ITRM20100054A1 - Uso terapeutico combinato di organostagno(iv) ed inibitori delle deacetilasi istoniche - Google Patents
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Description
USO TERAPEUTICO COMBINATO DI ORGANOSTAGNO(IV) ED INIBITORI DELLE DEACETILASI ISTONICHE
La presente invenzione riguarda l’utilizzo terapeutico di derivati organostagno(IV) in combinazione farmacologica e/o complessati con inibitori delle deacetilasi istoniche. Più in particolare, l’invenzione concerne l’uso terapeutico di composti organostagno(IV) complessati con acido valproico (VPA) e suoi derivati. Ancora più in dettaglio, l’invenzione concerne l’uso terapeutico come agenti antitumorali di detti complessi organostagno(IV) con acido valproico e suoi derivati, sia da soli che in combinazione con altri chemioterapici.
Negli eucarioti il livello di acetilazione degli istoni à ̈ regolato da due classi di enzimi, le istoneacetiltrasferasi (HATs) e le istonedeacetilasi (HDACs), che sono responsabili della acetilazione e deacetilazione dei residui di lisina nelle code N-terminali degli istoni.<1,2>Lo stato di acetilazione degli istoni, unitamente alle altre modifiche covalenti degli stessi, gioca un ruolo fondamentale nel controllo della espressione genica e, più in dettaglio, nel controllo della trascrizione di geni coinvolti in processi quali l’apoptosi e la proliferazione cellulare.<3-5>
E’ noto da recenti studi che il tributilstagno(IV) (TBT) e il trifenilstagno(IV) (TPT) promuovono l’attività delle istone acetiltransferasi (HATs)<6>
E’ noto anche che il sodio butirrato, che appartiene con l’acido valproico alla classe degli acidi grassi a corta catena, à ̈ stato il primo inibitore HDACs (HDACI) ad essere identificato.<1,7>
Ci sono molte evidenze sperimentali che suggeriscono che le cellule tumorali sono caratterizzate da ipoacetilazione degli istoni e che una sovra-espressione di HDACs à ̈ coinvolta nella tumorigenesi di numerose neoplasie umane.<4,8>
Da queste evidenze sperimentali, à ̈ nata l’idea di combinare l’azione delle due classi di composti, organostagno(IV) ed inibitori delle HDACs, per la cura di patologie caratterizzate da un livello di ipoacetilazione degli istoni, in particolare, per la cura del cancro.
La combinazione à ̈ da intendersi sia come combinazione farmacologica delle due classi di composti tal quali, sia come complessi organometallici in cui gli inibitori delle deacetilasi istoniche si comportano da leganti coordinanti nei confronti della porzione organostagno(IV).
A tal fine, abbiamo selezionato l’acido valproico come modello di HDACI e, nel caso dei complessi organometallici, come legante coordinante.
Esso, infatti, à ̈ chimicamente caratterizzato da semplicità strutturale e dalla presenza di un gruppo carbossilico in grado di coordinare la porzione organostagno(IV); inoltre sono noti i dati farmacocinetici e farmacodinamici in quanto l’acido valproico à ̈ già utilizzato in clinica medica come agente anticonvulsivante.<9>Dal punto di vista commerciale à ̈ da sottolineare il basso costo della molecola.
Inoltre l’acido valproico (VPA) ha suscitato interesse come agente antineoplastico nel 1997, quando alcuni studi hanno evidenziato la sua capacità di inibire la proliferazione e di indurre la differenziazione di cellule tumorali neuroectodermali primitive in vivo.<10>Per questi motivi, abbiamo progettato e sintetizzato complessi organostagno(IV) con acido valproico e ne abbiamo valutato l’attività antitumorale in vitro.
La trasformazione di una cellula normale in cellula tumorale à ̈ il risultato di alterazioni nel profilo di espressione genica e, di conseguenza, nella fisiologia cellulare. La relazione complessa che esiste tra crescita cellulare, angiogenesi e apoptosi nel processo di immortalizzazione e trasformazione, per esempio la perdita della differenziazione, dipende dal progressivo squilibrio tra l’espressione degli oncogeni e dei geni soppressori del tumore. Studi recenti evidenziano che gli acidi grassi a corta catena come VPA ed i suoi derivati modulano efficacemente la biologia di diverse linee cellulari inducendo la differenziazione, l’inibizione della proliferazione, incrementando l’apoptosi, e l’immunogenicità e riducendo le capacità metastatiche ed angiogenetiche delle cellule tumorali alterando il livello di acetilazione degli istoni e quindi modulando globalmente l’espressione genica.<11-14>
Inoltre, evidenze sperimentali suggeriscono un’attività agonistica di VPA nei confronti della famiglia di recettori nucleari PPAR (peroxisome proliferator-activated receptors) con effetti differenziativi.<12>
Anche alcuni derivati di organostagno(IV) risultano attivi come agenti antitumorali. Le prime ricerche risalgono al 1972, quando furono studiate le proprietà inibenti del Ph3Snacetato sulla crescita di tumori.<15>
E’ stato accertato che l’attività biologica di tali composti organometallici à ̈ essenzialmente determinata dal numero e dalla natura dei gruppi organici legati all’atomo centrale di stagno.
Numerosi composti di organostagno(IV) sono stati saggiati nei confronti di una serie di tumori e sull’argomento sono stati pubblicati numerosi lavori.<16-22>
Esempi di derivati di organostagno proposti per l’uso in formulazioni ad attività antitumorale sono descritti nelle pubblicazioni brevettuali EP 0484596 A1 e EP 0677528 A1 (Gielen et al., entrambe a nome Pharmachemie B.V.), e EP 0538517 A1 (Bouälam et al., Pharmachemie B.V.).
TBT e TPT in concentrazioni nanomolari agiscono inoltre da agonisti per il recettore γ PPAR gamma (peroxisome proliferator-activated receptor γ), membro della superfamiglia di recettori nucleari.<23-25>
PPARγ regola l’espressione genica formando un dimero con il recettore retinoide X (RXR), anche esso componente della superfamiglia dei recettori nucleari, e legando gli elementi di risposta a PPAR presenti nel gene promotore bersaglio.<26>
Recentemente à ̈ stato evidenziato anche che il tributilstagno (TBT) e il trifenilstagno (TPT) in concentrazioni nanomolari agiscono come agonisti per RXR.<23,24>
Studi recentissimi indicano che TPT e TBT legano PPARγ mediante una interazione ad alta affinità , con una modalità specifica e saturabile. Inoltre la competizione tra TBT e TPT e l’agonista PPARγ rosiglitazone à ̈ concentrazione dipendente.<27>
Poiché l’acido valproico e l’organostagno(IV) contribuiscono entrambi ad aumentare lo stato di acetilazione degli istoni, l’uno come inibitore delle HDACs, l’altro come promotore dell’attività delle HATs,<6>e poiché entrambi i composti modulano l’attività della famiglia recettoriale PPAR,<12,23>abbiamo ipotizzato che i composti organostagno(IV) con acido valproico possano agire su entrambi i bersagli molecolari, con possibili effetti di sinergia o di modulazione, soprattutto se sottoforma di complessi.
Perciò abbiamo focalizzato i nostri studi biologici sui complessi oragnostagno(IV) valproato, e più in particolare sul tributilstagno(IV) valproato, scegliendo le linee cellulari tumorali quale modello di patologia caratterizzata da un livello di ipoacetilazione degli istoni. .<4,8>
Secondo l’invenzione à ̈ stato trovato che il tributilstagno(IV) valproato, in seguito descritto, possiede una notevole attività antitumorale, che à ̈ stata dimostrata in vitro mediante esami di citotossicità su 60 linee cellulari eseguiti presso il National Cancer Institute (USA).
Formano pertanto oggetto della presente invenzione combinazioni chimiche e/o farmacologiche di organostagno(IV) con inibitori delle deacetilasi istoniche.
Formano in particolare oggetto specifico della presente invenzione complessi di organostagno(IV) con inibitori delle deacetilasi istoniche.
Più in particolare, formano oggetto della presente invenzione complessi di organostagno(IV) con acido valproico di formula generale (1) o (2) preferibilmente per l’uso come principi attivi medicinali:
(1)
(2)
in cui:
R1, R2e R3sono scelti, ognuno indipendentemente dall’altro, tra
H,
un gruppo alchilico, alcossilico, alchenilico o alchinilico con fino a 12 atomi di carbonio, un gruppo aromatico o aralchilico, isociclico o eterociclico, con fino a 12 atomi di carbonio.
In modo preferito, detti principi attivi medicinali sono agenti antitumorali.
Secondo alcune forme di realizzazione preferite dell’invenzione, R1, R2e R3(quando presente),uguali o diversi tra loro, possono essere scelti, ognuno indipendentemente dall’altro, tra H, un gruppo alchilico con fino a 8 atomi di carbonio, un gruppo alcossilico con fino a 8 atomi di carbonio o un gruppo fenile.
Sia tra i composti di diorganostagno(IV) con acido valproico che tra composti di triorganostagno(IV) con acido valproico proposti per l’uso medico secondo l’invenzione, e aventi, rispettivamente, la formula generale (1), e la formula generale (2), sono preferiti quelli in cui R1, R2e R3(quando presente) sono scelti, ognuno indipendentemente dall’altro, tra metile, etile, propile, butile e fenile.
Nel caso dei derivati di triorganostagno(IV) di formula generale (2)
(2)
in cui R1, R2ed R3sono scelti, ognuno indipendentemente dall’altro, tra: idrogeno, un gruppo alchilico, alcossilico, alchenilico o alchinilico con fino a 12 atomi di carbonio, un gruppo aromatico o aralchilico, isociclico o eterociclico, con fino a 12 atomi di carbonio, appartiene al sottogruppo dei composti preferiti, in modo specifico, il complesso tributilstagno-valproato di formula (2a):
(2a)
che si à ̈ dimostrato, nella sperimentazione condotta nel quadro della presente invenzione, quello con la migliore attività antitumorale in vitro tra i composti esaminati.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un preparato farmaceutico, in cui siano presenti organostagno(IV) e inibitori delle istone deacetilasi, tal quali o complessati, assieme ad uno o più coadiuvanti e/o veicoli farmacologicamente accettabili.
Costituisce forma di realizzazione preferita della presente invenzione un preparato farmaceutico, comprendente come principio attivo almeno uno dei derivati organometallici dell’acido valproico di formula generale (1) o (2) assieme ad uno o più coadiuvanti e/o veicoli farmacologicamente accettabili.
Secondo alcune forme di realizzazione particolarmente preferite dell’invenzione, l’invenzione ha ad oggetto l’uso di uno o più composti organostagno(IV) con acido valproico di formula generale (1) o (2), come sopra definite, per la produzione in particolare di un preparato ad attività antitumorale.
In maniera particolarmente preferita, il preparato comprende come principio attivo il complesso tributilstagno(IV) valproato di formula (2a).
Secondo l’invenzione, i composti sopra citati possono essere vantaggiosamente impiegati nelle terapie antineoplastiche, somministrandoli da soli come agenti citotossici o in combinazione con altri chemioterapici per aumentarne l’effetto terapeutico o per ridurre il fenomeno della farmacoresistenza.<28>
I preparati farmaceutici adatti per la somministrazione, a scopo terapeutico, in cui siano presenti organostagno(IV) e inibitori delle istone deacetilasi, tal quali o complessati secondo l’invenzione possono essere formulati secondo tecniche convenzionali note agli esperti del settore, mediante l’uso di eccipienti e veicoli farmaceuticamente accettabili, in modo da ottenere preparati adatti per iniezione parenterale (endovenosa, intramuscolare o sottocutanea), per somministrazione orale in forma solida o liquida, per somministrazione transdermica, rettale, intravaginale o locale, ad esempio sulle mucose del cavo oronasale, e simili.
La percentuale di composto attivo o di composti attivi nella composizione e il metodo per trattare le patologie di interesse, ed in particolare i tumori, può essere variata in modo da ottenere un dosaggio ottimale. Il dosaggio da somministrare tiene in considerazione i seguenti fattori: la via di somministrazione, la durata del trattamento, il peso e le condizioni del paziente, l’efficacia del composto attivo e la responsività del paziente.
Una volta determinato il corretto dosaggio del principio attivo o dei principi attivi, la formulazione e la scelta di eccipienti e coadiuvanti adatti ad ogni singola esigenza possono essere fatte sulla base delle comuni conoscenze del settore.
Le caratteristiche specifiche dell’invenzione, così come i vantaggi della stessa risulteranno più evidenti con riferimento alla descrizione dettagliata presentata a titolo meramente esemplificativo nel seguito, assieme ai risultati delle sperimentazioni effettuate su di essa.
Alcuni risultati sperimentali sono illustrati nei disegni allegati, in cui:
Fig. 1 mostra la rappresentazione Ortep della struttura cristallina del complesso Ph3SnVAL (VAL6)
Fig. 2 mostra la struttura cristallina di Ph3SnVAL. Le linee tratteggiate indicano le interazioni C-H..O intermoleculari
Fig. 3 . mostra coppie di molecole di Ph3SnVAL presenti nella struttura cristallina. Le linee tratteggiate indicano interazioni spigolo-faccia. I leganti valproati sono omessi per chiarezza della rappresentazione.
Fig.4 mostra il grafico delle medie della variazione percentuale di crescita dopo somministrazione di dose singola di VAL51•10<-5>M ottenuta presso i laboratori del NCI.
Fig.5 mostra le curve dose risposta ottenute incubando un panello di 60 linee cellulari tumorali umane con 5 differenti concentrazioni di VAL5 ottenute presso i laboratori del NCI.
Fig.6 mostra le curve dose risposta di cui alla figura 5, per citotipo.
Fig. 7 mostra il riepilogo dei dati sperimentali inerenti alle curve dose-risposta di cui alla figura 5 ed i valori di GI50, TGI, LC 50 calcolati.
Fig.8 mostra il grafico delle medie dei valori di GI50, TGI, LC 50 calcolati di cui alla figura 7
Fig.9 mostra gli effetti indotti dall’acido valproico (VPA) e dai suoi derivati sulla vitalità di differenti linee cellulari epatiche tramite saggio MTT. I valori sono espressi come percentuale di cellule rispetto al controllo
Fig 10 mostra le modifiche morfologiche indotte dal trattamento con acido valproico e derivati in differenti linee cellulari epatiche
Fig 11 mostra la morfologia della condensazione e frammentazione nucleare dopo l’incubazione col fluorocromo mediante microscopia a fluorescenza
Fig 12 mostra l’analisi citofluorimetrica della distribuzione delle cellule epatiche normali e tumorali lungo le fasi del ciclo proliferativi.
Per quanto riguarda la sintesi, come già notato, tutti i derivati organostagno(IV) complessi con acido valproico descritti di seguito sono stati ottenuti a partire da prodotti commercialmente disponibili. Nella sperimentazione chimica illustrata di seguito le analisi centesimali (C, H, S e N) sono state eseguite presso il Dipartimento di Chimica Inorganica ed Analitica “S. Cannizzaro†dell’Università di Palermo, con un analizzatore Vario EL III (Elementar GmbH) usando il metodo “purge and trap†, eseguendo la prova in doppio e valutando il risultato come media delle due successive analisi.
Gli spettri infrarossi dei composti sintetizzati sono stati registrati utilizzando uno spettrometro FT-IR Perkin-Elmer Spectrum One ed elaborati con l’omonimo software in dotazione allo strumento. Gli spettri sono stati registrati preparando emulsioni sia in nujol che in esaclorobutadiene, utilizzando celle di CsI ed acquisendo gli stessi con 8 scansioni e 4 cm<-1>di risoluzione.
Gli spettri<119>Sn Mössbauer sono stati ottenuti mantenendo la sorgente a temperatura ambiente e raffreddando il campione, finemente polverizzato e compresso tra due lamine di alluminio, alla temperatura di 77.3 ± 0.1 K per mezzo di criostati ad azoto liquido NRD-1258-MB (Cryo Industries of America inc., Atkinson, NH, USA) controllando la temperatura tramite termometro IT 502 della Oxford Instruments.
La calibrazione del multicanale à ̈ stata eseguita mediante lamina di ferro arricchito (<57>Fe = 95.2%, spessore 0.006 mm, Ritverc GmbH, St. Petersburg, Federazione Russa) con una sorgente<57>Co (10 mCi, Ritverc GmbH, St. Petersburg, Federazione Russa) a temperatura ambiente.
Lo spettro ottenuto à ̈ stato registrato su di un analizzatore multicanale modello 209 della Takes (Ponteranica, Bergamo) su di un sistema Wissenschaftliche Elektronik (MWE, Stanberg, Germania) consistente di “driving unit†MR250, generatore di funzione FG2 (onda triangolare, accelerazione costante) accoppiato ad un trasduttore di velocità MA250. In ciascun punto di velocità dello spettro à ̈ stato accumulato un numero di colpi sufficiente ad avere uno spettro ben definito. I dati così ottenuti sono stati elaborati con un personal computer, utilizzando appropriati programmi di calcolo.
Gli spettri<1>H,<13>C{<1>H} e<119>Sn{<1>H} NMR sono stati acquisiti alla temperatura di 296 K con uno strumento BrÃ1⁄4ker Avance DRX300 con “probe broad-band†con “inverse detection†alla frequenza operativa di 300.1, 75.5 e 118.9 Mhz, rispettivamente. I solventi utilizzati sono stati D2O (<1>H d=4.80), DMSO-d6(<1>H d=2.50 ;<13>C d=39.52) e CD3OD (<1>H d=3.31;<13>C d=49.00) e i relativi segnali<1>H e<13>C, riportati tra parentesi, assegnati rispetto al Me4Si (TMS), sono stati usati come riferimenti interni. Per gli spettri<13>C{<1>H} acquisiti in D2O, à ̈ stato usato come riferimento esterno il segnale<13>C del TMS (<13>C d=0.00), per lo<119>Sn, invece, à ̈ stato usato il segnale del Me4Sn (liquido puro) (<119>Sn d=0.00).
Sintesi del complesso Me2Sn(VAL)2
L'acido valproico (V = 320 µl; d = 0.91 g/ml, 2 mmol) à ̈ stato solubilizzato in metanolo (30 ml) e la soluzione aggiunta lentamente, sotto agitazione, ad una soluzione di Me2SnO (1 mmol; 164.78 mg). La soluzione à ̈ stata posta a reagire, a temperatura compresa tra 25-75 °C, per 24 ore.
Il volume della soluzione incolore ottenuta à ̈ stato filtrato sotto vuoto, e il residuo bianco che si separa à ̈ stato asciugato in essiccatore in presenza di P2O5.
Uno spettro IR (Tab. 2) della sospensione ha indicato che la reazione à ̈ avvenuta con completa conversione del materiale di partenza.
I dati analitici sono riportati in Tab. 1
Sintesi del complesso Bu2Sn(VAL)2
L'acido valproico (V = 320 µl; d = 0.91 g/ml, 2 mmol) à ̈ stato solubilizzato in metanolo (30 ml) e la soluzione aggiunta lentamente, sotto agitazione, ad una soluzione di Bu2SnO (1 mmol 248.93 quando). La soluzione à ̈ stata posta a reagire, a temperatura compresa tra 25-75 °C, per 24 ore.
La sospensione bianca ottenuta à ̈ stata filtrata sotto vuoto e ricristallizzata in una miscela cloroformio:metanolo = 2:1.
Il residuo ottenuto à ̈ stato asciugato in essiccatore in presenza di P2O5.
Uno spettro IR (Tab. 2) della sospensione ha indicato che la reazione à ̈ avvenuta con completa conversione del materiale di partenza.
I dati analitici sono riportati in Tab. 1
Sintesi del complesso Ph2Sn(VAL)2
Il complesso Ph2Sn(VAL)2Ã ̈ stato ottenuto come solido bianco, ponendo a reagire una sospensione metanolica di Ph2SnO e una soluzione metanolica di acido valproico, nel rapporto stechiometrico 1:2.
La reazione porta alla formazione del complesso, senza residuo di materiale non reagito né prodotti collaterali.
L'acido valproico (V = 320 µl; d = 0.91 g/ml, 2 mmol) à ̈ stato solubilizzato in metanolo (30 ml) e la soluzione aggiunta lentamente, sotto agitazione, ad una sospensione di Ph2SnO (1 mmol; 288.92 mg). La sospensione à ̈ stata posta a reagire, a temperatura compresa tra 25-75 °C, per 24 ore.
La sospensione bianca ottenuta à ̈ stata filtrata sotto vuoto, e il residuo à ̈ stato asciugato in essiccatore in presenza di P2O5.
Uno spettro IR (Tab. 2) della sospensione ha indicato che la reazione à ̈ avvenuta con completa conversione del materiale di partenza.
I dati analitici sono riportati in Tab. 1
Sintesi del complesso Me3SnVAL
Il complesso Me3SnVAL Ã ̈ stato ottenuto come solido bianco, ponendo a reagire soluzioni metanoliche di Me3SnOH e di acido valproico, nel rapporto stechiometrico 1:1.
La reazione porta alla formazione del complesso, senza residui di materiale non reagito né prodotti collaterali.
L'acido valproico (V = 160 µl; d = 0.91 g/ml, 1 mmol) à ̈ stato solubilizzato in metanolo (30 ml) e la soluzione aggiunta lentamente, sotto agitazione, ad una soluzione di Me3SnOH (1 mmol; 90.41 mg). La soluzione à ̈ stata posta a reagire, a temperatura compresa tra 25-75 °C, per 24 ore.
Dopo 24 h, il volume della soluzione à ̈ stato ridotto da 30 a 10 ml per mezzo di un evaporatore rotante. Dalla soluzione, posta in frigo, dopo 24h, si à ̈ separato un precipitato bianco, che à ̈ stato filtrato, lavato con metanolo e ricristallizzato in una miscela cloroformio:metanolo = 2:1. I cristalli così ottenuti, sono stati posti ad asciugare sotto vuoto in presenza di P4O10.
Uno spettro IR (Tab. 3) del precipitato ha indicato che la reazione à ̈ avvenuta con completa conversione del materiale di partenza.
I dati analitici sono riportati in Tab. 1
Sintesi del complesso Bu3SnVAL, forma preferita dell’invenzione
Il complesso Bu3Sn-valproato à ̈ stato ottenuto come solido bianco, ponendo a reagire soluzioni metanoliche di (Bu3Sn)2O e di acido valproico, nel rapporto stechiometrico 1:1. La reazione porta alla formazione del complesso, senza residui di materiale non reagito né prodotti collaterali.
L'acido valproico (V = 160 µl; d = 0.91 g/ml, 1 mmol) à ̈ stato solubilizzato in metanolo (30 ml) e la soluzione aggiunta lentamente, sotto agitazione, ad una soluzione di (Bu3Sn)2O (1 mmol; d=1.171 g/ml; 0.51 ml). La soluzione à ̈ stata posta a reagire, a temperatura compresa tra 25-75 °C, per 24 ore.
Dopo 24h, il volume della soluzione à ̈ stato ridotto da 30 a 10 ml per mezzo di un evaporatore rotante. Poiché dalla soluzione, posta in frigo, dopo 24h, non à ̈ precipitato alcun solido, essa à ̈ stata portata a secco, ottenendo un residuo bianco che à ̈ stato ricristallizzato in una miscela cloroformio:metanolo = 2:1. Il composto così ottenuto à ̈ stato asciugato sotto vuoto in presenza di P4O10.
Uno spettro IR (Tab. 3) del composto ha indicato che la reazione à ̈ avvenuta con completa conversione del materiale di partenza.
I dati analitici sono riportati in Tab. 1
Sintesi del complesso Ph3SnVAL
Il complesso Ph3Sn-valproato à ̈ stato ottenuto come solido bianco, ponendo a reagire soluzioni metanoliche di Ph3SnOH e di acido valproico, nel rapporto stechiometrico 1:1. La reazione porta alla formazione del complesso, senza residui di materiale non reagito né prodotti collaterali.
L'acido valproico (V = 160 µl; d = 0.91 g/ml, 1 mmol) à ̈ stato solubilizzato in metanolo (30 ml) e la soluzione aggiunta lentamente, sotto agitazione, ad una soluzione di Ph3SnOH (1 mmol; 183.5 mg). La soluzione à ̈ stata posta a reagire, a temperatura compresa tra 25-75 °C, per 24 ore.
Dopo 24h, il volume della soluzione à ̈ stato ridotto da 30 a 10 ml per mezzo di un evaporatore rotante. Poiché dalla soluzione, posta in frigo, dopo 24h, non à ̈ precipitato alcun solido, essa à ̈ stata portata a secco, ottenendo un residuo bianco che à ̈ stato ricristallizzato in una miscela cloroformio:metanolo = 2:1. I cristalli così ottenuti sono stati asciugati sotto vuoto in presenza di P4O10e successivamente caratterizzati attraverso diffrattometria a raggi-X
Uno spettro IR (Tab. 3) dei cristalli ha indicato che la reazione à ̈ avvenuta con completa conversione del materiale di partenza. I dati analitici sono riportati in Tab. 1
Compounds Yield (%) C H Sn
Me2Sn(VAL)249.20 8.12 26.85
80
(C18H36O4Sn) (49.68) (8.34) (27.27)
n-Bu2Sn(VAL)255.12 9.13 22.90
72
(C24H48O4Sn) (55.51) (9.32) (22.85) Ph2Sn(VAL)259.87 7.15 20.96
85
(C28H40O4Sn) (60.13) (7.21) (21.22) Me3SnVAL 43.12 7.50 38.47
78
(C11H24O2Sn) (43.04) (7.88) (38.66) Bu3SnVAL 55.35 9.70 27.80
80
(C20H42O2Sn) (55.45) (9.77) (27.40)
Ph3SnVAL 63.14 6.30 24.28
85
(C26H30O2Sn) (63.32) (6.13) (24.06)
Tabella 1 Dati analitici (% valori teorici tra parentesi) per R2SnVAL2(R = Me, Bu, 10233PTIT
Ph) e R3SnVAL (R = Me, Bu, Ph); VAL<->= [valproato]-
Assegnazioni VAL Me2Sn(VAL)2n-Bu2Sn(VAL)2Ph2Sn(VAL)2
Î1⁄2 (C=O)<1707s - - ->
s 1621s 1622s
Î1⁄2as(COO<->1622
) -1562s 1563s 1560
1419s 1420s 1422s
Î1⁄2s(COO-) -1389 1395 1412
203 201 200
∆Î1⁄2<b>-173 168 148
Î1⁄2as (Sn-C2)- 585 619w -
Î1⁄2sym (Sn-C2)- 518 569w -
Y-mode
- - - 450w (Sn-Ph)
Tabella 2 Bande IR in cm<-1>dell'acido valproico e dei suoi diorganostagno(IV) derivati.
Assegnazioni VAL Me3SnVAL Bu3SnVAL Ph3SnVAL
Î1⁄2(C=O)<1707s - - ->
Î1⁄2as(COO-)- 1632s 1630s 1632s
Î1⁄2s(COO-)- 1423s 1421s 1423s
∆Î1⁄2<b>- 209 209 209
Î1⁄2as (Sn-C2)- 550 550 550
Î1⁄2sym (Sn-C2)- 513 513 513
Y-mode
- - - 450w (Sn-Ph)
Tabella 3 Bande IR in cm<-1>dell'acido valproico e dei suoi triorganostagno(IV) derivati.
Attraverso la spettroscopia Mössbauer, in particolare dal valore dello shift isomerico, Î ́, à ̈ stato possibile discriminare lo stato di valenza dell’atomo di stagno e la natura del legame tra lo stagno ed i leganti. Î ́, infatti, riflette l’effetto induttivo dei sostituenti organici legati allo stagno, per cui diminuisce passando dai composti dialchilici ai composti difenilici. E’ stato inoltre possibile calcolare i valori teorici di splitting di quadrupolo, ∆, utilizzando il modello a carica puntiforme. Tali valori, confrontati con i valori di ∆ sperimentali, hanno permesso di avanzare ipotesi strutturali.
Per i derivati (1), contenenti la porzione diorganostagno (IV), sono stati calcolati, inoltre, gli angoli di legame C-Sn-C (Î ̧), delle metà organometalliche presenti nei complessi, attraverso la seguente equazione:
<∆ = 4{ R }>(<1− 0.75sin2Î ̧>)
dove {R}à ̈ il p.q.s (splitting di quadrupolo parziale) del gruppo alchilico e fenilico in una configurazione ottaedrica idealizzata (-1.03 e -0.95 mms<-1>, rispettivamente) e ∆ à ̈ lo splitting di quadrupolo misurato. Per tutti i complessi, pur non considerando il contributo degli altri gruppi legati allo stagno, si ottiene una stima dell’angolo con incertezza di ± 13°, comunque utile per valutare le distorsioni dalla geometria regolare dell'intorno dello stagno.
Gli shifts isomerici e gli splittings di quadrupolo misurati sono riportati in Tab. 4, insieme con i valori di ∆calc. In Tab. 4 viene anche riportata la geometria proposta per i complessi sintetizzati.
Dai dati Mössbauer à ̈ stato possibile ipotizzare una geometria trigonale bipiramidale per i derivati R2Sn(VAL)2(R = Me, Bu, Ph), con i gruppi alchilici e fenilici che occupano le posizioni equatoriali.
Nei derivati contenenti la porzione triorganostagno(IV)-VAL di formula (2), i risultati Mössbauer hanno confermato la presenza di un solo intorno chimico per lo stagno. I valori di splittings di quadrupolo ottenuti, in accordo, entro gli errori sperimentali (±0.4 mm/s), con quelli calcolati, sono compatibili con una tetracoordinazione intorno all’atomo metallico.
Composto<b>Î ́ (mm/s) |∆exp|(mm/s) Γ(mm/s) ∆calc<c>(mm/s)<Angolo>
C-Sn-C ± 13
Me2Sn(VAL)21.19 3.45 1.06 3.12 131.75°
n-
1.25 3.36 0.95 3.12 129.43°
Bu2Sn(VAL)2
Ph2Sn(VAL)2
Me3SnVAL n.c.
Bu3SnVAL n.c.
Ph3SnVAL 1.19 2.25 1.11 2.21 n.
a Lo spessore del campione varia tra 0.50-0.60 mg<119>Sn/cm<2>; shift isomerico, Î ́ = ± 0.03 mm/s, rispetto a BaSnO3; i valori Γ rappresenta l’ampiezza dei picchi risonanti; splitting di quadrupolo nucleare, |∆|= ± 0.02 mm/s.
b VAL<->= [valproato]-Tabella 4 Parametri Mössbauer sperimentali, shift isomerico, Î ́, mm/s, splitting di quadrupolo nucleare, |∆| sper e angolo C-Sn-C, misurati alla temperatura dell’azoto liquido, e splitting di quadrupolo nucleare calcolato in accordo al formalismo a carica puntiforme applicato alle strutture trigonali bipiramidali e tetraedriche idealizzate.
Indagini con raggi X del complesso Ph3SnVAL
Nella rappresentazione Ortep in Fig. 1 à ̈ mostrata la struttura cristallina del complesso Ph3SnVAL. In tabella 5 sono riportati gli angoli e le distanze di legame piu’ significative.
Legami distanze(Ã…) angoli (°)
Sn1 O1 2.057(3)
Sn1 O2 2.804(3)
Sn1 C1 2.1456(14)
Sn1 C7 2.1303(14)
Sn1 C13 2.1317(16)
O1 Sn1 O2 50.87(10)
O1 Sn1 C1 96.21(9)
O1 Sn1 C7 108.53(10)
O1 Sn1 C13 111.21(10)
O2 Sn1 C1 147.05(9)
O2 Sn1 C7 84.59(9)
O2 Sn1 C13 84.79(9)
C1 Sn1 C13 110.27(8)
C1 Sn1 C7 111.56(8)
C7 Sn1 C13 117.08(8)
Tabella 5 . Distanze (Ã…) ed angoli di legame (°) più significativi in Ph3SnVAL
La coordinazione attorno al centro metallico può essere descritta come tetraedrica distorta con angoli che variano da 117,1(1) a 96.2(1)°, quest’ultimo caratteristico dell’angolo di legame O(1)-Sn-C(1). Mentre due interazioni Sn-C sono molto simili [2.130(1), 2.132(1) Ã…] e confrontabili con quelle riportate in letteratura, il terzo, Sn-C(1), mostra un valore un poco maggiore, 2.146(1) Ã…, e mostra la maggior distorsione negli angoli di legame.
Il legante valproato, stericamente ingombrante, mostra diversi siti di coordinazione: il secondo atomo di ossigeno del gruppo carbossilato à ̈ posto ad una distanza da Sn di 2.804(3) Ã…, considerevolmente più bassa della somma dei loro raggi di van der Waals radii, 3.70 Ã….<29,30>Questa seconda interazione Sn…O, “debole†o “secondaria†, ben nota e descritta per molti complessi di stagno,<31,33>sebbene molto lunga per una interazione di legame, deve essere presa in considerazione quando si descrive la geometria completa attorno all’atomo di stagno. Di conseguenza, la sfera di coordinazione potrebbe anche essere considerata come espansa verso una pentacoordinazione distorta. D’altro canto le due diverse distanze di legame carbonio-ossigeno [C(19)-O(1) 1.292(5) vs. C(19)-O(2) 1.228(5) Ã…] permettono di escludere una qualsiasi delocalizzazione elettronica sulla metà carbossilato.
Per l’organizzazione sopramolecolare del complesso, l’atomo O(2) del carbossilato, oltre che di una interazione intra - molecolare C-H…O con C(18)-H(18), con distanza Donatore…Accettore di 3.212(.) Ã… e di un angolo di legame D-H..A di 123.2(.)°, à ̈ responsabile di una interazione intermolecolare con C(3)-H(3) [simm. op. -1+x, y, z] con distanza Donatore…Accettore di 3.487 Ã… e un angolo D-H…A di 142.0°. Le molecole di Ph3SnVAL sono legate mediante legami ad idrogeno C-H..O in infinite catene lungo l’asse a (Fig. 2)
Inoltre l’architettura dell’impacchettamento tridimensionale si basa, anche, su un reticolo di interazioni non covalenti spigolo-faccia che coinvolgono tutti e tre gli anelli aromatici di ciascuna molecola.<34>Mentre non à ̈ presente alcuna interazione intramolecolare anello aromatico- anello aromatico, si forma un dimero centrosimmetrico che coinvolge tutti e sei gli anelli in tre interazioni spigolo-faccia a forma di T, (Fig.3), del tutto comune in strutture di interesse biologico<35-37>.
La tabella successiva riporta la geometria delle tre interazioni a forma di T spigolo-faccia presenti nel complesso. Tutte le interazioni possono essere descritte come “face-tilted†A⇒B, A⇒C, e B⇒C, in accordo con i descrittori di strutture limite di queste interazioni non covalenti riportate da Burguete et al.<38>
Interazione<a>d1(Ã…) d2(Ã…)Î ̃ (°)
A⇒B 4.77 2.99 58
A⇒C 4.79 3.06 55
B⇒C 4.83 3.23 55
<a>La prima lettera si riferisce all’anello centroide che agisce da “idrogeno accettore†Tabella 6 Geometria delle interazioni faccia-spigolo determinate da dati di raggi X.
In tabella 6 sono riportati i valori delle distanze tra gli anelli aromatici centroidi (d1), le distanze tra atomi di idrogeno ed anelli centroidi (d2) e gli angoli diedri formati tra i piani che contengono le coppie di anelli arilici (Î ̧). I diversi parametri sono in buon accordo con quelli sperimentali e teorici trovati in altri sistemi<38>. Bisogna puntualizzare che, sebbene modeste in termini energetici, queste interazioni spigolo-faccia giocano un ruolo importante nei processi di riconoscimento molecolare.
Studio dell’attività antitumorale dei complessi organostagno(IV)-con acido valproico Gli studi dell’attività antitumorale dei complessi organostagno(IV) con acido valproico sono stati condotti presso il National Cancer Institute (NCI), nell’ambito del programma DTP (Developmental Therapeutics Program), e presso il Dipartimento di Scienze Biochimiche dell’Università degli Studi di Palermo.
Studi sull’attività antitumorale del complesso val5 effettuati presso il National Cancer Institute.
Il protocollo utilizzato dal National Cancer Institute prevede l’uso di 60 diverse linee cellulari tumorali umane, quali cellule di leucemia, melanoma, e cancro ai polmoni,al colon, all’encefalo, alle ovaie, al seno, alla prostata e al rene sulle quali vengono testati i nuovi composti di sintesi selezionati da una apposita commissione. Obiettivo dello studio à ̈ valutare l’inibizione selettiva della crescita o la citotossicità nei confronti di dette linee cellulari tumorali.<39-42>
Questo tipo di studio à ̈ unico per quanto riguarda la complessità dello studio dose-risposta su 60 linee cellulari prodotta dal composto e risulta in un pattern di risposte biologiche che può essere utilizzato in algoritmi che riconoscono il pattern. (COMPARE program. See: http://dtp.nci.nih.gov/docs/compare/compare.html)
Utilizzando questo algortitmo à ̈ possibile ipotizzare un meccanismo di azione del composto in esame o determinare l’unicità del pattern di risposta e le differenze rispetto a qualsiasi altro composto prototipo di riferimento contenuto nel database del NCI.
Questo studio, secondo il protocollo del NCI, avviene in due stadi: si comincia dalla valutazione del composto al dosaggio singolo di 10 µM su 60 linee cellulari. Il risultato dello screening a singola dose viene riportato come istogrammi, riportati in Fig 4.
Il tributilstagno(IV) valproato, forma preferita dell’invenzione oggetto di questo brevetto, ha mostrato significativa inibizione della crescita ed à ̈ per questo che sono stati eseguiti studi di citotossicità nei confronti delle 60 linee cellulari in 5 diversi dosaggi (secondo stadio del protocollo del NCI).
Metodo sperimentale dello screening di attività antitumorale in vitro.
Le linee cellulari umane di cancro oggetto dello screening sono state coltivate in terreno RPMI 1640 contenente il 5% di siero fetale bovino e 2mM di L-glutamina. Le cellule sono state seminate su piastre microtiter contenenti 96 pozzetti in 100 µL con una densità variabile da 5,000 a 40,000 cellule/pozzetto in dipendenza dalla velocità di crescita delle diverse linee cellulari. Dopo aver piastrato le cellule, le piastre microtiter sono state incubate a 37° C, 5 % CO2, 95 % aria e con umidità relativa del 100 % per 24ore, prima di aggiungere il composto in esame.
Dopo 24 ore, due piastre per ogni linea cellulare sono state fissate in situ con acido tricloroacetico TCA, al fine di costituire una misura della popolazione cellulare per ogni linea cellulare al tempo dell’aggiunta del composto (Tz). Il composto in esame à ̈ stato solubilizzato in dimetilsolfossido 400 volte la concentrazione massima desiderata per il campione e conservato in freezer fino al momento dell’utilizzo. Al momento dell’aggiunta del composto alla coltura, un’aliquota della soluzione concentrata à ̈ stata decongelata e diluita fino al doppio della concentrazione massima finale desiderata per il test con un medium completo contenente 50 µg/ml di gentamicina. Aliquote di 100 µl di questa soluzione di composto à ̈ stata aggiunta ai pozzetti microtiter appropriati contenenti già 100 µl di medium, fino a raggiungere quindi la concentrazione finale di farmaco desiderata. Dopo l’aggiunta della sostanza in esame, le piastre sono state incubate per ulteriori 48 ore a 37° C, 5 % CO2, 95 % aria e con umidità relativa del 100 %. Per le cellule adese il saggio si à ̈ concluso con l’aggiunta di TCA freddo. Le cellule sono state fissate in situ mediante aggiunta graduale di 50 µl di TCA freddo al 50 % (peso/volume) fino a raggiungere la concentrazione finale del 10 % di TCA ed incubate per 60 minuti a 4°C. Eliminato il surnatante, le piastre sono state lavate 5 volte con acqua ed aria secca. 100 µl di una soluzione di sulforodamina B (SRB) allo 0.4% in 1% di acido acetico sono stati aggiunti in ogni pozzetto, e le piastre sono state incubate per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la colorazione, il colorante non fissato à ̈ stato rimosso mediante 5 lavaggi con acido acetico all’1% e le piastre sono state asciugate con aria secca. Il colorante legato à ̈ stato successivamente solubilizzato con base trizma 10 mM ed stata misurata l’assorbanza mediante un lettore automatico di piastre alla lunghezza d’onda di 515 nm. Per le cellule in sospensione, il metodo seguito à ̈ stato lo stesso eccetto per il fatto che il saggio à ̈ stato concluso fissando le cellule adese alla base dei pozzetti aggiungendo delicatamente 50 µl di TCA all’80 % (concentrazione finale, 16 % TCA).
Utilizzando le tre misure di assorbanza [ tempo zero (Tz), crescita nel controllo (C), e crescita in presenza del composto alla concentrazione 10<-5>M], Ã ̈ stata calcolata la percentuale di crescita come:
[(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100 per concentrazioni in cui Ti>/=Tz
[(Ti-Tz)/Tz] x 100 per concentrazioni in cui Ti<Tz.
Interpretazione dei dati del test a singola dose:
I dati del test a singola dose vengono riportati come istogrammi in un grafico dei valori medi della percentuale di crescita delle cellule trattate. I valori riportati per il test a dose singola si riferiscono alla crescita in relazione al controllo (senza aggiunta di composto) e al numero di cellule al tempo zero (normalizzata).
Questo consente di evidenziare sia l’inibizione della crescita ( valori compresi tra 0 e 100) che la letalità (valori inferiori allo 0). Per esempio un valore pari a 100 significa che non c’à ̈ inibizione della crescita. Un valori pari a 40 corrisponde ad una inibizione della crescita pari al 60%. Un valore pari a 0 significa una crescita netta nulla durante l’esperimento. Un valore pari a -40 corrisponde ad un 40% di letalità . Un valore pari a -100 significa che tutte le cellule sono morte. Le informazioni contenute nel grafico del test a dose singola possono essere utilizzate per una analisi COMPARE. http://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html
Le Figure 4-8 mostrano i risultati dei test di VAL5 condotti su 60 differenti linee cellulari. Il composto VAL5 ha mostrato una eccellente attività antitumorale nei confronti di leucemia, melanoma e cancro ai polmoni, al colon, all’encefalo, alle ovaie, al seno, alla prostate e al rene.
Indagini biologiche sui derivati del VPA
Al fine di approfondire i meccanismi di azione dei complessi organostagno(IV) valproato, sono stati eseguiti ulteriori studi presso il Dipartimento di Scienze Biochimiche “Paolo Giaccone†utilizzando il saggio MTT, osservazione della morfologia cellulare mediante microscopia a fluorescenza, studi citofluorimetrici della distribuzione delle cellule lungo le fasi del ciclo proliferativo per la quantificazione dell'apoptosi, studi del coinvolgimento delle caspasi nel meccanismo apoptotico indotto dai composti mediante analisi di Western blotting e successiva analisi tramite anticorpi specifici per le proteine in studio.
Ricerche condotte in vitro evidenziano che l'acido valproico (VPA), uno dei più noti inibitori delle HDACs, induce morte per apoptosi nei citotipi tumorali epatici. L’azione farmacologica del VPA si à ̈ osservata solo quando impiegato ad alte dosi (IC50 1.7mM) e dopo lunghi tempi di incubazione (5 giorni). Come à ̈ noto l'impiego di alte dosi di farmaci rappresenta uno svantaggio nella possibile sperimentazione del farmaco in vivo per il trattamento delle neoplasie, in quanto può determinare l’insorgenza di effetti collaterali non indifferenti, conseguenti all’eccessiva deposizione del farmaco e al suo uso prolungato nel tempo.
Gli studi condotti con i nuovi derivati del VPA, oggetto dell’invenzione, hanno messo in evidenza un diverso profilo di attività biologica di tali composti rispetto al VPA in un ampio pannello di linee tumorali umane di differente origine. In particolare, VPA5 e VPA6 mostrano un potente effetto citotossico in cellule di epatocarcinoma umano quando impiegati a basse dosi (1-10 µM) e per tempi brevi (18-20 ore) di trattamento, mentre nelle cellule umane epatiche non tumorali essi risultano poco efficaci. Studi preliminari indicano che l’effetto citotossico si accompagna a frammentazione della cromatina, marker di morte per apoptosi.
Modello sperimentale
L’attività citotossica dei derivati del VPA à ̈ stata saggiata in vitro su diverse linee cellulari di epatocarcinoma umano HCC a differente grado di tumorigenicità (HepG2, Hep3B ed SK-Hep1); quest’ultime due sono prive della proteina soppressore dei tumori p53 a causa di una mutazione per delezione nel gene TP53<43>; come controllo sono state impiegate le cellule umane epatiche non tumorali immortalizzate Chang liver.
Materiali e Metodi
Condizioni di coltura delle cellule
Le linee cellulari impiegate sono state coltivate in fiasche sterili di polistirene da 75 cm<2>, adese in monostrato, e mantenute in coltura in un incubatore a circolazione d’aria alla temperatura di 37°C in una atmosfera satura di umidità contenente 95% di aria e 5% di CO2.
Le cellule Chang liver ed HepG2 sono state mantenute in terreno di coltura RPMI 1640 integrato con 1% di una soluzione di antibiotico (penicillina-streptomicina) e antimicotico (anfotericina B), addizionato con il 10% di siero bovino fetale (FCS), 1 mM di sodio piruvato e 2 mM di L-glutammina.
Le cellule Sk-Hep-1 ed Hep3B sono state mantenute in terreno DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) integrato con 1% di una soluzione di antibiotico (penicillinastreptomicina) e antimicotico (anfotericina B) addizionato con il 10% FCS a cui à ̈ stato aggiunto l’1% di L-glutammina e, nel terreno di coltura delle cellule Hep3B, l’1% di amminoacidi non essenziali.
Gli studi di vitalità e di morfologia cellulare sono stati condotti dopo distacco delle cellule dalla piastra di coltura mediante l’uso di una soluzione di tripsina-EDTA e successiva semina su piastre da 96 pozzetti da 0.3 cm di diametro alla densità di 6.5x10<3>cellule Chang liver, 10<4>cellule HepG2, Sk-Hep-1 ed Hep3B, in 200 µl di terreno di coltura. Le analisi citofluorimetriche sono state condotte seminando 1.5 x10<5>cellule Chang liver e 2.0x10<5>cellule HepG2, Sk-Hep-1 ed Hep3B, su piastre da 6 pozzetti da 3 cm di diametro.
Tutti i composti sono stati solubilizzati in Dimetilsolfossido (DMSO) realizzando una soluzione madre 1 mM poi opportunamente diluita in terreno di coltura per realizzare le concentrazioni finali. La diluizione à ̈ stata effettuata in modo da non superare lo 0.04% di concentrazione di DMSO, percentuale oltre la quale si possono avere dei fenomeni di tossicità . Inoltre, durante tutti gli esperimenti le cellule controllo sono state incubate in presenza del solo veicolo in cui sono stati solubilizzati i composti.
Analisi della vitalità cellulare mediante saggio MTT
Il saggio MTT à ̈ una tecnica di dosaggio quantitativo colorimetrico della vitalità cellulare che impiega il bromuro di metiltiazolildifenil-tetrazolio (MTT).<44>L’MTT à ̈ un sale tetrazolico che viene ridotto dalle deidrogenasi mitocondriali di cellule vitali in un precipitato di colore blu-violetto (formazone) la cui intensità à ̈ direttamente proporzionale al numero di cellule vive e misurabile spettrofotometricamente. Al termine dei trattamenti con i composti, viene aggiunto l’MTT (1mg/ml) e le cellule sono incubate per 2 ore alla temperatura di 37°C.
Allontanato il terreno di coltura si aggiunge un tampone di lisi ottenuto solubilizzando sodio dodecilsolfato 20% (peso/volume) in dimetilformammide 50% (pH 4.7), in modo da promuovere il rilascio del prodotto colorato, ottenuto dalla riduzione dell’MTT. Al termine, dopo 16 ore di incubazione alla temperatura di 37°C, si à ̈ eseguita la lettura spettrofotometrica della piastra, mediante l’impiego di un lettore per dosaggi ELISA (OPSYS MR, Dynex Technologies), che ha misurato l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 570 nm (TEST) e 630 nm (riferimento); si à ̈ utilizzato il solo tampone di lisi come prova di riferimento per azzerare lo strumento.
Ogni esperimento à ̈ stato ripetuto almeno 4 volte ed i dati sono riportati come percentuale rispetto al controllo (pozzetti della piastra coltivati senza alcun composto) in cui la capacità di riduzione dello MTT à ̈ stata considerata pari al 100% di vitalità .
Caratterizzazione dell’apoptosi
Osservazione della morfologia cellulare mediante microscopia a fluorescenza
Le modifiche morfologiche delle cellule sono state analizzate in microscopia ottica o a fluorescenza dopo colorazione con l’Hoechst 33258.
L’Hoechst 33258 à ̈ un fluorocromo ad alta affinità per il DNA. Si tratta di un marker fluorescente che si intercala tra gli acidi nucleici evidenziando i nuclei delle cellule mediante l’emissione di una fluorescenza. La colorazione con Hoechst 33258 permette, quindi, di mettere in evidenza eventuali modifiche indotte nell’organizzazione della cromatina dal trattamento delle cellule con il VPA e con i suoi derivati. Le cellule che sono andate incontro a morte per apoptosi presenteranno nei nuclei dei granuli brillanti, indice della frammentazione cromatinica indotta dalle endonucleasi apoptotiche. I nuclei delle cellule vitali avranno invece una fluorescenza diffusa.
Tale colorante viene eccitato ad una lunghezza d’onda di 360nm ed emette a 490-500nm. La colorazione à ̈ stata effettuata su cellule seminate in piastre da 96 pozzetti e 24 ore dopo incubate con i composti alle concentrazioni e ai tempi stabiliti. Al termine dell’incubazione con i composti, le cellule sono state fissate aggiungendo in ogni pozzetto 50 µl di una soluzione di metanolo/acido acetico (in rapporto 3:1) e incubate per 10 minuti. In seguito, il fissativo à ̈ stato rimosso per fare asciugare i pozzetti all’aria. Sono stati quindi aggiunti 50 µl della soluzione Hoechst (1.25µl/ml di PBS) e dopo incubazione per 10 minuti e due lavaggi in PBS, sono stati aggiunti 50 µl di una soluzione PBS/glicerolo (in rapporto 1:1). Si à ̈ proceduto con l’osservazione al microscopio a fluorescenza, impiegando il filtro DAPI.
Studio citofluorimetrico della distribuzione delle cellule lungo le fasi del ciclo proliferativo
La quantificazione dell’evento apoptotico à ̈ stata condotta marcando le cellule con ioduro di propidio (PI), un colorante fluorescente che si intercala al DNA, in accordo con il protocollo di Carollo et al.<45>Tale metodica permette di valutare la distribuzione delle cellule lungo le fasi del ciclo cellulare. La presenza di un picco a più bassa fluorescenza à ̈ indice di cellule con DNA frammentato.
Dopo trattamento con i composti le cellule sono state risospese in una soluzione ipotonica di fluorocromo, costituita da 50 µg/ml di ioduro di propidio, 0.1% di citrato di sodio, 0.1% di Nonidet P-40 e 100 µg/ml di RNAse, e incubate al buio alla temperatura di 4°C per tutta la notte.
La distribuzione delle cellule lungo le fasi del ciclo proliferativo à ̈ stata valutata mediante l’impiego di un citofluorimetro Beckman Coulter Epics XL usando il software Expo 32 per l’elaborazione dei dati. La fluorescenza emessa dalle cellule à ̈ stata analizzata come frequenza di istogrammi di parametri singoli e la percentuale della popolazione cellulare localizzata nella regione subdiploide (pre-G0/G1) à ̈ stata considerata come indice di morte cellulare programmata.
Risultati
Saggi di vitalità cellulare
Inizialmente sono state condotte delle analisi per valutare la sensibilità delle cellule epatiche tumorali HepG2, Hep3B ed SK-Hep1 e non tumorali Chang liver ai derivati dell'acido valproico (VPA) di nuova sintesi, utilizzando come controllo l’acido valproico. I dati riportati in Fig.9 dimostrano che i composti di nuova sintesi sono molto più efficaci del VPA nell’indurre una forte riduzione della vitalità cellulare, in modo dose-dipendente.
Le cellule non tumorali Chang liver risultano, invece, molto meno sensibili al trattamento con i composti.
Degni di nota sono i risultati ottenuti impiegando i composti indicati come VPA5 e VPA6. VPA5 impiegato alla concentrazione 2,5 µM determina una riduzione della vitalità cellulare del 65% nelle cellule HepG2, del 67% nelle cellule Hep3B e del 55% nelle cellule SK-Hep-1 dopo appena 20 ore di trattamento. Raddoppiando la concentrazione del VPA5 si à ̈ osservata una riduzione della vitalità cellulare del 78% nelle cellule HepG2, dell’81% nelle cellule Hep3B e dell’82% nelle cellule SHep-1. Nelle cellule Chang liver, VPA5 determina un effetto che non supera il 50% quando impiegato alla massima concentrazione (10 µM).
VPA6 causa anch’esso un forte effetto citotossico dose-dipendente nelle tre linee cellulari tumorali: dopo 20 ore di trattamento alla concentrazione 2,5 µM VPA6 determina una riduzione della vitalità del 24% nelle cellule HepG2, del 60% nelle cellule Hep3B e del 48% nelle cellule SK-Hep-1; la citotossicità raggiunge i valori del 47%, 78% e 69% rispettivamente nelle cellule HepG2, Hep3B ed SK-Hep-1 in presenza di VPA6 5 µM. Il composto determina nelle cellule Chang liver uno scarso effetto (-16%) quando impiegato alla concentrazione 10 µM.
Nella Tabella 7 sono riportati i valori di IC50 (concentrazione del composto al quale si osserva il 50% di inibizione della crescita cellulare rispetto alle cellule non trattate), espressi in µM, per i composti presi in esame.
Linee cellulari VPA5 VPA6
epatiche umane<IC50 ±SD (ï M)>
Chang liver 5,0±0.5 >10
HepG2 1,9±0.17 5,75±0.51
Hep3B 2,5±0.20 1,35±0.10
SK-Hep1 2,12±0.21 2,75±0.27
Tabella 7
Studi di morfologia cellulare
Le analisi morfologiche al microscopio ottico mostrano che dopo trattamento con VPA5 e VPA6, le cellule di epatocarcinoma appaiono arrotondate, isolate e staccate dal substrato di crescita, cambiamenti morfologici tipici delle fasi iniziali dell’evento apoptotico. Questi effetti non sono stati osservati dopo incubazione con VPA (Fig.10).
L’induzione di apoptosi à ̈ stata confermata dalle analisi mediante colorazione con Hoechst 33258, che ha evidenziato la presenza di cromatina condensata e frammentata nei nuclei delle cellule di epatocarcinoma trattate con VAL5 e VAL6. Il materiale genetico alterato a livello strutturale à ̈ riconoscibile per la presenza di granuli brillanti (Fig.11), un marker dell’induzione di apoptosi.
Analisi citofluorimetriche del ciclo cellulare
Lo studio della distribuzione delle cellule lungo le fasi del ciclo proliferativo mediante citometria di flusso, ha indicato che VPA5 induce nelle cellule HepG2, Hep3B ed Sk-Hep1 frammentazione del DNA, evidenziabile come comparsa di un picco preG0/G1rispettivamente del 43,4%, 39,8% e 21,8% dopo 20 ore di trattamento alla concentrazione 2,5 µM. Dopo trattamento con VPA 5µM il picco preG0/G1raggiunge i valori del 77,7%, 41,2% e 30,5% rispettivamente. IL VPA6 impiegato per 20 ore alla concentrazione 5µM determina l’accumulo del 67,2% della popolazione di cellule HepG2 nella fase preG0/G1del ciclo cellulare, mentre nelle cellule Hep3B ed SK-Hep1 causa un accumulo delle cellule nella fase G2/M, a cui segue un successivo aumento del picco preG0/G1.
Nelle tre linee cellulari tumorali il VPA non ha alcun effetto apoptotico quando impiegato alle stesse dosi e per lo stesso tempo di incubazione dei derivati di nuova sintesi.
I composti hanno effetti veramente limitati sulle cellule Chang liver, anche quando impiegati ad alte dosi. In queste condizioni il picco preG0/G1non si attesta mai al di sopra del 16% (rispetto al 10% mediamente osservato nelle prove controllo). Piuttosto i composti causano un accumulo delle cellule nella fase G2/M del ciclo cellulare, indice che le cellule Chang liver subiscono un blocco proliferativo. (Fig.12)
La presente invenzione à ̈ stata descritta con riferimento ad alcune sue forme di realizzazione specifiche, ma à ̈ da intendersi che variazioni o modifiche potranno essere ad essa apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.
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Claims (14)
- RIVENDICAZIONI 1. Combinazioni chimiche o farmacologiche di organostagno(IV) con inibitori delle deacetilasi istoniche.
- 2. Composti secondo la rivendicazione 1 dove l’organostagno(IV) à ̈ complessato con inibitori delle deacetilasi istoniche.
- 3. Complessi secondo la rivendicazione 2 del tipo: Rn-Sn(IV)⇠L in cui R sono scelti, ognuno indipendentemente dall’altro, tra H, un gruppo alchilico, alcossilico, alchenilico o alchinilico con fino a 12 atomi di carbonio, un gruppo aromatico o aralchilico, isociclico od eterociclico, con fino a 12 atomi di carbonio, con n variabile da 1 a 3, e dove L à ̈ la molecola o le molecole di inibitori delle deacetilasi istoniche coordinanti, in qualunque rapporto stechiometrico chimicamente accettabile.
- 4. Complessi secondo la rivendicazione 3 in cui L sono una o più molecole di legante, uguali o diverse tra loro, che coordinano con qualsiasi sito e modalità di coordinazione chimicamente accettabile.
- 5. Complessi secondo le rivendicazioni 3 e 4 in cui R sono scelti, ognuno indipendentemente dall’altro, tra H, un gruppo alchilico con fino a 8 atomi di carbonio, o un gruppo alcossilico con fino a 8 atomi di carbonio, o un gruppo fenile.
- 6. Complessi secondo le rivendicazioni 3-5 in cui R sono scelti, ognuno indipendentemente dall’altro, tra metile, etile, propile, butile, fenile.
- 7. Complessi secondo le rivendicazioni 3-6 dove L, gli inibitori delle deacetilasi istoniche, sono acido valproico e derivati.
- 8. Complessi secondo le rivendicazioni 6 diorganostagno(IV) valproato di formula generale:
- 9. Complessi secondo le rivendicazioni 6 triorganostagno(IV) valproato di formula generale:
- 10. Forma preferita dell’invenzione, secondo la rivendicazione 9, tributilstagno(IV) valproato di formula
- 11. Uso di uno o più composti organostagno(IV) con inibitori delle deacetilasi istoniche, come definita nelle rivendicazioni 1-10, per la produzione di un preparato farmaceutico sia da solo che in combinazione con altri principi attivi.
- 12. Uso secondo la rivendicazione 11 in cui detto preparato à ̈ un preparato antitumorale.
- 13. Preparato farmaceutico comprendente come principio attivo almeno uno dei composti organostagno (IV) con inibitori delle deacetilasi istoniche, come definiti nelle rivendicazioni 1-10, assieme ad uno o più coadiuvanti e/o veicoli farmacologicamente accettabili in qualunque rapporto di combinazione.
- 14. Preparato farmaceutico secondo la rivendicazione 13 comprendente come principio attivo il tributilstagno(IV)-valproato come definito nella rivendicazione 10.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITRM2010A000054A IT1397963B1 (it) | 2010-02-12 | 2010-02-12 | Uso terapeutico combinato di organostagno(iv) ed inibitori delle deacetilasi istoniche. |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITRM2010A000054A IT1397963B1 (it) | 2010-02-12 | 2010-02-12 | Uso terapeutico combinato di organostagno(iv) ed inibitori delle deacetilasi istoniche. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITRM20100054A1 true ITRM20100054A1 (it) | 2011-08-13 |
| IT1397963B1 IT1397963B1 (it) | 2013-02-04 |
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ID=42289095
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| ITRM2010A000054A IT1397963B1 (it) | 2010-02-12 | 2010-02-12 | Uso terapeutico combinato di organostagno(iv) ed inibitori delle deacetilasi istoniche. |
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| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT1397963B1 (it) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1400314A (fr) * | 1964-07-08 | 1965-05-21 | Carlisle Chemical Works | Agents répulsifs pour les rongeurs |
| FR1499737A (fr) * | 1966-08-11 | 1967-10-27 | United States Borax Chem | Composés organo-stanniques, leur préparation et leurs applications |
| CN101139368A (zh) * | 2007-09-13 | 2008-03-12 | 东北师范大学 | 组蛋白去乙酰化酶抑制剂有机锡多酸化合物及其制备方法 |
-
2010
- 2010-02-12 IT ITRM2010A000054A patent/IT1397963B1/it active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1400314A (fr) * | 1964-07-08 | 1965-05-21 | Carlisle Chemical Works | Agents répulsifs pour les rongeurs |
| FR1499737A (fr) * | 1966-08-11 | 1967-10-27 | United States Borax Chem | Composés organo-stanniques, leur préparation et leurs applications |
| CN101139368A (zh) * | 2007-09-13 | 2008-03-12 | 东北师范大学 | 组蛋白去乙酰化酶抑制剂有机锡多酸化合物及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GHOLIVAND K ET AL: "New organotin(IV) complexes of nicotinamide, isonicotinamide and some of their novel phosphoric triamide derivatives: Syntheses, spectroscopic study and crystal structures", JOURNAL OF ORGANOMETALLIC CHEMISTRY, ELSEVIER-SEQUOIA S.A. LAUSANNE, CH, vol. 695, no. 9, 12 February 2010 (2010-02-12), pages 1383 - 1391, XP026989836, ISSN: 0022-328X, [retrieved on 20100212] * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1397963B1 (it) | 2013-02-04 |
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