CN111344298A - 抗癌剂 - Google Patents

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Abstract

提供了一种抗癌剂，其包含肿瘤导向肽，该肿瘤导向肽具有两个半胱氨酸残基或已被修饰为存在两个半胱氨酸残基，这两个半胱氨酸残基之间具有砷原子，使得该肿瘤导向肽环化以产生一种含砷抗癌剂。这允许选择适当的肿瘤导向肽用于治疗给定的癌症，由此后续药剂向肿瘤微环境提供砷的更靶向递送。

Description

抗癌剂
技术领域
本发明涉及医疗领域。更具体地，本发明涉及与肽配位的砷以及所得复合物作为抗癌剂的用途。
发明背景
本文对背景技术的任何引用不应被解释为承认这些技术构成澳大利亚或其他地方的公知常识。
尽管三氧化二砷(As2O3，ATO)是众所周知的毒物，但是它已经在医学上使用了很长时间。1865年，砷类化合物(其中之一被称为福勒氏溶液(含1％ATO的溶液))被描述用于治疗慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)。由于它们的慢性毒性，它们在20世纪中叶被耐受性更好的药物替代。然而，在大规模临床筛选之后，已经在某些人类癌症如白血病、食管癌和淋巴瘤中鉴定了ATO的治疗效果。目前它被用于治疗血液恶性肿瘤如急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia)。
砷通过涉及许多细胞靶标的多种机制表现出其毒性和相反的治疗效果。砷容易与半胱氨酸或甲硫氨酸氨基酸残基(发现于蛋白质/酶中)中的硫结合，从而破坏广泛的细胞功能并最终导致细胞死亡。被三价砷靶向的蛋白质的一些充分研究的实例包括谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)、硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase)、线粒体腺嘌呤核苷酸易位酶(ANT)和微管蛋白。这些相互作用中的任何一种相互作用都导致细胞死亡。例如，线粒体在细胞内产生能量，从而破坏其功能导致细胞死亡。砷与微管蛋白的相互作用破坏了微管形成，阻止了细胞复制。另外，砷在细胞核内的积累导致DNA断裂。
急性早幼粒细胞白血病(APL)是一种侵袭性形式的白血病，如果不治疗，其可在三个月内引起死亡。目前最有效的APL治疗方法之一是ATO，它可以成功治愈85％接受其他疗法复发的患者。ATO于2015年底被批准用于一线APL组合疗法。它表现出多方面的行为，有利于克服抗性；因此，它引起了人们对治疗其他多种癌症特别是血液恶性肿瘤的极大兴趣。
不幸的是，ATO引起毒性副作用，这可能限制了在APL和其他癌症的治疗中可以施用的抗癌药物的剂量。这可能导致不完全的肿瘤反应、不良心脏事件的发展、药物抗性、治疗的中断和最终疾病的进展。毒副作用的根本原因源于含砷抗癌药物如ATO无差别地杀死癌细胞和健康细胞的事实。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了抗癌剂，其包含具有键合至两个半胱氨酸残基的砷原子的环化肿瘤导向肽(cyclised tumour homing peptide)。
合适地，与两个半胱氨酸残基键合的砷原子允许肿瘤导向肽是环状的。也就是说，正是砷在两个半胱氨酸之间的桥接产生了环化的肿瘤导向肽。
在一个实施方案中，肿瘤导向肽的两个砷键合的半胱氨酸残基彼此之间被少于20个氨基酸残基隔开。
在某些实施方案中，肿瘤导向肽的两个砷键合的半胱氨酸残基被少于18个氨基酸残基、或少于16个氨基酸残基、或少于15个氨基酸残基、或少于14个氨基酸残基隔开。
在实施方案中，在环化形成抗癌剂之前，键合砷原子的两个半胱氨酸残基分别是肿瘤导向肽的N-末端肽残基和C-末端肽残基。
如果不是天然存在于肿瘤导向肽上，则可以将键合砷原子的两个半胱氨酸残基添加到肿瘤导向肽上，从而分别形成N-末端肽残基和C-末端肽残基。
N-末端半胱氨酸可包含与其末端氨基氮键合的封端基团。
在一个实施方案中，抗癌剂还包含与砷原子键合的稳定基团。
合适地，稳定基团选自由以下组成的组：羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、环烷基和杂环基。
在实施方案中，肿瘤导向肽包含至少一个精氨酸残基和/或赖氨酸残基。
在一个实施方案中，抗癌剂具有式I所示的结构：
Figure BDA0002453272340000031
其中，与砷键合的硫原子是相应半胱氨酸残基的巯基硫(thiol sulfur)；
式I中的半胱氨酸残基被曲线所代表的少于20个氨基酸残基隔开；以及
R是稳定基团，其选自由以下组成的组：羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基，C1-C6烷氧基、芳基、环烷基、谷胱甘肽巯基(glutathiyl)和杂环基，其中每个基团可以是取代的或未取代的。
根据本发明的第二方面，提供了药物组合物，其包含第一方面的抗癌剂以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
根据本发明的第三方面，提供了治疗患者癌症的方法，包括以下步骤：向患者施用第一方面的抗癌剂或第二方面的药物组合物从而治疗癌症。
本发明的第四方面在于用于治疗患者癌症的第一方面的抗癌剂。
本发明的第五方面在于第一方面的抗癌剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
关于第三方面至第五方面，在一个实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤或实体瘤。
根据本发明的第六方面，提供了制备抗癌剂的方法，包括以下步骤：
(a)使包含两个半胱氨酸残基的肿瘤导向肽与砷化合物接触；以及
(b)使砷与两个半胱氨酸残基中的每一个结合以形成包含结合的砷原子的环化肿瘤导向肽；
由此制备抗癌剂。
抗癌剂可以如第一方面所述。
砷化合物可以是砷的氧化物。
在一个实施方案中，砷化合物可以包含与砷键合的烷基、羟基或芳基基团。
在一个实施方案中，所述方法可包括修饰选定的肿瘤导向肽以产生(present)两个半胱氨酸残基的步骤(a)(i)。
本发明的第七方面在于通过第六方面的方法制备的抗癌剂。
本发明的第八方面在于向患者递送治疗有效量的砷的方法，该方法包括以下步骤：向患者施用适当量的第一方面的抗癌剂或第二方面的药物组合物，从而递送治疗有效量的砷。
第八方面的方法可以包括针对第一方面描述的任何实施方案。
本发明的第九方面在于诊断癌症的方法，包括以下步骤：
(i)向患者施用包含至少一个放射性标记原子的第一方面的抗癌剂；
(ii)使抗癌剂定位于癌症；以及
(iii)检测抗癌剂的至少一个放射性标记的原子的存在，
由此诊断癌症。
在以上各个部分中提及的本发明的各种特征和实施方案，在适当的情况下，加以必要的变更，适用于其他部分。因此，在一个部分中指定的特征可以与在其他部分中指定的特征适当地组合。
通过下面的详细描述，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
为了可以容易地理解本发明并将其付诸实践，现在将参考附图通过示例来描述优选实施方案，其中：
图1A显示了LHP的正离子ESI-质谱，其中在m/z 407.4和m/z 610.5处的峰分别归属为[LHP+3H+]3+和[LHP+2H+]2+。图1B描述了AsI3和LHP在(a)磷酸盐缓冲液(pH 8)和(b)三乙胺(pH 8)中8h反应的ESI-MS结果，其中在m/z 431.4和m/z 646.8处的峰分别归属为[HyAs(LHP)+3H+]3+和[HyAs(LHP)+2H+]2+，证实了期望的产物HyAs(LHP)的产生。M/z 407.6、m/z 610.5和m/z 628.8处的离子分别归属为游离肽、[LHP+3H+]3+、[LHP+2H+]2+和[LHP.2H2O+2H+]2+。M/z 837.9处的离子鉴定为[HyAs(LHP)2+3H+]3+；图1C是在37℃温育16h后MMA(V)和LHP在磷酸盐缓冲液(pH 8)中反应的ESI-MS结果。m/z 437.1[MeAs(LHP)+3H+]3+、m/z 444.8[MeAs(LHP)+Na++2H+]3+、m/z 655.1[MeAs(LHP)+2H+]2+和m/z 666.4[MeAs(LHP)+Na++H+]2+处的离子证实了期望的产物MeAs(LHP)的产生。游离肽离子出现在m/z 407.6[LHP+3H+]3+、*＝m/z 414.9[LHP+Na++2H+]3+、m/z 610.5[LHP+2H+]2+、m/z 629.6[LHP+Na++H+]2+处；图1D显示了在37℃温育4h后，PAO和LHP在磷酸盐缓冲液(pH 8)中反应的ESI-MS结果，具m/z 457.6[PhAs(LHP)+3H+]3+和m/z 685.5[PhAs(LHP)+2H+]2+处的离子，证实了期望的产物PhAs(LHP)的产生。游离肽离子出现在m/z 407.6[LHP+3H+]3+和m/z 610.5[LHP+2H+]2+处；
图2A是来自分析型HPLC的一系列HPLC迹线，针对(a)LHP(顶部迹线中约15min的峰；第二迹线中约14min和17min的峰；第三迹线中约14min和19min的峰；以及第四迹线中约15min和22min的峰；)(b)HyAs(LHP)；(c)MeAs(LHP)；(d)PhAs(LHP)。在所有色谱图中，游离肽(LHP)出现在14.5min，特定的复合物出现在以下时间：(b)在17.2min的HyAs(LHP)峰，(c)在18.1min的MeAs(LHP)和(d)在22.1min的PhAs(LHP)；图2B是表征纯化(a)HyAs(LHP)；(b)MeAs(LHP)；(c)PhAs(LHP)后的化合物的一系列正离子ESI质谱。圆形＝[LHP+3H+]3+；矩形＝[HyAs(LHP)+3H+]3+；星形＝[LHP+2H+]2+；三角形＝[HyAs(LHP)+2H+]2+；X＝[MeAs(LHP)+3H+]3+；十字形＝[MeAs(LHP)+2H+]2+；垂直菱形＝[PhAs(LHP)+3H+]3+；水平菱形＝[PhAs(LHP)+2H+]2+；
图3是从As标准品和As-LHP化合物的固体样品获得的As K-边缘XANES光谱的图示，指示了砷LHP复合物的结构完整性，其中氧化态是As3+并且砷与两个硫原子和R基团结合；
图4是HyAs(LHP)固体样品的EXAFS分析(左)和相应的傅立叶变换(右)的图示，其显示了如表6所示的拟合3(2S和1O)的实验(黑色)数据和计算(红色)数据；证实了As3+与2个硫原子和1个氧原子结合；
图5是MeAs(LHP)固体样品的EXAFS分析(左)和相应的傅立叶变换(右)的图示，其显示了使用如表7所示的拟合4(2S和1C)的单次散射拟合(第一配位壳)的实验(黑色)数据和计算(红色)数据；证实了As3+与2个硫原子和1个碳原子结合；
图6是PhAs(LHP)的固体样品的EXAFS分析(左)和相应傅立叶变换(右)的图示，其显示了使用如表8所示的拟合4(2S和1C)的单次散射拟合(第一配位壳)的实验(黑色)数据和计算(红色)数据；证实了As3+与2个硫原子和1个碳原子结合；
图7是在37℃在MilliQ水中进行的PAO(10mM)与LHP(3mM)的反应产物的反相制备型HPLC色谱图。通过ESI-MS证实每个主要级分的身份。PAO在13.28min洗脱，PhAs(LHP)在15.99min和16.86min洗脱。次要级分的成分的身份尚未证实；
图8是(a)级分1和(b)级分2的正离子ESI质谱。峰鉴定为：m/z 407.5＝[LHP+3H+]3+，m/z 414.1＝[LHP+2H++Na+]3+，m/z 457.4＝[PhAs(LHP)+3H+]3+，m/z 463.5＝[PhAs(LHP)+3H++H2O]3+，m/z 610.7＝[LHP+2H+]2+，m/z 619.8＝[LHP+2H++H2O]2+，m/z 685.5＝[PhAs(LHP)+2H+]2+，m/z 696.7＝[PhAs(LHP)+H++Na+]2+，证实每个级分是相同的化合物PhAs(LHP)；
图9是鉴定为PhAs(LHP)的分离级分的反相分析型HPLC色谱图。(a)级分1：在15.97min和16.85min洗脱的PhAs(LHP)(b)级分2：在15.97min和16.87min洗脱的PhAs(LHP)，证明两种异构体的自发相互转化；
图10是Milli-Q水中的HyAs(LHP)在0h(蓝色，最左边的迹线和峰)和4h(红色，在亚砷酸盐迹线之后，具有较低的峰值)的As K-边缘XANES光谱，显示在该时间段内缺乏稳定性。4h光谱与亚砷酸盐的光谱(绿色)相似；
图11是Milli-Q水中的MeAs(LHP)在0h(蓝色，由于与14h光谱重叠而不可见)和14h(红色)的As K-边缘XANES光谱，显示在该时间段内良好的稳定性。两个光谱之间的残差用绿色表示；
图12是Milli-Q水中的PhAs(LHP)在0h(蓝色，由于与14h光谱重叠而不可见)和14h(红色)的As K-边缘XANES光谱，显示在该时间段内优异的稳定性。两个光谱之间的残差用绿色表示；
图13是IMDM(细胞培养基)中的MeAs(LHP)在0h(蓝色，略微较高的峰和较低的重叠迹线波谷)和24h(红色)的As K-边缘XANES光谱，显示出在该时间段内合理的稳定性。两个光谱之间的残差(绿色)显示出两个光谱之间、特别是在后边缘波谷的区域的异常；
图14是IMDM中的PhAs(LHP)在0h(蓝色，由于与24-h光谱重叠仅略微可见，重叠迹线的略微较低的峰和较低的波谷)和24h(红色)的As K-边缘XANES光谱，显示出在该时间段内良好的稳定性。两个光谱之间的残差用绿色表示；
图15是处理24-h后针对K562细胞上的MTT分析所产生的一系列浓度-反应曲线。测试的化合物包括：(A)目前的砷类药物：乙酰砷胺、亚砷酸盐、ATO；(B)起始材料和肽：AsI3、PAO、LHP、sLHP；(C)砷类肽：HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)和PhAs(sLHP)；这些曲线用于计算每种化合物的IC50，其中较低的IC50指示了毒性更高的化合物；
图16显示了在处理24-h后从K562细胞上的MTT分析中获得的特定As化合物的IC50值的比较结果，显示了砷类肽复合物(arsenic peptide complexes)毒性的改善；
图17是在处理24-h后从HL-60细胞上的MTT分析中获得的特定As化合物的IC50值的比较结果的图示，显示了含有靶向肽(targeting peptide)的PhAs(LHP)的良好毒性和含有混杂肽(scrambled peptide)(不再靶向)的PhAs(sLHP)的大大降低的毒性；
图18显示了在处理24-h后从Kasumi-1细胞上的MTT分析中获得的特定As化合物的IC50值的比较，显示了相比于其衍生物PhAs(sLHP)、亚砷酸盐、ATO和PAO，PhAs(LHP)的毒性显著改善；
图19是在处理24-h后从KARPAS 45细胞上的MTT分析中获得的特定As化合物的IC50值的比较结果的图示，显示了含有靶向肽的PhAs(LHP)的良好毒性和含有混杂肽(不再靶向)的PhAs(sLHP)的大大降低的毒性；
图20是在处理24-h后从HepG2细胞上的MTT分析中获得的特定As化合物的IC50值的比较结果；指示PhAs(LHP)对这些未被肽靶向的快速生长的癌细胞毒性较小；
图21是在处理24-h后从中国仓鼠(CH)实体瘤细胞上的MTT分析中获得的特定As化合物的IC50值的比较结果的图示，指示PhAs(LHP)对这些未被肽靶向的快速生长的癌细胞毒性较小；
图22是在处理24-h后从hPBMC上的MTT分析中获得的特定As化合物的IC50值的比较结果的图示，指示PhAs(LHP)对这些正常细胞的毒性较小；
图23是在处理24-h后各个细胞系的PhAs(LHP)的IC50值的比较，显示了PhAs(LHP)对白血病细胞系(肽靶向的K562、HL-60、Kasumi-1和KARPAS 45)的良好毒性，在粘附的快速生长癌细胞系(未被肽靶向的HepG2、A549和CH实体瘤细胞)中的毒性大大降低，以及在正常血细胞(也未被肽靶向的hPBMC)中的毒性也降低；
图24是在处理24-h(1.5μM As)后与特定细胞系相关的细胞As浓度的总结图。结果表示为一式三份样品(triplicate samples)的平均值和标准偏差。结果显示了用PhAs(LHP)处理后白血病细胞系中的选择性As摄取和在非白血病细胞中没有可检测的As摄取；
图25是PhAs(LHP)(1mM)在MilliQ水中和PhAs(LHP)处理的K562细胞(4h和24h，重叠迹线的下线)中的As K-边缘XANES光谱，显示As保持为As(III)，但存在As-S结合的细胞内修饰；
图26是PhAs(LHP)(1mM)在MilliQ水中和PhAs(LHP)处理的HL-60细胞(4h和24h，重叠迹线的下线)中的As K-边缘XANES光谱，显示As保持为As(III)，但存在As-S结合的细胞内修饰；
图27是甲苯胺蓝染色的薄切片对照和PhAs(LHP)处理的K562细胞的一系列显微照片图像。(a)K562对照细胞(b)PhAs(LHP)处理的K562细胞(10μM，4h)(c)PhAs(LHP)处理的K562细胞(10μM，24h)，显示了PhAs(LHP)处理后的应激和细胞死亡；
图28是薄切片的甲苯胺蓝染色对照和PhAs(LHP)处理的K562细胞的一系列显微照片图像和相关的微探针SR-XRF元素图。(a)K562对照细胞(b)PhAs(LHP)处理的K562细胞(10μM，4h)(c)PhAs(LHP)处理的K562细胞(10μM，24h)。操作条件包括：射束能量＝11.9keV；射束尺寸＝0.3×0.3μm2；步长＝0.3μm；停留时间＝2.5s/pt；以及扫描尺寸(H×V)＝(a)20×21μm2；(b)26×18μm2；(c)23×21μm2。这显示了在PhAs(LHP)处理后As在细胞核中的定位；
图29显示了暴露于PhAs(LHP)(10μM，24h)的K562细胞的甲苯胺蓝染色的薄切片(a)相关光显微照片图像(b)P、Zn和As的相应微探针SR-XRF图和三种元素的共定位图。这显示了在PhAs(LHP)处理后As在细胞核中的定位；
图30是甲苯胺蓝染色的薄切片对照和PhAs(LHP)处理的HL-60细胞的一系列显微照片图像。(a)HL-60对照细胞(b)PhAs(LHP)处理的HL-60细胞(10μM，4h)(c)PhAs(LHP)处理的HL-60细胞(10μM，24h)，显示了PhAs(LHP)处理后的应激和细胞死亡；
图31是薄切片的甲苯胺蓝染色对照和PhAs(LHP)处理的HL-60细胞的显微照片图像和相关微探针SR-XRF元素图。(a)HL-60对照细胞(b)PhAs(LHP)处理的HL-60细胞(10μM，4h)(c)PhAs(LHP)处理的HL-60细胞(10μM，24h)。操作条件包括：射束能量＝11.9keV；射束尺寸＝0.3×0.3μm2；步长＝0.3μm；停留时间＝2.5s/pt；以及扫描尺寸(H×V)＝(a)15×11μm2；(b)13×14μm2；(c)16×14μm2。这表明在处理4h至24hAs的摄取增加，其中在核中显著积累；
图32是暴露于PhAs(LHP)(10μM，24h)的HL-60细胞的甲苯胺蓝染色的薄切片(a)相关光显微照片图像(b)P、Zn和As的相应微探针SR-XRF图和三种元素的共定位图。这表明在用PhAs(LHP)处理后As在细胞核中显著积累；
图33是溶解在MilliQ水中的合成的NH2PhAs(III)的正离子ESI质谱(m/z 160-400)，峰显示为：m/z 184.0，[NH2-Ph-As＝O+H]+；m/z 202.0,[NH2-Ph-As-(OH)2+H]+；m/z220.0，未鉴定；m/z 259.0，[NH2-Ph-As-Cl2+Na]+；m/z 279.1，[P(Ph)3O+H]+，证实了NH2PhAs(III)的产生；
图34是固体标准品和合成的NH2PhAs(LHP)和NH2PhAs(III)的As K-边缘XANES光谱。光谱包括为亚砷酸盐、对氨基苯胂酸、PhAs(GS)2、PAO和NH2PhAs(LHP)采集的数据，指示了NH2PhAs(LHP)中的As是As(III)并且可能与S结合；
图35是由合成的对氨基苯基二氯胂/对氨基氧化苯胂(3mM)和LHP(1mM)在MilliQ水中于37℃反应16h后获得的产物的正离子ESI质谱(m/z 240-1500)，峰显示为：m/z259.1，[NH2-Ph-As-Cl2+Na]+；m/z 407.2，[LHP+3H]3+；m/z 462.4，[NH2-Ph-As(LHP)+3H]3+；m/z 610.1，[LHP+2H]2+；m/z 693.0，[NH2-Ph-As(LHP)+2H]2+，证实了NH2PhAs(LHP)的产生；
图36是NH2PhAs(LHP)的EXAFS分析(左)和相应的傅立叶变换(右)，其显示了使用单散射拟合(第一配位壳)的实验(––)数据和计算(---)数据。这证实了As与2S和1C结合；
图37是溶解在甲醇中的合成的对氯苯胂酸的正离子ESI质谱(m/z 160-600)，峰显示为：m/z 219.0，[OH-Ph-AsH2O3+H]+；m/z 236.9，[Cl-Ph-AsH2O3+H]+；m/z 141.0，污染物；m/z 158.0，污染物，证实了Cl-Ph-AsH2O3的产生；
图38是固体标准品和合成的ClPhAs(LHP)(第一迹线在底部系列迹线上升至峰值)和ClPhAs(V)的As K-边缘XANES光谱。标准品包括：亚砷酸盐、对氨基苯胂酸(后迹线在中间系列迹线中上升)、PhAs(GS)2和PAO。这指示了ClPhAs(LHP)中的As是As(III)并且可能与S结合；
图39是由ClPhAs(V)(1mM)与LHP(3mM)在MilliQ水中于37℃反应72h获得的产物的正离子ESI质谱(m/z 240-1400)，峰显示为：m/z 406.8，[氧化的LHP+3H]3+；m/z 468.8，[Cl-Ph-As(LHP)+3H]3+；m/z 609.5，[氧化的LHP+2H]2+；m/z 702.5，[Cl-Ph-As(LHP)+2H]2+，证实了ClPhAs(LHP)的产生；
图40是从制备型HPLC获得的第一ClPhAs(LHP)级分的EXAFS分析(左)和相应的傅立叶变换(右)，其显示了使用单散射拟合(第一配位壳)的实验(––)数据和计算(---)数据。这证实了As与2S和1C结合；
图41是溶解在甲醇中的合成的对碘苯胂酸的正离子ESI质谱(m/z 100-600)。峰归属为：m/z 328.8,[I-Ph-AsH2O3+H]+；m/z 141.0，污染物；m/z 158.0，污染物；这证实了IPhAsH2O3的产生；
图42是固体标准品和合成的IPhAs(LHP)(底部迹线对的第一迹线上升至峰值)和IPhAs(V)的As K-边缘XANES光谱。标准品包括：亚砷酸盐、对氨基苯胂酸(中间系列迹线的后者上升至峰值)、PhAs(GS)2和PAO。这指示了IPhAs(LHP)中的As是As(III)并且可能与S结合；
图43是由合成的对碘苯胂酸(1mM)和LHP(3mM)在MilliQ水中于37℃反应72h后获得的产物的正离子ESI质谱(m/z 240-1400)。峰：m/z 406.8，[氧化的LHP+3H]3+；m/z 499.3，[I-Ph-As(LHP)+3H]3+；m/z 609.5，[氧化的LHP+2H]2+；m/z 748.5，[I-Ph-As(LHP)+2H]2+，证实了IPhAs(LHP)的产生；以及
图44是从制备型HPLC获得的第一IPhAs(LHP)级分的EXAFS分析(左)和相应的傅立叶变换(右)，其显示了使用单散射拟合(第一配位壳)的实验(––)数据和计算(---)数据。这证实了As与2S和1C结合。
具体实施方式
本发明至少部分基于以下认识：砷原子可以稳定地连接于具有或已经被修饰而存在两个半胱氨酸残基的肿瘤导向肽，优选具有N-末端半胱氨酸残基和C-末端半胱氨酸残基的肿瘤导向肽，使得肿瘤导向肽环化以产生一种高选择性含砷抗癌剂。这允许选择适当的肿瘤导向肽用于治疗给定的癌症，由此后续药剂向肿瘤微环境提供砷的更靶向的递送。
令人惊奇的是，一旦肿瘤导向肽连接到砷，含砷抗癌剂就相当稳定，使得它可以以高度特异性和选择性的方式被配制并递送到肿瘤部位。同时，砷原子是生物可利用的，以对肿瘤细胞发挥其破坏作用。鉴于肿瘤导向肽相对于所结合的砷的大小以及半胱氨酸巯基(thiol group)与砷的键合强度，这种结果是无法预测的。这提供了在对癌症类型具有高度选择性的药剂中以有效和高效的方式递送砷的机会。由于选择肿瘤导向肽的能力，多种癌症可以以这种选择性方式被靶向。
定义
现在参考本文一般使用的术语，术语“烷基(alkyl)”是指含有例如1至约6个碳原子、优选1至约4个碳原子、还更优选1至2个碳原子的直链或支链烷基取代基。被认为包括在这些范围内的这样的取代基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。所涉及的碳的数目涉及碳主链和碳支链，但不包括属于任何取代基的碳原子，例如从主碳链上分支的烷氧基取代基的碳原子。
本文所用的术语“烯基(alkenyl)”是指含有至少一个碳-碳双键和例如2至6个碳原子(支链烯基具有3至6个碳原子)、优选2至5个碳原子(支链烯基优选3至5个碳原子)、更优选2至4个碳原子的直链烯基取代基。被认为包括在这些范围内的这样的取代基的实例包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、仲丁烯基、异丁烯基、叔丁烯基、戊烯基、异戊烯基、己烯基等。
本文所用的术语“炔基(alkynyl)”是指含有至少一个碳-碳三键和例如2至6个碳原子(支链炔基具有3至6个碳原子)、优选2至5个碳原子(支链炔基优选3至5个碳原子)、更优选2至4个碳原子的直链炔基取代基。被认为包括在这些范围内的此类取代基的实例包括乙炔基、丙炔基、异丙炔基、正丁炔基、仲丁炔基、异丁炔基、叔丁炔基、戊炔基、异戊炔基、己炔基等。
术语“环烷基(cycloalkyl)”是指任选取代的饱和单环、双环或三环碳基团。适当时，环烷基可以具有指定数量的碳原子，例如，C3-C6环烷基是具有3、4、5或6个碳原子的碳环基团。非限制性实例可包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
术语“芳基(aryl)”指未取代的或取代的芳族碳环取代基，如本领域通常理解的。应理解，根据Hückel规则，术语芳基适用于平面的且包含4n+2π个电子的环状取代基。苯基(可以是取代的或未取代的)是作为连接到砷原子的稳定基团的优选的芳基。
“杂环的(heterocyclic或heterocycle)”是指优选环中具有5至7个原子的芳族或非芳族环，并且在这些原子中，1至4个是杂原子，所述环是单独的或稠合至第二环上，其中所述杂原子独立地选自O、N和S。杂环包括部分饱和和完全饱和的杂环基团。杂环体系可以经由该基团的任何数量的碳原子或杂原子与另一部分连接，并且可以是饱和的和不饱和的。杂环包括氮杂环。杂环的非限制性实例包括二氢吲哚、吡咯烷基、吡咯啉基、吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、四氢呋喃基、四氢苯硫基(tetrahydrothiophenyl)、吡唑啉基、二硫醇基(dithiolyl)、氧杂硫醇基(oxathiolyl)、二噁烷基(dioxanyl)、二噁英基(dioxinyl)、噁嗪基、氮杂卓基(azepinyl)、二氮杂卓基、硫氮杂卓基(thiazepinyl)、氧杂卓基(oxepinyl)和硫杂卓基(thiapinyl)、咪唑啉基、硫代吗啉基等。
在描述的任何实施方案中，术语“取代的(substituted)”(如本文中称为“取代的或未取代的”)或“任选取代的(optionally substituted)”等可以指该部分被选自以下的基团取代：C1-C6烷基、芳基(包括本身可以被甲基、乙基、丙基、卤素、硝基、C1-C6烷氧基和谷胱甘肽巯基取代的苯基)、环烷基、羧基，谷胱甘肽巯基(glutathiyl)、卤素、硝基和卤代烷基。这些基团中的每一个本身可以被相同的基团或不同的基团取代。
本文所用的术语“肿瘤导向肽(tumour homing peptide)”是指具有识别和结合(任选地和/或被摄取进入)肿瘤细胞或组织、肿瘤血管、淋巴管和其他肿瘤相关微环境的能力的相对短的肽。它们在本领域中也可称为“肿瘤特异性内在化肽(tumour-specificinternalizing peptide)”和“肿瘤穿透肽(tumour penetrating peptide)”。肿瘤导向肽的性质没有特别限制，尽管它们必须存在至少两个半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基能够与一个砷原子键合，或能够被调整存在两个这样的半胱氨酸残基。各种各样的这类肽是可商购的，并且实际上可以按订单生产。
如本文中通常使用的，术语“施用(administering、administration)”等描述了例如通过特定途径或载体将抗癌剂或组合物引入哺乳动物。施用途径可包括局部、肠胃外和肠内，其包括口服、口腔、舌下、鼻、肛门、胃肠、皮下、静脉内、肌内和皮内施用途径，尽管不限于此。
“治疗(treat、treatment、treating)”是指将抗癌剂或组合物施用于受试者以至少改善、降低或抑制受试者经历的疾病、病症或病状(例如癌症)的现有体征或症状。
如本文所用，“有效量(effective amount)”是指施用足以预防所治疗病症的症状发生，或使症状恶化停止或治疗和减轻或至少降低症状严重程度的量的相关抗癌剂或组合物。有效量将以本领域技术人员理解的方式随患者年龄、性别、体重等而变化。可以通过常规试验确定合适的剂量或给药方案。
抗癌剂
在一种形式中，提供了包含具有与两个半胱氨酸残基键合的砷原子的环化肿瘤导向肽的抗癌剂。
合适地，与两个半胱氨酸残基键合的砷原子允许肿瘤导向肽是环状的。也就是说，砷与每个半胱氨酸的硫(sulfur)键合，从而形成具有砷桥的环肽结构。据信砷与二巯基(dithiol)(每个半胱氨酸的一个巯基)的相互作用产生比用单巯基-砷键合可实现的更稳定的抗癌剂。
由于在典型的纯化和表征过程中这些复合物的不稳定性，已经证明天然存在的砷-肽种类(arsenic-peptide species)难以分离和纯化。这极大地限制了砷-肽类复合物的治疗用途。因此，本发明的抗癌剂提供了显著的优点，因为它们可以被纯化、表征和储存，同时仍然保持功效。
在一个实施方案中，肿瘤导向肽的两个砷键合的半胱氨酸残基彼此被少于20个氨基酸残基隔开。
在某些实施方案中，肿瘤导向肽的两个砷键合的半胱氨酸残基被少于18个氨基酸残基、或少于16个氨基酸残基、或少于15个氨基酸残基、或少于14个氨基酸残基隔开。这些上限值中的任一个可与一个或两个氨基酸残基的下限范围相结合。
已经发现半胱氨酸残基之间的氨基酸数量在预测肽是否将环化并形成砷桥中是重要的。将与砷键合的半胱氨酸之间氨基酸残基的优选范围可选自2至15个残基、3至15个残基、4至15个残基、5至15个残基、2至14个残基、3至14个残基、4至14个残基和5至14个残基。
在实施方案中，在环化之前，结合砷原子的两个半胱氨酸残基分别形成肿瘤导向肽的N-末端肽残基和C-末端肽残基。优选肿瘤导向肽的每个末端氨基酸是半胱氨酸，因为这改善了环化并促进了各自的半胱氨酸巯基之间的砷桥接(arsenic bridging)。环化肽的形成是关键步骤，因为在大多数情况下，肽的环化构象被相关受体识别。
N-末端半胱氨酸可包含与其游离氨基氮键合的封端基团。不希望受任何特定理论的束缚，据信，封端基团在插入砷原子之前基本上起着防止肿瘤导向肽的环化和/或聚合的作用，或至少限制N-末端残基和C-末端残基的缔合以更好地促进砷键合。因此，封端基团对于有效的砷摄取和结合可能是重要的。封端基团可以由任何能够与氨基氮反应并形成相对非反应性/稳定封端基团的N-末端封端化合物形成。
因此，在一个实施方案中，封端基团是氨基反应性基团。任何具有用于与半胱氨酸氨基反应的羧酸的化合物都是合适的。优选的是，这种具有羧酸的化合物也具有非反应性部分。在优选的实施方案中，封端基团是烷酰基(alkanoyl group)，例如可以任选被取代的C2-C6烷酰基。各种类型的合适封端剂(capping agent)的具体实例可包括乙酰基、焦谷氨酸、吲哚类、苯并咪唑类、苯并咪唑酮类(benzimidazolones)、Fmoc等。较小的惰性封端基团是优选的，因此，在一个优选的实施方案中，封端基团是乙酰基。本领域技术人员应当理解，这种N-末端封端基团是本领域已知的，将它们定位在肿瘤导向肽上期望的位置的方法也是如此。
在一个实施方案中，抗癌剂还包含与砷原子键合的稳定基团(stabilisinggroup)。稳定基团通常已经与用于接触肿瘤导向肽的砷化合物中的砷原子结合。已经发现，稳定基团的选择可以对抗癌剂的稳定性具有显著的积极作用，并因此对其在治疗方法中的持续效力具有显著的积极作用。
合适地，稳定基团选自由以下组成的组：羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、芳基、环烷基、杂环基以及包括谷胱甘肽巯基的短链肽，每个基团可以是取代的或未取代的。
在一个实施方案中，稳定基团选自由以下组成的组：羟基、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C1-C4烷氧基、C5或C6芳基、C5或C6环烷基、C5或C6杂环基和谷胱甘肽巯基，每个基团可以是取代的或未取代的。
在某些实施方案中，稳定基团选自由以下组成的组：羟基、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基以及取代的或未取代的苯基。
当稳定基团是取代的苯基时，则取代基可以是羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、谷胱甘肽巯基、精氨酸、赖氨酸、卤素、C1-C4卤代烷基、硝基、氨基、仲胺或叔胺、酰胺基、醚和酯。
优选的取代基包括氨基(即NH2)、羟基、甲氧基、乙氧基、氟、氯和碘。
苯基上的取代可以位于砷原子连接点的邻位、间位或对位。优选地，取代是在砷原子对位的单取代。
在实施方案中，肿瘤导向肽包含至少一个精氨酸残基和/或赖氨酸残基。精氨酸和赖氨酸可以是优选的，因为这种带正电荷的氨基酸可以与带负电荷的细胞表面蛋白相互作用以改善肿瘤导向肽的内化。
第一方面的某些抗癌剂可以含有手性中心，其可以是(R)构型或(S)构型，或者当使用时，可以作为其混合物施用。因此，本发明还包括本文所述药剂的立体异构体，在适用的情况下，可以单独或以任何比例混合。这些立体异构体可以使用如实例中所述常规技术分离，例如HPLC。
特别地，砷原子可以是手性中心并且与其连接的环肽可以导致R异构体和S异构体的形成。本文的结构被认为明确涵盖R异构体和S异构体。已经发现，对映异构体可以在合成过程中自发形成，并且可以用作外消旋混合物。然而，应当理解，在一些实施方案中，可能需要分离和使用对映异构体纯形式或至少用一种异构体富集组合物。
在一个实施方案中，抗癌剂具有式I所示的结构：
Figure BDA0002453272340000171
其中，所示的与砷键合的硫原子是相应半胱氨酸残基的巯基硫；
式I中的半胱氨酸残基被曲线所代表的少于20个氨基酸残基隔开；以及
R是包含选自羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、芳基、环烷基、杂环基以及包括谷胱甘肽巯基的短链肽的部分的稳定基团，每个基团可以是取代的或未取代的。
稳定基团“R”可以包含或选自先前描述的那些稳定基团。
“R”的合适短链肽可以是或包含具有4至20个、优选4至16个或4至10个氨基酸残基的那些。
连接两个半胱氨酸残基的氨基酸链如前所述可以是氨基酸残基长度的形式。N-末端半胱氨酸还可以具有如前所述的封端基团。
因此，在一个实施方案中，式I的抗癌剂可以具有式II所示的结构：
Figure BDA0002453272340000181
其中，各种原子和基团如针对式I所述；
封端基团由氨基反应性化合物形成；以及
W为2至20个氨基酸残基。
应当理解，封端基团和半胱氨酸残基之间的“-NH”基团可以是-NH，它是半胱氨酸残基本身的一部分。即，-NH可以是标准半胱氨酸-NH2部分，封端基团已经与之结合形成“-NH-封端基团”。
由“W”表示的氨基酸残基的数量可以选自先前讨论的那些值中的任何一个，包括少于18个氨基酸残基、或少于16个氨基酸残基、或少于15个氨基酸残基、或少于14个氨基酸残基。这些上限值中的任何一个可以与两个氨基酸残基的下限范围相结合。
应当理解，尽管式I和II的结构可能是优选的，但它们不是被认为适用于本发明的唯一结构。特别地，不需要肽具有末端半胱氨酸残基，而仅需要存在两个这样的氨基酸，并且它们被足够数量的残基分开以允许与砷原子环化。
在一个实施方案中，砷原子将在两个半胱氨酸残基之间与之键合以形成桥的肿瘤导向肽可以选自由以下组成的组：
1.CAYHRLRRC；
2.CDCRGDCFC；
3.CPIEDRPMC；
4.CNRRTKAGC；
5.CGTKRKC；
6.CRGDGWC；
7.CVSNPRWKC；
8.CHVLWSTRC；
9.CLDGGRPKC；
10.GCSVSSVGALCTHV；
11.CRGDGWC；
12.CDCRGDCFC；
13.CVNHPAFAC；
14.CRGDRGPDC；
15.CRGDKTTNC；
16.CRGDHAGDC；
17.CLSYYPSYC；
18.CTPSPPFSHC；
19.CPHSKPCLC；
20.CSDSWHYWC；
21.CSDWQHPWC；
22.CSDYNHHWC；
23.CSDGQHYWC；
24.CYDSWHYWC；
25.CFDGNHIWC；
26.CTDFPRSFC；
27.CTQDRQHPC；
28.CLSRYLDQC；
29.CRGDCF；
30.CGNSNPKSC；以及
31.CPHNLTKLC
其中，当在第一方面形成的抗癌剂中时，砷原子将与上述肽序列的两个半胱氨酸残基键合并桥接在它们之间。半胱氨酸残基中的一个或两个可以是但不一定是末端残基。
总之，这些肿瘤导向肽可以靶向包括但不限于以下汇集的癌症：白血病/淋巴瘤、结肠癌、食道癌和胃食管癌、表皮鳞状细胞癌、黑色素瘤、胰岛肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、成视网膜细胞瘤、肿瘤转移、肝癌、胰腺癌、脑癌、间皮瘤，黑色素瘤、卵巢癌和胃癌。
应当理解，其他这样的肿瘤导向肽在商业上可用于替代癌症靶标，并且通常可以针对特定靶标“定购”。在这方面，抗癌剂的肿瘤导向肽组分没有特别限制，并且将基于期望的待靶向癌症从已知肽中选择。
在一个优选的实施方案中，砷原子将与之键合以形成桥的肿瘤导向肽是CAYHRLRRC(基序：CAY)；CDCRGDCFC(基序：RGD)或CPIEDRPMC。这些肽分别可用于靶向白血病和淋巴瘤细胞、血管生成脉管系统和结肠癌，因此可如前所述与砷原子环化以形成对这些靶标有效的抗癌剂。
在一个实施方案中，抗癌剂的砷是砷(III)原子。
在一个特别优选的实施方案中，第一方面的抗癌剂具有以下结构：
Figure BDA0002453272340000211
其中R是选自羟基、甲基和取代的或未取代的苯基的稳定基团。
在以下的实验部分中，提及HyAs(LHP)、MeAs(LHP)和PhAs(LHP)时分别是指上述结构，其中R分别是羟基、甲基和未取代的苯基。
根据本发明的第二方面，提供了药物组合物，其包含第一方面的抗癌剂以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
合适地，药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂可以是或包括稀释剂、溶剂、pH缓冲液、粘合剂、填充剂、乳化剂、崩解剂、聚合物、润滑剂、油、脂肪、蜡、包衣剂、粘度调节剂、助流剂(glidant)等中的一种或多种。
稀释剂可以包括微晶纤维素、乳糖、甘露醇、磷酸钙、硫酸钙、高岭土、干淀粉、糖粉等中的一种或多种。粘合剂可包括聚维酮、淀粉、硬脂酸、树胶、羟丙基甲基纤维素等中的一种或多种。崩解剂可以包括淀粉、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、羟基乙酸淀粉钠等中的一种或多种。溶剂可以包括乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿、丙酮、甲基乙基酮、二氯甲烷、水、盐溶液等中的一种或多种。润滑剂可以包括硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸钙、硬脂酸、硬脂酰富马酸钠、氢化植物油、山嵛酸甘油酯等中的一种或多种。助流剂可以是胶体二氧化硅、滑石或玉米淀粉等中的一种或多种。缓冲液可包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液，但不限于此。填料可包括一种或多种凝胶，包括明胶、淀粉和合成聚合物凝胶，但不限于此。包衣剂可包含成膜剂、溶剂、增塑剂等中的一种或多种。合适的成膜剂可以是羟丙基甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚维酮、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、丙烯酸酯等中的一种或多种。合适的溶剂可以是水、乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿、丙酮、甲基乙基酮、二氯甲烷等中的一种或多种。增塑剂可以是丙二醇、蓖麻油、甘油、聚乙二醇、聚山梨醇酯等中的一种或多种。
参见Rowe、Sheskey&Quinn编著的第6版《赋形剂手册》(Handbook of Excipients》(英国医药出版社)，其提供了根据本发明可以使用的赋形剂的非限制性实例。
应当理解，药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的选择至少部分取决于制剂的施用方式。仅作为举例，组合物可以是用于IV施用(IV administration)的溶液、注射液、栓剂、缓释制剂、渗透泵制剂或任何其他有效和安全施用的形式。由于有利的溶解度曲线(solubility profile)，特别优选用于IV施用的盐溶液。
根据本发明的第三方面，提供了治疗患者癌症的方法，该方法包括向患者施用第一方面的抗癌剂或第二方面的药物组合物从而治疗癌症的步骤。
本发明的第四方面在于用于治疗患者癌症的第一方面的抗癌剂。
本发明的第五方面在于第一方面的抗癌剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
关于第三方面至第五方面，在一个实施方案中，癌症可以是血液恶性肿瘤(haematological malignancy)或实体瘤。
在另一个实施方案中，癌症选自白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。
癌症可以选自由以下组成的组：鳞状细胞癌、基底细胞癌、黑色素瘤、腺体或导管的上皮衬层肿瘤(tumours of the epithelial lining of glands or ducts)、腺癌、乳头状癌、肝和胆道的乳头状腺癌肿瘤、胃肠道肝细胞癌肿瘤、食管鳞状细胞癌、食管腺癌、结肠直肠癌(结肠癌)、呼吸道胃癌(胃癌)肿瘤、支气管癌、小细胞癌、泌尿生殖道大细胞癌肿瘤、膀胱移行细胞癌、膀胱鳞状细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、血液细胞和相关细胞(白血病)、急性和慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴组织癌、恶性淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、结缔组织肿瘤、骨肉瘤(cancers of boneosteosarcoma)、神经系统肿瘤、成神经细胞瘤(neuroblastoma)、成视网膜细胞瘤(retinoblastoma)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、与致癌病毒相关的少突神经胶质细胞瘤(oligodendroglioma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、免疫缺陷个体中的B细胞淋巴瘤(b cell lymphoma's in immuno-comprised individuals)、鼻咽癌、食道癌和胃食管癌、表皮鳞状细胞癌、胰岛肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、成视网膜细胞瘤、肝癌、胰腺癌、脑癌、间皮瘤和乙型肝炎病毒肝细胞癌。
当癌症是白血病时，它可以是选自由以下组成的组的形式：急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性成淋巴细胞性B细胞白血病、急性成淋巴细胞性T细胞白血病、急性粒细胞白血病(acute myeloblastic leukemia，AML)、急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)、急性单核细胞白血病、急性红白血病、急性成巨核细胞白血病、急性髓单核细胞白血病(acute myelomonocytic leukemia)、急性未分化白血病、慢性髓细胞白血病(chronic myelocytic leukemia)和慢性淋巴细胞白血病。
优选地，癌症选自由以下组成的组：慢性髓性白血病、T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、结肠癌、胰腺癌、脑癌、间皮瘤、急性早幼粒细胞白血病(APL)和急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)。
在实施方案中，急性髓性白血病的治疗可以是高度优选的，因为这是已知难以治疗的癌症。本文提供的结果，特别是关于Kasumi-1细胞，表明第一方面的抗癌剂可以高度有效地对抗AML。
当癌症是实体瘤时，它可以是消化道癌、食管癌、肝癌、胃癌、结肠癌、皮肤癌、脑癌、骨癌、乳腺癌、肺癌、间皮癌和软组织癌(包括但不限于各种肉瘤)和前列腺癌中的一种或多种。
在一个实施方案中，癌症可以是目前被指示通过临床可用的三氧化二砷溶液治疗的任何癌症，或已证明三氧化二砷溶液对其有效的任何癌症。在一个实施方案中，患者中的淋巴瘤、白血病或实体瘤对标准治疗方法是难治性的，或者是白血病的复发病例。
抗癌剂可以单独使用或与其他已知治疗剂例如免疫治疗剂、单克隆抗体、化疗剂(chemotherapeutics)、辐射防护剂(radioprotectants)和放射治疗剂(radiotherapeutics)组合使用。特别地，抗癌剂的递送可以在施用一种或多种已知的抗肿瘤剂之前、期间或之后进行，所述已知的抗肿瘤剂包括但不限于低甲基化剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、芥子气化合物(mustard compound)、氮芥(nitrogen mustard)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、长春新碱、长春碱、紫杉醇、依托泊苷、替尼泊苷(temiposide)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素、顺铂、卡铂、磷酸雌莫司汀、羟基脲、BCNU、丙卡巴肼、VM-26、干扰素和全反式视黄酸(ATRA)或其他类视黄醇。合适的低甲基化药剂可以包括地西他滨(decitabine)、guancitabine、阿扎胞苷等。PD-1抑制剂的合适实例包括派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)，而合适的PD-L1抑制剂包括阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和度伐鲁单抗(durvalumab)。
抗癌剂在治疗各种癌症中的治疗剂量和给药频率(dosing frequency)将取决于癌症的性质、病症的严重程度以及个体患者的年龄、体重、病症和反应。重要的是，这样的给药可方便地基于标准方法并遵循用于递送三氧化二砷的当前给药方案(dosing regimen)的指导来决定。由于递送的效率，使用本发明抗癌剂的给药水平可能稍微低于目前递送三氧化二砷的给药方案，但是它们仍然是有用的指导，并且可以基于标准测试模型来调整最终的给药。
如本文所用，术语“受试者(subject)”或“个体(individual)”或“患者(patient)”可以指需要砷治疗的任何受试者，特别是脊椎动物受试者，甚至更特别是哺乳动物受试者。合适的脊椎动物包括但不限于灵长类、鸟类、家畜动物(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室测试动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如猫、狗)和圈养的野生动物(例如狐狸、鹿、澳洲野犬)。优选的患者是需要对癌症进行砷治疗的人。然而，应当理解，上述术语并不意味着必须存在症状。
根据本发明的第六方面，提供了制备抗癌剂的方法，包括以下步骤：
(a)使包含两个半胱氨酸残基的肿瘤导向肽与砷化合物接触；以及
(b)使砷与两个半胱氨酸残基中的每一个结合以形成包含结合的砷原子的环化肿瘤导向肽；
由此制备抗癌剂。
抗癌剂和砷化合物可以如第一方面的任何实施方案所述。
砷化合物可以是砷的氧化物或卤化砷。合适的氧化砷的一个非限制性实例是氧化苯胂(phenylarsine oxide)。
在一个实施方案中，砷化合物可以包含与砷键合的烷基、羟基或芳基。
在一个实施方案中，所述方法可包括修饰选定的肿瘤导向肽以产生两个半胱氨酸残基的步骤(a)(i)。当期望的肿瘤导向肽尚未显示两个合适的半胱氨酸残基时，这可能是有用的。本发明不仅限于天然包含半胱氨酸残基的肿瘤导向肽。半胱氨酸残基可以用本领域熟知的多种化学方法中的任何一种与肿瘤导向肽键合。正是这两个添加的半胱氨酸残基随后在该方法的步骤(b)中与砷结合。
修饰肿瘤导向肽以产生两个半胱氨酸残基的步骤可以是这样的修饰，该修饰使得肿瘤导向肽存在N-末端半胱氨酸残基和C-末端半胱氨酸残基。
该方法还可以包括，在使肿瘤导向肽与砷化合物接触的步骤之前，使封端化合物与肿瘤导向肽的N-末端半胱氨酸残基的游离氨基反应以形成与所述氨基的氮键合的封端基团的步骤。
本发明的第七方面在于通过第六方面的方法制备的抗癌剂。
本发明的第八方面在于向患者递送治疗有效量的砷的方法，该方法包括向患者施用适当量的第一方面的抗癌剂或第二方面的药物组合物，从而递送治疗有效量的砷的步骤。
第八方面的方法可以根据并且包括针对第一方面至第五方面所描述的实施方案中的任一个来执行。
本发明的第九方面在于诊断癌症的方法，包括以下步骤：
(iv)向患者施用包含至少一个放射性标记原子的第一方面的抗癌剂；
(v)使抗癌剂定位于癌症；以及
(vi)检测抗癌剂的至少一个放射性标记的原子的存在，
由此诊断癌症。
预期许多放射性标记的原子或基团可用作第九方面的方法中的标记物(marker)。优选地，放射性标记的原子或基团将是稳定基团或将是稳定基团的一部分。
在一个优选的实施方案中，稳定基团将是取代的苯基，并且放射性标记的原子或基团将取代于苯环上。一个优选的放射性标记的原子或基团可以是存在于苯环稳定基团上的放射性标记的氟原子。氟可以位于苯环与砷连接的邻位、间位或对位，但优选对位。所采用的氟同位素可以是已知用于医学成像或检测的任何氟同位素，但优选18F。单光子发射计算机断层摄影(SPECT)或正电子发射断层摄影(PET)或本领域公知的其他方法可用于检测步骤。
使抗癌剂定位于癌症的步骤可以是使抗癌剂与癌症结合或在癌细胞内或邻近癌细胞聚集的步骤。
因此，应当理解，第九方面中提及的第一方面的抗癌剂的用途包括第一方面所述的所有这类药剂，并且包括式I范围内的那些，但是进行了修饰，即那些存在的原子或基团中的至少一个被放射性标记。
以下实验部分更详细地描述了本发明某些化合物的表征及其功效。本发明旨在说明本发明化合物的某些具体实施方案及其功效，而不以任何方式限制本发明。
实验
砷-肽类复合物(As(LHP))的制备
材料
如所指定的，市售试剂具有分析级或更高纯度。偏亚砷酸钠(NaAsO2，≥99％)、三乙胺((C2H5)3N，≥99％)、磷酸氢二钠(Na2HPO4，≥99％)、磷酸二氢钠二水合物(NaH2PO4.2H2O，≥99％)和氧化苯胂(PAO，C6H5AsO，≥97％)以及
Figure BDA0002453272340000271
碱(≥99.9％，Tris)获自Sigma Aldrich(美国)。三碘化砷(III)(AsI3，≥98％)获自Strem Chemicals(美国)，单甲基胂酸(MMA(V)，CH5AsO3，≥97％)获自日本和光纯药工业株式会社(Wako PureChemical Industries(Japan))，以及甲酸(99％)、盐酸(HCl，32％)和氢氧化钠(NaOH，≥97％)获自Ajax FineChem。由肽2.0(美国)定制合成预乙酰化的肽AcCAYHRLRRC、AcCARHRYLRC(>98％)和CAYHRRLRC(>98％)。AcCAYHRLRRC(白血病导向肽)在本文中称为LHP，且AcCARHRYLRC(混杂肽)在本文中称为sLHP。Milli-Q水(18.2Ω，Millipore)用于所有稀释(除非另有说明)并用于制备NaOH、磷酸盐缓冲液和Tris.HCl缓冲液。
方法
pH值测量
注意到，在用梅特勒-托利多技术缓冲液(Mettler Toledo Technical Buffers)(4.0、7.0和9.2)校准之后，用梅特勒-托利多Seven Compact S220-Micro试剂盒测量和/或确认pH。
缓冲液的制备
使用表1中列出的适当体积的储备溶液A(NaH2PO4.2H2O，0.2M)和储备溶液B(Na2HPO4，0.2M)制备磷酸盐缓冲液(pH 7或pH 8，0.1M，100mL)。如前所述确定pH，并在用Milli-Q水稀释至100mL(终浓度0.1M)之前，根据需要通过逐滴加入溶液A或溶液B来调节pH。
表1针对特定pH的磷酸盐缓冲液的储备溶液组合。
Figure BDA0002453272340000281
通过向50mL Tris(0.2M)中加入约5mL HCl(0.2M)，同时监测pH，然后用Milli-Q水稀释至100mL(终浓度0.2M)，制备Tris-HCl缓冲液(pH 9)。
电喷雾电离-质谱(ESI-MS)
As-LHP复合物形成的ESI-MS分析
ESI-MS用于检测As类(species)与LHP的结合以优化复合条件。购买具有N-末端乙酰化并呈线性构象的肽CAYHRLRRC，其两个Cys的巯基与As配位。反应在如本文所述的各种条件下进行。在分析之前将溶液稀释在Milli-Q水(40x)中。图1A显示LHP的ESI-质谱。
ESI-MS操作条件
采用正离子模式下电喷雾电离的Micromass Quattro Micro三重四极杆质谱仪(Micromass，英国)收集所有质谱图。加热的干燥氮气是用于所有实验的雾化(nebulising)和干燥气体。采用毛细管电压3.00kV、锥电压35V、源温度80℃、脱溶剂温度120℃和脱溶剂气流400L/h进行光谱收集。
收集Milli-Q水的基线光谱。在样品注射之前用Milli-Q水彻底冲洗源，直到光谱类似于基线光谱。使用1mL注射器(SGE AnalyticalScience，澳大利亚)以10μL/min的流速注射每个样品。在300至1000的m/z范围内收集As-LHP产物的光谱。数据采集以连续模式进行，并且通常将80次扫描求和以获得代表性的光谱。用MassLynx软件(Waters，2003)处理光谱。用1的多项式阶数在曲线下方40％进行背景扣除，并用Savitsky-Golay算法进行平滑。然后用中心函数(Top，面积)生成质心光谱(centroid spectra)，并用其各自的m/z比和强度标注每个峰。
As-LHP复合物及其前体形成的方法发展
HyAs(LHP)的形成
表2包含使用反应物AsI3和LHP进行三次重复反应(triplicate reactions)以制备HyAs(LHP)的条件。在温育前用N2冲洗所有反应瓶。在指定的时间点(30min、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h)通过ESI-MS分析代表性等分试样以监测反应进程。
表2：用于As-LHP制备的一式三份样品的条件
Figure BDA0002453272340000291
Figure BDA0002453272340000301
MeAs(LHP)的形成
通过将单甲基胂酸(MMA(V)，3mM)与LHP(12mM)混合来检验MeAs(LHP)制剂，其中过量的LHP允许肽在MMA(V)的还原中氧化。将化合物在磷酸盐缓冲液(H2PO4 ˉ/HPO4 2ˉ，0.1M，pH8)中混合，用N2冲洗并在37℃或60℃温育1h、4h、8h、16h或24h。通过ESI-MS分析产物。
PhAs(LHP)的形成
基于HyAs(LHP)形成的结果，生产PhAs(LHP)的尝试涉及通过加热直到溶解(80℃至90℃，4h至8h)而制备的氧化苯胂(PAO)溶液(10mM的磷酸盐缓冲液，H2PO4 ˉ/HPO4 2ˉ，0.1M，pH 8)。冷却至室温后，将PAO(10mM)加入LHP(3mM)中，用N2冲洗小瓶并在37℃或60℃温育1h、4h、8h、16h或24h。通过ESI-MS分析产物。
PhAs(CAYHRRLRC)的形成测试
为了检验乙酰基在PhAs与LHP复合中的影响，尝试与非乙酰化肽CAYHRRLRC反应。如前所述，在磷酸盐缓冲液(H2PO4 ˉ/HPO4 2ˉ，0.1M，pH 8)中制备PAO(10mM)并冷却。然后加入CAYHRRLRC(3mM)，用N2冲洗，并将所得溶液在37℃或60℃温育1h、4h、8h、16h或24h。通过ESI-MS分析等分试样。
PhAs(sLHP)的制备
通过使PAO(10mM，如前所述，在磷酸盐缓冲液H2PO4 ˉ/HPO4 2ˉ中，0.1M，pH 8)和sLHP(3mM)反应来制备PhAs(sLHP)。用N2冲洗小瓶并在37℃温育8h至16h。通过ESI-MS分析产物。
各种As-LHP复合物的纯化
分析型高效液相色谱(HPLC)
配有SCL 10A VP系统控制器、SIL 10A DVP自动注射器和LC 10AT VO液相色谱单元的Shimadzu分析型HPLC系统与DGU 14A脱气器(degasser)和SPD M10A VP二极管阵列检测器一起使用。在用H2O(0.1％TFA)平衡20min后，使用Waters Sunfire C18柱，5μm，4.6×250mm(No.186002560)。用ACN/H2O(各含有0.1％TFA)进行梯度洗脱。所有溶剂在使用前通过过滤和超声脱气。在分析之前，通过0.20μm过滤器(Sartorius)过滤样品。分析游离LHP溶液以确定其洗脱时间。
制备型高效液相色谱(HPLC)
基于从分析型HPLC获得的洗脱曲线，使用制备型HPLC纯化As反应产物，该方法采用Waters Prep LC System和Waters Sunfire Prep C18，OBD 5μm，19x 150mm色谱柱(No.186002568)以及设置为λ220nm的2489紫外/可见检测器。在仪器上用He鼓泡之前，将所有溶剂预过滤和超声处理。每个样品在分析前通过0.20μm过滤器(Sartorius)过滤。在运行样品之前，用H2O(0.1％TFA)平衡柱30分钟。流速保持在20mL/min。表3表示所使用的溶剂梯度。分析游离LHP溶液作为标准品。收集级分并通过ESI-MS分析。
表3.用于HPLC纯化AsLHP复合物的溶剂梯度
Figure BDA0002453272340000321
As类复合物的干燥
为了获得纯化的化合物，使用Alpha 1-2LDplus冷冻干燥器(Christ)将鉴定的HPLC级分冷冻干燥过夜。
As-LHP复合物的表征
ESI-MS
制备As-肽复合物的溶液(100μM，0.5％甲酸)并根据前述操作条件通过ESI-MS分析。
XAS
对固体和溶液As-LHP样品进行XAS分析。通过将As-LHP与固体氮化硼(SigmaAldrich)充分混合来制备固体样品。最初使用XAFSmass程序确定稀释比，尽管发现另外10x稀释对于荧光模式中的分析是最佳的。将所得混合物安装在1-mm厚的铝样品容器中并用Kapton胶带密封。通过将As溶液(600μL)与乙二醇(300μL)混合以防止在快速冷冻期间结晶，制备用于XAS分析的溶液样品。通过注射器将所得溶液(1mM最终As浓度)转移到用Kapton胶带密封的样品容器中。然后将样品快速浸没在液氮中并转移到液氦低温恒温器中，在此在于10°K对其进行分析。
此外，收集As标准品的X射线吸收光谱：按照As-LHP复合物的描述制备固体标准品和溶液标准品。标准品包括：AsI3、As2S3、NaAsO2、NaAsO4、MMA(V)、PAO、As(GS)3、MeAs(GS)2和PhAs(GS)2。在日本筑波的澳大利亚国家光束线设备(ANBF，Beamline 20B)KEK收集砷K-边缘XAS数据，其中射束能量为2.5GeV，射束电流为300mA至400mA。Si[111]通道切割单色仪失谐50％以抑制谐波。使用36元件Ge阵列检测器(Eurisys/Canberra Industries)和1mm垂直狭缝宽度，在～10°K(用闭环He CryoIndustries REF-1577-D22低温恒温器维持)以荧光模式记录所有光谱。在以下能量范围收集砷K-边缘EXAFS光谱：边缘前区11640eV至11840eV(10eV步长)；XANES区11840eV至11890eV(0.25eV步长)；和EXAFS区11890eV至12468eV(k-空间中
Figure BDA0002453272340000331
-1步长至
Figure BDA0002453272340000332
-1步长)。同时在样品下游以透射模式分析固体砷酸钠标准品用于校准，由此将一阶导数光谱的第一峰的能量(对应于边缘能量)限定为11871.7eV。收集2至3次扫描的平均值用于所有数据分析。用EXAFSPAK进行数据处理。EXAFSPAK的DATFIT模块用于多重线性回归分析。使用BACKSUB和FEFF 8.2实现背景扣除和归一化以计算用于拟合EXAFS数据的理论相位和振幅函数。
NMR光谱表征
在90％H2O/10％D2O(用HCl调节pH～4)或100％D2O中分析As-LHP样品。使用VarianUnity 500-MHz光谱仪和Vnmrj 2.1B软件进行NMR实验。通过预饱和或通过在1.5s长的水上使用选择性方脉冲进行激发塑型(excitation sculpting)来实现对残留水信号的抑制。通过1H和1H COSY、TOCSY和NOESY实验获得质子共振归属(proton resonance assignment)。通过1H和13C COSY、TOCSY和NOESY实验获得碳归属。用COSY和TOCSY实验建立的脉冲序列进行NOESY实验。使用ACD/NMR处理器学术版(Processor Academic
Figure BDA0002453272340000333
)(2013，ACD Labs，多伦多，加拿大)进行光谱处理。将所有峰校准至4.8ppm处的水峰。
石墨炉原子吸收光谱法
使用配有Winlab 32AA Furnace程序的Perkin-Elmer AAnalyst 600原子吸收光谱仪分析溶液的As，并结合了塞曼效应(Zeeman-effect)背景校正、AS-800自动进样器(autosampler)和AA Accessory 7冷却系统。设置在193.7nm波长和0.7nm狭缝宽度的无电极As放电灯(Perkin-Elmer)给出约54W的仪器能量读数。使用购自美国InorganicVentures的认证的、基质匹配的砷标准溶液(批号#J2-AS02116)产生校准曲线。使用Pd和Mg基质改性剂溶液(购自美国Inorganic Ventures)制备Pd/Mg基质改性剂溶液(1mg/mL Pd，1mg/mL Mg(NO3)2)。分派的自动进样器体积是化学改性剂(5μL)和样品(20μL)。使用表4所示的炉操作条件，用插入式热解L'vov平台从热解石墨涂覆管的表面雾化砷。
表4.石墨炉操作条件
Figure BDA0002453272340000341
结果
As-LHP复合物的形成
HyAs(LHP)的形成
来自试验1的产物的分析没有显示出期望的As-LHP复合物的证据。ESI-MS在所有时间点的两个温度均产生了游离肽的光谱(图1A)。同样，对试验2至6的产物进行的光谱分析表明，在所有浓度、温度和时间点仅存在游离肽，未能产生期望的As-LHP复合物。因为在4h内进行的60℃测试显示出肽降解的迹象，所以中断了该温度测试。对于在Tris.HCl缓冲液(pH 9)中的所有样品，试验9没有产生As-LHP复合物的迹象。然而，在三乙胺(试验7)和pH8磷酸盐缓冲液(试验8)中尝试的反应立即产生白色沉淀。将该沉淀物的样品溶解在Milli-Q水/0.5％甲酸中，ESI-MS分析显示，在两种情况下都可归因于期望的产物的小信号的离子，尽管大量的峰仍然是游离肽的峰。当反应在24℃进行时，所得沉淀甚至在24h后也不溶解，表明其不是期望的产物。在37℃温育反应溶液时，通过30min时间点溶解的沉淀物和用于该时间点和1h和2h时间点的样品产生ESI-MS谱图，其包括可归属为游离肽的主峰和指示期望的产物形成的较小峰。对于在pH 8进行的反应，在37℃温育4h后的样品产生了图1B中的光谱，证实形成了HyAs(LHP)，其在m/z 431.4处具有高丰度的分子离子，在m/z 646.8处具有中等丰度的离子，分别对应于[HyAs(LHP)+3H+]3+和[HyAs(LHP)+2H+]2+。m/z 837.9处的小峰归属为[HyAs(LHP)2+3H+]3+，指示形成了HyAs(LHP)2，并证明需要纯化反应以分离期望的产物HyAs(LHP)。分别对应于[LHP+3H+]3+和[LHP+2H+]2+的m/z 407.6和m/z 610.5处与游离肽缔合的离子的存在最可能是由于电离过程中缔合砷的损失。用GFAAS分析HPLC纯化产物中的砷浓度以确认纯度。24h和48h时间段的ESI-MS谱图显示肽降解的迹象。
MeAs(LHP)的形成
MMA(V)和LHP反应始终保持无色。在37℃温育4-h后检测到指示MeAs(LHP)产物的小峰，这些峰的丰度在温育8h后增加。8-h和16-h温育之间没有显著差异，但是更长的温育时间再次产生肽降解。图1C描述了在37℃温育过夜(16h)后来自反应的ESI-MS谱图，证实了期望的产物MeAs(LHP)的产生，其中分子离子为m/z 655.1处的[MeAs(LHP)+2H+]和m/z437.1处的[MeAs(LHP)+3H+]3+。m/z 407.6和m/z 610.5处的高丰度离子指示游离肽、[LHP+3H+]3+和[LHP+2H+]2+与电离过程一致。存在的其他离子(m/z 414.9[LHP+Na++2H+]3+、m/z444.8[MeAs(LHP)+Na++2H+]3+、m/z 629.6[LHP+Na++H+]2+和m/z 666.4[MeAs(LHP)+Na++H+]2+)被归属为类似峰，在每种情况下，用Na+代替H+离子其中之一。有趣的是，对于该反应，没有二肽产物的证据。
PhAs(LHP)的形成
PAO和LHP产生PhAs(LHP)的反应导致混合后立即沉淀。如在HyAs(LHP)的情况下观察到的，沉淀物的ESI-MS分析显示归因于游离肽的大离子峰。在37℃温育1h后，沉淀溶解，并且在37℃温育4h后，ESI-MS分析(图1D)显示在m/z 685.5处的高丰度峰被鉴定为[PhAs(LHP)+2H+]2+，且在m/z 457.6处具有中度丰度的离子([PhAs(LHP)+3H+]3+)。如对于HyAs(LHP)和MeAs(LHP)的反应所观察到的，游离肽也存在于ESI-MS谱图中，如通过在m/z 407.6[LHP+3H+]3+和m/z 610.5[LHP+2H+]2+处的典型指示峰所证明的，其在HPLC纯化后被除去，如以下段落[00148]中所述。在37℃，8-h和16-h的温育期间产生与4-h温育相似的ESI-MS结果，但是在24-h再次有产物降解的迹象。
As-LHP复合物的纯化
分析型高效液相色谱(HPLC)
As-肽反应溶液的HPLC纯化产生了尖锐的、分离良好的峰。在每个色谱图中，游离肽出现在14.5min。HyAs(LHP)(b)的峰出现在17.2min，而MeAs(LHP)(c)和PhAs(LHP)分别在18.1min和22.1min洗脱。HPLC迹线示于图2A中。
制备型高效液相色谱(HPLC)
通过制备型HPLC放大反应和纯化得到与分析型HPLC相似的洗脱曲线，其中游离肽在16.9min洗脱，HyAs(LHP)在18.1min洗脱，MeAs(LHP)在19.6min洗脱，且PhAs(LHP)在22.8min洗脱。冷冻干燥期望的级分以除去溶剂后，产生对应于每种AsLHP复合物的白色固体。
As-LHP复合物的表征
ESI-MS
HyAs(LHP)(a)、MeAs(LHP)(b)和PhAs(LHP)(c)的ESI-质谱(图2B)均在m/z 407.4和m/z 610.5处出现峰，其可归因于LHP并分别鉴定为[LHP+3H+]3+和[LHP+2H+]2+。游离LHP的存在可能是由于电离过程中缔合As的损失。鉴定为[LHP+H++Na+]2+的m/z 622.3处的低丰度离子存在于所有As(LHP)反应和最终产物光谱中。HyAs(LHP)(a)在m/z 647.1处表现出高丰度的离子且在m/z 431.4表现出中等丰度的离子，分别归属为[HyAs(LHP)+2H+]2+和[HyAs(LHP)+3H+]3+，证实了期望的产物的产生。对应于MeAs(LHP)(b)和PhAs(LHP)(c)的系统的分析显示，各自具有与m/z 655.1处鉴定为[MeAs(LHP)+2H+]2+和m/z 685.5处鉴定为[PhAs(LHP)+2H+]2+的2+带电离子相关的高丰度离子，以及具有m/z 437.1处([MeAs(LHP)+3H+]3+)和m/z 457.6处([PhAs(LHP)+3H+]3+)的中等丰度的3+离子。
X射线吸收光谱(XAS)
图3显示了从As标准品的固体样品和第一方面的As肽抗癌剂HyAs(LHP)、MeAs(LHP)和PhAs(LHP)获得的As K-边缘XANES光谱的比较。所有固体样品的边缘(从一阶导数光谱的第一峰获得)和白线峰的相应能量列于下表5中。As(III)化合物亚砷酸钠(11867.89eV，黑色虚线，图3)和As(V)化合物砷酸钠(11871.38eV，黑色点线，图3)的边缘能量相差3.49eV。对As(III)复合物的边缘能量的检查显示，与氧结合的As(III)化合物(11867.89eV至11868.64eV，虚线，图3)相比，硫结合的As(III)化合物(短虚线，图3)显示出较低的边缘能量(11866.09eV至11867.07eV)。HyAs(LHP)(绿色实线，图3)的边缘能量为11866.97eV，其位于硫结合的As(III)化合物的范围的高端，但显著低于氧结合的As(III)化合物亚砷酸钠所表现出的边缘能量。与硫结合的As(III)复合物的光谱曲线也表现出在约11871.7eV处的特征波谷，而氧结合的As(III)化合物的光谱在后边缘区没有显示出这种明显的波谷(图3)。MeAs(LHP)(红色实线)和PhAs(LHP)(黑色实线)获得的光谱都表现出硫结合的As(III)复合物的特征后边缘波谷。这种抑制在HyAs(LHP)(绿色实线)的光谱中没有标记，可能是由于在这种结构中存在氧。
表5.As-LHP抗癌剂和As标准品的固体样品的砷K-边缘和白线峰XANES能量
Figure BDA0002453272340000371
Figure BDA0002453272340000381
甲基化的砷(V)化合物MMA(V)(红色点线)在11870.64eV表现出边缘能量，比单甲基化的砷(III)复合物MeAsIII(GS)2(11866.44eV，红色短虚线，图3)高2.75eV。MeAs(LHP)(红色实线，图3)的边缘能量出现在11866.27eV处，并对应于硫结合的As复合物的边缘能量。另外，MeAs(LHP)的XAS光谱的后边缘曲线与MeAsIII(GS)2光谱的后边缘曲线非常相似。PhAsO(蓝色虚线，图3)表现出11868.64eV的边缘能量，其最接近亚砷酸盐的边缘能量。这代表了在每种情况下砷都与负电性O结合的事实。PhAs(LHP)化合物(黑色实线)表现出出现在C/S结合的As(III)标准品的较低范围的边缘能量(11865.90eV)。PhAs(LHP)光谱的形状类似于MeAsIII(GS)2光谱(红色短虚线)和PhAsIII(GS)2光谱(绿色短虚线)的形状，但是白线峰的强度大于任一标准。
表6总结了从HyAs(LHP)获得的EXAFS数据进行的曲线拟合模拟。这些对应于As(III)，其通常以三角平面或三角椎体的方式配位至三个原子。当与两个硫原子(拟合1)相比时，模拟与砷配位的三个硫原子(拟合2)导致增加的拟合误差，这表明两个硫原子更可能与砷结合。第三反向散射体(backscatterer)与砷的拟合指示第三原子可能是氧或碳(拟合3和拟合4)。2个硫原子和1个碳原子的情况最初产生负的德拜-沃勒因子(Debye-Wallerfactor)；因此，随后将因子固定以获得拟合4所示的结果(表6)。图4显示了针对拟合3的实验EXAFS和计算EXAFS以及傅里叶变换分析，显示了在
Figure BDA0002453272340000382
以下的径向分布具有合理的一致性。还检验了其他可能的构型，包括1个硫原子和2个氧原子(拟合5)以及1个硫原子和2个碳原子，其中由于产生的物理上不可行的负的德拜-沃勒因子而将后者忽略。固定德拜-沃勒因子以减小该误差导致不合理的E0值。
表6.固态HyAs(LHP)的EXAFS拟合结果总结。*针对1S和2O以及2S和1C的拟合在固定前产生负的德拜-沃勒因子。针对1S和2C的所有尝试都产生负的德拜-沃勒因子。
Figure BDA0002453272340000391
表7(下面)显示了针对MeAs(LHP)生成的EXAFS光谱的潜在模型的模拟总结。类似地，仅与硫配位的砷的初始拟合证实了具有两个硫原子的模型产生了更紧密的拟合(拟合1与拟合2)，因为As与三个硫原子的配位增加了拟合误差。尝试检验1个硫原子与2个氧原子或2个碳原子的组合键合到砷的情况，产生了对于德拜-沃勒因子、E0或这两个参数均不可行的结果。此外，这不能通过固定参数来校正。拟合与两个硫原子和一个氧原子或一个碳原子结合的砷产生了可行的结果。总之，与两个硫原子和一个氧原子(拟合3)或一个碳原子(拟合4，如图5所示)结合的As(III)获得了最佳拟合。
表7.固态MeAs(LHP)的EXAFS拟合结果总结。*针对1S和2O的拟合以及1S和2C的拟合产生负的德拜-沃勒因子和/或不可行的E0值。最初拟合2S和1C的尝试在固定之前产生负的德拜-沃勒因子。
Figure BDA0002453272340000401
表8显示了从来自PhAs(LHP)的EXAFS光谱的As配位模型获得的模拟的总结。当两个硫原子配位到砷(拟合1)而不是三个硫原子(拟合2)时，再次获得最佳拟合。对于其中As与一个硫原子和两个氧原子或一个硫原子和两个碳原子配位的模型，获得的结果差(拟合未显示)。尽管包括与两个硫原子和一个氧原子或一个碳原子结合的砷的模型最初产生不合理的德拜-沃勒因子，但当该因子固定时，这得到了改善，并获得了有前景的拟合(拟合3和拟合4)，虽然2S和1O的拟合误差与2S和1C相比明显更大。因此，图6中示出了拟合4的结果。
表8.对固态PhAs(LHP)的EXAFS拟合结果总结。*针对1S和2O的拟合以及针对1S和2C的拟合产生负的德拜-沃勒因子和/或不可行的E0值。拟合2S和1C的最初尝试以及2S和1O的最初尝试在固定之前产生负的德拜-沃勒因子。
Figure BDA0002453272340000402
核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)
使用组合的-1H和1H 2-D COSY、TOCSY和NOESY NMR光谱数据，对游离肽AcCAYHRLRRC中的残基进行1H NMR共振的归属(表9)。通过1H和13C 2-D COSY、TOCSY、NOESY和HMBC NMR光谱数据进行13C NMR归属。还在相同条件下从CAYHRRLRC获得光谱，以便特异性鉴定和归属肽AcCAYHRLRRC中的单个半胱氨酸残基。
表9.LHP，22mM，90％H2O，10％D2O，pH 3.85，T 298.1K的1H和13C化学位移归属
Figure BDA0002453272340000411
Figure BDA0002453272340000421
MeAs(LHP)和PhAs(LHP)的NMR光谱对除了两个半胱氨酸之外的所有氨基酸残基产生相同的化学位移模式，其中两个半胱氨酸的化学位移与As和巯基的结合一致(下表10和11)。对于MeAs(LHP)，峰也归属为甲基；对于PhAs(LHP)，峰归属为苯环。
表10.对于MeAs(LHP)、22mM、90％H2O、10％D2O、pH 3.85、T 298.1K，R基团和半胱氨酸残基的1H和13C化学位移归属
Figure BDA0002453272340000431
表11对于PhAs(LHP)、22mM、90％H2O、10％D2O、pH 3.85、T 298.1K，R基团和半胱氨酸残基的1H和13C化学位移归属
Figure BDA0002453272340000432
石墨炉原子吸收光谱法
进行GFAAS以证实As-肽产物的纯度，结果示于下表12中。观察到理论和实验确定的As浓度之间的良好一致性。
表12.确定本发明各种含砷肽类的砷微量分析的GFAAS数据
Figure BDA0002453272340000441
PhAs(LHP)异构体的研究
方法
使用配有Prominence-i LC2030C系统控制器、自动注射器和液相色谱单元的Shimadzu分析型HPLC系统来纯化PhAs(LHP)。在用H2O(0.1％TFA)平衡20min后，使用WatersSunfire C18柱，5μm，4.6×250mm(No.186002560)。所有溶剂在使用前通过过滤和超声脱气。由LHP(3mM)和PAO(10mM)在MilliQ水(总体积1mL)中的反应(在37℃温育过夜)新鲜制备PhAs(LHP)样品。随后将其通过0.2-μm过滤器(Sartorius)过滤，然后再注射到色谱柱并进行分析，以确定目标级分的洗脱时间。用于最佳峰分离的反相分析型洗脱梯度列于下表13中。
表13用于分析和纯化PhAs(LHP)的反相分析型和制备型HPLC洗脱梯度。
Figure BDA0002453272340000442
基于从分析型HPLC获得的洗脱曲线，使用制备型HPLC进行PhAs(LHP)的纯化，该制备型HPLC采用Shimadzu SIL-10AP自动进样器、Shimadzu LC-20AP制备型液相色谱、Shimadzu FCV-200AL四通阀、Shimadzu SPD-M20A二极管阵列检测器、Shimadzu DGU-20A5R脱气单元、Shimadzu CDM-20A通信总线模块、LabSolutions软件和Luna 5u C18(2)柱(250×21.20mm，5μm，Phenomenex)。用H2O(0.1％TFA，20min)平衡柱。将根据最佳反应条件(由该方法发展的结果确定)制备的PhAs(LHP)溶液(6mL)注射到柱中，并使用表13中详述的洗脱液梯度分离。流速保持在15mL/min，并在λ254nm检测级分。收集主要级分并通过ESI-MS进行表征。如果需要，使用Alpha 1-2LDplus冷冻干燥机(Christ)干燥所鉴定的HPLC级分，以获得纯的化合物。
结果
使用上述分离方法，有两个峰(在15.99min和16.86min洗脱，制备型HPLC，图7)是明显的。当分离和收集时，每个峰通过ESI-MS鉴定为PhAs(LHP)。两个级分的光谱(图8)与ESI-MS峰相似，可归因于LHP和PhAs(LHP)。在m/z 407.5、414.1、610.7和619.8处出现的峰归因于LHP，分别鉴定为[LHP+3H+]3+、[LHP+2H++Na+]3+、[LHP+2H+]2+和[LHP+2H++H2O]2+。游离肽的存在是电离过程的结果。m/z 457.4、463.5、685.5和696.7处出现的峰指示PhAs(LHP)，并分别鉴定为[PhAs(LHP)+3H+]3+、[PhAs(LHP)+3H++H2O]3+、[PhAs(LHP)+2H+]2+和[PhAs(LHP)+H++Na+]2+。
将来自每个级分的所得化合物(分离并干燥)溶解在MilliQ水(3mM)中并通过分析型HPLC再次检验。在每种情况下，HPLC色谱图(图9)证实存在两个峰，如先前在初始制备型HPLC色谱图中观察到的。洗脱时间与PhAs(LHP)的洗脱时间一致。这表明存在PhAs(LHP)的自发转化异构体，并且与As原子的手性中心一致，As原子与三个不同部分(苯基和肽的两个不对称末端)结合，并含有孤对电子。这在下面指出，其中(a)是R异构体且(b)是S异构体。
Figure BDA0002453272340000461
As-LHP复合物的稳定性研究
方法
用XAS研究了As-LHP复合物的稳定性。通过将HyAs(LHP)、MeAs(LHP)或PhAs(LHP)(1.5mM)溶解在维持在37℃的Milli-Q水中制备样品。在分析之前立即将砷-肽溶液(600μL)与乙二醇(300μL)混合以防止在快速冷冻期间结晶。通过注射器将所得溶液(1mM最终As浓度)转移到用Kapton胶带密封的样品容器中。然后将样品快速浸没在液氮中并转移到液氦低温恒温器中，在此在10°K对其进行分析。
在日本筑波的澳大利亚国家光束线设备(ANBF，Beamline 20B)KEK收集砷K-边缘XAS数据，其中射束能量为2.5GeV，射束电流为300mA至400mA。Si[111]通道切割单色仪失谐50％以抑制谐波。使用36元件Ge阵列检测器(Eurisys/Canberra Industries)和1mm垂直狭缝宽度，在～10°K(用闭环He CryoIndustries REF-1577-D22低温恒温器维持)下以荧光模式记录所有光谱。在零时间点获得XAS光谱，然后在稍后的时间点4h或14h获得XAS光谱。使用EXAFSPAK处理和分析来自两个时间点的光谱。
还研究了两种最有前景的As-LHP复合物在细胞培养基(IMDM)中的稳定性。通过将MeAs(LHP)或PhAs(LHP)(1.5mM)溶解在维持在37℃的IMDM中来制备样品。遵循与Milli-Q水稳定性研究相同的方案。在零时间点然后在24h获得XAS光谱。与Milli-Q水样品一样，使用EXAFSPAK处理、拟合和定量来自两个时间点的光谱。
结果
图10显示了在Milli-Q水中HyAs(LHP)在两个时间点(0h，蓝色和4h，红色)获得的光谱的比较。4-h样品的光谱明显不同于0h样品的光谱，指示复合物在Milli-Q水中4h不稳定。4-h样品的光谱与Milli-Q水中亚砷酸盐的光谱相似，指示LHP不再与砷结合。边缘的位移指示砷结合到氧原子而不是硫原子(对于完整的HyAs(LHP)复合物，情况将是砷结合到硫原子)。
图11描述了在Milli-Q水中MeAs(LHP)在两个时间点(0h，蓝色和14h，红色)获得的光谱。这两个光谱与描述两个光谱之间的小异常的以绿色绘制的残差相比93％相当。
图12显示了在Milli-Q水中PhAs(LHP)在两个时间点(0h，蓝色和14h，红色)获得的光谱的比较。两个光谱之间的一致性接近100％，其中残差非常接近零，完全不显示显著的残差特征。这表明PhAs(LHP)复合物在Milli-Q水中稳定14h。
图13描述了在IMDM(细胞培养基)中MeAs(LHP)在两个时间点(0h，蓝色和24h，红色)获得的光谱。两个光谱与描述两个光谱之间的异常的以绿色绘制的残差相比82％相当。最显著的变化可以从减少的后边缘波谷中清楚地看出。
图14显示了IMDM(细胞培养基)中PhAs(LHP)在两个时间点(0h，蓝色和24h，红色)获得的光谱的比较。两个光谱之间的一致性是97％，其中残差(绿色)包含少量残差特征。这指示PhAs(LHP)复合物在IMDM中相当稳定持续24h。
As(LHP)复合物的细胞毒性(MTT)测试
方法
细胞系和培养方法
所有细胞培养和细胞分析均在生物安全柜(II类，Email WestinghousePty Ltd)中使用无菌技术进行。
人慢性髓性白血病(K562)细胞
K562细胞是来源于53岁女性的人慢性髓性白血病细胞/骨髓细胞，最初获自ATCC。选择该细胞系是因为它是LHP的靶标，因此可能是As-LHP复合物。使用MTT分析建立亚砷酸盐、AsI3、PAO、LHP、HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)、乙酰胂胺、ATO、sLHP和PhAs(sLHP)的毒性和IC50值。
K562细胞生长自半永久性细胞(购自ATCC)。细胞在含有IMDM(Iscove改良的Dulbecco's培养基，Invitrogen，500mL)、胎牛血清(FBS，Bovogen，Thermo Scientific，10％v/v)和青霉素/链霉素(Gibco，Life Technologies，10mL/500mL IMDM，分别为200IU/mL和200μg/mL)的生长培养基(GM)中生长。K562培养物在表面积为75cm2的细胞培养瓶(Greiner)中于37℃在5％CO2培养箱(Heraeus，Thermo Scientific，美国)中生长。将细胞传代培养，通常每周两次。将细胞悬浮液离心(1500rpm，5min，Heraeus Labofuge 300)，将沉淀重悬于GM(5mL)中并将2滴加入到细胞培养瓶中的GM(25mL)中。
人急性早幼粒细胞白血病(HL-60)细胞
HL-60细胞是来源于患有急性早幼粒细胞白血病的36岁白种人女性的人急性早幼粒细胞白血病细胞。HL-60细胞生长自半永久性细胞(最初购自ATCC)。这些APL细胞是另一种已知被CAYHRLRRC肽靶向的白血病细胞系，代表目前用AS疗法即ATO治疗的病症。细胞在含有IMDM(500mL)、FBS(20％v/v)和青霉素/链霉素(10mL/500mL IMDM，分别为200IU/mL和200μg/mL)的生长培养基(GMH)中生长。通常以与使用GMH的K562细胞相同的方式每周两次传代培养细胞。
人急性粒细胞白血病(Kasumi-1)细胞
Kasumi-1细胞购自CellBank Australia。Kasumi-1细胞是来源于7岁日本男性的人急性粒细胞白血病细胞/骨髓细胞。选择该细胞系以探索PhAs(LHP)作为AML治疗的潜力。Kasumi-1细胞在含有RPMI-1640(洛斯维·帕克纪念研究所培养基(Roswell ParkMemorial Institute Medium)，Invitrogen，500mL)、FBS(20％v/v)和青霉素/链霉素(10mL/500mL IMDM，分别为200IU/mL和200μg/mL)的生长培养基(GM1)中生长。Kasumi-1细胞在表面积为75cm2的细胞培养瓶中于37℃在5％CO2培养箱中生长。将细胞传代培养，通常每周两次。简言之，用新鲜GM1替换一半细胞悬浮液以维持细胞密度在3×105和3×106细胞/mL之间。
人T细胞白血病(KARPAS 45)细胞
KARPAS 45细胞是来源于治疗前2岁男性的人T细胞白血病细胞/骨髓细胞，并且在含有RPMI-1640、FBS(20％v/v)、谷氨酰胺(2mM，Gibco，LifeTechnologies)和青霉素/链霉素(10mL/500mL IMDM，分别为200IU/mL和200μg/mL)中生长。KARPAS 45培养物在表面积为75cm2的细胞培养瓶中于37℃在5％CO2培养箱中生长。将细胞传代培养，通常每周两次，用新鲜GMK替换一半体积。
人肝癌(HepG2)细胞
HepG2细胞是来源于15岁白种人男性的人肝癌细胞。它们是粘附的上皮样细胞，并且生长自半永久性细胞(最初购自ATCC)。细胞在含有DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，Life Technologies，500mL)、FBS(50mL，10％v/v)和青霉素/链霉素(10mL，分别为200IU/mL和200μg/mL)的生长培养基(GMA)中生长。将细胞传代培养，通常每周两次，然后达到汇合。去除细胞培养基、丢弃，并用PBS冲洗细胞，然后也将其去除并丢弃。加入胰蛋白酶(5mL，0.25％w/v的PBS溶液，Gibco，Life Technologies)，并将烧瓶温育直到细胞分离。将GMA(5mL)加入到烧瓶中，并将烧瓶的内容物转移到无菌管中并离心(1500rpm，5min)。除去上清液后，将沉淀重悬于GMA(5mL)中，并将1至2滴细胞溶液加入到细胞培养瓶中的GMA(25mL)中。
A549人肺癌细胞
A549细胞是来源于58岁男性的人肺癌细胞。它们是粘附的上皮样细胞，并且生长自购自CellBank Australia的半永久性细胞。细胞以与上述HepG2细胞相同的方式生长和传代培养。这些细胞也被选择代表源自不应被As-肽复合物识别或靶向的实体瘤的快速生长细胞。
中国仓鼠实体瘤细胞
选择中国仓鼠(CH)实体瘤细胞作为非人细胞系(不应被靶向)。它们是粘附的上皮样细胞，并且生长自半永久性细胞。细胞以与上述HepG2细胞相同的方式生长和传代培养。
人外周血单核细胞(hPBMC)
从健康志愿者抽取血液(40mL)。将无菌PBS(15mL)加入20mL血液中。将每个管倒置3至4次以混合。将血液用约15mL Ficoll-PaqueTM PLUS(GE Healthcare)灌注并离心(1700rpm，Heraeus Labofuge 400R离心机)30min(制动)。将单核细胞层转移到新试管中并用无菌PBS(50mL)洗涤两次。轻轻倒置试管以混合，然后离心(1500rpm，15min)。将单核细胞重悬于PBS(相当于原始血液体积)中并用血球计(haemocytometer)计数。离心后，将细胞重悬于足够的RPMI-1640中以产生所需的细胞群。进行校准分析，并确定对于使用hPBMC的MTT分析对照，每孔106个细胞产生最佳吸光度(1.00-2.00)。
MTT细胞毒性分析
通过适用Carmichael等人(癌症研究，1987,47,936)和Mosman(免疫学方法杂志，1983,65,55)所述的MTT分析来评估化合物的细胞毒性。MTT分析基于活细胞将四唑盐(tetrazolium)转化成甲瓒(formazan)，并允许通过比色法评估定量细胞存活率(cellsurvival)。该分析建立了每种化合物的IC50，以能够比较不同化合物对分析中使用的细胞系的毒性。该分析用于比较砷类肽复合物与其他砷类化合物的毒性，以检验它们作为抗白血病治疗的靶向能力和潜力。如前所述，通过MTT分析评估两种PhAs(LHP)异构体对K562和HL-60细胞的细胞毒性。处理前立即在IMDM中新鲜制备处理溶液并连续稀释。
进行细胞毒性分析，测试亚砷酸钠(亚砷酸盐，Sigma Aldrich)、氧化苯胂(PAO，Sigma Aldrich)、AsI3、乙酰胂胺(阿西太松，Sigma Aldrich)、ATO(获自Phebra的Pheasen制剂)、混杂LHP(sLHP)、LHP(获自Peptide 2.0，美国)、PhAs(LHP)和PhAs(sLHP)的各种浓度范围。
对K562细胞进行MTT细胞毒性分析的方案
将K-562细胞(8×105细胞)接种于60mm细胞培养皿中的生长培养基(5mL)中，并在37℃、5％CO2下温育24h。测试的化合物是亚砷酸盐、AsI3、ATO、乙酰砷胺、LHP、HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)、sLHP和PhAs(sLHP)。处理前立即在IMDM中新鲜制备处理溶液。将化合物在IMDM中连续稀释以获得用于分析的一系列浓度。将来自每个培养皿的细胞悬浮液离心(1200rpm，5min，Heraeus Labofuge 300)并将沉淀重悬浮在处理溶液(3mL)中，或者在对照细胞的情况下，重悬浮在IMDM(3mL)中，并返回培养皿用于温育(37℃，5％CO2)。24h后，将细胞溶液离心(1200rpm，5min)。加入无菌PBS洗涤细胞两次，然后离心(1200rpm，5min)。将细胞重悬于IMDM(5mL)中，并返回到新鲜培养皿中。向每个培养皿中加入MTT(400μL，2mg/mL，IMDM)并温育培养皿。4h后，将溶液离心(1200rpm，5min)并向沉淀中加入DMSO(1.8mL)以溶解甲瓒晶体(formazan crystal)。将每种溶液吸取(200μL/孔)到96孔板(1管/列，Cellstar，Greiner Bio-one，澳大利亚)中。
对HL-60细胞进行MTT细胞毒性分析的方案
测试的化合物包括：亚砷酸盐、ATO、乙酰砷胺、LHP、PhAs(LHP)、sLHP和PhAs(sLHP)。由于肽的费用以及PhAs(LHP)复合物相对于HyAs(LHP)和MeAs(LHP)的稳定性提高，决定中断后两种复合物的测试。处理前立即在IMDM中新鲜制备处理溶液。将化合物在IMDM中连续稀释以获得用于分析的浓度范围。由于细胞通过在培养皿和试管之间转移而损失，Tada等人的另一种MTT方案(免疫学方法杂志，1986,93,157)最初用K562细胞进行试验。当确定所得IC50值与先前方法相当时，将新方案用于用HL-60细胞进行的MTT分析。将HL-60细胞溶液(2×105细胞/50μL，IMDM)添加至各孔(第2至7行，B至I列，96孔平底板，Greiner)中。然后将处理溶液(50μL)加入到第3至11列中的每个孔中(在第3列中稀释度最高，在第11列中浓缩度最高)，同时将IMDM(50μL)加入到对照孔(第2列)中。将板温育(37℃，5％CO2)24h，之后向各孔中加入MTT溶液(20μL，5mg/mL，IMDM)，将板返回到培养箱中以允许甲瓒显色。4h后，将增溶溶液(100μL，在0.01M HCL中的10％SDS)添加到每个孔中并且将板温育过夜。
对Kasumi-1细胞进行的MTT细胞毒性分析的方案
以2×105细胞/孔的密度接种Kasumi-1细胞。评估的化合物包括：间亚砷酸钠(亚砷酸盐，Sigma Aldrich)、三氧化二砷(ATO，Phbra)、氧化苯胂(PAO，Sigma Aldrich)、白血病导向肽(LHP)和获自美国肽2.0的混杂的白血病导向肽(sLHP)；以及合成、纯化和表征的PhAs(LHP)和PhAs(sLHP)。处理前立即在RPMI-1640中新鲜制备处理溶液。将化合物在RPMI-1640中连续稀释以获得用于分析的一系列浓度。以与HL-60细胞相同的方式进行MTT分析至少3次，以获得IC50值的平均值和标准偏差。
对KARPAS 45细胞进行MTT细胞毒性分析的方案
处理前立即在RPMI-1640中新鲜制备处理溶液，并将化合物在RPMI-1640中连续稀释以获得用于分析的一系列浓度。测试的化合物是亚砷酸盐、ATO、乙酰砷胺、LHP、PhAs(LHP)、sLHP和PhAs(sLHP)。将KARPAS 45细胞溶液(6×105细胞/50μL，RPMI-1640)添加至每个孔(第2至4行，B至I列，96孔平底板，Greiner)。将处理溶液(50μL)加入到第3至11列的每个孔中(在第3列中稀释度最高，在第11列中浓缩度最高)，同时将RPMI-1640(50μL)加入到对照孔(第2列)。除了MTT溶液在RPMI-1640中制备之外，其余分析以与前段概述的针对HL-60细胞相同的方式进行。
对HepG2、A549和中国仓鼠实体瘤细胞进行MTT细胞毒性分析的方案
将细胞溶液(1×104个细胞/100μL GMA)添加至各孔(第2至7行，B至I列，96孔平底板，Greiner)中并温育24h。除去GMA并将新鲜制备的处理溶液(100μL，化合物在DMEM中连续稀释)加入到第3至11列中的每个孔中(在第3列中稀释度最高，在第11列中浓缩度最高)，同时将DMEM(100μL)加入到对照孔中(第2列)。测试的化合物是亚砷酸盐、ATO、PAO、乙酰砷胺、LHP和PhAs(LHP)。除了使用DMEM制备MTT溶液外，其余分析使用与HL-60细胞所用相同的方案进行。
对hPBMC进行MTT细胞毒性分析的方案
在处理当天，以与HL-60细胞相同的方式新鲜制备处理溶液。测试的化合物是亚砷酸盐、ATO、PAO、乙酰砷胺、LHP和PhAs(LHP)。将hPBMC细胞溶液(1×106细胞/50μL，RPMI-1640)添加至各孔(第2至4行，B至I列，96孔平底板，Greiner)中，并使用与HL-60细胞相同的方案进行其余分析。
MTT比色法评估和IC50计算
用于K562细胞分析的比色评估和计算
在570nm和630nm处测量吸光度(BMG LabTech Polarstar Omega酶标仪)。然后通过方程式1确定细胞存活率百分比。
Figure BDA0002453272340000531
方程式1
将计算的细胞活力(cell viability)相对于处理浓度作图以确定每个种类的IC50值。所有MTT分析进行至少3次以提供进行统计分析所需的必要能力。使用单向ANOVA和图基多重比较检验(Tukey’s multiple comparison test)(GraphPad Prism)进行统计学分析。
对HL-60、Kasumi-1、KARPAS 45、HepG2、A549、CH实体瘤细胞和hPBMC的分析的比色评估和计算，
在570nm和690nm处记录吸光度读数(BMG LabTech Polarstar Omega酶标仪)并产生浓度-反应曲线(使用方程式2计算细胞活力)以计算各化合物的IC50值。除非另有说明，MTT分析进行至少3次。使用单向ANOVA和图基多重比较检验(GraphPad Prism)进行统计学分析。
Figure BDA0002453272340000532
方程式2
结果
PhAs(LHP)异构体对K562和HL60细胞的MTT结果和IC50值
从MTT细胞毒性研究中获得的PhAs(LHP)异构体级分对K562和HL-60细胞的IC50值表明，从每个HPLC级分得到的产物表现出相同的毒性(表14)。
表14由鉴定为PhAs(LHP)的级分得到的两种化合物的MTT细胞毒性分析获得的IC50值。
*结果表示为三次分析的平均值和标准偏差。
显然，外消旋作用在室温及更高温度发生的，并且不影响生物活性，因此，对外消旋混合物(未拆分的异构体级分)进行了所有进一步的测试。
K562细胞的MTT结果和IC50值
处理24-h后针对K562细胞的MTT分析所得到的浓度-反应曲线如图15所示。导致细胞死亡的砷处理对大多数测试化合物产生典型的浓度-反应曲线。在处理24-h后，在K562细胞上获得的针对亚砷酸盐、AsI3、ATO、PAO、HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)和PhAs(sLHP)的IC50值显示在图16和表15中。亚砷酸盐和AsI3的IC50值非常相似(分别为18.63±0.49μM和18.14±0.75μM)。ATO处理产生的IC50值为9.74±0.16μM，约为亚砷酸盐(NaAsO2)的一半，这与ATO含有的砷原子为亚砷酸盐的两倍一致。PAO(IC50：3.40±0.42μM)比ATO毒性高三倍，指示由于与苯基的存在相关的亲脂性增加，该化合物的摄取可能更大。或者，苯基可直接涉及与细胞靶标的相互作用。
表15.在对K562细胞处理24-h后，从三次重复MTT分析中获得的IC50值。
Figure BDA0002453272340000551
值得注意的是，HyAs(LHP)处理产生的IC50(6.21±0.47μM)是ATO的IC50的60％，即使其含有的砷原子数量是ATO的一半。这表明肽的存在可能有助于HyAs(LHP)的摄取；然而，复合物较差的稳定性最有可能影响毒性。对于MeAs(LHP)获得的IC50值(IC50：3.74±0.17μM)是HyAs(LHP)的60％和ATO的37％，这可以归因于由于砷上存在甲基而导致该化合物的额外稳定性。PhAs(LHP)被证明是所测试的毒性最大的化合物(IC50：0.487±0.025μM)。苯环的存在也增加了该复合物的稳定性。它比ATO毒性高20倍，比PAO毒性高7倍。有趣的是，具有混杂肽(PhAs(sLHP)，IC50：790±32μM)的砷化合物被证明在K562细胞中比PhAs(LHP)的毒性低1600倍，指示肽构型在PhAs(LHP)对K562细胞的毒性中起重要作用。
对乙酰砷胺进行了高达1000μM的测试，且未能产生50％的抑制作用，其中60.5％的K562细胞在此高浓度下仍能存活。在1000μM，乙酰砷胺使溶液变成酸性(培养基变成黄色，pH 6.87)，因此很可能低pH有助于减少细胞数量而不是化合物本身。由于pH的变化，未测试更高的浓度以建立IC50。高达1000μM的LHP和sLHP对K562细胞都是无毒性的，因此不能促进As(LHP)复合物显示出毒性。在所有MTT分析中，这两种化合物的细胞活力保持接近或高于100％。
对每种化合物确定的IC50值进行统计学比较。PhAs(sLHP)的值在统计学上高于所有其他化合物(P<0.0001)。由于PhAs(sLHP)的较大的IC50值和相应的标准偏差，从其他化合物的IC50值之间的统计学比较中省略了该化合物的结果。表16包含统计分析结果。
亚砷酸盐和AsI3的IC50值彼此没有统计学差异。类似地，对于PAO和MeAs(LHP)获得的值没有统计学差异。重要的是，分析表明所有其他化合物的IC50值之间的差异具有统计学意义(P<0.0001)。
表16.比较了对K562细胞处理24h后从MTT分析中获得的IC50值的统计分析结果。
Figure BDA0002453272340000561
Figure BDA0002453272340000571
HL-60细胞的MTT结果和IC50值
图17显示了处理24h后HL-60细胞中亚砷酸盐、ATO、PAO、PhAs(LHP)和PhAs(sLHP)的IC50值。ATO产生IC50值(7.0±0.1μM)，略小于亚砷酸盐(20±1μM)获得的IC50值的一半，这与ATO作为亚砷酸盐含有两倍数量砷原子一致。它不完全是一半的事实表明，阴离子在两种细胞系中通过不同的方式(通过不同摄取机制或毒性作用方式二者之一)起作用。PAO(1.5±0.3μM)获得的IC50值是亚砷酸盐获得的IC50值的大约十三分之一以及ATO获得的IC50值的大约四分之一。IC50值为0.5±0.1μM的目标化合物PhAs(LHP)对HL-60细胞的毒性比PAO起始材料大3倍，这意味着LHP的存在可以帮助这些细胞中的摄取和/或毒性。混杂肽化合物PhAs(sLHP)的结果再次支持了这一点，该混杂肽化合物PhAs(sLHP)的IC50值为205±4μM，是PAO的IC50值的130倍并超过PhAs(LHP)的400倍。大的IC50表明混杂肽的额外体积很可能阻碍摄取，因此阻碍细胞毒性活性。进行摄取分析以进一步研究这些结果。
测试了LHP和sLHP肽，但在高达1000μM的浓度无毒性，在整个测试浓度范围内细胞活力均保持接近100％。经测试高达1000μM的乙酰砷胺不能诱导获得IC50值所需的毒性。
对各组中每种化合物的IC50进行了统计比较，毫不奇怪，PhAs(sLHP)的值与所有其他分析的砷类化合物均存在统计学差异(P<0.0001)。由于PhAs(sLHP)的大IC50值，从其他化合物的进一步统计分析中省略了该化合物的结果。重要的是，分析显示大多数结果之间的差异具有统计学显著性，如表17所示。发现亚砷酸盐的IC50值与所有其他测试化合物均存在显著差异(对于所有其他化合物，P<0.0001)。还发现ATO与所有其他化合物均存在显著差异(P<0.0001)，但PAO与PhAs(LHP)没有显著差异。
表17.比较了对K562细胞处理24h后从MTT分析中获得的IC50值的统计分析结果。
Figure BDA0002453272340000581
Kasumi-1细胞的MTT结果和IC50值
所有砷处理产生典型的浓度-响应曲线。亚砷酸盐、ATO、PAO、PhAs(LHP)和PhAs(sLHP)的IC50值总结在图18中。高达1000μM的前体肽LHP和sLHP对Kasumi-1细胞都是无毒性的。在对这些肽中的每一种进行的所有三次MTT分析中，MTT转化率的百分比保持接近或高于100％。
测试的最小毒性的砷化合物是PhAs(sLHP)(IC50＝650±0.6μM)，并且与测试的所有其他砷类化合物相比毒性显著更小(表18)。这个较大的IC50值指示配位的非靶向肽不被这些细胞识别，并且其庞大的存在会抑制细胞的摄取。PhAs(sLHP)的大的IC50值从其他As化合物的IC50值的统计分析中排除，以防止该高数值使分析失真。目标化合物PhAs(LHP)(IC50＝1.4±0.1μM)比PAO毒性高3.6倍(IC50＝5.1±0.5μM，P<0.001)，指示肽可能有助于将As摄取到这些细胞中。其毒性大约比ATO高40倍(61±1μM，P<0.001)。PhAs(LHP)比含有混杂肽的类似化合物PhAs(sLHP)毒性高约460倍(P<0.001)，指示肽构型在PhAs(LHP)对这些细胞的毒性中起重要作用。
这些结果表明，PhAs(LHP)有可能用于处理AML，而AML目前表现出较差的治愈率(仅27％的存活率)。
表18比较了对Kasumi-1细胞处理24h后从MTT分析中获得的IC50值的统计分析结果。
Figure BDA0002453272340000591
KARPAS 45细胞的MTT结果和IC50值
在对KARPAS 45细胞处理24h之后，获得亚砷酸盐、ATO、PAO、PhAs(LHP)和PhAs(sLHP)的IC50值，并且显示在图19中。令人惊讶的是，ATO的IC50值(IC50：15.1±1.8μM)是亚砷酸盐的值(IC50：66.2±2.6μM)的23％，这推断阴离子通过摄取方式或作用方式在该细胞系中对ATO的作用不同。PAO(IC50：5.1±2.3μM)的毒性比ATO的毒性大约高三倍，指示毒性受到影响该化合物摄取的亲脂性的影响。或者，PAO一旦位于细胞中就更具毒性。目标化合物PhAs(LHP)(IC50：7.8±1.2μM)的毒性是ATO的约两倍，但毒性略小于PAO。当与砷混杂肽复合物的结果比较时，这可以被置于上下文中。具有混杂肽的砷化合物(PhAs(sLHP)，IC50：248±19μM)被证明在KARPAS 45细胞中比PhAs(LHP)的毒性低32倍，指示肽构型在PhAs(LHP)对这些细胞的毒性中一定起重要作用。这也表明更大的分子量(由肽产生)降低了摄取，除非肽处于正确的构型以靶向大胞饮通路。这也表明，更大的分子量(由肽产生)会降低摄取，除非该肽具有正确的构型以靶向大胞饮途径(macropinocytotic pathway)。
对乙酰砷胺进行了高达1000μM的测试，且未能产生IC50值。由于细胞培养基pH的变化，未测试更高的浓度。高达1000μM的LHP和sLHP对KARPAS 45细胞都是无毒性的。在所有三次MTT分析中，这两种化合物的细胞活力保持接近或高于100％。
对各组之间的化合物的IC50值进行统计学比较。PhAs(sLHP)的值与所有其他化合物均存在统计学差异(P<0.0001)。由于PhAs(sLHP)的大的IC50和相应的标准偏差，从其他化合物的IC50值之间的统计学比较中省略了该化合物的结果。重要的是，分析显示大多数结果之间的差异具有统计学显著性，如表19所示。发现亚砷酸盐的IC50值与所有其他测试化合物均存在显著差异(P<0.0001)。与PAO相关的IC50值显著低于ATO的值(P<0.001)，但未发现显著低于PhAs(LHP)的值。PhAs(LHP)的IC50值显著低于ATO(P<0.05)和亚砷酸盐(P<0.0001)的值。
表19.比较了对KARPAS 45细胞处理24h后从MTT分析中获得的IC50值的统计分析结果。
Figure BDA0002453272340000601
HepG2细胞的MTT结果和IC50值
图20显示了在HepG2细胞处理24h后从MTT分析中获得的亚砷酸盐、PAO、ATO和PhAs(LHP)的IC50值。产生52±3μM的IC50值的ATO比具有89±1μM的IC50值的亚砷酸盐的毒性高1.7倍。目标化合物PhAs(LHP)产生非常高的IC50值(978±11μM)，并且毒性比ATO(IC50：52±3μM)低约19倍，以及毒性比PAO(IC50：0.63±0.01μM)低超过1500倍。由于PAO是PhAs(LHP)的起始材料，这些结果再次强烈地指示与白血病导向肽的缀合在PhAs(LHP)对细胞的靶向能力和毒性中起着重要作用，并且再次暗示较大分子量复合物PhAs(LHP)对不识别该肽的细胞没有毒性。
对乙酰砷胺和LHP均进行了高达1000μM的测试，但未能产生IC50值。相反，对于这些化合物中的每一种，HepG2细胞的活力(viability)在所有三次MTT分析中保持接近或高于100％。
将HepG2细胞处理24h后从MTT分析中获得的IC50值在各组之间进行统计学比较，并且发现PhAs(LHP)的值与所有其他化合物相比存在显著差异(P<0.0001)。
A549人肺癌细胞对PhAs(LHP)的IC50值
A549细胞中PhAs(LHP)的IC50值为234±5μM。这再次显示该复合物对人实体瘤细胞相对于白血病细胞的毒性相对较低。
CH实体瘤细胞的MTT结果和IC50值
在CH实体瘤细胞处理24h后获得的亚砷酸盐、PAO、ATO和PhAs(LHP)的IC50值显示在图21中。目标化合物PhAs(LHP)产生770±12μM的高IC50，并且毒性比ATO(IC50：23.3±0.9μM)低约34倍，以及毒性比PAO(IC50：1.49±0.03μM)低超过500倍。这表明PhAs(LHP)复合物的较大分子量阻碍细胞摄取；这是可以预期的，因为该肽不应被针对这些非人类肿瘤细胞的大胞饮途径摄取的受体识别。
对乙酰胂胺进行了高达1000μM的测试，且未能产生IC50值。高达1000μM的LHP对CH实体瘤细胞是无毒性的。在三次重复MTT分析中，这两种化合物的细胞活力保持接近或高于100％。
对各组中每种化合物的IC50值进行统计学比较，并且PhAs(LHP)的值显著高于所分析的所有其他砷类化合物(P<0.0001)。
hPBMC的MTT结果和IC50值
在处理24h后在hPBMC上获得的亚砷酸盐、ATO、PAO、PhAs(LHP)和PhAs(sLHP)的IC50值显示在图22中。有趣的是，尽管含有亚砷酸盐两倍数量的砷原子，ATO产生的IC50值(81.7±4.0μM)大约是亚砷酸盐(40.1±7.7μM)获得的IC50值的两倍。这再次表明阴离子以不同的方式(通过不同摄取机制或毒性作用方式二者之一)作用于这两种细胞系。PAO是毒性最强的化合物，IC50值为9.3±3.3μM，大约是亚砷酸盐的值的四分之一且约为ATO的值的十分之一。
最重要的是，目标化合物PhAs(LHP)产生495±6μM的高IC50值。这似乎证实了肽对白血病细胞的靶向能力超过健康细胞。
对乙酰砷胺和LHP均进行了高达1000μM的测试，且未能产生IC50值。
对hPBMC处理24h后获得的IC50值进行的统计分析结果列于表20中。发现每种化合物的值与其他值存在显著差异(P<0.0001)。
表20.比较了对hPBMC细胞处理24h后从MTT分析中获得的IC50值的统计分析结果。
Figure BDA0002453272340000621
在各种细胞系中测试的砷类化合物的IC50值的比较
表21显示了在6种不同细胞系中用4种特定砷类化合物处理24h后从MTT分析获得的IC50值的总结。亚砷酸盐在7个细胞系中的IC50值范围对于K562细胞为18.6±0.5μM，对于HepG2细胞为89±1μM。在用亚砷酸盐处理后，在白血病和非白血病细胞类型之间似乎没有明显的差异。令人惊奇的是，亚砷酸盐对快速生长的HepG2细胞比对静态的hPBMC具有更低的毒性。
ATO产生的IC50值范围从HL-60细胞的7.0±0.1μM至hPBMC的82±4μM。因为hPBMC是静态细胞，所以这些值的差异并不令人惊讶，因为砷因其与许多细胞分裂分子(例如微管蛋白)的相互作用而众所周知，并且这些靶标在静态细胞中不可得。ATO对K562细胞、HL-60细胞和KARPAS 45细胞显示略微更大的毒性(分别为9.7±0.2μM，7.0±0.1μM和15±2μM)。毒性对于Kasumi-1细胞(61±1μM)、HepG2细胞(52±3μM)和hPBMC(82±4μM)显著更低。
PAO产生的低μM IC50值范围在0.63±0.01μM和9±3μM之间。由于苯基的存在，这种对所有细胞类型的高毒性很可能与前述增加的亲脂性有关。
砷混杂肽复合物PhAs(sLHP)获得的所有IC50值都非常大，范围从HL-60细胞中的205±4μM到HepG2细胞中的960±10μM(表21)。
表21在对细胞系处理24h后从特定砷类化合物的MTT分析中获得的IC50值(μM)的比较。
Figure BDA0002453272340000631
Figure BDA0002453272340000632
LHP靶标：***高度识别的靶标，**识别的靶标，？未知。
值得注意的是，与非白血病细胞相比，PhAs(LHP)对白血病细胞具有高选择性毒性(如图23所示)。PhAs(LHP)对髓性白血病K562细胞和HL-60细胞均显示nM范围内的IC50值，其中在hPBMC中的IC50值大约高1000倍，在CH实体瘤细胞中的IC50值大约高1500倍，在HepG2细胞中的IC50值大约高2000倍，在A549细胞中的IC50值大约高470倍，表明该化合物具有治疗髓性白血病的潜力。Kasumi-1细胞的结果是特别有前景的。虽然PhAs(LHP)对淋巴样白血病KARPAS 45细胞不显示nM范围内的IC50值，但hPBMC的IC50值大约高64倍，表明该化合物具有良好的治疗窗，使得其也可用于T细胞白血病的潜在治疗。
白血病癌细胞和成纤维细胞的结果之间的巨大差异可能指示PhAs(LHP)对组织的毒性较小。令人惊奇的是，对于快速生长的非白血病HepG2细胞获得的IC50值远大于静态hPBMC获得的IC50值，这开启了PhAs(LHP)可能降低通常与砷治疗对快速生长细胞的毒性相关的副作用的可能性。动物实验和组织样品分析将是进一步检验该假设所必需的。
对不同细胞类型进行As处理24h后As摄取的总结
图24总结了用各种As化合物(1.5μM As)处理24h后与不同细胞类型相关的细胞As浓度。白血病细胞系K562、HL-60、Kasumi-1和KARPAS45用红色(较浅的的实心部分)表示，非白血病细胞类型用黑色(最深的阴影)表示，癌性粘附细胞HepG2用对角线条纹表示，正常细胞hPBMC用实心黑色表示。
在PhAs(LHP)处理后，在四种白血病细胞系(K562、HL-60、Kasumi-1和KARPAS 45)中检测到显著的(P<0.001)细胞As浓度，但最重要的是，没有检测到与非靶向的恶性细胞HepG2或非靶向的正常非癌hPBMC相关的细胞As浓度。由PhAs(LHP)处理的细胞As浓度在Kasumi-1细胞中最高。该浓度比与K562细胞相关的细胞As浓度高1.2倍(P<0.05)，比HL-60细胞的高1.4倍(P<0.001)，比与KARPAS 45细胞相关的细胞As浓度高4.0倍(P<0.001)。
用PhAs(sLHP)处理导致在任何测试的细胞类型中都没有可检测的As摄取，指示As-肽的摄取高度依赖于肽的氨基酸序列。
亚砷酸盐处理后的细胞As浓度都非常小(<4×10-14g/细胞)。与KARPAS 45细胞相关的最大细胞As浓度比与HepG2细胞相关的最小量高2.2倍。HepG2细胞浓度明显低于所有其他细胞类型(P<0.01)。hPBMC也没有可识别的趋势。
有趣的是，与粘附癌细胞系HepG2相比，ATO处理导致白血病细胞和正常hPBMC中摄取更大。与K562、HL-60和hPBMC相关的细胞As浓度相似(P>0.05)。在Kasumi-1细胞中发现最高的细胞As浓度，显著高于与每种其他细胞类型相关的细胞As浓度(P<0.001)。它比与HepG2细胞相关的细胞As浓度高5.5倍。
PAO处理后细胞As浓度明显有较大变化，HepG2细胞现在表现出显著高于所有其他细胞类型的As浓度(P<0.001)。该浓度比与PAO处理的hPBMC相关的细胞As浓度高2.2倍，比K562细胞高3.8倍，比Kasumi-1细胞高3.9倍，比KARPAS 45细胞高4.8倍，以及比HL-60细胞高7.6倍。有趣的是，hPBMC表现出第二高的细胞As浓度，并且这显著高于与白血病细胞系相关的细胞As浓度(P<0.001)。
PhAs(LHP)在白血病细胞中命运的研究
方法
如前所述获得并维持细胞系K562和HL-60。戊二醛(25％溶液)、Spurr的低粘度包埋树脂、3mm gold Finder格栅和甲苯胺蓝来源于Proscitech(Kirwan，澳大利亚)。使用先前记载的方法制备薄切片细胞用于微探针SRXRF分析。简言之，在细胞培养瓶(75cm2)中用IMDM(对照细胞，4h或24h)或PhAs(LHP)(IMDM中的10μM，4h或24h)处理细胞。通过离心用PBS洗涤细胞(2次)，并将最终的细胞沉淀在戊二醛(1mL，PBS中2％v/v)中室温固定2h；并在乙醇(30％×2、50％×2、70％×2、80％×2、90％×2、95％×2、100％×4)中脱水。将细胞在50％乙醇/50％Spurr树脂中摇动过夜，然后用100％Spurr树脂替换(×2，2天)以确保除去所有痕量的水，从而实现渗透。在最后一天，将细胞包埋在100％Spurr树脂中，离心(8000g，1h)并在Beem胶囊中在60℃固化过夜。使用超微切片机(Leica EM UC7)切割细胞沉淀的薄切片(1μm)。在安装到氮化硅膜上之前，用甲苯胺蓝染色薄切片。
将gold Finder格栅连接到设计成适合光学显微镜(Leica DMXRE落射荧光显微镜/目视显微镜)和X射线微探针(2-ID-D)的运动支架上。获得光学显微照片和XY坐标，以便找到合适的细胞进行分析。选择表现出完整外观、清晰限定的细胞核和远离其他细胞和细胞碎片的那些细胞用于分析。
微探针SR-XRF是在阿贡国家实验室(美国伊利诺伊州莱蒙市)的先进光子源(Advanced Photon Source)的光束线2-ID-D上进行的。使用两个波带片将11.9-keV X射线束聚焦到0.3×0.3μm2的斑点尺寸。将样品置于氦气氛中，并且借助于XYZ机动平台，通过以0.3μm的步长对样品进行光栅扫描来绘制从P(2.1keV)到As(11.9keV)的元素分布。使用2.5s/pt的停留时间和能量分散Vortex EM(加利福尼亚州北岭市的日立高新技术科学美国公司)硅漂移检测器检测荧光X射线。使用MAPS 1.7.3.02版软件包(S.Vogt，先进光子源)处理元素分布图。通过将X射线荧光强度与来自薄膜标准品NBS-1832和NBS-1833(美国马里兰州盖瑟斯堡市美国国家标准与技术研究院)的那些进行比较，将元素荧光强度转化为以微克/平方厘米(μg/cm2)为单位的绝对密度。
结果
图25描述了从PhAs(LHP)标准品和PhAs(LHP)处理的K562细胞(24h)获得的As K-边缘光谱。恒定的边缘能量指示细胞内As在24h内保持As(III)。后边缘区中的变化表明对As-S结合的一些修饰。例如，这可能反映了白血病导向肽与PhAs的解离及其随后与细胞内其他生物分子的结合。
图26描述了针对PhAs(LHP)标准品和PhAs(LHP)处理的HL-60细胞(24h)获得的AsK-边缘光谱。对于PhAs(LHP)处理的K562细胞样品观察到的光谱变化在HL-60细胞中也是明显的，由此边缘能量保持恒定。这表明PhAs(LHP)在24h期间保持为As(III)。边缘能量也与结合到硫部分的As原子一致，但是后边缘浸渍(post-edge dip)不如在PhAs(LHP)标准品中观察到的明显，再次表明与细胞中其他(含硫)生物分子的潜在配体交换反应。
图27描述了XRF分析之前甲苯胺蓝染色的薄切片K562细胞样品的显微照片图像。K562对照细胞样品(图27a)中的细胞通常是球形的，具有清楚限定和完整的细胞核。每个处理时间点显示了细胞响应PhAs(LHP)(10μM)处理的应激和死亡。处理4h后(图27b)，大多数细胞膜看起来是完整的，尽管存在细胞核片段化的细胞应激的明显证据。图27c描述了处理24-h(10μM)，清楚地显示了细胞膜的破裂和破碎/分散的核材料。
对每种处理条件(K562细胞和HL-60细胞)成像3至4个细胞，并在以下数据中提供每种的代表性图像。
从对照和PhAs(LHP)处理的(10μM，4h和24h)K-562细胞的薄切片获得的微探针SR-XRF元素分布图显示在图28中。浓度比As显著更高丰度的P、S和Zn用于限定细胞区域。P和Zn是核的标记物，因为它们分别存在于DNA磷酸骨架和DNA转录蛋白(锌指蛋白)中。对照K-562细胞(图28a)不含有任何显著水平的As，而4h和24h PhAs(LHP)处理的细胞(分别为28b和28c)各自在整个细胞中含有显著的As，这证明在细胞核中积累。
图29a示出了暴露于PhAs(LHP)(10μM，4h)的K-562细胞的甲苯胺蓝染色的薄切片的相关光学显微照片，而图29b示出了P、Zn和As的相应SR-XRF图谱以及三种元素的共定位图谱。由于使用含有S且随后影响细胞内S浓度的甲苯胺蓝染料，没有显示As与S的共定位图。
图28和29指示As已经进入细胞核，在那里它可能与DNA或与DNA复制相关的蛋白质相互作用，正如共定位图中优势蓝色所指出的(图29b)。如文献中报道的，磷占优势的区域与异染色质区一致。如共定位图中独特的蓝色区域所示，砷存在于整个细胞核中。仔细观察显示As存在于核仁中，以及异染色质区域和常染色质区域中(图29b)。后一区域与发生转录的堆积密度较小的DNA一致，允许As与转录蛋白中常见的富硫区域相互作用。对细胞质和细胞核中内源性元素浓度进行比较的统计分析未发现由于针对K562细胞的PhAs(LHP)处理而产生的特定趋势或变化。
图30显示了对照和PhAs(LHP)处理的(10μM，4h和24h)HL-60细胞的显微照片图像。对照细胞(图30a)通常是圆形的，具有大的、明确限定的细胞核和细胞膜。在4-h PhAs(LHP)处理后(图30b)，在HL-60细胞中细胞窘迫是明显的，其中大多数细胞不再是圆形的，而是不规则形状的，许多细胞的细胞核也变成不规则形状。HL-60细胞的24-h PhAs(LHP)处理(图30c)导致高度的细胞降解(cell degredation)，伴有细胞死亡的迹象。
图31描述了对照和PhAs(LHP)处理的(10μM，4h和24h)HL-60细胞的甲苯胺蓝染色的薄切片的可用显微照片图像和相应的SR-XRF元素图。与K562细胞一样，对照细胞中未出现显著的As(图31a)。然而，与K562细胞相反，在经过4-h PhAs(LHP)处理(图31b)后的HL-60细胞中仅存在少量As定位，这似乎与高DNA密集区、最可能与核仁有关。在经过24h PhAs(LHP)处理后的HL-60细胞中明显可见显著的As(图31c，图32b)，由此细胞核明显含有比细胞其余部分更大的As积累。位于细胞左下部分的强As区与Zn的强区域和P的较弱区域相关，这可能指示转录蛋白。
与K562细胞一样，比较HL-60细胞的细胞质和细胞核中元素浓度的统计学分析没有导致可归因于PhAs(LHP)处理的特定趋势或变化。
用于制备新型苯胂白血病导向肽化合物(XPhAs(LHP))的前体的氧化苯胂(对位取 代)类似物的合成
方法
化学品
本项目中使用的所有市售试剂均为分析级或更高级别。Milli-Q水(18.2Ω，Millipore)用作溶剂，用于稀释和制备缓冲溶液。对氨苯胂酸(≥99％)和活性炭(未处理的颗粒，8-20目)购自Sigma Aldrich(澳大利亚)。盐酸(HCl，32％)、甲醇(MeOH，>99.7％)、乙醚(Et2O，>99％)、氯仿(CHCl3，>99.5％)、乙醇(EtOH，>99.5％)、甲酸(99％)、碘(I2，>99.5％)和氢氧化钠(NaOH，>97.5％)均获自Ajax FineChem(澳大利亚)。三苯基膦(PPh3，99％)购自Acros Organics(澳大利亚)、亚硝酸钠(NaNO2，>99.8％)购自Thermo Fisher(澳大利亚)。碘化钾(KI，>99％)购自Chem Supply(澳大利亚)。磷酸氢二钠(Na2HPO4，>99％)和磷酸二氢钠二水合物(NaH2PO4.2H2O，≥99％)购自Sigma Aldrich(美国)。
缓冲液制备
使用表22中列出的适当体积的储备溶液A(NaH2PO4.2H2O，0.2M)和储备溶液B(Na2HPO4，0.2M)制备磷酸盐缓冲液(pH 8，0.1M，100mL)。在用梅特勒-托利多技术缓冲液(pH4.0、7.0和9.2)校准后，用梅特勒-托利多Sever Compact S220-Micro Kit测量和/或确认pH，并在用Milli-Q水(终浓度0.1M)稀释至100mL之前，根据需要逐滴加入溶液A或溶液B来调节pH，然后进行pH测量。
表22在特定pH*磷酸盐缓冲液的储备溶液组合。
Figure BDA0002453272340000691
*在25℃确定pH。
XPhAs(LHP)复合物形成的ESI-MS分析
使用ESI-MS监测上述前体(NH2PhAs(III)，ClPhAs(V)或IPhAs(V)，1.3.3节)与LHP(1.3.5节中所述)的配位，以优化反应条件以及优化随后的产物形成。使用1.3.5节中所述的条件在N2气氛下进行反应。在指定的时间，取出等分试样，将溶液在0.1％甲酸中稀释(50×)，以通过电喷雾电离-质谱(ESI-MS)进行分析。
ESI-MS操作条件
采用正离子模式下电喷雾电离的Micromass Quattro Micro三重四极杆质谱仪(Micromass，UK)收集所有质谱图。加热的干燥氮气用作所有实验的雾化和干燥气体。采用毛细管电压3.00kV、锥电压35V、源温度80℃、脱溶剂温度120℃和脱溶剂气流400L/h进行光谱收集。
在样品注射之前用Milli-Q水彻底冲洗源，直到光谱类似于基线光谱。然后使用1mL注射器(SGE AnalyticalScience，澳大利亚)以20μL/min的流速注射每个样品。数据采集以连续模式进行，并且通常将50次扫描求和以获得代表性的光谱。用MassLynx软件(Waters，2003)处理光谱。用1的多项式阶数在曲线下方40％进行背景扣除，并用Savitsky-Golay算法进行平滑。然后用中心函数(Top，面积)生成质心光谱(centroid spectra)，并用其各自的m/z比和强度标注每个峰。
XPhAs(LHP)复合物的纯化
分析型HPLC
使用配有Prominence-i LC2030C系统控制器、自动注射器和液相色谱单元的Shimadzu分析型HPLC系统纯化XPhAs(LHP)复合物。在用H2O(0.1％TFA)平衡20min后，使用Waters Sunfire C18柱，5μm，4.6×250mm(No.186002560)。使用H2O/ACN(0.1％TFA)进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min，从100％H2O到100％ACN。所有溶剂在使用前通过过滤和超声脱气。在分析之前，通过0.20μm过滤器(Sartorius)过滤样品。将根据最佳反应条件(由该方法发展的结果确定)制备的XPhAs(LHP)溶液(1mL)注射到柱中并分析，以确定溶液中每个种类的洗脱时间。还分析了每种相关的As前体(NH2PhAs(III)、ClPhAs(V)或IPhAs(V))以确定它们的洗脱时间。
制备型HPLC
基于从分析型HPLC获得的洗脱曲线，使用制备型HPLC进行X-PhAs(LHP)反应产物的纯化，该制备型HPLC采用Shimadzu SIL-10AP自动进样器、Shimadzu LC-20AP制备型液相色谱、Shimadzu FCV-200AL四通阀、Shimadzu SPD-M20A二极管阵列检测器、Shimadzu DGU-20A5R脱气单元、Shimadzu CDM-20A通信总线模块、LabSolutions软件和Luna 5u C18(2)柱(250×21.20mm，5μm，Phenomenex)。用H2O(0.1％TFA，20min)平衡柱。将根据最佳反应条件(由该方法发展的结果确定)制备的XPhAs(LHP)溶液(6mL)注射到柱中并使用表23和表24中详述的洗脱梯度分离。流速保持在15mL/min，并在λ254nm检测级分。收集主要级分并通过ESI-MS(操作条件如前所述)进行表征。
表23用于纯化NH2PhAs(LHP)的反相制备型HPLC洗脱梯度。
Figure BDA0002453272340000711
表24用于纯化ClPhAs(LHP)和PhAs(LHP)的反相制备型HPLC洗脱液梯度。
Figure BDA0002453272340000712
As复合物的干燥
为了获得纯化的化合物，使用Alpha 1-2LDplus冷冻干燥机(Christ)干燥鉴定的HPLC级分。
前体(NH2PhAs(III)、ClPhAs(V)和IPhAs(V))和肽复合物(XPhAs(LHP))的X射线吸收光谱表征。
采用X射线吸收光谱法(XAS)确定砷的氧化态以及前体和肽复合物中直接与砷配位的原子。
用于XAS分析的样品的制备
对合成的苯胂化合物、XPhAs(LHP)复合物和As标准品进行XAS分析。通过将样品与固体纤维素(Sigma Aldrich)充分混合来制备固体样品。最初使用XAFSmass程序确定稀释比，尽管发现另外10×稀释对于荧光模式中的分析是最佳的。将所得混合物安装在1-mm厚的铝样品容器中并用Kapton胶带密封。然后将每个样品快速浸没在液氮中并转移到液氦低温恒温器中，在此在10°K对其进行分析。收集下列As标准品的X-射线吸收光谱：PAO、苯胂基双谷胱甘肽(PhAs(GS)2)、对氨基苯胂酸和亚砷酸盐。
为了制备PhAs(GS)2，首先通过加热过夜(80℃)将PAO(0.048g)溶解在Milli-Q水(2mL)中。然后将所得溶液冷却至室温，然后加入谷胱甘肽(GSH)(0.26g)。用氮气冲洗反应管并使其反应过夜，通常16h。加入甲醇(10mL)以沉淀产物，通过离心(1700rpm，10min，Heraeus Labofuge300)分离产物。所得固体在室温干燥。
XAS实验仪器条件及数据分析
在澳大利亚同步加速器(AS，XAS Beamline，Clayton，VIC)进行XAS样品分析。射束能量为～3.0GeV，射束电流为200mA。Si(311)通道切割单色仪控制射束能量。所有光谱在～10°K(用牛津仪器的OPTIPTTL4K OptistatTMPTR，闭环He低温恒温器维持)以荧光模式记录。用100元件GE荧光检测器(Eurysis)和0.5mm的垂直狭缝宽度收集光谱。
收集具有以下能量范围的砷K-边缘XAS光谱：前缘区(pre-edge region)11667eV至11847eV(10eV步长)；XANES区11847eV至11930eV(0.25eV步长)；和EXAFS区11930eV至12468eV(k空间中
Figure BDA0002453272340000721
步长至
Figure BDA0002453272340000722
)。
在用于校准的样品下游以透射模式同时分析固体金箔标准品，由此将一阶导数光谱的第一峰值的能量(对应于边缘能量)限定为11920.0eV。通常，收集3至5次扫描用于所有样品分析。用EXAFSPAK进行数据处理。EXAFSPAK的DATFIT模块计算多重线性回归分析。用BACKSUB实现背景扣除和归一化，同时采用FEFF 8.2计算理论相位和振幅函数以拟合EXAFS数据。
对氨基苯基二氯胂(NH2PhAs(III))的合成
Figure BDA0002453272340000731
进行As(V)化合物对氨基苯胂酸还原成As(III)，以便通过与Cl交换促进肽结合。该方法改适自Heredia-Moya和Kirk((2008)Bioorg Med Chem.16,5743-5746)以及Ioannou和Tsivgolis((2015)Main Group Chem.14,237-253)报道的方法。简言之，将对氨基苯胂酸(0.2535g，1.00mmol)溶于脱气甲醇(1mL)和浓HCl(0.68mL)中。加入三苯基膦(0.4170g，1.50mmol)和碘(0.0123g，0.05mmol)，搅拌得到红色悬浮液。将所得混合物在室温搅拌4h以产生浅黄色溶液。通过加入醚(1mL)沉淀黄色产物对氨基苯基二氯胂(p-aminophenyldichloroarsine)(NH2PhAs(III))，并收集固体。用氯仿(2mL)和乙醚(2mL)的混合物萃取以从氧化副产物三苯基氧化膦中分离NH2PhAs(III)。
对氯苯胂酸(ClPhAs(V))的合成
Figure BDA0002453272340000732
通过对氨基苯胂酸的重氮化和随后与Cl交换来制备对氯苯胂酸(p-chlorophenylarsonic acid)(ClPhAs(V))。将对氨基苯胂酸(0.217g，1.00mmol)溶于MilliQ水(0.2mL)和浓HCl(0.12mL)中。完全溶解后，加入更浓的HCl(0.13mL)。将溶液冷却至0℃至5℃以产生悬浮液，并向容器中加入冰(0.1g)。在剧烈搅拌下，向酸化溶液中滴加NaNO2(0.074g，1.07mmol)的MilliQ水(0.2mL)溶液，得到橙色溶液。完全加入NaNO2后，反应溶液变为浅黄色。将反应容器升温至50℃并在该温度保持约2h，导致产生N2气体。溶液变成深橙色，沉淀明显。然后将悬浮液冷藏过夜。分离所得固体并溶于温NaOH(10％，0.6mL)中。将该溶液过滤并用HCl酸化以获得ClPhAs(V)。
对碘苯胂酸(IPhAs(V))的合成
Figure BDA0002453272340000741
通过对氨基苯胂酸的重氮化和随后与I交换来制备对碘苯胂酸(p-Iodophenylarsonic acid)(IPhAs(V))。将对氨基苯胂酸(0.217g，1.00mmol)溶于MilliQ水(0.2mL)和浓HCl(0.12mL)的混合物中。完全溶解后，加入更浓的HCl(0.13mL)。将溶液冷却至0℃至5℃，并向容器中加入冰(0.1g)。在剧烈搅拌下，向酸化溶液中滴加NaNO2(0.074g，1.07mmol)的MilliQ水(0.2mL)溶液。将溶液在冰中放置3min，然后缓慢加入碘化钾(1.076g，0.00648mol)在MilliQ水(1.5mL)中的冷却溶液。使反应容器在室温静置3min，然后升温至45℃，直到气体逸出停止(约3h至4h)。将悬浮液冷藏过夜，收集棕色固体并用冷MilliQ水洗涤。将固体溶于乙醇(1.4mL)中并加入活性炭。将混合物用热水(0.6mL)稀释，使其沸腾并趁热过滤。加入冷水(0.8mL)，并收集橙色/棕色晶体。
NH2PhAs(LHP)的形成
在表25所示的条件下，使用反应物NH2PhAs(III)和LHP进行三次重复反应，以制备NH2PhAs(LHP)。在温育前用N2冲洗所有反应瓶。在指定的时间点(1h、2h、16h和24h)通过ESI-MS分析代表性等分试样以监测反应进程。
表25形成NH2PhAs(LHP)的试验反应。
Figure BDA0002453272340000751
ClPhAs(LHP)的形成
在表26所示的条件下，使用反应物ClPhAs(V)和LHP进行三次重复反应以制备ClPhAs(LHP)。在温育前用N2冲洗所有反应瓶。在指定的时间点(30min、1h、2h、24h、72h和96h)通过ESI-MS分析代表性等分试样以监测反应进程。
表26形成ClPhAs(LHP)的试验反应。
Figure BDA0002453272340000752
IPhAs(LHP)的形成
在如下所示的条件下，使用反应物IPhAs(V)和LHP进行三次重复反应以制备IPhAs(LHP)。在温育前用N2冲洗所有反应瓶。在指定的时间点(1h、72h)通过ESI-MS分析代表性等分试样以监测反应进程。
表27用于形成IPhAs(LHP)的试验反应。
Figure BDA0002453272340000761
结果
NH2PhAs(III)的合成
ESI-质谱(图33)显示了由对氨基苯胂酸还原生成NH2PhAs(III)形成的反应产物。如m/z 259.0处的峰所示，成功制备了期望的As(III)化合物对氨基苯基二氯胂，归属为[NH2-Ph-As-Cl2+Na]+。此外，m/z 184.0处的峰对应于[NH2-Ph-As＝O+H]+，而m/z 202.0处的峰对应于[NH2-Ph-As-(OH)2+H]+，表明形成了第二As(III)化合物对氨基氧化苯胂。m/z279.1处的峰指示存在三苯基氧化膦[P(Ph)3O+H]+，其是由于三苯基氧化而形成的预期副产物。
1H NMR光谱还表明由于在区域δ＝7.36-7.76ppm中存在两组多重峰而形成两种主要产物。Ioannou和Tsivgoulis报道了纯的对氨基苯基二氯胂的合成，其中双峰存在于δ＝7.19ppm和δ＝7.70ppm处。根据该信息，合理地假定δ＝7.71ppm处的多重峰和与其相关的δ＝7.47ppm处多重峰可以归属为对氨基苯基二氯胂质子。因此，存在于δ＝7.42ppm和δ＝7.54ppm处的大的多重峰可归属为与对氨基氧化苯胂或对氨基苯基二羟基胂相关的质子。由于ESI质谱中与对氨基氧化苯胂相关的峰(m/z 184.0)的丰度相对较大，所以合理地假定由三苯基膦和碘还原对氨基苯胂酸导致形成两种主要产物：对氨基苯基二氯胂和对氨基氧化苯胂。
XAS还用于表征来自NH2PhAs(III)形成的As反应产物。图34显示了一些相关As(III)固体标准品：亚砷酸盐、PhAs(GS)2和PAO以及As(V)起始材料对氨基苯胂酸：氨基苯胂产物(底部光谱)和As K-边缘XANES光谱。如所预期的，As(III)种类表现出比As(V)化合物对氨基苯胂酸低大约3eV至5eV的边缘能量和白线峰(白线峰能量：亚砷酸盐，11871.54eV；PAO，11870.57eV；PhAs(GS)2，11869.55eV；对氨基苯胂酸，11874.56eV)。当我们考虑由亚砷酸盐相对于PAO产生的XANES光谱时，显然PAO中As与苯环的配位(与亚砷酸盐中的O原子相比)导致边缘位移至更低的能量。除了PhAs(GS)2中的苯基之外，As与两个GS配体的结合导致进一步的边缘位移至更低的能量。PhAs(GS)2的近后边缘结构的检验显示在约11874eV处吸收强度显著降低。NH2PhAs(III)在11871.80eV处产生白线峰，其指示As(III)种类。该峰相对较宽，且形状(前边缘区和后边缘区)不同于PAO的光谱。后边缘区显示与对氨基苯胂酸的XANES光谱的后边缘区的强相似性。这与后边缘区的宽度一起可以指示对氨基苯基二氯胂和对氨基氧化苯胂的混合物。
NH2PhAs(LHP)的形成
在成功合成对氨基苯胂化合物(含有两个种类，对氨基苯基二氯胂和对氨基氧化苯胂)之后，采用许多反应条件来确定产生期望的氨基苯胂-肽复合物的最佳反应条件。首先，将每个反应的温度保持在恒定的37℃以最小化任何产物的潜在降解。由于LHP的昂贵性质，因此过量使用了As化合物。尽管在所有反应物化学计量比反应都是快速的，但是确定理想的化学计量是3mol As：1mol LHP。确定反应溶液的最佳溶剂/pH为MilliQ水(pH 7)(参见磷酸盐缓冲液(pH 8))，因为通过制备型HPLC在磷酸盐缓冲液中纯化反应可得到的产物大约少10倍。尽管反应是快速的，并且容易形成期望的复合物，但是将反应在37℃温育大约24h以确保As化合物与肽的完全缀合。
使用最佳条件的NH2PhAs(III)和LHP的反应溶液的ESI-质谱(图35)显示形成了期望的氨基苯胂(LHP)复合物。期望的复合物的形成通过m/z 462.4([NH2-Ph-As(LHP)+3H]3+)和m/z 693.0([NH2-Ph-As(LHP)+2H]2+)的峰证实。未反应的对氨基苯基二氯胂(m/z 259.1)在光谱中是明显的，这是因为该试剂加入过量。少量游离LHP在光谱(m/z 407.2，610.1)中是明显的，并且可以归因于通过ESI-MS方法产生的断裂。
一旦通过ESI-MS确定了NH2PhAs(LHP)的存在，就可以通过HPLC进行分离。用ESI-MS分析在8.6min、10.5min和12.2min洗脱的级分，并将其鉴定为与NH2PhAs(III)相关的种类。期望的NH2PhAs(LHP)复合物在13.0min洗脱(大峰)。
合成的NH2PhAs(LHP)通过XAS表征(图34)。从边缘能量和白线峰值能量(11870.04eV)的位置可以清楚地看出，产物是As(III)种类。重要的是，NH2PhAs(LHP)光谱的后边缘区与由形成NH2PhAs(III)的反应产物获得的光谱的后边缘区存在显著差异。首先，白线峰较窄，表明产物较纯。其次，在约11874eV处的肩峰在形状上类似于PhAs(GS)2的肩峰，并且比亚砷酸盐或PAO的肩峰明显得多。由于后边缘降低(post-edge depression)指示As与S结合，因此也合理地假定As与肽结合，尽管也进行了EXAFS分析以证实这一点。
图36显示了对于合成的NH2PhAs(LHP)记录的最佳单散射拟合(对于第一配位壳)和EXAFS数据。
Figure BDA0002453272340000781
处的峰最可能是由于所喷射的电子与结合到As原子上的苯环的相互作用。As原子可能与2S和1C结合。
表征数据证实了NH2PhAs(LHP)的成功合成。
ClPhAs(V)的合成
化合物ClPhAs(V)通过对氨基苯胂酸的重氮化和随后的Cl偶联成功地合成。ESI质谱(图37)指示了期望的产物(m/z 236.9，[Cl-Ph-AsH2O3+H]+)的形成。m/z 219.0处的峰对应于对位取代的羟基苯胂酸([OH-Ph-AsH2O3+H]+)，其可以作为重氮化反应中的副产物产生。
通过1H NMR分析合成的对氯苯胂酸显示存在一个主要结构，其中两组多重峰存在于δ＝7.76ppm和δ＝7.69ppm处。
对氯苯胂酸的产率为约24％。其他合成方法可用于合成该化合物，例如通过Bart反应，其中碱性亚砷酸盐与由对氯苯胺形成的芳基重氮盐偶联。产率通常为60％至80％。然而，在本工作中使用的对氨基苯胂酸的重氮化和随后的Cl的偶联是优选的，因为该方法也可用于使用相同的前体对氨基苯胂酸制备对碘苯胂酸和可能的对溴苯胂酸，其中碘化钾和溴化钾的加入分别稍微改变。
合成的对氯苯胂酸的进一步表征通过XAS进行。图38显示了As(III)和As(V)固体标准品以及对氯苯胂酸的As K-边缘XANES光谱。对氯苯胂酸在11874.55eV处产生白线峰，其指示As(V)种类，并且几乎与对氨基苯胂酸相同，证实了As与Ph原子和O原子结合。
ClPhAs(LHP)的形成
LHP与对氯苯胂酸反应。在确定产生期望的Cl-PhAs(LHP)化合物的最佳反应条件的所有试验中，LHP均保持过量。这是为了确保在与LHP缀合之前对氯苯胂酸充分还原。测试不同的反应物比例以确定最佳反应条件，由此所有试验显示ClPhAs(LHP)的产生(通过ESI-MS证实)。重要的是，在16h前未观察到ClPhAs(LHP)的存在，表明还原成As(III)和随后的缀合不是快速的。在37℃温育约24h后，ESI质谱中存在对应于ClPhAs(LHP)的峰，以及与氧化的LHP(即通过S-S连接的环状LHP)相关的峰。72h后该反应的ESI质谱如图39所示。m/z468.8和m/z 702.5处的峰对应于期望的氯苯砷-肽结构(分别为[Cl-Ph-As(LHP)+3H]3+和([Cl-Ph-As(LHP)+2H]2+)。m/z 406.8和m/z 609.5处的峰所指示的离子对应于氧化的LHP(分别为[氧化的LHP+3H]3+和[氧化的LHP+2H]2+)。
一旦ESI-MS证实产生ClPhAs(LHP)，通过HPLC进行分离。在17.1min洗脱的级分的ESI-MS鉴定为氧化的LHP。在22.1min和22.4min洗脱两个重要级分。当通过ESI-MS分析时，这两个级分几乎一致，由此它们都含有期望的ClPhAs(LHP)复合物。
与前述PhAs(LHP)复合物的情况一样，假定不同的洗脱时间反映了两种自发互变的As异构体的存在。
初步的细胞毒性研究显示，来自各HPLC级分的产物在K562细胞(人慢性骨髓性白血病)中表现出相同的毒性，这与异构体的外消旋化一致。
对ClPhAs(LHP)进行XAS分析以确定与As配位的原子的性质及其氧化态。图38显示了As标准品和ClPhAs(LHP)的As K-边缘XANES光谱。ClPhAs(LHP)复合物的白线峰能量为11870.31eV，指示为As(III)种类。在该光谱中存在约11874eV处的显著后峰降低，这与PhAs(GS)2的后峰降低相似，并且与As(III)配位到肽上所预期的一致。
图40显示了对于ClPhAs(LHP)记录的EXAFS数据的单散射拟合(第一配位壳)，其中散射体是2S和1C。根据NH2PhAs(LHP)EXAFS拟合，傅立叶变换实验光谱中不与拟合对齐的
Figure BDA0002453272340000801
处的峰是由于所喷射的电子与邻近于As的苯环的相互作用发生在第一配位壳之外。表征数据证实了期望的复合物ClPhAs(LHP)的成功合成。
IPhAs(V)的合成
对碘苯胂酸是通过对氨基苯胂酸的重氮化和随后的I的偶联成功地合成的。IPhAs(V)的产率为约30％。
ESI质谱(图41)表明形成了期望的产物(m/z 328.8，[I-Ph-AsH2O3+H+]+)。通过1HNMR分析合成的对碘苯胂酸显示存在一个主要结构，其中两组多重峰存在于δ＝8.00ppm和δ＝7.51ppm处。
合成的对碘苯胂酸也通过XAS进行表征。图42显示了As(III)和As(V)固体标准品以及对碘苯胂酸的As K-边缘XANES光谱。对碘苯胂酸的近边缘X射线光谱显示了11874.8eV处的白线峰，指示As(V)种类。边缘能量也类似于对氨基苯胂酸的边缘能量，证实As与Ph和O原子结合。
IPhAs(LHP)的形成
As(V)种类IPhAs(V)与LHP反应，依赖于肽中的巯基以在与肽缀合之前还原胂酸基团。对碘苯胂酸的还原不迅速，通常在形成苯胂-肽复合物之前需要至少72h。该反应的ESI质谱(72h后)如图43所示。m/z 499.3和m/z 748.5处的峰对应于期望的碘基苯胂-肽结构([[I-Ph-As(LHP)+3H]3+和([I-Ph-As(LHP)+2H]2+)。m/z 406.8和m/z 609.5处的峰所指示的离子对应于氧化的LHP(分别为[氧化的LHP+3H]3+和[氧化的LHP+2H]2+)。
HPLC纯化产生了在17.1min洗脱的级分，其通过ESI-MS证实为氧化的LHP。洗脱两个重要级分(22.8min和23.2min)，其中ESI-MS显示了期望的IPhAs(LHP)复合物。如先前对于PhAs(LHP)和ClPhAs(LHP)所述，这些被证明是互变异构体(interconverting isomers)。
对碘苯胂酸的初步毒性研究显示，两种异构体在K562细胞系中引起相同的毒性，这与复合物在溶液中的自发外消旋化一致。
通过XAS分析IPhAs(LHP)复合物。图42显示了As标准品和IPhAs(LHP)复合物的AsK-边缘XANES光谱。IPhAs(LHP)复合物的白线峰能量为11869.79eV。根据其他XPhAs(LHP)光谱，IPhAs(LHP)光谱肩区的降低类似于PhAs(GS)2光谱中的降低，与结合到S的As(III)复合物一致。
图44显示了对于IPhAs(LHP)记录的EXAFS数据的单散射拟合(第一配位壳)，其中散射体是2S和1C。此外，在傅立叶变换实验光谱中
Figure BDA0002453272340000811
处不与拟合对准的峰可归因于所喷射的电子与邻近于As(超出第一配位壳)的苯环的相互作用。IPhAs(LHP)的表征数据证实了期望的复合物的成功合成。结论是IPhAs(LHP)复合物以两种对映异构体(As处的手性中心)的混合物形式存在，其在溶液中随时间自发地外消旋化。
总之，已经合成了许多包含吸电子、给电子和空间位阻基团的PhAs(LHP)的p取代的类似物。未来的实验将涉及所有这些复合物的完全纯化和表征，然后在生物学分析中进行测试，以确定潜在治疗用途的最佳复合物。生物学分析将反映以上已经描述的那些方案和细胞系。
为了描述的目的，向本领域的普通技术人员提供了本发明的各种实施方案的以上描述。并不旨在穷举或将本发明限于单个公开的实施方案。如上所述，本发明的许多替代和变化对于上述教导领域的技术人员是显而易见的。因此，虽然已经具体讨论了一些替代实施方案，但是本领域普通技术人员将清楚或相对容易地开发其他实施方案。因此，本专利说明书旨在包括这里已经讨论的本发明的所有替代、修改和变化，以及落入上述发明的精神和范围内的其他实施方案。
在所附的权利要求中以及在本发明的前述描述中，除了上下文由于明确的语言或必要的含意而另外明确要求之外，词语“包含(comprise)”或其变体包括“包含(comprises或comprising)”是以包含性的意义使用的，即，在本发明的一个或多个实施方案中，指定所述整体的存在，但不排除其他整体的存在或添加。

Claims (25)

1.一种抗癌剂，其包含具有与两个半胱氨酸残基键合的砷原子的环化肿瘤导向肽。
2.根据权利要求1所述的抗癌剂，其中所述肿瘤导向肽的两个与砷键合的半胱氨酸残基被少于20个氨基酸残基隔开。
3.根据权利要求1或2所述的抗癌剂，其中在环化之前，结合所述砷原子的所述两个半胱氨酸残基中的至少一个是所述肿瘤导向肽的末端残基。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗癌剂，其中在环化之前，结合所述砷原子的所述两个半胱氨酸残基分别形成所述肿瘤导向肽的N-末端肽残基和C-末端肽残基。
5.根据权利要求4所述的抗癌剂，其中所述N-末端半胱氨酸包含与其末端氨基氮键合的封端基团。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗癌剂，其还包含与所述砷原子键合的稳定基团。
7.根据权利要求6所述的抗癌剂，其中所述稳定基团选自由以下组成的组：羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、环烷基和杂环基，每个基团可以适当地被取代或未被取代。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗癌剂，其中所述肿瘤导向肽包含至少一个精氨酸残基和/或赖氨酸残基。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗癌剂，其具有如式I所示的结构：
Figure FDA0002453272330000011
Figure FDA0002453272330000021
其中，所示的并且与所述砷键合的硫原子是相应半胱氨酸残基的巯基硫；
式I中的所述半胱氨酸残基被曲线表示的少于20个氨基酸残基隔开；以及
R是选自由以下组成的组的稳定基团：羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、芳基、环烷基、杂环基和短链肽，每个基团可以是取代的或未取代的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗癌剂，其具有如式I所示的结构：
Figure FDA0002453272330000022
其中，所述原子和基团如针对式I所述；
所述封端基团由氨基反应性化合物形成；以及
W为2至20个氨基酸残基。
11.根据以上权利要求中任一项所述的抗癌剂，其中所述砷原子将在两个半胱氨酸残基之间与之键合以形成桥的肿瘤导向肽可以选自由以下组成的组：
1.CAYHRLRRC；
2.CDCRGDCFC；
3.CPIEDRPMC；
4.CNRRTKAGC；
5.CGTKRKC；
6.CRGDGWC；
7.CVSNPRWKC；
8.CHVLWSTRC；
9.CLDGGRPKC；
10.GCSVSSVGALCTHV；
11.CRGDGWC；
12.CDCRGDCFC；
13.CVNHPAFAC；
14.CRGDRGPDC；
15.CRGDKTTNC；
16.CRGDHAGDC；
17.CLSYYPSYC；
18.CTPSPPFSHC；
19.CPHSKPCLC；
20.CSDSWHYWC；
21.CSDWQHPWC；
22.CSDYNHHWC；
23.CSDGQHYWC；
24.CYDSWHYWC；
25.CFDGNHIWC；
26.CTDFPRSFC；
27.CTQDRQHPC；
28.CLSRYLDQC；
29.CRGDCF；
30.CGNSNPKSC；
31.CPHNLTKLC；并且
其中，当在第一方面形成的抗癌剂中时，所述砷原子将与上述肽序列的所述两个半胱氨酸残基键合并桥接在它们之间。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1至11中任一项所述的抗癌剂和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
13.一种治疗患者癌症的方法，所述方法包括以下步骤：向所述患者施用权利要求1至11中任一项所述的抗癌剂或权利要求12所述的药物组合物，从而治疗所述患者的癌症。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述癌症是血液恶性肿瘤或实体瘤。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述癌症选自白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述选自鳞状细胞癌、基底细胞癌、黑色素瘤、腺体或导管的上皮衬层肿瘤、腺癌、乳头状癌、肝和胆道的乳头状腺癌肿瘤、胃肠道肝细胞癌肿瘤、食管鳞状细胞癌、食管腺癌、结肠直肠癌(结肠癌)、呼吸道胃癌(胃癌)肿瘤、支气管癌、小细胞癌、泌尿生殖道大细胞癌肿瘤、膀胱移行细胞癌、膀胱鳞状细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、血液细胞和相关细胞(白血病)、急性和慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴组织癌、恶性淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、结缔组织肿瘤、骨肉瘤、神经系统肿瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、成胶质细胞瘤、与致癌病毒相关的少突神经胶质细胞瘤、伯基特淋巴瘤、免疫缺陷个体中的B细胞淋巴瘤、鼻咽癌、食道癌和胃食管癌、表皮鳞状细胞癌、胰岛肿瘤、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、成视网膜细胞瘤、肝癌、胰腺癌、脑癌、间皮瘤和乙型肝炎病毒肝细胞癌。
17.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中当所述癌症是白血病时，其选自由以下组成的组：慢性髓性白血病、T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、结肠癌、胰腺癌、脑癌、间皮瘤和急性早幼粒细胞白血病(APL)。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述抗癌剂与免疫治疗剂、单克隆抗体、化疗剂、辐射防护剂和放射治疗剂中的一种或多种组合施用。
19.一种制备抗癌剂的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使包含两个半胱氨酸残基的肿瘤导向肽与砷化合物接触；以及
(b)使所述砷与所述两个半胱氨酸残基中的每一个键合以形成包含结合的砷原子的环化肿瘤导向肽；
由此制备所述抗癌剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述砷化合物是砷的氧化物。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述砷化合物还包含与所述砷键合的烷基、羟基或芳基。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其还包含修饰选定的肿瘤导向肽以产生两个半胱氨酸残基的步骤(a)(i)。
23.一种通过权利要求19至22中任一项所述的方法制备的抗癌剂。
24.一种向患者递送治疗有效量的砷的方法，所述方法包括以下步骤：向所述患者施用适当量的权利要求1至11中任一项所述的抗癌剂或权利要求12所述的药物组合物，从而向所述患者递送治疗有效量的砷。
25.一种诊断癌症的方法，所述方法包括下述步骤：
(i)向患者施用包含至少一个放射性标记原子的权利要求1至11中任一项所述的抗癌剂；
(ii)使所述抗癌剂定位于所述癌症；以及
(iii)检测所述抗癌剂的所述至少一个放射性标记的原子的存在，由此诊断所述癌症。
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