TW202015707A - 抗癌劑 - Google Patents

Abstract

提供一種抗癌劑，其包含具有或經修飾以具有兩個半胱胺酸殘基的腫瘤導引胜肽，該砷原子存在於兩個半胱胺酸殘基之間，而使腫瘤導引胜肽環化成含有砷的抗癌劑。此允許合適腫瘤導引胜肽的選擇以用於治療既定癌症，因此後成試劑提供砷對腫瘤微環境更標靶的遞送。

Description

抗癌劑

本發明關於醫藥治療領域。具體而言，本發明關於配位至胜肽的砷及所得之複合物作為抗癌劑的用途。

本文先前技術的任何引用不解釋為承認此技術在澳洲或其他地方構成通常知識。

雖然三氧化二砷 (As₂ O₃ , ATO)是一種習知的毒物，其已長時間在醫療使用。在1865年，砷化合物(其中一種已知作為福勒氏溶液(Fowler’s Solution)(含有1% ATO的溶液))用於慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)的治療。由於其慢性毒性，在20世紀中期以較佳耐受性試劑替代此療法。然而，根據大規模臨床篩選，已鑑定ATO在某些人類癌症中的治療效果，如白血病(leukemia)、食道癌(oesophageal carcinoma)及淋巴瘤(lymphoma)。目前用於如急性前骨髓性細胞白血病(acute promyelocytic leukemia)之血液惡性腫瘤(haematological malignancies)的治療。

砷經由展現其毒性及相反地經由許多細胞標靶的各種機制的治療效果。砷容易與在半胱胺酸或甲硫胺酸胺基酸殘基(在蛋白質類/酶類中發現)中的硫結合，因而中斷廣泛的細胞作用且最終導致細胞死亡。一些已充分研究藉由三價砷標靶的蛋白質之實例包括麩胺基硫還原酶(glutathione reductase)、硫氧化還原蛋白還原酶(thioredoxin reductase)、粒線體腺苷酸轉移酶(mitochondrial adenine nucleotide translocase (ANT))及微管蛋白(tubulin)。任何這些交互作用導致細胞死亡。例如，粒線體在細胞中產生能量，因此中斷其作用導致細胞死亡。砷與微管蛋白的交互作用中斷微管形成而防止細胞複製。此外，砷在細胞核中累積導致DNA碎裂。

急性前骨髓性細胞白血病(APL)是一種攻擊型態的白血病，若沒有得到治療可能在三個月中造成死亡。如今其中一種對APL最有效的治療為ATO，其成功治癒85%在其他治療中復發的患者。ATO於2015年底准予用於第一線APL合併治療(combination therapy)。其展現有利於克服抗性的多方面特性(multifaceted behaviour)，因此其被引起相當大的興趣用於其他範圍的癌症治療，特別是血液惡性腫瘤。

不幸的是，ATO包括毒性副作用，而可能限制抗癌藥能夠施予APL及其他癌症治療之劑量。此可能導致不完整的腫瘤反應、不良心臟事件的發展、抗藥性、治療的終止以及最終疾病的進程。毒性副作用的根本原因為例如ATO的含砷抗癌藥無差別地殺死癌症細胞及健康細胞。

根據本發明的第一態樣，提供一種包含具有結合至兩個半胱胺酸殘基的砷原子的環化腫瘤導引胜肽之抗癌劑。

合適地，結合至兩個半胱胺酸殘基的砷原子允許腫瘤導引胜肽成為環狀。亦即，兩個半胱胺酸之間的砷的橋接產生環化腫瘤導引胜肽。

在一實施例中，腫瘤導引胜肽的兩個砷原子結合的半胱胺酸殘基藉由少於20個胺基酸殘基彼此分離。

在某些實施例中，腫瘤導引胜肽的兩個砷原子結合的半胱胺酸殘基藉由少於18個胺基酸殘基、或少於16個胺基酸殘基、或少於15個胺基酸殘基、或少於14個胺基酸殘基分離。

在一實施例中，在環化以形成抗癌劑之前，結合砷原子的兩個半胱胺酸殘基分別為腫瘤導引胜肽的N端及C端胜肽殘基。

若非自然的存在於腫瘤導引胜肽上，結合砷原子的兩個半胱胺酸殘基可被加到腫瘤導引胜肽上，因而分別形成N端及C端胜肽殘基。

N端半胱胺酸可包含結合至其終端胺基氮的封端基團(capping group)。

在實施例中，抗癌劑進一步包含結合至砷原子的穩定化基團(stabilising group)。

合適地，穩定化基團選自由羥基(hydroxyl)、C₁ 至C₆ 烷基(C₁ to C₆ alkyl)、C₂ 至C₆ 烯基(C₂ to C₆ alkenyl)、C₂ 至C₆ 炔基(C₂ to C₆ alkynyl)、芳基(aryl)、環烷基(cycloalkyl)及雜環基(heterocyclic)所組成之群組。

在實施例中，腫瘤導引胜肽包含至少一精胺酸及/或離胺酸殘基。

在一實施例中，抗癌劑具有如式I所示之結構：

式I 其中，結合至砷的硫原子為各自半胱胺酸殘基的硫醇基的硫(thiol sulfur)； 式1中的半胱胺酸殘基藉由以曲線表示的少於20個胺基酸殘基分離；以及 R為選自由羥基、C₁ 至C₆ 烷基、C₂ 至C₆ 烯基、C₂ 至C₆ 炔基、C₁ 至C₆ 烷氧基(C₁ to C₆ alkoxy)、芳基、環烷基、雜環基、麩胱甘肽基(glutathiyl)及雜環基所組成之群組的穩定化基團，各該基團可為經取代或未經取代。

根據本發明的第二態樣，提供一種藥學組合物，該藥學組合物包含第一態樣之抗癌劑及藥學上可接受的載體、稀釋劑及/或賦形劑。

根據本發明的第三態樣，提供一種對患者治療患者癌症的方法，該方法包含施予第一態樣的抗癌劑或第二態樣的藥學組合物至患者，以治療癌症的步驟。

本發明的第四態樣關於第一態樣的抗癌劑用於治療患者癌症的用途。

本發明的第五態樣關於第一態樣的抗癌劑用於製造癌症治療藥物的用途。

有關於第三態樣至第五態樣，在一實施例中，癌症為血液惡性腫瘤或固體腫瘤(solid tumour)。

根據本發明之第六態樣，提供一種製造抗癌劑的製程，其包括以下步驟： (a)將包含兩個半胱胺酸殘基的腫瘤導引胜肽接觸砷化合物；以及 (b)使砷與兩個半胱胺酸殘基的每一個結合，以形成包含結合砷原子的環化腫瘤導引胜肽； 以製造抗癌劑。

抗癌劑可如第一態樣所述。

砷化合物可為砷的氧化物。

在一實施例中，砷化合物可包含結合至砷的烷基、羥基或芳基。

在一實施例中，該製程進一步包含步驟(a)(i)：修飾所選之腫瘤導引胜肽，以具有兩個半胱胺酸殘基。

本發明的第七態樣關於藉由第六態樣之製程製造的抗癌劑。

本發明的第八態樣關於對患者遞送治療有效劑量的砷的方法，其包括對患者施予適當量的第一態樣的抗癌劑或第二態樣的藥學組合物，以遞送治療有效劑量的砷的步驟。

第八態樣的方法可包括描述第一態樣的任何實施例。

本發明的第九態樣關於診斷癌症的方法，其包括以下步驟： (i)對患者施予包含至少一種放射線標記原子的第一態樣之抗癌劑； (ii)允許抗癌劑被定位於癌症；以及 (iii)偵測抗癌劑的至少一種放射線標記原子的存在， 以診斷癌症。

在上述各部分中所提到的本發明的各種特徵和實施例將適當地應用到其他部分，且在細節上作必要的變更(mutatis mutandis) 。因此，在一個部分中說明的特徵可以適當地與在其他部分中所說明的特徵結合。

本發明的進一步特徵及優點將在以下詳細描述中變得顯而易見。

本發明為實際上至少部分地預測砷原子能夠穩定地附接到具有半胱胺酸殘基或經修飾而具有兩個半胱胺酸殘基的腫瘤導引胜肽，較佳地為具有N-端及C-端半胱胺酸殘基的腫瘤導引胜肽，而使腫瘤導引胜肽環化以得到高選擇性的含砷抗癌劑。此允許選擇用於治療給定癌症之合適腫瘤導引胜肽，因此之後的試劑提供砷對腫瘤微環境更標靶的遞送。

令人意外地，當腫瘤導引胜肽附接到砷，含砷抗癌劑相當穩定，而使其可以高特異性及選擇性的方式被製備及遞送到腫瘤位置。同時，砷原子為生物學上可利用以展現對腫瘤細胞的破壞效果。此結果尚未預測相對於結合砷的腫瘤導引胜肽的給定大小以及半胱胺酸硫醇基團與砷的結合強度。此提供將對癌症形式高度選擇性的試劑中砷以效率高及有效的方式遞送的機會。由於腫瘤導引胜肽選擇的能力，可以此選擇性方法標靶癌症。 定義

現將參照本文一般所使用的用語，用語「烷基(alkyl)」意指直鏈或支鏈的烷基取代基，其含有例如1至大約6個碳原子，較佳為1至大約4個碳原子，更佳為從1至2個碳原子。這種取代基的實例被認為包括在包含甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、二級丁基、異丁基、三級丁基、戊基、異戊基、己基及其類似物的這些範圍內。相關的碳數與主碳鏈及碳分支有關，但不包括屬於任何取代基的碳原子，例如從主碳鏈上分支出來的烷氧基取代基的碳原子。

本文所使用的用語「烯基(alkenyl)」意指含有至少一個碳-碳雙鍵的直鏈烯基取代基，例如，2至6個碳原子(分支烯基為3至6個碳原子)，較佳為2至5個碳原子(分支烯基較佳為3至5個碳原子)，更佳為2至4個碳原子。這種取代基的實例被認為包括在包含乙烯基(vinyl)、丙烯基(propenyl)、異丙基(isopropenyl)、正丁烯基(n -butenyl)、二級丁烯基(sec -butenyl)、異丁烯基(isobutenyl)、三級丁烯基(tert -butenyl)、戊烯基(pentenyl)、異戊烯基(isopentenyl)、己烯基(hexenyl)及其類似物的這些範圍內。

本文所使用的用語「炔基(alkynyl)」意指含有至少一個碳-碳三鍵的直鏈炔基取代基，例如，2至6個碳原子(分支炔基為3至6個碳原子)，較佳為2至5個碳原子(分支炔基較佳為3至5個碳原子)，更佳為2至4個碳原子。這種取代基的實例被認為包括在包含乙炔基(ethynyl)、丙炔基(propynyl)、異丙炔基(isopropynyl)、正丁炔基(n -butynyl)、二級丁炔基(sec -butynyl)、異丁炔基(isobutynyl)、三級丁炔基(tert -butynyl)、戊炔基(pentynyl)、異戊炔基(isopentynyl)、己炔基(hexynyl)及其類似物的這些範圍內。

用語「環烷基(cycloalkyl)」指的是選擇性經取代的飽和之單環、雙環或三環碳基團。合適地，環烷基基團可具有特定數目的碳原子，例如C₃ -C₆ 環烷基為具有3、4、5或6個碳原子的環烷基基團。非限制性的實例可包括環丙基(cyclopropyl)、環丁基(cyclobutyl)、環戊基(cyclopentyl)、環己基(cyclohexyl)及其類似物。

用語「芳基(aryl)」指的是所屬技術領域一般所理解之未經取代或經取代的芳族碳環取代基。應理解的是，用語芳基根據休克耳定則(Hückel’s rule)應用於平面且包含4n+2 p電子的環狀取代基。可經取代或未經取代的苯基(Phenyl)是作為附接至砷原子的穩定化基團的較佳芳基基團。

「雜環基(Heterocyclic)」或「雜環(heterocycle)」指的是較佳具有5至7個原子在環中且這些原子的1至4個為雜原子的芳香或非芳香環，所述的環被分離或融合至第二環上，其中所述的雜原子各自獨立地選自O、N及S。雜環包括部分及完全飽和的雜環基團。雜環系統可經由任何數目的碳原子或原子團(radical)的雜原子被附接至另一個部分，且可皆為飽和及未飽和。雜環(Heterocyclic rings)包括氮雜環(nitrogen heterocycles)。雜環之非限制性的實例包括吲哚(indoline)、吡咯啶基(pyrrolidinyl)、吡咯啉基(pyrrolinyl)、哌喃基(pyranyl)、哌啶基(piperidinyl)、哌[口井]基(piperazinyl)、嗎啉基(morpholinyl)、四氫呋喃基(tetrahydrofuranyl)、四氫噻吩基(tetrahydrothiophenyl)、吡唑啉基(pyrazolinyl)、二硫醇基(dithiolyl)、氧雜硫醇基(oxathiolyl)、二噁烷基(dioxanyl)、二噁烯基(dioxinyl)、[口咢][口井]基(oxazinyl)、氮呯基(azepinyl)、二氮呯基(diazepinyl)、噻氮呯基(thiazepinyl)、噁呯基(oxepinyl)及硫呯基(thiapinyl)、咪唑啉基(imidazolinyl)、硫代嗎啉基(thiomorpholinyl)及其類似物。

在任何實施例中所描述的用語「經取代(substituted)」(如關於本文中的「經取代或未經取代」)或「選擇性地經取代(optionally substituted)」及其類似用語)可指的是部分(moiety)以選自由C₁ -C₆ 烷基、芳基(包括苯基，其本身可經甲基、乙基、丙基、鹵素、硝基、C₁ -C₆ 烷氧基及麩胱甘肽基取代)、環烷基、羧基(carboxyl)、麩胱甘肽基、鹵素、硝基及鹵烷基(haloalkyl)所組成之群組的基團取代部分。這些基團中的每一個可自身地經相同或不同的基團取代。

本文所使用的用語「腫瘤導引胜肽(tumour homing peptide)」指的是具有可辨識及結合至、選擇性地及/或被攝取進入腫瘤細胞或組織、腫瘤血管、淋巴管及其他腫瘤相關微環境的相對短的胜肽(relatively short peptides)。其在所屬技術領域中也被稱為「腫瘤特異性內化胜肽(tumour-specific internalizing peptides)」及「腫瘤穿透胜肽(tumour penetrating peptides)」。腫瘤導引胜肽的本質並不特別限制，儘管其必須存在可結合至一個砷原子的至少兩個半胱胺酸殘基或可被調整為存在兩個這樣的半胱胺酸殘基。廣泛的這些胜肽為一般市售的，且事實上可以訂做。

作為本文一般所使用的用語「施予(administering)」或「施予(administration)」及其類似用語，以描述抗將癌劑或組合物如藉由特定的途徑或載體引導至哺乳類。儘管不侷限於此，施予的途徑可包括局部(topical)、包括口服(oral)、口腔(buccal)、舌下(sub-lingual)、鼻腔(nasal)、肛門(anal)、腸胃道(gastrointestinal)、皮下(subcutaneous)、靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)及皮內途徑的腸胃外及腸內(parenteral and enteral) 施予。

「治療(treat)」、「治療(treatment)」或「治療(treating)」意指為對個體施予用以至少改善(ameliorates)、減少或抑制存在如癌症或個體所經歷的疾病、異常或症狀的病徵或表徵的現狀的抗癌劑或組合物。

作為本文所使用之「有效劑量(effective amount)」指的是施予一劑量相關的抗癌劑或組合物足夠避免待治療之症狀的表徵的發生，或使表徵停止惡化或治療及減輕或至少減輕表徵的嚴重程度。所屬技術領域具有通常知識者將理解有效劑量會隨著患者年齡、性別、體重等而變化。可經由例行的試驗確定合適的劑量或劑量療程。 抗癌劑

在一實施例中，提供一種包含具有砷原子結合至兩個半胱胺酸殘基的環化腫瘤導引胜肽的抗癌劑。

合適地，結合至兩個半胱胺酸殘基的砷原子允許腫瘤導引胜肽成為環狀。亦即，砷結合至每個半胱胺酸的硫上，因而形成具有砷橋的環狀胜肽結構。其被認為的是砷與二硫醇基(dithiol)(每個半胱胺酸的一個硫醇基)的交互作用造成了可比單硫醇-砷結合更穩定的抗癌劑。

由於這些複合物在典型純化及特徵化程序中的不穩定性，自然發生的砷-胜肽種類已被證實難以分離及純化。此嚴重地限制砷-胜肽複合物的治療用途。因此，本抗癌劑在其可被純化、特徵化及儲存的方面提供顯著的優勢，且仍維持有效性。

在一實施例中，腫瘤導引胜肽的砷結合的兩個半胱胺酸殘基藉由少於20個胺基酸殘基相互分離。

在一些實施例中，腫瘤導引胜肽的砷結合的兩個半胱胺酸殘基藉由少於18個胺基酸殘基、或少於16個胺基酸殘基、或少於15個胺基酸殘基、或少於14個胺基酸殘基分離。任何這些上限值可與一個或兩個胺基酸殘基的下限值範圍耦合。

已發現在半胱胺酸殘基之間的胺基酸數目對預測胜肽是否會環化及形成砷橋是相當重要的。將結合至砷的半胱胺酸之間的胺基酸殘基較佳範圍可選自2至15個殘基、3至15個殘基、4至15個殘基、5至15個殘基、2至14個殘基、3至14個殘基、4至14個殘基以及5至14個殘基之間。

在實施例中，環化之前，砷原子結合的兩個半胱胺酸殘基分別形成腫瘤導引胜肽的N端及C端胜肽殘基。較佳的是，腫瘤導引胜肽的各終端胺基酸為半胱胺酸，如此改善環化作用並促進各個半胱胺酸硫醇基之間的砷橋接。環化胜肽的形成在多數情況下是一個關鍵的步驟，其為由相關的受體識別的胜肽的環化構形(cyclised conformation)。

N端半胱胺酸可包含結合至其游離胺基氮的封端基團。不希望受任何特定理論的束縛，封端基團被認為實質上用以在插入砷原子之前避免腫瘤導引胜肽的環化作用及/或聚合作用，或至少限制了N-及C-端殘基的相連，以更好的促進砷結合。因此，封端基團對有效的砷攝取及結合是重要的。封端基團可由任何能夠與胺基氮反應並形成相對不反應/穩定的封端基團的N-端封端化合物形成。

因此，在一實施例中，封端基團為胺基反應性基團。可適用任何呈現羧酸用於與半胱胺酸胺基團反應之化合物。較佳的是，這種呈現羧酸的化合物亦具有不反應部分(unreactive moiety)。在一較佳的實施例中，封端基團為如C₂ -C₆ 烷醯基(alkanoyl)的烷醯基，其可選擇性地經取代。各種類型合適的封端試劑之特定實例可包括乙醯基(acetyl)、焦麩胺酸(pyroglutamic acid)、吲哚、苯并咪唑(benzimidazoles)、苯并咪唑酮(benzimidazolones)、Fmoc及其類似物。較佳為較小的插入封端基團，因此在一較佳實施例中，封端基團為乙醯基團。所屬技術領域具有通常知識者將理解，如所屬技術領域已知的這種N-端封端基團是將其定位在腫瘤導引胜肽上的期望位置的手段。

在一實施例中，抗癌劑進一步包含結合至砷原子的穩定化基團。穩定化基團將典型的已經結合至用來接觸腫瘤導引胜肽的砷化合物中的砷原子。已發現穩定化基團的選擇可對抗癌劑的穩定性具有顯著的正向影響，且因此在治療方法中有持續的功效(ongoing efficacy)。

合適地，穩定化基團選自由羥基(hydroxyl)、C₁ 至C₆ 烷基、C₂ 至C₆ 烯基、C₂ 至C₆ 炔基、C₁ 至C₆ 烷氧基、芳基、環烷基、雜環基及包括麩胱甘肽基的短鏈胺基酸所組成之群組，每一個基團可為經取代或未經取代。

在一實施例中，穩定化基團選自由羥基、C₁ 至C₄ 烷基、C₂ 至C₄ 烯基、C₁ 至C₄ 烷氧基、C₅ 或C₆ 芳基、C₅ 或C₆ 環烷基、C₅ 或C₆ 雜環基及麩胱甘肽基所組成之群組，每一個基團可為經取代或未經取代。

在一些實施例中，穩定化基團選自由羥基、甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、二級丁基、異丁基、三級丁基及經取代或未經取代的苯基所組成之群組。

當穩定化基團為經取代的苯基，取代基可為羥基、C₁ 至C₄ 烷基、C₁ 至C₄ 烷氧基、麩胱甘肽基、精胺酸、離胺酸、鹵素、C₁ 至C₄ 鹵烷基、硝基、胺基、二級或三級胺、醯胺基(amido)、醚及酯。

較佳的取代基包括胺基(即NH₂ )、羥基、甲氧基、乙氧基、氟基、氯基及碘基。

在苯基上的取代基可為砷原子連接點的鄰位(ortho )、間位(meta )或對位(para )。較佳的取代基為對位至砷原子的單一取代基。

在一實施例中，腫瘤導引胜肽包含至少一個精胺酸及/或離胺酸殘基。精胺酸及離胺酸可較佳為，這些帶正電的胺基酸可與帶負電的細胞表面蛋白質交互作用，以改善腫瘤導引胜肽的內化作用(internalisation)。

第一態樣的一些抗癌劑可包含掌性中心，其可為(R)或(S)構形中的一種，或是當使用時，可作為其混合物施予。因此，在適用的情況下，本發明亦包括單獨或以任何比例混合的本文所描述之試劑的立體異構物。這些立體異構物可使用如本文中所描述的實例之HPLC的習知技術分離。

具體而言，砷原子可為掌性中心且與其附接的環狀胜肽可產生R及S異構物的形成。本文的結構被認為是明確地涵蓋R及S異構物兩者。已發現鏡像異構物可在合成過程中自發性地形成且可被用作為消旋(racemic)混合物。然而，將理解的是在一些實施例中，可期望分離並使用鏡像地(enantiomerically)純化的形式或至少富含具有一種異構物的組合物。

在一實施例中，抗癌劑具有如式I所示之結構：

式I 其中，所示被砷結合的硫原子為各自半胱胺酸殘基的硫醇基的硫； 式1中的半胱胺酸殘基藉由以曲線表示的少於20個胺基酸殘基分離；以及 R為包含選自由羥基、C₁ 至C₆ 烷基、C₂ 至C₆ 烯基、C₂ 至C₆ 炔基、C₁ 至C₆ 烷氧基、芳基、環烷基、雜環基及包含麩胱甘肽基之短鏈胜肽所組成之群組的部分的穩定化基團，

穩定化基團「R」可包含或被選自那些先前所描述的穩定化基團。

適合用於「R」的短鏈胜肽可為或包含那些具有介於4至20、較佳為4至16或4至10個之間的胺基酸殘基。

接合至兩個半胱胺酸殘基的胺基酸鏈可如同先前所描述的以胺基酸殘基的長度描述。N端半胱胺酸亦可具有如前文所描述的封端基團。

因此，在一實施例中，式I的抗癌劑可具有如式II中所式的結構

式II 其中，各種原子及基團如式I所述； 封端基團由胺基反應化合物形成；以及 W為介於2至20個之間的胺基酸殘基。

應理解的是，在封端基團及半胱胺酸殘基之間的「-NH₂ 」可為半胱胺酸殘基自己一部分的-NH。亦即，-NH可為與封端基團結合以形成「-NH-封端基團」的標準半胱胺酸-NH₂ 區域。

藉由「W」所表示的胺基酸殘基之數目可選自任何先前所討論的數目，其包括少於18個胺基酸殘基、或少於16個胺基酸殘基、或少於15個胺基酸殘基、或少於14個胺基酸殘基。任何這些上限值可與兩個胺基酸殘基的下限端範圍耦合。

應理解的是，雖然式I及式II的結構可為較佳的，但他們並不被認為是適用於本發明的唯一結構。具體而言，不要求胜肽具有終端半胱胺酸殘基，而僅需要存在兩個此胺基酸且藉由足夠數目的殘基分開，以允許與砷原子環化。

在一實施例中，砷原子將被結合於兩個半胱胺酸殘基之間以形成橋接的腫瘤導引胜肽可選自由以下所組成的群組： 1.    CAYHRLRRC； 2.    CDCRGDCFC ； 3.    CPIEDRPMC； 4.    CNRRTKAGC； 5.    CGTKRKC； 6.    CRGDGWC； 7.    CVSNPRWKC； 8.    CHVLWSTRC； 9.    CLDGGRPKC； 10.  GCSVSSVGALCTHV； 11.  CRGDGWC； 12.  CDCRGDCFC； 13.  CVNHPAFAC； 14.  CRGDRGPDC； 15.  CRGDKTTNC； 16.  CRGDHAGDC； 17.  CLSYYPSYC； 18.  CTPSPPFSHC； 19.  CPHSKPCLC； 20.  CSDSWHYWC； 21.  CSDWQHPWC； 22.  CSDYNHHWC； 23.  CSDGQHYWC； 24.  CYDSWHYWC； 25.  CFDGNHIWC； 26.  CTDFPRSFC； 27.  CTQDRQHPC； 28.  CLSRYLDQC； 29.  CRGDCF； 30.  CGNSNPKSC；以及 31.  CPHNLTKLC。 其中，當形成第一態樣的抗癌劑時，砷原子將結合並橋接在上述胜肽序列的兩個半胱胺酸殘基之間。半胱胺酸殘基的一個或兩著可為但不一定為終端殘基。

整體而言，這些腫瘤導引胜肽可標靶包括但不侷限於下列癌症的選擇：白血病/淋巴瘤(leukemia/lymphomas)、大腸癌、食道與胃食道癌(esophagus and gastroesophageal cancer)、表皮鱗狀細胞癌(epidermal squamous cell cancers)、黑色素瘤(melanoma)、胰島細胞瘤(pancreatic islet tumours)、乳癌(breast carcinoma)、前列腺癌、肺癌(lung cancer)、大腸直腸癌(colorectal cancer)、視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)、腫瘤轉移(tumour metastasis)、肝癌(hepatic cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、腦癌(brain cancer)、中皮瘤(mesothelioma)、黑色素瘤、卵巢癌及胃癌。

應理解的是，其他這些腫瘤導引胜肽為一般市售可得的，其用來替換癌症標靶且經常可被設計針對特定的標靶「訂做」。在這方面，抗癌劑的腫瘤導引胜肽化合物並不特別限制，且將基於所欲標靶的癌症自已知胜肽中選擇。

在一較佳的實施例中，將與砷原子結合以形成橋接的腫瘤導引胜肽為CAYHRLRRC (結構組元(Motif)：CAY)；CDCRGDCFC(結構組元：RGD)或CPIEDRPMC。這些胜肽分別對於標靶白血病及淋巴瘤細胞、血管新生的血管系統(angiogenic vasculature)及大腸癌相當有效，且因此如先前所述可以砷原子環化而形成有效抵抗這些標靶的抗癌劑。

在一實施例中，抗癌劑的砷為砷(III)原子。

在一更佳的實施例中，第一態樣的抗癌劑具有下列結構：

其中，R係為選自羥基、甲基及經取代或未經取代的苯基的穩定化基團。

在下列實驗部分，所提及的HyAs(LHP)、MeAs(LHP)及PhAs(LHP)是參考上述結構，其中R分別為羥基、甲基及未經取代的苯基。

根據本發明的第二態樣，提供一種包含第一態樣之抗癌劑及藥學上可接受的載體、稀釋劑及/或賦形劑的藥學組合物。

合適地，藥學上可接受的載體、稀釋劑及/或賦形劑可為或包括稀釋劑、溶劑、pH緩衝液、黏合劑、填料、乳化劑、崩散劑、聚合物、潤滑劑、油、脂類、蠟、塗料、黏度修飾劑、助滑劑及其類似物中的一種或多種。

稀釋劑可包括微晶型纖維素(microcrystalline cellulose)、乳糖(lactose)、甘露醇(mannitol)、磷酸鈣(calcium phosphate)、硫酸鈣(calcium sulfate)、高嶺土(kaolin)、乾澱粉(dry starch)、粉糖(powdered sugar)及其類似物中的一種或多種。黏合劑可包括聚乙烯吡咯烷酮(povidone)、澱粉(starch)、硬脂酸(stearic acid)、膠類(gums)、羥丙基甲基纖維素(hydroxypropylmethyl cellulose)及其類似物中的一種或多種。崩散劑可包括澱粉、交聯羧甲基纖維素鈉(croscarmellose sodium)、交聯聚維酮(crospovidone)、甘醇酸澱粉鈉(sodium starch glycolate)及其類似物中的一種或多種。溶劑可包括乙醇(ethanol)、甲醇(methanol)、異丙醇(isopropanol)、氯仿(chloroform)、丙酮(acetone)、甲基乙基酮(methylethyl ketone)、二氯甲烷(methylene chloride)、水、生理食鹽水(saline solutions)及其類似物中的一種或多種。潤滑劑可包括硬脂酸鎂(magnesium stearate)、硬脂酸鋅(zinc stearate)、硬脂酸鈣(calcium stearate)、硬脂酸(stearic acid)、硬脂醯反丁烯二酸鈉(sodium stearyl fumarate)、氫化植物油(hydrogenated vegetable oil)、山崳酸甘油酯(glyceryl behenate)及其類似物中的一種或多種。助滑劑可包括膠體二氧化矽(colloidal silicon dioxide)、滑石(talc)或玉米澱粉(cornstarch)及其類似物中的一種或多種。緩衝液可包括磷酸鹽緩衝液(phosphate buffers)、硼酸鹽緩衝液(borate buffers)及碳酸鹽緩衝液(carbonate buffers)，但不僅限於此。填料可包括一種或多種凝膠類，包含明膠(gelatin)、澱粉及合成聚合物凝膠(synthetic polymer gels)，但不僅限於此。塗料可包含成膜劑(film formers)、溶劑、塑化劑(plasticizers)及其類似物中的一種或多種。合適的成膜劑可為羥丙基甲基纖維素、甲基羥乙基纖維素(methyl hydroxyethyl cellulose)、乙基纖維素(ethyl cellulose)、羥丙織維素(hydroxypropyl cellulose)、聚乙烯吡咯烷酮、鈉羧甲基纖維素(sodium carboxymethyl cellulose)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、丙烯酸酯(acrylates)及其類似物中的一種或多種。合適的溶液可為水、乙醇、甲醇、異丙醇、氯仿、丙酮、甲基乙基酮、甲基乙基酮及其類似物中的一種或多種。塑化劑可為丙二醇(propylene glycol)、篦蔴油(castor oil)、甘油(glycerin)、聚乙二醇、聚山梨醇酯(polysorbates)及其類似物中的一種或多種。

參考教科書Excipients 6^th Edition, Eds. Rowe, Sheskey & Quinn (Pharmaceutical Press)，其提供根據本發明可為有效之賦形劑的非限制性實例。

應理解的是，藥學上可接受的載體、稀釋劑及/或賦形劑的選擇至少一部份將取決於配方的施予模式。僅作為實例，組成物可為用於IV施予的溶液、可注射液體、栓劑、緩釋配方、滲透壓幫浦配方的形式或任何其他對於施予有效及安全的形式。由於溶解度分布的優勢，具體較佳為用於IV施予的生理食鹽水溶液。

根據本發明的第三態樣，提供一種治療患者癌症的方法，其包括對患者施予第一態樣的抗癌劑或第二態樣的藥學組合物，以治療癌症的步驟。

本發明的第四態樣關於第一態樣的抗癌劑用於治療患者癌症的用途。

本發明的第五態樣關於第一態樣的抗癌劑用於製造癌症治療藥物的用途。

有關於第三態樣至第五態樣，在一實施例中，癌症為血液惡性腫瘤或固體腫瘤。

在進一步的實施例中，癌症係選自白血病、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)及淋巴瘤。

癌症可選自由鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma)、基底細胞癌(basal cell carcinoma)、黑色素瘤、腺體或導管之上皮襯膜的腫瘤(tumours of the epithelial lining of glands or ducts)、腺癌(adenocarcinoma)、乳突癌(papillary carcinoma)、肝及膽道的乳突狀腺癌腫瘤(papillary adenocarcinoma tumours of the liver and biliary tract)、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、腸胃道的腫瘤(tumours of the gastrointestinal tract)、食道的鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the oesophagus)、食道的腺癌(adenocarcinoma of the oesophagus)、大腸直腸癌(大腸癌)(colorectal carcinoma (colon cancer))、胃上皮癌(胃癌)(gastric carcinoma (stomach cancer))、呼吸道的腫瘤(tumours of the respiratory tract)、支氣管癌(bronchogenic carcinoma)、小細胞癌(small cell carcinoma)、泌尿生殖道的大細胞癌腫瘤(large cell carcinoma tumours of the urogenital tract)、膀胱的移行細胞癌(transitional cell carcinomas of the bladder)、膀胱的鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the bladder)、攝護腺癌(carcinoma of the prostate)、子宮頸癌(carcinoma of the cervix)、血液細胞及相關細胞(白血病)(blood cells and related cells (leukemias))、急性及慢性淋巴球性白血病(acute and chronic lymphocytic leukemia)、真性紅細胞增多症(polycythemia vera)、淋巴組織癌(cancers of lymphoid tissue)、包括霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)的惡性淋巴瘤(malignant lymphomas)、濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、瀰漫性淋巴瘤(diffuse lymphoma)、小淋巴性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)、大細胞淋巴瘤(large cell lymphoma)、淋巴母細胞性淋巴瘤 (lymphoblastic lymphoma)、多發性骨髓瘤、結締組織腫瘤(tumours of connective tissue)、骨肉瘤癌(cancers of bone osteosarcoma)、神經系統腫瘤(tumours of the nervous system)、神經母細胞瘤(neuroblastoma)、視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)、神經膠質母細胞瘤(glioblastoma)、與致癌基因病毒相關的寡樹圖神經膠細胞瘤(oligodendroglioma tumours associated with oncogenic viruses)、巴氏淋巴瘤(Burkitts lymphoma)、免疫力低下個體中的b細胞淋巴瘤(b cell lymphoma's in immuno-comprised individuals)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)、食道與胃食道癌(esophagus and gastroesophageal cancers)、表皮鱗狀細胞癌、胰島細胞瘤、乳癌、肺癌、大腸直腸癌、視網膜母細胞瘤、肝癌、胰臟癌、腦癌、中皮瘤及b型肝炎病毒肝細胞癌(hepatitis b virus hepatocellular carcinoma)所組成之群組。

當該癌症為白血病，其選自由急性淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia)(ALL)、急性B細胞淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic B-cell leukemia)、急性T細胞淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic T-cell leukemia)、急性骨髓母細胞性白血病(acute myeloblastic leukemia)(AML)、急性前骨髓性細胞白血病(APL)、急性單核母細胞性白血病(acute monoblastic leukemia)、急性紅血球細胞白血病(acute erythroleukemic leukemia)、急性巨核母細胞性白血病(acute megakaryoblastic leukemia)、急性髓單核細胞白血病(acute myelomonocytic leukemia)、急性未分化性白血病(acute undifferentiated leukemia)、慢性骨髓細胞性白血病(chronic myelocytic leukemia)及慢性淋巴球性白血病所組成之群組。

較佳地，癌症是選自由慢性骨髓细胞性白血病(chronic myeloid leukemia)、T細胞淋巴瘤(t-cell lymphoma)、骨髓增生不良症候群(myelodysplastic syndrome)、大腸癌、胰臟癌、腦癌、中皮瘤、急性前骨髓性細胞白血病(APL)及急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)(AML)所組成之群組。

在實施例中，高度較佳為急性骨髓性白血病的治療，其為已知難以治療的癌症。本文所提供的結果，特別與Kasumi-1細胞相關，指出第一態樣的抗癌劑可對於AML為非常有效。

當癌症為固體腫瘤，其可為包含但不侷限於消化道(digestive tract)、食道、肝、胃、大腸、皮膚、腦、骨、胸、肺、中皮層(mesothelium)及軟組織之各種肉瘤的癌症及前列腺癌中的一種或多種。

在一實施例中，癌症可以是目前指出通過臨床上可獲得的三氧化二砷溶液治療或者已經顯示三氧化二砷的溶液已顯示出有效的任何癌症。在一實施例中，在患者中的淋巴瘤、白血病或固體腫瘤對標準的治療方法是難以治癒的或者為白血病復發的案例。

抗癌劑可被單獨或與其他如，例如免疫療法(immunotherapeutics)、單株抗體(monoclonal antibody)、化學療法(chemotherapeutic)、輻射防護劑(radioprotectant)及放射治療(radiotherapeutic)的已知治療試劑組合使用。具體而言，抗癌劑的遞送可發生在施予一種或多種已知抗腫瘤試劑之前、之中或之後，該抗腫瘤試劑包含但不限於低甲基化試劑(hypomethylating agents)、PD-1抑制劑(PD-1 inhibitors)、PD-L1抑制劑(PD-L1 inhibitors)、芥子化合物(mustard compounds)、氮芥(nitrogen mustard)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、黴法蘭(melphalan)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氟尿苷(floxuridine)、甲胺喋呤(methotrexate)、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、紫杉醇(taxol)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(temiposide)、放線菌素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博萊黴素(bleomycin)、絲裂霉素(mitomycin)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、磷酸雌莫司汀(estramustine phosphate)、羥基尿素(hydroxyurea)、BCNU、丙卡巴肼(procarbazine)、VM-26、干擾素(interferons)及全反式維他命A酸(all-trans retinoic acid)(ATRA)或其他維他命A酸類(retinoids)。合適的低甲基化試劑可包括地西他濱(decitabine)、吉西他濱(guancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)及其類似物。PD-1抑制劑合適的實例包括派立珠單抗(pembrolizumab)及尼沃單抗(nivolumab)，而適當的PD-L1抑制劑包括阿替珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)及德瓦魯單抗(durvalumab)。

在癌症的各種療程中，抗癌劑的治療劑量及給藥頻率取決於癌症的性質、症狀的嚴重程度以及個體患者的年齡、體重、症狀及反應。重要地，這些劑量可基於標準程序並遵循目前用於遞送三氧化二砷之給藥方案的準則而容易地決定。由於遞送的效率，使用本抗癌劑的劑量濃度可略低於目前用於遞送三氧化二砷的給藥方案但仍維持有效的導引，且最終劑量可基於標準測試模式調整。

本文中所使用的用語「個體(subject)」、「個體(individual)」或「患者(patient)」可指的是任何個體，特別是脊椎動物個體，更具體而言為需要以砷對其治療的哺乳類個體。合適的脊椎動物包含但不限於靈長類動物、禽類、家畜類(如羊、牛、馬、驢、豬)、實驗室試驗動物(如兔子；小鼠；大鼠；天竺鼠；倉鼠)、伴生動物(如貓、狗)和眷養野生動物(如狐狸、鹿、野狗)。較佳的患者為需要以砷治療癌症的人類。然而，應被理解的是，上述用語並不意為必須存在的表徵。

根據本發明之第六態樣，提供一種製造抗癌劑的製程，其包括以下步驟： (a)將包含兩個半胱胺酸殘基的腫瘤導引胜肽接觸砷化合物；以及 (b)使砷與兩個半胱胺酸殘基的每一個結合，以形成包含結合砷原子的環化腫瘤導引胜肽； 以製造抗癌劑。

抗癌劑及砷化合物可如第一態樣的任何實施例所述。

砷化合物可為砷的氧化物或砷鹵化物。在合適的砷氧化物的一個非限制性的實例為氧化苯胂 (phenylarsine oxide)。

在一實施例中，砷化合物可包含結合至砷的烷基、羥基或芳基。

在一實施例中，製程進一步包含步驟(a)(i)：修飾所選之腫瘤導引胜肽，以具有兩個半胱胺酸殘基。該步驟在所期望的腫瘤導引胜肽尚未展現兩個合適的半胱胺酸殘基時為有效的。本發明並不僅限於本質上含有半胱胺酸殘基的腫瘤導引胜肽。半胱胺酸殘基可以所屬技術領域已知的許多任何化學方法被結合至腫瘤導引胜肽。此兩個添加的半胱胺酸殘基在製程的步驟(b)依序地結合至砷。

修飾腫瘤導引胜肽以具有兩個半胱胺酸殘基的步驟可被修改(modification)，使得腫瘤導引胜肽存在N-端及C-端的半胱胺酸殘基。

在腫瘤導引胜肽與砷化合物接觸的步驟之前，該製程亦可包括將封蓋化合物與腫瘤導引胜肽的N-端半胱胺酸殘基的游離胺基基團反應的步驟，以形成結合至所述胺基基團的氮的封端基團之步驟。

本發明的第七態樣關於藉由第六態樣之製程製造的抗癌劑。

本發明的第八態樣關於對患者遞送治療有效劑量的砷的方法，其包括對患者施予適當量的第一態樣的抗癌劑或第二態樣的藥學組合物的步驟，以遞送治療有效劑量的砷。

第八態樣的方法可藉由根據及包括任何第一態樣至第五態樣所描述的實施例執行。

本發明的第九態樣關於診斷癌症的方法，其包括以下步驟： (iv) 對患者施予包含至少一種放射線標記原子的第一態樣之抗癌劑； (v)允許抗癌劑被定位於癌症；以及 (vi)偵測抗癌劑的至少一種放射線標記原子的存在 以診斷癌症。

預期許多放射線標記的原子或基團將能夠使用作為在第九態樣中之方法的標記物。較佳地，放射線標記的原子或基團將為穩定化基團或為穩定化基團的一部分。

在一較佳的實施例中，穩定化基團為經取代的苯基且放射線標記的原子或基團可為在苯環上經取代。一個較佳的放射線標記的原子或基團可為存在苯環穩定化基團上的放射線標記的氟原子。氟可為苯環與砷連接點的鄰位、間位或對位，但較佳為對位。所採用的氟同位素可為任何已知用於醫學成像或檢測的同位素，但較佳為¹⁸ F。單光子激發斷層掃描(SPECT)或正電子發射斷層攝影術(PET)或其他在所屬領域已知的方法可被用於檢測步驟。

允許抗癌劑被定位於癌症的步驟可為允許抗癌劑與癌症結合或在癌細胞內或癌細胞附近聚集的步驟。

因此，應理解的是，第九態樣中所參考第一態樣的抗癌劑的用途包括這些第一態樣描述的所有試劑，並包括式I中的範圍，但具有其現有的原子或基團中的少一個被修飾成放射線標記。

以下實驗部分更詳細地描述了本發明的部分化合物的特徵及其功效。其目的在於說明本發明的化合物的部分具體實施例及其功效，而不以任何方式限制本發明。 實驗砷 - 胜肽複合物 ( As(LHP)) 的製備 材料

按照說明，市售可得的試劑為分析級或更高的純度。偏亞砷酸鈉(sodium meta-arsenite)(NaAsO₂ , ≥99%)、三乙胺(trimethylamine) ((C2H5)3N, ≥99%)、磷酸氫二鈉(sodium phosphate dibasic)(Na₂ HPO₄ , ≥99%)、二水合磷酸二氫鈉(sodium dihydrogen phosphate dihydrate)(NaH₂ PO₄ .2H₂ O, ≥99%)及氧化苯胂(phenylarsine oxide)(PAO, C₆ H₅ AsO, ≥97%)及 Trizma® base (≥99.9%, Tris)得自Sigma Aldrich(USA)。三氧化二砷(III) (AsI₃ , ≥98%)得自Strem Chemicals (USA)、單甲基砷酸(monomethylarsonic acid)(MMA(V), CH₅ AsO₃ , ＞97%)得自Wako Pure Chemical Industries (日本)以及甲酸(formic acid)(99%)、鹽酸(hydrochloric acid) (HCl, 32%)及氫氧化鈉(sodium hydroxide)(NaOH, ＞97%)得自Ajax Finechem。預乙醯化的胜肽AcCAYHRLRRC及AcCARHRYLRC (＞98%)及CAYHRRLRC (＞98%)藉由Peptide 2.0 (USA)訂製合成。AcCAYHRLRRC(白血病導引胜肽)在本文中將稱作為LHP以及AcCARHRYLRC(亂序胜肽)在本文中將稱作為sLHP。Milli-Q水(18.2 Ω, Millipore)用於所有的稀釋(除非另有說明)及用以製備NaOH、磷酸鹽緩衝液及Tris.HCl緩衝液溶液。方法 pH 的測量

將注意的是，以Mettler Toledo技術緩衝液(4.0、7.0及9.2)校準之後以Mettler Toledo Seven Compact S220-Micro Kit測量及/或確認pH。緩衝液的製備

磷酸鹽緩衝液(pH 7或 pH 8，0.1 M，100 mL)使用表1中所列的適量體積的儲備溶液(stock solution)A(NaH₂ PO₄ .2H₂ O, 0.2 M)及儲備溶液B(Na₂ HPO₄ , 0.2 M)製備。如前所述，測定pH，並在以Milli-Q水稀釋至100mL之前，依所需逐滴添加溶液A或溶液B調整(最終濃度0.1M)。 表1，磷酸鹽緩衝液在特定pH下的儲備溶液組合

Tris-HCl緩衝液藉由添加大約5 mL HCl (0.2 M)至50 mL Tris (0.2 M)，同時監控pH，然後以Milli-Q水稀釋至100mL(最終濃度0.2M)來製備。電灑離子化質譜光譜測定法 (ESI-MS) As-LHP 複合物配方的 ESI-MS 分析

ESI-MS用於偵測As物種(species)對LHP的結合，以優化錯合條件。購入的CAYHRLRRC胜肽具有乙醯化N-端並為線性構形，以允許兩個Cys硫醇基團與As配位。反應在本文所描述的各種條件下進行。在分析之前，溶液在Milli-Q水中稀釋。第1A圖示出對於LHP的ESI-質譜光譜。用於 ESI-MS 的操作條件

所有質譜光譜以Micromass Quattro Micro triple-quadrupole mass spectrometer (Micromass, UK)收集，其採用正離子模式的電噴霧電離。在所有實驗中，加熱的乾燥氮氣為霧化(nebulizing)及乾燥的氣體。採用3.00kV的毛細管電壓，35V的錐電壓，80℃的來源溫度，120℃的去溶劑化溫度和400L/h的去溶劑化氣體流速來收集光譜。

收集對Milli-Q水的基線光譜。在樣品注射之前，以Milli-Q水完整的潤洗訊號源直到光譜與基線光譜相似。每個樣品在10 µL/min的流速下以1-mL針筒(SGE Analytical Science, Australia)注入。As-LHP產物的光譜在300至1000的m/z 範圍中收集。數據採集以連續模式進行，通常將80次掃描相加以獲得代表性光譜。光譜以MassLynx軟體(Waters, 2003)進行。背景減除以1的多項式級數(polynomial order)與曲線下方40％進行，並以Savitsky-Golay演算法修勻(smoothed)。然後，以中心函數(頂部，面積)產生質心光譜(Centroid spectra)，且每個波峰以其分別的m/z 比及強度註記。發展用於形成 As-LHP 複合物及前體的方法 HyAs(LHP) 的形成

表2含有使用反應物AsI₃ 及LHP在進行三重複反應下的條件，以製備HyAs(LHP)。所有反應小瓶在培養前以N₂ 沖洗。藉由ESI-MS在特定的時間點(30min、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h)分析代表性等分試樣(aliquot)，以監測反應過程。 表2， 用於As-LHP製備的三重複樣品之條件

MeAs(LHP) 的形成

MeAs(LHP)的製備藉由混合單甲基砷酸(MMA(V), 3 mM)與LHP (12 mM)來檢驗，其中過量的LHP係允許胜肽於MMA(V)的還原作用中氧化。化合物混合於磷酸鹽緩衝液(H₂ PO₄ ^ˉ /HPO₄ ^2ˉ , 0.1 M, pH 8)中，以N₂ 沖洗並在37 °C或60 °C中培養1 h、4 h、8 h、16 h或24 h。產物藉由ESI-MS分析。PhAs(LHP) 的形成

基於來自HyAs(LHP)的形成的結果，藉由以熱直到溶解(80-90 ⁰C, 4-8 h)來製備的氧化苯胂的溶液(PAO)(在磷酸鹽緩衝液中10 Mm，H₂ PO₄ ^ˉ /HPO₄ ^2ˉ , 0.1 M, pH 8)嘗試生產PhAs(LHP)。冷卻至室溫之後，將PAO(10 mM)加入至LHP(3 mM)，小瓶以N₂ 沖洗並在37 °C或60 °C中培養1 h、4 h、8 h、16 h或24 h。產物藉由ESI-MS分析。測試 PhAs(CAYHRRLRC) 的形成

為了檢驗PhAs的複合物中的乙醯基對LHP的影響，嘗試與非乙醯化胜肽CAYHRRLRC反應。如前所述，PAO (10 mM)在磷酸鹽緩衝液(H₂ PO₄ ^ˉ /HPO₄ ^2ˉ , 0.1 M, pH 8)中製備並冷卻。然後加入CAYHRRLRC (3 mM)，以N₂ 沖洗，且產物溶液在37 °C或60 °C中培養1 h、4 h、8 h、16 h或24 h。等分試樣藉由ESI-MS分析。PhAs(sLHP) 的製備

PhAs(sLHP)藉由反應PAO (10 mM，如前所述，在磷酸鹽緩衝液中， H₂ PO₄ ^ˉ /HPO₄ ^2ˉ , 0.1 M, pH 8)及sLHP (3 mM)來製備。小瓶以N₂ 沖洗並在37 °C中培養8-16 h。產物藉由ESI-MS分析。各種 As-LHP 複合物的純化 分析型高效液相層析儀 (HPLC)

使用具有SCL 10A VP系統控制器、SIL 10 AD VP自動注射器及LC 10AT VO 液相層析單元的Shimadzu分析型HPLC系統與DGU 14A除氣機及SPD M10A VP二極體陣列偵測器。使用以H₂ O (0.1% TFA)平衡20分鐘之後的Waters Sunfire C18管柱，5 μm, 4.6 x 250 mm (No. 186002560)。以ACN/H₂ O各與0.1% TFA進行梯度沖提。所有溶劑在使用之前藉由過濾及超音波震盪除氣。樣品在分析之前經由0.20 μm過濾器(Sartorius)過濾。分析游離LHP的溶液以建立其沖提時間。製備型高效液相層析儀 (HPLC)

基於從分析型HPLC獲得的沖提輪廓，As反應產物的純化使用具有Waters Sunfire Prep C18, OBD 5 μm, 19 x 150 mm管柱(No. 186002568)及設定為λ 220 nm的2489 UV/可見光偵測器的Waters Prep LC系統的製備型HPLC進行。所有溶劑在用儀器上的He噴射之前預過濾並超音波震盪。各樣品在分析之前，經由0.20 μm過濾器(Sartorius)過濾。在運轉樣品之前，管柱以H₂ O (0.1% TFA)平衡30分鐘。流速維持在20 mL/min。表3代表所用的溶劑梯度。分析游離HLP的溶液作為標準品。收集分餾並藉由ESI-MS分析。 表3，用於HPLC純化AsLHP複合物的溶劑梯度

乾燥 As 複合物

為得到純化的化合物，使用Alpha 1-2 LDplus凍乾機(Christ)將已鑑定的HPLC分餾凍乾隔夜。As-LHP 複合物的特徵 ESI-MS

根據先前描述的操作條件藉由ESI-MS製備及分析As-胜肽複合物(100 μM, 0.5% 甲酸)的溶液。XAS

XAS分析對As-LHP的固態及溶液樣品進行。固體樣品藉由完全混合As-LHP與固體氮化硼(Sigma Aldrich)來製備。儘管發現額外的10倍稀釋對於螢光模式的分析是最佳的，稀釋比例使用最初XAFSmass程序測定。此所得的混合物安裝在1-mm厚的鋁樣品支架並以卡普頓膠帶(Kapton tape)密封。用於XAS分析的溶液樣品藉由混合As 溶液 (600 μL)與乙二醇(300 μL)來製備，以避免快速冷凍期間的結晶化。所得的溶液(最終濃度As 1 mM)藉由針筒轉移至以卡普頓膠帶密封的樣品支架。樣品之後快速的浸入液態氮中並轉移至液態氦低溫控制器(cryostat)，其在10 ⁰K下進行分析。

此外，收集As標準品的X射線吸收光譜：如對針對As-LHP複合物所述製備的固體及溶液標準品。標準品包括：AsI₃ 、As₂ S₃ 、NaAsO₂ 、NaAsO₄ 、MMA(V)、PAO、As(GS)₃ 、MeAs(GS)₂ 及PhAs(GS)₂ 。砷的K-邊緣XAS數據於具有光束能量2.5 GeV及光束電流300-400 mA的Australian National Beamline Facility (ANBF, beamline 20B) KEK, Tsukuba, Japan收集。Si[111]通道切斷單色器(channel-cut monochromators) 調變50%以抑制諧波。所有光譜在螢光模式中於~10⁰K下(以閉路循環氦CryoIndustries REF-1577-D22低溫控制器維持)使用36元Ge陣列偵測器(Eurisys/Canberra Industries)及1-mm垂直狹縫寬度記錄。砷的K-邊緣EXAFS光譜在下列能量範圍中收集：前緣區域11640–11840 eV (10 eV steps)；XANES區域 11840–11890 eV (0.25 eV steps)；以及EXAFS區域 11890-12468 eV (0.05 Ǻ-1 steps ink -space to 14.2 Ǻ-1)。同時在樣品的傳遞模式下游中分析固體砷酸鈉標準品以用於校準，其中第一衍生光譜的第一波峰之能量(對應於邊緣能量)定義為11871.7 eV。對所有數據分析收集2-3次掃描的平均。以EXAFSPAK進行數據處理。EXAFSPAK的DATFIT模組係用於多元線性回歸分析(multiple linear regression analysis)。背景減除及標準化使用BACKSUB達成，並使用FEFF 8.2 計算理論相及幅度函數以符合EXAFS數據。NMR 光譜特徵

As-LHP樣品在90% H₂ O/10% D₂ O(以HCL調整至pH ~4)或100% D₂ O中分析。NMR實驗使用Varian Unity 500-MHz光譜儀及Vnmrj 2.1B 軟體進行。殘餘水訊號的抑制藉由預飽和(presaturation)或藉由在水上使用選擇性方形脈衝激發塑型(excitation sculpting) 1.5秒長來達成。質子共振分配藉由¹ H及¹ HCOSY、TOCSY及NOESY實驗取得。碳分配藉由¹ H及¹³ C COSY、TOCSY及NOESY實驗取得。NOESY實驗以建立自COSY及TOCSY實驗的脈衝序列進行。光譜處理使用ACD/NMR Processor Academic Edition® (2013, ACD Labs, Toronto, Canada)進行。所有波峰以水在4.8ppm的波峰校準。石墨爐式原子吸收光譜儀 (Graphite Furnace Atomic Absorption Spectroscopy)

使用配備有Winlab 32 AA爐計畫(Furnace program)的Perkin-Elmer AAnalyst 600原子吸收光譜儀結合塞曼效應(Zeeman Effect) 背景校正、AS-800自動取樣器及AA Accessory 7冷卻系統分析溶液中的As。無電極As放電燈(Perkin-Elmer)設定在193.7 nm的波長及0.7 nm的狹縫寬度，得到讀值接近54W的儀器能量。購自Inorganic Ventures, USA之經認證、基質匹配的砷標準品溶液(Lot #J2-AS02116)用來產生校正曲線。使用Pd及Mg基質修飾溶液(購自Inorganic Ventures, USA)製備Pd/Mg基質修飾溶液(1 mg/mL Pd, 1 mg/mL Mg(NO₃ )₂ )。自動取樣器分配的量為化學修飾劑(5 μL)及樣品(20 μL)。使用表4中所示的爐操作條件，砷從插入有熱解L’vov平台的熱解石墨塗佈管的表面原子化(atomised)。 表4，石墨爐操作條件

結果 As-LHP 複合物的形成 HyAs(LHP) 的形成

分析來自試驗1的產物示出沒有所期望之As-LHP複合物的證據。在所有時間點的所有溫度中，ESI-MS產生游離胜肽的光譜(第1A圖)。相似地，來自試驗2至試驗6之產物的光譜分析示出在所有濃度、溫度及時間點中只有游離胜肽的存在，未能產生所期望的As-LHP複合物。因為當在60 ⁰C下測試超過4小時顯示胜肽降解的跡象，因而停止此溫度的測試。對於Tris.HCl緩衝液(pH 9)中的所有樣品，試驗9沒有產生As-LHP複合物的跡象。然而，於三乙胺(試驗7)及在pH 8的磷酸鹽緩衝液(試驗8)中嘗試的反應立即地產生白色沉澱。此沉澱物的樣品溶解於Milli-Q水/0.5%甲酸中並進行ESI-MS分析，雖然豐度波峰仍為那些游離胜肽，但在兩種情況下都有屬於所期望產物的小量離子訊號。當反應在24 ⁰C下進行時，所得的沉澱物即使在24小時後也不溶解，表明他並不是所期望的產物。反應溶液在37 ⁰C下培養之後，沉澱物在30分鐘的時間點溶解，且此樣品及在1及2小時的時間點產生的ESI-MS光譜包含可指定為游離胜肽的主要波峰以及指定為所期望之產物的形成的較小波峰。樣品接著在37 ⁰C下培養4小時用於在pH 8下進行反應以產生第1B圖中的光譜，其確認HyAs(LHP)具有在m/z 431.4豐度分子離子(abundant molecular ion)以及在m/z 646.8的中等豐度的離子的形成，其分別對應於[HyAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ 及[HyAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ 。在m/z 837.9的小波峰指為[HyAs(LHP)₂ + 3H⁺ ]³⁺ ，其指示HyAs(LHP)₂ 的形成，並證實反應可能需要進一步的純化以分離所期望的化合物HyAs(LHP)。與分別對應於[LHP + 3H⁺ ]³⁺ 及[LHP + 2H⁺ ]²⁺ 的m/z 407.6及m/z 610.5的游離胜肽相關的離子存在可能是由於電離製程中相關砷的損失。在HPLC-純化產物中的砷濃度分析以GFAAS進行以確認純度。24小時及48小時期間的ESI-MS光譜示出胜肽降解的跡象。MeAs(LHP) 的形成

MMA(V)及LHP的反應始終保持無色。小波峰指示在37 ⁰C下培養4小時之後偵測到MeAs(LHP)產物，隨著8小時的培養之後這些波峰的豐度增加。在培養8小時及16小時之間並沒有顯著的不同，但更長的培養期間再次產生胜肽降解。第1C圖描述在37 ⁰C(16 h)下培養隔夜的反應之ESI-MS光譜，以確認所期望之產物MeAs(LHP)的產生，其具有在m/z 655.1的[MeAs(LHP) + 2H⁺ ]及在m/z 437.1的[MeAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ 的分子離子。在m/z 407.6及m/z 610.5豐度的離子指示為[LHP + 3H⁺ ]³⁺ 及[LHP + 2H⁺ ]²⁺ 的游離胜肽與電離製程一致。(m/z 414.9 [LHP + Na⁺ + 2H⁺ ]³⁺ 、m/z 444.8 [MeAs(LHP) + Na⁺ + 2H⁺ ]³⁺ 、m/z 629.6 [LHP + Na⁺ + H⁺ ]²⁺ 及m/z 666.4 [MeAs(LHP) + Na⁺ + H⁺ ]²⁺ )存在的其他離子係指定為在每個案例中以Na⁺ 取代一個H⁺ 離子的相似波峰(analogous peaks)。有趣的是，此反應沒有二肽產物的證據。PhAs(LHP) 的形成

以PAO及LHP產生PhAs(LHP)的反應導致在混合之後立即地沉澱。如同在HyAs(LHP)的案例所觀察到的，沉澱物的ESI-MS分析示出屬於游離胜肽的大量離子波峰。接著在37 ⁰C下培養1小時，沉澱物溶解且接著在37 ⁰C下培養4小時，ESI-MS分析(第1D圖)示出在m/z 685.5被鑑定為[PhAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ 的豐度波峰與在m/z 457.6 ([PhAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ )的中等豐度離子。如同在HyAs(LHP)及MeAs(LHP)的反應所觀察到的，藉由典型指示波峰m/z 407.6[LHP + 3H⁺ ]³⁺ 及m/z 610.5 [LHP + 2H⁺ ]²⁺ 証實在ESI-MS光譜中亦存在游離胜肽，其如下列第[0184]段所述在HPLC純化中被移除，在37⁰C下培養8小時及16小時期間產生相似於培養4小時的ESI-MS結果，但在24小時再次的有產物降解的跡象。As-LHP 複合物的純化 分析型高效液相層析儀 (HPLC)

As-胜肽反應溶液的HPLC純化產生尖峰、易分離的波峰。在每個層析圖中，游離胜肽出現在14.5分鐘。HyAs(LHP)(b)的波峰出現在17.2分鐘，而MeAs(LHP)(c)及PhAs(LHP)分別在18.1分鐘及22.1分鐘被沖提。HPLC跡線示於第2A圖。製備型高效液相層析儀 (HPLC)

藉由製備型HPLC放大反應及純化產生與藉由分析型HPLC所產生相似的沖提輪廓，其中游離胜肽在16.9分鐘沖提、HyAs(LHP)在18.1分鐘、MeAs(LHP)在19.6分鐘以及PhAs(LHP)在22.8分鐘沖提。接著凍乾所期望的分餾以移除溶劑，產生對應於各AsLHP複合物的白色固體。As-LHP 複合物的特徵 ESI-MS

HyAs(LHP) (a)、MeAs(LHP) (b)及PhAs(LHP) (c)的ESI-質譜光譜(第2B圖)皆展現在m/z 407.4及610.5的波峰，其可歸屬於LHP且分別被鑑定為[LHP + 3H⁺ ]³⁺ 及[LHP + 2H⁺ ]²⁺ 。游離LHP的存在可能是由於在電離製程期間相關的As損失。在m/z 622.3被鑑定為[LHP + H⁺ + Na⁺ ]²⁺ 的低豐度離子存在於所有As(LHP)反應及最終產物的光譜中。HyAs(LHP) (a)展現在m/z 647.1的豐度離子及在m/z 431.4的中等豐度的離子，其分別被指定為[HyAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ 及[HyAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ ，以確認所期望產物的產生。對應於MeAs(LHP) (b)及PhAs(LHP) (c)之系統的分析示出每個具有與於m/z 655.1被鑑定為[MeAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ 及在m/z 685.5被鑑定為[PhAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ 的2+帶電離子與於m/z 437.1 ([MeAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ 及m/z 457.6 ([PhAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ )的中等豐度3+離子相關的豐度離子。X- 射線吸收光譜 (XAS)

第3圖示出得自As標準品的固體樣品及第一態樣的As胜肽抗癌劑HyAs(LHP)、MeAs(LHP)及PhAs(LHP)取得之As K-邊緣 XANES光譜的比較。邊緣的相對應能量(取得自第一衍生物光譜的第一波峰)及所有固體樣品的白線波峰列於下列表5中。As(III)化合物、亞砷酸鈉(sodium arsenite)(11867.89 eV，黑色虛線，第3圖)及As(V)化合物、砷酸鈉(sodium arsenate)(11871.38 eV，點狀黑線，第3圖)的邊緣能量差異為3.49 eV。檢查用於As(III)複合物的邊緣能量顯示硫結合的As(III)化合物(短虛線，第3圖) (11866.09 eV至11867.07 eV)展現低於氧結合的As(III)化合物(11867.89 eV至11868.64 eV，虛線，第3圖)的邊緣能量。用於HyAs(LHP)(純綠線，第3圖)的邊緣能量為11866.97 eV，其呈現硫結合的As(III)化合物的高端範圍，但顯著地低於氧結合的As(III)化合物、亞砷酸鈉所展現。硫結合的As(III)複合物的光譜輪廓亦展現了大約11871.7 eV的特徵波谷，而氧結合的As(III)化合物的光譜在後緣區域中並沒有展現此明顯的波谷(第3圖)。取得自MeAs(LHP)(純紅線)及PhAs(LHP)(純黑線)的光譜皆展現硫結合的As(III)複合物特徵的後緣波谷。此可能是由於在此結構中氧的存在，此凹陷在HyAs(LHP)(純綠線)的光譜中並不顯著。 表5，As-LHP抗癌劑及As標準品的固體樣品之砷 K-邊緣及白線波峰XANES能量

甲基化的砷(V)化合物、MMA(V)(紅色點線)展現高於單甲基化砷(III)複合物、MeAs^III (GS)₂ (11866.44 eV，短紅色虛線，第3圖)的邊緣能量11870.64 Ev、2.75 eV。MeAs(LHP) (純紅線，第3圖)的邊緣能量發生在11866.27 eV且對應至硫結合的As複合物。因此，MeAs(LHP)的XAS光譜的後邊緣輪廓與MeAs^III (GS)₂ 光譜非常相似。PhAsO (藍色虛線，第3圖)展現出最相似於亞砷酸鹽的邊緣能量11868.64 eV。此代表事實上在每個案例中砷結合至負電性的O。PhAs(LHP)化合物(純黑線)展現發生低於C/S-結合As(III)標準品範圍的邊緣能量(11865.90 eV)。PhAs(LHP)光譜的形狀相似於MeAs^III (GS)₂ 的光譜(短紅色虛線)及PhAs^III (GS)₂ 的光譜 (綠色虛線)，但白線波峰的強度大於這些標準品。

表6表示取得自HyAs(LHP)的EXAFS的數據進行的曲線擬合模擬的總結。這些對應於典型以三角形平面或三角錐體方式與三個原子配位的As(III)。相較於兩個硫原子(擬合1)，模擬三個硫原子配位至砷(擬合2)導致擬合錯誤的增加，表明更可能是兩個硫原子結合至砷。第三反向散射體(backscatterer)對砷的擬合指出第三原子可能為氧或碳(擬合3及擬合4)。2個硫原子及1個碳原子的狀況(scenario)起初產生了負德拜瓦勒因子(negative Debye-Waller factor)；如此隨後固定該因子以獲得擬合4中所示的結果(表6)。第4圖示出擬合3的實驗及計算的EXAFS及傅立葉轉換，以顯示徑向分布低於2.5 Ǻ的合理一致性。其他可能的組態亦檢查到包括1個硫原子及2個氧原子(擬合5)，及1個硫原子及2個碳原子，後者由於產生負德拜瓦勒因子而物理上不可行因而忽視。固定德拜瓦勒因子來降低此導致不合理E₀ 值的錯誤。 表6，固態HyAs(LHP)的EXAFS擬合結果總結 *1S及2O伴隨2S及1C的擬合在固定之前產生負德拜瓦勒因子。1S及2C的所有嘗試產生負德拜瓦勒因子。

表7(下方)示出MeAs(LHP)產生的EXAFS光譜的潛在模型的模擬總結。相似地，砷的起始擬合僅與硫配位，其確認了含有兩個硫原子的模式產生較接近擬合(擬合1與擬合2)，因為As配位至三個硫原子增加了擬合錯誤。嘗試檢查1個硫以及2個氧原子或2個碳原子結合至砷產生之組合的狀況，結果顯示對於德拜瓦勒因子、E₀ 或這兩個參數都不可行。進一步地，此可能無法藉由固定參數被修正。擬合砷與兩個硫原子和一個氧或一個碳原子結合產生可行的結果。綜上所述，最佳的擬合為得到As(III)結合至兩個硫原子和一個氧(擬合3)或一個碳原子(擬合4，如第5圖所示)。 表7，固態MeAs(LHP)的EXAFS擬合結果總結 *1S及2O伴隨1S及2C的擬合產生負德拜瓦勒因子及/或不可行的E₀ 值。在固定之前，最初嘗試2S及1C的擬合產生負德拜瓦勒因子。

表8示出PhAs(LHP)的EXAFS光譜取得自As配位的模型的模擬總結。再次最佳的擬合是配位至砷的兩個硫原子(擬合1)而取得，而不是三個硫原子(擬合2)。差的結果為對於其中As與一個硫和兩個氧原子或一個硫和兩個碳原子配位的模型獲得(未示出的擬合)。雖然包含砷與兩個硫原子和一個氧原子或一個碳原子結合的模型最初產生了不合理的德拜瓦勒因子，當此因子固定則被改善並得到很好的擬合(擬合3及擬合4)，儘管與2S及1C相比，2S及1O的擬合誤差明顯更大。因此，這些擬合4的結果示於第6圖中。 表8，固態PhAs(LHP)的EXAFS擬合結果的總結 *1S及2O伴隨1S及2C的擬合產生負德拜瓦勒因子及/或不可行的E₀ 值。在固定之前，最初嘗試2S及1C伴隨2S及1O的擬合產生負德拜瓦勒因子。

核磁共振譜法 ( Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy )

¹ H NMR與在游離胜肽AcCAYHRLRRC中的殘基共振的分配係使用組合的¹ H及¹ H 2-D COSY、TOCSY及NOESY NMR光譜數據(表9)進行。¹³ C NMR分配藉由¹ H及¹³ C 2-D COSY、TOCSY、NOESY及HMBC NMR光譜數據進行。光譜亦在相同的條件下取得自CAYHRRLRC，以具體的鑑定及指定在胜肽AcCAYHRLRRC中的每個半胱胺酸殘基。 表9，LHP的¹ H及¹³ C 化學位移分配，22 mM, 90%H₂ O, 10% D₂ O, pH 3.85,T 298.1 K

MeAs(LHP)及PhAs(LHP)的NMR光譜產生與兩個半胱胺酸相隔的所有胺基酸殘跡的相同化學位移圖案，其中存在與As結合至巰基(sulfhydryl groups)一致的化學位移(下方表10及11)。波峰亦指定為MeAs(LHP)的甲基及PhAs(LHP)的苯環。 表10，MeAs(LHP)的R基團及半胱胺酸殘基的¹ H及¹³ C 化學位移分配，22 mM, 90%H₂ O, 10% D₂ O, pH 3.85,T 298.1 K

表11，PhAs(LHP)的R基團及半胱胺酸殘基的¹ H及¹³ C 化學位移分配，22 mM, 90%H₂ O, 10% D₂ O, pH 3.85,T 298.1 K

石墨爐式原子吸收光譜儀

進行GFASS來確認As-胜肽產物的純度，並將結果示於下方表12。可以看出理論上和實驗上測定的As濃度之間的良好一致性。 表12，GFAAS數據測定本發明的各種含砷之胜肽的砷微量分析

PhAs(LHP) 的異構物的調查 方法

使用具有Prominence-i LC2030C系統控制器、自動注射器及液相層析單元的Shimadzu分析型HPLC系統進行PhAs(LHP)的純化。使用以H₂ O (0.1% TFA)平衡20分鐘後的Waters Sunfire C18管柱，5 μm, 4.6 × 250 mm (No. 186002560)。所有溶劑在使用之前藉由過濾及超音波震盪除氣。PhAs(LHP)的樣品從LHP(3 mM)及PAO(10 mM)在MilliQ水中在37°C下隔夜培養的反應以新鮮地製備。然後在注射入管柱之前經由0.2µm過濾器(Sartorius)過濾並分析以測定感興趣之分餾的沖提時間。用於最佳之波峰分離的逆相分析沖提梯度列於下方表13中。 表13，用於PhAs(LHP)分析及純化的逆相分析及製備型HPLC沖提梯度

基於取得自分析型HPLC的沖提輪廓，使用採用Shimadzu SIL-10AP自動注射器、Shimadzu LC-20AP製備液相層析、Shimadzu FCV-200AL 四元閥、Shimadzu SPD-M20A二極管陣列偵測器、Shimadzu DGU-20A5R除氣單元、Shimadzu CDM-20A通訊總線模組、LabSolutions軟體及Luna 5u C18(2)管柱(250×21.20 mm, 5 micron, Phenomenex)的製備HPLC進行PhAs(LHP)的純化。管柱以H₂ O (0.1% TFA, 20 min)平衡。根據最適化反應條件 (如自方法發展的結果所測定)製備的PhAs(LHP)溶液(6 mL)注入至管柱，並使用表13詳述的沖提梯度分離。流速維持在15 mL/min且分餾在λ 254 nm下偵測。收集主分餾並藉由ESI-MS表徵。如果需要，經鑑定的HPLC分餾使用Alpha 1-2 LDplus凍乾機乾燥以得到純化合物。結果

使用上述分離製程，證明有兩個波峰(製備型HPLC沖提於15.99及16.86分鐘，第7圖)。分離及收集時，每個波峰藉由ESI-MS鑑定為PhAs(LHP)。兩個分餾的光譜(第8圖)與ESI-MS波峰相似，其可被歸屬為LHP及PhAs(LHP)。在m/z 407.5、414.1, 610.7及619.8下展現的波峰係歸屬於LHP，並分別被鑑定為[LHP + 3H⁺ ]³⁺ 、[LHP + 2H⁺ + Na⁺ ]³⁺ 、[LHP + 2H⁺ ]²⁺ 及[LHP + 2H⁺ + H₂ O]²⁺ 。游離胜肽的存在為電離製程的結果。在m/z 457.4、463.5、685.5及696.7展現的波峰指示為PhAs(LHP)且被分別鑑定為[PhAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ 、[PhAs(LHP) + 3H⁺ + H₂ O]³⁺ 、[PhAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ 及[PhAs(LHP) + H⁺ + Na⁺ ]²⁺ 。

將來自每個分餾的所得化合物(分離並乾燥)溶解於MilliQ水(3 mM)並藉由分析型HPLC再檢驗。在每一個案例中，HPLC層析圖(第9圖)確認了如同先前在最初製備型HPLC層析圖中觀察到的兩個波峰的出現。沖提時間與PhAs(LHP)的沖提一致。此指出具有PhAs(LHP)的自發性轉化的異構體，且與結合至三個不同部分(苯基及胜肽的兩個不對稱終端)的As原子處的掌性中心一致，並含有孤電子對。此在下方指出，其中(a)為R異購物及(b)為S異構物。

As-LHP 複合物的穩定性研究 方法

As-LHP複合物的穩定性藉由XAS研究。樣品藉由將HyAs(LHP)、MeAs(LHP)或PhAs(LHP) (1.5 mM)溶解於維持在37°C的Milli-Q水中製備。在分析之前，立即將砷-胜肽溶液(600 μL)與乙二醇(300 μL)混合，以避免快速冷凍期間的結晶化。所得的溶液(最終濃度As 1 mM)藉由針筒轉移至以卡普頓膠帶密封的樣品支架。接著，樣品快速的浸入液態氮中並轉移至液態氦低溫控制器，其在10 ⁰K下進行分析。

砷的K-邊緣 XAS數據以光束能量2.5 GeV，且光束電流300-400 mA於Australian National Beamline Facility (ANBF, beamline 20B) KEK, Tsukuba, Japan收集。Si[111]通道切斷單色器調變50%以抑制諧波。所有光譜在螢光模式中於~10⁰K下(以閉路循環氦CryoIndustries REF-1577-D22低溫控制器維持)使用36元Ge陣列偵測器(Eurisys/Canberra Industries)及1-mm垂直狹縫寬度記錄。XAS光譜在零時間點及稍後的時間點4h、14h取得。來自兩個時間點的光譜使用EXAFSPAK處理及分析。

兩種最佳的As-LHP複合物的穩定性亦在細胞培養基(IMDM)中進行研究。樣品藉由將MeAs(LHP)或PhAs(LHP) (1.5 mM)溶解於維持在37 ⁰C的IMDM中製備。遵循與Milli-Q水穩定性研究的相同流程。XAS光譜在零時間點及稍後的時間點24h取得。相同於Milli-Q水樣品，來自兩個時間點的光譜使用EXAFSPAK處理、擬合及量化。結果

第10圖示出取得自在Milli-Q水中的HyAs(LHP)於兩個時間點(0h，藍色及4h，紅色)的光譜的比較。4-h樣品的光譜與得自0-h樣品的光譜完全不同，指出該複合物在Milli-Q水中4-h為不穩定的。4-h樣品的光譜相似於取得自亞砷酸鹽在Milli-Q水中的光譜，表明LHP不再結合至砷。在邊緣的位移指示砷結合至氧原子而不是硫原子(後者可能為完整(intact)的HyAs(LHP)複合物的情況)。

第11圖示出取得自Milli-Q水中的MeAs(LHP)於兩個時間點(0h，藍色及14h，紅色)的光譜。兩個光譜的93%相當於以綠色示出兩個光譜之間的小偏差所繪製的殘差。

第12圖示出取得自Milli-Q水中的PhAs(LHP)於兩個時間點(0h，藍色及14h，紅色)的光譜的比較。兩個光譜的一致性接近於100%，整個殘差非常接近於零，顯示沒有顯著的殘差特徵。此指出PhAs(LHP)複合物在Milli-Q水中14小時是穩定的。

第13圖示出取得自IMDM(細胞培養基)的MeAs(LHP)於兩個時間點(0h，藍色及24h，紅色)的光譜。兩個光譜的82%相當於以綠色示出兩個光譜之間的小偏差所繪製的殘差。最顯著的改變可清楚地在後緣波谷中看到減少。

第14圖示出取得自IMDM(細胞培養基)的PhAs(LHP)於兩個時間點(0h，藍色及24h，紅色)的光譜的比較。兩個光譜的一致性為97%具有包含較小殘差特徵的殘差(綠色)。此指出PhAs(LHP)複合物在IMDM中24小時是相當穩定的。As(LHP) 複合物的細胞毒性 (MTT) 測試 方法 細胞株及培養程序

所有細胞培養及細胞分析使用無菌技術在生物安全櫃(class II, Email Westinghouse Pty Ltd)中進行。人類慢性骨髓性白血病 (K562) 細胞

K562細胞是衍生自53歲女性的人類慢性骨髓性白血病細胞/骨髓細胞，最初取得自ATCC。由於此細胞株為LHP，預期為As-LHP複合物的標靶而被選擇。使用MTT分析建構亞砷酸鹽、AsI₃ 、PAO、LHP、HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)、乙醯胂胺、ATO、sLHP及PhAs(sLHP)的毒性及IC₅₀ 值。

K562細胞半永久性(semi-permanents)生長(購自ATCC)。細胞於含有IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s Medium, Invitrogen, 500 mL)、胎牛血清(FBS, Bovogen, Thermo Scientific, 10% v/v)及盤尼西林/鏈黴素(Gibco, Life Technologies, 10 mL/500 mL IMDM， 分別為200 IU/mL及200 μg/mL)的生長培養基(GM)中生長。K562培養物在具有75 cm² 表面積的細胞培養瓶(cell culture flasks)中於37 ⁰C、 5% CO₂ 的培養箱(Heraeus, Thermo Scientific, USA)中生長。細胞通常在每週繼代兩次。將細胞懸浮液離心(1500 rpm, 5 mins, Heraeus Labofuge 300)，將顆粒(pellet)再懸浮於GM(5 mL)中，並在細胞培養瓶中的GM (25 mL)加入2滴。人類急性前骨髓性白血病 (HL-60) 細胞

HL-60細胞為衍生自患有急性前骨髓性白血病的36歲高加索人女性的人類急性前骨髓性白血病細胞。HL-60細胞半永久性生長(最初購自ATCC)。這些APL細胞為已知藉由CAYHRLRRC胜肽標靶且代表了目前用As療法，即ATO治療症狀的另一白血病細胞株。細胞於含有IMDM(500 mL)、FBS( 20% v/v)及盤尼西林/鏈黴素(10 mL/500 mL IMDM， 分別為200 IU/mL及200 μg/mL)的生長培養基(GMH)中生長。細胞通常使用GMH以相同於K562細胞的方式在每週繼代兩次。人類急性骨髓母細胞性白血病 ( Kasumi-1 ) 細胞

Kasumi-1細胞購自澳洲細胞銀行(CellBank Australia)。Kasumi-1細胞為衍生自7歲日本男性的人類急性骨髓母細胞性白血病細胞/骨髓細胞，此細胞株被選擇以探究PhAs(LHP)作為治療AML的潛力。Kasumi-1細胞於含有RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute Medium, Invitrogen, 500 mL)、FBS(20% v/v)及盤尼西林/鏈黴素(10 mL/500 mL IMDM，分別為200 IU/mL及200 μg/mL)的生長培養基(GM1)中生長。Kasumi-1細胞在具有75 cm² 表面積的細胞培養瓶中於37 ⁰C、 5% CO₂ 的培養箱中生長。細胞通常在每週繼代兩次。簡言之，一半的細胞懸浮液以新鮮的GM1取代以維持細胞密度介於3 × 10⁵ 及3 × 10⁶ cells/mL之間。人類 T- 細胞白血病 (KARPAS 45) 細胞

KARPAS 45細胞是衍生自在治療前之2歲男性的人類T-細胞白血病細胞/骨髓細胞，且在含有RPMI-1640、FBS (20% v/v)、麩醯胺酸(Glutamine)(2mM, Gibco, Life Technologies)及盤尼西林/鏈黴素(10 mL/500 mL IMDM，分別為200 IU/mL及200 μg/mL)的生長培養基(GMK)中半永久性生長(購自澳洲細胞銀行)。KARPAS 45培養物在具有75 cm² 表面積的細胞培養瓶中於 37 ⁰C、 5% CO₂ 的培養箱中生長。細胞通常藉由替換一半體積的新鮮GMK每週繼代兩次。人類肝癌 ( HepG2) 細胞

HepG2細胞為衍生自15歲高加索男性的人類肝癌細胞。該細胞為貼附型上皮樣細胞，且半永久性生長(最初購自ATCC)。細胞於含有DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium, Life Technologies, 500 mL)、FBS(50 mL, 10% v/v)及盤尼西林/鏈黴素(10 mL，分別為200 IU/mL及200 µg/mL)的生長培養基(GMA)中生長。細胞在達到飽和(confluence)之前繼代，通常在每週繼代兩次。移除細胞培養基、捨棄並將細胞以PBS潤洗，之後亦將PBS移除及捨棄。加入胰蛋白酶(Trypsin) (5 mL, 在PBS中0.25% w/v, Gibco, Life Technologies)並將培養瓶培養直到細胞分離(detached)。加入GMA (5 mL)至培養瓶中並將培養瓶中的內容物轉移至無菌管並離心(1500 rpm, 5分鐘)。接著移除上清液，顆粒再懸浮於GMA (5 mL)中並加入1-2滴細胞溶液至細胞培養瓶中的GMA (25 mL)。A549 人類肺癌細胞

A549細胞為衍生自58歲男性的人類肺癌細胞。該細胞為貼附型上皮樣細胞，且半永久性生長，購自澳洲細胞銀行。細胞以相同於上述HepG2細胞的方式生長並繼代。這些細胞亦被選作為代表自固體腫瘤衍生之快速生長的細胞，其不應該被As-胜肽複合物辨識或標靶。中國倉鼠固體腫瘤細胞

中國倉鼠(CH)固體腫瘤細胞被選擇作為非人類細胞株(不應該被標靶)。該細胞貼附型上皮樣細胞，且半永久性生長。細胞以相同於上述HepG2細胞的方式生長並繼代。人類週邊血液單核細胞 (hPBMC)

從健康志願者中抽取血液(40 mL)。將無菌PBS(40 mL)加入20 mL的血液中。每管翻轉3-4次以混合。血液下放置有接近15 mL的Ficoll-PaqueTM PLUS (GE Healthcare)並離心(1700 rpm, Heraeus Labofuge 400 R centrifuge)30分鐘(解除制動(brake off))。單核細胞層轉移至新的管中並以無菌PBS(50 mL)沖洗兩次。該管子輕輕地翻轉以混合之後離心(1500 rpm, 15分鐘)。單核細胞於PBS(等於原始血液的體積)中再懸浮並以血球計(haemocytometer)計數。離心之後，細胞再懸浮於足夠的RPMI-1640以產生所需的細胞群。進行校準分析並使用hPBMC測得10⁶ cells/well用於MTT分析控制組產生最佳的吸光值(1.00-2.00)。MTT 細胞毒性分析

藉由MTT分析的適應性評估化合物的細胞毒性，MTT分析描述於Carmichaelet al . (Cancer Res. 1987 ,47 , 936) and Mosman (J. Immunol. Methods 1983 ,65 , 55)。MTT分析係基於藉由肝細胞將四唑鹽(tetrazolium salt)變成甲臢(formazan)的轉化並允許細胞存活率被經由比色評估(colourimetric assessment)定量。此分析建立每個化合物的IC₅₀ 以能夠比較不同化合物對於分析中使用的細胞株之毒性。此分析用於比較砷胜肽複合物與其他砷化合物的毒性以檢驗其標靶能力及作為抗白血病治療的潛力。如前所述，藉由MTT分析評估PhAs(LHP)的兩個異構物在K562及HL-60細胞的細胞毒性。處理溶液在處理之前立即在IMDM中新鮮製備並序列稀釋。

執行細胞毒性分析以測試亞砷酸鈉(亞砷酸鹽，Sigma Aldrich)、氧化苯胂(PAO， Sigma Aldrich)、AsI₃ 、乙醯胂胺(醋醯胺胂(acetarsone)，Sigma Aldrich)、ATO(取得自Phebra的Phenasen配方)、亂序LHP (sLHP)、LHP(兩者皆取得自Peptide 2.0, USA)、PhAs(LHP)及PhAs(sLHP)的各種濃度範圍。用於 K562 細胞之 MTT 細胞毒性分析之流程

在60-mm細胞培養盤中將K-562細胞(8 × 10⁵ cells)接種於生長培養基(5 mL)中，並在37 °C、5% CO₂ 培養24小時。所測試的化合物為亞砷酸鹽、AsI₃ 、ATO、乙醯胂胺、LHP、HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)、sLHP及PhAs(sLHP)。處理溶液在處理之前立即製備在IMDM中。化合物在IMDM中序列稀釋以達到用於分析的濃度範圍。各盤中的細胞懸浮液經離心(1200 rpm, 5分鐘, Heraeus Labofuge 300)以及顆粒再懸浮於處理溶液(3 mL)中，或控制組細胞的情況下於IMDM (3 mL)中，並回到盤中培養(37 °C, 5% CO₂ )。24小之後細胞溶液經離心(1200 rpm, 5 分鐘)。細胞藉由額外的無菌PBS沖洗兩次，接著離心(1200 rpm, 5 分鐘)。細胞再懸浮於IMDM(5 mL)中並返回新鮮的盤。在每個盤中加入MTT (400 µL, 2 mg/mL, IMDM)並培養該盤。4小時之後離心(1200 rpm, 5 分鐘)溶液，並在顆粒中加入DMSO(1.8 mL)以溶解甲䐶晶體。每一溶液吸移至96孔盤(1 tube/column, Cellstar, Greiner Bio-one, Australia)。用於 HL-60 細胞之 MTT 細胞毒性分析之流程

所測試的化合物包括：亞砷酸鹽、ATO、乙醯胂胺、LHP、PhAs(LHP)、Slhp及PhAs(sLHP)。由於胜肽的費用及PhAs(LHP)複合物經改善的穩定性超越HyAs(LHP)及MeAs(LHP)，決定不再進行後兩個複合物的測試。處理溶液在處理之前立即在IMDM中新鮮製備。化合物在IMDM中序列稀釋以達到用於分析的濃度範圍。由於細胞經由在盤與管子之間的轉移而流失，藉由Tadaet al. (J. Immunol. Methods 1986 ,93 , 157)之MTT流程替代最初以K562細胞試驗。由於確定所得的IC₅₀ 值與先前的方法相當，以將用於MTT分析的新流程導入HL-60細胞。在每孔(第2-7列，第B-I行，96孔平底盤，Greiner)中加入HL-60細胞溶液(2 × 10⁵ cells/50 µL, IMDM)。接著，在3-11行(在第3行中最稀釋，在第11行中最濃縮)中的每一個孔加入處理溶液(50 mL)，同時在控制組孔(第2行)中加入IMDM (50 mL)。該盤培養24小時(37 °C, 5% CO₂ )，之後在每個孔中加入MTT溶液(20 μL, 5 mg/mL, IMDM)並將盤放回培養箱使甲臢發生。4小時之後，在每個孔中加入增溶溶液(100 µL, 10% SDS in 0.01 M HCL)並將盤培養隔夜。用於 Kasumi-1 細胞之 MTT 細胞毒性分析之流程

Kasumi-1細胞以密度2 x 10⁵ cells/well接種。所評估的化合物包括：偏亞砷酸鈉(sodium meta arsenite)(亞砷酸鹽，Sigma Aldrich)、三氧化二砷(ATO, Phebra)、氧化苯胂(PAO, Sigma Aldrich)、取得自Peptide 2.0, USA的白血病導引胜肽(LHP)及亂序白血病導引胜肽(sLHP)；及經合成、純化及表徵的PhAs(LHP)及PhAs(sLHP)。處理溶液在處理之前立即在RPMI-1640中新鮮製備。化合物在RPMI-1640中序列稀釋以達到用於分析的濃度範圍。MTT分析以相同於HL-60細胞的方式執行至少3次，以得到IC₅₀ 值的平均值及標準差。用於 KARPAS 45 細胞之 MTT 細胞毒性分析之流程

處理溶液在處理之前立即在RPMI-1640中新鮮製備且化合物在RPMI-1640中序列稀釋以達到用於分析的濃度範圍。所測試的化合物為亞砷酸鹽、ATO、乙醯胂胺、LHP、PhAs(LHP)、sLHP及PhAs(sLHP)。在每孔(第2-4列，第B-I行，96孔平底盤，Greiner)中加入KARPAS 45細胞溶液(6 x 10⁵ cells/50 µL, RPMI-1640)。在3-11行(在第3行中最稀釋，在第11行中最濃縮)中的每一個孔加入處理溶液(50 mL)，同時在控制組孔(第2行)中加入RPMI-1640 (50 mL)。除了MTT溶液在RPMI-1640中製備之外，其餘的分析與前述段落描述的HL-60細胞相同的方式進行。用於 HepG2 、 A549 及中國倉鼠固體腫瘤 細胞之 MTT 細胞毒性分析之流程

在每孔(第2-7列，第B-I行，96孔平底盤，Greiner)中加入細胞溶液(1 x 10⁴ cells/100 µL GMA)並培養24小時。移除GMA並將新鮮製備的處理溶液(100 mL，以DMEM序列稀釋的化合物)加入第3-11行(在第3行中最稀釋，在第11行中最濃縮)中的每一個孔中，同時在控制組孔(第2行)中加入DMEM (100 mL)。所測試的化合物為亞砷酸鹽、ATO、PAO、乙醯胂胺、LHP及PhAs(LHP)。除了MTT溶液使用DMEM製備之外，其餘的分析使用與用於HL-60細胞相同的流程進行。用於 hPBMC 細胞之 MTT 細胞毒性分析之流程

處理溶液在處理當天以相同於HL-60細胞的方式新鮮製備。所測試的化合物為亞砷酸鹽、ATO、PAO、乙醯胂胺、LHP及PhAs(LHP)。在每孔(第2-4列，第B-I行，96孔平底盤，Greiner)中加入hPBMC細胞溶液(1 x 10⁶ cells/50 µL, RPMI-1640)且其餘分析使用如同用於HL-60細胞之相同的流程進行。MTT 比色評估及 IC₅₀ 計算 用於 K562 細胞測定之比色評估及計算

測定在570 nm及630 nm的吸光值(BMG LabTech Polarstar Omega microplate reader)。然後，藉由方程式1測定細胞存活率。

方程式1

經計算的細胞存活率(cell viability)相對於處理濃度製圖，以測定每個種類的IC₅₀ 值。所有MTT分析執行至少3次，以提供進行統計分析所需要之必要檢力(necessary power)。統計分析使用單向ANOVA分析(one-way ANOVA)及圖奇氏多重比較試驗(Tukey’s multiple comparison test)(GraphPad Prism)進行。用於 HL-60 、 Kasumi-1 、 KARPAS 45 、 HepG2 、 A549 、 CH 固體腫瘤 細胞及 hPBMC 之比色評估及計算

吸光值讀值在570 nm及690 nm紀錄(BMG LabTech Polarstar Omega microplate reader)並產生濃度-反應曲線(使用方程式2以計算細胞存活率)以計算每個化合物的IC₅₀ 值。除非另有指定，MTT分析執行至少3次。統計分析使用單向ANOVA分析及圖奇氏多重比較試驗進行(GraphPad Prism)。

方程式2結果 PhAs(LHP) 的異構物 對 K562 及 HL60 細胞 的 MTT 結果及 IC₅₀ 值

從PhAs(LHP)異構物分餾對K562及HL60細胞兩者的MTT細胞毒性研究所得到的IC₅₀ 值指出從每個HPLC分餾所得到的產物展現相同的毒性(表14) 表14，取得自兩個鑑定為PhAs(LHP)的分餾所得化合物之MTT細胞毒性分析的IC₅₀ 值

*結果以三次分析測定的平均值與標準差表示

由於證明外消旋作用發生在室溫及室溫以上，且此並不影響生物活性，所有進一步的測試在外消旋混合物(未判定異構物的分餾)上執行。對於 K562 細胞 的 MTT 結果及 IC₅₀ 值

在K562細胞上經24小時培養之後從MTT分析所得到的濃度-反應曲線示於第15圖中。砷處理導致細胞死亡，產生對於主要化合物測試的典型濃度-反應曲線。對於K562細胞以亞砷酸鹽、AsI₃ 、ATO、PAO、HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)及PhAs(sLHP) 24小時處理之後所得的IC₅₀ 值示於第16圖及表15中。對於亞砷酸鹽及AsI₃ 的IC₅₀ 值非常相似(分別為18.63 ± 0.49 µM及18.14 ± 0.75 µM)。ATO處理產生了9.74 ± 0.16 µM的IC₅₀ 值，大約為亞砷酸鹽(NaAsO₂ )的一半，其與ATO含有亞砷酸鹽的兩倍砷原子的情況一致。PAO(IC₅₀ : 3.40 ± 0.42 µM)比ATO多三倍的毒性，指出由於與苯基的存在相關的親脂性增加，可能使該化合物的攝取更多。此外，苯基可為直接參與細胞標靶的交互作用。 表15，自K562細胞經24小時處理之後的三重複MTT分析所取得的IC₅₀ 值

值得注意的是，HyAs(LHP)處理產生的IC₅₀ (6.21 ± 0.47 µM)是ATO的60%，即使其含有ATO一半數目的砷原子。此表明胜肽的存在可對HyAs(LHP)的攝取有貢獻；然而，該複合物較差的穩定性更可能影響毒性。取得自MeAs(LHP) (IC₅₀ : 3.74 ± 0.17 µM)的IC₅₀ 值為HyAs(LHP)的60%及ATO的37%，由於在砷上存在甲基而對此化合物額外的穩定性具有貢獻。PhAs(LHP)被證實為最具毒性的所測試化合物(IC₅₀ : 0.487 ± 0.025 µM)。苯環的存在亦增加了此複合物的穩定性。其毒性較ATO高20倍且較PAO高7倍。有趣的是，具有亂序胜肽的砷化合物(PhAs(sLHP), IC₅₀ : 790 ± 32 µM)被證實在K562細胞中為較PhAs(LHP)低1600倍的毒性，指出胜肽的組態在PhAs(LHP)對K562細胞的毒性扮演重要的角色。

乙醯胂胺測試高達1000µM且無法產生50%抑制，具有60.5%的K562細胞仍在此高濃度下存活。在1000µM，乙醯胂胺使溶液酸化(培養基轉變為黃色，pH 6.87)，因此很有可能是低pH造成細胞數目的降低而不是化合物本身。由於pH的改變，沒有測試更高的濃度來建立IC₅₀ 。高達1000µM的LHP及sLHP對K562細胞沒有毒性，且因此無法建立由As(LHP)複合物所展現的毒性。在所有MTT分析中，此些化合物的細胞存活率維持在接近或大於100%。

統計比較每種化合物建立的IC₅₀ 值。PhAs(sLHP)的值統計上高於其他所有化合物(P ＜0.0001)。由於PhAs(sLHP)的IC₅₀ 值及對應的標準差大，因而省略此化合物與其他化合物的IC₅₀ 值之間的統計比較結果。表16包含統計分析結果。

亞砷酸鹽及AsI₃ 的IC₅₀ 值彼此並無顯著的差異。相似地，取得自PAO及MeAs(LHP)的值並沒有顯著差異。重要地，分析顯示所有其他化合物的IC₅₀ 值之間的差異具有統計意義(P ＜0.0001)。 表16，比較取得自K562細胞24小時處理之後的MTT分析之IC₅₀ 值的統計分析結果

對於 HL-60 細胞 的 MTT 結果及 IC₅₀ 值

對於HL-60細胞以亞砷酸鹽、ATO、PAO、PhAs(LHP)及PhAs(sLHP) 24小時處理之後所得的IC₅₀ 值示於表17中。ATO產生的IC₅₀ 值(7.0 ± 0.1 µM)小於取得自亞砷酸鹽的IC₅₀ 值(20 ± 1 µM)的一半，其與ATO含有亞砷酸鹽的兩倍砷原子數量的情況一致。事實上，並不精確是一半，表明陰離子在兩種細胞株中是經由不同模式，藉由不同的攝取機制或毒性作用模式。取得自PAO的IC₅₀ 值(1.5 ± 0.3 µM)大約為亞砷酸鹽的十三分之一且大約為ATO之IC₅₀ 值的四分之一。感興趣的化合物PhAs(LHP)具有0.5 ± 0.1 µM的IC₅₀ 值，示出對於HL-60細胞，其毒性比PAO起始材料大三倍，表示LHP的存在可能有助於這些細胞的攝取及/或毒性。此藉由展現205 ± 4 µM的IC₅₀ 值的亂序胜肽化合物PhAs(sLHP)的結果再次被支持，其為PAO的130倍及PhAs(LHP)的超過四百倍。大的IC₅₀ 值表明超大量的亂序胜肽非常可能阻礙攝取，因此阻礙細胞毒性的活性。進行攝取分析以進一步探究這些結果。

測試LHP及sLHP胜肽，但在整個測試濃度範圍內，高達1000 μM時細胞存活率仍維持在接近100%而不具毒性。乙醯胂胺在測試高達1000 μM時未能誘導毒性以取得所需IC₅₀ 值。

每個化合物的IC₅₀ 值跨組統計比較，且不意外地PhAs(sLHP)的值與所有其他砷化合物的分析具有統計差異(P ＜0.0001)。由於大的PhAs(sLHP)的IC₅₀ 值，將省略此化合物的結果與其他化合物進行統計分析。重要的是，如表17所列，分析顯示大多數結果之間的差異具有統計學意義。發現亞砷酸鹽的IC₅₀ 值與所有其他所測試化合物具有顯著差異(對所有其他化合物P ＜0.0001)。ATO亦被發現與所有其他化合物具有顯著差異(P ＜0.0001)，但PAO與PhAs(LHP)沒有顯著差異。 表17，比較取得自HL-60細胞24小時處理之後的MTT分析之IC₅₀ 值的統計分析結果

對於 Kasumi-1 細胞 的 MTT 結果及 IC₅₀ 值

所有砷處理產生典型的濃度-反應曲線。對於亞砷酸鹽、ATO、PAO、PhAs(LHP)及PhAs(sLHP)的IC₅₀ 值總結於第18圖中。前體胜肽LHP及sLHP在Kasumi-1細胞中在高達1000 μM時無毒性。對於這些胜肽的每個皆進行三次MTT分析，MTT轉化的百分比維持接近或大於100%。

所測試最低毒性的砷化合物為PhAs(sLHP) (IC₅₀ =650 ± 0.6 µM)且顯著低於所有其他所測試砷化合物的毒性(表18)。此大的IC₅₀ 值指出配位的非標靶胜肽不被這些細胞所辨識，且其大量的存在抑制了細胞的攝取。PhAs(sLHP)之大的IC₅₀ 值從其他As化合物之IC₅₀ 值的統計分析中排除，以避免此大數目扭曲分析。感興趣的化合物PhAs(LHP) (IC₅₀ =1.4 ± 0.1 µM)比PAO(IC₅₀ =5.1 ± 0.5 µM,P ＜0.001)的毒性多3.6倍，指出該胜肽可能有助於這些細胞攝取As。其大約比ATO (61 ± 1 µM,P ＜0.001)的毒性多40倍。PhAs(LHP)大約比含有亂序胜肽的類似化合物PhAs(sLHP)的毒性多460倍 (P ＜0.001)，指出胜肽的組態在PhAs(LHP)對這些細胞的毒性中扮演重要的角色。

這些結果表明PhAs(LHP)使用於治療目前表現出較差的治癒率(僅27%的存活率)的AML之用途的潛力。 表18，比較取得自Kasumi-1細胞24小時處理之後的MTT分析之IC₅₀ 值的統計分析結果

對於 KARPAS 45 細胞 的 MTT 結果及 IC₅₀ 值

對於KARPAS 45 細胞以亞砷酸鹽、ATO、PAO、PhAs(LHP)及PhAs(sLHP)24小時處理之後所得的IC₅₀ 值示於表19中。ATO的IC₅₀ 值(IC₅₀ : 15.1 ± 1.8 µM)意外地為亞砷酸鹽之值(IC₅₀ : 66.2 ± 2.6 µM)的23%，表明陰離子在此細胞株中作用不同於ATO，或藉由攝取機制或作用模式。PAO (IC₅₀ : 5.1 ± 2.3 µM)大約比ATO的毒性多三倍，指出毒性藉由親脂性影響而影響該化合物的攝取。或者，PAO在此細胞中較具毒性。感興趣的化合物PhAs(LHP) (IC₅₀ : 7.8 ± 1.2 µM)大約是ATO的兩倍毒性，但稍低於PAO的毒性。當與砷亂序胜肽的結果比較時，此可置於上下文中。具有亂序胜肽的砷化合物(PhAs(sLHP)，IC₅₀ : 248 ± 19 µM)被證實在KARPAS 45細胞中較PhAs(LHP)的毒性低32倍，指出胜肽的組態在PhAs(LHP)對這些細胞的毒性中必定扮演種藥的角色。此亦示出較大的分子量(得自胜肽)降低攝取，除非該胜肽呈現正確組態以標靶巨胞飲途徑(macropinocytotic pathway)。

乙醯胂胺在測試高達1000 μM時仍未能產生IC₅₀ 值。由於細胞培養基之pH的改變，而不測試更高的濃度。LHP及sLHP在KARPAS 45細胞中在高達1000 μM時無毒性。在所有三次MTT分析中，此些胜肽兩側的細胞存活率維持接近或大於100%。

化合物的IC₅₀ 值跨組統計比較。PhAs(sLHP)的值與所有其他化合物具有統計差異(P ＜0.0001)。由於PhAs(sLHP)的IC₅₀ 值及對應的標準差大，將省略此化合物的結果與其他化合物的IC₅₀ 值之間的統計比較。重要的是，如表19所列，分析顯示大多數結果之間的差異具有統計學意義。發現亞砷酸鹽的IC₅₀ 值與所有其他所測試化合物具有顯著差異(P ＜0.0001)。關於PAO的IC₅₀ 值顯著低於ATO (P ＜0.001)，但並沒有發現顯著低於PhAs(LHP)。PhAs(LHP) 的IC₅₀ 值顯著低於ATO (P ＜0.05)及亞砷酸鹽(P ＜0.0001)。 表19，比較取得自KARPAS 45細胞24小時處理之後的MTT分析之IC₅₀ 值的統計分析結果

對於 HepG2 細胞 的 MTT 結果及 IC₅₀ 值

第20圖示出取得自HepG2細胞處理24小時後的MTT分析之亞砷酸鹽、PAO、ATO及PhAs(LHP)的IC₅₀ 值。ATO產生52 ± 3 µM的IC₅₀ 值，其較具有89 ± 1 µM之IC₅₀ 值的亞砷酸鹽的毒性多1.7倍。感興趣的化合物PhAs(LHP)產生非常高的IC₅₀ 值(978 ± 11 µM)且較ATO (IC₅₀ : 52 ± 3 µM)的毒性低約19倍及較PAO (IC₅₀ : 0.63 ± 0.01 µM)的毒性低超過1500倍。由於PAO為PhAs(LHP)的起始物質，這些結果再次強烈地指出對白血病導引胜肽的接合在PhAs(LHP)對細胞的標靶能力及毒性中扮演重要的角色，並再次表示較大分子量複合物PhAs(LHP)對不識別此胜肽的細胞無毒性。

乙醯胂胺及LHP兩著在測試高達1000 μM時未能產生IC₅₀ 值。而HepG2細胞的存活率在這些化合物每一個所有三次MTT分析中維持接近或大於100%。

取得自HepG2細胞24小時處理之後的MTT分析之IC₅₀ 值跨組統計比較且發現PhAs(sLHP)的值與所有其他化合物相比具有顯著差異(P ＜0.0001)。PhAs(LHP) 對於 A549 人類肺癌細胞 的 IC₅₀ 值

在A569細胞中PhAs(LHP)的IC₅₀ 值為234 ± 5µM。再次示出該複合物對人類固體腫瘤細胞相對於白血病細胞相對地毒性較低。對於 CH 固體腫瘤細胞 的 MTT 結果及 IC₅₀ 值

自亞砷酸鹽、PAO、ATO及PhAs(LHP)在CH固體腫瘤細胞中處理24小時後所取得的IC₅₀ 值示於第21圖中。感興趣的化合物PhAs(LHP)產生高的IC₅₀ (770 ± 12 µM)且為較ATO (IC₅₀ : 23.3 ± 0.9 µM)的毒性低約34倍及較PAO (IC₅₀ : 1.49 ± 0.03 µM)的毒性低超過500倍。此表明PhAs(LHP)複合物的較大分子量降低細胞攝取；其為被預期的，由於胜肽不應被用於非人類腫瘤細胞的巨胞飲途徑的攝取的受體識別。

乙醯胂胺在測試高達1000 μM時未能產生IC₅₀ 值。LHP對CH固體腫瘤細胞高達1000 μM時無毒性。這些化合物的細胞存活率在三重複的MTT分析中皆維持接近或大於100%。

每個化合物的IC₅₀ 值跨組統計比較且PhAs(sLHP)的值顯著高於所有其他砷化合物分析(P ＜0.0001)。對於 hPBMC 細胞 的 MTT 結果及 IC₅₀ 值

第22圖示出自亞砷酸鹽、ATO、PAO及PhAs(LHP)及PhAs(sLHP)在hPBMC細胞中處理24小時後所取得的IC₅₀ 值。有趣的是，ATO產生IC₅₀ 值(81.7 ± 4.0 µM)大約是亞砷酸鹽(40.1 ± 7.7 µM)所獲得的IC₅₀ 值的兩倍，儘管其含有亞砷酸鹽兩倍數目的砷原子。再次表明陰離子以不同的方式作用於這兩種細胞株；藉由不同的攝取機制或毒性作用模式。具有IC₅₀ 值9.3 ± 3.3 µM的PAO是最具毒性的化合物，其IC₅₀ 值為亞砷酸鹽的約四分之一及ATO的約十分之一。

最重要的是，感興趣的化合物PhAs(LHP)產生495 ± 6 µM的高IC₅₀ 值。此似乎確認了該胜肽對白血病細胞的標靶能力超過健康細胞。

乙醯胂胺及LHP兩著在測試高達1000 μM時再次未能產生IC₅₀ 值。

自hPBMC進行24小時處理後所取得的IC₅₀ 值進行的統計分析結果列於表20。發現每個化合物與其他數值的每一個具有顯著差異(P ＜0.0001)。 表20，比較取得自hPBMC細胞24小時處理之後的MTT分析之IC₅₀ 值的統計分析結果

所測試之砷化合物跨越各種細胞株之 IC₅₀ 值的比較

表21示出取得自以四種特定的砷化合物在六種不同細胞株中處理24小時之後的MTT分析之IC₅₀ 值的總結。亞砷酸鹽在7種細胞株中的IC₅₀ 值範圍在K562細胞的18.6 ± 0.5 µM與HepG2細胞的89 ± 1 µM之間。用亞砷酸鹽處理後，白血病和非白血病細胞類型之間似乎沒有明顯差異。令人意外地，亞砷酸鹽對快速生長的HepG2細胞的毒性低於對於靜態的hPBMC的毒性。

ATO產生的IC₅₀ 值範圍自HL-60細胞的7.0 ± 0.1µM至hPBMC的82 ± 4。由於hPBMC為靜態細胞(static cells)，在這些數值中的差異並不意外，因為砷與許多細胞分裂分子的相互作用為已知，例如，無微管蛋白及這些標靶在靜態細胞中為不可用的。ATO在K562細胞、HL-60細胞及KARPAS 45細胞中顯示稍高的毒性(分別為9.7 ± 0.2 µM、7.0 ± 0.1 µM及15 ± 2 µM)。對的Kasumi-1細胞(61 ±1 µM)、HepG2細胞(52 ± 3 µM)及hPBMC (82 ± 4 µM)的毒性顯著較低。

PAO產生範圍在0.63 ± 0.01 µM與 9 ± 3 µM之間的低µM IC₅₀ 值。如先前所提及的，由於苯基的存在，對所有細胞類型的高毒性非常可能與親脂性的增加相關。

所有取得自砷亂序胜肽複合物PhAs(sLHP)的IC₅₀ 值非常大，其範圍從HL-60細胞的205 ± 4 μM到HepG2細胞的960 ± 10 μM (表21)。 表21，取得自特定的砷化合物對細胞株24小時處理後的MTT分析之IC₅₀ 值(µM)的比較

^† LHP 標靶：*** 經高度辨識之標靶，** 經辨識之標靶，? 未知.

相較於非白血病細胞，PhAs(LHP)對白血病細胞的高選擇毒性(如第23圖中所示)是值得注意的。PhAs(LHP)對兩者骨髓性白血病K562細胞及HL-60細胞展現在nM範圍的IC₅₀ 值，其具有IC₅₀ 值較hPBMC高大約1000倍、較CH固體腫瘤細胞高大約1500倍、較HepG2細胞高接近2000倍及較A549細胞高470倍，指出此化合物作為用於治療骨髓性白血病的潛力。於Kasumi-1的結果特別有效。雖然PhAs(LHP)對淋巴白血病KARPAS 45細胞並未展現於nM範圍的IC₅₀ 值，但該IC₅₀ 值為較hPBMC高大約64倍，指出此化合物良好的治療範圍(therapeutic window)，使其亦可為用於T-細胞白血病的潛在治療。

對於白血病癌細胞與纖維母細胞之結果之間的巨大差異可指出PhAs(LHP)對組織的毒性較低。令人意外地，取得自快速生長之非白血病HepG2細胞的IC₅₀ 值遠大於取得自靜態hPBMC的值，顯示PhAs(LHP)可降低一般以砷對快速生長細胞治療的毒性相關之副作用的可能性。為進一步檢驗此假設，將需要進行動物測試及組織養品的分析。不同細胞類型經 24 小時砷處理之後砷攝取的總結

第24圖總結以各種As化合物(1.5 μM As)處理24小時之後，與不同細胞類型相關的細胞內As濃度。白血病細胞株K562、HL-60、Kasumi-1及KARPAS 45以紅色描繪(填充在區塊中較淺的)，及非白血病細胞類型以黑色描繪(最深的陰影)，以及斜條紋描繪的癌貼附型細胞HepG2及以純黑色描繪的正常細胞hPBMC。

PhAs(LHP)處理之後，在四種白血病細胞株(K562、HL-60、Kasumi-1及KARPAS 45)中偵測到顯著的(P ＜0.001)細胞內As濃度，但最重要的是關於非標靶的惡性細胞HepG2或非標靶的、正常、非癌症的hPBMC中沒有偵測到細胞內As濃度。在Kasumi-1細胞中，以PhAs(LHP)處理的細胞內As濃度最高。此濃度較K562(P ＜0.05)的細胞內As濃度高1.2倍、較HL-60細胞(P ＜0.001)高1.4倍及較KARPAS 45細胞 (P ＜0.001)的細胞內As濃度高4倍。

以PhAs(sLHP)處理得到在任何所試的細胞類型中沒有偵測到As攝取的結果，指出As-胜肽的攝取高度取決於胜肽的胺基酸序列。

以亞砷酸鹽處理之後的細胞內As濃度皆非常小(＜4×10^-14 g/cell)。與KARPAS 45細胞相關的最高細胞內As濃度較與HepG2細胞相關的最小濃度高2.2倍。在HepG2細胞中的濃度顯著低於所觀察到的所有其他細胞類型(P ＜0.01)。在hPBMC中也沒有可識別的趨勢。

有趣的是，ATO處理得到在白血病細胞及在正常hPBMC中攝取高於貼附型癌症細胞株HepG2的結果。與K562、HL-60細胞及hPBMC相關的細胞內As濃度相似(P ＞0.05)。最高的細胞內As濃度在Kasumi-1細胞中發現，顯著的高於與每個其他細胞類型相關的細胞內As濃度(P ＜0.001)。其較與HepG2細胞相關的細胞內As濃度高5.5倍。

PAO處理後細胞內As濃度明顯有大的變異，HepG2細胞現在表現出較所有其他細胞類型顯著更高的As濃度(P ＜0.001)。此濃度較經PAO處理的hPBMC的細胞內As濃度高2.2倍、較K562細胞高3.8倍、較Kasumi-1細胞高3.9倍、較KARPAS 45細胞高4.8倍及較HL-60細胞高7.6倍。有趣的是，第二高的細胞內As濃度以hPBMC表現，其顯著高於與白血病細胞株相關的細胞內As濃度(P ＜0.001)。調查 PhAs(LHP) 在白血病細胞中的結果 (fate) 方法

K562及HL-60細胞株如先前所述取得及維持。戊二醛(Glutaraldehyde)(25%溶液)、Spurr's低黏度嵌入樹脂、3‑mm 金探測網(gold Finder grids)及甲苯胺藍(toluidine blue)來自Proscitech (Kirwan, Australia)。使用先前所描述的程序製備薄切片細胞用於微探針SRXRF分析。簡言之，細胞在細胞培養瓶(75 cm² )中以IMDM (用於控制組細胞，4小時或24小時)或PhAs(LHP) (在IMDM中10 μM，4小時或24小時)處理。使用離心將細胞以PBS沖洗(2次)並將最終細胞顆粒固定在戊二醛(1 mL, 2% v/v in PBS)中室溫下2小時，並以在乙醇(30% ×2、50% ×2、70% ×2、80% ×2、 90% ×2、 95% ×2、100% ×4)中脫水(dehydrated)。藉由搖動在50%乙醇/50% Spurr’s 樹脂中的細胞隔夜來達到浸潤，及然後以100%Spurr’s 樹脂(×2超過2天)置換，以確保移除水的所有痕跡跡線。在最後一天時，細胞嵌入100%Spurr’s 樹脂中，離心(8000g , 1 h)及在Beem膠囊(Beem capsule)中60 °C下固化隔夜。細胞顆粒的薄片(1 µm)使用超薄切片機(ultramicrotome)(Leica EM UC7)裁切。在固定於氮化矽薄膜之前，薄切片以甲苯胺藍染色。

將金探測網連接到設計以擬合光學顯微鏡(Leica DMXRE Epi-fluorescence/visual microscope)與X射線微探針(2-ID-D)兩者的運動支架(kinematic mounts)。獲得光學顯微照片及XY坐標以定位用於分析的適合細胞。展現完整的外觀、明確定義的核且位在遠離其他細胞及細胞碎片的細胞被選擇用於分析。

微探針SR-XRF在Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA)處的先進光子源(Advanced Photon Source)的光束線2-ID-D進行。11.9-keV X-射線光束使用兩個區域板集中於0.3 × 0.3 µm² 的光點大小。將樣品置於氦氣氛中，且從P(2.1 keV)至As(11.9 keV)的元素分布藉由利用XYZ電動平台以0.3 µm間距(steps)光柵掃描樣品來映射(mapped)。螢光X-射線使用2.5 s/pt的滯留時間及能量分散Vortex EM (Hitachi High-Technologies Science America, Northridge, CA)矽漂移偵測器(silicon drift detector)偵測。元素分布圖使用MAPS Version 1.7.3.02軟體套件(S. Vogt, Advanced Photon Source)處理。藉由將X-射線螢光強度與薄膜標準品NBS-1832及NBS-1833(NIST, Gaithersburg, MD, USA)的X-射線螢光強度進行比較，將元素螢光強度轉換為每平方公分微克的絕對密度(µg/cm² )。結果

第25圖示出取得自PhAs(LHP)標準品及經PhAs(LHP)處理的K562細胞(24小時)的As K-邊緣光譜。恆定的邊緣能量指出細胞內As在24小時中維持為As(III)。後緣區域的改變表明As-S鍵結的一些修飾。例如，其能夠反應白血病導引胜肽與PhAs的解離且其隨後與細胞內其他生物分子結合。

第26圖示出取得自PhAs(LHP)標準品及經PhAs(LHP)處理的HL-60細胞(24小時)的As K-邊緣光譜。所觀察到經PhAs(LHP)處理的K562細胞樣品的光譜改變在HL-60亦為明顯，因此邊緣能量維持恆定。此示出PhAs(LHP)在24小時中維持為As(III)。邊緣能量亦與As原子結合至硫部分一致，但後邊緣下降並不像在PhAs(LHP)標準品中觀察到的明顯，再次表明潛在的配位基與細胞中的其他(含硫)生物分子交換反應。

第27圖示出在XRF分析前甲苯胺藍染色、薄切面的K562細胞樣本的顯微圖。在K562控制組細胞樣品(第27圖(a))中的細胞通常為具有明確定義且完整的細胞核的球形。每個處理時間點示出細胞反應出對PhAs(LHP) (10 µM)處理的壓力和消亡。4小時處理之後(第27圖(b))，雖然有明確的證據表明細胞核的碎裂與細胞壓力有關，主要的細胞膜看起來完整。第27圖(c)示出24小時處理(10 μM)，清楚的示出細胞膜的破裂及碎裂/分散的細胞核物質。

每種處理條件(K562及HL-60細胞)對三至四個細胞成像，並且在以下數據中提供每個處理條件的代表性圖像。

取得自控制組及經PhAs(LHP)處理的(10 µM，4小時及24小時)的K-562細胞的薄切面之微探針SR-XRF元素分布示於第28圖中。顯著較As更具豐度的P、S及Zn的濃度被用於定義細胞區域。由於P及Zn分別存在於DNA磷酸骨架及DNA轉錄蛋白(鋅手指蛋白)中，P及Zn為細胞核的標記。控制組的K-562細胞(第28圖(a))並沒有含有顯著的As濃度，而經PhAs(LHP)處理4小時及24小時的細胞(分別於第28圖(b)及第28圖(c))各自在整個細胞中含有顯著的As，並具有在細胞核中積聚的證據。

第29圖(a)示出暴露於PhAs(LHP) (10 µM，4小時)的甲苯胺藍染色的K-562細胞薄切片的相關光學顯微照片，同時第29圖(b)示出P、Zn及As的對應SR-XRF圖和三個元素的共定位圖(colocalisation map)。由於使用含有S的甲苯胺藍染色其隨後影響細胞內S濃度，因此沒有顯示As與S的共定位圖。

第28圖及第29圖指出As已進入細胞核，如共定位圖中(第29圖(b))顯著的藍色所指出，其潛在地與DNA或與DNA複製相關的蛋白質交互作用。如在文獻中所報導的，磷所佔區域與異染色質區域一致。藉由共定位圖中明顯的藍色區域顯示的砷存在於整個細胞核中。仔細檢驗顯示As存在於細胞核中及異染色質及真染色質區域兩者(第29圖(b))。後者區域與發生轉錄的較小密度DNA(less densely packed DNA)重合，以允許As與轉錄蛋白中常見的富含硫的區域交互作用。統計分析比較細胞質及細胞核中的內源性元素的濃度，得到結果如同以PhAs(LHP)處理K562細胞的結果沒有特定的趨勢或變化。

第30圖顯示控制組及經PhAs(LHP)處理(10 μM，4小時及24小時)之HL-60細胞的顯微圖像。控制組細胞(第30圖(a))通常為具有大而且明確的細胞核和細胞膜的圓弧形。4小時PhAs(LHP)處理之後(第30圖(b))，在HL-60細胞中出現明顯的細胞窘迫(cell distress)，因此大多數細胞不再是圓弧形的，而是形狀不規則的，許多細胞的細胞核也變成不規則形狀。HL-60細胞的24小時PhAs(LHP)處理(第30圖(c))導致證明細胞消亡的高度細胞降解。

第31圖示出甲苯胺藍染色的薄切面之控制組及經PhAs(LHP)處理(10 μM，4小時及24小時)的HL-60的有效細胞顯微圖及對應的SR-XRF元素圖。與K562細胞一樣，控制組細胞中沒有顯著的As(第31圖(a))。然而，與K562細胞相反，在HL-60細胞以PhAs(LHP)處理4小時之後，僅有小的As區域化(第31圖(b))，其顯示與高DNA密集區域有關，很可能是核仁。顯著的As明顯出現在經PhAs(LHP)處理24小時的HL-60細胞中(第31圖(c)、第32圖(b))，而細胞核明顯含有比細胞其他細胞更多的As積累。強烈的As區域位於與Zn的強烈區域和P的強度較弱區域相關的細胞的左下部分，此可能指示為轉錄蛋白。

如同K562細胞，統計分析比較在HL-60細胞的細胞質及細胞核中的元素濃度，所得到的結果沒有特定的趨勢或變化可能是由於PhAs(LHP)治療。作為用於製備新苯砷白血球導引胜肽化合物 (XPhAs(LHP) 的前體之氧化苯胂 ( 對位取代 ) 的類似物之合成 方法 化學品

使用在此計畫中之所有一般市售試劑為分析級或更高等級。Milli-Q水(18.2 Ω, Millipore)作為溶劑使用，用於稀釋及製備緩衝液溶液。對胺苯胂酸(³99%)及活性碳(未處理，顆粒狀，8-20目)購得自Sigma Aldrich (Australia)。鹽酸(HCl, 32%)、甲醇(MeOH, ＞99.7%)、二乙醚(diethyl ether)(Et₂ O, ＞99%)、氯仿(CHCl₃ , ＞99.5%)、乙醇(EtOH, ＞99.5%)、甲酸(99%)、碘(I₂ , ＞99.5%)及氫氧化鈉(NaOH, ＞97.5%)皆取得自Ajax Finechem (Australia)。三苯基膦(PPh₃ , 99%)購得自Acros Organics (Australia)，同時亞硝酸鈉(NaNO₂ , ＞99.8%)購得自Thermo Fisher (Australia)。碘化鉀(KI, ＞99%)購得自Chem Supply (Australia)。磷酸氫二鈉(Na₂ HPO₄ , ＞99%)及二水合磷酸二氫鈉(NaH₂ PO₄ .2H₂ O, ³99%)購得自Sigma Aldrich (USA)。緩衝液製備

磷酸鹽緩衝液(pH 8, 0.1 M, 100 mL)使用表22中所列適量體積的儲備溶液A(NaH₂ PO₄ .2H₂ O, 0.2 M)及儲備溶液B(Na₂ HPO₄ , 0.2 M)製備。pH以Mettler Toledo technical buffers (pH 4.0、7.0及9.2)校正後，以Mettler Toledo Sever Compact S220-Micro Kit測量及/或確認，並在以Milli-Q水稀釋至100mL之前，根據pH測量值依所需逐滴添加溶液A或溶液B調整(最終濃度0.1M)。 表22，磷酸鹽緩衝液在特定pH下的儲備溶液組合

* pH於25 ˚C下測定XPhAs(LHP) 複合物的形成之 ESI-MS 分析

前述的前體(NH₂ PhAs(III)、 ClPhAs(V)或IPhAs(V)， 章節1.3.3)與LHP(描述於章節1.3.5)的配位使用ESI-MS監測以最佳化反應條件及隨後形成產物。反應使用章節1.3.5所述的條件在N₂ 氣氛下執行。在特定的時間，取出等分試樣並將溶液以0.1%甲酸稀釋(50×)以藉由電噴灑游離質譜儀(ESI-MS)分析。用於 ESI-MS 的操作條件

所有質譜光譜以Micromass Quattro Micro triple-quadrupole mass spectrometer (Micromass, UK)收集，其採用正離子模式的電噴霧電離。在所有實驗中，加熱的乾燥氮氣為霧化及乾燥的氣體。採用3.00kV的毛細管電壓，35V的錐電壓，80℃的來源溫度，120℃的去溶劑化溫度和400L/h的去溶劑化氣體流速來收集光譜。

在樣品注射之前以Milli-Q水完整的潤洗訊號源直到光譜與基線光譜相似。接著，每個樣品在20 µL/min的流速下以1-mL針筒(SGE Analytical Science, Australia)注入。數據採集以連續模式進行，通常將50次掃描相加以獲得代表性光譜。光譜以MassLynx軟體(Waters, 2003)進行。背景減除以1的多項式級數與曲線下方40％進行，並以Savitsky-Golay演算法修勻。然後，以中心函數(頂部，面積)產生質心光譜，且每個波峰以其分別的m/z 比及強度註記。 XPhAs(LHP)複合物的純化 分析型HPLC

使用具有Prominence-i LC2030C 系統控制器、自動注射器及液相層析單元的Shimadzu分析型HPLC系統用於XPhAs(LHP)複合物的純化。使用H₂ O (0.1% TFA)平衡20分鐘後的Waters Sunfire C18管柱，5 μm, 4.6 × 250 mm (No. 186002560)。應用含有H₂ O/ACN (0.1% TFA)的線性梯度沖提使用流速1 mL/min從100% H₂ O至100% ACN。所有溶劑在使用之前藉由過濾及超音波震盪除氣。在分析之前，樣品經由0.2-μm過濾器(Sartorius)過濾。XPhAs(LHP)的溶液(1 mL)根據最適化反應條件製備(如測定自方法發展的結果所測定)，將其注入至管柱並分析，以測定在溶液中每個種類的沖提時間。也分析每個相關的As前體(NH₂ PhAs(III), ClPhAs(V)或IPhAs(V))以建立其沖提時間。 製備型HPLC

基於取得自分析型HPLC的沖提輪廓，X-PhAs(LHP)反應產物的純化使用配備有Shimadzu SIL-10AP自動注射器、Shimadzu LC-20AP製備液相層析、Shimadzu FCV-200AL四元閥、Shimadzu SPD-M20A二極管陣列偵測器、Shimadzu DGU-20A5R除氣單元、Shimadzu CDM-20A通訊總線模組、LabSolutions軟體及Luna 5u C18(2)管柱(250×21.20 mm, 5 micron, Phenomenex)的製備型HPLC進行。管柱以H₂ O (0.1% TFA, 20分鐘)平衡。將根據最適化反應條件製備(如自方法發展的結果所測定)的XPhAs(LHP)的溶液(6 mL)注入至管柱，並使用表23及表24詳述的沖提梯度分離。流速維持在15 mL/min且分餾在λ 254 nm下偵測。收集主分餾並藉由ESI-MS表徵(操作條件如前所列)。 表23，用於純化NH₂ PhAs(LHP)之逆相製備型HPLC沖提梯度

表24，用於純化ClPhAs(LHP)及PhAs(LHP)之逆相製備型HPLC沖提梯度

乾燥 As 複合物

為得到純化的化合物，經鑑定的HPLC分餾使用Alpha 1-2 LDplus凍乾機(Christ)乾燥。X 射線吸收光譜表徵的前體 (NH₂ PhAs(III) 、 ClPhAs(V) 及 IPhAs(V)) 及胜肽複合物 (XPhAs(LHP))

採用X-射線吸收光譜(XAS)用於測定砷氧化態以及與在前體及胜肽複合物中的As直接配位的原子。製備用於 XAS 分析的樣品

對合成的苯基砷化合物、XPhAs(LHP)複合物及As標準品進行XAS分析。固體樣品藉由完全混合As-LHP與固體纖維素(Sigma Aldrich)來製備。儘管發現額外的10倍稀釋對於螢光模式的分析是最佳的，但稀釋比例最初使用XAFSmass程序測定。所得的混合物安裝在1-mm厚的鋁樣品支架並以卡普頓膠帶密封。接著，將每個樣品快速浸入液態氮中並轉移至液態氦低溫控制器，其在10 ⁰K下進行分析。收集下列As標準品的X射線吸收光譜：PAO、雙麩胱甘肽基苯砷(phenylarsenic bisglutathione)(PhAs(GS)₂ )、對胺苯胂酸及亞砷酸鹽。

對於PhAs(GS)₂ 的製備，首先將PAO (0.048 g)藉由加熱(80 ˚C)隔夜溶解於Milli-Q水(2 mL)中。之後所得溶液再加入麩胱甘肽(glutathione)(GSH)(0.26 g)之前冷卻至室溫。反應管以氮氣沖洗並放置反應隔夜，一般為16小時。加入甲醇(10 mL)以藉由離心(1700 rpm, 10 mins, Heraeus Labofuge 300)分離來沉澱產物。所得的固體在室溫下乾燥。XAS 實驗儀器條件及數據分析

以Australian Synchrotron (AS, XAS beamline, Clayton, VIC)進行XAS樣品分析。光束能量為~3.0 GeV且光束電流為200 mA。Si(311)通道切斷單色器控制光束能量。所有光譜在螢光模式中於~10⁰K(以閉路循環氦低溫控制器，OPTIPTTL4K Optistat^TM PTR, Oxford Instruments維持)紀錄。光譜以100-元GE 螢光偵測器(Eurysis)及0.5 mm的垂直狹縫寬度收集。

砷的K-邊緣XAS光譜在下列能量範圍中收集：前緣區域11667–11847 eV (10 eV steps)；XANES區域11847–11930 eV (0.25 eV steps)；以及EXAFS區域11930-12468 eV (0.025 Å^-1 steps in k-space to 13.0 Å^‑1 )。

同時在樣品的傳遞模式下游中分析固體金箔標準品(gold foil standard)以用於校準，其中第一衍生光譜的第一波峰之能量(對應於邊緣能量)定義為11920.0 eV。一般對所有數據分析收集3-5次掃描。以EXAFSPAK進行數據處理。EXAFSPAK的DATFIT模組計算多元線性回歸分析。背景減除及標準化使用BACKSUB達成，並使用FEFF 8.2 計算理論相及幅度函數以符合EXAFS數據。 對-胺基苯二氯胂(p-aminophenyldichloroarsine)(NH₂ PhAs(III))的合成

進行對胺苯胂酸的As(V)化合物還原成As(III)，以促進胜肽經由與Cl的交換而結合。該方法改編自Heredia-Moya and Kirk ((2008)Bioorg. Med. Chem. 16 , 5743-5746)及Ioannou與Tsivgoulis ((2015)Main Group Chem. 14 , 237-253)報導的程序。簡言之，對胺苯胂酸(0.2535 g, 1.00 mmol)溶解於脫氣(de-aerated)甲醇(1 mL)及濃縮HCl(0.68 mL)中。加入三苯膦 (0.4170 g, 1.50 mmol)及碘(iodine)(0.0123 g, 0.05 mmol)，在攪拌中得到紅色懸浮液。所得到的混合物在室溫下攪拌4小時以產生淡黃色溶液。淡黃色的產物，對-胺基苯二氯胂(NH₂ PhAs(III))藉由醚(1 mL)的加入而沉澱並收集固體。使用氯仿(2 mL)及醚(2 mL)的混合物萃取，以從氧化副產物三苯基膦氧化物(triphenylphosphine oxide)中分離NH₂ PhAs(III)。對 - 氯苯胂酸 (ClPhAs(V) 的合成

對-氯苯胂酸(ClPhAs(V))藉由對胺苯胂酸的重氮化(diazotisation)及隨後與Cl交換而製備。對胺苯胂酸 (0.217 g, 1.00 mmol) 溶解於MilliQ水(0.2 mL)及濃縮HCl(0.12 mL)中。完全溶解後加入更多的濃縮HCl(0.13 mL)。溶液冷卻至0-5 ˚C以製造懸浮液，並在管中加入冰(0.1 g)。在劇烈攪拌下，將在MilliQ水(0.2 mL)中的NaNO₂ (0.074 g, 1.07 mmol)逐滴加入至酸化溶液中，得到橘色溶液。完成NaNO₂ 的加入後，反應溶液轉變成淡黃色。反應管溫熱至50 ˚C並維持在此溫度大約2小時，以導致N₂ 氣體的釋放。溶液變成深橘色並有明顯沉澱。接著，將懸浮液冷藏隔夜。分離所得的固體並溶解在溫NaOH (10%, 0.6 mL)中。該溶液過濾並以HCl酸化以得到ClPhAs(V)。對 - 碘苯胂酸 (IPhAs(V) 的合成

對-碘苯胂酸(IPhAs(V))藉由對胺苯胂酸的重氮化及隨後與I交換而製備。對胺苯胂酸(0.217 g, 1.00 mmol) 溶解於MilliQ水(0.2 mL)及濃縮HCl(0.12 mL)的混合物中。完全溶解後，加入更多的濃縮HCl(0.13 mL)。溶液冷卻至0-5 ˚C並在管中加入冰(0.1 g)。在劇烈攪拌下，將在MilliQ水(0.2 mL)中的NaNO₂ (0.074 g, 1.07 mmol)溶液逐滴加入至酸化溶液中。溶液留置在冰中3分鐘，然後緩慢的加入冷卻的在MilliQ水(1.5 mL)中的碘化鉀(1.076 g, 0.00648 mol)溶液。將反應管放置在室溫下3分鐘然後升溫至45 ˚C直到氣體釋放(大約3-4小時)。懸浮液冷藏隔夜及收集棕色固體並以冷卻的MilliQ水沖洗。固體溶解於乙醇(1.4 mL)中並加入活性碳。以熱水(0.6 mL)稀釋混合物使其沸騰並趁熱過濾。加入冷水(0.8 mL)並收集橘色/棕色結晶。NH₂ PhAs(LHP) 的形成

在表25指出的條件下使用反應劑、NH₂ PhAs(III)及LHP進行三重複反應以製備NH₂ PhAs(LHP)。所有反應瓶在培養之前以N₂ 浸潤。藉由ESI-MS在指定的時間點(1小時、2小時、16小時及24小時) 分析代表性等分試樣，以監測反應過程。 表25，用於NH₂ PhAs(LHP)形成的試驗反應

ClPhAs(LHP)的形成

在表26指出的條件下使用反應劑、ClPhAs(V)及LHP進行三重複反應以製備ClPhAs(LHP)。所有反應瓶在培養之前以N₂ 浸潤。藉由ESI-MS在指定的時間點(30分鐘、1小時、2小時、24小時、72小時及96小時) 分析代表性等分試樣，以監測反應過程。 表26，用於ClPhAs(LHP)形成的試驗反應

IPhAs(LHP) 的形成

在下方指出的條件下使用反應劑、IPhAs(V)及LHP進行三重複反應以製備IPhAs(LHP)。所有反應瓶在培養之前以N₂ 浸潤。藉由ESI-MS在指定的時間點(1小時、72小時) 分析代表性等分試樣，以監測反應過程。 表27，用於IPhAs(LHP)形成的試驗反應

結果 NH₂ PhAs(III) 的合成

ESI-質譜光譜(第33圖)示出形成自對胺苯胂酸的還原以產生NH₂ PhAs(III)的反應產物。如在m/z 259.0被指定為[NH₂ -Ph-As-Cl₂ + Na]⁺ 的波峰所指出，成功產生所期望的As(III)化合物對-胺基苯二氯胂。此外，在m/z 184.0的波峰對應於[NH₂ -Ph-As=O + H]⁺ ，同時在m/z 202.0的波峰對應於[NH₂ -Ph-As-(OH)₂ + H]⁺ ，表明第二As(III)化合物，對-胺基苯胂氧化物的形成。在m/z 279.1的波峰指出三苯基膦氧化物[P(Ph)₃ O + H]⁺ 的存在，此為由三苯基膦氧化而形成的預期副產物。

由於在d=7.36-7.76 ppm區域存在兩組多重態(multiplets)，¹ H NMR光譜亦表明兩個主要產物的形成。Ioannou及Tsivgoulis反映了純的對-胺基苯二氯胂的合成，其中雙峰存在於d=7.19 ppm及 d=7.70 ppm。根據這些訊息，可合理的假設在d=7.71的多重態及關於在d=7.47 ppm的多重態可被指定為對-胺基苯二氯胂質子。因此，於d=7.42 ppm及d=7.54 ppm的大量多重態可被指定為對-胺基苯胂氧化物或對-胺基苯基二羥基胂(p -aminophenyldihydroxyarsine)。由於在ESI質譜中與對-胺基苯胂氧化物(m/z 184.0)相關的峰的相對大的豐度，合理假設藉由三苯膦及碘還原對胺苯胂酸導致兩個主要產物對-胺基苯二氯胂及對-胺基苯胂氧化物的形成。

XAS亦用來表徵從形成NH₂ PhAs(III)的As反應產物。第34圖示出胺基苯砷產物(底部光譜)及一些相應的As(III)固體標準品：亞砷酸鹽、PhAs(GS)₂ 及PAO以及As(V)起始物質(對胺苯胂酸)的As K-邊緣XANES光譜。如所預期，As(III)種類表現出邊緣能量及白線波峰大約較As(V)化合物(對胺苯胂酸)低3-5 eV(白線波峰能量：亞砷酸鹽，11871.54 eV；PAO，11870.57 eV；PhAs(GS)₂ , 11869.55 eV；對胺苯胂酸，11874.56 eV)。當考慮到從亞砷酸鹽與PAO產生的XANES光譜時，PAO中的As與苯環的配位(與亞砷酸鹽中的O原子相比)明顯導致邊緣向低能量轉移。除了與PhAs(GS)₂ 中的苯基之外，As對兩個GS配位基的結合導致進一步的邊緣向更低能量轉移。對於PhAs(GS)₂ 的接近後緣結構的檢查顯示在約11874eV處吸收強度顯著下降。NH₂ PhAs(III)引起在11871.80 eV的白線波峰，其指示As(III)的種類。波峰相對較寬，且形狀(前緣區域和後緣區域)與PAO的光譜不同。後緣區域示出了與對胺苯胂酸的XANES光譜之後緣區域強烈的相似性。這與後緣區域的廣泛性一起可被指示為對-胺基苯二氯胂及對-胺基苯胂氧化物的混合物。NH₂ PhAs(LHP) 的形成

在成功合成對-胺基苯砷化合物之後(包含兩個種類，對-胺基苯二氯胂及對-胺基苯胂氧化物)，採用許多反應條件來鑑定產生所需胺基苯基砷-胜肽複合物的最適化反應條件。首先，各反應的溫度維持在恆定37 ˚C以最小化任何產物潛在的降解。由於LHP昂貴的本質，因而使用過量的As化合物。雖然在所有反應物化學計量比下快速反應，但決定理想的化學劑量為3 mol As:1 mol LHP。由於藉由製備型HPLC在磷酸鹽緩衝液中純化反應產生的產物少約10倍(ten times less product)，反應溶液之最佳溶劑/pH決定為MilliQ水(pH 7) (參閱磷酸鹽緩衝液 (pH 8))。即使反應很快速，且容易形成所期望的複合物，但反應在37 ˚C下培養大約24小時以確保As化合物與胜肽完全接合。

使用最佳條件的NH₂ PhAs(III)與LHP的反應溶液的ESI-質譜光譜(第35圖)示出所期望之胺基苯砷(LHP)複合物的形成。所期望複合物的形成藉由在m/z 462.4 ([NH₂ -Ph-As(LHP) + 3H]³⁺ )及m/z 693.0 ([NH₂ -Ph-As(LHP) + 2H]²⁺ )的波峰確認。未處理的對-胺基苯二氯胂 (m/ z 259.1)明顯出現在光譜中，由於此試劑的過量添加。在光譜(m/z 407.2, 610.1)中明顯出現少量的游離LHP，且可能歸因於藉由ESI-MS製程中的碎裂。

當NH₂ PhAs(LHP)的存在藉由ESI-MS確認，藉由HPLC進行分離。在8.6分鐘、10.5分鐘及12.2分鐘沖提的分餾藉由ESI-MS分析，且被鑑定為與NH₂ PhAs(III)相關的種類。所期望的NH₂ PhAs(LHP)複合物在13.3分鐘被沖提(大波峰)。

合成的NH₂ PhAs(LHP)藉由XAS表徵(第34圖)。從邊緣能量的位置和白線波峰能量(11870.04 eV)可以清楚地看出產物為As(III)種類。重要地，NH₂ PhAs(LHP)光譜的後緣區域與從反應產物中形成NH₂ PhAs(III)的邊緣區域存在顯著差異。首先，白線波峰為窄的，表示純產物。次之，在大約11874 eV的肩部相似於PhAs(GS)₂ ，且比亞砷酸鹽或PAO更明顯。由於後緣的凹陷指示As結合至S，儘管也進行了EXAFS分析以證實這一點，但假定As與胜肽結合也是合理的。

第36圖示出最佳的單一散射擬合(第一配位殼層)及記錄合成的NH₂ PhAs(LHP)的EXAFS數據。由於射出電子與結合至As原子的苯環的交互作用，而非常可能使波峰在R+D(Å) ＞ 3。As原子可能結合至2S及1C。

表徵數據確認NH₂ PhAs(LHP)的成功合成。ClPhAs(V) 的合成

化合物ClPhAs(V)藉由對胺苯胂酸的重氮化及隨後與Cl結合而成功地合成。ESI質譜光譜(第37圖)指出所期望產物(m/z 236.9, [Cl-Ph-AsH₂ O₃ + H]⁺ )的形成。在m/z 219.0的波峰對應於對位取代的羥基苯胂酸(hydroxy phenylarsonic acid)([OH-Ph-AsH₂ O₃ + H]⁺ )，其可作為重氮化反應中的副產物產生。

藉由¹ H NMR分析合成的對-氯苯胂酸顯示一個主要結構的存在，其具有兩組多重態存在於d=7.76 ppm及d=7.69 ppm。

對-氯苯胂酸的產率大約為24%。其他合成方法可用於合成該化合物，例如經由巴特反應(Bart Reaction)，以使鹼性亞砷酸鹽與由對-氯苯胺(p-chloroaniline)形成的芳基重氮(aryldiazonium)結合。產率一般介於60-80%之間。然而，對胺苯胂酸的重氮化及隨後與Cl結合使用在此方法中是較佳的，因為此方法亦可使用相同的前體(對胺苯胂酸)以分別加上碘化鉀及溴化鉀的少量修飾的方式而產生對-碘苯胂酸及可能的對-溴苯胂酸(p -bromophenylarsonic acid)。

藉由XAS進行對合成的對-氯苯胂酸進一步表徵。第38圖示出As(III)及As(V)固體標準品以及對-氯苯胂酸的As K-邊緣 XANES光譜。對-氯苯胂酸引起在11874.55 eV的白線波峰，其指示為As(V)的種類，且幾乎與對胺苯胂酸相同，確認了As結合至Ph和O原子。ClPhAs(LHP) 的形成

LHP與對-氯苯胂酸反應。在所有試驗中，確認產生所期望之Cl-PhAs(LHP)化合物的最適化反應條件，LHP保持過量。此確保在結合至LHP之前，對-氯苯胂酸充分地還原。測試不同的反應物比率，以確定最適化反應條件，而所有的試驗顯示ClPhAs(LHP)的產生(藉由ESI-MS確認)。重要地，在16小時之前並未被觀察到ClPhAs(LHP)的出現，表明As(III)的還原與之後並未快速結合。在37 ˚C下培養大約24小時之後，對應於ClPhAs(LHP)的波峰以及與氧化LHP相關的波峰，即藉由S-S結合的環化LHP存在於ESI質譜光譜中。此反應72小時的ESI質譜光譜示於第39圖中。在m/z 468.8及m/z 702.5的波峰對應於所期望的氯苯砷-胜肽結構(分別為[Cl-Ph-As(LHP) + 3H]³⁺ 及([Cl-Ph-As(LHP) + 2H]²⁺ )。藉由波峰在m/z 406.8及m/z 609.5所指出的離子對應於氧化LHP(分別為[氧化LHP + 3H]³⁺ 及[氧化 LHP + 2H]²⁺ )。

當ESI-MS確認ClPhAs(LHP)的產生，藉由HPLC進行分離。在17.1分鐘沖提的ESI-MS分餾鑑定為氧化LHP。兩個明顯的分餾在22.1分鐘及22.4分中被沖提。這些分餾的兩者藉由ESI-MS分析時幾乎一致，因而其皆含有所期望的ClPhAs(LHP)複合物。

如同先前描述的PhAs(LHP)複合物相同的情況，推測不同的沖提時間反映了兩種自發相互轉化的As異構體的存在。

初步細胞毒性研究顯示來自每個HPLC分餾的產物在K562細胞(人類慢性骨髓性白血病)中表現出相同的毒性，其與異構物的外消旋作用一致。

進行ClPhAs(LHP)的XAS分析以確定與As配位的原子的本質及其氧化態。第38圖示出As標準品及ClPhAs(LHP)的As K-邊緣 XANES 光譜。ClPhAs(LHP)複合物的白線波峰能量為11870.31 eV，指出As(III)的種類。在大約11874 eV處的顯著的後波峰下降出現在此光譜中，其相似於PhAs(GS)₂ 且與As(III)及胜肽配位所預期的一致。

第40圖示出記錄ClPhAs(LHP)的EXAFS數據的單一散射擬合(第一配位殼層)，其中散射體是2S及1C。如同先前NH₂ PhAs(LHP)的EXAFS擬合，在傅立葉轉換實驗光譜中在R+D(Å) ＞ 3的波峰與擬合不對齊是由於射出的電子與鄰近於As的苯環交互作用，其發生於第一配位殼層之外。表徵數據確認所期望複合物ClPhAs(LHP)的成功合成。IPhAs(V) 的合成

對-碘苯胂酸藉由對胺苯胂酸的重氮化及隨後與I結合而成功地合成。IPhAs(V)的產率大約為30%。

ESI質譜光譜(第41圖)指出所期望產物(m/z 328.8, [I-Ph-AsH₂ O₃ + H⁺ ]⁺ )的形成。藉由¹ H NMR分析合成的對-碘苯胂酸，其顯示一個主要結構的存在，其中兩組多重態存在於d=8.00 ppm及d=7.51 ppm。

合成的對-碘苯胂酸亦藉由XAS表徵。第42圖示出As(III)及As(V)固體標準品以及對-碘苯胂酸的As K-邊緣 XANES光譜。對-碘苯胂酸的接近邊緣x射線光譜示出在11874.8 eV的白線波峰，指示為As(V)的種類。邊緣能量亦相似於對胺苯胂酸，確認As結合至Ph和O原子。IPhAs(LHP) 的形成

As(V)的種類(IPhAs(V))依賴於胜肽中的硫醇基與LHP反應，以在與胜肽結合之前還原胂酸基團。對-碘苯胂酸的還原並不快速，一般在苯砷-胜肽複合物形成之前耗費至少72小時。此反應(72小時之後)的ESI質譜光譜示於第43圖中。在m/z 499.3及m/z 748.5的波峰對應於所期望的碘苯砷-胜肽結構(分別為[I-Ph-As(LHP) + 3H]³⁺ 及([I-Ph-As(LHP) + 2H]²⁺ )。藉由波峰在m/z 406.8及m/z 609.5所指出的離子對應於氧化LHP(分別為[氧化LHP + 3H]³⁺ 及[氧化 LHP + 2H]²⁺ )。

HPLC純化產生在17.1分鐘沖提的分餾，其藉由ESI-MS確認為氧化的LHP。兩個明顯的分餾被沖提(22.8分鐘及23.2分鐘)，其中ESI-MS顯示為所期望的IPhAs(LHP)複合物。這些顯示是如前所述的相互轉化的異構體PhAs(LHP)及ClPhAs(LHP)。

對-碘苯胂酸的初步毒性研究表明兩種異構體在K562細胞株中引發相同的毒性，這與溶液中複合物的自發外消旋作用一致。

藉由XAS分析IPhAs(LHP)複合物。第42圖示出As標準品及IPhAs(LHP)複合物的As K-邊緣XANES光譜。IPhAs(LHP)複合物的白線波峰能量為11869.79 eV。如先前其他XPhAs(LHP)光譜，IPhAs(LHP)光譜在肩部區域的凹陷相似於PhAs(GS)₂ 的光譜，與結合至S的As(III)複合物一致。

第44圖示出用於IPhAs(LHP)記錄的EXAFS數據的單一散射擬合(第一配位殼層)，散射體是2S和1C。再次，在傅立葉轉換實驗光譜中在R+D(Å) ＞ 3的波峰與擬合不對齊，其可歸因於射出的電子與鄰近於As的苯環的交互作用(在第一配位殼層之外)。IPhAs(LHP)的表徵數據確認所期望複合物的成功合成。總而言之，IPhAs(LHP)複合物以兩種對映體(As的掌性中心)的混合物存在，其隨時間在溶液中自發外消旋。

總而言之，PhAs(LHP)之對位取代類似物的數目涵蓋已合成的拉電子(electron withdrawing)、推電子(electron donating)及立體阻礙(sterically hindering)基團。進一步的實驗將涉及在生物測定進行測試之前，對所有這些複合物的完全純化和表徵，以確定用於潛在治療用途的最佳複合物。生物測試將如上述反應那些流程及細胞株。

本發明之上述的各種實施例說明的目的在於提供對所屬技術領域具有通常知識者進行描述。其並非旨在窮舉(exhaustive)或將本發明限制於單一公開的實施例。如上所述，本發明的許多替換和變化對於上述教示的所屬技術領域具有通常知識者是顯而易見的。因此，雖然已經具體討論了一些替代實施例，但是其他實施例對於所屬技術領域具有通常知識者將是顯而易見或相對容易發展。因此，此專利說明書旨在涵蓋本文已討論的本發明所有替代、修改及變化，及其他落入上述發明的精神與範疇的其他實施例。

除非因明確語言或必要的暗示而上下文明確要求之外，否則在本發明的後面和前面的描述中的申請專利範圍中，文字「包含(comprise)」或其變化包括「包含(comprises)」或「包含(comprising)」，將用於包括性意義，亦即，用以指定所列元件的存在，而非排除在本發明的一個或多個實施例中存在或添加的其他額外元件。

無

為了使本發明可被易於理解並實際實施，現將參照附圖藉由示例方式對較佳實施例進行描述，其中：

第1A圖示出具有波峰為分別指定[LHP + 3H⁺ ]³⁺ 及[LHP + 2H⁺ ]²⁺ 的m/z 407.4及m/z 610.5之LHP的正離子ESI-質譜；第1B圖描繪AsI₃ 及LHP在(a)磷酸鹽緩衝液(pH=8)及(b)三乙胺(pH=8)中反應8小時的ESI-MS結果，其具有波峰為分別指定[HyAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ 及[HyAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ 的m/z 431.4及m/z 646.8，以確認所期望產物HyAs(LHP)的產出。在m/z 407.6、m/z 610.5及m/z 628.8的離子指定為游離胜肽，分別為[LHP + 3H⁺ ]³⁺ 、[LHP + 2H⁺ ]²⁺ 及[LHP.2H₂ O + 2H⁺ ]²⁺ 。在m/z 837.9的離子被鑑定為[HyAs(LHP)₂ ⁺ 3H⁺ ]³⁺ ；第1C圖示出MMA(V)及LHP在磷酸鹽緩衝液(pH=8)中反應，隨後在37 ⁰C下培養16小時的ESI-MS結果。在m/z 437.1 [MeAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ 、m/z 444.8 [MeAs(LHP) + Na⁺ + 2H⁺ ]³⁺ 、m/z 655.1 [MeAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ 以及m/z 666.4 [MeAs(LHP) + Na⁺ + H⁺ ]²⁺ 的離子確認所期望產物MeAs(LHP)的產出。游離胜肽離子發生在m/z 407.6 [LHP + 3H⁺ ]³⁺ 、 * =m/z 414.9 [LHP + Na⁺ + 2H⁺ ]³⁺ 、m/z 610.5 [LHP + 2H⁺ ]²⁺ 、m/z 629.6 [LHP + Na⁺ + H⁺ ]²⁺ ；第1D圖示出PAO及LHP在磷酸鹽緩衝液(pH=8)中反應，隨後在37 ⁰C下培養4小時之產物的ESI-MS結果，其具有在m/z 457.6 [PhAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ 及m/z 685.5 [PhAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ 的離子以確認所期望產物PhAs(LHP)的產出。游離胜肽離子發生在m/z 407.6 [LHP + 3H⁺ ]³⁺ 及m/z 610.5 [LHP + 2H⁺ ]²⁺ ；

第2A圖為來自分析型HPLC對(a) LHP(在大約15分鐘處的上部跡線(trace)；在14分鐘及17分鐘處的第二跡線；在14及19分鐘處的第三跡線；以及在15及22分鐘處的最後跡線的波峰)；(b) HyAs(LHP)；(c) MeAs(LHP)；(d) PhAs(LHP)的一系列HPLC跡線。游離胜肽(LHP)在所有層析圖中出現在14.5分鐘處，與特定的複合物出現在下列時間點：(b) HyAs(LHP) 波峰在17.2分鐘處(c) MeAs(LHP)在18.1分鐘處以及(d) PhAs(LHP)在22.1分鐘處；第2B圖為表示下列純化後之化合物：(a) HyAs(LHP)；(b) MeAs(LHP)；(c) PhAs(LHP)的一系列正離子ESI-質譜光譜。圓點= [LHP + 3H⁺ ]³⁺ ；矩形 = [HyAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ ；星形 = [LHP + 2H⁺ ]²⁺ ；三角形 = [ HyAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ ；X = [MeAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ ；十字形 = [MeAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ ；垂直菱形 = [PhAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ ；水平菱形= [PhAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ ；

第3圖為得自As標準品及As-LHP化合物之固體樣品的As K-邊緣 XANES光譜的圖表，其指出砷LHP複合物的結構完整性，其中氧化態為As³⁺ 且砷結合至兩個硫原子及R基團；

第4圖為HyAs(LHP)的固體樣品的EXAFS分析(左)及對應的傅立葉轉換(Fourier transform)(右)的圖表，其顯示如表6所示之擬合3(2S及1O)的實驗數據(黑色)及計算數據(紅色)；以確認As³⁺ 結合至2個硫原子及1個氧原子；

第5圖為MeAs(LHP)的固體樣品的EXAFS分析(左)及對應的傅立葉轉換(右)的圖表，其顯示使用單一散射擬合(第一配位殼層)對如表7所示之擬合4(2S及1C)的實驗數據(黑色)及計算數據(紅色)；以確認As³⁺ 結合至2個硫原子及1個碳原子的圖表；

第6圖為PhAs(LHP)的固體樣品的EXAFS分析(左)及對應的傅立葉轉換(右)的圖表，其顯示使用單一散射擬合(第一配位殼層)對如表8所示之擬合4(2S及1C)的實驗數據(黑色)及計算數據(紅色)；以確認As³⁺ 結合至2個硫原子及1個碳原子的圖表；

第7圖為PAO (10 mM)與LHP (3 mM)在MilliQ水中37 °C下執行之反應產物的逆相製備型HPLC層析圖。每個主要的分餾的鑑別藉由ESI-MS確認。PAO在13.28分鐘處被沖提、PhAs(LHP) 在15.99分鐘及16.86分鐘處被沖提。較小分餾之化合物的鑑別並未確認；

第8圖為(a)分餾1及(b)分餾2的正離子ESI-質譜。波峰被鑑別為：m/z 407.5 = [LHP + 3H⁺ ]³⁺ 、m/z 414.1 = [LHP + 2H⁺ + Na⁺ ]³⁺ 、m/z 457.4 = [PhAs(LHP) + 3H⁺ ]³⁺ 、m/z 463.5 = [PhAs(LHP) + 3H⁺ + H₂ O]³⁺ 、m/z 610.7 = [LHP + 2H⁺ ]²⁺ 、m/z 619.8 = [LHP + 2H⁺ + H₂ O]²⁺ 、m/z 685.5 = [PhAs(LHP) + 2H⁺ ]²⁺ 、m/z 696.7 = [PhAs(LHP) + H⁺ + Na⁺ ]²⁺ ，確認每一個分餾為相同的化合物PhAs(LHP)；

第9圖為鑑定為PhAs(LHP)之分離分餾的逆相分析型HPLC層析圖。(a)分餾1：於15.97及16.85分鐘處沖提的PhAs(LHP)；(b) 於15.97及16.87分鐘處沖提的PhAs(LHP)，證明兩種異構物自發地互相轉換(spontaneous interconversion)；

第10圖為HyAs(LHP)在Milli-Q水中於0小時(藍色，最左的跡線及波峰)及4小時(紅色，接著具有較低峰值的亞砷酸鹽(arsenite))顯示在此期間缺乏穩定性的As K邊緣XANES光譜。4小時的光譜相似於亞砷酸鹽(綠色)的光譜；

第11圖為MeAs(LHP)在Milli-Q水中於0小時(藍色，由於重疊於14小時光譜而不可見)及14小時(紅色)顯示在此期間具有良好的穩定性的As K邊緣XANES光譜。兩個光譜之間的殘差(residual)以綠色表示；

第12圖為PhAs(LHP)在Milli-Q 水中於0小時(藍色，由於重疊於14小時光譜而不可見)及14小時(紅色)顯示在此期間具有優異的穩定性的As K邊緣XANES光譜。兩個光譜之間的殘差以綠色表示；

第13圖為MeAs(LHP)在IMDM中(細胞培養基)於0小時(藍色，稍微較高波峰及較低波谷的重疊跡線)及24小時(紅色)顯示在此期間具有合理的穩定性的As K邊緣XANES光譜。兩個光譜之間的殘差(綠色)示出兩個光譜之間的偏差(anomalies)，特別是在後緣的波谷；

第14圖為PhAs(LHP)在IMDM中於0小時(藍色，由於重疊於24小時光譜而僅稍微可見稍微較低的波峰及較低波谷的重疊跡線)及24小時(紅色)顯示在此期間具有良好的穩定性的As K邊緣XANES光譜。兩個光譜之間的殘差以綠色表示；

第15圖為在K562細胞上24小時處理之後MTT分析所產生的一系列濃度-反應曲線。所測的化合物包括：(A) 目前的砷藥物：乙醯胂胺(acetarsol)、亞砷酸鹽、ATO，(B) 起始物質及胜肽：AsI₃ 、PAO、LHP、sLHP，(C) 砷胜肽：HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)及PhAs(sLHP)；這些曲線用來計算各化合物的IC₅₀ ，其中較低的IC₅₀ 指示出化合物較具毒性；

第16圖示出在K562細胞上24小時處理之後MTT分析所得到的特定As化合物之IC₅₀ 值的比較結果，顯示出砷胜肽複合物經改良的毒性。

第17圖是在HL-60細胞上24小時處理之後MTT分析所產生所得到的特定As化合物之IC₅₀ 值的比較結果的圖表，顯示出含有標靶胜肽的PhAs(LHP)具有充分的毒性且含有亂序胜肽(scrambled peptide)(不再標靶)之PhAs(sLHP)具有大幅下降的毒性；

第18圖示出在Kasumi-1細胞上24小時處理之後MTT分析所得到的特定As化合物之IC₅₀ 值的比較，顯示出實質上改善PhAs(LHP)及其衍生物PhAs(sLHP)、亞砷酸鹽、ATO及PAO的毒性；

第19圖是在KARPAS 45細胞上24小時處理之後MTT分析所得到的特定As化合物之IC₅₀ 值的比較結果的圖表，顯示出含有標靶胜肽的PhAs(LHP) 具有充分的毒性且含有亂序胜肽(不再標靶)之PhAs(sLHP)具有大幅下降的毒性；

第20圖是在HepG2細胞上24小時處理之後MTT分析所得到的特定As化合物之IC₅₀ 值的比較結果的圖表，指出不藉由該胜肽標靶的PhAs(LHP)對這些快速成長的癌症細胞毒性較低；

第21圖是在中國倉鼠(CH)固體腫瘤細胞上24小時處理之後MTT分析所得到的特定As化合物之IC₅₀ 值的比較結果的圖表，指出不藉由該胜肽標靶的PhAs(LHP)對這些快速成長的癌症細胞毒性較低；

第22圖是在hPBMC細胞上24小時處理之後MTT分析所得到的特定As化合物之IC₅₀ 值的比較結果的圖表，指出PhAs(LHP)對這些正常細胞毒性較低；

第23圖為PhAs(LHP)橫跨細胞株經24小時處理之後IC₅₀ 值的比較，顯示PhAs(LHP)抵抗白血病細胞株(藉由胜肽標靶的K562、HL-60、Kasumi-1及KARPAS 45)具有充分的毒性，在附著性快速成長的癌症細胞株(不藉由胜肽標靶的固體腫瘤細胞HepG2、A549及CH)具有大幅降低的毒性，且在正常細胞(亦不藉由胜肽標靶的hPBMC)也具有降低的毒性；

第24圖為關於特定細胞株24小時處理後(1.5 µM As)，細胞As濃度的總結圖表。結果以三重複樣品的平均及標準差表示。結果顯示以PhAs(LHP)處理後的白血病細胞株的選擇性As攝取，且在非白血病細胞中沒有偵測到As的攝取。

第25圖為PhAs(LHP)(1mM)在Milli-Q水中及經PhAs(LHP)處理的K562細胞(4小時及24小時，較低的重疊跡線)中的As K邊緣XANES光譜，顯示As維持為As(III)但具有As-S結合的細胞內修飾；

第26圖為PhAs(LHP)(1mM)在Milli-Q水中及經PhAs(LHP)處理的HL-60細胞(4小時及24小時，較低的重疊跡線)中的As K邊緣XANES光譜，顯示As維持為As(III)但具有As-S結合的細胞內修飾；

第27圖為甲苯胺藍染色、薄切面的控制組及經PhAs(LHP)處理的K562細胞的一系列顯微圖。(a) 為K562控制組細胞，(b) 為經PhAs(LHP)處理的K562細胞(10 μM, 4 h)，(c) 為經PhAs(LHP)處理的K562細胞(10 μM, 24 h)，顯示PhAs(LHP)處理之後的壓力及細胞消亡(cell demise)；

第28圖為薄切面、甲苯胺藍染色的控制組及經PhAs(LHP)處理的K562細胞的一系列顯微圖及相關的微探針SR-XRF元素圖。(a) 為K562控制組細胞，(b) 為經PhAs(LHP)處理的K562細胞(10 μM, 4 h)，(c) 為經PhAs(LHP)處理的K562細胞(10 μM, 24 h)。操作條件包括：光束能量 = 11.9 keV；光束尺寸 = 0.3 × 0.3 μm² ；步輻 = 0.3 μm；採樣間隔時間(dwell time) = 2.5 s/pt；以及掃描尺寸(H × V) = (a) 20 × 21 μm² ； (b) 26 × 18 μm² ；(c) 23 × 21 μm² 。此示出在PhAs(LHP)處理之後As在細胞核中區域化；

第29圖示出經暴露至PhAs(LHP)(10 μM, 24 h)之K562細胞的甲苯胺藍染色薄切面，(a) 為關聯光學顯微圖，(b) 為P、Zn及As對應的微探針SR-XRF圖，以及該三種元素的共定位圖(colocalisation map)。此示出在PhAs(LHP)處理之後As在細胞核中區域化；

第30圖為甲苯胺藍染色、薄切面的控制組及經PhAs(LHP)處理的HL-60細胞的一系列顯微圖。(a) 為HL-60控制組細胞，(b) 為經PhAs(LHP)處理的HL-60細胞(10 μM, 4 h)，(c) 為經PhAs(LHP)處理的HL-60細胞(10 μM, 24 h)，顯示PhAs(LHP)處理之後的壓力及細胞消亡；

第31圖為薄切面、甲苯胺藍染色的控制組及經PhAs(LHP)處理的HL-60細胞顯微圖及相關的微探針SR-XRF元素圖。(a) 為HL-60控制組細胞，(b) 為經PhAs(LHP)處理的HL-60細胞(10 μM, 4 h)，(c) 為經PhAs(LHP)處理的HL-60細胞(10 μM, 24 h)。操作條件包括：光束能量 = 11.9 keV；光束尺寸 = 0.3 × 0.3 μm² ；步輻= 0.3 μm；採樣間隔時間= 2.5 s/pt；以及掃描尺寸(H × V) = (a)15 × 11 μm² ；(b) 13 × 14 μm² ；(c) 16 × 14 μm² 。此示出在4至24小時處理之間As攝取的增加與顯著在核中的累積；

第32圖示出經暴露至PhAs(LHP) (10 μM, 24 h)之K562細胞的甲苯胺藍染色薄切面，(a) 為關聯光學顯微圖，(b) 為P、Zn及As的對應的微探針SR-XRF圖以及該三種元素的共定位圖。此示出在PhAs(LHP)處理之後，As顯著在核中累積；

第33圖為合成的NH₂ PhAs(III)溶解於MilliQ水中之正離子ESI-質譜(m/z 160-400)，其所示的波峰：m/z 184.0, [NH₂ -Ph-As=O + H]⁺ ；m/z 202.0, [NH₂ -Ph-As-(OH)₂ + H]⁺ ；m/z 220.0，未鑑定；m/z 259.0, [NH₂ -Ph-As-Cl₂ + Na]⁺ ；m/z 279.1, [P(Ph)₃ O + H]，以確認NH₂ PhAs(III)的產出；

第34圖為固體標準品及合成的NH₂ PhAs(LHP)及NH₂ PhAs(III)的As K邊緣XANES光譜。光譜包括亞砷酸鹽、對胺苯胂酸(p -arsanilic acid)、PhAs(GS)₂ 、PAO及NH₂ PhAs(LHP)的數據，指出在NH₂ PhAs(LHP)中的As為As(III)且可能結合至S；

第35圖為得自合成的對-胺基苯二氯胂/對-胺基苯胂氧化物(p -aminophenyldichloroarsine/p -aminophenylarsine oxide)(3 mM)與LHP (1 mM)在MilliQ水中於37˚C下反應16小時之後的產物之正離子ESI-質譜(m/z 240-1500)，其所示的波峰：m/z 259.1, [NH₂ -Ph-As-Cl₂ + Na]⁺ ；m/z 407.2, [LHP + 3H]³⁺ ；m/z 462.4, [NH₂ -Ph-As(LHP) + 3H]³⁺ ；m/z 610.1, [LHP + 2H]²⁺ ；m/z 693.0, [NH₂ -Ph-As(LHP) + 2H]²⁺ ，以確認NH₂ PhAs(LHP)的產出；

第36圖為NH₂ PhAs(LHP)的EXAFS分析(左)及對應的傅立葉轉換(右)，其示出使用單一散射擬合(第一配位殼層)之實驗數據(––)及計算數據(---)。此確認As是結合至2S及1C；

第37圖為合成的對-氯苯胂酸(p -chlorophenylarsonic acid)溶解於甲醇之正離子ESI-質譜(m/z 160-600)，其所示的波峰：m/z 219.0, [OH-Ph-AsH₂ O₃ + H]⁺ ；m/z 236.9, [Cl-Ph-AsH₂ O₃ + H]⁺ ；m/z 141.0, 汙染物；m/z 158.0, 汙染物，以確認Cl-Ph-AsH₂ O₃ 的產出；

第38圖為固體標準品及合成的ClPhAs(LHP)(首先上升至一系列較低跡線上的波峰之跡線)及ClPhAs(V)的As K邊緣XANES光譜。標準品包括：亞砷酸鹽、對胺苯胂酸(之後在一系列中間跡線中上升的跡線)、PhAs(GS)₂ 及PAO。此指出在ClPhAs(LHP)中的As為As(III)且可能結合至S；

第39圖為得自ClPhAs(V) (1 mM)與LHP (3 mM)在MilliQ水中37˚C反應72小時之後的產物之正離子ESI-質譜(m/z 240-1400)，其所示的波峰：m/z 406.8, [氧化LHP + 3H]³⁺ ；m/z 468.8, [Cl-Ph-As(LHP) + 3H]³⁺ ；m/z 609.5, [氧化LHP + 2H]²⁺ ；m/z 702.5, [Cl-Ph-As(LHP) + 2H]²⁺ ，以確認ClPhAs(LHP)的產出；

第40圖為得自製備型HPLC的ClPhAs(LHP)第一分餾的EXAFS分析(左)及對應的傅立葉轉換(右)，其示出使用單一散射擬合(第一配位殼層)之實驗數據(––)及計算數據(---)。此確認As是結合至2S及1C；

第41圖為合成的對-碘苯胂酸(p -iodophenylarsonic acid)溶解於甲醇中之正離子ESI-質譜(m/z 100-600)。波峰指定為：m/z 328.8, [I-Ph-AsH₂ O₃ + H]+；m/z 141.0，汙染物；m/z 158.0，汙染物。此確認IPhAsH₂ O₃ 的產出；

第42圖為固體標準品及合成的IPhAs(LHP)(一對較低跡線中首先上升至波峰的跡線)及IPhAs(V)的As K邊緣XANES光譜。標準品包括：亞砷酸鹽、對胺苯胂酸(一系列中間跡線中後期上升成波峰的跡線)、PhAs(GS)₂ 及PAO。此指出在IPhAs(LHP)中的As為As(III)且可能結合至S；

第43圖為得自合成的對-碘苯胂酸(1 mM)與LHP (3 mM)在MilliQ水中37˚C反應72小時之後的產物之正離子ESI-質譜(m/z 240-1400)。波峰：m/z 406.8, [氧化LHP + 3H]³⁺ ；m/z 499.3, [I-Ph-As(LHP) + 3H]³⁺ ；m/z 609.5, [氧化LHP + 2H]²⁺ ；m/z 748.5, [I-Ph-As(LHP) + 2H]²⁺ ，以確認IPhAs(LHP)的產出；以及

第44圖為得自製備型HPLC的IPhAs(LHP)第一分餾的EXAFS分析(左)及對應的傅立葉轉換(右)，其示出使用單一散射擬合(第一配位殼層)之實驗數據(––)及計算數據(---)。此確認As是結合至2S及1C。

Claims (25)

1. 一種抗癌劑，其包含具有結合至兩個半胱胺酸殘基的砷原子的環化腫瘤導引胜肽。
2. 如申請專利範圍第1項所述之抗癌劑，其中該腫瘤導引胜肽的砷結合的該兩個半胱胺酸殘基藉由少於20個胺基酸殘基分離。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之抗癌劑，其中在環化之前，與該砷原子結合該兩個半胱胺酸殘基中的至少一個為該腫瘤導引胜肽的終端殘基。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之抗癌劑，其中在環化之前，與該砷原子結合的該兩個半胱胺酸殘基分別形成該腫瘤導引胜肽的N端胜肽殘基及C端胜肽殘基。
5. 如申請專利範圍第4項所述之抗癌劑，其中該N端半胱胺酸包含結合至其終端胺基氮的封端基團。
6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之抗癌劑，其進一步包含結合至該砷原子的穩定化基團。
7. 如申請專利範圍第6項所述之抗癌劑，其中該穩定化基團選自由羥基、C₁ 至C₆ 烷基、C₂ 至C₆ 烯基、C₂ 至C₆ 炔基、芳基、環烷基及雜環基所組成之群組，各該基團可適當地經取代或未經取代。
8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之抗癌劑，其中該腫瘤導引胜肽包含至少一個精胺酸及/或離胺酸殘基。
9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之抗癌劑，其具有如式I所示之結構：

   

   式I 其中，所示與砷結合的硫原子為各自的該半胱胺酸殘基的硫醇基的硫； 式1中的該半胱胺酸殘基藉由以曲線表示的少於20個胺基酸殘基分離；以及 R為選自由羥基、C₁ 至C₆ 烷基、C₂ 至C₆ 烯基、C₂ 至C₆ 炔基、C₁ 至C₆ 烷氧基、芳基、環烷基、雜環基及短鏈胜肽所組成之群組的穩定化基團，各該基團可為經取代或未經取代。
10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之抗癌劑，其具有如式II所示之結構：

    

    式II 其中，原子及基團如式I所述； 封端基團形成自胺基反應化合物；以及 W為介於2至20個之間的胺基酸殘基。
11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述之抗癌劑，其中將該砷原子結合於該兩個半胱胺酸殘基之間以形成橋的該腫瘤導引胜肽可選自由以下所組成之群組： 1.  CAYHRLRRC； 2.  CDCRGDCFC； 3.  CPIEDRPMC； 4.  CNRRTKAGC； 5.  CGTKRKC； 6.  CRGDGWC； 7.  CVSNPRWKC； 8.  CHVLWSTRC； 9.  CLDGGRPKC； 10. GCSVSSVGALCTHV； 11. CRGDGWC； 12. CDCRGDCFC； 13. CVNHPAFAC； 14. CRGDRGPDC； 15. CRGDKTTNC； 16. CRGDHAGDC； 17. CLSYYPSYC； 18. CTPSPPFSHC； 19. CPHSKPCLC； 20. CSDSWHYWC； 21. CSDWQHPWC； 22. CSDYNHHWC； 23. CSDGQHYWC； 24. CYDSWHYWC； 25. CFDGNHIWC； 26. CTDFPRSFC； 27. CTQDRQHPC； 28. CLSRYLDQC； 29. CRGDCF； 30. CGNSNPKSC； 31. CPHNLTKLC；以及 其中，當形成第一態樣的抗癌劑時，該砷原子結合並橋接在上述胜肽序列的該兩個半胱胺酸殘基之間。
12. 一種藥學組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述之抗癌劑，及藥學上可接受的載體、稀釋劑及/或賦形劑。
13. 一種治療患者的癌症的方法，其包括對患者施予如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述之抗癌劑及如申請專利範圍第12項所述之藥學組合物，以治療該患者的癌症的步驟。
14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該癌症為血液惡性腫瘤或固體腫瘤。
15. 如申請專利範圍第13項或第14項所述之方法，其中該癌症選自白血病、多發性骨髓瘤及淋巴瘤。
16. 如申請專利範圍第13項至第15項中任一項所述之方法，其中該癌症選自由鱗狀細胞癌、基底細胞癌、黑色素瘤、腺體或導管之上皮襯膜的腫瘤、腺癌、乳突癌、肝及膽道的乳突狀腺癌腫瘤、肝細胞癌、腸胃道的腫瘤、食道的鱗狀細胞癌、食道的腺癌、大腸直腸癌(大腸癌)、胃上皮癌(胃癌)、呼吸道的腫瘤、支氣管癌、小細胞癌、泌尿生殖道的大細胞癌腫瘤、膀胱的移行細胞癌、膀胱的鱗狀細胞癌、攝護腺癌、子宮頸癌、血液細胞及相關細胞(白血病)、急性及慢性淋巴球性白血病、真性紅細胞增多症、淋巴組織癌、包括霍奇金氏淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤的惡性淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、瀰漫性淋巴瘤、小淋巴性淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、結締組織腫瘤、骨肉瘤癌、神經系統腫瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、與致癌基因病毒相關的寡樹圖神經膠細胞瘤、巴氏淋巴瘤、免疫力低下個體中的b細胞淋巴瘤、鼻咽癌、食道與胃食道癌、表皮鱗狀細胞癌、胰島細胞瘤、乳癌、肺癌、大腸直腸癌、視網膜母細胞瘤、肝癌、胰臟癌、腦癌、中皮瘤及b型肝炎病毒肝細胞癌所組成之群組。
17. 如申請專利範圍第13項至第15項中任一項所述之方法，其中當該癌症為白血病，其選自由慢性骨髓细胞性白血病、T細胞淋巴瘤、骨髓增生不良症候群、大腸癌、胰臟癌、腦癌、中皮瘤及急性前骨髓性細胞白血病(APL)所組成之群組。
18. 如申請專利範圍第13項至第17項中任一項所述之方法，其中該抗癌劑與免疫療法、單株抗體、化學療法、輻射防護劑及放射治療的一種或多總組合施予。
19. 一種製造抗癌劑的製程，其包括以下步驟： (a)將包含兩個半胱胺酸殘基的腫瘤導引胜肽接觸砷化合物；以及 (b)使砷與該兩個半胱胺酸殘基的每一個結合，以形成包含結合砷原子的環化腫瘤導引胜肽； 以製造抗癌劑。
20. 如申請專利範圍第19項所述之製程，其中該砷化合物為砷的氧化物。
21. 如申請專利範圍第19項或第20項所述之製程，其中該砷化合物進一步包含結合至砷的烷基、羥基或芳基。
22. 如申請專利範圍第19項至第21項任一項所述之製程，其進一步包含步驟(a)(i)：修飾所選之腫瘤導引胜肽以具有兩個半胱胺酸殘基。
23. 一種抗癌劑，其藉由如申請專利範圍第19項至第22項中任一項所述的製程製造。
24. 一種對患者遞送治療有效劑量的砷的方法，其包括對患者施予適當量的如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述之抗癌劑及如申請專利範圍第12項所述之藥學組合物，以對患者遞送治療有效劑量的砷的步驟。
25. 一種診斷癌症的方法，其包括以下步驟： (i)對患者施予包含至少一種放射線標記原子的如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述之抗癌劑； (ii)允許該抗癌劑被定位於癌症；以及 (iii)偵測該抗癌劑的該至少一種放射線標記原子的存在， 以診斷該癌症。

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