BR112020007145A2 - agente anticâncer, composição farmacêutica, métodos para tratar um câncer e para diagnosticar um câncer, processo para a produção de um agente anticâncer e método de entrega - Google Patents

agente anticâncer, composição farmacêutica, métodos para tratar um câncer e para diagnosticar um câncer, processo para a produção de um agente anticâncer e método de entrega Download PDF

Info

Publication number
BR112020007145A2
BR112020007145A2 BR112020007145-5A BR112020007145A BR112020007145A2 BR 112020007145 A2 BR112020007145 A2 BR 112020007145A2 BR 112020007145 A BR112020007145 A BR 112020007145A BR 112020007145 A2 BR112020007145 A2 BR 112020007145A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
lhp
cancer
arsenic
cells
phas
Prior art date
Application number
BR112020007145-5A
Other languages
English (en)
Inventor
Carolyn Therese Dillon
Judith Anne Carrall
Original Assignee
University Of Wollongong
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2017904199A external-priority patent/AU2017904199A0/en
Application filed by University Of Wollongong filed Critical University Of Wollongong
Publication of BR112020007145A2 publication Critical patent/BR112020007145A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/285—Arsenic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/36—Arsenic; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/66—Arsenic compounds
    • C07F9/70—Organo-arsenic compounds
    • C07F9/74—Aromatic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/66—Arsenic compounds
    • C07F9/70—Organo-arsenic compounds
    • C07F9/74—Aromatic compounds
    • C07F9/76—Aromatic compounds containing hydroxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/66—Arsenic compounds
    • C07F9/70—Organo-arsenic compounds
    • C07F9/74—Aromatic compounds
    • C07F9/78—Aromatic compounds containing amino groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

É fornecido um agente anticâncer compreendendo um peptídeo de tropismo tumoral que possui ou foi modificado para apresentar dois resíduos de cisteína, com um átomo de arsênio entre eles, de modo que o peptídeo de tropismo tumoral ciclize para formar um agente anticâncer contendo arsênio. Isso permite a seleção de um peptídeo de tropismo tumoral apropriado para o tratamento de um determinado câncer, pelo qual o agente subsequente fornece uma entrega mais direcionada de arsênio ao microambiente tumoral.

Description

“AGENTE ANTICÂNCER, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA TRATAR UM CÂNCER E PARA DIAGNOSTICAR UM CÂNCER, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM AGENTE ANTICÂNCER E MÉTODO DE ENTREGA” CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A invenção refere-se ao campo do tratamento médico. De modo mais particular, a presente invenção refere-se ao arsênio coordenado com peptídeos e ao uso dos complexos resultantes como agentes anticâncer.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Qualquer referência à anterioridade no presente documento não deve ser interpretada como uma admissão de que tal estado da técnica constitui conhecimento geral comum na Austrália ou em qualquer outro lugar.
[003] Embora o trióxido de arsênio (As2O3, ATO) seja um veneno bem conhecido, ele tem sido utilizado no meio médico há bastante tempo. Em 1865, os compostos arsênicos, (um dos quais era conhecida como solução de Fowler (uma solução contendo 1% ATO)), foram descritos para o tratamento da leucemia mieloide crônica. Eles foram substituídos, devido à toxicidade crônica que apresentavam, por agentes que eram mais bem tolerados em meados do século 20. Entretanto, após o acompanhamento clínico em estudos clínicos de larga escala, os efeitos terapêuticos do ATO foram identificados em certos cânceres humanos, como a leucemia, carcinoma esofágico e linfoma. Atualmente, ele é usado no tratamento de neoplasias hematológicas, como na leucemia promielocítica aguda.
[004] O arsênio exibe sua toxicidade, e inversamente efeitos terapêuticos, por meio de uma variedade de mecanismos que envolvem certo número de alvos celulares. O arsênio se liga prontamente ao enxofre nos resíduos de aminoácidos cisteína ou metionina (que são encontrados em proteínas/enzimas), interrompendo assim uma vasta gama de funções celulares e,
finalmente, resultando na morte celular. Alguns exemplos bem estudados de proteínas alvo do arsênio trivalente incluem glutationa redutase, tioredoxina redutase, adenina nucleotídeo translocase mitocondrial (ANT) e tubulina. Qualquer uma dessas interações leva à morte celular. Por exemplo, a mitocôndria produz energia dentro da célula de tal modo que interrupções em seu funcionamento resultam na morte da célula. A interação do arsênio com a tubulina interrompe a formação de microtúbulos, impedindo a replicação celular. Além disso, o acúmulo de arsênio dentro do núcleo da célula resulta na fragmentação do DNA.
[005] A leucemia promielocítica aguda (APL) é uma forma agressiva de leucemia que pode causar mortalidade dentro de três meses, se não for tratada. Um dos tratamentos atuais mais eficazes para a APL é o ATO, que cura com sucesso 85% dos pacientes que recidivaram após outras terapias. O ATO foi aprovada no final de 2015 na terapia combinada de primeira linha para APL. Ele apresenta comportamento multifacetado, benéfico para superar a resistência; de modo que invocou um interesse considerável para o tratamento de uma série de outros tipos de cânceres, particularmente neoplasias hematológicas.
[006] Infelizmente, o ATO induz efeitos colaterais tóxicos que podem limitar a dose do medicamento anticâncer que pode ser administrado no tratamento da LPA e de outros tipos de cânceres. Isso pode levar à resposta incompleta do tumor, ao desenvolvimento de eventos cardíacos adversos, resistência aos medicamentos, descontinuação do tratamento e, por fim, a progressão da doença. A causa subjacente dos efeitos colaterais tóxicos decorre do fato de que os medicamentos anticâncer que contêm arsênio, como o ATO, matam indiscriminadamente células de câncer e células saudáveis.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[007] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um agente anticâncer compreendendo um peptídeo de tropismo tumoral (homing tumoral) ciclizado possuindo um átomo de arsênio ligado a dois resíduos de cisteína.
[008] Adequadamente, o átomo de arsênio ligado aos dois resíduos de cisteína permite que o peptídeo de tropismo tumoral seja cíclico. Ou seja, forma uma ponte do arsênio entre duas cisteínas que gera o peptídeo de tropismo tumoral ciclizado.
[009] Em um exemplo de realização, os dois resíduos de cisteína ligados ao arsênio do peptídeo de tropismo tumoral são separados, um do outro, por menos de 20 resíduos de aminoácidos.
[010] Em determinados exemplos de realização, os dois resíduos de cisteína ligados ao arsênio do peptídeo de tropismo tumoral são separados por menos de 18 resíduos de aminoácidos, ou menos de 16 resíduos de aminoácidos, ou menos de 15 resíduos de aminoácidos ou menos de 14 resíduos de aminoácidos.
[011] Em exemplos de realização, antes da ciclização para formar o agente anticâncer, os dois resíduos de cisteína que se ligam ao átomo de arsênio são os respectivos resíduos de peptídeo N-terminal e C-terminal do peptídeo de tropismo tumoral.
[012] Se não estiver naturalmente presente no peptídeo de tropismo tumoral, os dois resíduos de cisteína que se ligam ao átomo de arsênio podem ser adicionados ao peptídeo de tropismo tumoral para formar assim os respectivos resíduos de peptídeo N-terminal e C-terminal.
[013] A cisteína N-terminal pode compreender um grupo de capeamento (capping) ligado ao seu nitrogênio amino-terminal.
[014] Em um exemplo de realização, o agente anticâncer compreende ainda um grupo estabilizador ligado ao átomo de arsênio.
[015] De modo adequado, o grupo estabilizador é selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxila, alquila-C1 a C6, alquenila-C2 a C6, alquinila--C2 a C6, arila, cicloalquila e heterocíclico.
[016] Em exemplos de realização, o peptídeo de tropismo tumoral compreende pelo menos um resíduo de arginina e/ou lisina.
[017] Em um exemplo de realização, o agente anticâncer tem uma estrutura como mostrado na fórmula I: Fórmula I em que, os átomos de enxofre aos quais o arsênio está ligado são ti- il-enxofres dos respectivos resíduos de cisteína; os resíduos de cisteína na Fórmula I são separados por menos de 20 resíduos de aminoácidos representados pela linha curva; e R é um grupo estabilizador selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxila, alquila C1 a C6, alquenila C2 a C6, alquinila C2 a C6, alcóxi C1 a C6, arila, cicloalquila, glutatiíla e heterocíclico, em que cada dos grupos pode ser substituído ou não substituído.
[018] De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um agente anticâncer do primeiro aspecto e um veículo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[019] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento de um câncer em um paciente, incluindo a etapa de administração de um agente anticâncer do primeiro aspecto ou a composição farmacêutica do segundo aspecto ao paciente, para, desse modo, tratar o câncer.
[020] Um quarto aspecto da invenção reside em um agente anticâncer do primeiro aspecto para uso no tratamento de um câncer em um paciente.
[021] Um quinto aspecto da invenção reside no uso de um agente anticâncer do primeiro aspecto na fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer.
[022] Com relação aos aspectos do terceiro ao quinto aspecto, em um exemplo de realização, o câncer é uma neoplasia hematológica ou um tumor sólido.
[023] De acordo com um sexto aspecto da invenção, é fornecido um processo para a produção de um agente anticâncer, incluindo as etapas de: - colocar um peptídeo de tropismo tumoral compreendendo dois resíduos de cisteína em contato com um composto de arsênio; - permitir que o arsênio se ligue a cada um dos dois resíduos de cisteína para formar um peptídeo de tropismo tumoral ciclizado compreendendo um átomo de arsênio ligado; e - para, desse modo, produzir o agente anticâncer.
[024] O agente anticâncer pode ser como descrito para o primeiro aspecto.
[025] O composto de arsênio pode ser um óxido de arsênio.
[026] Em um exemplo de realização, o composto de arsênio pode compreender um grupo alquila, hidroxila ou arila ligado ao arsênio.
[027] Em um exemplo de realização, o processo pode compreender a etapa (a)(i) de modificação de um peptídeo de tropismo tumoral selecionado para apresentar dois resíduos de cisteína.
[028] Um sétimo aspecto da invenção reside em um agente anticâncer produzido pelo processo do sexto aspecto.
[029] Um oitavo aspecto da invenção reside em um método de entrega de uma quantidade terapeuticamente eficaz de arsênio para um paciente incluindo a etapa de administrar ao paciente uma quantidade apropriada do agente anticâncer do primeiro aspecto, ou a composição farmacêutica do segundo aspecto, para, desse modo, entregar a quantidade terapeuticamente eficaz de arsênio.
[030] O método do oitavo aspecto pode incluir qualquer um dos exemplos de realização descritos para o primeiro aspecto.
[031] Um nono aspecto da invenção reside em um método de diagnóstico de um câncer, incluindo as etapas de: - administrar um agente anticâncer do primeiro aspecto compreendendo pelo menos um átomo radioativamente marcado a um paciente; - permitir que o agente anticâncer se localize no câncer; e - detectar a presença de pelo menos um átomo radiomarcado do agente anticâncer; e - para, desse modo, diagnosticar o câncer.
[032] As várias características e exemplos de realização da presente invenção, referidos nas seções individuais acima, aplicam-se, conforme apropriado, mutatis mutandis a outras seções. Consequentemente, as características especificadas em uma seção podem ser combinadas com as características especificadas em outras seções, conforme apropriado.
[033] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[034] Para que a invenção possa ser prontamente entendida e colocada em prática, serão descritos exemplos de realização preferidos a título de exemplo, com referência às figuras anexas, em que: - A Figura 1A mostra o espectro de massa ESI de íon positivo para LHP com picos em m/z 407,4 e m/z 610,5 atribuído [LHP + 3H+]3+ e [LHP + 2H+]2+, respectivamente; A Figura 1B mostra os resultados de ESI-MS para as reações de 8 h de AsI3 e LHP em (a) tampão fosfato (pH 8) e (b) trietilamina (pH 8) com picos em m/z 431,4 e m/z 646,8 atribuído [HyAs(LHP) + 3H+]3+ e [HyAs(LHP) + 2H+]2+,
respectivamente, confirmando a produção do produto desejado, HyAs (LHP). Íons a m/z 407,6, m/z 610,5, e m/z 628,8 são atribuídos aos peptídeos livres, [LHP +
3H+]3+, [LHP + 2H+]2+, e [LHP,2H2O + 2H+]2+, respectivamente.
O íon em m/z 837,9 é identificado como [HyAs(LHP)2 + 3H+]3+; Figura 1C é o resultado de ESI-MS para a reação de MMA(V) e LHP em tampão fosfato (pH 8) seguindo 16 h de incubação a 37ºC.
Íons a m/z 437,1 [MeAs(LHP) + 3H+]3+, m/z 444,8 [MeAs(LHP) + Na+ +
2H+]3+, m/z 655,1 [MeAs(LHP) + 2H+]2+, e m/z 666,4 [MeAs(LHP) + Na+ + H+]2+,
confirmando a produção do produto desejado, MeAs(LHP). Os íons de peptídeo livre acorrem a m/z 407,6 [LHP + 3H+]3+, * = m/z 414,9 [LHP + Na+ + 2H+]3+, m/z
610,5 [LHP + 2H+]2+, m/z 629,6 [LHP + Na+ + H+]2+; Figura 1D mostra os resultados ESI-MS para os produtos a partir da reação de PAO e LHP em tampão fosfato (pH 8) seguindo 4 h de incubação a 37ºC com íons a m/z 457,6
[PhAs(LHP) + 3H+]3+ e m/z 685,5 [PhAs(LHP) + 2H+]2+, confirmando a produção do produto desejado, PhAs(LHP). Os íons de peptídeo livre acorrem a m/z 407,6
[LHP + 3H+]3+, e m/z 610,5 [LHP + 2H+]2+;
- A Figura 2 A é uma série de traços de HPLC a partir do HPLC analítico para (a) LHP (pico de aproximadamente 15 min no traço superior; 14 min e 17 min no segundo traço; 14 e 19 min no terceiro traço; e 15 e 22 min no último traço); (b) HyAs (LHP); (c) MeAs (LHP); (d) PhAs (LHP). O peptídeo livre (LHP)
aparece aos 14,5 min em todos os cromatogramas, com os complexos especificados nos seguintes tempos: (b) pico de HyAs (LHP) aos 17,2 min (c)
MeAs (LHP) aos 18,1 min e (d) PhAs (LHP) aos 22,1 min; A Figura 2B é uma série de espectros de massa ESI de íons positivos caracterizando os compostos após a purificação (a) HyAs (LHP); (b) MeAs (LHP); (c) PhAs (LHP). círculo = [LHP +
3H+]3+; retângulo = [ HyAs(LHP) + 3H+]3+; estrela = [LHP + 2H+]2+; triângulo = [ HyAs(LHP) + 2H+]2+; X = [MeAs(LHP) + 3H+]3+; cruz = [MeAs(LHP) + 2H+]2+;
diamante vertical = [PhAs(LHP) + 3H+]3+; diamante horizontal = [PhAs(LHP) +
2H+]2+;
- A Figura 3 é uma representação dos espectros XANES (absorção de raios X próximo à borda) obtidos na borda K de amostras sólidas dos padrões
As e de compostos As-LHP, indicando a integridade estrutural dos complexos de arsênio LHP, em que o estado de oxidação é As3+ e o arsênio está ligado a dois átomos de enxofre e ao grupo R;
- A Figura 4 é uma representação gráfica de uma análise EXAFS
(esquerda) e a transformada de Fourier correspondente (direita) de uma amostra sólida de HyAs (LHP) mostrando dados experimentais (preto) e calculados
(vermelho) para Fit 3 (2S e 1O) como mostrado na tabela 6; confirmando que o
As3+ está ligado a 2 átomos de enxofre e 1 átomo de oxigênio;
- A Figura 5 é uma representação gráfica de uma análise EXAFS
(esquerda) e a transformada de Fourier correspondente (direita) da amostra sólida de MeAs (LHP) mostrando dados experimentais (preto) e calculados (vermelho)
usando um único ajuste de dispersão (a primeira camada de coordenação) para o
Fit 4 (2S e 1C) como mostrado na tabela 7; confirmando que o As3+ está ligado a 2 átomos de enxofre e 1 átomo de carbono;
- A Figura 6 é uma representação gráfica de uma análise EXAFS
(esquerda) e a transformada de Fourier correspondente (direita) da amostra sólida de PhAs (LHP) mostrando dados experimentais (preto) e calculados (vermelho)
usando um único ajuste de dispersão (a primeira camada de coordenação) para o
Fit 4 (2S e 1C) como mostrado na tabela 8; confirmando que o As3+ está ligado a 2 átomos de enxofre e 1 átomo de carbono;
- A Figura 7 é o cromatograma de HPLC preparativa em fase reversa dos produtos de reação de PAO (10 mM) com LHP (3 mM) realizado em água
MilliQ a 37ºC.
As identidades de cada fração principal foram confirmadas por ESI- MS.
O PAO foi eluído aos 13,28 minutos, PhAs (LHP) foi eluído aos 15,99 e 16,86 minutos.
As identidades dos componentes das frações menores foram confirmadas;
- A Figura 8 é o espectro de massa ESI de íons positivos de (a)
Fração 1 e (b) Fração 2. Os picos são identificados como: m/z 407,5 = [LHP +
3H+]3+, m/z 414,1 = [LHP + 2H+ + Na+]3+, m/z 457,4 = [PhAs(LHP) + 3H+]3+, m/z
463,5 = [PhAs(LHP) + 3H+ + H2O]3+, m/z 610,7 = [LHP + 2H+]2+, m/z 619,8 = [LHP
+ 2H+ + H2O]2+, m/z 685,5 = [PhAs(LHP) + 2H+]2+, m/z 696,7 = [PhAs(LHP) + H+ +
Na+]2+, confirmando cada uma das frações como o mesmo composto, PhAs (LHP);
- A Figura 9 é o cromatograma de HPLC analítico em fase inversa das frações isoladas identificadas como PhAs (LHP). (a) Fração 1: PhAs (LHP)
eluído aos 15,97 e 16,85 min. (b) Fração 2: PhAs (LHP) eluída aos 15,97 e 16,87 minutos, demonstrando a interconversão espontânea dos dois isômeros;
- A Figura 10 é o espectro XANES obtidos na borda K do As para
HyAs (LHP) em água Milli-Q a 0 h (azul, traço e pico mais à esquerda) e 4 h
(vermelho, após traço de arsenito com menor valor de pico) mostrando falta de estabilidade durante esse período.
O espectro de 4 horas é semelhante ao espectro de arsenito (verde);
- A Figura 11 é o espectro XANES obtidos na borda K do As para
MeAs (LHP) em água Milli-Q a 0 h (azul, não visível devido à sobreposição com o espectro de 14 h) e 14 h (vermelho) mostrando boa estabilidade sobre esse período de tempo.
O resíduo entre os dois espectros é representado em verde;
- A Figura 12 é o espectro XANES obtidos na borda K do As para
PhAs (LHP) em água Milli-Q a 0 h (azul, não visível devido à sobreposição com o espectro de 14 h) e 14 h (vermelho) mostrando excelente estabilidade sobre esse período de tempo.
O resíduo entre os dois espectros é representado em verde;
- A Figura 13 é o espectro XANES obtidos na borda Kdo As para
MeAs (LHP) em IMDM (meio celular) a 0 h (azul, pico ligeiramente mais alto e vale mais baixo de traços sobrepostos) e 24 h (vermelho) mostrando estabilidade razoável sobre esse período de tempo.
O resíduo entre os dois espectros (verde)
mostra anomalias entre os dois espectros, particularmente na região do vale pós-
borda;
- A Figura 14 é o espectro XANES obtidos na borda K do As para
PhAs (LHP) em IMDM a 0 h (azul, pico apenas ligeiramente visível devido à sobreposição com o espectro de 24h, pico ligeiramente mais baixo e vale mais baixo de traços sobrepostos) e 24 h (vermelho) mostrando a boa estabilidade sobre esse período de tempo.
O resíduo entre os dois espectros é representado em verde;
- A Figura 15 é uma série de curvas concentrações-respostas produzidas por ensaios MTT em células K562 após 24 h de tratamento.
Os compostos testados incluíram: (A) Drogas de arsênio atuais : Acetarsol, arsenito,
ATO, (B) Peptídeos e materiais de partida: AsI3, PAO, LHP, sLHP, (C) Peptídeos de arsênio: HyAs (LHP), MeAs (LHP), PhAs (LHP) e PhAs (sLHP); Estas curvas são usadas para calcular a metade da concentração inibitória máxima (IC 50) para cada composto em que uma IC50 mais baixa indica um composto mais tóxico;
- A Figura 16 mostra os resultados de uma comparação de valores
IC50 dos compostos As especificados obtidos a partir de ensaios de MTT em células K562 após 24 h de tratamento, exibindo melhora na toxicidade dos complexos de peptídeo - arsênio;
- A Figura 17 é uma representação dos resultados de uma comparação dos valores de IC50 dos compostos As especificados, obtidos a partir de ensaios MTT em células HL-60 após 24 horas de tratamento, mostrando boa toxicidade de PhAs (LHP) que contém o peptídeo alvo e a toxicidade muito reduzida de PhAs (sLHP), que contém o peptídeo embaralhado (que não é mais direcionado);
- A Figura 18 mostra uma comparação comparativa dos valores de IC50 dos compostos As especificados, obtidos a partir de ensaios de MTT em células Kasumi-1 após tratamento de 24 horas, mostrando toxicidade substancialmente melhorada de PhAs (LHP) versus seus PhAs (sLHP) derivados,
arsenito, ATO e PAO;
- A Figura 19 é uma representação dos resultados de uma comparação dos valores de IC50 dos compostos As especificados, obtidos a partir de ensaios MTT em células KARPAS 45 após 24 horas de tratamento, mostrando boa toxicidade de PhAs (LHP) que contém o peptídeo alvo e a toxicidade muito reduzida de PhAs (sLHP), que contém o peptídeo embaralhado (que não é mais direcionado);
- A Figura 20 é uma representação dos resultados de uma comparação de valores IC50 dos compostos As especificados obtidos a partir de ensaios MTT em células HepG2 após 24 h de tratamento; indicando que PhAs
(LHP) é menos tóxico para essas células de câncer de crescimento rápido, que não são alvos do peptídeo;
- A Figura 21 é uma representação dos resultados de uma comparação de valores IC50 dos compostos As especificados obtidos a partir de ensaios em tumores sólidos de Células de Hamster Chinês (CH) após 24 h de tratamento; indicando que PhAs (LHP) é menos tóxico para essas células de câncer de crescimento rápido, que não são alvos do peptídeo;
- A Figura 22 é uma representação dos resultados de uma comparação de valores IC50 dos compostos As especificados obtidos a partir de ensaios MTT em células hPBMC após 24 h de tratamento; indicando que PhAs
(LHP) é menos tóxico para essas células normais;
- A Figura 23 é um comparação de valores IC50 para PhAs(LHP) em todas as linhagens de células após 24 h de tratamento, que mostra a boa toxicidade de PhAs(LHP) contra as linhagens de células de leucemia (K562, HL-
60, Kasumi-1 e Karpas 45 que são alvos do peptídeo), reduziram significativamente a toxicidade nas linhagens de células de câncer de crescimento rápido aderentes (células tumorais sólidas HepG2, A549 e CH que não são alvos do peptídeo) e também reduziram a toxicidade nas células sanguíneas normais
(hPBMC, que também não são alvos do peptídeo);
- A Figura 24 é um resumo gráfico das concentrações celulares de
As associadas às linhagens de células especificadas após tratamento de 24 horas
(1,5 µM de As). Os resultados são representados como a média e o desvio padrão das amostras em triplicatas.
Os resultados mostram absorção seletiva de As nas linhagens de células de leucemia após o tratamento com PhAs(LHP) e absorção de As não detectável nas células não leucêmicas;
- A Figura 25 é o espectro XANES obtidos na borda K do As para
PhAs(LHP) (1 mM) em água MilliQ e células K562 tratadas com PhAs(LHP) (4 h e
24 h, linha inferior de traços sobrepostos), mostrando que As permanece como
As(III), mas que existem modificações intracelulares da ligação As-S;
- A Figura 26 é o espectro XANES obtidos na borda K do As para
PhAs(LHP) (1 mM) em água MilliQ e células HK-60 tratadas com PhAs(LHP) (4 h e 24 h, linha inferior de traços sobrepostos), mostrando que As permanece como
As(III), mas que existem modificações intracelulares da ligação As-S;
- A Figura 27 é uma série de imagens de fotomicrografia de células
K562 tratadas com PhAs(LHP) e controle em corte fino, coradas com azul de toluidina. (a) células K562 de controle (b) células K562 tratadas com PhAs(LHP)
(10 μM, 4 h) (c) células K562 tratadas com PhAs(LHP) (10 μM, 24 h), mostrando o estresse e a morte celular após tratamento com PhAs(LHP);
- A Figura 28 é uma série de imagens de fotomicrografia e mapas elementares de microssonda SR-XRF correlacionados para células K562 tratadas com PhAs(LHP) e de controle em corte fino, coradas com azul de toluidina. (a)
células K562 de controle (b) células K562 tratadas com PhAs(LHP) (10 μM, 4 h)
(c) células K562 tratadas com PhAs(LHP) (10 μM, 24 h). As condições operacionais incluem: energia do feixe = 11,9 keV; tamanho do feixe = 0,3 × 0,3 μm2; tamanho do passo = 0,3 μm; tempo de permanência = 2,5 s/pt; e dimensões de varredura (H × V) = (a) 20 × 21 μm 2; (b) 26 × 18 μm2; c) 23 × 21 μm2. Isso mostra a localização de As no núcleo celular após o tratamento com PhAs(LHP); - A Figura 29 mostra cortes finos corados com azul de toluidina de células K562 que foram expostas a PhAs(LHP) (10 pM, 24 h); (a) imagem de micrografia de luz Correlativo/ (b) a mapas de microssonda SR-XRF correspondentes de P, Zn e As e o mapa de colocalização dos três elementos.
Isso mostra a localização de As no núcleo celular após o tratamento com PhAs(LHP); - A Figura 30 é uma série de imagens de fotomicrografia de células KL-60 tratadas com PhAs(LHP) e controle em corte fino, coradas com azul de toluidina. (a) células HL-60 de controle (b) células HL-60 tratadas com PhAs(LHP) (10 μM, 4 h) (c) células HL-60 tratadas com PhAs(LHP) (10 μM, 24 h), mostrando o estresse e a morte celular após tratamento com PhAs(LHP); - A Figura 31 são imagens de fotomicrografia e mapas elementares de microssonda SR-XRF correlacionados para células HL-60 tratadas com PhAs(LHP) e de controle em corte fino, coradas com azul de toluidina. (a) células HL-60 de controle (b) células HL-60 tratadas com PhAs(LHP) (10 μM, 4 h) (c) células HL-60 tratadas com PhAs(LHP) (10 μM, 24 h). As condições operacionais incluem: energia do feixe = 11,9 keV; tamanho do feixe = 0,3 × 0,3 μm 2; tamanho do passo = 0,3 μm; tempo de permanência = 2,5 s/pt; e dimensões de varredura (H × V) = (a) 15 × 11 μm2; (b) 13 × 14 μm2; c) 16 × 14 μm2. Isso mostra aumento da captação de As entre 4-24 h de tratamento com acúmulo significativo no núcleo; - A Figura 32 é um corte fino corado com azul de toluidina de células HL-60 que foram expostas a PhAs(LHP) (10 pM, 24 h); (a) imagem de micrografia de luz Correlativo/ (b) a mapas de microssonda SR-XRF correspondentes de P, Zn e As e o mapa de colocalização dos três elementos. A imagem mostra o acúmulo significativo de As no núcleo após tratamento com PhAs (LHP);
- A Figura 33 é o espectro de massa ESI íon positivo (m/z 160-400)
dos NH2PhAs(III) sintetizados dissolvidos em água Milli-Q mostrando picos: m/z
184,0, [NH2-Ph-As=O + H]+; m/z 202,0, [NH2-Ph-As-(OH)2 + H]+; m/z 220,0, não identificado; m/z 259,0, [NH2-Ph-As-Cl2 + Na]+; m/z 279,1, [P(Ph)3O + H]+,
confirmando a produção de NH2PhAs(III);
- A Figura 34 é o espectro XANES obtidos na borda K do As de padrões sólidos e NH2PhAs(LHP) e NH2PhAs(III) sintetizados.
Os espectros incluem os dados adquiridos para arsenito, ácido p -arsanílico , PhAs(GS)2, PAO e
NH2PhAs(LHP), indicando que As in NH2PhAsLHP) é As(III) e provavelmente ligado a S;
- A Figura 35 é o espectro de massa ESI de íons positivos (m/z 240-
1500) dos produtos obtidos da reação do óxido de p-aminofenildicloroarsina/p-
aminofenilarsina sintetizado (3 mM) e LHP (1 mM) em água MilliQ a 37ºC depois de 16 horas, mostrando picos: m/z 259,1, [NH2-Ph-As-Cl2 + Na]+; m/z 407,2, [LHP
+ 3H]3+; m/z 462,4, [NH2-Ph-As(LHP) + 3H]3+; m/z 610,1, [LHP + 2H]2+; m/z 693,0,
[NH2-Ph-As(LHP) + 2H]2+, confirmando a produção de NH2PhAs(LHP);
- A Figura 36 é uma análise EXAFS (à esquerda) e Transformadas de Fourier (direita) correspondentes de NH2PhAs(LHP) mostrando dados experimentais (–––) e os dados calculados (-----) utilizando um ajuste de dispersão único (a primeira camada de coordenação). Isso confirma que As está ligado a 2S e 1C;
- A Figura 37 é o espectro de massa ESI íon positivo (m/z 160-600)
do ácido p-clorofenilarsônico sintetizado dissolvido em água Milli-Q mostrando picos: m/z 219,0, [OH-Ph-AsH2O3 + H]+; m/z 236,9, [Cl-Ph-AsH2O3 + H]+; m/z
141,0, contaminante; m/z 158,0, contaminante, confirmando a produção de Cl-Ph-
AsH2O3; - A Figura 38 são espectros XANES obtidos na borda K de padrões sólidos e ClPhAs(LHP) sintetizados (primeiro traço a subir para um pico na série de traços menores) e ClPhAs(V). Os padrões incluem: arsenito, ácido p-arsanílico (último traçado a subir na série de traços intermediários), PhAs(GS)2 e PAO. Isto indica que o As no Cl PhAs(LHP) é As(III) e está provavelmente ligado ao S; - A Figura 39 é o espectro de massa ESI de íon positivo (m/z 240- 1400) dos produtos obtidos a partir da reação de ClPhAs(V) (1 mM) com LHP (3 mM) em água MilliQ a 37ºC por 72 h mostrando picos: m/z 406,8, [LHP oxidado + 3H]3+; m/z 468,8, [Cl-Ph-As(LHP) + 3H]3+; m/z 609,5, [LHP oxidado + 2H]2+; m/z 702,5, [Cl-Ph-As(LHP) + 2H]2+, confirmando a produção de ClPhAs(LHP); - A Figura 40 é uma análise EXAFS (à esquerda) e Transformada de Fourier (direita) correspondente da primeira fração CIPhAs(LHP) obtida a partir da HPLC preparativa mostrando dados experimentais (–––) e calculados (-----) utilizando um ajuste de dispersão único (a primeira camada de coordenação). Isso confirma que As está ligado a 2S e 1C; - A Figura 41 é o espectro de massa ESI íon positivo (m/z 100-600) do ácido p-iodofenilarsônico sintetizado dissolvido em metanol. Os picos foram designados como: m/z 328,8, [I-Ph-AsH2O3 + H]+; m/z 141,0, contaminante; m/z 158,0, contaminante. Isso confirma a produção de IPhAsH2O3; - A Figura 42 são espectros XANES obtidos na borda K de padrões sólidos e IPhAs(LHP) sintetizados (primeiro traço a subir para um pico na série de traços menores) e lPhAs(V). Os padrões incluem: arsenito, ácido p-arsanílico (último na série de traços intermediários a ter o pico elevado), PhAs(GS)2 e PAO.
Isto indica que o As no lPhAs(LHP) é As(III) e está provavelmente ligado ao S; - A Figura 43 é o espectro de massa ESI de íon positivo (m/z 240- 1400) dos produtos obtidos a partir da reação de ácido p-iodofenilarsônico (1 mM) e LHP (3 mM) em água MilliQ a 37ºC após 72 h. Picos: m/z 406,8, [LHP oxidado + 3H]3+; m/z 499,3, [I-Ph-As(LHP) + 3H]3+; m/z 609,5, [LHP oxidado + 2H]2+; m/z 748,5, [I-Ph-As(LHP) + 2H]2+, confirmando a produção de IPhAs(LHP); e - A Figura 44 é uma análise EXAFS (à esquerda) e Transformada de
Fourier (direita) correspondente da primeira fração IPhAs(LHP) obtida a partir da HPLC preparativa mostrando dados experimentais (–––) e calculados (-----) utilizando um ajuste de dispersão único (a primeira camada de coordenação). Isso confirma que As está ligado a 2S e 1C.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[035] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na constatação de que um átomo de arsênio pode ser ligado de forma estável a um peptídeo de tropismo (homing) tumoral que tem ou foi modificado para apresentar, dois resíduos de cisteína, de um modo preferido um peptídeo de tropismo tumoral possuindo resíduos de cisteína nas extremidades N- e C-terminais, de modo que o peptídeo do tropismo tumoral ciclize para formar um agente anticâncer contendo arsênio altamente seletivo. Isso permite a seleção de um peptídeo de tropismo tumoral apropriado para o tratamento de um determinado câncer, pelo qual o agente subsequente fornece uma entrega mais direcionada de arsênio ao microambiente tumoral.
[036] Surpreendentemente, uma vez que o peptídeo de tropismo tumoral está ligado ao arsênio, o agente anticâncer contendo arsênio é bastante estável, de modo que pode ser formulado e entregue, de maneira altamente específica e seletiva, a um local do tumor. Ao mesmo tempo, o átomo de arsênio está biologicamente disponível para exercer seu efeito de dano nas células tumorais. Tal resultado não poderia ter sido previsto dado o tamanho do peptídeo de tropismo tumoral em relação ao arsênio ligado e também a força de ligação dos grupos tiol de cisteína ao arsênio. Isso fornece uma oportunidade de fornecer arsênio de maneira eficiente e eficaz dentro de um agente altamente seletivo para os tipos de câncer. Devido à capacidade de selecionar o peptídeo de tropismo tumoral, uma grande variedade de cânceres pode ser direcionada dessa maneira seletiva.
DEFINIÇÕES
[037] Com referência à terminologia usada de maneira genérica no presente documento, o termo “alquila” significa uma alquila de cadeia linear ou ramificada substituinte contendo, por exemplo, de 1 a cerca de 6 átomos de carbono, preferencialmente de 1 a cerca de 4 átomos de carbono, ainda mais preferencialmente de 1 para 2 átomos de carbono. Exemplos de tais substituintes considerados incluídos dentro desses intervalos incluem metila, etila, propila, isopropila, n-butila, sec-butila, isobutila, terc-butila, pentila, isoamila, hexila e similares. O número de carbonos referidos refere-se ao esqueleto de carbono e ramificação de carbono, mas não inclui átomos de carbono pertencentes a quaisquer substituintes, por exemplo, os átomos de carbono de um substituinte alcóxi ramificado da cadeia principal de carbono.
[038] O termo “alquenila”, conforme utilizado na presente invenção, significa um substituinte alquenila linear contendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono e, por exemplo, 2 a 6 átomos de carbono (alquenilas ramificadas são de 3 a 6 átomos de carbono), preferencialmente de 2 a 5 átomos de carbono (alquenilas ramificadas são de preferência de 3 a 5 átomos de carbono), mais preferencialmente de 2 a 4 átomos de carbono. Exemplos de tais substituintes considerados incluídos nestes intervalos incluem vinila, propenila, isopropenila, n- butila, sec-butila, isobutenila, terc-butila, pentenila, isopentenila, hexenila e similares.
[039] O termo “alquinila”, conforme utilizado na presente invenção, significa um substituinte alquinila linear contendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono e, por exemplo, de 2 a 6 átomos de carbono (alquinilas ramificadas são de 3 a 6 átomos de carbono), preferencialmente de 2 a 5 átomos de carbono (alquinilas ramificados são de preferência de 3 a 5 átomos de carbono), mais preferencialmente de 2 a 4 átomos de carbono. Exemplos de tais substituintes considerados incluídos dentro desses intervalos incluem etinila, propinila, isopropinila, n-butinila, sec-butinila, isobutinila, terc-butinila, pentinila,
isopentinila, hexinila e semelhantes.
[040] O termo “cicloalquila” refere-se a grupos de carbono tricíclicos, bicíclicos ou monocíclicos, saturados, opcionalmente substituídos. Quando apropriado, o grupo cicloalquila pode ter um número especificado de átomos de carbono, por exemplo, cicloalquila C3 -C6 é um grupo carbocíclico com 3, 4, 5 ou 6 átomos de carbono. Exemplos não limitantes podem incluir ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila e similares.
[041] O termo “arila” refere-se a um substituinte carbocíclico aromático não substituído ou substituído, como comumente entendido na técnica.
Entende-se que o termo arila se aplica a substituintes cíclicos que são planares e compreendem 4n+2π elétrons, de acordo com a Regra de Hückel. O grupo fenila, que pode ser substituída ou não substituída, é um grupo arila preferido como o grupo estabilizador ligado ao átomo de arsênio.
[042] “Heterocíclico” ou “heterociclo” refere-se a um anel aromático ou não aromático, de preferência com 5 a 7 átomos no anel e destes, os átomos 1 a 4 são heteroátomos, sendo o referido anel isolado ou fundido com um segundo anel, em que os referidos heteroátomos são selecionados independentemente a partir de O, N e S. Heterocíclico inclui grupos heterocíclicos parcial e totalmente saturados. Os sistemas heterocíclicos podem ser ligados a outra porção por qualquer número de átomos de carbono ou heteroátomos do radical e podem ser saturados e insaturados. Os anéis hererocíclicos incluem heterociclos de nitrogênio. Exemplos não limitantes de heterocíclicos incluem indolina, pirrolidinila, pirrolinila, piranila, piperidinila, piperazinila, morfolinila, tetra-hidrofuranila, tetra- hidrotiofenila, pirazolinila, ditiolila, oxatiolila, dioxanila, dioxinila, oxazinila, tolazinila, diazepinila, diapina e similares.
[043] Em qualquer um dos exemplos de realização descritos, o termo “substituído” (tal como é referido no presente com ‘substituído ou não substituído’) ou “opcionalmente substituído” e construções gramaticais semelhantes podem referir-se a substituição do referido radical por um grupo selecionado a partir do grupo que consiste de alquila C1-C6, arila (incluindo fenila que pode a própria fenila substituída com metila, etila, propila, halo, nitro, alcóxi- C1-C6, e glutatila), cicloalquila, carboxila, glutatila, halo, nitro e haloalquila. Cada um desses grupos pode ser substituído pelo mesmo grupo ou por grupos diferentes.
[044] O termo “peptídeo de tropismo tumoral”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a peptídeos relativamente curtos que têm a capacidade de reconhecer e se ligar, e/ou opcionalmente ser captado em células ou tecidos tumorais, vasos sanguíneos de tumores, vasos linfáticos e outros microambientes associados a tumores. Eles também podem ser referidos na técnica como “peptídeos internalizantes específicos de tumores”, “peptídeos de homing tumoral” e “peptídeos penetrantes em tumores”. A natureza do peptídeo de tropismo tumoral não é especialmente limitada, embora tais peptídeos devam apresentar pelo menos dois resíduos de cisteína que sejam capazes de se ligar a um átomo de arsênio ou que possam ser adaptados para apresentar dois desses resíduos de cisteína. Uma grande variedade de tais peptídeos está disponível comercialmente e pode, de fato, ser feita sob encomenda.
[045] Tal como é geralmente utilizado na presente invenção, os termos “administrando” ou “administração” e similares, descrevem a introdução do agente ou composição anticâncer a um mamífero, tal como por uma via ou veículo específico. As vias de administração podem incluir vias de administração tópica, parenteral e enteral, que incluem vias de administração oral, bucal, sublingual, nasal, anal, gastrointestinal, subcutânea, intravenosa, intramuscular e intradérmica, embora sem se limitar a estes.
[046] O termo “tratar” ou “tratamento” significa a administração do agente ou composição anticâncer a um sujeito para pelo menos melhorar, reduzir ou suprimir sinais ou sintomas existentes da doença, distúrbio ou condição, como um câncer, experimentado pelo sujeito.
[047] Conforme utilizado na presente invenção, “quantidade eficaz” refere-se à administração de uma quantidade do agente ou composição anticâncer relevante suficiente para impedir a ocorrência de sintomas da condição sendo tratada, ou para interromper o agravamento dos sintomas ou para tratar e aliviar ou pelo menos reduzir a gravidade dos sintomas. A quantidade eficaz variará de uma maneira que seria entendida por um especialista na técnica com idade, sexo, peso do paciente, etc. Uma dosagem ou regime de dosagem apropriado pode ser determinado através de um teste de rotina.
AGENTE ANTICÂNCER
[048] Em uma forma, é fornecido um agente anticâncer compreendendo um peptídeo de tropismo tumoral ciclizado possuindo um átomo de arsênio ligado a dois resíduos de cisteína.
[049] Adequadamente, o átomo de arsênio ligado aos dois resíduos de cisteína permite que o peptídeo de tropismo tumoral seja cíclico. Ou seja, o arsênio é ligado a um enxofre de cada cisteína, formando assim uma estrutura peptídica cíclica com uma ponte de arsênio. Acredita-se que a interação do arsênio com o ditiol (um tiol de cada cisteína) resulte em um agente anticâncer mais estável do que pode ser alcançado com a ligação monotiol-arsênio.
[050] As espécies de peptídeo-arsênio de ocorrência natural mostraram-se difíceis de isolar e purificar devido à instabilidade desses complexos durante os processos típicos de purificação e caracterização. Isso limitou bastante o uso terapêutico de complexos de arsênio-peptídeo. Os presentes agentes anticâncer, portanto, fornecem vantagens significativas na medida em que podem ser purificados, caracterizados e armazenados, mantendo a eficácia.
[051] Em um exemplo de realização, os dois resíduos de cisteína ligados ao arsênio do peptídeo de tropismo tumoral são separados, um do outro, por menos de 20 resíduos de aminoácidos.
[052] Em determinados exemplos de realização, os dois resíduos de cisteína ligados ao arsênio do peptídeo de tropismo tumoral são separados por menos de 18 resíduos de aminoácidos, ou menos de 16 resíduos de aminoácidos, ou menos de 15 resíduos de aminoácidos ou menos de 14 resíduos de aminoácidos. Qualquer um desses valores superiores pode ser acoplado a uma faixa de extremidade inferior de um ou dois resíduos de aminoácidos.
[053] Verificou-se que o número de aminoácidos entre os resíduos de cisteína é importante para prever se o peptídeo irá ou não ciclizar e formar a ponte (ligação) de arsênio. Intervalos preferidos de resíduos de aminoácidos entre as cisteínas que se ligam ao arsênio podem ser selecionados entre 2 a 15 resíduos, 3 a 15 resíduos, 4 a 15 resíduos, 5 a 15 resíduos, 2 a 14 resíduos, 3 a 14 resíduos, 4 a 14 resíduos e 5 a 14 resíduos.
[054] Em exemplos de realização, antes da ciclização, os dois resíduos de cisteína que se ligam ao átomo de arsênio são os respectivos resíduos de peptídeo N-terminal e C-terminal do peptídeo de tropismo tumoral. É preferido que cada aminoácido terminal do peptídeo de tropismo tumoral seja uma cisteína, pois isso melhora a ciclização e promove a ponte de arsênio entre os respectivos tióis de cisteína. A formação do peptídeo ciclizado é uma etapa crítica, pois, na maioria dos casos, é a conformação ciclizada do peptídeo que é reconhecida pelo receptor relevante.
[055] A cisteína N-terminal pode compreender um grupo de capeamento (capping) ligado ao seu nitrogênio amino-terminal livre. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria específica, acredita-se que o grupo de capeamento atue essencialmente para impedir a ciclização e/ou polimerização do peptídeo de tropismo tumoral antes da inserção do átomo de arsênio ou pelo menos limite a associação dos resíduos N- e C-terminais para melhor promover a ligação do arsênio. O grupo de capeamento pode, portanto, ser importante para captação e ligação eficientes do arsênio. O grupo de capeamento pode ser formado a partir de qualquer composto de capeamento N-terminal capaz de reagir com o nitrogênio amino e formar um grupo de capeamento relativamente não reativo/estável.
[100] Portanto, em um exemplo de realização, o grupo de capeamento é um grupo amino reativo. Qualquer composto que apresenta um ácido carboxílico para reação com o grupo amino cisteína pode ser adequado. É preferido que tal composto que apresente um ácido carboxílico também possua uma porção não reativa. Em exemplos de realização preferidos, o grupo de capeamento é um grupo alcanoila, tal como um grupo alcanoíla C2-C6, o qual pode ser opcionalmente substituído. Exemplos específicos de agentes de capeamento apropriados de várias classes podem incluir acetila, ácido piroglutâmico, indóis, benzimidazóis, benzimidazolonas, Fmoc e similares. Grupos de capeamento inertes menores são preferidos e, portanto, em um exemplo de realização preferido, o grupo de capeamento é um grupo acetila. Será reconhecido pelo especialista na técnica que tais grupos de capeamento (capping) N-terminais são conhecidos no estado da técnica, assim como os meios de colocá-los na posição desejada no peptídeo de tropismo tumoral.
[101] Em um exemplo de realização, o agente anticâncer compreende ainda um grupo estabilizador ligado ao átomo de arsênio. O grupo estabilizador já estará tipicamente ligado ao átomo de arsênio no composto de arsênio que é usado para contatar o peptídeo de tropismo tumoral. Verificou-se que a escolha do grupo estabilizador pode ter um significante efeito positivo sobre a estabilidade do agente anticâncer e, portanto, sua eficácia contínua nos métodos de tratamento.
[102] Adequadamente, o grupo estabilizador é selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxila, alquila C1 a C6, alquenila C2 a C6, alquinila C2 a C6, alcóxi C1 a C6, arila, cicloalquila, heterociclo e peptídeos de cadeia curta, incluindo glutatiíla, em que cada dos grupos pode ser substituído ou não substituído.
[103] Em um exemplo de realização, o grupo de estabilização é selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxila, alquila C1 a C4, alquenila C2 a C4, alcoxi C1 a C4, arila C5 ou C6, cicloalquila C5 ou C6, heteroclico C5 ou C6, e glutatiíla, em que cada um deles pode ser substituído ou não substituído.
[104] Em determinados exemplos de realização, o grupo estabilizador é selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxila, metila, etila, propila, isopropila, n-butila, sec-butila, isobutila, terc-butila e fenila, substituído ou não substituído.
[105] Quando o grupo estabilizador é substituído por fenila, então a substituição pode ser com hidroxila, alquila-C1 a C4, C1 a C4 alcoxi, glutathiyl, arginina, lisina, halo, C1 a C4 de halo alquilo, nitro, amino, secundário ou amina terciária, amido, éter e éster.
[106] As substituições preferidas incluem amino (isto é, NH2), hidroxila, metóxi, etóxi, flúor, cloro e iodo.
[107] A substituição no grupo fenila pode ser orto, meta ou para até o ponto de ligação do átomo de arsênio. Preferencialmente a substituição é uma única substituição para o átomo de arsênio.
[108] Em exemplos de realização, o peptídeo de tropismo tumoral compreende pelo menos um resíduo de arginina e/ou lisina. A arginina e a lisina podem ser preferidas, pois esses aminoácidos carregados positivamente podem interagir com as proteínas da superfície celular carregadas negativamente para melhorar a internalização do peptídeo de tropismo tumoral.
[109] Alguns dos agentes anticâncer do primeiro aspecto podem conter centros quirais, que podem ser de configuração (R) ou (S) ou, quando utilizado, podem ser administrados como uma mistura dos mesmos. Consequentemente, a presente invenção também inclui estereoisômeros dos agentes descritos na presente invenção, quando aplicável, individualmente ou misturados em qualquer proporção. Esses estereoisômeros podem ser separados usando técnicas convencionais, tal como descrito nos exemplos, tal como por HPLC.
[110] De modo específico, o átomo de arsênio pode ser um centro quiral e o peptídeo cíclico a ele ligado pode resultar na formação de isômeros R e S. As estruturas contidas na presente invenção são consideradas com abrangendo explicitamente os isômeros R e S. Verificou-se que os enantiômeros podem se formar de maneira espontaneamente durante a síntese e podem ser utilizados como uma mistura racêmica. Entretanto, ficará evidente que em alguns exemplos de realização pode ser desejável separar e usar a forma enantiomericamente pura ou pelo menos enriquecer uma composição com um determinado isômero.
[111] Em um exemplo de realização, o agente anticâncer tem uma estrutura como mostrado na fórmula I: Fórmula I em que, os átomos de enxofre mostrados, aos quais o arsênio está ligado, são tiol enxofres dos respectivos resíduos de cisteína; os resíduos de cisteína na Fórmula I são separados por menos de 20 resíduos de aminoácidos representados pela linha curva; e R é um grupo estabilizador compreendendo frações selecionadas a partir do grupo que consiste em hidroxila, alquila C1 a C6, alquenila C2 a C6, alquinila C2 a C6, alcóxi C1 a C6, arila, cicloalquila, heterociclo e peptídeos de cadeia curta, incluindo glutatiíla, em que cada dos grupos pode ser substituído ou não substituído.
[112] O grupo estabilizador, ‘R’, pode compreender ou ser selecionado dentre os grupos estabilizadores descritos anteriormente.
[113] Os peptídeos de cadeia curta apropriados para 'R' podem ser ou compreender aqueles que possuem entre quatro a vinte, preferencialmente, entre quatro a dezesseis ou quatro a dez resíduos de aminoácidos.
[114] A cadeia de aminoácidos que une os dois resíduos de cisteína pode ser tal como descrito anteriormente em termos de comprimento de resíduos de aminoácidos. A cisteína N-terminal também pode ter um grupo de capeamento como descrito anteriormente.
[115] Portanto, em um exemplo de realização, o agente anticâncer de Fórmula I pode ter uma estrutura como mostrado na fórmula II: Fórmula II em que os vários átomos e grupos são como descritos para a Fórmula I; o grupo de capeamento é formado a partir de um composto amino- reativo; e W tem entre 2 a 20 resíduos de aminoácidos.
[116] Será compreendido que o grupo ‘-NH’ entre o grupo de capeamento e o resíduo de cisteína pode ser o -NH que faz parte do próprio resíduo de cisteína. Ou seja, o NH pode ser o radical -NH2 padrão de cisteína ao qual o grupo de capeamento se ligou para formar ‘-NH-Grupo de capeamento’.
[117] O número de resíduos de aminoácidos representados por ‘W’ pode ser selecionado a partir de qualquer um desses valores discutidos anteriormente, incluindo menos de 18 resíduos de aminoácidos ou menos de 16 resíduos de aminoácidos ou menos de 15 resíduos de aminoácidos ou menos de 14 resíduos de aminoácidos. Qualquer um desses valores superiores pode ser acoplado a uma faixa de extremidade inferior de dois resíduos de aminoácidos.
[118] Será compreendido que, embora as estruturas de fórmula I e II possam ser preferidas, elas não são as únicas estruturas consideradas apropriadas para uso na presente invenção. De modo particular, não é necessário que o peptídeo possua resíduos terminais de cisteína, mas apenas que dois desses aminoácidos estejam presentes e que sejam separados por um número suficiente de resíduos para permitir a ciclização com o átomo de arsênio.
[119] Em um exemplo de realização, o peptídeo de tropismo tumoral ao qual o átomo de arsênio está ligado entre dois resíduos de cisteína para formar uma ponte, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em:
1. CAYHRLRRC;
2. CDCRGDCFC;
3. CPIEDRPMC;
4. CNRRTKAGC;
5. CGTKRKC;
6. CRGDGWC;
7. CVSNPRWKC;
8. CHVLWSTRC;
9. CLDGGRPKC;
10. GCSVSSVGALCTHV;
11. CRGDGWC;
12. CDCRGDCFC;
13. CVNHPAFAC;
14. CRGDRGPDC;
15. CRGDKTTNC;
16. CRGDHAGDC;
17. CLSYYPSYC;
18. CTPSPPFSHC;
19. CPHSKPCLC;
20. CSDSWHYWC;
21. CSDWQHPWC;
22. CSDYNHHWC;
23. CSDGQHYWC;
24. CYDSWHYWC;
25. CFDGNHIWC;
26. CTDFPRSFC;
27. CTQDRQHPC;
28. CLSRYLDQC;
29. CRGDCF;
30. CGNSNPKSC; e
31. CPHNLTKLC.
em que o átomo de arsênio, quando no agente anticâncer formado do primeiro aspecto, será ligado e formará uma ponte entre dois dos resíduos de cisteína das sequências peptídicas acima. Um ou ambos os resíduos de cisteína podem ser, mas não são necessariamente, um resíduo terminal.
[120] Coletivamente, esses peptídeos de tropismo tumoral podem ter como alvo uma seleção de cânceres, incluindo, entre outros, os seguintes tipos: leucemia/linfomas, câncer de cólon, câncer de esôfago e gastroesofágico, carcinoma de células escamosas, melanoma, tumores de ilhotas pancreáticas, carcinoma de mama, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer colorretal, retinoblastoma, metástase tumoral, câncer hepático, câncer pancreático, câncer cerebral, mesotelioma, melanoma, câncer de ovário e câncer gástrico.
[121] Será compreendido que outros de tais peptídeos de tropismo tumoral encontram-se comercialmente disponíveis para alvos de câncer alternativos e muitas vezes podem ser desenvolvidos “sob demanda” para um determinado alvo. A este respeito, o componente peptídico de tropismo tumoral do agente anticâncer não é particularmente limitado e será escolhido dentre peptídeos conhecidos com base no câncer desejado a ser alvejado.
[122] Em um exemplo de realização preferido, o peptídeo de tropismo tumoral ao qual o átomo de arsênio será ligado para formar uma ponte é CAYHRLRRC (Motivo: CAY); CDCRGDCFC (motivo: RGD) ou CPIEDRPMC.
Esses peptídeos são úteis para alvejar células de leucemia e linfoma, vasculatura angiogênica e câncer de cólon, respectivamente, e podem, portanto, ser ciclizados com um átomo de arsênio, como descrito anteriormente, para formar agentes anticâncer eficazes contra esses alvos.
[123] Em um exemplo de realização, o arsênio do agente anticâncer é um átomo de arsênio (III).
[124] Em um exemplo de realização particularmente preferido, o agente anticâncer do primeiro aspecto tem a estrutura abaixo: em que R é um grupo estabilizador selecionado entre hidroxila, metila e fenila substituído ou não substituído.
[125] Na Seção experimental a seguir, as referências a HyAs (LHP), MeAs(LHP) e PhAs(LHP) são referências à estrutura acima em que R é hidroxila, metila e fenila não substituído, respectivamente.
[126] De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um agente anticâncer do primeiro aspecto e um veículo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[127] Adequadamente, o veículo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser ou incluir um ou mais de diluentes, solventes, tampões de pH, ligantes, cargas, emulsificantes, desintegrantes, polímeros, lubrificantes, óleos, gorduras, ceras, revestimentos, agentes modificadores da viscosidade, deslizantes e similares.
[128] Os diluentes podem incluir um ou mais componentes dentre celulose microcristalina, lactose, manitol, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio, caulino, amido seco, açúcar em pó e similares. Os aglutinantes/ligantes podem incluir um ou mais dentre povidona, amido, ácido esteárico, gomas, hidroxipropilmetil celulose e similares. Os desintegrantes podem incluir um ou mais dentre amido, croscarmelose sódica, crospovidona, glicolato de amido sódico e semelhantes. Os solventes podem incluir um ou mais etanol, metanol, isopropanol, clorofórmio, acetona, metiletilcetona, cloreto de metileno, água, soluções salinas e similares. Os lubrificantes podem incluir um ou mais dentre estearato de magnésio, estearato de zinco, estearato de cálcio, ácido esteárico, estearilfumarato de sódio, óleo vegetal hidrogenado, behenato de glicerila e similares. Um deslizante pode ser um ou mais componentes dentre dióxido de silício coloidal, talco ou amido de milho e similares. Os tampões podem incluir tampões de fosfato, tampões de borato e tampões de carbonato, embora não estão limitados aos mesmos. As cargas podem incluir um ou mais componentes dentre géis, inclusive gelatina, amido e géis de polímeros sintéticos, embora sem limitações. Os revestimentos podem compreender um ou mais dentre formadores de película, solventes, plastificantes e similares. Os formadores de película adequados podem ser um ou mais dentre hidroxipropilmetilcelulose, metil- hidroxietil celulose, etil celulose, hidroxipropil celulose, povidona, carboximetil celulose sódica, polietileno glicol, acrilatos e similares. Os solventes adequados podem ser um ou mais dentre água, etanol, metanol, isopropanol, clorofórmio, acetona, metiletilcetona, cloreto de metileno e similares. Os plastificantes podem ser um ou mais dentre propileno glicol, óleo de mamona, glicerina, polietileno glicol, polissorbatos e semelhantes.
[129] É feita referência ao Handbook of Excipients 6ª Edição, Eds.
Rowe, Sheskey & Quinn (Pharmaceutical Press), que fornece exemplos não limitantes de excipientes que podem ser úteis de acordo com a invenção.
[130] Será compreendido que a escolha de veículos, diluentes e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis dependerá, pelo menos em parte, do modo de administração da formulação. Apenas a título de exemplo, a composição pode estar na forma de uma solução para administração I.V., um líquido injetável, um supositório, uma formulação de liberação lenta, uma formulação de bomba osmótica ou qualquer outra forma que seja eficaz e segura para administração.
Uma solução salina para administração IV é particularmente preferida devido a um perfil de solubilidade vantajoso.
[131] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento de um câncer em um paciente, incluindo a etapa de administração de um agente anticâncer do primeiro aspecto ou a composição farmacêutica do segundo aspecto ao paciente, para, desse modo, tratar o câncer.
[132] Um quarto aspecto da invenção reside em um agente anticâncer do primeiro aspecto para uso no tratamento de um câncer em um paciente.
[133] Um quinto aspecto da invenção reside no uso de um agente anticâncer do primeiro aspecto na fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer.
[134] Em relação aos aspectos do terceiro ao quinto aspecto, em um exemplo de realização, o câncer pode ser uma neoplasia hematológica ou um tumor sólido.
[135] Em um exemplo de realização adicional, o câncer é selecionado a partir de leucemia, mieloma múltiplo e linfoma.
[136] O câncer pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, melanoma, tumores de revestimento epitelial de glândulas ou ductos, adenocarcinoma, carcinoma papilar, tumores de adenocarcinoma papilar hepático e do trato biliar, tumores de carcinoma hepatocelular e do trato gastrointestinal, carcinoma de células escamosas do esôfago, adenocarcinoma de esôfago, carcinoma colorretal (câncer de cólon), carcinoma gástrico (câncer de estômago) tumores do trato respiratório, carcinoma broncogênico, carcinoma de células pequenas, tumores de carcinoma de grandes células do trato urogenital, carcinoma de células de transição da bexiga, carcinoma de células escamosas da bexiga, carcinoma de próstata, carcinoma do colo uterino, de células do sangue e células relacionadas (leucemias), leucemia linfocítica aguda e crônica, policitemia vera, cânceres do tecido linfoide, linfomas malignos, incluindo linfoma de Hodgkin e linfoma não- Hodgkin, linfoma folicular, linfoma difuso, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico, mieloma múltiplo, Tumores de tecido conjuntivo, cânceres de osteossarcoma ósseo, tumores do sistema nervoso, neuroblastoma, retinoblastoma, glioblastoma, tumores de oligodendroglioma associados com vírus oncogênicos, Linfoma de Burkitts, linfoma de células b em indivíduos imunocomprometidos, carcinoma nasofaríngeo, câncer de esôfago e gastroesofágico, câncer de células escamosas epidermais, tumores de ilhotas pancreáticas, carcinoma de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer colorretal, retinoblastoma, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer cerebral,
mesotelioma e carcinoma hepatocelular causado pelo vírus da hepatite B.
[137] Quando o câncer é leucemia, pode ser uma forma selecionada a partir do grupo que consiste de leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia de células B linfoblástica aguda, leucemia de células T linfoblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda (AML), leucemia promielocítica aguda (APL), leucemia monoblástica aguda, leucemia eritroleucêmica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia indiferenciada aguda, leucemia mielocítica crônica e leucemia linfocítica crônica.
[138] De preferência, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia mieloide crônica, linfoma de células T, síndrome mielodisplásica, câncer de cólon, câncer de pâncreas, câncer de cérebro, mesotelioma, leucemia promielocítica aguda (APL) e leucemia mieloide aguda (AML).
[139] O tratamento da leucemia mieloide aguda pode, em exemplos de realização, ser altamente preferido, pois este é um câncer que é conhecido por ser de difícil tratamento. Os resultados aqui fornecidos, particularmente em relação às células Kasumi-1, indicam que o agente anticâncer do primeiro aspecto pode ser altamente eficaz contra a AML.
[140] Quando o câncer é um tumor sólido ele pode ser um ou mais tumor de um câncer do trato digestivo, esôfago, fígado, estômago, cólon, pele, cérebro, osso, mama, pulmão, mesotélio e tecidos moles, incluindo, mas não se limitando a diversos sarcomas e câncer de próstata.
[141] Em um exemplo de realização, o câncer pode ser qualquer câncer atualmente indicado para tratamento por soluções de trióxido de arsênio disponíveis clinicamente ou contra as quais as soluções de trióxido de arsênio demonstraram eficácia. Em um exemplo de realização, o linfoma, leucemia ou tumor sólido no paciente é refratário aos métodos padrão de tratamento ou é um caso de leucemia recorrente.
[142] O agente anticâncer pode ser usado sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos conhecidos, como, por exemplo, imunoterapêuticos, anticorpos monoclonais, quimioterápicos, radioprotetores e radioterapêuticos. Particularmente, a entrega do agente anticâncer pode ocorrer antes, durante ou após a administração de uma ou mais agentes antitumorais conhecidos, incluindo, mas não se limitando a; agentes de hipometilação, PD-1, inibidores de DP-L1, compostos de mostarda, mostardas nitrogenadas, clorambucila, melfalano, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracila, floxuridina, metotrexato, vincristina, vinblastina, taxol, etoposídeo, temiposídeo, dactinomicina, mitocondrina, dounorubicina, doxorubicina, dounx, carboplatina, fosfato de estramustina, hidroxiureia, BCNU, procarbazina, VM-26, interferons e ácido retinoico todo-trans (ATRA) ou outros retinoides. Agentes hipometilantes adequados podem incluir decitabina, guancitabina, azacitidina e similares. Exemplos adequados de inibidores de PD-1 incluem pembrolizumabe e nivolumabe, enquanto inibidores apropriados de PD-L1 incluem atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe.
[143] A dose terapêutica e da frequência da administração do agente anticâncer no tratamento de vários cânceres irá depender da natureza do câncer, da severidade da condição, bem como a idade, peso corporal, condição e resposta do paciente individual. É importante ressaltar que essa dosagem pode ser convenientemente decidida com base em processos padrão e seguindo as diretrizes dos atuais regimes de dosagem para administração de trióxido de arsênio. Devido à eficiência da administração, pode ser que os níveis de dosagem usando o atual agente anticâncer sejam um pouco menores do que os regimes atuais de administração de trióxido de arsênio, mas tais regimes continuam sendo um guia útil e a dosagem final pode ser ajustada com base em modelos de teste padrão.
[144] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “sujeito”
ou “indivíduo” ou “paciente” podem se referir a qualquer sujeito, particularmente um sujeito vertebrado, e ainda mais particularmente a um sujeito mamífero, para quem a terapia de arsênio é desejada. Os animais vertebrados adequados incluem, mas não estão restritos a, primatas, aves, animais de criação (por exemplo, ovelhas, vacas, cavalos, burros, porcos), animais de teste em laboratório (por exemplo, coelhos, camundongos, ratos, porquinhos-da-índia, hamsters), animais de companhia (por exemplo, gatos, cães) e animais selvagens em cativeiro (por exemplo, raposas, veados, dingos). Um paciente preferido é um ser humano que necessita de terapia com arsênio para tratar um câncer. No entanto, será entendido que os termos mencionados acima não implicam que os sintomas estejam necessariamente presentes.
[145] De acordo com um sexto aspecto da invenção, é fornecido um processo para a produção de um agente anticâncer, incluindo as etapas de: - colocar um peptídeo de tropismo tumoral compreendendo dois resíduos de cisteína em contato com um composto de arsênio; - permitir que o arsênio se ligue a cada um dos dois resíduos de cisteína para formar um peptídeo de tropismo tumoral ciclizado compreendendo um átomo de arsênio ligado; e - para, desse modo, produzir o agente anticâncer.
[146] O agente anticâncer e o composto de arsênio podem ser como descrito para qualquer exemplo de realização do primeiro aspecto.
[147] O composto de arsênio pode ser um óxido de arsênio ou um haleto de arsênio. Um exemplo não limitante de um óxido de arsênio adequado é o óxido de fenilarsina.
[148] Em um exemplo de realização, o composto de arsênio pode compreender um grupo alquila, hidroxila ou arila ligado ao arsênio.
[149] Em um exemplo de realização, o processo pode compreender a etapa (a)(i) de modificação de um peptídeo de tropismo tumoral selecionado para apresentar dois resíduos de cisteína. Isso pode ser útil quando o peptídeo de tropismo tumoral desejado ainda não exibe dois resíduos de cisteína apropriados.
A presente invenção não se limita apenas aos peptídeos de tropismo tumoral que compreendem naturalmente resíduos de cisteína. Os resíduos de cisteína podem ser ligados ao peptídeo de tropismo tumoral por qualquer um de uma série de métodos químicos que são bem conhecidos no estado da técnica. São estes dois resíduos de cisteína adicionados que são subsequentemente ligados ao arsênio na etapa (b) do processo.
[150] A etapa de modificação do peptídeo de tropismo tumoral para apresentar dois resíduos de cisteína pode ser uma modificação de modo que o peptídeo de tropismo tumoral apresente um resíduo de cisteína N- e C-terminal.
[151] O processo também pode incluir, antes da etapa de contato do peptídeo de tropismo tumoral com o composto de arsênio, a etapa de reação de um composto de capeamento com o grupo amino livre do resíduo de cisteína N- terminal do peptídeo de tropismo tumoral para formar um grupo de capeamento ligado ao nitrogênio do referido grupo amino.
[152] Um sétimo aspecto da invenção reside em um agente anticâncer produzido pelo processo do sexto aspecto.
[153] Um oitavo aspecto da invenção reside em um método de entrega de uma quantidade terapeuticamente eficaz de arsênio para um paciente incluindo a etapa de administrar ao paciente uma quantidade apropriada do agente anticâncer do primeiro aspecto, ou a composição farmacêutica do segundo aspecto, para, desse modo, entregar a quantidade terapeuticamente eficaz de arsênio.
[154] O método do oitavo aspecto pode ser realizado de acordo com, e incluindo, qualquer um dos exemplos de realização descritos para o primeiro ao quinto aspectos.
[155] Um nono aspecto da invenção reside em um método de diagnóstico de um câncer, incluindo as etapas de: - administrar um agente anticâncer do primeiro aspecto compreendendo pelo menos um átomo radioativamente marcado a um paciente; - permitir que o agente anticâncer se localize no câncer; - detectar a presença de pelo menos um átomo radiomarcado do agente anticâncer; e - para, desse modo, diagnosticar o câncer.
[156] Espera-se que um número de átomos ou grupos radiomarcados esteja disponível para uso como marcador no método do nono aspecto. De modo preferido, o átomo ou grupo radiomarcado será ou fará parte do grupo estabilizador.
[157] Em um exemplo de realização preferido, o grupo estabilizador será uma fenila substituída e o átomo ou grupo marcado de maneira radioativa será substituído no anel fenila. Um átomo ou grupo radiomarcado preferido pode ser um átomo de flúor radiomarcado apresentado no anel fenila do grupo estabilizador. O flúor pode ser orto, meta ou para na ligação do anel fenila ao arsênio, mas é preferencialmente para. O isótopo de flúor empregado pode ser qualquer um conhecido para uso em imagiologia ou detecção médica, mas será preferencialmente o F18. A Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único (SPECT) ou Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET) ou outros métodos bem conhecidos no estado da técnica podem ser usados para a etapa de detecção.
[158] A etapa de permitir que o agente anticâncer se localize no câncer pode ser uma etapa que permite que o agente anticâncer se ligue ao câncer ou se agregue dentro ou adjacente às células de câncer.
[159] Será compreendido, portanto, que a referência, no nono aspecto para o uso de um agente anticâncer do primeiro aspecto inclui todos tais agentes descritos para o primeiro aspecto, e inclui aqueles dentro do escopo da Fórmula I, mas com a modificação de que pelo menos um desses átomos ou grupos existentes está radiomarcado.
[160] A seção experimental a seguir descreve com mais detalhes a caracterização de alguns dos compostos da invenção e eficácia dos mesmos. A intenção é ilustrar alguns exemplos de realização específicos dos compostos da invenção e a eficácia dos mesmos sem, de forma alguma, limitar o escopo da invenção.
EXPERIMENTAL PREPARAÇÃO DE COMPLEXOS ARSÊNIO-PEPTÍDEO (AS(LHP)) MATERIAIS
[161] Os reagentes disponíveis comercialmente eram de grau analítico ou de pureza superior, conforme especificado. meta-arsenito de sódio (NaASO2, ≥ 99%), trietilamina ((C2H5)3N, ≥ 99%), fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4, ≥ 99%), di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado (NaH2PO4.2H2O, ≥ 99%), e óxido de fenilarsina (PAO, C6H5AsO, ≥ 97%) e a base Trizma® (≥ 99,9%, Tris) foram obtidos a partir de Sigma Aldrich (EUA). O tri-iodeto de arsênio(III) (AsI3, ≥ 98%) foi obtido da Strem Chemicals (EUA), o ácido mono metilssarsônico (MMA(V), CH5AsO3, > 97%) foi obtido da Wako Pure Chemical Industries (Japão) e o ácido fórmico (99%), ácido clorídrico (HCl, 32%) e hidróxido de sódio (NaOH,> 97%) da Ajax Finechem. Os peptídeos pré-acetiladoa AcCAYHRLRRC, e AcCARHRYLRC (> 98%) e CAYHRRLRC (> 98%) foram sintetizados pela Peptide
2.0 (EUA). AcCAYHRLRRC (peptídeo de tropismo de leucemia) será referido aqui como LHP e AcCARHRYLRC (peptídeo embaralhado) será aqui referido como sLHP. Utilizou-se água Milli-Q (18,2 Ω, Millipore) para todas as diluições (a menos que especificado de outra forma) e para preparar soluções de NaOH, tampão fosfato e tampão Tris.HCl.
MÉTODOS MEDIÇÃO DE PH
[162] Quando mencionado, o pH foi medido e/ou confirmado utilizando o kit Mettler Toledo Seven compact S220-Micro após a calibração com padrões técnicos da Mettler Toledo (4,0, 7,0, e 9,2).
PREPARAÇÃO DE TAMPÕES
[163] Os tampões de fosfato (pH 7 ou pH 8, 0,1 M, 100 mL) foram preparados usando os volumes apropriados da solução estoque A (NaH2PO4.2H2O, 0,2 M) e solução estoque B (Na2HPO4, 0,2 M) listado na Tabela
1. O pH foi determinado, como descrito anteriormente, e ajustado pela adição gota a gota da Solução A ou Solução B, conforme necessário, antes da diluição para 100 mL com água Milli-Q (concentração final 0,1 M).
TABELA 1
COMBINAÇÕES DE SOLUÇÕES ESTOQUE PARA TAMPÕES FOSFATO EM PH
ESPECÍFICO pH, 25ºC mL de Solução A mL de Solução B 7,0 19,50 30,50 8,0 2,65 47,35
[164] O tampão Tris-HCl (pH 9) foi preparado adicionando aproximadamente 5 mL de HCl (0,2 M) a 50 mL de Tris (0,2 M) enquanto o pH era monitorado, depois diluindo com água Milli-Q a 100 mL (concentração final 0,2 M).
ESPECTROMETRIA DE MASSA DE IONIZAÇÃO POR ELETROPULVERIZAÇÃO (ESI-MS)
[165] Análise ESI-MS da formação do complexo As-LHPESI-MS foi utilizado para detectar a ligação de espécies As ao LHP, a fim de otimizar as condições de complexação. O peptídeo, CAYHRLRRC, foi adquirido com a extremidade N-terminal acetilada e em uma conformação linear para permitir que os dois grupos Cys tiol se coordenassem com o As. As reações foram realizadas sob várias condições, conforme descrito na presente invenção. As soluções foram diluídas em água Milli-Q (40 x) antes da análise. A Figura 1 A mostra o espectro de massa ESI para LHP.
CONDIÇÕES DE OPERAÇÃO PARA ESI-MS
[166] Todos os espectros de massa foram coletados com um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo Micromass Quattro Micro (Micromass, Reino Unido) empregando ionização por eletropulverização no modo de íon positivo. O nitrogênio seco aquecido foi o gás de nebulização e secagem para todos os experimentos. Uma tensão capilar de 3,00 kV, tensão de cone de 35 V, temperatura da fonte de 80ºC, temperatura de dessolvatação de 120ºC e fluxo de gás de dessolvatação de 400 L/h foram empregados para coletar os espectros.
[167] Um espectro basal para a água Milli-Q foi coletado. A fonte foi lavada completamente com água Milli-Q antes da injeção da amostra até o espectro se assemelhar ao espectro basal. Cada amostra foi injetada a uma velocidade de fluxo de 10 µL/min usando uma seringa de 1 mL (SGE Analytical Science, Austrália). Os espectros dos produtos As-LHP foram coletados na faixa de m/z de 300 a 1000. A aquisição de dados foi realizada no modo contínuo e, normalmente, 80 varreduras foram somadas para obter espectros representativos.
Os espectros foram processados com o software MassLynx (Waters, 2003). A subtração de fundo foi realizada com uma ordem polinomial de 1 com 40% abaixo da curva e suavizada com o algoritmo de Savitsky-Golay. Os espectros do centroide foram então gerados com a função central (Topo, área), e cada pico foi anotado com sua respectiva intensidade e razão m/z.
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS PARA A FORMAÇÃO DE COMPLEXOS AS-LHP E PRECURSORES FORMAÇÃO DE HYAS (LHP)
[168] A Tabela 2 contém as condições sob as quais reações em triplicatas foram realizadas usando os reagentes, AsI3 e LHP, para preparar HyAs (LHP). Todos os frascos de reação foram lavados com N2 antes da incubação.
Uma alíquota representativa foi analisada por ESI-MS nos pontos de tempo especificados (30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h, 24 h, 48 h) para monitorar o progresso da reação.
TABELA 2 CONDIÇÕES PARA AMOSTRAS EM TRIPLICATAS PARA A PREPARAÇÃO DE AS-LHP Razão Ensaio Concentrações Solvente Temp. (⁰C) pH As:LHP 1 5 mM para ambos os 1:1 NaOH (20 mM) 20, 37 pH 10 reagentes 2 0,10 mM-3,00 mM 1:1 NaOH (20 mM) 22, 37, 60 pH 10 3 3 mM diversos As LHP 1:2 NaOH (20 mM) 22, 37, 60 pH 10 1:3 1:5 1:10 4 diversos As 2:1 NaOH (20 mM) 23, 37, 60 pH 10 3 mM LHP 3:1 5:1 10:1 5 diversos As 2:1 Água Milli-Q 24, 37, 60 pH 7 3 mM LHP 3:1 5:1 6 diversos As 2:1 Tampão fosfato 24, 37, 60 pH 7 3 mM LHP 3:1 (H2PO4ˉ/HPO42ˉ, 5:1 0,1 M) 7 diversos As 2:1 Trietilamina 24, 37 pH 8 3 mM LHP 3:1 5:1 8 diversos As 2:1 Tampão fosfato 24, 37 pH 8 3 mM LHP 3:1 (H2PO4ˉ/HPO42ˉ, 5:1 0,1 M) 9 diversos As 2:1 Tampão Tris,HCl 24, 37 pH 9 3 mM LHP 3:1 (0,1 M) 5:1 FORMAÇÃO DE MEAS(LHP)
[169] A preparação de MeAs (LHP) foi examinada misturando ácido monometilarsênio (MMA(V), 3 mM) com LHP (12 mM), onde o excesso de LHP era para permitir a oxidação do peptídeo na redução de MMA(V). Os compostos foram misturados em tampão fosfato (H2PO4ˉ/HPO42ˉ, 0,1 M, pH 8), lavados com N2 e incubados a 37ºC ou 60ºC por 1 h, 4 h, 8 h, 16 h ou 24 h. Os produtos foram analisados por ESI-MS.
FORMAÇÃO DE PHAS(LHP)
[170] Com base nos resultados da formação de HyAs(LHP), as tentativas de produzir PhAs(LHP) envolveram uma solução de óxido de fenilararsina (PAO) (10 mM em tampão fosfato, H2PO4ˉ/HPO42ˉ, 0,1 M, pH 8), preparado por aquecimento até se dissolver (80-90ºC, 4-8 h). Após o resfriamento até à temperatura ambiente, o PAO (10 mM) foi adicionado a LHP (3 mM), os frascos foram lavados com N2 e incubados a 37ºC ou 60ºC durante 1 h, 4 h, 8 h, 16 h, ou 24 h. Os produtos foram analisados por ESI-MS.
TESTE PARA A FORMAÇÃO DE PHAS(CAYHRRLRC)
[171] Com o intuito de examinar a influência do grupo acetila na complexação do PhAs ao LHP, a reação foi tentada com o peptídeo não acetinado, CAYHRRLRC. O PAO (10 mM) foi preparado em tampão fosfato (H2PO4ˉ/HPO42ˉ, 0,1 M, pH 8) e resfriado, como descrito anteriormente.
CAYHRRLRC (3 mM) foi então adicionado, lavado com N2, e a solução resultante foi incubada a 37ºC ou 60ºC durante 1 h, 4 h, 8 h, 16 h, ou 24 h. As alíquotas foram analisadas por ESI-MS.
PREPARAÇÃO DE PHAS(LHP)
[172] PhAs(sLHP) foi preparado pela reação de PAO (10 mM, conforme descrito anteriormente em tampão de fosfato, H2PO4ˉ/HPO42ˉ, 0,1 M, pH 8) e sLHP (3 mM). Os frascos foram lavados com N2 e incubados a 37ºC durante 8-16 h. O produto foi analisado por ESI-MS.
PURIFICAÇÃO DOS VÁRIOS COMPLEXOS AS-LHP CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC) ANALÍTICA
[173] Um sistema de HPLC analítica Shimadzu com controlador de sistema SCL 10A VP, injetor automático SIL 10 AD VP e unidade de cromatografia líquida LC10AT VO foi usado com um desgaseificador DGU 14A e um detector de matriz de diodos SPD M10A VP. Uma coluna de Waters Sunfire C18, 5 μm, 4,6 x
250 mm (Nº: 186002560) foi utilizada após equilíbrio com H 2O (0,1% de TFA) durante 20 minutos. Um gradiente de eluição com ACN/H2O, cada um com 0,1% de TFA foi realizado. Todos os solventes foram desgaseificados por filtração e sonicação antes do uso. As amostras foram filtradas através de um filtro de 0,20 μm (Sartorius) antes da análise. Uma solução de LHP livre foi analisada para estabelecer seu tempo de eluição.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC) PREPARATIVA
[174] Com base no perfil de eluição obtido a partir da HPLC analítica, a purificação dos produtos da reação tal como foi realizado usando uma coluna de HPLC preparativa foi utilizada empregando um Sistema LC Waters Prep com uma coluna Waters Sunfire Prep C18, OBD 5 μm, 19 x 150 mm (186002568) e um detector UV/Visível 2489 ajustado para λ 220 nm. Todos os solventes foram pré-filtrados e sonicados antes da aspersão com He no instrumento. Cada amostra foi filtrada através de um filtro de 0,20 μm (Sartorius) antes da análise. A coluna foi equilibrada com H2O (0,1% de TFA), durante 30 minutos antes de executar a amostra. A velocidade de fluxo foi mantida em 20 mL/min. A tabela 3 representa o gradiente de solvente utilizado. Uma solução de LHP livre foi analisada como padrão. As frações foram coletadas e analisadas por ESI-MS.
TABELA 3
GRADIENTE DE SOLVENTE USADO PARA PURIFICAÇÃO POR HPLC DE COMPLEXOS
ASLHP Tempo (min) % de água Milli-Q (0,1% TFA) % de ACN (0,1% TFA) 0 100 0 2 95 5 32 65 35 37 100 0 40 100 0
SECAGEM DOS COMPLEXOS DE AS
[175] Para se obter compostos purificados, as frações de HPLC foram liofilizadas durante a noite utilizando um liofilizador Alpha 1-2 LDplus
(Christ).
CARACTERIZAÇÃO DE COMPLEXOS AS-LHP ESI-MS
[176] As soluções dos complexos As-peptídeo (100 μM, ácido fórmico a 0,5%) foram preparadas e analisadas por ESI-MS de acordo com as condições operacionais descritas anteriormente.
XAS
[177] A análise XAS foi realizada em amostras As-LHP sólidas e em solução. As amostras sólidas foram preparadas misturando cuidadosamente o As- LHP com nitreto de boro sólido (Sigma Aldrich). A proporção de diluição foi determinada inicialmente usando o programa XAFSmass, embora tenha sido verificado que uma diluição adicional de 10x era ideal para análise no modo de fluorescência. Esta mistura resultante foi montada em suportes de amostras de alumínio com 1 mm de espessura e selada com fita Kapton. As amostras da solução foram preparadas para análise XAS misturando a solução As (600 μL) com etileno glicol (300 μL) para evitar a cristalização durante o rápido congelamento. A solução resultante (concentração final de 1 mM de As) foi transferida por uma seringa para o suporte de amostra que foi selado com fita Kapton. A amostra foi rapidamente submersa em nitrogênio líquido e transferida para o criostato de hélio líquido, onde foi analisada a 10ºK.
[178] Além disso, os espectros de absorção de raios-X foram coletados para os padrões As: os padrões sólido e em solução foram preparados conforme descrito para os complexos As-LHP. Os padrões incluíram: AsI3, As2S3, NaAsO2, NaAsO4, MMA(V), PAO, As(GS)3, MeAs(GS)2, e PhAs(GS)2. Os dados XAS na borda K do arsênio foram coletados no National National Beamline Facility (ANBF, beamline 20B) KEK, Tsukuba, Japão, com uma energia de feixe de 2,5 GeV e corrente de feixe de 300-400 mA. Um monocromador com corte de canal de Si[111] foi dessintonizado em 50% para rejeitar harmônicos. Todos os espectros foram registrados no modo de fluorescência a ~ 10ºK (mantido com um criostato de He ciclo fechado, CryoIndustries REF-1577-D22) usando um detector de matriz Ge de 36 elementos (Eurisys/Canberra Industries) e uma fenda vertical de 1 mm largura. Os espectros EXAFS na borda K do arsênio foram coletados nas seguintes faixas de energia: região pré-borda 11640-11840 eV (etapas de 10 eV); região XANES 11840-11890 eV (etapas de 0,25 eV); e região EXAFS 11890- 12468 eV (etapas de 0,05 Å-1 no espaço k até 14,2 Å-1). Um padrão de arsenato de sódio sólido foi analisado simultaneamente no modo de transmissão a jusante da amostra para calibração, por meio da qual a energia do primeiro pico do primeiro espectro derivado (correspondente à energia da borda) foi definida como 11871,7 eV. Uma média de 2-3 varreduras foi utilizada para todas as análises de dados. O processamento dos dados foi realizado com o EXAFSPAK. O módulo DATFIT do EXAFSPAK foi utilizado para análise de regressão linear múltipla. A subtração e normalização do fundo foram obtidas usando BACKSUB e o FEFF 8.2 foi utilizado para calcular as funções fase e amplitude calculadas teoricamente para o ajuste dos dados EXAFS.
CARACTERIZAÇÃO POR ESPECTROSCOPIA DE RMN
[179] Amostras As-LHP foram analisadas em 90% de H2O/10% de D2O, (pH ~ 4 ajustado com HCl), ou 100% de D2O. Experimentos de RMN foram realizadas utilizando um espectrômetro Varian Unity 500-MHz e o Software Vnmrj
2.1B. A supressão do sinal de água residual foi alcançada por pré-saturação ou por esculpir a excitação usando um pulso quadrado seletivo na água com 1,5 s de duração. Atribuição de ressonância do próton foi obtida por experimentos H 1 e H1 COSY, TOCSY e NOESY. Atribuição de carbono foi obtida por experimentos H 1 e C13 COSY, TOCSY e NOESY. Os experimentos NOESY foram realizados com sequências de pulsos estabelecidas a partir dos experimentos COZY e TOCSY. O processamento espectral foi realizado usando o ACD/NMR Processor Academic Edition® (2013, ACD Labs, Toronto, Canadá). Todos os picos foram calibrados para o pico de água a 4,8 ppm.
ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA COM FORNO DE GRAFITE
[180] As soluções foram analisadas para As usando um espectrômetro de absorção atômica Perkin-Elmer AAnalyst 600 equipado com o programa Winlab 32 AA Furnace incorporando correção de fundo com efeito Zeeman, um amostrador automático AS-800 e um sistema de resfriamento AA Accessory 7. Uma lâmpada de descarga As sem eletrodo (Perkin-Elmer) ajustada em um comprimento de onda de 193,7 nm e uma largura de fenda de 0,7 nm, forneceu uma leitura de energia do instrumento de aproximadamente 54 W. Uma solução padrão de arsênio certificada, compatível com a matriz (lote # J2- AS02116), adquirido de Inorganic Ventures, EUA, foi utilizada para produzir a curva de calibração. Um solução modificadora de matriz Pd/Mg (1 mg/mL de Pd, 1 mg/mL de Mg(NO3)2) foi preparada utilizando soluções modificadoras de matriz Pd/Mg (adquiridas da Inorganic Ventures, EUA). Os volumes do amostrador automático dispensados foram de 5 μL para o modificador químico e 20 μL para a amostra. O arsênio foi atomizado a partir da superfície de tubos revestidos com grafite pirolítico com plataformas de L’vov inseridas usando as condições de operação do forno apresentadas na Tabela 4.
TABELA 4
CONDIÇÕES DE OPERAÇÃO DO FORNO DE GRAFITE Estágio Temperatura ºC Rampa Permanência Fluxo de gás s s mL.min-1 Secagem 1 110 1 30 250 Secagem 2 130 15 30 250 Pirólise/calcinação 1200 10 20 250 Atomização 2000 0 5 0 Limpeza 2450 1 3 250
RESULTADOS FORMAÇÃO DE COMPLEXOS AS-LHP FORMAÇÃO DE HYAS (LHP)
[181] As análises dos produtos a partir do Ensaio 1 não mostrou nenhuma evidência para o produto desejado complexo As-LHP.
ESI-MS produziu espectros para o peptídeo livre (FIG. 1A) para ambas as temperaturas em todos os momentos.
De forma similar, a análise espectral dos produtos a partir dos testes 2-6 mostrou apenas a existência do peptídeo livre para todas as concentrações, temperaturas e pontos de tempo, deixando de produzir o produto desejado complexo As-LHP.
Como os testes a 60ºC ao longo de 4 h mostraram sinais de degradação do peptídeo, este teste de temperatura foi descontinuado.
O ensaio 9 não produziu sinal do complexo As-LHP para todas as amostras em tampão Tris.HCl (pH 9). Entretanto, as tentativas de reações em trietilamina
(Ensaio 7) e em tampão fosfato pH 8 (Ensaio 8), produziram imediatamente um precipitado branco.
Uma amostra deste precipitado foi dissolvida em água Milli-
Q/ácido fórmico a 0,5% e a análise ESI-MS mostrou pequenos sinais de íons que poderiam ser atribuídos ao produto desejado em ambos os casos, embora os picos abundantes fossem novamente de peptídeo livre.
Quando a reação foi realizada a 24ºC, o precipitado resultante não se dissolveu, mesmo depois de 24 h, sugerindo que não era o produto desejado.
Após incubação da solução de reação a 37ºC, o precipitado dissolvido pelo ponto em tempo de 30 minutos e a amostra para este e os pontos de tempos de 1 e 2h produziram espectros ESI-MS que incluíam picos dominantes que poderiam ser atribuídos ao peptídeo livre e pequenos picos que indicavam a formação do produto desejado.
As amostras seguintes de incubação durante 4 horas a 37ºC para as reações realizadas em pH
8 produziu o espectro na Figura 1B, confirmando a formação de HyAs(LHP)) com um íon molecular abundante em m/z 431,4 e um íon moderadamente abundante em m/z 646,8 correspondente ao [HyAs (LHP) + 3H+]3+ e [HyAs(LHP) + 2H+]2+,
respectivamente.
O pequeno pico em m/z 837,9 foi designado como [HyAs(LHP)2
+ 3H+]3+ indicativo da formação de HyAs(LHP)2, e demonstra que a purificação da reação seria necessária para isolar o produto desejado, HyAs(LHP). A presença de íons associados ao peptídeo livre em m/z 407,6 em m/z 610,5, correspondendo ao [LHP + 3H+]3+ e [LHP + 2H+]2+, respectivamente, é mais provável devido à perda do arsênio associado no processo de ionização. A análise da concentração de arsênio no produto purificado por HPLC foi realizada com GFAAS para confirmar a pureza. Os espectros ESI-MS para os períodos de 24 e 48 h mostraram sinais de degradação do peptídeo.
FORMAÇÃO DE MEAS(LHP)
[182] A reação de MMA(V) e LHP se manteve incolor. Pequenos picos indicativos do produto MeAs(LHP) foram detectados após 4 h de incubação a 37ºC com a abundância destes picos crescentes após a incubação de 8 h. Não houve diferença significativa entre os tempos de incubação de 8 h e 16 h, mas o período de incubação mais longo, mais uma vez produzir degradação do peptídeo.
A Figura 1C representa o espectro ESI-MS a partir da reação na sequência durante a noite de incubação a 37ºC (16 h), confirmando a produção do produto desejado, MeAs(LHP), com o íon molecular, [MeAs(LHP) + 2H+] em m/z 655,1 e [MeAs(LHP) + 3 H+]3+ em m/z 437,1. Os íons abundantes em m/z 407,6 e m/z 610,5, indicativos do peptídeo livre, [LHP + 3H+]3+ e [LHP + 2H+]2+, são consistentes com o processo de ionização. Os outros íons presentes (m/z 414,9 [LHP + Na+ + 2H+]3+, m/z 444,8 [MeAs (LHP) + Na+ + 2H+]3+, m/z 629,6 [LHP + Na+ + H+]2+, e m/z 666,4 [MeAs(LHP) + Na+ + H+]2+) são designados como os picos análogos com Na+ substituindo um dos íons H+ em cada caso. Curiosamente, para esta reação, não houve evidência de um produto dipeptídeo.
FORMAÇÃO DE PHAS(LHP)
[183] A reação do PAO e LHP para produzir PhAs(LHP) resultou em precipitação imediata após a mistura. Como foi observado no caso de HyAs(LHP), a análise ESI-MS do precipitado mostrou grandes picos de íons atribuíveis ao peptídeo livre. Após uma hora de incubação a 37ºC, o precipitado se dissolveu e a seguir foi submetido a 4 h de incubação a 37ºC, a análise ESI-MS (Figura 1 D) mostrou um pico abundante em m/z 685,5 identificado como [PhAs(LHP) + 2H+]2+ com um íon moderadamente abundante em m/z 457,6 ([PhAs (LHP) + 3H+]3+).
Como foi observado nas reações de HyAs(LHP) e MeAs(LHP), o peptídeo livre também estava presente no espectro ESI-MS, como evidenciado pelos picos indicativos típicos em m/z 407,6 [LHP + 3H+]3+, e m/z 610,5 [LHP + 2H+]2+, que é removido após purificação por HPLC, como descrito no parágrafo [184] abaixo. Os períodos de incubação 8 h e 16 h a 37ºC produziu resultados ESI-MS semelhantes aos resultados para 4 h de incubação, mas no tempo de incubação de 24h, mais uma vez, houve sinais de degradação do produto.
PURIFICAÇÃO DE COMPLEXOS AS-LHP CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC) ANALÍTICA
[184] A purificação por HPLC das soluções de reação de As- peptídeo produziu picos afiados, bem separados. Em cada cromatograma, o peptídeo livre aparece aos 14,5 min. O pico para HyAs(LHP) (b) aparece em 17,2 min, enquanto MeAs(LHP) (c) e PhAs(LHP) eluem em 18,1 min e 22,1 min, respectivamente. Os vestígios da HPLC são mostrados na Figura 2A.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC) PREPARATIVA
[185] O aumento da reação e purificação por HPLC preparativa resultou em perfis de eluição semelhantes aos produzidos pela HPLC analítica com o peptídeo livre que eluiu em 16,9 min, HyAs(LHP) em 18,1 min, MeAs(LHP) em 19,6 min e PhAs(LHP) eluindo em 22,8 min. Após a liofilização da fração desejada, para remover o solvente, um sólido branco foi produzido, o que corresponde a cada um dos complexos AsLHP.
CARACTERIZAÇÃO DOS COMPLEXOS AS-LHP ESI-MS
[186] Os espectros de massa ESI (FIG. 2B) de HyAs (LHP) (a), MeAs (LHP) (b) e PhAs (LHP) (c) exibem picos em m/z 407.4 e 610.5 que podem ser atribuídos ao LHP e identificado como [LHP + 3H+]3+ e [LHP + 2H+]2+, respectivamente. A presença do LHP livre é provavelmente devida à perda do As associado durante o processo de ionização. O íon de baixa abundância em m/z 622,3, identificado como [LHP + H+ + Na+]2+, está presente em todas as reações As(LHP) e nos espectros do produto final. HyAs(LHP) (a) exibe um íon abundante em m/z 647,1 com um íon moderadamente abundante em m/z 431,4 atribuído a [HyAs (LHP) + 2H+]2+ e [HyAs (LHP) + 3H+]3+, respectivamente, confirmando a produção do produto desejado. A análise dos sistemas correspondentes para MeAs(LHP) (b) e PhAs(LHP) (c) mostram que cada um tem iões abundantes associados com o íon carregado 2+ em m/z 655,1 identificado como [MeAs(LHP) + 2H+]2+ e m/z 685,5 identificados como [PhAs(LHP) + 2H+]2+ com íons 3+ moderadamente abundantes em m/z 437,1 ([MeAs(LHP) + 3H+]3+ e m/z 457,6 ([PhAs(LHP) + 3H+]3+).
ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO DE RAIOS X (XAS)
[187] A FIG. 3 mostra a comparação dos espectros XANES obtidos na borda K do As de amostras sólidas dos padrões de As e dos agentes anticâncer As-peptídeo do primeiro aspecto, HyAs(LHP), MeAs(LHP) e PhAs(LHP). As energias correspondentes das bordas (obtidas a partir do primeiro pico do primeiro espectro derivado) e os picos de linha branca (white-line) para todas as amostras sólidas estão listados na Tabela 5, abaixo. As energias da borda do composto As (III), arsenito de sódio (11867.89 eV, linha preta tracejada, FIG. 3), e o composto As (V), arsenato de sódio (11871.38 eV, linha preta pontilhada, FIG. 3) diferiram em 3,49 eV. A inspeção das energias das bordas dos complexos As(III) revela que os compostos As(III) ligados ao enxofre (linhas tracejadas curtas, FIG. 3) exibem energias da borda mais baixas (11866,09 eV a 11867,07 eV) do que os compostos As(III) ligados com oxigênio (11867,89 eV a 11868,64 eV, linhas tracejadas, FIG. 3). A energia da borda para HyAs(LHP) (linha verde sólida, FIG. 3) era de 11866,97 eV, que fica no extremo superior da faixa para os compostos As(III) ligados ao enxofre, mas é significativamente menor do que a exibida pelo composto As(III) ligado ao oxigênio, arsenito de sódio. O perfil dos espectros para os complexos As(III) ligados ao enxofre também exibiu um vale característico em aproximadamente 11871,7 eV, enquanto os espectros para os compostos As(III) ligados ao oxigênio não exibiram esse vale acentuado na região pós-borda (FIG. 3). Os espectros obtidos para MeAs(LHP) (linha vermelha sólida) e PhAs(LHP) (linha preta sólida) exibiram o vale pós borda característico dos complexos As(III) ligados ao enxofre. Essa depressão não foi tão acentuada no espectro do HyAs(LHP) (linha verde sólida), talvez devido à presença de oxigênio nessa estrutura.
TABELA 5
BORDA K DO ARSÊNIO E O PICO DE ENERGIA XANES DE AMOSTRAS SÓLIDAS DE AGENTES ANTICÂNCER AS-LHP E PADRÕES DE AS Estado de Composto energia borda K pico de linha Átomos oxidação do As branca Coordenadores III PhAs(LHP) 11865,90 11868,1 Ph, 2S III As2S3 11866,09 11868,2 3S III MeAs(LHP) 11866,27 11868,3 C, 2S III PhAs(GS)2 11866,37 11868,4 Ph, 2S III MeAs(GS)2 11866,44 11868,4 C, 2S III HyAs(LHP) 11866,97 11868,7 O, 2S III Me2As(GS) 11867,01 11868,3 2C, S III As(GS)3 11867,07 11868,4 3S III AsI3 11867,27 11869,3 3I III Arsenito 11867,89 11869,8 3O III PhAsO 11868,64 11869,6 Ph, =O, V DMA(V) 11869,47 11872,0 2C, =O, O V MMA(V) 11870,64 11872,6 C, =O, 2O V Arsenato 11871,38 11873,6 =O, 3O
[188] O composto de arsênio (V) metilado, MMA (V) (linha vermelha pontilhada), exibiu uma energia da borda em 11870,64 eV, 2,75 eV superior ao complexo de arsênio monometilado (III), MeAsIII (GS)2 (11866,44 eV, linha vermelha tracejada, FIG. 3). A energia da borda para MeAs(LHP) (linha vermelha sólida, Fig. 3) ocorreu em 11866,27 eV e correspondeu à dos complexos As ligados ao enxofre. Além disso, o perfil pós-borda do espectro XAS de MeAs(LHP) se assemelhava muito ao do espectro MeAsIII(GS)2. O PhAsO (linha azul tracejada, Fig. 3) exibiu uma energia da borda de 11868.64 eV que é a mais próxima a do arsenito. Isso é representativo do fato de que o arsênio está ligado ao O eletronegativo em cada caso. O composto PhAs(LHP) (linha preta sólida) exibiu uma energia da borda (11865,90 eV) que ocorreu na faixa mais baixa dos padrões de As(III) ligado ao C/S. A forma do espectro PhAs(LHP) se assemelhava ao do espectro de MeAsIII(GS)2 (linha vermelha tracejada curta) e do espectro de PhAsIII(GS)2 (linha verde tracejada), mas a intensidade do pico de linha branca foi maior do que em qualquer um dos padrões.
[189] A Tabela 6 representa o resumo das simulações de ajuste de curva realizadas para dados EXAFS obtidos a partir de HyAs(LHP). Eles correspondem ao As(III), que é tipicamente coordenado para três átomos de maneira planar trigonal ou piramidal trigonal. A simulação de três átomos de enxofre coordenados com arsênio (Ajuste 2) resultou em um erro de ajuste aumentado quando comparado com o de dois átomos de enxofre (Ajuste 1), sugerindo que era mais provável que dois átomos de enxofre estivessem ligados ao arsênio. O ajuste de um terceiro retrodispersor ao arsênio indicava que o terceiro átomo provavelmente era oxigênio ou carbono (Ajustes 3 e 4). O cenário de 2 átomos de enxofre e 1 átomo de carbono produziu inicialmente um fator Debye-Waller negativo; como tal, o fator foi posteriormente fixado para obter o resultado mostrado no Ajuste 4 (Tabela 6). A FIG. 4 mostra as análises EXAFS e Transformada de Fourier experimentais e calculadas para o Ajuste 3, mostrando concordância razoável para a distribuição radial abaixo de 2,5 Ǻ. Outras configurações possíveis que também foram examinadas incluíram 1 átomo de enxofre e 2 átomos de oxigênio (Ajuste 5), e 1 átomo de enxofre e 2 átomos de carbono com o último descontado devido a fatores de Debye-Waller negativos fisicamente inviáveis produzidos. A correção do fator Debye-Waller para reduzir esse erro resultou em valores E0 irracionais.
TABELA 6
RESUMO DOS RESULTADOS DE AJUSTE DE EXAFS PARA HYAS(LHP) EM ESTADO SÓLIDO.
* O ajuste para 1S e 2O juntamente com aquele para 2S e 1C produziu fatores de Debye-Waller negativos antes da correção. Todas as tentativas para 1S e 2C produziram fatores de Debye-Waller negativos. Ajuste retrodispersores Distância Fator de Debye- -ΔE0 (eV) erro de N interatômica(R) Waller (δ2, Å-2) ajuste (%) 1 2S 2,265(3) 0,0016(2) 9,8(7) 47 2 3S 2,295(4) 0,0053(3) 11,0(7) 57 3 2S 2,238(3) 0,0019(2) 14,6(corr.) 34 1O 1,778(4) 0,0010(5) 4 2S 2,244(2) 0,0016(2) 13,5(5) 37 1C 1,847(8) 0,002(corr.) 5 1S 2,207(6) 0,002(corr.)* 20(1) 60 2O 1,747(5)
[190] A Tabela 7 (abaixo) mostra um resumo das simulações de modelos em potencial para os espectros EXAFS produzidos para MeAs(LHP). De forma similar, o ajuste inicial do arsênio coordenado exclusivamente ao enxofre confirmou que um modelo com dois átomos de enxofre produzia ajustes mais próximos (Ajuste 1 versus Ajuste 2), uma vez que a coordenação do As para três átomos de enxofre aumentou o erro de ajuste. As tentativas para examinar os cenários para uma combinação de 1 átomo de enxofre e 2 átomos de oxigênio ou 2 átomos de carbono ligados ao arsênio produziu resultados que não eram viáveis para o fator de Debye-Waller, E0, ou ambos os parâmetros. Além disso, isso não pôde ser corrigido fixando os parâmetros. O ajuste para o arsênio ligado a dois átomos de enxofre e um átomo de oxigênio ou um de carbono produziram resultados viáveis. Em conclusão, os melhores ajustes foram obtidos para As(III) ligado a dois enxofres e um oxigênio (Ajuste 3) ou um carbono (Ajuste 4, como mostrado na FIG. 5).
TABELA 7 RESUMO DOS RESULTADOS DE AJUSTE DE EXAFS PARA MEAS(LHP) EM ESTADO
SÓLIDO.
* O ajuste para 1S e 2O juntamente com aquele para 1S e 2C produziu fatores de Debye-Waller negativos e /ou valore E0 inviáveis. A tentativa inicial de ajustar 2S e 1C produziu fatores de Debye-Waller negativos antes da correção. Ajuste Retrodispersores Distância Fator de Debye- -ΔE0 (eV) Erro de N Interatômica Waller (δ2, Å-2) ajuste (%) (R) 1 2S 2,250(1) 0,0018(1) 12,9(4) 25 2 3S 2,245(2) 0,0047(1) 13,8(3) 28 3 2S 2,246(1) 0,00106(8) 14,4(3) 21 1O 1,898(4) 0,0025(8) 4 2S 2,245(1) 0,00109(7) 14,6(3) 19 1C 1,952(6) 0,002(corr.)
[191] A Tabela 8 mostra o resumo das simulações obtidas dos modelos de coordenação As a partir do espectro EXAFS de PhAs(LHP). Mais uma vez, o melhor ajuste foi obtido quando dois átomos de enxofre foram coordenados com arsênio (Ajuste 1), em vez de três átomos de enxofre (Ajuste 2). Resultados ruins foram obtidos para modelos nos quais o As foi coordenado com um átomo de enxofre e dois átomos de oxigênio ou um átomo de enxofre e dois átomos de carbono (ajustes não mostrados). Enquanto os modelos que incluíam arsênio se ligavam a dois átomos de enxofre e um átomo de oxigênio ou um átomo de carbono produziam inicialmente um fator de Debye-Waller irracional, isso foi melhorado quando esse fator foi corrigido e ajustes promissores foram obtidos (Ajustes 3 e 4), embora o erro de ajuste para 2S e 1O em comparação com 2S e 1C fosse significativamente maior. Assim, os resultados para o Ajuste 4 são mostrados na FIG. 6.
TABELA 8 RESUMO DOS RESULTADOS DE AJUSTE DE EXAFS PARA PHAS(LHP) EM ESTADO SÓLIDO.
* O ajuste para 1S e 2O juntamente com aquele para 1S e 2C produziu fatores de Debye-Waller negativos e /ou valore E 0 inviáveis. A tentativa inicial de ajustar 2S e 1C juntamente com aquele para 2S e 1O produziu fatores de Debye-Waller negativos antes da correção.
Ajuste Retrodispersores Distância Fator de Debye- -ΔE0 (eV) Erro de N Interatômica (R) Waller (δ2, Å-2) ajuste (%) 1 2S 2,266(2) 0,0027(1) 10,6(6) 43 2 3S 2,257(3) 0,0058(2) 12,6(6) 53 3 2S 2,251(4) 0,0027(2) 14(1) 66 1O 1,80(5) 0,002(corr.) 14(1) 4 2S 2,253(2) 0,0022(1) 14,2(4) 36 1C 1,94(7) 0,002 (corr.) 14,2(4)
ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
[192] As determinações de ressonâncias RMN H 1 para resíduos no peptídeo livre, AcCAYHRLRRC, foram feitas usando dados espectrais de RMN combinados COSY 1H e 1H 2-D , TOCSY e NOESY (Tabela 9). Os determinações de RMN C 13 foram feitas por dados espectrais de RMN 1H e 13C C2-D-COSY, TOCSY, NOESY, e HMBC . Os espectros também foram obtidos no CAYHRRLRC sob as mesmas condições, a fim de identificar e atribuir especificamente os resíduos individuais de cisteína no peptídeo AcCAYHRLRRC.
TABELA 9 ATRIBUIÇÃO DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS H1 E C13 DE LHP, 22 MM, 90% DE H2O, 10% DE D2O, PH 3,85, T 298,1 K Resíduo H1 Deslocamento C13 Deslocamento químico δ (ppm) químico δ (ppm) Ac CH3 2,08 CH3 26,62 C=O 172,13 Cys-1 NH 7,84 Cα 61,53 Hα 4,41 Cβ 31,01 Hβ 3,04,3,14 C=O 173,35 Ala-2 NH 8,49 Cα 57,55 Hα 4,37 Cβ 21,61 Hβ 1,48 C=O 174,44 Tyr-3 NH 8,21 Cα 63,91 Hα 4,21 Cβ 28,29 Hβ 3,05 Cγ 132,15 Hδ 6,84 Cδ 131,33 Hε 7,10 Cε 119,43
Resíduo H1 Deslocamento C13 Deslocamento químico δ (ppm) químico δ (ppm) Cζ 160,72 C=O 174,11 His-4 NH 8,14 Cα 60,23 Hα 4,52 Cβ 36,59 Hβ 2,96,3,08 Cγ 137,31 CHδ 8,62 Cδ 123,90 NHδ 7,25 Cε 139,22 CHε 3,98 C=O 173,14 NHε 8,46 Arg-5 NH 8,20 Cα 60,10 Hα 4,08 Cβ 31,92 Hβ 1,90,1,97 Cγ 26,99 Hγ 1,53 Cδ 44,21 Hδ 2,95 Cζ 161,09 C=O 173,26 Leu-6 NH 8,19 Cα 59,21 Hα 4,22 Cβ 43,22 Hβ 1,49 Cγ 27,41 Hγ 1,48 Cδ 25,13 Hδ 0,75, 0,80 C=O 175,62 Arg-7 NH 8,13 Cα 60,13 Hα 4,20 Cβ 32,25 Hβ 2,11,2,16 Cγ 27,22 Hγ 1,49 Cδ 43,38 Hδ 3,08 Cζ 161,32 C=O 172,74 Arg-8 NH 8,15 Cα 60,07 Hα 4,20 Cβ 32,23 Hβ 2,11,2,16 Cγ 27,18 Hγ 1,49 Cδ 43,29 Hδ 3,08 Cζ 161,26 C=O 172,53 Cys-9 NH 7,91 Cα 64,21 Hα 4,52 Cβ 27,43 Hβ 2,97,2,99 C=O 171,20
[193] Os espectros de RMN de MeAs(LHP) e PhAs(LHP) produziram os mesmos padrões de alterações químicas para todos os resíduos de aminoácidos, exceto as duas cisteínas, para as quais houve deslocamentos químicos consistentes com a ligação de As aos grupos sulfidrila (Tabelas 10 e 11 abaixo). Picos também foram atribuídos ao grupo metila para MeAs(LHP) e anel fenila para PhAs(LHP). TABELA 10
ATRIBUIÇÃO DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS H1 E C13 DE GRUPO R E RESÍDUOS DE CISTEÍNA PARA MEAS(LHP), 22 MM, 90% DE H2O, 10% DE D2O, PH 3,85, T 298,1 K Grupo R ou resíduo H1 Deslocamento C13 Deslocamento químico δ (ppm) químico δ (ppm) Me CH3 4,58 CH3 84,81 Cys-1 NH 7,84 Cα 61,53 Hα 4,46 Cβ 38,21 Hβ 3,25,3,35 C=O 173,35 Cys-9 NH 7,91 Cα 64,21 Hα 4,56 Cβ 34,63 Hβ 3,19,3,21 C=O 171,20 TABELA 11 ATRIBUIÇÃO DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS H1 E C13 DE GRUPO R E RESÍDUOS DE CISTEÍNA PARA PHAS(LHP), 22 MM, 90% DE H2O, 10% DE D2O, PH 3,85, T 298,1
K Grupo R ou resíduo H1 Deslocamento C13 Deslocamento químico δ (ppm) químico δ (ppm) Ph m-H 7,52 C (As) 138,81 p-H 7,53 C (m) 131,7 o-H 7,78 C (p) 128,9 C (o) 130,3 Cys-1 NH 7,85 Cα 61,54 Hα 4,41 Cβ 38,24 Hβ 3,28,3,38 C=O 173,35 Cys-9 NH 7,91 Cα 64,21 Hα 4,52 Cβ 34,65 Hβ 3,21,3,24 C=O 171,20
ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA COM FORNO DE GRAFITE
[194] O GFAAS foi realizado para confirmar a pureza dos produtos As- peptídeo e os resultados são mostrados na tabela 12 abaixo. É observada uma boa concordância entre as concentrações de As teóricas e experimentalmente determinadas.
TABELA 12
DADOS GFAAS DETERMINANDO A MICROANÁLISE DE ARSÊNIO PARA OS VÁRIOS PEPTÍDEOS CONTENDO AS DA INVENÇÃO. Amostra As teórico % As Determinado % Deter./teórico %
Amostra As teórico % As Determinado % Deter./teórico % HyAs(LHP) 0,0573 0,0472 82,4 MeAs(LHP) 0,0574 0,0566 98,6 PhAs(LHP) 0,0548 0,0547 99,8 INVESTIGAÇÃO DE ISÔMEROS DE PHAS(LHP)
MÉTODO
[195] Um sistema de HPLC analítico Shimadzu com controlador de sistema Prominence-i LC2030C, injetor automático e unidade de cromatografia líquida foi usado para a purificação de PhAs(LHP). Uma coluna de Waters Sunfire C18, 5 μm, 4,6 x 250 mm (Nº: 186002560) foi utilizada após equilíbrio com H 2O (0,1% de TFA) durante 20 minutos. Todos os solventes foram desgaseificados por filtração e sonicação antes do uso. A amostra de PhAs(LHP) foi preparada de fresco a partir da reação de LHP (3 mM) e PAO (10 mM) em água Milli-Q (volume total de 1 mL) incubada a 37ºC durante a noite. A mistura foi então filtrada através de um filtro de 0,2 µm (Sartorius) antes de ser injetada na coluna e analisada para determinar os tempos de eluição das frações de interesse. O gradiente de eluição analítica de fase reversa usado para a separação de picos ideal está listado na Tabela 13 abaixo.
TABELA 13
GRADIENTE DE ELUENTE DE HPLC DE FASE REVERSA ANALÍTICO E PREPARATÓRIO USADO PARA ANÁLISE E PURIFICAÇÃO DE PHAS(LHP). Tempo (min) Solvente A (%) Solvente B (%) 0,01 100 0 2,00 80 20 20,00 74 26 20,01 0 100 23,01 100 0
[196] Com base no perfil de eluição obtido a partir da HPLC analítica, a purificação de PhAs(LHP) foi realizada usando HPLC preparativa empregando um amostrador automático Shimadzu SIL-10AP, cromatografia líquida preparativa Shimadzu LC-20AP, válvula quaternária Shimadzu FCV-200AL,
detector de matriz de diodos Shimadzu SPD-M20A, unidade de desgaseificação Shimadzu DGU-20A5R, módulo de barramento de comunicações Shimadzu CDM- 20A, e Software LabSolutions e uma coluna Luna 5u C18(2) (250 × 21,20 mm, 5 mícrons, Phenomenex). A coluna foi equilibrada com H2O (0,1% de TFA, 20 min).
Uma solução (6 mL) de PhAs(LHP), preparada de acordo com as condições ótimas de reação (conforme determinado a partir dos resultados do desenvolvimento do método), foi injetada na coluna e separada usando os gradientes de eluente detalhados na Tabela 13. A velocidade de fluxo foi mantida em 15 mL/min e as frações foram detectadas em λ 254 nm. As principais frações foram coletadas e caracterizadas por ESI-MS. Quando necessário, as frações de HPLC identificadas foram secas usando um liofilizador Alpha 1-2 LDplus Freeze Dryer (Christ) para se obter os compostos puros.
RESULTADOS
[197] Utilizando o processo de separação acima, dois picos ficaram evidentes (eluindo em 15,99 e 16,8 6 min, HPLC preparatória, FIG. 7). Quando isolados e coletados, cada pico foi identificado por ESI-MS como PhAs(LHP). Os espectros (FIG. 8) para as duas frações foram semelhantes com os picos de ESI- MS que poderiam ser atribuídos ao LHP e ao PhAs(LHP). Os picos exibidos em m/z 407,5, 414,1, 610,7 e 619,8 são atribuídos ao LHP e são identificados como [LHP + 3H+]3+, [LHP + 2H+ + Na+]3+, [LHP + 2H+]2+, and [LHP + 2H+ + H2O]2+, respectivamente. A presença do peptídeo livre é resultado do processo de ionização. Os picos exibidos em m/z 457,4, 463,5, 685,5 e 696,7 são indicativos de PhAs(LHP), e são identificados como [PhAs(LHP) + 3H+]3+, [PhAs(LHP) + 3H+ + H2O]3+, [PhAs(LHP) + 2H+]2+, e [PhAs(LHP) + H+ + Na+]2+, respectivamente.
[198] Os compostos resultantes (isolados e secos) de cada fração foram dissolvidos em água MilliQ (3 mM) e reexaminados por HPLC analítica. Em cada caso, o cromatograma de HPLC (FIG. 9) confirmou a presença de dois picos, tal como havia sido observado anteriormente no cromatograma da HPLC preparatória inicial. Os tempos de eluição foram consistentes com a eluição de PhAs(LHP). Isso indica que existem isômeros de PhAs de conversão espontânea (LHP) e é consistente com um centro quiral no átomo As que está ligado a três porções diferentes (o grupo fenila e as duas extremidades assimétricas do peptídeo) e contém um par solitário. Isto é indicado abaixo onde (a) é o isômero R e (b) é o isômero S.
ESTUDOS DE ESTABILIDADE DE COMPLEXOS AS-LHP MÉTODO
[199] A estabilidade dos complexos As-LHP foi estudada por XAS.
As amostras foram preparadas por dissolução de HyAs(LHP), MeAs(LHP) ou PhAs(LHP) (1,5 mM) em água Milli-Q que foi mantida a 37ºC. Imediatamente antes da análise da solução de peptídeo de arsênio (600 μL) foi misturado com etileno glicol (300 μL) para evitar a cristalização durante o congelamento rápido. A solução resultante (concentração final de 1 mM de As) foi transferida por uma seringa para o suporte de amostra que foi selado com fita Kapton. A amostra foi rapidamente submersa em nitrogênio líquido e transferida para o criostato de hélio líquido, onde foi analisada a 10ºK.
[200] Os dados XAS obtidos na borda K do arsênio foram coletados no National National Beamline Facility (ANBF, beamline 20B) KEK, Tsukuba, Japão, com uma energia de feixe de 2,5 GeV e corrente de feixe de 300-400 mA.
Um monocromador com corte de canal de Si[111] foi dessintonizado em 50% para rejeitar harmônicos. Todos os espectros foram registrados no modo de fluorescência a ~ 10ºK (mantido com um criostato de He ciclo fechado, CryoIndustries REF-1577-D22) usando um detector de matriz Ge de 36 elementos
(Eurisys/Canberra Industries) e uma fenda vertical de 1 mm largura. Os espectros XAS foram obtidos no ponto zero e, posteriormente, em 4 h ou 14 h. Os espectros dos dois momentos foram processados e analisados usando EXAFSPAK.
[201] A estabilidade dos dois complexos As-LHP mais promissores também foi estudada em meio celular (IMDM). As amostras foram preparadas por dissolução do (MEAS LHP) ou PhAs(LHP) (1,5 mM) em IMDM que foi mantida a 37ºC. O mesmo protocolo foi seguido como aquele para os estudos de estabilidade em água Milli-Q. Os espectros de XAS foram obtidos no ponto zero e em 24 h. Como nas amostras de água Milli-Q, os espectros dos dois momentos foram processados, ajustados e quantificados usando EXAFSPAK.
RESULTADOS
[202] A Figura 10 mostra a comparação dos espectros obtidos para dois pontos no tempo (0 h, azul e 4 h, vermelho) de HyAs(LHP) em água Milli-Q. O espectro para a amostra de 4 h é claramente diferente daquele obtido para a amostra de 0 h, indicando que o complexo não é estável em água Milli-Q durante 4 h. O espectro para a amostra de 4 h é semelhante ao obtido para o arsenito em água Milli-Q sugerindo que o LHP já não está mais ligado ao arsênio. O deslocamento da borda é indicativo de arsênio ligado a átomos de oxigênio em vez de átomos de enxofre (o último seria o caso do complexo HyAs(LHP) intacto).
[203] A Figura 11 ilustra o espectro obtido para dois pontos no tempo (0 h, azul e 14 h, vermelho) de MeAs(LHP) em água Milli-Q. Os dois espectros foram 93% comparáveis ao resíduo representado graficamente em verde, representando as pequenas anomalias entre os dois espectros.
[204] A Figura 12 mostra a comparação dos espectros obtidos para dois pontos no tempo (0 h, azul e 14 h, vermelho) de PhAs(LHP) em água Milli-Q.
A concordância entre os dois espectros é próxima de 100%, com o residual, muito próximo de zero, não exibindo características residuais significativas. Isso indica que o complexo PhAs(LHP) é estável em água Milli-Q por 14 h.
[205] A Figura 13 ilustra o espectro obtido para dois pontos no tempo (0 h, azul e 24 h, vermelho) de MeAs(LHP) em IMDM (meio celular). Os dois espectros foram 82% comparáveis ao resíduo representado graficamente em verde, representando as anomalias entre os dois espectros. A alteração mais significativa pode ser vista claramente em uma redução no vale/calha pós-borda.
[206] A Figura 14 mostra a comparação dos espectros obtidos para dois pontos no tempo (0 h, azul e 24 h, vermelho) de PhAs(LHP) em IMDM (meio de cultura). A concordância entre os dois espectros é de 97% com o residual (verde), contendo características residuais menores. Isso indica que o complexo PhAs(LHP) é razoavelmente estável em IMDM por 24 h.
TESTES DE CITOTOXICIDADE (MTT) DE COMPLEXOS AS(LHP) MÉTODOS LINHAGENS DE CÉLULAS E PROCEDIMENTOS DE CULTURA
[207] Todas as culturas e ensaios celulares foram realizadas em uma capela de segurança biológica (classe II, Email Westinghouse Pty Ltd), utilizando uma técnica asséptica.
CÉLULAS HUMANAS DE LEUCEMIA MIELOIDE CRÔNICA (K562)
[208] As células K562 são células de leucemia mieloide crônica humanas/células da medula óssea derivadas de uma mulher de 53 anos de idade, originalmente obtida da ATCC. Essa linhagem celular foi escolhida por ser um alvo do LHP e, portanto, potencialmente, dos complexos As-LHP. A toxicidade e os valores de IC50 foram estabelecidos para arsenito, AsI3, PAO, LHP, HyAs(LHP), MeAs(LHP), PhAs(LHP), acetarsol, ATO, sLHP, e PhA(sLHP) utilizando o ensaio MTT.
[209] As células K562 foram cultivadas a partir de semipermanentes (adquiridas a partir da ATCC). As células foram cultivadas em meio de crescimento (GM) contendo IMDM (Meio Dulbecco modificado por Iscove, Invitrogen, 500 mL), soro bovino fetal (SBF, Bovogen, Thermo Scientific, 10% v/v)
e penicilina/estreptomicina (Gibco, Life Technologies, 10 mL/500 mL IMDM, 200 UI/mL e 200 μg/mL, respectivamente). As culturas de K562 foram cultivadas em frascos de cultura de células (Greiner) com 75 cm2 de área de superfície, a 37ºC em uma incubadora com atmosfera de 5% de CO2 (Heraeus, Thermo Scientific, EUA). As células foram subcultivadas, tipicamente duas vezes por semana. A suspensão de células foi centrifugada (1500 rpm, 5 minutos, Heraeus Labofuge 300), o sedimento foi resuspenso em GM (5 mL) e 2 gotas foram adicionadas a GM (25 mL) no balão de cultura de células.
CÉLULAS HUMANAS DE LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA (HL-60)
[210] As células HL-60 são células humanas de leucemia promielocítica aguda, derivadas de uma mulher branca de 36 anos com leucemia promielocítica aguda. As células HL-60 foram cultivadas a partir de semipermanentes (originalmente adquiridas a partir da ATCC). Essas células APL são de outra linhagem celular de leucemia conhecida por ser alvo do peptídeo CAYHRLRRC e representam a condição atualmente tratada com a terapia As, ou seja, ATO. As células foram cultivadas em meio de crescimento (GMH) contendo IMDM (500 mL), SBF (20% v/v) e penicilina/estreptomicina (10 mL/500 mL IMDM, 200 UI/mL e 200 µg/mL, respectivamente). As células foram subcultivadas, tipicamente duas vezes por semana da mesma maneira que as células K562 usando GMH.
CÉLULAS DE LEUCEMIA MIELOBLÁSTICA AGUDA HUMANA (KASUMI-1)
[211] As células Kasumi-1 foram adquiridas na CellBank Australia.
As células Kasumi-1 são células humanas de leucemia mieloblástica aguda/células da medula óssea derivadas de um japonês do sexo masculino de 7 anos de idade. Esta linhagem de células foi escolhida para explorar o potencial de PhAs(LHP) como um tratamento para LMA. As células Kasumi-1 foram cultivadas em meio de crescimento (GM1) contendo RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute Medium, Invitrogen, 500 mL), SBF (20% v/v) e penicilina/estreptomicina
(10 mL/500 mL IMDM, 200 UI/mL e 200 µg/mL, respectivamente). AS células Kasumi-1 foram cultivadas em frascos de cultura de células com 75 cm 2 de área de superfície, em uma incubadora a 37ºC e 5% de CO2. As células foram subcultivadas, tipicamente duas vezes por semana. Resumidamente, metade da suspensão de células foi substituída por meio GM1 fresco para manter a densidade celular entre 3 x 105 e 3 x 106 células/mL.
CÉLULAS-T DE LEUCEMIA HUMANAS (KARPAS 45)
[212] As células KARPAS 45 são células T de leucemia humanas/células da medula óssea derivadas a partir de uma criança do sexo masculino de 2 anos de idade antes de ser submetida à terapia, e foram cultivadas a partir de semipermanentes (adquiridas a partir de CellBank Austrália) em meio de crescimento (GMK) contendo RPMI-1640, SBF (20% v/v), glutamina (2mM, Gibco, Life Technologies) e penicilina/estreptomicina (10 mL/500 mL IMDM, 200 UI/mL e 200 μg/mL, respectivamente). As culuturas de KARPAS 45 foram cultivadas em frascos de cultura de células com 75 cm2 de área de superfície, em uma incubadora a 37ºC e 5% de CO2. As células foram subcultivadas, tipicamente duas vezes por semana, substituindo metade do volume com GMK fresco.
CÉLULAS DE CÂNCER DO FÍGADO HUMANAS (HEPG2)
[213] As células HepG2 são células de carcinoma hepático humano derivadas de um homem caucasiano de 15 anos de idade. São células aderentes, do tipo epitelial e foram cultivadas a partir de semipermanente (originalmente adquiridas da ATCC). As células foram cultivadas em meio de crescimento (GMA) contendo DMEM (Meio de Eagle modificado por Dulbecco, Life Technologies 500 mL), SBF (10% v/v) e penicilina/estreptomicina (10 mL/500 mL IMDM, 200 UI/mL e 200 µg/mL, respectivamente). As células foram subcultivadas, tipicamente duas vezes por semana antes de atingirem a confluência. O meio celular foi removido, descartado e as células lavadas com PBS, que também foi removido e descartado. Adicionou-se tripsina (5 mL, 0,25% p/v em PBS, Gibco, Life
Technologies) e o balão foi incubado até as células se soltarem. GMA (5 mL) foi adicionado ao balão e o conteúdo do balão foi transferido para um tubo estéril e centrifugado (1500 rpm, 5 minutos). Após a remoção do sobrenadante, o sedimento foi resuspenso em GMA (5 mL) e 1-2 gotas da solução celular foram adicionadas ao GMA (25 mL) no balão de cultura de células.
CÉLULAS A549 DE CÂNCER DE PULMÃO HUMANO
[214] As células A549 são células de carcinoma de pulmão humano derivadas de um homem de 58 anos de idade. São células aderentes, do tipo epitelial e foram cultivadas a partir de semipermanentes adquiridas da CellBank Australia. As células foram cultivadas e subcultivadas da mesma maneira que para as células HepG2, descritas acima. Essas células também foram escolhidas para representarem células de crescimento rápido derivadas de um tumor sólido que não deve ser reconhecido ou alvejado pelo complexo As-peptídeo.
CÉLULAS DE TUMOR SÓLIDO DE HAMSTER CHINÊS
[215] As células de tumor sólido de Hamster Chinês (CH) foram escolhidas como uma linhagem de células não humanas (que não devem ser alvejadas). São células aderentes, do tipo epitelial e foram cultivadas a partir de semipermanentes. As células foram cultivadas e subcultivadas da mesma maneira que para as células HepG2, descritas acima.
CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO HUMANO (HPBMC)
[216] O sangue (40 mL) foi coletado de um voluntário saudável.
PBS estéril (15 mL) foi adicionado a 20 mL de sangue. Cada tubo foi invertido 3-4 vezes para misturar. O sangue foi coberto com aproximadamente 15 mL de Ficoll- Paque® PLUS (GE Healthcare) e centrifugado (1700 rpm, centrífuga Heraeus Labofuge 400 R) por 30 minutos (sem freio). A camada de células mononucleares foi transferida para novos tubos e lavada duas vezes com PBS estéril (50 mL). Os tubos foram suavemente invertidos para misturar e o centrifugado (1500 rpm, 15 min). As células mononucleares foram resuspensas em PBS (equivalente ao volume sanguíneo original) e contadas com um hemocitômetro. Após a centrifugação, as células foram resuspensas em RPMI-1640 suficiente para produzir a população de células necessária. Foi realizado um ensaio de calibração e foi determinado que 106 células/poço produziram a absorbância ideal (1,00 a 2,00) para os controles do ensaio MTT usando hPBMC.
ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE MTT
[217] As citotoxicidades dos compostos foram avaliadas por adaptações do ensaio MTT descrito por Carmichael et al. (Cancer Res. 1987, 47, 936) e Mosman (J. Immunol. Methods 1983, 65, 55). O ensaio MTT baseia-se na conversão de um sal de tetrazólio em formazan pelas células vivas e permite que a sobrevivência das células seja quantificada por meio de avaliação colorimétrica.
Este ensaio estabelece um valor de IC50 para cada composto para permitir a comparação das toxicidades de diferentes compostos em relação à linhagem de células utilizada no ensaio. Este ensaio foi utilizado para comparar as toxicidades dos complexos arsênio - peptídeo com outros compostos de arsênio, a fim de examinar a capacidade e potencial de direcionamento destes complexos como tratamentos antileucemia. . As citotoxicidades dos dois isômeros de PhAs(LHP) foram avaliadas em células K562 e HL-60 pelo ensaio MTT, conforme descrito anteriormente. As soluções de tratamento foram preparadas recentemente no IMDM imediatamente antes do tratamento e foram diluídas em série.
[218] Foram realizados ensaios de citotoxicidade testando várias faixas de concentração de arsenito de sódio (arsenito, Sigma Aldrich), óxido de fenilarsina (PAO, Sigma Aldrich), AsI3, acetarsol (acetarsona, Sigma Aldrich), ATO (formulação Phenasen obtida de Phebra), LHP embaralhado (sLHP), LHP (ambos obtidos da Peptide 2.0, EUA), PhAs(LHP) e PhAs (sLHP).
PROTOCOLO PARA ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE MTT EM CÉLULAS K562
[219] Células K-562 (8 x 105 células) foram semeadas em meio de crescimento (5 mL) em placas de cultura celular de 60 mm e incubadas a 37ºC,
5% de CO2 durante 24 h. Os compostos testados foram arsenito, ASI 3, ATO, Acetarsol, LHP, HyAs(LHP), MeAs(LHP), PhAs(LHP), sLHP e PhAs(sLHP). As soluções de tratamento foram preparadas frescas em IMDM imediatamente antes do tratamento. Os compostos foram diluídos em série no IMDM para atingir um intervalo de concentrações para análise. A suspensão de células de cada placa foi centrifugada (1200 rpm, 5 min, Heraeus Labofuge 300) e os sedimentos foram resuspensos em soluções de tratamento (3 mL) ou, no caso das células controle, IMDM (3 mL) e retornados para as placas para incubação (37ºC, 5% de CO 2).
Após 24 h, as soluções celulares foram centrifugadas (1200 rpm, 5 min). As células foram lavadas duas vezes por adição de PBS estéril seguido de centrifugação (1200 rpm, 5 min). As células foram resuspensas em IMDM (5 mL) e retornadas às placas com meio fresco. Foi adicionado MTT (400 µL, 2 mg/mL, IMDM) a cada placa e as placas foram incubadas. Após 4 h, as soluções foram centrifugadas (1200 rpm, 5 min) e DMSO (1,8 mL) foi adicionado aos pellets para dissolver os cristais de formazan. Pipetou-se cada solução (200 µL/poço) para uma placa de 96 poços (1 tubo/coluna, Cellstar, Greiner Bio-one, Austrália).
PROTOCOLO PARA ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE MTT EM CÉLULAS HL-60
[220] Os compostos testados incluíram: arsenito, ATO, Acetarsol, LHP, PhAs(LHP), sLHP e PhAs(sLHP). Devido ao custo do peptídeo e à estabilidade aprimorada do complexo PhAs(LHP) sobre HyAs(LHP) e MeAs(LHP), decidiu-se interromper o teste dos dois últimos complexos. As soluções de tratamento foram preparadas frescas em IMDM imediatamente antes do tratamento. Os compostos foram diluídos em série no IMDM para atingir um intervalo de concentrações para análise. Devido à perda de células por transferência entre placas e tubos, um protocolo MTT alternativo de Tada et al. (J.
Immunol. Methods 1986, 93, 157) foi inicialmente testado com células K562. Como foi determinado que os valores IC50 resultantes são comparáveis com o método anterior, o novo protocolo foi utilizado para os ensaios MTT realizados com as células HL-60. Uma solução de células HL-60 (2 x 105 células/50μL, IMDM) foi adicionada a cada poço (linhas 2-7, colunas B-I, placa de 96 poços de fundo plano, Greiner). As soluções de tratamento (50 μL) foram então adicionadas a cada um dos poços nas colunas 3-11 (mais diluídas na coluna 3, mais concentradas na coluna 11), enquanto IMDM (50 μL) foi adicionado aos poços de controle (Coluna 2). As placas foram incubadas (37ºC, 5% de CO2) durante 24 h, em seguida, uma solução de MTT (20 μL, 5 mg/mL, IMDM) foi adicionada a cada poço e as placas foram recolocadas no incubador para permitir desenvolvimento de formazan. Após 4 h, a solução solubilizante (100 µL, SDS a 10% em HCL 0,01 M) foi adicionada a cada poço e as placas foram incubadas durante a noite.
PROTOCOLO PARA ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE MTT EM CÉLULAS KASUMI-1
[221] Células Kasumi-1 foram semeadas a uma densidade de 2 x 105 células/poço. Os compostos avaliados incluíram: meta-arsenito de sódio (arsenito, Sigma Aldrich), trióxido de arsênio (ATO, Phebra), óxido de fenilarsina (PAO, Sigma Aldrich), peptídeo de tropismo de leucemia (LHP) e peptídeo de tropismo de leucemia embaralhado (sLHP) obtido a partir da Peptide 2.0, EUA; e PhAs(LHP) e PhAs(sLHP), que foram sintetizados, purificados e caracterizados.
As soluções de tratamento foram preparadas frescas em RPMI-1640 imediatamente antes do tratamento. Os compostos foram diluídos em série em meio RPMI-1640 para atingir um intervalo de concentrações para análise. Os ensaios MTT foram realizadas, no mesmo modo que as células HL-60, pelo menos 3 vezes para se obter um desvio médio e padrão para os valores IC50.
PROTOCOLO PARA ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE MTT EM CÉLULAS KARPAS 45
[222] As soluções de tratamento foram preparadas em meio RPMI- 1640 imediatamente fresco antes do tratamento e os compostos foram diluídos em série em RPMI-1640 para atingir os intervalos de concentrações para a análise. Os compostos testados foram arsenito, ATO, Acetarsol, LHP, PhAs(LHP), sLHP e PhAs(sLHP). Uma solução de células KARPAS 45 (6 x 105 células/50μL, RPMI-
1640) foi adicionada a cada poço (linhas 2-4, colunas B-I, placa de 96 poços de fundo plano, Greiner). As soluções de tratamento (50 μL) foram então adicionadas a cada um dos poços nas colunas 3-11 (mais diluídas na coluna 3, mais concentradas na coluna 11), enquanto RPMI-1640 (50 μL) foi adicionado aos poços de controle (Coluna 2). O restante do ensaio foi realizado da mesma maneira que para as células HL-60 descritas no parágrafo anterior, com a exceção de que a solução MTT foi preparada em RPMI-1640.
PROTOCOLO PARA ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE MTT EM CÉLULAS TUMORAIS HEPG2, A549 E DE CÉLULAS DE HAMSTER CHINÊS
[223] A solução de células (1 x 104 células/100μL, GMA) foi adicionada a cada poço (linhas 2-7, colunas B-I, placa de 96 poços de fundo plano, Greiner) e as placas foram incubadas durante 24 horas. O GMA foi removido e soluções de tratamento preparadas no momento do uso (100 μL dos compostos diluídos em série em DMEM) foram então adicionadas a cada um dos poços nas colunas 3-11 (mais diluídas na coluna 3, mais concentradas na coluna 11), enquanto DMAM (100 μL) foi adicionado aos poços de controle (Coluna 2).
Os compostos testados foram arsenito, ATO, PAO, Acetarsol, LHP e PhAs(LHP).
O restante do ensaio foi realizado usando o mesmo protocolo usado para as células HL-60, com a exceção de que a solução MTT foi preparada usando DMEM.
PROTOCOLO PARA ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE MTT EM HPBMC.
[224] As soluções de tratamento foram preparadas frescas no dia do tratamento da mesma maneira que no protocolo com células HL-60. Os compostos testados foram arsenito, ATO, PAO, acetarsol, LHP e PhAs(LHP). A solução de células hPBMC (1 x 106 células/50 µL, RPMI-1640) foi adicionada a cada poço (linhas 2-4, colunas B-I, de placas de 96 poços de fundo plano, Greiner) e o restante do ensaio foi realizado usando o mesmo protocolo usado para as células HL-60.
AVALIAÇÃO COLORIMÉTRICA MTT E CÁLCULOS DE IC50 AVALIAÇÃO COLORIMÉTRICA E CÁLCULOS DE IC50 PARA OS ENSAIOS EM CÉLULAS K562
[225] A absorbância foi medida a 570 nm e 630 nm (leitor de microplacas BMG LabTech Polarstar Omega). A porcentagem de sobrevivência celular foi então determinada pela Equação 1. Equação 1
[226] A viabilidade celular foi calculada graficamente em função das concentrações de tratamento para determinar o valor IC50 de cada espécie. Todos os ensaios MTT foram realizados por pelo menos três vezes para fornecer a potência necessária para realizar a análise estatística. As análises estatísticas foram realizadas usando ANOVA unidirecional e teste de comparação múltipla de Tukey (GraphPad Prism).
AVALIAÇÃO COLORIMÉTRICA E CÁLCULOS PARA OS ENSAIOS EM CÉLULAS HL-60, KASUMI-1, KARPAS 45, HEPG2, A549, CÉLULAS DE TUMOR SÓLIDO CH E HPBMC.
[227] As leituras de absorbância foram registradas a 570 nm e 690 nm (leitor de microplacas BMG LabTech Polarstar Omega) e curvas de concentração-resposta (usando a equação 2 para calcular a viabilidade das células) foram produzidos a fim de calcular o valor de IC50 para cada composto.
Os ensaios de MTT foram realizados em triplicatas, a menos que indicado de outra forma. As análises estatísticas foram realizadas usando ANOVA unidirecional e teste de comparação múltipla de Tukey (GraphPad Prism). Equação 2
RESULTADOS RESULTADOS DE MTT E VALORES DE IC50 PARA ISÔMEROS DE PHAS(LHP) EM RELAÇÃO ÀS CÉLULAS K562 E HL60
[228] Os valores IC50 obtidos a partir de estudos de citotoxicidade celular MTT das frações de isômeros PhAs(LHP) em células K562 e células HL-60 indicou que os produtos resultantes de cada fração de HPLC exibem as mesmas toxicidades (Tabela 14).
TABELA 14 VALORES IC50 OBTIDOS A PARTIR DE ENSAIOS MTT DE CITOTOXICIDADE DOS DOIS
COMPOSTOS RESULTANTES A PARTIR DE FRAÇÕES IDENTIFICADAS COMO PHAS(LHP). Linhagem celular Fração 1 valor IC50 (μM)* Fração 2 valor IC50 (μM)* K562 0,47 ± 0,02 0,48 ± 0,04 HL-60 0,64 ± 0,02 0,63 ± 0,03 * Os resultados são representados como a média e o desvio padrão de três ensaios.
[229] Como era evidente que a racemização ocorreu à temperatura ambiente e acima, e que isso não afetou a atividade biológica, todos os testes adicionais foram realizados com mistura racêmica (frações de isômeros não resolvidos).
RESULTADOS DE MTT E VALORES IC50 PARA CÉLULAS K562
[230] As curvas de concentração-resposta resultantes dos ensaios MTT sobre células K562 após um tratamento de 24 h estão representadas na Figura 15. O tratamento com arsênio, resultando em morte celular, produziu curvas de concentração-resposta típicas para a maioria dos compostos testados.
Os valores IC50 obtidos para arsenito, ASI3, ATO, PAO, HyAs(LHP), MeAs(LHP), PhAs(LHP) e PhA(sLHP) sobre células K562 após 24 h de tratamento são mostrados na Figura 16 e Tabela 15. Os valores IC50 para arsenito e AsI3 foram muito semelhantes (18,63 ± 0,49 µM e 18,14 ± 0,75 µM, respectivamente). O tratamento com ATO produziu um valor IC50 de 9,74 ± 0,16 μM, aproximadamente metade do valor obtido com arsenito (NaAsO2), o que é consistente com o fato do ATO conter duas vezes os átomos de arsênio como arsenito. O PAO (IC50: 3,40 ± 0,42 µM) foi três vezes mais tóxico que o ATO, indicando que existe possivelmente uma maior captação deste composto devido ao aumento da lipofilicidade associada à presença do grupo fenila. Alternativamente, a fenila pode estar diretamente envolvida na interação com o alvo celular.
TABELA 15 OS VALORES DE IC50 OBTIDOS A PARTIR DE ENSAIOS MTT EM TRIPLICATAS APÓS 24 H DE TRATAMENTO EM CÉLULAS K562. Tratamento IC50 (µM) Arsenito 18,63 ± 0,49 AsI3 18,14 ± 0,75 ATO 9,74 ± 0,16 PAO 3,40 ± 0,42 HyAs(LHP) 6,21 ± 0,47 MeAs(LHP) 3,74 ± 0,17 PhAs(LHP) 0,487 ± 0,025 PhAs(sLHP) 790 ± 32
[231] É importante observar que o tratamento com HyAs(LHP) produziu um valor de IC50 (6,21 ± 0,47 mM) que foi 60% do valor obtido com ATO, mesmo que ele contendo a metade do número de átomos de arsênio do ATO. Isto sugere que a presença do peptídeo pode contribuir para a absorção de HyAs(LHP); no entanto, a menor estabilidade do complexo provavelmente influencia a toxicidade. O valor de IC50 obtido para MeAs(LHP) (IC50 : 3,74 ± 0,17 μM) foi de 60% do HyAs(LHP) e 37% do ATO, o que poderia ser atribuído à estabilidade extra deste composto, devido à presença do grupo metil no arsênio. O PhAs(LHP) provou ser o composto mais tóxico testado (IC50 : 0,487 ± 0,025 µM).
A presença do anel fenil também aumenta a estabilidade deste complexo. Ele foi vinte vezes mais tóxico que o ATO e sete vezes mais tóxico que PAO.
Curiosamente, o composto de arsênio com o peptídeo embaralhado (PhAs (sLHP), IC50: 790 ± 32 µM) provou ser 1600 vezes menos tóxico que PhAs(LHP) nas células K562, indicando que a configuração do peptídeo desempenha um papel importante na toxicidade do PhAs(LHP) em direção às células K562.
[232] O acetarsol foi testado até 1000 µM e não produziu 50% de inibição com 60,5% das células K562 ainda viáveis nesta concentração alta. A
1000 µM, o acetarsol tornou a solução ácida (o meio ficou amarelo, pH 6,87), de modo que é altamente provável que o baixo pH esteja contribuindo para a redução do número de células e não do próprio composto. Devido às mudanças de pH, concentrações mais altas não foram testadas para estabelecer uma IC50. O LHP e sLHP não foram tóxicos até 1000 µM nas células K562 e, portanto, não podem estar contribuindo para a toxicidade exibida pelos complexos As(LHP). A viabilidade celular de ambos os compostos permaneceu fechada ou acima de 100% em todos os ensaios MTT.
[233] Os valores de IC50 estabelecidos para cada composto foram comparados estatisticamente. O valor de PhAs (sLHP) foi estatisticamente superior a todos os outros compostos (P <0,0001). Devido ao grande valor de IC50 correspondente e o desvio padrão para PhA(sLHP) os resultados deste composto foram omitidos das comparações estatísticas entre os valores de IC50 dos outros compostos. A Tabela 1 6 contém os resultados da análise estatística.
[234] Os valores de IC50 para arsenito e AsI3 não foram estatisticamente diferentes entre si. Da mesma forma, os valores obtidos para PAO e MeAs(LHP) não foram estatisticamente diferentes. De modo importante, a análise revelou que as diferenças entre os valores de IC50 para todos os outros compostos foram estatisticamente significativas (P < 0,0001).
TABELA 16 RESULTADOS DA ANÁLISE ESTATÍSTICA COMPARANDO OS VALORES DE IC50 OBTIDOS A PARTIR DE ENSAIOS MTT APÓS 24 H DE TRATAMENTO EM CÉLULAS K562. Teste de comparação múltipla de Tukey Diferença média Q Significante P Arsenito vs AsI3 0,4867 1,997 Não Ns Arsenito vs PAO 15,23 62,50 Sim <0,0001 Arsenito vs ATO 8,887 36,46 Sim <0,0001 Arsenito vs HyAs(LHP) 12,42 50,96 Sim <0,0001 Arsenito vs MeAs(LHP) 14,89 61,10 Sim <0,0001 Arsenito vs PhAs(LHP) 18,14 74,45 Sim <0,0001 AsI3 vs PAO 14,75 60,51 Sim <0,0001 AsI3 vs ATO 8,400 34,47 Sim <0,0001
Teste de comparação múltipla de Tukey Diferença média Q Significante P AsI3 vs HyAs(LHP) 11,93 48,96 Sim <0,0001 AsI3 vs MeAs(LHP) 14,40 59,10 Sim <0,0001 AsI3 vs PhAs(LHP) 17,66 72,45 Sim <0,0001 PAO vs ATO -6,347 26,04 Sim <0,0001 PAO vs HyAs(LHP) -2,813 11,54 Sim <0,0001 PAO vs MeAs(LHP) -0,3433 1,409 Não Ns PAO vs PhAs(LHP) 2,910 11,94 Sim <0,0001 ATO vs HyAs(LHP) 3,533 14,50 Sim <0,0001 ATO vs MeAs(LHP) 6,003 24,63 Sim <0,0001 ATO vs PhAs(LHP) 9,257 37,98 Sim <0,0001 HyAs(LHP) vs MeAs(LHP) 2,470 10,13 Sim <0,0001 HyAs(LHP) vs PhAs(LHP) 5,723 23,48 Sim <0,0001 MeAs(LHP) vs PhAs(LHP) 3,253 13,35 Sim <0,0001 RESULTADOS DE MTT E VALORES DE IC50 PARA CÉLULAS HL-60
[235] Os valores de IC50 obtidos para arsenito, ATO, PAO, PhAs(LHP) e PhAs(sLHP) em células HL-60 na sequência de um tratamento de 24 horas são mostrados na FIG. 17. ATO produzido um valor de IC50 (7,0 ± 0,1 μM), um pouco menor do que a metade da obtida para arsenito (20 ± 1 μM) que é consistente com ATO contendo o dobro do número de átomos de arsênio como arsenito. O fato de não ser exatamente metade sugere que o ânion age através de um modo diferente nas duas linhagens de células; por um mecanismo diferente de absorção ou modo de ação quanto à toxicidade. O valor de IC50 obtido para PAO (1,5 ± 0,3 µM) é aproximadamente um décimo terceiro do arsenito e cerca de um quarto do valor de IC50 do ATO. O composto de interesse, PhAs(LHP), com um valor de IC50 de 0,5 ± 0,1 μM, mostrou três vezes maior toxicidade para células HL-60 do que o material de partida PAO, implicando que a presença de LHP pode auxiliar a absorção e/ou toxicidade nessas células. Isso é novamente suportado pelo resultado para o composto com peptídeo PhAs embaralhado (scrambled) (sLHP), que exibiu um valor de IC50 de 205 ± 4 μM, cento e trinta vezes o valor do PAO e mais do que quatro centenas de vezes que PhAs(LHP). A grande IC 50 sugere que a massa extra do peptídeo codificado impede provavelmente a absorção e, consequentemente, dificulta a atividade citotóxica. Foram realizados ensaios de absorção para explorar ainda mais esses resultados.
[236] Os peptídeos, LHP e sLHP, foram testados, mas não foram tóxicos até 1000 μM, com a viabilidade celular permanecendo próxima a 100% em todas as faixas de concentração testadas. O acetarsol, testado até 1000 μM, não conseguiu induzir a toxicidade necessária para obter um valor de IC50.
[237] Os valores de IC50 para cada composto foram estatisticamente comparados em todo o grupo e, de maneira não surpreendente, o valor para PhA(sLHP) foi estatisticamente diferente de todos os outros compostos de arsênio testados (P < 0,0001). Devido ao grande valor de IC50 para PhAs(sLHP) os resultados deste composto foram omitidos de outras análises estatísticas para os outros compostos. É importante ressaltar que a análise mostrou que as diferenças entre a maioria dos resultados foram estatisticamente significativas, conforme listado na Tabela 17. Verificou-se que o valor de IC50 do arsenito foi significativamente diferente de todos os outros compostos testados (P < 0,0001 para todos os outros compostos). ATO também foi encontrado como significativamente diferente de todos os outros compostos (P < 0,0001), mas PAO não foi considerado significativamente diferente de PhAs(LHP).
TABELA 17.
RESULTADOS DA ANÁLISE ESTATÍSTICA COMPARANDO OS VALORES DE IC50 OBTIDOS A PARTIR DE ENSAIOS MTT APÓS 24 H DE TRATAMENTO EM CÉLULAS HL-60. Teste de comparação múltipla de Tukey Diferença média Q Significante P Arsenito vs ATO 12,56 35,90 Sim <0,0001 Arsenito vs PAO 18,01 51,46 Sim <0,0001 Arsenito vs PhAs(LHP) 19,03 54,39 Sim <0,0001 ATO vs PAO 5,444 15,56 Sim <0,0001 ATO vs PhAs(LHP) 6,472 18,49 Sim <0,0001 PAO vs PhAs(LHP) 1,028 2,937 Não ns RESULTADOS DE MTT E VALORES DE IC50 PARA CÉLULAS KASUMI-1
[238] Todos os tratamentos com arsênio produziram curvas típicas de concentração-resposta. Os valores IC50 estão resumidos na Figura 18 para arsenito, ATO, PAO, PhAs(LHP) e PhAs(sLHP). Os peptídeos precursores, LHP e sLHP, não foram tóxicos até a concentração de 1000 μM nas células Kasumi-1. A percentagem de conversão de MTT permaneceu próxima ou acima de 100% nos três ensaios de MTT conduzidos para cada um desses peptídeos.
[239] O composto de arsênio menos tóxico ensaiado foi o PhAs(sLHP) (IC50 = 650 ± 0,6 μM) e foi significativamente menos tóxico do que todos os outros compostos de arsênio testados (Tabela 18). Esta grande valor IC50 indica que o peptídeo não segmentação coordenado não é reconhecido por estas células, e que a sua presença volumosa inibe a absorção nas células. O grande valor de IC50 para PhAs(sLHP) foi excluído da análise estatística dos valores de IC50 para outros compostos As para evitar que tal número elevado distorcesse a análise. O composto de interesse, PhAs(LHP) (IC50 = 1,4 ± 0,1 μM), foi 3,6 vezes mais tóxico do que PAO (IC50 = 5,1 ± 0,5 μM, P <0,001), indicando que o peptídeo provavelmente auxilia a absorção de As nessas células. ele foi aproximadamente quarenta vezes mais tóxico que ATO (61 ± 1 µM, P <0,001). O PhAs(LHP) foi cerca de 460 vezes mais tóxico que o composto análogo, PhAs (sLHP) (P <0,001), contendo o peptídeo embaralhado (scrambled), indicando que a configuração do peptídeo desempenha um papel importante na toxicidade do PhAs(LHP) para essas células.
[240] Esses resultados sugerem o potencial do uso de PhAs(LHP) para o tratamento da LMA, que atualmente exibe uma baixa taxa de cura (apenas 27% de sobrevida).
TABELA 18 RESULTADOS DA ANÁLISE ESTATÍSTICA COMPARANDO OS VALORES DE IC50 OBTIDOS A PARTIR DE ENSAIOS MTT APÓS 24 H DE TRATAMENTO EM CÉLULAS KASUMI-1.
Diferença P< Teste de comparação múltipla de Tukey média q Significante? Arsenito vs ATO 0,3738 0,1383 Não ns Arsenito vs PAO 56,11 20,75 Sim <0,0001 Arsenito vs PhAs(LHP) 59,87 22,14 Sim <0,0001
Diferença P< Teste de comparação múltipla de Tukey média q Significante? Arsenito vs PhAs(sLHP) -594,7 219,9 Sim <0,0001 ATO vs PAO 55,74 20,62 Sim <0,0001 ATO vs PhAs(LHP) 59,49 22,00 Sim <0,0001 ATO vs PhAs(sLHP) -595,0 220,1 Sim <0,0001 PAO vs PhAs(LHP) 3,753 1,388 Não ns PAO vs PhAs(sLHP) -650,8 240,7 Sim <0,0001 PhAs(LHP) vs PhAs(sLHP) -654,5 242,1 Sim <0,0001 RESULTADOS DE MTT E VALORES DE IC50 PARA CÉLULAS KARPAS 45
[241] Os valores de IC50 foram obtidos para arsenito, ATO, PAO, PhAs(LHP) e PhAs (sLHP) em células KARPAS 45 após um tratamento de 24 horas, e os resultados são mostrados na FIG. 19. O valor de IC50 para ATO (IC50: 15,1 ± 1,8 µM) foi surpreendentemente 23% do valor para o arsenito (IC50: 66,2 ± 2,6 µM), o que infere que o ânion age diferentemente ao ATO nessa linhagem celular, seja por modo de absorção ou modo de ação. O PAO (IC50: 5,1 ± 2,3 μM) foi de aproximadamente três vezes mais tóxico do que o ATO, indicando que a toxicidade é influenciada pela lipofilicidade que influencia a absorção deste composto. Alternativamente, o PAO é mais tóxico quando está na célula. O composto de interesse, PhAs(LHP) (IC50: 7,8 ± 1,2 µM), era cerca de duas vezes mais tóxico que o ATO, mas um pouco menos tóxico que PAO. Isso pode ser contextualizado quando comparado ao resultado do complexo peptídeo embaralhado - arsênio. O composto de arsênio com o peptídeo embaralhado (PhAs (sLHP), IC50: 248 ± 19 µM) provou ser 32 vezes menos tóxico que PhAs(LHP) nas células KARPAS 45, indicando que a configuração do peptídeo desempenha um papel importante na toxicidade do PhAs(LHP) contra estas células. Isso também mostra que o maior peso molecular (resultante do peptídeo) reduz a captação, a menos que o peptídeo esteja na configuração correta para atingir a via macropinocitótica.
[242] Acetarsol, foi testado até 1,000 μM e não conseguiu produzir um valor IC50. Devido às mudanças no pH do meio celular, concentrações mais altas não foram testadas. O LHP e o sLHP não foram tóxicos até a concentração de 1000 µM nas células KARPAS 45. A viabilidade celular de ambos os compostos permaneceu fechada ou acima de 100% em todos os três ensaios MTT.
[243] Os valores de IC50 dos compostos foram estatisticamente comparados entre o grupo. O valor de PhAs (sLHP) foi estatisticamente diferente a todos os outros compostos (P <0,0001). Devido ao grande valor de IC 50 correspondente e o desvio padrão para PhA(sLHP) os resultados deste composto foram omitidos das comparações estatísticas entre os valores de IC50 dos outros compostos. É importante ressaltar que a análise mostrou que as diferenças entre a maioria dos resultados foram estatisticamente significantes, conforme ilustrado na Tabela 19. Verificou-se que o valor de IC50 do arsenito foi significativamente diferente de todos os outros compostos testados (P < 0,0001). O valor de IC 50 associado com PAO foi significativamente mais baixo do que do ATO (P <0,001), mas não foi encontrado com sendo significativamente mais baixo do que do PhAs(LHP). O valor de IC50 de PhAs(LHP) foi significativamente menor que o do ATO (P <0,05) e arsenito (P <0,0001).
TABELA 19 RESULTADOS DA ANÁLISE ESTATÍSTICA COMPARANDO OS VALORES DE IC50 OBTIDOS A PARTIR DE ENSAIOS MTT APÓS 24 H DE TRATAMENTO EM CÉLULAS KARPAS 45.
Teste de comparação múltipla de Tukey Diferença média q Significante P Arsenito vs ATO 51,16 42,91 Sim <0,0001 Arsenito vs PAO 61,08 51,23 Sim <0,0001 Arsenito vs PhAs(LHP) 58,47 49,04 Sim <0,0001 ATO vs PAO 9,917 8,318 Sim <0,0001 ATO vs PhAs(LHP) 7,303 6,126 Sim <0,05 PAO vs PhAs(LHP) -2,613 2,192 Não ns RESULTADOS DE MTT E VALORES IC50 PARA CÉLULAS HEPG2
[244] A Figura 20 mostra os valores de IC50 que foram obtidos para arsenito, PAO, ATO e PhAs(LHP) de ensaios MTT após o tratamento das células HepG2 por 24 horas. ATO produzido um valor de IC50 de 52 ± 3 μM, o qual foi 1,7 vezes mais tóxico do que o arsenito com um valor de IC 50 de 89 ± 1 μM. O composto de interesse, PhAs(LHP), produziu um nível muito elevado de IC 50 de 978 ± 11 μM, e foi de cerca de dezenove vezes menos tóxico do que ATO (IC 50: 52 ± 3 μM) e mais do que mil e quinhentas vezes menos tóxico do que PAO (IC50: 0,63 ± 0,01 µM). Como o PAO é o material de partida para PhAs(LHP), esses resultados, mais uma vez, indicam fortemente que a conjugação com o peptídeo local da leucemia desempenha um papel importante na capacidade de direcionamento e toxicidade dos PhAs(LHP) para as células e implica novamente que o complexo de maior peso molecular, PhAs(LHP), não é tóxico para as células que não reconhecem o peptídeo.O acetarsol e LHP foram testados até a concentração de 1000 μM, mas não conseguiu produzir valores IC 50. Em vez disso, a viabilidade das células HepG2 permaneceu próxima ou acima de 100% em todos os três ensaios MTT para cada um desses compostos.
[245] Os valores de IC50 obtidos a partir de ensaios MTT após 24 h de tratamento das células HepG2 foram estatisticamente comparados entre o grupo e verificou-se que o valo para PhAs(LHP) foi significativamente diferente quando comparado com todos os outros compostos (P <0,0001).
VALORES DE IC50 DE CÉLULAS A549 DE CÂNCER DE PULMÃO HUMANO PARA PHAS(LHP)
[246] O valor de IC50 para PhAs(LHP) em células A549 é de 234 ± 5 μM. Mais uma vez isto demonstra comparativamente a baixa toxicidade do complexo contra células de tumor sólido humanas versus células de leucemia.
RESULTADOS DE MTT E VALORES DE IC50 PARA CÉLULAS DE TUMORES SÓLIDOS CH
[247] Os valores de IC50 obtidos para arsenito, PAO, ATO e PhAs(LHP) após 24 h de tratamento de células de tumor sólido CH são mostrados na FIG. 21. O composto de interesse, PhAs(LHP), produziu um elevado valor IC50 de 770 ± 12 μM, e foi de cerca de trinta e quatro vezes menos tóxico do que o ATO (IC50: 23,3 ± 0,9 μM) e mais de quinhentas vezes menos tóxico do que o PAO (IC50: 1,49 ± 0,03 μM). Isso sugere que o maior peso molecular do complexo PhAs(LHP) dificulta a captação celular; o que é esperado, uma vez que o peptídeo não deve ser reconhecido pelo receptor para a absorção pelo via macropinocítica destas células tumorais não humanas.
[248] O acetarsol foi testado até 1,000 μM e não conseguiu produzir um valor IC50. O LHP não foi tóxico até a concentração de 1000 µM em células de tumor sólido CH. A viabilidade celular de ambos os compostos permaneceu fechada ou acima de 100% em triplicatas de ensaios MTT.
[249] Os valores de IC50 para cada composto foram estatisticamente comparados em todo o grupo e o valor para PhA(LHP) foi significantemente maior do que todos os outros compostos de arsênio avaliados (P < 0,0001).
RESULTADOS DE MTT E VALORES IC50 PARA HPBMCS
[250] Os valores de IC50 obtidos para arsenito, ATO, PAO, PhAs(LHP) e PhAs(sLHP) em hPBMC após um tratamento de 24 horas são mostrados na FIG. 22. De modo interessante, o ATO produziu um valor de IC50 (81,7 ± 4,0 μM) cerca de duas vezes o obtido para arsenito (40,1 ± 7,7 μM) apesar de conter o dobro do número de átomos de arsênio como arsenito. Mais uma vez, isso sugere que o ânion age de modo diferente contra essas duas linhagens de células; por um mecanismo diferente de absorção ou modo de ação para a toxicidade. PAO foi o composto mais tóxico, com um valor de IC50 de 9,3 ± 3,3 μM, o que é cerca de um quarto do valor para o arsenito e cerca de um décimo do valor para ATO.
[251] De modo mais importante ainda, o composto de interesse, PhAs(LHP), produziu um elevado valor de IC50 de 495 ± 6 μM. Isso parece confirmar a capacidade de direcionamento do peptídeo em direção às células de leucemia sobre células saudáveis.
[252] Mais uma vez, o acetarsol e LHP foram testados até a concentração de 1000 μM, mas não conseguiu produzir valores IC50.
[253] Os resultados das análises estatísticas realizadas nos valores de IC50 obtidos após o tratamento de hPBMC por 24 horas estão listados na tabela
20. Verificou-se que o valor para cada composto foi significativamente diferente para cada um dos outros valores (P <0,0001).
TABELA 20 RESULTADOS DA ANÁLISE ESTATÍSTICA COMPARANDO OS VALORES DE IC50 OBTIDOS A PARTIR DE ENSAIOS MTT APÓS 24 H DE TRATAMENTO EM HPBMC. Teste de comparação múltipla de Tukey Diferença média Q Significante P Arsenito vs ATO -41,65 13,33 Sim <0,0001 Arsenito vs PAO 30,74 9,837 Sim <0,0001 Arsenito vs PhAs(LHP) -454,6 145,5 Sim <0,0001 ATO vs PAO 72,39 23,17 Sim <0,0001 ATO vs PhAs(LHP) -413,0 132,2 Sim <0,0001 PAO vs PhAs(LHP) -485,4 155,3 Sim <0,0001 COMPARAÇÃO DOS VALORES DE IC50 DOS COMPOSTOS DE ARSÊNIO TESTADOS NAS
VÁRIAS LINHAGENS DE CÉLULAS
[254] A Tabela 21 mostra um resumo dos valores IC50 obtidos a partir de ensaios MTT após 24 h de tratamento com os quatro compostos de arsênio especificados em seis linhagens de células diferentes. Os valores de IC 50 para arsenito dentre as sete linhagens de células variaram entre 18 0,6 ± 0,5 μM para células K562 e 89 ± 1 μM para células HepG2. Parece não haver diferença aparente entre os tipos de células de leucemia e não leucêmicas após o tratamento com arsenito. Surpreendentemente, o arsenito é menos tóxico para as células HepG2 de rápido crescimento do que para hPBMC estáticas.
[255] O ATO produziu valores de IC50 que variam de 7,0 ± 0,1 μM para células HL-60 a 82 ± 4 μM para hPBMC. Uma vez que hPBMC são células estáticas, as diferenças nesses valores não são surpreendentes, pois o arsênio é bem conhecido pela sua interação com diversas moléculas da divisão celular, por exemplo, a tubulina e estes alvos não estão disponíveis em células estáticas. O
ATO exibiu uma toxicidade ligeiramente maior para células K562, células HL-60 e células KARPAS 45 (9,7 ± 0,2 μM, 7,0 ± 0,1 μM, e 15 ± 2 μM, respectivamente). A toxicidade foi significativamente menor em relação às células Kasumi-1 (61 ± 1 µM), células HepG2 (52 ± 3 µM) e hPBMC (82 ± 4 µM).
[256] O PAO produziu baixos valores de IC50 que variam entre 0,63 ± 0,01 μM e 9 ± 3 μ M. Essa alta toxicidade para todos os tipos de células está provavelmente relacionada ao aumento da lipofilicidade, mencionado anteriormente, devido à presença do grupo fenila.
[257] Todos os valores de IC50 obtidos para o complexo de peptídeo codificado por arsênio, PhAs(sLHP), eram muito grandes, variando de 2 05 ± 4 μM em células HL-60 a 960 ± 10 μM em células HepG2 (Tabela 21).
TABELA 21 COMPARAÇÃO DOS VALORES DE IC50 (ΜΜ) OBTIDOS A PARTIR DE ENSAIOS MTT
DOS COMPOSTOS DE ARSÊNIO ESPECIFICADOS EM LINHAGENS DE CÉLULAS APÓS 24 HORAS DE TRATAMENTO LHP† Arsenito ATO PAO PhAs (LHP) PhAs alvo (sLHP) K562 *** 18,6 ± 0,5 9,7 ± 0,2 3,4 ± 0,4 0,49 ± 0,02 790 ± 30 Leucemia Céls de HL-60 ** 20 ± 1 7,0 ± 0,1 1,5 ± 0,3 0,5 ± 0,1 205 ± 4 Kasumi-1 ? 61,2 ± 0,6 61 ± 1 5,1 ± 0,5 1,4 ± 0,1 660 ± 10 KARPAS 45 ? 66 ± 3 15 ± 2 5±2 8±1 250 ± 20 HepG2 Não 89 ± 1 52 ± 3 0,63 ± 0,01 978 ± 11 960 ± 10 leucêmicas Céls. não A549 Não 234 ± 5 tumor sólido CH Não 26,1 ± 0,8 23,3 ± 0,9 1,49 ± 0,03 770 ± 12 hPBMC Não 40 ± 8 82 ± 4 9±3 495 ± 6 665 ± 8 † LHP alvo: *** alvo altamente reconhecido, ** alvo reconhecido, ? não conhecido.
IC50<1 1<IC50<10 10<IC50<100 100<IC50<1000
[258] A toxicidade altamente seletiva (como representado graficamente na FIG. 23) de PhAs(LHP) em relação às células de leucemia, em comparação com células não leucêmicas, é digna de nota. O PhAs(LHP) exibe um valor de IC50 na faixa nM para ambas células leucêmicas mieloides, K562 e HL-60, com valores de IC50 aproximadamente 1000 vezes maiores em hPBMC, aproximadamente 1500 vezes maiores em células de tumor sólido CH, e cerca de 2000 vezes maiores em células HepG2 e valores 470 vezes maiores em células A549, indicando o potencial desse composto como tratamento para leucemias mieloides. O resultado para as células Kasumi-1 é particularmente promissor.
Embora PhAs(LHP) não exibe um valor de IC50 na faixa nM em contra células leucêmicas linfoides KARPAS 45, o valor de IC50 é aproximadamente 64 vezes maior em hPBMC, indicando uma boa janela terapêutica para esse composto, de modo que também pode ser um potencial tratamento para leucemias de células T.
[259] As grandes diferenças entre os resultados das células leucêmicas de câncer e as células fibroblásticas podem ser uma indicação de que os PhAs(LHP) seriam menos tóxicos para os tecidos. Surpreendentemente, o valor de IC50 obtido para as células HepG2 não leucêmicas de crescimento rápido foi muito maior que o valor obtido para células hPBMC estáticas, abrindo a possibilidade de que o PhAs(LHP) diminui os efeitos colaterais comumente associados à toxicidade nos tratamentos com arsênio para células de crescimento rápido. Ensaios em animais e análises de amostras de tecido serão necessários para examinar melhor esta hipótese.
RESUMO DA CAPTAÇÃO DE AS APÓS 24 H DE TRATAMENTO COM DIFERENTES
TIPOS DE CÉLULAS
[260] A Figura 24 resume as concentrações celulares de As associadas aos diferentes tipos de células após tratamento de 24 horas com os vários compostos de As (1,5 μM de As). As linhagens de células de leucemia, K562, HL-60, Kasumi-1 e KARPAS 45, estão representadas em vermelho (mais claro dos blocos preenchidos), e os tipos de células não leucêmicas estão representados em preto (sombreamento mais escuro), com o câncer células aderentes, HepG2 com faixas diagonais, e células normais, hPBMC, em preto sólido.
[261] Após o tratamento com PhAs(LHP), concentrações significativas de As celular (P <0,001) foram detectadas nas quatro linhagens de células de leucemia (K562, HL-60, Kasumi-1 e KARPAS 45), mas, o mais importante, não houve detecção de concentrações de As celulares associadas às células malignas não alvos, HepG2 ou células normais hPBMC, não alvos e não cancerosas. A concentração de As celular resultante do tratamento com PhAs(LHP) foi maior nas células Kasumi-1. Essa concentração foi 1,2 vezes maior que a concentração de As celular associada às células K562 (P <0,05), 1,4 vezes maior que a concentração nas células HL-60 (P <0,001) e 4,0 vezes maior que a concentração nas células KARPAS 45 (P <0,001).
[262] O tratamento com PhAs(sLHP) não resultou em captação detectável de As em nenhum dos tipos de células testados, indicando que a captação do peptídeo As era altamente dependente da sequência de aminoácidos do peptídeo.
[263] As concentrações celulares de As após o tratamento com arsenito foram todas muito pequenas (< 4 × 10-14 g/célula). A maior concentração de As celular, associada às células KARPAS 45, foi 2,2 vezes maior que a menor quantidade, associada às células HepG2. A concentração nas células HepG2 foi significativamente menor do que a observada em todos os outros tipos de células (P <0,01). Também não houve tendência identificável para hPBMC.
[264] Curiosamente, o tratamento com ATO resultou em maior captação nas células de leucemia e nas células hPBMC normais do que a linhagem de células de câncer aderente, HepG2. As concentrações celulares de As associadas às células K562, HL-60 e hPBMCs foram semelhantes (P > 0,05).
A maior concentração celular de As foi encontrada nas células Kasumi-1, significativamente maior que as concentrações celulares de As associadas a cada um dos outros tipos de células (P <0,001). Ela foi 5,5 vezes maior que a concentração de As celular associada às células HepG2.
[265] Grandes variações foram evidentes nas concentrações celulares de As após o tratamento com PAO, com as células HepG2 agora exibindo uma concentração de As significativamente maior que todos os outros tipos de células (P <0,001). Essa concentração foi 2,2 vezes maior que a concentração celular de As associada às hPBMCs tratadas com PAO, 3,8 vezes maior que as células K562, 3,9 vezes maior que as células Kasumi-1, 4,8 vezes maior que as células KARPAS 45 e 7,6 vezes maior do que as células HL-60. Foi interessante que a segunda maior concentração celular de As tenha sido exibida pelas hPBMCs e que essa fosse significativamente maior que as concentrações celulares de As associadas às linhagens de células de leucemia (P <0,001).
INVESTIGAÇÕES SOBRE O DESTINO DE PHAS(LHP) EM CÉLULAS DE LEUCEMIA MÉTODO
[266] As linhagens de células, K562 e HL-60, foram obtidas e mantidas como descrito anteriormente. Glutaraldeído (solução a 25%), resina de montagem de baixa viscosidade de Spurr, grelha de localização de ouro de 3 - mm, e azul de toluidina foram adquiridos a partir de Proscitech (Kirwan, Austrália).
As células em cortes finos para microscopia foram preparadas para análise por microssonda SR XRF usando procedimentos documentados anteriormente.
Resumidamente, as células foram tratadas em frascos de cultura de células (75 cm 2), quer com IMDM (para as células de controle, 4 h ou 24 h) ou PhAs(LHP) (10 μ M em IMDM, 4 h, ou 24 h). As células foram lavadas com PBS (2 vezes) usando centrifugação e o sedimento celular final foi fixado em gluteraldeído (1 mL, 2% v/v em PBS) por 2 h à temperatura ambiente; e desidratado em etanol (30% × 2,50% × 2,70% × 2,80% × 2,90% × 2,95% × 2,100% × 4). A infiltração foi alcançada balançando as células em 50% de etanol/50% de resina de Spurr durante a noite e substituindo-a por 100% de resina de Spurr (× 2 em 2 dias) para garantir a remoção de todos os vestígios de água. No dia final, as células foram embebidas em 100% de resina de Spurr, centrifugadas (8000 g, 1 h) e curadas a 60ºC durante a noite em uma cápsula de Beem. Cortes finos (1 µm) do sedimento celular foram cortados usando um ultramicrôtomo (Leica EM UC7). As secções finas foram coradas com azul de toluidina antes da montagem em membranas de nitreto de silício.
[267] As grelhas de localização de ouro foram fixadas em suportes cinemáticos projetados para caber no microscópio óptico (microscópio visual/fluorescência Epica/Leica DMXRE) e na microssonda de raios X (2-ID-D).
As micrografias ópticas e coordenadas XY foram obtidas para localizar células adequadas para análise. As células que exibiam uma aparência intacta, um núcleo claramente definido e estavam localizadas afastadas de outras células e detritos celulares foram escolhidas para a análise.
[268] O microssonda SR- XRF foi realizado no feixe 2-ID-D no Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory (Lemont, IL, EUA). O feixe de raios-X de 1,9 keV foi focalizado para um tamanho de ponto de 0,3 × 0,3 µm 2 usando duas placas de zona. As amostras foram alojadas em uma atmosfera de hélio e as distribuições dos elementos a partir P (2,1 k eV) para As (11,9 keV) foram mapeadas por varredura (raster scanning) da amostra em passos de 0,3 μm, com o auxílio de um estágio motorizado XYZ. Os raios X fluorescentes foram detectados usando um tempo de permanência de 2,5 s/pt e um detector de derivação de silício Vortex EM por energia dispersiva (Hitachi High-Technologies Science America, Northridge, CA). Os mapas de distribuição elementar foram processados usando o pacote de software MAPS versão 1.7.3.02 (S. Vogt, Advanced Photon Source). Conversão de intensidades de fluorescência elementar de densidades absolutas em microgramas por centímetro quadrado (μg/cm 2) foi realizada por comparação com intensidades de fluorescência de raios-X com os de filmes finos padrão, NBS- 1832 e NBS-1833 (NIST, Gaithersburg, MD, EUA).
RESULTADOS
[269] A Figura 25 mostra os espectros da borda K obtidos para o padrão PhAs(LHP) e as células K562 tratadas com PhAs(LHP) (24 h). A energia constante da borda indica que o As intracelular permanece como As(III) durante as 24 h. A alteração na região da pós-borda sugere alguma modificação na ligação As-S. Por exemplo, isso poderia refletir a dissociação do peptídeo de tropismo de leucemia dos PhAs e sua subsequente ligação a outras biomoléculas nas células.
[270] A Figura 26 mostra os espectros da borda K obtidos para o padrão PhAs(LHP) e as células HL-60 tratadas com PhAs(LHP) (24 h). As alterações espectrais observadas na amostra de células K562 tratadas com PhAs(LHP) também são evidentes nas células HL-60, em que a energia da borda permanece constante. Isso mostra que o PhAs(LHP) permanece como As(III) durante o período de 24 horas. A energia da borda também é consistente com o átomo As ligado às porções de enxofre, mas a queda pós-borda não é tão pronunciada quanto a observada no padrão PhAs(LHP), mais uma vez sugerindo possíveis reações de troca de ligantes com outras biomoléculas (contendo enxofre) na célula.
[271] A Figura 27 mostra as imagens de micrografia das amostras de células K562 de finos cortes corados com azul de toluidina antes da análise XRF. As células na amostra de células de controle K562 (Figura 27a) são geralmente esféricas com um núcleo claramente definido e intacto. Cada ponto de tempo de tratamento mostra o estresse e morte das células em resposta ao tratamento com PhAs(LHP) (10 μM). Após 4 horas de tratamento (Figura 27b), a maioria das membranas celulares parece intacta, embora haja evidência clara de estresse celular com fragmentação do núcleo. A FIG. 27c, que descreve o tratamento de 24 h (10 μM), mostra claramente a ruptura da membrana celular e material nuclear fragmentado/disperso.
[272] Três a quatro células foram fotografadas para cada uma das condições de tratamento e (células K562 e HL-60) e uma imagem representativa para cada é fornecida nos dados seguintes.
[273] Os mapas de distribuição elementar Microssonda SR-XRF obtidos a partir de seções finas das células K-562 tratadas com PhAs (10 µM, 4 h e 24 h) são mostrados na Figura 28. As concentrações de P, S e Zn, que são significativamente mais abundantes que As, são usadas para definir a região celular. P e Zn são marcadores do núcleo devido à sua presença no esqueleto de DNA fosfato e nas proteínas de transcrição de DNA (proteínas dedos de zinco), respectivamente. As células K-562 de controle (Figura 28a) não continham níveis significativos de As, enquanto que as células tratadas com PhAs(LHP) por 4 e 24 h (28b e 28c, respectivamente) continham As de maneira significativa em toda a célula, com evidências de acúmulo no núcleo celular.
[274] A Figura 29a mostra a micrografia de luz correlativa do corte fino corada com azul de toluidina de células K-562 que foram expostas ai PhAs(LHP) (10 µM, 4 h) enquanto a Figura 29b mostra os mapas SR-XRF correspondentes para P, Zn e As e o mapa de colocalização dos três elementos.
O mapa de colocalização de As com S não é mostrado devido ao uso do corante azul de toluidina, que contém S, e consequentemente afeta a concentração intracelular de S.
[275] As Figuras 28 e 29 indicaram que As entrou no núcleo onde interage potencialmente com o DNA ou com as proteínas associadas à replicação do DNA, conforme observado pela predominância de azul no mapa de colocalização (Figura 29b). As áreas dominadas por fósforo são consistentes com as regiões de heterocromatina, conforme relatado na literatura. O arsênio, como é evidente pela região azul distinta no mapa de colocalização, está presente em todo o núcleo. Uma inspeção cuidadosa revela que As está presente no nucléolo e nas regiões de heterocromatina e eucromatina (Figura 29b). A última área coincide com o DNA menos densamente compactado onde ocorre a transcrição, permitindo que o As interaja com as áreas ricas em enxofre comuns nas proteínas de transcrição. A análise estatística comparando as concentrações dos elementos endógenos no citoplasma e no núcleo não resultou em tendências ou alterações específicas como um resultado do tratamento com PhAs(LHP) para as células K562.
[276] A Figura 30 mostra as imagens de micrografia das células HL- 60 tratadas com controle e PhAs(LHP) (10 μM, 4 he 24 h). As células de controle (Figura 30a) estavam tipicamente arredondadas com membranas celulares e núcleos bem definidos e grandes. Após o tratamento com PhAs(LHP) durante 4 h (Figura 30b), o sofrimento celular é evidente nas células HL-60, em que a maioria das células não mais está arredondada, mas tem uma forma irregular juntamente com os núcleos de muitas das células também se tornando de forma irregular. O tratamento das células HL-60 por 24 horas com PhAs(LHP) (Figura 30c) resultou em um alto grau de degradação celular com evidência de morte celular.
[277] A Figura 31 ilustra as imagens de micrografia disponíveis e os mapas elementares SR-XRF correspondentes para os cortes finos corados com azul de toluidina para as células HL-60 de controle e tratadas com PhAs(LHP) (10 μ M, 4 h e 24 h). Assim como nas células K562, não houve As significante nas células de controle (Figura 31a). Entretanto, em contraste com as células K562, existem apenas pequenas localizações de As evidentes nas células HL-60 após o tratamento com PhAs(LHP) durante 4 h (Figura 31b), que parece estar associado à região densa de DNA, mais provavelmente ao nucléolo. As significativo foi evidente nas células HL-60 tratadas com PhAs(LHP) por 24 h (Figura 31c, Figura 32b), em que o núcleo contém claramente um maior acúmulo de As do que o resto da célula. A região As intensa localizada na porção inferior esquerda da célula correlacionou-se com uma região intensa de Zn e uma região menos intensa de P, o que pode ser indicativo de proteínas de transcrição.
[278] Assim como as células K562, a análise estatística comparando as concentrações dos elementos no citoplasma e o núcleo das células HL-60 não resultou em tendências ou alterações específicas que pudessem ser atribuídas ao tratamento com PhAs(LHP).
SÍNTESE DE ANÁLOGOS DO ÓXIDO DE FENILARSINA (PARA-SUBSTITUÍDO) COMO PRECURSORES PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS COMPOSTOS DE PEPTÍDEO DE TROPISMO PARA LEUCEMIA - FENILARSÊNICO (XPHAS(LHP)) MÉTODOS PRODUTOS QUÍMICOS.
[279] Todos os reagentes disponíveis comercialmente utilizados neste projeto eram de grau analítico ou superior. A água Milli-Q (18,2 Ω, Millipore) foi usada como solvente, para diluições e para preparar soluções tampão. Ácido p- arsanílico (≥99%) e carvão ativado (não tratado, granular, malha 20/08) foram adquiridos da Sigma Aldrich (Austrália). Ácido clorídrico (HCl, 32%), metanol (MeOH, > 99,7%), éter dietílico (Et2O, > 99%), clorofórmio (CHCl3, > 99,5%), etanol (EtOH, > 99,5%), ácido fórmico (99%), iodo (I2, > 99,5%) e hidróxido de sódio (NaOH, > 97,5%) foram todos obtidos da Ajax Finechem (Austrália). A trifenilfosfina (PPh3, 99%) foi adquirida da Acros Organics (Austrália), enquanto que o nitrito de sódio (NaNO2, > 99,8%) foi adquirido da Thermo Fisher (Austrália).
O iodeto de potássio (KI, > 99%) foi adquirido da Chem Supply (Austrália). O fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4, > 99%) e di-hidrogenofosfato de sódio di- hidratado (NaH2PO4.2H2O, ≥ 99%) foram adquiridos da Sigma Aldrich (EUA).
PREPARAÇÃO DE TAMPÃO
[280] O tampão fosfato (pH 8, 0,1 M, 100 mL) foi preparado usando os volumes apropriados da solução estoque A (NaH2PO4.2H2O, 0,2 M) e solução estoque B (Na2HPO4, 0,2 M) listado na Tabela 22. O pH foi medido e/ou confirmado com o kit Mettler Toledo Sever Compact S220-Micro após a calibração com tampões técnicos da Mettler Toledo (pH 4,0, 7,0 e 9,2) e ajustado pela adição gota a gota da solução A ou da solução B, conforme necessário, pendente Medição do pH, antes da diluição para 100 mL com água Milli-Q (concentração final de 0,1 M).
TABELA 22
COMBINAÇÕES DE SOLUÇÕES ESTOQUE PARA TAMPÕES FOSFATO EM PH ESPECÍFICO* pH Solução A (mL) Solução B (mL)
8.0 2,65 47,35 * pH determinado a 25ºC.
ANÁLISE ESI-MS DA FORMAÇÃO DE COMPLEXOS XPHAS(LHP)
[281] A coordenação dos precursores mencionados acima (NH2PhAs(III), ClPhAs(V) ou IPhAs(V), Seção 1.3.3) com LHP (descrito na Seção
1.3.5) foram monitorizados através de ESI-MS para otimizar as condições de reação e, posteriormente, a formação de produto. As reações foram realizadas sob uma atmosfera de N2 usando as condições descritas na Seção 1.3.5. Nos tempos especificados, uma alíquota foi removida e a solução foi diluída (50 ×) em ácido fórmico a 0,1% para análise por espectrometria de massa de ionização por eletropulverização (ESI-MS).
CONDIÇÕES OPERACIONAIS PARA ESI-MS
[282] Todos os espectros de massa foram coletados com um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo Micromass Quattro Micro (Micromass, Reino Unido) empregando ionização por eletropulverização no modo de íon positivo. O nitrogênio seco aquecido foi usado como gás de nebulização e secagem para todos os experimentos. Uma tensão capilar de 3,00 kV, tensão de cone de 35 V, temperatura da fonte de 80ºC, temperatura de dessolvatação de 120ºC e fluxo de gás de dessolvatação de 400 L/h foram empregados para coletar os espectros.
[283] A fonte foi lavada completamente com água Milli-Q antes da injeção da amostra até o espectro se assemelhar ao espectro basal. Cada amostra foi então injetada a uma velocidade de fluxo de 20 µL/min usando uma seringa de 1 mL (SGE Analytical Science, Austrália). A aquisição de dados foi realizada no modo contínuo e, normalmente, 50 varreduras foram somadas para obter espectros representativos. Os espectros foram processados com o software MassLynx (Waters, 2003). A subtração de fundo foi realizada com uma ordem polinomial de 1 com 40% abaixo da curva e suavizada com o algoritmo de Savitsky-Golay. Os espectros do centroide foram então gerados com a função central (Topo, área), e cada pico foi anotado com sua respectiva intensidade e razão m/z.
PURIFICAÇÃO DE COMPLEXOS XPHAS(LHP) HPLC ANALÍTICO
[284] Um sistema de HPLC analítico Shimadzu com controlador de sistema Prominence-i LC2030C, injetor automático e unidade de cromatografia líquida foi usado para a purificação de complexos XPhAs(LHP). Uma coluna de Waters Sunfire C18, 5 μm, 4,6 x 250 mm (Nº: 186002560) foi utilizada após equilíbrio com H2O (0,1% de TFA) durante 20 minutos. Um gradiente linear de eluição com H2O/ACN (TFA a 0,1%), foi aplicado a partir de 100% de H 2O até 100% de ACN, utilizando uma velocidade de fluxo de 1 mL/min. Todos os solventes foram desgaseificados por filtração e sonicação antes do uso. As amostras foram filtradas através de um filtro de 0,20 μm (Sartorius) antes da análise. A solução (1 mL) de XPhAs(LHP), preparada de acordo com as condições ótimas de reação (conforme determinado a partir dos resultados do desenvolvimento do método), foi injetada na coluna e analisada afim de determinar os tempos de eluição de cada espécie em solução. Cada um dos precursores de As relevantes (NH2PhAs(III), ClPhAs(V) ou IPhAs(V)), também foram analisados para estabelecer os tempos de eluição dos mesmos.
HPLC PREPARATÓRIA
[285] Com base no perfil de eluição obtido a partir da HPLC analítica, a purificação dos produtos da reação X-PhAs(LHP) foi realizada usando
HPLC preparativa empregando um amostrador automático Shimadzu SIL-10AP, cromatografia líquida preparativa Shimadzu LC-20AP, válvula quaternária Shimadzu FCV-200AL, detector de matriz de diodos Shimadzu SPD-M20A, unidade de desgaseificação Shimadzu DGU-20A5R, módulo de barramento de comunicações Shimadzu CDM-20A, e Software LabSolutions e uma coluna Luna 5u C18(2) (250 × 21,20 mm, 5 mícrons, Phenomenex). A coluna foi equilibrada com H2O (0,1% de TFA, 20 min). Uma solução (6 mL) de XPhAs(LHP), preparada de acordo com as condições ótimas de reação (conforme determinado a partir dos resultados do desenvolvimento do método), foi injetada na coluna e separada usando os gradientes de eluente detalhados na Tabela 23 e Tabela 24. A velocidade de fluxo foi mantida em 15 mL/min e as frações foram detectadas em λ 254 nm. As principais frações foram coletadas e caracterizadas por ESI-MS (condições operacionais conforme listado anteriormente).
TABELA 23
GRADIENTE ELUENTE DA HPLC PREPARATIVA DE FASE REVERSA UTILIZADO PARA PURIFICAR NH2PHAS(LHP). Tempo (min) Solvente A (%) Solvente B (%) 0,01 100 0 26,00 50 50 TABELA 24
GRADIENTE ELUENTE DA HPLC PREPARATIVA DE FASE REVERSA UTILIZADO PARA PURIFICAR CLPHAS(LHP) E PHAS(LHP). Tempo (min) Solvente A (%) Solvente B (%) 0,01 100 0 30,00 57 43
SECAGEM DOS COMPLEXOS DE AS
[286] Para se obter compostos purificados, as frações de HPLC foram secas utilizando um liofilizador Alpha 1-2 LDplus (Christ). CARACTERIZAÇÃO ESPECTROSCÓPICA DE ABSORÇÃO DE RAIOS-X DOS PRECURSORES (NH2PHAS(III), CLPHAS(V) E IPHAS(V)) E OS COMPLEXOS
PEPTÍDICOS (XPHAS(LHP))
[287] A espectroscopia de absorção de raios X (XAS) foi empregada para determinar o estado de oxidação do arsênio e os átomos diretamente coordenados ao As nos complexos peptídicos e precursores.
PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE XAS
[288] As análises de XAS foram realizadas nos compostos de fenilarsênicos sintetizados, complexos XPhAs(LHP) e padrões de As. As amostras sólidas foram preparadas misturando cuidadosamente a amostra com celulose sólida (Sigma Aldrich). A proporção de diluição foi determinada inicialmente usando o programa XAFSmass, embora tenha sido verificado que uma diluição adicional de 10x era ideal para análise no modo de fluorescência. As misturas resultantes foram montadas em suportes de amostras de alumínio com 1 mm de espessura e seladas com fita Kapton. Cada amostra foi rapidamente submersa em nitrogênio líquido e transferida para o criostato de hélio líquido, onde foi analisada a 10ºK. Os espectros de absorção de raios-X foram coletados para os seguintes padrões As: PAO, bis-glutationa fenilarsênico (PhAs(GS)2), ácido p-arsanílico e arsenito.
[289] Para a preparação de PhAs(GS)2, o PAO (0,048 g) foi inicialmente dissolvido em água Milli-Q (2 mL) por aquecimento durante a noite (80ºC). A solução resultante foi então arrefecida até à temperatura ambiente antes da sua adição à glutationa (GSH) (0,26 g). O tubo de reação foi lavado com nitrogênio e deixado para reagir durante a noite, tipicamente por 16 h. Foi adicionado metanol (10 mL) para precipitar o produto, o qual foi separado por centrifugação (1700 rpm, 10 minutos, Heraeus Labofuge 300). O sólido resultante foi seco em temperatura ambiente.
CONDIÇÕES DO INSTRUMENTO EXPERIMENTAL XAS E ANÁLISE DE DADOS
[290] A análise da amostra XAS foi realizada no The Australian Synchrotron (AS, XAS beamline, Clayton, VIC). A energia do feixe foi de ~ 3,0
GeV e a corrente do feixe foi de 200 mA. Um monocromador de corte de canal Si(311) controlava a energia do feixe. Todos os espectros foram registrados no modo de fluorescência a ~ 10ºK (mantido com um criostato He de ciclo fechado, OPTIPTTL4K Optistat® PTR, Oxford Instruments). Os espectros foram coletados com um detector de fluorescência GE de 100 elementos (Eurysis) e uma largura de fenda vertical de 0,5 mm.
[291] Os espectros XAS na borda K do arsênio foram coletados nas seguintes faixas de energia: região pré-borda 11667-11847 eV (etapas de 10 eV); região XANES 11847-11930 eV (etapas de 0,25 eV); e região EXAFS 11930- 12468 eV (etapas de 0,025 Å-1 no espaço k até 13,0 Å-1).
[292] Um padrão de folha de ouro sólida foi analisado simultaneamente no modo de transmissão a jusante da amostra para calibração, por meio da qual a energia do primeiro pico do primeiro espectro derivado (correspondente à energia da borda) foi definida como 11920,0 eV. Normalmente, foram coletadas 3-5 varreduras para todas as análises de amostra. O processamento dos dados foi realizado com o EXAFSPAK. O módulo DATFIT do EXAFSPAK calculou a análise de regressão linear múltipla. A subtração e normalização do fundo foram obtidas com BACKSUB, enquanto o FEFF 8.2 foi empregado para calcular as funções de amplitude e fase teóricas para o ajuste dos dados EXAFS.
SÍNTESE DE P-AMINOFENILDICLOROARSINA (NH2PHAS(III))
[293] A redução do composto As(V), ácido p-arsanílico, para As(III) foi realizada a fim de facilitar a ligação do peptídeo através da troca com Cl. O método foi adaptado dos procedimentos relatados por Heredia-Moya e Kirk ((2008) Bioorg. Med. Chem. 16, 5743-5746), e Ioannou e Tsivgoulis ((2015) Main Group Chem. 14, 237-253). Resumidamente, dissolveu-se ácido p-arsanílico (0,2535 g, 1,00 mmol) em metanol desaerado (1 mL) e HCl concentrado (0,68 mL). Foram adicionados trifenilfosfina (0,4170 g, 1,50 mmol) e iodo (0,0123 g, 0,05 mmol), resultando em uma suspensão vermelha após agitação. A mistura resultante foi agitada durante 4 h à temperatura ambiente para produzir uma solução amarela clara. O produto amarelo, p-aminofenildicloroarsina (NH2PhAs(III)), foi precipitado pela adição de éter (1 mL), e o sólido foi coletado. A extração com uma mistura de clorofórmio (2 mL) e éter (2 mL) foi usada para separar NH2PhAs(III) a partir do produto secundário oxidado, o óxido de trifenilfosfina.
SÍNTESE DE ÁCIDO P-CLOROFENILARSÔNICO (CLPHAS(V))
[294] O ácido p-clorofenilarsônico (ClPhAs(V)) foi preparado pela diazotização do ácido p-arsanílico e subsequente troca com Cl. O ácido p- arsanílico (0,217 g, 1,00 mmol) foi dissolvido em água Milli-Q (0,2 mL) e HCl concentrado (0,12 mL). Após dissolução completa, foi adicionado mais HCl concentrado (0,13 mL). A solução foi arrefecida a 0-5ºC para criar uma suspensão e foi adicionado gelo (0,1 g) ao recipiente. Uma solução de NaNO2 (0,074 g, 1,07 mmol) em água Milli-Q (0,2 mL) foi adicionada gota a gota na solução acidificada com agitação vigorosa, resultando uma solução laranja. Após a completa adição de NaNO2 a solução da reação se tornou amarelo claro. O recipiente da reação foi aquecido até 50ºC e mantido nessa temperatura durante cerca de 2 h, resultando na evolução de gás N2. A solução tornou-se laranja escura e um precipitado ficou evidente. A suspensão foi então refrigerada durante a noite. O sólido resultante foi isolado e dissolvido em NaOH quente (10%, 0,6 mL). Esta solução foi filtrada e acidificada com HCl para se obter ClPhAs(V).
SÍNTESE DE ÁCIDO P-IODOFENILARSÔNICO (LPHAS(V))
[295] O ácido p-iodofenilarsônico (lPhAs(V)) foi preparado pela diazotização do ácido p-arsanílico e subsequente troca com l. O ácido p-arsanílico (0,217 g, 1,00 mmol) foi dissolvido em uma mistura de água Milli-Q (0,2 mL) e HCl concentrado (0,12 mL). Após dissolução completa, foi adicionado mais HCl concentrado (0,13 mL). A solução foi arrefecida a 0-5ºC e foi adicionado gelo (0,1 g) ao recipiente. Uma solução de NaNO2 (0,074 g, 1,07 mmol) em água Milli-Q (0,2 mL) foi adicionada gota a gota na solução acidificada com agitação vigorosa.
A solução foi deixada em gelo por 3 minutos, em seguida uma solução resfriada de iodeto de potássio (1,076 g, 0,00648 mol) em água MilliQ (1,5 mL) foi adicionada lentamente. O recipiente da reação foi deixado em repouso por 3 minutos à temperatura ambiente e então aquecido a 45ºC até a evolução do gás cessar (aproximadamente 3-4 h). A suspensão foi refrigerada durante a noite e um sólido marrom foi coletado e lavado com água MilliQ fria. O sólido foi dissolvido em etanol (1,4 mL) e foi adicionado carvão ativado. A mistura foi diluída com água quente (0,6 mL), levada a ebulição e filtrada enquanto quente. Foi adicionada água fria (0,8 mL) e os cristais laranja/marrom foram coletados.
FORMAÇÃO DE NH2PHAS(LHP)
[296] As reações em triplicatas foram realizadas sob as condições indicadas na tabela 25, utilizando os reagentes, NH2PhAs (III) e LHP, para preparar NH2PhAs(LHP). Todos os frascos de reação foram lavados com N2 antes da incubação. Uma alíquota representativa foi analisada por ESI-MS nos pontos de tempo especificados (1 h, 2 h, 16 h e 24 h) para monitorar o progresso da reação.
TABELA 25 REAÇÕES EXPERIMENTAIS PARA FORMAÇÃO DE NH2PHAS(LHP). Ensaio Concentrações razão Solvente Temp (ºC) pH NH2PhAs(III):LHP 1 3 mM NH2PhAs(V), 3:1 água MilliQ 37 7 1 mM LHP 2 3 mM NH2PhAs(V), 3:1 Tamp, fosfato 37 8 1 mM LHP (H2PO4-/HPO42-, 0,1M) FORMAÇÃO DE CIPHAS(LHP)
[297] Reações em triplicatas foram realizadas sob as condições indicadas na tabela 26, utilizando os reagentes, ClPhAs(V) e LHP, para preparar ClPhAs(LHP). Todos os frascos de reação foram lavados com N 2 antes da incubação. Uma alíquota representativa foi analisada por ESI-MS nos pontos de tempo especificados (30 min., 1 h, 2 h, 24 h, 72 h, e 96 h) para monitorar o progresso da reação.
TABELA 26 REAÇÕES EXPERIMENTAIS PARA FORMAÇÃO DE CIPHAS(LHP). Ensaio Concentrações razão Solvente Temp (ºC) pH ClPhAs(V):LHP 1 1 mM ClPhAs(V), 3 1:3 Água MilliQ 37 7 mM LHP 2 1 mM ClPhAs(V), 5 1:5 Água MilliQ 37 7 mM LHP 3 1 mM ClPhAs(V), 8 1:8 Água MilliQ 37 7 mM LHP
FORMAÇÃO DE IPHAS(LHP)
[298] Reações em triplicatas foram realizadas sob as condições indicadas abaixo, utilizando os reagentes, lPhAs(V) e LHP, para preparar lPhAs(LHP). Todos os frascos de reação foram lavados com N2 antes da incubação. Uma alíquota representativa foi analisada por ESI-MS nos pontos de tempo especificados (1 h e 72 h) para monitorar o progresso da reação.
TABELA 27 REAÇÕES EXPERIMENTAIS PARA FORMAÇÃO DE IPHAS(LHP). Ensaio Concentrações razão Solvente Temp (ºC) pH IPhAs(V):LHP 1 1 mM IPhAs(V), 3 1:3 Água MilliQ 37 7 mM LHP 2 1 mM IPhAs(V), 4 1:4 Água MilliQ 37 7 mM LHP 3 1 mM IPhAs(V), 5 1:5 Água MilliQ 37 7 mM LHP
RESULTADOS SINTESE DE NH2PHAS(III)
[299] A espectro de massa ESI (Figura 33) exibe produtos da reação formados a partir da redução de ácido p-arsanílico para produzir NH2PhAs(III). O composto As(III) desejado p-aminofenil dicloroarsina foi produzido com sucesso, tal como indicado pelo pico em m/z 259,0, designado como [NH2- Ph-A-Cl2 + Na]+. Além disso, o pico em m/z 184,0 corresponde a [NH2 -Ph-As=O + H]+, enquanto o pico em m/z 202,0 corresponde a [NH2-Ph-As-(OH)2 + H]+, sugerindo a formação de um segundo composto de As (III), óxido de p- aminofenilarsina. O pico em m/z 279,1 indica a presença de óxido de trifenilfosfina, [P(Ph)3O + H]+, que é um produto secundário esperado formado como resultado da oxidação da trifenilfosfina.
[300] O espectro de RMN 1H também sugere a formação de dois produtos principais, devido à presença de dois conjuntos de multipletos na região δ=7,36-7,76 ppm. Ioannou e Tsivgoulis relataram a síntese de p-
aminofenildicloroarsina pura, em que os dupletos estavam presentes em δ=7,19 ppm e δ= 7,70 ppm. A partir dessas informações, é razoável supor que o multipleto em δ= 7,71 ppm e o multipleto relacionado a ele, δ= 7,47 ppm, pode ser designado como prótons de p-aminofenildicloroarsina. Por conseguinte, os grandes multipletos presentes em δ= 7,42 ppm e δ= 7,54 ppm podem ser atribuídos como prótons associados com ambos, óxido de p-aminofenilarsina ou p- aminofenildihidroxiarsina. Devido à abundância relativamente grande do pico associado ao óxido de p-aminofenilarsina (m/z 184,0) no espectro de massa ESI, é razoável supor que a redução do ácido p-arsanílico pela trifenilfosfina e iodo resultou na formação de dois produtos principais: p-aminofenildicloroarsina e óxido de p-aminofenilarsina.
[301] XAS também foi usada para caracterizar os produtos de reação de As a partir da formação de NH2PhAs(III). A Figura 34 mostra os produtos aminofenilarsênicos (espectro inferior) e os espectros XANES na borda K do As de alguns padrões sólidos de As(III) relevantes: arsenito, PhAs(GS)2 e PAO e o material de partida As(V): ácido p-arsanílico. Conforme previsto, as espécies As(III) exibiram energias da borda e picos de linha branca aproximadamente 3-5 eV inferiores ao composto As(V), ácido p-arsanílico (energias de pico de linha branca: arsenito, 11871,54 eV; PAO, 11870,57 eV; PhAs (GS) 2, 11869,55 eV; ácido p-arsanílico, 11874,56 eV). Quando consideramos os espectros XANES gerados a partir de arsenito versus PAO, fica evidente que a coordenação do anel fenila no PAO (comparado aos átomos de O no arsenito) resulta em uma mudança da borda para menor energia. A ligação de As a dois ligantes GS, além de um grupo fenila em PhAs(GS)2, resultou em uma mudança da borda adicional para menor energia. O exame da estrutura pós-borda próxima para PhAs(GS)2 mostrou uma depressão substancial na intensidade de absorção em aproximadamente 11874 eV. NH2PhAs(III) deu origem a um pico de linha branca em 11871,80 eV, o que é indicativo de uma espécie de As(III). O pico é relativamente amplo e a forma
(região pré-borda e pós-borda) é diferente do espectro do PAO. A região pós- borda mostra uma forte similaridade com a região pós-borda do espectro XANES do ácido p-arsanílico. Isto, juntamente com a amplitude da região pós-borda, pode ser indicativo de uma mistura de p-aminofenildicloroarsina e óxido de p- aminofenilarsina.
FORMAÇÃO DE NH2PHAS(LHP)
[302] Após a síntese bem-sucedida do composto p- aminofenilarsênico (contendo duas espécies, p-aminofenildicloroarsina e óxido de p-aminofenilarsina), várias condições de reação foram empregadas para identificar as condições ideais de reação para produzir o(s) complexo(s) de aminofenilarsênico-peptídeo desejado(s). Primeiramente, a temperatura de cada reação foi mantida constante a 37ºC para minimizar a potencial degradação de qualquer produto. Devido à natureza cara do LHP, o composto As foi usado em excesso. Embora a reação foi rápida em todas as proporções estequiométricas dos reagentes, foi decidido que a estequiometria ideal era 3 mol de As:1 mol de LHP. O solvente/pH ideal da solução da reação foi determinado como água MilliQ (pH 7) (cf. tampão fosfato (pH 8)), uma vez que a purificação da reação em tampão fosfato por HPLC preparativa produziu aproximadamente dez vezes menos produto. Embora a reação tenha sido rápida e a formação do complexo desejado tenha ocorrido rapidamente, a reação foi incubada a 37ºC por aproximadamente 24 horas para garantir a conjugação completa do composto As ao peptídeo.
[303] O espectro de massa ESI (Figura 35) da solução de reação de NH2PhAs(III) e LHP utilizando as condições ótimas mostra a formação do complexo aminofenilarsênico (LHP) desejado. A formação do complexo desejado é confirmada pelos picos em m/z 462,4 ([NH2-Ph-As(LHP) + 3H]3+) e m/z 693,0 ([NH2-Ph-As(LHP) + 2H]2+). A p-aminofenildicloroarsina não reagida (m/z 259,1) é evidente no espectro, desde que este reagente tenha sido adicionado em excesso.
Pequenas quantidades de LHP livre são evidentes no espectro (m/z 407,2, 610,1) e podem ser atribuídas à fragmentação pelo processo ESI-MS.
[304] Uma vez que a existência de NH2PhAs(LHP) foi confirmada por ESI-MS, a separação por HPLC foi realizada. As frações que eluíram aos 8,6 min, 10,5 min e 12,2 min foram analisadas por ESI-MS e identificadas como espécies relacionadas ao NH2PhAs (III). O complexo NH2PhAs(LHP) desejado foi eluído em 13,0 min (pico grande).
[305] O NH2PhAs(LHP) sintetizado foi caracterizado por XAS (Figura 34). Fica claro a partir da posição da energia da borda e do pico de energia da linha branca (11870.04 eV) que o produto é uma espécie de As(III). De modo importante, existe uma diferença significativa na região pós-borda do espectro NH2PhAs(LHP) obtido a partir dos produtos da reação que forma NH2PhAs(III). Em primeiro lugar, o pico da linha branca é mais estreito, sugerindo um produto mais puro. Em segundo lugar, o ombro em aproximadamente 11874 eV é semelhante em forma ao do PhAs(GS)2 e muito mais pronunciado que o do arsenito ou PAO. Uma vez que a depressão pós-borda é indicativa de As ligado a S, também é razoável supor que o As esteja ligado ao peptídeo, embora também tenha sido realizada uma análise EXAFS para confirmar isso.
[306] A Figura 36 mostra o melhor ajuste de dispersão única (para a primeira camada/esfera de coordenação) e os dados EXAFS registrados para NH2PhAs (LHP) sintetizado. Os picos em R+Δ(Å)> 3 são provavelmente devidos a interações do elétron ejetado com o anel fenila ligado ao átomo As. O átomo As provavelmente está ligado a 2S e 1C.
[307] Os dados de caracterização confirmam a síntese bem sucedida de NH2PhAs(LHP).
SÍNTESE DE CLPHAS(V)
[308] O composto, ClPhAs(V), foi sintetizado com sucesso pela diazotização do ácido p-arsanílico e subsequente acoplamento de CI. O espectro de massa ESI (Figura 37) indica a formação do produto desejado (m/z 236,9, [Cl- Ph-AsH2O3 + H]+). O pico em m/z 219,0 corresponde ao ácido hidroxi fenilarsônico para-substituído ([OH-Ph-AsH2O3 + H]+), que pode ser produzido como um produto secundário em reações de diazotisação.
[309] A análise do ácido p-clorofenilarsônico por RMN 1H mostrou a presença de uma estrutura principal, com dois conjuntos de multipletos presente no δ= 7,76 ppm e δ= 7,69 ppm.
[310] O rendimento do ácido p-clorofenilarsônico foi de aproximadamente 24%. Estão disponíveis outros métodos sintéticos para sintetizar este composto, como por meio da reação de Bart, em que o arsenito alcalino é acoplado a um arildiazônio, formado a partir de p-cloroanilina. O rendimento está tipicamente entre 60-80%. Entretanto,a diazotização do ácido p- arsanílico e subsequente acoplamento de Cl, usado neste trabalho foi preferível, pois esse método também pode ser usado para produzir ácido p-iodofenilarsônico e possivelmente ácido p-bromofenilarsônico usando o mesmo precursor, ácido p- arsanílico, com a ligeira modificação da adição de iodeto de potássio e brometo de potássio, respectivamente.
[311] A caracterização adicional do ácido p-clorofenilarsônico sintetizado foi realizada por XAS. A Figura 38 mostra os espectros XANES na borda K do As dos padrões sólidos As(III) e As(V), bem como o ácido p- clorofenilarsônico. O ácido p-clorofenilarsônico deu origem a um pico de linha branca na 11874,55 eV, o que é indicativo de espécies As(V), e é quase idêntico à do ácido p-arsanílico, confirmando o As ligado aos átomos pH e S.
FORMAÇÃO DE CIPHAS(LHP)
[312] O LHP reagiu com ácido p-clorofenilarsônico. Em todos os ensaios para identificar as condições de reação ideais para produzir o composto Cl-PhAs(LHP) desejado, o LHP foi mantido em excesso. Isto foi para garantir que o ácido p-clorofenilarsônico fosse suficientemente reduzido antes da conjugação com LHP. Diferentes razões de reagentes foram testadas para determinar as condições ideais de reação, nas quais todos os ensaios mostraram produção de ClPhAs(LHP) (confirmado por ESI-MS). É importante ressaltar que a presença de ClPhAs(LHP) não foi observada antes de 16 h, sugerindo que a redução para As(III) e a subsequente conjugação não é rápida. Após a incubação a 37ºC por aproximadamente 24 h, estavam presentes no espectro de massa ESI os picos correspondentes a ClPhAs(LHP), bem como picos relacionados ao LHP oxidado, ou seja, LHP cíclico unido por S-S. O espectro de massa ESI para esta reação após 72 h é mostrado na Figura 39. Os picos em m/z 468,8 e m/z 702,5 correspondem à estrutura clorofenilarsênico-peptídeo desejada ([Cl-Ph-As(LHP) + 3H]3+ e ([Cl-Ph-As(LHP) + 2H]2+, respectivamente) Os íons indicados pelos picos em m/z 406,8 e m/z 609,5 correspondem ao LHP oxidado ([LHP oxidado + 3H]3+ e [LHP oxidado + 2H]2+, respectivamente).
[313] Uma vez que ESI-MS confirmou a produção de ClPhAs(LHP), a separação por HPLC foi realizada. ESI-MS da fração eluída aos 17,1 min foi identificado como LHP oxidado. Duas frações significativas foram eluídas aos 22,1 minutos e 22,4 minutos. Ambas as frações foram quase idênticas quando analisadas por ESI-MS, de modo que ambas continham o complexo ClPhAs(LHP) desejado.
[314] Como foi o caso do complexo PhAs descrito anteriormente (LHP), postula-se que os diferentes tempos de eluição refletem a existência de dois isômeros As espontaneamente interconversores.
[315] Estudos preliminares de toxicidade celular mostraram que os produtos de cada fração de HPLC exibem a mesma toxicidade em células K562 (leucemia mieloide crônica humana), o que é consistente com a racemização dos isômeros.
[316] A análise XAS de ClPhAs(LHP) foi conduzida para determinar a natureza dos átomos coordenados com As e seu estado de oxidação. A Figura
38 mostra os espectros XANES na borda K do As dos padrões As e ClPhAs(LHP).
O pico de energia da linha branca do complexo ClPhAs(LHP) foi de 11870,31 eV, indicando uma espécie de As (III). A depressão pós-pico significativa em aproximadamente 11874 eV está presente neste espectro, que é semelhante ao do PhAs(GS)2 e é consistente com o esperado para a coordenação de As (III) ao peptídeo.
[317] A Figura 40 mostra o ajuste de dispersão única (primeira camada/esfera de coordenação) para os dados EXAFS registrados para ClPhAs(LHP), nos quais os dispersores são 2S e 1C. Como o ajuste EXAFS para NH2PhAs(LHP), os picos a R + Δ(Å)> 3 no espectro experimental da transformada de Fourier que não se alinham ao ajuste são devidos à interação do elétron ejetado com o anel fenila adjacente ao As que ocorrem além da primeira camada de coordenação. Os dados de caracterização confirmam a síntese bem sucedida do complexo desejado, ClPhAs(LHP).
SÍNTESE DE LPHAS(V)
[318] O ácido p-iodofenilarsônico (lPhAs(V)) foi sintetizado com sucesso pela diazotização do ácido p-arsanílico e subsequente acoplamento de l.
O rendimento de IPhAs(V) foi de aproximadamente 30%.
[319] O espectro de massa ESI (Figura 41) indicou a formação do produto desejado (m/z 328,8, [Cl-Ph-AsH2O3 + H]+). A análise do ácido p- iodofenilarsônico por RMN 1H mostrou a presença de uma estrutura principal maior, no qual dois conjuntos de multipletos estavam presentes em δ= 8,00 ppm e δ= 7,51 ppm.
[320] O ácido p-iodofenilarsônico sintetizado também foi caracterizado por XAS. A Figura 42 mostra os espectros XANES na borda K do As dos padrões sólidos As(III) e As(V), bem como o ácido p-iodofenilarsônico. Os espectros de raios X da borda próxima para o ácido p-iodofenilarsônico mostram um pico de linha branca em 11874,8 eV, indicando uma espécie de As(V). A energia da borda também é semelhante à do ácido p-arsanílico, confirmando o As ligado aos átomos Ph e S.
FORMAÇÃO DE IPHAS(LHP)
[321] As espécies As(V), IPhAs(V), reagiram com LHP, contando com os grupos tiol no peptídeo para reduzir o grupo ácido arsônico antes da conjugação com o peptídeo. A redução do ácido p-iodofenilarsônico não foi rápida, geralmente levando pelo menos 72 horas antes da formação do complexo fenilarsênico-peptídeo. O espectro de massa ESI para esta reação (após 72 h) é mostrado na Figura 43. Os picos em m/z 499,3 e m/z 748,5 correspondem à estrutura iodofenilarsênico-peptídeo desejada ([I-Ph-As(LHP) + 3H]3+ e ([Cl-Ph- As(LHP) + 2H]2+, respectivamente). Os íons indicados pelos picos em m/z 406,8 e m/z 609,5 correspondem ao LHP oxidado ([LHP oxidado + 3H]3+ e [LHP oxidado + 2H]2+, respectivamente).
[322] A purificação por HPLC resultou em uma fração eluída aos 17,1 min que foi confirmada por ESI-MS como sendo LHP oxidado. Duas frações importantes foram eluídas (22,8 min e 23,2 min), as quais o ESI-MS mostrou com sendo o complexo IPhAs(LHP) desejado. Estes foram mostrados como isômeros de conversão, conforme descrito anteriormente para PhAs(LHP) e ClPhAs(LHP).
[323] Os estudos de toxicidade preliminares de ácido p- iodofenilarsônico mostrou que os dois isômeros induzem a mesma toxicidade na linhagem de células K562, que foi consistente com a racemização espontânea do complexo em solução.
[324] O complexo IPhAs(LHP) foi analisado por XAS. A Figura 42 mostra os espectros XANES na borda K do As dos padrões As e complexo lPhAs(LHP). a energia do pico da linha branca para o complexo IPhAs(LHP) foi de 11869,79 eV. De acordo com o espectro de outros XPhAs(LHP), a depressão na região do ombro dos espectros de IPhAs (LHP) é semelhante àquela do espectro PhAs(GS)2, consistente com um complexo As(III) ligado a S.
[325] A Figura 44 mostra o ajuste de dispersão única (primeira camada/esfera de coordenação) para os dados EXAFS registrados para lPhAs(LHP), em que os dispersores são 2S e 1C. Novamente, os picos a R + Δ(Å)> 3 no espectro experimental da transformada de Fourier, que não se alinham ao ajuste, podem ser atribuídos à interação do elétron ejetado com o anel fenila adjacente ao As (além da primeira camada de coordenação). Os dados de caracterização confirmam a síntese bem sucedida do complexo desejado, lPhAs(LHP). Conclui-se que o complexo IPhAs(LHP) existe como uma mistura de dois enantiômeros (centro quiral em As) que racemizam espontaneamente em solução ao longo do tempo.
[326] Em resumo, foram sintetizados vários análogos p-substituídos de PhAs(LHP) que abrangem grupos de retirada de elétrons, doação de elétrons e impedimento estérico. Experimentos futuros envolverão a purificação e caracterização completa de todos estes complexos antes de testa-los em ensaios biológicos para determinar o complexo ótimo para a potencial utilização terapêutica. Os testes biológicos refletirão esses protocolos e as linhagens de células já descritas acima.
[327] A descrição acima dos diversos exemplos de realização da presente invenção é fornecida para fins descritivos para um técnico versado na técnica relacionada. Tais exemplos de realização não pretendem ser exaustivos ou limitar o escopo da invenção a um único exemplo de realização divulgado.
Como mencionado acima, numerosas alternativas e variações para a presente invenção serão evidentes para os especialistas na técnica a partir do que foi ensinado acima. Consequentemente, embora alguns exemplos de realização alternativos tenham sido discutidos de maneira específica, outros exemplos de realização serão evidentes ou serão desenvolvidos de maneira relativamente fácil por aqueles versados na técnica. Assim, o presente relatório descritivo pretende abranger todas as alternativas, modificações e variações da presente invenção que foram aqui discutidas e outros exemplos de realização que se enquadrem no espírito e no escopo da invenção descrita acima.
[328] Nas reivindicações a seguir e na descrição anterior da invenção, exceto quando o contexto claramente exigir de outra forma devido a linguagem expressa ou implicação necessária, a palavra “compreender”, ou variações da mesma incluindo “compreende” ou “compreendendo”, é usada em um sentido inclusivo, ou seja, ela especifica a presença dos números inteiros indicados, mas sem impedir a presença ou adição de números inteiros adicionais em um ou mais exemplos de realização da invenção.

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. AGENTE ANTICÂNCER, caracterizado por compreender um peptídeo de tropismo tumoral ciclizado possuindo um átomo de arsênio ligado a dois resíduos de cisteína.
2. AGENTE ANTICÂNCER, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos dois resíduos de cisteína ligados ao arsênio do peptídeo de tropismo tumoral estarem separados por menos de 20 resíduos de aminoácidos.
3. AGENTE ANTICÂNCER, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por, antes da ciclização, pelo menos um dos dois resíduos de cisteína que se ligam ao átomo de arsênio ser um resíduo terminal do peptídeo de tropismo tumoral.
4. AGENTE ANTICÂNCER, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por, antes da ciclização, os dois resíduos de cisteína que se ligam ao átomo de arsênio formarem os respectivos resíduos de peptídeo N-terminal e C-terminal do peptídeo de tropismo tumoral.
5. AGENTE ANTICÂNCER, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela cisteína N-terminal compreender um grupo de capeamento ligado ao seu nitrogênio amino-terminal.
6. AGENTE ANTICÂNCER, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda um grupo estabilizador ligado ao átomo de arsênio.
7. AGENTE ANTICÂNCER, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo grupo estabilizador ser selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxila, alquila-C1 a C6, alquenila C2 a C6, alquinila C2 a C6, arila, cicloalquila e heterociclo, em que cada um dos grupos pode ser substituído ou não substituído, conforme apropriado.
8. AGENTE ANTICÂNCER, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo peptídeo de tropismo tumoral compreender pelo menos um resíduo de arginina e/ou lisina.
9. AGENTE ANTICÂNCER, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ter uma estrutura como mostrado na Fórmula I: Fórmula I em que, os átomos de enxofre mostrados aos quais o arsênio está ligado, são tiol enxofres dos respectivos resíduos de cisteína; os resíduos de cisteína na Fórmula I são separados por menos de 20 resíduos de aminoácidos representados pela linha curva; e R é um grupo estabilizador selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxila, alquila C1 a C6, alquenila C2 a C6, alquinila C2 a C6, alcóxi C1 a C6, arila, cicloalquila, heterocíclico, e peptídeos de cadeia curta, em que cada dos grupos pode ser substituído ou não substituído.
10. AGENTE ANTICÂNCER, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ter uma estrutura como mostrado na Fórmula I: Fórmula II em que os átomos e grupos são como descritos para a Fórmula I; o grupo de capeamento é formado a partir de um composto amino-
reativo; e W tem entre 2 a 20 resíduos de aminoácidos.
11. AGENTE ANTICÂNCER, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo peptídeo de tropismo tumoral ao qual o átomo de arsênio está ligado entre dois resíduos de cisteína para formar uma ponte ser selecionado a partir do grupo que consiste em:
1. CAYHRLRRC;
2. CDCRGDCFC;
3. CPIEDRPMC;
4. CNRRTKAGC;
5. CGTKRKC;
6. CRGDGWC;
7. CVSNPRWKC;
8. CHVLWSTRC;
9. CLDGGRPKC;
10. GCSVSSVGALCTHV;
11. CRGDGWC;
12. CDCRGDCFC;
13. CVNHPAFAC;
14. CRGDRGPDC;
15. CRGDKTTNC;
16. CRGDHAGDC;
17. CLSYYPSYC;
18. CTPSPPFSHC;
19. CPHSKPCLC;
20. CSDSWHYWC;
21. CSDWQHPWC;
22. CSDYNHHWC;
23. CSDGQHYWC;
24. CYDSWHYWC;
25. CFDGNHIWC;
26. CTDFPRSFC;
27. CTQDRQHPC;
28. CLSRYLDQC;
29. CRGDCF;
30. CGNSNPKSC;
31. CPHNLTKLC; e em que o átomo de arsênio, quando no agente anticâncer formado do primeiro aspecto, será ligado e formará uma ponte entre dois dos resíduos de cisteína das sequências peptídicas acima.
12. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um agente anticâncer de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, e um veículo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
13. MÉTODO PARA TRATAR UM CÂNCER, em um paciente, caracterizado por incluir a etapa de administrar ao paciente o agente anticâncer de qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, para, desse modo, tratar o câncer no paciente.
14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo câncer ser uma neoplasia hematológica ou um tumor sólido.
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo câncer ser selecionado a partir de leucemia, mieloma múltiplo e linfoma.
16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 15, caracterizado pelo câncer poder ser selecionado a partir do grupo que consiste em carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais,
melanoma, tumores de revestimento epitelial de glândulas ou ductos, adenocarcinoma, carcinoma papilar, tumores de adenocarcinoma papilar hepático e do trato biliar, tumores de carcinoma hepatocelular e do trato gastrointestinal, carcinoma de células escamosas do esôfago, adenocarcinoma de esôfago, carcinoma colorretal (câncer de cólon), carcinoma gástrico (câncer de estômago) tumores do trato respiratório, carcinoma broncogênico, carcinoma de células pequenas, tumores de carcinoma de grandes células do trato urogenital, carcinoma de células de transição da bexiga, carcinoma de células escamosas da bexiga, carcinoma de próstata, carcinoma do colo uterino, de células do sangue e células relacionadas (leucemias), leucemia linfocítica aguda e crônica, policitemia vera, cânceres do tecido linfoide, linfomas malignos, incluindo linfoma de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin, linfoma folicular, linfoma difuso, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico, mieloma múltiplo, Tumores de tecido conjuntivo, cânceres de osteossarcoma ósseo, tumores do sistema nervoso, neuroblastoma, retinoblastoma, glioblastoma, tumores de oligodendroglioma associados com vírus oncogênicos, Linfoma de Burkitts, linfoma de células b em indivíduos imunocomprometidos, carcinoma nasofaríngeo, câncer de esôfago e gastroesofágico, câncer de células escamosas epidermais, tumores de ilhotas pancreáticas, carcinoma de mama, câncer de pulmão, câncer colorretal, retinoblastoma, câncer hepático, câncer pancreático, câncer cerebral, mesotelioma e carcinoma hepatocelular causado pelo vírus da hepatite B.
17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 15, caracterizado pelo fato de que, quando o câncer é uma leucemia, ele é selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia mieloide crônica, linfoma de células T, síndrome mielodisplásica, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer de cérebro, mesotelioma e leucemia promielocítica aguda (APL).
18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 17, caracterizado pelo agente anticâncer ser administrado em combinação com um ou mais de um agente imunoterápico, anticorpo monoclonal, quimioterápico, radioprotetor e radioterápico.
19. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM AGENTE ANTICÂNCER, caracterizado por compreender as etapas de: - colocar um peptídeo de tropismo tumoral compreendendo dois resíduos de cisteína em contato com um composto de arsênio; - permitir que o arsênio se ligue a cada um dos dois resíduos de cisteína para formar um peptídeo de tropismo tumoral ciclizado compreendendo um átomo de arsênio ligado; e - para, desse modo, produzir o agente anticâncer.
20. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo composto de arsênio ser um óxido de arsênio.
21. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo composto de arsênio compreender ainda um grupo alquila, hidroxila ou arila ligado ao arsênio.
22. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 21, caracterizado por compreender ainda a etapa (a)(i) de modificação de um peptídeo de tropismo tumoral para apresentar dois resíduos de cisteína.
23. AGENTE ANTICÂNCER, caracterizado pela produção pelo processo de qualquer uma das reivindicações de 19 a 22.
24. MÉTODO DE ENTREGA de uma quantidade terapeuticamente eficaz de arsênio, para um paciente, caracterizado por incluir a etapa de administrar ao paciente uma quantidade apropriada do agente anticâncer de qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, para, desse modo, entregar ao paciente a quantidade terapeuticamente eficaz de arsênio.
25. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UM CÂNCER,
caracterizado por incluir as etapas de:
- administrar a um paciente um agente anticâncer de qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 compreendendo pelo menos um átomo radioativamente marcado;
- permitir que o agente anticâncer se localize no câncer; e
- detectar a presença de pelo menos um átomo radiomarcado do agente anticâncer,
- para, desse modo, diagnosticar o câncer.
BR112020007145-5A 2017-10-17 2018-10-17 agente anticâncer, composição farmacêutica, métodos para tratar um câncer e para diagnosticar um câncer, processo para a produção de um agente anticâncer e método de entrega BR112020007145A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2017904199 2017-10-17
AU2017904199A AU2017904199A0 (en) 2017-10-17 Anti-cancer agent
PCT/AU2018/000202 WO2019075507A1 (en) 2017-10-17 2018-10-17 ANTICANCER AGENT

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020007145A2 true BR112020007145A2 (pt) 2020-09-24

Family

ID=66172988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020007145-5A BR112020007145A2 (pt) 2017-10-17 2018-10-17 agente anticâncer, composição farmacêutica, métodos para tratar um câncer e para diagnosticar um câncer, processo para a produção de um agente anticâncer e método de entrega

Country Status (16)

Country Link
US (1) US11819489B2 (pt)
EP (1) EP3676282A4 (pt)
JP (1) JP7345459B2 (pt)
KR (1) KR20200071725A (pt)
CN (1) CN111344298B (pt)
AU (1) AU2018352461B2 (pt)
BR (1) BR112020007145A2 (pt)
CA (1) CA3075650A1 (pt)
CL (1) CL2020001438A1 (pt)
IL (1) IL272705B1 (pt)
MX (1) MX2020002273A (pt)
NZ (1) NZ761556A (pt)
PE (1) PE20201279A1 (pt)
SG (1) SG11202001669UA (pt)
WO (1) WO2019075507A1 (pt)
ZA (1) ZA202000996B (pt)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1563099B1 (en) 2002-11-07 2009-07-22 Newsouth Innovations Pty Limited Induction of the mitochondrial permeability transition
WO2008134761A2 (en) 2007-04-30 2008-11-06 Intezyne Technologies, Inc. Modification of biological targeting groups for the treatment of cancer
EP2231684A4 (en) * 2007-12-12 2011-09-07 Ziopharm Oncology Inc COMPOUNDS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF CANCER

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018352461A1 (en) 2020-02-27
CN111344298B (zh) 2024-05-28
JP7345459B2 (ja) 2023-09-15
NZ761556A (en) 2024-02-23
CN111344298A (zh) 2020-06-26
WO2019075507A9 (en) 2020-05-22
SG11202001669UA (en) 2020-03-30
MX2020002273A (es) 2020-09-21
PE20201279A1 (es) 2020-11-24
WO2019075507A1 (en) 2019-04-25
JP2021509394A (ja) 2021-03-25
CA3075650A1 (en) 2019-04-25
US11819489B2 (en) 2023-11-21
IL272705A (en) 2020-04-30
EP3676282A4 (en) 2021-07-14
KR20200071725A (ko) 2020-06-19
US20210205259A1 (en) 2021-07-08
EP3676282A1 (en) 2020-07-08
ZA202000996B (en) 2022-07-27
AU2018352461B2 (en) 2020-07-16
CL2020001438A1 (es) 2020-09-21
IL272705B1 (en) 2024-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6190025B2 (ja) ジグリシドエーテル誘導体治療剤およびその使用方法
JP2016530285A (ja) 癌の撮像及び治療のためのハロゲン化化合物、及びその使用方法
WO2020042996A1 (zh) 奥沙利铂偶联前药、其制备方法及用途
BR112012029975B1 (pt) peptídeo e composição farmacêutica como medicamento
WO2011082487A1 (en) Bisphenol derivatives and their use as androgen receptor activity modulators
McKeon et al. Platinum (IV) oxaliplatin–peptide conjugates targeting memHsp70+ phenotype in colorectal cancer cells
PT679656E (pt) Melhoramentos em complexos de platina
US10544138B2 (en) Tricyclic kinase inhibitors of MELK and methods of use
CN110891588A (zh) 拟肽大环化合物及其用途
BR112020007145A2 (pt) agente anticâncer, composição farmacêutica, métodos para tratar um câncer e para diagnosticar um câncer, processo para a produção de um agente anticâncer e método de entrega
JP2018524320A (ja) カルボプラチンベースの共結晶の医薬組成物及びその用途
TWI841540B (zh) 抗癌劑及其之藥學組合物和用途
CA2717181C (en) Treatment methods and compositions for lung cancer, adenocarcinoma, and other medical conditions
ES2222988T3 (es) Formas de sal especificas de derivados de trifeniletileno como moduladores selectivos de los receptores de estrogenos.
TW202015707A (zh) 抗癌劑
RU2429242C2 (ru) Применение тетранитрозильного комплекса железа с тиофенолом в качестве противоопухолевого лекарственного средства
RU2819398C2 (ru) Кристаллическая форма миметика smac, применяемого в качестве ингибитора iap, и способ ее получения
EP4334294A1 (en) Compounds for use in the treatment of cancer
CA3205844A1 (en) Ligands and their use
WO2023250116A1 (en) Indocyanine green (icg) modification for treatment of liver cancer
ITRM20100054A1 (it) Uso terapeutico combinato di organostagno(iv) ed inibitori delle deacetilasi istoniche
PL235215B1 (pl) Kompleksy platyny(II) i palladu(II) oraz ich zastosowanie medyczne
CZ25727U1 (cs) Salophenové komplexy železa s heterocyklickými N-donorovými ligandy a jejich použití jako léčiv v protinádorové terapii

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]