BR112012029975B1 - peptídeo e composição farmacêutica como medicamento - Google Patents

Abstract

PEPTÍDEO COMO MEDICAMENTO, EM PARTICULAR PARA O TRATAMENTO DO CÂNCER. A presente invenção refere-se a um peptídeo de sequência SEQ 1: INWLKIAKKVAGML-NH2, e um ou várias de suas variantes escolhidas, dentre as sequências SEQ. 2 a SEQ. 25, ou uma de suas misturas. Em particular, esses peptídeos são utilizados como medicamento, notadamente para o tratamento do câncer. A presente invenção se refere também a uma composição farmacêutica, compreendendo esses peptídeos.

Description

[001] A presente invenção refere-se a uma composição farma-cêutica, compreendendo pelo menos um peptideo particular para sua aplicação como medicamento no tratamento do câncer.

[002] Para tratar o câncer, existe convencionalmente três espécies de terapias: a cirurgia que visa a retirar o tumor, a radioterapia que visa a destruir o tumor por raios, e os tratamentos médicos (quimioterapia). A cirurgia e a radioterapia são tratamentos pesados difíceis de suportar para o doente. Além disso, esses três tratamentos devem ser mais frequentemente associados, pois complementares. Eles devem ser combinados no âmbito de uma estratégia programada.

[003] No que se refere aos tratamentos médicos, eles têm por finalidade tratar não somente o órgão atingido, mas também o organismo por completo pela administração de medicamentos anticancerí- genos. Assim, diferentemente da cirurgia ou da radioterapia que tratam o tumor apenas localmente, só os tratamentos médicos têm uma ação geral que permite tratar um tumor que já disseminou ou que está em via de fazê-lo. Existem vários tipos de tratamentos médicos: a quimioterapia citotóxica e hormonoterapia são os mais clássicos; a imunote- rapia, a terapia gênica e as terapias não citotóxicas são ainda do do-mínio da pesquisa.

[004] O documento WO00/02581 se refere à utilização de um peptideo para a fabricação de u medicamento destinado ao tratamento ou à profilaxia do câncer, o peptideo sendo constituído notadamente pelas sequências EARPALLTSRLRFIPK, DGLRPIVNMDYVVGAR, GVPEYGCWNLRKTWNF, ILAKFLHVVL ou ELLRSFFYV.

[005] A publicação “Monitoring the positioning of short polycationic peptides in model lipid bilayers by combining hydrogen/deuterium exchange and electrospray ionization mass spectrometry”, oriunda de Bioquímica e Biofísica Acta, 2008, páginas 2797 a 2805, descreve a utilização de um espectrômetro de massa de ionização eletroaspersão para analisar as propriedades de troca hidrogênio/deutério do peptídeo Apoica-MP INWLKIAKKVAGML- NH2.

[006] Apesar de uma pesquisa aprofundada nesse domínio, não existe ainda no momento atual um medicamento que seja, ao mesmo tempo, eficaz no tratamento de cânceres e que preserve as células sadias de um organismo humano ou animal. A quimioterapia de hoje acarreta sempre efeitos secundários de uma gravidade mais ou menos grande.

[007] A presente invenção tem por finalidade propor um novo peptídeo medicamento e uma nova composição farmacêutica que evitam o total ou parte desses efeitos secundários.

[008] Para isso, a invenção tem por objeto um peptídeo que compreende pelo menos uma sequência escolhida dentre: as sequências SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO: 25.

[009] A invenção se refere também um peptídeo que compreende pelo menos uma sequência escolhida dentre: as sequências SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 25 para uma utilização como medicamento.

[0010] De preferência, os peptídeos de sequências SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 25 são utilizados no tratamento do câncer. Em particular, as sequências de peptídeos agindo como princípio ativo para tratar o câncer são as seguintes (Tabela 1): Tabela I

[0011] Os trabalhos do requerente sobre esses peptídeos de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 25 permitiram colocarem evidência, de maneira surpreendente, que esses peptídeos apresentem uma atividade ci- totóxica contra células cancerígenas, não sendo tóxicas ou muito ligeiramente tóxicas, para as células da hospedeira a tratar. Os peptídeos ativos, de acordo com a invenção, alteram com efeito de maneira específica os microtúbulos das células cancerígenas.

[0012] Constituintes de uma das três redes de filamentos da cito- estrutura, os microtúbulos são polímeros complexos e instáveis, cuja unidade de base é o dímero de tubulinas α e β. Eles estão na origem de múltiplos movimentos celulares, transporte axonal, ou motilidade, por exemplo, e, sobretudo, eles fornecem o material de base para a constituição do fuso mitótico. Os microtúbulos são tubos ocos de com-primento variável e em perpétua reforma. Assim, perturbando a dinâmica dos microtúbulos das células cancerígenas, os peptídeos, segundo a invenção, agem também como antimitóticos, impedindo a proliferação das células cancerígenas (redução ou parada da mitose das células cancerígenas).

[0013] Os peptídeos ativos, de acordo com a invenção, alterariam também, de maneira específica, as membranas plásmicas das células cancerígenas e não induziriam essas mesmas alterações nas células sadias do organismo hospedeiro. Isto se explicaria pelo fato de os pep- tídeos ativos, por causa de seu caráter policatiônico, agiriam sobre as membranas plásmicas das células cancerígenas ricas em cargas negativas. Por conseguinte, os peptídeos ativos, de acordo com a invenção, apresentam uma ação sobre dois compartimentos celulares diferentes: a cito-estrutura intracelular e a membrana plásmica das células cancerígenas.

[0014] Os peptídeos ativos, que compreendem apenas 10 a 14 ácidos aminados, apresentam também a vantagem de serem muito fáceis de sintetizar.

[0015] De preferência, o(s) peptídeo(s) citado(s) na tabela I, aplicados para uma utilização como medicamento para o tratamento do câncer, são notadamente eficazes para o tratamento do câncer do seio, do glioblastoma, câncer do cérebro, do colo uterino, colo-retal, cutânea, endométrio, estômago, fígado, gastrointestinal estromal, he- mopatias malignas (leucemia, mieloma múltiplo, linfomas (Mal de Hodgkin, linfoma não-hodgkiniano), carcinoma hepatocelular, sarcoma de Kaposi, câncer da laringe, mesotelioma, câncer do esôfago, do olho, ósteo-sarcoma, câncer do ovário, do pâncreas, da pele (notadamente boca), câncer do pulmão, da próstata, rabdomiossarcoma, câncer do rim, do seio, do testículo, da tireoide, dos tecidos moles, carcinoma da bexiga, mieloma (câncer ósseo) e plasmocitoma.

[0016] Conforme uma outra característica da invenção, os peptí- deos de sequências SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 25 são produzidos por síntese química.

[0017] Uma outra finalidade da presente invenção se refere a uma composição farmacêutica, compreendendo um dos peptídeos, tais como definidos acima.

[0018] Vantajosamente, a composição se apresenta sob a forma de uma solução, de uma suspensão aquosa, ou no estado seco sob a forma de comprimidos não revestidos ou revestidos, como as pílulas, as geleias, as cápsulas ou os pós.

[0019] Se a composição farmacêutica estiver no estado seco, ela poderá ser misturada a um ou vários diluentes inertes, tais como o amido, a celulose, a sacarose, a lactose ou a sílica, etc. Ela pode também compreender outras substâncias no estado seco como um ou vários lubrificantes, tais como o estearato de magnésio, ou o talco, um corante, um revestimento (drágeas) ou um verniz.

[0020] Se a composição farmacêutica, de acordo com a invenção, estiver sob a forma líquida, ela poderá compreender soluções, suspensões, emulsões, xaropes, e elixires farmaceuticamente aceitáveis contendo diluentes inertes, tais como a água, o etanol, o glicerol, os óleos vegetais ou o óleo de parafina. A composição farmacêutica pode compreender outras substâncias líquidas que os diluentes, por exemplo, produtos umedecedores, edulcorantes, espessantes, aromatizan- tes ou estabilizantes.

[0021] De maneira preferida, a composição, associada eventualmente a um excipiente do veículo inerte não tóxico farmaceuticamente aceitável, é caracterizada pelo fato de ser administrada por via tópica sob a forma de aplicação cutânea, transcutânea ou percutânea; oral; parenteral; nasal ou brônquica.

[0022] A composição farmacêutica para administração parenteral pode ser, de preferência, uma solução aquosa ou não aquosa, uma suspensão ou uma emulsão. Como solvente ou veículo, citar-se-ão a água, o polipropileno glicol, óleos vegetais, em particular o óleo de oliva ou o óleo de sésamo, ésteres orgânicos injetáveis, por exemplo, o oleato de etila ou outros solventes orgânicos convenientes. A composição rabdomiossarcoma, câncer dos rins, do seio, do testículo, da ti- reoide, dos tecidos moles, carcinoma da bexiga, mieloma (câncer ósseo) e plasmocitoma.

[0023] De acordo com uma outra característica da invenção, os peptídeos de sequências SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 25 são produtos por síntese química.

[0024] Uma outra finalidade da presente invenção se refere a uma composição farmacêutica, compreendendo um dos peptídeos, tais como definidos acima.

[0025] Vantajosamente, a composição se apresenta sob a forma de uma solução, de uma suspensão aquosa, ou no estado seco sob a forma de comprimidos não revestidos ou revestidos, como as pílulas, as geleias, as cápsulas ou os pós.

[0026] Se a composição farmacêutica estiver no estado seco, ela poderá ser misturada a um ou vários diluentes inertes, tais com o amido, a celulose, a sacarose, a lactose ou a sílica, etc. Ela pode também compreender outras substâncias no estado seco como um ou vários lubrificantes, tais como o estearato de magnésio ou o talco, um corante, um revestimento (drágeas) ou um verniz.

[0027] Se a composição farmacêutica, de acordo com a invenção, estiver sob a forma líquida, ela poderá compreender soluções, suspensões, emulsões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis contendo diluentes inertes, tais como a água, o etanol, o glicerol, os óleos vegetais ou o óleo de parafina. A composição farmacêutica pode compreender outras substâncias líquidas que os diluentes, por exemplo, produtos umedecedores, edulcorantes, espessantes, aromatizan- tes ou estabilizantes.

[0028] De maneira preferida, a composição, associada eventualmente a um excipiente ou veículo inerte não tóxico farmaceuticamente aceitável, é caracterizada pelo fato de ser administrada por via tópica sob a forma de aplicação cutânea, transcutânea ou percutânea; oral; parenteral; nasal ou brônquica.

[0029] A composição farmacêutica para administração parenteral pode ser, de preferência, uma solução aquosa ou não aquosa, uma suspensão ou uma emulsão. Como solvente ou veículo, citar-se-ão a água, o propileno glicol, óleos vegetais, em particular o óleo de oliva ou óleo de sésamo, ésteres orgânicos injetáveis, por exemplo, o oleato de etila ou de outros solventes orgânicos convenientes. A composição farmacêutica pode também conter adjuvantes, em particular agentes umedecedores, isotonizantes, emulsificantes, dispersantes e estabili- zantes.

[0030] Para a administração por via tópica, os medicamentos serão administrados vantajosamente sob a forma de pomadas, cremes, géis ou patchs.

[0031] Em particular, a composição farmacêutica é estéril.

[0032] A esterilização pode ser feita de várias formas, por exemplo por filtragem asseptizante, incorporando à composição dos agentes esterilizantes, por irradiação ou por aquecimento. Os medicamentos podem também ser preparados sob a forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas no momento do emprego em água estéril ou qualquer outro meio estéril injetável.

[0033] A composição farmacêutica poderá, além disso, ser utilizada sozinha ou em associação, em um tratamento determinado com outros medicamentos, ou associada à radioterapia ou cirurgia.

[0034] A invenção será melhor compreendida e outras finalidade, detalhes, características e vantagens desta aparecerão mais claramente no decorrer da descrição seguinte de um modo de realização particular da invenção, dado unicamente a título ilustrativo e não limitativo, com Referência: aos desenhos anexados. Exemplos dos testes farmacêuticos são, além disso, propostos a fim de ilustrar, mas em nenhum caso não saberiam ser interpretados como limitando o alcance da invenção.

[0035] Nesses desenhos:

[0036] - a figura 1 representa o efeito do peptídeo de SEQ ID NO: 1 sobre a polimerização de microtúbulos de um cérebro de rato sadio em doses de 23,3 pM, 46,6 pM, 70 pM e 93,3 pM, assim como o efeito de uma amostra prova não tendo sido submetido ao peptídeo de SEQ ID NO: 1; em particular, a figura 1 representa a evolução da polimerização in vitro de microtúbulos de cérebro de rato, quantificada por medidas de densidade óptica a 345 nm de comprimento de onda, em função do tempo em minutos e em presença ou não de peptídeo de SEQ ID NO: 1;

[0037] - a figura 2 representa o efeito de peptídeo de SEQ ID NO: 1 às doses de 46,6 pm, 70 pm, 93,3 pM e 116 pM sobre a estabilidade dos microtúbulos de cérebro de rato sadio, avaliada pela percentagem de despolimerização microtubular induzido por um tratamento de 30 min a 4°C dos microtúbulos previamente ligados a 37°C durante 15 min;

[0038] - a figura 3 representa fotos da linhagem celular A549 (cân cer do pulmão) tratada com o peptídeo de SEQ ID NO: 1 a 15 pM e não tratada com esse peptídeo (controle a 0 pM), da linhagem celular NMT-1 tratada com o peptídeo de SEQ ID NO: 1 a 15 pM e não tratada com esse peptídeo (controle) e da linhagem celular PANC-1 (câncer do pâncreas) tratada com o peptídeo de SEQ ID NO: 1 a 15 pM e não tratada com esse peptídeo (controle);

[0039] - a figura 4 representa fotos de linhagens celulares não tu- morais, FIBRO 1 e FIBRO 2 (células fibroplásticas) tratadas com o peptídeo de SEQ ID NO: 1 a 15 pM e não tratadas com esse peptídeo (controle);

[0040] - a figura 5 representa quatro gráficos que representam a confiabilidade células de diferentes linhagens: T (linhagem de rins Cós); G (linhagem de pulmão A549); C (linhagem de fígado HepG2); R (linhagem pancreática PANC1); S (linhagem pancreática MiaPaCa); X (linhagem supra-renaliana H2 95 R); Y (linhagem de melanoma MNT- 1); linhagens linfocitárias leucêmicas L1 (HL 60); L3 (U 937); L4 (NB 4); L5 (MenoMacβ), e uma linhagem de linfócitos normais L6, e isto em função da concentração do peptídeo de SEQ ID NO: 1;

[0041] - a figura 6 representa 4 imagens em contraste de fase de células cancerígenas A 549 (câncer do pulmão), mostrando sua morfo-logia na ausência do peptídeo de SEQ ID NO: 1 (imagens provas A e B) e as alterações de sua morfologia induzidas por 15 pM do peptídeo de SEQ ID NO: 1 (imagem C tomada 4 horas após a injeção do peptídeo de SEQ ID NO: 1 e imagem D tomada 2 horas após a injeção do peptídeo de SEQ ID NO: 1); e

[0042] - a figura 7 representa um gráfico, mostrando o efeito do peptídeo de SEQ ID NO: 1 (concentração de 15 pM) sobre a perda de adesividade ao substrato das células cancerígenas A 549 em função do tempo.

MATERIAIS E MÉTODOS A1) Síntese dos peptídeos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 25 e purificação

[0043] Os peptídeos são preparados por uma síntese sobre fase sólida fracionada manualmente, utilizando o N-9-fluoro fenil metóxi - carbonila com uma resina TGS Novasyn. As cadeias laterais protegem os grupos, incluindo t-butila para a serina e t-butóxi carbonila para a lisina. Para preparar os peptídeos que apresentam um resíduo N- terminal acetilado, após o acoplamento do último resíduo de ácido aminado, o ácido anídrico foi acrescentado aos complexos resina- peptídeo e mantido sob agitação durante 1 hora para promover a ace- tilação.

[0044] A clivagem dos complexos resina-peptídeo foi realizada por tratamento com o ácido trifluoro acético /1,2-etano ditiol / anisol / fenol / água (82,5 ; 2,5 ; 5 ; 5 ; 5 por volume) a uma concentração de 10 ml.g-1 à temperatura ambiente durante 2 horas. Uma filtragem foi em seguida efetuada para eliminar a resina. Depois, o éter etílico a 4°C foi acrescentado, provocando a precipitação dos peptídeos brutos que foram em seguida coletados após uma centrifugação a 1000 g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Os peptídeos brutos foram em seguida solubilizados na água e cromatografados sob RP-HPLC, utilizando uma coluna semipreparatória (250 mm* 10,0 mm; 5 pm) C-18 de Shiseidido sob uma purificação isocrática com 40% (v/v) de aceto- nitrila, contendo 0,1% (v/v) de TFA a uma taxa de 2 ml/min. A purificação foi regulada a 215 nm com um detector UV-DAD (detector ultravioleta com barras de diodos) shimadzu, modelo SPD-M10A) e cada fração purificada foi manualmente coletada em um fiole em vidro de 2 ml_. As sequências dos peptídeos sintetizados (os acetilados como os não acetilados) foram determinadas por análises HPLC e ESI-MS. A2) Peptídeos de SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 25

[0045] Assim, depois que os peptídeos foram sintetizados, purificados e examinados, testes foram feitos para determinar suas atividades biológicas. A maior parte dentre eles mostraram também apresentar uma atividade antibacteriana.

[0046] Além disso, apareceu, de maneira surpreendente e inesperada que os peptídeos, segundo a invenção, apresentavam propriedades que alteram os microtúbulos de células cancerígenas, e notadamente o peptideo SEQ ID NO: 1 para o qual os resultados são descritos abaixo. Esse peptideo é um peptideo curto de 14 ácidos aminados. Esse peptideo apresenta a seguinte sequência de ácidos aminados: INWLKIA KKVA GML -NH2 (SEQ ID NO: 1).

[0047] Os peptideo de sequência SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO: 25 são variantes ou homólogos do peptideo de SEQ ID NO: 1. Essas va- riantes diferem do peptídeo SEQ ID NO: 1 por um a três ácidos ami- nados (ausência ou substituição de um ou vários ácidos aminados) e/ou pela ausência do grupo -NH2 na extremidade N-terminal. Essas variantes se mostraram, seja tão eficazes quanto o peptídeo de SEQ ID NO: 1, seja mostraram uma eficácia ligeiramente menor do que o peptídeo de SEQ ID NO: 1, mas geralmente são mais ativos sobre tipos de cânceres que respondam um pouco pior ao peptídeo SEQ ID NO: 1.

TESTES EXPERIMENTAIS 81) Efeito do peptídeo de sequência SEQ ID NO: 1 sobre as proprie-dades dos microtúbulos purificados (figura 1)

[0048] Microtúbulos purificados de cérebro de rato foram preparados por um processo in vitro dependente da temperatura de ligação a 37°C e de desligamento a 4°C em presença de GTP (guanosina trifos- fato) descrito por FELLOUS et al. (1977) "microtubule assembly in vitro, purification of assembly-promoting factors", Eur J. Biochem, 15 de agosto de 19787, 15; 78 (1): 167-174.

[0049] A polimerização in vitro dos microtúbulos foi seguida pela medida das mudanças de turvação a 345 nm a cada 30 segundos no decorrer de um período de incubação de 15 minutos. As medidas de densidade óptica foram feitas com um espectrofotômetro UVICON termostato a 37°C e equipado com um carregador automático que pode acolher 6 cubas.

[0050] Tal como representado na figura 1, o peptídeo de SEQ ID NO: 1 induz um aumento importante da turvação durante o processo da polimerização de microtúbulos em relação à amostra prova não compreendendo o peptídeo de SEQ ID NO: 1 e servindo de controle da polimerização de microtúbulos. O aumento de absorbância observada em presença do peptídeo de SEQ ID NO: 1 vai com o aumento de sua concentração e pode atingir um nível muito elevado, que só pode se explicar pelo único aumento de microtúbulos normais polime- rizados. Esses dados implicam assim a formação de estruturas de microtúbulos anormais ou de agregados não organizados de tubulina em presença do peptídeo de SEQ ID NO: 1. Por conseguinte, a figura 1 demonstra que o peptídeo SEQ ID NO: 1 tem uma ação direta sobre microtúbulos purificados e que, por conseguintes, os microtúbulos intracelulares deveriam constituir um alvo do peptídeo. Além disso, essa polimerização de microtúbulos anormais assemelha-se à polimeriza- ção de microtúbulos que ocorre em presença de uma elevada taxa de um anticancerígeno já conhecido: o Taxol. 82) Ação do peptídeo SEQ ID NO: 1: similar à ação do Taxol (figura 2).

[0051] Um outro argumento que sugere muito que o peptídeo de SEQ ID NO: 1 e o Taxol apresentam uma certa similitude em seu mecanismo de ação é demonstrada na figura 2.

[0052] O mesmo tipo de experiências que utilizam a mesma tecnologia que para B1) foi realizado para avaliar a estabilidade dos microtúbulos formados em presença de concentrações crescentes do peptídeo de SEQ ID NO: 1. Essa estabilidade é indicada pela incapacidade desses microtúbulos a se despolimerizar após um tratamento a 4°C, durante 30 minutos.

[0053] Com efeito, uma diminuição de capacidade dos microtúbulos a se despolimerizar é observada em presença de SEQ ID NO: 1,quando são submetidos à temperatura de 4°C durante 30 minutos. Essa diminuição é tanto mais importante quanto mais elevada for a concentração de SEQ ID NO: 1. Ela se torna total, caso a concentração de SEQ ID NO: 1 seja muito elevada. Os microtúbulos formados em presença de concentrações muito elevadas do peptídeo de SEQ ID NO: 1 perdem com efeito sua capacidade a se despolimerizar, quando são submetidos durante 30 minutos a uma temperatura de 4°C.

[0054] O fato de o peptideo de SEQ ID NO: 1 apresentar um mecanismo de ação muito próximo daquele do Taxol é uma vantagem certa da presente invenção. É preciso também acrescentar que as observações do requerente, demonstrando o efeito reversível do peptideo de SEQ ID NO: 1 sobre as propriedades microtubulares lhe dão uma vantagem maior em relação a outros peptídeos anti- microtubulares como as dolostatinas, cujo efeito sobre os microtúbulos é reversível.

[0055] Com testes no nível celular, é confirmado que o peptideo de SEQ ID NO: 1 tem um mecanismo de ação similar àquele do Taxol. Esses testes mostram, com efeito, que o peptideo de SEQ ID NO: 1 aumenta, de forma anormal e irrevbersível, a concentração intracelular de tubulina polimerizada e/ou agregada, induzindo assim um bloqueio do processo de mitose.

[0056] Todavia, o peptideo de SEQ ID NO: 1 não parece se ligar sobre o mesmo local da tubulina que o Taxol, pois várias linhagens obtidas a partir de tumores do seio resistentes ao taxol e que mantiveram essa propriedade de resistência em cultura. Essas células in vitro mostram uma grande sensibilidade ao peptideo de SEQ ID NO: 1 e alguns análogos desse peptideo (cf. parágrafo B9).

[0057] Essa observação é maior, pois será possível considerar uma terapia eficaz, graças ao peptideo SEQ ID NO: 1 a 25 em pacientes que não respondem ou não respondem mais a um tratamento pelo Taxol. 83) Efeito do peptideo de SEQ ID NO: 1 sobre a alteração de organi-zação da rede de microtúbulos das células cancerígenas via uma marcação por imuno fluorescência das tubulinas ligadas (figuras 3).

[0058] Para verificar a hipótese que o peptideo de SEQ ID NO: 1 poderia impedir a proliferação de células cancerígenas, alterando a rede de microtúbulos (isto é, tendo um mecanismo de ação próximo daquele do ("mecanismo taxol-like"), experiências de marcação por imunofluorescência das estruturas de microtúbulos das células tratadas ou não pelo peptídeo de SEQ ID NO: 1 foram realizados, empregando o processo descrito abaixo.

[0059] Células cancerígenas de diferentes linhagens (A549): câncer do pulmão, NMT1: melanoma, Panel: câncer do pâncreas) foram incubadas sobre lâminas de vidro com diferentes concentrações do peptídeo de SEQ ID NO: 1 durante 4 horas a 37°C. Em seguida, as células foram fixadas com PFA, lavadas com PBS e incubadas em um tampão PBS (tampão fosfato salino) contendo 1% de BSA, 0,1% de Triton X 100 durante 30 minutos a 37°C. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com um anticorpo monoclonal anti-beta tubu- lina durante a noite em uma câmara fria. Em seguida, as lâminas de vidro foram lavadas com PBS e as células foram incubadas com um anticorpo de cabra anti-camundongo acoplado ao isotiocianato de fluo- resceína (FITC) durante 60 minutos à temperatura ambiente. Após lavagem ao PBS, as células marcadas foram visualizadas com um microscópio com fluorescência. A técnica de coloração pelo dapi foi aplicada para marcar os núcleos em azul.

[0060] Tal como representado na figura 3, quando as células A 549 do câncer do pulmão são tratadas pelo peptídeo de SEQ ID NO: 1, e isto mesmo durante um curto lapso de tempo, há formação de polímeros muito densos de tubulina que são uma mistura de microtúbulos e de agregados. Quando essas células não são tratadas com o peptídeo de SEQ ID NO: 1, a rede de microtúbulos é muito organizada e não perturbada. A figura 3 mostra também o efeito de peptídeo de SEQ ID NO: 1 sobre duas outras variedades de células cancerígenas, as células de melanoma MNT-1 e as células pancreáticas PANC 1. Quando as células são tratadas com peptídeo SEQ ID NO: 1, sua rede microtubular é também alterada conforme mostra o aumento significa- tivo da fluorescência em relação à fluorescência das células não tratadas. Todavia, a alteração microtubular observada nas células MNT-1 e PANC 1 tratadas é menos importante que nas células A549. Isto pode se explicar pelo fato de que o período do tratamento não era suficiente ou pelo fato das tubulinas das linhagens MNT-1 e PANC 1 apresentarem diferenças em sua estrutura molecular em relação às tubulinas das células A549 e seriam assim capazes induzir uma redução de sua afinidade para o peptídeo SEQ ID NO: 1. 84) Atividade do peptídeo de SEQ ID NO: 1 sobre células sadias (figura 4)

[0061] A atividade específica do peptídeo de SEQ ID NO: 1 sobre as células cancerígenas e não sobre as células sadias foi confirmada pelas experiências mostradas na figura 4. Duas variedades de células fibroblásticas não tumorigênicas: FIBRO 1 e FIBRO 3 foram colocadas em contato com o peptídeo de SEQ ID NO: 1, a fim de ver se a rede de microtúbulos de células sadias era também perturbada pelo peptídeo. Ora, a figura 4 demonstra que os fibroblastos humanos que representam uma variedade de células normais não respondem totalmente ao peptídeo de SEQ ID NO: 1 (não de modificação de densidade da tubulina polimerizada), pelo menos com concentrações em peptídeo de SEQ ID NO: 1 utilizadas pelas células cancerígenas (15 pM). Essa observação representa um avanço importante da presente invenção. Muito poucos agentes antitumorais apresentam uma diferença muito grande de citotoxicidade para as células cancerígenas versus as células sadias do organismo hospedeiro (isto é, muito tóxico para as células cancerígenas e ligeiramente tóxico para as células sadias do hospedeiro).

[0062] Este último ponto tem duas consequências importantes: é, com efeito, muito provável que poucos efeitos secundários aparecerão, quando o peptídeo de SEQ ID NO: 1 e seus análogos serão em- pregados como agente terapêutico no mamífero, em particular no Homem.

[0063] Além disso, será possível aumentar de maneira significativa a eficácia do peptideo de SEQ ID NO: 1 e de seus análogos, aumentando, seja sua dosagem, seja seu tempo de tratamento. 85) medida da proliferação e da confiabilidade celulares (figura 5)

[0064] As linhagens celulares a seguir (tabela II) foram analisadas para determinar e quantificar a atividade do peptideo de SEQ ID NO: 1 na tabela II que se segue, aos fibroblastos M e N não são tumorais, os linfócitos L.1, L.3, L.4 e L.5 são leucêmicos, enquanto que os linfócitos L.6 são linfócitos normais.

[0065] Aproximadamente 10000 células fora cultivadas em um volume de 0,2 ml_ por poço em microplacas de 96 poços durante 24 horas antes do tratamento pelo peptideo de SEQ ID NO: 1. As células foram incubadas de 48 a 72 horas a 37°C em um incubador CO2 em presença ou não do peptideo de SEQ ID NO: 1 em diferentes concentrações.

[0066] Em sequência a essa incubação, 0 reagente MTT ou brometo de 3-(4,5 dimetil -2-il)-2,5 difenil tetrazólio (0,5 mg/ml em um volume de 0,1 ml) foi acrescentado a cada poço e incubado durante 2 horas a 37°C, Tabela II

[0067] O anel de tetrazólio que contém o MTT é então reduzido pelo succinato desidrogenase das células vivas em formazan. Em seguida o flutua foi retirado e 0,1 ml de tampão de lise (isopropanol contendo 10% de Triton X 100 e 10% de HCI 1N) foi acrescentado para dissolver o precipitado azul-violeta de formazan formado. Após alguns minutos, a absorbância foi determinada à temperatura ambiente, utilizando uma leitura de microplaca com um comprimento de onda teste de 562 nm. Poços que não compreendem peptídeo de SEQ ID NO: 1 foram utilizados, de maneira a controlar a confiabilidade de células de controle. Valores de IC 50 (concentração de peptídeo de SEQ ID NO: 1, provocando 50% de citotoxicidade sobre essas linhagens celulares) para cada variedade de células foram avaliadas pela relação da absorbância das células tratadas sobre a absorbância das células de controle.

[0068] Um outro método de medida da confiabilidade celular foi utilizado. Esse método consiste em efetuar uma contagem direta visual do número de células, auxiliando uma célula de Malassez, em diversas condições de tratamento. Esse método permite avaliar melhor as etapas que precedem a morte celular (melhor visibilidade ao microscópio por visão direta de células) do que pelo teste MTT.

[0069] Tal como representado na figura 5 e na tabela III, o peptídeo de SEQ ID NO: 1 1 impede a proliferação das células tumorais. Quanto mais for aumentada a dose do peptídeo de SEQ ID NO: 1, mais a proliferação de células cancerígenas será impedida. Foi observado que as doses de peptídeo SEQ ID NO: 1 tóxicos para as células cancerígenas não o são para as células normais como os linfócitos normais ou os fibroblastos. A partir do requerente, o peptídeo SEQ ID NO: 1 diminui a proliferação das células cancerígenas provavelmente alterando a formação dos microtúbulos do fuso mitótico.

[0070] Foi também observado que a sensibilidade das diferentes variedades de células tumorais varia. A tabela III abaixo prova que o valor de IC 50 é muito baixo para as células tumorais muito sensíveis, tal como a variedade de célula A549 (câncer do pulmão). O valor de IC 50 é mais alto para variedades de células menos sensíveis, tais como as células pancreáticas (variedade de células PANC 1) ou de variedades de células de melanoma humano MNT 1 (variedade de células DU 145) de variedades de células de glioblastoma (U87 - M6). Neste último caso, sensivelmente depende do tempo de exposição das células de glioblastoma com o peptídeo de SEQ ID NO: 1. Essa observação sugere que o peptídeo de SEQ ID NO: 1 poderia apresentar uma ação e uma eficácia diferente, conforme o tipo de células cancerígenas. Uma modulação da dose ou do comprimento do tratamento pode então ser considerada para agir eficazmente sobre certos tipos de cânceres. O conjunto dos resultados da tabela III mostra bem que o peptídeo de SEQ ID NO: 1 tem uma atividade antitumoral muito ampla que o peptideo de SEQ ID NO: 1 tem uma ampla atividade antitumoral que poderia ser mais importante que aquela do taxol para combater diferentes tipos de cânceres.

[0071] A tabela III mostra também a baixíssima toxicidade do peptideo SEQ ID NO: 1 em diferentes tipos de células normais como os linfócitos ou os fibroblastos.

[0072] Essa tabela mostra que o peptideo de SEQ ID NO: 1 apresenta uma atividade em um grande painel de células cancerígenas (medida da confiabilidade celular). Tabela III

B6) Efeitos do peptídeo de e sobre a estrutura da membrana plásmica (figuras 6 e 7)

[0073] Os efeitos de SEQ ID NO: 1 sobre a estrutura e propriedades da membrana plásmica foram colocados em evidência por experiências de visão direta das células tratadas ao microscópio com contraste de fase e por experiências de contagem das células que aderem e daquelas que perderam sua capacidade de aderir ao substrato.

[0074] A figura 6 mostra que, em presença do peptídeo de SEQ ID NO: 1, o número de células tumorais A549 diminuiu muito (após 2 e 4 horas de tratamento) e que, além disso, seu contorno celular é muito alterado em consequência das alterações da membrana plásmica. Isto se acrescenta às alterações que afetam a citoestrutura microtubular.

[0075] A figura 7 mostra com efeito que o número de células A 549, que conserva suas propriedades adesivas ao substrato, diminui em função do tempo de incubação e que, ao contrário, o número de células A 549 que flutuam no que flutua por causa de uma perda de adesividade ao substrato, aumenta em função do tempo de cultura.

[0076] O peptídeo de SEQ ID NO: 1, por sue caráter policatiônico modifica as propriedades das membranas plásmicas das células can-cerígena ricas em fosfolipídeos de carga negativa, desestabilizando a estrutura da dupla camada lipídica dessas células. Essa desestabiliza- ção membranária acarreta deformações celulares seja induzindo extensões citoplásmicas, seja deformações do contorno celular conforme mostra a experiência ilustrada na figura 6, na qual se vê nas células tratadas um contorno celular anormal com aumento do volume celular. A desestabilização das membranas acarreta também mudanças funcionais como a perda de adesão ao substrato de cultura conforme indica a figura 7.

[0077] Essas alterações membranárias são responsáveis por mortes celulares importantes. Portanto, o peptídeo de SEQ ID NO: 1 e certas variantes exercem um duplo efeito, citostático (inibição das mitoses) e citotóxico (mortes celulares). Esse duplo efeito amplifica a ação antitumoral desses peptídeos.

[0078] O peptídeo de SEQ ID NO: 1 e certos análogos podem não alterar somente as membranas de células cancerígenas. Eles podem alterar as membranas de outros tipos celulares, como, por exemplo, células bacterianas ou fúngicas. 87) Efeitos dos análogos do peptídeo de sequência SEQ ID NO: 1.

[0079] Os análogos ou variantes do peptídeo SEQ ID NO: 1 foram testados sobre a linhagem A549 que corresponde a um câncer do pulmão ainda muito difícil de cuidar. Os variantes testados são os seguintes: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 2.

[0080] A avaliação da atividade de diferentes variantes testadas pode ser resumida conforme seguir:

[0081] Em conclusão da análise da atividade dos variantes do pep- tideo de SEQ ID NO: 1, é possível dizer que pelo menos quatro peptí- deos que apresentam uma sequência modificada em relação àquela de SEQ ID NO: 1, a saber os peptídeos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9, têm uma atividade citotóxica intei-ramente equivalente ao peptideo SEQ ID NO: 1 face às células A 549.

[0082] Um outro resultado se refere ao peptideo de SEQ ID NO: 7. Esse peptideo se revelou não somente ativo contra as células de melanoma MNT-1 com um IC 50q eu se situa entre 10 e 15 pM e também contra as células de câncer do seio T47 com um IC50 entre 10 e 15 pM.

[0083] Além disso, aumentando-se a dosagem ou aumentando-se o tratamento no tempo dos peptídeos, será possível melhorar a eficácia do tratamento contra o câncer. Por exemplo, aumentando-se a dosagem de SEQ ID NO: 1, será possível obter melhores resultados para tratar tumores medianamente sensíveis como certos tumores pancreá- ticos PANC-1 ou o glioblastoma. 88) Resistência das células cancerígenas face os peptídeos SEQ ID NO: 1 à 25.

[0084] Enfim, segundo as indicações das experiências preliminares, o peptideo de SEQ ID NO: 1 e seus análogos apresentariam a vantagem de não induzir um processo rápido de resistência. 89) Sensibilidade de células resistentes ao taxol aos peptídeos de se-quências SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 7.

[0085] Os trabalhos foram efetuados sobre 2 linhagens de células TX1 e TX 2 derivadas de tumores do seio que não respondem mais ao Taxol. As duas linhagens mostraram uma sensivelmente muito boa a pelo menos dois peptideo a saber o peptideo de SEQ ID NO: 1 e o peptideo de SEQ 7. Mais precisamente, os resultados de inibição de crescimento descobriram já significativos após 24 H de cultura em presença desses peptídeos.

[0086] Após 48 horas de cultura em presença de peptídeos, as avaliações de inibição de crescimento são as seguintes:

[0087] Para os dois tipos de células resistentes TX1 e TX2, os peptídeo SEQ ID NO: 1 de SEQ ID NO: 7 apresentam uma sensibilidade muito boa, já que o índice IC50 avaliado se situou entre 3 e 7 pM.

Claims (5)

1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência escolhida dentre as sequência de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 7, 9, 18 e 19 .

2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é produzidos por síntese.

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo ou uma mistura de peptídeos como definido na reivindicação 1.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que se apresenta sob a forma de uma solução, de uma suspensão aquosa, ou no estado seco sob a forma de comprimidos sem revestimento ou revestidos, como as pílulas, as geleias, as cápsulas, ou os pós.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, as-sociada eventualmente a um excipiente ou um veículo inerte não tóxico farmaceuticamente aceitável, caracterizada pelo fato de que é ad- ministrável por via tópica sob a forma de aplicação cutânea, transcutâ- nea ou percutânea; oral; parenteral; nasal ou brônquica.

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