticorpos ativáveis quando clivados. Assim, os ensaios podem ser adaptados para avaliar a presença ou ausência de um agente de clivagem e a presença ou ausência de um alvo de interesse. A presença ou ausência do agente de clivagem pode ser detectada pela presença e/ou um aumento no marcador detectável dos anticorpos ativáveis, conforme descrito acima, e a presença ou ausência do alvo pode ser detectada pela detecção de um complexo alvo-AB por exemplo, pelo uso de um anticorpo anti-alvo marcado de forma detectável.
[0406] Os anticorpos ativáveis também são úteis na geração de imagens in situ para a validação da ativação do anticorpo ativável, por exemplo, por clivagem de protease e ligação a um alvo específico. A imagem in situ é uma técnica que permite a localização da atividade proteolítica e do alvo em amostras biológicas, como culturas de células ou seções de tecidos. Usando esta técnica, é possível confirmar a ligação a um determinado alvo e a atividade proteolítica com base na presença de um marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente).
[0407] Essas técnicas são úteis com qualquer célula ou tecido congelado derivado de um local da doença (por exemplo, tecido tumoral) ou tecidos saudáveis. Essas técnicas também são úteis com amostras de células ou tecidos frescos.
[0408] Nestas técnicas, um anticorpo ativável é marcado com um marcador detectável. O rótulo detectável pode ser um corante fluorescente (por exemplo, isotiocianato de fluorescência (FITC), isotiocianato de rodamina (TRITC), um corante de infravermelho próximo (NIR) (por exemplo, nanocristais Qdot®), um metal coloidal, um hapteno, um marcador radioativo, biotina e um reagente de amplificação como estreptavidina ou uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina).
[0409] A detecção do marcador em uma amostra que foi incubada com o anticorpo ativável marcado indica que a amostra contém o alvo e contém uma protease específica para a CM do anticorpo ativável. Em algumas modalidades, a presença da protease pode ser confirmada usando inibidores de protease de amplo espectro, como os aqui descritos, e/ou usando um agente que é específico para a protease, por exemplo, um anticorpo como A11, que é específico para a protease matriptase e inibe a atividade proteolítica da matriptase; ver, por exemplo, Publicação Internacional n° WO 2010/129609, publicado em 11 de novembro de 2010. A mesma abordagem do uso de inibidores de protease de amplo espectro, como os aqui descritos, e/ou usando um agente inibidor mais seletivo pode ser usada para identificar uma protease ou classe de proteases específicas para a CM do anticorpo ativável. Em algumas modalidades, a presença do alvo pode ser confirmada usando um agente que é específico para o alvo, por exemplo, outro anticorpo ou o marcador detectável pode ser competido com o alvo não marcado. Em algumas modalidades, o anticorpo ativável não marcado pode ser usado, com detecção por um anticorpo secundário marcado ou por um sistema de detecção mais complexo.
[0410] Técnicas semelhantes também são úteis para imagens in vivo em que a detecção do sinal fluorescente em um indivíduo, por exemplo, um mamífero, incluindo um humano, indica que o local da doença contém o alvo e contém uma protease específica para a CM do anticorpo ativável.
[0411] Essas técnicas também são úteis em kits e/ou como reagentes para a detecção, identificação ou caracterização da atividade da protease em uma variedade de células, tecidos e organismos com base na CM específico da protease no anticorpo ativável.
[0412] Em algumas modalidades, a imagem in situ e/ou a imagem in vivo são úteis em métodos para identificar quais pacientes tratar. Por exemplo, na imagem in situ, os anticorpos ativáveis são usados para rastrear amostras de pacientes para identificar aqueles pacientes com a protease (ou proteases) e alvo (ou alvos) apropriado no local apropriado, por exemplo, no local do tumor.
[0413] Em algumas modalidades, a imagem in situ é usada para identificar ou refinar uma população de pacientes adequada para tratamento com um anticorpo ativável da divulgação. Por exemplo, pacientes com resultado positivo tanto para o alvo quanto para uma protease que cliva o substrato na porção clivável (CM) do anticorpo ativável que está sendo testado (por exemplo, acumulam anticorpos ativados no local da doença) são identificados como candidatos adequados ao tratamento com um anticorpo ativável que compreende tal CM. Da mesma forma, os pacientes com resultado negativo para um ou ambos os alvos e a protease que quebra o substrato na CM no anticorpo ativável sendo testado usando esses métodos são identificados como candidatos adequados para outra forma de terapia (isto é, não são adequados para o tratamento com o anticorpo ativável sendo testado). Em algumas modalidades, esses pacientes que testam negativo em relação a um primeiro anticorpo ativável podem ser testados com outros anticorpos ativáveis compreendendo CMs diferentes até que um anticorpo ativável adequado para tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável compreendendo uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença).
[0414] Em algumas modalidades, a imagem in vivo é usada para identificar ou refinar uma população de pacientes adequada para tratamento com um anticorpo ativável da divulgação. Por exemplo, pacientes com resultado positivo tanto para o alvo quanto para uma protease que cliva o substrato na porção clivável (CM) do anticorpo ativável que está sendo testado (por exemplo, acumulam anticorpos ativados no local da doença) são identificados como candidatos adequados ao tratamento com um anticorpo ativável que compreende tal CM. Da mesma forma, pacientes com resultado negativo são identificados como candidatos adequados para outra forma de terapia (isto é, não adequados para o tratamento com o anticorpo ativável sendo testado). Em algumas modalidades, esses pacientes que testam negativo em relação a um primeiro anticorpo ativável podem ser testados com outros anticorpos ativáveis compreendendo CMs diferentes até que um anticorpo ativável adequado para tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável compreendendo uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença).
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[0415] Os anticorpos, anticorpos conjugados, anticorpos ativáveis e/ou anticorpos ativáveis conjugados da divulgação (também aqui referidos como “compostos ativos”) e derivados, fragmentos, análogos e homólogos dos mesmos, podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração.
[0416] É especialmente vantajoso formular composições orais ou parentéricas na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmaceuticamente aceitável requerido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da divulgação é ditada e diretamente dependente das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico específico a ser alcançado, e das limitações inerentes à técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento de indivíduos.
[0417] As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem ou distribuidor juntamente com instruções para administração.
[0418] A invenção será ainda descrita nas seguintes modalidades e exemplos enumerados, que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.
MODALIDADES ENUMERADAS
[0419] A invenção pode ser definida por referência às seguintes modalidades ilustrativas enumeradas. CONJUNTO I I-1. Um anticorpo ativável conjugado que compreende: (a) um anticorpo ativável (AA) compreendendo em um estado não clivado a disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB, em que: (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente a CD71 de mamífero e compreende a sequência da cadeia pesada da região variável de SEQ ID NO: 5 e a sequência da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7; (ii) MM é um radical dissimulador que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, em que a MM acoplado ao AB inibe a ligação do CD71 ao AB quando o anticorpo conjugado ativável está num estado não clivado; (iii) CM é um radical clivável compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 156 acoplado ao AB em que a CM é um polipeptídio que funciona como um substrato para uma protease; e (b) monometil auristatina E (MMAE), em que o anticorpo ativável é conjugado com dois equivalentes de MMAE. (c) . Uma composição que compreende: um anticorpo ativável conjugado com a fórmula AA-(AG)p em que (a) AA é um anticorpo ativável compreendendo em um estado não clivado a disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB, em que: (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 de mamífero e compreende a sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5 e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 7, (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 18, em que a MM acoplado ao AB inibe a ligação do AB ao CD71 quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado, e (iii) CM é um radical clivável compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 156 acoplado ao AB em que a CM é um polipeptídio que funciona como um substrato para uma protease; e (b) AG é um agente conjugado ao AA, em que o agente é MMAE e em que p é 2. I-3. Um método para fabricar um anticorpo ativável conjugado compreendendo: conjugando pelo menos uma MMAE a um anticorpo ativável (AA) produzindo assim uma composição compreendendo AA- (MMAE) p, em que p é 1 a 8; e enriquecer a composição para as espécies de anticorpos ativáveis conjugados em que p é 2, em que AA compreende em um estado não clivado compreende a disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM-CM-AB em que: (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 de mamífero e compreende a sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 5 e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 7, (ii) MM é uma porção de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM acoplado ao AB que inibe a ligação do AB ao CD71 quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado e (iii) CM é uma porção clivável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 156 acoplada ao AB em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease. I-4. O anticorpo ativável conjugado da modalidade I-1 ou a composição da modalidade I-2 ou o método da modalidade I-3, em que o AB compreende a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 20. I-5. O anticorpo ativável conjugado da modalidade I-1 ou a composição da modalidade I-2 ou o método da modalidade I-3, em que o AB compreende a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 167. I-6. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1, I-4 e I-5 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2, I-4 e I-5 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-5, em que o AB compreende a sequência de cadeia leve da SEQ ID NO: 19. I-7. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I4 a I-6 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-6 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a 6, em que o AA compreende um peptídeo de ligação LP1 entre o AB e a MM. I-8. O anticorpo ativável conjugado ou composição ou método da modalidade I-7, em que o LP1 compreende a sequência de aminoácidos de GGGSSGGS (SEQ ID NO: 207). I-9. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e 4 a 8 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-8 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-8, em que o AA compreende um peptídeo de ligação LP2 entre o AB e a CM. I-10. O anticorpo ativável conjugado ou composição ou método da modalidade I-9, em que o LP2 compreende a sequência de aminoácidos de GGGS (SEQ ID NO: 38). I-11. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-10 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-10 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-10, em que o AA compreende um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e em que o AA no estado não clivado tem a disposição estrutural do terminal N ao terminal C da seguinte maneira: MM -LP1-CM-LP2-AB. I-12. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-11 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-11 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-11, em que o anticorpo ativável compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência espaçadora selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 138 e 143 a 145 e GQG. I-13. O anticorpo ativável conjugado ou composição ou método da modalidade I-12, em que a sequência espaçadora é N-terminal para a MM. I-14. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-13 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-13 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-13, em que o anticorpo ativável compreende a sequência da região variável da cadeia leve das SEQ ID NOs: 201. I-15. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-13 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-13 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-13, em que o anticorpo ativável compreende a sequência da região variável da cadeia leve das SEQ ID NOs: 202. I-16. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-13 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-13 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-13, em que o anticorpo ativável compreende a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 169. I-17. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-13 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-13 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-13, em que o anticorpo ativável compreende a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 170. I-18. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-17 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-17 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-17, em que o AB se liga especificamente a CD71 humano e CD71 macaco cinomolgo. I-19. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-18 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e 4 a 18 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-18, em que a MM tem uma constante de dissociação para ligação ao AB que é maior que a constante de dissociação do AB ao CD71. I-20. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-19 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-19 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-19, em que a MM não interfere ou compete com o AB pela ligação a CD71 quando o anticorpo ativável está em um estado clivado. I-21. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-20 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-20 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-20, em que a MM é um polipeptídeo de não mais que 40 aminoácidos de comprimento. I-22. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-21 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-21 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-21, em que a CM é um substrato para uma protease que é ativa no tecido doente. I-23. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-22 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-22 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-22, em que o agente é conjugado ao AB via um ligante. I-24. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-23 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-23 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-23, em que o ligante com o qual o agente está conjugado com o AB compreende uma porção valina-citrulina. I-25. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-24 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-24 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-24, em que o ligante com o qual o agente está conjugado com o AB compreende uma porção maleimida caproil-valina- citrulina. I-26. O anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-25 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-25 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-25, em que o ligante com o qual o agente está conjugado com o AB compreende uma porção maleimida caproil-valina- citrulina para aminobenziloxicarbonila. I-27. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que pelo menos 50% do anticorpo ativável conjugado da composição é de as espécies quando p é 2. I-28. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que pelo menos 75% do anticorpo ativável conjugado da composição é de as espécies quando p é 2. I-29. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que pelo menos 90% do anticorpo ativável conjugado da composição é de as espécies quando p é 2. I-30. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que pelo menos 95% do anticorpo ativável conjugado da composição é de as espécies quando p é 2. I-31. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que pelo menos 98% do anticorpo ativável conjugado da composição é de as espécies quando p é 2. I-32. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que os equivalentes de cada uma das espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição em que p é 1 ou 3 a 8 é menor que os equivalentes das espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição em que p é 2. I-33. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que as espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição na qual p é 1 ou 3 a 8 é menor que os equivalentes das espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição na qual p é 2. I-34. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que menos de 50% das espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição é das espécies quando p é 1 ou 3 a 8. I-35. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que menos de 25% das espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição é das espécies quando p é 1 ou 3 a 8. I-36. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que menos de 10% das espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição é das espécies quando p é 1 ou 3 a 8. I-37. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que menos de 5% das espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição é das espécies quando p é 1 ou 3 a 8. I-38. A composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-26 ou o método de qualquer uma das modalidades I-3 a I-26, em que menos de 2% das espécies de anticorpos ativáveis conjugados da composição é das espécies quando p é 1 ou 3 a 8. I-39. Uma composição farmacêutica que compreende: o anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-26 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-38; e um veículo. I-40. Um método para tratar, aliviar um sintoma ou retardar a progressão de um câncer em um indivíduo, em que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades I-1 e I-4 a I-26 ou a composição de qualquer uma das modalidades I-2 e I-4 a I-38 ou a composição farmacêutica da modalidade I-39 a um indivíduo em necessidade da mesma. I-41. O método da modalidade I-40, em que o câncer é um câncer gástrico. I-42. O método da modalidade I-40, em que o câncer é um câncer de ovário. I-43. O método da modalidade I-40, em que o câncer é um câncer de esôfago. I-44. O método da modalidade I-40, em que o câncer é um câncer de pulmão de células não pequenas. I-45. O método da modalidade I-40, em que o câncer é um câncer de mama. I-46. O método da modalidade I-40, em que o câncer é um câncer colorretal. I-47. O método da modalidade I-40, em que o câncer é um melanoma. I-48. O método da modalidade I-40, em que o câncer é um câncer de próstata. I-49. O método da modalidade I-40, em que o câncer é um mesotelioma. CONJUNTO II II-1. Um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo:
Figure img0013
Fórmula (I) (a) em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende i. uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência de CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência de CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11; e ii. uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15; (ii) MM é uma porção de mascaramento que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) LP1 é uma primeira porção de ligação que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM é uma porção clivável que compreende a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (v) LP2 é uma segunda porção de ligação que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e (b) em que “n” é 2. II-2. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-1, em que o AB compreende um isotipo IgG1. II-3. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-1 ou II-2, em que o AB é um anticorpo com uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C- terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. II-4. Um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo:
Figure img0014
(a) em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 7; (ii) MM é uma porção de mascaramento que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) LP1 é uma primeira porção de ligação que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM é uma porção clivável que compreende a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (v) LP2 é uma segunda porção de ligação que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e (b) em que “n” é 2. II-5. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-4, em que o AB compreende um isotipo IgG1. II-6. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-4 ou II-5, em que o AB é um anticorpo com uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C- terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. II-7. Um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo:
Figure img0015
(a) em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 19; (ii) MM é uma porção de mascaramento que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) LP1 é uma primeira porção de ligação que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM é uma porção clivável que compreende a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (v) LP2 é uma segunda porção de ligação que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e (b) em que “n” é 2. II-8. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-7, em que o AB compreende um isotipo IgG1. II-9. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-7 ou II-8, em que o AB é um anticorpo com uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C- terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. II-10. Um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo:
Figure img0016
em que MM-LP1-CM-LP2-AB é um anticorpo ativável, em que o AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano, em que o anticorpo ativável compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 170, e em que “n” é 2. II-11. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-10, em que o AB compreende um isotipo IgG1. II-12. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-10 ou II-11, em que o AB é um anticorpo com uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. II-13. Um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo:
Figure img0017
(a) em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende i. uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência de CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência de CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11; e ii. uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15; (ii) MM é uma porção de mascaramento que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; e (iii) CM é uma porção clivável que compreende a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) em que “n” é 2. (c) 14. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-13, em que o AB compreende um isotipo IgG1. (d) 15. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-13 ou II-14, em que o AB é um anticorpo com uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. II-16. Um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (IQ ou um sal do mesmo:
Figure img0018
(a) em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 7; (ii) MM é uma porção de mascaramento que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; e (iii) CM é uma porção clivável que compreende a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) em que “n” é 2. II-17. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-16, em que o AB compreende um isotipo IgG1. II-18. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-16 ou II-17, em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. II-19. Um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo:
Figure img0019
(a) em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 19; (ii) MM é uma porção de mascaramento que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; e (iii) CM é uma porção clivável que compreende a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) em que “n” é 2. II-20. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-19, em que o AB compreende um isotipo IgG1. II-21. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-19 ou II-20, em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. II-22. Um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo:
Figure img0020
em que MM-CM-AB é um anticorpo ativável, em que o AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano, em que o anticorpo ativável compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 169, e em que “n” é 2. II-23. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-22, em que o AB compreende um isotipo IgG1. II-24. O anticorpo ativável conjugado da modalidade II-22 ou II-23, em que o AB é um anticorpo que possui uma região constante da cadeia pesada e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina. II-25. Um método para fabricar um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (I) ou um sal do mesmo:
Figure img0021
(a) em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende i. uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência de CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência de CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11; e ii. uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15; (ii) MM é uma porção de mascaramento que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) LP1 é uma primeira porção de ligação que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM é uma porção clivável que compreende a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (v) LP2 é uma segunda porção de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e em que “n” é 2; (b) em que o método compreende (i) redução de um anticorpo ativável que compreende MM-LP1-CM-LP2-AB com um agente redutor; e (ii) conjugação de um ou mais vcMMAEs ao anticorpo ativável reduzido. II-26. Um método para fabricar um anticorpo ativável conjugado que compreende a estrutura da Fórmula (II) ou um sal do mesmo:
Figure img0022
(a) em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende i. uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência de CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência de CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11; e ii. uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15; (ii) MM é uma porção de mascaramento que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) CM é uma porção clivável que compreende a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e e em que “n” é 2; (b) em que o método compreende (i) redução de um anticorpo ativável que compreende MM-CM-AB com um agente redutor; e (ii) conjugação de um ou mais vcMMAEs ao anticorpo ativável reduzido. II-27. Uma composição farmacêutica compreendendo: o anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades II-1 a II-24; e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. II-28. Um método para tratar, aliviar um sintoma ou retardar a progressão de um câncer em um indivíduo, o método que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades II-1 a II-24 ou do produto farmacêutico composição da modalidade II-27 a um indivíduo em necessidade do mesmo para um câncer selecionado do grupo que consiste em: câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama ER+, câncer de mama triplo negativo, câncer colorretal, melanoma, câncer de próstata, mieloma múltiplo, linfoma difuso de células B grandes, carcinoma de células pequenas de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas, mesotelioma, linfoma não Hodgkin, carcinoma hepatocelular e glioblastoma. II-29. Um anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades II-1 a II-24 ou uma composição farmacêutica da modalidade II-27, para uso como um medicamento. II-30. Um anticorpo ativável conjugado de qualquer uma das modalidades II-1 a II-24, ou uma composição farmacêutica da modalidade II-27, para uso no tratamento de câncer, opcionalmente em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em: câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama ER+, câncer de mama triplo negativo, câncer colorretal, melanoma, câncer de próstata, mieloma múltiplo, linfoma difuso de células B grandes, carcinoma de células pequenas de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas, mesotelioma, linfoma não Hodgkin, carcinoma hepatocelular e glioblastoma.
EXEMPLOS EXEMPLO 1. ANTICORPOS ATIVÁVEIS CONJUGADOS ANTI-CD71 (AADCs)
[0420] Os estudos aqui fornecidos foram projetados para produzir alguns dos anticorpos ativáveis conjugados anti-CD71 da divulgação.
[0421] Como descrito no Pedido de Patente n° U.S. 2016/0355599 A1, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade, foi obtido um anticorpo monoclonal anti-CD71 M21 utilizando a tecnologia de hibridoma de camundongo, de acordo com as técnicas conhecidas na técnica. Os camundongos foram imunizados com o domínio extracelular CD71 humano (ECD) e os hibridomas subsequentes foram triados usando um ensaio piggyback de citotoxicidade, e os clones positivos para citotoxicidade deste ensaio foram confirmados por ELISA para ligar o polipeptídeo ECD CD71 humano e confirmados para ligação das superfícies celulares por FACS. O anticorpo monoclonal anti-CD71 M21 inclui uma região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 1 e uma região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 2.
[0422] Também foram testados os seguintes anticorpos anti-CD71 humanizados, que foram baseados no anticorpo monoclonal M21 de camundongo anti-CD71: Ab21.10 LcB: HcA (VH da SEQ ID NO: 3 e VL da SEQ ID NO: 7), Ab21.11 LcB: HcB (VH da SEQ ID NO: 4 e VL da SEQ ID NO: 7), Ab21.12 LcB:HcC (VH da SEQ ID NO: 5 e VL da SEQ ID NO: 7) e M21 (VH da SEQ ID NO: 1 e VL da SEQ ID NO: 2). A capacidade de vários anticorpos anti-CD71 da divulgação de se ligar ao CD71 da superfície celular foi confirmada por FACS.
[0423] Todos os anticorpos anti-CD71 humanizados mostraram ligação ao CD71 humano e cinomolgo que era comparável à ligação demonstrada pelo anticorpo de camundongo M21 CD71. A ligação dos anticorpos anti-CD71 humanizados foi confirmada na linha celular BxPC3 por FACS. Resumidamente, as células BxPC3 foram marcadas com o anticorpo monoclonal de camundongo Mab21 ou huCD71 (Ab21.10, Ab21.11 e Ab21.12) nas concentrações indicadas e subsequentemente detectadas com um anticamundongo de cabra marcado com Alexa Fluor 647 ou IgG anti-humano Alexa Fluor 647, respectivamente.
[0424] Em um estudo exemplificador, a atividade de ligação de anti-CD71 Ab21.12 LcB:HcC (VH da SEQ ID NO: 5 e VL da SEQ ID NO: 7) ao CD71 recombinante (usando ELISA) e células que expressam CD71 (usando fluxo citometria) a partir de fontes humanas, de macaco cinomolgo, camundongo e rato foram medidas. Como mostrado nos resultados exemplificadores da Tabela 1, o anticorpo anti-CD71 ligou o CD71 recombinante humano e de macaco com afinidade equivalente conforme medido por ELISA, e que eram equivalentes à afinidade da holo- transferrina humana ao CD71 humano. O anticorpo ligou as linhagens celulares expressando CD71 humano e macaco (células cancerígenas pancreáticas BxPC3 humanas e células epiteliais renais primárias de macaco cinomolgo, respectivamente) com afinidade equivalente, medida por citometria de fluxo. Nenhuma ligação significativa pelo anticorpo anti-CD71 foi medida para CD71 recombinante de camundongo ou uma linha celular de expressão de CD71 de camundongo (taxa de células de hepatoma H-4-11-E). TABELA 1: LIGAÇÃO DE ANTI-CD71 A CD71 HUMANO, DE MACACO, RATO E CAMUNDONGO POR ELISA E CITOMETRIA DE FLUXO E LIGAÇÃO DE
Figure img0023
EXEMPLO 2. REVELAÇÃO DA MÁSCARA
[0425] Os estudos aqui fornecidos foram projetados para identificar e caracterizar porções de mascaramento para uso em anticorpos anti-CD71 ativáveis da divulgação.
[0426] Como descrito no Pedido de Patente n° U.S. 2016/0355599 A1, o anticorpo anti-CD71 21.12, compreendendo uma VH da SEQ ID NO: 5 e uma VL da SEQ ID NO: 7, foi usado para triar uma biblioteca de peptídeos X15 aleatória com uma diversidade total de 6x1010, em que X é qualquer aminoácido, usando um método semelhante ao descrito na Publicação Internacional PCT n° WO 2010/081173, publicado em 15 de julho de 2010. A triagem consistiu em uma rodada de MACS e cinco rodadas de classificação FACS. A triagem inicial de MACS foi feita com Dynabeads de proteína A (Invitrogen) e o anticorpo anti-CD71 21.12 a uma concentração de 200 nM. Para MACS, aproximadamente 1x1012 células foram rastreadas quanto à ligação e 1x107 células foram coletadas. O anti-CD71 21.12 foi conjugado com DyLight-488 (ThermoFisher), a atividade de ligação ao CD71 foi confirmada e o anti-CD71 21.12-488 foi usado como uma sonda fluorescente para todas as rodadas FACS. As células bacterianas foram coradas e os clones positivos foram coletados da seguinte forma: 20 nM de anti-CD71 21.12-488 com 1x106 células coletadas na rodada FACS 1, 5 nM de anti-CD71 21.12-488 com 6,2x104 células coletadas na rodada FACS 2 e 5 nM de anti-CD71 21.12-488 com 5x103 células e 1 nM de anti-CD71 21.12-488 com 5x102 células coletadas na rodada FACS 3, 1 nM de anti-CD71 21.12-488 com >2x102 células coletadas nas rodadas FACS 4 e 5. Verificou-se que a população positiva da segunda rodada FACS inibe a ligação do anticorpo anti-CD71 21.12-488 à proteína CD71 recombinante. Os clones peptídicos individuais foram identificados por análise de sequência dos ligantes 5 nM da rodada FACS 3 e dos ligantes 1 nM das rodadas FACS 3, 4 e 5.
[0427] As frações de máscara identificadas incluem TF01 (QFCPWSYYLIGDCDI; SEQ ID NO: 16) e TF02 (NLCTEHSFALDCRSY; SEQ ID NO: 17). As máscaras TF01 e TF02 foram truncadas e escaneadas com alanina para gerar famílias de anticorpos ativáveis com diferentes eficiências de mascaramento, incluindo a porção de mascaramento TF02.13 (NLCTEHSAALDCRSY; SEQ ID NO: 18).
[0428] Esses peptídeos mascaradores foram usados para gerar anticorpos ativáveis anti-CD71 da divulgação. As sequências para alguns desses anticorpos ativáveis anti-CD71 são mostradas abaixo na Tabela A. Em algumas modalidades, esses anticorpos ativáveis anti-CD71 incluem a porção clivável 2001 (ISSGLLSGRSDNH; SEQ ID NO: 91), a porção clivável 3001 (AVGLLAPPGGLSGRSDNH; SEQ ID NO: 97), porção clivável 2011 (ISSGLLSGRSDNP; SEQ ID NO: 156) ou a porção clivável 3011 (AVGLLAPPGGLSGRSDNP; SEQ ID NO: 164), como indicado.
[0429] Embora certas sequências mostradas abaixo incluam a sequência espaçadora da SEQ ID NO: 138, os versados na técnica apreciam que os anticorpos anti-CD71 ativáveis da divulgação podem incluir qualquer sequência espaçadora adequada, como, por exemplo, uma sequência espaçadora selecionada do grupo que consiste em QGQSGQG (SEQ ID NO: 138), QGQSGQ (SEQ ID NO: 109), QGQSG (SEQ ID NO: 139), QGQS (SEQ ID NO: 140), QGQ, QG, GQSGQG (SEQ ID NO: 143), QSGQG (SEQ ID NO: 144), SGQG (SEQ ID NO: 145), GQG, G ou Q. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD71 ativáveis da divulgação não podem ter uma sequência espaçadora ligada a seu terminal N.
QUADRO A. SEQUÊNCIAS DE ANTICORPOS ATIVÁVEIS ANTI-CD71
[0430] Região variável da cadeia pesada HuCD71_HcC Sequência de Aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWI GAIYPGNSETGYAQKFQGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRENWDP GFAFWGQGTLITVSS (SEQ ID NO: 5) Sequência nucleotídica CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGC CTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGAT GCACTGGGTGCGACAGGCTCCAGGCCAGGGCCTCGAATGGATCGGCGCCATC TACCCCGGCAACTCCGAGACAGGCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCCAC CCTGACCGCCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGC GGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGAGAGAACTGGGACCCCGG CTTCGCCTTCTGGGGCCAGGGCACCCTGATCACCGTGTCCTCC (SEQ ID NO: 206) Cadeia pesada HuCD71_HcC-des Sequência de Aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWI GAIYPGNSETGYAQKFQGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRENWDP GFAFWGQGTLITVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ ID NO: 167) Sequência nucleotídica CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGC CTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGAT GCACTGGGTGCGACAGGCTCCAGGCCAGGGCCTCGAATGGATCGGCGCCATC TACCCCGGCAACTCCGAGACAGGCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCCAC CCTGACCGCCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGC GGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGAGAGAACTGGGACCCCGG CTTCGCCTTCTGGGGCCAGGGCACCCTGATCACCGTGTCCTCCGCCAGCACCA AGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGC ACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCACACCTTCCCTGCCGTGC TGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCC AGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACAC CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTC CTCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCC CCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGT GGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGG ACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAAC TCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAA CGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCG AAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACA CTGCCACCTAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCT GGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCC AGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAA CGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGA AGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC (SEQ ID NO: 168) Cadeia pesada HuCD71_HcC Sequência de Aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWI GAIYPGNSETGYAQKFQGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRENWDP GFAFWGQGTLITVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 20) Sequência nucleotídica CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGC CTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGAT GCACTGGGTGCGACAGGCTCCAGGCCAGGGCCTCGAATGGATCGGCGCCATC TACCCCGGCAACTCCGAGACAGGCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCCAC CCTGACCGCCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGC GGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGAGAGAACTGGGACCCCGG CTTCGCCTTCTGGGGCCAGGGCACCCTGATCACCGTGTCCTCCGCCAGCACCA AGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGC ACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCACACCTTCCCTGCCGTGC TGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCC AGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACAC CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTC CTCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCC CCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGT GGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGG ACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAAC TCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAA CGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCG AAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACA CTGCCACCTAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCT GGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCC AGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAA CGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGA AGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAG (SEQ ID NO: 21) HuCD71_LcB Sequência de Aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTS NLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 19) HuCD71_LcB Sequência nucleotídica GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGC GACAGAGTGACAATCACCTGTTCCGCCAGCTCCTCCGTGTACTACATGTACTGG TTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGTGGATCTACTCCACCTCCAA CCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACT ACACCCTGACCATCTCCAGCATGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGC CAGCAGCGGCGGAACTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAAT CAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGC AGCTGAAGTCCGGCACCGCCAGCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCC CGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACT CCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCC TCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTG CGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGCG GCGAGTGC (SEQ ID NO: 208) Cadeia leve de anticorpo ativável anti-CD71-TF01-2001 [espaçador (SEQ ID NO: 138)] [huCD71Lc_TF01_2001 (SEQ ID NO: 141)] Sequência de Aminoácidos [QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSD IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGV PSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID NO: 22) Cadeia leve de anticorpo ativável anti-CD71-TF02.13-2001 [espaçador (SEQ ID NO: 138)] [huCD71Lc_TF02.13_2001 (SEQ ID NO: 142)] Sequência de aminoácidos [QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASG VPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID NO: 23) Cadeia leve de anticorpo ativável anti-CD71-TF02.13-3011 [espaçador (SEQ ID NO: 138)] [huCD71Lc_TF02.13_3011 (SEQ ID NO: 146)] Sequência de aminoácidos [QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDN PGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSN LASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID NO: 147) Cadeia leve de anticorpo ativável anti-CD71-TF02.13-2011 [espaçador (SEQ ID NO: 138)] [huCD71Lc_TF02.13_2011 (SEQ ID NO: 169)] Sequência de aminoácidos [QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASG VPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID NO: 170) Cadeia leve de anticorpo ativável anti-CD71-TF01-3011 [espaçador (SEQ ID NO: 138)] [huCD71Lc_TF01_3011 (SEQ ID NO: 173)] Sequência de aminoácidos [QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNP GGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNL ASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID NO: 174) Região variável de cadeia leve de anticorpo ativável anti-CD71-TF02.13-2001 [espaçador (SEQ ID NO: 138)] [domínio Vu huCD71Lc_TF02.13_2001 (SEQ ID NO: 197)] Sequência de aminoácidos [QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASG VPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 198) Região variável da cadeia leve de anticorpo ativável anti-CD71-TF02.13-3011 [espaçador (SEQ ID NO: 138)] [domínio Vu huCD71Lc_TF02.13_3011 (SEQ ID NO: 199)] Sequência de aminoácidos [QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDN PGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSN LASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 200) Região variável da cadeia leve de anticorpo ativável anti-CD71-TF02.13-2011 [espaçador (SEQ ID NO: 138)] [domínio Vu huCD71Lc_TF02.13_2011 (SEQ ID NO: 201)] Sequência de aminoácidos [QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASG VPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 202) Região variável da cadeia leve de anticorpo ativável anti-CD71-TF01-2001 [espaçador (SEQ ID NO: 138)] [domínio VL huCD71Lc_TF01_2001 (SEQ ID NO: 195)] Sequência de Aminoácidos [QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSD IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGV PSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 196) Região variável da cadeia leve de anticorpo ativável anti-CD71-TF01-3011 [espaçador (SEQ ID NO: 138)] [domínio Vu huCD71Lc_TF01_3011 (SEQ ID NO: 203)] Sequência de aminoácidos [QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNP GGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNL ASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 204)
EXEMPLO 3. GERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS ATIVÁVEIS ANTI-CD71 ATIVÁVEIS E ANTICORPOS ATIVÁVEIS CONJUGADOS ANTI-CD71
[0431] Os estudos aqui fornecidos foram projetados para gerar alguns anticorpos ativáveis anti-CD71 da divulgação.
[0432] Os anticorpos ativáveis anti-CD71 foram gerados com diferentes eficiências de mascaramento (isto é, uma medição da capacidade da MM do anticorpo ativável de bloquear a ligação do AB do anticorpo ativável ao seu alvo). Os peptídeos TF01 e TF02 foram mutados por truncagem e varredura de alanina, como descrito no Exemplo 2, e essas variantes de peptídeo mascarador foram usadas para gerar famílias de anticorpos ativáveis anti-CD71 da presente divulgação com uma variedade de eficiências de mascaramento.
[0433] A ligação de anticorpos ativáveis anti-CD71 da presente divulgação à linha celular NCI H292 (também aqui referida como H292) foi avaliada usando FACS. Resumidamente, as células foram marcadas com anticorpo huCD71 ou anticorpo ativável em uma variedade de concentrações e subsequentemente detectadas com um anticorpo secundário anti-IgG humano anti-IgG de cabra marcado com Alexa Fluor 647 para determinar uma curva de ligação. Como resumido nos dados de ligação exemplificativos abaixo na Tabela 2, os anticorpos ativáveis por anti-CD71 da presente divulgação mostram uma gama de eficiências de mascaramento em comparação com o anticorpo anti-CD71 parental (huCD71 21.12 Ab). TABELA 2: EFICIÊNCIA DE MASCARAMENTO DE PORÇÕES DE MASCARAMENTO
Figure img0024
[0434] Estes dados exemplificadores na Tabela 2 mostram que ambas as máscaras (TF01 e TF02.13) inibem a ligação do anticorpo anti-CD71 ao CD71 quando o anticorpo ativável está em um estado intacto ou não clivado. Estes dados exemplificadores também demonstram que a porção de mascaramento TF01 demonstra uma eficiência de mascaramento mais alta que a porção de mascaramento TF02.13.
EXEMPLO 4: CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DO ANTICORPO ATIVÁVEL CD71 E DO ANTICORPO ATIVÁVEL CONJUGADO CD71
[0435] Este exemplo mostra que os anticorpos ativáveis anti-CD71 e os anticorpos ativáveis conjugados anti-CD71 da presente divulgação demonstraram menor afinidade de ligação à proteína recombinante e de superfície celular e humana CD71 do cinomolgo quando na sua forma intacta e não clivada, em comparação com as suas formas clivadas correspondentes à protease.
[0436] Como mostrado nas Figuras 3A e 3B, um ensaio de ligação em fase sólida (ELISA) foi usado para demonstrar a afinidade de ligação de anticorpos ativáveis anti-CD71 e anticorpos ativáveis conjugados anti-CD71 da presente divulgação ao CD71 recombinante, tanto em suas formas intactas não clivadas quanto em suas formas clivadas ativadas por protease. Nesses exemplos, a proteína recombinante de cinomolgo (FIGURA 3B) ou CD71 humana (FIGURA 3A) (Sistemas de P&D) foi revestida em placas ELISA a uma concentração de 1 μg/ml e, em seguida, incubada com a concentração indicada de anti-CD71 anticorpo ativável (“anti-CD71- TF02.13-2011”) da presente divulgação ou intacto, E2 não clivada (isto é, tendo um DAR de ~2) anti-CD71 conjugado anticorpo ativável (“anti-CD71 -TF02.13-2011-vc- MMAE E2”) da presente divulgação. Também foram testados o anticorpo ativável anti- CD71 (“anti-CD71-TF02.13-2011 (Act)”) ou E2 (ou seja, com um DAR de ~ 2) anticorpo ativável conjugado anti-CD71 (“anti-CD71-TF02.13-2011 (Act)”) da presente divulgação após o tratamento com uma protease que clivou a porção clivável do componente anticorpo ativável.
[0437] Como discutido aqui, “E2” refere-se a uma composição de um determinado anticorpo ativável conjugado anti-CD71 da presente divulgação que inclui essencialmente apenas as espécies do anticorpo ativável conjugado em que a carga do medicamento é de 2 moléculas de medicamento para cada molécula de anticorpo ativável, e essencialmente não inclui nenhuma quantidade ou quantidade mínima de outras espécies possíveis (ou seja, quando a carga do medicamento é 0, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 etc.) Como discutido aqui, “DAR” refere-se à média relação entre a fármaco (neste caso, MMAE) e o anticorpo ativável (isto é, CD71-TF02.13-2011) em uma população desses anticorpos ativáveis conjugados. Assim, neste exemplo, anti-CD71-TF02.13- 2011-vc-MMAE E2 refere-se a uma composição que inclui apenas anticorpo ativável anti-CD71-TF02.13-2011 em que cada anticorpo ativável tinha um medicamento carga de 2 equivalentes de vc-MMAE e um DAR de cerca de 2, conforme descrito no Exemplo 26.
[0438] A quantidade de anticorpo ligado em cada amostra foi detectada por incubação e detecção por anticorpo anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre e detecção Ultra TMB (Thermo Fisher Scientific). Um resumo das afinidades de ligação é mostrado abaixo: TABELA 3A: ATIVIDADE DE LIGAÇÃO A CD71 OBSERVADA EXEMPLARMENTE DE ANTICORPOS ATIVÁVEIS ANTI-CD71 NÃO CLIVADOS E CLIVADOS E ANTICORPOS ATIVÁVEIS CONJUGADOS ANTI-CD71
Figure img0025
[0439] As figuras 3C e 3D mostram em um ensaio FACS os resultados exemplificadores de que anticorpos ativáveis anti-CD71 da presente divulgação e anticorpos ativáveis conjugados anti-CD71 da presente divulgação ligam células que expressam CD71 humano (FIGURA 3C) e CD71 de cinomolgo (FIGURA 3D) com uma constante de dissociação mais alta e uma afinidade menor do que a do anticorpo ativável anti-CD71 ativado por protease correspondente ou o anticorpo ativável conjugado anti-CD71 ativado por protease da presente divulgação. Estes resultados exemplificadores mostram que a afinidade de ligação dos anticorpos ativáveis anti- CD71 ativados por protease da presente divulgação e os anticorpos ativáveis conjugados anti-CD71 ativados por protease da presente divulgação ligados às células a uma afinidade semelhante à do anticorpo anti-CD71 parental, demonstrando assim o efeito da porção de mascaramento na inibição da ligação do anti-CD71 ao seu alvo no anticorpo ativável intacto ou anticorpo ativável conjugado intacto.
[0440] No estudo exemplificador mostrado nas Figuras 3C e 3D, a ligação dos anticorpos da presente divulgação às linhagens celulares indicadas foi realizada utilizando um método de marcação FACS padrão. Resumidamente, as células foram marcadas com os anticorpos indicados ou anticorpos ativáveis da presente divulgação: um anticorpo de controle (AB095), um anticorpo anti-CD71 humano (Ab 21.12, com um VH da SEQ ID NO: 5 e uma VL da SEQ ID NO: 7), um anticorpo ativável anti-CD71 (anti-CD71 TF02.13-2011) ou um E2 (ou seja, com um DAR de ~ 2) anticorpo ativável conjugado anti-CD71 (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2). Além disso, a afinidade de ligação do anticorpo ativável anti-CD71 (anti-CD71 TF02.13-2011 (Act)) e do E2 (isto é, com um DAR de ~ 2) anticorpo ativável conjugado anti-CD71 (anti-CD71 TF02. 13-2011-vcMMAE E2 (Act)) também foram testados após a ativação da protease que clivou a porção clivável no mesmo. Cada artigo de teste foi aplicado nas concentrações indicadas e subsequentemente detectado com um anticorpo secundário anti-IgG humano de cabra marcado com Alexa Fluor 647.
[0441] A Tabela 3B abaixo mostra os valores de EC50 com base nas curvas de ligação representadas nas FIGURAS 3C para 3D. Estes resultados mostram que o anticorpo ativável intacto e o anticorpo ativável conjugado intacto se ligam ao seu alvo com menor afinidade do que seus pares ativados por protease, e que os anticorpos ativáveis ativados por protease se ligam a uma afinidade semelhante à do anticorpo anti-CD71 parental. TABELA 3B: ATIVIDADE DE LIGAÇÃO CD71 OBSERVADA EXEMPLIFICATIVA DE LIGANTES ANTI-CD71
Figure img0026
[0442] Em um estudo exemplar semelhante, os testes ELISA e citometria de fluxo foram usados para demonstrar a afinidade de ligação dos anticorpos anti-CD71, anticorpos conjugados anti-CD71, anticorpos ativáveis anti-CD71 (forma intacta, não clivada e forma ativada por protease) e anticorpos ativáveis conjugados anti-CD71 (forma intacta, não clivada e forma clivada ativada por protease) da presente divulgação para linhagens celulares que expressam CD71 recombinante para CD71 humano e cinomolgo recombinante e CD71 humano e cinomolgo. Os artigos de teste foram o anticorpo anti-CD71 Ab21.12 (VH da SEQ ID NO: 5 e uma VL da SEQ ID NO: 7), o anticorpo conjugado anti-CD71 Ab21.12-vcMMAE E2 (ou seja, tendo um DAR de ~ 2), o anticorpo ativável anti-CD71-TF02.13-2011 e o anticorpo ativável conjugada DAR2 anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (ou seja, tendo um DAR de ~ 2).
[0443] Nos exemplos de ELISA, proteínas ECD de CD71 cinomolgo ou humano recombinante foram revestidas em placas de ELISA e depois incubadas com uma de uma gama de concentrações dos artigos de teste da presente divulgação, seguida pela medição da quantidade de artigo de teste ligado com um secundário anticorpo. Os artigos de teste que foram ativados foram incubados com a enzima protease da matriptase. Os valores aparentes de Kd aparentes para cada artigo de teste são mostrados na Tabela 3C.
[0444] No estudo exemplificador também mostrado na Tabela 3C, a ligação dos anticorpos da presente divulgação às linhagens celulares indicadas foi realizada usando um método de marcação FACS padrão. Os resultados da citometria de fluxo refletem o Kapp medido médio de quatro linhagens celulares humanas (câncer de mama humano HCC1806, câncer colorretal humano HT-29, câncer de pulmão humano NCI-H292 e câncer de pulmão humano NCI-H520) e uma linha celular CHO- K1 que expressa CD71 de macaco cinomolgo. Os valores aparentes de Kd aparentes para cada artigo de teste são mostrados na Tabela 3C. TABELA 3C: ATIVIDADE DE LIGAÇÃO CD71 OBSERVADA EXEMPLIFICATIVA DE ANTICORPOS ANTI-CD71, ANTICORPOS CONJUGADOS ANTI-CD71, ANTICORPOS ATIVÁVEIS ANTI-CD71 NÃO CLIVADOS E CLIVADOS E ANTICORPOS ATIVÁVEIS CONJUGADOS ANTI-CD71
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[0445] Estes resultados exemplificadores mostram que os anticorpos ativáveis intactos e os anticorpos ativáveis conjugados intactos mostraram uma afinidade aparente menor ao CD71 em comparação com os seus homólogos ativados ou seus anticorpos parentais.
EXEMPLO 5: EXPRESSÃO CD71 EM VÁRIOS TUMORES PRIMÁRIOS E METASTÁTICOS DERIVADOS DE PACIENTES
[0446] Este exemplo mostra que o CD71 é expresso em uma grande variedade de tipos de tumores primários e metastáticos por coloração imuno- histoquímica (IHC) usando um anticorpo anti-CD71.
[0447] As Figuras 1 e 2 mostram que CD71 é altamente expresso em um grande número de amostras de tumor primário e metastático, usando coloração IHC com um anticorpo anti-CD71 adquirido comercialmente em vários tumores primários derivados de pacientes e microarranjos de tecidos metastáticos derivados de pacientes (TMA). A Figura 1 mostra uma coloração IHC de CD71 no câncer de cabeça e pescoço (1), câncer cervical (2), câncer de mama (3), linfoma não Hodgkin (NHL) nos linfonodos (4), câncer de pulmão (5), um câncer de bexiga (6), um câncer de ovário (7) e um câncer de esôfago (8). A Figura 2 mostra uma coloração IHC de CD71 em um microarranjo de tecidos (TMA) consistindo em núcleos de tumores metastáticos demonstrando um nível de expressão moderado a alto de CD71 na maioria dos núcleos. Um resumo da expressão de CD71 em amostras de tumores humanos por imuno-histoquímica (IHC) é mostrado na Tabela 4A. TABELA 4A: RESUMO DA EXPRESSÃO DE CD71 EM AMOSTRAS DE TUMOR HUMANO POR IHC
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EXEMPLO 6: EFICIÊNCIA DE MASCARAMENTO E EFICÁCIA IN VIVO DE ANTI-CD71-AADC NO MODELO DE XENOENXERTO CRC
[0448] Este exemplo mostra que a eficiência de mascaramento de anticorpos ativáveis por CD71 anti-humano com toxinas conjugadas (AADCs) da presente divulgação é um fator em sua eficácia em um modelo de xenoenxerto de camundongo HT29 para câncer colorretal (CRC).
[0449] Nestes estudos, cresceram tumores de xenoenxerto HT29 em camundongos para um volume médio de 150 mm3. Os ratos foram então randomizados em grupos e dosados no dia 1 com 3 mg/kg (ou indicado de outra forma) de cada artigo de teste indicado. O volume médio do tumor ± SEM foi plotado para cada ponto no tempo.
[0450] A Figura 4A mostra que um AADC anti-CD71 exemplificativo da presente divulgação (anti-CD71 TF01-3011-vc-MMAE) com uma máscara de afinidade mais alta mostrou alguma inibição do crescimento do tumor em relação a um controle de veículo após uma dose única de 3 mg/kg. Em comparação, a Figura 4B mostrou um AADC anti-CD71 exemplificativo da presente divulgação (anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE) com uma máscara de afinidade mais baixa, mas com o mesmo substrato clivável mostrou regressão essencialmente completa do xenoenxerto após uma dose única 3 mg/kg. A Figura 4C mostra um AADC anti-CD71 exemplificativo da presente divulgação (anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE) com a máscara de afinidade mais baixa, mas com o mesmo substrato clivável, também mostrou regressão essencialmente completa do xenoenxerto HT29 em uma única dosagem de 2 mg/kg ou 3 mg/kg. Estes resultados exemplificadores mostram que um AADC com a porção de mascaramento de afinidade mais baixa demonstrou uma eficácia mais alta do que um AADC com uma porção de mascaramento de afinidade mais alta.
EXEMPLO 7: SUBSTRATOS CLIVÁVEIS E EFICÁCIA IN VIVO DE ANTI- CD71-AADC EM MODELOS DE XENOENXERTO CRC
[0451] Este exemplo mostra o efeito do substrato clivável na eficácia de anticorpos ativáveis conjugados a CD71 (AADCs) exemplificadores anti-humanos exemplificadores da presente divulgação em um modelo de xenoenxerto de camundongo.
[0452] Nestes estudos, cresceram tumores de xenoenxerto HT29 (derivado de câncer colorretal) em camundongos para um volume médio de 150 mm3. Os camundongos foram então randomizados em grupos e dosados no dia 1 com a quantidade indicada no artigo de teste indicado. O volume médio do tumor ± SEM foi plotado para cada ponto no tempo.
[0453] A Figura 5 mostra que um AADCs anti-CD71 exemplificativo da presente divulgação (CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE) mostra regressão completa ou quase completa no modelo de xenoenxerto de camundongo em duas dosagens diferentes. Esses dados exemplificadores demonstram que a eficácia do AADC indicado (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE) com um substrato menos clivável é substancialmente o mesmo que a eficácia do AADC (anti-CD71 TF02.13-3011- vc- MMAE) com um substrato mais clivável mostrado nas Figuras 4B e 4C.
EXEMPLO 8: EFICÁCIA ANTI-CD71-AADC ATIVÁVEL IN VIVO EM VÁRIOS MODELOS DE XENOENXERTO
[0454] Este exemplo mostra as eficácias do AADC anti-CD71 TF02.13-2011- vc-MMAE da presente divulgação em duas razões diferentes de fármaco para anticorpo (DARs) em vários modelos de xenoenxerto de camundongo.
[0455] Nesses estudos, câncer de ovário (OV-90; Figura 6B), câncer de estômago (NCI-N87; Figura 6A), ER + câncer de mama (BT474; Figura 6C) ou câncer de mama triplo negativo (HCC-70; a Figura 6D) tumores de xenoenxertos em murganhos foram cultivadas até um volume médio de 150 milímetros3. Os camundongos foram então randomizados em grupos e dosados no dia 1 com o artigo de teste indicado. A quantidade de cada AADC administrada foi comparada com a dose com base na quantidade de toxina MMAE, de modo que o anti-CD71 TF02.13- 2011-vc-MMAE (com um DAR médio de ~ 3) foi administrado a 3 mg/kg e anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 (com um DAR médio de ~ 2) foram administrados a 4,3 mg/kg. O volume médio do tumor ± SEM foi plotado para cada ponto no tempo.
[0456] As Figuras 6A-6B mostram que um AADCs anti-CD71 exemplificativo da presente divulgação (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE) mostra regressão completa ou quase completa em um modelo de xenoenxerto de camundongo com câncer de ovário e estômago. O anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 (ou seja, com um DAR de ~ 2), que incluía AADCs purificados, cada um com dois equivalentes de toxina MMAE, também mostrou regressões completas nos mesmos modelos. Em todos os casos, como mostrado nas Figuras 6C e 6D, mesmo quando não foi observada regressão completa ou quase completa, as atividades do E2 (ou seja, tendo um DAR de ~ 2) e os AADCs mais altos da DAR eram equivalentes ou quase equivalentes. Esses dados exemplificadores demonstram que a eficácia da E2 (ou seja, com um DAR de ~ 2) AADC (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2) é comparável à DAR AADC mais alta correspondente.
[0457] Como mostrado na Tabela 4B, a eficácia de AADC anti-CD71 TF02.13- 2011-vc-MMAE E2 com um DAR de ~ 2 foi testada contra uma variedade de linhas de células derivadas do paciente (PDX) ou câncer (CDX) em uma modelo de xenoenxerto de camundongo e receberam doses iguais ou inferiores a 6 mg/kg uma ou duas vezes. Os resultados, que são resumidos abaixo, mostram que o AADC demonstrou pelo menos alguma eficácia, variando de regressão a estase e inibição do crescimento tumoral em quase todos os modelos testados. TABELA 4B: EFICÁCIA DO ANTI-CD71 TF02.13-2011-VC-MMAE E2 EM XENOENXERTOS DERIVADOS DE LINHAGEM CELULAR
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EXEMPLO 9: ENSAIOS BIOANALÍTICOS PARA DETERMINAR OS NÍVEIS DE TOXINA CONJUGADA E LIVRE E AADC TOTAL E INTACTO EM AMOSTRAS DE ANIMAIS TRATADOS
[0458] Este exemplo mostra fluxos de trabalho exemplificadores para ensaios para medir níveis de metabólitos em amostras de teste, incluindo os níveis de toxina conjugada e livre e os níveis de anticorpos ativáveis conjugados intactos e totais.
[0459] As figuras 7A, 7B e 7C mostram fluxos de trabalho esquemáticos para os ensaios bioanalíticos exemplificadores para determinar a quantidade de anticorpo ativável intacto e total (ou seja, combinado intacto e clivado) nos macacos tratados, bem como a quantidade de AADC intacto (com toxina não clivada) e toxina clivada nos macacos tratados. Utilizando o exemplo de protocolo de ensaio representado na FIGURA 7A, a quantidade total de anticorpo ativável intacto e clivado (por exemplo, anti-CD71 TF02.13-3001) na amostra pode ser capturada por esferas magnéticas de proteína A e subsequentemente desnaturada (RapiGestTM), reduzida com ditiotreitol, alquilado e tripsina digerido. Os fragmentos peptídicos resultantes podem ser analisados usando LC-MS/MS de fase reversa para identificar e quantificar fragmentos peptídicos característicos das cadeias pesada e leve do anticorpo. Neste ensaio em particular, um ou mais peptídeos característicos da porção de anticorpo do anticorpo ativável ou do anticorpo ativável conjugado podem ser identificados e quantificados usando LC-MS/MS de fase reversa para determinar a quantidade total de anticorpo ativável intacto e clivado, assim medir a quantidade de anticorpo ativável total intacto e clivado na amostra.
[0460] No mesmo ensaio, um ou mais peptídeos característicos para a porção clivável não clivada (CM) e a porção de mascaramento (MM) do anticorpo ativável (por exemplo, do terminal N da cadeia leve do anti-CD71-TF02.13- 2011) pode ser identificado e quantificado usando LC-MS/MS de fase reversa para determinar a quantidade total de anticorpo ativável intacto, medindo assim a quantidade de anticorpo ativável intacto na amostra.
[0461] Utilizando o exemplo de protocolo de ensaio representado na FIGURA 7B, a quantidade total de AADC (por exemplo, anti-CD71 TF02.13-3001-vc-MMAE) que permanece conjugada à sua toxina (MMAE) na amostra pode ser determinada. Neste ensaio, a quantidade total de anticorpo ativável, conjugado e não conjugado, é capturada pelo MabSelect® Protein A. Essa fração é tratada com uma protease de cisteína para clivar a toxina ligante, liberando assim qualquer toxina que permaneça conjugada ao seu anticorpo ativável. Usando LC-MS/MS de fase reversa para analisar a porção clivada por protease de cisteína, a toxina característica (por exemplo, MMAE) que permaneceu conjugada ao anticorpo ativável capturado pode ser identificada e quantificada, medindo assim a quantidade de toxina conjugada na amostra.
[0462] Utilizando o exemplo de protocolo de ensaio representado na FIGURA 7C, a quantidade total de toxina na amostra, que inclui toxinas clivadas do AADC no animal, pode ser determinada. Neste ensaio exemplar representado na FIGURA 7C, a proteína total da amostra é precipitada, deixando livre, toxina não conjugada (MMAE) no sobrenadante. O sobrenadante pode ser analisado usando LC-MS/MS de fase reversa para identificar e quantificar a toxina característica (por exemplo, MMAE) que não se associou à proteína precipitada, medindo assim a quantidade de toxina não conjugada na amostra. Nestes ensaios, os padrões internos (por exemplo, SILuTM Mab, Sigma-Aldrich) foram incluídos para permitir a quantificação.
EXEMPLO 10: TOLERABILIDADE E ESTABILIDADE DE ADCS ANTI-CD71- AADC E ANTI-CD71 EM MACACOS CINOMOLGOS
[0463] Este exemplo mostra que os anticorpos ativáveis por CD71 anti- humano com toxinas conjugadas (AADCs) da presente divulgação são bem tolerados em macacos cinomolgos em comparação com o conjugado de fármaco anti-CD71 parental correspondente (ADCs) com base em uma ou mais leituras hematológicas e clínicas sintomas. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 5 e resumidos na Figura 17.
[0464] Neste estudo, os macacos cinomolgos foram tratados por via intravenosa com o AADC ou ADC indicado, com a dosagem indicada nos dias 1 e 21. Apenas uma dose foi tolerada para anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE AADC e apenas uma dose foi administrada para anti-CD71-vc-MMAE E2 (isto é, com um DAR de ~ 2) ADC. A estabilidade dos anticorpos ativáveis (ou seja, anticorpo ativável total versus anticorpo ativável intacto) nas amostras obtidas de cada animal foi realizada conforme descrito no Exemplo 9, utilizando LC/MS/MS de fase reversa TABELA 5: RESUMO DA TOLERABILIDADE E ESTABILIDADE DO ANTI- CD71 AADC E ADC EM MACACOS CINOMOLGOS
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[0465] A perda de peso corporal foi determinada com o menor peso medida após a 1a dose administrada. A contagem inicial de neutrófilos era de pelo menos 1.000 por μl.
[0466] Como resumido na Tabela 5, o E2 não mascarado (isto é, com um DAR de ~2) ADC (Anti-CD71-vc-MMAE E2) demonstrou letalidade dentro de 8 dias após a primeira dose.
[0467] Os resultados exemplificadores resumidos na Tabela 5 também mostram que os AADCs com o substrato menos clivável (ou seja, anti-CD71 TF02.13- 2011-vc-MMAE e anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2) foram melhor tolerados e demonstrados um nível mais alto de estabilidade circulatória em um primata não humano que o AADC correspondente com o substrato mais clivável (isto é, anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE). Finalmente, os resultados exemplificadores mostram que o AADC (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 (ou seja, com um DAR de ~ 2)) demonstrou uma tolerabilidade mensurável melhorada em um primata não humano do que a DAR AADC mais alto correspondente (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE).
EXEMPLO 11: ESTABILIDADE E FARMACOCINÉTICA DE ANTI-CD71- AADC EM MACACOS CINOMOLGOS
[0468] Este exemplo mostra a estabilidade e a farmacocinética de anticorpos ativáveis por CD71 anti-humano com toxinas conjugadas (AADCs) da presente divulgação em macacos cinomolgos. Neste estudo,
[0469] Neste estudo, cujos resultados são descritos em mais detalhes nos Exemplos 12 a 14, quatro grupos de macacos cinomolgos foram tratados por via intravenosa com o E2 indicado (isto é, com um DAR de ~ 2) anti-CD71 TF02.13-2011- vc-MMAE ou um controle de veículo com a dosagem e esquema indicados na Tabela 6. As amostras de cada animal foram obtidas nos dias indicados na Tabela 6, que foram analisadas quanto a anticorpos ativáveis totais e intactos e toxina MMAE conjugada e não conjugada da maneira descrita no Exemplo 9. TABELA 6: PROJETO DE ESTUDO DE TOXICIDADE ANTI-CD71 AADC
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[0470] Como resumido na Tabela 6, os macacos cinomolgos foram doseados com veículo ou anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 AADC por bolus IV lento nos níveis de dose e horários mostrados. As amostras de sangue para análise toxicocinética foram processadas no plasma e armazenadas a -80 °C antes da análise. As amostras de soro foram obtidas para análise antifármacos pré-dose e 7 dias após a segunda dose para os Grupos 1-3 e 22 dias após a primeira dose para o Grupo 4. Todos os grupos continham três animais (2 machos e 1 fêmea).
EXEMPLO 12: ESTABILIDADE DE ANTI-CD71-AADC EM MACACOS CINOMOLGOS
[0471] Este exemplo mostra a estabilidade de anticorpos ativáveis por CD71 anti-humano com toxinas conjugadas (AADCs) da presente divulgação em macacos cinomolgos.
[0472] Como mostrado nos resultados exemplificadores das FIGURAS 8A e 8B, as concentrações plasmáticas de anticorpo ativável total e intacto (anti-CD71 TF02.13-2011) do AADC administrado foram determinadas da maneira descrita nos Exemplos 9 e 11. Os limites inferiores de quantificação (LLOQ) para o anticorpo ativável intacto e total foram de 0,633 nM, conforme indicado. Estes resultados exemplificadores demonstram que a concentração plasmática de anticorpos ativáveis intactos era geralmente mantida durante o intervalo de dosagem de 21 dias e em um nível proporcional à dose administrada originalmente. Mesmo 7 dias após a dose, aproximadamente 80% do anticorpo ativável conjugado (anti-CD71-TF02.13-2011-vc- MMAE E2) no plasma estava na forma pró-fármaco intacta.
[0473] Como mostrado nos resultados exemplificadores das FIGURAS 9A e 9B, as concentrações plasmáticas da toxina MMAE conjugada e não conjugada foram determinadas da maneira descrita nos Exemplos 9 e 11. O limite inferior de quantificação (LLOQ) foi de 1,77 nM para MMAE conjugado e 0,31 nM para MMAE não conjugado, conforme indicado. Estes resultados exemplificadores demonstram que menos de 1% da MMAE total medido na concentração plasmática de estava em uma forma não conjugada.
EXEMPLO 13: ALTERAÇÃO DA PROPORÇÃO DE FÁRMACO PARA ANTICORPO ATIVÁVEL APÓS DOSAGEM DE ANTI-CD71-AADC EM MACACOS CINOMOLGOS
[0474] Este exemplo mostra a razão observada de fármaco (MMAE) para anticorpo ativável (anti-CD71 TF02.13-2011) no plasma após a dosagem de macacos cinomolgos com anticorpos ativáveis anti-CD71 humanos com toxinas conjugadas (AADCs) da presente divulgação.
[0475] As concentrações plasmáticas de anticorpo ativável total e intacto (anti- CD71 TF02.13-2011) foram determinadas da maneira descrita nos Exemplos 9 e 11. Como mostrado na Figura 10, a proporção de fármaco para anticorpo ativável foi calculada dividindo-se a concentração de MMAE conjugado (consultar Exemplo 12 e Figura 9A) pela concentração de anticorpo ativável total (consultar o Exemplo 11 e Figura 8A) em cada momento indicado. As razões médias e desvios padrão para pontos de tempo específicos são mostrados na Tabela 7. Estes resultados exemplificadores demonstram que a proporção observada de fármaco MMAE para anticorpo ativável mudou ao longo do tempo de uma maneira que era consistente entre cada uma das três (3) dosagens. Em cada dosagem, a DAR calculado do AADC intacto começou em ~ 2 imediatamente após e dentro de 4 horas após a administração, e essa proporção caiu para cerca de 1 aproximadamente 96 horas (isto é, cerca de 4 dias) após a dose.
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EXEMPLO 14: PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DE ANTI-CD71- AADC EM MACACOS CINOMOLGOS
[0476] Este exemplo mostra os parâmetros farmacocinéticos de anticorpos ativáveis por CD71 anti-humano com toxinas conjugadas (AADCs) da presente divulgação em macacos cinomolgos.
[0477] As concentrações plasmáticas de anticorpo ativável total e intacto (anti- CD71 TF02.13-2011) foram determinadas da maneira descrita nos Exemplos 9 e 11. Como mostrado na Tabela 8, a Cmax média para um determinado analito foi baseada na concentração plasmática máxima observada. A AUC0-7 média foi baseada na área sob a curva de concentração-tempo no plasma dos dias 0 a 7. As estimativas de meia- vida para anticorpo ativável conjugado total, anticorpo ativável conjugado intacto e MMAE conjugado variaram de 2,5 a 6,3 dias. As estimativas de meia-vida não foram geradas para MMAE não conjugado. TABELA 8: RAZÃO FÁRMACO/ANTICORPO ATIVÁVEL
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EXEMPLO 15: ENSAIO DE ANTICORPOS ANTIFÁRMACOS
[0478] Este exemplo descreve o uso de um ensaio de ponte para monitorar a formação de anticorpos antifármacos (ADA) nos animais testados.
[0479] Amostras de plasma para análise de ADA foram coletadas antes do estudo e 7 dias após a segunda dose. Anticorpos antifármacos foram detectados em 3 dos 9 animais dosados no estudo.
EXEMPLO 16: CITOTOXICIDADE IN VITRO DO ANTICORPO ATIVÁVEL CONJUGADO ANTI-CD71
[0480] Este exemplo descreve ensaios de citotoxicidade in vitro em linhagens celulares derivadas de tumores humanos de anticorpos ativáveis conjugados anti- CD71 intactos e ativados da presente divulgação em comparação com um isotipo de controle ADC.
[0481] Uma atividade citotóxica exemplar in vitro do anticorpo ativável conjugado da presente divulgação anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (HC da SEQ ID NO: 167 e LC da SEQ ID NO: 169), com ou sem pré-tratamento com matriptase, foi avaliada e comparada com um controle de anticorpo conjugado que não se liga ao isotipo CD71 (AB095-vcMMAE com DAR de 2, em que AB095 é específico para a toxina tetânica). A citotoxicidade dos artigos de teste foi testada em HT29 (linha celular de câncer colorretal humano), H292 (linha celular de câncer de pulmão humano), H520 (linha celular de câncer de pulmão humano) e HCC1806 (linha celular de câncer de mama humano) incubando cada artigo de teste com cada linha de células por 5 dias e, em seguida, medindo a viabilidade celular em uma faixa de concentrações de cada artigo de teste para determinar o EC50 para cada artigo de teste. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 9. TABELA 9: VALORES EC50 PARA ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE IN VITRO EM CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS
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[0482] Estes resultados exemplificadores mostram que a citotoxicidade in vitro do anticorpo ativável conjugado anti-CD71 intacto era semelhante à do controle isotípico, mas foi substancialmente aumentada após a ativação da matriptase.
EXEMPLO 17: ATIVAÇÃO DE LIGAÇÃO E COMPLEMENTO DE FC PELO ANTICORPO ATIVÁVEL CONJUGADO ANTI-CD71
[0483] Este exemplo demonstrou a capacidade de anticorpos ativáveis conjugados com anti-CD71 da presente divulgação para mediar mecanismos baseados em funções efetoras, como citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
[0484] A porção cristalizável por fragmento (Fc) de um anticorpo IgG pode mediar uma variedade de funções, algumas das quais ocorrem através da ligação a receptores Fc e C1q. Essas funções incluem indução de citocinas, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) através da ativação da via clássica do sistema complemento, fagocitose e homeostase de anticorpos através da reciclagem de IgG. (Ravetch et al., Annu Rev Immunol., 2001; 19: 275 a 290; Roopenian et al., Nat Rev Immunol. 2007; 7: 715 a 725).
[0485] A homeostase do anticorpo é regulada em parte pelo receptor neonatal relacionado ao Fc, FcRn, que está presente nas células epiteliais intestinais, células endoteliais vasculares e células apresentadoras de antígenos profissionais. Intracelularmente, o FcRn está presente nas vesículas; em endossomas ácidos com pH baixo, pode ligar a porção Fc de uma IgG que foi absorvida pela pinocitose. A IgG é então liberada quando os endossomas são reciclados para a superfície celular como resultado da exposição ao pH neutro extracelular. Esse processo permite o controle do tráfego de IgG através das barreiras epiteliais de camada única e protege as moléculas de IgG do catabolismo, prolongando a meia-vida sérica de IgG. (Roopeniano). De fato, as mutações que aumentam a ligação ao FcRn a pH baixo, mas mantêm baixa ligação ao pH fisiológico, demonstraram ter meia-vida sérica mais longa. (Hinton et al., J Biol Chem. 2004; 279: 6.213 a 6.216; Hinton et al., J Immunol. 2006;176: 346 a 356).
[0486] O sistema FCYR humano é composto por receptores de ativação (FCYRI, FcYRIIa e FcYRIIIa) e inibidores (FcYRIIb). O FCYRI, um receptor de IgG1 de alta afinidade, é expresso por células da linhagem monocítica. (Li et al., J Immunol. 2008; 181: 1.012 a 1.018) FcYRIIa é um receptor de IgG de baixa afinidade mais amplamente expresso que se liga preferencialmente a complexos imunes. (Littaua et al., J. Immunol., 1990; 144: 3.183 a 3.186) FcRIIb é expresso principalmente na linhagem monocítica e nas células B e é um receptor de IgG inibidor de baixa afinidade. Após a ligação do FcYRIIb aos complexos IgG, processos dependentes de cálcio, como desgranulação, fagocitose, ADCC, liberação de citocinas e ativação pró- inflamatória são bloqueados. (Clynes et al., Nat. Med., 6: 446 a 446 (2000); Minard- Colin et al., Blood, 112: 1.205 a 1.213 (2008); e Hamaguchi et al., J. Exp. Med., 203: 743 a 753 (2006)). FcYRIIIa é um receptor de baixa afinidade responsável pela atividade ADCC das células NK. (Ravetch) para aumentar a diversidade de receptores FcY, existem variantes polimórficas de FcYRIIa (H131 versus R131) e FcYRIIIa (V158 versus F158) que apresentam diferenças nas afinidades pelas moléculas de IgG. (Bruhns et al., Blood, 2008; 113: 3.716 a 3.725).
[0487] A capacidade dos anticorpos para mediar uma variedade de funções através de sistemas efetores de FcYR ou complemento permite a possibilidade de farmacologia exagerada não intencional em produtos biológicos de engenharia baseados em IgG. A reatividade cruzada desconhecida nos linfócitos do sangue periférico é capaz de desencadear a reticulação dos receptores FcY. Como as interações do receptor FcY de reticulação podem mediar uma variedade de funções, incluindo indução de citocinas, ADCC e fagocitose (Ravetch), é importante determinar a capacidade dos anticorpos terapêuticos para ligar alvos indesejados no sangue ou tecidos.
MÉTODOS - RESSONÂNCIA DE PLASMA DE SUPERFÍCIE FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa E ENSAIO DE LIGAÇÃO FcRn
[0488] FcYRII e FcYRIII humano recombinante foram capturados via 6xHis-tag para avaliar sua ligação a Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE, anti-CD71 Ab21.12 (IgG1/K), AB095-MMAE-E2 e AB095 (IgG1/k) por ressonância plasmônica de superfície (Biacore). Os anticorpos anti-6xHis de camundongo foram imobilizados diretamente em um chip CM5 por acoplamento de amina de acordo com o protocolo do fabricante com a densidade de 10.000 RU. Os FcYRs humanos foram então capturados nas células de fluxo 2, 3 e 4 para atingir o nível de captura dos FcYRs de 250-500 RU. A célula de fluxo 1 foi usada como superfície de referência. O tampão HBS-EP+ (GE, Healthcare) foi usado como o tampão em execução. Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2, anti-CD71 Ab21.12 (IgG1/K), AB095-MMAE-E2, AB095 (IgG1/K) e trastuzumabe (IgG1/K) foram injetados em todos os as células de fluxo a uma taxa de fluxo de 50 μl/minuto por um a dois minutos (um minuto para FcYRIIb e FcYRIIa H131 e dois minutos para FcYRIIIa F158 e FcYRIIIa V158) em concentrações variando de 46,9 a 12.000 nM para FCYRII e 7,8 a 4.000 nM para FCYRIII (diluição em série de duas vezes para ambos), seguido de um a cinco minutos de tempo de dissociação (um minuto para FcYRIIb, FcYRIIa H131 e cinco minutos para FcYRIIIa F158 e FcYRIIIa V158). As superfícies do chip foram regeneradas com uma injeção de HCl 100 mM a uma taxa de fluxo de 100 μl/minuto por dois segundos nas quatro células de fluxo. Foram realizadas três experiências com o uso de três chips CM5 diferentes para cada amostra (cada uma em duplicado) para acomodar todos os tipos de erros experimentais (instrumento, superfície e operador). A média dos resultados dessas três experiências.
[0489] Para análise de ligação ao FcRn, Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2, Anti-CD71 TF02.13-2011 (IgG1/K sem vc-MMAE), AB095-vcMMAE-E2 (um ser humano monoclonal não específico anticorpo IgG1/K do toxoide antitetânico contendo MMAE com DAR enriquecido = 2), AB095 (um anticorpo monoclonal humano não- específico do toxoide IgG1/K) e trastuzumabe (IgG1/K) foram diretamente imobilizados em um chip CM5 por acoplamento de amina de acordo com o protocolo do fabricante com a densidade de 500 RU. O Hu FcRn foi injetado sobre todas as células de fluxo a uma taxa de fluxo de 50 μl/minuto por um minuto em concentrações variando de 5,5 a 12.000 nM (diluição em série de 3 vezes), seguido de um tempo de dissociação de dois minutos. As superfícies foram regeneradas com uma injeção de 100 mM de HCl por dois segundos, seguido de HBS-EP+, pH 7,4. As amostras foram preparadas e corridas em dois sistemas tampão de corrida, MES-EP+ pH 6,0 e HBS-EP pH 7,4. Três experimentos com o uso de três chips CM5 diferentes foram realizados para cada amostra (cada uma em duplicado) para explicar o erro do instrumento, da superfície e do operador. A média dos resultados dessas três experiências.
[0490] Todos os dados recombinantes de FcYRIIIa V158 humano e FcYRIIIa F158 foram ajustados ao modelo de ajuste de ligação 1:1 com Rmax fixo local para explicar a variabilidade nos níveis de captura. Os dados de ligação de FcYRIIb, FcYRIIa H131 e FcRn humano recombinante foram ajustados a um modelo de afinidade em estado estacionário. O software de avaliação Biacore T200 versão 2.0 foi utilizado para ajustar todos os dados.
RESULTADOS
[0491] O anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 contém um isotipo Fc de IgG1/k humano. Esperava-se que se ligasse a FcYRI, FcYIIa, FcYIIb, FcYIII, consistente com outros anticorpos IgG1/k do tipo selvagem. A ligação de anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 a FcYR foi analisada por ressonância plasmônica de superfície, um ELISA de ligação à competição por FcYRI (resultados não mostrados) e ELISA de ligação à competição por FcYRIII (resultados não mostrados) e ligação de anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 para complemento foi analisado por ensaios funcionais de ativação de complemento humana e de cinomolgo (resultados não mostrados). Estes ensaios foram comparados com anticorpos humanos comerciais e gerados internamente. O material humano anti-HER2, IgG1/k, trastuzumabe de nível clínico foi usado como controle positivo para os ensaios de ligação a FcYR. Sabe-se que os receptores Fc e o complemento se ligam a anticorpos IgG1 do tipo selvagem. (Ravetch; Roopenian; Burton et al., Nature. 1980; 288: 338 a 344; Hughes-Jones et al., Mol Immunol., 1979; 16: 697 a 701; e Hezareh et al., J Virol. 2001; 75: 12.161 a 12.168). O exame do anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE revelou que ele ligava FcYRI, FcYIIa H131, FcYRIII e FcRn, embora tenha sido observada uma ligação modestamente reduzida a FcYRIII (por SPR) quando comparada ao controle positivo, trastuzumabe. A ligação do anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 ao FcYRIIb foi muito fraca para determinar porque ficou abaixo do limite de detecção do instrumento Biacore a 1,0 e-05 KD. (consultar as tabelas 10A e 10B). TABELA 10A: LIGAÇÃO DO ANTICORPO ATIVÁVEL CONJUGADO ANTI- CD71 A FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa POR RESSONÂNCIA PLASMÁTICA DE SUPERFÍCIE
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TABELA 10B: RESSONÂNCIA PLASMÁTICA DE SUPERFÍCIE DE FcRn HUMANO
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[0492] A citotoxicidade dependente do complemento (CDC) foi avaliada avaliando-se a capacidade do anticorpo ativável conjugado com anti-CD71 para ativar o complemento sérico humano e do cinomolgo capturando iC3b (humano) ou C3 (cino) por ELISA, para CDC.
[0493] Como mostrado nos resultados exemplificadores da Figura 12, a ligação dos artigos de teste indicados nas concentrações indicadas a iC3b é mostrada como um ensaio para a ativação do complemento humano. O Anti-CD71-TF02.13- 2011-vcMMAE E2 ligou o iC3b em um ensaio de ativação do complemento no soro humano e no cinomolgo, mas em menor grau do que o anticorpo 7C6 de controle positivo usado no ensaio do CDC. O anticorpo 7C6.7 com as mutações indicadas foi utilizado como controle negativo. A ligação iC3b do anti-CD71-TF02.13-2011- vcMMAE E2 também foi menor do que a sua contraparte de anticorpo ativável não conjugado (anti-CD71-TF02.13-2011).
EXEMPLO 18: LIBERAÇÃO DE CITOCINAS EM PBMCs HUMANAS
[0494] Este exemplo mostrou que, embora o anti-CD71-TF02.13-2011- vcMMAE E2 não se ligue a células mononucleares do sangue periférico humano ou cinomolgo (PBMCs), os anticorpos IgG1 são capazes de reticular os receptores FCY nos linfócitos do sangue periférico, mediando assim uma variedade de funções incluindo indução de citocinas.
[0495] A capacidade de anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 ou anti-CD71- TF02.13-2011 de induzir a liberação de citocinas in vitro em PBMCs humanas foi avaliada em um formato de fase solúvel ou sólida (ligado a placa) para as seguintes citocinas: interleucina (IL) -1β, IL 6, IL 2, interferon (IFN) Y e fator de necrose tumoral alfa (TNFα). Para a experiência em fase sólida, PBMCs de 8 doadores humanos saudáveis foram adicionados a placas de polipropileno previamente revestidas com 0,96 μg de artigo de teste e lavadas após 1,5 horas. O sobrenadante foi coletado após 48 horas para análise. Trastuzumabe e um controle de isotipo não vinculado ADC, AB095-vcMMAE E2, foram utilizados como controles negativos. Foram utilizados três controles positivos: anticorpos estimuladores de células T, TGN1412 ou visilizumabe e células B e lipopolissacarídeo estimulador de células mieloides (LPS). Em 1 dos 8 doadores testados, foi observada uma liberação substancial de 3 das 5 citocinas medidas IL-1β, IL-6 e TNFα em resposta a ambos os anti-CD71-TF02.13-2011- vcMMAE E2 e AB095- vcMMAE-E2. Foi observada liberação de IL-6 e TNFα em mais 2 de 8 doadores em resposta a anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 e AB095- vcMMAE E2. Três doadores foram testados no ensaio de apresentação solúvel, que foi um ensaio de apresentação de alta densidade celular de 24 horas.
[0496] Neste estudo, a liberação de citocinas de PBMCs de doadores humanos foi medida após estimulação com uma pré-camada de 0,96 μg/poço com anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 e anti-CD71-TF02.13-2011 (IgG1K). O trastuzumabe foi usado como um anticorpo IgGlK de controle negativo. AB095- vcMMAE-E2 e AB095 (IgG1K) foram utilizados como anticorpos de controle de isotipo. TGN1412, visilizumabe e lipopolissacarídeo (LPS) foram adicionados como controles positivos para a liberação de citocinas. Os valores em negrito e em caixa destacam o artigo de teste que provocou a liberação de citocinas >2 vezes a liberação pelo trastuzumabe.
[0497] Como mostrado nos resultados exemplificadores da Tabela 11, o anti- CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 não provocou liberação de citocinas acima do nível induzido pelo trastuzumabe de controle negativo. A liberação de citocinas também foi avaliada em 3 doadores de macacos cinomolgo no formato de fase sólida para as seguintes citocinas: IL-1β, IL-6, IL-2, IFNY, IL-8 e IL-10. O anti-CD71-TF02.13-2011- vcMMAE E2 elicitou a produção de IL-8 ligeiramente acima do nível de fundo, conforme definido pelo trastuzumabe, em 1 dos 3 doadores testados. Nos estudos de toxicologia que não GLP e GLP do macaco cinomolgo para anti-CD71-TF02.13-2011- vcMMAE E2, não foram observados sintomas clínicos agudos representativos da liberação de citocinas em nenhum nível de dose. TABELA 11: LIBERAÇÃO DE CITOCINAS DE PBMCs HUMANAS EM RESPOSTA AO ANTICORPO ATIVÁVEL CONJUGADO ANTI-CD71 EM FASE SÓLIDA E OUTROS ARTIGOS DE TESTE
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EXEMPLO 19: EFICÁCIA ANTITUMORAL DE AADC ANTI-CD71 NO MODELO DE CAMUNDONGO DE XENOENXERTO SW-48
[0498] Este exemplo mostra a eficácia do anticorpo ativado conjugado anti- CD71 da presente divulgação em um modelo de xenoenxerto de tumor de camundongo, usando célula SW-48 (câncer colorretal humano).
[0499] Neste estudo exemplificativo, injeções intraperitoneais únicas de anti- CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) nas doses indicadas foram administradas a grupos de 8 camundongos e o volume médio do tumor foi observado ao longo do tempo. Como mostrado na Figura 13 e Tabela 12, foi observada uma faixa de inibição total do crescimento (TGI) aos 23 dias em comparação ao controle do veículo em todas as dosagens, com regressão completa do tumor observada nas dosagens de 6 e 12 mg/kg. TABELA 12: INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DO TUMOR DE XENOENXERTO APÓS TRATAMENTO COM AADC ANTI-CD71
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CR = resposta completa; RP = resposta parcial; TGI = inibição do crescimento tumoral; TGD = atraso no crescimento do tumor; TR = resposta total.
EXEMPLO 20: EFICÁCIA ANTITUMORAL DE AADC ANTI-CD71 EM UM MODELO DE CAMUNDONGO DLBCL PDX
[0500] Este Exemplo mostra a eficácia do anticorpo ativado conjugado com anti-CD71 da presente divulgação em cinco (5) modelo de xenoenxerto (PDX) derivado de paciente de tumor de camundongo (PDX), usando linfoma de células B grandes difusas (DLBCL) derivado de paciente derivado de paciente de HuPrime em SCID feminino ou Camundongos NOG.
[0501] Neste estudo exemplificador, grupos de 3 camundongos foram estabelecidos com tumores subcutâneos (100-200 mm3) e administrados com 6 mg/kg de anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) ou um controle de veículo em dias 0 e 7. Conforme mostrado nos resultados exemplificadores da Figura 14, o artigo de teste da AADC alcançou >100% de TGI em 4 de 5 modelos e 72% de TFI em 1 modelo em comparação com o grupo de controle do veículo. Respostas completas (ou seja, ausência de tumor mensurável no término do estudo) nos modelos administrados com o AADC foram observadas em 2 de 3 camundongos para LY2345, 3 de 3 camundongos para o modelo LY6933, 2 de 3 camundongos para o modelo LY6934 e 2 ou 3 ratos para o modelo LY2318. Nenhuma resposta completa foi observada para o modelo LY3604. Esses resultados exemplificadores demonstram que o AADC da presente divulgação demonstrou eficácia, até a resposta completa em alguns modelos.
EXEMPLO 21: EFICÁCIA ANTITUMORAL DE AADC ANTI-CD71 EM MODELOS DE CAMUNDONGO DE ENXERTO DE TUMOR PDX
[0502] Este exemplo mostra a eficácia do anticorpo ativado conjugado anti- CD71 da presente divulgação em nove (9) modelos de xenoenxerto (PDX) derivado de paciente com tumor de camundongo, usando câncer de mama humano derivado de paciente TumorGraft (CTG-0437, CTG-0869, CTG -1059), câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) (CTG-1082, CTG-0860, CTG-0160, CTG-1012) e carcinoma de células pequenas da cabeça e pescoço (HNSCC) (CTG-1140, CTG- 1082) em ratos nus.
[0503] Neste estudo exemplificador, grupos de 3 camundongos para cada modelo de PDX foram estabelecidos com tumores subcutâneos (150 - 300 mm3) e administrados com 6 mg/kg de anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) ou um controle do veículo nos dias 0 e 7. Conforme mostrado nos resultados exemplificadores das Figuras 15A, 15B e 15C, o artigo de teste da AADC alcançou >100% de inibição do crescimento de tumores (TGI) em 6 de 9 modelos nas três indicações de câncer. Nestes 6 modelos nos quais foi observado >100% de TGI, 6 de 18 camundongos que receberam o AADC alcançaram resposta completa (isto é, ausência de tumor mensurável no final do estudo). Em 2 modelos adicionais, foram observados 92% e 78% de TGI para HNSCC e NSCLC, respectivamente. Um modelo NSCLC não respondeu ao AADC. Como mostrado nesses resultados exemplificadores, o AADC da presente divulgação demonstrou eficácia, incluindo respostas completas em alguns casos, ao modelo PDX derivado de uma variedade de tipos de câncer humano.
EXEMPLO 22: EFICÁCIA ANTITUMORAL DE AADC ANTI-CD71 NO MODELO DE CAMUNDONGO PDX PANCREÁTICO HuPrime
[0504] Este exemplo mostra a eficácia do anticorpo ativado conjugado com anti-CD71 da presente divulgação em um modelo de camundongo xenoenxerto derivado do paciente (PDX), usando câncer de pâncreas humano derivado do paciente HuPrime (PA6237) em camundongos SCID.
[0505] Neste estudo exemplar, um grupo de 3 camundongos foi estabelecido com tumores subcutâneos (100 - 200 mm 3) e administrado com 3 ou 6 mg/kg de anti- CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) ou um veículo controle nos dias 0 e 7. Como mostrado nos resultados exemplificadores da Figura 16, o artigo de teste AADC alcançou> 100% de inibição do crescimento tumoral (TGI) em 3 e 6 mg/kg. Neste grupo de 6 mg/kg, 3 de 3 respostas completas foram observadas até o dia 59, enquanto o grupo de 3 mg/kg manteve resposta completa até o dia 31, seguido de rebrota do tumor.
EXEMPLO 23: ESTUDOS DE TOXICIDADE PILOTO SEM GLP DE ANTICORPO ATIVÁVEL CONJUGADO ANTI-CD71
[0506] Este exemplo mostra as toxicidades relativas do anticorpo ativável conjugado anti-CD71 (AADC) anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 da presente divulgação em níveis de dose variando de 6 a 18 mg/kg a anticorpos conjugados anti- CD71 (ADC) Ab21.12-vcMMAE E2 em níveis de dose variando de 0,6 a 6 mg/kg em macacos cinomolgos (1-2 macacos por sexo por grupo) após injeção intravenosa em bolus uma vez a cada 3 semanas (Q3W) ou a cada 2 semanas (Q2W). As necropsias terminais foram realizadas nos animais de teste no dia 29 (7 dias após a última dose). As avaliações durante o estudo incluíram sinais clínicos, peso corporal, consumo de alimentos, patologia clínica, patologia anatômica, CT e imunogenicidade. Um resumo do estudo piloto de toxicidade é mostrado na Tabela 13. TABELA 13: ESTUDO DE TOXICIDADE PILOTO SEM GLP EM MACACOS C NOMOLGOS
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[0507] Toxicidade grave foi observada como manifestada por postura curvada, atividade diminuída e elevação da temperatura corporal em grupos que receberam uma dose alta de CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (18 mg/kg), doses frequentes de CD71-TF02.13 -2011-vcMMAE E2 (dosagem nos dias 1 e 15), ou o conjugado fármaco-anti-CD71 parental não mascarado (ADC) (Ab21.12-vcMMAE E2) a 6 e 2 mg/kg. Quando uma causa de morte pôde ser estabelecida, foi determinado que a infecção era secundária à supressão imunológica relacionada à fármaco.
[0508] Os achados relacionados ao artigo de teste foram semelhantes para CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 e Ab21.12-vcMMAE E2 e consistiram principalmente em toxicidade hematológica. Os principais achados incluíram (1) mortalidade atribuída à infecção secundária em grupos que receberam uma dose única de CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 a 18 mg/kg, CD71-TF02.13-2011- vcMMAE E2 nos dias 1 e 15 a 8 mg/kg, ou uma dose única de ADC (Ab21.12-vcMMAE E2) a > 2 mg/kg, (2) diminuição do peso corporal 2 semanas após a dose, com recuperação de 3 semanas após a dose em > 12 mg/kg de CD71-TF02.13-2011- vcMMAE E2, (3) reduções dependentes da dose na massa de glóbulos vermelhos e todas as populações de leucócitos com recuperação parcial a completa observadas 3 semanas após a dose, (4) aumento transitório das plaquetas níveis 2 semanas após a dose, (5) aumentos leves a moderados no fibrinogênio, diminuição da albumina e aumento da globulina, (6) reduções leves a moderadas na medula óssea, baço e celularidade tímica, com reduções de peso correspondentes no timo e no baço. Celularidade diminuída também foi observada em vários tecidos linfoides.
[0509] Neste estudo exemplar, as doses mais altas toleradas de CD71- TF02.13-2011-vcMMAE E2 e Ab21.12-vcMMAE E2 (o ADC correspondente) nesses estudos foram 12 mg/kg e 0,6 mg/kg, respectivamente, administradas uma vez a cada 3 semanas para 2 doses.
EXEMPLO 24: ESTUDOS DE TOXICIDADE DE GLP DE ANTICORPO ATIVÁVEL CONJUGADO ANTI-CD71
[0510] Este exemplo mostra um estudo de toxicidade de dose repetida de GLP em macacos cinomolgos do anticorpo ativável conjugado anti-CD71 (AADC) anti- CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 da presente divulgação em níveis de dose de 0, 2, 6 ou 12 mg/kg nos dias 1 e 22 por injeção intravenosa em bolus. Os grupos de doses são mostrados na Tabela 14. TABELA 14: ESTUDO DE TOXICIDADE DE GLP EM MACACOS CINOMOLGOS
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[0511] Neste estudo exemplificador, cada grupo de 6 macacos machos e 6 fêmeas foi dosado com anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 ou veículo (bolus IV da dose indicada nos dias 1 e 22), como mostrado na Tabela 14. Necrópsias terminais foram realizadas no dia 29 e necropsias de recuperação foram realizadas no dia 64. As avaliações de toxicidade incluíram mortalidade, sinais clínicos, alterações no peso corporal, consumo de alimentos, patologia clínica, patologia anatômica, exames oftalmológicos e avaliações da função cardiovascular, respiratória e do sistema nervoso central. O estudo incluiu análise TK e uma avaliação da formação de ADA. As seguintes observações exemplificadoras foram feitas. Um resumo dos resultados selecionados do estudo de toxicidade de GLP do anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2, com um DAR de ~ 2, em comparação com os estudos não-GLP correspondentes de um conjugado fármaco-anticorpo anti-CD71 não mascarado (ADC) Ab21 .12- vcMMAE E2 (também com um DAR de ~ 2), está resumido na Tabela 15. TABELA 15: RESULTADOS DO ESTUDO DE TOXICIDADE DE GLP EM MACACOS CINOMOLGOS
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[0512] Não houve efeitos relacionados à AADC sobre pesos corporais, consumo de alimentos, frequência respiratória, eletrocardiografia, coagulação e parâmetros de análise de urina, nem houve efeitos neurológicos, efeitos oculares ou achados patológicos graves.
[0513] A mortalidade relacionada à AADC foi observada em doses de 12 mg/kg; uma fêmea foi encontrada morta no dia 10 e duas fêmeas foram sacrificadas no dia 11 em declínio da condição clínica. A patologia clínica relacionada à AADC e os achados microscópicos nesses animais foram semelhantes aos presentes em animais que sobreviveram à necropsia programada (dia 29), com exceção das evidências microscópicas de infecção bacteriana, que foram consideradas uma consequência da imunossupressão relacionada à AADC.
[0514] Como mostrado na Tabela 15, o anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 demonstrou tolerabilidade superior em relação a Ab21.12-vcMMAE E2 sem perda detectável de peso corporal. Como mostrado, o Ab21.12-vcMMAE E2 carecia de tolerabilidade dentro de 8 dias de uma dose única a 2 mpk, enquanto o anti-CD71- TF02.13-2011-vcMMAE E2 forneceu proteção > 10 vezes sobre o não-mascarado, Ab21.12- vcMMAE E2.
[0515] Os sinais clínicos relacionados à AADC em animais tratados com 12 mg/kg que sobreviveram até a necropsia programada foram lesões/feridas na pele consistentes com infecção que se correlacionava com populações de leucócitos diminuídas e sinais de resposta de fase aguda (albumina e colesterol diminuídos e aumento de globulinas, bilirrubina total e triglicerídeos).
[0516] Alterações nos parâmetros hematológicos > 6 mg/kg após a primeira dose consistiram em reduções na massa de glóbulos vermelhos, reticulócitos e todos os subconjuntos de leucócitos, além de aumentos nas plaquetas. Alterações hematológicas em 2 mg/kg foram limitadas a plaquetas levemente aumentadas após a primeira e a segunda dose.
[0517] As alterações relacionadas aos AADC nos parâmetros de química clínica após a primeira dose foram mais notáveis em 12 mg/kg e consistiram em uma resposta de fase aguda (reduções de albumina e colesterol e aumentos de globulinas, triglicerídeos [somente mulheres], bilirrubina total) e aumenta o nitrogênio da ureia (apenas indivíduos) e creatinina e diminui o fósforo. Alterações químicas clínicas em 6 mg/kg foram observadas apenas após a primeira dose e foram limitadas a bilirrubina minimamente aumentada e a globulinas aumentadas em fêmeas individuais.
[0518] Os achados hematológicos e químicos clínicos relacionados à AADC se recuperaram ao final da fase de recuperação.
[0519] Achados microscópicos relacionados à AADC na eutanásia terminal estavam presentes no timo, glândula adrenal e medula óssea em > 6 mg/kg/dose. Os achados no local da injeção foram observados em todos os grupos e são interpretados como estando relacionados ao procedimento de administração e não especificamente ao AADC. Os pesos tímicos foram diminuídos em macacos machos com 12 mg/kg e macacos com 6 mg/kg, que se correlacionaram histologicamente com diminuição da celularidade, particularmente do córtex tímico. Os pesos das glândulas suprarrenais foram aumentados em macacos machos com 12 mg/kg e macacos fêmeas com 6 mg/kg e o correlato histológico foi a hipertrofia adrenocortical. A celularidade diminuída estava presente na medula óssea, especificamente no fêmur, em macacos machos doseados com > 6 mg/kg. Após um intervalo de 6 semanas sem dose, a celularidade diminuída do timo e a hipertrofia adrenocortical não estavam presentes, consistente com a recuperação completa dessas alterações. O aumento da celularidade da medula óssea persistiu, mas com diminuição da gravidade, consistente com a recuperação parcial.
EXEMPLO 25: CONJUGAÇÃO DE MMAE AO ANTICORPO ATIVÁVEL CD71 E MÉTODOS DE REDUÇÃO DA DAR DO ANTICORPO ATIVÁVEL CONJUGADO CD71 RESULTANTE A CERCA DE DAR 3
[0520] Este exemplo descreve os métodos que foram usados para conjugar vc-MMAE ao anticorpo ativável anti-CD71, anti-CD71 TF02.13-2011, para criar anti- CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE contendo uma carga de fármaco de 2 Moléculas MMAE para cada molécula anti-CD71 TF02.13-2011, além dos métodos usados para enriquecer a DAR para cerca de 3.
MÉTODO DE CONJUGAÇÃO
[0521] TF02.13-2011-vc-MMAE anti-CD71 enriquecido com E2 - A uma solução de TF02.13-2011 anti-CD71 (13,95 mg/ml), solução de 39 g, 544 mg, 3,5 nmols) foi adicionada EDTA 0,5 M (0,39 ml) e TCEP (0,77 ml, 10 mM em WFI, 7,7 nmols, 2,2 equivalentes) a 2-8 °C durante a noite. O anticorpo reduzido foi então diluído com DMSO (2,29 ml) tratado com vcMMAE em DMSO (1,89 ml de vcMMAE 9,49 mM em DMSO, 17,9 nmols, 5,1 equivalentes) à temperatura ambiente por 1 h. O anticorpo conjugado foi tratado com N-acetilcisteína (0,29 ml de 100 mM em WFI, 29 nmols, 8,2 equivalentes) para extinguir o excesso de vcMMAE. A solução extinta foi analisada por HIC (cromatografia de interação hidrofóbica) para espécies DAR> E4 (espécies DAR superiores, 20,9% na preparação acima).
MÉTODO PARA ENRIQUECER PARA REDUZIR A DAR
[0522] A reação de conjugação foi suspensa com resina HIC, como as disponíveis comercialmente na Tosoh Biosciences (Toyopearl alquila como exemplo) em porções à temperatura ambiente por 2 h para reduzir as espécies de DAR mais altas a um nível desejado (geralmente <2%). A solução tratada foi filtrada e a resina foi lavada sucessivamente com PBSE (fosfato de potássio 125 mM, NaCl 150 mM, EDTA 6,3 mM, pH 7,2, 22 g) seguido por PBS (fosfato de potássio 5 mM, NaCl 200 mM, pH 7, 35 g). O filtrado e as lavagens combinados foram concentrados e trocados de tampão usando um filtro de centrífuga de corte de peso molecular de 30 kD e depois diluído com componentes da formulação para armazenamento.
[0523] O produto resultante continha 228 mg (A280 6,5 mg/ml) e demonstrou ter um DAR de cerca de 2,9 conforme medido em uma coluna HIC disponível comercialmente e constituir as seguintes características e espécies de DAR: SEC 98,7% monômero, 0,2% maior de molécula peso, peso molecular 1,1% menor, endotoxina <0,06 UE/mg, espécies DAR maiores que E4 foram menores que 2% da área; A DAR E0 foi de cerca de 6,2% na área, a DAR E2 foi de cerca de 40,7% e a DAR E4 foi de cerca de 46,8%).
[0524] Nos exemplos aqui descritos, este produto DAR enriquecido é referido como “anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE (com um DAR médio de ~ 3)”
EXEMPLO 26: CONJUGAÇÃO DE MMAE AO ANTICORPO ATIVÁVEL CD71 E MÉTODOS PARA ENRIQUECER A DAR DO ANTICORPO ATIVÁVEL CONJUGADO CD71 RESULTANTE A CERCA DE DAR 2 (“E2”)
[0525] Este exemplo descreve os métodos que foram usados para conjugar vc-MMAE ao anticorpo ativável anti-CD71, anti-CD71 TF02.13-2011, para criar anti- CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE contendo uma carga de fármaco de 2 Moléculas MMAE para cada molécula anti-CD71 TF02.13-2011, além dos métodos usados para enriquecer a DAR para cerca de 2.
MÉTODO DE CONJUGAÇÃO
[0526] Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 - A uma solução de anti-CD71 TF02.13-2011 (20,3 mg/ml) foi diluído com 1.457 g de PBSE (fosfato de potássio 125 mM, NaCl 150 mM, 6,3 mM EDTA, pH 7,7) e arrefecido a 4 ° C. À solução arrefecida, foi adicionado TCEP (10 mM em WFI, 30,2 ml, 0,30 mmol, 1,5 equivalentes) e mantido a 4 °C durante 15 horas. Ao anticorpo reduzido, uma solução de vc-MMAE (1,056 g, 0,80 mmol, 4 equivalentes) em DMSO (300 g) foi adicionada com resfriamento seguido de um enxaguamento com DMSO (65 g), após o que a solução foi deixada aquecer até a sala temperatura. Após 3,5 h, foi adicionada N-acetilcisteína (0,226 g, 1,60 mmol, 8 equivalentes) para extinguir o excesso de vc-MMAE e a mistura de reação foi armazenada a 2-8 °C até a purificação.
MÉTODO PARA ENRIQUECER PARA REDUZIR A DAR
[0527] O produto foi purificado em porções em colunas de purificação HIC disponíveis comercialmente como as disponíveis comercialmente na GE Life Sciences (alquil Sefarose) usando um gradiente de tampões de sulfato de amônio/fosfato a pH 7,1 com monitoramento a 280 nm por UV. O conjunto de produtos DAR2 coletados (aproximadamente 9,5 g, 30% de rendimento) foi trocado por tampão com tampão a pH 6,0 por TFF usando membranas Pellicon 3 Ultracel 30 kD e depois diluído com componentes da formulação para armazenamento.
[0528] O produto resultante (A280 6,4 mg/ml) demonstrou ter um DAR de cerca de 2 conforme medido em uma coluna HIC disponível comercialmente e constituir as seguintes características e espécies de DAR: SEC 99,6% de monômero, 0,2% de HMW, 0,2% de LMW, A endotoxina <0,06 EU/mg e a DAR E2 foram de cerca de 99,0% da área, com variabilidade de corrida para corrida entre 94 a 99% de DAR E2. Nos exemplos aqui descritos, este produto de DAR Enriquecido 2 (“E2”) é referido como “anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2”.
EXEMPLO 27: AVALIAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS BIOFÍSICAS DE ESPÉCIES E2 VERSUS ESPÉCIES DAR MAIS ALTAS EM MODELOS MURINOS PRÉ-CLÍNICOS
[0529] O produto conjugado, não purificado por HIC, obtido a partir do método descrito no Exemplo 25, foi executado em uma coluna HIC usando tampões e procedimentos padrão, conforme descrito aqui. Como mostrado na Figura 18A, foram identificadas várias espécies com carga de fármaco entre 0 e 8.
[0530] O produto E2 purificado obtido do Exemplo 26 foi submetido à mesma cromatografia HIC. Como mostrado na Figura 18B, apenas uma única espécie contendo uma carga de fármaco de 2 foi observada.
[0531] Os produtos não purificados e E2 foram radiomarcados e injetados em camundongos para avaliar a depuração geral e a toxicidade de cada produto. Como mostrado na Figura 18C, o produto E2 purificado mostrou ter uma folga significativamente menor em relação ao produto não purificado e carregado com muito fármaco.
OUTRAS MODALIDADES
[0532] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição anterior pretende ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo a seguir.

Claims (19)

1. Anticorpo ativável conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a estrutura da Fórmula (0 ou um sal do mesmo:
Figure img0052
(a) em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende i. uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência de CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência de CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11; e ii. uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15; (ii) MM é uma porção de mascaramento que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; (iii) LP1 é uma primeira porção de ligação que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 207; (iv) CM é uma porção clivável que compreende a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (v) LP2 é uma segunda porção de ligação que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38; e (b) em que “n” é 2.
2. Anticorpo ativável conjugado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o AB compreende um isotipo IgG1.
3. Anticorpo ativável conjugado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o AB é um anticorpo tendo uma região constante da cadeia pesada, e em que o resíduo C-terminal da região constante da cadeia pesada não é uma lisina.
4. Anticorpo ativável conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência da SEQ ID NO: 5 e a região variável da cadeia leve compreende uma sequência da SEQ ID NO: 7.
5. Anticorpo ativável conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 19.
6. Anticorpo ativável conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 201.
7. Anticorpo ativável conjugado, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 202.
8. Anticorpo ativável conjugado, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 202, em que o aminoácido N-terminal da SEQ ID NO: 202 é modificado a piroglutamato.
9. Anticorpo ativável conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 169.
10. Anticorpo ativável conjugado, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 170.
11. Anticorpo ativável conjugado, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 167 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 170, em que o aminoácido N-terminal da SEQ ID NO: 170 é modificado a piroglutamato.
12. Anticorpo ativável conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a estrutura da Fórmula (IQ ou um sal da mesma:
Figure img0053
Fórmula (II) (a) em que (i) AB é um anticorpo que se liga especificamente ao CD71 humano e compreende i. uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma sequência de CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 10 e uma sequência de CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11; e ii. uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, uma sequência CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma sequência CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 15; (ii) MM é uma porção de mascaramento que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, em que a MM inibe a ligação do AB ao CD71 humano quando o anticorpo ativável conjugado está em um estado não clivado; e (iii) CM é uma porção clivável que compreende a sequência da SEQ ID NO: 156, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease; e (b) em que “n” é 2.
13. Método para fabricar o anticorpo ativável conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende (i) reduzir um anticorpo ativável que compreende MM-LP1-CM-LP2-AB ou MM-CM-AB com um agente redutor; e (ii) conjugar um ou mais vcMMAEs ao anticorpo ativável reduzido.
14. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: o anticorpo ativável conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12; e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. Uso do anticorpo ativável conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar, aliviar um sintoma ou atrasar a progressão de um câncer em um indivíduo com necessidade da mesmo.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em: câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama ER+, câncer de mama triplo negativo, câncer colorretal, melanoma, câncer de próstata, mieloma múltiplo, linfoma difuso de células B grandes, carcinoma de células pequenas de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas, mesotelioma, linfoma não Hodgkin, carcinoma hepatocelular e glioblastoma.
17. Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: o anticorpo ativável conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12; e um ou mais vcMMAE e/ou um agente redutor; e opcionalmente, um marcador detectável.
18. Uso do anticorpo ativável conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que é em métodos de diagnóstico e/ou imagem.
19. Método in vitro para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) colocar a amostra em contato com o anticorpo ativável, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12; e (ii) medir um nível de anticorpo ativável conjugado na amostra.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130116404A1 (en) 2011-11-08 2013-05-09 Case Western Reserve University Targeted non-invasive imaging probes of egfr expressing cells
BR112017023862A2 (pt) * 2015-05-04 2018-07-17 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd71, anticorpos anti-cd71 ativáveis, e métodos de uso destes
WO2019183633A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Case Western Reserve Univeristy Psma targeted conjugate compounds and uses thereof
CA3179911A1 (en) * 2020-04-08 2021-10-14 Janssen Biotech, Inc. Compositions and methods for blood-brain barrier delivery
WO2021207657A1 (en) * 2020-04-09 2021-10-14 Cytomx Therapeutics, Inc. Compositions containing activatable antibodies
WO2024026474A1 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988001513A1 (en) 1986-08-28 1988-03-10 Teijin Limited Cytocidal antibody complex and process for its preparation
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
EP1919931A4 (en) 2005-08-31 2010-01-20 Univ California CELLULAR LIBRARIES OF PEPTIDE SEQUENCES (CLIPS) AND METHODS OF USE THEREOF
CA3128656A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
EP2570137A3 (en) * 2007-11-07 2013-08-21 Celldex Therapeutics, Inc. Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (DEC-205)
EP2385955B1 (en) 2009-01-12 2020-08-12 CytomX Therapeutics, Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
ES2725356T3 (es) * 2009-04-29 2019-09-23 Henry M Jackson Found Advancement Military Medicine Inc Anticuerpos monoclonales de ERG2 y su uso terapéutico
CA2761310C (en) 2009-05-07 2017-02-28 Charles S. Craik Antibodies and methods of use thereof
SG191977A1 (en) * 2011-02-01 2013-08-30 Genmab As Human antibodies and antibody-drug conjugates against cd74
HUE054362T2 (hu) * 2012-01-31 2021-09-28 Sbi Biotech Co Ltd Foszfolipáz D4 elleni antitest
WO2014026136A2 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-resistant systems for polypeptide display and methods of making and using thereof
CN103145847B (zh) * 2013-02-05 2014-05-21 浙江大学 一种抗cd20抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用
KR102535900B1 (ko) * 2013-12-25 2023-05-26 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 trop2 항체-약물 컨쥬게이트
BR112017023862A2 (pt) * 2015-05-04 2018-07-17 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd71, anticorpos anti-cd71 ativáveis, e métodos de uso destes
CN106237341B (zh) * 2016-07-12 2019-07-30 浙江大学 一种抗体偶联药物及其制备方法和应用

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