ES2452719B1

ES2452719B1 - Compuestos antitumorales de rutenio (II)

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Publication number: ES2452719B1
Application number: ES201231511A
Authority: ES
Inventors: Mª Concepción LÓPEZ MARTÍNEZ; Lluís BELSA MIRET; Asensio GONZÁLEZ GAZULLA; Ramón MESSEGUER PEYPOCH; Carme Calvis Calpe
Original assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB; Leitat Technological Centre
Current assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB; Leitat Technological Centre
Priority date: 2012-10-01
Filing date: 2012-10-01
Publication date: 2015-01-26
Anticipated expiration: 2032-10-01
Also published as: ES2452719A1

Abstract

Compuestos antitumorales de rutenio (II).#Los nuevos compuestos (II) donde n = 1; Y{sup,-} es PF{sub,6}{sup,-}; L es MeCN; R{sup,1}, R{sup,2} y R{sup,3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl y OCH{sub,3}; R{sup,4} es H y R{sup,7} es CH{sub,3} muestran alta actividad citotóxica en líneas celulares de cáncer de mama. Lo mismo sucede con los nuevos compuestos (II) donde n = 0 y L es Cl, siendo iguales los demás radicales. La actividad en células normales no- proliferativas es relativamente baja. Las actividades de (II), tanto con n = 1 como con n = 0, son más altas que las de los compuestos de platino (II) trans- y cis-[Pt(A)Cl{sub,2}(dmso)] derivados de idénticos compuestos fenilindólicos A. Así, los compuestos (II) son útiles para el tratamiento del cáncer, particularmente del cáncer de mama.

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos antitumorales de rutenio (II)

Esta invención se refiere a nuevos compuestos de rutenio (II), así como a sus usos terapéuticos o 5 métodos de tratamiento.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El desarrollo de nuevos compuestos organometálicos con aplicaciones en medicina es actualmente un 10 área de investigación intensiva. El descubrimiento de las actividades antineoplásicas de cis-[PtCl2(NH3)2] (cisplatino) en 1960 y su creciente uso clínico ha desencadenado el desarrollo de varios tipos de nuevos agentes citotóxicos basados en platino, tales como carboplatino y oxaliplatino, con gran eficacia contra diferentes tipos de tumores (testicular, de ovario, pulmonar, etc.). Desafortunadamente, cisplatino, carboplatino y oxaliplatino: (i) muestran una actividad limitada contra otros tumores comunes (p.ej. 15 tumores de mama o de colon); (ii) provocan efectos adversos, tales como toxicidad renal, naúseas y disrupción de médula ósea, generalmente atribuidos a la presencia de platino, y (iii) provocan resistencia al fármaco. Para superar algunos de estos problemas o limitaciones, se ha enfocado mucha investigación hacia el diseño y preparación de nuevos principios activos antitumorales conteniendo metales, con mayor actividad y/o menores efectos secundarios adversos. 20

Recientemente se ha encontrado que compuestos organometálicos, i.e. compuestos metálicos con al menos un enlace covalente metal-carbono, son candidatos prometedores para principios activos farmacéuticos, tal como se describe p.ej. en G. Gasser et al., "Organometallic Anticancer Compounds", J. Med. Chem. 2011, vol. 54, pp. 3-25, y en las referencias allí citadas, donde se revisan compuestos 25 antitumorales de platino, hierro, rodio, iridio, osmio y rutenio.

Buscando nuevos agentes antitumorales que puedan ser una alternativa a los usados actualmente y/o que puedan tener menores efectos secundarios indeseables, M. Pfeffer et al., en la solicitud internacional de patente WO 2006/016069 A1, ha propuesto algunos compuestos organometálicos de rutenio (i.e. 30 compuestos con al menos un enlace covalente carbono-rutenio) que tienen un enlace intramolecular nitrógeno-rutenio, donde el átomo de nitrógeno pertenece al ligando orgánico enlazado al metal por el átomo de carbono. Esta solicitud internacional de patente ha dado lugar a varias patentes concedidas, tales como US 8.193.175 B2 y EP 1.776.103 B1, donde se reivindican composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de rutenio con fórmulas 1 y 2. 35

Yn n +RuCNL1L4L3L2
Yn n +RuCNL1R1

40

45

50
1 2

En las fórmulas 1 y 2: L1 , L2 , L3 y L4 , idénticos o diferentes, representan, o bien un ligando dador con 2 electrones provenientes de un átomo de nitrógeno, oxígeno, fósforo o azufre, o bien un átomo de 55 halógeno; R1 representa un átomo de hidrógeno o uno o más substituyentes sobre el radical fenilo, seleccionados entre (C1-C6)-alquilo y (C6-C18)-arilo; Y- es un contraanión cuando n es 1, o no existe cuando n es 0; la línea curva entre C y N representa un ligando orgánico donde los átomos C y N están separados por 2-5 átomos. En este tipo de disposición atómica, el rutenio forma parte de una entidad cíclica, y estos compuestos generalmente se llaman compuestos ciclometalados. 60

La solicitud internacional de patente WO 2011/001109 A1, que también tiene a M. Pfeffer como primer inventor, describe compuestos de rutenio similares a los de la WO 2006/016069 A1. Sin embargo, en todos los ligandos C,N específicamente descritos en ambos documentos el átomo de N dador, o bien está
al final de una cadena de alquilo (i.e. es un átomo de N tipo amina, como en -CH2-CH2-NH2 ), o bien está formando parte de un anillo aromático de seis miembros (i.e. es un N tipo piridina). En ninguno de los compuestos específicamente mencionados en estos documentos del estado de la técnica el átomo de N dador está formando parte de un anillo de cinco miembros.
5
El estado de la técnica sugiere que la naturaleza del ligando C,N es crítica para la actividad del compuesto de rutenio (II). Además, a pesar de los intensos esfuerzos en I+D, ningún compuesto de rutenio ha sido comercializado todavía como principio activo farmacéutico antitumoral. Así pues, se necesitan nuevos compuestos organometálicos que puedan ser alternativas a los compuestos antitumorales de platino actualmente usados. 10

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona nuevos compuestos de rutenio (II) con 2-fenilindoles substituidos particulares como ligandos, que sorprendentemente muestran actividades antitumorales mayores que las 15 de los correspondientes compuestos de platino (II).

Así, un aspecto de la presente invención se relaciona con la provisión de un compuesto de rutenio que tiene la fórmula semi-sandwich (I), que comprende un grupo Ru(6-areno) -enlazado, donde n es 1 o 0.
20

NNR4R2R3OR7R1RuYn Ln +R6

25

30

35

(I) 40

Cuando n = 1, (I) es iónico e Y- es un anión seleccionado del grupo que consiste en PF6- , BF4- , CF3CO2- , CH3CO2- , CF3SO3- y NO3- ; además, cuando n = 1 L es un ligando dador neutro con dos electrones provenientes de un átomo de nitrógeno, oxígeno, fósforo o azufre. Cuando n = 0, (I) es neutro (el anión Y- no existe) y L es F, Cl o Br . 45

R1 , R2 , R3 y R4 , idénticos o diferentes, son radicales independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, (C1-C3)-alquilo, (C1-C3)-alcoxilo y OH; R6 es H o uno o más substituyentes sobre el radical fenilo, seleccionados del grupo que consiste en (C1-C3)-alquilo y (C6-C18)-arilo; y R7 es un radical seleccionado del grupo que consiste en H y (C1-C6)-alquilo. 50

Los grupos alquilos pueden ser lineales o ramificados. Los grupos (C6-C18)-arilo son radicales provenientes de sistemas mono-, bi- o tricíclicos, de hidrocarburos aromáticos, con entre 6 y 18 átomos de carbono, donde los anillos pueden estar aislados o fusionados, tales como los grupos fenilo, naftilo y bi-fenilo. 55

En una realización preferida, los compuestos de rutenio son aquéllos en los que el Ru(6-areno) es Ru(6-p-cimeno), que tienen la fórmula (II).

En una primera realización particular de los compuestos (II), n = 1 e Y- es un anión seleccionado del grupo 60 que consiste en PF6- , BF4- , CF3CO2- , CH3CO2- , CF3SO3- y NO3- , siendo PF6- el preferido.

Cuando n = 1 L es un ligando dador neutro con dos electrones provenientes de un átomo de nitrógeno, oxígeno, fósforo o azufre. Un ligando dador neutro L preferido es MeCN.

5
NNR4R2R3OR7R1RuMeMeMeYn Ln +

10

15

20

(II)
25

En realizaciones particulares R1 , R2 , R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, CH3 , OCH3 y OH ; y R7 se selecciona del grupo que consiste en H y CH3 . Realizaciones preferidas son aquéllas en las que R1 , R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl y OCH3 ; R4 es H, y R7 es CH3 . 30

Realizaciones específicas de los compuestos (II) con n = 1 son los compuestos 7a-7e de fórmula [Ru(6-p-cymene){(2-C,N)-2-(4’R1-C6H3)-3NOMe-5R2-6R3-(C8H2N)}(MeCN)][PF6], cuyo dibujo se muestra, y donde R1 , R2 , R3 , R4 y R7 son como sigue:
35
R1 = R2 = R3 = R4 = H , R7 = CH3 (compuesto 7a);
R1 = Cl , R2 = R3 = R4 = H , R7 = CH3 (compuesto 7b);
R1 = H , R2 = OCH3 , R3 = H , R4 = H , R7 = CH3 (compuesto 7c);
R1 = F , R2 = OCH3 , R3 = H , R4 = H , R7 = CH3 (compuesto 7d); y
R1 = F , R2 = OCH3 , R3 = OCH3 , R4 = H , R7 = CH3 (compuesto 7e). 40

NNR4R2R3OR7R1RuMeMeMeNCMePF6+

45

50

55

60
7

En una segunda realización particular de los compuestos (II), n = 0 (i.e. Y- no existe) y L es F, Cl o Br, preferentemente Cl.

En realizaciones particulares R1 , R2 , R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, CH3 , OCH3 y OH ; y R7 se selecciona del grupo que consiste en H y CH3 . Realizaciones 5 preferidas son aquéllas en las que R1 , R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl y OCH3 ; R4 es H y R7 es CH3 .

Realizaciones específicas de los compuestos (II) con n = 0 son los compuestos 6a-6e de fórmula [Ru(6-p-cimeno){(2-C,N)-2-(4’R1-C6H3)-3NOMe-5R2-6R3-(C8H2N)}Cl], cuyo dibujo se muestra, y donde R1 , R2 , 10 R3 , R4 y R7 son los correspondientes a 7a-7e, respectivamente.

NNR4R2R3OR7R1RuMeMeMeCl
15

20

25

30

6

Los compuestos de fórmula (I) pueden estar en forma cristalina, bien como compuestos no solvatados o como solvatos (p.ej. hidratos). Se pretende que ambas formas estén dentro del alcance de la protección 35 de la presente invención. Métodos para preparar solvatos se conocen generalmente en la técnica.

La preparación de los compuestos de fórmula (I) o (II) donde n = 1 y L es diferente de MeCN, puede llevarse a cabo mediante el tratamiento de los compuestos (I) o (II) donde n = 1 y L es MeCN, con un exceso del correspondiente ligando neutro L, siendo L preferiblemente un disolvente coordinante. 40

La preparación de los compuestos de fórmula (I) o (II) donde n = 1 y L es MeCN puede llevarse a cabo mediante la reacción de los compuestos de fórmula (I) o (II) donde n = 0 y L es Cl, con cantidades equimolares de AgY en acetonitrilo. Los ejemplos que acompañan ilustran la preparación de los compuestos 7a-7e a partir de los compuestos 6a-6e mediante la reacción con cantidades equimolares de 45 Ag[PF6] en acetonitrilo.

La preparación de los compuestos de fórmula (I) donde n = 0 y L es Cl puede llevarse a cabo haciendo reaccionar [Ru(6-areno)Cl(-Cl)]2 , el cual puede representarse por la fórmula
50

RuR6ClCl2

55

60
primero con Ag[PF6] en acetona; eliminando después el AgCl por filtración, y finalmente tratando el filtrado con el ligando deseado de fórmula general 3, que se muestra. Las reacciones con ligandos 3a-3e se ilustran en los ejemplos que acompañan, siendo R1 , R2 , R3 , R4 y R7 los correspondientes a 6a-6e y 7a-
7e.

La preparación de los ligandos 3a y 3b ha sido publicada por los inventores, como se menciona en los ejemplos que acompañan. La preparación de los ligandos 3c, 3d y 3e se describe aquí.
5

NNR4R2R3OR7R1

10

15

3
20
Como se muestra en los ejemplos que acompañan, para la comparación de su actividad citotóxica con los compuestos 6a-6c y los compuestos 7a-7c, los inventores han preparado los isómeros trans- (4a-4c) y cis- (5a-5c) de los complejos de platino [Pt(A)Cl2(dmso)] con A = los fenilindoles 3a-3c, respectivamente, donde:
25
R1 = R2 = R3 = R4 = H , R7 = CH3 en los compuestos 3a, 4a y 5a;
R1 = Cl , R2 = R3 = R4 = H , R7 = CH3 en los compuestos 3b, 4b y 5b; y
R1 = H , R2 = OCH3 , R3 = H , R4 = H , R7 = CH3 en los compuestos 3c, 4c y 5c.

30
NNR4R2R3OR7PtCldmsoClR1

NNR4R2R3OR7PtdmsoClClR1

35

40

4 5 45

Respecto a las condiciones específicas para llevar a cabo los procedimientos de obtención de los compuestos de la presente invención, el experto en la materia sabría cómo ajustar los parámetros de cada uno de los pasos indicados, a la luz de la descripción, los ejemplos y el conocimiento común y general en química. 50

Se ha determinado la inhibición del crecimiento celular in vitro de los compuestos de rutenio y platino mencionados específicamente antes, en las líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 y MDA-MB231. Los resultados de los valores IC50 correspondientes a la inhibición del crecimiento de las células cancerosas al nivel del 50% se muestran en la Tabla 1. A efectos de comparación, se ha realizado un 55 estudio paralelo con los ligandos 3a-3e y con el cisplatino. Los ligandos 3a, 3b y 3e no muestran actividad citotóxica relevante frente a ninguna de las dos líneas celulares.

La Tabla 1 muestra las actividades citotóxicas en las líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 y MDA-MB231, de los ligandos libres 3a-3e y de los dos grupos de compuestos de rutenio, a saber, los neutros 60 6a-6e y los iónicos 7a-7e. A efectos de comparación, también se incluyen en la Tabla 1 los datos de los isómeros trans-(4a-4c) y cis-(5a-5c) de los compuestos de platino [Pt(A)Cl2(dmso)], siendo A = 3a-3c, así como los datos del cisplatino, siempre en idénticas condiciones experimentales.

La Tabla 1 muestra que, en general, con el mismo ligando 3a-3e, las actividades citotóxicas de los compuestos iónicos 7a-7e son mayores que las correspondientes a los compuestos neutros 6a-6e. De todos los productos ensayados, el compuesto 7b y -en menor medida- el compuesto 7d son especialmente destacados, pues exiben valores de IC50 a un nivel submicromolar. Consecuentemente, están entre los compuestos de rutenio (II) más citotóxicos que se conocen. 5

Como se ilustra en los ejemplos que acompañan, la actividad citotóxica de the compuestos de la presente invención es mayor sobre células proliferativas que sobre células normales no-proliferativas.

10

Table 1: Results de viability assays con proliferating cells: IC50 (M) for cell lines

Type de compuesto: Compound R1 R2 R3 MCF-7 MDA-MB231

Ligands: 3a H H H  100  80

: 3b Cl H H  100  100

: 3c H OMe H 34  100

: 3d F OMe H > 100 > 12.4

: 3e F OMe OMe > 100 > 100

Platinum compuestos

Trans: 4a H H H 2.1 4.4

: 4b Cl H H 35 16

: 4c H OMe H 12 7.2

Cis: 5a H H H 13 12

: 5b Cl H H 7.3 4.3

: 5c H OMe H 16 15

Ruthenium compuestos

neutral (n = 0): 6a H H H 2.1 1.1

: 6b Cl H H 1.1 0.45

: 6c H OMe H 1.9 1.3

: 6d F OMe H 5.4 3.5

: 6e F OMe OMe 3.7 3.2

ionic (n = 1): 7a H H H 1.5 1.4

: 7b Cl H H 0.66 0.57

: 7c H OMe H 2.4 1.9

: 7d F OMe H 0.91 0.87

: 7e F OMe OMe 1.7 1.5

cisplatin: 19 6.5

Otro aspecto de la invención se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de los compuestos de rutenio antes definidos, y 15 cantidades suficientes de excipientes farmacéuticamente aceptables. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva", como aquí se usa, se refiere a una cantidad de un compuesto que, cuando se administra, es suficiente para impedir el desarrollo de, o aliviar en alguna medida, uno o más de los síntomas de la enfermedad. La dosis particular de compuesto administrada según esta invención obviamente vendrá determinada por las circunstancias particulares que rodeen el caso, incluyendo el 20 compuesto administrado, la vía de administración, la enfermedad particular de que se trate y consideraciones similares.

La expression "excipientes farmacéuticamente aceptables" se refiere a materiales, composiciones o vehículos farmacéuticamente aceptables. Cada excipiente debe de ser farmacéuticamente aceptable en 25 el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición farmacéutica. También ha de ser adecuado para usarse en contacto con el tejido u órgano de humanos y animales, sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, immunogénesis u otro problema o complicación acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
30
Otro aspecto de la invención se relaciona con cualquiera de los compuestos de rutenio antes definidos, para uso como principio activo farmacéutico; particularmente para uso en el tratamiento del cáncer; y más específicamente para uso en el tratamiento del cáncer de mama. Este aspecto también puede expresarse como el uso de uno de los compuestos de rutenio antes definidos para la manufactura de un
medicamento para el tratamiento del cáncer, particularmente del cáncer de mama. La presente invención también se relaciona con un método para el tratamiento o prevención del cáncer, particularmente del cáncer de mama, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de uno de los compuestos de rutenio antes definidos, junto con cantidades suficientes de excipientes farmacéuticamente aceptables, en un animal que lo necesite, incluyendo un humano. 5

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso "consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los 10 siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas

EJEMPLOS 15

En los ligandos 3, los complejos neutros de rutenio 6 y los complejos iónicos de rutenio 7, las letras a-e que los acompañan se refieren a los siguientes conjuntos de substituyentes:

a : R1 = H ; R2 = H ; R3 = H 20
b : R1 = Cl ; R2 = H ; R3 = H
c : R1 = H ; R2 = OMe ; R3 = H
d : R1 = F ; R2 = OMe ; R3 = H
e : R1 = F ; R2 = OMe ; R3 = OMe
25
Materiales y métodos

Bromuro de cetiltrimetilamonio (Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB), [Ru(6-p-cimeno)Cl(-Cl)]2, Ag[PF6] y NaOAc se obtuvieron de fuentes comerciales y se utilizaron tal y como se recibieron.
30
El cis-[PtCl2(dmso)2] y los ligandos (4’R1-C6H4)-3NOMe-5R2-6R3-(C8H2N) con R1 = R2 = R3 = H (3a) y R1 = Cl y R2 = R3 = H (3b), se prepararon tal y como se describe en C. López et al., "Cyclopalladation of 3-methoxyimino-2-phenyl-3H-indoles", J. Organomet. Chem. 2008, vol. 693, pp. 2877-2886, y en las referencias allí incluidas. Los isómeros trans-(4a-4b) y cis-(5a-5b) de los compuestos de platino [Pt(A)Cl2(dmso)] (con A = 3a-3b) se prepararon tal y como se describe en C. López et al., "Synthesis, 35 crystal structures and properties of cis- and trans-isomers of [Pt{C6H4-4R1-1[C8H4N-3'-NOMe]}Cl2(dmso)] (R1 = H or Cl)", J. Mol. Struct. 2011, vol. 999, pp. 49-59. Todos los disolventes se secaron y destilaron siguiendo los procedimientos estándar, excepto el acetonitrilo que fue de calidad HPLC.

Preparación del ligando (4’R1-C6H4)-3NOMe-5R2-6R3-(C8H2N) con R1 = H, R2 = OMe , R3 = H (3c) 40

A una solución que contiene 3-hidroxiimino-5-metoxi-2-fenil-3H-indol (666 mg, 3.0 × 10-3 mol), CTAB (690 mg, 1.9 × 10-3 mol) y NaOH (12 mL de una disolución al 40 %) en CH2Cl2 (125 mL), se adicionó yoduro de metilo (2.28 g, 1 mL, 16 × 10-3 mol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Tras este periodo, se adicionó agua (75 mL) y la disolución resultante se transfirió a un embudo de 45 decantación. Se separó la capa orgánica, y la capa acuosa se extrajo con 20 mL de CH2Cl2. Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. La posterior purificación por cromatografía flash sobre alúmina neutra, usando dietil éter como eluyente, produjo la liberación de una banda roja, que se recogió y concentró a sequedad en un evaporador rotatorio, dando 3c. El producto se recogió y se secó al vacío durante un día. Rendimiento: 710 mg (89 %). Anal. (%) calc. 50 para C16H14N2O2 (Peso molecular, molecular weight, M.W. = 266.29 g/mol): C, 72.16; H, 5.30; N, 10.52; encontrado: C, 72.8; H, 5.6; N, 9.8. Espectrometría de masas (Mass Spectrometry, MS) (ESI+): m/z = 267.1 {[M]+H}+. IR: 1592 cm-1 [(C=N-)].

Preparación de los ligandos (4’R1-C6H4)-3NOMe-5OMe-6R3-(C6H2N) con R1 = F y R3 = H (3d), y con 55 R1 = F y R3 = OMe (3e).

Una solución que contiene 3 × 10-3 mol del correspondiente precursor (4’F-C6H4)-3NOH-5OMe-6R3-(C6H3N)} (R3 = H o OMe) {0.811 g (para 3d) y 0.901 g (para 3e), respectivamente}, CTAB (666 mg, 3.0 ×10-3 mol) y 12 mL de una solución de NaOH al 40% en CH2Cl2, se trató con yoduro de metilo (2.28 g, 1 60 mL, 16 × 10-3 mol). La mezcla resultante se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. Tras este periodo se añadió agua (75 mL) y la disolución se transfirió a un embudo de decantación. La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con 20 mL de CH2Cl2. Los extractos orgánicos se combinaron, se
secaron con Na2SO4, y después se filtró. El filtrado se concentró en un evaporador rotatorio y a continuación se hizo una cromatografía flash sobre alúmina neutra. La elución con una mezcla dietil éter: CH2Cl2 (1:1) produjo una banda naranja que se recogió y se concentró a sequedad en un evaporador rotatorio. Los sólidos obtenidos se recogieron y se secaron al vacío durante 24 h. Rendimientos: 0.72 g (84%) para 3d y 0.69 g (74%) para 3e. Para 3d: Anal (%) calc. for C16H13FN2O2 (M.W. 284.29 g/mol): C, 5 67.60; H, 4.61; N, 9.85; encontrado: C, 67.59; H, 4.51; N, 9.37. MS (ESI+): m/z = 285.1 {[M]+1}+. IR: 1549 cm-1 [(>C=N-)]. Datos para 3e: Anal (%) calc. para C17H15FN2O3 (M.W. 314.31 g/mol): C, 64.96; H, 4.81; N, 8.91; encontrado: C, 65.12; H, 5.09; N, 8.73. MS (ESI+): m/z = 315.1 {[M]+1}+. IR: 1615 cm-1 [(>C=N-)].

Preparación de trans-[Pt(C8H3N-2-C6H5-3-NOMe-5-OMe)Cl2(dmso)] (4c)·CH2Cl2 . 10

Una suspensión formada por 232 mg de cis-[PtCl2(dmso)2] (5.5 × 10-4 mol) y 30 mL de metanol de calidad HPLC se protegió de la luz con papel de aluminio y se calentó a reflujo hasta la completa disolución. Entonces la disolución caliente se filtró y el filtrado se añadió a una disolución que contenía 146 mg de 3c (5.5 × 10-4 mol) y 5 mL de metanol. La disolución roja resultante se refluyó durante 1h. Tras este periodo 15 la disolución caliente se concentró hasta aproximadamente 10 mL y se dejó enfriar hasta 298 K. El sólido formado se recogió y se secó al aire durante 12 h. Posteriormente se disolvió en la mínima cantidad de CH2Cl2 ; la evaporación lenta del disolvente a aproximadamente 277 K produjo cristales rojo oscuro que se recogieron y se secaron al aire durante 3 h. Rendimiento: 219 mg (57%). Datos para 4c·CH2Cl2 : Anal. (%) calc. para C18H20Cl2N2O3PtS·CH2Cl2 (M.W. = 695.34 g/mol): C, 32.82; H, 3.19; N, 4.03; S, 4.61; 20 encontrado: C, 32.7; H, 3.20; N, 3.95; S, 4.55: MS (ESI+): m/z = 611.0 {[M-(CH2Cl2)] + H}+. IR (cm-1): 1588 [(C=N-)] y 359 [(Pt-Cl)].

Preparación de cis-[Pt(C8H3N-2-C6H5-3-NOMe-5-OMe)Cl2(dmso)] (5c)
25
El compuesto 5c se aisló mediante un procedimiento análogo al descrito para 4c, pero utilizando un periodo de reflujo de 14 h. La solución de color rojo oscuro obtenida tras el reflujo se concentró a sequedad en un evaporador rotatorio. Entonces el residuo se disolvió en la mínima cantidad de CH2Cl2 y se pasó a través de una columna de SiO2 (2.0 cm × 16.0 cm). La elución con CH2Cl2 primero, y después con una mezcla CH2Cl2 : MeOH (50:3), produjo la liberación de dos bandas que se recogieron y 30 concentraron a sequedad en un evaporador rotarorio dando 4c (155 mg, 46%) y 5c (123 mg, 37%), respectivamente. Datos para 5c: Anal.(%) calc. para C18H20Cl2N2O3PtS (M.W. = 610.41 g/mol): C, 35.42; H, 3.30; N, 4.59; S, 5.25; encontrado: C, 35.5; H, 3.3; N, 4.5; S, 5.18. MS (ESI+): m/z = 611 {[M]+H}+. IR (cm-1): 1590 [(C=N)-], 347 y 310 [(Pt-Cl)].
35
Procedimiento general para la síntesis de los compuestos neutros [Ru(6-p-cimeno){(2-C,N)-2-(4’R1-C6H3)-3NOMe-5R2-6R3-(C8H2N)]}Cl] (6a-6e)

41 mg de Ag[PF6] (1.6 × 10-4 mol) se disolvieron en 15 mL de acetona. La disolución resultante se transfirió a un matraz Erlenmeyer conteniendo 50 mg (8.20 × 10-5 mol) de [Ru(6-p-cimeno)Cl(-Cl)]2. El 40 matraz se protegió de la luz con papel de aluminio, se conectó a un refrigerante y se calentó a 328 K durante 3 días. Posteriormente el AgCl formado se separó mediante filtración con papel Whatmann y el filtrado se trató con 1.6 × 10-4 mol del ligando deseado {2-(4’R1-C6H4)-3NOMe-5R2-6R3-(C8H2N)} (3a-3e). La mezcla de reacción se calentó a 328 K bajo agitación constante durante 24 h. Posteriormente se filtró y el filtrado se concentró a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo marrón oscuro se trató con la 45 mínima cantidad de CH2Cl2 y se pasó a través de una columna de SiO2 (2 cm × 50 cm). La elución con CH2Cl2 produjo dos bandas. La primera que se eluyó era naranja y dio tras la concentración una pequeña cantidad del correspondiente ligando libre. La segunda produjo, tras la concentración en un evaporador rotatorio, el compuesto 6a-6e correspondiente como un sólido de color marrón púrpura oscuro.
50
Datos para 6a: Anal. (%) calc. para C25H25ClN2ORu (M.W. = 506.07 g/mol): C, 59.34; H, 4.98; N, 5.54; encontrados: C, 59.10; H, 4.93; N, 5.54. MS (ESI+) m/z = 524.1 {[M]+ (NH4)}+, 507.1 {[M]+ H}+ y 471.1 {[M]-Cl}+. IR: 1631 cm-1 [(>C=N-)].

Datos para 6b: Anal. (%) calc. para C25H25Cl2N2ORu·1/2 CH2Cl2 (M.W. = 582.91 g/mol): C, 52.54; H, 4.32; 55 N, 4.81; Encontrados: C, 52.69; H, 4.50; N, 4.95. MS (ESI+) m/z = 558.1 {[M]- (1/2 CH2Cl2)+ (NH4)}+, 541.0 {[M]-(1/2 CH2Cl2)+ H}+ y 505.1 {[M]-(1/2 CH2Cl2)-Cl}+ . IR: 1574 cm-1 [(>C=N-)].

Datos para 6c: Anal. (%) calc. para C25H24Cl2N2ORu·1/2CH2Cl2 (M.W. = 540.1 g/mol): C, 52.54; H, 4.32; N, 4.81; encontrados: C, 52.69; H, 4.50; N, 4.95. MS (ESI+) m/z = 558.1 {[M]+(NH4)}+; 541.0 {[M]+H}+ y 60 505.1 {[M]-Cl}+. IR: 1565 cm-1 [(>C=N-)].

Datos para 6d: Anal. (%) calc. para C26H26ClFN2O2Ru· (M.W. = 554.02 g/mol): C, 56.37; H, 4.73; N, 5.06; encontrados: C, 56.42; H, 4.85; N, 4.97. MS (ESI+) m/z = 572.1 {[M+ (NH4)}+; 555.1 [{M]+H}+ y 519.1 {[M]-Cl}-. IR: 1577 cm-1 [(>C=N-)].

Datos para 6e: Anal. (%) calc. para C27H28ClFN2O3Ru·1/2 H2O (M.W. = 593.80 g/mol): C, 54.46; H, 4.83; 5 N, 4.80; encontrados: C, 54.85; H, 5.02; N, 4.73. MS (ESI+) m/z = 602.1 {[M]-(½ H2O)+ (NH4)}+; 585.1 [{M]- (½ H2O) +H}+ y 549.1 {[M]-Cl}- . IR: 1581 cm-1 [(>C=N-)].

Procedimiento general para la síntesis de los compuestos iónicos [Ru(6-p-cimeno){(2-C,N)-2-(4’R1-C6H3)-3NOMe-5R2-6R3-(C8H2N)]}(MeCN)][PF6] (7a-7e) 10

Una cantidad de 7.4 × 10-5 mol del compuesto correspondiente 6a-6e se introdujo en un matraz Erlenmeyer y se protegió de la luz con papel de aluminio. Entonces se añadió una disolución formada por 19 mg (7.4 × 10-5 mol) de Ag[PF6] y 15 mL de MeCN. El matraz se conectó a un refrigerante y la mezcla se calentó 328 K durante 24 h bajo agitación contínua. El AgCl formado se separó por filtración usando 15 papel Whatmann y el filtrado se concentró a sequedad en un evaporador rotatorio. El sólido marrón oscuro formado se recogió y se secó al vacío. Rendimientos: 15 mg (47%) para 7a, 30 mg (94%) para 7b, 43 mg (84%) para 7c, 20 mg (63%) para 7d y 28 mg (90%) para 7e.

Datos para 7a: Anal. (%) calc. para C27H28F6N3OPRu (M.W. = 656.56 g/mol): C, 49.93; H, 4.32; N, 6.28; 20 encontrados: C, 50.10; H, 4.30; N, 6.40. MS (ESI+) m/z = 511.6 {[M]-[PF6]}- y 471.1 {[M]-([PF6]-CH3CN)}-. IR (cm-1): 1596 [(>C=N-)] y 841 [(P-F)].

Datos para 7b: Anal. (%) calc. para C27H27ClF6N3OPRu (M.W. = 691.01 g/mol): C, 46.93; H, 3.94; N, 6.08. encontrados: C, 47.01; H, 3.98; N, 5.98. MS (ESI+) m/z = 546.1 {[M]-[PF6]}- y 505.0 {[M]-[PF6]-CH3CN)}-. IR 25 (cm-1): 1572 [(>C=N-)] y 841 [(P-F)].

Datos para 7c: Anal. (%) calc. para C28H30F6N3O2PRu (M.W. = 686.59 g/mol): C, 48.98; H, 4.40; N, 6.12; encontrados: C, 49.03; H, 4.46; N, 6.05. MS (ESI+) m/z= 542.1 {[M]-[PF6]}- y 501.0 {[M]-[PF6]-CH3CN)}-)}+. IR (cm-1): 1567 [ (>C=N-)] y 840 [(P-F)]. 30

Datos para 7d: Anal. (%) calc. para C28H29F7N3O2PRu (M.W. = 705.09 g/mol): C, 47.73; H, 4.15; N, 5.96; encontrados: C, 47.80; H, 4.20; N, 6.01; MS (ESI+) m/z= 560.1 {[M]-[PF6]}- y 519.1 {[M]-([PF6]-CH3CN)}-. IR (cm-1): 1577 [(>C=N-)] y 840 [(P-F)].
35
Datos para 7e: Anal. (%) calc. para C29H31F7N3O3PRu (M.W. = 735.10 g/mol): C, 47.41; H, 4.25; N, 5.72; encontrados: C, 47.58; H, 4.28; N, 5.70. MS (ESI+) m/z= 590.1 {[M]-[PF6]}- y 549.1 {[M]-([PF6]-CH3CN)}-. IR (cm-1): 1581 [(>C=N-)] y 841 [(P-F)].

Ensayos de viabilidad con células proliferativas 40

Las células de cáncer de mama MDA-MB-231 y MCF-7 se hicieron crecer en cultivos monocapa en medio DMEM high glucose (Gibco-BRL 31966-21) con 10% suero de ternero fetal (fetal calf serum, FCS) inactivado por temperatura (56 oC) (Gibco-BRL 10106-169). Durante el cultivo, las células se expandieron hasta llegar a un 80%-90% de confluencia. Primero se retiraba cualquier resto de medio mediante lavados 45 con HBSS libre de cationes, seguido de una incubación con tripsina ([0.5 µg/mL]/EDTA [0.2 µg/mL]) (Gibco-BRL, 15400054) en HBSS a 37 ºC; posteriormente se transferían al medio de cultivo específico más 10% FCS. Para los ensayos de viabilidad celular de MCF-7 y MDA-MB231, los compuestos se disolvieron en dmso (100%) a 50 mM. Posteriormente se realizaron diluciones seriadas en dmso (1:1) (de este modo la concentración de dmso en el medio celular fue siempre la misma); finalmente, se hicieron 50 diluciones 1:500 de las series de los compuestos en el medio celular. El ensayo se realizó según K. T. Givens et al., "Proliferation of Human Ocular Fibroblasts", Investigative Ophthalmology & Visual Science 1990, vol. 31, pp. 1856-1862. Las células MDA-MB231 y MCF-7 se sembraron en placas de 96 pocillos (Cultek) a razón de 5000 células/pocillo o 10000 células/pocillo, respectivamente, en 100 µL de medio de cultivo. A las 24 h, el medio se substituyó por 100 µL/pozo de las series de diluciones de las drogas. Los 55 pocillos de control no contenían los compuestos. Cada concentración puntual se realizó por triplicado. Los blancos de control que contenían el medio y el reactivo colorimétrico sin las células también se incluyeron en la misma placa. Los valores de los blancos se substrajeron de los valores del test, siendo el valor medio un 5-10% de los valores del control positivo. Las placas se incubaron durante 72 h. Para la medida de la actividad de la hexosaminidase, se retiró el medio de cada pocillo y las células se lavaron una vez 60 con PBS. A continuación, se añadieron a cada pocillo 60 µL de una solución de substrato (p-nitrofenol-N-acetil-β-D-glucosamida 7.5 mM [Sigma N-9376], citrato de sodio 0.1 M, pH = 5.0, 0.25% Triton X-100) y se realizó una incubación a 37 °C durante 1-2 h; tras este tiempo de incubación aparecía un color amarillo,
momento en el que se revelaban las placas mediante la adición 90 µL/pocillo de una disolución de revelador (glicina 50 mM, pH = 10.4; EDTA 5 mM). La intensidad del color se midió por absorbancia a 410 nm.

El análisis de los datos se hizo calculando el porcentaje de la viabilidad celular normalizada frente los 5 valores del control negativo, que se tomaron como el 100%. La curva se ajustó utilizando la ecuación sigmoidea dosis-respuesta con pendiente variable) y los valores de IC50 se obtuvieron a partir de la ecuación Y = Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((Log EC50-X)*HillSlope)); donde: X es el logaritmo de la concentración; Y es la respuesta; e Y empieza en la parte inferior y llega al máximo con un perfil sigmoideo. Los resultados se muestran en la Tabla 1. 10

Ensayos de viabilidad con células no proliferativas

Se usó la línea celular WI-38, que es una línea de fibroblasto normal embrionaria de pulmón y tiene una vida limitada, calculada en 50 ± 10 pases; y la línea VA-13, que deriva de la línia WI-38 transformada con 15 el virus SV40. Las células WI-38 y VA-13 se descongelaron en DMEM high glucose (Gibco-BRL 31966-21) con 10% FCS inactivado por temperatura (56 oC). Durante el cultivo, las células se expandieron cuando llegaban a un 80%-90% de confluencia. Primero se retiraba cualquier resto de medio mediante lavados con HBSS libre de cationes, seguido de una incubación con tripsina ([0.5 µg/mL]/EDTA [0.2 µg/mL]) (Gibco-BRL, 15400054) en HBSS a 37 ºC; posteriormente se transferían al medio de cultivo 20 específico más 10% FCS. Para el ensayo, las células se trataban de la misma forma, se contaban y se distribuían a una concentración de 10000 células/pocillo en placas de 96 pocillos (Cultek). El medio fue el mismo que para el mantenimiento regular. Tras 24 h, se aportó un suplemento al medio de 100 µL/pocillo de una dilución seriada (1:1) de LB-6D a una concentración inicial de100 µM. Al mismo tiempo, las células se mantenían en cultivo hasta que dejaban de dividirse (cultivo finito). 25

Los ensayos de viabilidad se llevaron a cabo tras 72 h de incubación. Para la medida de la actividad de la hexosaminidase, se retiró el medio de cada pocillo y las células se lavaron una vez con PBS. A continuación, se añadieron a cada pocillo 60 µL de una solución de substrato (p-nitrofenol-N-acetil-β-D-glucosamida 7.5 mM [Sigma N-9376], citrato de sodio 0.1 M, pH = 5.0, 0.25% Triton X-100) y se realizó 30 una incubación a 37 ºC durante 1-2 horas; tras este tiempo de incubación aparecía un color amarillo, momento en el que se revelaban las placas mediante la adición 90 µL/pocillo de una disolución de revelador (glicina 50 mM, pH = 10.4; EDTA 5 mM). La intensidad del color se midió por absorbancia a 410 nm.
35
El análisis de los datos se hizo calculando el porcentaje de la viabilidad celular normalizada frente los valores del control negativo, que se tomaron como el 100%. La curva se ajustó utilizando la ecuación sigmoidea dosis-respuesta con pendiente variable) y los valores de IC50 se obtuvieron a partir de la ecuación Y = Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((Log EC50-X)*HillSlope)); donde : X es el logaritmo de la concentración; Y es la respuesta; e Y empieza en la parte inferior y llega al máximo con un perfil 40 sigmoideo.

En este ejemplo los valores de IC50 para el compuesto 6b fueron 1.8 and 3.7 µM, para WI-38 y VA-13, respectivamente. Estos valores son parecidos a los obtenidos para las líneas celulares de cáncer de mama. Estos resultados son los esperados debido al efecto del compuesto sobre la replicación del ADN 45 Sin embargo, cuando se trataron con el compuesto 6b a 3 µM las células que ya no se multiplicaban (cultivo finito), no se observó ningún efecto significativo al compararlas con el control.

50

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto de rutenio que tiene la fórmula (I)

5 NNR4R2R3OR7R1RuYn Ln +R6

(I)

donde n es 1 o 0;
cuando n = 1 Y- es un anión seleccionado del grupo que consiste en PF6- , BF4- , CF3CO2- , CH3CO2- , 10 CF3SO3- y NO3- ; además, cuando n = 1 L es un ligando dador neutro con dos electrones provenientes de un átomo de nitrógeno, oxígeno, fósforo o azufre;
cuando n = 0, i.e. el anión Y- no existe, L es F, Cl o Br;
R1 , R2 , R3 y R4 , idénticos o diferentes, son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, (C1-C3)-alquilo, (C1-C3)-alcoxilo y OH; 15
R6 es H o uno o más substituyentes sobre el radical fenilo, seleccionado del grupo que consiste en (C1-C3)-alquilo y (C6-C18)-arilo; y
R7 es un radical seleccionado del grupo que consiste en H y (C1-C6)-alquilo.

2. Compuesto de rutenio según la reivindicación 1, que tiene la fórmula (II). 20

NNR4R2R3OR7R1RuMeMeMeYn Ln +
(II)

25
3. Compuesto de rutenio según la reivindicación 2, donde: n = 1; Y- es un anión seleccionado del grupo que consiste en PF6- , BF4- , CF3CO2- , CH3CO2- , CF3SO3- y NO3- ; y L es un ligando dador neutro con dos electrones provenientes de un átomo de nitrógeno, oxígeno, fósforo o azufre.

4. Compuesto de rutenio según la reivindicación 3, donde Y- es PF6- y L es MeCN. 30

5. Compuesto de rutenio según cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, donde R1 , R2 , R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, CH3 , OCH3 y OH; y
R7 se selecciona del grupo que consiste en H y CH3 .

6. Compuesto de rutenio según la reivindicación 5, donde R1 , R2 y R3 se seleccionan independientemente 5 del grupo que consiste en H, F, Cl y OCH3 ; R4 es H y R7 es CH3 .

7. Compuesto de rutenio según la reivindicación 6, seleccionado del grupo que consiste en los cinco compuestos 7a-7e de fórmula [Ru(6-p-cimeno){(2-C,N)-2-(4’R1-C6H3)-3NOMe-5R2-6R3-(C8H2N)}(MeCN)][PF6] , donde R1 , R2 y R3 son los siguientes: 10

R1 = R2 = R3 = H (compuesto 7a);
R1 = Cl , R2 = R3 = H (compuesto 7b);
R1 = H , R2 = OCH3 , R3 = H (compuesto 7c);
R1 = F , R2 = OCH3 , R3 = H (compuesto 7d); y 15
R1 = F , R2 = OCH3 , R3 = OCH3 (compuesto 7e).

8. Compuesto de rutenio según la reivindicación 2, donde n = 0 y L es F, Cl o Br.

9. Compuesto de rutenio según la reivindicación 8, donde L es Cl. 20

10. Compuesto de rutenio según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde R1 , R2 , R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, CH3 , OCH3 y OH; y
R7 se selecciona del grupo que consiste en H y CH3 .
25
11. Compuesto de rutenio según la reivindicación 10, donde R1 , R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl y OCH3 ; R4 es H y R7 es CH3 .

12. Compuesto de rutenio según la reivindicación 11, seleccionado del grupo que consiste en los cinco compuestos 6a-6e de fórmula [Ru(6-p-cimeno){(2-C,N)-2-(4’R1-C6H3)-3NOMe-5R2-6R3-(C8H2N)}Cl], 30 donde R1 , R2 y R3 son los siguientes:

R1 = R2 = R3 = H (compuesto 6a);
R1 = Cl , R2 = R3 = H (compuesto 6b);
R1 = H , R2 = OCH3 , R3 = H (compuesto 6c); 35
R1 = F , R2 = OCH3 , R3 = H (compuesto 6d); y
R1 = F , R2 = OCH3 , R3 = OCH3 (compuesto 6e).

13. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un compuesto de rutenio como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, y cantidades suficientes 40 de excipientes farmacéuticamente aceptables.

14. Uso de un compuesto de rutenio como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.
45
15. Uso según la reivindicación 14, donde el cáncer es cáncer de mama.