TW201927815A - 抗－ｃｄ７１可活化之抗體藥物共軛物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明概括而言係有關以其活化形式結合CD71的共軛可活化之抗體及於各種治療、診斷與預防適應症中製造及使用此等抗-CD71共軛可活化之抗體之方法。

Description

抗－ＣＤ７１可活化之抗體藥物共軛物及其使用方法
本發明概括而言係有關以活化狀態結合CD71之可活化之抗體藥物共軛物(AADC)及於各種治療、診斷及預防適應症中製造及使用此等抗-CD71共軛可活化之抗體之方法。
抗體為主之療法已證明對數種疾病為有效治療，惟於若干情形下，由於廣泛標靶表現毒性已限制其治療效力。另外，抗體為主之治療已展現例如投予後從循環中迅速清除之其他限制。
於小分子治療領域中，已開發策略以提供活性化學實體之前藥。該等前藥係以相對無活性(或活性顯著較低)形式投予。一旦投予，前藥於活體內代謝成為活性化合物。該等前藥策略可為其預期目標提供增加之藥物選擇性及減少不利效果。
因此，於抗體為主之治療領域中對於模擬小分子前藥所欲特徵之抗體持續有所需求。
本揭露提供特異性結合CD71[亦已知為運鐵蛋白質受體蛋白質1(TfR1)]之共軛可活化之抗體。
於本發明之一態樣中，本文提供一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽：

其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；(iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分；(iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；及(b)其中“n”為2。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明之相關態樣中，本文提供一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽：其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；(iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分；(iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；及(b)其中“n”為2。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明之相關態樣中，本文提供一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽：其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之序列之輕鏈；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；(iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分；(iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；及(b)其中“n”為2。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明之相關態樣中，本文提供一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽：其中MM-LP1-CM-LP2-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體，其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：169之序列之輕鏈，以及其中“n”為2。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明之相關態樣中，本文提供一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽：其中MM-LP1-CM-LP2-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體，其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：170之序列之輕鏈其中“n”為2。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明之相關態樣中，本文提供一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽：

其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；以及(iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(b)其中“n”為2。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明之相關態樣中，本文提供一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；以及(iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(b)其中“n”為2。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明之相關態樣中，本文提供一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之序列之輕鏈；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；以及(iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(b)其中“n”為2。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明之相關態樣中，本文提供一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽其中MM-LP1-CM-LP2-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體，其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：169之序列之輕鏈，以及其中“n”為2。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明之相關態樣中，本文提供一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽其中MM-LP1-CM-LP2-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體，其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：170之序列之輕鏈，及其中“n”為2。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供製造包含式(I)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法，其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；(iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分；(iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；及(b)其中“n”為2；該方法包括(i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供製造包含式(I)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法，其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；(iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分；(iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；及(b)其中“n”為2；該方法包括(i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供製造包含式(I)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法，其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之序列之輕鏈；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；(iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分；(iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；及(b)其中“n”為2；該方法包括(i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供製造包含式(I)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法其中MM-LP1-CM-LP2-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體，其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：169之序列之輕鏈；及(b)其中“n”為2；該方法包括(i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供製造包含式(I)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法其中MM-LP1-CM-LP2-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體，其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：170之序列之輕鏈；及(b)其中“n”為2；該方法包括(i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供製造包含式(II)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法，其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；(iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(b)其中“n”為2；該方法包括(i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供製造包含式(II)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法，其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；(iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(b)其中“n”為2；該方法包括(i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供製造包含式(II)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法，其中(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之序列之輕鏈；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；(iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(b)其中“n”為2；該方法包括(i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供製造包含式(II)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法其中MM-LP1-CM-LP2-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體，其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：169之序列之輕鏈；及(b)其中“n”為2；該方法包括(i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供製造包含式(II)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法其中MM-LP1-CM-LP2-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體，其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：170之序列之輕鏈；及(b)其中“n”為2；該方法包括(i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供包含一重複(one iteration)式(I)或式(II)之共軛可活化之抗體之醫藥組成物。於若干具體實例中，醫藥組成物可包含醫藥上可接受之載劑。
於本發明另一態樣中，本文提供治療、減輕個體中癌症之症狀或延緩其進展之方法，該方法包括將治療有效量之式(I)或式(II)之共軛可活化之抗體或包含一重複式(I)或式(II)之共軛可活化之抗體及視需要之醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物投予有其需要之個體，所述癌症係選自由下列者所組成之群組：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小細胞肺癌、ER+乳癌、三重陰性乳癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、攝護腺癌、多發性骨髓瘤、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、頭頸部小細胞癌、胰臟癌、間皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肝細胞癌及神經膠母細胞瘤。
於本發明另一態樣中，本文提供共軛可活化之抗體，其包含(a)可活化之抗體(AA)，其於未切割狀態下包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB，其中(i) AB為特異性結合哺乳動物CD71之抗體且包含SEQ ID NO：5之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：7之輕鏈可變區序列；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，與該AB偶合之該MM抑制該AB與CD71之結合；(iii) CM為與該AB偶合之包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(b)單甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)，其中該可活化之抗體與兩個當量之MMAE共軛。於若干具體實例中，共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，該共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供具有式AA-(AG)p之共軛可活化之抗體，其中(a) AA為可活化之抗體，其於未切割狀態下包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB，其中(i) AB為特異性結合哺乳動物CD71之抗體且包含SEQ ID NO：5之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：7之輕鏈可變區序列；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，與該AB偶合之該MM抑制該AB與CD71之結合；(iii) CM為與該AB偶合之包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(b) AG為與該AA共軛劑，其中該製劑為MMAE且其中p為2。於若干具體實例中，該共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，該共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供一種製造共軛可活化之抗體之方法，該方法包括(a)使至少一個MMAE與可活化之抗體(AA)共軛從而產生包含AA-(MMAE)p之組成物，其中p為1至8；及(b)富有其中p為2之該共軛可活化之抗體類別(species)之組成物，其中呈未切割狀態之AA包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB其中AB為特異性結合哺乳動物CD71之抗體且包含SEQ ID NO：5之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：7之輕鏈可變區序列；(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，與該AB偶合之該MM抑制該AB與CD71之結合；(iii) CM為與該AB偶合之包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及(b) AG為與該AA共軛劑，其中該製劑為MMAE且其中p為2。於若干具體實例中，該共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，該共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於本發明另一態樣中，本文提供作為藥劑用之如本文揭示之任何共軛可活化之抗體或醫藥組成物。
於本發明另一態樣中，本文提供用於治療癌症之如本文揭示之任何共軛可活化之抗體或醫藥組成物，視需要地其中該癌症係選自由下列者所組成之群組：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小細胞肺癌、ER+乳癌、三重陰性乳癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、攝護腺癌、多發性骨髓瘤、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、頭頸部小細胞癌、胰臟癌、間皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肝細胞癌及神經膠母細胞瘤。
於本發明另一態樣中，本文提供套組包含如本文揭示之至少一種可活化之抗體之套組。該套組可進一步包含一或多個vcMMAE及/或還原劑。
本揭露提供抗-CD71共軛可活化之抗體，其於活化狀態下特異性結合CD71。CD71亦為所謂運鐵蛋白受體蛋白1(TfR1)。大體而言，本揭露係針對抗-CD71共軛可活化之抗體，其包含遮蔽部分、可切割部分、vc連接子及MMAE毒素。當該可活化之抗體呈未切割狀態時，遮蔽部分(MM)降低抗體結合部位結合其CD71標靶抗原之能力；可切割部分(CM)為蛋白酶可活化之基質，其於腫瘤微環境中被切割，導致遮蔽部分之移除並伴隨活化靶定CDR之抗-CD71。具體而言，本揭露敘述抗-CD71共軛之可活化之單株抗體之篩選，其比此項技藝中已知之其他抗-CD71共軛之可活化之單株抗體具有更優異之效力及耐受性，因其具有較低親和力之遮蔽部分、較少之可切割部分之基質及2的低藥物負載之獨特組合，此等共同導致於小鼠之腫瘤模式中顯著地增進效力及耐受性。另外，與含野生型IgG1 Fc之其他抗體不同，該抗-CD71共軛之可活化之單株抗體亦出人意外地缺少與抑制性FcγRIIb受體結合之能力，這是很重要的，因已知與此類受體之結合會抑制鈣依賴性程序，例如去顆粒作用、胞噬作用、抗體依賴型細胞傳介之細胞毒性(ADCC)、細胞介素釋放及促發炎之活化，若FcγRIIb受體被活化，則預期所有這些都將導致效力降低。
CD71為於分裂細胞(包括癌細胞)上表現之細胞表面受體。其於廣泛多種癌細胞類型中大量表現，且CD71被內在化，因此使其成為使用抗體定向之共軛毒素之標靶癌症療法之引人注目之標靶。鑑定具有較高及較低親和力之遮蔽部分(MM)以及具有較小或較大可切割性之可切割部分(CM)，並用於建構多種可活化之抗體，然後vcMMAE共軛之抗體(即可活化之抗體藥物共軛物或AADC)。於小鼠異種移植模式中，此等共軛可活化之抗體之例示性效力研究顯示，具有較高親和力遮蔽部分之AADC(例如CD71-TF01-3011-vcMMAE)比彼等具有較低親和力遮蔽物者(例如CD71-TF02.13-3011-vcMMAE)證實較低之效力。此外，使用具有相同較低親和力遮蔽物但不同可切割性基質之AADC之其他效力研究顯示，雖然效力相同，惟於非人類靈長類動物中，相較於具有更多可切割基質之AADC(CD71-TF02.13-3011-vcMMAE)，具較少可切割基質之AADC(CD71-TF02.13-2011-vcMMAE)有較佳耐受性及較低量呈活化形式之體液AADC，從而可提供較高之治療指數。進一步研究顯示，相較於較高DAR(即DAR~3)之相同共軛可活化之抗體，具有較低藥物對可活化之抗體比率之AADC(例如CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2，其中DAR為2)於較高劑量下具有更高耐受性。此外，CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2於人類癌症之多種CDX及PDX小鼠模式中，以劑量匹配劑量顯示與較高DAR之AADC相等效力。最後，CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2對其未遮蔽之對應物顯示顯著之耐受性，其未遮蔽之對應物即使於低劑量下也不具耐受性。
於若干具體實例中，共軛之可活化之單株抗體被含CD71之細胞內在化。“CD71”一詞之使用擬涵蓋其任何變異，例如，舉非限制性實例而言，CD-71及/或CD 71與所有變異於本文中互換使用。
CD71為跨膜醣蛋白，主要結合運鐵蛋白。CD71為細胞恆穩狀態所必需。CD71係經由配體傳介式胞吞作用連續再循環，其中主要配體為運鐵蛋白。亦已知CD71於分裂細胞上無所不在地表現。
CD71及CD71有關訊息傳遞之異常表現及/或活性涉及許多疾病及病症，例如癌症之發病機制。CD71於許多癌症中過度表現，包括實體及血液腫瘤二者。CD71擁有廣泛之細胞表面表現。惡性細胞中之CD71傳介細胞分裂所需之較高鐵攝取量。CD71亦與白血病之預後不良有關。由於其遍及多種癌症適應症，CD71為所欲之標靶。
本揭露提供共軛可活化之抗-CD71抗體，其於與異常CD71表現及/或活性關聯疾病或病症之治療、預防、延緩進展、改善及/或減輕症狀之方法中有用。舉例而言，該可活化之抗-CD71抗體可用於癌症或其他腫瘤狀況之治療、預防、延緩進展、改善及/或減輕症狀之方法中。
本揭露提供抗共軛可活化之抗-CD71抗體，其於與表現CD71細胞關聯疾病或病症之治療、預防、延緩進展、改善及/或減輕症狀之方法中有用。於若干具體實例中，細胞與異常CD71表現及/或活性關聯。於若干具體實例中，細胞與正常CD71表現及/或活性關聯。舉例而言，該可活化之抗-CD71抗體可用於癌症或其他腫瘤狀況之治療、預防、延緩進展、改善及/或減輕症狀之方法中。
本揭露提供共軛可活化之抗-CD71抗體，其於病變細胞表現CD71之疾病或病症之治療、預防、延緩進展、改善及/或減輕症狀之方法中有用。於若干具體實例中，病變細胞與異常CD71表現及/或活性關聯。於若干具體實例中，病變細胞與正常CD71表現及/或活性關聯。舉例而言，該可活化之抗-CD71抗體可用於癌症或其他腫瘤狀況之治療、預防、延緩進展、改善及/或減輕症狀之方法中。
共軛可活化之抗-CD71抗體包括特異性結合與遮蔽部分(MM)偶合之CD71之抗體或其抗原結合片段，俾使MM之偶合降低抗體或其抗原結合片段結合CD71之能力。於若干具體實例中，MM係經由含蛋白酶的基質之序列偶合，舉例而言，於個體之治療部位及CD71共位之蛋白酶。
本發明之例示性可活化之抗-CD71抗體包括，舉例而言，包含如或衍生自下文所示重鏈可變及輕鏈可變序列(CDR序列以粗體及下面劃線顯示)之重鏈及輕鏈之可活化之抗體：

本發明之例示性可活化之抗-CD71抗體包括，舉例而言，包含可變重鏈互補決定區1(VH CDR1，本文中亦稱為CDRH1)序列、可變重鏈互補決定區2(VH CDR2，本文中亦稱為CDRH2)序列、可變重鏈互補決定區3(VH CDR3，本文中亦稱為CDRH3)序列、可變輕鏈互補決定區1(VL CDR1，本文中亦稱為CDRL1)序列、可變輕鏈互補決定區2(VL CDR2，本文中亦稱為CDRL2)序列及可變輕鏈互補決定區3(VL CDR3，本文中亦稱為CDRL3)序列之組合之可活化之抗體，其中至少一個CDR序列係選自由包含胺基酸序列GYTFTSYWMH(SEQ ID NO：9)之VH CDR1序列、包含胺基酸序列AIYPGNSETG(SEQ ID NO：10)之VH CDR2序列、包含胺基酸序列ENWDPGFAF(SEQ ID NO：11)之VH CDR3序列、包含胺基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO：12)或CRASSSVYYMY(SEQ ID NO：13)之VL CDR1序列、包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：14)之VL CDR2序列及含胺基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO：15)之VL CDR3序列所組成之組群。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體的抗體或其抗原結合片段包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列及VL CDR3序列之組合，其中至少一個CDR序列係選自由包含與含胺基酸序列GYTFTSYWMH(SEQ ID NO：9)之VH CDR1序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VH CDR1序列、包含與含胺基酸序列AIYPGNSETG(SEQ ID NO：10)之VH CDR2序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VH CDR2序列、包含與含胺基酸序列ENWDPGFAF(SEQ ID NO：11)之VH CDR3序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VH CDR3序列、包含與含胺基酸序列ASSSVYYMY(SEQ ID NO：12)或CRASSSVYYMY(SEQ ID NO：13)之VL CDR1序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VL CDR1序列、包含與含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：14)之VL CDR2序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VL CDR2序列及包含與含胺基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO：15)之VL CDR3序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VL CDR3序列所組成之組群。
於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列及VL CDR3序列之組合，其中VH CDR1序列包含胺基酸序列GYTFTSYWMH(SEQ ID NO：9)；VH CDR2序列包含胺基酸序列AIYPGNSETG(SEQ ID NO：10)；VH CDR3序列包含胺基酸序列ENWDPGFAF(SEQ ID NO：11)；VL CDR1序列包含胺基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO：12)或CRASSSVYYMY(SEQ ID NO：13)；VL CDR2序列包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：14)及VL CDR3序列包含胺基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO：15)。
於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列及VL CDR3序列之組合，其中VH CDR1序列包含與胺基酸序列GYTFTSYWMH(SEQ ID NO：9)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列；VH CDR2序列包含與胺基酸序列AIYPGNSETG(SEQ ID NO：10)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列；VH CDR3序列包含與胺基酸序列ENWDPGFAF(SEQ ID NO：11)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列；VL CDR1序列包含與胺基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO：12)或CRASSSVYYMY(SEQ ID NO：13)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列；VL CDR2序列包含與胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：14)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列；及VL CDR3序列包含與胺基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO：15)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列。
於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體的抗體包括特異性結合CD71之抗體。於若干具體實例中，共軛可活化之抗體包括結合CD71之單株抗體。於若干具體實例中，此類結合CD71之單株抗體為擬人化或完全人類單株抗體。
於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段包含包括SEQ ID NO：5之重鏈可變區胺基酸序列。於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段，包含包括SEQ ID NO：7之輕鏈可變區胺基酸序列。於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段，包含包括SEQ ID NO：5之重鏈可變區胺基酸序列及包括SEQ ID NO：7之輕鏈可變區胺基酸序列或其抗原結合片段。
於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段包含與包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之重鏈可變區胺基酸序列。於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段，包含與包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之輕鏈可變區胺基酸序列。於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段，包含與包括SEQ ID NO：1和3-5之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之重鏈可變區胺基酸序列及與包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之輕鏈可變區胺基酸序列。
於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段係由包含編碼包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列之重鏈胺基酸序列之核酸序列之核酸序列所編碼。於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段係由包含編碼包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈胺基酸序列之核酸序列之核酸序列所編碼。於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段係由包含編碼包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列之重鏈胺基酸序列之核酸序列及由包含編碼包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈胺基酸序列之核酸序列之核酸序列所編碼。
於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段係由包含與編碼包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列之重鏈胺基酸序列之核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之核酸序列之核酸序列所編碼。於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段係由包含與編碼包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈胺基酸序列之核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之核酸序列之核酸序列所編碼。於若干具體實例中，本揭露共軛可活化之抗體之抗體或其抗原結合片段係由包含與編碼包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列之重鏈胺基酸序列之核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之核酸序列及與編碼含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈胺基酸序列之核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之核酸序列之核酸序列所編碼。
本揭露亦提供經由於導致可活化之抗體表現之條件下培養細胞以產生本揭露共軛可活化之抗體的可活化之抗體之方法，其中該細胞包含本揭露之核酸分子或本揭露之載體。
本揭露亦提供共軛可活化之抗體，其包括特異性結合與遮蔽部分(MM)偶合之CD71之抗體或其抗原結合片段，俾使MM之偶合降低抗體或其抗原結合片段結合CD71之能力。於若干具體實例中，MM係經由含蛋白酶基質之序列偶合，舉例而言，於病變組織中具活性之蛋白酶及/或於個體之治療部位與CD71共位之蛋白酶。本文所提供之共軛可活化之抗-CD71抗體，於本文中亦可互換地稱為抗-CD71共軛可活化之抗體或CD71共軛可活化之抗體，於循環中穩定，於擬治療及/或診斷之部位活化，惟於正常情況下則不，例如健康組織或非治療及/或診斷所靶定之其他組織，且當被活化時，展現至少與對應之未修飾抗體(本文中亦稱為親源抗體)可相較之與CD71之結合。
本發明亦提供使用結合CD71之共軛可活化之抗體治療、預防及/或延緩個體中與CD71之異常表現及/或活性關聯症狀之開始或進展或減輕之方法，特別是結合並中和或以其他方式抑制至少一種CD71及/或CD71傳介之訊息傳遞之生物活性的共軛可活化之抗體。
本發明亦提供使用結合CD71之共軛可活化之抗體治療、預防及/或延緩個體中與表現CD71或異常表現CD71細胞之存在、生長、增殖、轉移、及/或活性關聯症狀之開始或進展或減輕之方法，特別是結合、靶定、中和、殺死或以其他方式抑制至少一種表現CD71或異常表現CD71細胞之生物活性之可活化之抗體。
本發明亦提供使用結合CD71之共軛可活化之抗體治療、預防及/或延緩個體中與表現CD71細胞之存在、生長、增殖、轉移、及/或活性關聯症狀之開始或進展或減輕之方法，特別是結合、靶定、中和、殺死或以其他方式抑制至少一種表現CD71的細胞之生物活性之可活化之抗體。
本發明亦提供使用結合CD71之共軛可活化之抗體治療、預防及/或延緩個體中與異常表現CD71細胞之存在、生長、增殖、轉移、及/或活性關聯症狀之開始或進展或減輕之方法，特別是結合、靶定、中和、殺死或以其他方式抑制至少一種異常表現CD71的細胞之生物活性之共軛可活化之抗體。
呈活化狀態之共軛可活化之抗體結合CD71且包含(i)特異性結合CD71之抗體(AB)；(ii)當可活化之抗體係呈未切割狀態時，遮蔽部分(MM)抑制AB與CD71之結合；及(c)與AB偶合之可切割部分(CM)，其中CM為作用為蛋白酶基質之多肽。
於若干具體實例中，呈未切割狀態之共軛可活化之抗體，具有從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
於若干具體實例中，共軛可活化之抗體包含MM與CM間之連接肽。
於若干具體實例中，共軛可活化之抗體包含CM與AB間之連接肽。
於若干具體實例中，共軛可活化之抗體包含第一連接肽(LP1)及第二連接肽(LP2)，且其中呈未切割狀態之共軛可活化之抗體，具有從N端至C端之結構排列如下：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。於若干具體實例中，兩個連接肽不需要彼此相同。
於若干具體實例中，LP1或LP2至少有一個包含選自由(GS)n 、(GGS)n 、(GSGGS)n (SEQ ID NO：24)與(GGGS)n (SEQ ID NO：25)所組成組群之胺基酸序列，其中n為至少1之整數。
於若干具體實例中，LP1或LP2至少有一個包含選自由GGSG(SEQ ID NO：26)、GGSGG(SEQ ID NO：27)、GSGSG(SEQ ID NO：28)、GSGGG(SEQ ID NO：29)、GGGSG(SEQ ID NO：30)及GSSSG(SEQ ID NO：31)所組成組群之胺基酸序列。
於若干具體實例中，LP1包含胺基酸序列GGGSSGGS(SEQ ID NO：207)、GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO：32)、GSSGGSGGSGG(SEQ ID NO：33)、GSSGGSGGSGGS(SEQ ID NO：34)、GSSGGSGGSGGSGGGS(SEQ ID NO：35)、GSSGGSGGSG(SEQ ID NO：36)、GSSGGSGGSGS(SEQ ID NO：37)。
於若干具體實例中，LP2包含胺基酸序列GSS、GGS、GGGS(SEQ ID NO：38)、GSSGT(SEQ ID NO：39)或GSSG(SEQ ID NO：40)。
於若干具體實例中，關於與哺乳動物CD71結合，AB具有約100nM或更小之解離常數。於若干具體實例中，關於與哺乳動物CD71結合，AB具有約10nM或更小之解離常數。於若干具體實例中，關於與哺乳動物CD71結合，AB具有約5nM或更小之解離常數。於若干具體實例中，關於與哺乳動物CD71結合，AB具有約1nM或更小之解離常數。於若干具體實例中，關於與哺乳動物CD71結合，AB具有約0.5nM或更小之解離常數。於若干具體實例中，關於與哺乳動物CD71結合，AB具有約0.1nM或更小之解離常數。於若干具體實例中，關於與哺乳動物CD71結合，AB具有0.01nM至100nM、0.01nM至10nM、0.01nM至5nM、0.01nM至1nM、0.01至0.5nM、0.01nM至0.1nM、0.01nM至0.05nM、0.05nM至100nM、0.05nM至10nM、0.05nM至5nM、0.05nM至1nM、0.05至0.5nM、0.05nM至0.1nM、0.1nM至100nM、0.1nM至10nM、0.1nM至5nM、0.1nM至1nM、0.1至0.5nM、0.5nM至100nM、0.5nM至10nM、0.5nM至5nM、0.5nM至1nM、1nM至100nM、1nM至10nM、1nM至5nM、5nM至100nM、5nM至10nM或10nM至100nM之解離常數。
於若干具體實例中，呈未切割狀態之共軛可活化之抗體以小於或等於1nM、小於或等於5nM、小於或等於10nM、小於或等於15nM、小於或等於20nM、小於或等於25nM、小於或等於50nM、小於或等於100nM、小於或等於150nM、小於或等於250nM、小於或等於500nM、小於或等於750nM、小於或等於1000nM及/或小於或等於2000nM之解離常數與哺乳動物CD71特異性結合。
於若干具體實例中，呈未切割狀態之共軛可活化之抗體，以於1nM至2000nM、1nM至1000nM、1nM至750nM、1nM至500nM、1nM至250nM、1nM至150nM、1nM至100nM、1nM至50nM、1nM至25nM、1nM至15nM、1nM至10nM、1nM至5nM、5nM至2000nM、5nM至1000nM、5nM至750nM、5nM至500nM、5nM至250nM、5nM至150nM、5nM至100nM、5nM至50nM、5nM至25nM、5nM至15nM、5nM至10nM、10nM至2000nM、10nM至1000nM、10nM至750nM、10nM至500nM、10nM至250nM、10nM至150nM、10nM至100nM、10nM至50nM、10nM至25nM、10nM至15nM、15nM至2000nM、15nM至1000nM、15nM至750nM、15nM至500nM、15nM至250nM、15nM至150nM、15nM至100nM、15nM至50nM、15nM至25nM、25nM至2000nM、25nM至1000nM、25nM至750nM、25nM至500nM、25nM至250nM、25nM至150nM、25nM至100nM、25nM至50nM、50nM至2000nM、50nM至1000nM、50nM至750nM、50nM至500nM、50nM至250nM、50nM至150nM、50nM至100nM、100nM至2000nM、100nM至1000nM、100nM至750nM、100nM至500nM、100nM至250nM、100nM至150nM、150nM至2000nM、150nM至1000nM、150nM至750nM、150nM至500nM、150nM至250nM、250nM至2000nM、250nM至1000nM、250nM至750nM、250nM至500nM、500nM至2000nM、500nM至1000nM、500nM至750nM、500nM至500nM、500nM至250nM、500nM至150nM、500nM至100nM、500nM至50nM、750nM至2000nM、750nM至1000nM或1000nM至2000nM範圍內之解離常數與哺乳動物CD71特異性結合。
於若干具體實例中，呈活化狀態之共軛可活化之抗體以小於或等於0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM或10nM之解離常數與哺乳動物CD71特異性結合。
於若干具體實例中，呈活化狀態之共軛可活化之抗體，以於0.01nM至100nM、0.01nM至10nM、0.01nM至5nM、0.01nM至1nM、0.01至0.5nM、0.01nM至0.1nM、0.01nM至0.05nM、0.05nM至100nM、0.05nM至10nM、0.05nM至5nM、0.05nM至1nM、0.05至0.5nM、0.05nM至0.1nM、0.1nM至100nM、0.1nM至10nM、0.1nM至5nM、0.1nM至1nM、0.1至0.5nM、0.5nM至100nM、0.5nM至10nM、0.5nM至5nM、0.5nM至1nM、1nM至100nM、1nM至10nM、1nM至5nM、5nM至100nM、5nM至10nM或10nM至100nM範圍內之解離常數與哺乳動物CD71特異性結合。
於若干具體實例中，哺乳動物CD71係選自由人類CD71、鼠類CD71、大鼠CD71及馬來猴CD71所組成之組群。於若干具體實例中，AB以小於1nM之解離常數特異性結合人類CD71、鼠類CD71或馬來猴CD71。於若干具體實例中，哺乳動物CD71係人類CD71。
於若干具體實例中，AB具有一或多種下述之特性：(a) AB特異性結合人類CD71；及(b)AB特異性結合人類CD71與馬來猴CD71。
於若干具體實例中，AB具有一或多種下述之特性：(a) AB特異性結合人類CD71與馬來猴CD71；(b) AB抑制運鐵蛋白與哺乳動物CD71之結合；(c) AB抑制人類運鐵蛋白與人類CD71之結合；及(d) AB抑制馬來猴運鐵蛋白與馬來猴CD71之結合。
於若干具體實例中，AB以EC50 小於或等於5nM、小於或等於10nM、小於或等於50nM、小於或等於100nM、小於或等於500nM、及/或小於或等於1000nM阻斷天然配體與哺乳動物CD71結合之能力。於若干具體實例中，AB以EC50 小於或等於5nM、小於或等於10nM、小於或等於50nM、小於或等於100nM、小於或等於500nM、及/或小於或等於1000nM阻斷運鐵蛋白與哺乳動物CD71結合之能力。於若干具體實例中，CD71之天然配體係運鐵蛋白。
於若干具體實例中，AB以EC50 為5nM至1000nM、5nM至500nM、5nM至100nM、5nM至50nM、5nM至10nM、10nM至1000nM、10nM至500nM、10nM至100nM、10nM至50nM、50nM至1000nM、50nM至500nM、50nM至100nM、100nM至1000nM、100nM至500nM、500nM至1000nM阻斷天然配體與哺乳動物CD71結合之能力。於若干具體實例中，AB以EC50 為5nM至1000nM、5nM至500nM、5nM至100nM、5nM至50nM、5nM至10nM、10nM至1000nM、10nM至500nM、10nM至100nM、10nM至50nM、50nM至1000nM、50nM至500nM、50nM至100nM、100nM至1000nM、100nM至500nM、500nM至1000nM阻斷運鐵蛋白與哺乳動物CD71結合之能力。於若干具體實例中，CD71之天然配體係運鐵蛋白。
於若干具體實例中，本揭露之AB抑制或降低表現哺乳動物CD71細胞之生長、增殖、及/或轉移。不擬受任何理論束縛，本揭露之AB可經由與CD71之特異性結合和抑制、阻斷、及/或預防天然配體與哺乳動物CD71之結合，抑制或降低表現哺乳動物CD71細胞之生長、增殖、及/或轉移。於若干具體實例中，哺乳動物CD71之天然配體係運鐵蛋白。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之解離常數，其大於AB與CD71之解離常數。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之解離常數，其不超過AB與CD71之解離常數。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之解離常數，其小於AB與CD71之解離常數。
於若干具體實例中，MM對AB之解離常數(Kd )比AB對標靶之解離常數係不超過2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大，或介於1-5、5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍或更大之間。
於若干具體實例中，當可活化之抗體係呈切割狀態時，MM不干預或與AB競爭和CD71之結合。
於若干具體實例中，MM係長度為約2至40個胺基酸之多肽。於若干具體實例中，MM係長度為最多約40個胺基酸之多肽。
於若干具體實例中，MM多肽序列與CD71的不同。於若干具體實例中，MM多肽序列與AB之任何天然結合夥伴係不超過50%完全相同。於若干具體實例中，MM多肽序列與CD71的不同且與AB之任何天然結合夥伴係不超過 40%、30%、25%、20%、15%或10%完全相同。
於若干具體實例中，MM與AB之偶合降低AB與CD71結合之能力，俾使當與MM偶合之AB面對CD71時，其解離常數(Kd )係至少2倍大於當未與MM偶合面對CD71時之Kd 。
於若干具體實例中，MM與AB之偶合降低AB與CD71結合之能力，俾使當與MM偶合之AB面對CD71時，其解離常數(Kd )係至少5倍大於當未與MM偶合面對CD71時之Kd 。
於若干具體實例中，MM與AB之偶合降低AB與CD71結合之能力，俾使當與MM偶合之AB面對CD71時，其解離常數(Kd )係至少10倍大於當未與MM偶合面對CD71時之Kd 。
於若干具體實例中，MM與AB之偶合降低AB與CD71結合之能力，俾使當與MM偶合之AB面對CD71時，其解離常數(Kd )係至少20倍大於當未與MM偶合面對CD71時之Kd 。
於若干具體實例中，MM與AB之偶合降低AB與CD71結合之能力，俾使當與MM偶合之AB面對CD71時，其解離常數(Kd )係至少40倍大於當未與MM偶合面對CD71時之Kd 。
於若干具體實例中，MM與AB之偶合降低AB與CD71結合之能力，俾使當與MM偶合之AB面對CD71時，其解離常數(Kd )係至少100倍大於當未與MM偶合面對CD71時之Kd 。
於若干具體實例中，MM與AB之偶合降低AB與CD71結合之能力，俾使當與MM偶合之AB面對CD71時，其解離常數(Kd )係至少1000倍大於當未與MM偶合面對CD71時之Kd 。
於若干具體實例中，MM與AB之偶合降低AB與CD71結合之能力，俾使當與MM偶合之AB面對CD71時，其解離常數(Kd )係至少10,000倍大於當未與MM偶合面對CD71時之Kd 。
於若干具體實例中，於CD71存在之情況下，使用標靶位移分析法(例如，舉例而言於PCT公開案第 WO 2010/081173號中所述之分析，其全部內容特此併入以資參考)進行活體外分析，與CM被切割時比較，CM未被切割時，MM 降低AB與CD71結合至少90%之能力。
於若干具體實例中，MM包含選自由SEQ ID NO：16或18所組成組群之胺基酸序列。
於若干具體實例中，切割CM之蛋白酶於病變組織中具活性(例如向上調節或以其他方式不調節)，且當可活化之抗體暴露於蛋白酶時，該蛋白酶切割可活化之抗體中之CM。
於若干具體實例中，蛋白酶與組織中之CD71共位，且當可活化之抗體暴露於蛋白酶時，該蛋白酶切割共軛可活化之抗體中之CM。
於若干具體實例中，CM位於共軛可活化之抗體中之適當位置，俾使當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，係以比未修飾之AB與CD71結合之解離常數至少大2倍之解離常數，降低發生共軛可活化之抗體與CD71之結合，而呈切割狀態時(即，當共軛可活化之抗體呈切割狀態時)，則AB結合CD71。
於若干具體實例中，CM位於共軛可活化之抗體中之適當位置，俾使當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，係以比未修飾之AB與CD71結合之解離常數至少大5倍之解離常數，降低發生可活化之抗體與CD71之結合，而呈切割狀態時(即，當共軛可活化之抗體呈切割狀態時)，則AB結合CD71。
於若干具體實例中，CM位於共軛可活化之抗體中之適當位置，俾使當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，係以比未修飾之AB與CD71結合之解離常數至少大10倍之解離常數，降低發生可活化之抗體與CD71之結合，而呈切割狀態時(即，當共軛可活化之抗體呈切割狀態時)，則AB結合CD71。
於若干具體實例中，CM位於共軛可活化之抗體中之適當位置，俾使當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，係以比未修飾之AB與CD71結合之解離常數至少大20倍之解離常數，降低發生共軛可活化之抗體與CD71之結合，而呈切割狀態時(即，當共軛可活化之抗體呈切割狀態時)，則AB結合CD71。
於若干具體實例中，CM位於共軛可活化之抗體中之適當位置，俾使當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，係以比未修飾之AB與CD71結合之解離常數至少大40倍之解離常數，降低發生共軛可活化之抗體與CD71之結合，而呈切割狀態時，則AB結合CD71。
於若干具體實例中，CM位於共軛可活化之抗體中之適當位置，俾使當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，係以比未修飾之AB與CD71結合之解離常數至少大50倍之解離常數，降低發生共軛可活化之抗體與CD71之結合，而呈切割狀態時，則AB結合CD71。
於若干具體實例中，CM位於共軛可活化之抗體中之適當位置，俾使當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，係以比未修飾之AB與CD71結合之解離常數至少大100倍之解離常數，降低發生共軛可活化之抗體與CD71之結合，而呈切割狀態時，則AB結合CD71。
於若干具體實例中，CM位於共軛可活化之抗體中之適當位置，俾使當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，係以比未修飾之AB與CD71結合之解離常數至少大200倍之解離常數，降低發生共軛可活化之抗體與CD71之結合，而呈切割狀態時，則AB結合CD71。
於若干具體實例中，CM係長度最多15個胺基酸之多肽。
於若干具體實例中，CM為包含至少為一種基質金屬蛋白酶(MMP)之基質之第一可切割部分(CM1)與至少為一種絲胺酸蛋白酶(SP)之基質之第二可切割部分(CM2)之多肽。於若干具體實例中，CM1-CM2基質之CM1基質序列與CM2基質序列中之每一個係獨立地長度為最多15個胺基酸之多肽。
於若干具體實例中，CM為至少是一種於癌症中是或被認為是向上調節或以其他方式不調節之蛋白酶之基質。
於若干具體實例中，CM為至少是一種選自由基質金屬蛋白酶(MMP)、凝血酶、嗜中性白血球彈性蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、天門冬醯胺內肽酶、及絲胺酸蛋白酶[例如蛋白裂解酶(MT-SP1)與尿激酶(uPA)]所組成組群之蛋白酶之基質。不受理論束縛，人們認為此等蛋白酶至少於一種癌症中係向上調節或以其他方式不調節。
於若干具體實例中，選擇CM與特定蛋白酶一起使用，例如已知與可活化之抗體之標靶共位之蛋白酶。
於若干具體實例中，CM為至少是一種MMP之基質。於若干具體實例中，CM為選自包括MMP 9、MMP 14、MMP 1、MMP 3、MMP 13、MMP 17、MMP 11及MMP 19組群之蛋白酶之基質。於若干具體實例中，CM為MMP 9之基質。於若干具體實例中，CM為MMP 14之基質。
於若干具體實例中，CM為包含序列TGRGPSWV(SEQ ID NO：41)、SARGPSRW(SEQ ID NO：42)、TARGPSFK(SEQ ID NO：43)、LSGRSDNH(SEQ ID NO：44)、GGWHTGRN(SEQ ID NO：45)、HTGRSGAL(SEQ ID NO：46)、PLTGRSGG(SEQ ID NO：47)、AARGPAIH(SEQ ID NO：48)、RGPAFNPM(SEQ ID NO：49)、SSRGPAYL(SEQ ID NO：50)、RGPATPIM(SEQ ID NO：51)、RGPA(SEQ ID NO：52)、GGQPSGMWGW(SEQ ID NO：53)、FPRPLGITGL(SEQ ID NO：54)、VHMPLGFLGP(SEQ ID NO：55)、SPLTGRSG(SEQ ID NO：56)、SAGFSLPA(SEQ ID NO：57)、LAPLGLQRR(SEQ ID NO：58)、SGGPLGVR(SEQ ID NO：59)、PLGL(SEQ ID NO：60)、LSGRSGNH(SEQ ID NO：175)、SGRSANPRG(SEQ ID NO：176)、LSGRSDDH(SEQ ID NO：177)、LSGRSDIH(SEQ ID NO：178)、LSGRSDQH(SEQ ID NO：179)、LSGRSDTH(SEQ ID NO：180)、LSGRSDYH(SEQ ID NO：181)、LSGRSDNP(SEQ ID NO：182)、LSGRSANP(SEQ ID NO：183)、LSGRSANI(SEQ ID NO：184)、LSGRSDNI(SEQ ID NO：185)、MIAPVAYR(SEQ ID NO：186)、RPSPMWAY(SEQ ID NO：187)、WATPRPMR(SEQ ID NO：188)、FRLLDWQW(SEQ ID NO：189)、ISSGL(SEQ ID NO：190)、ISSGLLS(SEQ ID NO：191)、及/或ISSGLL(SEQ ID NO：192)之基質。
於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LSGRSDNH(SEQ ID NO：44)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列TGRGPSWV(SEQ ID NO：41)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列PLTGRSGG(SEQ ID NO：47)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列GGQPSGMWGW(SEQ ID NO：53)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列FPRPLGITGL(SEQ ID NO：54)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列VHMPLGFLGP(SEQ ID NO：55)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列PLGL(SEQ ID NO：60)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列SARGPSRW(SEQ ID NO：42)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列TARGPSFK(SEQ ID NO：43)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列GGWHTGRN(SEQ ID NO：45)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列HTGRSGAL(SEQ ID NO：46)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列AARGPAIH(SEQ ID NO：48)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列RGPAFNPM(SEQ ID NO：49)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列SSRGPAYL(SEQ ID NO：50)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列RGPATPIM(SEQ ID NO：51)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列RGPA(SEQ ID NO：52)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LSGRSGNH(SEQ ID NO：175)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列SGRSANPRG(SEQ ID NO：176)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LSGRSDDH(SEQ ID NO：177)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LSGRSDIH(SEQ ID NO：178)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LSGRSDQH(SEQ ID NO：179)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LSGRSDTH(SEQ ID NO：180)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LSGRSDYH(SEQ ID NO：181)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LSGRSDNP(SEQ ID NO：182)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LSGRSANP(SEQ ID NO：183)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LSGRSANI(SEQ ID NO：184)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LSGRSDNI(SEQ ID NO：185)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列MIAPVAYR(SEQ ID NO：186)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列RPSPMWAY(SEQ ID NO：187)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列WATPRPMR(SEQ ID NO：188)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列FRLLDWQW(SEQ ID NO：189)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列ISSGL(SEQ ID NO：190)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列ISSGLLS(SEQ ID NO：191)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列及/或ISSGLL(SEQ ID NO：192)。
於若干具體實例中，CM為MMP之基質且包含序列ISSGLSS(SEQ ID NO：61)；QNQALRMA(SEQ ID NO：62)；AQNLLGMV(SEQ ID NO：63)；STFPFGMF(SEQ ID NO：64)；PVGYTSSL(SEQ ID NO：65)；DWLYWPGI(SEQ ID NO：66)、ISSGLLSS(SEQ ID NO：67)、LKAAPRWA(SEQ ID NO：68)；GPSHLVLT(SEQ ID NO：69)；LPGGLSPW(SEQ ID NO：70)；MGLFSEAG(SEQ ID NO：71)；SPLPLRVP(SEQ ID NO：72)；RMHLRSLG(SEQ ID NO：73)；LAAPLGLL(SEQ ID NO：74)；AVGLLAPP(SEQ ID NO：75)；LLAPSHRA(SEQ ID NO：76)；及/或PAGLWLDP(SEQ ID NO：77)。
於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列ISSGLSS(SEQ ID NO：61)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列QNQALRMA(SEQ ID NO：62)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列AQNLLGMV(SEQ ID NO：63)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列STFPFGMF(SEQ ID NO：64)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列PVGYTSSL(SEQ ID NO：65)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列DWLYWPGI(SEQ ID NO：66)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列ISSGLLSS(SEQ ID NO：67)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LKAAPRWA(SEQ ID NO：68)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列GPSHLVLT(SEQ ID NO：69)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LPGGLSPW(SEQ ID NO：70)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列MGLFSEAG(SEQ ID NO：71)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列SPLPLRVP(SEQ ID NO：72)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列RMHLRSLG(SEQ ID NO：73)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LAAPLGLL(SEQ ID NO：74)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列AVGLLAPP(SEQ ID NO：75)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列LLAPSHRA(SEQ ID NO：76)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列PAGLWLDP(SEQ ID NO：77)。
於若干具體實例中，CM為凝血酶之基質。於若干具體實例中，CM為凝血酶之基質且包含序列GPRSFGL(SEQ ID NO：78)或GPRSFG(SEQ ID NO：79)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列GPRSFGL(SEQ ID NO：78)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列GPRSFG(SEQ ID NO：79)。
於若干具體實例中，CM包含選自由NTLSGRSENHSG(SEQ ID NO：80)；NTLSGRSGNHGS(SEQ ID NO：81)；TSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：82)；TSGRSANP(SEQ ID NO：83)；VAGRSMRP(SEQ ID NO：84)；VVPEGRRS(SEQ ID NO：85)；ILPRSPAF(SEQ ID NO：86)；MVLGRSLL(SEQ ID NO：87)；QGRAITFI(SEQ ID NO：88)；SPRSIMLA(SEQ ID NO：89)；與SMLRSMPL(SEQ ID NO：90)所組成組群之胺基酸序列。
於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列NTLSGRSENHSG(SEQ ID NO：80)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列NTLSGRSGNHGS(SEQ ID NO：81)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列TSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：82)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列TSGRSANP(SEQ ID NO：83)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列VAGRSMRP(SEQ ID NO：84)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列VVPEGRRS(SEQ ID NO：85)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列ILPRSPAF(SEQ ID NO：86)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列MVLGRSLL(SEQ ID NO：87)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列QGRAITFI(SEQ ID NO：88)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列SPRSIMLA(SEQ ID NO：89)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列SMLRSMPL(SEQ ID NO：90)。
於若干具體實例中，CM為嗜中性白血球彈性蛋白酶之基質。於若干具體實例中，CM為絲胺酸蛋白酶之基質。於若干具體實例中，CM為uPA之基質。於若干具體實例中，CM為天門冬醯胺內肽酶之基質。於若干具體實例中，CM為蛋白裂解酶之基質。於若干具體實例中，CM為半胱胺酸蛋白酶之基質。於若干具體實例中，CM為例如組織蛋白酶之半胱胺酸蛋白酶之基質。
於若干具體實例中，CM為CM1-CM2基質且包含序列ISSGLLSGRSDNH(SEQ ID NO：91)；ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：92)；AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：93)；TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：94)；VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：95)；TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：96)；AVGLLAPPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：97)；LSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：98)；VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：99)；LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：100)；LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO：101)；LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO：102)；ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：103)；LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：104)；QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：105)；LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：106)；QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：107)；ISSGLLSGRSGNH(SEQ ID NO：108)；ISSGLLSGRSANPRG(SEQ ID NO：148)；AVGLLAPPTSGRSANPRG(SEQ ID NO：149)；AVGLLAPPSGRSANPRG(SEQ ID NO：150)；ISSGLLSGRSDDH(SEQ ID NO：151)；ISSGLLSGRSDIH(SEQ ID NO：152)；ISSGLLSGRSDQH(SEQ ID NO：153)；ISSGLLSGRSDTH(SEQ ID NO：154)；ISSGLLSGRSDYH(SEQ ID NO：155)；ISSGLLSGRSDNP(SEQ ID NO：156)；ISSGLLSGRSANP(SEQ ID NO：157)；ISSGLLSGRSANI(SEQ ID NO：158)；AVGLLAPPGGLSGRSDDH(SEQ ID NO：159)；AVGLLAPPGGLSGRSDIH(SEQ ID NO：160)；AVGLLAPPGGLSGRSDQH(SEQ ID NO：161)；AVGLLAPPGGLSGRSDTH(SEQ ID NO：162)；AVGLLAPPGGLSGRSDYH(SEQ ID NO：163)；AVGLLAPPGGLSGRSDNP(SEQ ID NO：164)；AVGLLAPPGGLSGRSANP(SEQ ID NO：165)；AVGLLAPPGGLSGRSANI(SEQ ID NO：166)、ISSGLLSGRSDNI(SEQ ID NO：171)；AVGLLAPPGGLSGRSDNI(SEQ ID NO：172)；GLSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：193)；及/或GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：194)。
於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSDNH(SEQ ID NO：91)，其於本文中亦稱為基質2001。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：92)，其於本文中亦稱為基質1001/LP¢/0001，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列 AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：93)，其於本文中亦稱為基質2015及/或基質1004/LP¢/0003，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GG。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：94)，其於本文中亦稱為基質0003/LP¢/1004，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GG。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG
(SEQ ID NO：95)，其於本文中亦稱為基質1003/LP¢/0003，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GG。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：96)，其於本文中亦稱為基質0003/LP¢/1003，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GG。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：97)，其於本文中亦稱為基質3001及/或基質1004/LP¢/0001，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GG。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列LSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：98)，其於本文中亦稱為基質0001/LP¢/1004，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GG。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：99)，其於本文中亦稱為基質1003/LP¢/0001，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GG。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：100)，其於本文中亦稱為基質0001/LP¢/1003，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GG。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO：101)，其於本文中亦稱為基質0001/LP¢/1001，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO：102)，其於本文中亦稱為基質0002/LP¢/1001，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：103)，其於本文中亦稱為基質1001/LP¢/0002，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：104)，其於本文中亦稱為基質0001/LP¢/1002，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：105)，其於本文中亦稱為基質1002/LP¢/0001，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：106)，其於本文中亦稱為基質0002/LP¢/1002，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：107)，其於本文中亦稱為基質1002/LP¢/0002，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO：205)。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSGNH(SEQ ID NO：108)，其於本文中亦稱為基質2002。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSANPRG(SEQ ID NO：148)，其於本文中亦稱為基質2003。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPTSGRSANPRG(SEQ ID NO：149)，其於本文中亦稱為基質2004。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPSGRSANPRG(SEQ ID NO：150)，其於本文中亦稱為基質2005。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSDDH(SEQ ID NO：151)，其於本文中亦稱為基質2006。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSDIH(SEQ ID NO：152)，其於本文中亦稱為基質2007。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSDQH(SEQ ID NO：153)，其於本文中亦稱為基質2008。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSDTH(SEQ ID NO：154)，其於本文中亦稱為基質2009。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSDYH(SEQ ID NO：155)，其於本文中亦稱為基質2010。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSDNP(SEQ ID NO：156)，其於本文中亦稱為基質2011。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSANP(SEQ ID NO：157)，其於本文中亦稱為基質2012。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSANI(SEQ ID NO：158)，其於本文中亦稱為基質2013。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDDH
(SEQ ID NO：159)，其於本文中亦稱為基質3006。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDIH
(SEQ ID NO：160)，其於本文中亦稱為基質3007。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDQH
(SEQ ID NO：161)，其於本文中亦稱為基質3008。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDTH
(SEQ ID NO：162)，其於本文中亦稱為基質3009。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDYH
(SEQ ID NO：163)，其於本文中亦稱為基質3010。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDNP(SEQ ID NO：164)，其於本文中亦稱為基質3011。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPGGLSGRSANP(SEQ ID NO：165)，其於本文中亦稱為基質3012。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPGGLSGRSANI(SEQ ID NO：166)，其於本文中亦稱為基質3013。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列ISSGLLSGRSDNI(SEQ ID NO：171)，其於本文中亦稱為基質2014。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDNI(SEQ ID NO：172)，其於本文中亦稱為基質3014。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列GLSGRSDNHGGAVGLLAPP
(SEQ ID NO：193)，其於本文中亦稱為基質0001/LP¢/1004，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GG。於若干具體實例中，CM1-CM2基質包含序列GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：194)，其於本文中亦稱為基質0001/LP¢/1003，其中於此CM1-CM2基質中所使用之LP¢為胺基酸序列GG。
於若干具體實例中，CM為至少是兩種蛋白酶之基質。於若干具體實例中，CM為至少是兩種選自由MMP、凝血酶、嗜中性白血球彈性蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、uPA、天門冬醯胺內肽酶與蛋白裂解酶所組成組群之蛋白酶之基質。
於若干具體實例中，共軛可活化之抗體至少包含第一CM及第二CM。於若干具體實例中，第一CM及第二CM各為長度不超過15個胺基酸之多肽。於若干具體實例中，呈未切割狀態之共軛可活化之抗體中之第一CM及第二CM具有從N端至C端如下之結構排列：MM-CM1-CM2-AB或AB-CM2-CM1-MM。於若干具體實例中，第一CM及第二CM中至少有一種係具有作為選自由MMP、凝血酶、嗜中性白血球彈性蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、uPA、天門冬醯胺內肽酶及蛋白裂解酶組群之蛋白酶之基質之功能之多肽。於若干具體實例中，第一CM係被標靶組織中選自由MMP、凝血酶、嗜中性白血球彈性蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、uPA、天門冬醯胺內肽酶及蛋白裂解酶所組成組群之第一切割劑切割及第二CM係被標靶組織中之第二切割劑切割。於若干具體實例中，另一種蛋白酶係選自由彼等於表(I)中所示所組成之組群。於若干具體實例中，第一切割劑及第二切割劑為選自由MMP、凝血酶、嗜中性白血球彈性蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、uPA、天門冬醯胺內肽酶及蛋白裂解酶所組成組群之相同蛋白酶，及第一CM及第二CM為該酵素之不同基質。於若干具體實例中，第一切割劑及第二切割劑為選自由彼等於表(I)中所示所組成組群之相同蛋白酶。於若干具體實例中，第一切割劑及第二切割劑為不同蛋白酶。於若干具體實例中，第一切割劑及第二切割劑係共位於標靶組織中。於若干具體實例中，第一CM及第二CM被標靶組織中之至少一種切割劑切割。
於若干具體實例中，共軛可活化之抗體係暴露於被其切割之蛋白酶，俾使共軛之活化抗體，於蛋白酶切割CM後之活化或切割狀態下，包含包括至少一部分LP2及/或CM序列之輕鏈胺基酸序列。
於若干具體實例中，該可活化之抗體係與一或多個當量之劑共軛。於若干具體實例中，該可活化之抗體係與一個當量之劑共軛。於若干具體實例中，該可活化之抗體係與二、三或四個當量之劑共軛。於若干具體實例中，該可活化之抗體係具有同質數(homogeneous number)當量共軛劑之可活化之抗體之混合物之一部分。於若干具體實例中，該可活化之抗體係具有異質數(heterogeneous number)當量共軛劑之可活化之抗體之混合物之一部分。於若干具體實例中，該可活化之抗體之混合物係使與各個可活化之抗體共軛之劑之平均數介於0至1個間、介於1至2個間、介於2與3個間或介於3與4個間。於若干具體實例中，該可活化之抗體之混合物係使與各個可活化之抗體共軛之劑之平均數為1個、2個、3個或4個。
於若干具體實例中，該可活化之抗體包含一或多個位點特異性胺基酸序列之修飾，俾使離胺酸及/或半胱胺酸殘基之數量相對於可活化之抗體之原始胺基酸序列為增加或減少，因此於若干具體實例中，相應地增加或減少可與可活化之抗體共軛之劑之數量，或於若干具體實例中以位點特異性方式限制劑與可活化之抗體之共軛。於若干具體實例中，修飾之可活化之抗體係用一或多個非天然胺基酸以位點特異性方式進行修飾，因此於若干具體實例中，限制劑僅與非天然胺基酸之位點共軛。
本文所揭示之共軛可活化之抗體可包含各種化學計量莫耳比之藥物分子與抗體部分，此取決於抗體之組態及至少部分取決於用於產生共軛之方法。
“藥物負載”一詞係指個別共軛可活化之抗體中每個抗體之藥物分子之莫耳比。於特定具體實例中，藥物負載可包含1至4個藥物分子、2至4個藥物分子、1至3個藥物分子、2至3個藥物分子或1至2個藥物分子。於特定具體實例中，藥物負載可包含1個藥物分子、2個藥物分子、3個藥物分子或4個藥物分子。
就本發明之目的而言，熟習此項技藝者將理解，“藥物負載”與“藥物對抗體比”(亦稱為DAR)不同。DAR係指於至少兩種共軛可活化之抗體分子之族群中每個抗體之藥物分子之平均莫耳比，而藥物負載則係指於個別共軛可活化之抗體分子中每個抗體之藥物分子之莫耳比。藥物負載主要與共軛可活化之抗體之建構與設計相關，而DAR則主要與將投予患者之治療用共軛可活化之抗體之醫藥組成物相關。
於若干具體實例中，本發明之可活化之抗體可共軛以產生具有狹窄DAR分佈之共軛可活化之抗體之相當同質製劑。於若干具體實例中，共軛可活化之抗體製劑就其DAR分佈而言可為大體上同質，意指於製劑內為具有特定DAR(例如DAR為2及/或4)之位點特異性ADC之優勢類。於若干具體實例中，大體上是同質之共軛可活化之抗體製劑就負載位點而言亦可為相同(即於游離半胱胺酸上)。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之DAR為約2及/或4。於此場合中，“約”一詞應被解釋為意指含大於80%之具有DAR等於2與4及大約相等分佈(例如各大於40%)之兩種主要類別之聚集體，及由其他DAR類別構成之其餘共軛可活化之抗體製劑。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之DAR將濃化至約2。於此場合中，“約”一詞應被解釋為意指含大於約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% ± 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9%之共軛可活化之抗體製劑。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之DAR將濃化至約2，“約”一詞被解釋為意指含大於約94%± 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9%之共軛可活化之抗體製劑。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之DAR將濃化至約2，“約”一詞被解釋為意指含大於約95%± 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9%之共軛可活化之抗體製劑。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之DAR將濃化至約2，“約”一詞被解釋為意指含大於約96%± 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9%之共軛可活化之抗體製劑。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之DAR將濃化至約2，“約”一詞被解釋為意指含大於約97%± 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9%之共軛可活化之抗體製劑。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之DAR將濃化至約2，“約”一詞被解釋為意指含大於約98%± 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9%之共軛可活化之抗體製劑。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之DAR將濃化至約2，“約”一詞被解釋為意指含大於約99%± 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9%之共軛可活化之抗體製劑。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之DAR為約2及/或4。於此場合中，“約”一詞應被解釋為意指含大於80%之具有DAR等於2與4及大約相等分佈(例如各大於40%)之兩種主要類別之聚集體，及由其他DAR類別構成之其餘共軛可活化之抗體製劑。
於若干具體實例中，可經由使用位點特異性之可活化之抗體及/或選擇性還原與共軛達成所欲之同質性。於若干具體實例中，可經由使用位點特異性構築體與選擇性還原之組合達成所欲之同質性。於若干具體實例中，製劑可進一步純化，例如經由使用分析或製備級層析法技術。於此等具體實例中，共軛可活化之抗體製劑之同質性可使用各種此項技藝中已知之技術分析，包括惟不限於質譜測定法、HPLC(例如粒徑排阻HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛細管電泳。
關於共軛可活化之抗體製劑之純化，應理解的是可使用標準藥劑製備方法以得到所欲之純度。如本文所討論之液相層析法，例如逆相(RP)與疏水作用層析法(HIC)，可經由藥物負載值分離混合物中之化合物。於若干情況下，亦可使用離子交換(IEC)或混合模式層析法(MMC)以單離具有特定藥物負載之類別。
於若干具體實例中，具有既定DAR和相對高程度之藥物負載同質性之本揭露之共軛可活化之抗體製劑實際上可包含具有藥物負載範圍或分佈之共軛物之混合物，惟其中在混合物中藥物負載之分佈集中於平均DAR值附近(或具有其加權平均值)。因此，於若干具體實例中，共軛可活化之抗體製劑將包括共軛物之混合物，其中混合物之平均DAR為約1、2或3，各自+/-0.5。應理解的是，於特定較佳具體實例中，範圍或偏差可小於0.4。 因此，於其他具體實例中，組成物將包括平均DAR為1、2或3，各自+/- 0.3。
於若干具體實例中，源自共軛反應之共軛可活化之抗體製劑中每個抗體之藥物分佈可經由習知之方法描繪其特性，例如UV-Vis分光光度測定法、逆相HPLC、HIC、質譜分析、ELISA及電泳。
於若干具體實例中，包含具有不同藥物負載共軛物之混合物之本揭露之共軛可活化之抗體之混合物，可純化或濃化為一或多個類別之具有特定藥物負載之共軛物。舉例而言，包含具有藥物負載為0、2、4、6及8之AADC之混合物之共軛可活化之抗體混合物，可濃化或純化為具有藥物負載為2之共軛可活化之抗體。於若干具體實例中，可純化或濃化混合物為僅具有藥物負載為4之共軛可活化之抗體之類別。於若干具體實例中，可純化或濃化混合物為僅具有藥物負載為2與4之共軛可活化之抗體之類別。本文所用之具有相當同質製劑類別之具有藥物負載為2共軛物類別之製劑或純化或共軛可活化之抗體稱為“E2”，其具有約2之DAR。本文所用之具有相當同質製劑之具有藥物負載為4共軛物類別之製劑或純化或共軛可活化之抗體稱為“E4”。本文所用之具有藥物負載為2或4之共軛物類別混合物之製劑或純化或共軛可活化之抗體稱為“DE”(濃化DAR)，具有大約3之DAR。於此場合中，“約”一詞被解釋為意指處方量之+/- 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體可由下式表示：
AA-(AG)p
其中AA為可活化之抗體，其呈未切割狀態時具有從N端至C端為MM-CM-AB之結構排列。AB為特異性結合哺乳動物CD71之抗體並包含序列SEQ ID NO：5之重鏈可變區與序列SEQ ID NO：7之輕鏈可變區。MM為遮蔽部分，其包含序列SEQ ID NO：18，且當AA係呈未切割狀態時MM與AB偶合，因此抑制AB與CD71之結合。CM為可切割部分，其包含序列SEQ ID NO：156，CM係與AB偶合且CM為具有作為蛋白酶基質功能之多肽。AG為與AA共軛之製劑，其中AA-(AG)p 。於若干具體實例中，p為0、1、2、3、4、5、6、7或8。於若干具體實例中，本揭露之組成物包含本揭露之共軛可活化之抗體之混合物，其中各個共軛可活化之抗體由式AA-(AG)p 表示，其中p為0至8之整數。於若干具體實例中，組成物包含本揭露之共軛可活化之抗體之混合物，其中至少 50%、至少 75%、至少 85%、至少 90%、至少 95%或至少 98%之類別為共軛可活化之抗體，其中p為2。
於若干具體實例中，為具有特定藥物負載共軛物之既定種類純化或濃化之共軛可活化之抗體製劑，至少包含既定藥物負載種類之一定百分比。舉例而言，於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含至少50%之製劑為具有藥物負載為2之共軛可活化之抗體。於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含至少75%具有藥物負載為2之共軛可活化之抗體。於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含至少85%具有藥物負載為2之共軛可活化之抗體。於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含至少90%具有藥物負載為2之共軛可活化之抗體。於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含至少95%具有藥物負載為2之共軛可活化之抗體。於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含至少98%具有藥物負載為2之共軛可活化之抗體。
於若干具體實例中，為既定藥物負載種類純化或濃化之共軛可活化之抗體製劑，包含既定藥物負載種類之莫耳當量大於所有其他藥物負載種類相加之總莫耳當量。舉例而言，於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑為使藥物負載非2組成物之各個共軛可活化之抗體種類之相加當量小於藥物負載為2之共軛可活化之抗體之當量。於若干具體實例中，E4共軛可活化之抗體之製劑為使藥物負載非4組成物之各個共軛可活化之抗體種類之相加當量小於藥物負載為4之共軛可活化之抗體之當量。於若干具體實例中，DE共軛可活化之抗體之製劑為使藥物負載非2或4組成物之各個共軛可活化之抗體種類之相加當量小於具有藥物負載為2或4之共軛可活化之抗體之當量。
於若干具體實例中，為既定之DAR類別(例如本文所討論之E2或E4)純化或濃化之共軛可活化之抗體製劑，包含小於一定百分比之非既定藥物負載種類之共軛可活化之抗體。舉例而言，於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含藥物負載不為2之類別小於50%之共軛可活化之抗體。舉例而言，於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含藥物負載不為2之類別小於25%之共軛可活化之抗體。舉例而言，於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含藥物負載不為2之類別小於15%之共軛可活化之抗體。舉例而言，於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含藥物負載不為2之類別小於10%之共軛可活化之抗體。舉例而言，於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含藥物負載不為2之類別小於5%之共軛可活化之抗體。舉例而言，於若干具體實例中，E2共軛可活化之抗體之製劑包含藥物負載不為2之類別小於2%之共軛可活化之抗體。於若干其他具體實例中，富含，或純化製劑(例如E4或DE)可於該富含或純化之共軛可活化之抗體之組成物中具有小於50%、小於25%、小於15%、小於10%、小於5%或小於2%之不為藥物負載類別。
於若干具體實例中，劑為消炎劑。
於若干具體實例中，共軛可活化之抗體亦包含可檢測部分。於若干具體實例中，可檢測部分為診斷劑。
於若干具體實例中，共軛可活化之抗體亦包含訊息肽。於若干具體實例中，訊息肽係經由間隔子與可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，間隔子於不存在訊息肽之情況下與可活化之抗體共軛。於若干具體實例中，間隔子直接連結至可活化之抗體之MM。於若干具體實例中，間隔子以從N端至C端為間隔子-MM-CM-AB之結構排列，直接連結至可活化之抗體之MM。直接連結至可活化之抗體之MM之N端之間隔子之實例為QGQSGQ(SEQ ID NO：109)。其他直接連結至可活化之抗體之MM之N端之間隔子之實例，包括QGQSGQG(SEQ ID NO：138)、QGQSG(SEQ ID NO：139)、QGQS(SEQ ID NO：140)、QGQ、QG及Q。其他直接連結至可活化之抗體之MM之N端之間隔子之實例，包括GQSGQG(SEQ ID NO：143)、QSGQG(SEQ ID NO：144)、SGQG(SEQ ID NO：145)、GQG及G。於若干具體實例中，無間隔子連結至MM之N端。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO：109)。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列QGQSGQG(SEQ ID NO：138)。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列QGQSG(SEQ ID NO：139)。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列QGQS(SEQ ID NO：140)。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列QGQ。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列QG。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列Q。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列GQSGQG(SEQ ID NO：143)。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列QSGQG(SEQ ID NO：144)。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列SGQG(SEQ ID NO：145)。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列GQG。於若干具體實例中，間隔子至少包括胺基酸序列G。於若干具體實例中，間隔子係不存在。
於若干具體實例中，共軛可活化之抗體之AB天然地包含一或多個雙硫鍵。於若干具體實例中，AB可經工程處理以包含一或多個雙硫鍵。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之可活化之抗體係由核酸序列所編碼，其包含編碼選自由SEQ ID NO：5所組成組群之重鏈可變區胺基酸序列之核酸序列。於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之可活化之抗體係由核酸序列所編碼，其包含編碼選自包括SEQ ID NO：7組群之輕鏈可變區胺基酸序列之核酸序列。於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之可活化之抗體係由核酸序列所編碼，其包含編碼選自由SEQ ID NO：5所組成組群之重鏈可變區胺基酸序列及編碼選自包括SEQ ID NO：7所組成組群之輕鏈可變區胺基酸序列之核酸序列。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之可活化之抗體係由核酸序列所編碼，其包含與編碼選自由SEQ ID NO：5所組成組群之重鏈可變區胺基酸序列之核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之核酸序列。於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之可活化之抗體係由核酸序列所編碼，其包含與編碼選自由SEQ ID NO：7所組成組群之輕鏈可變區胺基酸序列之核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之核酸序列。於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體之可活化之抗體係由核酸序列所編碼，其包含與編碼選自由SEQ ID NO：5所組成組群之重鏈可變區胺基酸序列之核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之核酸序列及與編碼選自由SEQ ID NO：7所組成組群之輕鏈可變區胺基酸序列之核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之核酸序列。
本揭露亦提供經由在導致可活化之抗體表現之條件下培養細胞以生產本揭露可活化之抗體之方法，其中該細胞包含本揭露之核酸分子或本揭露之載體。
本揭露亦提供製造於活化狀態下結合CD71之可活化之抗體之方法，該方法包括：(a)培養包含核酸構築體之細胞，其在導致可活化之抗體表現之條件下編碼可活化之抗體，其中可活化之抗體包含本揭露之可活化之抗體；及(b)回收該可活化之抗體。
於若干具體實例中，共軛可活化之抗體之血清半衰期較對應抗體長；例如，共軛可活化之抗體之pK較對應抗體長。於若干具體實例中，共軛可活化之抗體之血清半衰期與對應抗體類似。於若干具體實例中，當投予至生物體時，共軛可活化之抗體之血清半衰期為至少15天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，共軛可活化之抗體之血清半衰期為至少12天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，共軛可活化之抗體之血清半衰期為至少11天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，共軛可活化之抗體之血清半衰期為至少10天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，共軛可活化之抗體之血清半衰期為至少9天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，共軛可活化之抗體之血清半衰期為至少8天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，共軛可活化之抗體之血清半衰期為至少7天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少6天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少5天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少4天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少3天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少2天。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少24小時。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少20小時。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少18小時。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少16小時。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少14小時。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少12小時。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少10小時。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少8小時。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少6小時。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少4小時。於若干具體實例中，當投予至生物體時，可活化之抗體之血清半衰期為至少3小時。
本揭露亦提供經由在導致多肽表現之條件下培養細胞以生產抗-CD71抗體及/或可活化之抗-CD71抗體多肽之方法，其中該細胞包含編碼本文所述抗體及/或可活化之抗體之單離核酸分子及/或包含此等單離核酸序列之載體。本揭露提供經由在導致抗體及/或可活化之抗體表現之條件下培養細胞以生產抗體及/或可活化之抗體之方法，其中該細胞包含編碼本文所述抗體及/或可活化之抗體之單離核酸分子及/或包含此等單離核酸序列之載體。
本發明提供經由投予有其需要個體治療有效量之本文所述共軛可活化之抗-CD71抗體，預防、延緩進展、治療、減輕症狀或以其他方式改善個體中CD71所傳介疾病之方法。
本發明亦提供經由投予有其需要個體治療有效量之本文所述共軛可活化之抗-CD71抗體，預防、延緩進展、治療、減輕症狀或以其他方式改善個體中癌症之方法。已知CD71於多種癌症上表現，例如，舉而言，腺癌、膽管(膽道)癌、膀胱癌、乳癌(例如三重陰性乳癌與Her2陰性乳癌)、類癌、子宮頸癌、膽管癌(cholangiocarcinoma)、結腸直腸癌(colorectal)、子宮內膜癌(endometrial)、神經膠質瘤、頭頸癌(例如頭頸部鱗狀細胞癌)、白血病、肝癌、肺癌(例如NSCLC、SCLC)、淋巴瘤、黑色素瘤、口咽癌、卵巢癌、胰臟癌、攝護腺癌(例如轉移性去勢抗性攝護腺癌)、腎癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌及尿路上皮癌。
於若干具體實例中，癌症係與表現CD71之腫瘤相關。於若干具體實例中，癌症係由於表現CD71之腫瘤。
於此等方法與用途之任何具體實例中，所使用之共軛可活化之抗-CD71抗體可於疾病之任何階段投予。舉例而言，此類共軛可活化之抗-CD71抗體可投予罹患任何階段從早期至轉移之癌症患者。於本文中，個體與患者等詞互換使用。
於若干具體實例中，個體為哺乳動物，例如人類或非人類靈長類動物。
將共軛可活化之抗-CD71抗體與其治療調配物，投予罹患或易患與異常CD71表現及/或活性相關疾病或病症之個體。罹患或易患與異常CD71表現及/或活性相關疾病或病症之個體，係使用任一此項技藝中已知之多種方法鑑定。舉例而言，罹患癌症或其他腫瘤性症狀之個體，係使用任何多種臨床及/或實驗室測試(例如，身體檢查與血液、尿液及/或糞便分析)鑑定，以評估健康狀況。舉例而言，罹患炎症及/或發炎性病症之個體，係使用任何多種臨床及/或實驗室測試[例如，身體檢查及/或體液分析(例如血液、尿液及/或糞便分析)]鑑定，以評估健康狀況。
若達到任何多種實驗室或臨床之目標，則認為對罹患與異常CD71表現及/或活性相關疾病或病症之患者，投予共軛可活化之抗-CD71抗體為成功。舉例而言，若與疾病或病症相關之一或多種症狀係減輕、降低、抑制或不進展至進一步，即，更壞狀況，則認為對罹患與異常CD71表現及/或活性相關疾病或病症之患者，投予共軛可活化之抗-CD71抗體為成功。若疾病或病症進入緩解或不進展至進一步，即，更壞狀況，則認為對罹患與異常CD71表現及/或活性相關疾病或病症之患者，投予共軛可活化之抗-CD71抗體為成功。
於若干具體實例中，將共軛可活化之抗-CD71抗體與其治療調配物，投予罹患或易患疾病或病症之個體，例如罹患癌症或其他腫瘤性症狀之個體，其中個體之病變細胞表現CD71。於若干具體實例中，病變細胞與異常CD71表現及/或活性相關。於若干具體實例中，病變細胞與正常CD71表現及/或活性相關。使用任一此項技藝中已知之多種方法鑑定罹患或易患疾病或病症之個體，其中個體之病變細胞表現CD71。舉例而言，罹患癌症或其他腫瘤性症狀之個體，係使用任何多種臨床及/或實驗室測試(例如，身體檢查與血液、尿液及/或糞便分析)鑑定，以評估健康狀況。舉例而言，罹患炎症及/或發炎性病症之個體，係使用任何多種臨床及/或實驗室測試[例如，身體檢查及/或體液分析(例如血液、尿液及/或糞便分析)]鑑定，以評估健康狀況。
於若干具體實例中，將共軛可活化之抗-CD71抗體與其治療調配物，投予罹患或易患與表現CD71細胞或此類細胞之存在、生長、增殖、轉移、及/或活性相關疾病或病症之個體，例如罹患癌症或其他腫瘤性症狀之個體。於若干具體實例中，細胞與異常CD71表現及/或活性相關。於若干具體實例中，細胞與正常CD71表現及/或活性相關。使用任一此項技藝中已知之多種方法鑑定罹患或易患與表現CD71細胞相關疾病或病症之個體。舉例而言，罹患癌症或其他腫瘤性症狀之個體，係使用任何多種臨床及/或實驗室測試(例如，身體檢查與血液、尿液及/或糞便分析)鑑定，以評估健康狀況。舉例而言，罹患炎症及/或發炎性病症之個體，係使用任何多種臨床及/或實驗室測試[例如，身體檢查及/或體液分析(例如血液、尿液及/或糞便分析)]鑑定，以評估健康狀況。
若達到任何多種實驗室或臨床之目標，則認為對罹患與表現CD71細胞相關疾病或病症之患者，投予共軛可活化之抗-CD71抗體為成功。舉例而言，若與疾病或病症相關之一或多種症狀係減輕、降低、抑制或不進展至進一步，即，更壞狀況，則認為對罹患與表現CD71細胞相關疾病或病症之患者，投予共軛可活化之抗-CD71抗體為成功。若疾病或病症進入緩解或不進展至進一步，即，更壞狀況，則認為對罹患與表現CD71細胞相關疾病或病症之患者，投予共軛可活化之抗-CD71抗體為成功。
本揭露亦提供病變細胞表現CD71之病症或疾病之治療、減輕症狀或延緩進展之方法，其包括投予有其需要個體治療有效量之本揭露之共軛之抗體或包含本揭露抗體之醫藥組成物或包含本揭露共軛之抗體之醫藥組成物。於若干具體實例中，該病症或疾病係癌症。
本揭露亦提供與表現CD71細胞相關病症或疾病之治療、減輕症狀或延緩進展之方法，其包括投予有其需要個體治療有效量之本揭露之共軛之抗體或包含本揭露共軛之抗體之醫藥組成物。於若干具體實例中，與表現CD71細胞相關之病症或疾病係癌症。於若干具體實例中，癌症係腺癌、膽管(膽道)癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、三重陰性乳癌、Her2陰性乳癌、類癌、子宮頸癌、膽管癌(cholangiocarcinoma)、結腸直腸癌、結腸癌、子宮內膜癌、神經膠質瘤、頭頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、白血病、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、口咽癌、卵巢癌、胰臟癌、攝護腺癌、轉移性去勢抗性攝護腺癌、腎癌、肉瘤、皮膚癌、鱗狀細胞癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、泌尿生殖器癌或尿路上皮癌。於若干具體實例中，天然配體係運鐵蛋白。於若干具體實例中，哺乳動物CD71之表現及/或活性係異常。於若干具體實例中，該方法包括投予額外之劑。於若干具體實例中，額外之劑係治療劑。
本揭露亦提供抑制或降低表現哺乳動物 CD71細胞生長、增殖或轉移之方法，其包括投予有其需要個體治療有效量之本揭露抗體或本揭露之共軛之抗體或包含本揭露抗體之醫藥組成物或包含本揭露共軛之抗體之醫藥組成物。於若干具體實例中，天然配體係運鐵蛋白。於若干具體實例中，哺乳動物CD71之表現及/或活性係異常。於若干具體實例中，該方法包括投予額外之劑。於若干具體實例中，額外之劑係治療劑。
本揭露亦提供抑制、阻斷或預防天然配體與哺乳動物CD71結合之方法，其包括投予有其需要個體治療有效量之本揭露抗體或本揭露之共軛之抗體或包含本揭露抗體之醫藥組成物或包含本揭露共軛之抗體之醫藥組成物。於若干具體實例中，天然配體係運鐵蛋白。於若干具體實例中，哺乳動物CD71之表現及/或活性係異常。於若干具體實例中，該方法包括投予額外之劑。於若干具體實例中，額外之劑係治療劑。
本揭露亦提供病變細胞表現CD71之病症或疾病之治療、減輕症狀或延緩進展之方法，其包括投予有其需要個體治療有效量之本揭露之可活化之抗體或本揭露之共軛可活化之抗體或包含本揭露可活化之抗體之醫藥組成物或包含本揭露共軛可活化之抗體之醫藥組成物。於若干具體實例中，該病症或疾病係癌症。
本揭露亦提供與表現CD71細胞相關病症或疾病之治療、減輕症狀或延緩進展之方法，其包括投予有其需要個體治療有效量之本揭露之共軛可活化之抗體或包含本揭露共軛可活化之抗體之醫藥組成物。於若干具體實例中，與表現CD71細胞相關之病症或疾病係癌症。於若干具體實例中，癌症係腺癌、膽管(膽道)癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、三重陰性乳癌、Her2陰性乳癌、類癌、子宮頸癌、膽管癌(cholangiocarcinoma)、結腸直腸癌、結腸癌、子宮內膜癌、神經膠質瘤、頭頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、白血病、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、口咽癌、卵巢癌、胰臟癌、攝護腺癌、轉移性去勢抗性攝護腺癌、腎癌、肉瘤、皮膚癌、鱗狀細胞癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、泌尿生殖器癌或尿路上皮癌。於若干具體實例中，天然配體係運鐵蛋白。於若干具體實例中，哺乳動物CD71之表現及/或活性係異常。於若干具體實例中，該方法包括投予額外之劑。於若干具體實例中，額外之劑係治療劑。
本揭露亦提供抑制或降低表現哺乳動物 CD71細胞生長、增殖或轉移之方法，其包括投予有其需要個體治療有效量之本揭露之可活化之抗體或本揭露之共軛可活化之抗體或包含本揭露可活化之抗體之醫藥組成物或包含本揭露共軛可活化之抗體之醫藥組成物。於若干具體實例中，天然配體係運鐵蛋白。於若干具體實例中，哺乳動物CD71之表現及/或活性係異常。於若干具體實例中，該方法包括投予額外之劑。於若干具體實例中，額外之劑係治療劑。
本揭露亦提供抑制、阻斷或預防天然配體與哺乳動物CD71結合之方法，其包括投予有其需要個體治療有效量之本揭露之共軛可活化之抗體或包含本揭露共軛可活化之抗體之醫藥組成物。於若干具體實例中，天然配體係運鐵蛋白。於若干具體實例中，哺乳動物CD71之表現及/或活性係異常。於若干具體實例中，該方法包括投予額外之劑。於若干具體實例中，額外之劑係治療劑。
於此等方法及套組之若干具體實例中，抗-CD71共軛可活化之抗體包含可檢測標籤。於此等方法及套組之若干具體實例中，可檢測標籤包括顯影劑、對比劑、酵素、螢光標籤、發色團、染料、一或多種金屬離子或配體系標籤。於此等方法及套組之若干具體實例中，顯影劑包含放射性同位素。於此等方法及套組之若干具體實例中，放射性同位素為銦或鎝。於此等方法及套組之若干具體實例中，對比劑包含碘、釓或氧化鐵。於此等方法及套組之若干具體實例中，酵素包含山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。於此等方法及套組之若干具體實例中，螢光標籤包含黃螢光蛋白(YFP)、青螢光蛋白、綠螢光蛋白(GFP)、經修飾之紅螢光蛋白(mRFP)、紅螢光蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED或銪衍生物。於此等方法及套組之若干具體實例中，發光標籤包含N-甲基吖啶鎓衍生物。於此等方法之若干具體實例中，標籤包含Alexa Fluor® 標籤，例如Alex Fluor® 680或Alexa Fluor® 750。於此等方法及套組之若干具體實例中，配體系標籤包含生物素、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白或一或多種半抗原。
於此等方法及套組之若干具體實例中，個體為哺乳動物。於此等方法之若干具體實例中，個體為人類。於若干具體實例中，個體為非人類哺乳動物，例如非人類靈長類動物、伴生動物(例如貓、狗、馬)、農場動物、役畜或動物園動物。於若干具體實例中，個體為囓齒動物。
於此等方法及套組之若干具體實例中，該方法為活體內方法。於此等方法之若干具體實例中，該方法為原位方法。於此等方法之若干具體實例中，該方法為擬體內方法。於此等方法之若干具體實例中，該方法為活體外方法。
於該等方法及套組之若干具體實例中，該方法為用於鑑定或以其他方式改善適用於以本揭露之抗-CD71共軛可活化之抗體治療之患者族群，隨後經由投予有其需要之個體該共軛可活化之抗-CD71抗體治療。舉例而言，於此等方法中，對於標靶(例如，CD71)以及切割所測試抗-CD71可活化之抗體可切割部分(CM)中的基質之蛋白酶二者之測試皆呈陽性之患者被鑑定為使用包含CM之抗-CD71可活化之抗體治療之適當候選者，然後投予該患者治療有效量之所測試之可活化之抗-CD71抗體及/或共軛可活化之抗-CD71抗體。同樣地，使用此等方法對於標靶(例如CD71)及切割所測試可活化之抗體之CM中基質之蛋白酶之測試中之任一或二者皆呈陰性之患者可能被鑑定為另一種療法形式之適當候選者。於若干具體實例中，該等患者可用其他抗-CD71可活化之抗體進行測試，直到鑑定出治療之適當抗-CD71可活化之抗體(例如包含在患者之疾病部位被切割的CM之抗-CD71可活化之抗體)。於若干具體實例中，然後投予該患者治療有效量之對該患者之測試呈陽性之可活化之抗-CD71抗體及/或共軛。適當之AB、MM、及/或CM包括本文所揭示之任何AB、MM、及/或CM。
根據本發明之醫藥組成物可包含本發明之抗體及視需要之醫藥上可接受之載劑。此等醫藥組成物可包含於套組中，例如，舉例而言，診斷套組。
於若干具體實例中，醫藥組成物包含本揭露之共軛可活化之抗體及視需要之醫藥上可接受之載劑。於若干具體實例中，醫藥組成物包含額外之劑。於若干具體實例中，額外之劑係治療劑。
本揭露之可活化之抗體中之抗-CD71抗體與AB特異性結合CD71標靶，例如，舉例而言，哺乳動物CD71及/或人類CD71。本揭露亦包含抗-CD71抗體與AB，其與本揭露之抗體及/或本文所述之經活化的可活化之抗體結合相同的CD71抗原決定區。本揭露亦包含抗-CD71抗體與AB，其與本文所述之抗-CD71抗體及/或活化之抗-CD71可活化之抗體競爭結合CD71標靶，例如人類CD71。本揭露亦包含抗-CD71抗體與AB，其與本文所述之抗-CD71抗體及/或活化之抗-CD71可活化之抗體交叉競爭結合CD71標靶，例如人類CD71。
本文提供之可活化之抗-CD71抗體包含遮蔽部分。於若干具體實例中，遮蔽部分係與抗-CD71抗體偶合或以其他方式連接之胺基酸序列，並定位於可活化之抗-CD71抗體之構築體內，俾使遮蔽部分降低抗-CD71抗體特異性結合CD71之能力。使用任何多種已知技術鑑定適當之遮蔽部分。例如，使用Daugherty等人於PCT公開案第WO 2009/025846號中所述之方法鑑定肽遮蔽部分，其全部內容特此併入以資參考。
本文提供之可活化之抗-CD71抗體包含可切割部分。於若干具體實例中，可切割部分包含作為蛋白酶(通常是胞外蛋白酶)基質之胺基酸序列。使用任何多種已知技術鑑定適當之基質。例如，使用Daugherty等人於美國專利案第7,666,817號、Stagliano等人於美國專利案第8,563,269號及La Porte等人於PCT公開案第WO 2014/026136號中所述之方法鑑定肽基質，其中各者之全部內容特此併入以資參考[亦參見Boulware 等人“Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics.” Biotechnol. Bioeng. 106.3(2010)：339-46]。
例示性基質包括，惟不限於，可利用下文表(I)中所列舉之一或多種酵素或蛋白酶切割之基質。
本文所述之可活化之抗-CD71抗體克服抗體治療之限制，特別是對已知於體內至少有若干程度毒性之抗體治療。標靶傳介之毒性構成開發治療性抗體之主要限制。本文提供之可活化之抗-CD71抗體係設計以對付傳統治療性抗體於正常組織中與標靶抑制相關之毒性。此等可活化之抗-CD71抗體保持遮蔽，直到於疾病部位被蛋白分解地活化。以抗-CD71抗體作為親源治療性抗體開始，經由併入蛋白酶基質之連接子，將抗體與抑制性遮蔽物偶合而工程處理本發明之可活化之抗-CD71抗體。
當以MM修飾AB且於標靶存在下時，則與未以MM修飾之AB之特異性結合或親源AB與標靶之特異性結合比較，降低或抑制AB與其標靶之特異性結合。
以MM修飾之AB對標靶之Kd 比未以MM修飾之AB或親源 AB對標靶之Kd 至少大5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更大或介於5至10、10至100、10至1,000、10至10,000、10至100,000、10至1,000,000、10至10,000,000、100至1,000、100至10,000、100至100,000、100至1,000,000、100至10,000,000、1,000至10,000、1,000至100,000、1,000至1,000,000、1000至10,000,000、10,000至100,000、10,000至1,000,000、10,000至10,000,000、100,000至1,000,000或100,000至10,000,000倍。相反地，以MM修飾之AB對標靶之結合親和力比未以MM修飾之AB或親源 AB對標靶之結合親和力至少低2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更大或介於5至10、10至100、10至1,000、10至10,000、10至100,000、10至1,000,000、10至10,000,000、100至1,000、100至10,000、100至100,000、100至1,000,000、100至10,000,000、1,000至10,000、1,000至100,000、1,000至1,000,000、1000至10,000,000、10,000至100,000、10,000至1,000,000、10,000至10,000,000、100,000至1,000,000或100,000至10,000,000倍。
MM對AB之解離常數(Kd )通常大於AB對標靶之Kd 。MM對AB之Kd 可比AB對標靶之Kd 至少大5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。相反地，MM對AB之結合親和力通常低於AB對標靶之結合親和力。MM對AB之結合親和力可比AB對標靶之結合親和力至少低5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。
於若干具體實例中，MM對AB之解離常數(Kd )大約等於AB對標靶之Kd 。於若干具體實例中，MM對AB之解離常數(Kd )不超過AB對標靶之解離常數。
於若干具體實例中，MM對AB之解離常數(Kd )小於AB對標靶之解離常數。
於若干具體實例中，MM對AB之解離常數(Kd )大於AB對標靶之解離常數。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之Kd ，其不超過AB與標靶結合之Kd 。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之Kd ，其不小於AB與標靶結合之Kd 。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之Kd ，其大約等於AB與標靶結合之Kd 。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之Kd ，其小於AB與標靶結合之Kd 。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之Kd ，其大於AB與標靶結合之Kd 。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之Kd ，其比AB與標靶結合之Kd 不超過大於2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1,000倍。於若干具體實例中，MM具有與AB結合之Kd ，其比AB與標靶結合之Kd 大1至5、2至5、2至10、5至10、5至20、5至50、5至100、10至100、10至1,000、20至100、20至1000或100至1,000倍。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之親和力，其小於AB與標靶結合之親和力。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之親和力，其不超過AB與標靶結合之親和力。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之親和力，其大約等於AB與標靶結合之親和力。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之親和力，其不小於AB與標靶結合之親和力。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之親和力，其大於AB與標靶結合之親和力。
於若干具體實例中，MM具有與AB結合之親和力，其比AB與標靶結合之親和力小2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1,000倍。於若干具體實例中，MM具有與AB結合之親和力，其比AB與標靶結合之親和力小1至5、2至5、2至10、5至10、5至20、5至50、5至100、10至100、10至1,000、20至100、20至1000或100至1,000倍。於若干具體實例中，MM具有與AB結合之親和力，其比AB與標靶結合之親和力小2至20倍。於若干具體實例中，未與AB共價連接且與AB等莫耳濃度之MM不抑制AB與標靶之結合。
當以MM修飾AB且於標靶存在下時，則與未以MM修飾之AB與標靶之特異性結合或親源AB與標靶之特異性結合比較，降低或抑制AB與其標靶之特異性結合。當比較標靶與未以MM修飾之AB之結合或親源AB之結合，以MM修飾之AB之結合標靶之能力，於活體內或以活體外分析測量時，可降低至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及甚至100%，達至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小時或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月或更長時間。
MM抑制AB與標靶之結合。MM結合AB之抗原結合結構域並抑制AB與標靶之結合。MM可於空間上抑制AB與標靶之結合。MM可異位地抑制AB與其標靶之結合。於此等具體實例中，當AB被修飾或偶合至MM並於標靶存在下時，與未以MM修飾之AB、親源AB或未偶合至MM之AB與標靶之結合比較，於活體內或以活體外分析測量時，AB與標靶無結合或實質上無結合，或AB與標靶之結合不超過0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或50%，達至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小時或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月或更長時間。
當AB與MM偶合或被其修飾時，MM‘遮蔽’或降低或以其他方式抑制AB與標靶之特異性結合。當AB與MM偶合或被其修飾時，此類偶合或修飾可造成結構上變化，從而降低或抑制AB特異性結合其標靶之能力。
與MM偶合或被其修飾之AB可由下式表示[依序從胺基(N)端區至羧基(C)端區]：

其中MM為遮蔽部分，AB為抗體或其抗體片段，及L為連接子。於許多具體實例中，可能所欲嵌入一或多個連接子(例如撓性連接子)進入組成物中以提供可撓性。
於特定具體實例中，MM不是AB之天然結合夥伴。於若干具體實例中，MM包含與AB無或實質上無同源性之任何天然結合夥伴。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴相似不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%完全相同。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴不超過25%完全相同。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴不超過50%完全相同。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴不超過20%完全相同。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴不超過10%完全相同。
於若干具體實例中，該可活化之抗體包含被MM修飾之AB且亦包含一或多個可切割部分(CM)。此類可活化之抗體對AB之標靶，展現可活化/可切換之結合。可活化之抗體通常包含被遮蔽部分(MM)修飾或與其偶合之抗體或抗體片段(AB)及可修飾或可切割部分(CM)。於若干具體實例中，CM包含胺基酸序列，其作為至少一種蛋白酶之基質。
佈置可活化之抗體之元件以便定位MM與CM，俾使於切割(或相對活性)狀態與標靶存在下，AB結合標靶，而可活化之抗體於未切割(或相對不活性)狀態與標靶存在下，AB與其標靶之特異性結合被降低或抑制。由於經由MM之抑制或遮蔽AB與其標靶特異性結合之能力，可降低AB與其標靶之特異性結合。
以MM與CM修飾之AB對標靶之Kd 比未以MM與CM修飾之AB或親源AB對標靶之Kd 至少大5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更大或介於5至10、10至100、10至1,000、10至10,000、10至100,000、10至1,000,000、10至10,000,000、100至1,000、100至10,000、100至100,000、100至1,000,000、100至10,000,000、1,000至10,000、1,000至100,000、1,000至1,000,000、1000至10,000,000、10,000至100,000、10,000至1,000,000、10,000至10,000,000、100,000至1,000,000或100,000至10,000,000倍。相反地，以MM與CM修飾之AB對標靶之結合親和力比未以MM與CM修飾之AB或親源AB對標靶之結合親和力至少低5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更大或介於5至10、10至100、10至1,000、10至10,000、10至100,000、10至1,000,000、10至10,000,000、100至1,000、100至10,000、100至100,000、100至1,000,000、100至10,000,000、1,000至10,000、1,000至100,000、1,000至1,000,000、1000至10,000,000、10,000至100,000、10,000至1,000,000、10,000至10,000,000、100,000至1,000,000或100,000至10,000,000倍。
當以MM與CM修飾AB且於標靶存在但無修飾劑(例如至少一種蛋白酶)存在下時，則與未以MM與CM修飾之AB與標靶之特異性結合或親源AB與標靶之特異性結合比較，降低或抑制AB與其標靶之特異性結合。當比較標靶與親源AB之結合或未以MM與CM修飾之AB之結合，以MM與CM修飾之AB之結合標靶之能力，於活體內或以活體外分析測量時，可降低至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及甚至100%，達至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小時或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月或更長時間。
本文所用之切割狀態一詞係指經由至少一種蛋白酶修飾CM後之可活化之抗體之情況。本文所用之未切割狀態一詞係指無被蛋白酶切割CM之可活化之抗體之情況。如上面所討論，本文所用之“可活化之抗體”一詞係指其未切割(原態)狀態以及其切割狀態之可活化之抗體二者。對一般熟習之技術人員將明顯可見的是，於若干具體實例中，由於蛋白酶之切割CM導致至少釋放MM[例如其中MM未經由共價鍵(例如半胱胺酸殘基間之雙硫鍵)連結至可活化之抗體]，切割之可活化之抗體可能缺少MM。
經由可活化或可切換意指，當可活化之抗體係呈抑制、遮蔽或未切割狀態(即第一構形)時，可活化之抗體展現與標靶之第一級結合，而呈未抑制、未遮蔽及/或切割狀態(即第二構形)則與標靶第二級結合，其中第二級之標靶結合大於第一級之結合。通常，於能切割CM之切割劑(即蛋白酶)存在下，標靶向可活化之抗體之AB之接近比不存在此類切割劑時更大。因此，當可活化之抗體係呈未切割狀態時，AB被抑制與標靶結合且可被標靶結合遮蔽(即第一構形就是AB不能結合標靶)；呈切割狀態時，AB係未被抑制或未被遮蔽與標靶結合。
挑選可活化之抗體之CM與AB，以便AB相當於既定標靶之結合部分及CM相當於蛋白酶之基質。於若干具體實例中，蛋白酶係與個體之治療部位或診斷部位中之標靶共位。本文所用之共位係指於相同部位或相鄰附近。於若干具體實例中，蛋白酶切割CM，產生與位於切割部位附近之標靶結合之活化抗體。本文所揭示之可活化之抗體發現特殊用途，其例如能切割CM中位點之蛋白酶，即蛋白酶，係於治療部位或診斷部位之含標靶組織中存在比非治療部位組織(例如健康組織)中相對較高量。於若干具體實例中，本揭露之CM亦被一或多種其他蛋白酶切割。於若干具體實例中，一或多種其他蛋白酶與標靶共位並負責CM於活體內之切割。
於若干具體實例中，可活化之抗體提供降低毒性及/或不良副作用，否則若AB未被遮蔽或以其他方式抑制與靶標之結合，則可能產生AB於非治療部位之結合。
通常，可經由挑選所關注AB及建構可活化之抗體之剩餘部分設計可活化之抗體，以便當構形被束縛時MM提供AB遮蔽或減少AB與其標靶之結合。可考慮結構設計準則以提供此功能特徵。
提供可活化之抗體，其展現於抑制與未抑制構形中與標靶結合之所欲動態範圍之可切換表現型。動態範圍通常係指(a)第一組條件下參數之最大檢測量與(b)第二組條件下該參數之最小檢測值之比。舉例而言，於可活化之抗體之情況下，動態範圍係指(a)於至少有一種能切割可活化之抗體CM之蛋白酶存在下，標靶蛋白與可活化之抗體結合之最大檢測量與(b)於無蛋白酶存在下，標靶蛋白與可活化之抗體結合之最小檢測量之比。可活化之抗體之動態範圍可計算為可活化之抗體切割劑(例如酵素)處理之解離常數與可活化之抗體切割劑處理之解離常數之比。可活化之抗體之動態範圍越大，該可活化之抗體之可切換表現型越好。具有相對較高動態範圍值(例如大於1)之可活化之抗體，展現更令人滿意之切換表現型，俾使可活化之抗體與標靶蛋白之結合，於能切割可活化之抗體CM之切割劑(例如酵素)存在下比不存在切割劑下，更大程度地發生(例如顯著地發生)。
可活化之抗體可以多種結構組態提供。下面提供可活化之抗體之例示性公式。特別仔細考慮的是AB、MM與CM之N至C端順序可於可活化之抗體內逆轉。亦特別仔細考慮的是CM與MM可重疊胺基酸序列，例如，俾使CM包含在MM內。
舉例而言，可活化之抗體可由下式表示[依序從胺基(N)端區至羧基(C)端區]：

其中MM為遮蔽部分，CM為可切割部分，與AB為抗體或其片段。應注意的是，儘管MM與CM於上式中指示為不同之成分，惟於本文所揭示之所有例示性具體實例(包括式)中，仔細考慮的是CM與MM之胺基酸序列可重疊，例如，俾使CM係完全或部分包含於MM內。此外，上面公式提供可位於可活化之抗體元件之N端或C端之額外胺基酸序列。
於特定具體實例中，MM不是AB之天然結合夥伴。於若干具體實例中，MM包含與AB無或實質上無同源性之任何天然結合夥伴。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴相似不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%完全相同。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴不超過50%完全相同。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴不超過25%完全相同。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴不超過20%完全相同。於若干具體實例中，MM與AB之任何天然結合夥伴不超過10%完全相同。
於許多具體實例中，可能所欲嵌入一或多個連接子(例如撓性連接子)進入可活化之抗體構築體中，俾使於一或多個MM-CM接合處、CM-AB接合處或兩處提供可撓性。舉例而言，AB、MM及/或CM可能不含足夠數量之殘基(例如，Gly、Ser、Asp、Asn，尤其是Gly與Ser，特別是Gly)可提供所欲之可撓性。因此，該等可活化之抗體構築體之可切換表現型可受益於引入一或多個胺基酸以提供撓性連接子。此外，如下文所述，於可活化之抗體呈構形受約束之構築體提供處，可操作地嵌入撓性連接子以於未切割之可活化之抗體中促進環狀結構之形成及維持。
舉例而言，於特定具體實例中，可活化之抗體包含下式之一(其中下式代表N端至C端方向或C端至N端方向之胺基酸序列)：

其中MM、CM及AB如上文所界定；其中LP1及LP2各自獨立且視需要地存在或不存在，係包含至少1個撓性胺基酸(例如，Gly)之相同或不同之撓性連接子。此外，上式提供位於可活化之抗體元件N端或C端之額外胺基酸序列。其實例包括，惟不限於，靶定部分(例如，存在標靶組織中的細胞受體之配體)及血清半衰期延伸部分[例如，結合血清蛋白之多肽例如免疫球蛋白(例如，IgG)或血清白蛋白(例如，人類血清白蛋白(HAS)]。
該CM被至少一種蛋白酶以約0.001-1500×104 M-1 S-1 或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250或1500×104 M-1 S-1 之速率特異性切割。於若干具體實例中，該CM以約100,000 M-1 S-1 之速率被特異性切割。於若干具體實例中，該CM以約1×10E2至約1×10E6 M-1 S-1 (即，約1×102 至約1×106 M-1 S-1 )之速率被特異性切割。
關於被酵素特異性切割，須進行酵素與CM間之接觸。當包含與MM及CM偶合的AB之可活化之抗體在標靶及足夠酵素活性存在下時，該CM可被切割。足夠酵素活性係指酵素與該CM接觸且造成切割之能力。容易預想的是，酵素可能在CM附近惟由於其他細胞因素或該酵素之蛋白質修飾而無法切割。
適用於本文所述之組成物之連接子通常為提供該經修飾之AB或可活化之抗體可撓性以促進抑制該AB與標靶之結合者。該等連接子通常係指撓性連接子。適當之連接子可容易地選定且可具任何適當之不同長度，例如從1個胺基酸(例如，Gly)至20個胺基酸、從2個胺基酸至15個胺基酸、從3個胺基酸至12個胺基酸，包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8 胺基酸或7個胺基酸至8個胺基酸，及長度可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。
例示性撓性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物[包括，例如，(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：24)及(GGGS)n(SEQ ID NO：25)，其中n係至少為1之整數]、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物及此項技藝中已知之其他撓性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物相對未結構化，因此可作為諸成分間之中性繫鏈用。甘胺酸甚至比丙氨酸獲得顯著更多之phi-psi空間，且較具有更長側鏈之諸殘基更少受限制[參見Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142(1992)]。例示性撓性連接子包括，惟不限於Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：26)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：27)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：28)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：29)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：30)、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO：31)等。一般熟習技藝人士將認識，可活化之抗體之設計可包括全部或部分撓性之連接子，俾使該連接子可包括撓性連接子以及賦予較少撓性結構之一或多個部分以提供所欲之可活化之抗體結構。
本揭露亦提供包含可活化之抗-CD71抗體之組成物及方法，所述可活化之抗-CD71抗體包含特異性結合CD71之抗體或抗體片段(AB)，其中該AB與降低該AB結合其標靶的能力之遮蔽部分(MM)偶合。於若干具體實例中，該可活化之抗-CD71抗體進一步包含為蛋白酶基質之可切割部分(CM)。本文提供之組成物及方法使得一或多種劑能夠連接於該AB中之一或多個半胱胺酸殘基而不危害可活化之抗-CD71抗體之活性(例如，遮蔽、活化或結合活性)。於若干具體實例中，本文提供之組成物及方法使得一或多種劑能夠連接於該AB中之一或多個半胱胺酸殘基而不減少或以其他方式干預該MM內之一或多個二硫鍵。本文提供之組成物及方法產生與一或多種劑(例如，任何各種治療、診斷及/或預防製劑)共軛可活化之抗-CD71抗體，舉例而言，於若干具體實例中，而無任何製劑與該可活化之抗-CD71抗體之MM共軛。本文提供之組成物及方法產生共軛可活化之抗-CD71抗體，其中該MM有效且高效地保留遮蔽呈未切割狀態之可活化之抗體的AB之能力。本文提供之組成物及方法產生共軛可活化之抗-CD71抗體，其中該可活化之抗體於可切割該CM之蛋白酶存在下仍被活化，即，切割。
該可活化之抗-CD71抗體具有至少一個供劑共軛之點，惟於本文提供之方法及組成物中，少於所有可能的共軛點可用於與供劑共軛。於若干具體實例中，該一或多個共軛點為涉及二硫鍵之硫原子。於若干具體實例中，該一或多個共軛點為涉及鏈間二硫鍵之硫原子。於若干具體實例中，該一或多個共軛點為涉及鏈間硫鍵之硫原子，惟非涉及鏈內二硫鍵之硫原子。於若干具體實例中，該一或多個共軛點半胱胺酸之硫原子或含硫原子之其他胺基酸殘基。該等殘基可於抗體結構中天然存在或可經由定點誘變、化學轉化或錯誤併入非天然胺基酸而併入抗體中。
亦提供製備於AB中具有一或多個鏈間二硫鍵且於MM中具有一或多個鏈內二硫鍵之可活化之抗-CD71抗體共軛物之方法，並提供與游離硫醇具反應性之藥物。該方法通常包括以還原劑(例如，舉例而言，TCEP)部分還原可活化之抗體中的鏈間二硫鍵；並使與游離硫醇具反應性之藥物和經部分還原之可活化之抗體共軛。本文中所用部分還原一詞係指其中可活化之抗-CD71抗體與還原劑接觸且少於所有二硫鍵之情況，例如，小於被還原之所有可能共軛位點。於若干具體實例中，小於99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或小於5%之所有可能共軛位點被還原。
於又其他實施例中，係提供還原且使劑(例如，藥物)與可活化之抗-CD71抗體共軛導致放置劑之選擇性之方法。該方法通常包括以還原劑部分還原該可活化之抗-CD71抗體，俾使該可活化之抗體之遮蔽部分或其他非AB部分中之任何共軛位點不被還原，且使該劑與該AB中之鏈間硫醇共軛。選擇共軛位點俾使容許所欲劑放置以使共軛發生於所欲位點。還原劑為，舉例而言，TCEP。還原反應條件例如，舉例而言，還原劑對可活化之抗體的比率、培育時間、培育期間的溫度、還原反應溶液的pH等係經由鑑定產生共軛可活化之抗體(其中該MM有效且高效地保留遮蔽呈未切割狀態之可活化之抗體的AB之能力)之條件而確定。還原劑對可活化之抗-CD71抗體之比率將取決於該可活化之抗體而不同。於若干具體實例中，還原劑對可活化之抗-CD71抗體之比率將在約20：1至1：1、約10：1至1：1、約9：1至1：1、約8：1至1：1、約7：1至1：1、約6：1至1：1、約5：1至1：1、約4：1至1：1、約3：1至1：1、約2：1至1：1、約20：1至1：1.5、約10：1至1：1.5、約9：1至1：1.5、約8：1至1：1.5、約7：1至1：1.5、約6：1至1：1.5、約5：1至1：1.5、約4：1至1：1.5、約3：1至1：1.5、約2：1至1：1.5、約1.5：1至1：1.5或約1：1至1：1.5之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約5：1至1：1之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約5：1至1.5：1之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約4：1至1：1之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約4：1至1.5：1之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約8：1至約1：1之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約2.5：1至1：1之範圍內。
於若干具體實例中，係提供還原可活化之抗-CD71抗體該AB中之鏈間二硫鍵且使劑(例如，含硫醇劑，例如藥物)與所得鏈間硫醇共軛以選擇性定位劑於該AB上之方法。該方法通常包括以還原劑部分還原該AB以形成至少兩個鏈間硫醇而不在該可活化之抗體中形成所有可能之鏈間硫醇；且使該劑與該經部分還原之AB之鏈間硫醇共軛。舉例而言，以所欲比率之還原劑：可活化之抗體，使該可活化之抗體之該AB於約37℃部分還原約1小時。於若干具體實例中，還原劑對可活化之抗體之比率將在約20：1至1：1、約10：1至1：1、約9：1至1：1、約8：1至1：1、約7：1至1：1、約6：1至1：1、約5：1至1：1、約4：1至1：1、約3：1至1：1、約2：1至1：1、約20：1至1：1.5、約10：1至1：1.5、約9：1至1：1.5、約8：1至1：1.5、約7：1至1：1.5、約6：1至1：1.5、約5：1至1：1.5、約4：1至1：1.5、約3：1至1：1.5、約2：1至1：1.5、約1.5：1至1：1.5或約1：1至1：1.5之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約5：1至1：1之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約5：1至1.5：1之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約4：1至1：1之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約4：1至1.5：1之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約8：1至約1：1之範圍內。於若干具體實例中，該比率在約2.5：1至1：1之範圍內。
含硫醇試劑可為，舉例而言，半胱胺酸或N-乙醯基半胱胺酸。還原劑可為，舉例而言，TCEP。於若干具體實例中，共軛之前，經還原之可活化之抗體可使用例如管柱層析法、透析或滲濾法純化。替代地，經還原之抗體於部分還原後及共軛之前不予以純化。
本發明亦提供經部分還原之可活化之抗-CD71抗體，其中該可活化之抗體中的至少一個鏈間二硫鍵已以還原劑還原而不干預該可活化之抗體中之任何鏈內二硫鍵，其中該可活化之抗體包含特異性結合CD71之抗體(AB)或其抗原結合片段、抑制呈未切割狀態之該可活化之抗體之該AB與該CD71標靶結合之遮蔽部分(MM)及與該AB偶合之可切割部分(CM)，其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽。於若干具體實例中，該MM經由該CM與該AB偶合。於若干具體實例中，該可活化之抗體之一或多個鏈內二硫鍵未受還原劑之干預。於若干具體實例中，該可活化之抗體內之MM之一或多個鏈內二硫鍵未受還原劑之干預。於若干具體實例中，呈未切割狀態之該可活化之抗體具有從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB或AB-CM-MM。於若干具體實例中，還原劑為TCEP。
於又其他實施例中，經由提供具有確定數量及位置之離胺酸及/或半胱胺酸殘基之可活化之抗-CD71抗體使劑(例如，藥物)還原及與可活化之抗-CD71抗體共軛從而導致放置劑之選擇性之方法。於若干具體實例中，該確定數量之離胺酸及/或半胱胺酸殘基高於或低於親源抗體或可活化之抗體胺基酸序列中之對應殘基量。於若干具體實例中，該確定數量之離胺酸及/或半胱胺酸殘基可產生可與該抗-CD71抗體或可活化之抗-CD71抗體共軛之確定數量之劑當量。於若干具體實例中，該確定數量之離胺酸及/或半胱胺酸殘基可以位點特異性方式產生可與該抗-CD71抗體或可活化之抗-CD71抗體共軛之確定數量之劑當量。於若干具體實例中，該經修飾之可活化之抗體係以位點特異性方式經一或多個非天然胺基酸修飾，因而於若干具體實例中，限制劑只與非天然胺基酸之位點共軛。於若干具體實例中，具有確定數量及位置之離胺酸及/或半胱胺酸殘基之抗-CD71抗體或可活化之抗-CD71抗體如本文所討論以還原劑部分還原俾使該可活化之抗體之遮蔽部分或其他非AB部分中之任何共軛位點不被還原，且使該劑與該AB中之鏈間硫醇共軛。
本揭露亦提供經部分還原之可活化之抗體，其中該可活化之抗體中之至少一個鏈間二硫鍵已以還原劑還原而不干預該可活化之抗體中之任何鏈內二硫鍵，其中該可活化之抗體包含特異性結合標靶(例如，CD71)之抗體(AB)或其抗原結合片段、抑制呈未切割狀態之該可活化之抗體之該AB與該標靶結合之遮蔽部分(MM)及與該AB偶合之可切割部分(CM)，其中該CM為作用為至少一種蛋白酶之基質之多肽。於若干具體實例中，該MM經由該CM與該AB偶合。於若干具體實例中，該可活化之抗體之一或多個鏈內二硫鍵未受還原劑之干預。於若干具體實例中，該可活化之抗體內之MM之一或多個鏈內二硫鍵未受還原劑之干預。於若干具體實例中，呈未切割狀態之該可活化之抗體具有從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB或AB-CM-MM。於若干具體實例中，還原劑為TCEP。
於若干具體實例中，本文所述之可活化之抗體亦包括與該可活化之抗體共軛劑。於若干具體實例中，該共軛劑為治療劑，例如消炎及/或抗腫瘤劑。於該等實施例中，該製劑係與該可活化之抗體之碳水化合物部分共軛，舉例而言，於若干具體實例中，其中該碳水化合物部分位於該可活化之抗體中的抗體或抗原結合片段之抗原結合區之外。於若干具體實例中，該劑係與該可活化之抗體中的抗體或抗原結合片段之巰基共軛。
於若干具體實例中，該劑為胞毒劑例如毒素(如，細菌、真菌、植物或動物來源之酵素活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性共軛物)。
於若干具體實例中，該劑為可檢測之部分例如，舉例而言，標籤或其他標記。於若干具體實例中，該可檢測部分為診斷劑。舉例而言，該製劑為或包含放射性標記之胺基酸、可利用標記之抗生物素蛋白檢測之一或多個生物素基部分(例如，含有可利用光學或量熱法檢測之螢光標記或酵素活性之鏈酶抗生物素蛋白)、一或多個放射性同位素或放射性核種、一或多種螢光標籤、一或多種酵素標籤、及/或一或多種化學發光劑。於若干具體實例中，可檢測部分被間隔子分子附著。
本揭露亦有關包含與胞毒劑例如毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源之酵素活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性共軛物)共軛之抗體之免疫共軛物。適當之胞毒劑包括，例如，尾海兔素及其衍生物(例如澳瑞他汀(auristatin)E、AFP、MMAF、MMAE、MMAD、DMAF、DMAE)。舉例而言，該劑為單甲基澳瑞他汀E(MMAE)或單甲基澳瑞他汀D(MMAD)。於若干具體實例中，該劑為尾海兔素。於若干具體實例中，該劑為澳瑞他汀或其衍生物。於若干具體實例中，該劑為澳瑞他汀E或其衍生物。於若干具體實例中，該劑為單甲基澳瑞他汀E(MMAE)。於若干具體實例中，該劑為單甲基澳瑞他汀D(MMAD)。於若干具體實例中，該劑為類美登素或類美登素衍生物。
於若干具體實例中，與該AB共軛之連接子及毒素包含SPDB-DM4部分、vc-MMAD部分、vc-MMAE部分、vc-倍癌黴素或PEG2-vc-MMAD部分。於若干具體實例中，該連接子為可切割之連接子。於若干具體實例中，該連接子為不可切割之連接子。於若干具體實例中，該劑為可檢測部分。
於若干具體實例中，該劑係使用馬來醯亞胺己醯基-纈胺酸-瓜胺酸連接子或馬來醯亞胺PEG-纈胺酸-瓜胺酸連接子連接於該AB。於若干具體實例中，該劑係使用馬來醯亞胺己醯基-纈胺酸-瓜胺酸連接子連接於該AB。於若干具體實例中，該劑係使用馬來醯亞胺己醯基-纈胺酸-瓜胺酸連接子連接於該AB之單甲基澳瑞他汀E(MMAE)，且此連接子有效負載建構(payload construct)於本文中稱為“vc-MMAE”。於若干具體實例中，該製劑係使用馬來醯亞胺PEG-纈胺酸-瓜胺酸連接子連接於該AB。於若干具體實例中，該劑係使用馬來醯亞胺四-PEG-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄氧基羰基連接子連接於該AB之單甲基澳瑞他汀D(MMAD)，此連接子有效負載建構於本文中稱為“PEG4-vc-MMAD”。於若干具體實例中，該劑係使用馬來醯亞胺四-PEG-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄氧基羰基連接子連接於該AB之單甲基澳瑞他汀E(MMAE)，此連接子有效負載建構於本文中稱為“PEG4-vc-MMAE”。於若干具體實例中，該劑係使用馬來醯亞胺PEG-纈胺酸-瓜胺酸連接子連接於該AB。於若干具體實例中，該劑係使用馬來醯亞胺雙-PEG-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄氧基羰基連接子連接於該AB之單甲基澳瑞他汀D(MMAD)，此連接子有效負載建構於本文中稱為“PEG2-vc-MMAD”。PEG4-vc-MMAD、PEG4-vc-MMAE、PEG2-vc-MMAD及vc-MMAE結構如下所示：

本揭露亦提供包含連接於vcMMAE之可活化之抗體之共軛可活化之抗體，其為具val-cit(vc)連接子之單甲基澳瑞他汀(auristatin)E(MMAE)有效負載，其中該可活化之抗體包含特異性結合標靶之抗體(AB)、當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時抑制該AB與標靶之結合之偶合於該AB之遮蔽部分(MM)及偶合於該AB之可切割部分(CM)，且該CM為作用為蛋白酶基質之多肽。於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體具有式(I)之結構或其鹽：

其中AB為特異性結合標靶之抗體且包含重鏈可變區、重鏈及/或一或多個重鏈CDR(CDRH)區。該AB亦包括輕鏈可變區、輕鏈及/或一或多個輕鏈CDR(CDRL)區。式(I)之共軛可活化之抗體亦包含遮蔽部分(MM)(其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與其標靶之結合)、第一連接部分(LP1)、可切割部分(CM)(其CM中)及第二連接部分(LP2)。於式(I)之特定實施例中，“n”為2。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(I)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於若干具體實例中，本揭露之共軛可活化之抗體具有式(II)之結構或其鹽：

其中AB為特異性結合標靶且包含重鏈可變區、重鏈及/或一或多個重鏈CDR(CDRH)區之抗體。該AB亦包括輕鏈可變區、輕鏈及/或一或多個輕鏈CDR(CDRL))區。式(I)之共軛可活化之抗體亦包括遮蔽部分(MM)(其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與其標靶之結合)，及可切割部分(CM)(其中CM)。於式(II)之特定實例中，“n”為2。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。於若干具體實例中，式(II)之共軛可活化之抗體，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於具式(I)或(II)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，該標靶為哺乳動物CD71。於具式(I)或(II)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，該標靶為人類CD71。
於具式(I)或(II)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，AB包括重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列與輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列；包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之MM及包括SEQ ID NO：156之序列之CM；且“n”為2。於具式(I)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，AB包括重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列與輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列；包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之MM；包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之LP1；包括SEQ ID NO：156之序列之CM及包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之LP2；且“n”為2。
於具式(I)或(II)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，AB包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區；包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之MM及包括SEQ ID NO：156之序列之CM；且“n”為2。於具式(I)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，AB包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區；包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之MM；包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之LP1；包括SEQ ID NO：156之序列之CM及包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之LP2；且“n”為2。
於具式(I)或(II)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，AB包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之序列之輕鏈；包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之MM及包括SEQ ID NO：156之序列之CM；且“n”為2。於具式(I)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，AB包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之序列之輕鏈；包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之MM；包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之LP1；包括SEQ ID NO：156之序列之CM及包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之LP2；且“n”為2。
於具式(I)或(II)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，AB包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：169之序列之輕鏈；且“n”為2。於具式(I)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，AB包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：169之序列之輕鏈；且“n”為2。於具式(I)或(II)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，AB包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：201之序列之輕鏈；且“n”為2。
於具式(I)或(II)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，AB包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區。於具式(I)或(II)之本揭露之共軛可活化之抗體之若干實施例中，AB包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區。
本揭露亦提供共軛可活化之抗體，其包含連接於單甲基澳瑞他汀D(MMAD)有效負載之可活化之抗體，其中該可活化之抗體包含特異性結合標靶之抗體(AB)或其抗原結合片段、抑制呈未切割狀態之該可活化之抗體之該AB與該標靶結合之遮蔽部分(MM)、及偶合於該AB之可切割部分(CM)，該CM為作用為至少一種MMP蛋白酶之基質之多肽。
於若干具體實例中，MMAD-共軛可活化之抗體可使用使製劑連接於AB的數種方法之任一種進行共軛：(a)連接於該AB之碳水化合物部分或(b)連接於該AB之巰基或(c)連接於該AB之胺基或(d)連接於該AB之羧酸根基團。於若干具體實例中，該MMAD有效負載經由連接子與該AB共軛。於若干具體實例中，該MMAD有效負載經由連接子與該AB中之半胱胺酸共軛。於若干具體實例中，該MMAD有效負載經由連接子與該AB中之離胺酸共軛。於若干具體實例中，該MMAD有效負載經由連接子與該AB之另一殘基(例如本文揭示之彼等殘基)共軛。於若干具體實例中，該連接子為含硫醇之連接子。於若干具體實例中，該連接子為可切割之連接子。於若干具體實例中，該連接子為不可切割之連接子。於若干具體實例中，該連接子係選自包括表(II)及(III)所示連接子之組群。於若干具體實例中，該可活化之抗體及該MMAD有效負載係經由馬來醯亞胺己醯基-纈胺酸-瓜胺酸連接子連接。於若干具體實例中，該可活化之抗體及該MMAD有效負載係經由馬來醯亞胺PEG-纈胺酸-瓜胺酸連接子連接。於若干具體實例中，該可活化之抗體及該MMAD有效負載係經由馬來醯亞胺己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄氧基羰基連接子連接。於若干具體實例中，該可活化之抗體及該MMAD有效負載係經由馬來醯亞胺PEG-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄氧基羰基連接子連接。於若干具體實例中，該MMAD有效負載係使用本文揭示之部分還原及共軛技術與該AB共軛。
於若干具體實例中，本揭露連接子之聚乙二醇(PEG)成分由2個乙二醇單體、3個乙二醇單體、4個乙二醇單體、5個乙二醇單體、6個乙二醇單體、7個乙二醇單體8個乙二醇單體、9個乙二醇單體或至少10個乙二醇單體形成。於本揭露之若干實施例中，該PEG成分為具支鏈之聚合物。於本揭露之若干實施例中，該PEG成分為無支鏈之聚合物。於若干具體實例中，該PEG聚合物成分以胺基或其衍生物、羧基或其衍生物或胺基或其衍生物及羧基或其衍生物兩者官能化。
於若干具體實例中，本揭露連接子之PEG成分為胺基-四-乙二醇-羧基或其衍生物。於若干具體實例中，本揭露連接子之PEG成分為胺基-三-乙二醇-羧基或其衍生物。於若干具體實例中，本揭露連接子之PEG成分為胺基-二-乙二醇-羧基或其衍生物。於若干具體實例中，胺基衍生物係於胺基和與其共軛的羧基之間形成醯胺鍵。於若干具體實例中，羧基衍生物係於羧基和與其共軛的胺基之間形成醯胺鍵。於若干具體實例中，羧基衍生物於羧基和與其共軛的羥基之間形成酯鍵。
可使用之酵素活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(源自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思子素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、石竹屬蛋白、美洲大蠊(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素、絲林黴素、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素及單端孢黴烯類。多種放射性核種可用於產生放射性共軛之抗體。其實例包括212 Bi、131 I、131 In、90 Y及186 Re。
抗體及胞毒劑之共軛物係使用各種雙官能蛋白偶合劑例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基四氫噻吩(IT)、亞胺酸酯類之雙官能衍生物(例如已二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯類(例如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(例如戊二醛)、雙疊氮基化合物(例如雙對疊氮基苯甲醯基)已二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、異氰酸酯類(例如甲苯2,6-異氰酸酯)及雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)製備。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta 等人，Science 238：1098(1987)中所述製備。碳-14-標記之1-異硫氰酸苄基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於使放射性核苷酸與抗體共軛之例示性螯合劑(參見WO94/11026)。
熟習此項技藝者將認知，大量多種可能之部分體可與本揭露所得抗體偶合(參見，例如，
"Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and
Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr(eds), Carger Press, New York,(1989)；其全部內容併入本文以資參考)。
偶合可利用使兩個分子結合的任何化學反應完成，只要該抗體與另一個部分體保留其各自之活性即可。此連結可包括許多化學機制，例如共價結合、親和力結合、嵌入、配位結合及錯合。然而，於若干具體實例中，該結合為共價結合。共價結合可經由直接縮合既有的側鏈或經由併入外部橋接分子達成。許多二價或多價連接劑可用於使蛋白質分子，例如本揭露之抗體，與其他分子偶合。舉例而言，代表性偶合劑可包括有機化合物例如硫酯類、碳二亞胺類、琥珀醯亞胺酯類、二異氰酸酯類、戊二醛、重氮苯類及六亞甲基二胺類。此列表不擬詳盡論述此項技藝中已知之各類偶合劑，而是，例示更常見之偶合劑(參見Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133：1335-2549(1984)；Jansen等人，Immunological Reviews 62：185-216(1982)及Vitetta 等人，Science 238：1098(1987))。
於若干具體實例中，除了本文提供之組成物及方法外，共軛可活化之抗體亦可經由於該可活化之抗體序列中插入或以其他方法包含經修飾之胺基酸序列而修飾以供位點特異性共軛。此等經修飾之胺基酸序列係經設計以容許該共軛劑於共軛可活化之抗體內經控制之放置及/或劑量。舉例而言，該可活化之抗體可經工程處理，以於提供反應性硫醇基且不負面影響蛋白質折疊與組裝亦不改變抗原結合之輕鏈及重鏈位置上包含半胱胺酸取代。於若干具體實例中，該可活化之抗體可經工程處理，以於該可活化之抗體內包含或以其他方式引入一或多個非天然胺基酸殘基以提供適當之共軛位點。於若干具體實例中，該可活化之抗體可經工程處理，以於該可活化之抗體序列內包含或以其他方式引入酵素可活化之肽序列。
適當之連接子見述於敘述MBS(M-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯)用途之文獻中(參見，例如，Ramakrishnan, S.等人，Cancer Res. 44：201-208(1984))。亦參見，美國專利案No. 5,030,719，敘述經由寡肽連接子與抗體偶合的經鹵化之乙醯基醯肼衍生物之用途。於若干具體實例中，適當之連接子包括：(i) EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基-丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；(ii) SMPT(4-琥珀醯亞胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(Pierce Chem. Co., Cat.(21558G)；(iii) SPDP(琥珀醯亞胺基-6 [3-(2-吡啶基二硫基)丙醯胺基]己酸酯(Pierce Chem. Co., Cat #21651G)；(iv)磺酸基-LC-SPDP(磺酸基琥珀醯亞胺基 6 [3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯胺]己酸酯(Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G)；及(v)與EDC共軛之磺酸基-NHS(N-羥基磺酸基-琥珀酰亞胺：Pierce Chem. Co., Cat. #24510)。另外之連接子包括，惟不限於，SMCC((4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯)、磺酸基-SMCC(磺酸基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯)、SPDB(N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)或磺酸基-SPDB(N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺酸基丁酸酯)。
上文敘述之連接子含有具不同屬性之成分，因而導致具不同生理化學性質之共軛物。舉例而言，烷基羧酸酯之磺酸基-NHS酯比芳族羧酸酯之磺酸基-NHS酯更穩定。含有NHS-酯之連接子比磺酸基-NHS酯溶解性差。再者，連接子SMPT含有空間位阻之二硫鍵，且可形成具增加的穩定性之共軛物。二硫鍵結，通常比其他鍵結不穩定，因為二硫鍵結於體外被切割，導致可用的共軛物較少。特別是，磺酸基-NHS可提高碳二亞胺偶合劑之穩定性。碳二亞胺偶合劑(例如EDC)與磺酸基-NHS結合使用時，形成比單獨碳二亞胺偶合反應更耐水解之酯類。
於若干具體實例中，該等連接子可切割。於若干具體實例中，該等連接子不可切割。於若干具體實例中，存在二或多個連接子。該二或多個連接子全部相同，即，可切割或不可切割，或該二或多個連接子不同，即，至少一個可切割且至少一個不可切割。
本揭露利用數種方法使製劑連接於AB：(a)連接於該AB之碳水化合物部分或(b)連接於該AB之巰基或(c)連接於該AB之胺基或(d)連接於該AB之羧酸根基團。根據本揭露，AB可經由具有至少兩個反應基團(一個與AB反應，一個與製劑反應)之中間連接子。可選擇包括任何可相容的有機化合物之連接子，俾使與AB(或製劑)之反應不會不利地影響AB之反應性及選擇性。再者，連接子與製劑之連接希望不會破壞製劑之活性。用於與氧化之抗體或氧化之抗體片段反應之適當連接子包括含有選自包括一級胺、二級胺、肼、醯肼、羥基胺、苯基肼、半卡肼及硫半卡肼等基團之組群之胺者。該等反應性官能基可呈部分該連接子結構存在，或可經由不含該等基團的連接子之適當化學修飾引入。
根據本揭露，用於附著於經還原的AB之適當連接子包括具有能與經還原的抗體或片段之巰基反應之特定反應基團者。該等反應基團包括，惟不限於：反應性鹵烷基(包括，舉例而言，鹵基乙醯基)、對汞苯甲酸鹽基團及能進行Michael型加成反應之基團(包括，舉例而言，馬來醯亞胺類及由Mitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101：3097-3110所述類型之基團)。
根據本揭露，用於附著於既不氧化也不還原的Ab之適當連接子包括具有能與存在該AB中未經修飾的離胺酸殘基中之一級胺基反應之特定官能基者。該等反應基團包括，惟不限於，NHS羧酸或碳酸酯、磺酸基-NHS羧酸或碳酸酯、4-硝基苯基羧酸或碳酸酯、五氟苯基羧酸或碳酸酯、醯基咪唑、異氰酸酯類及異硫氰酸酯類。
根據本揭露，用於附著於既不氧化也不還原的Ab之適當連接子包括能與存在該AB中已以適當試劑活化之天冬胺酸或麩胺酸殘基中之羧酸基團反應之特定官能基者。適當之活化試劑包括添加或不添加NHS或磺酸基-NHS之EDC及用於形成羧醯胺之其他脫水劑。於此等情況中，存在適當連接子中之官能基將包括一級胺及二級胺、肼、羥基胺與醯肼。
製劑可於連接子附著於AB之前或之後附著於連接子。於特定應用中，可能所欲先產生其中連接子不含相關製劑之AB-連接子中間體。取決於特定應用，然後使特異性製劑共價附著於該連接子。於若干具體實例中，AB先附著於MM、CM及相關之連接子，然後附著於供共軛目的之連接子。
具支鏈之連接子 ：於特定實施例中，係使用具有多個附著製劑用的位點之具支鏈之連接子。關於多個位點連接子，單一共價附著於AB將導致AB-連接子中間體能於許多位點結合製劑。該等位點可為製劑可被附著之醛或巰基或任何化學位點。
於若干具體實例中，經由於AB上之多個位點附著單一位點連接子可達到較高之比活性(或較高之製劑對AB之比率)。此多個位點可利用兩種方法之任一種引入AB中。首先，可於相同AB中產生多個醛基及/或巰基。其次可使具有用於隨後附著於連接子的多個官能位點之"具支鏈之連接子"附著於該AB之醛或巰基。具支鏈之連接子或多個位點連接子之官能位點可為醛或巰基，或可為可附著連接子之任何化學位點。利用組合此二方法可獲得更高之比活性，即，附著多個位點連接子於AB上之數個位點。
可切割之連接子 ：於本揭露之一實施例中，可使用易於被補體系統的酵素(例如惟不限於u-纖維蛋白溶酶原活化劑、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、胰蛋白酶、纖溶酶或具有蛋白水解活性之另一酵素)切割之肽連接子。根據本揭露之一方法，經由容易被補體切割之連接子而附著製劑。抗體係選自可活化補體之類別。抗體-製劑共軛物，因此，活化補體級聯並於標靶位點釋放製劑。根據本揭露之另一方法，係經由容易被具有蛋白水解活性的酵素(例如u-纖維蛋白溶酶原活化劑、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、纖溶酶或胰蛋白酶)切割之連接子而附著製劑。
表(II)提供可切割之連接子序列之非限制性實例。
另外，劑可經由二硫鍵(舉例而言，半胱胺酸分子上之二硫鍵)附著於AB。由於許多腫瘤自然地釋放高量麩胱甘肽(一種還原劑)，此會減少隨後於遞送位點釋放製劑之二硫鍵。於若干具體實例中，會修飾CM的還原劑也會修飾共軛可活化之抗體的連接子。
間隔子及可切割之元件 ：於若干具體實例中，可能需要以使可活化之抗體之AB與製劑間的間隔最適化之方式建構該連接子。此可經由使用一般結構的連接子達成：
W -(CH2 )n - Q
其中
W為--NH--CH2 --或者--CH2 --；
Q為胺基酸、肽；及
n為0至20之整數。
於若干具體實例中，連接子可包含間隔子元件及可切割之元件。間隔子元件的作用為使可切割之元件遠離AB核心位置俾使該可切割之元件更接近負責切割的酵素。上述某些具支鏈之連接子可作為間隔子元件用。
此整個討論中，應理解的是，連接子與製劑(或間隔子元件與可切割之元件或可切割之元件與製劑)之附著不需要特定的附著模式或反應。任何提供適當穩定性及生物相容性的反應均可接受。
血清補體及連接子之選擇 ：根據本揭露之一方法，當所欲釋放製劑時，則使用可活化補體之類的抗體之AB。所得共軛物保留結合抗原及活化補體級聯二者之能力。因此，根據本揭露之此實施例，係使製劑接合於可切割連接子或可切割元件之一端並使該連接子基團之另一端附著於AB上之特定位點。舉例而言，若該製劑具有羥基或胺基，則其可分別經由酯或醯胺鍵附著於肽、胺基酸或經適當選擇之其他連接子之羧基端。舉例而言，該等製劑可經由碳二亞胺反應附著於連接子肽。若該製劑含有會干預附著連接子之官能基，則可於附著之前封阻此等干預性官能基，一旦製成產物共軛物或中間體即將其解封。然後直接或於進一步修飾後，使用該連接子之相對或胺基末端與能活化補體的AB結合。
連接子(或連接子之間隔子元件)可具任何所需長度，其一端可共價附著於可活化之抗體之AB上的特定位點。該連接子或間隔子元件之另一端可附著於胺基酸或肽連接子。
因此當此等共軛物於補體存在下與抗原結合時，使該製劑附著於連接子之醯胺或酯鍵將被切割，導致釋放呈其活化形式之製劑。此等共軛物，於投予個體時，將於標靶位點完成製劑之遞送及釋放，且對於醫藥製劑、抗生素、抗代謝物、抗增生劑等之活體內遞送特別有效。
用於無補體活化的釋放之連接子 ：於靶向遞送之又另一應用中，所欲釋放沒有補體活化之製劑，因為補體級聯之活化最終將溶解標靶細胞。因此，當必需不殺死標靶細胞而完成製劑之遞送及釋放時，此方法有用。當所欲遞送細胞介質例如激素、酵素、皮質類固醇、神經傳遞質、基因或酵素至標靶細胞時，此為目標。此等共軛物可利用連接該製劑於不能經由對血清蛋白酶切割輕度敏感的連接子活化補體之AB而製備。當此共軛物投予個體時，將快速形成抗原-抗體複合物而製劑的切割將緩慢發生，因而導致於標靶位點釋放化合物。
生物化學交聯劑 ：於若干具體實例中，該可活化之抗體可使用特定生物化學交聯劑與一或多種治療劑共軛。交聯劑將兩種不同分子之官能基連結在一起形成分子橋。欲以逐步方式連接兩種不同蛋白質，可使用排除不需要的均聚物形成之雜-雙官能交聯劑。
可被溶酶體蛋白酶切割之肽基連接子亦有用，舉例而言，Val-Cit、Val-Ala或其他二肽類。此外，可使用於溶酶體之低pH環境中可切割之酸不穩定連接子，例如：雙唾液酸醚。其他適當連接子包括組織蛋白酶不穩定之基質，特別是於酸性pH顯示最佳功能者。
表(III)中提及例示性雜雙官能交聯劑。


表(III)：例示性雜雙官能交聯劑
不可切割之連接子或直接附著 ：於本揭露之若干實施例中，可設計共軛物，俾使製劑被遞送至標靶惟不釋放。此可利用直接或者經由可切割之連接子連接製劑於AB而達成。
此等不可切割之連接子可包括胺基酸、肽、D-胺基酸或其他有機化合物，其可經修飾以包括隨後可經由本文所述之方法用於連接AB之官能基。該等有機連接子之通式可為
W -(CH2 )n - Q
其中
W為--NH--CH2 --或--CH2 --；
Q為胺基酸、肽；及
n為0至20之整數。
不可切割之共軛物 ：於若干具體實例中，化合物附著於不活化補體之AB。使用不能補體活化之AB時，此附著可使用易於被活化的補體切割之連接子或使用不易被活化的補體切割之連接子達成。
界定：
除非另行界定，否則有關本揭露所用之科學及技術術語應具有一般熟習此項技藝者通常理解之含義。“一個”實體一詞係指一或多個該實體。舉例而言，化合物係指一或多個化合物。如此，“一(a、an)”、“一或多個”及”至少一個”等詞可互換使用。再者，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數及數複術語應包括單數。大體而言，與本文所述之細胞及組織培養、分子生物學及蛋白質及寡多核苷酸或多核苷酸化學與雜交相關所用的命名及技術為此項技藝中悉知且常用者。關於重組DNA、寡核苷酸合成、及組織培養與轉形係使用標準技術(例如，電穿孔、脂質體轉染)。酵素反應及純化技術係根據製造商說明書或如此項技藝中通常達成者或如本文所述進行。前述技術及程序通常根據此項技藝中悉知及如見述於本說明書通篇所引用及討論之多種一般及更具體之參考文獻中之習知方法進行(參見例如，Sambrooket al . Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))。與本文所述之分析化學、合成有機化學、藥物及製藥化學相關所用之命名法，與實驗室程序及技術為此項技藝中悉知且常用者。標準技術用於化學合成、化學分析、藥物製備、調配及遞送及治療患者。
如根據本揭露所用，除非另行指示，否則下述術語應被理解為具有下述意義：
如本文所用“抗體”一詞係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含有特異性結合抗原(與抗原免疫反應)的抗原結合位點之分子。“特異性結合或“與抗原免疫反應”或“免疫特異性結合”意指，抗體與所所欲抗原之一或多個抗原決定子反應且不與其他多肽反應或以低許多之親和力(Kd ＞ 10-6 )結合。
已知基本抗原結構單元包含四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，各對具有一個“輕”鏈(約25 kDa)及一個“重”鏈(約50-70 kDa)。各鏈之胺基端部分包括主要負責抗原識別之約100至110或更多胺基酸之可變區。各鏈之羧基端部分界定主要負責效應子功能之恆定區。通常，得自人類之抗體分子與IgG、IgM、IgA、IgE及IgD任一類別有關，其由於存在分子中的重鏈性質而彼此不同。某些類別也具有亞類，例如IgG1 、IgG2 及其他。再者，於人類中，輕鏈可為κ鏈或λ鏈。
如本文所用之“單株抗體”(mAb)或“單株抗體組成物”一詞係指抗體分子群，其僅含有由獨特的輕鏈基因產物和獨特的輕鏈基因組成的單一分子類別之抗體。特別是，單株抗體之互補決定區(CDRs)於該群體之所有分子中完全相同。MAb含有能與抗原的特定表位發生免疫反應之抗原結合位點，其特徵在於對該抗原具有獨特的結合親和力。
“抗原結合位點”或“結合部分一詞係指參與抗原結合之免疫球蛋白分子部分。抗原結合位點由重(“H”)鏈及輕(“L”)鏈N端可變(“V”)區之胺基酸殘基形成。重鏈及輕鏈V區內之三個高度發散伸展區，稱為“高度變異區”，係介於所謂“框架區”或“FRs”之更保守的側翼伸展區之間。因此，“FR”一詞係指天然存在免疫球蛋白中的高度變異區之間，及與其相鄰之胺基酸序列。於抗體分子中，三個輕鏈高度變異區及三個重鏈高度變異區於三維空間中彼此相對配置而形成抗原結合表面。該抗原結合表面與經結合抗原之三維表面互補，各重鏈及輕鏈的三個高度變異區稱為“互補決定區”或“CDRs”。各結構域之胺基酸分配係根據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987 and 1991))或Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196：901-917(1987), Chothiaet al . Nature 342：878-883(1989)之界定。
如本文所用之“表位”一詞包括能特異性結合免疫球蛋白、scFv或T細胞受體之任何蛋白質決定子。“表位”一詞包括任何蛋白質決定子能特異性結合免疫球蛋白或T細胞受體。表位抗原決定子通常由分子之化學活性表面基團(例如胺基酸或糖側鏈)組成，且通常具有特定三維結構特徵，以及特定電荷特徵。舉例而言，抗體可針對多肽之N端或C端肽產生。當解離常數≤ 1 µM時，抗體可特異性結合抗原；於若干具體實例中，≤ 100nM且於若干具體實例中，≤ 10nM。
如本文所用之“特異性結合”、“免疫結合”及“免疫結合性質”等詞係指在免疫球蛋白分子及與對其具特異性之抗原間發生的類型之非共價相互作用。免疫結合相互作用的強度或親和力可就該相互作用之解離常數(Kd)來表示，其中Kd 較小表示親和力較大。可使用此項技藝中悉知之方法定量所選定多肽之免疫結合性質。有一該等方法必需測量抗原結合位點/抗原複合物形成及解離之速率，其中彼等速率取決於複合物夥伴之濃度、相互作用之親和力及同樣影響兩個方向的速率之幾何參數。因此，“結合常數”(Kon )及“解離常數”(Koff )二者可經由計算結合及解離之濃度與實際速率測定(參見Nature 361：186-87(1993))。Koff /Kon 之比率使得能消除與親和力不相關的所有參數，且與解離常數數Kd 相等(通常參見，Davies et al.(1990) Annual Rev Biochem 59：439-473)。據稱如經由例如放射性配體結合測定法或熟習此項技藝者已知之類似測定法所測，當結合常數(Kd ) £1 mM時，於若干具體實例中，£ 100nM，於若干具體實例中，£ 10nM及於若干具體實例中，£ 100 pM至約1 pM，本揭露之抗體特異性結合於標靶。
如本文所用之“單離之多核苷酸”一詞應意指基因體、cDNA或合成來源之多核苷酸或其一些組合，由於其來源，“單離之多核苷酸”(1)與其中該“單離之多核苷酸”係於自然界發現之全部或部分多核苷酸不相關、(2)可操作地連接於在自然界中不連接之多核苷酸或(3)於自然界中不發生為較大序列的一部分。根據本揭露分之多核苷酸包括編碼本文所示重鏈免疫球蛋白分子之核酸分子，及編碼本文所示輕鏈免疫球蛋白分子之核酸分子。
本文提及的“單離之蛋白質”一詞意指cDNA、重組RNA或合成來源之蛋白質或其一些組合，由於其來源或衍生來源，“單離之蛋白質”(1)與於自然界發現之蛋白質不相關、(2)不含源自相同來源之其他蛋白質(例如，不含鼠類蛋白質)、(3)由源自不同物種的細胞表現或(4)不存在自然界中。
於本文中作為一般術語用之“多肽”一詞係指原態蛋白質、片段或多肽序列之類似物。因此，原態蛋白質片段、及類似物為多肽屬之類別。根據本揭露之多肽包含本文所示之重鏈免疫球蛋白分子、及本文所示之輕鏈免疫球蛋白分子、以及由包含重鏈免疫球蛋白分子與輕鏈免疫球蛋白分子(例如κ輕鏈免疫球蛋白分子)之組合形成的抗體分子，反之亦然，以及片段及其類似物。
如本文所用之“天然存在”一詞應用於物體時係指物體可於自然界發現之事實。舉例而言，存在生物體(包括病毒)中之多肽或多核苷酸序列可從天然來源單離且未被人於實驗室中或其他方法有意修飾，為天然存在。
如本文所用之“可操作地連接”一詞係指如此敘述的成分位置處於容許彼等以其預期方式起作用的關係。調控序列“可操作地連接”於編碼序列係以與調控序列可相容之條件下完成編碼序列表現之方式連接。
如本文所用之“調控序列”一詞係指達成與彼等連接的編碼序列之表現及處理所需之多核苷酸序列。該等調控序列之性質取決於原核生物中之宿主生物而不同，該等調控序列通常包括真核生物中之啓動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列，通常，該等調控序列包括啓動子及轉錄終止序列。“調控序列”一詞擬包括，至少，其存在對於表現及加工為必要之所有成分，亦可包括其存在有助益之額外成分，舉例而言，前導序列及融合夥伴序列。本文提及之“多核苷酸”一詞意指至少10個鹼基長之核苷酸，核糖核苷酸或去氧核苷酸或任一類型核苷酸之經修飾形式。該術語包括單股及雙股形式之DNA。
本文提及之寡核苷酸一詞包括經由天然存在及非天然存在之寡核苷酸鍵結而連接在一起之天然存在及經修飾之核苷酸。寡核苷酸為通常包含長度200個鹼基或更少之多核苷酸子集。於若干具體實例中，寡核苷酸為10至60個鹼基長，於若干具體實例中，12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個鹼基長。寡核苷酸通常為單股，例如，用於探針，惟寡核苷酸可為雙股，例如，用於建構基因突變體。本揭露之寡核苷酸為意義或反義核苷酸。
本文提及之“天然存在之核苷酸”一詞包括去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。本文提及之“經修飾之核苷酸”一詞包括具有經修飾或經取代之糖基等之核苷酸。本文提及之“寡核苷酸鍵結”一詞包括寡核苷酸鍵結例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、胺苯基硫代磷酸酯、縮苯胺磷酸酯、胺基磷酸酯等。參見例如，LaPlancheet al . Nucl. Acids Res. 14：9081(1986)；Stecet al . J. Am. Chem. Soc. 106：6077(1984), Steinet al . Nucl. Acids Res. 16：3209(1988)；Zonet al . Anti Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zonet al . Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991))；Stecet al . U.S. Patent No. 5,151,510；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90：543(1990)。如果需要，寡核苷酸可包含檢測用標籤。
本文所用之二十個習知胺基酸及其縮寫遵循習知用法。參見Immunology - A Synthesis(2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Green, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.(1991))。該二十個習知胺基酸之立體異構物(例如，D-胺基酸)、非天然胺基酸例如α-, α-二取代之胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非習知胺基酸亦可為本揭露多肽之適當成分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、s-N-甲基精胺酸、及其他類似之胺基酸與亞胺酸(例如，4-羥基脯胺酸)。於本文所用之多肽標記法中，根據標準用法及慣例，左手方向為胺基端方向及右手方向為羧基端方向。
同樣地，除非另行說明，否則單股多核苷酸序列之左手端為5’末端及雙股多核苷酸序列之左手方向稱為5’方向。新生RNA轉錄本5’至3’添加方向稱為與RNA具有相同序列的DNA股上之轉錄方向序列區，其為RNA轉錄本5’至5’末端者稱為“上游序列”，與RNA具有相同序列的DNA股上之序列區且為RNA轉錄本3’至3’末端者稱為“下游序列”。
當應用於多肽時，“實質上同一性”一詞意指，兩個肽序列進行最佳序列排比(例如經由使用默認空位權重之GAP或BESTFIT等程式)時，共享至少80%序列同一性，於若干具體實例中，至少90%序列同一性，於若干具體實例中，至少95%序列同一性及於若干具體實例中，至少99%序列同一性。
於若干具體實例中，不相同的殘基位置因保守性胺基酸取代而不同。
如本文所討論，假若胺基酸序列中之差異維持至少75%，於若干具體實例中，至少80%、90%、95%及於若干具體實例中，99%，則抗體或免疫球蛋白分子中胺基酸序列之微小差異被預期為本揭露所涵蓋。特別是，慮及保守性胺基酸置換。保守性置換係發生於與其側鏈相關的胺基酸家族內者。基因編碼的胺基酸通常為分為幾個家族：(1)酸性胺基酸為天冬胺酸、麩胺酸；(2)鹼性胺基酸為離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3)非極性胺基酸為丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸及(4)未帶電荷之極性胺基酸為甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。親水性胺基酸包括精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、麩胺醯胺、麩胺酸、組胺酸、離胺酸、絲胺酸及蘇胺酸。疏水性胺基酸包括丙胺酸、半胱胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸，其他胺基酸家族包括(i)絲胺酸及蘇胺酸，其為脂族-羥基家族；(ii)天冬醯胺及麩胺醯胺，其為含醯胺家族；(iii) 丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸，其為脂族家族；及(iv)苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸，其為芳族家族。舉例而言，可合理地預期，以異白胺酸或纈胺酸單離置換白胺酸、以麩胺酸單離置換白胺酸天冬胺酸、以絲胺酸單離置換白胺酸蘇胺酸或使用結構相關胺基酸之胺基酸類似置換不會對所得分子之結合或性質具有重大影響，尤其是如果該置換不涉及框架位點內之胺基酸。經由分析多肽衍生物之比活性可容易地確定胺基酸變化是否產生功能性肽。於本文中詳述分析方法。抗體或免疫球蛋白分子之片段或類似物可容易地由通常熟習此項技藝者製備。適當之片段或類似物之胺基及羧基末端出現於功能域邊界附近。結構域及功能域可利用與公共或專有序列數據庫比較核苷酸及/或胺基酸序列數據予以鑑定。於若干具體實例中，係使用電腦化比較法鑑定發生於已知結構及/或功能的其他蛋白質中之序列基序或預測之蛋白質構形結構域。鑑定折疊成已知三維結構的蛋白質序列之方法為已知。Bowie 等人，Science 253：164(1991)。因此，前述實例證明，熟習此項技藝者可根據本揭露識別可用以界定結構域及功能域之序列基序及結構構形。
適當之胺基酸取代為：(1)降低對蛋白水解之易感性、(2)降低對氧化之易感性、(3)改變結合形成蛋白質複合物之親和力、(4)改變結合親和力及(5)賦予或修飾該等類似物之其他物理化學或功能性性質。類似物可包括天然存在之肽序列以外的序列之多種突變蛋白。舉例而言，可於天然存在的序列中進行單一或多個胺基酸取代(例如，保守性胺基酸取代)(例如，於結構域外側之多肽部分形成分子間接觸。保守性胺基酸取代不應實質上改變親源序列之結構特徵(例如，置換胺基酸不應傾向打破親源序列中發生的螺旋構造，或破壞表徵親源序列的其他類型之二級結構)。此項技藝公認的多肽二級及三級結構之實例見述於Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y.(1991))；及Thornton et at. Nature 354：105(1991)。
如本文所用之“多肽片段”一詞係指具有胺基端及/或羧基端缺失及/或一或多個內部缺失之多肽，惟其中其餘胺基酸序列與，例如，源自全長cDNA序列推導出之天然存在序列中之對應位置相同。該等片段長度通常為至少5、6、8或10個胺基酸；於若干具體實例中，至少14個胺基酸；於若干具體實例中，至少20個胺基酸；通常至少50個胺基酸及於若干具體實例中，至少70個胺基酸。如本文所用之“類似物”一詞係指於適當結合條件下，由至少25個胺基酸之片段組成之多肽，其與推導出之胺基酸序列之一部分具有實質上之同一性且具有與標靶之特異性結合。通常，多肽類似物包含相對於天然存在序列之保守性胺基酸取代(或添加或缺失)。類似物通長度為至少20個胺基酸，於若干具體實例中，至少50個胺基酸或更多，且常可與全長天然存在之多肽一樣長。
“製劑”一詞於本文中係用以表示化學化合物、化學化合物之混合物、生物巨分子或生物材料製成之萃取物。
如本文所用之“標籤”或“經標記”等詞係指併入可檢測之標籤，例如，經由併入放射性標記之胺基酸或附著於可利用標記之抗生物素蛋白檢測之生物素基部分之多肽(例如，含有可利用光學或量熱法檢測之螢光標記或酵素活性之鏈酶抗生物素蛋白)。於特定情況下標籤或標記亦可為治療性。標記多肽及醣蛋白之多種方法為此項技藝中已知且可使用。多肽標籤之實例包括，惟不限於，下列：放射性同位素或放射性核種(例如，3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)、螢光標籤(例如，FITC、若丹明、鑭系元素)、酵素標籤(例如，山葵過氧化酶、p-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光、生物素基團、由二級報導基因識別之預定多肽表位(例如，白胺酸拉鍊對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合結構域、表位標籤)。於若干具體實例中，標籤係經由具多種長度間隔子臂之附著以減少潛在之空間阻礙。如本文所用之“醫藥製劑或藥物”一詞係指適當投予患者時能誘導所欲治療效果之化學化合物或組成物。
本文之其他化學術語係係根據此項技藝中之習知用法使用，例如The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco(1985))。
如本文所用之“實質上純”意指標的物種為存在之主要物種(即，以莫耳計，其較組成物中任何其他個別物種更豐富)，且於若干具體實例中，實質上純化之區分為其中該標的物種包含存在的所有大分子物種之至少約50%(以莫耳計)之組成物。
大體而言，實質上純之組成物將佔組成物中存在的所有大分子物種之大於約80%，於若干具體實例中，大於約85%、90%、95%及99%。於若干具體實例中，將標的物種純化至基本均勻性(經由習知檢測方法不能於組成物中檢測出污染物種)，其中組成物基本上由單一大分子物種組成。
患者一詞包括人類及獸醫研究對象。
本揭露之抗體及/或可活化之抗體特異性結合既定標靶，例如，人類標靶蛋白例如人類CD71。本揭露亦包括與如本文所述之抗體及/或可活化之抗體之相同表位結合之抗體及/或可活化之抗體。本揭露亦包括抗體及/或抗體可活化之抗體，其與本文所述之抗-CD71抗體及/或抗-CD71可活化之抗體競爭結合CD71，例如，人類CD71。本揭露亦包括抗體及/或抗體可活化之抗體，其與本文所述之抗-CD71抗體及/或抗-CD71可活化之抗體交叉競爭結合CD71，例如，人類CD71。
熟習此項技藝者將認知，可以在未過度實驗下，經由探查單株抗體(例如，鼠類單株或擬人化抗體)是否阻止如本文所述方法中所用單株抗體之與標靶結合，以確定前者與後者是否具有相同特異性。若所測試單株抗體與本揭露之單株抗體競爭，如本揭露單株抗體之結合降低所示，則兩種單株抗體結合相同或密切相關之表位。確定單株抗體是否具有本揭露單株抗體的特異性之替代方法為使本揭露單株抗體與靶標一 起預培育，然後添加所測試單株抗體以確定所測試單株抗體結合靶標的能力是否被抑制。如果所測試單株抗體被抑制，則其很可能具有與本揭露單株抗體相同或功能相等之表位特異性。

共軛可活化之抗體之用途
應察知的是，根據本揭露治療實體之投予將與適當之醫藥上可接受之載劑、賦形劑、及併入調配物中之其他製劑一起進行，以提供增進之轉移、遞送、耐受性等。
本揭露之治療調配物，其包含為非限制性實例共軛可活化之抗體，係用以預防、治療或者改善與異常標靶表現及/或活性相關之疾病或病症。舉例而言，本揭露之治療調配物，其包含共軛可活化之抗體，係用以治療或者改善癌症或其他腫瘤症狀、發炎、炎性病症、及/或自體免疫疾病。於若干具體實例中，癌症為實體腫瘤或表現標靶之惡性腫瘤症。於若干具體實例中，癌症為表現標靶之實體腫瘤。於若干具體實例中，癌症為表現標靶之惡性腫瘤症。於若干具體實例中，標靶表現於薄壁組織(例如，於癌症中，通常執行器官或組織的功能之器官或組織部分)。於若干具體實例中，標靶於細胞、組織或器官上表現。於若干具體實例中，標靶於基質(即，細胞、組織或器官之結締支撐框架)上表現。於若干具體實例中，標靶於成骨細胞上表現。於若干具體實例中，標靶於內皮細胞(脈管系統)上表現。於若干具體實例中，標靶於癌症幹細胞上表現。於若干具體實例中，與抗體及/或該可活化之抗體共軛之製劑為微管抑制劑。於若干具體實例中，與抗體及/或該可活化之抗體共軛之製劑核酸損壞劑。
預防、改善或治療之有效性係與用於診斷或治療與標靶表現及/或活性(例如，舉例而言，異常標靶表現及/或活性)相關之疾病或病症之任何已知方法相關聯地確定。延長個體的存活或者延緩與標靶表現及/或活性(例如，個體中之異常標靶表現及/或活性)相關之疾病或病症進展，表示抗體、共軛之抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體賦予臨床優勢。
抗體、共軛抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體可呈醫藥組成物形式投予。於使用抗體片段之若干實施例中，挑選特異性結合標靶蛋白的結合結構域之最小片段。舉例而言，根據抗體之可變區序列，可設計保留結合標靶蛋白序列能力之肽分子。該等肽可化學合成及/或利用重組DNA技術產生(參見，例如，Marasco等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：7889-7893(1993))。
用於活體內投予之調配物必須無菌。此利用通過無菌過濾膜過濾可容易地達成。
於若干具體實例中，抗體、共軛之抗體，可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體含有可檢測之標籤。使用完整抗體或其片段(例如，Fab、scFv或F(ab)2 )。關於探針或抗體，“經標記”一詞旨在涵蓋經由使可檢測物質與探針或抗體偶合(即，物理性連接)直接標記探針或抗體，以及經由與直接經標記之另一試劑之反應性間接標記探針或抗體。間接標記之實例包括使用螢光標記之二次抗體檢測一次抗體及以生物素末端標記DNA 探針俾使其可用螢光標記之鏈酶抗生物素蛋白檢測。“生物試樣”一詞旨在包括自個體單離之組織、細胞及生物流體，以及存在個體中之組織、細胞及流體。因此，“生物試樣”一詞之用法包含血液及血液之區分或成分包括血液血清、血液血漿或淋巴。亦即，本揭露之檢測方法可用以檢測於活體外以及活體內生物試樣中之分析物mRNA、蛋白質或基因體DNA。舉例而言，用於檢測分析物mRNA之活體外技術包括北方式雜交法及原位雜交法。用於檢測分析物蛋白質之活體外技術包括酵素連結免疫吸附測定法(ELISAs)、西方墨點法、免疫沈澱法、免疫化學染色及免疫螢光法。用於檢測分析物基因體DNA之活體外技術包括南方雜交法。進行免疫測定法之程序見述於，例如“ELISA：Theory and Practice：Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther(Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995；“Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996；及“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985。再者，用於檢測分析物蛋白質之活體內技術包括於個體中引入經標記之抗分析物蛋白質抗體。舉例而言，可使用其於個體中之存在及位置可利用標準成像技術檢測之放射性標記物標記之抗體。
本揭露之抗體、共軛之抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體亦可用於各種診斷及預防調配物。於一實施例中，係將共軛可活化之抗體投予瀕臨形成一或多種前述病症風險之患者。患者或器官對一或多種前述病症之傾向可使用基因型、血清學或生物化學標記確定。
於本揭露之若干實施例中，係將共軛可活化之抗體投予經診斷具有與前述一或多種病症相關的臨床徵兆之人類個體。經診斷後，投予共軛可活化之抗體減輕或逆轉臨床徵兆的結果。
本揭露之抗體、共軛抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體亦可用於檢測患者試樣中之標靶，因此可作為診斷劑用。舉例而言，本揭露之抗體及/或可活化之抗體及其共軛形式用於活體外測定法(例如，ELISA)，以檢測患者試樣中之標靶量。
於一實施例中，本揭露之抗體、共軛抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體係固定於固體支撐物(例如，微量滴定盤之槽)上。經固定化之抗體、共軛之抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體作為可能存在測試試樣中的任何標靶之捕獲抗體用。於經固定之抗體及/或可活化之抗體及/或其共軛形式與患者試樣接觸之前，清洗固體支撐物，且以封阻劑例如牛奶蛋白或白蛋白處理以防止分析物之非特異性吸附。
隨後以懷疑含有抗原之測試試樣，或含有標準量抗原之溶液處理該等槽。該等試樣為，例如，源自懷疑具有被認為是病理學診斷的體液抗原量的個體之血清樣品。於沖洗掉測試試樣或標準品後，以可檢測之標籤之二次抗體處理固體支撐物。該經標記之二次抗體作為檢測抗體之用。測量可檢測標籤之量，並經由與源自標準試樣形成的標準曲線比較以確定測試試樣中標靶抗原的濃度。
應察知的是，根據使用本揭露之抗體及可活化之抗體與其共軛形式所得結果，於活體外診斷分析中，可能可根據標靶抗原之表現量將個體中之疾病分期。就既定疾病而言，血液試樣係取自經診斷處於該疾病進展的各個階段，及/或治療性處理該疾病的各個點之個體。使用針對每個進展或治療階段提供統計學顯著結果之樣品群，指定可被認為係各個階段特徵之一系列抗原濃度。
抗體、共軛抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體亦可用於診斷及/或成像方法中。於若干具體實例中，該等方法為活體外方法。於若干具體實例中，該等方法為活體內方法。於若干具體實例中，該等方法為原位方法。於若干具體實例中，該等方法為離體方法。舉例而言，具有酵素可切割之CM的可活化之抗體可用以檢測能切割CM的酵素之存在與否。該等可活化之抗體可用於診斷，其可包括經由測量既定宿主生物之既定細胞或組織中活化抗體(即，從可活化之抗體之切割產生的抗體)之累積以活體內檢測(例如，定性或定量)酵素活性(或，於若干具體實例中，還原潛力增加的環境，例如可提供二硫鍵還原的環境)。活化之抗體之該等累積不僅指示該組織表現酵素活性(或取決於CM性質而增加之還原潛力)，惟亦指示該組織表現與活化之抗體結合的標靶。
舉例而言，可選擇CM作為於腫瘤部位、於生物學受限部位(例如，於膿瘡、器官等中)之病毒或細菌感染位點發現的至少一種蛋白酶之基質。AB可為結合標靶抗原者。使用如本文揭示之方法，或適當時，熟習此項技藝者熟悉之方法，可使檢測標籤(例如，螢光標籤或放射性標籤或放射性示跡劑)與AB或抗體及/或可活化之抗體之其他區域共軛。上述篩選方法之上下文中已討論適當之可檢測標籤，下文提供另外之特定實例。使用對疾病狀態的蛋白質或肽具特異性之AB，以及其活性於所關注疾病組織中升高之至少一種蛋白酶，相對於其中CM特異性酵素不以可檢測量存在或以低於疾病組織中之量存在或無活性(例如，呈酶原形式或與抑制劑複合)之組織，可活化之抗體將展現與疾病組織增加之結合速率。由於小蛋白及肽經由腎臟過濾系統從血液迅速被清除，且因為對CM具特異性的酵素未以可檢測量存在(或以於無疾病組織中之較低量存在或以無活性構形存在)，相對於無疾病組織，疾病組織中活化之抗體之累積增強。
於另一實例中，可活化之抗體可用以檢測試樣中之切割劑存在與否。舉例而言，當可活化之抗體含有容易被酵素切割的CM時，該可活化之抗體可用以檢測(定性或者定量)試樣中酵素之存在。於另一實例中，當可活化之抗體含有容易被還原劑切割的CM時，該可活化之抗體可用以檢測(定性或者定量)試樣中還原狀態的存在。欲促進此等方法中之分析，可以可檢測地標記可活化之抗體，且可使其與支撐物(如，固體支撐物例如載玻片或珠粒)結合。該可檢測之標籤可位於該可活化之抗體切割後未釋出之部分，舉例而言，該可檢測之標籤可為淬滅螢光標籤或發生切割之前不可檢測之其他標籤。該測定法可經由，舉例而言，使該經固定、可檢測地標記之可活化之抗體與懷疑含有酵素及/或還原劑之試樣接觸足以發生切割的時間，然後洗滌以去除過量試樣及污染物而進行。然後經由在與試樣接觸之前該可活化之抗體可檢測信號之變化評估試樣中之切割劑(例如，酵素或還原劑)存在與否，例如，由於可活化之抗體被試樣中的切割劑切割，可檢測信號之存在及/或增加。
該等檢測方法亦可經修改以供檢測切割時能結合可活化之抗體的AB之標靶存在與否。因此，該測定法可經修改以評估切割劑存在與否及所關注標靶存在與否。切割劑存在與否可如上述經由可活化之抗體的可檢測標籤存在及/或增加予以檢測，及標靶存在與否可經由標靶-AB複合物例如，經由使用可檢測標籤之抗標靶抗體予以檢測。
可活化之抗體亦可用於原位成像以驗證可活化之抗體活化，例如，經由蛋白酶切割，及與特定標靶之結合。原位成像係能將生物試樣(例如細胞培養或組織切片)中之蛋白水解活性及標靶切片定位之技術。使用此技術，得以根據可檢測之標籤(例如，螢光標籤)的存在證實與既定標靶的結合以及蛋白水解活性。
此等技術可用於源自疾病部位(例如腫瘤組織)或健康組織之任何冷凍細胞或組織。此等技術亦可用於新鮮細胞或組織試樣。
於此等技術中，可活化之抗體係以可檢測之標籤標記。可檢測之標籤可為螢光染料[例如螢光團、螢光異硫氰酸鹽(FITC)、若丹明異硫氰酸鹽(TRITC)、Alexa Fluor®標籤]、近紅外(NIR)染料(例如，Qdot®奈米結晶)、膠態金屬、半抗原、放射性標記、生物素及擴增試劑例如鏈酶抗生物素蛋白或酵素(例如山葵過氧化酶或鹼性磷酸酶)。
檢測已與經標記、可活化之抗體一起培育的試樣中之標籤指示，該試樣含有標靶且含有對該可活化之抗體的CM具特異性之蛋白酶。於若干具體實例中，蛋白酶的存在可使用廣譜蛋白酶抑制劑，例如本文中所述者，及/或經由使用對該蛋白酶具特異性之製劑，舉例而言，例如抗體A11，對蛋白酶蛋白裂解酶具特異性且抑制蛋白裂解酶之蛋白水解活性予以證實；參見例如，國際公開案第WO 2010/129609號，2010年11月公開。使用例如本文所述之廣譜蛋白酶抑制劑及/或經由使用更具選擇性的抑制劑之相同方法可用以鑑定對該可活化之抗體的CM具特異性之蛋白酶。於若干具體實例中，標靶的存在可使用對該標靶具特異性之製劑，例如，另一抗體，或可與未標記之標靶競爭之可檢測標籤證實。於若干具體實例中，可使用未標記之可活化之抗體，利用經標記之二次抗體或更複雜之檢測系進行檢測。
類似之技術對於其中於個體(例如，哺乳動物，包括人類)中螢光信號之檢測指出疾病部位含有標靶且含有對該可活化之抗體的CM具特異性之蛋白酶之活體內成像亦有用。
根據可活化之抗體中的蛋白酶特異性CM，此等技術於用於檢測、鑑定或特性分析多種細胞、組織及生物中的蛋白酶活性之套組及/或試劑中亦有用。
本揭露提供於多種診斷及/或預防適應症中使用抗體及/或可活化之抗體之方法。舉例而言，本揭露提供檢測個體或試樣中之切割劑及所關注標靶存在與否之方法，該方法係經由(i)使個體或試樣與可活化之抗體接觸，其中該可活化之抗體包含遮蔽部分(MM)、被切割劑(例如，蛋白酶)切割之可切割部分(CM)及特異性結合所關注標靶之抗原結合結構域或其片段(AB)，其中該可活化之抗體呈未切割、不活化狀態，其包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM為抑制AB與標靶結合之肽，及其中MM未具AB之天然存在的結合夥伴之胺基酸序列且不呈AB天然結合夥伴之經修飾形式；及(b)其中，於未切割、不活化狀態下，MM干預AB與標靶之特異性結合，及於切割、活化狀態下，MM不干預或競爭AB與標靶之特異性結合；及(ii)測量個體或試樣中經活化的可活化之抗體之量，其中於個體或試樣中可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑及靶標存在個體或試樣中及其中於個體或試樣中無可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑、靶標或切割劑與靶標兩者不存在及/或不充分存在個體或試樣中。於若干具體實例中，該可活化之抗體為與治療劑共軛之可活化之抗體。於若干具體實例中，該可活化之抗體不與製劑共軛。於若干具體實例中，該可活化之抗體包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，可檢測之標籤位於AB上。於若干具體實例中，測量個體或試樣中可活化之抗體之量係使用與該活化之抗體特異性結合之二級試劑達成，其中該試劑包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，二級試劑為包含可檢測之標籤之抗體。
本揭露亦提供於個體或試樣中檢測切割劑存在與否之方法，該方法係經由(i)於所關注標靶(例如，標靶)存在下，使個體或試樣與可活化之抗體接觸，其中該可活化之抗體包含遮蔽部分(MM)、被切割劑(例如，蛋白酶)切割之可切割部分(CM)及特異性結合所關注標靶之抗原結合結構域或其片段(AB)，其中該可活化之抗體呈未切割、不活化狀態包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM為抑制AB與標靶結合之肽，及其中MM未具AB之天然存在的結合夥伴之胺基酸序列且不呈AB天然結合夥伴之經修飾形式；及(b)其中，於未切割、不活化狀態下，MM干預AB與標靶之特異性結合，及於切割、活化狀態下，MM不干預或競爭AB與標靶之特異性結合；及(ii)測量個體或試樣中經活化的可活化之抗體之量，其中於個體或試樣中可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑存在個體或試樣中及其中於個體或試樣中無可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑不存在及/或不充分存在個體或試樣中。於若干具體實例中，該可活化之抗體為與治療劑共軛之可活化之抗體。於若干具體實例中，該可活化之抗體不與製劑共軛。於若干具體實例中，該可活化之抗體包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，可檢測之標籤位於AB上。於若干具體實例中，測量個體或試樣中可活化之抗體之量係使用與該活化之抗體特異性結合之二級試劑達成，其中該試劑包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，二級試劑為包含可檢測之標籤之抗體。
本揭露亦提供用於檢測個體或試樣中之切割劑及標靶存在與否之方法的套組，其中該套組至少包含可活化之抗體，其包含遮蔽部分(MM)、被切割劑(例如，蛋白酶)切割之可切割部分(CM)及特異性結合所關注標靶之抗原結合結構域或其片段(AB)，其中該可活化之抗體呈未切割、不活化狀態，其包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM為抑制AB與標靶結合之肽，及其中MM未具AB之天然存在的結合夥伴之胺基酸序列且不呈AB天然結合夥伴之經修飾形式；及(b)其中，於未切割、不活化狀態下，MM干預AB與標靶之特異性結合，及於切割、活化狀態下，MM不干預或競爭AB與標靶之特異性結合；及(ii)測量個體或試樣中經活化的可活化之抗體之量，其中於個體或試樣中可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑存在個體或試樣中及其中於個體或試樣中無可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑不存在及/或不充分存在個體或試樣中。於若干具體實例中，該可活化之抗體為與治療劑共軛之可活化之抗體。於若干具體實例中，該可活化之抗體不與製劑共軛。於若干具體實例中，該可活化之抗體包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，可檢測之標籤位於AB上。於若干具體實例中，測量個體或試樣中可活化之抗體之量係使用與該活化之抗體特異性結合之二級試劑達成，其中該試劑包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，二級試劑為包含可檢測之標籤之抗體。
本揭露亦提供檢測個體或試樣中之切割劑存在與否之方法，該方法係經由(i)使個體或試樣與可活化之抗體接觸，其中該可活化之抗體包含遮蔽部分(MM)、被切割劑(例如，蛋白酶)切割之可切割部分(CM)、特異性結合標靶之抗原結合結構域(AB)及可檢測之標籤，其中該可活化之抗體呈未切割、不活化狀態包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB或AB-CM-MM；其中MM為抑制AB與標靶結合之肽，及其中MM未具AB之天然存在的結合夥伴之胺基酸序列且不為呈AB天然結合夥伴之經修飾形式；其中，於未切割、不活化狀態下，MM干預AB與標靶之特異性結合，及於切割、活化狀態下，MM不干預或競爭AB與標靶之特異性結合；及其中可檢測之標籤位於可活化之抗體的一部分，於切割CM後被釋出；及(ii)測量個體或試樣中可檢測的標籤之量，其中於個體或試樣中可檢測量之可檢測標籤指示切割劑不存在及/或不充分存在個體或試樣中及其中於個體或試樣中無可檢測量之可檢測標籤指示切割劑存在個體或試樣中。於若干具體實例中，該可活化之抗體為與治療劑共軛之可活化之抗體。於若干具體實例中，該可活化之抗體不與製劑共軛。於若干具體實例中，該可活化之抗體包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，可檢測之標籤位於AB上。於若干具體實例中，測量個體或試樣中可活化之抗體之量係使用與該活化之抗體特異性結合之二級試劑達成，其中該試劑包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，二級試劑為包含可檢測之標籤之抗體。
本揭露亦提供用於檢測個體或試樣中之切割劑及標靶存在與否之方法的套組，其中該套組至少包含用於與個體或生物試樣接觸之本文所述之可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體(例如，與治療劑共軛之可活化之抗體)及用於檢測個體或生物試樣中經活化的可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體之量之方法，其中於個體或生物試樣中可檢測量之經活化的可活化之抗體指示該切割劑及該標靶存在個體或生物試樣中及其中於個體或生物試樣中無可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑、靶標或切割劑與靶標兩者不存在及/或不充分存在個體或生物試樣中，使得無法於個體或生物試樣中檢測到該可活化之抗體之標靶結合及/或蛋白酶切割。
本揭露亦提供檢測個體或試樣中之切割劑存在與否之方法，該方法係經由(i)於標靶存在下，使個體或生物試樣與可活化之抗體接觸及(ii)測量個體或生物試樣中經活化的可活化之抗體之量，其中於個體或生物試樣中可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑存在個體或生物試樣中及其中於個體或生物試樣中無可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑不存在及/或不充分存在具可檢測量之個體或生物試樣中，使得無法於個體或生物試樣中檢測到該可活化之抗體之蛋白酶切割。該等可活化之抗體包含遮蔽部分(MM)、被切割劑(例如，蛋白酶)切割之可切割部分(CM)及特異性結合標靶之抗原結合結構域或其片段(AB)，其中該可活化之抗體呈未切割(即，不活化)狀態包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM為抑制AB與標靶結合之肽，及其中MM未具AB之天然存在的結合夥伴之胺基酸序列；及(b)其中呈未切割狀態的可活化之抗體之MM干預AB與標靶之特異性結合，及其中該呈切割(即，活化)狀態的可活化之抗體之MM不干預或競爭AB與標靶之特異性結合。於若干具體實例中，該可活化之抗體為與治療劑共軛之可活化之抗體。於若干具體實例中，該可活化之抗體不與製劑共軛。於若干具體實例中，可檢測之標籤附著於遮蔽部分。於若干具體實例中，可檢測之標籤附著於蛋白酶切割位點N端之可切割部分。於若干具體實例中，AB之單一抗原結合位點被遮蔽。於若干具體實例中，其中本揭露之抗體具有至少兩個抗原結合位點，至少一個抗原結合位點被遮蔽及至少一個抗原結合位點未被遮蔽。於若干具體實例中，所有抗原結合位點都被遮蔽。於若干具體實例中，測量步驟包括使用包含可檢測標籤之二級試劑。
本揭露亦提供用於檢測個體或試樣中之切割劑及標靶存在與否之方法的套組，其中該套組至少包含本文所述之可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體，用於在標靶存在下，使個體或生物試樣與可活化之抗體接觸及測量個體或生物試樣中經活化的可活化之抗體之量，其中於個體或生物試樣中可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑存在個體或生物試樣中及其中於個體或生物試樣中無可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑不存在及/或不充分存在具可檢測量之個體或生物試樣中，使得無法於個體或生物試樣中檢測到該可活化之抗體之蛋白酶切割。該等可活化之抗體包含遮蔽部分(MM)、被切割劑(例如，蛋白酶)切割之可切割部分(CM)及特異性結合標靶之抗原結合結構域或其片段(AB)，其中該可活化之抗體呈未切割(即，不活化)狀態包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM為抑制AB與標靶結合之肽，及其中MM未具AB之天然存在的結合夥伴之胺基酸序列；及(b)其中呈未切割狀態的可活化之抗體之MM干預AB與標靶之特異性結合，及其中該呈切割(即，活化)狀態的可活化之抗體之MM不干預或競爭AB與標靶之特異性結合。於若干具體實例中，該可活化之抗體為與治療劑共軛之可活化之抗體。於若干具體實例中，該可活化之抗體不與製劑共軛。於若干具體實例中，可檢測之標籤附著於遮蔽部分。於若干具體實例中，可檢測之標籤附著於蛋白酶切割位點N端之可切割部分。於若干具體實例中，AB之單一抗原結合位點被遮蔽。於若干具體實例中，其中本揭露之抗體具有至少兩個抗原結合位點，至少一個抗原結合位點被遮蔽及至少一個抗原結合位點未被遮蔽。於若干具體實例中，所有抗原結合位點都被遮蔽。於若干具體實例中，測量步驟包括使用包含可檢測標籤之二級試劑。
本揭露亦提供用於檢測個體或試樣中之切割劑存在與否之方法的套組，其中該套組至少包含本文所述之可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體，用於與個體或生物試樣接觸及用於檢測個體或生物試樣中經活化的可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體之量之方法，其中該可活化之抗體包含位於可活化之抗體的一部分，於切割CM後被釋出之可檢測之標籤，其中於個體或生物試樣中可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑不存在及/或不充分存在個體或生物試樣中使得無法於個體或生物試樣中檢測到該可活化之抗體之標靶結合及/或蛋白酶切割，及其中於個體或生物試樣中無可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑存在具可檢測量之個體或生物試樣中。
本揭露提供檢測個體或試樣中之切割劑及標靶存在與否之方法，該方法係經由(i)使個體或生物試樣與可活化之抗體接觸，其中該可活化之抗體包含位於可活化之抗體的一部分，於切割CM後被釋出之可檢測之標籤及(ii)測量個體或生物試樣中經活化的可活化之抗體之量，其中個體或生物試樣中可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑、靶標或切割劑與靶標兩者不存在及/或不充分存在個體或生物試樣中，使得無法於個體或生物試樣中檢測到該可活化之抗體之標靶結合及/或蛋白酶切割，及其中個體或生物試樣中可檢測量減少之經活化的可活化之抗體指示該切割劑及該標靶存在個體或生物試樣中。可檢測之標籤之減少量為，舉例而言，減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%及/或約100%。該等可活化之抗體包含遮蔽部分(MM)、被切割劑切割之可切割部分(CM)及特異性結合標靶之抗原結合結構域或其片段(AB)，其中該可活化之抗體呈未切割(即，不活化)狀態包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM為抑制AB與標靶結合之肽，及其中MM未具AB之天然存在的結合夥伴之胺基酸序列；及(b)其中呈未切割狀態的可活化之抗體之MM干預AB與標靶之特異性結合，及其中該呈切割(即，活化)狀態的可活化之抗體之MM不干預或競爭AB與標靶之特異性結合。於若干具體實例中，該可活化之抗體為與治療劑共軛之可活化之抗體。於若干具體實例中，該可活化之抗體不與製劑共軛。於若干具體實例中，該可活化之抗體包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，可檢測之標籤位於AB上。於若干具體實例中，測量個體或試樣中可活化之抗體之量係使用與該活化之抗體特異性結合之二級試劑達成，其中該試劑包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，二級試劑為包含可檢測之標籤之抗體。
本揭露亦提供用於檢測個體或試樣中之切割劑及標靶存在與否之方法的套組，其中該套組至少包含用於與個體或生物試樣接觸之本文所述之可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體及用於檢測個體或生物試樣中經活化的可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體之量之方法，其中個體或生物試樣中可檢測量之經活化的可活化之抗體指示切割劑、靶標或切割劑與靶標兩者不存在及/或不充分存在個體或生物試樣中，使得無法於個體或生物試樣中檢測到該可活化之抗體之標靶結合及/或蛋白酶切割，及其中個體或生物試樣中可檢測量減少之經活化的可活化之抗體指示該切割劑及該標靶存在個體或生物試樣中。可檢測之標籤之減少量為，舉例而言，減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%及/或約100%。
本揭露亦提供檢測個體或試樣中之切割劑存在與否之方法，該方法係經由(i)使個體或生物試樣與可活化之抗體接觸，其中該可活化之抗體包含位於可活化之抗體的一部分，於切割CM後被釋出之可檢測之標籤；及(ii)測量個體或生物試樣中可檢的標籤之量，其中於個體或生物試樣中可檢測量之可檢測標籤指示切割劑不存在及/或不充分存在具可檢測量之個體或生物試樣中，使得無法於個體或生物試樣中檢測到該可活化之抗體之蛋白酶切割，及其中個體或生物試樣中可檢測量減少之可檢測標籤指示切割劑存在個體或生物試樣中。可檢測之標籤之減少量為，舉例而言，減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%及/或約100%。該等可活化之抗體包含遮蔽部分(MM)、被切割劑切割之可切割部分(CM)及特異性結合標靶之抗原結合結構域或其片段(AB)，其中該可活化之抗體呈未切割(即，不活化)狀態包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM為抑制AB與標靶結合之肽，及其中MM未具AB之天然存在的結合夥伴之胺基酸序列；及(b)其中呈未切割狀態的可活化之抗體之MM干預AB與標靶之特異性結合，及其中該呈切割(即，活化)狀態的可活化之抗體之MM不干預或競爭AB與標靶之特異性結合。於若干具體實例中，該可活化之抗體為與治療劑共軛之可活化之抗體。於若干具體實例中，該可活化之抗體不與製劑共軛。於若干具體實例中，該可活化之抗體包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，可檢測之標籤位於AB上。於若干具體實例中，測量個體或試樣中可活化之抗體之量係使用與該活化之抗體特異性結合之二級試劑達成，其中該試劑包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，二級試劑為包含可檢測之標籤之抗體。
本揭露亦提供用於檢測個體或試樣中之所關注切割劑存在與否之方法的套組，其中該套組至少包含用於與個體或生物試樣接觸之本文所述之可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體及用於檢測個體或生物試樣中經活化的可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體之量之方法，其中該可活化之抗體包含位於可活化之抗體的一部分，於切割CM後被釋出之可檢測之標籤，其中於個體或生物試樣中可檢測量之可檢測標籤指示切割劑、靶標或切割劑與靶標兩者不存在及/或不充分存在個體或生物試樣中，使得無法於個體或生物試樣中檢測到該可活化之抗體之標靶結合及/或蛋白酶切割，及其中個體或生物試樣中可檢測量減少之可檢測標籤指示該切割劑及該標靶存在個體或生物試樣中。可檢測之標籤之減少量為，舉例而言，減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%及/或約100%。
於此等方法及套組之之若干具體實例中，該可活化之抗體包含可檢測之標籤。於此等方法及套組之若干具體實例中，可檢測之標籤包括顯影劑、對比劑、酵素、螢光標籤、發色團、染料、一或多種金屬離子或配體系標籤。於此等方法及套組之若干具體實例中，顯像劑包含放射性同位素。於此等方法及套組之若干具體實例中，放射性同位素為銦或鎝。於此等方法及套組之若干具體實例中，對比劑包含碘、釓或氧化鐵。於此等方法及套組之若干具體實例中，酵素包含山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。於此等方法及套組之若干具體實例中，螢光標籤包含黃螢光蛋白(YFP)、青螢光蛋白(CFP)、綠螢光蛋白(GFP)、經修飾之紅螢光蛋白(mRFP)、紅螢光蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED或銪衍生物。於此等方法及套組之若干具體實例中，發光標籤包含N-甲基吖啶鎓衍生物。於此等方法之若干具體實例中，標籤包含Alexa Fluor® 標籤、例如Alex Fluor® 680或Alexa Fluor® 750。於此等方法及套組之若干具體實例中，配體系標籤包含生物素、抗生物素蛋白、鏈酶抗生物素蛋白或一或多個半抗原。
於此等方法及套組之若干具體實例中，個體為哺乳動物。於此等方法及套組之若干具體實例中，個體為人類。於若干具體實例中，個體為非人類哺乳動物，例如非人類靈長類動物伴生動物(例如貓、狗、馬)、農場動物、役畜或動物園動物。於若干具體實例中，個體為囓齒動物。
於此等方法之若干具體實例中，該方法為活體內方法。於此等方法之若干具體實例中，該方法為原位方法。於此等方法之若干具體實例中，該方法為擬體內方法。於此等方法之若干具體實例中，該方法為活體外方法。
於若干具體實例中，原位成像及/或活體內成像於鑑定患者治療之方法中有用。舉例而言，於原位成像中，可活化之抗體係用以篩選患者試樣以鑑定於適當位置(例如，於腫瘤部位)具有適當蛋白酶及標靶之彼等患者。
於若干具體實例中，原位成像係用以鑑定或者改善適於以本揭露之可活化之抗體治療的患者族群。舉例而言，對於標靶(例如，標靶)以及切割所測試可活化之抗體可切割部分(CM)中的基質之蛋白酶二者之測試皆呈陽性(例如，於疾病部位累積活化之抗體)之患者被鑑定為使用包含該等CM之該等可活化之抗體治療之適當候選者。同樣地，使用此等方法對於標靶(例如，標靶)及切割所測試可活化之抗體之CM中基質之蛋白酶之測試中之任一或二者皆呈陰性之患者可能被鑑定為另一種治療形式之適當候選者。於若干具體實例中，相對於第一個可活化之抗體測試陰性之該等患者可以包含不同CM之其他可活化之抗體測試直到鑑定出用於治療之適當可活化之抗體(例如，包含於疾病部位被患者切割的CM之可活化之抗體)。於若干具體實例中，然後投予該患者治療有效量之對該患者之測試呈陽性之可活化之抗體。
於若干具體實例中，活體內成像係用以鑑定或者改善適於以本揭露之可活化之抗體治療的患者族群。舉例而言，對於標靶(例如，標靶)以及切割所測試可活化之抗體可切割部分(CM)中的基質之蛋白酶二者之測試皆呈陽性(例如，於疾病部位累積活化之抗體)之患者被鑑定為使用包含該等CM之該等可活化之抗體治療之適當候選者。同樣地，測試陰性之患者可能被鑑定為另一治療形式之適當候選者。於若干具體實例中，相對於第一個可活化之抗體測試陰性之該等患者可以包含不同CM之其他可活化之抗體測試直到鑑定出用於治療之適當可活化之抗體(例如，包含於疾病部位被患者切割的CM之可活化之抗體)。於若干具體實例中，然後投予該患者治療有效量之對該患者之測試呈陽性之可活化之抗體。
於方法及套組之若干具體實例中，該方法或套組係用以鑑定或者改善適於以本揭露之可活化之抗體治療的患者族群。舉例而言，對於標靶(例如，標靶)以及切割所測試可活化之抗體可切割部分(CM)中的基質之蛋白酶二者使用此等方法之測試皆呈陽性(例如，於疾病部位累積活化之抗體)之患者被鑑定為使用包含該等CM之該等可活化之抗體治療之適當候選者。同樣地，使用此等方法對於標靶(例如，標靶)及切割所測試可活化之抗體之CM中基質的蛋白酶之測試中兩者皆呈陰性之患者可能被鑑定為另一種治療形式之適當候選者。於若干具體實例中，該等患者可以其他可活化之抗體測試直到鑑定出用於治療之適當可活化之抗體(例如，包含於疾病部位被患者切割的CM之可活化之抗體)。於若干具體實例中，對於任一標靶(例如，標靶)之測試呈陰性之患者被鑑定為使用包含該等CM之該等可活化之抗體治療之適當候選者。於若干具體實例中，對於任一標靶(例如，標靶)之測試呈陰性之患者被鑑定為不是使用包含該等CM之該等可活化之抗體治療之適當候選者。於若干具體實例中，該等患者可以其他可活化之抗體測試直到鑑定出用於治療之適當可活化之抗體(例如，包含於疾病部位被患者切割的CM之可活化之抗體)。於若干具體實例中，該可活化之抗體為與治療劑共軛之可活化之抗體。於若干具體實例中，該可活化之抗體不與製劑共軛。於若干具體實例中，該可活化之抗體包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，可檢測之標籤位於AB上。於若干具體實例中，測量個體或試樣中可活化之抗體之量係使用與該活化之抗體特異性結合之二級試劑達成，其中該試劑包含可檢測之標籤。於若干具體實例中，二級試劑為包含可檢測之標籤之抗體。
於若干具體實例中，方法或套組係用以鑑定或者改善適於以本揭露之抗標靶可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體(例如，與治療劑共軛之可活化之抗體)治療的患者族群，隨後經由投予有其需要之個體該可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體進行治療。舉例而言，於此等方法中，對於標靶(例如，標靶)以及切割所測試可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體可切割部分(CM)中的基質之蛋白酶二者之測試皆呈陽性之患者被鑑定為使用包含該等CM之該等抗體及/或該等共軛可活化之抗體治療之適當候選者，然後投予該患者治療有效量之經測試之該可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體。同樣地，使用此等方法對於標靶(例如，標靶)及切割所測試可活化之抗體之CM中基質之蛋白酶之測試中之任一或二者皆呈陰性之患者可能被鑑定為另一種治療形式之適當候選者。於若干具體實例中，該等患者可以其他可活化之抗體測試直到鑑定出用於治療之適當可活化之抗體(例如，包含於疾病部位被患者切割的CM之可活化之抗體)。於若干具體實例中，然後投予該患者治療有效量之對該患者之測試呈陽性之可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體。
於此等方法及套組之若干具體實例中，MM為長度約4至40個胺基酸之肽。於此等方法及套組之若干具體實例中，該可活化之抗體包含連接子肽，其中該連接子肽位於MM與CM之間。於此等方法及套組之之若干具體實例中，該可活化之抗體包含連接子肽，其中該連接子肽位於AB與CM之間。於此等方法及套組之之若干具體實例中，該可活化之抗體包含第一連接子肽(LP1)及第二連接子肽(LP2)，其中該第一連接子肽位於MM與CM之間及該第二連接子肽位於AB與CM之間。於此等方法及套組之若干具體實例中，LP1及LP2各為長度約1至20個胺基酸之肽，及其中各LP1及LP2不需要為相同之連接子。於此等方法及套組之若干具體實例中，LP1及LP2之一或二者包含甘胺酸-絲胺酸聚合物。於此等方法及套組之若干具體實例中，LP1及LP2至少一者包含選自包括(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：24)及(GGGS)n(SEQ ID NO：25)之組群之胺基酸序列，其中n係至少為1之整數。於此等方法及套組之若干具體實例中，LP1及LP2至少一者包含具式(GGS)n之胺基酸序列，其中n係至少為1之整數。於此等方法及套組之若干具體實例中，LP1及LP2至少一者包含選自包括Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：26)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：27)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：28)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：29)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：30)及Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO：31)之組群之胺基酸序列。
於此等方法及套組之若干具體實例中，該AB包含選自本文提供的交叉反應性抗體序列之抗體或抗體片段序列。於此等方法及套組之若干具體實例中，AB包含Fab 片段、scFv或單鏈抗體(scAb)。
於此等方法及套組之若干具體實例中，切割劑為與標靶共位於個體或試樣中之蛋白酶及CM為作用為蛋白酶基質之多肽，其中當可活化之抗體暴露於蛋白酶時，該蛋白酶切割可活化之抗體中之CM。於此等方法及套組之若干具體實例中，CM為長度多達15個胺基酸之多肽。於此等方法及套組之若干具體實例中，CM係偶合於AB之N端。於此等方法及套組之若干具體實例中，CM係偶合於AB之C端。於此等方法及套組之若干具體實例中，CM係偶合於AB之VL鏈之N端。
由於一般觀察到的轉譯後修飾，本發明抗體多肽鏈之N端及C端可與本文所述之序列不同。舉例而言，抗體重鏈中常缺少C端離胺酸殘基[Dick et al.(2008) Biotechnol. Bioeng. 100：1132]。於治療性抗體之輕鏈以及重鏈上，N端麩胺醯胺殘基，及較少程度之麩胺酸殘基，常轉化為焦麩胺酸殘基[Dick et al.(2007) Biotechnol. Bioeng. 97：544；Liu et al.(2011) JBC 28611211；Liu et al.(2011) J. Biol. Chem. 286：11211]。因此，式(I)及/或式(II)之共軛可活化之抗體可具有其中重鏈恆定區之C端殘基於末端缺少一或多個胺基酸、缺少C端離胺酸、由於轉譯後處理而移除C端離胺酸或C端離胺酸為離胺酸以外之胺基酸之抗體(AB)。於一實施例中，若重鏈恆定區之C端殘基為離胺酸以外之胺基酸，則其為不能形成二硫鍵或者不能與胞毒劑共軛之胺基酸。
於特定實施例中，式(I)及/或式(II)之共軛可活化之抗體可具有抗體(AB)，其中重鏈及/或輕鏈任一者之N端麩胺酸視需要為焦麩胺酸或者轉譯後修飾為焦麩胺酸。
於特定實施例中，式(I)及/或式(II)共軛可活化之抗體之重鏈恆定區於C端包含離胺酸或另一胺基酸，例如，其包含下述最後胺基酸：重鏈之PGK。於特定實施例中，重鏈恆定區於C端缺少一或多個胺基酸，及具有，例如，C端序列PG或P。
於特定實施例中，式(I)及/或式(II)共軛可活化之抗體之重鏈及/或輕鏈可變區於N端包含麩胺酸或焦麩胺酸胺基酸，例如，其包含下述最後胺基酸：輕鏈之pQGQ及/或重鏈之pQVQ，其中“pQ”代表焦麩胺酸。
本揭露之抗體、共軛之抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體係於診斷及預防調配物中使用。於一實施例中，可活化之抗體係投予瀕臨形成一或多種前述發炎、炎性病症、癌症或其他病症風險之患者。
可使用基因型、血清學或生物化學標記確定患者或器官對一或多種前述病症之傾向。
於本揭露之若干實施例中，係投予經診斷具有與前述一或多種病症相關的臨床徵兆之人類個體抗體、共軛抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體。經診斷後，投予抗體、共軛抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體以減輕或逆轉臨床徵兆的結果。
本揭露之抗體、共軛之抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體亦可用於檢測患者試樣中之標靶因此可作為診斷劑用。舉例而言，本揭露之抗體、共軛之抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體係用於活體外測定法，例如，ELISA，以檢測患者試樣中之標靶量。
於一實施例中，本揭露之抗體及/或可活化之抗體係固定於固體支撐物(例如，微量滴定盤之槽)上。該經固定之抗體及/或可活化之抗體作為可能存在測試試樣中的任何標靶之捕獲抗體用。於經固定之抗體及/或可活化之抗體與患者試樣接觸之前，清洗固體支撐物，且以封阻劑例如牛奶蛋白或白蛋白處理以防止分析物之非特異性吸附。
隨後以懷疑含有抗原之測試試樣，或含有標準量抗原之溶液處理該等槽。該等試樣為，例如，源自懷疑具有被認為是病理學診斷的循環抗原量的個體之血清樣品。於沖洗掉測試試樣或標準品後，以可檢測之標籤之二次抗體處理固體支撐物。該經標記之二次抗體作為檢測抗體之用。測量可檢測之標籤之量，並經由與源自標準試樣形成的標準曲線比較以確定測試試樣中標靶抗原的濃度。
應察知的是，根據使用本揭露之抗體及/或可活化之抗體所得結果，於活體外診斷分析中，可能可根據標靶抗原之表現量將個體中之疾病分期。就既定疾病而言，血液試樣係取自經診斷處於該疾病進展的各個階段，及/或治療處理該疾病的各個點之個體。使用針對每個進展或治療階段提供統計學顯著結果之樣品群，指定可被認為係各個階段特徵之一系列抗原濃度。
抗體、共軛之抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體亦可用於診斷及/或成像方法中。於若干具體實例中，該等方法為活體外方法。於若干具體實例中，該等方法為活體內方法。於若干具體實例中，該等方法為原位方法。於若干具體實例中，該等方法為離體方法。舉例而言，具有酵素可切割之CM的可活化之抗體可用以檢測能切割CM的酵素之存在與否。該等可活化之抗體可用於診斷，其可包括經由測量既定宿主生物之既定細胞或組織中活化抗體(即，從可活化之抗體之切割產生的抗體)之累積以活體內檢測(例如，定性或定量)酵素活性(或，於若干具體實例中，還原潛力增加的環境，例如可提供二硫鍵還原的環境)。活化之抗體之該等累積不僅指示該組織表現酵素活性(或取決於CM性質而增加之還原潛力)，惟亦指示該組織表現與活化之抗體結合的標靶。
舉例而言，可選擇CM作為於腫瘤部位、於生物學受限部位(例如，於膿瘡、器官等中)之病毒或細菌感染位點發現的蛋白酶之蛋白酶基質。AB可為結合標靶抗原者。使用熟習此項技藝者熟悉之方法，可使檢測標籤(例如，螢光標籤或放射性標籤或放射性示跡劑)與AB或可活化之抗體之其他區域共軛。上述篩選方法之上下文中已討論適當之可檢測標籤，下文提供另外之特定實例。使用對疾病狀態的蛋白質或肽具特異性之AB，以及其活性於所關注疾病組織中升高之至少一種蛋白酶，相對於其中CM特異性酵素不以可檢測量存在或以低於疾病組織中之量存在或無活性(例如，呈酶原形式或與抑制劑複合)之組織，可活化之抗體將展現與疾病組織增加之結合速率。由於小蛋白及肽經由腎臟過濾系統從血液迅速被清除，且因為對CM具特異性的酵素未以可檢測量存在(或以於無疾病組織中之較低量存在或以無活性構形存在)，相對於無疾病組織，疾病組織中活化之抗體之累積增強。
於另一實例中，可活化之抗體可用以檢測試樣中之切割劑存在與否。舉例而言，當可活化之抗體含有容易被酵素切割的CM時該可活化之抗體可用以檢測(定性或者定量)試樣中酵素之存在。於另一實例中，當可活化之抗體含有容易被還原劑切割的CM時，該可活化之抗體可用以檢測(定性或者定量)試樣中還原狀態的存在。欲促進此等方法中之分析，可以可檢測地標記可活化之抗體，且可使其與支撐物(如，固體支撐物例如載玻片或珠粒)結合。該可檢測之標籤可位於該可活化之抗體切割後未釋出之部分，舉例而言，該可檢測之標籤可為淬滅螢光標籤或發生切割之前不可檢測之其他標籤。該測定法可經由，舉例而言，使該經固定、可檢測地標記之可活化之抗體與懷疑含有酵素及/或還原劑之試樣接觸足以發生切割的時間，然後洗滌以去除過量試樣及污染物而進行。然後經由在與試樣接觸之前該可活化之抗體可檢測信號之變化評估試樣中之切割劑(例如，酵素或還原劑)存在與否，例如，由於可活化之抗體被試樣中的切割劑切割，可檢測信號之存在及/或增加。
該等檢測方法亦可經修改以供檢測切割時能結合可活化之抗體的AB之標靶存在與否。因此，該測定法可經修改以評估切割劑存在與否及所關注標靶存在與否。切割劑存在與否可如上述經由可活化之抗體的可檢測標籤存在及/或增加予以檢測，及標靶存在與否可經由標靶-AB複合物例如，經由使用可檢測標籤之抗標靶抗體予以檢測。
可活化之抗體亦可用於原位成像以驗證可活化之抗體活化，例如，經由蛋白酶切割，及與特定標靶之結合。原位成像係能將生物試樣(例如細胞培養或組織切片)中之蛋白水解活性及標靶切片定位之技術。使用此技術，得以根據可檢測之標籤(例如，螢光標籤)的存在證實與既定標靶的結合以及蛋白水解活性。
此等技術可用於源自疾病部位(例如腫瘤組織)或健康組織之任何冷凍細胞或組織。此等技術亦可用於新鮮細胞或組織試樣。
於此等技術中，可活化之抗體係以可檢測標籤標記。可檢測之標籤可為螢光染料[例如螢光異硫氰酸鹽(FITC)、若丹明異硫氰酸鹽(TRITC)]、近紅外(NIR)染料(例如，Qdot®奈米結晶)、膠態金屬、半抗原、放射性標記、生物素及擴增試劑例如鏈酶抗生物素蛋白或酵素(例如山葵過氧化酶或鹼性磷酸酶)。
檢測已與經標記、可活化之抗體一起培育的試樣中之標籤指示，該試樣含有標靶且含有對該可活化之抗體的CM具特異性之蛋白酶。於若干具體實例中，蛋白酶的存在可使用廣譜蛋白酶抑制劑，例如本文所述者，及/或經由使用對該蛋白酶具特異性之製劑，舉例而言，例如抗體A11，對蛋白酶蛋白裂解酶具特異性且抑制蛋白裂解酶之蛋白水解活性予以證實；參見例如，International Publication Number WO 2010/129609, published 11 November 2010。使用例如本文所述之廣譜蛋白酶抑制劑及/或經由使用更具選擇性的抑制劑之相同方法可用以鑑定對該可活化之抗體的CM具特異性之蛋白酶或蛋白酶類別。於若干具體實例中，標靶的存在可使用對該標靶具特異性之製劑，例如，另一抗體，或可與未標記之標靶競爭之可檢測之標籤證實。於若干具體實例中，可使用未標記之可活化之抗體，利用經標記之二次抗體或更複雜之檢測系進行檢測。
類似之技術對於其中於個體(例如，哺乳動物，包括人類)中螢光信號之檢測指出疾病部位含有標靶且含有對該可活化之抗體的CM具特異性之蛋白酶之活體內成像亦有用。
根據可活化之抗體中的蛋白酶特異性CM，此等技術於用於檢測、鑑定或特性分析多種細胞、組織及生物中的蛋白酶活性之套組及/或試劑中亦有用。
於若干具體實例中，原位成像及/或活體內成像於鑑定患者治療之方法中有用。舉例而言，於原位成像中，可活化之抗體係用以篩選患者試樣以鑑定於適當位置(例如，於腫瘤部位)具有適當蛋白酶及標靶之彼等患者。
於若干具體實例中，原位成像係用以鑑定或者改善適於以本揭露之可活化之抗體治療的患者族群。舉例而言，對於標靶以及切割所測試可活化之抗體可切割部分(CM)中的基質之蛋白酶二者之測試皆呈陽性(例如，於疾病部位累積活化之抗體)之患者被鑑定為使用包含該等CM之該等可活化之抗體治療之適當候選者。同樣地，使用此等方法對於標靶以及切割所測試可活化之抗體之CM中基質之蛋白酶之測試中之二者皆呈陰性之患者被鑑定為另一種治療形式(即，不適合以所測試之可活化之抗體治療)之適當候選者。於若干具體實例中，相對於第一個可活化之抗體測試陰性之該等患者可以包含不同CM之其他可活化之抗體測試直到鑑定出用於治療之適當可活化之抗體(例如，包含於疾病部位被患者切割的CM之可活化之抗體)。
於若干具體實例中，活體內成像係用以鑑定或者改善適於以本揭露之可活化之抗體治療的患者族群。舉例而言，對於標靶以及切割所測試可活化之抗體可切割部分(CM)中的基質之蛋白酶二者之測試皆呈陽性(例如，於疾病部位累積活化之抗體)之患者被鑑定為使用包含該等CM之該等可活化之抗體治療之適當候選者。同樣地，對於標靶及切割所測試可活化之抗體CM中的基質之蛋白酶中任一者或兩者使用此等方法之測試為陰性之患者被鑑定為另一治療形式之適當候選者(即，不適合以所測試之可活化之抗體治療)。於若干具體實例中，相對於第一個可活化之抗體測試陰性之該等患者可以包含不同CM之其他可活化之抗體測試直到鑑定出用於治療之適當可活化之抗體(例如，包含於疾病部位被患者切割的CM之可活化之抗體)。

醫藥組成物
本揭露之抗體、共軛之抗體、可活化之抗體及/或共軛可活化之抗體(於本文中亦稱為“活性化合物”)及其衍生物、片段、類似物與同源物，可併入適用於投予之醫藥組成物中。
特別有利的為，為了容易給藥及劑量一致，調配呈劑量單位型之口服或非經口組成物。如本文所用之劑量單位型係指適合供待治療個體用之呈單位劑量之物理分離單元；各單元含有經計算可與所需藥學上可接受之載劑一起產生所欲治療效果之預定量之活性化合物。本揭露的劑量單位型之說明書由直接取決於活性化合物的獨特特徵及欲達成之特定治療效果，以及配製用於治療個體的該等活性化合物於此項技藝中之固有局限決定。
醫藥組成物可與給藥說明一起包含於容器、包裝或分配器中。
茲以下文列舉之實施例及實例進一步說明本發明，其不對專利申請範圍中敘述之本發明範圍構成侷限。

列舉之實施例
本發明可經由參考下文列舉之說明性具體實例予以界定。
第I組
I-1. 一種共軛可活化之抗體，其包含：
(a)可活化之抗體(AA)，其於未切割狀態下包含從N端至C端之結構排列如下，其中：
(i) AB為特異性結合哺乳動物CD71之抗體且包含SEQ ID NO：5之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：7之輕鏈可變區序列；
(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，與該AB偶合之該MM抑制該AB與CD71之結合；
(iii) CM為與該AB偶合之包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；以及
(b)單甲基澳瑞他汀E(MMAE)，其中該可活化之抗體與兩個當量之MMAE共軛。
I-2. 一種組成物，其包含：具式AA-(AG)p之共軛可活化之抗體，其中
(a) AA為可活化之抗體，其於未切割狀態下包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB，其中：
(i) AB為特異性結合哺乳動物CD71之抗體且包含SEQ ID NO：5之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：7之輕鏈可變區序列，
(ii) MM為包括SEQ ID NO：18序列之遮蔽部分，其中當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，與該AB偶合之該MM抑制該AB與CD71之結合，以及
(iii) CM為包括與該AB偶合之SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及
(b) AG為與該AA共軛之劑，其中該劑為MMAE且其中p為2。
I-3. 一種製造共軛可活化之抗體之方法，該方法包括：使至少一個MMAE與可活化之抗體(AA)共軛從而產生包含AA-(MMAE)p之組成物，其中p為1至8；且使組成物富含其中p為2之該共軛可活化之抗體類，其中呈未切割狀態之AA包含從N端至C端之結構排列如下：MM-CM-AB，其中：
(i) AB為特異性結合哺乳動物CD71之抗體且包含SEQ ID NO：5之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：7之輕鏈可變區序列，
(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，與該AB偶合之該MM抑制該AB與CD71之結合，以及
(iii) CM為包括與該AB偶合之SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽。
I-4. 具體實例I-1之共軛可活化之抗體或具體實例I-2之組成物或具體實例I-3之方法，其中該AB包含SEQ ID NO：20之重鏈序列。
I-5. 具體實例I-1之共軛可活化之抗體或具體實例I-2之組成物或具體實例I-3之方法，其中該AB包含SEQ ID NO：167之重鏈序列。
I-6. 具體實例I-1、I-4、及I-5任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2、I-4、及I-5任一者之組成物或任一者之方法具體實例I-3至I-5，其中該AB包含SEQ ID NO：19之輕鏈序列。
I-7. 具體實例I-1及I-4至I-6任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及 I-4至I-6任一者之組成物或具體實例I-3至6任一者之方法，其中該AA包含該AB與該MM間之連接肽LP1。
I-8. 具體實例I-7之共軛可活化之抗體或組成物或方法，其中該LP1包含GGGSSGGS(SEQ ID NO：207)之胺基酸序列。
I-9. 具體實例I-1及4至8任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-8任一者之組成物或具體實例I-3至I-8任一者之方法，其中該AA包含該AB與該CM間之連接肽LP2。
I-10. 具體實例I-9之共軛可活化之抗體或組成物或方法，其中該LP2包含GGGS(SEQ ID NO：38)之胺基酸序列。
I-11. 具體實例I-1及I-4至I-10任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-10任一者之組成物或具體實例I-3至I-10任一者之方法，其中該AA包含第一連接肽(LP1)及第二連接肽(LP2)，及其中呈未切割狀態之該AA具有從N端至C端之結構排列如下：MM-LP1-CM-LP2-AB。
I-12. 具體實例I-1及I-4至I-11任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-11任一者之組成物或具體實例I-3至I-11任一者之方法，其中該可活化之抗體包含輕鏈，其包含選自包括SEQ ID NO：138及143-145與GQG之組群之間隔子序列。
I-13. 具體實例I-12之共軛可活化之抗體或組成物或方法，其中該間隔子序列在MM之N端。
I-14. 具體實例I-1及I-4至I-13任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-13任一者之組成物或具體實例I-3至I-13任一者之方法，其中該可活化之抗體包含SEQ ID NO：201之輕鏈可變區序列。
I-15. 具體實例I-1及I-4至I-13任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-13任一者之組成物或具體實例I-3至I-13任一者之方法，其中該可活化之抗體包含SEQ ID NO：202之輕鏈可變區序列。
I-16. 具體實例I-1及I-4至I-13任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-13任一者之組成物或具體實例I-3至I-13任一者之方法，其中該可活化之抗體包含SEQ ID NO：169之輕鏈序列。
I-17. 具體實例I-1及I-4至I-13任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-13任一者之組成物或具體實例I-3至I-13任一者之方法，其中該可活化之抗體包含SEQ ID NO：170之輕鏈序列。
I-18. 具體實例I-1及I-4至I-17任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-17任一者之組成物或任一者之方法具體實例I-3至I-17，其中該AB特異性結合人類CD71及馬來猴CD71。
I-19. 具體實例I-1及I-4至I-18任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及4至18任一者之組成物或具體實例I-3至I-18任一者之方法，其中該MM具有與AB結合之解離常數，其大於AB與CD71之解離常數。
I-20. 具體實例I-1及I-4至I-19任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-19任一者之組成物或具體實例I-3至I-19任一者之方法，其中當該可活化之抗體呈切割狀態時，該MM不干預或競爭AB與CD71之結合。
I-21. 具體實例I-1及I-4至I-20任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-20任一者之組成物或具體實例I-3至I-任一者之方法20，其中該MM為長度不超過40個胺基酸之多肽。
I-22. 具體實例I-1及I-4至I-21任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-21任一者之組成物或具體實例I-3至I-21任一者之方法，其中該CM係於患病組織中具活性之蛋白酶之基質。
I-23. 具體實例I-1及I-4至I-22任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-22任一者之組成物或具體實例I-3至I-22任一者之方法，其中該劑經由連接子與該AB共軛。
I-24. 具體實例I-1及I-4至I-23任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-23任一者之組成物或具體實例I-3至I-23任一者之方法，其中該劑與該AB共軛之連接子包含纈胺酸-瓜胺酸部分。
I-25. 具體實例I-1及I-4至I-24任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-24任一者之組成物或具體實例I-3至I-24任一者之方法，其中該劑與該AB共軛之連接子包含-纈胺酸-瓜胺酸部分。
I-26. 具體實例I-1及I-4至I-25任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-25任一者之組成物或具體實例I-3至I-25任一者之方法，其中該劑與該AB共軛之連接子包含馬來醯亞胺己醯基-纈胺酸-瓜胺酸對胺基苄氧基羰基部分。
I-27. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中該組成物至少50%之共軛可活化之抗體為當p為2之類別。
I-28. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中該組成物至少75%之共軛可活化之抗體為當p為2之類別。
I-29. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中該組成物至少90%之共軛可活化之抗體為當p為2之類別。
I-30. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中該組成物至少95%之共軛可活化之抗體為當p為2之類別。
I-31. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中該組成物至少98%之共軛可活化之抗體為當p為2之類別。
I-32. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中p為1或3至8之組成物的各共軛可活化之抗體類別之當量數小於其中p為2之組成物的共軛可活化之抗體類別之當量數。
I-33. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中p為1或3至8之組成物的共軛可活化之抗體類別小於其中p為2之組成物的共軛可活化之抗體類別之當量數。
I-34. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中該組成物小於50%之共軛可活化之抗體類別為當p為1或3至8之類別。
I-35. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中該組成物小於25%之共軛可活化之抗體類別為當p為1或3至8之類別。
I-36. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中該組成物小於10%之共軛可活化之抗體類別為當p為1或3至8之類別。
I-37. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中該組成物小於5%之共軛可活化之抗體類別為當p為1或3至8之類別。
I-38. 具體實例I-2及I-4至I-26任一者之組成物或具體實例I-3至I-26任一者之方法，其中該組成物小於2%之共軛可活化之抗體類別為當p為1或3至8之類別。
I-39. 一種醫藥組成物，其包含：
具體實例I-1及I-4至I-26任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-38任一者之組成物；及載劑。
I-40. 一種治療、減輕個體中癌症之症狀或延緩其進展之方法，該方法包括投予有其需要之個體治療有效量之具體實例I-1及I-4至I-26任一者之共軛可活化之抗體或具體實例I-2及I-4至I-38任一者之組成物或具體實例I-3之醫藥組成物。
I-41. 具體實例I-40之方法，其中該癌症為胃癌。
I-42. 具體實例I-40之方法，其中該癌症為卵巢癌。
I-43. 具體實例I-40之方法，其中該癌症為食道癌。
I-44. 具體實例I-40之方法，其中該癌症為非小細胞肺癌。
I-45. 具體實例I-40之方法，其中該癌症為乳癌。
I-46. 具體實例I-40之方法，其中該癌症為結腸直腸癌。
I-47. 具體實例I-40之方法，其中該癌症為黑色素瘤。
I-48. 具體實例I-40之方法，其中該癌症為攝護腺癌。
I-49. 具體實例I-40之方法，其中該癌症為間皮瘤。
第II組
II-1. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽：

(a)其中
(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含
i.重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及
ii. 輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列；
(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；
(iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分；
(iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及
(v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；及
(b)其中“n”為2。
II-2. 具體實例II-1之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
II-3. 具體實例II-1之共軛可活化之抗體或II-2，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
II-4. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽：

(a)其中
(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區；
(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；
(iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分；
(iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及
(v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；以及
(b)其中“n”為2。
II-5. 具體實例II-4之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
II-6. 具體實例II-4或II-5之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
II-7. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽：

(a)其中
(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之序列之輕鏈；
(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；
(iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分；
(iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及
(v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；以及
(b)其中“n”為2。
II-8. 具體實例II-7之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
II-9. 具體實例II-7或II-8之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
II-10. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽：

其中MM-LP1-CM-LP2-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體，
其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：170之序列之輕鏈，以及
其中“n”為2。
II-11. 具體實例II-10之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
II-12. 具體實例II-10或II-11之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
II-13. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽：

(a)其中
(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含
i.重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及
ii. 輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列；
(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；以及
(iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；以及
(b)其中“n”為2。
II-14. 具體實例II-13之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
II-15. 具體實例II-13或II-14之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
II-16. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽：

(a)其中
(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區；
(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；以及
(iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；以及
(b)其中“n”為2。
II-17. 具體實例II-16之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
II-18. 具體實例II-16或II-17之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
II-19. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽：

(a)其中
(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之序列之輕鏈；
(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；以及
(iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；以及
(b)其中“n”為2。
II-20. 具體實例II-19之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
II-21. 具體實例II-19或II-20之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
II-22. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽：

其中MM-CM-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體，
其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：169之序列之輕鏈，以及
其中“n”為2。
II-23. 具體實例II-22之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
II-24. 具體實例II-22或II-23之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
II-25. 一種製造包含式(I)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法：

(a)其中
(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含
i.重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及
ii. 輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列；
(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；
(iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分；
(iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；與
(v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；
且其中“n”為2；
(b)該方法包括
(i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及
(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。
II-26. 一種製造包含式(II)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法：

(a)其中
(i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含
i.重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及
ii. 輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列；
(ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；
(ii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及
且其中“n”為2；
(b)該方法包括
(i)以還原劑還原包含MM-CM-AB之可活化之抗體；及
(ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。
II-27. 一種醫藥組成物，其包含：具體實例II-1至II-24任一者之共軛可活化之抗體；及視需要之醫藥上可接受之載劑。
II-28. 一種治療、減輕個體中癌症之症狀或延緩其進展之方法，該方法包括投予有其需要之個體治療有效量之具體實例II-1至II-24任一者之共軛可活化之抗體或具體實例II-27之醫藥組成物，其中該癌症係選自由下列者所組成之群組：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小細胞肺癌、ER+乳癌、三重陰性乳癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、攝護腺癌、多發性骨髓瘤、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、頭頸部小細胞癌、胰臟癌、間皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肝細胞癌及神經膠母細胞瘤。
II-29. 作為藥劑用之如具體實例II-1至II-24任一者之共軛可活化之抗體或具體實例II-27之醫藥組成物。
II-30. 用於治療癌症之具體實例II-1至II-24任一者之共軛可活化之抗體或具體實例II-27之醫藥組成物，視需要地其中該癌症係選自由下列者所組成之群組：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小細胞肺癌、ER+乳癌、三重陰性乳癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、攝護腺癌、多發性骨髓瘤、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、頭頸部小細胞癌、胰臟癌、間皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肝細胞癌及神經膠母細胞瘤。

實施例
實施例1. 抗-CD71共軛可活化之抗體(AADC)
設計本文中提供之研究以製造若干本揭露之抗-CD71共軛可活化之抗體。
如美國專利申請案第US 2016/0355599 A1號中所述(其全部內容併入本文以資參考)，使用小鼠融合瘤技術，依照此項技藝中已知之技術得到抗-CD71 M21單株抗體。以人類CD71胞外結構域(ECD)免疫小鼠，接著使用細胞毒性背馱分析篩選融合瘤，並對源自此分析之細胞毒性陽性選殖株經由ELISA確認結合人類CD71 ECD多肽及經由FACS確認結合細胞表面。抗-CD71 M21單株抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：2之輕鏈可變區(VL)。
亦測試下述根據抗-CD71小鼠單株抗體M21之擬人化抗-CD71抗體：Ab21.10 LcB：HcA(SEQ ID NO：3之VH及SEQ ID NO：7之VL)、Ab21.11 LcB：HcB(SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：7之VL)、Ab21.12 LcB：HcC(SEQ ID NO：5之VH及SEQ ID NO：7之VL)及M21(SEQ ID NO：1之VH及SEQ ID NO：2之VL)。經由FACS確認本揭露各種抗-CD71抗體結合細胞表面CD71之能力。
所有擬人化抗-CD71抗體顯示與人類及馬來猴CD71結合，其與CD71 M21小鼠抗體所證實之結合相當。經由FACS確認擬人化抗-CD71抗體於BxPC3細胞株上之結合。簡言之，以指示濃度之小鼠單株Mab21或huCD71(Ab21.10、Ab21.11及Ab21.12)抗體標識BxPC3細胞，接著分別以Alexa Fluor 647標識之山羊抗-小鼠或抗-人類IgG Alexa Fluor 647檢測。
於例示性研究中，測量抗-CD71 Ab21.12 LcB：HcC(SEQ ID NO：5之VH及SEQ ID NO：7之VL)及重組CD71(使用ELISA)與人類、馬來猴、小鼠及大鼠來源之表現CD71細胞(使用流式細胞測量術)之結合活性。如表1之例示性結果所示，如經由ELISA所測量，抗-CD71抗體以等效親和力結合人類及猴重組CD71，且其等效於人類全運鐵蛋白對人類CD71之親和力。如經由流式細胞測量術所測量，抗體以等效親和力結合人類及猴表現CD71之細胞株(分別為人類BxPC3胰臟癌細胞及馬來猴初代腎上皮細胞)。未測量到抗-CD71抗體及重組小鼠CD71或大鼠表現CD71細胞株(大鼠H-4-11-E肝腫瘤細胞)之顯著結合。


表 1 ：經由 ELISA 及流式細胞測量術之抗 -CD71 與人類、猴、大鼠、及小鼠 CD71 之結合，及經由 ELISA 之全運鐵蛋白及人類 CD71 之結合
實施例2. 遮蔽之發現
設計本文中提供之研究以鑑定及表徵用於本揭露可活化之抗-CD71抗體之遮蔽部分。
如於美國專利申請案第US 2016/0355599 A1號中所述，使用類似2010年7月15日公開之PCT國際公開案第WO 2010/081173號中所述之方法，使用包含SEQ ID NO：5之VH及SEQ ID NO：7之VL之抗-CD71 21.12抗體篩選具有總歧異度為6×1010 之隨機型X15 肽庫，其中X為任何胺基酸。篩選由一回合之MACS及五回合之FACS分選構成。以蛋白質-A Dynabeads(Invitrogen)及濃度200nM之抗-CD71 21.12抗體進行初始MACS分選。就MACS而言，大約篩選1×1012 個細胞用於結合並收集1×107 個細胞。抗-CD71 21.12與DyLight-488(ThermoFisher)共軛，確認CD71之結合活性並使用抗-CD71 21.12-488作為所有FACS回合之螢光探針。將細菌細胞染色，並收集陽性選殖株如下：於FACS第1回合中，收集20nM抗-CD71 21.12-488之1×106 個細胞；於FACS第2回合中，收集5nM抗-CD71 21.12-488之6.2×104 個細胞及於FACS第3回合中，收集5nM抗-CD71 21.12-488之5×103 個細胞與1nM抗-CD71 21.12-488之5×102 個細胞；於FACS第4及第5回合中，收集1nM抗-CD71 21.12-488之大於2×102 個細胞。證實源自FACS第2回合之陽性族群抑制抗-CD71 21.12-488抗體與重組CD71蛋白質之結合。經由序列分析源自FACS第3回合之5nM結合物及FACS第3、4與5回合之1nM結合物鑑定個別肽選殖系。
所鑑定之遮蔽部分包括TF01
(QFCPWSYYLIGDCDI；SEQ ID NO：16)及TF02
(NLCTEHSFALDCRSY；SEQ ID NO：17)。將TF01及TF02遮蔽物截短並進行丙胺酸掃描以產生具有不同遮蔽效率之可活化之抗體家族，包括遮蔽部分TF02.13(NLCTEHSAALDCRSY；SEQ ID NO：18)。
使用此等遮蔽肽以產生本揭露之抗-CD71可活化之抗體。特定此等抗-CD71可活化之抗體之序列示於下文表A中。於若干具體實例中，此等抗-CD71可活化之抗體包括如所示之可切割部分2001(ISSGLLSGRSDNH；SEQ ID NO：91)、可切割部分3001(AVGLLAPPGGLSGRSDNH；SEQ ID NO：97)、可切割部分2011(ISSGLLSGRSDNP；SEQ ID NO：156)或可切割部分3011(AVGLLAPPGGLSGRSDNP；SEQ ID NO：164)。
雖然下文所示之特定序列由SEQ ID NO：138之間隔子序列，惟一般熟習此項技藝者理解本揭露之可活化之抗-CD71抗體可包含任何適當之間隔子序列，例如，舉例而言，選自由QGQSGQG(SEQ ID NO：138)、QGQSGQ(SEQ ID NO：109)、QGQSG(SEQ ID NO：139)、QGQS(SEQ ID NO：140)、QGQ、QG、GQSGQG(SEQ ID NO：143)、QSGQG(SEQ ID NO：144)、SGQG(SEQ ID NO：145)、GQG、G或Q所組成組群之間隔子序列。於若干具體實例中，本揭露之可活化之抗-CD71抗體可不具有與其N端連結之間隔子序列。



實施例3. 可活化之抗-CD71可活化之抗體及抗-CD71共軛可活化之抗體之產生及特性分析
設計本文中提供之研究以產生若干本揭露之抗-CD71可活化之抗體。
產生具不同遮蔽效率之抗-CD71可活化之抗體(即，可活化之抗體之MM阻斷可活化之抗體之AB與其標靶結合能力之測量)。如實施例2所述，經由截短及丙胺酸掃描使肽TF01及肽TF02突變，並使用此等遮蔽肽變異體以產生一系列遮蔽效率之本揭露之抗-CD71可活化之抗體家族。
使用FACS評估本揭露抗-CD71可活化之抗體與NCI H292(本文中亦稱為H292)細胞株之結合。簡言之，以一系列濃度之huCD71抗體或可活化之抗體標識細胞，接著以Alexa Fluor 647標識之山羊抗-人類IgG二次抗體檢測以確定結合曲線。如下文表2中之例示性結合數據所概述，相較於親源抗-CD71抗體(huCD71 21.12 Ab)，本揭露之抗-CD71可活化之抗體顯示一系列之遮蔽效率。
表2中之此等例示性數據顯示，當可活化之抗體呈完整或未切割狀態時，兩種遮蔽物(TF01及TF02.13)皆抑制抗-CD71抗體與CD71之結合。此等例示性數據亦證實TF01遮蔽部分證實比TF02.13遮蔽部分更高之遮蔽效率。

實施例4：CD71可活化之抗體及CD71共軛可活化之抗體之結合活性特性分析
此實施例顯示本揭露之抗-CD71可活化之抗體與抗-CD71共軛可活化之抗體呈其完整、未切割形式時，相較於其對應之蛋白酶切割形式，證實對重組與細胞表面人類及馬來猴CD71蛋白較低之結合親和力。
如圖3A及3B中所示，使用固相結合分析(ELISA)以證實本揭露之抗-CD71可活化之抗體及抗-CD71共軛可活化之抗體二者皆以其完整未切割形式及其蛋白酶活化之切割形式對重組CD71之結合親和力。於此等實施例中，將重組馬來猴(圖3B)或人類CD71(圖3A)蛋白質(R&D Systems)以濃度1 μg/mL塗覆於ELISA微量盤上，然後與所指示濃度之本揭露之完整未切割之抗-CD71可活化之抗體(“抗-CD71-TF02.13-2011”)或本揭露之完整未切割之E2(即，具有~2之DAR)抗-CD71共軛可活化之抗體(“抗-CD71-TF02.13-2011-vc-MMAE E2”)一起培育。亦分析以切割可活化之抗體成分之可切割部分之蛋白酶處理後之本揭露之抗-CD71可活化之抗體[“抗-CD71-TF02.13-2011(Act)”]或E2(即，具有~2之DAR)抗-CD71共軛可活化之抗體[“抗-CD71-TF02.13-2011(Act)”]。
如本文所討論，“E2”係指本揭露給定抗-CD71共軛可活化之抗體之組成物，其實質上僅包含共軛可活化之抗體類別，其中藥物負載為每個可活化之抗體分子為2個藥物分子，且實質上不包含任何或極微量之其他可能種類(即，其中藥物負載為0、1、3、4、5、6、7、8等)。如本文所討論，“DAR”係指於此類共軛可活化之抗體族群中藥物(於此情形下，MMAE)與該可活化之抗體(即CD71-TF02.13-2011)間之平均比率。因此，於此實施例中，抗-CD71-TF02.13-2011-vc-MMAE E2係指僅包含抗-CD71-TF02.13-2011可活化之抗體之組成物，其中各個可活化之抗體具有如實施例26中所述之2當量vc-MMAE與DAR約為2之藥物負載。
經由培育及利用共軛山葵過氧化酶之山羊抗-人類抗體與Ultra TMB(Thermo Fisher Scientific)檢測之檢測，檢測各個試樣中結合抗體之量。該結合親和力之概述示於下面：
圖3C及3D顯示，於FACS分析中，本揭露之抗-CD71可活化之抗體與本揭露之抗-CD71共軛可活化之抗體結合表現人類CD71(圖3C)及馬來猴CD71(圖3D)細胞之例示性結果具有比本揭露對應之蛋白酶活化抗-CD71可活化之抗體或蛋白酶活化抗-CD71共軛可活化之抗體更高之解離常數及更低之親和力。此等例示性結果顯示，本揭露之經切割、蛋白酶活化之抗-CD71可活化之抗體及本揭露之經切割、蛋白酶活化之抗-CD71共軛可活化之抗體以與親源抗-CD71抗體類似之親和力與該等細胞結合，因此證實遮蔽部分於完整可活化之抗體或完整共軛可活化之抗體中抑制抗-CD71與其標靶結合之效果。
於圖3C及3D所示之例示性研究中，使用標準FACS標記法進行本揭露抗體與指示細胞株之結合。簡言之，以本揭露指示之抗體或可活化之抗體標記細胞：對照抗體(AB095)、人類抗-CD71抗體(Ab 21.12，具有SEQ ID NO：5之VH及SEQ ID NO：7之VL)、抗-CD71可活化之抗體(抗-CD71 TF02.13-2011)、或E2(即，具有~2之DAR)抗-CD71共軛可活化之抗體(抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)。另外，亦於切割其中可切割部分之蛋白酶-活化後，分析抗-CD71可活化之抗體[抗-CD71 TF02.13-2011(Act)與E2(即，具有~2之DAR)抗-CD71共軛可活化之抗體[抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2(Act)]之結合親和力。各種檢測物品以指示濃度施用，隨後以Alexa Fluor 647標識之山羊抗-人類IgG二次抗體檢測。
下文表3B顯示根據圖3C至3D所描繪結合曲線之EC50值。此等結果顯示，完整可活化之抗體及完整共軛可活化之抗體以低於其蛋白酶活化對應物之親和力與其標靶結合，且經蛋白酶活化之可活化之抗體以與親源抗-CD71抗體類似之親和力結合。
於類似之例示性研究中，使用ELISA與流式細胞測量術分析，證實本揭露之抗-CD71抗體、抗-CD71共軛之抗體、抗-CD71可活化之抗體(完整之未切割形式與蛋白酶活化之切割形式)及抗-CD71共軛可活化之抗體(完整之未切割形式與蛋白酶活化之切割形式)，對重組CD71至重組人類及馬來猴CD71以及表現人類及馬來猴CD71細胞株之結合親和力。檢測物品為抗-CD71 Ab 21.12抗體(SEQ ID NO：5之VH及SEQ ID NO：7之VL)、共軛之抗體[抗-CD71 Ab21.12-vcMMAE E2(即，具有~2之DAR)]、可活化之抗體(抗-CD71-TF02.13-2011)、以及DAR2之共軛可活化之抗體[抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(即，具有~2之DAR)]。
於ELISA實例中，將重組馬來猴或人類CD71 ECD蛋白質塗覆於ELISA微量盤上，然後與一系列濃度之本揭露檢測物品之一種一起培育，接著以二次抗體測量結合檢測物品之量。活化之檢測物品係與蛋白裂解酶之蛋白酶酵素一起培育。各種檢測物品之例示性表觀Kd值示於表3C中。
於亦示於表3C之例示性研究中，使用標準FACS標記法進行本揭露抗體與指示細胞株之結合。流式細胞測量術之結果反映4種人類細胞株(HCC1806人類乳癌、HT-29人類結腸直腸癌、NCI-H292人類肺癌及NCI-H520人類肺癌)及一種表現馬來猴CD71之CHO-K1細胞株之平均測量Kapp。各種檢測物品之例示性表觀Kd值示於表3C中。
此等例示性結果顯示，相較於其活化對應物或其親源抗體，完整可活化之抗體與完整共軛可活化之抗體對CD71顯示較低之表觀親和力。

實施例5：CD71於多種患者源之原發與轉移腫瘤上之表現
此實施例顯示，經由使用抗-CD71抗體之免疫組織化學(IHC)染色，CD71於大量多種原發與轉移腫瘤類型上表現。
圖1及2顯示，使用商業購買之抗-CD71抗體，對多種患者源之原發腫瘤與患者衍生之轉移組織微陣列(TMA)進行IHC染色，CD71於大量原發與轉移腫瘤試樣中高度表現。圖1顯示於頭頸癌(1)、子宮頸癌(2)、乳癌(3)、淋巴結中之非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)(4)、肺癌(5)、膀胱癌(6)、卵巢癌(7)及食道癌(8)中CD71之IHC染色。圖2顯示於由轉移腫瘤中心部分構成之組織微陣列(TMA)中CD71之IHC染色，證實於大多數中心部分中CD71之中等至高程度之表現。茲將利用免疫組織化學(IHC)於人類腫瘤試樣中之CD71表現概述於表4A。

實施例 6 ： CRC 異種移植模式中之遮蔽效率及可活化之抗 -CD71-AADC 之活體內效力
此實施例顯示，本揭露之具有共軛毒素之抗-人類CD71可活化之抗體(AADC)之遮蔽效率為其於HT29結腸直腸癌(CRC)小鼠異種移植模式中效力之因素。
此等研究中，使小鼠之HT29異種移植腫瘤發展至平均體積為150 mm3 。然後將小鼠隨機分組並於第1天投予3 mg/kg(或另行指示)之各種指示檢測物品。繪製各個時間點之平均腫瘤體積±SEM。
圖4A顯示具有較高親和力遮蔽物之本揭露之例示性抗-CD71 AADC(抗-CD71 TF01-3011-vc-MMAE)，於單次3 mg/kg劑量後，顯示相對於媒劑對照之若干腫瘤生長抑制。相較之下，圖4B顯示具有較低親和力遮蔽物惟具相同可切割基質之本揭露之例示性抗-CD71 AADC(抗-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE)，於單次3 mg/kg劑量後，顯示異種移植物之實質上完全消退。圖4C顯示具有較低親和力遮蔽物惟具相同可切割基質之本揭露之例示性抗-CD71 AADC(抗-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE)，於單次2 mg/kg 或3 mg/kg劑量後，亦皆顯示HT29異種移植物之實質上完全消退。此等例示性結果顯示，具有較低親和力遮蔽部分之AADC證實比具有較高親和力遮蔽部分之AADC更高之效力。

實施例 7 ： CRC 異種移植模式中之可切割基質及可活化之抗 -CD71-AADC 之活體內效力
此實施例顯示於小鼠異種移植模式中可切割基質對本揭露之例示性抗-人類CD71共軛可活化之抗體(AADC)效力之影響。
於此等研究中，使小鼠之HT29(衍生自結腸直腸癌)異種移植腫瘤發展至平均體積為150 mm3 。然後將小鼠隨機分組，並於第1天給藥指示量之指示檢測物品。繪製各個時間點之平均腫瘤體積±SEM。
圖5顯示本揭露之例示性抗-CD71 AADC
(CD71 TF02-3011-vc-MMAE)於兩種不同劑量之小鼠異種移植模式中顯示完全或幾乎完全消退。如圖4B及4C所示，此等例示性數據證實具較少可切割基質之指示AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE)之效力與具有較多可切割基質之AADC(抗-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE)之效力實質上相同。

實施例 8 ：多種異種移植模式中可活化之抗 -CD71-AADC 之活體內效力
此實施例顯示本揭露之抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE AADC於多種小鼠異種移植模式中對兩種不同藥物對抗體比(DAR)之效力。
於此等研究中，使小鼠之卵巢癌(OV-90，圖6B)、胃癌(NCI-N87，圖6A)、ER+乳癌(BT474，圖6C)、或三重陰性乳癌(HCC-70，圖6D)之異種移植腫瘤生長至平均體積為150 mm3 。然後將小鼠隨機分組，並於第1天給藥指示檢測物品。所投予各AADC之量係根據MMAE毒素量進行劑量匹配，俾使抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE(具有平均DAR~3)以3 mg/kg投予及抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2(平均DAR~2)以4.3 mg/kg投予。繪製各個時間點之平均腫瘤體積±SEM。
圖6A-6B顯示本揭露之例示性抗-CD71 AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE)於卵巢癌及胃癌之小鼠異種移植模式中顯示完全或幾乎完全消退。抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2(即，具有~2之DAR)，其包含各具2當量MMAE毒素之純化AADC，於相同模式中亦顯示完全消退。所有案例中，例如圖6C及6D所示，即使在尚未觀察到完全或幾乎完全消退時，E2(即，具有~2之DAR)與較高DAR AADC之活性亦為等效或幾乎等效。此等例示性數據證實，E2(即，具有~2之DAR) AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2)之劑量匹配效力與對應之較高DAR AADC可相比。
如表4B中所示，於小鼠異種移植模式中，測試具有~2之DAR之抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 AADC對多種衍生自患者(PDX)或癌症(CDX)細胞株之效力，且給藥一次或兩次小於或等於6 mg/kg。結果如下文所概述，幾乎於所有測試模式中顯示AADC至少證實若干效力，其範圍為消退至停滯到腫瘤生長抑制。

實施例 9 ：測定源自經處理動物試樣中之共軛及游離毒素與完整及總 AADC 之量之生物分析測定
此實施例顯示用於分析以測量測試試樣中代謝物之量之例示性工作流程，其包括共軛及游離毒素之量，與完整及總共軛可活化之抗體之量。
圖7A、7B及7C顯示用於例示性生物分析測定之工作流程概要，以測定於經處理之猴中完整及總(即，合併完整及經切割之)可活化之抗體之量，以及於經處理之猴中完整AADC(含未經切割之毒素)及經切割之毒素之量。使用圖7A中描繪之例示性分析實驗流程，可經由磁性蛋白質A珠粒捕捉試樣中完整及經切割之可活化之抗體(例如抗-CD71 TF02.13-3001)之總量，接著予以變性(RapiGestTM )、以二硫蘇糖醇還原、烷基化及胰蛋白酶分解。所得肽片段可使用逆相LC-MS/MS分析以鑑定及定量源自抗體重鏈及輕鏈之獨特肽片段。於此特定分析中，可使用逆相LC-MS/MS鑑定及定量可活化之抗體或共軛可活化之抗體之抗體部分中特有之一或多種肽，以測定完整及經切割之可活化之抗體之總量，從而測量試樣中完整及經切割之可活化之抗體之總量。
於相同分析中，可使用逆相LC-MS/MS鑑定及定量可活化之抗體之未經切割之可切割部分(CM)及遮蔽部分(MM)(例如，源自抗-CD71-TF02.13-2011輕鏈之N端)中特有之一或多種肽，以測定完整之可活化之抗體之總量，從而測量試樣中完整可活化之抗體之量。
使用圖7B中描繪之例示性分析實驗流程，可測定試樣中與其毒素(MMAE)保持共軛之AADC(例如抗-CD71 TF02.13-3001-vc-MMAE)之總量。於此分析中，共軛及未共軛可活化之抗體之總量係由MabSelect®蛋白質A捕捉。將此區分用半胱胺酸蛋白酶處理以切割連接子-毒素，從而釋放與其可活化之抗體保持共軛之任何毒素。使用逆相LC-MS/MS分析半胱胺酸蛋白酶切割之區分，可鑑定及定量保持與被捕捉之可活化之抗體共軛之獨特毒素(例如MMAE)，從而測量試樣中共軛之毒素量。
使用圖7C中所描繪之例示性分析實驗流程，可測定試樣中包括從動物中之AADC所切割之毒素之毒素總量。於圖7C中所描繪之該例示性分析中，源自試樣之總蛋白質被沈澱，於上清液中留下游離、未共軛毒素(MMAE)。可使用逆相LC-MS/MS分析上清液以鑑定及定量未與沈澱之蛋白質結合之獨特毒素(例如MMAE)，從而測量試樣中未共軛之毒素量。於此等分析中，包括內標準(例如SILuTM Mab，Sigma-Aldrich)在內以容許定量。

實施例 10 ：於馬來猴中抗 -CD71-AADC 及抗 -CD71 ADC 之耐受性穩定性
此實施例顯示，相較於根據一或多個血液學示值讀數及臨床症狀之對應親源抗-CD71抗體藥物共軛物(ADC)，本揭露之具共軛毒素(AADC)之抗-人類CD71可活化之抗體於馬來猴中有良好之耐受性。結果概述於下文表5及概述於圖17中。
於此研究中，於第1天及第21天以指示劑量之指示AADC或ADC靜脈內處理馬來猴。對於抗-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE AADC僅耐受一個劑量，且對於抗-CD71-vc-MMAE E2(即，具有~2之DAR) ADC僅投予一個劑量。使用逆相LC/MS/MS)，如實施例9所述進行從各動物得到試樣中之可活化之抗體之穩定性(即，總可活化之抗體vs完整可活化之抗體)。
投予第一劑量後，依據最低重量測量決定體重減少量。基線嗜中性白血球計數為每μL至少1000個。
如表5中所概述，無遮蔽之E2(即，具有~2之DAR) ADC(抗-CD71-vc-MMAE E2)於第一劑量之8天內證實致命性。
表5中所概述之例示性結果亦顯示，於非人類靈長類動物中，具較少可切割基質之AADC(即，抗-CD71 TF02.132011-vc-MMAE及抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2)較對應之具更多可切割基質之AADC(即抗-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE)具有更佳之耐受性且證實較高程度之循環穩定性。最後，該例示性結果顯示，於非人類靈長類動物中，AADC [抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2(即，具有~2之DAR)]證實比對應較高DAR之 AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE)明顯增進之耐受性。

實施例 11 ：於馬來猴中抗 -CD71-AADC 之穩定性與藥物動力學
此實施例顯示本揭露之具有共軛毒素(AADC)之抗-人類CD71可活化之抗體於馬來猴中之穩定性與藥物動力學。
此研究中，於實施例12至14中更詳細地說明結果，4組馬來猴以所示之E2(即，具有~2之DAR)抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE或媒劑對照之載劑及表6所示之指示劑量及時間表進行靜脈內處理。於表6中所示之日子，得到各個動物之試樣，以實施例9所述方式分析全體及完整之可活化之抗體及共軛與未共軛之MMAE毒素。
如表6中所概述，經由緩慢靜脈推注依所示劑量與時間表給藥馬來猴媒劑或抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 AADC。將用於毒物動力學分析之血液試樣處理成血漿並於分析前貯存於-80℃。取得血清試樣於抗藥物分析，第1至第3組係於給藥前及第2劑量後第7天，第4組則於第1劑量後第22天。所有組別包含三隻動物(2公及1母)。

實施例 12 ：於馬來猴中抗 -CD71-AADC 之穩定性
此實施例顯示本揭露之具共軛毒素(AADC)之抗-人類CD71可活化之抗體於馬來猴中之穩定性。
如圖8A及8B之例示性結果所示，以實施例9及其中所述之方式測定所投予AADC之全體及完整可活化之抗體(抗-CD71 TF02.13-2011)的血漿濃度。完整以及全體可活化之抗體之定量下限(LLOQ)皆為0.633nM，如所示。此等例示性結果展示，於21天之給藥間隔期間，通常維持完整可活化之抗體血漿濃度，且係與最初給藥劑量成比例之量。甚至於給藥後7天，血漿中大約80％之共軛可活化之抗體(抗-CD71-TF02.13-2011-vc-MMAE E2)係呈完整之前藥形式。
如圖9A及9B之例示性結果所示，以實施例9及11所述之方式測定共軛及未共軛MMAE毒素的血漿濃度。共軛MMAE之定量下限(LLOQ)為1.77nM而未共軛MMAE為0.31nM，如所示。此等例示性結果證實，血漿濃度中所測量之總MMAE小於1%係呈未共軛形式。

實施例 13 ：於馬來猴中抗 -CD71-AADC 給藥後藥物與可活化之抗體比之變化
此實施例顯示，於以本揭露之具共軛毒素(AADC)之抗-人類CD71可活化之抗體給藥馬來猴後，血漿中所觀測之藥物(MMAE)與可活化之抗體(抗-CD71 TF02.13-2011)之比率。
以實施例9及11所述之方式測定全體及完整之可活化之抗體(抗-CD71 TF02.13-2011)的血漿濃度。如圖10中所示，將共軛MMAE濃度(參見實施例12及圖9A)除以全體可活化之抗體之濃度(參見實施例11及圖8A)，計算各指示時間點之藥物與可活化之抗體之比率。特定時間點之平均比率及標準偏差示於表7。此等例示性結果證實，MMAE藥物與可活化之抗體之觀測比值以與三種(3)劑量之各種間一致之方式隨時間變化。於各種劑量中，完整AADC之計算DAR於投予後後立即，開始及4小時內為約2，該比值於給藥後大約96小時(即，約4天)後降至約1。

實施例 14 ：於馬來猴中抗 -CD71-AADC 之藥物動力學參數
此實施例顯示本揭露之具共軛毒素(AADC)之抗-人類CD71可活化之抗體於馬來猴中之藥物動力學參數。
以實施例9及11所述之方式測定全體及完整之可活化之抗體(抗-CD71 TF02.13-2011)的血漿濃度。如表8所示，給定分析物之平均Cmax 係根據所觀測之最大血漿濃度。平均AUC0-7 係根據從第0天到第7天的血漿濃度及時間曲線下之面積。全體共軛可活化之抗體、完整共軛可活化之抗體及MMAE共軛物的半衰期估計值範圍為2.5天至6.3天。未產生未共軛之MMAE的半衰期估計值。

實施例 15 ：抗藥物抗體之分析
此實施例敘述使用架橋分析(bridging assay)監測測試動物中抗藥物抗體(ADA)之形成。
於研究前及第2劑量後7天收集血漿試樣供ADA分析。此研究中給藥之9隻動物中有3隻檢測出抗藥物抗體。

實施例 16 ：抗 -CD71 共軛可活化之抗體之活體外細胞毒性
此實施例敘述相較於同型對照之ADC，本揭露之完整及活化之抗-CD71共軛可活化之抗體於衍生自人類腫瘤細胞株上之活體外細胞毒性分析。
評估本揭露之共軛可活化之抗體，抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(SEQ ID NO：167之HC及SEQ ID NO：169之LC)，於有或無以蛋白裂解酶預處理之例示性活體外細胞毒性活性；並與同型無CD71結合之共軛抗體對照(AB095-vcMMAE，DAR為2，其中AB095對破傷風毒素具特異性)相比較。使用HT29(人類結腸直腸癌細胞株)、H292(人類肺癌細胞株)、H520(人類肺癌細胞株)及HCC1806(人類乳癌細胞株)測試檢測物品之細胞毒性，其係經由將各個檢測物品與各種細胞株一起培育5天，然後測量於一系列濃度下各種檢測物品之細胞存活率，以測定各個檢測物品之EC50。結果概述於下文表9中。
此等例示性結果顯示，完整抗-CD71共軛可活化之抗體之活體外細胞毒性類似同型對照之活體外細胞毒性，惟於蛋白裂解酶活化後大大地增加。

實施例 17 ：經由抗 -CD71 共軛可活化之抗體之 Fc 結合及補體活化
實施例證實本揭露之抗-CD71共軛可活化之抗體傳介效應物功能為主之機制(例如抗體依賴型細胞傳介之細胞毒性(ADCC)及補體依賴型細胞毒性(CDC))之能力。
IgG抗體片段之可結晶(Fc)部分可傳介多種功能，其中若干經由與Fc受體及C1q之結合發生。此等功能包括細胞介素誘發、抗體依賴型細胞傳介之細胞毒性(ADCC)、經由活化補體系統之傳統路徑之補體依賴型細胞毒性(CDC)、胞噬作用及經由IgG再循環之抗體恆穩狀態(Ravetch等人， Annu Rev Immunol ., 2001;19：275-290; Roopenian等人， Nat Rev Immunol . 2007;7：715-725)。
抗體恆穩狀態部分受Fc相關新生兒受體(FcRn)之調控，其存在腸上皮細胞、血管內皮細胞及專職抗原呈現細胞上。於細胞內，FcRn存在囊泡中；於低pH之酸性胞內體內其可結合已由胞飲作用攝入之IgG之Fc部分。然後當胞內體再循環至細胞表面時，由於暴露於細胞外之中性pH而釋放IgG。此過程可控制穿越單層上皮屏障之IgG運送，且保護IgG分子免受分解代謝，延長IgG之血清半衰期(Roopenian)。確實，於低pH下增強之FcRn結合，惟於生理pH下維持低結合之突變已顯示具有更長之血清半衰期(Hinton等人， J Biol Chem . 2004;279：6213-6216; Hinton等人， J Immunol . 2006;176：346-356)。
人類FcγR系統係由活化(FcγRI、FcγRIIa及FcγRIIIa)及抑制性(FcγRIIb)受體二者組成。FcγRI，高親和力IgG1受體，係由單核細胞譜系之細胞表現(Li等人， J Immunol . 2008;181：1012-1018)。FcγRIIa為更廣泛表現之低親和力IgG1受體，其優先結合免疫複合體(Littaua等人， J Immunol ., 1990;144：3183-3186)。FcγRIIb主要在單核細胞譜系及B細胞上表現且為低親和力之抑制性IgG受體。於FcγRIIb與IgG複合體結合後，所有鈣依賴性程序(例如去顆粒作用、胞噬作用、ADCC、細胞介素釋放及促發炎活化)都被阻斷((Clynes等人， Nat. Med ., 6：446-446(2000)；Minard-Colin等人， Blood , 112：1205-1213(2008)及Hamaguchi等人， J. Exp. Med ., 203：743-753(2006))。FcγRIIIa為負責NK細胞ADCC活性之低親和力受體(Ravetch)。為了增加Fcγ受體之歧異度，有FcγRIIa(H131 vs R131)及FcγRIIIa(V158 vs F158)之多型性變異體，其對IgG分子之親和力具有差異(Bruhns等人， Blood , 2008;113：3716-3725)。
抗體經由FcγR或補體效應物系統傳介多種功能之能力，提供於IgG為主之工程處理生物製劑上非預期之誇大藥理學之可能性。於末梢血液淋巴細胞上未知之交叉反應性能觸發Fcγ受體之交聯。因為交聯Fcγ受體之交互作用可傳介包括細胞介素誘發、ADCC及胞噬作用等多種功能(Ravetch)，對於確定治療性抗體與血液或組織中之非預期標靶結合之能力非常重要。

方法 - 表面電漿共振FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及FcRn結合分析
利用表面電漿共振(Biacore)，經由6xHis標籤捕捉重組人類FcγRII & FcγRIII以評估其與抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE、抗-CD71 Ab21.12(IgG1/κ)、AB095-MMAE-E2及AB095(IgG1/κ)之結合。根據廠商之實驗流程，經由胺偶合將小鼠抗-6xHis抗體直接固定於CM5晶片上至密度為10000 RU。然後於流通槽2、3及4上捕捉人類FcγR，以達成250-500 RU之FcγR捕捉量。使用流通槽1作為參考表面。使用HBS-EP+緩衝液(GE, Healthcare)作為流動緩衝液。將抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2、抗-CD71 Ab21.12(IgG1/κ)、AB095-MMAE-E2、AB095(IgG1/κ)及曲妥珠單抗(trastuzumab)(IgG1/κ)，以濃度範圍FcγRII為從46.9至12000nM及FcγRIII為從7.8至4000nM(兩者皆為2倍系列稀釋)及流速50 μL/分鐘注射到所有流通槽上1至2分鐘(FcγRIIb及FcγRIIa H131為1分鐘，FcγRIIIa F158及FcγRIIIa V158為2分鐘)，隨後為1至5分鐘之解離時間(FcγRIIb、FcγRIIa H131 1分鐘，FcγRIIIa F158及FcγRIIIa V158 5分鐘)。以流速100 μL/分鐘注射100 mM HCl至所有4個流通槽上2秒以再生晶片表面。針對各試樣(各兩重複)使用三種不同CM5晶片進行3次實驗以調和所有類型之實驗誤差(儀器、表面及操作者)。平均此等3次實驗之結果。
關於FcRn結合之分析，係根據廠商實驗流程經由胺偶合直接使抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2、抗-CD71 TF02.13-2011(無vc-MMAE之IgG1/κ)、AB095-vcMMAE-E2(含富含MMAE DAR=2之非特異性單株人類抗破傷風類毒素IgG1/κ抗體)、AB095(非特異性單株人類抗破傷風類毒素IgG1/κ抗體)及曲妥珠單抗(IgG1/κ)直接固定於CM5晶片上至密度為500 RU。將Hu FcRn以濃度範圍為5.5至12000nM(3倍系列稀釋)及流速50 μL/分鐘注射到所有流通槽上1分鐘，接著為2分鐘之解離時間。注射100 mM HCl 2秒鐘，隨後為HBS-EP+(pH 7.4)以再生表面。試樣於兩種流動緩衝液系統(MES-EP+ pH 6.0及HBS-EP pH 7.4)中製備及進行。慮及儀器、表面及操作者之誤差，針對各試樣(各兩重複)使用3種不同CM5晶片進行3次實驗。平均此等3次實驗之結果。
將所有重組人類FcγRIIIa V158數據及FcγRIIIa F158數據擬合為1：1結合之擬合模式，其中Rmax固定於局部以慮及捕捉量之變異性。將重組人類FcγRIIb、FcγRIIa H131及FcRn 結合數據擬合為穩定狀態之親和力模式。使用Biacore T200評估軟體2.0版以擬合所有數據。

結果
抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2含人類IgG1/κ同型Fc。和其他野生型IgG1 /κ抗體一致地，其被預期與FcγRI、FcγIIa、FcγIIb、FcγIII結合。經由表面電漿共振、FcγRI競爭結合之ELISA(結果未顯示)及FcγRIII競爭結合之ELISA(結果未顯示)分析抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2與FcγR之結合，及經由功能性人類及馬來猴之補體活化試驗分析抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2與補體之結合(結果未顯示)。此等試驗利用市售及機構內產生之人類抗體規範(benchmarked)。臨床級人類抗-HER2、IgG1/κ、曲妥珠單抗物料作為與FcγR結合分析之陽性對照。已知Fc受體及補體與野生型IgG1抗體結合(Ravetch; Roopenian; Burton等人， Nature . 1980;288：338-344；Hughes-Jones等人， Mol Immunol ., 1979;16：697-701及Hezareh等人， J Virol . 2001;75：12161-12168)。儘管相較於陽性對照(曲妥珠單抗)時，觀察到適度降低與FcγRIII之結合(經由SPR)，抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE之檢查顯露其的確與FcγRI、FcγIIa H131、FcγRIII及FcRn結合。抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2與FcγRIIb之結合太弱無法測定，因其跌落至Biacore儀器之檢測界限(1.0 e-05 KD)下(參見表10A及10B)。

經由用於CDC之以ELISA捕捉iC3b(人類)或C3(馬來猴)，評估抗-CD71共軛可活化之抗體活化人類及馬來猴血清補體之能力，以評估補體依賴型細胞毒性(CDC)。
如圖12之例示性結果所示，所指示檢測物品在指示濃度下與iC3b之結合表示為人類補體活化之分析。抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2於人類及馬來猴血清中之補體活化分析中結合iC3b，惟程度較小於用於CDC分析中陽性對照之7C6抗體。具有指示突變之7C6.7抗體作為陰性對照。抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2與iC3b之結合，亦較小於其未共軛可活化之抗體之對應物(抗-CD71-TF02.13-2011)。

實施例 18 ：於人類 PBMC 中細胞介素之釋放
此實施例顯示儘管抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2不結合人類或馬來猴之末梢血液單核細胞(PBMC)，惟IgG1抗體能交聯末梢血液淋巴細胞上之Fcγ受體，從而傳介包括細胞介素誘發之多種功能。
以可溶或固相(結合培養盤)格式評價抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2或抗-CD71-TF02.13-2011於人類PBMC中誘發下述細胞介素：介白素(IL)-1β]、IL 6、IL 2、干擾素(IFN)γ及腫瘤壞死因子α(TNFα)之活體外細胞介素釋放之能力。就固相實驗而言，添加源自8位健康人類捐贈者之PBMC至預先以0.96 µg檢測物品塗覆之聚丙烯培養盤中，並於1.5小時後沖洗掉。48小時後收集上清液供分析用。以曲妥珠單抗及非結合同型對照ADC(AB095-vcMMAE E2)作為陰性對照。使用三種陽性對照：T細胞刺激抗體、TGN1412或維西珠單抗(visilizumab)及B細胞、與刺激類骨髓細胞之脂多醣(LPS)。於對抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2及AB095-vcMMAE-E2二者之反應中，觀察到所測試8位捐贈者中有1位大量釋放5種所測量細胞介素中之3種(IL-1β、IL-6及TNFα)。8位捐贈者之另外2位於對抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2及AB095-vcMMAE-E2二者之反應中則觀察到IL-6及TNFα之釋放。3位捐贈者以可溶呈現分析(soluble presentation assay)測試，其為24小時之高細胞密度呈現分析。
此研究中，於以預被覆0.96 µg/槽之抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2及抗-CD71-TF02.13-2011(IgG1κ)刺激後，測量人類捐贈者PBMC之細胞介素釋放。曲妥珠單抗作為陰性對照IgG1κ抗體。AB095-vcMMAE-E2及AB095(IgG1κ)作為同型對照抗體。添加TGN1412、維西珠單抗及脂多醣(LPS)作為細胞介素釋放之陽性對照。以粗體及方框框住之數值強調檢測物品，其引出細胞介素之釋放大於曲妥珠單抗釋放之2倍。
如表11之例示性結果所示，抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2引出細胞介素之釋放不超過陰性對照曲妥珠單抗所誘發之量。亦以固相格式評估於3隻馬來猴供體中下述細胞介素之釋放：IL-1β、IL-6、IL-2、IFNγ、IL-8及IL 10。於3隻所測試之供體中有1隻，抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2引出之IL-8產量稍微超過由曲妥珠單抗所界定之背景值。就抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2之馬來猴非GLP及GLP毒理學研究而言，於任何劑量均未觀察到細胞介素釋放之代表性急性臨床症狀。

實施例 19 ：抗 -CD71 AADC 於 SW-48 異種移植小鼠模式中之抗腫瘤效力
此實施例顯示本揭露之抗-CD71共軛之活化抗體於使用SW-48細胞(人類結腸直腸癌)之小鼠腫瘤異種移植模式中之效力。
於此例示性研究中，將指示劑量之抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(AADC)單次腹膜內注射投予8隻小鼠之組別，並經時觀察平均腫瘤體積。如圖13及表12中所示，相較於媒劑對照，觀察所有劑量於23天時之總生長抑制(TGI)範圍，於6及12 mg/kg劑量時觀察到腫瘤完全消退。

實施例 20 ：抗 -CD71 AADC 於 DLBCL PDX 小鼠模式中之抗腫瘤效力
此實施例顯示本揭露之抗-CD71共軛之活化抗體於5隻衍生自小鼠腫瘤患者之異種移植(PDX)模式中之效力，其使用於SCID或NOG母小鼠中衍生自HuPrime患者之瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
此例示性研究中，建立罹患皮下腫瘤(100至200 mm3 )之3隻小鼠組別並於第0天及第7天投予6 mg/kg之抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(AADC)或媒劑對照。如圖14之例示性結果所示，相較於媒劑對照組，AADC檢測物品於5個模式中之4個達到大於100%之TGI及1個模式為72% TFI。於投予AADC之模式中觀察到LY2345之3隻小鼠中之2隻、模式LY6933中3隻小鼠中之3隻、模式LY6934中3隻小鼠中之2隻及模式LY2318中3隻小鼠中之2隻完全反應(即，於研究終止時可測量之腫瘤消失)。模式LY3604未觀察到完全反應。此等例示性結果證實本揭露之AADC於若干模式中證實多達完全反應之效力。

實施例 21 ：抗 -CD71 AADC 於腫瘤移植物 PDX 小鼠模式中之抗腫瘤效力
此實施例顯示本揭露之抗-CD71共軛之活化抗體於9隻衍生自小鼠腫瘤患者之異種移植(PDX)模式中之效力，其使用裸小鼠中TumorGraft患者衍生之人類乳癌(CTG-0437、CTG-0869、CTG-1059)、非小細胞肺癌(NSCLC)(CTG-1082、CTG-0860、CTG-0160、CTG-1012)及頭頸部小細胞癌(HNSCC)(CTG-1140、CTG-1082)。
於此例示性研究中，建立具皮下腫瘤(150至300 mm3 )之各PDX模式3隻小鼠之組別並於第0天及第7天投予6 mg/kg之抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(AADC)或媒劑對照。如圖15A、15B及15C之例示性結果所示，AADC檢測物品於橫越3種癌症適應症之9個模式中之6個達到大於100%之腫瘤生長抑制(TGI)。於此等觀察到大於100% TGI之6個模式中，接受AADC之18隻小鼠中之6隻達到完全反應(即，於研究終止時可測量之腫瘤消失)。於另外2個模式中，分別觀察到HNSCC及NSCLC之92％及78％之TGI。1個NSCLC模式對AADC無反應。如此等例示性結果所示，本揭露之AADC證實對衍生自多種人類癌症類型之PDX模式之效力，包括於若干情況下之完全反應。

實施例 22 ：抗 -CD71 AADC 於 HuPrime 胰臟 PDX 小鼠模式中之抗腫瘤效力
此實施例顯示本揭露之抗-CD71共軛之活化抗體於衍生自患者之異種移植(PDX)小鼠模式中之效力，其使用SCID小鼠中衍生自HuPrime患者之人類胰臟癌(PA6237)。
於此例示性研究中，建立具皮下腫瘤(100至200 mm3 )之3隻小鼠之組別並於第0天及第7天投予3或6 mg/kg之抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(AADC)或媒劑對照。如圖16之例示性結果所示，AADC檢測物品於3及6 mg/kg時達到大於100%之腫瘤生長抑制(TGI)。於此等6 mg/kg組中，第59天觀察到3隻中之3隻完全反應，然而3 mg/kg組到第31天維持完全反應，隨後腫瘤再生長。

實施例 23 ：抗 -CD71 共軛可活化之抗體之非 GLP 先導性毒性研究
此實施例顯示本揭露之抗-CD71共軛可活化之抗體(AADC)(抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2，劑量範圍6至18 mg/kg)及抗-CD71共軛之抗體(ADC)(Ab21.12-vcMMAE E2，劑量範圍0.6至6 mg/kg)於馬來猴(每組每性別1至2隻猴)中每3週1次(Q3W)或每2週1次(Q2W)靜脈推注注射後之相對毒性。於第29天(最後劑量後7天)進行末端屍體剖檢。研究期間之評估包括臨床症狀、體重、攝食量、臨床病理學、解剖病理學、TK及免疫原性。該先導性毒性研究之概述示於表13。
由接受高劑量CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(18 mg/kg)、頻繁劑量CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2(於第1天及第15天給藥)、或以6及2 mg/kg未遮蔽之親源抗-CD71抗體藥物共軛物(ADC)(Ab21.12-vcMMAE E2)之組別中之駝背姿勢、活動力減退及體溫上升，顯示觀察到之嚴重毒性。於可建立死亡原因時，其被確定為藥物相關免疫抑制之繼發性感染。
就CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2及Ab21.12-vcMMAE E2而言之檢測物品相關研究結果類似且主要由血液學毒性構成。關鍵之研究結果包括(1)於接受18 mg/kg單次劑量之CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2、於第1天及第15天8 mg/kg之CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2、或 ≥ 2 mg/kg單次劑量ADC(Ab21.12-vcMMAE E2)之組別中觀察到歸因於繼發性感染之死亡；(2)以≥ 12 mg/kg之CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2給藥後2週體重下降，給藥後3週恢復；(3)紅血球量及所有白血球族群呈劑量依賴性下降，給藥後3週觀察到部分至完全恢復；(4)給藥後2週血小板量短暫增加；(5)纖維蛋白原輕度至中度增加、白蛋白下降及球蛋白增加；(6)骨髓、脾臟及胸腺細胞性輕度至中度減少，伴隨胸腺及脾臟之對應重量下降。於數種類淋巴組織中亦觀察到減少的細胞性。
於此例示性研究中，每3週投予1次總共2劑量，在這些研究中CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2及Ab21.12-vcMMAE E2(對應之ADC)之最高耐受性劑量分別為12 mg/kg及0.6 mg/kg。

實施例 24 ：抗 -CD71 共軛可活化之抗體之 GLP 毒性研究
此實施例顯示本揭露抗-CD71共軛可活化之抗體(AADC)抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2於馬來猴中之GLP重覆劑量毒性研究，其中係於第1天及第22天以劑量0、2、6、或12 mg/kg進行靜脈推注；劑量組別示於表14。
於此例示性研究中，如表14中所示，每組6隻公猴及6隻母猴投予抗-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2或媒劑(於第1天及第22天靜脈推注指示劑量)。於第29天進行末端屍體剖檢，並於第64天進行恢復屍體剖檢(recovery necropsies)。毒性評估包括死亡率、臨床症狀、體重變化、攝食量、臨床病理學、解剖病理學、眼科檢查，以及評估心血管、呼吸及中樞神經系統之功能。該研究包括TK分析及ADA形成之評估。進行下述例示性觀察。
關於體重、攝食量、呼吸速率、心電圖、凝血及尿液分析參數無AADC相關之影響，也無任何神經系統影響、視覺影響、或總體病理學之研究結果。
於12 mg/kg劑量觀察到AADC相關之死亡；第10天發現一隻母猴死亡及於第11天將處於衰退臨床症狀之2隻母猴實行安樂死。此等動物中AADC相關之臨床病理學及微觀研究結果除了細菌感染之微觀證據(其被視為AADC相關免疫抑制之結果)外，與存活至預定屍體剖檢(第29天)之動物中所存在者類似。
於投予12 mg/kg之存活至預定屍體剖檢之動物中，與AADC相關的臨床症狀為與感染一致之皮膚損傷/創傷，其與下降之白血球族群及急性發病期反應之徵象(白蛋白及膽固醇下降與球蛋白、總膽紅素及三酸甘油酯增加)關聯。
第一劑量後，於≥ 6 mg/kg之血液學參數變化包括紅血球量、網狀紅血球及所有白血球子集之下降以及血小板增加。第一及第二劑量後，於2 mg/kg之血液學變化局限於輕度之血小板增加。
於第一劑量後，與AADC相關之臨床化學參數之變化以12 mg/kg時最顯著，包括急性發病期反應(白蛋白與膽固醇下降及球蛋白、三酸甘油酯[僅母猴]、總膽紅素增加)與尿素氮(僅個體)及肌酸酐增加以及磷下降。只於第一劑量後看到6 mg/kg之臨床化學變化且局限於個別母猴中極微地增加之膽紅素及增加之球蛋白。
與AADC相關之血液學及臨床化學研究結果於恢復期結束時恢復。
≥ 6 mg/kg/劑量時，於終端安樂死與AADC相關之微觀研究結果呈現於胸腺、腎上腺及骨髓中。於所有組別觀察到注射部位之研究結果，並被解釋為與投予程序有關而非特別針對AADC。投予12 mg/kg之公猴及投予6 mg/kg之母猴胸腺重下降，其於組織學上與細胞性狀下降相關聯，特別是胸腺皮層。投予12 mg/kg之公猴及投予6 mg/kg之母猴腎上腺重增加且與組織學相關聯的為腎上腺皮質肥大。投予≥ 6 mg/kg之公猴中，下降之細胞性呈現於骨髓中，特別是於股骨。於無劑量間隔6週後，胸腺與腎上腺皮質肥大之下降的細胞性不存在，此與此等變化之完全恢復一致。骨髓細胞性增加持續，惟嚴重度下降，與部分恢復一致。

實施例 25 ： MMAE 及 CD71 可活化之抗體之共軛及降低所產生 CD71 共軛可活化之抗體之 DAR 至約 DAR 3 之方法
此實施例概述用以使vc-MMAE與抗-CD71可活化之抗體(抗-CD71 TF02.13-2011)共軛以創造每個抗-CD71 TF02.13-2011分子含有2個MMAE分子藥物負載之抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE之方法，以及用以富含DAR至約3之方法。

共軛方法
富含E2之抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE - 於2至8℃在抗-CD71 TF02.13-201之溶液(13.95 mg/mL)(39 g溶液，544 mg，3.5nMol)中，添加0.5 M EDTA(0.39 mL)及TCEP(0.77 mL，10 mM於WFI中，7.7nMol，2.2當量)過夜。然後將還原之抗體以DMSO(2.29 mL)稀釋，室溫下，以DMSO中之vcMMAE(1.89 mL之9.49 mM vcMMAE DMSO溶液，17.9nMol，5.1當量)處理1小時。以N-乙醯半胱胺酸(0.29 mL之100 mM之WFI溶液，29nMol，8.2當量)處理共軛之抗體以淬滅過量之vcMMAE。經由HIC(疏水作用層析法)分析經淬滅溶液之DAR類別＞ E4(較高DAR類別，於上述製備中20.9%)。

富含至較低DAR之方法
於室溫使共軛反應與HIC樹脂(如從Tosoh Biosciences市售可得者(例如Toyopearl alkyl))分批懸浮2小時以降低較高DAR類別至靶定程度(通常＜ 2%)。過濾經處理之溶液並依次以PBSE(125 mM 磷酸鉀、150 mM NaCl、6.3 mM EDTA、pH 7.2、22 g)接著以PBS(5 mM 磷酸鉀、200 mM NaCl、pH 7、35 g)洗滌樹脂。將合併之過濾液及潤洗液濃縮，並使用30 kD分子量截留之離心過濾器進行緩衝液交換，然後以調配物成分稀釋後貯存。
所得產物相當於228 mg(A280 6.5 mg/mL)，從市售可得之HIC管柱測量顯示具有約2.9之DAR及構成下述特性及DAR類別：SEC 98.7%單體，0.2%較高分子量，1.1%較低分子量，內毒素＜ 0.06 EU/mg；大於E4之DAR類別為小於2面積%，DAR E0為約6.2面積%，DAR E2為約40.7面積%及DAR E4為約46.8面積%。
於本文所述之實施例中，此富含之DAR產物稱為“抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE(具有~3之平均DAR)”。

實施例 26 ： MMAE 與 CD71 可活化之抗體之共軛及富含所產生 CD71 共軛可活化之抗體之 DAR 至約 DAR 2(“E2”) 之方法
此實施例概述用以使vc-MMAE與抗-CD71可活化之抗體(抗-CD71 TF02.13-2011)共軛以創造每個抗-CD71 TF02.13-2011分子含有2個MMAE分子藥物負載之抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE之方法，以及用以富含DAR至約2之方法。

共軛方法
抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 -以1457 g PBSE(125 mM磷酸鉀、150 mM NaCl、6.3 mM EDTA、pH 7.7)稀釋抗-CD71 TF02.13-2011(20.3 mg/mL)溶液，並冷卻至4℃。於冷卻溶液中添加TCEP(10 mM於WFI中，30.2 mL，0.30 mmol，1.5當量)於4℃維持15小時。於還原之抗體中，在冷卻下添加於DMSO(300 g)中之vc-MMAE溶液(1.056 g，0.80 mmol，4當量)，隨後以DMSO潤洗(65 g)，之後使溶液回溫至室溫。3.5小時後，添加N-乙醯半胱胺酸(0.262 g，1.60 mmol，8當量)以淬滅過量之vc-MMAE，並將反應混合物於2至8℃下貯存直至純化。

富含至較低DAR之方法
將產物於市售可得之HIC純化管柱(如從GE Life Sciences市售可得者(alkyl Sepharose))上分批純化，使用pH 7.1之硫酸銨/磷酸鹽緩衝液梯度，利用UV於280nM監測。將收集之DAR 2產物匯集(大約9.5 g，產率30%)，使用Pellicon 3 Ultracel 30 kD膜經由TFF於pH 6.0以緩衝液進行緩衝液交換，然後以調配物成分稀釋後貯存。
所得產物(A280 6.4 mg/mL)從市售可得之HIC管柱測量顯示具有約2之DAR及構成下述特性及DAR類別：SEC 99.6%單體，0.2% HMW，0.2% LMW，內毒素 ＜ 0.06 EU/mg及DAR E2為約99.0面積%，批次間之變異性介於94至99% DAR E2間。
於本文所述之實施例中，此富含(E nriched)之DAR 2 ( “E2”)產物稱為“抗-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2”。

其他實施例
雖然本發明已結合其詳細說明予以敘述，惟前述敘述意欲說明而不對由附加申請專利範圍界定之本發明範圍構成侷限。其他態樣、優點及修飾均隸屬下述範圍之內。
如實施例5中所討論，圖1描繪測定各種原發及轉移癌組織類型中CD71表現量之例示性免疫組織化學(IHC)分析。此圖式及實施例中所示例示性結果顯示於多種人類癌症原發腫瘤中表現高量之CD71。
如實施例5中所討論，圖2描繪多種患者源之轉移癌試樣中CD71表現量之例示性研究。此圖式及實施例中所示例示性結果顯示，於多種人類癌症轉移腫瘤中表現高量之CD71。
如實施例4中所討論，圖3A及3B描繪當可活化之抗體係完整或經蛋白分解活化(表示為“ACT”)時，本揭露未共軛及共軛之抗-CD71可活化之抗體結合人類或馬來猴重組CD71能力之例示性活體外分析。於這些圖式及實施例中所示例示性結果顯示，抗-CD71共軛可活化之抗體以與其未共軛之抗-CD71可活化之抗體對應物可相較之量與CD71結合，且二者於蛋白酶活化後亦皆以相等增加之親和力與CD71結合。
如實施例4中所討論，圖3C及3D描繪當可活化之抗體係完整或經蛋白分解活化(表示為“ACT”)時，本揭露未共軛及共軛之抗-CD71可活化之抗體結合人類或馬來猴細胞表面上CD71能力之例示性活體外分析。於這些圖式及實施例中所示例示性結果顯示，抗-CD71共軛可活化之抗體以與其未共軛之抗-CD71可活化之抗體對應物可相較之量與細胞表面CD71結合，且二者於蛋白酶活化後亦皆以相等增加之親和力與細胞表面CD71結合。
如實施例6中所討論，圖4A、4B及4C描繪本揭露之抗-CD71共軛可活化之抗體(AADC)於小鼠異種移植模式中(抗-CD71 TF01-3011-MMAE 對抗-CD71 TF02.13-2011-MMAE)之例示性效力研究。於這些圖式及實施例中所顯示之例示性結果，具較低親和力遮蔽部分(TF02.13)之AADC證實比具較高親和力遮蔽部分(TF01)之AADC有較高之效力。
如實施例7中所討論，圖5描繪於小鼠異種移植模式中本揭露之抗-CD71共軛可活化之抗體(AADC)之例示性效力研究。此圖式及實施例中所示之例示性結果證明具較少可切割基質之所指AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE)之效力實質上與圖4B及4C中所示具更多可切割基質之AADC(抗-CD71 TF02.13-3011-vcMMAE)之效力一樣。
如實施例8中所討論，圖6A、6B、6C及6D描繪本揭露之具不同DAR之抗-CD71共軛可活化之抗體(AADC)(具DAR~3之抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE及具DAR~2之抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)於小鼠異種移植模式中之例示性效力研究。於這些圖式及實施例中所示之例示性結果證實具有不同DAR之經劑量匹配之AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE)之效力顯現可相較之效力。
如實施例9中所討論，圖7A、7B及7C顯示用於分析投予本揭露抗-CD71共軛可活化之抗體(AADC)所產生代謝產物之例示性工作流程概要。
如實施例11-14中所討論，圖8A、8B、9A、9B、10及11描繪於動物模式中投予本揭露抗-CD71共軛可活化之抗體(AADC)後，代謝副產物之例示性時程。於這些圖式及實施例中所示之例示性結果證實，本揭露之全體及完整AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)之量於整個給藥期間以劑量比例之量維持於動物中，且於整個給藥期間及所有給藥量下，與可活化之抗體共軛之MMAE量實質上較高於未共軛之MMAE量。
如實施例17中所討論，圖12描繪所指示檢測物品對iC3b蛋白質片段之例示性滴定，表示其活化補體級聯反應之能力。於此圖式及實施例中所顯示之例示性結果證明，相較於其未共軛可活化之抗體，本揭露之AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)證實較低之補體活化能力。
如實施例19中所討論，圖13描繪使用人類結腸直腸細胞株之小鼠異種移植模式中，本揭露AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)之例示性效力。於此圖式及實施例中所示之例示性結果證實，本揭露之AADC於所有劑量下顯示顯著之腫瘤生長抑制，且於最高劑量下觀察到完全消退。
如實施例20中所討論，圖14描繪使用人類患者源腫瘤(DLBCL)之小鼠異種移植模式中，本揭露AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)之例示性效力。於此圖式及實施例中所示之例示性結果證實，本揭露之AADC於單一投予後顯示顯著之腫瘤生長抑制，並於若干情況下觀察到完全反應。
如實施例21中所討論，圖15A、15B及15C描繪本揭露之AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)於小鼠患者源之異種移植(PDX)模式中之例示性效力。這些圖式及實施例中所示之例示性結果證實，本揭露之AADC於源自多種人類癌症類型之PDX模式中證實效力，包括於若干情況下之完全反應。
如實施例22中所討論，圖16描繪本揭露之AADC(抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)於小鼠患者源之異種移植模式中之例示性效力。於此圖式及實施例中所顯示之例示性結果證實，本揭露之AADC證實對PDX胰臟癌模式之效力，包括於若干情況下之完全反應。
如實施例10中所討論，圖17概述顯示本揭露之具共軛毒素(AADC)之抗-人類CD71可活化之抗體(抗-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2)，相較於對應之親源抗-CD71抗體藥物共軛物(ADC)，即使於較高相對之劑量下，於馬來猴中耐受性良好且穩定之結果；AADC具有較大之可切割性基質，且AADC具較高之DAR。

Claims (30)

  1. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽： (a)其中 (i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含 i.重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及 ii. 輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列； (ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合； (iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分； (iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；以及 (v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；以及 (b)其中“n”為2。
  2. 如申請專利範圍第1項之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
  4. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽： (a)其中 (i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區； (ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合； (iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分； (iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；以及 (v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；以及 (b)其中“n”為2。
  5. 如申請專利範圍第4項之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
  6. 如申請專利範圍第4或5項之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
  7. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽： (a)其中 (i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之序列之輕鏈； (ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合； (iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分； (iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；以及 (v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分；以及 (b)其中“n”為2。
  8. 如申請專利範圍第7項之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
  9. 如申請專利範圍第7或8項之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
  10. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(I)之結構或其鹽： 其中MM-LP1-CM-LP2-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體， 其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：170之序列之輕鏈，以及 其中“n”為2。
  11. 如申請專利範圍第10項之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
  12. 如申請專利範圍第10或11項之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
  13. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽： (a)其中 (i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含 i.重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及 ii. 輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列； (ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；以及 (iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；以及 (b)其中“n”為2。
  14. 如申請專利範圍第13項之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
  15. 如申請專利範圍第13或14項之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
  16. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽： (a)其中 (i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：5之序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO：7之序列之輕鏈可變區； (ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；以及 (iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；以及 (b)其中“n”為2。
  17. 如申請專利範圍第16項之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
  18. 如申請專利範圍第16或17項之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
  19. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽： (a)其中 (i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之序列之輕鏈； (ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合；以及 (iii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；以及 (b)其中“n”為2。
  20. 如申請專利範圍第19項之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
  21. 如申請專利範圍第19或20項之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
  22. 一種共軛可活化之抗體，其包含式(II)之結構或其鹽： 其中MM-CM-AB為可活化之抗體，其中該AB為特異性結合人類CD71之抗體， 其中該可活化之抗體包含包括SEQ ID NO：167之序列之重鏈及包括SEQ ID NO：169之序列之輕鏈，以及 其中“n”為2。
  23. 如申請專利範圍第22項之共軛可活化之抗體，其中該AB包含IgG1同型。
  24. 如申請專利範圍第22或23項之共軛可活化之抗體，其中該AB為具有重鏈恆定區之抗體，且其中該重鏈恆定區之C端殘基不為離胺酸。
  25. 一種製造包含式(I)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法： (a)其中 (i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含 i.重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及 ii. 輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列； (ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合； (iii) LP1為包括SEQ ID NO：207之胺基酸序列之第一連接部分； (iv) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及 (v) LP2為包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列之第二連接部分； 且其中“n”為2； (b)該方法包括 (i)以還原劑還原包含MM-LP1-CM-LP2-AB之可活化之抗體；及 (ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。
  26. 一種製造包含式(II)結構或其鹽之共軛可活化之抗體之方法： (a)其中 (i) AB為特異性結合人類CD71之抗體且包含 i.重鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：9之CDRH1序列、包括SEQ ID NO：10之CDRH2序列及包括SEQ ID NO：11之CDRH3序列；以及 ii. 輕鏈可變區，其包含包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之CDRL1序列、包括SEQ ID NO：14之CDRL2序列及包括SEQ ID NO：15之CDRL3序列； (ii) MM為包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之遮蔽部分，其中當該共軛可活化之抗體呈未切割狀態時，該MM抑制該AB與人類CD71之結合； (ii) CM為包括SEQ ID NO：156之序列之可切割部分；其中該CM為作用為蛋白酶基質之多肽；及 且其中“n”為2； (b)該方法包括 (i)以還原劑還原包含MM-CM-AB之可活化之抗體；及 (ii)使一或多個vcMMAE與該還原之可活化之抗體共軛。
  27. 一種醫藥組成物，其包含： 如申請專利範圍第1至24項中任一項之共軛可活化之抗體；及 視需要之醫藥上可接受之載劑。
  28. 減輕個體中癌症之症狀或延緩其進展之方法，該方法包括投予有其需要之個體治療有效量之如申請專利範圍第1至24項中任一項之共軛可活化之抗體或申請專利範圍第27項之醫藥組成物，其中該癌症係選自由下列者所組成之群組：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小細胞肺癌、ER+乳癌、三重陰性乳癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、攝護腺癌、多發性骨髓瘤、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、頭頸部小細胞癌、胰臟癌、間皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肝細胞癌及神經膠母細胞瘤。
  29. 一種作為藥劑用之如申請專利範圍第1至24項中任一項之共軛可活化之抗體或如申請專利範圍第27項之醫藥組成物。
  30. 一種用於治療癌症之如申請專利範圍第1至24項中任一項之共軛可活化之抗體或如申請專利範圍第27項之醫藥組成物，視需要地其中該癌症係選自由下列者所組成之群組：胃癌、卵巢癌、食道癌、非小細胞肺癌、ER+乳癌、三重陰性乳癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、攝護腺癌、多發性骨髓瘤、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、頭頸部小細胞癌、胰臟癌、間皮瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肝細胞癌及神經膠母細胞瘤。
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