CN111278467A - 抗cd71可活化抗体药物缀合物和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及以活性形式结合CD71的缀合可活化抗体，和制备这些抗CD71缀合可活化抗体并且在多种治疗、诊断以及预防适应症中使用所述抗体的方法。

Description

抗CD71可活化抗体药物缀合物和其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年10月14日提交的美国临时申请第62/572,467号的权益，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
对序列表的参考
根据37C.F.R.§1.821通过EFS-Web以计算机可读形式(CFR)按文件名为“CYTM056001US_12OCT2018_FINAL_ST25.txt”与此同时电子提交的“序列表”以引用的方式并入本文中。序列表的电子副本创建于2018年10月12日，并且磁盘大小为96千字节。
技术领域
本发明大体上涉及以活化状态结合CD71的可活化抗体药物缀合物(AADC)，和制备这些抗CD71缀合可活化抗体并且在多种治疗、诊断以及预防适应症中使用所述抗体的方法。
背景技术
基于抗体的疗法已经证实可有效治疗数种疾病，但在一些情况下，因宽靶标表达范围导致的毒性限制了其治疗有效性。另外，基于抗体的治疗剂展现其它局限性，如施用后迅速从循环中清除。
在小分子治疗剂领域中，已开发出提供活性化学实体的前药的策略。此类前药以相对无活性(或活性显著较低)的形式施用。一旦施用，则前药在体内代谢成活性化合物。此类前药策略可提供药物对其预期靶标提高的选择性并且减少不良影响。
因此，在基于抗体的治疗剂领域中继续需要模拟小分子前药的期望特征的抗体。
发明内容
本公开提供特异性结合CD71，也称为转铁蛋白受体蛋白1(TfR1)的缀合可活化抗体。
在本发明的一个方面，本文提供包含式(I)结构或其盐的缀合可活化抗体：
Figure BDA0002465367670000021
其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：10的CDRH2序列和包含SEQ IDNO：11的CDRH3序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含有包含SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：13的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：14的CDRL2序列和包含SEQ ID NO：15的CDRL3序列；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；(iii)LP1是包含SEQ ID NO：207的氨基酸序列的第一键联部分；(iv)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(v)LP2是包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的第二键联部分；并且(b)其中“n”是2。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的一个相关方面，本文提供包含式(I)结构或其盐的缀合可活化抗体，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：5的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：7的序列的轻链可变区；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；(iii)LP1是包含SEQ ID NO：207的氨基酸序列的第一键联部分；(iv)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(v)LP2是包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的第二键联部分；并且(b)其中“n”是2。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的一个相关方面，本文提供包含式(I)结构或其盐的缀合可活化抗体，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：19的序列的轻链；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；(iii)LP1是包含SEQID NO：207的氨基酸序列的第一键联部分；(iv)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(v)LP2是包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的第二键联部分；并且(b)其中“n”是2。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的一个相关方面，本文提供包含式(I)结构或其盐的缀合可活化抗体，其中MM-LP1-CM-LP2-AB是可活化抗体，其中AB是特异性结合到人类CD71的抗体，其中可活化抗体包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：169的序列的轻链，并且其中“n”是2。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的一个相关方面，本文提供包含式(I)结构或其盐的缀合可活化抗体，其中MM-LP1-CM-LP2-AB是可活化抗体，其中AB是特异性结合到人类CD71的抗体，其中可活化抗体包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：170的序列的轻链，其中“n”是2。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的一个相关方面，本文提供包含式(II)结构或其盐的缀合可活化抗体：
Figure BDA0002465367670000041
其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：10的CDRH2序列和包含SEQ IDNO：11的CDRH3序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含有包含SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：13的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：14的CDRL2序列和包含SEQ ID NO：15的CDRL3序列；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；并且(iii)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(b)其中“n”是2。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的一个相关方面，本文提供包含式(II)结构或其盐的缀合可活化抗体，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：5的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：7的序列的轻链可变区；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；并且(iii)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(b)其中“n”是2。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的一个相关方面，本文提供包含式(II)结构或其盐的缀合可活化抗体，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：19的序列的轻链；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；并且(iii)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(b)其中“n”是2。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的一个相关方面，本文提供包含式(II)结构或其盐的缀合可活化抗体，其中MM-LP1-CM-LP2-AB是可活化抗体，其中AB是特异性结合到人类CD71的抗体，其中可活化抗体包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：169的序列的轻链，并且其中“n”是2。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的一个相关方面，本文提供包含式(II)结构或其盐的缀合可活化抗体，其中MM-LP1-CM-LP2-AB是可活化抗体，其中AB是特异性结合到人类CD71的抗体，其中可活化抗体包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：170的序列的轻链，并且其中“n”是2。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供制造包含式(I)结构或其盐的缀合可活化抗体的方法，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：10的CDRH2序列和包含SEQ ID NO：11的CDRH3序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含有包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：14的CDRL2序列和包含SEQ ID NO：15的CDRL3序列；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；(iii)LP1是包含SEQ ID NO：207的氨基酸序列的第一键联部分；(iv)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(v)LP2是包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的第二键联部分；并且(b)其中“n”是2；方法包含：(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供制造包含式(I)结构或其盐的缀合可活化抗体的方法，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：5的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：7的序列的轻链可变区；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；(iii)LP1是包含SEQ ID NO：207的氨基酸序列的第一键联部分；(iv)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(v)LP2是包含SEQ IDNO：38的氨基酸序列的第二键联部分；并且(b)其中“n”是2；方法包含：(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供制造包含式(I)结构或其盐的缀合可活化抗体的方法，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：19的序列的轻链；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；(iii)LP1是包含SEQ ID NO：207的氨基酸序列的第一键联部分；(iv)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(v)LP2是包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的第二键联部分；并且(b)其中“n”是2；方法包含：(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供制造包含式(I)结构或其盐的缀合可活化抗体的方法，其中MM-LP1-CM-LP2-AB是可活化抗体，其中AB是特异性结合到人类CD71的抗体，其中可活化抗体包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：169的序列的轻链，并且(b)其中“n”是2；方法包含：(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供制造包含式(I)结构或其盐的缀合可活化抗体的方法，其中MM-LP1-CM-LP2-AB是可活化抗体，其中AB是特异性结合到人类CD71的抗体，其中可活化抗体包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：170的序列的轻链；并且(b)其中“n”是2；方法包含：(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供制造包含式(II)结构或其盐的缀合可活化抗体的方法，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：10的CDRH2序列和包含SEQ ID NO：11的CDRH3序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含有包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：14的CDRL2序列和包含SEQ ID NO：15的CDRL3序列；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；(iii)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(b)其中“n”是2；方法包含：(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供制造包含式(II)结构或其盐的缀合可活化抗体的方法，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：5的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：7的序列的轻链可变区；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；(iii)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(b)其中“n”是2；方法包含：(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供制造包含式(II)结构或其盐的缀合可活化抗体的方法，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：19的序列的轻链；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；(iii)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(b)其中“n”是2；方法包含：(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供制造包含式(II)结构或其盐的缀合可活化抗体的方法，其中MM-LP1-CM-LP2-AB是可活化抗体，其中AB是特异性结合到人类CD71的抗体，其中可活化抗体包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：169的序列的轻链，并且(b)其中“n”是2；方法包含：(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供制造包含式(II)结构或其盐的缀合可活化抗体的方法，其中MM-LP1-CM-LP2-AB是可活化抗体，其中AB是特异性结合到人类CD71的抗体，其中可活化抗体包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：170的序列的轻链，并且(b)其中“n”是2；方法包含：(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供医药组合物，其包含式(I)或式(II)的一个重复的缀合可活化抗体。在一些实施例中，医药组合物可包含药学上可接受的载剂。
在本发明的另一方面，本文提供治疗个体的癌症、减轻个体的癌症症状或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包含针对癌症向有需要的个体施用治疗有效量的式(I)或式(II)的缀合可活化抗体，或包含式(I)或式(II)的一个重复的缀合可活化抗体和任选地药学上可接受的载剂的医药组合物，所述癌症选自由以下组成的组：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、ER+乳腺癌、三阴性乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部小细胞癌、胰腺癌、间皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)、肝细胞癌以及成胶质细胞瘤。
在本发明的另一方面，本文提供缀合可活化抗体，所述抗体包含(a)可活化抗体(AA)，其在未裂解状态下从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到哺乳动物CD71，并且包含SEQ ID NO：5的重链可变区序列和SEQ ID NO：7的轻链可变区序列；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，与AB偶联的MM抑制AB与CD71的结合；(iii)CM是与AB偶联的包含SEQ IDNO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；和(b)单甲基奥瑞他汀E(monomethyl auristatin E；MMAE)，其中可活化抗体与两个当量的MMAE偶联。在一些实施例中，缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供具有式AA-(AG)p的缀合可活化抗体，其中(a)AA是可活化抗体，其在未裂解状态下从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB，其中(i)AB是抗体，其特异性结合到哺乳动物CD71，并且包含SEQ ID NO：5的重链可变区序列和SEQ ID NO：7的轻链可变区序列；(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，与AB偶联的MM抑制AB与CD71的结合；(iii)CM是与AB偶联的包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；和(b)AG是与AA缀合的药剂，其中所述药剂是MMAE并且其中p是2。在一些实施例中，缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供一种制造缀合可活化抗体的方法，其包含：(a)将至少一个MMAE缀合到可活化抗体(AA)，从而产生包含AA--(MMAE)p的组合物，其中p是1到8；和(b)针对其中p为2的缀合可活化抗体物种富集组合物，其中AA在未裂解状态下从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB，其中AB是抗体，其特异性结合到哺乳动物CD71并且包含SEQ ID NO：5的重链可变区序列和SEQ ID NO：7的轻链可变区序列；(ii)MM是包含SEQ IDNO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，与AB偶联的MM抑制AB与CD71的结合；(iii)CM是与AB偶联的包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；和(b)AG是与AA缀合的药剂，其中所述药剂是MMAE并且其中p是2。在一些实施例中，缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在本发明的另一方面，本文提供如本文所公开的任何缀合可活化抗体或医药组合物，其用作药剂。
在本发明的另一方面，本文提供了本文所公开的用于治疗癌症的任何缀合可活化抗体或医药组合物，任选地，其中癌症选自由以下组成的组：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、ER+乳腺癌、三阴性乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部小细胞癌、胰腺癌、间皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肝细胞癌以及成胶质细胞瘤。
在本发明的另一方面，本文提供试剂盒，其包含至少一种如本文所公开的可活化抗体。所述试剂盒可进一步包含一个或多个vcMMAE和/或还原剂。
附图说明
如实例5所论述，图1描绘了确定各种原发性和转移性癌组织类型中CD71表达水平的示例性免疫组织化学(IHC)分析。这张图和实例中显示的示例性结果显示，CD71在多种人类癌症的原发性肿瘤中以高水平表达。
如实例5中所论述，图2描绘了在多个患者来源的转移癌样品中CD71表达水平的示例性研究。这张图和实例中显示的示例性结果显示，CD71在多种人类癌症的转移性肿瘤中以高水平表达。
如实例4中所论述，图3A和3B描绘了当可活化抗体完整或蛋白水解活化(表示为“ACT”)时，本公开的未缀合和缀合的抗CD71可活化抗体结合人类或食蟹猕猴重组CD71的能力的示例性体外分析。这些图和实例中显示的示例性结果显示，抗CD71缀合可活化抗体与其未缀合抗CD71可活化抗体对应物以相当的水平结合到CD71，并且两者以蛋白酶活化后同等增加的亲和力结合CD71。
如实例4中所论述，图3C和3D描绘了当可活化抗体完整或蛋白水解活化(表示为“ACT”)时，本公开的未缀合和缀合的抗CD71可活化抗体结合细胞表面上的人类或食蟹猕猴CD71的能力的示例性体外分析。这些图和实例中显示的示例性结果显示，抗CD71缀合可活化抗体与其未缀合抗CD71可活化抗体对应物以相当的水平结合到细胞表面CD71，并且两者以蛋白酶活化后同等增加的亲和力结合细胞表面CD71。
如实例6中所论述，图4A、4B和4C描绘了本公开的抗CD71缀合可活化抗体(AADC)在小鼠异种移植模型中的示例性功效研究(抗CD71TF01-3011-MMAE与抗CD71 TF02.13-2011-MMAE)。这些图和实例中显示的这些示例性结果显示，具有较低亲和力掩蔽部分(TF02.13)的AADC展现比具有较高亲和力掩蔽部分(TF01)的AADC更高的功效。
如实例7中所论述，图5描绘了本公开的抗CD71缀合可活化抗体(AADC)在小鼠异种移植模型中的示例性功效研究。这张图和实例中显示的示例性结果证明，具有较难裂解底物的指定AADC(抗CD71 TF02.13-2011-vcMMAE)的功效与图4B和4C中所示的具有较易裂解的底物的AADC(抗CD71TF02.13-3011-vcMMAE)的功效大体上相同。
如实例8中所论述，图6A、6B、6C以及6D描绘了小鼠异种移植模型中本公开的具有不同DAR的抗CD71缀合可活化抗体(AADC)(具有约3的DAR的抗CD71 TF02.13-2011-vcMMAE与具有约2的DAR抗CD71TF02.13-2011-vcMMAE E2)的示例性功效研究。这些图和实例中显示的示例性结果证明，具有不同DAR的剂量匹配AADC(抗CD71 TF02.13-2011-vcMMAE)的功效显示相当的功效。
如实例9中所论述，图7A、7B和7C显示了用于分析由施用本公开的抗CD71缀合可活化抗体(AADC)产生的代谢产物的示例性示意工作流。
如实例11到14中所论述，图8A、8B、9A、9B、10以及11描绘了在动物模型中施用本公开的抗CD71缀合可活化抗体(AADC)后代谢副产物的示例性时间过程。这些图和实例中显示的示例性结果显示，在整个给药过程中在动物中，本公开的全部和完整AADC(抗CD71TF02.13-2011-vcMMAE E2)的量以与剂量成比例的量维持，并且在整个给药过程中和在所有给药水平下，与可活化抗体缀合的MMAE的量显著高于未缀合的MMAE的量。
如实例17中所论述，图12描绘了指定测试品向iC3b蛋白片段的示例性滴定，表示其活化补体级联的能力。这张图和实例中显示的示例性结果证明，与其未缀合的可活化抗体相比，本公开的AADC(抗CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)展现较低的补体活化能力。
如实例19中所论述，图13描绘了在使用人类结肠直肠细胞系的小鼠异种移植模型中，本公开的AADC(抗CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)的示例性功效。这张图和实例中显示的示例性结果证明，本公开的AADC在所有剂量下显示显著肿瘤生长抑制，在最高剂量下观察到完全消退。
如实例20中所论述，图14描绘了在使用人类患者来源的肿瘤(DLBCL)的小鼠异种移植模型中，本公开的AADC(抗CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)的示例性功效。这张图和实例中显示的示例性结果证明，本公开的AADC在单次施用后显示显著肿瘤生长抑制，在一些情况下观察到完全反应。
如实例21所论述，图15A、15B和15C描绘了在小鼠患者来源的异种移植(PDX)模型中，本公开的AADC(抗CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)的示例性功效。这些图和实例中显示的示例性结果证明，本公开的AADC在来源于多种人类癌症类型的PDX模型中证明了功效，包括在一些情况下的完全反应。
如实例22中所论述，图16描绘了在小鼠患者来源的异种移植模型中，本公开的AADC(抗CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)的示例性功效。这张图和实例中显示的示例性结果证明，本公开的AADC证明了对PDX胰腺癌模型的功效，包括在一些情况下的完全反应。
如实例10中所论述，图17概述了结果，其显示与对应的亲本抗CD71抗体药物缀合物(ADC)、具有更大可裂解性的底物的AADC和具有较高DAR的AADC相比，即使在较高相对剂量下，本公开的具有缀合毒素的抗人类CD71可活化抗体(AADC)(抗CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)在食蟹猕猴中具有良好的耐受性并且稳定。
如实例27中所论述，图18A、18B和18C显示了未纯化抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE和纯化抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2中存在的物种的HIC分离分布图，以及其在小鼠中的清除率。这些图和实例显示，抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2以单一缀合物物种形式迁移并且具有较低的清除率。
具体实施方式
本公开提供了抗CD71缀合可活化抗体，其在活化状态下特异性结合CD71。CD71也称为转铁蛋白受体蛋白1(TfR1)。一般来说，本公开涉及抗CD71缀合可活化抗体，其包含掩蔽部分、可裂解部分、vc接头以及MMAE毒素。当可活化抗体呈未裂解状态时，掩蔽部分(MM)降低抗体结合位点与其CD71靶抗原结合的能力；可裂解部分(CM)是在肿瘤微环境中被裂解，引起掩蔽部分的去除和靶向抗CD71的CDR的伴随活化的蛋白酶可活化的底物。具体地，本公开描述了抗CD71缀合可活化单克隆抗体的选择，所述单克隆抗体相对于所属领域中其它已知的其它抗CD71缀合可活化单克隆抗体具有优异的功效和耐受性，因为其具有较低亲和力掩蔽部分、较难裂解的部分底物和为2的低载药量的独特组合，其共同引起小鼠肿瘤模型中的功效和耐受性显著提高。另外，与含有野生型IgG1 Fc的其它抗体不同，抗CD71缀合可活化单克隆抗体还出人意料地缺乏与抑制性FcγRIIb受体结合的能力，这很重要，因为已知与此类受体的结合抑制钙依赖性过程，如脱粒、吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放以及促炎性活化，如果FcγRIIb受体被活化，则预期所有这些过程都导致功效降低。
CD71是在分裂细胞(包括癌细胞)上表达的细胞表面受体。其在多种癌细胞类型中以高水平表达，并且CD71被内化，因此使其成为使用抗体导向缀合毒素的靶向癌症疗法的有吸引力的靶标。鉴别并且使用具有较高和较低亲和力的掩蔽部分(MM)以及具有更小或更大可裂解性的可裂解部分(CM)来构建多种可活化抗体，并且然后构建vcMMAE缀合抗体(即可活化抗体药物缀合物或AADC)。这些缀合可活化抗体在小鼠异种移植模型中的示例性功效研究显示，与具有较低亲和力掩蔽的AADC(例如，CD71-TF02.13-3011-vcMMAE)相比，具有较高亲和力掩蔽部分的AADC(例如，CD71-TF01-3011-vcMMAE)展现较低功效。此外，使用具有相同较低亲和力掩蔽但具有不同可裂解性的底物的AADC进行的其它功效研究显示，尽管功效相同，但在非人类灵长类动物中，与具有较易裂解的底物的AADC(CD71-TF02.13-3011-vcMMAE)相比，具有较难裂解底物的AADC(CD71-TF02.13-2011-vcMMAE具有更好的耐受性和较低水平的呈活化形式的循环AADC，从而提供更高的治疗指数。进一步的研究显示，与具有较高DAR(即DAR约3)的相同结合可活化抗体相比，具有较低药物与可活化抗体比率(例如，CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2，其中DAR为2)的AADC在较高剂量下的耐受性较好。此外，CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2在多种人类癌症的CDX和PDX小鼠模型中，以剂量匹配的剂量显示与较高DAR AADC等同的功效。最后，CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2相对于其未掩蔽的对应物显示显著耐受性，所述对应物即使在低剂量下也不耐受。
在一些实施例中，缀合可活化单克隆抗体被含CD71的细胞内化。术语“CD71”的使用旨在涵盖其任何变型，如借助于非限制性示例，CD-71和/或CD71，并且所有变型在本文中可互换使用。
CD71是主要结合转铁蛋白的跨膜糖蛋白。CD71对于细胞稳态至关重要。CD71通过配体介导的内吞作用不断再循环，其中主要的配体是转铁蛋白。还已知CD71在分裂细胞上广泛表达。
CD71的异常表达和/或活性和CD71相关信号传导牵涉许多疾病和病症(如癌症)的发病机理。CD71在包括实体癌症和血液癌症的许多癌症中过表达。CD71具有宽细胞表面表达。恶性细胞中的CD71介导细胞分裂所需的较高铁摄取。CD71还与白血病的不良预后相关。CD71是理想靶标，因为其在多种癌症指征中普遍存在。
本公开提供了缀合可活化抗CD71抗体，所述抗体适用于治疗、预防与异常CD71表达和/或活性相关的疾病或病症，延缓其进展，改善和/或减轻其症状的方法。举例来说，可活化抗CD71抗体用于治疗、预防癌症或其它赘生性病况，延缓其进展，改善和/或减轻其症状的方法。
本公开提供了抗缀合可活化抗CD71抗体，所述抗体适用于治疗、预防与表达CD71的细胞相关的疾病或病症，延缓其进展，改善和/或减轻其症状的方法。在一些实施例中，细胞与异常CD71表达和/或活性相关。在一些实施例中，细胞与正常CD71表达和/或活性相关。举例来说，可活化抗CD71抗体用于治疗、预防癌症或其它赘生性病况，延缓其进展，改善和/或减轻其症状的方法。
本公开提供了缀合可活化抗CD71抗体，所述抗体适用于治疗、预防病变细胞表达CD71的疾病或病症，延缓其进展，改善和/或减轻其症状的方法。在一些实施例中，病变细胞与异常CD71表达和/或活性相关。在一些实施例中，病变细胞与正常CD71表达和/或活性相关。举例来说，可活化抗CD71抗体用于治疗、预防癌症或其它赘生性病况，延缓其进展，改善和/或减轻其症状的方法。
缀合可活化抗CD71抗体包括与掩蔽部分(MM)偶联的特异性结合CD71的抗体或其抗原结合片段，使得MM的偶联降低了抗体或其抗原结合片段结合CD71的能力。在一些实施例中，MM通过包括蛋白酶的底物的序列偶联，所述蛋白酶例如与CD71共定位于个体治疗位点的蛋白酶。
本发明的示例性可活化抗CD71抗体包括例如可活化抗体，其包括重链和轻链，所述重链和轻链是或衍生自以下所示的重链可变序列和轻链可变序列(CDR序列以粗体和下划线显示)：
muM21 VH：
Figure BDA0002465367670000201
muM21 VL：
Figure BDA0002465367670000202
hu2vHa可变重链
Figure BDA0002465367670000203
hu2vHb可变重链
Figure BDA0002465367670000204
hu2vHc可变重链
Figure BDA0002465367670000205
hu21vKa可变轻链
Figure BDA0002465367670000206
hu21vKb可变轻链
Figure BDA0002465367670000207
hu21vKc可变轻链
Figure BDA0002465367670000208
本发明的示例性可活化抗CD71抗体包括例如可活化抗体，其包括以下的组合：可变重链互补决定区1(VH CDR1，在本文中也称为CDRH1)序列、可变重链互补决定区2(VHCDR2，在本文中也称为CDRH2)序列、可变重链互补决定区3(VH CDR3，在本文中也称为CDRH3)序列、可变轻链互补决定区1(VL CDR1，在本文中也称为CDRL1)序列、可变轻链互补决定区2(VL CDR2，在本文中也称为CDRL2)序列以及可变轻链互补决定区3(VL CDR3，在本文中也称为CDRL3)序列，其中至少一个CDR序列选自由以下组成的组：包含氨基酸序列GYTFTSYWMH(SEQ ID NO：9)的VH CDR1序列；包含氨基酸序列AIYPGNSETG(SEQ ID NO：10)的VH CDR2序列；包含氨基酸序列ENWDPGFAF(SEQ ID NO：11)的VH CDR3序列；包含氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO：12)或CRASSSVYYMY(SEQ ID NO：13)的VL CDR1序列；包含氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：14)的VL CDR2序列；以及包含氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO：15)的VL CDR3序列。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段包含以下的组合：VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列以及VL CDR3序列，其中至少一个CDR序列选自由以下组成的组：包括与包含氨基酸序列GYTFTSYWMH(SEQID NO：9)的VH CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列的VH CDR1序列；包括与包含氨基酸序列AIYPGNSETG(SEQ ID NO：10)的VH CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列的VH CDR2序列；包括与包含氨基酸序列ENWDPGFAF(SEQ ID NO：11)的VHCDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列的VH CDR3序列；包括与包含氨基酸序列ASSSVYYMY(SEQ ID NO：12)或CRASSSVYYMY(SEQ ID NO：13)的VL CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列的VL CDR1序列；包括与包含氨基酸序列STSNLAS(SEQ IDNO：14)的VL CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列的VL CDR2序列；以及包括与包含氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO：15)的VL CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列的VL CDR3序列。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段包含以下的组合：VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列以及VL CDR3序列，其中VH CDR1序列包含氨基酸序列GYTFTSYWMH(SEQ ID NO：9)；VH CDR2序列包含氨基酸序列AIYPGNSETG(SEQ ID NO：10)；VH CDR3序列包含氨基酸序列ENWDPGFAF(SEQ ID NO：11)；VL CDR1序列包含氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO：12)或CRASSSVYYMY(SEQ ID NO：13)；VL CDR2序列包含氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：14)；并且VL CDR3序列包含氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO：15)。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段以下的组合：VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列以及VL CDR3序列，其中VH CDR1序列包含与氨基酸序列GYTFTSYWMH(SEQ ID NO：9)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列；VH CDR2序列包含与氨基酸序列AIYPGNSETG(SEQ ID NO：10)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列；VH CDR3序列包含与氨基酸序列ENWDPGFAF(SEQ IDNO：11)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列；VL CDR1序列包含与氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO：12)或CRASSSVYYMY(SEQ IDNO：13)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列；VL CDR2序列包含与氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：14)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列；并且VL CDR3序列包含与氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO：15)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体包括特异性结合CD71的抗体。在一些实施例中，缀合可活化抗体包括结合CD71的单克隆抗体。在一些实施例中，此类结合CD71的单克隆抗体是人源化或完全人类单克隆抗体。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：5的重链可变区氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：7的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：5的重链可变区氨基酸序列和包含SEQ ID NO：7的轻链可变区氨基酸序列或其抗原结合片段。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段包含与包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的重链可变区氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段包含与包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段包含与包含SEQ ID NO：1和3-5的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的重链可变区氨基酸序列，和与包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段由包含编码重链氨基酸序列的核酸序列的核酸序列编码，所述重链氨基酸序列包含有包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段由包含编码轻链氨基酸序列的核酸序列的核酸序列编码，所述轻链氨基酸序列包含有包含SEQID NO：7的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段由包含编码重链氨基酸序列的核酸序列和编码轻链氨基酸序列的核酸序列的核酸序列编码，所述重链氨基酸序列包含有包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码包含有包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码包含有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码包含有包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列，和与编码包含有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。
本公开还提供了通过在引起可活化抗体表达的条件下培养细胞来产生本公开的缀合可活化抗体的可活化抗体的方法，其中所述细胞包含本公开的核酸分子或本公开的载体。
本公开还提供了缀合可活化抗体，其包括与掩蔽部分(MM)偶联的特异性结合CD71的抗体或其抗原结合片段，使得MM的偶联降低抗体或其抗原结合片段结合CD71的能力。在一些实施例中，MM通过包括蛋白酶的底物的序列偶联，所述蛋白酶例如在患病组织中有活性的蛋白酶和/或与CD71共定位于个体的治疗位点的蛋白酶。本文提供的缀合可活化抗CD71抗体，在本文中也可互换地称作抗CD71缀合可活化抗体或CD71缀合可活化抗体，在循环中稳定，在治疗和/或诊断的预期部位活化，但在正常，例如健康组织或其它未作为治疗和/或诊断目标的组织中不活化，并且在活化时展现至少与对应的未修饰抗体(在本文中也称为亲本抗体)相当的与CD71的结合。
本发明还提供了治疗、预防与个体的CD71的异常表达和/或活性相关的症状和/或延缓其发作或进展或减轻所述症状的方法，所述方法使用结合CD71的缀合可活化抗体，尤其结合并且中和或以其它方式抑制CD71的至少一种生物活性和/或CD71介导的信号传导的缀合可活化抗体。
本发明还提供了治疗、预防与个体的表达CD71或异常表达CD71的细胞的存在、生长、增殖、转移和/或活性相关的症状和/或延缓其发作或进展或减轻所述症状的方法，所述方法使用结合CD71的缀合可活化抗体，尤其结合、靶向、中和、杀死或以其它方式抑制表达或异常表达CD71的细胞的至少一种生物活性的可活化抗体。
本发明还提供了治疗、预防与个体的表达CD71的细胞的存在、生长、增殖、转移和/或活性相关的症状和/或延缓其发作或进展或减轻所述症状的方法，所述方法使用结合CD71的缀合可活化抗体，尤其结合、靶向、中和、杀死或以其它方式抑制表达CD71的细胞的至少一种生物活性的可活化抗体。
本发明还提供了治疗、预防与个体的异常表达CD71的细胞的存在、生长、增殖、转移和/或活性相关的症状和/或延缓其发作或进展或减轻所述症状的方法，所述方法使用结合CD71的缀合可活化抗体，尤其结合、靶向、中和、杀死或以其它方式抑制异常表达CD71的细胞的至少一种生物活性的可活化抗体。
呈活化状态的缀合可活化抗体结合CD71，并且包括(i)特异性结合到CD71的抗体(AB)；(ii)当可活化抗体呈未裂解状态时抑制AB与CD71结合的掩蔽部分(MM)；和(c)与AB偶联的可裂解部分(CM)，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽。
在一些实施例中，呈未裂解状态的缀合可活化抗体从N端到C端具有如下结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
在一些实施例中，缀合可活化抗体在MM与CM之间包含键联肽。
在一些实施例中，缀合可活化抗体在CM与AB之间包含键联肽。
在一些实施例中，所述缀合可活化抗体包含第一键联肽(LP1)和第二键联肽(LP2)，并且其中呈未裂解状态的缀合可活化抗体从N端到C端具有如下结构排列：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施例中，两个键联肽不需要彼此相同。
在一些实施例中，LP1或LP2中的至少一个包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：24)以及(GGGS)n(SEQ ID NO：25)，其中n是至少一的整数。
在一些实施例中，LP1或LP2中的至少一个包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GGSG(SEQ ID NO：26)、GGSGG(SEQ ID NO：27)、GSGSG(SEQ ID NO：28)、GSGGG(SEQ IDNO：29)、GGGSG(SEQ ID NO：30)以及GSSSG(SEQ ID NO：31)。
在一些实施例中，LP1包含氨基酸序列GGGSSGGS(SEQ ID NO：207)、GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO：32)、GSSGGSGGSGG(SEQ ID NO：33)、GSSGGSGGSGGS(SEQ ID NO：34)、GSSGGSGGSGGSGGGS(SEQ ID NO：35)、GSSGGSGGSG(SEQ ID NO：36)、GSSGGSGGSGS(SEQ IDNO：37)。
在一些实施例中，LP2包含氨基酸序列GSS、GGS、GGGS(SEQ ID NO：38)、GSSGT(SEQID NO：39)或GSSG(SEQ ID NO：40)。
在一些实施例中，AB与哺乳动物CD71结合的解离常数是约100nM或更低。在一些实施例中，AB与哺乳动物CD71结合的解离常数是约10nM或更低。在一些实施例中，AB与CD71结合的解离常数是约5nM或更低。在一些实施例中，AB与CD71结合的解离常数是约1nM或更低。在一些实施例中，AB与CD71结合的解离常数是约0.5nM或更低。在一些实施例中，AB与CD71结合的解离常数是约0.1nM或更低。在一些实施例中，AB与哺乳动物CD71结合的解离常数是0.01nM到100nM、0.01nM到10nM、0.01nM到5nM、0.01nM到1nM、0.01到0.5nM、0.01nm到0.1nM、0.01nm到0.05nM、0.05nM到100nM、0.05nM到10nM、0.05nM到5nM、0.05nM到1nM、0.05到0.5nM、0.05nm到0.1nM、0.1nM到100nM、0.1nM到10nM、0.1nM到5nM、0.1nM到1nM、0.1到0.5nM、0.5nM到100nM、0.5nM到10nM、0.5nM到5nM、0.5nM到1nM、1nM到100nM、1nM到10nM、1nM到5nM、5nM到100nM、5nM到10nM或10nM到100nM。
在一些实施例中，呈未裂解状态的缀合可活化抗体以低于或等于1nM、低于或等于5nM、低于或等于10nM、低于或等于15nM、低于或等于20nM、低于或等于25nM、低于或等于50nM、低于或等于100nM、低于或等于150nM、低于或等于250nM、低于或等于500nM、低于或等于750nM、低于或等于1000nM和/或低于或等于2000nM的解离常数特异性结合到哺乳动物CD71。
在一些实施例中，呈未裂解状态的缀合可活化抗体以在以下范围内的解离常数特异性结合到哺乳动物CD71：1nM到2000nM、1nM到1000nM、1nM到750nM、1nM到500nM、1nM到250nM、1nM到150nM、1nM到100nM、1nM到50nM、1nM到25nM、1nM到15nM、1nM到10nM、1nM到5nM、5nM到2000nM、5nM到1000nM、5nM到750nM、5nM到500nM、5nM到250nM、5nM到150nM、5nM到100nM、5nM到50nM、5nM到25nM、5nM到15nM、5nM到10nM、10nM到2000nM、10nM到1000nM、10nM到750nM、10nM到500nM、10nM到250nM、10nM到150nM、10nM到100nM、10nM到50nM、10nM到25nM、10nM到15nM、15nM到2000nM、15nM到1000nM、15nM到750nM、15nM到500nM、15nM到250nM、15nM到150nM、15nM到100nM、15nM到50nM、15nM到25nM、25nM到2000nM、25nM到1000nM、25nM到750nM、25nM到500nM、25nM到250nM、25nM到150nM、25nM到100nM、25nM到50nM、50nM到2000nM、50nM到1000nM、50nM到750nM、50nM到500nM、50nM到250nM、50nM到150nM、50nM到100nM、100nM到2000nM、100nM到1000nM、100nM到750nM、100nM到500nM、100nM到250nM、100nM到150nM、150nM到2000nM、150nM到1000nM、150nM到750nM、150nM到500nM、150nM到250nM、250nM到2000nM、250nM到1000nM、250nM到750nM、250nM到500nM、500nM到2000nM、500nM到1000nM、500nM到750nM、500nM到500nM、500nM到250nM、500nM到150nM、500nM到100nM、500nM到50nM、750nM到2000nM、750nM到1000nM或1000nM到2000nM。
在一些实施例中，呈活化状态的缀合可活化抗体以低于或等于0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM或10nM的解离常数特异性结合到哺乳动物CD71。
在一些实施例中，呈活化状态的缀合可活化抗体以在以下范围内的解离常数特异性结合到哺乳动物CD71：0.01nM到100nM、0.01nM到10nM、0.01nM到5nM、0.01nM到1nM、0.01到0.5nM、0.01nm到0.1nM、0.01nm到0.05nM、0.05nM到100nM、0.05nM到10nM、0.05nM到5nM、0.05nM到1nM、0.05到0.5nM、0.05nm到0.1nM、0.1nM到100nM、0.1nM到10nM、0.1nM到5nM、0.1nM到1nM、0.1到0.5nM、0.5nM到100nM、0.5nM到10nM、0.5nM到5nM、0.5nM到1nM、1nM到100nM、1nM到10nM、1nM到5nM、5nM到100nM、5nM到10nM或10nM到100nM。
在一些实施例中，哺乳动物CD71选自由以下组成的组：人类CD71、鼠类CD71、大鼠CD71以及食蟹猕猴CD71。在一些实施例中，AB以低于1nM的解离常数特异性结合到人类CD71、鼠类CD71或食蟹猕猴CD71。在一些实施例中，哺乳动物CD71是人类CD71。
在一些实施例中，AB具有以下特征中的一个或多个：(a)AB特异性结合到人类CD71；和(b)AB特异性结合到人类CD71和食蟹猕猴CD71。
在一些实施例中，AB具有以下特征中的一个或多个：(a)AB特异性结合人类CD71和食蟹猕猴CD71；(b)AB抑制转铁蛋白与哺乳动物CD71的结合；(c)AB抑制人转铁蛋白与人类CD71的结合；以及(d)AB抑制食蟹猕猴转铁蛋白与食蟹猕猴CD71的结合。
在一些实施例中，AB以低于或等于5nM、低于或等于10nM、低于或等于50nM、低于或等于100nM、低于或等于500nM和/或低于或等于1000nM的EC50阻断天然配体与哺乳动物CD71结合的能力。在一些实施例中，AB以低于或等于5nM、低于或等于10nM、低于或等于50nM、低于或等于100nM、低于或等于500nM和/或低于或等于1000nM的EC50阻断转铁蛋白与哺乳动物CD71结合的能力。在一些实施例中，CD71的天然配体是转铁蛋白。
在一些实施例中，AB以5nM到1000nM、5nM到500nM、5nM到100nM5nM到50nM、5nM到10nM、10nM到1000nM、10nM到500nM、10nM到100nM 10nM到50nM、50nM到1000nM、50nM到500nM、50nM到100nM、100nM到1000nM、100nM到500nM、500nM到1000nM的EC50阻断天然配体与哺乳动物CD71结合的能力。在一些实施例中，AB以5nM到1000nM、5nM到500nM、5nM到100nM5nM到50nM、5nM到10nM、10nM到1000nM、10nM到500nM、10nM到100nM 10nM到50nM、50nM到1000nM、50nM到500nM、50nM到100nM、100nM到1000nM、100nM到500nM、500nM到1000nM的EC50阻止转铁蛋白与哺乳动物CD71结合的能力。在一些实施例中，CD71的天然配体是转铁蛋白。
在一些实施例中，本公开的AB抑制或减少表达哺乳动物CD71的细胞的生长、增殖和/或转移。在不希望受任何理论束缚的情况下，本公开的AB可通过与CD71特异性结合并且抑制、阻断和/或防止天然配体与哺乳动物CD71的结合而抑制或减少表达哺乳动物CD71的细胞的生长、增殖和/或转移。在一些实施例中，哺乳动物CD71的天然配体是转铁蛋白。
在一些实施例中，MM与AB结合的解离常数大于AB与CD71的解离常数。
在一些实施例中，MM与AB结合的解离常数不大于AB与CD71的解离常数。
在一些实施例中，MM与AB结合的解离常数小于AB与CD71的解离常数。
在一些实施例中，MM针对AB的解离常数(Kd)不大于AB针对靶标的解离常数的2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大，或在以下之间：1到5、5到10、10到100、10到1,000、10到10,000、10到100,000、10到1,000,000、10到10,000,000、100到1,000、100到10,000、100到100,000、100到1,000,000、100到10,000,000、1,000到10,000、1,000到100,000、1,000到1,000,000、1000到10,000,000、10,000到100,000、10,000到1,000,000、10,000到10,000,000、100,000到1,000,000或100,000到10,000,000倍或更大。
在一些实施例中，当可活化抗体呈裂解状态时，MM不干扰AB与CD71的结合或与AB竞争所述结合。
在一些实施例中，MM是长度为约2到40个氨基酸的多肽。在一些实施例中，MM是长度为至多约40个氨基酸的多肽。
在一些实施例中，MM多肽序列与CD71的多肽序列不同。在一些实施例中，MM多肽序列与AB的任何天然结合搭配物不超过50％相同。在一些实施例中，MM多肽序列与CD71的多肽序列不同，并且与AB的任何天然结合搭配物不超过40％、30％、25％、20％、15％或10％相同。
在一些实施例中，MM与AB的偶联降低了AB结合CD71的能力，使得与MM偶联时AB针对CD71的解离常数(Kd)比未与MM偶联时AB针对CD71的Kd大至少两倍。
在一些实施例中，MM与AB的偶联降低了AB结合CD71的能力，使得与MM偶联时AB针对CD71的解离常数(Kd)比未与MM偶联时AB针对CD71的Kd大至少五倍。
在一些实施例中，MM与AB的偶联降低了AB结合CD71的能力，使得与MM偶联时AB针对CD71的解离常数(Kd)比未与MM偶联时AB针对CD71的Kd大至少10倍。
在一些实施例中，MM与AB的偶联降低了AB结合CD71的能力，使得与MM偶联时AB针对CD71的解离常数(Kd)比未与MM偶联时AB针对CD71的Kd大至少20倍。
在一些实施例中，MM与AB的偶联降低了AB结合CD71的能力，使得与MM偶联时AB针对CD71的解离常数(Kd)比未与MM偶联时AB针对CD71的Kd大至少40倍。
在一些实施例中，MM与AB的偶联降低了AB结合CD71的能力，使得与MM偶联时AB针对CD71的解离常数(Kd)比未与MM偶联时AB针对CD71的Kd大至少100倍。
在一些实施例中，MM与AB的偶联降低了AB结合CD71的能力，使得与MM偶联时AB针对CD71的解离常数(Kd)比未与MM偶联时AB针对CD71的Kd大至少1000倍。
在一些实施例中，MM与AB的偶联降低了AB结合CD71的能力，使得与MM偶联时AB针对CD71的解离常数(Kd)比未与MM偶联时AB针对CD71的Kd大至少10,000倍。
在一些实施例中，在存在CD71的情况下，与使用靶置换分析，例如PCT公开案第WO2010/081173号中所描述的分析体外分析时CM被裂解时相比，当CM未被裂解时，MM将AB结合CD71的能力降低至少90％，所述公开案的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，MM包含选自由SEQ ID NO：16或18组成的组的氨基酸序列。
在一些实施例中，裂解CM的蛋白酶在患病组织中活跃，例如，上调或以其它方式不受调控，并且当可活化抗体暴露于蛋白酶时，蛋白酶裂解可活化抗体中的CM。
在一些实施例中，蛋白酶与CD71在组织中共定位，并且当可活化抗体暴露于蛋白酶时，蛋白酶裂解缀合可活化抗体中的CM。
在一些实施例中，CM位于缀合可活化抗体中，使得当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，缀合可活化抗体与CD71的结合被减弱到以比未修饰的AB与CD71结合的解离常数大至少两倍的解离常数进行，而在呈裂解状态时(即，当缀合可活化抗体呈裂解状态时)，AB结合CD71。
在一些实施例中，CM位于缀合可活化抗体中，使得当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，可活化抗体与CD71的结合被减弱到以比未修饰的AB与CD71结合的解离常数大至少五倍的解离常数进行，而在呈裂解状态时(即，当缀合可活化抗体呈裂解状态时)，AB结合CD71。
在一些实施例中，CM位于缀合可活化抗体中，使得当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，可活化抗体与CD71的结合被减弱到以比未修饰的AB与CD71结合的解离常数大至少10倍的解离常数进行，而在呈裂解状态时(即，当缀合可活化抗体呈裂解状态时)，AB结合CD71。
在一些实施例中，CM位于缀合可活化抗体中，使得当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，缀合可活化抗体与CD71的结合被减弱到以比未修饰的AB与CD71结合的解离常数大至少20倍的解离常数进行，而在呈裂解状态时(即，当缀合可活化抗体呈裂解状态时)，AB结合CD71。
在一些实施例中，CM位于缀合可活化抗体中，使得当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，缀合可活化抗体与CD71的结合被减弱到以比未修饰的AB与CD71结合的解离常数大至少40倍的解离常数进行，而在呈裂解状态时，AB结合CD71。
在一些实施例中，CM位于缀合可活化抗体中，使得当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，缀合可活化抗体与CD71的结合被减弱到以比未修饰的AB与CD71结合的解离常数大至少50倍的解离常数进行，而在呈裂解状态时，AB结合CD71。
在一些实施例中，CM位于缀合可活化抗体中，使得当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，缀合可活化抗体与CD71的结合被减弱到以比未修饰的AB与CD71结合的解离常数大至少100倍的解离常数进行，而在呈裂解状态时，AB结合CD71。
在一些实施例中，CM位于缀合可活化抗体中，使得当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，缀合可活化抗体与CD71的结合被减弱到以为比未修饰的AB与CD71结合的解离常数大至少200倍的解离常数进行，而在呈裂解状态时，AB结合CD71。
在一些实施例中，CM是长度为至多15个氨基酸的多肽。
在一些实施例中，CM是包括第一可裂解部分(CM1)和第二可裂解部分(CM2)的多肽，所述第一可裂解部分是至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物，所述第二可裂解部分是至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底物。在一些实施例中，CM1-CM2底物的CM1底物序列和CM2底物序列中的每一个独立地是长度为至多15个氨基酸的多肽。
在一些实施例中，CM是至少一种蛋白酶的底物，所述至少一种蛋白酶是或被认为在癌症中上调或以其它方式不受调控。
在一些实施例中，CM是至少一种选自由以下组成的组的蛋白酶的底物：基质金属蛋白酶(MMP)、凝血酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬酰胺内肽酶(legumain)以及丝氨酸蛋白酶，如间质蛋白酶(MT-SP1)和尿激酶(uPA)。在不受理论束缚的情况下，据信这些蛋白酶在至少一种癌症中上调或以其它方式不受调控。
在一些实施例中，选择CM以便与特定蛋白酶，例如已知与可活化抗体的靶标共定位的蛋白酶一起使用。
在一些实施例中，CM是至少一种MMP的底物。在一些实施例中，CM是选自由以下组成的组的蛋白酶的底物：MMP 9、MMP14、MMP1、MMP3、MMP13、MMP17、MMP11以及MMP19。在一些实施例中，CM是MMP9的底物。在一些实施例中，CM是MMP14的底物。
在一些实施例中，CM是包括以下序列的底物：TGRGPSWV(SEQ ID NO：41)；SARGPSRW(SEQ ID NO：42)；TARGPSFK(SEQ ID NO：43)；LSGRSDNH(SEQ ID NO：44)；GGWHTGRN(SEQ IDNO：45)；HTGRSGAL(SEQ ID NO：46)；PLTGRSGG(SEQ ID NO：47)；AARGPAIH(SEQ ID NO：48)；RGPAFNPM(SEQ ID NO：49)；SSRGPAYL(SEQ ID NO：50)；RGPATPIM(SEQ ID NO：51)；RGPA(SEQID NO：52)；GGQPSGMWGW(SEQ ID NO：53)：FPRPLGITGL(SEQ ID NO：54)；VHMPLGFLGP(SEQ IDNO：55)；SPLTGRSG(SEQ ID NO：56)；SAGFSLPA(SEQ ID NO：57)；LAPLGLQRR(SEQ ID NO：58)；SGGPLGVR(SEQ ID NO：59)；PLGL(SEQ ID NO：60)；LSGRSGNH(SEQ ID NO：175)；SGRSANPRG(SEQ ID NO：176)；LSGRSDDH(SEQ ID NO：177)；LSGRSDIH(SEQ ID NO：178)；LSGRSDQH(SEQID NO：179)；LSGRSDTH(SEQ ID NO：180)；LSGRSDYH(SEQ ID NO：181)；LSGRSDNP(SEQ IDNO：182)；LSGRSANP(SEQ ID NO：183)；LSGRSANI(SEQ ID NO：184)；LSGRSDNI(SEQ ID NO：185)；MIAPVAYR(SEQ ID NO：186)；RPSPMWAY(SEQ ID NO：187)；WATPRPMR(SEQ ID NO：188)；FRLLDWQW(SEQ ID NO：189)；ISSGL(SEQ ID NO：190)；ISSGLLS(SEQ ID NO：191)；和/或ISSGLL(SEQ ID NO：192)。
在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LSGRSDNH(SEQ ID NO：44)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列TGRGPSWV(SEQ ID NO：41)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列PLTGRSGG(SEQ ID NO：47)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列GGQPSGMWGW(SEQ ID NO：53)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列FPRPLGITGL(SEQ ID NO：54)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列VHMPLGFLGP(SEQ ID NO：55)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列PLGL(SEQ ID NO：60)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列SARGPSRW(SEQ ID NO：42)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列TARGPSFK(SEQ ID NO：43)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列GGWHTGRN(SEQ ID NO：45)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列HTGRSGAL(SEQ ID NO：46)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列AARGPAH(SEQ ID NO：48)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列RGPAFNPM(SEQ ID NO：49)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列SSRGPAYL(SEQ IDNO：50)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列RGPAPTIM(SEQ ID NO：51)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列RGPA(SEQ ID NO：52)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LSGRSGNH(SEQ ID NO：175)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列SGRSANPRG(SEQ ID NO：176)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LSGRSDDH(SEQ ID NO：177)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LSGRSDIH(SEQ ID NO：178)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LSGRSDQH(SEQ IDNO：179)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LSGRSDTH(SEQ ID NO：180)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LSGRSDYH(SEQ ID NO：181)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LSGRSDNP(SEQ ID NO：182)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LSGRSANP(SEQ ID NO：183)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LSGRSANI(SEQ ID NO：184)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LSGRSDNI(SEQ ID NO：185)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列MIAPVAYR(SEQ ID NO：186)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列RPSPMWAY(SEQ ID NO：187)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列WATPRPMR(SEQ ID NO：188)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列FRLLDWQW(SEQ ID NO：189)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列ISSGL(SEQ ID NO：190)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列ISSGLLS(SEQ ID NO：191)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列和/或ISSGLL(SEQ ID NO：192)。
在一些实施例中，CM是MMP的底物，并且包括序列ISSGLSS(SEQ ID NO：61)；QNQALRMA(SEQ ID NO：62)；AQNLLGMV(SEQ ID NO：63)；STFPFGMF(SEQ ID NO：64)；PVGYTSSL(SEQ ID NO：65)；DWLYWPGI(SEQ ID NO：66)、ISSGLLSS(SEQ ID NO：67)、LKAAPRWA(SEQ IDNO：68)；GPSHLVLT(SEQ ID NO：69)；LPGGLSPW(SEQ ID NO：70)；MGLFSEAG(SEQ ID NO：71)；SPLPLRVP(SEQ ID NO：72)；RMHLRSLG(SEQ ID NO：73)；LAAPLGLL(SEQ ID NO：74)；AVGLLAPP(SEQ ID NO：75)；LLAPSHRA(SEQ ID NO：76)；和/或PAGLWLDP(SEQ ID NO：77)。
在一些实施例中，CM包含氨基酸序列ISSGLSS(SEQ ID NO：61)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列QNQALRMA(SEQ ID NO：62)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列AQNLLGMV(SEQ ID NO：63)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列STFPFGMF(SEQ ID NO：64)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列PVGYTSSL(SEQ ID NO：65)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列DWLYWPGI(SEQ ID NO：66)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列ISSGLLSS(SEQ IDNO：67)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LKAAPRWA(SEQ ID NO：68)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列GPSHLVLT(SEQ ID NO：69)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LPGGLSPW(SEQ ID NO：70)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列MGLFSEAG(SEQ ID NO：71)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列SPLPLRVP(SEQ ID NO：72)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列RMHLRSLG(SEQ ID NO：73)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LAAPLGLL(SEQ IDNO：74)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列AVGLLAPP(SEQ ID NO：75)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列LLAPSHRA(SEQ ID NO：76)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列PAGLWLDP(SEQ ID NO：77)。
在一些实施例中，CM是凝血酶的底物。在一些实施例中，CM是凝血酶的底物，并且包括序列GPRSFGL(SEQ ID NO：78)或GPRSFG(SEQ ID NO：79)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列GPRSFGL(SEQ ID NO：78)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列GPRSFG(SEQ ID NO：79)。
在一些实施例中，CM包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：NTLSGRSENHSG(SEQID NO：80)；NTLSGRSGNHGS(SEQ ID NO：81)；TSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：82)；TSGRSANP(SEQID NO：83)；VAGRSMRP(SEQ ID NO：84)；VVPEGRRS(SEQ ID NO：85)；ILPRSPAF(SEQ ID NO：86)；MVLGRSLL(SEQ ID NO：87)；QGRAITFI(SEQ ID NO：88)；SPRSIMLA(SEQ ID NO：89)；以及SMLRSMPL(SEQ ID NO：90)。
在一些实施例中，CM包含氨基酸序列NTLSGRSENHSG(SEQ ID NO：80)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列NTLSGRSGNHGS(SEQ ID NO：81)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列TSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：82)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列TSGRSANP(SEQ IDNO：83)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列VAGRSMRP(SEQ ID NO：84)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列VVPEGRRS(SEQ ID NO：85)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列ILPRSPAF(SEQ ID NO：86)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列MVLGRSLL(SEQ ID NO：87)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列QGRAITFI(SEQ ID NO：88)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列SPRSIMLA(SEQ ID NO：89)。在一些实施例中，CM包含氨基酸序列SMLRSMPL(SEQ IDNO：90)。
在一些实施例中，CM是中性粒细胞弹性蛋白酶的底物。在一些实施例中，CM是丝氨酸蛋白酶的底物。在一些实施例中，CM是uPA的底物。在一些实施例中，CM是天冬酰胺内肽酶的底物。在一些实施例中，CM是间质蛋白酶的底物。在一些实施例中，CM是半胱氨酸蛋白酶的底物。在一些实施例中，CM是半胱氨酸蛋白酶，如组织蛋白酶的底物。
在一些实施例中，CM是CM1-CM2底物，并且包括序列ISSGLLSGRSDNH(SEQ ID NO：91)；ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：92)；AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：93)；TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：94)；VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：95)；TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：96)；AVGLLAPPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：97)；LSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：98)；VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：99)；LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：100)；LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO：101)；LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO：102)；ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：103)；LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：104)；QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：105)；LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：106)；QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：107)；ISSGLLSGRSGNH(SEQ ID NO：108)；ISSGLLSGRSANPRG(SEQ ID NO：148)；AVGLLAPPTSGRSANPRG(SEQ ID NO：149)；AVGLLAPPSGRSANPRG(SEQ ID NO：150)；ISSGLLSGRSDDH(SEQ ID NO：151)；ISSGLLSGRSDIH(SEQ ID NO：152)；ISSGLLSGRSDQH(SEQID NO：153)；ISSGLLSGRSDTH(SEQ ID NO：154)；ISSGLLSGRSDYH(SEQ ID NO：155)；ISSGLLSGRSDNP(SEQ ID NO：156)；ISSGLLSGRSANP(SEQ ID NO：157)；ISSGLLSGRSANI(SEQID NO：158)；AVGLLAPPGGLSGRSDDH(SEQ ID NO：159)；AVGLLAPPGGLSGRSDIH(SEQ ID NO：160)；AVGLLAPPGGLSGRSDQH(SEQ ID NO：161)；AVGLLAPPGGLSGRSDTH(SEQ ID NO：162)；AVGLLAPPGGLSGRSDYH(SEQ ID NO：163)；AVGLLAPPGGLSGRSDNP(SEQ ID NO：164)；AVGLLAPPGGLSGRSANP(SEQ ID NO：165)；AVGLLAPPGGLSGRSANI(SEQ ID NO：166)、ISSGLLSGRSDNI(SEQ ID NO：171)；AVGLLAPPGGLSGRSDNI(SEQ ID NO：172)；GLSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：193)；和/或GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：194)。
在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDNH(SEQ ID NO：91)，其在本文中也称为底物2001。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：92)，其在本文中也称为底物1001/LP′/0001，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：93)，其在本文中也称为底物2015和/或底物1004/LP′/0003，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：94)，其在本文中也称为底物0003/LP′/1004，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：95)，其在本文中也称为底物1003/LP′/0003，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：96)，其在此也称为底物0003/LP′/1003，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：97)，其在本文中也称为底物3001和/或底物1004/LP′/0001，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列LSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：98)，其在本文中也称为底物0001/LP′/1004，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：99)，其在本文中也称为底物1003/LP′/0001，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：100)，其在本文中也称为底物0001/LP′/1003，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO：101)，其在本文中也称为底物0001/LP′/1001，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS(SEQID NO：102)，其在本文中也称为底物0002/LP′/1001，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：103)，其在本文中也称为底物1001/LP′/0002，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：104)，其在本文中也称为底物0001/LP′/1002，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ IDNO：205)。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：105)，其在本文中也称为底物1002/LP′/0001，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：106)，其在本文中也称为底物0002/LP′/1002，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：107)，其在本文中也称为底物1002/LP′/0002，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ IDNO：205)。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSGNH(SEQ ID NO：108)，其在本文中也称为底物2002。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSANPRG(SEQ IDNO：148)，其在本文中也称为底物2003。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPTSGRSANPRG(SEQ ID NO：149)，其在本文中也称为底物2004。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPSGRSANPRG(SEQ ID NO：150)，其在本文中也称为底物2005。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDDH(SEQ ID NO：151)，其在本文中也称为底物2006。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDIH(SEQ ID NO：152)，其在本文中也称为底物2007。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDQH(SEQ IDNO：153)，其在本文中也称为底物2008。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDTH(SEQ ID NO：154)，其在本文中也称为底物2009。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDYH(SEQ ID NO：155)，其在本文中也称为底物2010。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDNP(SEQ ID NO：156)，其在本文中也称为底物2011。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSANP(SEQ ID NO：157)，其在本文中也称为底物2012。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSANI(SEQ ID NO：158)，其在本文中也称为底物2013。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDDH(SEQ ID NO：159)，其在本文中也称为底物3006。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDIH(SEQ ID NO：160)，其在本文中也称为底物3007。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDQH(SEQ ID NO：161)，其在本文中也称为底物3008。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDTH(SEQID NO：162)，其在本文中也称为底物3009。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDYH(SEQ ID NO：163)，其在本文中也称为底物3010。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDNP(SEQ ID NO：164)，其在本文中也称为底物3011。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSANP(SEQ ID NO：165)，其在本文中也称为底物3012。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSANI(SEQID NO：166)，其在本文中也称为底物3013。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDNI(SEQ ID NO：171)，其在本文中也称为底物2014。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDNI(SEQ ID NO：172)，其在本文中也称为底物3014。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列GLSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：193)，其在本文中也称为底物0001/LP′/1004，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施例中，CM1-CM2底物包括序列GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：194)，其在此也称为底物0001/LP′/1003，其中如这种CM1-CM2底物中所使用的LP′是氨基酸序列GG。
在一些实施例中，CM是至少两种蛋白酶的底物。在一些实施例中，CM是至少两种选自由以下组成的组的蛋白酶的底物：MMP、凝血酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、uPA、天冬酰胺内肽酶以及间质蛋白酶。
在一些实施例中，缀合可活化抗体包括至少第一CM和第二CM。在一些实施例中，第一CM和第二CM各自是不超过15个氨基酸长的多肽。在一些实施例中，呈未裂解状态的缀合可活化抗体中的第一CM和第二CM从N端到C端具有如下结构排列：MM-CM1-CM2-AB或AB-CM2-CM1-MM。在一些实施例中，第一CM和第二CM中的至少一个是充当选自由以下组成的组的蛋白酶的底物的多肽：MMP、凝血酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、uPA、天冬酰胺内肽酶以及间质蛋白酶。在一些实施例中，第一CM由靶组织中的MMP、凝血酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、uPA、天冬酰胺内肽酶以及间质蛋白酶裂解，并且第二CM由靶组织中的第二裂解剂裂解。在一些实施例中，另一蛋白酶选自由表(I)中所示的蛋白酶组成的组。在一些实施例中，第一裂解剂和第二裂解剂是选自由以下组成的组的相同蛋白酶：MMP、凝血酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、uPA、天冬酰胺内肽酶以及间质蛋白酶，并且第一CM和第二CM是酶的不同底物。在一些实施例中，第一裂解剂和第二裂解剂是选自表(I)中所示的蛋白酶组成的组的相同蛋白酶。在一些实施例中，第一裂解剂和第二裂解剂是不同的蛋白酶。在一些实施例中，第一裂解剂和第二裂解剂在靶组织中共定位。在一些实施例中，第一CM和第二CM由靶组织中的至少一种裂解剂裂解。
在一些实施例中，缀合可活化抗体暴露于蛋白酶并且由蛋白酶裂解，使得在活化或裂解状态下，缀合活化抗体包括轻链氨基酸序列，蛋白酶裂解CM后，所述轻链氨基酸序列包括LP2和/或CM序列的至少一部分。
在一些实施例中，可活化抗体与一个或多个当量的药剂缀合。在一些实施例中，可活化抗体与一个当量的药剂缀合。在一些实施例中，可活化抗体与两个、三个或四个当量的药剂缀合。在一些实施例中，可活化抗体是具有均一数目当量的缀合药剂的可活化抗体混合物的一部分。在一些实施例中，可活化抗体是具有非均一数目当量的缀合药剂的可活化抗体混合物的一部分。在一些实施例中，可活化抗体的混合物使得与每种可活化抗体缀合的药剂的平均数目为在零到一之间、一到二之间、二到三之间或三到四之间。在一些实施例中，可活化抗体的混合物使得与每种可活化抗体缀合的药剂的平均数目为一、二、三或四。
在一些实施例中，可活化抗体包含一种或多种位点特异性氨基酸序列修饰，使得赖氨酸和/或半胱氨酸残基的数目相对于可活化抗体的原始氨基酸序列增加或减少，因此在一些实施例中，对应地增加或减少可与可活化抗体缀合的药剂的数目，或在一些实施例中，以位点特异性方式限制药剂与可活化抗体的缀合。在一些实施例中，修饰的可活化抗体以位点特异性方式经一种或多种非天然氨基酸修饰，因此在一些实施例中，将药剂的缀合限于仅非天然氨基酸的位点。
本文所公开的缀合可活化抗体可视抗体的构形并且至少部分地取决于用于实现缀合的方法而定，以各种化学计量摩尔比包含药物分子和抗体部分。
术语“载药量(drug load/drug loading)”是指单个缀合可活化抗体中每抗体的药物分子的摩尔比。在某些实施例中，载药量可包含1到4个药物分子、2到4个药物分子、1到3个药物分子、2到3个药物分子或1到2个药物分子。在某些实施例中，载药量可包含1个药物分子、2个药物分子、3个药物分子或4个药物分子。
出于本发明的目的，所属领域的技术人员应理解“载药量”和“药物与抗体的比率”(也称为DAR)是不相同的。DAR是指在至少两个缀合可活化抗体分子的群体中每抗体的药物分子的平均摩尔比，而载药量是指单个缀合可活化抗体分子中每抗体的药物分子的摩尔比。载药量主要与缀合可活化抗体的构建和设计相关，而DAR主要与将向患者施用的治疗性缀合可活化抗体医药组合物相关。
在一些实施例中，可以缀合本发明的可活化抗体以产生具有窄DAR分布的缀合可活化抗体的相对均质的制剂。在一些实施例中，缀合可活化抗体制剂就其DAR分布来说可以是大体上均质的，这意味着制剂内是具有特定DAR(例如，2和/或4的DAR)的位点特异性ADC的主导物种。在一些实施例中，大体上均质的缀合可活化抗体制剂就负载位点来说也可以是均质的(即在游离半胱氨酸上)。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的DAR将为约2和/或4。在这种情形下，术语“约”应解释为意指缀合可活化抗体制剂，其总共含有大于80％的DAR等于2和4的分布大致相等(例如，各自大于40％)的两种主要物种，并且其余部分由其它DAR物种组成。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的DAR将被富集到约2。在这种情形下，术语“约”应解释为意指含有大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9％的缀合可活化抗体制剂。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的DAR将被富集到约2，术语“约”被解释为意指含有大于约94％±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9％的缀合可活化抗体制剂。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的DAR将被富集到约2，术语“约”被解释为意指含有大于约95％±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9％的缀合可活化抗体制剂。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的DAR将被富集到约2，术语“约”被解释为意指含有大于约96％±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9％的缀合可活化抗体制剂。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的DAR将被富集到约2，术语“约”被解释为意指含有大于约97％±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9％的缀合可活化抗体制剂。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的DAR将被富集到约2，术语“约”被解释为意指含有大于约98％±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9％的缀合可活化抗体制剂。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的DAR将被富集到约2，术语“约”被解释为意指含有大于约99％±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9％的缀合可活化抗体制剂。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的DAR将为约2和/或4。在这种情形下，术语“约”应解释为意指缀合可活化抗体制剂，其总共含有大于80％的DAR等于2和4的分布大致相等(例如，各自大于40％)的两种主要物种，并且其余部分由其它DAR物种组成。
在一些实施例中，有可能通过使用位点特异性可活化抗体和/或选择性还原和缀合来实现所需均质性。在一些实施例中，可通过使用位点特异性构建体与选择性还原的组合来实现所需均质性。在一些实施例中，可如通过使用分析或制备型色谱技术进一步纯化制剂。在这些实施例中，可使用所属领域中已知的各种技术，包括但不限于质谱、HPLC(例如尺寸排阻HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛细管电泳来分析缀合可活化抗体制剂的均质性。
关于缀合可活化抗体制剂的纯化，应了解，可采用标准医药制备方法来获得所需纯度。如本文所论述，液相色谱方法，如反相(RP)和疏水相互作用色谱(HIC)可通过载药量值来分离混合物中的化合物。在一些情况下，也可使用离子交换(IEC)或混合模式色谱(MMC)来分离具有特定载药量的物种。
在一些实施例中，具有给定DAR，相对高水平的载药量均匀性的本公开的缀合可活化抗体制剂实际上可包含具有一定范围或分布的载药量的缀合物的混合物，但其中混合物中的载药量分布以平均DAR值为中心(或具有平均DAR值的加权平均值)。因此，在一些实施例中，缀合可活化抗体制剂将包括缀合物的混合物，其中混合物的平均DAR为约1、2或3，各自+/-0.5。应了解，在某些优选实施例中，范围或偏差可以小于0.4。因此，在其它实施例中，组合物将包含1、2或3，各自+/-0.3的平均DAR。
在一些实施例中，可以通过常规手段，如UV-Vis分光光度法、反相HPLC、HIC、质谱、ELISA以及电泳来表征来自缀合反应的缀合可活化抗体制剂中每抗体的药物分布。
在一些实施例中，包括具有不同载药量的缀合物混合物的本公开的缀合可活化抗体的混合物可针对一种或多种具有特定载药量的缀合物的物种纯化或富集。举例来说，可针对载药量为2的缀合可活化抗体富集或纯化包括载药量为0、2、4、6以及8的AADC的混合物的缀合可活化抗体混合物。在一些实施例中，可仅针对载药量为4的缀合可活化抗体的物种纯化或富集混合物。在一些实施例中，可仅针对载药量为2和4的缀合可活化抗体的物种纯化或富集混合物。如本文所用，载药量为2的缀合物物种的物种的相对均质制剂的制剂或纯化或缀合可活化抗体被称为“E2”，其DAR为约2。如本文所用，载药量为4的缀合物物种的相对均质制剂的制剂或纯化或缀合可活化抗体被称为“E4”。如本文所用，载药量为2或4的缀合物物种的混合物的制剂或纯化或缀合可活化抗体被称为“DE”(DAR富集)，其DAR为约3。在这种情形下，术语“约”被解释为意指所开处量的+/-0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体可由下式表示：
AA-(AG)p
其中AA是可活化抗体，其在未裂解状态下从N端到C端具有MM-CM-AB的结构排列。AB是特异性结合到哺乳动物CD71，并且包括SEQ ID NO：5的重链可变区序列和SEQ ID NO：7的轻链可变区序列的抗体。MM是包括SEQ ID NO：18的序列的掩蔽部分，并且当AA呈未裂解状态时，MM与AB偶联并且抑制AB与CD71的结合。CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，CM与AB偶联，并且CM是充当蛋白酶的底物的多肽。AG是与AA缀合的药剂，其中AA-(AG)p。在一些实施例中，p是0、1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，本公开的组合物包括本公开的缀合可活化抗体的混合物，其中每种缀合可活化抗体由式AA-(AG)p表示，其中p是0到8的整数。在一些实施例中，组合物包括本公开的缀合可活化抗体的混合物，其中至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的物种是缀合可活化抗体，其中p为2。
在一些实施例中，针对具有特定载药量的给定缀合物物种纯化或富集的缀合可活化抗体的制剂包括至少一定百分比的给定载药量物种。举例来说，在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包括至少50％的制剂是载药量为2的缀合可活化抗体。在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包括至少75％的载药量为2的缀合可活化抗体。在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包括至少85％的载药量为2的缀合可活化抗体。在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包括至少90％的载药量为2的缀合可活化抗体。在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包括至少95％的载药量为2的缀合可活化抗体。在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包括至少98％的载药量为2的缀合可活化抗体。
在一些实施例中，针对给定载药量物种纯化或富集的缀合可活化抗体的制剂包括与所有其它载药量物种组合的总摩尔当量相比，更多摩尔当量的给定载药量物种。举例来说，在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂使得其中载药量不为2的组合物的每个缀合可活化抗体物种的组合当量小于载药量为2的缀合可活化抗体的当量。在一些实施例中，E4缀合可活化抗体的制剂使得其中载药量不为4的组合物的每个缀合可活化抗体物种的组合当量小于载药量为4的缀合可活化抗体的当量。在一些实施例中，DE缀合可活化抗体的制剂使得其中载药量不为2或4的组合物的每个缀合可活化抗体物种的组合当量小于载药量为2或4的缀合可活化抗体的当量。
在一些实施例中，针对给定DAR物种(例如如本文所论述的E2或E4)纯化或富集的缀合可活化抗体的制剂包括少于一定百分比的非给定载药量物种的缀合可活化抗体。举例来说，在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包含少于50％的不为载药量为2的物种的缀合可活化抗体。举例来说，在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包含少于25％的不为载药量为2的物种的缀合可活化抗体。举例来说，在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包含少于15％的不为载药量为2的物种的缀合可活化抗体。举例来说，在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包含少于10％的不为载药量为2的物种的缀合可活化抗体。举例来说，在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包含小于5％的不为载药量为2的物种的缀合可活化抗体。举例来说，在一些实施例中，E2缀合可活化抗体的制剂包含少于2％的不为载药量为2的物种的缀合可活化抗体。在一些其它实施例中，或富集或纯化的制剂(例如E4或DE)可具有少于50％、少于25％、少于15％、少于10％、少于5％或少于2％的不是富集或纯化的缀合可活化抗体组合物中的对应载药量物种。
在一些实施例中，所述药剂是抗炎剂。
在一些实施例中，缀合的It可活化抗体还包括可检测部分。在一些实施例中，可检测部分是诊断剂。
在一些实施例中，缀合可活化抗体还包括信号肽。在一些实施例中，信号肽通过间隔子缀合到可活化抗体。在一些实施例中，间隔子在不存在信号肽的情况下缀合到可活化抗体。在一些实施例中，间隔子直接接合到可活化抗体的MM。在一些实施例中，间隔子以从N端到C端间隔子-MM-CM-AB的结构排列直接接合到可活化抗体的MM。直接接合到可活化抗体的MM的N端的间隔子的实例是QGQSGQ(SEQ ID NO：109)。直接接合到可活化抗体的MM的N端的间隔子的其它实例包括QGQSGQG(SEQ ID NO：138)、QGQSG(SEQ ID NO：139)、QGQS(SEQ IDNO：140)、QGQ、QG以及G。直接接合到可活化抗体的MM的N端的间隔子的其它实例包括GQSGQG(SEQ ID NO：143)、QSGQG(SEQ ID NO：144)、SGQG(SEQ ID NO：145)、GQG以及G。在一些实施例中，没有间隔子接合到MM的N端。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO：109)。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸序列QGQSGQG(SEQ ID NO：138)。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸序列QGQSG(SEQ ID NO：139)。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸序列QGQS(SEQ ID NO：140)。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸序列QGQ。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸序列QG。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸残基Q。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸序列GQSGQG(SEQ ID NO：143)。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸序列QSGQG(SEQ ID NO：144)。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸序列SGQG(SEQ ID NO：145)。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸序列GQG。在一些实施例中，间隔子包括至少氨基酸序列G。在一些实施例中，不存在间隔子。
在一些实施例中，缀合可活化抗体的AB天然含有一个或多个二硫键。在一些实施例中，AB可以被工程改造以包括一个或多个二硫键。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的可活化抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自由SEQ ID NO：5组成的组的重链可变区氨基酸序列的核酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的可活化抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自由SEQ ID NO：7组成的组的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的可活化抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自由SEQ ID NO：5组成的组的重链可变区氨基酸序列的核酸序列，和编码选自由SEQ ID NO：7组成的组的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的可活化抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码选自由SEQ ID NO：5组成的组的重链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的可活化抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码选自由SEQ ID NO：7组成的组的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体的可活化抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码选自由SEQ ID NO：5组成的组的重链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列，和与编码选自由SEQ ID NO：7组成的组的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。
本公开还提供了通过在引起可活化抗体表达的条件下培养细胞来产生本公开的可活化抗体的方法，其中所述细胞包含本公开的核酸分子或本公开的载体。
本公开还提供了制造在活化状态下结合CD71的可活化抗体的方法，方法包含：(a)在导致可活化抗体表达的条件下培养包含编码可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中可活化抗体包括本公开的可活化抗体；(b)回收可活化抗体。
在一些实施例中，缀合可活化抗体的血清半衰期长于相应抗体的血清半衰期；例如，缀合可活化抗体的pK长于对应抗体的pK。在一些实施例中，缀合可活化抗体的血清半衰期与对应抗体的血清半衰期相似。在一些实施例中，当向生物体施用时，缀合可活化抗体的血清半衰期是至少15天。在一些实施例中，当向生物体施用时，缀合可活化抗体的血清半衰期是至少12天。在一些实施例中，当向生物体施用时，缀合可活化抗体的血清半衰期是至少11天。在一些实施例中，当向生物体施用时，缀合可活化抗体的血清半衰期是至少10天。在一些实施例中，当向生物体施用时，缀合可活化抗体的血清半衰期是至少9天。在一些实施例中，当向生物体施用时，缀合可活化抗体的血清半衰期是至少8天。在一些实施例中，当向生物体施用时，缀合可活化抗体的血清半衰期是至少7天。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少6天。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少5天。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少4天。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少3天。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少2天。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少24小时。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少20小时。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少18小时。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少16小时。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少14小时。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少12小时。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少10小时。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少8小时。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少6小时。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少4小时。在一些实施例中，当向生物体施用时，可活化抗体的血清半衰期是至少3小时。
本公开还提供了通过在引起多肽表达的条件下培养细胞来产生抗CD71抗体和/或可活化抗CD71抗体多肽的方法，其中所述细胞包含编码本文所描述的抗体和/或可活化抗体的分离核酸分子和/或包括这些分离核酸序列的载体。本公开提供了通过在引起抗体和/或可活化抗体表达的条件下培养细胞来产生抗体和/或可活化抗体的方法，其中所述细胞包含编码本文所描述的抗体和/或可活化抗体的分离核酸分子和/或包括这些分离核酸序列的载体。
本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的本文所描述的缀合可活化抗CD71抗体来预防个体的CD71介导的疾病、延缓所述疾病进展、治疗所述疾病、减轻所述疾病的症状或以其它方式改善所述疾病的方法。
本发明还提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的本文所描述的缀合可活化抗CD71抗体来预防个体的癌症、延缓癌症进展、治疗癌症、减轻癌症的症状或以其它方式改善癌症的方法。已知CD71在多种癌症中表达，如借助于非限制性实例，腺癌、胆管(胆)癌、膀胱癌、乳腺癌，例如三阴性乳腺癌和Her2阴性乳腺癌；类癌；宫颈癌；胆管癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌；神经胶质瘤；头颈癌，例如头颈鳞状细胞癌；白血病；肝癌；肺癌，例如NSCLC、SCLC；淋巴瘤；黑色瘤；口咽癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌，例如转移性去势抵抗性前列腺癌；肾癌；皮肤癌；鳞状细胞癌，胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；以及尿路上皮癌。
在一些实施例中，所述癌症与表达CD71的肿瘤相关。在一些实施例中，所述癌症归因于表达CD71的肿瘤。
在这些方法和用途的任何实施例中的任一者中使用的缀合可活化抗CD71抗体可在疾病的任何阶段施用。举例来说，可将此类缀合可活化抗CD71抗体施用于患有从早期到转移的任何阶段的癌症的患者。术语个体和患者在本文中可互换使用。
在一些实施例中，个体是哺乳动物，如人类或非人类灵长类动物。
将缀合可活化抗CD71抗体和其治疗性配制物施用于患有或易患与异常CD71表达和/或活性相关的疾病或病症的个体。使用所属领域中已知的多种方法中的任何一种来鉴别患有或易患与异常CD71表达和/或活性相关的疾病或病症的个体。举例来说，使用多种临床和/或实验室测试，如身体检查以及血液、尿液和/或粪便分析中的任一种来鉴别患有癌症或其它赘生性病况的个体，以评估健康状况。举例来说，使用多种临床和/或实验室测试，如身体检查和/或体液分析，例如血液、尿液和/或粪便分析中的任何一种来鉴别患有炎症和/或炎性病症的个体，以评估健康状况。
如果达到多种实验室或临床目标中的任一种，则将缀合可活化抗CD71抗体向患有与异常CD71表达和/或活性相关的疾病或病症的患者的施用视为成功的。举例来说，如果与疾病或病症相关的症状中的一种或多种减轻、减少、受抑制或未进展到进一步(即，更差)的状态，则将缀合可活化抗CD71抗体向患有与异常CD71表达和/或活性相关的疾病或病症的患者的施用视为成功的。如果疾病或病症进入缓解或未进展到进一步(即，更差)的状态，则将缀合可活化抗CD71抗体向患有与异常CD71表达和/或活性相关的疾病或病症的患者的施用视为成功的。
在一些实施例中，将缀合可活化抗CD71抗体和其治疗性配制物施用于患有或易患疾病或病症的个体，如患有癌症或其它赘生性病况的个体，其中个体的病变细胞表达CD71。在一些实施例中，病变细胞与异常CD71表达和/或活性相关。在一些实施例中，病变细胞与正常CD71表达和/或活性相关。使用所属领域中已知的多种方法中的任一种来鉴别患有或易患疾病或病症的个体，其中个体的病变细胞表达CD71。举例来说，使用多种临床和/或实验室测试，如身体检查以及血液、尿液和/或粪便分析中的任一种来鉴别患有癌症或其它赘生性病况的个体，以评估健康状况。举例来说，使用多种临床和/或实验室测试，如身体检查和/或体液分析，例如血液、尿液和/或粪便分析中的任何一种来鉴别患有炎症和/或炎性病症的个体，以评估健康状况。
在一些实施例中，将缀合可活化抗CD71抗体和其治疗性配制物施用于患有或易患于与表达CD71的细胞，或此类细胞的存在、生长、增殖、转移和/或活性相关的疾病或病症的个体，如患有癌症或其它赘生性病况的个体。在一些实施例中，细胞与异常CD71表达和/或活性相关。在一些实施例中，细胞与正常CD71表达和/或活性相关。使用所属领域中已知的多种方法中的任一种，确定患有或易患与表达CD71的细胞相关的疾病或病症的个体。举例来说，使用多种临床和/或实验室测试，如身体检查以及血液、尿液和/或粪便分析中的任一种来鉴别患有癌症或其它赘生性病况的个体，以评估健康状况。举例来说，使用多种临床和/或实验室测试，如身体检查和/或体液分析，例如血液、尿液和/或粪便分析中的任何一种来鉴别患有炎症和/或炎性病症的个体，以评估健康状况。
如果达到多种实验室或临床目标中的任一种，则将缀合可活化抗CD71抗体向患有与表达CD71的细胞相关的疾病或病症的患者的施用视为成功的。举例来说，如果与疾病或病症相关的症状中的一种或多种减轻、减少、受抑制或未进展到进一步(即，更差)的状态，则将缀合可活化抗CD71抗体向患有与表达CD71的细胞相关的疾病或病症的患者的施用视为成功的。如果疾病或病症进入缓解或未进展到进一步(即，更差)的状态，则将缀合可活化抗CD71抗体向患有与表达CD71的细胞相关的疾病或病症的患者的施用视为成功的。
本公开还提供了治疗病变细胞表达CD71的病症或疾病、减轻其症状或延缓其进展的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的本公开的缀合抗体或包含本公开的抗体的医药组合物或包含本公开的缀合抗体的医药组合物。在一些实施例中，病症或疾病是癌症。
本公开还提供了治疗与表达CD71的细胞相关的病症或疾病、减轻其症状或延缓其进展的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的本公开的缀合抗体或包含有包含本公开的缀合抗体的医药组合物的医药组合物。在一些实施例中，与表达CD71的细胞相关的病症或疾病是癌症。在一些实施例中，所述癌症是腺癌、胆管(胆)癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、Her2阴性乳腺癌、类癌、宫颈癌、胆管癌、结肠直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、头颈鳞状细胞癌、白血病、肝癌、肺癌、非小细胞癌肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌、肾癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿生殖系统癌或尿路上皮癌。在一些实施例中，天然配体是转铁蛋白。在一些实施例中，哺乳动物CD71的表达和/或活性异常。在一些实施例中，所述方法包含施用另外的药剂。在一些实施例中，另外的药剂是治疗剂。
本公开还提供了抑制或减少表达哺乳动物CD71的细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的本公开的抗体或本公开的缀合抗体或包含本公开的抗体的医药组合物或包含本公开的缀合抗体的医药组合物。在一些实施例中，天然配体是转铁蛋白。在一些实施例中，哺乳动物CD71的表达和/或活性异常。在一些实施例中，所述方法包含施用另外的药剂。在一些实施例中，另外的药剂是治疗剂。
本公开还提供了抑制、阻断或阻止天然配体与哺乳动物CD71结合的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的本公开的抗体或本公开的缀合抗体或包含本公开的抗体的医药组合物或包含本公开的缀合抗体的医药组合物。在一些实施例中，天然配体是转铁蛋白。在一些实施例中，哺乳动物CD71的表达和/或活性异常。在一些实施例中，所述方法包含施用另外的药剂。在一些实施例中，另外的药剂是治疗剂。
本公开还提供了治疗病变细胞表达CD71的病症或疾病、减轻其症状或延缓其进展的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的本公开的可活化抗体或本公开的缀合可活化抗体或包含本公开的可活化抗体的医药组合物或包含本公开的缀合可活化抗体的医药组合物。在一些实施例中，病症或疾病是癌症。
本公开还提供了治疗与表达CD71的细胞相关的病症或疾病、减轻其症状或延缓其进展的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的本公开的缀合可活化抗体或包含本公开的缀合可活化抗体的医药组合物。在一些实施例中，与表达CD71的细胞相关的病症或疾病是癌症。在一些实施例中，所述癌症是腺癌、胆管(胆)癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、Her2阴性乳腺癌、类癌、宫颈癌、胆管癌、结肠直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、头颈鳞状细胞癌、白血病、肝癌、肺癌、非小细胞癌肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌、肾癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿生殖系统癌或尿路上皮癌。在一些实施例中，天然配体是转铁蛋白。在一些实施例中，哺乳动物CD71的表达和/或活性异常。在一些实施例中，所述方法包含施用另外的药剂。在一些实施例中，另外的药剂是治疗剂。
本公开还提供了抑制或减少表达哺乳动物CD71的细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的本公开的可活化抗体或本公开的缀合可活化抗体或包含本公开的可活化抗体的医药组合物或包含本公开的缀合可活化抗体的医药组合物。在一些实施例中，天然配体是转铁蛋白。在一些实施例中，哺乳动物CD71的表达和/或活性异常。在一些实施例中，所述方法包含施用另外的药剂。在一些实施例中，另外的药剂是治疗剂。
本公开还提供了抑制、阻断或阻止天然配体与哺乳动物CD71结合的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的本公开的缀合可活化抗体或包含本公开的缀合可活化抗体的医药组合物。在一些实施例中，天然配体是转铁蛋白。在一些实施例中，哺乳动物CD71的表达和/或活性异常。在一些实施例中，所述方法包含施用另外的药剂。在一些实施例中，另外的药剂是治疗剂。
在这些方法和试剂盒的一些实施例中，抗CD71缀合可活化抗体包括可检测标记。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，可检测标记包括显像剂、造影剂、酶、荧光标记、生色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，显像剂包括放射性同位素。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，放射性同位素是铟或锝。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，造影剂包含碘、钆或氧化铁。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，荧光标记包含黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰的红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED或铕衍生物。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，发光标记包含N-甲基吖啶鎓衍生物。在这些方法的一些实施例中，标记包含Alex
Figure BDA0002465367670000581
标记，如Alex
Figure BDA0002465367670000582
680或Alexa
Figure BDA0002465367670000583
750。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，基于配体的标记包含生物素、亲和素、链霉亲和素或一种或多种半抗原。
在这些方法和试剂盒的一些实施例中，个体是哺乳动物。在这些方法的一些实施例中，个体是人类。在一些实施例中，个体是非人类哺乳动物，如非人类灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、农场动物、工作动物或动物园动物。在一些实施例中，个体是啮齿动物。
在这些方法和试剂盒的一些实施例中，所述方法是体内方法。在这些方法的一些实施例中，所述方法是原位方法。在这些方法的一些实施例中，所述方法是离体方法。在这些方法的一些实施例中，所述方法是体外方法。
在方法和试剂盒的一些实施例中，所述方法用于鉴别或以其它方式精简适于用本公开的抗CD71缀合可活化抗体治疗的患者群体，接着通过将缀合可活化抗CD71抗体向有需要的个体施用来治疗。举例来说，针对靶标(例如，CD71)和裂解这些方法中测试的抗CD71可活化抗体的可裂解部分(CM)中的底物的蛋白酶均测试为阳性的患者被鉴别为适用于用包含此类CM的此类抗CD71可活化抗体治疗的候选者，并且随后患者施用治疗有效量的测试的可活化抗CD71抗体和/或缀合可活化抗CD71抗体。同样，针对靶标(例如，CD71)和裂解使用这些方法测试的可活化抗体中的CM中的底物的蛋白酶中的任一个或两个测试为阴性的患者可鉴别为适用于另一疗法形式的候选者。在一些实施例中，可用其它抗CD71可活化抗体测试此类患者，直到鉴别出适用于治疗的抗CD71可活化抗体(例如，包含在患者疾病位点处被患者裂解的CM的抗CD71可活化抗体)。在一些实施例中，然后向患者施用治疗有效量的可活化抗CD71抗体和/或缀合物，患者对其测试为阳性。合适的AB、MM和/或CM包括本文所公开的AB、MM和/或CM中的任一个。
根据本发明的医药组合物可包括本发明的抗体和任选地药学上可接受的载剂。这些医药组合物可包含于试剂盒，例如诊断试剂盒中。
在一些实施例中，医药组合物包含本公开的缀合可活化抗体，和任选地药学上可接受的载剂。在一些实施例中，医药组合物包含另外的药剂。在一些实施例中，另外的药剂是治疗剂。
本公开的可活化抗体中的抗CD71抗体和AB特异性结合CD71靶标，例如哺乳动物CD71和/或人类CD71。本公开中还包括与本公开的抗体和/或本文所描述的活化的可活化抗体结合到相同CD71表位的抗CD71抗体和AB。本公开中还包括与本文所描述的抗CD71抗体和/或活化的抗CD71可活化抗体竞争与CD71靶标，例如人类CD71的结合的抗CD71抗体和AB。本公开中还包括与本文所描述的抗CD71抗体和/或活化的抗CD71可活化抗体交叉竞争与CD71靶标，例如人类CD71的结合的抗CD71抗体和AB。
本文提供的可活化抗CD71抗体包括掩蔽部分。在一些实施例中，掩蔽部分是与抗CD71抗体偶联或以其它方式连接的氨基酸序列，并且位于可活化抗CD71抗体构建体中，使得掩蔽部分减弱抗CD71抗体特异性结合CD71的能力。使用多种已知技术中的任一种来鉴别合适的掩蔽部分。举例来说，使用Daugherty等人的PCT公开第WO 2009/025846号中描述的方法鉴别肽掩蔽部分，其内容以全文引用的方式并入本文中。
本文提供的可活化抗CD71抗体包括可裂解部分。在一些实施例中，可裂解部分包括氨基酸序列，所述氨基酸序列是蛋白酶，通常是细胞外蛋白酶的底物。使用多种已知技术中的任一种来鉴别合适的底物。举例来说，使用在Daugherty等人的美国专利第7,666,817号；Stagliano等人的美国专利第8,563,269号；以及La Porte等人的PCT公开第WO 2014/026136号中描述的方法鉴别肽底物，其全部内容以全文引用的方式并入本文中。(另见Boulware等人“展现快速水解动力学的蛋白酶的肽底物的进化优化(Evolutionaryoptimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapidhydrolysis kinetics)。”《生物技术和生物工程(Biotechmol.Bioeng.)》106.3(2010)：339-46)。
示例性底物包括但不限于可由表(I)中所列的以下酶或蛋白酶中的一种或多种裂解的底物。
表(I)：示例性蛋白酶和/或酶
Figure BDA0002465367670000611
本文所描述的可活化抗CD71抗体克服了抗体治疗剂，尤其已知在体内至少在某种程度上有毒性的抗体治疗剂的局限性。靶标介导的毒性构成治疗性抗体开发的主要限制。本文提供的可活化抗CD71抗体被设计成解决与正常组织中的靶标由传统治疗性抗体抑制相关的毒性。这些可活化抗CD71抗体保持掩蔽，直到在疾病位点处被蛋白水解活化为止。从抗CD71抗体作为亲本治疗性抗体开始，通过并入有蛋白酶的底物的接头将抗体与抑制性掩蔽物偶联，对本发明的可活化抗CD71抗体进行工程改造。
当经MM修饰AB并且在存在靶标的情况下，与未经MM修饰的AB特异性结合或亲本AB与靶标的特异性结合相比，AB与其靶标的特异性结合被减弱或抑制。
与未经MM修饰的AB或亲本AB针对靶标的Kd相比，经MM修饰的AB针对靶标的Kd高至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更高，或高5到10、10到100、10到1,000、10到10,000、10到100,000、10到1,000,000、10到10,000,000、100到1,000、100到10,000、100到100,000、100到1,000,000、100到10,000,000、1,000到10,000、1,000到100,000、1,000到1,000,000、1000到10,000,000、10,000到100,000、10,000到1,000,000、10,000到10,000,000、100,000到1,000,000或100,000到10,000,000倍之间。相反，与未经MM修饰的AB或亲本AB针对靶标的结合亲和力相比，经MM修饰的AB针对靶标的结合亲和力低至少2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大，或低5到10、10到100、10到1,000、10到10,000、10到100,000、10到1,000,000、10到10,000,000、100到1,000、100到10,000、100到100,000、100到1,000,000、100到10,000,000、1,000到10,000、1,000到100,000、1,000到1,000,000、1000到10,000,000、10,000到100,000、10,000到1,000,000、10,000到10,000,000、100,000到1,000,000或100,000到10,000,000倍之间。
MM针对AB的解离常数(Kd)一般高于AB针对靶标的Kd。与AB针对靶标的Kd相比，MM针对AB的Kd可以高至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。相反，MM针对AB的结合亲和力一般低于AB针对靶标的结合亲和力。与AB针对靶标的结合亲和力相比，MM针对AB的结合亲和力可以低至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。
在一些实施例中，MM针对AB的解离常数(Kd)大致等于AB针对靶标的Kd。在一些实施例中，MM针对AB的解离常数(Kd)不超过AB针对靶标的解离常数。
在一些实施例中，MM针对AB的解离常数(Kd)小于AB针对靶标的解离常数。
在一些实施例中，MM针对AB的解离常数(Kd)大于AB针对靶标的解离常数。
在一些实施例中，MM与AB结合的Kd不超过AB与靶标的结合的Kd。
在一些实施例中，MM与AB结合的Kd不小于AB与靶标的结合的Kd。
在一些实施例中，MM与AB结合的Kd大致等于AB与靶标的结合的Kd。
在一些实施例中，MM与AB结合的Kd小于AB与靶标的结合的Kd。
在一些实施例中，MM与AB结合的Kd大于AB与靶标的结合的Kd。
在一些实施例中，与AB与靶标结合的Kd相比，MM与AB结合的Kd不高超过2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1,000倍。在一些实施例中，与AB与靶标结合的Kd相比，MM与AB结合的Kd高1到5、2到5、2到10、5到10、5到20、5到50、5到100、10到100、10到1,000、20到100、20到1000或100到1,000倍之间。
在一些实施例中，MM与AB结合的亲和力小于AB与靶标结合的亲和力。
在一些实施例中，MM与AB结合的亲和力不超过AB与靶标结合的亲和力。
在一些实施例中，MM与AB结合的亲和力大致等于AB与靶标结合的亲和力。
在一些实施例中，MM与AB结合的亲和力不小于AB与靶标结合的亲和力。
在一些实施例中，MM与AB结合的亲和力大于AB与靶标结合的亲和力。
在一些实施例中，MM与AB结合的亲和力比AB与靶标结合的亲和力小2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1,000。在一些实施例中，MM与AB结合的亲和力比AB与靶标结合的亲和力小1到5、2到5、2到10、5到10、5到20、5到50、5到100、10到100、10到1,000、20到100、20到1000或100到1,000倍。在一些实施例中，MM与AB的结合亲和力比AB与靶标的结合亲和力小2到20倍。在一些实施例中，未与AB共价键联并且与AB在等摩尔浓度下的MM不抑制AB与靶标的结合。
与未经MM修饰的AB与靶标的特异性结合或亲本AB与靶标的特异性结合相比，当AB经MM修饰并且在靶标存在下时，AB与其靶标的特异性结合被减少或抑制。当在体内或在体外分析中测量时，与未经MM修饰的AB与靶标的结合或亲本AB与靶标的结合相比，经MM修饰时，AB与靶标结合的能力可减弱至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％甚至100％，持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。
MM抑制AB与靶标的结合。MM结合AB的抗原结合域并且抑制AB与靶标的结合。MM可以在空间上抑制AB与靶标的结合。MM可以异位抑制AB与其靶标的结合。在这些实施例中，当在体内或在体外分析中测量时，在AB经修饰或偶联到MM时并且在靶标存在下，AB与靶标不结合或大体上不结合，或与未经MM修饰的AB、亲本AB或未与MM偶联的AB与靶标的结合相比，不超过AB与靶标结合的0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％，持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。
当AB与MM偶联或由MM修饰时，MM“掩蔽”或减弱或以其它方式抑制AB与靶标的特异性结合。当AB与MM偶联或由MM修饰时，此类偶联或修饰可实现减弱或抑制AB特异性结合其靶标的能力的结构改变。
与MM偶联或经MM修饰的AB可由下式表示(按从氨基(N)末端区到羧基(C)末端区的顺序：
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
其中MM是掩蔽部分，AB是抗体或其抗体片段，并且L是接头。在许多实施例中，可能期望将一种或多种接头，例如柔性接头插入组合物中，以便提供柔性。
在某些实施例中，MM不是AB的天然结合搭配物。在一些实施例中，MM不含或大体上不含与AB的任何天然结合搭配物的同源性。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合配偶体的相似度不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的同一性。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合搭配物具有不超过25％的同一性。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合搭配物具有不超过50％的同一性。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合搭配物具有不超过20％的同一性。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合搭配物具有不超过10％的同一性。
在一些实施例中，可活化抗体包括由MM修饰的AB，并且还包括一个或多个可裂解部分(CM)。此类可活化抗体展现与AB靶标的可活化/可切换结合。可活化抗体一般包括由掩蔽部分(MM)和可修饰或可裂解部分(CM)修饰或与所述部分偶联的抗体或抗体片段(AB)。在一些实施例中，CM含有充当至少一种蛋白酶的底物的氨基酸序列。
可活化抗体的元件布置成使得MM和CM定位成使得在裂解(或相对活性)状态下并且在存在靶标的情况下，AB结合靶标，而可活化抗体在未裂解(或相对无活性)状态下在靶标存在的情况下，AB与其靶标的特异性结合被减弱或抑制。由于MM对AB特异性结合其靶标的能力的抑制或掩蔽，可减弱AB与其靶标的特异性结合。
与未经MM和CM修饰的AB或亲本AB针对靶标的Kd相比，经MM和CM修饰的AB针对靶标的Kd高至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更高，或高5到10、10到100、10到1,000、10到10,000、10到100,000、10到1,000,000、10到10,000,000、100到1,000、100到10,000、100到100,000、100到1,000,000、100到10,000,000、1,000到10,000、1,000到100,000、1,000到1,000,000、1000到10,000,000、10,000到100,000、10,000到1,000,000、10,000到10,000,000、100,000到1,000,000或100,000到10,000,000倍之间。相反，与未经MM和CM修饰的AB或亲本AB针对靶标的结合亲和力相比，经MM和CM修饰的AB针对靶标的结合亲和力低至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大，或低5到10、10到100、10到1,000、10到10,000、10到100,000、10到1,000,000、10到10,000,000、100到1,000、100到10,000、100到100,000、100到1,000,000、100到10,000,000、1,000到10,000、1,000到100,000、1,000到1,000,000、1000到10,000,000、10,000到100,000、10,000到1,000,000、10,000到10,000,000、100,000到1,000,000或100,000到10,000,000倍之间。
当AB经MM和CM修饰并且存在靶标但不存在调节剂(例如至少一种蛋白酶)的情况下，与未经MM和CM修饰的AB或亲本AB与靶标的特异性结合相比，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。当在体内或在体外分析中测量时，与亲本AB与其靶标的结合或未经MM和CM修饰的AB与其靶标的结合相比，当经MM和CM修饰时，AB结合其靶标的能力可减弱至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及甚至100％，持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。
如本文所用，术语裂解状态是指在由至少一种蛋白酶修饰CM之后可活化抗体的状况。如本文所用，术语未裂解状态是指在不存在CM由蛋白酶裂解的情况下可活化抗体的状况。如上文所论述，术语“可活化抗体”在本文中用于指处于其未裂解(天然)状态以及处于其裂解状态两者的可活化抗体。对于普通技术人员将显而易见的是，在一些实施例中，由于CM由蛋白酶裂解，裂解的可活化抗体可能缺乏MM，引起至少MM的释放(例如，其中MM未由共价键(例如，半胱氨酸残基之间的二硫键)接合到可活化的肽)。
可活化或可切换意指当可活化抗体处于受抑制、掩蔽或未裂解状态(即，第一构形)时，可活化抗体展现与靶标的第一结合水平，并且在可活化抗体处于不受抑制、未掩蔽和/或裂解状态(即，第二构形)时，展现与靶标的第二结合水平，其中靶结合的第二水平大于结合的第一水平。一般来说，与不存在此类裂解剂的情况相比，在存在能够裂解CM的裂解剂的情况下，靶标与可活化抗体的AB更接近。因此，当可活化抗体在未裂解状态下时，AB与靶标结合被抑制并且可以被掩蔽而无法进行靶标结合(即，第一构形是AB无法结合靶标的构形)，并且在裂解状态下时，AB的靶标结合不受抑制或不受掩蔽。
选择可活化抗体的CM和AB，使得AB代表针对给定靶标的结合部分，而CM代表蛋白酶的底物。在一些实施例中，蛋白酶与靶标共定位于个体的治疗位点或诊断位点。如本文所用，共定位是指在相同位置或在附近相对接近。在一些实施例中，蛋白酶裂解CM，产生与位于裂解位点附近的靶标结合的活化抗体。本文所公开的可活化抗体在以下情况下具有特定用途：例如，与在非治疗位点中(例如在健康组织中)相比，在治疗位点或诊断位点的含靶标组织中，能够裂解CM中的位点的蛋白酶(即蛋白酶)以相对较高水平存在。在一些实施例中，本公开的CM也由一种或多种其它蛋白酶裂解。在一些实施例中，一种或多种其它蛋白酶与靶标共定位并且负责在体内裂解CM。
在一些实施例中，如果AB未被掩蔽或以其它方式受抑制与靶标的结合，则可活化抗体提供降低的可能原本由AB在非治疗位点处的结合引起的毒性和/或不良副作用。
一般来说，可通过选择所关注的AB并且构建可活化抗体的其余部分设计可活化抗体，使得当构形受限时，MM提供AB的掩蔽或AB与其靶标结合的减弱。可考虑结构设计标准来提供这种功能特征。
提供了在抑制的构形与未抑制的构形中展现靶结合所需的动态范围的可切换表型的可活化抗体。动态范围一般是指(a)在第一组条件下的参数的最大检测水平与(b)在第二组条件下所述参数的最小检测值的比率。举例来说，在可活化抗体的情形下，动态范围是指(a)在至少一种能够裂解可活化抗体的CM的蛋白酶的存在下，靶蛋白与可活化抗体结合的最大检测水平与(b)在不存在蛋白酶的情况下，靶蛋白与可活化抗体结合的最小检测水平的比率。可以将可活化抗体的动态范围计算为可活化抗体裂解剂(例如，酶)处理的解离常数与可活化抗体裂解剂处理的解离常数的比率。可活化抗体的动态范围越大，可活化抗体的可切换表型越好。具有相对较高的动态范围值(例如，大于1)的可活化抗体展现更理想的切换表型，使得与不存在裂解剂的情况相比，在能够裂解可活化抗体的CM的裂解剂(例如，酶)存在下，可活化抗体与靶蛋白的结合以更大程度进行(例如，占优势地进行)。
可以多种结构构形提供可活化抗体。下文提供可活化抗体的示例性式。特别设想在可活化抗体内，AB、MM和CM的N端到C端顺序可以颠倒。还特别设想CM和MM可在氨基酸序列上重叠，例如，使得CM含于MM内。
举例来说，可活化抗体可由下式表示(按从氨基(N)末端区到羧基(C)末端区的顺序：
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
其中MM是掩蔽部分，CM是可裂解部分，并且AB是抗体或其片段。应注意，尽管在上式中MM和CM指示为不同的组分，但在本文所公开的所有示例性实施例(包括式)中，设想MM和CM的氨基酸序列可以重叠，例如使得CM完全或部分含于MM内。另外，上式提供了可位于可活化抗体元件的N端或C端的额外氨基酸序列。
在某些实施例中，MM不是AB的天然结合搭配物。在一些实施例中，MM不含或大体上不含与AB的任何天然结合搭配物的同源性。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合配偶体的相似度不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的同一性。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合搭配物具有不超过50％的同一性。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合搭配物具有不超过25％的同一性。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合搭配物具有不超过20％的同一性。在一些实施例中，MM与AB的任何天然结合搭配物具有不超过10％的同一性。
在许多实施例中，可能期望将一种或多种接头，例如柔性接头插入可活化抗体构建体中，以便在MM-CM接合部、CM-AB接合部或两者中的一个或多个处提供柔性。举例来说，AB、MM和/或CM可能不含足以提供所需柔性的残基(例如，Gly、Ser、Asp、Asn，特别是Gly和Ser，尤其Gly)数目。如此，此类可活化抗体构建体的可切换表型可受益于一种或多种氨基酸的引入以提供柔性接头。另外，如下文所描述，在将可活化抗体以构形受约束构建体形式提供时，可将柔性接头可操作地插入以促进未裂解的可活化抗体中环状结构的形成和维持。
举例来说，在某些实施例中，可活化抗体包含下式之一(其中下式表示在N到C端方向或C到N端方向上的氨基酸序列)：
(MM)-LP1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-LP2-(AB)
(MM)-LP1-(CM)-LP2-(AB)
其中MM、CM和AB如上文所定义；其中LP1和LP2各自独立并且任选存在或不存在，是包括至少1个柔性氨基酸(例如，Gly)的相同或不同的柔性接头。另外，上式提供了可位于可活化抗体元件的N端或C端的额外氨基酸序列。实例包括但不限于靶向部分(例如，靶组织中存在的细胞受体的配体)和延长血清半衰期的部分(例如，结合血清蛋白，如免疫球蛋白(例如，IgG)或血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HAS))的多肽。
CM由至少一种蛋白酶以约0.001到1500×104M-1S-1或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250或1500×104M-1S-1的速率特异性裂解。在一些实施例中，CM以约100,000M-1S-1的速率特异性裂解。在一些实施例中，CM以约1×10E2到约1×10E6 M-1S-1(即，约1×102到约1×106M- 1S-1)的速率特异性裂解。
为了被酶特异性裂解，在酶与CM之间进行接触。当包含与MM和CM偶联的AB的可活化抗体在靶标和足够酶活性存在下，CM可被裂解。足够酶活性可以指酶与CM接触并且实现裂解的能力。可容易地预见到，酶可能在CM附近，但由于其它细胞因子或酶的蛋白质修饰而不能裂解。
适用于本文所描述的组合物的接头一般是提供修饰的AB或可活化抗体的柔性以促进AB与靶标结合的抑制的接头。此类接头一般称为柔性接头。合适的接头可以容易地选择，并且可具有任何合适的不同长度，如1个氨基酸(例如，Gly)到20个氨基酸、2个氨基酸到15个氨基酸、3个氨基酸到12个氨基酸，包括4个氨基酸到10个氨基酸、5个氨基酸到9个氨基酸、6个氨基酸到8个氨基酸或7个氨基酸到8个氨基酸，并且长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：24)和(GGGS)n(SEQ ID NO：25)，其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及所属领域中已知的其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并且因此可以充当组分之间的中性系链。比甚至丙氨酸相比，甘氨酸进入显著更多
Figure BDA0002465367670000721
空间，并且比具有较长侧链的残基更不受限制(参见Scheraga，《计算化学评论(Rev.Computational Chem.)》11173-142(1992))。示例性柔性接头包括但不限于Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：26)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：27)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：28)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：29)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：30)、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO：31)等。普通技术人员将认识到，可活化抗体的设计可包括全部或部分柔性的接头，使得接头可包括柔性接头以及一个或多个赋予较不柔性结构的部分以提供所需的可活化抗体结构。
本公开还提供了包括可活化抗CD71抗体的组合物和方法，所述抗体包括特异性结合CD71的抗体或抗体片段(AB)，其中AB与降低AB结合其靶标的能力的掩蔽部分(MM)偶联。在一些实施例中，可活化抗CD71抗体进一步包括作为蛋白酶的底物的可裂解部分(CM)。本文提供的组合物和方法使得一种或多种药剂能够连接到AB中的一个或多个半胱氨酸残基，而不损害可活化抗CD71抗体的活性(例如，掩蔽、活化或结合活性)。在一些实施例中，本文提供的组合物和方法能够将一种或多种药剂连接到AB中的一个或多个半胱氨酸残基，而不还原或以其它方式干扰MM内的一个或多个二硫键。本文提供的组合物和方法产生与一种或多种药剂，例如多种治疗、诊断和/或预防剂中的任一种缀合可活化抗CD71抗体，例如，在一些实施例中，(多种)药剂中的任一种不与可活化抗CD71抗体的MM缀合。本文提供的组合物和方法产生缀合可活化抗CD71抗体，其中MM保留有效并且高效掩蔽呈未裂解状态的可活化抗体的AB的能力。本文提供的组合物和方法产生缀合可活化抗CD71抗体，其中在可裂解CM的蛋白酶存在下，可活化抗体仍被活化，即被裂解。
可活化抗CD71抗体具有至少一个与药剂的缀合点，但在本文提供的方法和组合物中，少于全部可能的缀合点可用于与药剂缀合。在一些实施例中，一个或多个缀合点是二硫键中涉及的硫原子。在一些实施例中，一个或多个缀合点是链间二硫键中涉及的硫原子。在一些实施例中，一个或多个缀合点是链间硫键中涉及的硫原子，但不是链内二硫键中涉及的硫原子。在一些实施例中，一个或多个结合点是半胱氨酸或其它含硫原子的氨基酸残基的硫原子。此类残基可天然出现于抗体结构中，或可通过定点诱变、化学转化或非天然氨基酸的错误并入而并入到抗体中。
还提供了制备在AB中具有一个或多个链间二硫键并且在MM中具有一个或多个链内二硫键的可活化抗CD71抗体的缀合物的方法，并且提供了与游离硫醇具有反应性的药物。所述方法一般包括用还原剂，例如TCEP还原可活化抗体中的链间二硫键；和使与游离硫醇具有反应性的药物与部分还原的可活化抗体缀合。如本文所用，术语部分还原是指可活化抗CD71抗体与还原剂接触并且少于全部二硫键，例如少于所有可能的缀合位点被还原的情况。在一些实施例中，少于99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或少于5％的所有可能的缀合位点被还原。
在其它实施例中，提供了使药剂，例如药物还原并且缀合到可活化抗CD71抗体，引起药剂放置的选择性的方法。所述方法一般包括用还原剂部分还原可活化抗CD71抗体，使得可活化抗体的掩蔽部分或其它非AB部分中的任何缀合位点不被还原，和将药剂与AB中的链间硫醇缀合。选择(多个)缀合位点，以便允许药剂允许在所需位点发生缀合的所需放置。还原剂是例如TCEP。还原反应条件，例如还原剂与可活化抗体的比率、培育长度、培育期间的温度、还原反应溶液的pH等通过鉴别产生缀合可活化抗体的条件来确定，在所述抗体中，MM保留有效并且高效掩蔽呈未裂解状态的可活化抗体的AB的能力。还原剂与可活化抗CD71抗体的比率将根据可活化抗体而变化。在一些实施例中，还原剂与可活化抗CD71抗体的比率将在约20∶1到1∶1、约10∶1到1∶1、约9∶1到1∶1、约8∶1到1∶1、约7∶1到1∶1、约6∶1到1∶1、约5∶1到1∶1、约4∶1到1∶1、约3∶1到1∶1、约2∶1到1∶1、约20∶1到1∶1.5、约10∶1到1∶1.5、约9∶1到1∶1.5、约8∶1到1∶1.5、约7∶1到1∶1.5、约6∶1到1∶1.5、约5∶1到1∶1.5、约4∶1到1∶1.5、约3∶1到1∶1.5、约2∶1到1∶1.5、约1.5∶1到1∶1.5或约1∶1到1∶1.5的范围内。在一些实施例中，比率在约5∶1到1∶1的范围内。在一些实施例中，比率在约5∶1到1.5∶1的范围内。在一些实施例中，比率在约4∶1到1∶1的范围内。在一些实施例中，比率在约4∶1到1.5∶1的范围内。在一些实施例中，比率在约8∶1到约1∶1的范围内。在一些实施例中，比率在约2.5∶1到1∶1的范围内。
在一些实施例中，提供还原可活化抗CD71抗体的AB中的链间二硫键并且将药剂(例如含硫醇的药剂，如药物)缀合到所得链间硫醇以将(多种)药剂在AB上选择性地定位的方法。所述方法一般包括用还原剂部分还原AB以在可活化抗体中形成至少两个链间硫醇而不形成所有可能的链间硫醇；和使药剂与部分还原的AB的链间硫醇缀合。举例来说，可活化抗体的AB在约37℃下以还原剂：可活化抗体的所需比率被部分还原约1小时。在一些实施例中，还原剂与可活化抗体的比率将在约20∶1到1∶1、约10∶1到1∶1、约9∶1到1∶1、约8∶1到1∶1、约7∶1到1∶1、约6∶1到1∶1、约5∶1到1∶1、约4∶1到1∶1、约3∶1到1∶1、约2∶1到1∶1、约20∶1到1∶1.5、约10∶1到1∶1.5、约9∶1到1∶1.5、约8∶1到1∶1.5、约7∶1到1∶1.5、约6∶1到1∶1.5、约5∶1到1∶1.5、约4∶1到1∶1.5、约3∶1到1∶1.5、约2∶1到1∶1.5、约1.5∶1到1∶1.5或约1∶1到1∶1.5的范围内。在一些实施例中，比率在约5∶1到1∶1的范围内。在一些实施例中，比率在约5∶1到1.5∶1的范围内。在一些实施例中，比率在约4∶1到1∶1的范围内。在一些实施例中，比率在约4∶1到1.5∶1的范围内。在一些实施例中，比率在约8∶1到约1∶1的范围内。在一些实施例中，比率在约2.5∶1到1∶1的范围内。
含硫醇的试剂可以是例如半胱氨酸或N-乙酰基半胱氨酸。还原剂可以是例如TCEP。在一些实施例中，可以在缀合之前使用例如柱色谱、透析或透滤来纯化还原的可活化抗体。或者，在部分还原之后和缀合之前不纯化还原的抗体。
本发明还提供了部分还原的可活化抗CD71抗体，其中已用还原剂还原了可活化抗体中的至少一个链间二硫键，而没有干扰可活化抗体中的任何链内二硫键，其中可活化抗体包括特异性结合CD71的抗体或抗原结合片段(AB)、抑制呈未裂解状态的可活化抗体的AB与CD71靶标结合的掩蔽部分(MM)和与AB偶联的可裂解部分(CM)，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽。在一些实施例中，MM通过CM与AB偶联。在一些实施例中，可活化抗体的一个或多个链内二硫键不受还原剂干扰。在一些实施例中，可活化抗体内的MM的一个或多个链内二硫键不受还原剂干扰。在一些实施例中，呈未裂解状态的可活化抗体从N端到C端具有如下结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施例中，还原剂是TCEP。
在其它实施例中，通过提供具有确定数目和位置的赖氨酸和/或半胱氨酸残基的可活化抗CD71抗体，将例如药物的药剂还原并且缀合到可活化抗CD71抗体引起在药剂放置中的选择性的方法。在一些实施例中，赖氨酸和/或半胱氨酸残基的确定数目高于或低于亲本抗体或可活化抗体的氨基酸序列中对应残基的数目。在一些实施例中，确定数目的赖氨酸和/或半胱氨酸残基可产生确定数目的可与抗CD71抗体或可活化抗CD71抗体缀合的药剂当量。在一些实施例中，确定数目的赖氨酸和/或半胱氨酸残基可产生确定数目的可以位点特异性方式与抗CD71抗体或可活化抗CD71抗体缀合的药剂当量。在一些实施例中，修饰的可活化抗体以位点特异性方式经一种或多种非天然氨基酸修饰，因此在一些实施例中，将药剂的缀合限于仅非天然氨基酸的位点。在一些实施例中，可用本文所论述的还原剂部分还原具有确定数目和位置的赖氨酸和/或半胱氨酸残基的抗CD71抗体或可活化抗CD71抗体，使得可活化抗体的掩蔽部分或其它非AB部分的任何缀合位点未被还原，并且使药剂与AB中的链间硫醇缀合。
本公开还提供了部分还原的可活化抗体，其中已用还原剂还原可活化抗体中的至少一个链间二硫键，而没有干扰可活化抗体中的任何链内二硫键，其中可活化抗体包括特异性结合到靶标(例如，CD71)的抗体或抗原结合片段(AB)、抑制呈未裂解状态的可活化抗体的AB与靶标结合的掩蔽部分(MM)以及与AB偶联的可裂解部分(CM)，其中CM是充当至少一种蛋白酶的底物的多肽。在一些实施例中，MM通过CM偶联到AB。在一些实施例中，可活化抗体的一个或多个链内二硫键不受还原剂干扰。在一些实施例中，可活化抗体内的MM的一个或多个链内二硫键不受还原剂干扰。在一些实施例中，呈未裂解状态的可活化抗体从N端到C端具有如下结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施例中，还原剂是TCEP。
在一些实施例中，本文所描述的可活化抗体还包括与到可活化抗体缀合的药剂。在一些实施例中，缀合剂是治疗剂，如抗炎剂和/或抗肿瘤剂。在此类实施例中，药剂与可活化抗体的碳水化合物部分缀合，例如，在一些实施例中，其中碳水化合物部分位于可活化抗体的抗体或的抗原结合片段的抗原结合区之外。在一些实施例中，所述药剂与可活化抗体中的抗体或抗原结合片段的巯基缀合。
在一些实施例中，所述药剂是细胞毒性剂，如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。
在一些实施例中，所述药剂是可检测部分，例如标记或其它标记物。在一些实施例中，可检测部分是诊断剂。举例来说，所述药剂是或包括放射性标记的氨基酸、一种或多种可通过标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可通过光学或量热法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分、一种或多种放射性同位素或放射性核素、一种或多种荧光标记、一种或多种酶标记和/或一种或多种化学发光剂。在一些实施例中，可检测部分由间隔子分子连接。
本公开还涉及免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂，如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素缀合的抗体(即，放射性缀合物)。合适的细胞毒性剂包括例如海兔毒素和其衍生物(例如，奥瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE、MMAD、DMAF、DMAE)。举例来说，药剂是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)或单甲基奥瑞他汀D(MMAD)。在一些实施例中，药剂是海兔毒素。在一些实施例中，药剂是奥瑞他汀或其衍生物。在一些实施例中，药剂是奥瑞他汀E或其衍生物。在一些实施例中，药剂是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)。在一些实施例中，药剂是单甲基奥瑞他汀D(MMAD)。在一些实施例中，药剂是类美登素或类美登素衍生物。
在一些实施例中，缀合到AB的接头和毒素包含SPDB-DM4部分、vc-MMAD部分、vc-MMAE部分、vc-多卡霉素(duocarmycin)或PEG2-vc-MMAD部分。在一些实施例中，接头是可裂解的接头。在一些实施例中，接头是不可裂解的接头。在一些实施例中，药剂是可检测部分。
在一些实施例中，所述药剂使用马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头或马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头与AB键联。在一些实施例中，所述药剂使用马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头与AB键联。在一些实施例中，所述药剂是使用马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头与AB键联的单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，并且这种接头有效负载构建体在本文中称为“vc-MMAE”。在一些实施例中，所述药剂使用使用马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头与AB键联。在一些实施例中，所述药剂是使用马来酰亚胺四-PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头与AB键联的单甲基奥瑞他汀D(MMAD)，并且这种接头有效负载构建体在本文中称为“PEG4-vc-MMAD”。在一些实施例中，所述药剂是使用马来酰亚胺四-PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头与AB键联的单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，并且这种接头有效负载构建体在本文中称为“PEG4-vc-MMAE”。在一些实施例中，所述药剂使用马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头与AB键联。在一些实施例中，所述药剂是使用马来酰亚胺双-PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头与AB键联的单甲基奥瑞他汀D(MMAD)，并且这种接头有效负载构建体在本文中称为“PEG2-vc-MMAD”。PEG4-vc-MMAD、PEG4-vc-MMAE、PEG2-vc-MMAD以及vc-MMAE的结构如下所示：
PEG4-vc-MMAD：
Figure BDA0002465367670000781
PEG4-vc-MMAE：
Figure BDA0002465367670000782
PEG2-vc-MMAD：
Figure BDA0002465367670000783
vc-MMAE
Figure BDA0002465367670000784
本公开还提供了缀合可活化抗体，其包括与vcMMAE键联的可活化抗体，vcMMAE是具有val-cit(vc)接头的单甲基奥瑞他汀E(MMAE)有效负载，其中所述可活化抗体包括与靶标特异性结合的抗体(AB)、当缀合可活化抗体呈未裂解状态时抑制AB与靶标结合的与AB偶联的掩蔽部分(MM)以及与AB偶联的可裂解部分(CM)，并且CM是充当蛋白酶的底物的多肽。在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体具有式(I)的结构或其盐：
Figure BDA0002465367670000791
其中AB是与靶标特异性结合并且包括重链可变区、重链和/或一个或多个重链CDR(CDRH)区的抗体。AB还包括轻链可变区、轻链和/或一个或多个轻链CDR(CDRL)区。式(I)的缀合可活化抗体还包括掩蔽部分(MM)，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与其靶标的结合；第一键联部分(LP1)；可裂解部分(CM)，其中CM；以及第二键联部分(LP2)。在式(I)的特定实施例中，“n”是2。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(I)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在一些实施例中，本公开的缀合可活化抗体具有式(II)的结构或其盐：
Figure BDA0002465367670000801
其中AB是与靶标特异性结合并且包括重链可变区、重链和/或一个或多个重链CDR(CDRH)区的抗体。AB还包括轻链可变区、轻链和/或一个或多个轻链CDR(CDRL)区。式(I)的缀合可活化抗体还包括掩蔽部分(MM)，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与其靶标的结合；和可裂解部分(CM)，其中CM。在式(II)的特定实施例中，“n”是2。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB包含IgG1同种型。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。在一些实施例中，式(II)的缀合可活化抗体，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地为焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在式(I)或(II)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，靶标是哺乳动物CD71。在式(I)或(II)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，靶标是人类CD71。
在式(I)或(II)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，AB包括重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：10的CDRH2序列以及包含SEQ IDNO：11的CDRH3序列；和轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：14的CDRL2序列以及包含SEQ ID NO：15的CDRL3序列；包括SEQ ID NO：18的氨基酸序列的MM；以及包括SEQ ID NO：156的序列的CM；并且“n”是2。在式(I)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，AB包括重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：10的CDRH2序列以及包含SEQ ID NO：11的CDRH3序列；和轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：14的CDRL2序列以及包含SEQ ID NO：15的CDRL3序列；包括SEQ ID NO：18的氨基酸序列的MM；包括SEQ ID NO：207的氨基酸序列的LP1；包括SEQ ID NO：156的序列的CM；以及包括SEQ IDNO：38的氨基酸序列的LP2；并且“n”是2。
在式(I)或(II)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，AB包括有包括SEQID NO：5的序列的重链可变区和包括SEQ ID NO：7的序列的轻链可变区、包括SEQ ID NO：18的氨基酸序列的MM以及包括SEQ ID NO：156的序列的CM，并且“n”是2。在式(I)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，AB包括有包括SEQ ID NO：5的序列的重链可变区和包括SEQ ID NO：7的序列的轻链可变区、包括SEQ ID NO：18的氨基酸序列的MM、包括SEQ ID NO：207的氨基酸序列的LP1、包括SEQ ID NO：156的序列的CM以及包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列的LP2，并且“n”是2。
在式(I)或(II)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，AB包括有包括SEQID NO：167的序列的重链和包括SEQ ID NO：19的序列的轻链、包括SEQ ID NO：18的氨基酸序列的MM以及包括SEQ ID NO：156的序列的CM，并且“n”是2。在式(I)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，AB包括有包括SEQ ID NO：167的序列的重链和包括SEQ ID NO：19的序列的轻链、包括SEQ ID NO：18的氨基酸序列的MM、包括SEQ ID NO：207的氨基酸序列的LP1、包括SEQ ID NO：156的序列的CM以及包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列的LP2，并且“n”是2。
在式(I)或(II)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，AB包括有包括SEQID NO：167的序列的重链和包括SEQ ID NO：169的序列的轻链，并且“n”是2。在式(I)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，AB包括有包括SEQ ID NO：167的序列的重链和包括SEQ ID NO：169的序列的轻链，并且“n”是2。在式(I)或(II)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，AB包括有包括SEQ ID NO：167的序列的重链和包括SEQ ID NO：201的序列的轻链，并且“n”是2。
在式(I)或(II)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，AB包括有包括SEQID NO：5的序列的重链可变区和包括SEQ ID NO：7的序列的轻链可变区。在式(I)或(II)的本公开的缀合可活化抗体的一些实施例中，AB包括有包括SEQ ID NO：5的序列的重链可变区和包括SEQ ID NO：7的序列的轻链可变区。
本公开还提供了缀合可活化抗体，其包括与单甲基奥瑞他汀D(MMAD)有效负载键联的可活化抗体，其中可活化抗体包括特异性结合到靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)、抑制呈未裂解状态的可活化抗体的AB与靶标结合的掩蔽部分(MM)以及与AB偶联的可裂解部分(CM)，并且CM是充当至少一种MMP蛋白酶的底物的多肽。
在一些实施例中，MMAD缀合可活化抗体可使用几种将药剂与AB连接的方法中的任一种来缀合：(a)连接到AB的碳水化合物部分，或(b)连接到AB的巯基，或(c)连接到AB的氨基，或(d)连接到AB的羧酸酯基。
在一些实施例中，MMAD有效负载通过接头与AB缀合。在一些实施例中，MMAD有效负载通过接头与AB中的半胱氨酸缀合。在一些实施例中，MMAD有效负载通过接头与AB中的赖氨酸缀合。在一些实施例中，MMAD有效负载通过接头与AB的另一残基，如本文所公开的那些残基缀合。在一些实施例中，接头是含硫醇的接头。在一些实施例中，接头是可裂解的接头。在一些实施例中，接头是不可裂解的接头。在一些实施例中，接头选自表(II)和(III)中所示的接头。在一些实施例中，可活化抗体和MMAD有效负载通过马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头连接。在一些实施例中，可活化抗体和MMAD有效负载通过马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头连接。在一些实施例中，可活化抗体和MMAD有效负载通过马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头连接。在一些实施例中，可活化抗体和MMAD有效负载通过马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头连接。在一些实施例中，使用本文所公开的部分还原和缀合技术将MMAD有效负载缀合到AB。
在一些实施例中，本公开的接头的聚乙二醇(PEG)组分由2个乙二醇单体、3个乙二醇单体、4个乙二醇单体、5个乙二醇单体、6个乙二醇单体、7个乙二醇单体、8个乙二醇单体、9个乙二醇单体或至少10个乙二醇单体形成。在本公开的一些实施例中，PEG组分是支链聚合物。在本公开的一些实施例中，PEG组分是无支链聚合物。在一些实施例中，PEG聚合物组分经氨基或其衍生物、羧基或其衍生物或氨基或其衍生物和羧基或其衍生物两者官能化。
在一些实施例中，本公开的接头的PEG组分是氨基-四乙二醇-羧基或其衍生物。在一些实施例中，本公开的接头的PEG组分是氨基-三乙二醇-羧基或其衍生物。在一些实施例中，本公开的接头的PEG组分是氨基-二乙二醇-羧基或其衍生物。在一些实施例中，氨基衍生物是在氨基与其所缀合的羧基之间的酰胺键的形成物。在一些实施例中，羧基衍生物是在羧基与其所缀合的氨基之间的酰胺键的形成物。在一些实施例中，羧基衍生物是在羧基与其所缀合的羟基之间的酯键的形成物。
可使用的酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思子毒素A链、莫迪素A链、α-八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨蛋白、洋商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制因子、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制因子、白树素(gelonin)、有丝分裂素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素(enomycin)以及单端孢霉烯(tricothecene)。多种放射性核素可用于产生放射性缀合的抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y以及186Re。
抗体和细胞毒性剂的缀合物使用多种双官能蛋白偶联剂制得，双官能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸亚甲代苯酯)以及双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。举例来说，可如Vitetta等人，《科学(Science)》238：1098(1987)中所描述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。(参见WO94/11026)。
所属领域普通技术人员将认识到，可将很多种可能的部分与本公开的所得抗体偶联。(参见例如“缀合物疫苗(Conjugate Vaccines)”，《对微生物学和免疫学的贡献(Contributions to Microbiology and Immunology)》，J.M.Cruse和艮E.Lewis，Jr(编)，Carger Press，纽约(New York)，(1989)，其全部内容以引用的方式并入本文中。
可通过将结合两个分子的任何化学反应来实现偶联，只要抗体和另一部分保留其各自的活性即可。这种键联可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、插层、配位结合以及络合。然而，在一些实施例中，结合是共价结合。共价结合可通过现有侧链的直接缩合或通过并入外部桥接分子来实现。许多二价或多价键联剂适用于将蛋白质分子，如本公开的抗体与其它分子偶联。举例来说，代表性偶联剂可包括有机化合物，如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯以及六亚甲基二胺。这一清单并非旨在穷尽所属领域中已知的各种类别的偶联剂，而是更常见的偶联剂的示例。(参见Killen和Lindstrom，《免疫学杂志(Jour.Immun.)》133：1335-2549(1984)；Jansen等人，《免疫学评论(Immunological Reviews)》62：185-216(1982)；和Vitetta等人，《科学》238：1098(1987)。
在一些实施例中，除了本文提供的组合物和方法外，还可以通过插入或以其它方式包含于可活化抗体序列中的修饰的氨基酸序列来修饰缀合可活化抗体以便进行位点特异性缀合。这些修饰的氨基酸序列被设计成允许缀合可活化抗体内缀合剂的受控放置和/或剂量。举例来说，可将可活化抗体工程改造成在轻链和重链上的位置处包括半胱氨酸取代，所述取代提供反应性硫醇基并且不负面影响蛋白质折叠和装配，也不改变抗原结合。在一些实施例中，可将可活化抗体工程改造以在可活化抗体内包括或以其它方式引入一种或多种非天然氨基酸残基以提供适用于缀合的位点。在一些实施例中，可将可活化抗体工程改造以在可活化抗体序列内包括或以其它方式引入酶可活化肽序列。
合适的接头描述于文献中。(参见例如，Ramakrishnan，S.等人，《癌症研究(CancerRes.)》44：201-208(1984)描述MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的使用。还参见美国专利第5,030,719号，其描述借助于寡肽接头与抗体偶联的卤化乙酰基酰肼衍生物的使用。在一些实施例中，合适的接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(皮尔斯化学公司(Pierce Chem.Co.)，目录号(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(皮尔斯化学公司，目录号21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)]-丙酰胺]己酸酯(皮尔斯化学公司，目录号#2165-G)；以及(v)与EDC缀合的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：皮尔斯化学公司，目录号24510)。额外接头包括但不限于SMCC((4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)或磺基SPDB(N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯)。
上文所描述的接头含有具有不同属性的组分，因此产生具有不同物理化学特性的缀合物。举例来说，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳香族羧酸酯的磺基-NHS酯更稳定。含NHS酯的接头比磺基-NHS酯的溶解度低。此外，接头SMPT含有空间位阻的二硫键，并且可形成具有提高的稳定性的缀合物。一般来说，二硫键比其它键更不稳定，因为二硫键在体外被裂解，使得可用的缀合物较少。磺基-NHS尤其可增强碳二亚胺偶联的稳定性。当与磺基-NHS一起使用时，碳二亚胺偶联(如EDC)形成比单独的碳二亚胺偶联反应对水解的抗性更大的酯。
在一些实施例中，接头是可裂解的。在一些实施例中，接头是不可裂解的。在一些实施例中，存在两个或更多个接头。两个或更多个接头都是相同的，即，可裂解的或不可裂解的，或两个或更多个接头是不同的，即，至少一个可裂解和至少一个不可裂解。
本公开利用几种方法将药剂与AB连接：(a)连接到AB的碳水化合物部分，或(b)连接到AB的巯基，或(c)连接到AB的氨基，或(d)连接到AB的羧酸酯基。根据本公开，AB可通过具有至少两个反应性基团的中间接头与药剂共价连接，一个反应性基团与AB反应并且一个反应性基团与药剂反应。可选择可以包括任何相容性有机化合物的接头，使得与AB(或药剂)的反应不会不利地影响AB反应性和选择性。此外，接头与药剂的连接可能不破坏药剂的活性。适用于与氧化的抗体或氧化的抗体片段反应的接头包括含有选自由以下组成的组的胺的接头：伯胺、仲胺、肼、酰肼、羟胺、苯肼、氨基脲以及氨基硫脲基。此类反应性官能团可以作为接头结构的一部分存在，或可通过不含此类基团的接头的合适化学修饰引入。
根据本公开，适用于连接到还原的AB的接头包括具有某些能够与还原的抗体或片段的巯基反应的反应性基团的接头。此类反应性基团包括但不限于：反应性卤烷基(包括例如卤乙酰基)、对汞苯甲酯基和能够进行迈克尔型(Michael-type)加成反应的基团(包括例如马来酰亚胺和Mitra和Lawton，1979，《美国化学会志(J.Amer.Chem.Soc.)》101：3097-3110所描述类型的基团。
根据本公开，适用于连接到既不氧化也不还原的Ab的接头包括具有能够与Ab中未修饰的赖氨酸残基中存在的伯氨基反应的某些官能团的接头。此类反应性基团包括但不限于NHS羧酸或碳酸酯、磺基-NHS羧酸或碳酸酯、4-硝基苯基羧酸或碳酸酯、五氟苯基羧酸或碳酸酯、酰基咪唑、异氰酸酯以及异硫氰酸酯。
根据本公开，适用于连接到既不氧化也不还原的Ab的接头包括具有能够与Ab中天冬氨酸或谷氨酸残基中存在的羧酸基反应的某些官能团的接头，所述Ab已经合适的试剂活化。合适的活化试剂包括具有或不具有添加的NHS或磺基-NHS的EDC，以及用于羧酰胺形成的其它脱水剂。在这些情况下，合适的接头中存在的官能团将包括伯胺和仲胺、肼、羟胺以及酰肼。
可以在将接头连接到AB之前或之后将药剂连接到接头。在某些应用中，可能期望首先产生AB-接头中间体，其中所述接头不含缔合药剂。取决于特定应用，然后可将特定药剂共价连接到接头。在一些实施例中，AB首先连接到MM、CM和相关接头，并且然后连接到用于缀合目的的接头。
支链接头：在特定实施例中，利用了具有多个用于连接药剂的位点的支链接头。对于多位点接头，与AB的单一共价连接将使得AB-接头中间体能够在多个位点处结合药剂。位点可以是醛或巯基，或药剂可连接到的任何化学位点。
在一些实施例中，可通过在AB上的多个位点处连接单一位点接头来实现更高的比活性(或更高的药剂与AB的比率)。可通过两种方法中的任一种将所述多个位点引入到AB中。首先，可在同一AB中产生多个醛基和/或巯基。第二，可将具有用于随后连接到接头的多个功能位点的“支链接头”连接到AB的醛或巯基。支链接头或多位点接头的功能位点可以是醛或巯基，或可以是可连接到接头的任何化学位点。通过将这两种方法组合，即在AB上的多个位点处连接多位点接头，可获得更高的比活性。
可裂解接头：对补体系统的酶裂解敏感的肽接头，所述酶如但不限于u-纤溶酶原活化因子、组织纤溶酶原活化因子、胰蛋白酶、纤溶酶或另一具有蛋白水解活性的酶，可用于本公开的一个实施例。根据本公开的一种方法，药剂通过对由补体裂解敏感的接头连接。抗体选自可活化补体的类别。因此，抗体-药剂缀合物活化补体级联并且在靶位点释放药剂。根据本公开的另一方法，药剂通过对由具有蛋白水解活性的酶裂解敏感的接头连接，所述酶如u-纤溶酶原活化因子、组织纤溶酶原活化因子、纤溶酶或胰蛋白酶。
表(II)中提供了可裂解的接头序列的非限制性实例。
表(II)：用于缀合的示例性接头序列
Figure BDA0002465367670000891
另外，药剂可通过二硫键(例如，半胱氨酸分子上的二硫键)连接到AB。由于许多肿瘤天然释放高水平的谷胱甘肽(还原剂)，因此这可以还原二硫键，随后在递送位点处释放药剂。在一些实施例中，将修饰CM的还原剂还将修饰缀合可活化抗体的接头。
间隔子和可裂解元件：在一些实施例中，可能有必要以优化试剂和可活化抗体的AB之间的间隔的方式构建接头。这可以通过使用以下通式结构的接头来完成：
W-(CH2)n-Q
其中
W是--NH--CH2-或--CH2--；
Q是氨基酸、肽；并且
n是0到20的整数。
在一些实施例中，接头可包含间隔元件和可裂解元件。间隔元件用于将可裂解元件远离AB的核心定位，使得负责裂解的酶更易于接近可裂解元件。上文所描述的某些支链接头可充当间隔元件。
在这一论述通篇，应理解，接头与药剂的连接(或间隔元件与可裂解元件，或可裂解元件与药剂的连接)不需要是特定连接或反应模式。提供具有合适稳定性和生物相容性的产物的任何反应是可接受的。
血清补体和接头的选择：根据本公开的一种方法，当期望释放药剂时，使用作为可以活化补体的类别的抗体的AB。所得缀合物保留结合抗原和活化补体级联的能力。因此，根据本公开的这一实施例，药剂接合到可裂解接头或可裂解元件的一端，并且接头基团的另一端连接到AB上的特定位点。举例来说，如果药剂具有羟基或氨基，则其可分别通过酯或酰胺键连接到肽、氨基酸或其它适当选择的接头的羧基端。举例来说，此类药剂可通过碳二亚胺反应连接到接头肽。如果药剂含有会干扰与接头连接的官能团，则这些干扰的官能团可在连接之前阻断，并且在制得产物缀合物或中间体后解阻断。然后直接或在进一步修饰后使用接头的对置端或氨基端，以便与能够活化补体的AB结合。
接头(或接头的间隔元件)可具有任何所需长度，其一端可共价连接到可活化抗体的AB上的特定位点。接头或间隔元件的另一端可以连接到氨基酸或肽接头。
因此，当这些缀合物在补体存在下与抗原结合时，将药剂连接到接头的酰胺或酯键将被裂解，使得药剂以其活性形式释放。当将这些缀合物施用于个体时，将在靶位点处实现药剂的递送和释放，并且对于药剂、抗生素、抗代谢物、抗增殖剂等的体内递送尤其有效。
用于在没有补体活化的情况下释放的接头：在靶向递送的又一应用中，由于补体级联的活化最终将溶解靶细胞，因此期望在没有补体活化的情况下释放药剂。因此，当应在不杀死靶细胞的情况下实现药剂的递送和释放时，这种方法适用。这是期望将细胞介体，如激素、酶、皮质类固醇、神经递质、基因或酶递送到靶细胞时的目标。这些缀合物可以通过将药剂连接到AB而制备，所述AB不能通过对由血清蛋白酶裂解轻度敏感的接头活化补体。当将这种缀合物施用于个体时，抗原-抗体复合物将快速形成，而药剂的裂解将缓慢发生，从而引起化合物在靶位点处释放。
生化交联剂：在一些实施例中，可使用某些生化交联剂将可活化抗体与一种或多种治疗剂缀合。交联试剂形成将两个不同分子的官能团连接在一起的分子桥。为了逐步键联两种不同蛋白质，可使用消除不需要的均聚物形成的异质双官能交联剂。
可被溶酶体蛋白酶裂解的肽基接头也适用，例如Val-Cit、Val-Ala或其它二肽。另外，可使用在溶酶体的低pH环境中可裂解的酸不稳定接头，例如：双唾液酸基醚。其它合适的接头包括组织蛋白酶不稳定的底物，尤其在酸性pH下显示最佳功能的底物。
表(III)中提及示例性异质双官能交联剂。
表(III)：示例性异质双官能交联剂
Figure BDA0002465367670000921
不可裂解的接头或直接连接：在本公开的一些实施例中，可以设计缀合物，使得药剂被递送到靶标但不释放。这可以通过将药剂直接或通过不可裂解的接头连接到AB来实现。
这些不可裂解的接头可包括氨基酸、肽、D-氨基酸或其它有机化合物，其可经修饰以包括随后可通过本文所描述的方法用于与AB连接的官能团。此类有机接头的通式可以是
W-(CH2)n-Q
其中
W是--NH--CH2-或--CH2--；
Q是氨基酸、肽；并且
n是0到20的整数。
不可裂解的缀合物：在一些实施例中，化合物可以连接到不活化补体的AB。当使用不能进行补体活化的AB时，可使用对由活化补体裂解敏感的接头或对由活化补体裂解不敏感的接头来实现这种连接。
定义：
除非另外定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语应具有所属领域普通技术人员通常理解的含义。术语“一”实体或“一个”实体是指所述实体中的一个或多个。举例来说，化合物是指一种或多种化合物。如此，术语“一”、“一个”、“一个或多个”和“至少一个”可互换使用。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。一般来说，本文所描述的与细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或聚核苷酸化学和杂交结合使用的命名法和技术是所属领域中众所周知并且常用的命名法和技术。对于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化，使用标准技术(例如电穿孔、脂质体转染)。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明书或如所属领域中通常所实现或如本文中所描述来进行。前述技术和程序一般根据所属领域中众所周知和如本发明的说明书通篇中所论述的各种一般性和较特定的参考文献中所述的常规方法来执行。参见例如Sambrook等人《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》(第2版，纽约州冷泉港冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.)(1989))。与本文描述的分析化学、合成有机化学以及药物和医药化学结合使用的命名法以及其实验室程序和技术是所属领域众所周知并且常用的。使用标准技术进行化学合成、化学分析、医药制备、调配和递送以及治疗患者。
如根据本公开所用，除非另外指示，否则以下术语应理解为具有以下含义：
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫学活性部分，即，含有特异性结合抗原(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与……免疫反应”或“免疫特异性结合”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定子反应，并且不与其它多肽反应或以低得多的亲合力(Kd＞10-6)结合。
已知基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50到70kDa)。每条链的氨基端部分包括具有约100到110个或更多个主要负责抗原识别的氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分限定主要负责效应功能的恒定区。一般来说，从人类获得的抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE以及IgD类别中的任一种，其因分子中存在的重链性质而彼此不同。某些类别还具有亚类，如IgG1、IgG2和其它。此外，在人类中，轻链可以是κ链或λ链。
如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)或“单克隆抗体组合物”是指仅含有由独特轻链基因产物和独特重链基因产物组成的抗体分子的一种分子物种的抗体分子群。特定来说，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在群体的所有分子中相同。Mab含有能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点，其特征在于对特定表位的独特结合亲和力。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区域的三个高度相异的拉伸片段(被称作“高变区”)插在被称为“框架区”或“FR”的较保守的侧接片段之间。因此，术语“FR”是指天然见于免疫球蛋白中的高变区之间和附近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此安置，以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且重链和轻链中的每一个的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。每个域的氨基酸分配符合Kabat免疫目的的蛋白质序列(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest)的定义(马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院(National Institutes of Health，Bethesda，Md.)(1987和1991))或Chothia和Lesk《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196：901-917(1987)，Chothia等人《自然(Nature)》342：878-883(1989)。
如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合到免疫球蛋白、scFv或T细胞受体的任何蛋白质决定子。术语“表位”包括能够特异性结合到免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白质决定子。表位决定子通常由根据表面化学活性分组的分子(如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。举例来说，可产生针对多肽的N端或C端肽的抗体。当解离常数≤1μM；在一些实施例中，≤100nM并且在一些实施例中，≤10nM时，抗体称为特异性结合抗原。
如本文所用，术语“特异性结合”、“免疫结合”以及“免疫结合特性”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白特异的抗原之间发生的非共价相互作用类型。免疫结合相互作用的强度或亲和力可按照相互作用的解离常数(Kd)表示，其中较小Kd表示较大亲和力。所选多肽的免疫结合特性可使用所属领域众所周知的方法定量。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物搭配物的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，“缔合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)都可以通过计算浓度和缔合和解离的实际速率来确定。(参见《自然》361：186-87(1993))。Koff/Kon的比率使得能够消除与亲和力不相关的所有参数，并且等于解离常数Kd。(一般参见Davies等人(1990)《生物化学年评(Annual Rev Biochem)》59：439-473)。如通过分析，如放射性配体结合分析或所属领域的技术人员已知的类似分析测量，当结合常数(Kd)是≤1μM，在一些实施例中≤100nM，在一些实施例中≤10nM，并且在一些实施例中≤100pM到约1pM时，本公开的抗体称为特异性结合到靶标。
如本文所用，术语“分离的多核苷酸”将意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其某一组合，借助于其来源，“分离的多核苷酸”(1)与其中“分离的多核苷酸”见于自然界中的多核苷酸全部或部分不相关，(2)可操作地连接到在自然界中未键联的多核苷酸，或(3)作为较大序列的一部分在自然界中不存在。根据本公开的多核苷酸包括编码本文所示的重链免疫球蛋白分子的核酸分子，和编码本文所示的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
本文提及的术语“分离的蛋白质”是指cDNA、重组RNA或合成来源或其某一组合的蛋白质，借助于其来源或衍生源，“分离的蛋白质”(1)与见于自然界中的蛋白质不相关，(2)不含来自同一源的其它蛋白质，例如不含鼠类蛋白质，(3)由不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。
术语“多肽”在本文中用作属类名，以指代天然蛋白质、片段或多肽序列的类似物。因此，天然蛋白质片段和类似物是多肽属的物种。根据本公开的多肽包含本文所示的重链免疫球蛋白分子和本文所示的轻链免疫球蛋白分子，以及由包含以下的组合形成的抗体分子：重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子，如κ轻链免疫球蛋白分子，且反之亦然，以及其片段和类似物。
如本文所用，术语“天然存在”在应用于一种对象时，指的是一种对象可以在自然界中存在的事实。举例来说，可以从自然界中的来源分离并且尚未在实验室中经有意人工修饰的生物体(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指所描述的组分处于允许其以其预期方式起作用的关系的放置。“可操作地连接”到编码序列的控制序列是以使得在与控制序列相容的条件下实现对编码序列的表达的方式进行连接。
如本文所用，术语“控制序列”是指实现多核苷酸序列所接合的编码序列的表达和加工必需的多核苷酸序列。此类控制序列的性质取决于原核生物中的宿主生物体而不同，此类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点以及真核生物中的转录终止序列，一般来说，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括至少存在对于表达和加工来说是必需的所有组分，并且还可包括存在有利的其它组分，例如前导序列和融合搭配物序列。本文所提及的术语“多核苷酸”是指长度至少为10个碱基的核苷酸，所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。术语包括单链和双链形式的DNA。
本文所提及的术语寡核苷酸包括天然存在的核苷酸，和通过天然存在的和非天然存在的寡核苷酸键联连接在一起的修饰的核苷酸。寡核苷酸是一般包含200个碱基或更少的长度的多核苷酸亚组。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为10到60个碱基，并且在一些实施例中，长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20到40个碱基。寡核苷酸通常是单链的，例如用于探针，不过寡核苷酸可以是双链的，例如用于构建基因突变体。本公开的寡核苷酸是正义或反义寡核苷酸。
本文所提及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文所提及的术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰或取代的糖基和其类似物的核苷酸。本文所提及的术语“寡核苷酸键联”包括寡核苷酸键联，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、磷酰胺酯等。参见例如LaPlanche等人《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》14：9081(1986)；Stec等人《美国化学会志》106：6077(1984)，Stein等人《核酸研究》16：3209(1988)，Zon等人《抗癌药物设计(Anti Cancer DrugDesign)》6：539(1991)；Zon等人《寡核苷酸和类似物：实用方法(Oligonucleotides andAnalogues：APractical Approach)》，第87-108页(F.Eckstein编，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)，英格兰牛津(Oxford England)(1991))；Stec等人美国专利第5,151,510号；Uhlmann和Peyman《化学评论(Chemical Reviews)》90：543(1990)。如果需要，寡核苷酸可包括用于检测的标记。
如本文所用，二十种常规氨基酸和其缩写遵循常规用法。参见《免疫学综合(Immunology-A Synthesis)》(第2版，E.S.Golub和D.R.Green编，Sinauer Associates，马萨诸塞州桑德兰(Sunderland，Mass.)(1991))。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸，如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸以及其它非常规氨基酸也可能是适用于本公开的多肽的组分。非常规氨基酸的实例包括：4羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸以及其它类似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽记号中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基端方向，并且右手方向是羧基端方向。
类似地，除非另外规定，否则单链多核苷酸序列的左手端是5′端，双链多核苷酸序列的左手方向被称为5′方向。新生RNA转录物5′到3′的添加方向称为转录方向，DNA链上具有与RNA相同的序列并且在RNA转录物5′端的5′方向的序列区称为“上游序列”，DNA链上具有与RNA相同的序列并且在RNA转录物3′端的3′方向的序列区称为“下游序列”。
当应用于多肽时，术语“大体同一性”是指当两个肽序列如通过使用默认间隙权重的GAP或BESTFIT程序最佳比对时，共有至少80％序列同一性，在一些实施例中，至少90％序列同一性，在一些实施例中，至少95％序列同一性，并且在一些实施例中，至少99％序列同一性。
在一些实施例中，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。
如本文所论述，设想抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小变化由本公开涵盖，条件是氨基酸序列中的变化保持至少75％，在一些实施例中，至少80％、90％、95％，并且在一些实施例中，99％。特定来说，设想保守氨基酸置换。保守置换是发生在侧链相关的氨基酸家族内的置换。基因编码的氨基酸一般分为以下家族：(1)酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸，以及(4)不带电极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸以及苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸。其它氨基酸家族包括：(i)丝氨酸和苏氨酸，其为脂肪族羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，其为含有酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸，其为脂肪族家族；(iv)苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸，其为芳香族家族。举例来说，可合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸独立置换亮氨酸，用谷氨酸独立置换天冬氨酸，用丝氨酸独立置换苏氨酸或用结构相关氨基酸类似置换氨基酸对所得分子的结合或特性将不具有重大影响，尤其在置换不涉及在框架位点内氨基酸的情况下。氨基酸改变是否产生功能性肽可通过测定多肽衍生物的比活性容易地确定。本文中详细描述分析。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可由所属领域普通技术人员容易地制备。片段或类似物的合适氨基和羧基端出现在功能域的边界附近。可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较来鉴别结构域和功能域。在一些实施例中，使用计算机化比较方法来鉴别在已知结构和/或功能的其它蛋白质中出现的序列基序或预测的蛋白质构形域。鉴别折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等人《科学》253：164(1991)。因此，前述实例证明，所属领域的技术人员可根据本公开识别可用于限定结构域和功能域的序列基序和结构构形。
合适的氨基酸取代是以下的取代：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变对形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，以及(5)赋予或修饰此类类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可包括除天然存在的肽序列外的序列的各种突变蛋白。举例来说，可在天然存在的序列中(例如，在形成分子间接触的(多个)域外的多肽部分中)进行单个或多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应显著改变亲本序列的结构特征(例如，置换氨基酸不应倾向于破坏亲本序列中出现的螺旋，或破坏作为亲本序列的特征的其它类型的二级结构)。领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于《蛋白质，结构和分子原理(Proteins，Structures and MolecularPrinciples)》(Creighton编，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)，纽约(1984))；蛋白质结构介绍(C.Branden和J.Tooze编，加兰出版公司(Garland Publishing)，纽约州纽约(1991))；和Thornton等人《自然》354：105(1991)。
如本文所用，术语“多肽片段”是指具有氨基端和/或羧基端缺失和/或一种或多种内部缺失，但其中其余氨基酸序列与例如由全长cDNA序列推导的天然存在的序列中的对应位置相同的多肽。片段典型地至少5、6、8或10个氨基酸长，在一些实施例中，至少14个氨基酸长，在一些实施例中，至少20个氨基酸长，通常至少50个氨基酸长，并且在一些实施例中，至少70个氨基酸长。如本文所用，术语“类似物”是指包含至少25个氨基酸的段的多肽，其与推导的氨基酸序列的一部分具有大体同一性，并且在合适的结合条件下具有与靶标的特异性结合。典型地，多肽类似物相对于天然存在的序列包含保守的氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物典型地至少20个氨基酸长，在一些实施例中，至少50个氨基酸长或更长，并且通常可与全长天然存在的多肽一样长。
术语“药剂”在本文中用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。
如本文所用，术语“标记”或“标记的”是指并入可检测标记物，例如通过并入放射性标记的氨基酸或连接到可由标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可通过光学或量热法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标记或标记物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是所属领域中已知的并且可使用。多肽标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、若丹明(rhodamine)、镧系磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基、由二级报告分子(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、表位标签)识别的预定多肽表位。在一些实施例中，标记由具有多种长度的间隔臂连接以降低潜在位阻。如本文所用，术语“药剂或药物”是指当适当地施用于患者时能够诱导所需治疗效果的化合物或组合物。
本文中的其它化学术语根据所属领域的常规用法使用，如由麦格劳-希尔化学术语词典(The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms)(Parker，S.编，麦格劳-希尔，旧金山(San Francisco)(1985))所例示。
如本文所用，“大体上纯”意指目标物种是存在的主导物种(即，按摩尔计，其比组合物中的任何其它个别物种更丰富)，并且在一些实施例中，大体上纯化的部分是目标物种占存在的所有大分子物种的至少约50％(按摩尔计)的组合物。
一般来说，大体上纯的组合物将占组合物中存在的所有大分子物种的超过约80％，在一些实施例中，超过约85％、90％、95％和99％。在一些实施例中，目标物种纯化到基本均质(无法通过常规检测方法在组合物中检测到污染物物种)，其中组合物基本上由单一大分子物种组成。
术语患者包括人类和兽医学个体。
本公开的抗体和/或可活化抗体特异性结合给定靶标，例如人类靶标蛋白，如人类CD71。本公开中还包括与本文所描述的抗体和/或可活化抗体到结合相同表位的抗体和/或可活化抗体。本公开中还包括与本文所描述的抗CD71抗体和/或抗CD71可活化抗体竞争与CD71，例如人类CD71结合的抗体和/或抗体可活化抗体。本公开中还包括与本文所描述的抗CD71抗体和/或抗CD71可活化抗体交叉竞争与CD71，例如人类CD71结合的抗体和/或抗体可活化抗体。
所属领域的技术人员将认识到，有可能确定单克隆抗体(例如，鼠类单克隆抗体或人源化抗体)是否与本文所描述的方法中使用的单克隆抗体具有相同特异性，而无需进行过多实验，所述确定通过查明前者是否阻止后者与靶标结合来进行。如果所测试的单克隆抗体与本公开的单克隆抗体竞争，如由本公开的单克隆抗体的结合减少显示，则两种单克隆抗体结合到相同或紧密相关的表位。确定单克隆抗体是否具有本公开的单克隆抗体的特异性的替代方法是将本公开的单克隆抗体与靶标预培育，并且然后添加所测试的单克隆抗体以确定所测试的单克隆抗体结合靶标的能力是否被抑制。如果所测试的单克隆抗体被抑制，则极有可能其与本公开的单克隆抗体具有相同或功能等效的表位特异性。
缀合可活化抗体的用途
应了解，根据本公开的治疗实体的施用将与合适的药学上可接受的载剂、赋形剂以及并入到配制物中以提供改良的转移、递送、耐受等的其它试剂一起施用。
借助于非限制性实例包括缀合可活化抗体的本公开的治疗性配制物用于预防、治疗或以其它方式改善与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症。举例来说，包括缀合可活化抗体的本公开的治疗性配制物用于治疗或以其它方式改善癌症或其它赘生性病况、炎症、炎性疾病和/或自身免疫疾病。在一些实施例中，癌症是其中表达靶标的实体肿瘤或血液恶性疾病。在一些实施例中，癌症是其中表达靶标的实体肿瘤。在一些实施例中，癌症是其中表达靶标的血液恶性疾病。在一些实施例中，靶标在薄壁组织(例如，在癌症中，通常执行器官或组织的(多种)功能的器官或组织的部分)上表达。在一些实施例中，靶标在细胞、组织或器官上表达。在一些实施例中，靶标在基质(即，细胞、组织或器官的结缔支持框架)上表达。在一些实施例中，靶标在成骨细胞上表达。在一些实施例中，靶标在内皮(脉管系统)上表达。在一些实施例中，靶标在癌症干细胞上表达。在一些实施例中，与抗体和/或可活化抗体缀合的药剂是微管抑制剂。在一些实施例中，与抗体和/或可活化抗体缀合的药剂是核酸破坏剂。
结合用于诊断或治疗与靶标表达和/或活性，例如异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症的任何已知方法，确定预防、改善或治疗的有效性。延长个体的存活或以其它方式延缓与靶标表达和/或活性，例如异常的靶标表达和/或活性相关的疾病或病症在个体中的进展，表明抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体赋予临床益处。
抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体可以医药组合物的形式施用。在使用抗体片段的一些实施例中，选择与靶蛋白的结合域特异性结合的最小片段。举例来说，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白序列能力的肽分子。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见例如，Marasco等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，90：7889-7893(1993))。
用于体内施用的配制物必须是无菌的。这易于通过经无菌过滤膜过滤实现。
在一些实施例中，抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体含有可检测标记。使用完整抗体或其片段(例如，Fab、scFv或F(ab)2)。关于探针或抗体，术语“标记”旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)到探针或抗体直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂反应而间接标记探针或抗体。间接标记的实例包含使用荧光标记的二级抗体检测初级抗体且用生物素末端标记DNA探针以使得其可用荧光标记的链霉亲和素来检测。术语“生物样品”旨在包括从个体分离的组织、细胞和生物流体，以及存在于个体内的组织、细胞和流体。因此，术语“生物样品”的使用包括血液和血液的部分或组分，包括血清、血浆或淋巴。即，本公开的检测方法可用于在体外以及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。举例来说，用于检测分析物mRNA的体外技术包括RNA杂交(Northern hybridization)和原位杂交。用于检测分析物蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附检定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫化学染色以及免疫荧光。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包括DNA杂交(Southern hybridization)。进行免疫测定的程序描述于例如“ELISA：理论与实践：分子生物学方法(ELISA：Theory and Practice：Methods inMolecular Biology)”第42卷，J.R.Crowther(编)，人类出版社(Human Press)，新泽西州托托瓦(Totowa，NJ)，1995；“免疫分析(Immunoassay)”，E.Diamandis和T.Christopoulus，学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，加利福尼亚州圣迭戈(San Diego，CA)，1996；以及“酶免疫分析的实践和理论(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)”，P.Tijssen，爱思唯尔科学出版社(Elsevier Science Publishers)，阿姆斯特丹(Amsterdam)，1985中。此外，用于检测分析物蛋白质的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白质抗体引入个体中。举例来说，抗体可以用放射性标记物标记，所述放射性标记物在个体中的存在和位置可以通过标准成像技术检测。
本公开的抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体也适用于多种诊断和预防配制物。在一个实施例中，将缀合可活化抗体施用于具有罹患前述病症中的一种或多种的风险的患者。可使用基因型、血清学或生化标记物确定患者或器官对前述病症中的一种或多种的易感性。
在本公开的一些实施例中，将缀合可活化抗体施用于诊断患有与前述病症中的一种或多种相关的临床适应症的人类个体。诊断后，施用缀合可活化抗体以减轻或逆转临床适应症的影响。
本公开的抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体也适用于检测患者样品中的靶标并且因此适用作诊断剂。举例来说，本公开的抗体和/或可活化抗体和其缀合形式用于体外分析，例如ELISA，以检测患者样品中的靶标水平。
在一个实施例中，将本公开的抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体固定在固体支持物(例如，微量滴定板的(多个)孔)上。固定的抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体充当可存在于测试样品中的任何靶标的捕获抗体。在使固定的抗体和/或可活化抗体和/或其缀合形式与患者样品接触之前，冲洗固体支持物并且用封闭剂，如乳蛋白或白蛋白处理以防止分析物的非特异性吸附。
随后，用怀疑含有抗原的测试样品或含有标准量抗原的溶液处理孔。此类样品是例如来自怀疑具有视为诊断病理的循环抗原水平的个体的血清样品。冲洗掉测试样品或标准物后，用可检测标记的第二抗体处理固体支持物。标记的第二抗体充当检测抗体。测量可检测标记的水平，并且通过与由标准样品建立的标准曲线进行比较来确定测试样品中靶抗原的浓度。
应了解，基于使用本公开的抗体和可活化抗体和其缀合形式获得的结果，在体外诊断分析中有可能基于靶抗原的表达水平对个体的疾病进行分期。对于给定疾病，从诊断为处于疾病进展的各个阶段和/或处于疾病的治疗性处理中的各个点的个体取得血液样品。使用为进展或疗法的每个阶段提供统计显著结果的样品群，指定可视为每个阶段所特有的抗原浓度范围。
抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体也可用于诊断和/或成像方法。在一些实施例中，此类方法是体外方法。在一些实施例中，此类方法是体内方法。在一些实施例中，此类方法是原位方法。在一些实施例中，此类方法是离体方法。举例来说，具有酶可裂解的CM的可活化抗体可用于检测是否存在能够裂解CM的酶。此类可活化抗体可用于诊断，其可包括通过在给定宿主生物体的给定细胞或组织中测量活化抗体(即，由可活化抗体裂解产生的抗体)的积累体内检测(例如，定性或定量)酶活性(或在一些实施例中，具有提高的还原势的环境，如可提供二硫键还原的环境)。活化抗体的此类积累不仅表明组织表达酶活性(或取决于CM的性质的提高的还原势)，而且表明组织表达活化抗体结合到的靶标。
举例来说，可选择CM作为至少一种蛋白酶的底物，所述至少一种蛋白酶见于肿瘤位点、病毒或细菌感染的位点、生物学上受限的位点(例如在脓肿中、在器官中等等)等等。AB可以是结合靶抗原的一种AB。使用本文所公开的方法，或在适当时，所属领域的技术人员熟悉的方法，可将可检测标记(例如，荧光标记或放射性标记或放射性示踪剂)缀合到抗体和/或可活化抗体的AB或其它区。在以上筛选方法的情形下论述了合适的可检测标记，并且在以下提供了额外的具体实例。使用对疾病状态的蛋白质或肽具有特异性的AB以及至少一种在所关注的疾病组织中活性升高的蛋白酶，相对于CM特异性酶不以可检测水平存在或以低于疾病组织中的水平存在或无活性(例如，呈酶原形式或与抑制剂复合)的组织，可活化抗体将展现提高的与疾病组织的结合率。由于肾脏过滤系统迅速从血液中清除小蛋白质和多肽，并且由于对CM具有特异性的酶不以可检测水平存在(或在非疾病组织中以较低的水平存在或以无活性构形存在)，因此相对于非疾病组织，活化抗体在疾病组织中的积累得到增强。
在另一实例中，可活化抗体可用于检测样品中是否存在裂解剂。举例来说，在可活化抗体含有对由酶裂解敏感的CM时，可活化抗体可用于检测(定性或定量)样品中酶的存在。在另一实例中，在可活化抗体含有对由还原剂裂解敏感的CM时，可活化抗体可用于检测(定性或定量)样品中还原条件的存在。为了促进这些方法中的分析，可活化抗体可以被可检测标记，并且可以与支持物(例如，固体支持物，如载玻片或珠粒)结合。可检测标记可以位于裂解后不释放的可活化抗体的一部分上，例如，可检测标记可以是淬灭的荧光标记或直到发生裂解才不可检测的其它标记。举例来说，可通过例如使固定的可检测标记的可活化抗体与怀疑含有酶和/或还原剂的样品接触，持续足以发生裂解的时间，然后洗涤以去除过量的样品和污染物来进行分析。然后通过与样品接触之前可活化抗体的可检测信号的变化，例如由于样品中的裂解剂对可活化抗体的裂解，可检测信号的存在和/或增加，评定样品中是否存在裂解剂(例如，酶或还原剂)。
此类检测方法可调适成还提供能够结合裂解时的可活化抗体的AB的靶标是否存在的检测。因此，分析可调适成评定裂解剂是否存在以及所关注的靶标是否存在。可通过如上文所描述的可活化抗体的可检测标记的存在和/或增加来检测裂解剂是否存在，并且可通过检测靶标-AB复合物，例如通过使用可检测标记的抗靶标抗体来检测靶标是否存在。
可活化抗体也适用于原位成像，以便验证可活化抗体活化，例如通过蛋白酶裂解，以及与特定靶标的结合。原位成像是使得能够在生物样品(如细胞培养物或组织切片)中定位蛋白水解活性和靶标的技术。使用这种技术，有可能基于可检测标记(例如，荧光标记)的存在来确认与给定靶标的结合和蛋白水解活性两者。
这些技术适用于来源于疾病位点的任何冷冻细胞或组织(例如肿瘤组织)或健康组织。这些技术也适用于新鲜细胞或组织样品。
在这些技术中，可活化抗体标记有可检测标记。可检测标记可以是荧光染料(例如，荧光团、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸若丹明(TRITC)、Alexa
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标记)、近红外(NIR)染料(例如，
Figure BDA0002465367670001072
纳米晶体)、胶态金属、半抗原、放射性标记物、生物素以及扩增试剂(如链霉亲和素)或酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。
在已与标记的可活化抗体一起培育的样品中检测到标记表明样品含有靶标，并且含有对可活化抗体的CM具有特异性的蛋白酶。在一些实施例中，可使用广谱蛋白酶抑制剂，如本文所描述的抑制剂，和/或通过使用对蛋白酶具有特异性的试剂，例如对蛋白酶间质蛋白酶具有特异性并且抑制间质蛋白酶的蛋白水解活性的抗体(如A11)，确认蛋白酶的存在；参见例如2010年11月11日公开的国际公开号WO 2010/129609。使用广谱蛋白酶抑制剂，如本文所描述的抑制剂，和/或通过使用选择性更高的抑制剂的相同方法可用于鉴别对可活化抗体的CM具有特异性的蛋白酶。在一些实施例中，可使用对靶标具有特异性的试剂，例如另一抗体确认靶标的存在，或可以将可检测标记与未标记的靶标竞争。在一些实施例中，可使用未标记的可活化抗体，并且通过标记的二级抗体或更复杂的检测系统进行检测。
相似的技术也适用于体内成像，其中在个体，例如哺乳动物，包括人类中检测到荧光信号表明疾病位点含有靶标，并且含有对可活化抗体的CM具有特异性的蛋白酶。
这些技术还适用于试剂盒和/或适用作试剂，所述试剂盒和/或试剂用于基于可活化抗体中的蛋白酶特异性CM，检测、鉴别或表征多种细胞、组织和生物体中的蛋白酶活性。
本公开提供了在多种诊断和/或预防适应症中使用抗体和/或可活化抗体的方法。举例来说，本公开提供了通过以下检测个体或样品中是否存在裂解剂和所关注的靶标的方法：(i)使个体或样品与可活化抗体接触，其中所述可活化抗体包含掩蔽部分(MM)、由裂解剂(例如，蛋白酶)裂解的可裂解部分(CM)以及特异性结合所关注的靶标的抗原结合域或其片段(AB)，其中可活化抗体在未裂解非活化状态下从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB的天然存在的结合搭配物的氨基酸序列，并且不是AB的天然结合搭配物的修饰形式；并且(b)其中，在未裂解非活化状态下，MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且在裂解的活化状态下，MM不干扰或竞争AB与靶标的特异性结合；和(ii)测量所述个体或样品中活化的可活化抗体的水平，其中所述个体或样品中可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或样品中存在裂解剂和靶标，并且其中所述个体或样品中无可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或样品中不存在和/或不充分存在裂解剂、靶标或裂解剂和靶标两者。在一些实施例中，可活化抗体是与治疗剂缀合可活化抗体。在一些实施例中，可活化抗体不与药剂缀合。在一些实施例中，可活化抗体包含可检测标记。在一些实施例中，可检测标记位于AB上。在一些实施例中，使用特异性结合到活化抗体的二级试剂来实现测量个体或样品中的可活化抗体的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施例中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了通过以下检测个体或样品中是否存在裂解剂的方法：(i)在所关注的靶标(例如，靶标)存在下使个体或样品与可活化抗体接触，其中所述可活化抗体包含掩蔽部分(MM)、由裂解剂(例如，蛋白酶)裂解的可裂解部分(CM)以及特异性结合所关注的靶标的抗原结合域或其片段(AB)，其中可活化抗体在未裂解非活化状态下从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB的天然存在的结合搭配物的氨基酸序列，并且不是AB的天然结合搭配物的修饰形式；并且(b)其中，在未裂解非活化状态下，MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且在裂解的活化状态下，MM不干扰或竞争AB与靶标的特异性结合；和(ii)测量所述个体或样品中活化的可活化抗体的水平，其中所述个体或样品中可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或样品中存在裂解剂，并且其中所述个体或样品中无可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或样品中不存在和/或不充分存在裂解剂。在一些实施例中，可活化抗体是与治疗剂缀合可活化抗体。在一些实施例中，可活化抗体不与药剂缀合。在一些实施例中，可活化抗体包含可检测标记。在一些实施例中，可检测标记位于AB上。在一些实施例中，使用特异性结合到活化抗体的二级试剂来实现测量个体或样品中的可活化抗体的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施例中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了用于检测个体或样品中是否存在裂解剂和靶标的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少可活化抗体，所述可活化抗体包含掩蔽部分(MM)、由裂解剂(例如，蛋白酶)裂解的可裂解部分(CM)以及特异性结合所关注的靶标的抗原结合域或其片段(AB)，其中可活化抗体在未裂解非活化状态下从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB的天然存在的结合搭配物的氨基酸序列，并且不是AB的天然结合搭配物的修饰形式；并且(b)其中，在未裂解非活化状态下，MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且在裂解的活化状态下，MM不干扰或竞争AB与靶标的特异性结合；和(ii)测量所述个体或样品中活化的可活化抗体的水平，其中所述个体或样品中可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或样品中存在裂解剂，并且其中所述个体或样品中无可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或样品中不存在和/或不充分存在裂解剂。在一些实施例中，可活化抗体是与治疗剂缀合可活化抗体。在一些实施例中，可活化抗体不与药剂缀合。在一些实施例中，可活化抗体包含可检测标记。在一些实施例中，可检测标记位于AB上。在一些实施例中，使用特异性结合到活化抗体的二级试剂来实现测量个体或样品中的可活化抗体的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施例中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了通过以下检测个体或样品中是否存在裂解剂的方法：(i)使个体或样品与可活化抗体接触，其中所述可活化抗体包含掩蔽部分(MM)、由裂解剂(例如，蛋白酶)裂解的可裂解部分(CM)、特异性结合靶标的抗原结合域(AB)以及可检测标记，其中可活化抗体在未裂解非活化状态下从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB的天然存在的结合搭配物的氨基酸序列，并且不是AB的天然结合搭配物的修饰形式；其中，在未裂解非活化状态下，MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且在裂解的活化状态下，MM不干扰或竞争AB与靶标的特异性结合；并且其中位于可活化抗体的一部分上的可检测标记在裂解CM后释放；和(ii)测量所述个体或样品中可检测标记的水平，其中所述个体或样品中可检测水平的可检测标记表明所述个体或样品中不存在和/或不充分存在裂解剂，并且其中所述个体或样品中无可检测水平的可检测标记表明所述个体或样品中存在裂解剂。在一些实施例中，可活化抗体是与治疗剂缀合可活化抗体。在一些实施例中，可活化抗体不与药剂缀合。在一些实施例中，可活化抗体包含可检测标记。在一些实施例中，可检测标记位于AB上。在一些实施例中，使用特异性结合到活化抗体的二级试剂来实现测量个体或样品中的可活化抗体的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施例中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了用于检测个体或样品中是否存在裂解剂和靶标的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少本文所描述的可活化抗体和/或缀合可活化抗体(例如，与治疗剂缀合的可活化抗体)，用于接触个体或生物样品和用于检测个体或生物样品中活化的可活化抗体和/或缀合可活化抗体的水平的装置，其中所述个体或生物样品中可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或生物样品中存在裂解剂和靶标，并且其中所述个体或生物样品中无可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或生物样品中裂解剂、靶标或裂解剂和靶标两者不存在和/或不充分存在，使得在所述个体或生物样品中无法检测到可活化抗体的靶标结合和/或蛋白酶裂解。
本公开还提供了通过以下检测个体或样品中是否存在裂解剂的方法：(i)在靶标存在下使个体或生物样品与可活化抗体接触，和(ii)测量所述个体或生物样品中活化的可活化抗体的水平，其中所述个体或生物样品中可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或生物样品中存在裂解剂，并且其中所述个体或生物样品中无可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或生物样品中裂解剂不以可检测水平存在和/或不以可检测水平充分存在，使得在个体或生物样品中无法检测到可活化抗体的蛋白酶裂解。此类可活化抗体包括掩蔽部分(MM)、由裂解剂(例如，蛋白酶)裂解的可裂解部分(CM)以及特异性结合靶标的抗原结合域或其片段(AB)，其中呈未裂解(即，未活化)状态的可活化抗体从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB的天然存在的结合搭配物的氨基酸序列；并且(b)其中呈未裂解状态的可活化抗体的MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且其中呈裂解(即，活化)状态的可活化抗体的MM不干扰或竞争AB与靶标的特异性结合。在一些实施例中，可活化抗体是与治疗剂缀合可活化抗体。在一些实施例中，可活化抗体不与药剂缀合。在一些实施例中，可检测标记连接到掩蔽部分。在一些实施例中，可检测标记连接到蛋白酶裂解位点N端的可裂解部分。在一些实施例中，AB的单个抗原结合位点被掩蔽。在其中本公开的抗体具有至少两个抗原结合位点的一些实施例中，至少一个抗原结合位点被掩蔽并且至少一个抗原结合位点未被掩蔽。在一些实施例中，所有抗原结合位点均被掩蔽。在一些实施例中，测量步骤包括使用包含可检测标记的二级试剂。
本公开还提供了用于检测个体或样品中是否存在裂解剂和靶标的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少本文所描述的可活化抗体和/或缀合可活化抗体，用于在靶标存在下使个体或生物样品与可活化抗体接触，和测量个体或生物样品中活化的可活化抗体的水平，其中所述个体或生物样品中可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或生物样品中存在裂解剂，并且其中所述个体或生物样品中无可检测水平的活化的可活化抗体表明所述个体或生物样品中裂解剂不以可检测水平存在和/或不以可检测水平充分存在，使得在所述个体或生物样品中无法检测到可活化抗体的蛋白酶裂解。此类可活化抗体包括掩蔽部分(MM)、由裂解剂(例如，蛋白酶)裂解的可裂解部分(CM)以及特异性结合靶标的抗原结合域或其片段(AB)，其中呈未裂解(即，未活化)状态的可活化抗体从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB的天然存在的结合搭配物的氨基酸序列；并且(b)其中呈未裂解状态的可活化抗体的MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且其中呈裂解(即，活化)状态的可活化抗体的MM不干扰或竞争AB与靶标的特异性结合。在一些实施例中，可活化抗体是与治疗剂缀合可活化抗体。在一些实施例中，可活化抗体不与药剂缀合。在一些实施例中，可检测标记连接到掩蔽部分。在一些实施例中，可检测标记连接到蛋白酶裂解位点N端的可裂解部分。在一些实施例中，AB的单个抗原结合位点被掩蔽。在其中本公开的抗体具有至少两个抗原结合位点的一些实施例中，至少一个抗原结合位点被掩蔽并且至少一个抗原结合位点未被掩蔽。在一些实施例中，所有抗原结合位点均被掩蔽。在一些实施例中，测量步骤包括使用包含可检测标记的二级试剂。
本公开还提供了用于检测个体或样品中是否存在裂解剂的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少本文所描述的可活化抗体和/或缀合可活化抗体，用于接触个体或生物样品和用于检测个体或生物样品中的活化的可活化抗体和/或缀合可活化抗体的水平的装置，其中所述可活化抗体包括位于在裂解CM后释放的可活化抗体的一部分上的可检测标记，其中个体或生物样品中可检测水平的活化的可活化抗体表明在个体或生物样品中裂解剂不存在和/或不充分存在，使得无法在个体或生物样品中检测到可活化抗体的靶标结合和/或蛋白酶裂解，并且其中个体或生物样品中无可检测水平的活化的可活化抗体表明裂解剂以可检测水平存在于个体或生物样品中。
本公开提供了通过以下检测个体或样品中是否存在裂解剂和靶标的方法：(i)使个体或生物样品与可活化抗体接触，其中所述可活化抗体包括位于在CM裂解后释放的可活化抗体的一部分上的可检测标记，和(ii)测量个体或生物样品中活化的可活化抗体的水平，其中个体或生物样品中可检测水平的活化的可活化抗体的表明个体或生物样品中不存在和/或不充分存在裂解剂、靶标或裂解剂和靶标两者，使得在个体或生物样品中无法检测到可活化抗体的靶标结合和/或蛋白酶裂解，并且其中个体或生物样品中降低的可检测水平的活化的可活化抗体表明裂解剂和靶标存在于个体或生物样品中。可检测标记的降低水平是例如降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。此类可活化抗体包括掩蔽部分(MM)、由裂解剂裂解的可裂解部分(CM)以及特异性结合靶标的抗原结合域或其片段(AB)，其中呈未裂解(即，非活化)状态的可活化抗体从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB的天然存在的结合搭配物的氨基酸序列；并且(b)其中呈未裂解状态的可活化抗体的MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且其中呈裂解(即，活化)状态的可活化抗体的MM不干扰或竞争AB与靶标的特异性结合。在一些实施例中，可活化抗体是与治疗剂缀合可活化抗体。在一些实施例中，可活化抗体不与药剂缀合。在一些实施例中，可活化抗体包含可检测标记。在一些实施例中，可检测标记位于AB上。在一些实施例中，使用特异性结合到活化抗体的二级试剂来实现测量个体或样品中的可活化抗体的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施例中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了用于检测个体或样品中是否存在裂解剂和靶标的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少本文所描述的可活化抗体和/或缀合可活化抗体，用于接触个体或生物样品和测量个体或生物样品中活化的可活化抗体的水平，其中个体或生物样品中可检测水平的活化的可活化抗体表明个体或生物样品中不存在和/或不充分存在裂解剂、靶标或裂解剂和靶标两者，使得在个体或生物样品中无法检测到可活化抗体的靶标结合和/或蛋白酶裂解，并且其中个体或生物样品中降低的可检测水平的活化的可活化抗体表明裂解剂和靶标存在于个体或生物样品中。可检测标记的降低水平是例如降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。
本公开还提供了通过以下检测个体或样品中是否存在裂解剂的方法：(i)使个体或生物样品与可活化抗体接触，其中所述可活化抗体包括位于在CM裂解后释放的可活化抗体的一部分上的可检测标记，和(ii)测量个体或生物样品中可检测标记的水平，其中个体或生物样品中可检测水平的可检测标记的表明个体或生物样品中裂解剂不以可检测水平存在和/或不以可检测水平充分存在，使得在个体或生物样品中无法检测到可活化抗体的蛋白酶裂解，并且其中个体或生物样品中降低的可检测水平的可检测标记表明裂解剂存在于个体或生物样品中。可检测标记的降低水平是例如降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。此类可活化抗体包括掩蔽部分(MM)、由裂解剂裂解的可裂解部分(CM)以及特异性结合靶标的抗原结合域或其片段(AB)，其中呈未裂解(即，非活化)状态的可活化抗体从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB的天然存在的结合搭配物的氨基酸序列；并且(b)其中呈未裂解状态的可活化抗体的MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且其中呈裂解(即，活化)状态的可活化抗体的MM不干扰或竞争AB与靶标的特异性结合。在一些实施例中，可活化抗体是与治疗剂缀合可活化抗体。在一些实施例中，可活化抗体不与药剂缀合。在一些实施例中，可活化抗体包含可检测标记。在一些实施例中，可检测标记位于AB上。在一些实施例中，使用特异性结合到活化抗体的二级试剂来实现测量个体或样品中的可活化抗体的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施例中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了用于检测个体或样品中是否存在所关注的裂解剂的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少本文所描述的可活化抗体和/或缀合可活化抗体，用于接触个体或生物样品和用于检测个体或生物样品中活化的可活化抗体和/或缀合可活化抗体的水平的装置，其中所述可活化抗体包括位于在CM裂解后释放的可活化抗体的一部分上的可检测标记，其中个体或生物样品中可检测水平的活化的可检测标记表明个体或生物样品中不存在和/或不充分存在裂解剂、靶标或裂解剂和靶标两者，使得在个体或生物样品中无法检测到可活化抗体的靶标结合和/或蛋白酶裂解，并且其中个体或生物样品中降低的可检测水平的可检测标记表明裂解剂和靶标存在于个体或生物样品中。可检测标记的降低水平是例如降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。
在这些方法和试剂盒的一些实施例中，可活化抗体包括可检测标记。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，可检测标记包括显像剂、造影剂、酶、荧光标记、生色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，显像剂包括放射性同位素。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，放射性同位素是铟或锝。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，造影剂包含碘、钆或氧化铁。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，荧光标记包含黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰的红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED或铕衍生物。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，发光标记包含N-甲基吖啶鎓衍生物。在这些方法的一些实施例中，标记包含Alex
Figure BDA0002465367670001171
标记，如Alex
Figure BDA0002465367670001172
680或Alexa
Figure BDA0002465367670001173
750。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，基于配体的标记包含生物素、亲和素、链霉亲和素或一种或多种半抗原。
在这些方法和试剂盒的一些实施例中，个体是哺乳动物。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，个体是人类。在一些实施例中，个体是非人类哺乳动物，如非人类灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、农场动物、工作动物或动物园动物。在一些实施例中，个体是啮齿动物。
在这些方法的一些实施例中，所述方法是体内方法。在这些方法的一些实施例中，所述方法是原位方法。在这些方法的一些实施例中，所述方法是离体方法。在这些方法的一些实施例中，所述方法是体外方法。
在一些实施例中，原位成像和/或体内成像适用于鉴别治疗哪些患者的方法。举例来说，在原位成像中，可活化抗体用于筛选患者样品，以鉴别在适当位置，例如在肿瘤位点处具有适当(多种)蛋白酶和(多种)靶标的那些患者。
在一些实施例中，原位成像用于鉴别或以其它方式精简适于用本公开的可活化抗体治疗的患者群体。举例来说，将对靶标(例如，靶标)和裂解所测试的可活化抗体(例如，在疾病位点积聚的活化抗体)的可裂解部分(CM)中的底物的蛋白酶均测试为阳性的患者鉴别为适合用包含此类CM的此类可活化抗体治疗的候选者。同样，可将对靶标(例如，靶标)和裂解使用这些方法测试的可活化抗体中的CM中底物的蛋白酶中的任一者或两者测试为阴性的患者鉴别为另一疗法形式的合适候选者。在一些实施例中，就第一可活化抗体来说测试为阴性的此类患者可用包含不同CM的其它可活化抗体测试，直到鉴别出适用于治疗的可活化抗体(例如，包含在疾病位点由患者裂解的CM的可活化抗体)。在一些实施例中，然后向患者施用治疗有效量的可活化抗体，患者对所述抗体测试为阳性。
在一些实施例中，体内成像用于鉴别或以其它方式精简适合用本公开的可活化抗体治疗的患者群体。举例来说，将对靶标(例如，靶标)和裂解所测试的可活化抗体(例如，在疾病位点积聚的活化抗体)的可裂解部分(CM)中的底物的蛋白酶均测试为阳性的患者鉴别为适合用包含此类CM的此类可活化抗体治疗的候选者。同样，可将测试为阴性的患者鉴别为另一疗法形式的合适候选者。在一些实施例中，就第一可活化抗体来说测试为阴性的此类患者可用包含不同CM的其它可活化抗体测试，直到鉴别出适用于治疗的可活化抗体(例如，包含在疾病位点由患者裂解的CM的可活化抗体)。在一些实施例中，然后向患者施用治疗有效量的可活化抗体，患者对所述抗体测试为阳性。
在方法和试剂盒的一些实施例中，所述方法或试剂盒用于鉴别或以其它方式精简适合用本公开的可活化抗体治疗的患者群体。举例来说，将对靶标(例如，靶标)和裂解这些方法中测试的可活化抗体的可裂解部分(CM)中的底物的蛋白酶均测试为阳性的患者鉴别为适合用包含此类CM的此类可活化抗体治疗的候选者。同样，可将对靶标(例如，靶标)和裂解使用这些方法测试的可活化抗体中的CM中底物的蛋白酶均测试为阴性的患者鉴别为另一疗法形式的合适候选者。在一些实施例中，可用其它可活化抗体测试此类患者，直到鉴别出适用于治疗的可活化抗体(例如，包含在疾病位点由患者裂解的CM的可活化抗体)。在一些实施例中，将对任一靶标(例如，靶标)测试为阴性的患者鉴别为适合用包含此类CM的此类可活化抗体治疗的候选者。在一些实施例中，将对任一靶标(例如，靶标)测试为阴性的患者鉴别为不适合用包含此类CM的此类可活化抗体治疗的候选者。在一些实施例中，可用其它可活化抗体测试此类患者，直到鉴别出适用于治疗的可活化抗体(例如，包含在疾病位点由患者裂解的CM的可活化抗体)。在一些实施例中，可活化抗体是与治疗剂缀合可活化抗体。在一些实施例中，可活化抗体不与药剂缀合。在一些实施例中，可活化抗体包含可检测标记。在一些实施例中，可检测标记位于AB上。在一些实施例中，使用特异性结合到活化抗体的二级试剂来实现测量个体或样品中的可活化抗体的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施例中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
在一些实施例中，使用方法或试剂盒来鉴别或以其它方式精简适于用本公开的抗靶标可活化抗体和/或缀合可活化抗体(例如，与治疗剂缀合可活化抗体)治疗的患者群体，接着通过向有需要的个体施用可活化抗体和/或缀合可活化抗体进行治疗。举例来说，将对靶标(例如，靶标)和裂解这些方法中测试的可活化抗体和/或缀合可活化抗体的可裂解部分(CM)中的底物的蛋白酶均测试为阳性的患者鉴别为适合用包含此类CM的此类抗体和/或此类缀合可活化抗体治疗的候选者，并且然后患者施用治疗有效量的所测试的可活化抗体和/或缀合可活化抗体。同样，可将对靶标(例如，靶标)和裂解使用这些方法测试的可活化抗体中的CM中底物的蛋白酶中的任一者或两者测试为阴性的患者鉴别为另一疗法形式的合适候选者。在一些实施例中，可用其它抗体和/或缀合可活化抗体测试此类患者，直到鉴别出适用于治疗的抗体和/或缀合可活化抗体(例如，包含在疾病位点由患者裂解的CM的可活化抗体/或缀合可活化抗体)。在一些实施例中，然后患者施用治疗有效量的可活化抗体和/或缀合可活化抗体，患者对所述抗体测试为阳性。
在这些方法和试剂盒的一些实施例中，MM是具有约4到40个氨基酸的长度的肽。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，可活化抗体包含接头肽，其中接头肽位于MM与CM之间。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，可活化抗体包含接头肽，其中接头肽位于AB与CM之间。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，可活化抗体包含第一接头肽(LP1)和第二接头肽(LP2)，其中第一接头肽位于MM与CM之间，并且第二接头肽位于AB与CM之间。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，LP1和LP2各自是长度约1到20个氨基酸的肽，并且其中LP1和LP2各自不必是相同的接头。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，LP1和LP2中的一个或两个包含甘氨酸-丝氨酸聚合物。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，LP1和LP2中的至少一个包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：24)和(GGGS)n(SEQ IDNO：25)，其中n是至少一的整数。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，LP1和LP2中的至少一个包含具有式(GGS)n的氨基酸序列，其中n是至少一的整数。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，LP1和LP2中的至少一个包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：26)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：27)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQID NO：28)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：29)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：30)以及Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO：31)。
在这些方法和试剂盒的一些实施例中，AB包含选白本文提出的交叉反应性抗体序列的抗体或抗体片段序列。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，AB包含Fab片段、scFv或单链抗体(scAb)。
在这些方法和试剂盒的一些实施例中，裂解剂是与靶标共定位于个体或样品中的蛋白酶，并且CM是充当蛋白酶的底物的多肽，其中当可活化抗体暴露于蛋白酶时，蛋白酶裂解可活化抗体中的CM。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，CM是长度为至多15个氨基酸的多肽。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，CM与AB的N端偶联。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，CM与AB的C端偶联。在这些方法和试剂盒的一些实施例中，CM与AB的VL链的N端偶联。
由于通常观察到的翻译后修饰，因此本发明的抗体多肽链的N端和C端可以与本文所描述的序列不同。举例来说，抗体重链通常缺少C端赖氨酸残基。Dick等人(2008)《生物技术和生物工程》100：1132。N端谷氨酰胺残基，和在更轻微程度上，谷氨酸残基，经常在治疗性抗体的轻链和重链两者上转化为焦谷氨酸残基。Dick等人(2007)《生物技术和生物工程》97：544；Liu等人(2011)JBC28611211；Liu等人(2011)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》286：11211。因此，式(I)和/或式(II)的缀合可活化抗体可具有抗体(AB)，其中重链恒定区的C端残基在末端缺少一个或多个氨基酸，缺少C端赖氨酸，由于翻译后加工而去除了C端赖氨酸，或C端赖氨酸是除赖氨酸外的氨基酸。如果重链恒定区的C端残基是除赖氨酸外的氨基酸，则在一个实施例中，其为一般不适合于形成二硫键或以其它方式不适合于与细胞毒性剂缀合的氨基酸。
在某些实施例中，式(I)和/或式(II)的缀合可活化抗体可具有抗体(AB)，其中重链和/或轻链上的N端谷氨酸任选地是焦谷氨酸或翻译后修饰为焦谷氨酸。
在某些实施例中，式(I)和/或式(II)的缀合可活化抗体的重链恒定区在C端包含赖氨酸或另一氨基酸，例如，其包含以下最后氨基酸：对于重链，PGK。在某些实施例中，重链恒定区在C端缺少一个或多个氨基酸，并且具有例如C端序列PG或P。
在某些实施例中，式(I)和/或式(II)的缀合可活化抗体的重链和/或轻链可变区在N端包含谷氨酸或焦谷氨酸氨基酸，例如，其包含以下最后氨基酸：对于轻链，pQGQ；和/或对于重链，pQVQ，其中“pQ”代表焦谷氨酸。
本公开的抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体用于诊断和预防配制物。在一个实施例中，将可活化抗体施用于具有罹患前述炎症、炎性病症、癌症或其它病症中的一种或多种的风险的患者。
可使用基因型、血清学或生化标记物确定患者或器官对前述病症中的一种或多种的易感性。
在本公开的一些实施例中，将抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体施用于诊断患有与前述病症中的一种或多种相关的临床适应症的人类个体。在诊断后，施用抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体以减轻或逆转临床适应症的影响。
本公开的抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体也适用于检测患者样品中的靶标，并且因此适用作诊断剂。举例来说，本公开的抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体用于体外分析，例如ELISA，以检测患者样品中的靶标水平。
在一个实施例中，将本公开的抗体和/或可活化抗体固定于固体支持物(例如，微量滴定板的(多个)孔)上。固定的抗体和/或可活化抗体充当可存在于测试样品中的任何靶标的捕获抗体。在使固定的抗体和/或可活化抗体与患者样品接触之前，冲洗固体支持物并且用封闭剂(如乳蛋白或白蛋白)处理以防止分析物的非特异性吸附。
随后，用怀疑含有抗原的测试样品或含有标准量抗原的溶液处理孔。此类样品是例如来自怀疑具有视为诊断病理的循环抗原水平的个体的血清样品。冲洗掉测试样品或标准物后，用可检测标记的第二抗体处理固体支持物。标记的第二抗体充当检测抗体。测量可检测标记的水平，并且通过与由标准样品建立的标准曲线进行比较来确定测试样品中靶抗原的浓度。
应了解，基于使用本公开的抗体和/或可活化抗体获得的结果，在体外诊断分析中有可能基于靶抗原的表达水平对个体的疾病进行分期。对于给定疾病，从诊断为处于疾病进展的各个阶段和/或处于疾病的治疗性处理中的各个点的个体取得血液样品。使用为进展或疗法的每个阶段提供统计显著结果的样品群，指定可视为每个阶段所特有的抗原浓度范围。
抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体还可用于诊断和/或成像方法。在一些实施例中，此类方法是体外方法。在一些实施例中，此类方法是体内方法。在一些实施例中，此类方法是原位方法。在一些实施例中，此类方法是离体方法。举例来说，具有酶可裂解的CM的可活化抗体可用于检测是否存在能够裂解CM的酶。此类可活化抗体可用于诊断，其可包括通过在给定宿主生物体的给定细胞或组织中测量活化抗体(即，由可活化抗体裂解产生的抗体)的积累体内检测(例如，定性或定量)酶活性(或在一些实施例中，具有提高的还原势的环境，如可提供二硫键还原的环境)。活化抗体的此类积累不仅表明组织表达酶活性(或取决于CM的性质的提高的还原势)，而且表明组织表达活化抗体结合到的靶标。
举例来说，可选择CM作为蛋白酶的蛋白酶底物，所述蛋白酶见于肿瘤位点、病毒或细菌感染的位点、生物学上受限的位点(例如在脓肿中、在器官中等等)等等。AB可以是结合靶抗原的一种AB。使用所属领域的技术人员熟悉的方法，可将可检测标记(例如，荧光标记或放射性标记或放射性示踪剂)缀合到可活化抗体的AB或其它区。在以上筛选方法的情形下论述了合适的可检测标记，并且在以下提供了额外的具体实例。使用对疾病状态的蛋白质或肽具有特异性的AB以及在所关注的疾病组织中活性升高的蛋白酶，相对于CM特异性酶不以可检测水平存在或以低于疾病组织中的水平存在或无活性(例如，呈酶原形式或与抑制剂复合)的组织，可活化抗体将展现提高的与疾病组织的结合率。由于肾脏过滤系统迅速从血液中清除小蛋白质和多肽，并且由于对CM具有特异性的酶不以可检测水平存在(或在非疾病组织中以较低的水平存在或以无活性构形存在)，因此相对于非疾病组织，活化抗体在疾病组织中的积累得到增强。
在另一实例中，可活化抗体可用于检测样品中是否存在裂解剂。举例来说，在可活化抗体含有对由酶裂解敏感的CM时，可活化抗体可用于检测(定性或定量)样品中酶的存在。在另一实例中，在可活化抗体含有对由还原剂裂解敏感的CM时，可活化抗体可用于检测(定性或定量)样品中还原条件的存在。为了促进这些方法中的分析，可活化抗体可以被可检测标记，并且可以与支持物(例如，固体支持物，如载玻片或珠粒)结合。可检测标记可以位于裂解后不释放的可活化抗体的一部分上，例如，可检测标记可以是淬灭的荧光标记或直到发生裂解才不可检测的其它标记。举例来说，可通过例如使固定的可检测标记的可活化抗体与怀疑含有酶和/或还原剂的样品接触，持续足以发生裂解的时间，然后洗涤以去除过量的样品和污染物来进行分析。然后通过与样品接触之前可活化抗体的可检测信号的变化，例如由于样品中的裂解剂对可活化抗体的裂解，可检测信号的存在和/或增加，评定样品中是否存在裂解剂(例如，酶或还原剂)。
此类检测方法可调适成还提供能够结合裂解时的可活化抗体的AB的靶标是否存在的检测。因此，分析可调适成评定裂解剂是否存在以及所关注的靶标是否存在。可通过如上文所描述的可活化抗体的可检测标记的存在和/或增加来检测裂解剂是否存在，并且可通过检测靶标-AB复合物，例如通过使用可检测标记的抗靶标抗体来检测靶标是否存在。
可活化抗体也适用于原位成像，以便验证可活化抗体活化，例如通过蛋白酶裂解，以及与特定靶标的结合。原位成像是使得能够在生物样品(如细胞培养物或组织切片)中定位蛋白水解活性和靶标的技术。使用这种技术，有可能基于可检测标记(例如，荧光标记)的存在来确认与给定靶标的结合和蛋白水解活性两者。
这些技术适用于来源于疾病位点的任何冷冻细胞或组织(例如肿瘤组织)或健康组织。这些技术也适用于新鲜细胞或组织样品。
在这些技术中，可活化抗体标记有可检测标记。可检测标记可以是荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸若丹明(TRITC)、Alexa
Figure BDA0002465367670001241
标记)、近红外(NIR)染料(例如，
Figure BDA0002465367670001242
纳米晶体)、胶态金属、半抗原、放射性标记物、生物素以及扩增试剂(如链霉亲和素)或酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。
在已与标记的可活化抗体一起培育的样品中检测到标记表明样品含有靶标，并且含有对可活化抗体的CM具有特异性的蛋白酶。在一些实施例中，可使用广谱蛋白酶抑制剂，如本文所描述的抑制剂，和/或通过使用对蛋白酶具有特异性的试剂，例如对蛋白酶间质蛋白酶具有特异性并且抑制间质蛋白酶的蛋白水解活性的抗体(如A11)，确认蛋白酶的存在；参见例如2010年11月11日公开的国际公开号WO 2010/129609。使用广谱蛋白酶抑制剂，如本文所描述的抑制剂，和/或通过使用选择性更高的抑制剂的相同方法可用于鉴别对可活化抗体的CM具有特异性的蛋白酶或一类蛋白酶。在一些实施例中，可使用对靶标具有特异性的试剂，例如另一抗体确认靶标的存在，或可以将可检测标记与未标记的靶标竞争。在一些实施例中，可使用未标记的可活化抗体，并且通过标记的二级抗体或更复杂的检测系统进行检测。
相似的技术也适用于体内成像，其中在个体，例如哺乳动物，包括人类中检测到荧光信号表明疾病位点含有靶标，并且含有对可活化抗体的CM具有特异性的蛋白酶。
这些技术还适用于试剂盒和/或适用作试剂，所述试剂盒和/或试剂用于基于可活化抗体中的蛋白酶特异性CM，检测、鉴别或表征多种细胞、组织和生物体中的蛋白酶活性。
在一些实施例中，原位成像和/或体内成像适用于鉴别治疗哪些患者的方法。举例来说，在原位成像中，可活化抗体用于筛选患者样品，以鉴别在适当位置，例如在肿瘤位点处具有适当(多种)蛋白酶和(多种)靶标的那些患者。
在一些实施例中，原位成像用于鉴别或以其它方式精简适于用本公开的可活化抗体治疗的患者群体。举例来说，将对靶标和裂解所测试的可活化抗体(例如，在疾病位点积聚的活化抗体)的可裂解部分(CM)中的底物的蛋白酶均测试为阳性的患者鉴别为适合用包含此类CM的此类可活化抗体治疗的候选者。同样，将对靶标和裂解使用这些方法测试的可活化抗体中的CM中底物的蛋白酶中的任一者或两者测试为阴性的患者鉴别为另一疗法形式的合适候选者(即，不适合用所测试的可活化抗体治疗)。在一些实施例中，就第一可活化抗体来说测试为阴性的此类患者可用包含不同CM的其它可活化抗体测试，直到鉴别出适用于治疗的可活化抗体(例如，包含在疾病位点由患者裂解的CM的可活化抗体)。
在一些实施例中，体内成像用于鉴别或以其它方式精简适合用本公开的可活化抗体治疗的患者群体。举例来说，将对靶标和裂解所测试的可活化抗体(例如，在疾病位点积聚的活化抗体)的可裂解部分(CM)中的底物的蛋白酶均测试为阳性的患者鉴别为适合用包含此类CM的此类可活化抗体治疗的候选者。同样，将测试为阴性的患者被鉴别为另一疗法形式的合适候选者(即，不适合用所测试的可活化抗体治疗)。在一些实施例中，就第一可活化抗体来说测试为阴性的此类患者可用包含不同CM的其它可活化抗体测试，直到鉴别出适用于治疗的可活化抗体(例如，包含在疾病位点由患者裂解的CM的可活化抗体)。
医药组合物
可将本公开的抗体、缀合抗体、可活化抗体和/或缀合可活化抗体(在本文中也称为“活性化合物”)和其衍生物、片段、类似物以及同源物并入到适于施用的医药组合物中。
尤其有利的是调配便于施用和剂量均匀性的单位剂型经口或肠胃外组合物。如本文所用，单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗个体的物理离散单元；每个单位含有经计算以与所需药学上可接受的载剂结合产生期望治疗效果的预定量的活性化合物。本公开的单位剂型的规格取决于且直接依赖于活性化合物的独特特征和欲实现的特定治疗效果，以及所属领域中混配用于治疗个体的此类活性化合物固有的局限性。
医药组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
本发明将在以下列举的实施例和实例中进一步描述，所述实施例和实例不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。
列举的实施例
可通过参考以下列举的说明性实施例来限定本发明。
集合I
I-1.一种缀合可活化抗体，其包含：
(a)在未裂解状态下从N端到C端包含如下结构排列的可活化抗体(AA)：MM-CM-AB，其中：
(i)AB是抗体，其特异性结合到哺乳动物CD71并且包含SEQ ID NO：5的重链可变区序列和SEQ ID NO：7的轻链可变区序列；
(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，与AB偶联的MM抑制AB与CD71的结合；
(iii)CM是与AB偶联的包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；和
(b)单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，其中可活化抗体与两个当量的MMAE偶联。
I-2.一种组合物，其包含：具有以下式的缀合可活化抗体
AA-(AG)p，其中
(a)AA是在未裂解状态下从N端到C端包含如下结构排列的可活化抗体：MM-CM-AB，其中：
(i)AB是抗体，其特异性结合到哺乳动物CD71并且包含SEQ ID NO：5的重链可变区序列和SEQ ID NO：7的轻链可变区序列，
(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，与AB偶联的MM抑制AB与CD71的结合，并且
(iii)CM是与AB偶联的包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(b)AG是与AA缀合的药剂，其中所述药剂是MMAE并且其中p是2。
I-3.一种制造缀合可活化抗体的方法，其包含：将至少一个MMAE缀合到可活化抗体(AA)，从而产生包含AA-(MMAE)p的组合物，其中p是1到8；和针对其中p为2的缀合可活化抗体物种富集组合物，其中AA在未裂解状态下从N端到C端包含如下结构排列：MM-CM-AB，其中：
(i)AB是抗体，其特异性结合到哺乳动物CD71并且包含SEQ ID NO：5的重链可变区序列和SEQ ID NO：7的轻链可变区序列，
(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，与AB偶联的MM抑制AB与CD71的结合，并且
(iii)CM是与AB偶联的包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽。
I-4.如实施例I-1的缀合可活化抗体或如实施例I-2的组合物或如实施例I-3的方法，其中AB包含SEQ ID NO：20的重链序列。
I-5.如实施例I-1的缀合可活化抗体或如实施例I-2的组合物或如实施例I-3的方法，其中AB包含SEQ ID NO：167的重链序列。
I-6.如实施例I-1、I-4和I-5中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2、I-4和I-5中任一项的组合物或如实施例I-3到I-5中任一项的方法，其中AB包含SEQ ID NO：19的轻链序列。
I-7.如实施例I-1和I-4到I-6中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-6中任一项的组合物或如实施例I-3到6中任一项的方法，其中AA包含AB与MM之间的键联肽LP1。
I-8.如实施例I-7的缀合可活化抗体或组合物或方法，其中LP1包含氨基酸GGGSSGGS(SEQ ID NO：207)的氨基酸序列。
I-9.如实施例I-1和4到8中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-8中任一项的组合物或如实施例I-3到I-8中任一项的方法，其中AA包含AB与CM之间的键联肽LP2。
I-10.如实施例I-9的缀合可活化抗体或组合物或方法，其中LP2包含GGGS(SEQ IDNO：38)的氨基酸序列。
I-11.如实施例I-1和I-4到I-10中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-10中任一项的组合物或如实施例I-3到I-10中任一项的方法，其中AA包含第一键联肽(LP1)和第二键联肽(LP2)，并且其中呈未裂解状态的AA从N端到C端具有如下结构排列：MM-LP1-CM-LP2-AB。
I-12.如实施例I-1和I-4到I-11中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-11中任一项的组合物或如实施例I-3到I-11中任一项的方法，其中所述可活化抗体包含轻链，所述轻链包含选自由SEQ ID NO：138和143-145以及GQG组成的组的间隔序列。
I-13.如实施例I-12的缀合可活化抗体或组合物或方法，其中所述间隔序列在MM的N端。
I-14.如实施例I-1和I-4到I-13中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-13中任一项的组合物或如实施例I-3到I-13中任一项的方法，其中可活化抗体包含SEQID NO：201的轻链可变区序列。
I-15.如实施例I-1和I-4到I-13中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-13中任一项的组合物或如实施例I-3到I-13中任一项的方法，其中可活化抗体包含SEQID NO：202的轻链可变区序列。
I-16.如实施例I-1和I-4到I-13中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-13中任一项的组合物或如实施例I-3到I-13中任一项的方法，其中可活化抗体包含SEQID NO：169的轻链序列。
I-17.如实施例I-1和I-4到I-13中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-13中任一项的组合物或如实施例I-3到I-13中任一项的方法，其中可活化抗体包含SEQID NO：170的轻链序列。
I-18.如实施例I-1和I-4到I-17中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-17中任一项的组合物或如实施例I-3到I-17中任一项的方法，其中AB特异性结合人类CD71和食蟹猕猴CD71。
I-19.如实施例I-1和I-4到I-18中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和4到I-18中任一项的组合物或如实施例I-3到I-18中任一项的方法，其中MM与AB结合的解离常数大于AB与CD71的解离常数。
I-20.如实施例I-1和I-4到I-19中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-19中任一项的组合物或如实施例I-3到I-19中任一项的方法，其中当可活化抗体呈裂解状态时，MM不干扰AB与CD71的结合或与AB竞争所述结合。
I-21.如实施例I-1和I-4到I-20中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-20中任一项的组合物或如实施例I-3到I-20中任一项的方法，其中MM是长度不超过40个氨基酸的多肽。
I-22.如实施例I-1和I-4到I-21中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-21中任一项的组合物或如实施例I-3到I-21中任一项的方法，其中CM是在患病组织中有活性的蛋白酶的底物。
I-23.如实施例I-1和I-4到I-22中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-22中任一项的组合物或如实施例I-3到I-22中任一项的方法，其中所述药剂通过接头与AB缀合。
I-24.如实施例I-1和I-4到I-23中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-23中任一项的组合物或如实施例I-3到I-23中任一项的方法，其中药剂与AB缀合所利用的接头包含缬氨酸-瓜氨酸部分。
I-25.如实施例I-1和I-4到I-24中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-24中任一项的组合物或如实施例I-3到I-24中任一项的方法，其中药剂与AB缀合所利用的接头包含马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸部分。
I-26.如实施例I-1和I-4到I-25中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-25中任一项的组合物或如实施例I-3到I-25中任一项的方法，其中药剂与AB缀合所利用的接头包含马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸对氨基苄氧基羰基部分。
I-27.如实施例I-2和I-4到I-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的缀合可活化抗体的至少50％是p为2时的物种。
I-28.如实施例I-2和I-4到I-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的缀合可活化抗体的至少75％是p为2时的物种。
I-29.如实施例I-2和I-4到I-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的缀合可活化抗体的至少90％是p为2时的物种。
I-30.如实施例I-2和I-4到1-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的缀合可活化抗体的至少95％是p为2时的物种。
I-31.如实施例I-2和I-4到I-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的缀合可活化抗体的至少98％是p为2时的物种。
I-32.如实施例I-2和I-4到I-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的p为1或3到8缀合可活化抗体物种中的每一种的当量小于所述组合物的p为2的缀合可活化抗体物种的当量。
I-33.如实施例I-2和I-4到I-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的p为1或3到8缀合可活化抗体物种小于所述组合物的p为2的缀合可活化抗体物种的当量。
I-34.如实施例I-2和I-4到I-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的缀合可活化抗体的物种的少于50％是p为1或3到8时的物种。
I-35.如实施例I-2和I-4到I-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的缀合可活化抗体的物种的少于25％是p为1或3到8时的物种。
I-36.如实施例I-2和I-4到I-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的缀合可活化抗体的物种的少于10％是p为1或3到8时的物种。
I-37.如实施例I-2和I-4到I-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的缀合可活化抗体的物种的少于5％是p为1或3到8时的物种。
I-38.如实施例I-2和I-4到I-26中任一项的组合物或如实施例I-3到I-26中任一项的方法，其中所述组合物的缀合可活化抗体的物种的少于2％是p为1或3到8时的物种。
I-39.一种医药组合物，其包含：
如实施例I-1和I-4到I-26中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-38中任一项的组合物；和一种载剂。
I-40.一种治疗个体的癌症、减轻个体的癌症症状或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的如实施例I-1和I-4到I-26中任一项的缀合可活化抗体或如实施例I-2和I-4到I-38中任一项的组合物或如实施例1-39的医药组合物。
I-41.如实施例I-40的方法，其中所述癌症是胃癌。
I-42.如实施例I-40的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
I-43.如实施例I-40的方法，其中所述癌症是食道癌。
I-44.如实施例I-40的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
I-45.如实施例I-40的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
I-46.如实施例I-40的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌。
I-47.如实施例I-40的方法，其中所述癌症是黑素瘤。
I-48.如实施例I-40的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
I-49.如实施例I-40的方法，其中所述癌症是间皮瘤。
集合II
II-1.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(I)的结构或其盐：
Figure BDA0002465367670001331
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含
i.重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：10的CDRH2序列以及包含SEQ ID NO：11的CDRH3序列；和
ii轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：14的CDRL2序列以及包含SEQ ID NO：15的CDRL3序列；
(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；
(iii)LP1是包含SEQ ID NO：207的氨基酸序列的第一键联部分；
(iv)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(v)LP2是包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的第二键联部分；并且
(b)其中“n”是2。
II-2.如实施例II-1的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
II-3.如实施例II-1或II-2的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
II-4.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(I)的结构或其盐：
Figure BDA0002465367670001341
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：5的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：7的序列的轻链可变区；
(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；
(iii)LP1是包含SEQ ID NO：207的氨基酸序列的第一键联部分；
(iv)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(v)LP2是包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的第二键联部分；并且
(b)其中“n”是2。
II-5.如实施例II-4的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
II-6.如实施例II-4或II-5的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
II-7.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(I)的结构或其盐：
Figure BDA0002465367670001351
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：19的序列的轻链；
(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；
(iii)LP1是包含SEQ ID NO：207的氨基酸序列的第一键联部分；
(iv)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(v)LP2是包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的第二键联部分；并且
(b)其中“n”是2。
II-8.如实施例II-7的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
II-9.如实施例II-7或II-8的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
II-10.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(I)的结构或其盐：
Figure BDA0002465367670001361
其中MM-LP1-CM-LP2-AB是可活化抗体，其中所述AB是特异性结合到人类CD71的抗体，
其中可活化抗体包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：170的序列的轻链，并且
其中“n”是2。
II-11.如实施例II-10所述的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
II-12.如实施例II-10或II-11所述的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
II-13.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(II)的结构或其盐：
Figure BDA0002465367670001362
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含
i.重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：10的CDRH2序列以及包含SEQ ID NO：11的CDRH3序列；和
ii轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：14的CDRL2序列以及包含SEQ ID NO：15的CDRL3序列；
(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；并且
(iii)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(b)其中“n”是2。
II-14.如实施例II-13所述的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
II-15.如实施例II-13或II-14所述的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
II-16.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(II)的结构或其盐：
Figure BDA0002465367670001371
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：5的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：7的序列的轻链可变区；
(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；并且
(iii)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(b)其中“n”是2。
II-17.如实施例II-16的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
II-18.如实施例II-16或II-17的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
II-19.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(II)的结构或其盐：
Figure BDA0002465367670001381
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：19的序列的轻链；
(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；并且
(iii)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(b)其中“n”是2。
II-20.如实施例II-19的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
II-21.如实施例II-19或II-20的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
II-22.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(II)的结构或其盐：
Figure BDA0002465367670001391
其中MM-CM-AB是可活化抗体，其中AB是特异性结合到人类CD71的抗体，
其中可活化抗体包含有包含SEQ ID NO：167的序列的重链和包含SEQ ID NO：169的序列的轻链，并且
其中“n”是2。
II-23.如实施例II-22的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
II-24.如实施例II-22或II-23的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
II-25.一种制造包含式(I)的结构或其盐的缀合可活化抗体的方法：
Figure BDA0002465367670001392
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含
i.重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：10的CDRH2序列以及包含SEQ ID NO：11的CDRH3序列；和
ii轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：14的CDRL2序列以及包含SEQ ID NO：15的CDRL3序列；
(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；
(iii)LP1是包含SEQ ID NO：207的氨基酸序列的第一键联部分；
(iv)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(v)LP2是包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的第二键联部分；
并且其中“n”是2；
(b)所述方法包含
(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和
(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。
II-26.一种制造包含式(II)的结构或其盐的缀合可活化抗体的方法：
Figure BDA0002465367670001401
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含
i.重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：10的CDRH2序列以及包含SEQ ID NO：11的CDRH3序列；和
ii.轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：14的CDRL2序列以及包含SEQ ID NO：15的CDRL3序列；
(ii)MM是包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当缀合可活化抗体呈未裂解状态时，MM抑制AB与人类CD71的结合；
(ii)CM是包含SEQ ID NO：156的序列的可裂解部分，其中CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
并且其中“n”是2；
(b)所述方法包含
(i)用还原剂还原包含MM-CM-AB的可活化抗体；和
(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。
II-27.一种医药组合物，其包含：如实施例II-1到II-24中任一项的缀合可活化抗体；和任选地药学上可接受的载剂。
II-28.一种治疗个体的癌症、减轻个体的癌症症状或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包含针对癌症向有需要的个体施用治疗有效量的如实施例II-1到II-24中任一项的缀合可活化抗体或如实施例II-27的医药组合物，所述癌症选自由以下组成的组：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、ER+乳腺癌、三阴性乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部小细胞癌、胰腺癌、间皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肝细胞癌以及成胶质细胞瘤。
II-29.如实施例II-1到II-24中任一项的缀合可活化抗体或如实施例II-27的医药组合物，其用作药剂。
II-30.如实施例II-1到II-24中任一项的缀合可活化抗体或如实施例II-27的医药组合物，其用于治疗癌症，任选地其中所述癌症选自由以下组成的组：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、ER+乳腺癌、三阴性乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部小细胞癌、胰腺癌、间皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肝细胞癌以及成胶质细胞瘤。
实例
实例1.抗CD71缀合可活化抗体(AADC)
本文提供的研究被设计成制备本公开的抗CD71缀合可活化抗体中的一些。
如以全文引用的方式并入本文中的美国专利申请第US 2016/0355599 A1号中所描述，根据所属领域中已知的技术，使用小鼠杂交瘤技术获得抗CD71 M21单克隆抗体。用人类CD71细胞外域(ECD)免疫小鼠，并且使用细胞毒性驮载(piggyback)分析筛选随后的杂交瘤，并且通过ELISA确认来自这一分析的细胞毒性阳性克隆结合人类CD71 ECD多肽，并且通过FACS确认结合细胞表面。抗CD71 M21单克隆抗体包括SEQ ID NO：1的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：2的轻链可变区(VL)。
还测试了基于抗CD71小鼠单克隆抗体M21的以下人源化抗CD71抗体：Ab21.10LcB：HcA(SEQ ID NO：3的VH和SEQ ID NO：7的VL)、Ab21.11LcB：HcB(SEQ ID NO：4的VH和SEQ IDNO：7的VL)、Ab21.12LcB：HcC(SEQ ID NO：5的VH和SEQ ID NO：7的VL)以及M21(SEQ ID NO：1的VH和SEQ ID NO：2的VL)。通过FACS确认本公开的各种抗CD71抗体结合细胞表面CD71的能力。
所有人源化抗CD71抗体均显示与由CD71 M21小鼠抗体所展现的结合相当的与人类和食蟹猕猴CD71的结合。在BxPC3细胞系上通过FACS确认人源化抗CD71抗体的结合。简单来说，BxPC3细胞用指定浓度的小鼠单克隆Mab21或huCD71(Ab21.10、Ab21.11和Ab21.12)抗体标记，并且随后分别用Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠或抗人类IgG Alexa Fluor647检测。
在示例性研究中，测量抗CD71 Ab21.12LcB：HcC(SEQ ID NO：5的VH和SEQ ID NO：7的VL)与来自人类、食蟹猕猴、小鼠以及大鼠来源的重组CD71(使用ELISA)和表达CD71的细胞(使用流式细胞术)。如表1的示例性结果所示，抗CD71抗体以如由ELISA测量的等效亲和力结合人类和猴重组CD71，并且所述亲和力等效于人类全转铁蛋白对人类CD71的亲和力。如通过流式细胞术测量，抗体以等效亲和力结合表达人类和猴CD71的细胞系(分别为人类BxPC3胰腺癌细胞和食蟹猕猴原代肾上皮细胞)。没有测量到抗CD71抗体与重组小鼠CD71或表达大鼠CD71的细胞系(比率H-4-11-E肝细胞癌细胞)的显著结合。
表1：通过ELISA和流式细胞术测得的抗CD71与人类、猴、大鼠以及小鼠CD71的结合，以及通过ELISA测得的全转铁蛋白与人类CD71的结合
Figure BDA0002465367670001431
实施例2.掩蔽物发现
本文提供的研究被设计成鉴别并且表征用于本公开的可活化抗CD71抗体的掩蔽部分。
如美国专利申请第US 2016/0355599A1号中所描述，使用类似于2010年7月15日发布的PCT国际公开号WO 2010/081173中所描述的方法，将包含SEQ ID NO：5的VH和SEQ IDNO：7的VL的抗CD71 21.12抗体用于筛选具有6×1010的总多样性的随机X15肽库，其中X是任何氨基酸。筛选由一轮MACS和五轮FACS分选组成。使用蛋白A戴诺珠粒(Dynabead)(英杰(Invitrogen))和浓度为200nM的抗CD71 21.12抗体进行初始MACS分选。对于MACS，针对结合筛选大致1×1012个细胞并且收集1×107个细胞。将抗CD71 21.12与DyLight-488(赛默飞世尔(ThermoFisher))缀合，确认CD71结合活性，并且将抗CD71 21.12-488用作所有FACS轮的荧光探针。对细菌细胞进行染色并且如下收集阳性克隆：在FACS第1轮中，20nM抗CD7121.12-488，收集1×106个细胞；在FACS第2轮中，5nM抗CD71 21.12-488，收集6.2×104个细胞；并且在第3轮FACS中，5nM抗CD71 21.12-488，收集5×103个细胞，和1nM抗CD71 21.12-488，收集5×102个细胞；在第4轮和第5轮中，1nM抗CD71 21.12-488，收集＞2×102个细胞。验证了来自第二轮FACS的阳性群体抑制抗CD71 21.12-488抗体与重组CD71蛋白的结合。通过由来自FACS第3轮的5nM结合子和FACS第3、4和5轮的1nM结合子的序列分析，鉴别出单个肽克隆。
鉴别的掩蔽部分包括TF01(QFCPWSYYLIGDCDI；SEQ ID NO：16)和TF02(NLCTEHSFALDCRSY；SEQ ID NO：17)。将TF01和TF02掩蔽物截短并且进行丙氨酸扫描以产生具有不同掩蔽效率的可活化抗体家族，包括掩蔽部分TF02.13(NLCTEHSAALDCRSY；SEQ IDNO：18)。
这些掩蔽肽用于产生本公开的抗CD71可活化抗体。这些抗CD71可活化抗体的某些的序列在下表A中显示。在一些实施例中，这些抗CD71可活化抗体包括如所指示的可裂解部分2001(ISSGLLSGRSDNH；SEQ ID NO：91)、可裂解部分3001(AVGLLAPPGGLSGRSDNH；SEQ IDNO：97)、可裂解部分2011(ISSGLLSGRSDNP；SEQ ID NO：156)或可裂解部分3011(AVGLLAPPGGLSGRSDNP：SEQ ID NO：164)。
尽管下文显示的某些序列包括SEQ ID NO：138的间隔序列，但所属领域普通技术人员了解，本公开的可活化抗CD71抗体可包括任何合适的间隔序列，例如选自由以下组成的组的间隔序列：QGQSGQG(SEQ ID NO：138)、QGQSGQ(SEQ ID NO：109)、QGQSG(SEQ ID NO：139)、QGQS(SEQ ID NO：140)、QGQ、QG、GQSGQG(SEQ ID NO：143)、QSGQG(SEQ ID NO：144)、SGQG(SEQ ID NO：145)、GQG、G或Q。在一些实施例中，本公开的可活化抗CD71抗体可不具有接合到其N端的间隔序列。
表A.抗CD71可活化抗体序列
HuCD71_HcC重链可变区
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001451
核苷酸序列
Figure BDA0002465367670001452
HuCD71_HcC-des重链
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001453
核苷酸序列
Figure BDA0002465367670001454
Figure BDA0002465367670001461
HuCD71_HcC重链
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001462
核苷酸序列
Figure BDA0002465367670001463
Figure BDA0002465367670001471
HuCD71_LcB
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001472
HuCD71_LcB
核苷酸序列
Figure BDA0002465367670001473
Figure BDA0002465367670001481
可活化抗体轻链抗CD71-TF01-2001
[间隔子(SEQ ID NO：138)][huCD71Lc_TF01_2001(SEQ ID NO：141)]
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001482
可活化抗体轻链抗CD71-TF02.13-2001
[间隔子(SEQ ID NO：138)][huCD71Lc_TF02.13_2001(SEQ ID NO：142)]
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001483
可活化抗体轻链抗CD71-TF02.13-3011
[间隔子(SEQ ID NO：138)][huCD71Lc_TF02.13_3011(SEQ ID NO：146)]
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001484
Figure BDA0002465367670001491
可活化抗体轻链抗CD71-TF02.13-2011
[间隔子(SEQ ID NO：138)][huCD71Lc_TF02.13_2011(SEQ ID NO：169)]
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001492
可活化抗体轻链抗CD71-TF01-3011
[间隔子(SEQ ID NO：138)][huCD71Lc_rF01_3011(SEQ ID NO：173)]
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001493
可活化抗体轻链可变区抗CD71-TF02.13-2001
[间隔子(SEQ ID NO：138)][huCD71Lc_TF02.13_2001VL域(SEQ ID NO：197)]
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001494
可活化抗体轻链可变区抗CD71-TF02.13-3011
[间隔子(SEQ ID NO：138)][huCD71Lc_TF02.13_3011VL域(SEQ ID NO：199)]
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001501
可活化抗体轻链可变区抗CD71-TF02.13-2011
[间隔子(SEQ ID NO：138)][huCD71Lc_TF02.13_2011VL域(SEQ ID NO：201)]
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001502
可活化抗体轻链可变区抗CD71-TF01-2001
[间隔子(SEQ ID NO：138)][huCD71Lc_TF01_2001VL域(SEQ ID NO：195)]
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001503
可活化抗体轻链可变区抗CD71-TF01-3011
[间隔子(SEQ ID NO：138)][huCD71Lc_TF01_3011VL域(SEQ ID NO：203)]
氨基酸序列
Figure BDA0002465367670001504
实例3.可活化抗CD71可活化抗体和抗CD71缀合可活化抗体的产生和表征
本文提供的研究被设计成产生一些本公开的抗CD71可活化抗体。
产生具有不同掩蔽效率(即，可活化抗体的MM阻断可活化抗体的AB与其靶标结合的能力的量度)的抗CD71可活化抗体。如实例2中所描述，通过截短和丙氨酸扫描使肽TF01和TF02突变，并且这些掩蔽肽变异体用于产生具有一系列掩蔽效率的本公开的抗CD71可活化抗体家族。
使用FACS评估本公开的抗CD7l可活化抗体与NCI H292(在本文中也称为H292)细胞系的结合。简单来说，将细胞用一系列浓度的huCD71抗体或可活化抗体标记，并且随后用Alexa Fluor 647标记的山羊抗人类IgG二级抗体检测，以确定结合曲线。如以下表2中的示例性结合数据中所概述，与亲本抗CD71抗体(huCD71 21.12Ab)相比，本公开的抗CD71可活化抗体显示一系列掩蔽效率。
表2：掩蔽部分的掩蔽效率
可活化抗体掩蔽部分 轻链VL SEQ ID NO K<sub>app</sub>(nM) 掩蔽效率
无(Ab 21.12) 7 2.288 1
TF01 809 809.5 352
TF02.13 813 127.4 55
表2中的这些示例性数据显示，当可活化抗体呈完整或未裂解状态时，两种掩蔽物(TF01和TF02.13)均抑制抗CD71抗体与CD71的结合。这些示例性数据还展现TF01掩蔽部分展现比TF02.13掩蔽部分更高的掩蔽效率。
实例4：CD71可活化抗体和CD71缀合可活化抗体的结合活性的表征
这一实例显示，当本公开的抗CD71可活化抗体和抗CD71缀合可活化抗体呈其完整、未裂解形式时，与其对应蛋白酶裂解形式相比，展现对重组和细胞表面人类和食蟹猕猴CD71蛋白的较低结合亲和力。
如图3A和3B所示，使用固相结合分析(ELISA)来展现呈完整、未裂解形式和其蛋白酶活化、裂解形式两者的本公开的抗CD71可活化抗体和抗CD71缀合可活化抗体与重组CD71的结合亲和力。在这些实例中，将重组猕猴(图3B)或人类CD71(图3A)蛋白(安迪生物公司(R&D Systems))以1μg/mL的浓度涂布在ELISA板上，并且然后与指定浓度的本公开的完整、未裂解的抗CD71可活化抗体(“抗CD71-TF02.13-2011”)或本公开的完整、未裂解的E2(即，DAR为约2)抗CD71缀合可活化抗体(“抗CD71-TF02.13-2011-vc-MMAE E2”)一起培育。还分析了在用裂解可活化抗体组分的可裂解部分的蛋白酶处理后，本公开的抗CD71可活化抗体(“抗CD71-TF02.13-2011(活化)”)或E2(即，DAR为约2)抗CD71缀合可活化抗体(“抗CD71-TF02.13-2011(活化)”)。
如本文所论述，“E2”是指本公开的给定抗CD71缀合可活化抗体的组合物，其基本上仅包括对于每个可活化抗体分子载药量为2个药物分子的缀合可活化抗体的物种，并且基本上不包括任何或极小量的其它可能物种(即，其中载药量为0、1、3、4、5、6、7、8等)。如本文所论述，“DAR”是指在此类缀合可活化抗体的群体中，药物(在这种情况下，MMAE)与可活化抗体(即CD71-TF02.13-2011)之间的平均比率。因此，在这个实例中，抗CD71-TF02.13-2011-vc-MMAE E2是指仅包括抗CD71-TF02.13-2011可活化抗体的组合物，其中每个可活化抗体具有2当量的vc-MMAE的载药量和约2的DAR，如实例26中所描述。
通过培育并且通过与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人类抗体检测和超TMB(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))检测来检测每个样品中结合抗体的量。以下显示结合亲和力的概述：
表3A：未裂解和裂解的抗CD71可活化抗体和抗CD71缀合可活化抗体的示例性观察到的CD71结合活性
Figure BDA0002465367670001531
图3C和3D显示FACS分析中的示例性结果，即与本公开的对应蛋白酶活化的抗CD71可活化抗体或蛋白酶活化的抗CD71缀合可活化抗体相比，本公开的抗CD71可活化抗体和本公开的抗CD71缀合可活化抗体以较高解离常数和较低亲和力结合表达人类CD71(图3C)和食蟹猕猴CD71(图3D)的细胞。这些示例性的结果显示，本公开的裂解、蛋白酶活化抗CD71可活化的抗体和本公开的裂解、蛋白酶活化抗CD71缀合可活化抗体以与亲本抗CD71抗体类似的亲和力结合到细胞，因此证明掩蔽部分在完整的可活化抗体或完整的缀合可活化抗体中抑制抗CD71与其靶标结合的效果。
在图3C和3D中所示的示例性研究中，使用标准FACS标记方法进行本公开的抗体与指定细胞系的结合。简单来说，用指定的本公开抗体或可活化抗体标记细胞：对照抗体(AB095)、人类抗CD71抗体(Ab 21.12，具有SEQ ID NO：5的VH和SEQ ID NO：7的VL)、抗CD71可活化抗体(抗CD71 TF02.13-2011)或E2(即DAR为约2)抗CD71缀合可活化抗体(抗CD71TF02.13-2011-vcMMAE E2)。另外，在裂解其中可裂解部分的蛋白酶活化之后，还分析了抗CD71可活化抗体(抗CD71 TF02.13-2011(活化))和E2(即DAR为约2)抗CD71缀合可活化抗体(抗CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2(活化))的结合亲和力。将每种测试品以指定浓度施加，并且随后用Alexa Fluor 647标记的山羊抗人类IgG二级抗体检测。
以下表3B显示基于图3C到3D中所描绘的结合曲线的EC50值。这些结果显示，完整的可活化抗体和完整的缀合可活化抗体以比其蛋白酶活化的对应物低的亲和力结合到其靶标，并且蛋白酶活化的可活化抗体以与亲本抗CD71抗体类似的亲和力结合。
表3B：抗CD71结合子的示例性观察到的CD71结合活性
Figure BDA0002465367670001541
在一项类似的示例性研究中，ELISA和流式细胞术分析用于证明本公开的抗CD71抗体、抗CD71缀合抗体、抗CD71可活化抗体(完整、未裂解形式和蛋白酶活化、裂解形式)以及抗CD71缀合可活化抗体(完整、未裂解形式和蛋白酶活化、裂解形式)与重组CD71、与重组人类和食蟹猕猴CD71以及表达人类和食蟹猕猴CD71的细胞系的结合亲和力。测试品为抗CD71 Ab21.12抗体(SEQ ID NO：5的VH和SEQ ID NO：7的VL)、缀合抗体抗CD71Ab21.12-vcMMAE E2(即DAR为约2)、可活化抗体抗CD71-TF02.13-2011以及DAR2缀合可活化抗体抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(即DAR为约2)。
在ELISA实例中，将重组食蟹猕猴或人类CD71 ECD蛋白涂布在ELISA板上，并且然后与一系列浓度之一的本公开的测试品一起培育，接着用二级抗体测量结合的测试品的量。将活化的测试品与间质蛋白酶蛋白酶一起培育。表3C中显示每种测试品的示例性表观Kd值。
在表3C中还显示的示例性研究中，使用标准FACS标记方法进行本公开的抗体与指定细胞系的结合。流式细胞术结果反映了来自四种人类细胞系(HCC1806人类乳腺癌、HT-29人类结肠直肠癌、NCI-H292人类肺癌以及NCI-H520人类肺癌)和一种表达食蟹猕猴CD71的CHO-K1细胞系的平均Kapp测量值。表3C中显示每种测试品的示例性表观Kd值。
表3C：抗CD71抗体、抗CD71缀合抗体、未裂解和裂解的抗CD71可活化抗体以及抗CD71缀合可活化抗体的示例性观察到的CD71结合活性
Figure BDA0002465367670001551
这些示例性结果显示，完整的可活化抗体和完整的缀合可活化抗体与其活化对应物或其亲本抗体相比，显示对CD71的较低表观亲和力。
实例5：多种患者来源的原发性和转移性肿瘤中的CD71表达
这一实例使用抗CD71抗体通过免疫组织化学(IHC)染色，显示CD71在很多种原发性和转移性肿瘤类型中表达。
图1和2显示在多个患者来源的原发肿瘤和患者来源的转移组织微阵列(TMA)上使用IHC染色利用商购的抗CD71抗体，CD71在大量原发性和转移性肿瘤样品中高度表达。图1显示头颈癌(1)、宫颈癌(2)、乳腺癌(3)、淋巴结中的非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)(4)、肺癌(5)、膀胱癌(6)、卵巢癌(7)以及食道癌(8)中的CD71 IHC染色。图2显示由来白转移性肿瘤的核心组成的组织微阵列(TMA)中CD71的IHC染色在大多数核心中展现中度到高水平的CD71表达。表4A显中示通过免疫组织化学(IHC)对人类肿瘤样品中CD71表达的总结。
表4A：通过IHC测得的人类肿瘤样品中CD71表达的概述
Figure BDA0002465367670001561
实例6：掩蔽效率和CRC异种移植模型中可活化抗CD71-AADC的体内功效
这一实例显示，本公开的具有缀合毒素的抗人类CD71可活化抗体(AADC)的掩蔽效率是其在HT29结肠直肠癌(CRC)小鼠异种移植模型中的功效的因素。
在这些研究中，使小鼠中的HT29异种移植肿瘤生长到150mm3的平均体积。然后将小鼠随机分入组中，并且在第1天给予3mg/kg(或另外指定)的每种指定的测试品。对每个时间点绘制平均肿瘤体积±SEM。
图4A显示在单次3mg/kg剂量后，相对于媒剂对照，具有较高亲和力掩蔽物的本公开的示例性抗CD71 AADC(抗CD71 TF01-3011-vc-MMAE)显示一定肿瘤生长抑制。相比之下，图4B显示在单次3mg/kg剂量后，具有较低亲和力掩蔽物但具有相同可裂解底物的本公开的示例性抗CD71 AADC(抗CD71TF02.13-3011-vc-MMAE)显示异种移植物的基本上完全消退。图4C显示在2mg/kg或3mg/kg单次剂量两者下，具有较低亲和力掩蔽物但具有相同可裂解底物的本公开的示例性抗CD71 AADC(抗CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE)也显示HT29异种移植物的基本上完全消退。这些示例性结果显示，与具有较高亲和力掩蔽部分的AADC相比，具有较低亲和力掩蔽部分的AADC展现更高的功效。
实例7：可裂解底物和CRC异种移植模型中可活化抗CD71-AADC的体内功效
这一实例显示可裂解底物对小鼠异种移植模型中本公开的示例性抗人类CD71缀合可活化抗体(AADC)的功效的影响。
在这些研究中，使小鼠中的HT29(结肠直肠癌来源)异种移植肿瘤生长到150mm3的平均体积。然后将小鼠随机分入组中并且在第1天给予指定量的指定测试品。对每个时间点绘制平均肿瘤体积±SEM。
图5显示在两种不同剂量下，本公开的示例性抗CD71 AADC(CD71TF02.13-2011-vc-MMAE)在小鼠异种移植模型中显示完全或接近完全消退。这些示例性数据证明，具有较难裂解的底物的指定AADC(抗CD71TF02.13-2011-vc-MMAE)的功效与如图4B和4C中所示的具有较易裂解的底物的AADC(抗CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE)的功效大体上相同。
实例8：多种异种移植模型中的可活化抗CD71-AADC体内功效
这一实例显示在各种小鼠异种移植模型中，在两种不同的药物与抗体比率(DAR)下的本公开的抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE AADC的功效。
在这些研究中，使小鼠中的卵巢癌(OV-90；图6B)、胃癌(NCI-N87；图6A)、ER+乳腺癌(BT474；图6C)或三阴性乳腺癌(HCC-70；图6D)异种移植肿瘤生长到150mm3的平均体积。然后将小鼠随机分入组中，并且在第1天给予指定测试品。基于MMAE毒素的量，对每种AADC的施用量进行剂量匹配，使得抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE(平均DAR为约3)以3mg/kg的施用并且抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2(平均DAR为约2)以4.3mg/kg施用。对每个时间点绘制平均肿瘤体积±SEM。
图6A到6B显示本公开的示例性抗CD71 AADC(抗CD71TF02.13-2011-vc-MMAE)在卵巢癌和胃癌小鼠异种移植模型中显示完全或接近完全消退。包括各自具有两个当量的MMAE毒素的纯化AADC的抗CD71TF02.13-2011-vc-MMAE E2(即DAR为约2)在相同模型中也显示完全的消退。在所有情况下，如图6C和6D中所示，即使未观察到完全或接近完全消退时，E2(即DAR为约2)与较高DAR AADC的活性是等效或几乎等效的。这些示例性数据证明，E2(即DAR为约2)AADC(抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2)的剂量匹配功效与对应的较高DAR AADC相当。
如表4B中所示，DAR为约2的抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 AADC的功效相对于多种患者来源(PDX)或癌细胞(CDX)细胞系在小鼠异种移植模型中测试，并且以小于或等于6mg/kg一次或两次给予。以下概述的结果显示，在几乎所有测试的模型中，AADC展现在消退到停滞到肿瘤生长抑制范围内的至少一些功效。
表4B：抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2在细胞系来源的异种移植物中的功效
Figure BDA0002465367670001591
实例9：确定来自经过处理的动物的样品中缀合和游离毒素以及完整和总AADC的水平的生物分析性分析
这一实例显示用于测量测试样品中代谢物水平，包括缀合和游离毒素的水平以及完整和总缀合可活化抗体的水平的分析的示例性工作流。
图7A、7B和7C显示确定经过处理的猴体内完整和总(即组合的完整和裂解的)可活化抗体的量，以及经过处理的猴体内完整AADC(具有未裂解的毒素)和裂解的毒素的量的示例性生物分析性分析的示意性工作流。使用图7A中所描绘的示例性分析方案，可将样品中完整和裂解的可活化抗体(例如抗CD71 TF02.13-3001)的总量用磁性蛋白A珠粒捕获，并且随后变性(RapiGestTM)，用二硫苏糖醇还原，烷基化并且胰蛋白酶消化。可通过使用反相LC-MS/MS分析所得肽片段，以从抗体重链和轻链中鉴别并且定量特征肽片段。在这一特定分析中，可使用反相LC-MS/MS鉴别并且定量可活化抗体或缀合可活化抗体的抗体部分所特有的一种或多种肽，以确定完整和裂解的可活化抗体两者的总量，由此测量样品中完整和裂解的可活化抗体的总量。
在同一分析中，可使用反相LC-MS/MS鉴别并且定量可活化抗体的未裂解的可裂解部分(CM)和掩蔽部分(MM)部分(例如，来自抗CD71-TF02.13-2011轻链的N端)所特有的一种或多种肽，以确定完整的可活化抗体的总量，由此测量样品中完整的可活化抗体的量。
使用图7B中所描绘的示例性分析方案，可确定样品中保持与其毒素(MMAE)缀合的AADC(例如抗CD71 TF02.13-3001-vc-MMAE)的总量。在这一分析中，缀合和未缀合的可活化抗体的总量均由
Figure BDA0002465367670001601
蛋白A捕获。这种部分经半胱氨酸蛋白酶处理以裂解接头毒素，由此释放保持与其可活化抗体缀合的任何毒素。使用反相LC-MS/MS来分析半胱氨酸蛋白酶裂解的部分，可鉴别并且定量保持与捕获的可活化抗体缀合的特征毒素(例如MMAE)，由此测量样品中缀合毒素的量。
使用图7C中所描绘的示例性分析方案，可确定包括在动物中从AADC裂解的毒素的样品中毒素的总量。在图7C中所描绘的这一示例性分析中，使来自样品的总蛋白质沉淀，在上清液中留下游离的未缀合毒素(MMAE)。可使用反相LC-MS/MS分析上清液，以鉴别并且定量不与沉淀蛋白质缔合的特征毒素(例如MMAE)，由此测量样品中未缀合毒素的量。在这些分析中，包括内标(例如SILuTM Mab，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))以允许定量。
实例10：抗CD71-AADC和抗CD71 ADC在食蟹猕猴中的耐受性和稳定性
这一实例显示，基于一种或多种血液学读数和临床症状，与对应的亲本抗CD71抗体药物缀合物(ADC)相比，在食蟹猕猴中，本公开的具有缀合毒素的抗人类CD71可活化抗体(AADC)具有良好耐受性。结果概述于以下表5中并且概述于图17中。
在这项研究中，将食蟹猕猴在第1天和第21天用指定AADC或ADC以指定剂量静脉内处理。对于抗CD71 TF02.13-3011-vc-MMAEAADC，仅一次剂量耐受，并且对于抗CD71-vc-MMAE E2(即DAR为约2)ADC，施用仅一次剂量。使用反相LC/MS/MS，如实例9中所描述进行从每只动物获得的样品中可活化抗体(即，总可活化抗体相对于完整的可活化抗体)的稳定性。
表5：抗CD71 AADC和ADC在食蟹猕猴中的耐受性和稳定性的概述
Figure BDA0002465367670001611
以第1施用剂量后的最低测量重量确定体重减轻。基线中性粒细胞计数是每微升至少1000个。
如表5中概述，未掩蔽的E2(即DAR为约2)ADC(抗CD71-vc-MMAE E2)在第一剂量的8天内展现致死性。
表5中概述的示例性结果还显示，与具有较易裂解底物的对应AADC(即抗CD71TF02.13-3011-vc-MMAE)相比，具有较难裂解底物的AADC(即抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE和抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2)在非人类灵长类动物中具有较好的耐受性并且展现较高水平的循环稳定性。最后，示例性结果显示，与对应的较高DAR AADC(抗CD71TF02.13-2011-vc-MMAE)相比，AADC(抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2(即DAR为约2))展现在非人类灵长类动物中的耐受性可测量地提高。
实例11：抗CD71-AADC在食蟹猕猴中的稳定性和药代动力学
这一实例显示本公开的具有缀合毒素的抗人类CD71可活化抗体(AADC)在食蟹猕猴中的稳定性和药代动力学。在这项研究中，
在结果在实例12到14中更详细描述的这项研究中，用指定E2(即DAR为约2)抗CD71TF02.13-2011-vc-MMAE或媒剂对照以如表6中所示的指定剂量和时程对四组食蟹猕猴进行静脉内处理。在表6中指定的日子从每只动物获得样品，以实例9中所描述的方式分析所述样品的全部和完整的可活化抗体以及缀合和未缀合的MMAE毒素。
表6：抗CD71 AADC毒性研究设计
Figure BDA0002465367670001621
如表6中所概述，通过以所示的剂量水平和时程缓慢IV推注，食蟹猕猴被给予媒剂或抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 AADC。将用于毒理动力学分析的血液样品加工成血浆，并且在分析之前在-80℃下储存。第1到3组在剂量前和第二剂量后7天，并且第4组在第一剂量后22天获得血清样品用于抗药物分析。所有组均含有三只动物(2只雄性和1只雌性)。
实例12：抗CD71-AADC在食蟹猕猴中的稳定性
这一实例显示本公开的具有缀合毒素的抗人类CD71可活化抗体(AADC)在食蟹猕猴中的稳定性。
如图8A和8B的示例性结果中所示，以实例9和11中所描述的方式测定所施用的AADC的全部和完整的可活化抗体(抗CD71 TF02.13-2011)的血浆浓度。如所指示，完整抗体和总可活化抗体的定量下限(LLOQ)均为0.633nM。这些示例性结果证明，完整的可活化抗体的血浆浓度一般在21天给药间隔期间保持，并且处于与初始施用剂量成比例的水平。即使在剂量后7天，血浆中大致80％的缀合可活化抗体(抗CD71-TF02.13-2011-vc-MMAE E2)也呈完整前药形式。
如图9A和9B的示例性结果中所示，以实例9和11中所描述的方式测定缀合和未缀合的MMAE毒素的血浆浓度。如所指示，缀合MMAE的定量下限(LLOQ)为1.77nM，并且未缀合MMAE的定量下限(LLOQ)为0.31nM。这些示例性结果证明，在血浆浓度中测量的总MMAE的不到1％呈未缀合形式。
实施13：食蟹猕猴中抗CD71-AADC给药后药物与可活化抗体的比率的变化
这一实例显示，在用本公开的具有缀合毒素的抗人类CD71可活化抗体(AADC)给予食蟹猕猴后，血浆中观察到的药物(MMAE)与可活化抗体(抗CD71 TF02.13-2011)的比率。
以实例9和11中所描述的方式测定全部和完整的可活化抗体(抗CD71TF02.13-2011)的血浆浓度。如图10中所示，通过在每个指定时间点将缀合MMAE的浓度(参见实例12和图9A)除以总的可活化抗体的浓度(参见实例11和图8A)来计算药物与可活化抗体的比率。表7中显示特定时间点的平均比率和标准差。这些示例性结果证明，观察到的MMAE药物与可活化抗体的比率随时间推移以在三(3)次剂量中的每一者之间一致的方式改变。在每次剂量中，计算出的完整AADC的DAR紧接在施用后并且在施用约4小时内以约2开始，并且这一比率在剂量后大致96小时(即约4天)下降到约1。
表7：药物与可活化抗体的比率
Figure BDA0002465367670001641
实例14：抗CD71-AADC在食蟹猕猴中的药代动力学参数
这一实例显示本公开的具有缀合毒素的抗人类CD71可活化抗体(AADC)在食蟹猕猴中的药代动力学参数。
以实例9和11中所描述的方式测定全部和完整的可活化抗体(抗CD71TF02.13-2011)的血浆浓度。如表8中所示，给定分析物的平均Cmax基于观察到的最大血浆浓度。平均AUC0-7基于第0天到第7天的血浆浓度-时间曲线下的面积。总的缀合可活化抗体、完整的缀合可活化抗体以及缀合MMAE的半衰期估计值的范围为2.5到6.3天。未产生未缀合MMAE的半衰期估计值。
表8：药物与可活化抗体的比率
Figure BDA0002465367670001642
实例15：抗药物抗体的分析
这一实例描述使用桥接分析来监测测试动物中抗药物抗体(ADA)的形成。
在研究前和第二剂量后7天收集用于ADA分析的血浆样品。在研究中给药的9只动物中的3只中检测到抗药物抗体。
实例16：抗CD71缀合可活化抗体的体外细胞毒性
这一实例描述与同种型对照ADC相比，对本公开的完整和活化的抗CD71缀合可活化抗体在人类肿瘤来源细胞系上的体外细胞毒性分析。
评估用或不用间质蛋白酶预处理的本公开的缀合可活化抗体抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(SEQ ID NO：167的HC和SEQ ID NO：169的LC)下的示例性体外细胞毒性活性，并且与同种型非CD71结合缀合抗体对照(DAR为2的AB095-vcMMAE，其中AB095对破伤风毒素具有特异性)进行比较。通过将每种测试品与每种细胞系一起培育，历时5天，在HT29(人类结肠直肠癌细胞系)、H292(人类肺癌细胞系)、H520(人类肺癌细胞系)以及HCC1806(人类乳腺癌细胞系)上测试测试品的细胞毒性，并且然后在一系列浓度的每种测试品中测量细胞活力，以确定每种测试品的EC50。结果概述于以下表9中。
表9：人类肿瘤细胞中体外细胞毒性分析的EC50值
Figure BDA0002465367670001651
这些示例性结果显示，完整的抗CD71缀合可活化抗体的体外细胞毒性与同种型对照类似，但在间质蛋白酶活化后显著增加。
实例17：由抗CD71缀合可活化抗体进行的Fc结合和补体活化
这一实例证明，本公开的抗CD71缀合可活化抗体介导基于效应功能的机制，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。
IgG抗体的可结晶片段(Fc)部分可介导多种功能，其中一些通过与Fc受体和C1q结合进行。这些功能包括细胞因子诱导、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、通过补体系统经典途径的活化的补体依赖性细胞毒性(CDC)、吞噬作用以及通过IgG再循环的抗体稳态。(Ravetch等人，《免疫学年评(Annu Rev Immunol.)》，2001；19：275-290；Roopenian等人，《自然评论：免疫学(Nat Rev Immunol.)》2007；7：715-725)。
抗体的体内稳态部分受Fc相关新生受体FcRn调控，所述受体存在于肠上皮细胞、血管内皮细胞以及专职抗原呈递细胞上。在细胞内，FcRn存在于囊泡中；在低pH下在酸性内体中，其可结合与通过胞饮作用摄取的IgG的Fc部分。然后，当内体再循环到细胞表面时，由于暴露于细胞外中性pH，IgG被释放。这一过程允许控制IgG跨单层上皮屏障的运输，并且保护IgG分子免于分解代谢，延长IgG血清半衰期。(Roopenian)。实际上，已显示在低pH下增强FcRn结合但在生理pH下保持低结合的突变具有更长的血清半衰期。(Hinton等人，《生物化学杂志》2004；279：6213-6216；Hinton等人，《免疫学杂志(J Immunol.)》2006；176：346-356)。
人类FcγR系统由活化(FcγRI、FcγRIIa以及FcγRIIIa)和抑制性(FcγRIIb)受体两者构成。FcγRI，一种高亲和力IgG1受体，由单核细胞谱系的细胞表达。(Li等人，《免疫学杂志》2008；181：1012-1018)。FcγRIIa是更广泛表达的低亲和力IgG受体，其优先结合免疫复合物。(Littaua等人，《免疫学杂志》，1990；144：3183-3186)。FcγRIIb主要在单核细胞谱系和B细胞上表达，并且是低亲和力抑制性IgG受体。FcγRIIb与IgG复合物结合后，钙依赖性过程(如脱粒、吞噬作用、ADCC、细胞因子释放以及促炎性活化)均被阻断。(Clynes等人，《自然医学(Nat.Med.)》，6：446-446(2000)；Minard-Colin等人，《血液(Blood)》，112：1205-1213(2008)；以及Hamaguchi等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》，203：743-753(2006))。FcγRIIIa是负责NK细胞的ADCC活性的低亲和力受体。(Ravetch)为了增加Fcγ受体的多样性，存在FcγRIIa(H131与R131)和FcγRIIIa(V158与F158)的多态变异体，所述多态变异体对IgG分子的亲和力有所不同。(Bruhns等人，《血液》，2008；113：3716-3725)。
抗体通过FcγR或补体效应系统介导多种功能的能力允许在基于IgG的工程改造生物制剂中非预期地放大药理学的可能性。对外周血淋巴细胞的未知交叉反应性能够触发Fcγ受体的交联。由于交联Fcγ受体相互作用可以介导多种功能，包括细胞因子诱导、ADCC以及吞噬作用(Ravetch)，因此确定治疗性抗体结合血液或组织中非预期靶标的能力是重要的。
方法-表面等离子体共振FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa以及FcRn结合分析
通过6×His标签捕获重组人类FcγRII和FcγRIII，以通过表面等离振子共振(Biacore)评定其与抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE、抗CD71 Ab21.12(IgG1/κ)、AB095-MMAE-E2以及AB095(IgG1/κ)的结合。根据制造商的方案，通过胺偶联将小鼠抗6×His抗体直接固定在CM5芯片上，直到10000RU的密度。然后在流动池2、3和4上捕获人类FcγR，以实现250到500RU的FcγR捕获水平。流动池1用作参考表面。HBS-EP+缓冲液(GE医疗(GE，Healthcare))用作运作缓冲液。对于FcγRII浓度范围为46.9到12000nM，并且对于FcγRIII浓度范围为7.8到4,000nM(两者均进行2倍连续稀释)，将抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2、抗CD71 Ab21.12(IgG1/κ)、AB095-MMAE-E2，AB095(IgG1/κ)以及曲妥珠单抗(trastuzumab)(IgG1/κ)以50微升/分钟的流动速率注入到所有流动池上一到两分钟(对于FcγRIIb和FcγRIIa H131一分钟，并且对于FcγRIIIa F158和FcγRIIIa V158两分钟)，接着一到五分钟解离时间(对于FcγRIIb、FcγRIIa H131一分钟，并且对于FcγRIIIaF158和FcγRIIIa V158五分钟)。通过在所有四个流动池上以100微升/分钟的流动速率注入100mM HCl持续两秒，使芯片表面再生。对每个样品运作使用三种不同CM5芯片的三次实验(每个样品两次重复)，以适应所有类型的实验误差(仪器、表面以及操作员)。将这三次实验的结果取平均值。
对于FcRn结合分析，根据制造商的方案，通过胺偶联将抗CD71TF02.13-2011-vc-MMAE E2、抗CD71 TF02.13-2011(不具有vc-MMAE的IgG1/κ)、AB095-vcMMAE-E2(具有富集的DAR＝2的含MMAE的非特异性单克隆人类抗破伤风类毒素IgG1/κ抗体)、AB095(非特异性单克隆人类抗破伤风类毒素IgG1/κ抗体)以及曲妥珠单抗(IgG1/κ)直接固定在CM5芯片上，直到500RU的密度。将Hu FcRn以5.5到12000nM浓度范围(3倍连续稀释)以50微升/分钟的流动速率注入到所有流动池上持续一分钟，后接两分钟解离时间。利用注入100mM HCl持续两秒，接着注入HBS-EP+，pH 7.4来再生表面。制备样品并且在两个运作缓冲液系统MES-EP+pH6.0和HBS-EP pH 7.4中运作。对每个样品运作使用三种不同CM5芯片的三次实验(每个样品两次重复)，以考虑仪器、表面以及操作者的误差。将这三次实验的结果取平均值。
将所有重组人类FcγRIIIa V158数据和FcγRIIIa F158数据拟合到1∶1结合拟合模型，其中Rmax固定于局部以考虑捕获水平的变化性。将重组人类FcγRIIb、FcγRIIaH131以及FcRn结合数据拟合到稳态亲和力模型。使用Biacore T200评估软件2.0版来拟合所有数据。
结果
抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2含有人类IgG1/κ同种型Fc。预期其与FcγRI、FcγIIa、FcγIIb、FcγIII结合，与其它野生型IgG1/κ抗体一致。通过表面等离子体共振来分析抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2与FcγR的结合，通过功能性人类和食蟹猕猴补体活化分析来分析FcγRI竞争结合ELISA(结果未显示)和FcγRIII竞争结合ELISA(结果未显示)以及CD71TF02.13-2011-vc-MMAE E2与补体的结合(结果未显示)。这些分析通过商业和内部产生的人类抗体进行基准测试。将临床级人类抗HER2、IgG1/κ、曲妥珠单抗材料用作FcγR结合分析的阳性对照。已知Fc受体和补体结合野生型IgG1抗体。(Ravetch；Roopenian；Burton等人，《自然》1980；288：338-344；Hughes-Jones等人，《分子免疫学(MolImmunol.)》，1979；16：697-701；以及Hezareh等人，《病毒学杂志(J Virol.)》2001；75：12161-12168)。对抗CD71TF02.13-2011-vc-MMAE的检查展现其确实结合FcγRI、FcγIIaH131、FcγRIII以及FcRn，不过与阳性对照曲妥珠单抗相比，观察到其与FcγRIII的结合略有减弱(通过SPR测得)。抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2与FcγRIIb的结合太弱而无法测定，因为其下降到Biacore仪器在1.0e-05KD下的检测限以下。(参见表10A和10B)。
表10A：通过表面等离子体共振测得的抗CD71缀合可活化抗体与FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa的结合
Figure BDA0002465367670001691
表10B：人类FcRn表面等离子体共振
Figure BDA0002465367670001701
通过评定抗CD71缀合可活化抗体活化人类和食蟹猕猴血清补体的能力评估补体依赖性细胞毒性(CDC)，所述评定通过针对CDC由ELISA捕获iC3b(人类)或C3(食蟹猕猴)来进行。
如图12中的示例性结果所示，指定浓度下的指定测试品与iC3b的结合显示为对人类补体活化的分析。在人类和食蟹猕猴血清两者中的补体活化分析中，抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2结合iC3b，但程度比在CDC分析中所使用的阳性对照7C6抗体低。具有指定突变的7C6.7抗体用作阴性对照。抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2的iC3b结合也弱于其未缀合的可活化抗体对应物(抗CD71-TF02.13-2011)。
实例18：人类PBMC中的细胞因子释放
这一实例显示，尽管抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2不结合人类或食蟹猕猴外周血单核细胞(PBMC)，但IgG1抗体能够交联外周血淋巴细胞上的Fcγ受体，从而介导多种功能，包括细胞因子诱导。
以可溶性或固相(培养板结合)形式评估抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2或抗CD71-TF02.13-2011针对以下细胞因子诱导人类PBMC中体外细胞因子释放的能力：白介素(IL)-1β、IL 6、IL 2、干扰素(IFN)γ以及肿瘤坏死因子α(TNFα)。对于固相实验，将来自8位健康人类供体的PBMC添加到先前用0.96μg测试品涂布的聚丙烯培养板中，并且在1.5小时后洗掉。48小时后收集上清液用于分析。曲妥珠单抗和非结合性同种型对照ADC AB095-vcMMAE E2用作阴性对照。使用三种阳性对照：刺激T细胞的抗体TGN1412或维西珠单抗(visilizumab)，和刺激B细胞和骨髓细胞的脂多糖(LPS)。在所测试的8个供体中的1个中，观察到回应于CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2和AB095-vcMMAE-E2两者，5种测量的细胞因子中的3种，IL-1β、IL-6以及TNFα大量释放。在8个供体中的另外2个中，观察到回应于抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2和AB095-vcMMAE E2两者，IL-6和TNFα释放。在可溶性呈递分析中测试三个供体，所述分析是24小时高细胞密度呈递分析。
在这项研究中，以0.96微克/孔用抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2和抗CD71-TF02.13-2011(IgG1κ)预涂刺激后，测量来自人类供体PBMC的细胞因子释放。曲妥珠单抗用作阴性对照IgG1κ抗体。AB095-vcMMAE-E2和AB095(IgG1κ)用作同种型对照抗体。添加TGN1412、维西珠单抗以及脂多糖(LPS)作为细胞因子释放的阳性对照。粗体并且加框的值突出显示引起细胞因子释放＞由曲妥珠单抗引起的释放的2倍的测试品。
如表11中的示例性结果所示，抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2不引起超过由阴性对照曲妥珠单抗诱导的水平的细胞因子释放。还在3个食蟹猕猴供体中以固相形式针对以下细胞因子评估细胞因子释放：IL-1β、IL-6、IL-2、IFNγ、IL-8以及IL 10。抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2在测试的3个供体中的1个中引起略高于如由曲妥珠单抗限定的背景水平的IL-8产生。在针对抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2的食蟹猕猴非GLP和GLP毒理学研究中，在任何剂量水平下未观察到代表细胞因子释放的急性临床症状。
表11：回应于固相抗CD71缀合可活化抗体和其它测试品的人类PBMC的细胞因子释放
Figure BDA0002465367670001721
Figure BDA0002465367670001731
实例19：抗CD71 AADC在SW-48异种移植小鼠模型中的抗肿瘤功效
这一实例显示使用SW-48细胞(人类结肠直肠癌)，本公开的抗CD71缀合活化抗体在小鼠肿瘤异种移植模型中的功效。
在这一示例性研究中，向8只小鼠的组施用指定剂量的抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(AADC)单次腹膜内注射，并且随时间推移观察平均肿瘤体积。如图13和表12中所示，在所有剂量中观察到与媒剂对照相比在23天时的一系列总生长抑制(TGI)，在6和12mg/kg剂量下观察到完全肿瘤消退。
表12：抗CD71 AADC处理后的异种移植肿瘤生长抑制
Figure BDA0002465367670001732
CR＝完全反应；PR＝部分反应；TGI＝肿瘤生长抑制；TGD＝肿瘤生长延缓；TR＝总反应。
实例20：抗CD71 AADC在DLBCL PDX小鼠模型中的抗肿瘤功效
这一实例显示在雌性SCID或NOG小鼠中使用HuPrime患者来源的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，本公开的抗CD71缀合活化抗体在五(5)个小鼠肿瘤患者来源的异种移植(PDX)模型中的功效。
在这一示例性研究中，3只小鼠的组用皮下肿瘤(100到200mm3)建立，并且在第0天和第7天施用6mg/kg的抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(AADC)或媒剂对照。如图14的示例性结果中所示，与媒剂对照组相比，AADC测试品在5个模型中的4个中实现了＞100％TGI，并且在1个模型中实现了72％TFI。在LY2345的3只小鼠中的2只、模型LY6933的3只小鼠的3只、模型LY6934的3只小鼠的2只以及模型LY2318的2或3只小鼠中观察到施用AADC的模型中的完全反应(即，研究终止时不存在可测量的肿瘤)。针对模型LY3604未观察到完全反应。这些示例性结果证明，本公开的AADC证明了功效，在一些模型中高达完全反应。
实例21：抗CD71 AADC在TumorGraft PDX小鼠模型中的抗肿瘤功效
这一实例显示在裸鼠中使用TumorGraft患者来源的人类乳腺癌(CTG-0437、CTG-0869、CTG-1059)、非小细胞肺癌(NSCLC)(CTG-1082、CTG-0860、CTG-0160、CTG-1012)以及头颈部小细胞癌(HNSCC)(CTG-1140、CTG-1082)，本公开的抗CD71缀合活化抗体在九(9)个小鼠肿瘤患者来源的异种移植(PDX)模型中的功效。
在这一示例性研究中，每个PDX模型的3只小鼠的组用皮下肿瘤(150到300mm3)建立，并且在第0天和第7天施用6mg/kg的抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(AADC)或媒剂对照。如图15A、15B和15C的示例性结果中所示，遍及三种癌症适应症，AADC测试品在9个模型中的6个中实现了＞100％肿瘤生长抑制(TGI)。在这6个观察到TGI＞100％的模型中，接受AADC的18只小鼠中的6只实现了完全反应(即，研究终止时不存在可测量的肿瘤)。在另外2个模型中，针对HNSCC和NSCLC分别观察到92％和78％TGI。一个NSCLC模型对AADC不起反应。如这些示例性结果中所示，本公开的AADC证明对来源于多种人类癌症类型的PDX模型的功效，包括在一些情况下的完全反应。
实例22：抗CD71 AADC在HuPrime胰腺PDX小鼠模型中的抗肿瘤功效
这一实例显示在SCID小鼠中使用HuPrime患者来源的人类胰腺癌(PA6237)，本公开的抗CD71缀合活化抗体在患者来源的异种移植(PDX)小鼠模型中的功效。
在这一示例性研究中，3只小鼠的组用皮下肿瘤(100到200mm3)建立，并且在第0天和第7天施用3或6mg/kg的抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(AADC)或媒剂对照。如图16的示例性结果中所示，AADC测试品在3和6mg/kg下实现了＞100％肿瘤生长抑制(TGI)。在这些6mg/kg组中，直到第59天观察到3个完全反应中的3个，而3mg/kg组保持完全反应直到第31天，接着肿瘤再生。
实例23：抗CD71缀合可活化抗体的非GLP先导毒性研究
这一实例显示，在每3周一次(Q3W)或每2周一次(Q2W)的IV推注注射后，在食蟹猕猴(每组每性别1到2只猴)中在6到18mg/kg范围内的剂量水平下的本公开的抗CD71缀合可活化抗体(AADC)抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2相对于在0.6到6mg/kg范围内的剂量水平下的抗CD71缀合抗体(ADC)Ab21.12-vcMMAE E2的相对毒性。在第29天(最后一次剂量后7天)对测试动物进行终末尸检。研究期间的评定包括临床体征、体重、食物消耗、临床病理、解剖病理、TK以及免疫原性。表13中显示先导毒性研究的概述。
表13：食蟹猕猴中的非GLP先导毒性研究
Figure BDA0002465367670001761
Figure BDA0002465367670001762
在接受高剂量CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(18mg/kg)、频繁剂量CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(在第1天和第15天给药)或6和2mg/kg下的未掩蔽的亲本抗CD71抗体药物缀合物(ADC)(Ab21.12-vcMMAE E2)的组中，观察到如由驼背体态、活动减少以及体温升高体现的严重毒性。当可确立死亡原因时，确定其为继发于药物相关免疫抑制的感染。
CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2和Ab21.12-vcMMAE E2的测试品相关研究结果相似，并且主要由血液学毒性组成。关键研究结果包括(1)在接受18mg/kg下的CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2单次剂量、第1天和第15天8mg/kg下的CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2或≥2mg/kg下的ADC(Ab21.12-vcMMAE E2)的单次剂量的组中，观察到归因于继发感染的死亡，(2)剂量后2周体重减轻，在≥12mg/kg下的CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2剂量后3周恢复，(3)红细胞团和所有白细胞群体的剂量依赖性减少，在剂量后3周观察到部分到完全恢复，(4)剂量后2周血小板水平短暂提高，(5)纤维蛋白原轻度到中度增加，白蛋白减少，并且球蛋白增加，(6)骨髓、脾脏以及胸腺细胞结构轻度到中度减少，伴随对应的胸腺和脾脏重量减轻。在几个淋巴组织中也观察到细胞结构减少。
在这一示例性研究中，这些研究中CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2和Ab21.12-vcMMAE E2(对应的ADC)的最高耐受剂量分别为12mg/kg和0.6mg/kg，其每3周施用一次持续2个剂量。
实例24：抗CD71缀合可活化抗体的GLP毒性研究
这一实例显示在第1天和第22天在0、2、6或12mg/kg的剂量水平下通过IV推注注射的本公开的抗CD71缀合可活化抗体(AADC)抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2在食蟹猕猴中的GLP重复剂量毒性研究。剂量组显示于表14中。
表14：食蟹猕猴的GLP毒性研究
Figure BDA0002465367670001771
在这一示例性研究中，每组6只雄性和6只雌性猴被给予抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2或媒剂(第1天和第22天静脉推注所示剂量)，如表14所示。在第29天进行终末尸检，在第64天进行恢复尸检。毒性评估包括死亡率，临床体征，体重变化，食物消耗，临床病理，解剖病理，眼科检查，以及心血管，呼吸和中枢神经系统功能的评估。研究包括TK分析和对ADA形成的评定。进行了以下示例性观察。表15中概述来自DAR为约2的抗CD71TF02.13-2011-vcMMAE E2的GLP毒性研究与未掩蔽的抗CD71抗体药物缀合物(ADC)Ab21.12-vcMMAEE2(DAR也为约2)的对应非GLP研究比较的所选结果的概述。
表15：食蟹猕猴中的GLP毒性研究结果
Figure BDA0002465367670001781
不存在对体重、食物消耗、呼吸速率、心电图、凝血以及尿液分析参数的AADC相关效应，也不存在任何神经系统效应、眼效应或宏观病理学研究结果。
在12mg/kg剂量下观察到AADC相关死亡；在第10天发现1只雌性死亡，并且在第11天对临床状况不断下降的2只雌性实施安乐死。这些动物中的AADC相关临床病理和显微研究结果与存活到排定的尸检(第29天)的动物中存在的那些相似，例外之处在于细菌感染的显微证据，这被视为AADC相关免疫抑制的结果。
如表15中所示，相对于Ab21.12-vcMMAE E2，抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2展现优异的耐受性，没有可检测的体重减轻。如所显示，Ab21.12-vcMMAE E2在2mpk下的单次剂量的8天之内缺乏耐受性，而与未掩蔽的Ab21.12-vcMMAE E2相比，抗CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2提供≥10倍保护。
在排定尸检之前一直存活的12mg/kg给药动物中，AADC相关临床体征是与白细胞群体减少关联的感染一致的皮肤病变/创伤，和急性期反应的体征(白蛋白和胆固醇减少，并且球蛋白、总胆红素以及甘油三酯增加)。
在第一剂量后，≥6mg/kg下的血液学参数的变化由以下组成：红细胞团、网织红细胞和所有白细胞亚群减少，以及血小板增加。在第一和第二剂量后，2mg/kg下的血液学变化限于血小板轻度增加。
在第一剂量后，临床化学参数的AADC相关变化在12mg/kg下最值得注意，并且由以下组成：急性期反应(白蛋白和胆固醇减少，和球蛋白、甘油三酯(仅雌性)、总胆红素增加)和尿素氮(仅个别)和肌酐增加以及磷减少。仅在第一剂量后发现6mg/kg下的临床化学变化，并且限于个别雌性中最低限度的胆红素增加和球蛋白增加。
在恢复阶段结束时，AADC相关血液学和临床化学研究结果恢复。
在≥6毫克/千克/剂量下，在胸腺、肾上腺以及骨髓中存在终末安乐死时的AADC相关显微研究结果。在所有组中均观察到注射位点处的研究结果，并且所述研究结果被解释为与施用程序相关，且不与AADC特定相关。以12mg/kg给药的雄性猴和以6mg/kg给药的雌性猴的胸腺重量减少，这在组织学上与尤其胸腺皮质的细胞结构减少相关联。以12mg/kg给药的雄性猴和以6mg/kg给药的雌性猴的肾上腺重量增加，并且组织学关联是肾上腺皮质肥大。用≥6mg/kg给药的雄性猴特别在股骨中的骨髓中存在细胞结构减少。在6周无剂量间隔后，不存在胸腺细胞结构减少和肾上腺皮质肥大，与这些改变的完全恢复一致。骨髓的细胞结构增加保持，但严重程度降低，与部分恢复一致。
实例25：MMAE与CD71可活化抗体的缀合和将所得CD71缀合可活化抗体的DAR降低到约DAR 3的方法
这一实例概述用于将vc-MMAE与抗CD71可活化抗体抗CD71 TF02.13-2011缀合，以产生含有对于每个抗CD71 TF02.13-2011分子2个MMAE分子的载药量的抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE的方法，外加用于将DAR富集到约3的方法。
缀合方法
E2富集的抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE-在2到8℃下向抗CD71TF02.13-2011(13.95mg/mL)39g溶液，544mg，3.5nmol)的溶液中添加0.5M EDTA(0.39mL)和TCEP(0.77mL，10mM WFI溶液，7.7nmol，2.2当量)过夜。然后将还原的抗体在室温下用DMSO(2.29mL)稀释，用DMSO中的vcMMAE(1.89mL的DMSO中的9.49mM vcMMAE，17.9nmol，5.1当量)处理1小时。用N-乙酰基半胱氨酸(0.29mL的100mM WFI溶液，29nmol，8.2当量)处理缀合抗体以淬灭过量vcMMAE。通过HIC(疏水相互作用色谱)分析淬灭的溶液的＞E4的DAR物种(较高DAR物种，在以上制剂中为20.9％)。
用于富集到较低DAR的方法
将缀合反应物用HIC树脂，如可从东曹生物科学(Tosoh Biosciences)商购的树脂(作为一个实例，Toyopearl烷基)在室温下逐份悬浮2h，以将较高DAR物种降低到目标水平(一般＜2％)。过滤处理过的溶液，并且用PBSE(125mM磷酸钾，150mM NaCl，6.3mM EDTA，pH7.2，22g)，后接PBS(5mM磷酸钾，200mM NaCl，pH 7，35g)连续洗涤树脂。浓缩合并的滤液和冲洗液，并且使用30kD截留分子量离心过滤器进行缓冲液交换，然后用配制物组分稀释以便储存。
所得产物含有228mg(A280 6.5mg/mL)，并且显示如由市售HIC柱测量，DAR为约2.9，并且构成以下特征和DAR物种：SEC 98.7％单体，0.2％较高分子量，1.1％较低分子量，内毒素＜0.06EU/mg，超过E4的DAR物种少于2面积％；DAR E0为约6.2面积％，DAR E2为约40.7面积％，并且DAR E4为约46.8面积％)。
在本文所描述的实例中，这种富集的DAR产品被称为“抗CD71TF02.13-2011-vc-MMAE(平均DAR为约3)”。
实例26：MMAE与CD71可活化抗体的缀合和将所得CD71缀合可活化抗体的DAR富集到约DAR 2(“E2”)的方法
这一实例概述用于将vc-MMAE与抗CD71活化抗体抗CD71 TF02.13-2011缀合，以产生含有对于每个抗CD71 TF02.13-2011分子2个MMAE分子的载药量的抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE的方法，外加用于将DAR富集到约2的方法。
缀合方法
抗CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2-向抗CD71 TF02.13-2011(20.3mg/mL)的溶液用1457g PBSE(125mM磷酸钾，150mM NaCl，6.3mM EDTA，pH 7.7)稀释并且冷却到4℃。向冷却的溶液中添加TCEP(10mM WFI溶液，30.2mL，0.30mmol，1.5当量)，并且在4℃下保持15小时。伴随冷却向还原的抗体中添加vc-MMAE(1.056g，0.80mmol，4当量)的DMSO(300g)溶液，接着DMSO冲洗(65g)，其后使溶液温热到室温。3.5小时后，添加N-乙酰基半胱氨酸(0.262g，1.60mmol，8当量)以淬灭过量vc-MMAE，并且将反应混合物在2到8℃下储存直到纯化。
用于富集到较低DAR的方法
使用pH 7.1下的硫酸铵/磷酸铵缓冲液的梯度，伴随由UV在280nm下监测，在市售HIC纯化柱，如可从GE生命科学(GE Life Sciences)商购的那些(烷基琼脂糖)上逐份纯化产物。将收集到的DAR 2产品库(大致9.5g，30％产率)使用Pellicon 3Ultracel 30kD膜，通过TFF用pH 6.0下的缓冲液进行缓冲液交换，然后用配制物组分稀释以便储存。
所得产物(A280 6.4mg/mL)显示如由市售HIC柱测量的DAR为约2，并且构成以下特征和DAR物种：SEC 99.6％单体，0.2％HMW，0.2％LMW，内毒素＜0.06EU/mg，并且DAR E2为约99.0面积％，运作之间的变化性在94％到99％DAR E2之间。
在本文所描述的实例中，这种富集(Enriched)的DAR 2(“E2”)产物被称为“抗CD71TF02.13-2011-vcMMAE E2”。
实例27：临床前鼠类模型中E2相对于较高DAR物种的生物物理特性的评定
使用如本文所概述的标准缓冲液和程序，将由实例25中所描述的方法获得的非HIC纯化的缀合产物在HIC柱上运作。如图18A中所示，鉴别了载药量在0到8之间的数个物种。
使从实例26获得的纯化E2产物经历相同HIC色谱。如图18B中所示，仅观察到含有为2的载药量的单一物种。
对未纯化的产物和E2产物进行放射性标记，并且注射到小鼠中，以评定每种产物的总体清除率和毒性。如图18C中所示，相对于未纯化的高载药量产物，显示纯化的E2产物具有显著较低清除率。
其它实施例
虽然已结合本发明的详细描述描述了本发明，但前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修改在以下范围内。
Figure IDA0002465367720000011
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Figure IDA0002465367720000801

Claims (30)

1.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(I)的结构或其盐：
Figure FDA0002465367660000011
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含
i.重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO:10的CDRH2序列以及包含SEQ ID NO:11的CDRH3序列；和
ii.轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的CDRL1序列、包含SEQID NO:14的CDRL2序列以及包含SEQ ID NO:15的CDRL3序列；
(ii)MM是包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当所述缀合可活化抗体呈未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与人类CD71的结合；
(iii)LP1是包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列的第一键联部分；
(iv)CM是包含SEQ ID NO:156的序列的可裂解部分，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(v)LP2是包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的第二键联部分；并且
(b)其中“n”是2。
2.根据权利要求1所述的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
3.根据权利要求1或2所述的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中所述重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
4.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(I)的结构或其盐：
Figure FDA0002465367660000021
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO:5的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:7的序列的轻链可变区；
(ii)MM是包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当所述缀合可活化抗体呈未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与人类CD71的结合；
(iii)LP1是包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列的第一键联部分；
(iv)CM是包含SEQ ID NO:156的序列的可裂解部分，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(v)LP2是包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的第二键联部分；并且
(b)其中“n”是2。
5.根据权利要求4所述的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
6.根据权利要求4或5所述的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中所述重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
7.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(I)的结构或其盐：
Figure FDA0002465367660000031
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO:167的序列的重链和包含SEQ ID NO:19的序列的轻链；
(ii)MM是包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当所述缀合可活化抗体呈未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与人类CD71的结合；
(iii)LP1是包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列的第一键联部分；
(iv)CM是包含SEQ ID NO:156的序列的可裂解部分，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(v)LP2是包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的第二键联部分；并且
(b)其中“n”是2。
8.根据权利要求7所述的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
9.根据权利要求7或8所述的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中所述重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
10.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(I)的结构或其盐：
Figure FDA0002465367660000041
其中MM-LP1-CM-LP2-AB是可活化抗体，其中所述AB是特异性结合到人类CD71的抗体，
其中所述可活化抗体包含有包含SEQ ID NO:167的序列的重链和包含SEQ ID NO:170的序列的轻链，并且
其中“n”是2。
11.根据权利要求10所述的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
12.根据权利要求10或11所述的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中所述重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
13.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(II)的结构或其盐：
Figure FDA0002465367660000042
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含
i.重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO:10的CDRH2序列以及包含SEQ ID NO:11的CDRH3序列；和
ii.轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的CDRL1序列、包含SEQID NO:14的CDRL2序列以及包含SEQ ID NO:15的CDRL3序列；
(ii)MM是包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当所述缀合可活化抗体呈未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与人类CD71的结合；并且
(iii)CM是包含SEQ ID NO:156的序列的可裂解部分，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(b)其中“n”是2。
14.根据权利要求13所述的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
15.根据权利要求13或14所述的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中所述重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
16.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(II)的结构或其盐：
Figure FDA0002465367660000051
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO:5的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:7的序列的轻链可变区；
(ii)MM是包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当所述缀合可活化抗体呈未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与人类CD71的结合；并且
(iii)CM是包含SEQ ID NO:156的序列的可裂解部分，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(b)其中“n”是2。
17.根据权利要求16所述的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
18.根据权利要求16或17所述的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中所述重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
19.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(II)的结构或其盐：
Figure FDA0002465367660000061
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含有包含SEQ ID NO:167的序列的重链和包含SEQ ID NO:19的序列的轻链；
(ii)MM是包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当所述缀合可活化抗体呈未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与人类CD71的结合；并且
(iii)CM是包含SEQ ID NO:156的序列的可裂解部分，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(b)其中“n”是2。
20.根据权利要求19所述的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
21.根据权利要求19或20所述的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中所述重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
22.一种缀合可活化抗体，所述抗体包含式(II)的结构或其盐：
Figure FDA0002465367660000071
其中MM-CM-AB是可活化抗体，其中所述AB是特异性结合到人类CD71的抗体，
其中所述可活化抗体包含有包含SEQ ID NO:167的序列的重链和包含SEQ ID NO:169的序列的轻链，并且
其中“n”是2。
23.根据权利要求22所述的缀合可活化抗体，其中所述AB包含IgG1同种型。
24.根据权利要求22或23所述的缀合可活化抗体，其中所述AB是具有重链恒定区的抗体，并且其中所述重链恒定区的C端残基不是赖氨酸。
25.一种制造缀合可活化抗体的方法，所述抗体包含式(I)的结构或其盐：
Figure FDA0002465367660000081
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含
i.重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO:10的CDRH2序列以及包含SEQ ID NO:11的CDRH3序列；和
ii.轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的CDRL1序列、包含SEQID NO:14的CDRL2序列以及包含SEQ ID NO:15的CDRL3序列；
(ii)MM是包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当所述缀合可活化抗体呈未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与人类CD71的结合；
(iii)LP1是包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列的第一键联部分；
(iv)CM是包含SEQ ID NO:156的序列的可裂解部分，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
(v)LP2是包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的第二键联部分；
并且其中“n”是2；
(b)所述方法包含
(i)用还原剂还原包含MM-LP1-CM-LP2-AB的可活化抗体；和
(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。
26.一种制造缀合可活化抗体的方法，所述抗体包含式(II)的结构或其盐：
Figure FDA0002465367660000091
(a)其中
(i)AB是抗体，其特异性结合到人类CD71并且包含
i.重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:9的CDRH1序列、包含SEQ ID NO:10的CDRH2序列以及包含SEQ ID NO:11的CDRH3序列；和
ii.轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的CDRL1序列、包含SEQID NO:14的CDRL2序列以及包含SEQ ID NO:15的CDRL3序列；
(ii)MM是包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的掩蔽部分，其中当所述缀合可活化抗体呈未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与人类CD71的结合；
(ii)CM是包含SEQ ID NO:156的序列的可裂解部分，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且
并且其中“n”是2；
(b)所述方法包含
(i)用还原剂还原包含MM-CM-AB的可活化抗体；和
(ii)将一个或多个vcMMAE与还原的可活化抗体缀合。
27.一种医药组合物，其包含：
根据权利要求1至24中任一项所述的缀合可活化抗体；和
任选地药学上可接受的载剂。
28.一种治疗个体的癌症、减轻个体的癌症症状或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包含针对癌症向有需要的个体施用治疗有效量的根据权利要求1至24中任一项所述的缀合可活化抗体或根据权利要求27所述的医药组合物，所述癌症选自由以下组成的组：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、ER+乳腺癌、三阴性乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部小细胞癌、胰腺癌、间皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肝细胞癌以及成胶质细胞瘤。
29.根据权利要求1至24中任一项所述的缀合可活化抗体或根据权利要求27所述的医药组合物，其用作药剂。
30.根据权利要求1至24中任一项所述的缀合可活化抗体或根据权利要求27所述的医药组合物，其用于治疗癌症，任选地其中所述癌症选自由以下组成的组：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、ER+乳腺癌、三阴性乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部小细胞癌、胰腺癌、间皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肝细胞癌以及成胶质细胞瘤。
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