BR112020006901A2 - ligantes de integrina e usos dos mesmos - Google Patents

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Zhen Li
Xiaokai Li
Erik W. Bush
Rui Zhu
Jonathan Benson
Dongxu Shu
Patrick Shao
Matthew Fowler-Watters
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Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.
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Abstract

(fórmula i) a presente invenção refere-se a ligantes sintéticos da integrina a¿ß6 de fórmula i apresentando estabilidade sérica e afinidade para integrina a¿ß6, que é um receptor expresso em uma variedade de tipos de célula. os ligantes descritos são úteis para distribuir moléculas de carga, tais como agentes de rnai ou outros compostos à base de oligonucleotídeo, para células que expressam a integrina a¿ß6, e assim facilitam a absorção das moléculas de carga nessas células. também são descritas composições que incluem ligantes da integrina a¿ß6 e métodos de uso.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LIGAN- TES DE INTEGRINA E USOS DOS MESMOS”. Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório US Série Nº 62/580.398, depositado em 1 de novembro de 2017, o Pedido de Patente Provisório US Série Nº 62/646.739, deposi- tado em 22 de março de 2018, e o Pedido de Patente Provisório US Série Nº 62/679.549, depositado em 1 de junho de 2018, cujas ínte- gras encontram-se aqui incorporadas a título de referência. Antecedentes
[0002] A integrina alfa-v beta-6 (avB6), que é expressa em vários tipos de célula incluindo células epiteliais, é um receptor para o peptí- dio associado à latência (LAP) do TGF-E e para as proteínas da matriz extracelular (ECM) fibronectina, vitronectina, e tenascina. Embora difi- cilmente detectável no epitélio de adultos saudáveis normais, a integri- na avB6 é supra-regulada durante a cicatrização de feridas e em dife- rentes tipos de câncer (por exemplo, câncer de cólon, de ovário, en- dometrial, e gástrico), e com frequência é associado a um pobre prog- nóstico contra câncer. Já foi demonstrado que a integrina avB6 pode promover a invasão e a migração de células na metástase, e inibir a apoptose. A integrina avB6 também pode regular a expressão de me- taloproteases matriciais (MMP's) e ativar o TGF-B1. Há cada vez mais evidências, principalmente a partir de estudos in vitro, que sugerem que a integrina avB6 pode promover a evolução de carcinomas. Assim sendo, a integrina avB6 é atraente como um biomarcador de tumores e potencial-alvo terapêutico tendo em vista, entre outras coisas, seu pa- pel na expressão de metaloproteases matriciais (MMPs) e na ativação de TGF-B1.
[0003] A distribuição in vivo de compostos terapeuticamente efica- zes, tais como compostos medicamentosos, para as células e/ou teci-
dos desejados, continua sendo um desafio geral para o desenvolvi- mento de produtos medicamentosos. Continua a haver necessidade de ligantes vetorizados estáveis e eficazes que sejam capazes de atingir seletivamente células ou tecidos-alvo, que possam ser empre- gados para facilitar a distribuição vetorizada de moléculas de carga (por exemplo, um composto ou princípio terapeuticamente ativo) para células ou tecidos específicos. De fator, há uma necessidade geral de ligantes vetorizados que possam ser conjugados a uma ou mais molé- culas de carga desejadas, tal como um ou mais produtos medicamen- tosos ou outras cargas úteis, para facilitar a distribuiçô das moléculas de carga para as células ou tecidos desejados in vivo. Além disso, há uma necessidade de compostos que atinjam a integrina alfa-v beta-6, que sejam adequados para serem conjugados a moléculas de carga, para distribuir as moléculas de carga para células que expressam a integrina alfa-v beta-6, in vivo. Quando às moléculas de carga especí- ficas, tais como compostos terapêuticos à base de oligonucleotídeo (por exemplo, oligonucleotídeos antissentido ou agentes de RNAi), há uma necessidade de ligantes vetorizados que sejam capazes de atin- gir a integrina alfa-v beta-6 que possam ser conjugados a compostos à base de oligonucleotídeo para distribuir o terápico para células e/ou tecidos que expressam a integrina alfa-v beta-6, e facilitar a entrada do terápico na célula através de endocitose mediada por receptor, pinoci- tose, ou por outros meios.
Sumário
[0004] Neste pedido são descritos novos ligantes da integrina avB6 sintéticos (neste pedido também denominados ligantes de avB6 ligands). Os ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido são es- táveis no soro e têm afinidade para, e podem ligar-se com especifici- dade, a integrinas avB6. Os ligantes da integrina avB6 podem ser con- jugados a moléculas de carga para facilitar a distribuição da molécula de carga para células ou tecidos desejados que expressam a integrina avB6, tal como células epiteliais.
[0005] Também neste pedido são revelados métodos de distribui- ção de uma molécula de carga para um tecido e/ou célula expressan- do a integrina avB6 in vivo, onde os métodos incluem administrar a um indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 revelados neste pedi- do que foram conjugados a uma ou mais moléculas de carga. São ain- da revelados métodos de tratamento de um indivíduo que tenha uma doença, sintoma, ou distúrbio para o qual a distribuição de uma molé- cula de carga terapêutica (por exemplo, um princípio farmacêutico ati- vo) para uma célula expressando a integrina avB6 é capaz de tratar o indivíduo, onde o método inclui administrar a um indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido que foram conjuga- dos a uma ou mais moléculas de carga terapêuticas.
[0006] Em algumas modalidades, são descritos neste pedido mé- todos de inibição da expressão de um gene-alvo em uma célula, onde os métodos incluem administrar à célula uma quantidade eficaz de um ou mais ligantes da integrina avB6 que foram conjugados a um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo (por exemplo, um terápico à base de oligonucleotídeo) capazes de inibir a expressão de um ge- ne-alvo em uma célula, tal como um agente de RNAi. Em algumas modalidades, são descritos neste pedido métodos de inibição da ex- pressão de um gene-alvo em uma célula de um indivíduo, onde o indi- víduo recebe uma quantidade eficaz de um ou mais ligantes da inte- grina avB6 que foram conjugados a um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo (por exemplo, um terápico à base de oligonucleotídeo) capazes de inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula, tal co- mo um agente de RNAi.
[0007] Ainda descritas neste pedido são composições farmacêuti- cas que incluem ligantes da integrina avB6. As composições descritas neste pedido podem ser composições farmacêuticas que incluem um ou mais ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido conjugados a uma ou mais substâncias terapêuticas, tal como um agente de RNAi ou outra molécula de carga.
[0008] Em algumas modalidades, neste pedido são descritos mé- todos de tratamento de um indivíduo tendo uma doença ou distúrbio mediado pelo menos em parte pela expressão de um gene-alvo, onde os métodos incluem administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica, on- de a composição farmacêutica inclui um ou mais ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido conjugados a um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo, tal como um agente de RNAi.
[0009] Em um primeiro aspecto, esta invenção apresenta ligantes da integrina avB6 sintéticos.
[0010] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido inclui a estrutura da seguinte fórmula: Sr "Ro o o 2! ão RS RA ESmula 1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde, n é um inteiro de 0 a 7; Jé C-H ou N; Z é OR3, N(R13)2 ou SR'?; R' é H, C1-C6 alquila opcionalmente substituída, OH, COOH, CON(Rº)2, ORô, ou R' compreende uma molécula de carga, onde ca- da Rº é independentemente H ou C1-C6 alquila, e Rº é H ou C1-C6 alquila; R?, RP! e RP? são cada um deles independentemente H, halo, cicloal-
quileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, ou heteroarileno opci- onalmente substituído, ou R?, RP? e RP? podem compreender uma mo- lécula de carga; R*º é H ou alquila opcionalmente substituída; R'! é H ou alquila opcionalmente substituída, ou R'* e R' junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um heterociclo opcional- mente substituído; R'? é H ou alquila opcionalmente substituída; cada R'? é independentemente H, alquila opcionalmente substituída, ou R'? compreende uma molécula de carga; R** é alquila opcional- mente substituída; e onde pelo menos um dentre R', R?à, R'3, Rº* e RP? compreende uma molécula de carga.
[0011] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido pode ser conjugado a uma ou mais (por exemplo, 2,3,4,5,6,7,8,9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30; ou 1 a 30, 1 a 25, 1a20,1a15,1a 10, 1a5,5a30,5a25,5a20,5a15,5a10,10a30,10a25,10a 20, 10 a 15, 15 a 30, 15 a 25, 15 a 20, 20 a 30, 20 a 25, ou 25 a 30) moléculas de carga (por exemplo, qualquer uma das moléculas de carga descritas neste pedido ou conhecidas na literatura).
[0012] Em algumas modalidades, mais de um avB6 ligante da in- tegrina revelado neste pedido (por exemplo, 2, 3, 4, 5,6,7,8, ou 1 a 8, 1a7,1a6,1a5,1a4,1a3,1a2,/2a8,2a7,2a6,2a5,2a4,2 a3,3a8,3a7,3a6,3a5,3a4,4a8,4a7,4a6,ou4as5ligantes da integrina avB6) pode ser conjugado a uma molécula de carga (por exemplo, qualquer uma das moléculas de carga descritas neste pedido ou conhecidas na literatura).
[0013] Em um outro aspecto, esta invenção apresenta composi-
ções que incluem um ou mais dos ligantes da integrina avB6 descritos neste pedido. Por exemplo, em algumas modalidades, as composições compreendendo um ou mais ligantes da integrina avB6 revelados nes- te pedido incluem um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo, tal como um ou mais agentes de RNAi, para serem distribuídos para uma célula in vivo. Em algumas modalidades, neste pedido são descri- tas composições para distribuir um agente de RNAi para uma célula in vivo, onde o agente de RNAi é ligado a um ou mais ligantes da integri- na avB6.
[0014] São descritas composições que incluem um ou mais ligan- tes da integrina avB6. Em algumas modalidades, uma composição compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, uma composição que inclui um ou mais ligantes da inte- grina avB6 compreende uma ou mais outras substâncias farmacêuti- cas ou princípios ou compostos farmaceuticmente ativos. Em algumas modalidades, neste pedido são descritos medicamentos que incluem um ou mais ligantes da integrina avB6.
[0015] Composições que incluem um ou mais ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido conjugados a uma ou mais moléculas de carga podem facilitar a distribuição da molécula de carga in vivo ou in vitro para células que expressam a integrina avB6. Por exemplo, com- posições que incluem um ou mais ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido podem distribuir moléculas de carga, tais como compos- tos à base de oligonucleotídeo, in vivo ou in vitro, para células epiteli- ais alveolares tipo | e Il, células caliciformes, células epiteliais secreto- ras, células epiteliais ciliadas, células epiteliais da córnea e da conjun- tiva, células epiteliais dérmicas, colangiócitos, enterócitos, células epi- teliais ductais, células epiteliais glandulares, e tumores epiteliais (car- cinomas).
[0016] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta mé-
todos que compreende o uso de um ou mais ligantes da integrina avB6 e/ou composições descritas neste pedido e, se desejado, colocar os ligantes da integrina avB6 revelados e/ou as composições em uma forma adequada para administração como um produto farmacêutico. Em outras modalidades, a invenção apresenta métodos para a produ- ção dos ligantes e composições, por exemplo, medicamentos, descri- tos neste pedido.
[0017] As composições que incluem um ou mais ligantes da inte- grina avB6 podem ser administradas ao indivíduos in vivo por meio de vias de administração conhecidas na literatura como sendo adequadas para tal administração tendo em vista a molécula de carga que se bus- ca administrar, incluindo, por exemplo, administração por inalação (formulações aerossóis ou de pó seco), intranasal, subcutânea, intra- venosa, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, oral, sublingual, tópica, ou intratumoral. Em algumas modalidades, as composições que incluem um ou mais ligantes da integrina avB6 podem ser adminis- tradas para distribuição sistêmica, por exemplo, por administração in- travenosa ou subcutânea. Em algumas modalidades, as composições que incluem um ou mais ligantes da integrina avB6 podem ser adminis- tradas para distribuição localizada, por exemplo, por distribuição por inalação via um inalador ou nebulizador de pó seco. Em algumas mo- dalidades, as composições que incluem um ou mais ligantes da inte- grina avB6 podem ser administradas para distribuição localizada por administração tópica.
[0018] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para uma célula epitelial alveolar tipo | in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados a uma ou mais moléculas de carga.
[0019] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé-
todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para uma célula epitelial alveolar tipo Il in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados a uma ou mais moléculas de carga.
[0020] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para uma célula caliciforme in vivo, onde os métodos incluem ad- ministrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjuga- dos a uma ou mais moléculas de carga.
[0021] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para uma célula epitelial secretora in vivo, onde os métodos inclu- em administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados a uma ou mais moléculas de carga.
[0022] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para uma célula epitelial ciliada in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conju- gados a uma ou mais moléculas de carga.
[0023] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para uma célula epitelial da córnea in vivo, onde os métodos in- cluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados a uma ou mais moléculas de carga.
[0024] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para uma célula epitelial da conjuntiva in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados a uma ou mais moléculas de carga.
[0025] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé-
todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para uma célula epitelial dérmica in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conju- gados a uma ou mais moléculas de carga.
[0026] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para um colangiótico in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados a uma ou mais moléculas de carga.
[0027] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para um enterócito in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados a uma ou mais moléculas de carga.
[0028] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para uma célula epitelial ductal in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conju- gados a uma ou mais moléculas de carga.
[0029] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para uma célula epitelial glandular in vivo, onde os métodos inclu- em administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados a uma ou mais moléculas de carga.
[0030] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de uma ou mais moléculas de carga deseja- das para um tumor epitelial (carcinoma) in vivo, onde os métodos in- cluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados a uma ou mais moléculas de carga.
[0031] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé-
todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para uma célula epitelial alveolar tipo | in vivo, onde os métodos inclu- em administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a distribuição de um agente de RNAi para uma célula epitelial alveolar tipo | in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula epitelial alveo- lar tipo | in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a integrina avB6.
[0032] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para uma célula epitelial alveolar tipo Il in vivo, onde os métodos inclu- em administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a distribuição de um agente de RNAi para uma célula epitelial alveolar tipo Il in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula epitelial alveo- lar tipo Il in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a integrina avB6.
[0033] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para uma célula caliciforme in vivo, onde os métodos incluem adminis-
trar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em algumas mo- dalidades, neste pedido são revelados métodos para a distribuição de um agente de RNAi para uma célula caliciforme in vivo, onde os méto- dos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas moda- lidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula caliciforme in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a integrina avB6.
[0034] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para uma célula epitelial secretora in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conju- gados ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em al- gumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a dis- tribuição de um agente de RNAi para uma célula epitelial secretora in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula epitelial secretora in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a inte- grina avB6.
[0035] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para uma célula epitelial ciliada in vivo, onde os métodos incluem ad- ministrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjuga- dos ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em algu- mas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a distri-
buição de um agente de RNAi para uma célula epitelial ciliada in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula epitelial ciliada in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a integrina avpB6.
[0036] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para uma célula epitelial da córnea in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conju- gados ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em al- gumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a dis- tribuição de um agente de RNAi para uma célula epitelial da córnea in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula epitelial da córnea in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a integrina avB6.
[0037] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para uma célula epitelial da conjuntiva in vivo, onde os métodos inclu- em administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a distribuição de um agente de RNAi para uma célula epitelial da conjun- tiva in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula epitelial da conjuntiva in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afini- dade para a integrina avB6.
[0038] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para uma célula epitelial dérmica in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conju- gados ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em al- gumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a dis- tribuição de um agente de RNAi para uma célula epitelial dérmica in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula epitelial dérmica in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a inte- grina avB6.
[0039] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para um colangiócito in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a distribuição de um agente de RNAi para um colangiócito in vivo, onde os métodos incluem admi- nistrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pe- dido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em um colangiócito in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a integrina avB6.
[0040] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para um enterócito in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a distribuição de um agente de RNAi para um enterócito in vivo, onde os métodos incluem adminis- trar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em um enterócito in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indiví- duo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a integrina avB6.
[0041] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para uma célula epitelial ductal in vivo, onde os métodos incluem ad- ministrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjuga- dos ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em algu- mas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a distri- buição de um agente de RNAi para uma célula epitelial ductal in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula epitelial ductal in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a integrina avB6.
[0042] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para uma célula epitelial glandular in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conju- gados ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em al- gumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a dis- tribuição de um agente de RNAi para uma célula epitelial glandular in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula epitelial glandular in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a inte- grina avB6.
[0043] Em algumas modalidades, neste pedido são revelados mé- todos para a distribuição de um composto à base de oligonucleotídeo para um tumor epitelial (carcinoma) in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conju- gados ao um ou mais compostos à base de oligonucleotídeo. Em al- gumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para a dis- tribuição de um agente de RNAi para um tumor epitelial (carcinoma) in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um ou mais ligantes da integrina avB6 conjugados ao um ou mais agentes de RNAi. Em algumas modalidades, neste pedido são revelados métodos para inibir a expressão de um gene-alvo em um tumor epitelial (carcinoma) in vivo, onde os métodos incluem administrar ao indivíduo um agente de RNAi conjugados a um ou mais ligantes que têm afinidade para a integrina avB6.
[0044] A menos que definido em contrário, todos os termos técni- cos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que aquele comumente conhecido pelo especialista na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equiva- lentes àqueles descritos neste pedido possam ser usados na prática ou testes da presente invenção, métodos e materiais adequados estão descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas neste pedido estão aqui incorpora- das em sua íntegra a título de referência. Em caso de conflito, o pre- sente relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerão. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a serem limitativos.
[0045] Outros objetos, características, aspectos, e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da descrição detalhada e das rei- vindicações que se seguem. Descrição Detalhada Ligantes da Integrina avB6.
[0046] Neste pedido são descritos ligantes da integrina avB6 sinté- ticos apresentando estabilidade sérica e afinidade para a integrina avB6. Os ligantes da integrina avB6 podem ser usados para atingir cé- lulas que expressam a integrina avB6 in vitro, in situ, ex vivo, e/ou in vivo. Em algumas modalidades, os ligantes da integrina avB6 revela- dos neste pedido podem ser conjugados a uma ou mais moléculas de carga para preferivelmente direcionar e vetorizar as moléculas de car- ga para células que expressam a integrina avB6 in vitro, in situ, ex vivo, e/ou in vivo. Em algumas modalidades, as moléculas de carga incluem ou consistem em compostos farmaceuticamente ativos. Em algumas modalidades, as moléculas de carga incluem ou consistem compostos à base de oligonucleotídeo, tal como agentes de RNAi. Em algumas modalidades, os ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido são conjugados a moléculas de carga para direcionar as moléculas de car- ga para células epiteliais in vivo.
[0047] Em um primeiro aspecto, esta invenção apresenta ligantes da integrina avB6 sintéticos.
[0048] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido inclui a estrutura da seguinte fórmula: Sr "Ru o o 2) nº ” Re fórmula 1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde, n é um inteiro de 0 a 7; Jé C-H ou N; Z é OR'?, N(R13)2 ou SR'?; R' é H, C1-C6 alguila opcionalmente substituída, OH, COOH, CON(Rº)2, ORô, ou R' compreende uma molécula de carga, onde ca- da Rº é independentemente H ou C1-C6 alquila, e Rº é H ou C1-C6 alquila; R?, RP? e RP? são cada um deles independentemente H, halo, cicloal- quileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, ou heteroarileno opci- onalmente substituído, ou R?, RP? e RP? podem compreender uma mo- lécula de carga; R*º é H ou alquila opcionalmente substituída; R*! é H ou alquila opcionalmente substituída, ou R'* e R junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um heterociclo opcional- mente substituído; R'? é H ou alquila opcionalmente substituída; cada R'º é independentemente H, alquila opcionalmente substituída, ou R'? compreende uma molécula de carga; R'* é alquila opcional- mente substituída; e onde pelo menos um dentre R', Rºà, R'?, RP e RP? compreende uma molécula de carga.
[0049] Em algumas modalidades, n=3 na fórmula |. Em algumas modalidades, n=4 na fórmula |.
[0050] Em algumas modalidades da fórmula |, Rº é naftileno. Em algumas modalidades da fórmula |, R? é naftileno substituído e R? também compreende uma molécula de carga.
[0051] Em algumas modalidades um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido inclui a estrutura da seguinte fórmula: Ru Ro À & OR SH Y 13 Rº (fórmula 11) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde, n é um inteiro de O a 7 (isto é, né 0, 1,2, 3,4,5,6,ou7); Jé C-HouN; R' é H, C1-C6 alquila, CH(R?)(Rº), OH, COOH, CH2CH2CH2aNH>7, CO- NHR”, ORº, onde R? é H ou C1-C6 alquila, Rº é H, C1-C6 alquila, Rº é H ou C1-C6 alquila, e Rº é H ou C1-C6 alquila; R? é cicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, ou hetero- arileno opcionalmente substituído, R'*º é H ou alquila opcionalmente substituída; R*! é H ou alquila opcionalmente substituída, ou R'* e R' junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um heterociclo opcional- mente substituído; R'? é H ou alquila opcionalmente substituída; R'? é H ou alquila opcionalmente substituída; R*º é alquila opcionalmente substituída;
onde pelo menos um dentre R' ou R? inclui uma molécula de carga.
[0052] Em algumas modalidades, n=3 na fórmula Il. Em algumas modalidades, n=4 na fórmula |l.
[0053] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido inclui a estrutura da seguinte fórmula: 7 Coto (SJ OH 2N o : o Rº (fórmula ll) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde, n é um inteiro de 1 a 7 (isto é, n é 1,2, 3,4,5,6, ou7); R” inclui uma ou mais moléculas de carga; e Rº é uma ou mais poções cíclicas divalentes opcionalmente substituí- das tendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 átomos de carbono, tal como ci- cloalquila (por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo- hexila, ou ciclo-heptila), cicloalquenila (por exemplo, ciclopentenila, ciclobutenila, ciclopentenila, ciclo-hexenila, ou ciclo-heptenila), arila (por exemplo, fenila), heteroarila (por exemplo, piridila, pirimidinila, pi- ridazinila, pirrol, pirazol, imidazol, tiofeno, benzotiofeno, thiazol, benzo- tiazol, furano, oxazol, isoxazol, benzofuran, indol, indazol, benzimi- dazol, oxadiazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, tetrazol, quinolinila, isoqui- nolinila, ou quinoxalinila), ou heterociíclla (por exemplo, tetra- hidrofurano, tetra-hidropirano, piperidina, pirrolidina, dioxano, ou dioxo- lano).
[0054] Em algumas modalidades, n=3 na fórmula Ill. Em algumas modalidades, n=4 na fórmula III.
[0055] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedid
Ro NA on
FIO
AAA (fórmula IV) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde, n é um inteiro de 1 a 7 (isto é, né 1,2,3,4,5,6,ou7) e Rº inclui uma ou mais moléculas de carga.
[0056] Em algumas modalidades, n=3 na fórmula IV. Em algumas modalidades, n=4 na fórmula IV.
[0057] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um precursor de ligante vetorizado para integrina da estrutura: qn Rº o R nº 7 (ST HI 2) ão o o Ré Ro fórmula 1b) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde, n é um inteiro de 0 a 7; J é C-H ou N; Z é OR", N(R13)2 ou SR'?; R' é H, C1-C6 alquila opcionalmente substituída, OH, COOH, CON(Rº)2, ORô, ou R' compreende um grupo de ligação conjugado a um grupo reativo, onde cada R*º é independentemente H ou C1-C6 al- quila, e Rº é H ou C1-C6 alquila; R?, RP! e RP? são cada um deles independentemente H, halo, cicloal- quileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, ou heteroarileno opci-
onalmente substituído, ou R?, RP e RP? podem compreender um grupo de ligação conjugado a um grupo reativo; R'*º é H ou alquila opcionalmente substituída; R*! é H ou alquila opcionalmente substituída, ou R'* e R junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um heterociclo opcional- mente substituído; R'? é H ou alquila opcionalmente substituída; cada R'? é independentemente H, alquila opcionalmente substituída, ou R'? compreende um grupo de ligação conjugado a um grupo reativo; R*º é alquila opcionalmente substituída; e onde pelo menos um dentre R', R?, R'?, RP e RP? compreende um grupo de ligação conjugado a um grupo reativo.
[0058] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido pode ser conjugado a uma ou mais (por exemplo, 2,3,4,5,6,7,8, 9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30; ou 1 a 30, 1a 25, 1a 20,1a15,1a 10, 1a5,5a30,5a25,5a20,5a15,5a10,10 a 30, 10a25,10a 20, 10 a 15, 15 a 30, 15 a 25, 15 a 20, 20 a 30, 20 a 25, ou 25 a 30) moléculas de carga (por exemplo, qualquer uma das moléculas de carga descritas neste pedido ou conhecidas no estado da técnica).
[0059] Em algumas modalidades, more than one avB6 ligante da integrina revelado neste pedido (por exemplo, 2, 3, 4, 5,6,7,8, ou 1 a 8,1a7,1a6,1a5,1a4,1a3,1a2,2a8,2a7,2a6,2a5,2a4, 2a3,3a8,3a7,3a6,3a5,3a4,4a8,4a7,4a6,o0uU4ab5ligan- tes da integrina avB6) podem ser conjugados a uma molécula de carga (por exemplo, qualquer uma das moléculas de carga descritas neste pedido ou conhecidas no estado da técnica).
[0060] Em algumas modalidades, os ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido são opcionalmente conjugados a uma ou mais moléculas de carga via um grupo de ligação, tal como, por exemplo,
um grupo polietileno glicol (PEG).
[0061] Em algumas modalidades, os ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido são opcionalmente conjugados a uma ou mais moléculas de carga via um cadafalso que inclui pelo menos um ponto de ligação para cada ligante e pelo menos um ponto de ligação para cada molécula de carga. Em algumas modalidades, os ligantes da in- tegrina avB6 compreendem, consistem em, ou consistem essencial- mente em, uma molécula de carga. Em algumas modalidades, os |li- gantes da integrina avB6 compreendem, consistem em, ou consistem essencialmente em, mais de uma molécula de carga.
[0062] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 com- preende, consiste em, ou consiste essencialmente em, qualquer uma dentre Estrutura 1, Estrutura 2, Estrutura 5, Estrutura 5.1, Estrutura 5.2, Estrutura 6, Estrutura 6.1, Estrutura 6.2, Estrutura 6.3, Estrutura 6.4, Estrutura 7, Estrutura 8, Estrutura 9, Estrutura 10, Estrutura 11, Estru- tura 12, Estrutura 13, Estrutura 14, Estrutura 15, Estrutura 16, Estrutu- ra 17, Estrutura 18, Estrutura 19, Estrutura 20, Estrutura 22, Estrutura 23, Estrutura 24, Estrutura 25, Estrutura 27, Estrutura 29, Estrutura 30, Estrutura 31, Estrutura 32, Estrutura 33, Estrutura 34, Estrutura 35, Estrutura 36, ou Estrutura 37, todas reveladas neste pedido.
[0063] Qualquer um dos ligantes da integrina avB6 revelados nes- te pedido pode ser ligado a uma molécula de carga, um grupo reativo, e/ou um grupo reativo protegido. Um grupo reativo pode ser usado pa- ra facilitar a conjugação do ligante da integrina avB6 a uma molécula de carga. Os ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido podem aumentar a vetorização de uma molécula de carga para uma integrina avB6 ou para uma célula expressando uma integrina avB6. Uma molé- cula de carga pode ser, porém sem limitação, um princípio ou compos- to farmaceuticamente ativo, um profármaco, ou outra substância com benefício terapêutico ou diagnóstico conhecido. Em algumas modali-
dades, uma molécula de carga pode ser, porém sem limitação, uma molécula pequena, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma imunoglobulina, um anticorpo monocional, um rótulo ou marcador, um lipídio, um composto à base de oligonucleotídeo natural ou modificado (por exemplo, um oligonucleotídeo antissentido ou um agente de RNAi), um ácido nucleico natural ou modificado, um peptídio, um ap- tâmero, um polímero, uma poliamina, uma proteína, uma toxina, uma vitamina, um polietileno glicol, um hapteno, uma digoxigenina, uma biotina, um átomo ou molécula radioativa, ou um fluoróforo. Em algu- mas modalidades, uma molécula de carga inclui um princípio farma- ceuticamente ativo ou um profármaco. Em algumas modalidades, uma molécula de carga inclui um composto à base de oligonucleotídeo co- mo um princípio farmaceuticamente ativo. Em algumas modalidades, uma molécula de carga inclui um agente de RNAi como um princípio farmaceuticamente ativo.
[0064] Conforme usado neste pedido, o termo "alquila” refere-se a um grupo hidrocarboneto alifático saturado, de cadeia linear ou ramifi- cada, tendo de 1 a 10 átomos de carbono a menos que especificado em contrário. Por exemplo. "C1-C6, alquila” inclui grupos alquil tendo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 carbonos em um arranjo linear ou ramificado. Exemplos não limitativos de grupos alquil incluem metila, etila, iso-propila, ter- butila, n-hexila. Conforme usado neste pedido, o termo "aminoalquila” refere-se a um grupo alquil como definido acima, substituído em qual- quer posição com um ou mais grupos amino conforme permitido pela valência normal. Os grupos amino podem ser não-substituídos, mo- nossubstituídos, ou dissubstituídos. Exemplos não limitativos de gru- pos aminoalquil incluem aminometila. dimetilaminometila, e 2- aminoprop-1-ila.
[0065] Conforme usado neste pedido, o termo "cicloalquila” signifi- ca um anel hidrocarboneto não aromático saturado ou insaturado ten-
do de 3 a 14 átomos de carbono, a menos que especificado em con- trário. Exemplos não limitativos de grupos cicloalquil incluem, porém sem limitação, ciclopropila. metil-ciclopropila, 2,2-dimetil-ciclobutila, 2- etil-ciclopentila, e ciclo-hexila. Cicloalquilas podem incluir múltiplos anéis em espiral ou fundidos. Os grupos cicloalquil são opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra-, ou penta-substituídos em qualquer posição con- forme permitido pela valência normal.
[0066] Conforme usado neste pedido, o termo "cicloalquileno" refe- re-se a um radical divalente de um grupo cicloalquil descrito neste pe- dido. Cicloalquileno é um subconjunto de cicloalquila, referente aos mesmos resíduos que cicloalquila, porém tendo dois pontos de substi- > tuíção. Exemplos de cicloalquileno incluem ciclopropilene, 4 1,4-
O TO ciclo-hexileno É e 1,5-ciclo-oxileno Os grupos cicloalquileno são opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra-, ou penta- substituídos em qualquer posição conforme permitido pela valência normal. Os grupos cicloalquileno podem ser mono-, di-, ou tri-cíclicos.
[0067] Conforme usado neste pedido, o termo "alquenila” refere-se a um radical hidrocarboneto não aromático, linear ou ramificado, con- tendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono, e tendo de 2 a átomos de carbono a menos que especificado em contrário. Até cinco ligações duplas carbono-carbono podem estar presentes em tais grupos. Por exemplo. "C2-C6" alquenil é definido como um radical al- quenil tendo de 2 a 6 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquenil incluem, porém sem limitação, etenila, propenila, butenila, e ciclo- hexenila. A porção linear, ramíificada ou cíclica do grupo alquenil pode conter ligações duplas e é opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra-, ou penta-substituída em qualquer posição conforme permitido pela valên- cia normal. O termo "cicloalquenila” significa um grupo hidrocarboneto monocíclico tendo o número de átomos de carbono específicado e pe- lo menos uma ligação dupla carbono-carbono.
[0068] Conforme usado neste pedido, o termo "alquinila” refere-se a um radical hidrocarboneto, linear ou ramíificado, contendo de 2 a 10 átomos de carbono, a menos que especificado em contrário, e conten- do pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Até 5 ligações tri- plas carbono-carbono podem estar presentes. Assim sendo, "C2-C6 alquinila” significa um radical alquinil tendo de 2 a 6 átomos de carbo- no. Exemplos de grupos alquinil incluem, porém sem limitação, etinila, 2-propinila, e 2-butinila. A porção linear ou ramificada do grupo alquinil pode ser opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra-, ou penta-substituída em qualquer posição conforme permitido pela valência normal.
[0069] Conforme usado neste pedido, "alcoxila” ou "alcóxi" refere- se a um radical -O-alquil tendo o número indicado de átomos de car- bono. Por exemplo. C1-C6 alcóxi destina-se a incluir grupos C1, C2, C3, C4, C5, e C6 alcóxi. Por exemplo. C1-8 alcóxi destina-se a incluir grupos C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, e C8 alcóxi. Exemplos de alcóxi incluem, porém sem limitação, metóxi, etóxi, n-propóxi, i-propóxi, n- butóxi, s-butóxi, t-butóxi, n-pentóxi, s-pentóxi, n-heptóxi, e n-octóxi.
[0070] Conforme usado neste pedido, "ceto" refere-se a qualquer grupo alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, cicloalquenila, heteroci- clila, heteroarila, ou aril definido neste pedido preso através de uma ponte carbonila. Exemplos de grupos ceto incluem, porém sem limita- ção, alcanoila (por exemplo. acetila, propionila, butanoila, pentanoila, ou hexanoila), alqguenoila (por exemplo, acriloil) alquinoila (por exemplo, etinoila. propinoila. butinoila, pentinoila, ou hexinoila), ariloila (por exemplo, benzoila), heteroariloila (por exemplo, pirroloila, imidazoloila, quinolinoila, ou piridinoil).
[0071] Conforme usado neste pedido, "alcoxicarbonila” refere-se a qualquer grupo alcóxi definido acima preso através de uma ponte car-
bonil (isto é, -C(O)O-alquil). Exemplos de grupos alcoxicarbonil inclu- em, porém sem limitação, metoxicarbonila, etoxicarbonila, iso- propoxicarbonila, n-propoxicarbonila. t-butoxicarbonila, benziloxicarbo- nila, ou n-pentoxicarbonila.
[0072] Conforme usado neste pedido, "ariloxicarbonila” refere-se a qualquer grupo aril definido neste pedido preso através de uma ponte oxicarbonil (isto é, -C(O)O-aril). Exemplos de grupos ariloxicarbonil in- cluem, porém sem limitação, fenoxicarbonil e naftiloxicarbonila.
[0073] Conforme usado neste pedido, "heteroariloxicarbonila” refe- re-se a qualquer grupo heteroaril definido neste pedido preso através de uma ponte oxicarbonil (isto é. -C(O)O-heteroaril). Exemplos de gru- pos heteroariloxicarbonil incluem, porém sem limitação, 2- piridiloxicarbonila, 2-oxazoliloxicarbonila, 4-tiazoliloxicarbonila, ou piri- midiniloxicarbonila.
[0074] Conforme usado neste pedido, "arila” ou "aromático" signifi- ca qualquer anel de carbono monocíclico ou policíclico estável de até 6 átomos em cada anel, onde pelo menos um anel é aromático. Exem- plos de grupo aril incluem, porém sem limitação, fenila, naftila, antra- cenila, tetra-hidronaftila, indanila, e bifenila. Nos casos em que o subs- tituinte aril é bicíclico e um anel é não aromático, entende-se que a li- gação é feita via o anel aromático. Os grupos aril são opcionalmente mono-, di-, tri-. tetra-, ou penta-substituídos em qualquer posição con- forme permitido pela valência normal.
[0075] Conforme usado neste pedido, o termo "arileno" refere-se a um radical divalente de um grupo aril descrito neste pedido. Arileno é um subconjunto de arila, referente aos mesmos resíduos que arila, po- rém tendo dois pontos de substituição. Exemplos de arileno incluem fenileno, que se refee a um grupo fenil divalente. Os grupos arileno são opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra-, ou penta-substituídos em qualquer posição conforme permitido pela valência normal.
[0076] Conforme usado neste pedido, o termo "halo" refere-se a um radical halogênio, por exemplo, "halo" pode indicar um radical flúor (F), cloro (CI), bromo (Br), ou iodo (1).
[0077] Conforme usado neste pedido, o termo "heteroarila” repre- senta um anel monocíclico ou policíclico estável de até 7 átomos em cada anel, onde pelo menos um anel é aromático e contém de 1 a 4 heteroátomos selecionados do grupo que consiste em O, N, e S. Exemplos de grupos heteroaril incluem, porém sem limitação, acridinila. carbazolila, cinnolinila, quinoxalinila, pirrazolila, indolila. benzotriazolila, furanila, tienila, benzotienila, benzofuranila, benzimidazolonila, ben- zoxazolonila, quinolinila, isoquinolinila, dihidroisoindolonila, imidazopi- ridinila, isoindolonila, indazolila, oxazolila, oxadiazolila, isoxazolila, in- dolila, pirazinila, piridazinila, piridinila, pirimidinila, pirrolila, e tetra- hidroquinolina. Também se entende que "heteroarila” inclui o derivado do tipo N-óxido de qualquer heteroaril contendo nitrogênio. Nos casos em que o substituinte heteroaril é bicíclico e um anel é não aromático ou não contém heteroátomos, entende-se que a ligação é feita via o anel aromático ou via o anel contendo heteroátomos. Os grupos hete- roaril são opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra-, ou penta-substituídos em qualquer posição conforme permitido pela valência normal.
[0078] Conforme usado neste pedido, o termo "heteroarileno" refe- re-se a um radical divalente de um grupo heteroaril descrito neste pe- dido. Heteroarileno é um subconjunto de heteroarila, referente aos mesmos resíduos que heteroarila, porém tendo dois pontos de substi- tuição. Exemplos de heteroaril incluem piridinileno, pirimidinileno, e pirrolileno. Os grupos heteroarileno são opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra-, ou penta-substituídos em qualquer posição conforme permitido pela valência normal.
[0079] Conforme usado neste pedido, o termo "heterociclo”, "hete- rocíclico" ou "heterociclila” significa um heterociclo aromático ou não aromático de 3 a membros contendo de 1 a 4 heteroátomos selecio- nados do grupo que consiste em O, N, e S, incluindo grupos policícli- cos.
Conforme usado neste pedido, o termo "heterocíclico” também é considerado sinônimo dos termos "heterociclo" e "heterociclila” e en- tende-se que também tem as mesmas definições apresentadas neste pedido. "Heterociclila” inclui as heteroarilas mencionadas acima, ssim como análogos do di-hidro e tetra-hidro dos mesmos.
Exemplos de grupos heterociclil incluem, porém sem limitação, azetidinila, benzoi- midazolila, benzofuranila, benzofurazanila, benzopirazolila, benzo- triazolila, benzotiofenila, benzoxazolila, carbazolila, carbolinila, cinnoli- nila, furanila, imidazolila, indolinila, indolila, indolazinila, indazolila. iso- benzofuranila, isoindolila, isoquinolila, isotiazolila, isoxazolila, naftpiri- dinila, oxadiazolila, oxo-oxazolidinila, oxazolila, oxazolina, oxopiperazi- nila, oxopirrolidinila, oxomorfolinila, isoxazolina, oxetanila, piranila, pi- razinila, pirazolila, piridazinila, piridopiridinila, piridazinila, piridila, piridi- nonila, pirimidila, pirimidinonila, pirrolila, quinazolinila, quinolila, quinoxalinila, tetra-hidropiranila, tetra-hidrofuranila, tetra- hidrotiopiranila, tetra-hidroisoquinolinila, tetrazolila, tetrazolopiridila, tiadiazolila, tiazolila, tienila, triazolila, 1,4-dioxanila, hexa-hidroazepinila, piperazinila, piperidinila, piridin-2-onila, pirrolidinila, morfolinila, tiomor- folinila, di-hidrobenzoimidazolila, di-hidrobenzofuranila,di- hidrobenzotiofenila, di-hidrobenzoxazolila, di-hidrofuranila, di- hidroimidazolila, di-hidroindolila, di-hidroisooxazolila, di-hidroisotiazolila, di-hidro-oxadiazolila, di-hidrooxazolila, di-hidropirazinila, di- hidropirazolila, di-hidropiridinila, di-hidropirimidinila. di-hidropirrolila, di- hidroquinolinila. di-hidrotetrazolila, di-hidrotiadiazolila, di-hidrotiazolila, di-hidrotienila, di-hidrotriazolila, di-hidroazetidinila, dioxidotiomorfolinila, metilenodioxibenzoila, tetra-hidrofuranila, e tetra-hidrotienila, e N- óxidos dos mesmos.
A ligação de um substituinte heterociclil pode ocorrer via um átomo de carbono ou via um heteroátomo.
Os grupos heterociíclil são opcionalmente mono-, di-, tri, tetra-, ou penta- substituídos em qualquer posição conforme permitido pela valência normal.
[0080] Conforme usado neste pedido, o termo "heterocicloalquila” significa um heterociclo não aromático de 3 a 14 membros contendo de 1 a 4 heteroátomos selecionados do grupo que consiste em O, N, e S, incluindo grupos policíclicos. Exemplos de grupos heterociclil inclu- em, porém sem limitação, azetidinila, oxopiperazinila, oxopirrolidinila, oxomorfolinila, oxetanila, piranila, piridinonila, pirimidinonila, tetra- hidropiranila, tetra-hidrofuranila, tetra-hidrotiopiranila, tetra- hidroisoquinolinila, 1,4-dioxanila. hexa-hidroazepinila, piperazinila, pi- peridinila, pirrolidinila, morfolinila, tiomorfolinila, di-hidrofuranila, di- hidroimidazolila, di-hidroiso-oxazolila, di-hidroisotiazolila, di-hidro- oxadiazolila, di-hidro-oxazolila, di-hidropirazinila, di-hidropirazolila, di- hidropiridinila, di-hidropirimidinila, di-hidropirrolila, di-hidrotetrazolila, di- hidrotiadiazolila, di-hidrotiazolila, di-hidrotienila, di-hidrotriazolila, dioxi- dotiomorfolinila, e tetra-hidrotienila, e N-óxidos dos mesmos. A ligação de um substituinte heterocicloalquil pode ocorrer via um átomo de car- bono ou via um heteroátomo. Os grupos heterociclil são opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra-, ou penta-substituídos em qualquer posição con- forme permitido pela valência normal.
[0081] Conforme usado neste pedido, o termo "heterocicloalquile- no" refere-se a um radical divalente de um grupo heterocicloalquil des- crito neste pedido. Heterocicloalquileno é um subconjunto de heteroci- cloalquila, referente aos mesmos resíduos que heterocicloalquila, po- rém tendo dois pontos de substituição. Exemplos de heterocicloalqui- leno incluem piperidinileno. azetidinileno. e tetra-hidrofuranileno. Os grupos heterocicloalquileno são opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra-, ou penta-substituídos em qualquer posição conforme permitido pela valência normal.
[0082] Conforme usado neste pedido, os termos "tratar", “trata- mento”, e similares, significam os métodos ou as etapas seguidas para proporcionar o alívio ou a mitigação do número, da severidade, e/ou da frequência de um ou mais sintomas de uma doença em um indiví- duo. Conforme usado neste pedido, "tratar" e "tratamento" podem in- cluir a prevenção, o controle, o tratamento profilático, e/ou a inibição do número, da severidade, e/ou da frequência de um ou mais sintomas de uma doença em um indivíduo.
[0083] Conforme usado neste pedido, a expressão "introdução em uma célula”, quando se referindo a um agente de RNAi, significa a dis- tribuição funcional do agente de RNAi em uma célula. A expressão “distribuição funcional” significa a distribuição do agente de RNAi para a célula de uma maneira que permite que o agente de RNAi tenha a atividade biológica esperada, por exemplo, inibição sequência- específica da expressão gênica.
[0084] A menos que indicado em contrário, o uso do símbolo 21 , conforme usado neste pedido, significa que qualquer grupo ou grupos podem estar ligados ao mesmo, os quais estejam de acordo com o escopo das invenções descritas neste pedido.
[0085] Conforme usado neste pedido, o termo "isômeros" refere-se a compostos com fórmulas moleculares idênticas, mas que diferem na natureza ou na sequência de ligação de seus átomos ou no arranjo dos seus átomos no espaço, os isômeros que diferem no arranjo dos seus átomos no espaço são chamados de “estereoisômeros”. Os este- reoisômeros que são não imagens especulares um do outro são cha- mados de “diatereoisômeros”, e os estereoisômeros que não são ima- gens especulares superponíveis são chamados de “enantiômeros” ou, às vezes, isômeros óticos. Um átomo de carbono ligado a quatro subs- tituintes não idênticos é chamado de “centro quiral”. Quando os com-
postos descritos neste pedido contêm ligações duplas olefínicas ou outros centros de assimetria geomética para os quais a estrutura iso- mérica não é especificamente definida, é porque os compostos podem incluir ambos os isômeros geométricos E e Z isoladamente ou em uma mistura. Os compostos de fórmula | ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, destinam-se a incluir todos os isômeros pos- síveis, assim como suas formas racêmicas e oticamente puras. Da mesma forma, a menos que expressamente indicado em contrário, to- das as formas tautoméricas destinam-se a estar incluídas.
[0086] Conforme usado neste pedido, um grupo de ligação é um ou mais átomos que conectam uma molécula ou porção de uma molé- cula a uma segunda molécula ou a uma segunda porção de uma mo- lécula. Na literatura, os termos grupos de ligação e espaçados são às vezes usados intercambiavelmente. De maneira similar, conforme usado na literatura, o termo cadafalso é às vezes usado intercambia- velmente com um grupo de ligação. Em algumas modalidades, um grupo de ligação pode incluir um grupo de ligação clivável por peptí- dios. Em algumas modalidades, um grupo de ligação pode incluir ou consistir no peptídio fenilalanina-citrulina-fenilalanina-prolina. Em al- gumas modalidades, um grupo de ligação pode incluir ou consistir em um grupo PEG.
[0087] Conforme usado neste pedido, o termo "ligado" quando se referindo à conexão entre duas moléculas significa que duas molécu- las são unidas por uma ligação covalente ou que duas moléculas são associadas via ligações não covalentes (por exemplo, ligações hidro- gênio ou ligações iônicas). Em alguns exemplos, onde o termo "ligado" refere-se à associação entre duas moléculas via ligações não covalen- tes, a ligação entre as duas moléculas diferentes tem uma KD inferior a 1 x 10º M (por exemplo, inferior a 1 x 10º M, inferior a 1 x 10º M, ou inferior a 1 x 107 M) em tampão fisiologicamente aceitável (por exem-
plo, solução salina tamponada com fosfato). A menos que indicado em contrário, o termo ligado, conforme usado neste pedido, pode indicar a conexão entre um primeiro composto e um segundo composto com ou sem qualquer átomo ou grupo de átomos interveniente.
[0088] O especialista na técnica entenderia e consideraria facil- mente que os compostos e as composições reveladas neste pedido podem ter determinados átomos (por exemplo, átomos de N, O, ou S) em um estado protonado ou desprotonado, dependendo do ambiente no qual o composto ou a composição é colocada. Por conseguinte, conforme usado neste pedido, as estruturas reveladas neste pedido prevêem que determinados grupos funcionais, tais como, por exemplo, OH, SH, ou NH, podem ser protonados ou desprotonados. A descrição deste pedido pretende cobrir os compostos e as composições revela- das independentemente de seu estado de protonação baseado no pH do ambiente, como seria facilmente entendido pelo especialista na técnica.
[0089] As estruturas podem ser representadas como tendo uma ligação "flutuando" sobre uma estrutura anelar para indicar ligação a qualquer carbono ou heteroátomo no anel conforme permitido pela va-
TT Cr lência. Por exemplo, a estrutura indica que R pode substituir qualquer átomo de hidrogênio em qualquer uma das cinco posições disponíveis no anel. Ligações “flutuantes” também podem ser usadas em estruturas bicíclicas para indicar uma ligação em qualquer posição de qualquer dos anéis do biciclo conforme permitido pela valência. No caso de biciclos, a ligação será mostrada “flutuando sobre ambos os
CS
PD anéis, por exemplo, indica que R pode substituir qual-
quer átomo de hidrogênio em qualquer uma das sete posições dispo- níveis no anel.
[0090] Conforme usada em uma reivindicação deste pedido, a ex- pressão "consistindo em” exclui qualquer elemento, etapa, ou ingredi- ente não especificado na reivindicação. Quando usada em uma reivin- dicação deste pedido, a expressão "consistindo essencialmente em” limita o escopo da reivindicação aos materiais ou etapas especificados e àqueles que não afetam materialmente as características básicas e novas da invenção reivindicada.
[0091] Neste pedido está descrito o uso dos ligantes da integrina avB6 descritos para vetorizar e distribuir uma molécula de carga para uma célula que expressa a integrina avB6. A molécula de carga pode ser distribuída para uma célula in vitro, in situ, ex vivo, ou in vivo.
[0092] Em algumas modalidades da fórmula lb, o grupo de ligação é um grupo PEG contendo 2-20 unidades etileno glicol.
[0093] Em algumas modalidades da fórmula lb, o grupo reativo é uma azida.
[0094] Em algumas modalidades, o ligante da integrina av6 tem estruturas que incluem, consistem em, ou consistem essencialmente em qualquer uma das es- mn truturas representadas a Ss seguir: Pa (estrutura 1) Õ. o É o Ss ) At Lt OH H HS ó
O
CO oO NANA
O H q H NS NA, N OH
É CO CO (Estrutura 2); Ort
SN OA OH H no O cl cl
IDO (Estrutura 5); Qto *. eo A OH
H HS O [6 Cc! O OO DA (Estrutura 5.1); Odo S OA ou O o Cc! Cl Os OR ” (Estrutura 5.2);
RA N OH [> a 2N À Ô o RODANDO (Estrutura 6); hs CO "a 4N Oo Õ O OO NDA NON NO (Estrutura 6.1); RA A on "
TE ZN O Õ Oo BO DADADO (Estrutura 6.1); fr, N
N N OH Âi
TX FA ZN Oo O O POD eo Lo AÇO (Estrutura 6.1);
H Q H * Nr ae OH | H 4N Oo É O traga = E
EV OANÇAO Lo AÇO (Estrutura 6.4);
RA N
N N OH Mn EAD O (Estrutura 7);
H O H
DN NA OH | H 4N Oo SO O
II
O O. RO se (Estrutura 8);
Po DANA
O > N Y | H O 4N O O O (Estrutura 9); H o H
NS NAN OH | H 4N o Ô O RODIN INN (Estrutura 10);
NOIS Oo Oo Õ o ROSANA ANO (Estrutura 11);
R Tr EX O.
OS
N BOVINA ONÇA O (Estrutura 12);
H Q H * NAN OH | H 2N o o FO IIDN ÇA O O (Estrutura 13);
S NOT | H Z2N Oo O
OK
T E RO OA OO (Estrutura 14);
A N OH TEST : Z4N O O o (Estrutura 15); No o * SA e N OH 7
OA NX o Oo ê O OVINOS O (Estrutura 16);
DO N
ON NO OH [EN dn o
O es Ss FDS ON Rr OR O (Estrutura 17); H ? H
SS NA OH | H 4N Oo Õ O FOI ONO (estrutura 18);
NA N
N N OH ás ZN o O o o . O. O. ADA OSSO (Estrutura 19); H 7 H | NA OH O & Oo O. O. AA OQ o (Estrutura 20);
H 9 H f * RA AA A OH 2N no o FIV INV ONDO (Estrutura 22); H 9 H f * NA N OH 2N * ô o ADDING AÇO (Estrutura 23); H o H
O NO A ÇA OH 2N Re : o RORZO ONA ROO (Estrutura 24); o H 9 H é NA ÇA OH 2N no ê o RODIN O O (Estrutura 25);
H Z 4 E NA, N a
DEAL E ZN (e) o YO Ir, AO (Estrutura 27); o o dd, Ú
A NOS OH | H
É O cn OO Ag VIDE (Estrutura 29); | OT “o —2N o o P o LoungaHA o (Estrutura 30);
OH
QN N N OH “SO RODIN AIN O (Estrutura 31); oH É gq
H S LO oH oO OPINA VINDA O (Estrutura 32);
NH> 4 q H
RD NAS N OH Tr no ? o FOI ONO (Estrutura 33);
RA N f RN N N OH ZN n o Õ Oo BOZO ANA O (Estrutura 34); OoH H 8 H RANA A ÇA o OH Cx no o FOI ONA O (Estrutura 35); f SS N N N OH 2N na Õ o FO VON OA O (Estrutura 36); e
H OX q
CEPA Y OH FO INN ANN O (Estrutura 37), ou sais farmaceuticamente aceitáveis das mesmas, onde > indica o ponto de ligação a uma porção compreendendo uma molécula de carga.
[0095] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido pode ser conjugado a uma ou mais (por exemplo, 2,3,4,5,6,7,8,9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30; ou 1a 30, 1a 25, 1a 20, 1a15,1a 10, 1a5,5a30,5a25,5a20,5a15,5a10,10a30,10a25,10a 20, 10 a 15, 15 a 30, 15 a 25, 15 a 20, 20 a 30, 20 a 25, ou 25 a 30) moléculas de carga (por exemplo, qualquer uma das moléculas de carga descritas neste pedido ou conhecidas no estado da técnica).
[0096] Em algumas modalidades, mais de ume ligante da integrina avB6 revelado neste pedido (por exemplo, 2, 3, 4, 5,6,7,8, ou 1a 8,1 a7,1a6,1a5,1a4,1a3,1a2,2a8,2a7,2a6,2a5,2a4,2a 3,3a8,3a7,3a6,3a5,3a4,4a8,4a7,4a6,ou4as5ligantes da integrina avB6) pode ser conjugado a uma molécula de carga (por exemplo, qualquer uma das moléculas de carga descritas neste pedido ou conhecidas no estado da técnica).
[0097] Em algumas modalidades, os ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido são opcionalmente conjugados a uma ou mais moléculas de carga via um grupo de ligação, tal como, por exemplo, um grupo polietileno glicol (PEG).
[0098] Em algumas modalidades, os ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido são opcionalmente conjugados a uma ou mais moléculas de carga via um cadafalso que inclui pelo menos um ponto de ligação para cada ligante e pelo menos um ponto de ligação para cada molécula de carga. Em algumas modalidades, os ligantes da in- tegrina avB6 compreendem, consistem em, ou consistem essencial- mente em, uma molécula de carga. Em algumas modalidades, os |li- gantes da integrina avB6 compreendem, consistem em, ou consistem essencialmente em, mais de uma molécula de carga.
[0099] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 com- preende, consiste em, ou consiste essencialmente em, qualquer uma das Estrutura 1, Estrutura 2, Estrutura 5, Estrutura 5.1, Estrutura 5.2, Estrutura 6, Estrutura 6.1, Estrutura 6.2, Estrutura 6.3, Estrutura 6.4, Estrutura 7, Estrutura 8, Estrutura 9, Estrutura 10, Estrutura 11, Estru- tura 12, Estrutura 13, Estrutura 14, Estrutura 15, Estrutura 16, Estrutu- ra 17, Estrutura 18, Estrutura 19, Estrutura 20, Estrutura 22, Estrutura 23, Estrutura 24, Estrutura 25, Estrutura 27, Estrutura 29, Estrutura 30, Estrutura 31, Estrutura 32, Estrutura 33, Estrutura 34, Estrutura 35, Estrutura 36, ou Estrutura 37, each as disclosed herein.
[0100] Qualquer um dos ligantes da integrina avB6 revelados nes- te pedido pode ser ligado a uma molécula de carga, um grupo reativo, e/ou um grupo reativo protegido. Um grupo reativo pode ser usado pa- ra facilitar a conjugação do ligante da integrina avB6 a uma molécula de carga. Os ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido podem aumentar a vetorização de uma molécula de carga para uma integrina avB6 ou para uma célula expressando uma integrina avB6. Uma molé- cula de carga pode ser, porém sem limitação, um princípio ou compos- to farmaceuticamente ativo, um profármaco, ou outra substância com benefício terapêutico conhecido. Em algumas modalidades, uma mo- lécula de carga pode ser, porém sem limitação, uma molécula peque- na, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma imunoglobulina, um anticorpo monoclonal, um rótulo ou marcador, um lipídio, um composto à base de oligonucleotídeo natural ou modificado (por exemplo, um oligonucleotídeo antissentido ou um agente de RNAi), um ácido nu- cleico natural ou modificado, um peptídio, um aptâmero, um polímero, uma poliamina, uma proteína, uma toxina, uma vitamina, um polietile- no glicol, um hapteno, uma digoxigenina, uma biotina, um átomo ou molécula radioativa, ou um fluoróforo. Em algumas modalidades, uma molécula de carga inclui um princípio farmaceuticamente ativo ou um profármaco. Em algumas modalidades, uma molécula de carga inclui um composto à base de oligonucleotídeo como um princípio farmaceu- ticamente ativo. Em algumas modalidades, uma molécula de carga inclui um agente de RNAi como um princípio farmaceuticamente ativo.
[0101] Em um aspecto, a invenção apresenta uma estrutura com- preendendo um ligante da integrina avB6 descrito neste pedido, um grupo de ligação, e um cadafalso, onde o cadafalso é ligado a uma molécula de carga. Em algumas modalidades, a estrutura pode com- preender o ligante na forma monodentada. Em algumas modalidades, a estrutura pode compreender o ligante na forma bidentada. Em algu- mas modalidades, a estrutura pode compreender o ligante na forma tridentada. Em algumas modalidades, a estrutura pode compreender o ligante na forma tetradentada.
[0102] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
& o | | | OO (estrutura 1)
[0103] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 1 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exem- plo, agentes de RNAi).
[0104] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 po- de ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo pro- tegido, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: Õ posar X N OH
O
OO (estrutura 1a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0105] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 po- de ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura:
N3 Sd: d
O
Ó AA SA er A N oH
O OU (estrutura 1b)
[0106] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: Doo DADA ” O » LA OH | 4N no Õ O OO (estrutura 2)
[0107] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 2 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exem- plo, agentes de RNAi).
[0108] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: H XX qu SS NANA oH Ns ns Õ O (estrutura 2a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0109] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: Pra A Oo H o H SN NA, N OH TO HS 3 O OO (estrutura 2b)
[0110] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: e LH SN o OH
H H o o Cc cl
IAN > * (estrutura 5)
[0111] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 5 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exem- plo, agentes de RNAi).
[0112] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: Qdo A y go OH
H H o o Cc cr x (estrutura 5a)
onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0113] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: o. Or o o 1! IMTNTON (estrutura 5b)
[0114] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: Õ O: A Je Pg sa A, (estrutura 5.1)
[0115] Nas modalidades, o docomprimento do PEG no grupo rea- tivo PEG-azida pode ser variado. Em algumas modalidades, os ligan- tes da integrina avB6 de Estrutura 5.1 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)-azida e compreende a se- guinte estrutura: ã PODIDO DO"
E Ig O ONA (estrutura 5.1b)
[0116] É possível usar um grupo reativo (ou grupo reativo protegi- do para facilitar a conjugação do ligante da integrina avB6 a uma mo- lécula de interesse, por exemplo, a uma molécula de carga (seja dire-
tamente ou via um ou mais cadafalsos e/ou ligadores).
[0117] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: O. Ri A * OA OH
H H o o Cc! Cl On a * (estrutura 5.2)
[0118] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 5.2 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0119] Em algumas modalidades, um grupo reativo PEG-azida po- de ser substituído por um grupo reativo alquil-azida. Em algumas mo- dalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo alquil-azida e compreende a seguinte estrutura: Odo A Ss OA OH H H o o Cc! Cl
OA Nº (estrutura 5.2b)
[0120] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: H o H “ NA OF | H 4N o Õ o o. o OT OO (estrutura 6)
[0121] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 6 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exem-
plo, agentes de RNAi).
[0122] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura:
H Q H
M SA OH EN n o
O x (estrutura 6a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0123] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: Sed o cos CSA d 2N o Õ o
NI DVI NAO (estrutura 6b)
[0124] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
FO O OA O (estrutura 6.1)
[0125] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 6.1 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0126] Em algumas modalidades, o comprimento do PEG no grupo reawtivo PEG-azida pode ser variado. Em algumas modalidades, os ligantes da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)-azida, e compreende a seguinte estru- tura:
O
OO WO SAO a OA ao (estrutura 6.1b)
[0127] É possível usar um grupo reativo (ou grupo reativo protegi- do) para facilitar a conjugação do ligante da integrina avB6 a uma mo- lécula de interesse, por exemplo, a uma molécula de carga (seja dire- tamente ou via um ou mais cadafalsos e/ou ligadores).
[0128] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
O
OO ESG A SÃO (estrutura 6.2)
[0129] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 6.2 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0130] Em algumas modalidades, um grupo reativo PEG-azida po- de ser substituído por um grupo alquil-azida. Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo alquil-azida, e compreende a seguinte estrutura: Re HA cor
TEST
OO NODIODIOIO O (estrutura 6.2b)
[0131] É possível usar um grupo reativo (ou grupo reativo protegi- do) para facilitar a conjugação do ligante da integrina avB6 a uma mo- lécula de interesse, por exemplo, to uma molécula de carga (seja dire- tamente ou via um ou mais cadafalsos e/ou ligadores).
[0132] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: H " H GL Y or
EO CO O a O (estrutura 6.3)
[0133] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 6.3 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0134] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga. Em algumas modalidades, os ligantes da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo azida e compreende a seguinte estrutura:
ss A ao TO “o O º
QN N Longo (estrutura 6.3b)
[0135] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: IA Ho con CONT Ss! O.
EÇO SO a (estrutura 6.4)
[0136] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 6.4 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0137] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo azida e compreende a se- guinte estrutura: NR nd o O no O o Nos OO
AMA Ene ara (estrutura 6.4b)
[0138] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
Hu 9 H
CEPA ÇILO O
CO ema nado (estrutura 7)
[0139] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 7 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exem- plo, agentes de RNAi).
[0140] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura:
H Q H Ienassses * (estrutura 7a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0141] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo PEG-azida, e compreende a seguinte estrutura: H 9 H
CEO
O so» NONO (estrutura 7b)
[0142] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re-
velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: CO "O O o. OU LL, AAA (estrutura 8)
[0143] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 8 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exem- plo, agentes de RNAi).
[0144] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: AoA ço TC q Õ o o OO (estrutura 8a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0145] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo PEG-azida, e compreende a seguinte estrutura: TEN &S! >
O nO (estrutura 8b)
[0146] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re-
velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
ANA o Tr * & % o (estrutura 9)
[0147] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 9 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exem- plo, agentes de RNAi).
[0148] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: RA e. AN Po oH OU (estrutura 9a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0149] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: VON ÇAANs é O (estrutura 9b)
[0150] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re-
velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: Hon A Ho con TT Wo Õ S AE arg (estrutura 10)
[0151] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 10 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0152] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: H 9 H
CEO Y OH O
OO * — (estrutura 10a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0153] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: H 7 H Ienassps Y OH
CO
NO OO (estrutura 10b)
[0154] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: A o O Õ o ao (estrutura 11)
[0155] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 11 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0156] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: LB on A o o Õ o ú (estrutura 11a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0157] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura:
KR N N N. OH OX o Õ o
NOVIS ON O (estrutura 11b)
[0158] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
AA 2N O Õ o O,
O N
EDDIE (estrutura 12)
[0159] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 12 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0160] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: H 9 H
NS RA OF CO Rn &õ Ô o
O O
N x (estrutura 12a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0161] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura:
TCP 2N o ÔÕ o O,
OS N
NEVADA ON O (estrutura 12b)
[0162] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: o O
O O. es.
N FADOS a OA ÃO Nó v > (estrutura 13)
[0163] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 13 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0164] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: A A on
GESITI XIS x (estrutura 13a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0165] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: GESSO X Sº
OO NOVO MAMA Ma O (estrutura 13b)
[0166] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: AA o GEN S! De Papos dO (estrutura 14)
[0167] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 14 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0168] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: Hondo Ro or
O
TF * (estrutura 14a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0169] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: H q H
CEO Y OH O
SE NON ON O (estrutura 14b)
[0170] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
TENTA O
Ç & Lg (estrutura 15)
[0171] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 15 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0172] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: AoA e on TC no Ô o O * (estrutura 15a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0173] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: S dA E TESS &! Ad Ne a (estrutura 15b)
[0174] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: Br EA on n o o Ô o ps A at a O (estrutura 16)
[0175] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 16 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0176] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: LB A oH Ui o o Õ o x (estrutura 16a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0177] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: AD SA o or o o o
NE VOAN OA ? (estrutura 16b)
[0178] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: AoA ços Tr A O Õ o
CS Ss
NASA AAA AAA (estrutura 17)
[0179] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 17 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0180] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: yu ? H
N N OH TX IX Y
OS Ss * (estrutura 17a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0181] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: AoA ços CO E & Õ o NEAR Ao (estrutura 17b)
[0182] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: sao A o Cr “o Õ Õ
O
O Paga (estrutura 18)
[0183] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 18 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0184] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura:
selo à ns Ao or
EST À 2N O Õ o x (estrutura 18a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0185] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: o
H H N N OH O
NEI ID OA O (estrutura 18b)
[0186] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: H ? H
DANO N OH 7 7
Á
AS SAD SAO o o (estrutura 19)
[0187] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 19 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAIi).
[0188] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: Red do on ” 7 O. (estrutura 19a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0189] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: H ? Hu
SS NA OH Ls no Ô o O, Ng AÇO (estrutura 19b)
[0190] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: o COPA om 7 "GO CÇ, Amen (estrutura 20)
[0191] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 20 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0192] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi-
do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: od A cor
CITA O O
Q » (estrutura 20a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0193] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: PIT o A, Mo A a (estrutura 20b)
[0194] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
OO POVOAM Ana (estrutura 22)
[0195] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 22 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0196] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura:
2N ho o
O
O ú (estrutura 22a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0197] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: AAA AA con TOS NX SH! NINO O Na O (estrutura 22b)
[0198] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: CO no Õ o MI TORÇO (estrutura 23)
[0199] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 23 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0200] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura:
7T1/277 H q H d NA, N oH CO Ho : o * (estrutura 23a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0201] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: go LA ANA AA ÇA, OH
NIM (estrutura 23b)
[0202] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: o *y La OH AO Ap A O AO DO “ 9 9 (estrutura 24)
[0203] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 24 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0204] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura:
o RA, KW OH * (estrutura 24a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0205] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: H o H SS We N. OH Tr no o O. O. O NDT Mo Da (estrutura 24b)
[0206] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: o O A "” N o Õ o
ORA OSVO ON ORO 9 º (estrutura 25)
[0207] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 25 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0208] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura:
O H + H SS AO oH Or nã : O x (estrutura 25a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0209] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura:
O or " N fe) 2N o Õ o O. O. Oo NI o o (estrutura 25b)
[0210] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: * RÃ Ú OH
COSTS 2N o o
OVINOS o o (estrutura 27)
[0211] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de
T4/277 Estrutura 25 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0212] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: Hu 9 Hu
SAIO * (estrutura 27a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0213] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: H " H
DST NOSSO ON O (estrutura 27b)
[0214] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
[0215] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
O A COST
AINDA CO (estrutura 29)
[0216] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 25 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0217] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: od NÃ or
COST IS O
O » (estrutura 29a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0218] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: OO or O no ÔÕ o Ng ON ONO OO (estrutura 29b)
[0219] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
COS TÇÕIS O : . ArgsA (estrutura 30)
[0220] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 25 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0221] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: H n H H
TOS
O OU (estrutura 30a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0222] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: O O. : oa (estrutura 30b)
[0223] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
OH TC “o Õ o Cn (estrutura 31)
[0224] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 25 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0225] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura:
T7T/277 o OH
H H NS IA LA oH CX Ho o X (estrutura 31a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0226] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: o OH Ren N OH
CEA 2N n Ô o
RPI AROS OR O Nó o o (estrutura 31b)
[0227] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: oH o Ss LAO OH Cr no : o OVINOS ANNA O (estrutura 32)
[0228] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 25 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0229] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura:
oH o S AL ão TO Ts , o x (estrutura 32a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0230] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: oH S tt ” Tr à o REA as ao a gado (estrutura 32b)
[0231] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: NH? Egg aà (estrutura 33)
[0232] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 25 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAIi).
[0233] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi-
do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: NH? H o H « Ts .oH CO no : o x (estrutura 33a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0234] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: NH; a & NA, N OH NAO Aa O (estrutura 33b)
[0235] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura:
RANA A ÇA OH TC no Õ o IDIOMA O (estrutura 34)
[0236] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 25 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0237] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: H g H
SS NADANDO N OH TO nã , o x (estrutura 34a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0238] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura:
H À EM NA, N OH Cr ” à : o O. O. O paga a AS (estrutura 34b)
[0239] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: a OH
H H ” RAIA OH TC Ho o IO ara OD ag (estrutura 35)
[0240] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 25 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0241] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura:
OH H '“ H AI A oH CO Po : o * (estrutura 35a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0242] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: o OH NOIS Ma O a O (estrutura 35b)
[0243] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: H 9 H OA ÇA Ah cor TX No : o
ODIN AÇO (estrutura 36)
[0244] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 25 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0245] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: No prai, N oH * (estrutura 36a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0246] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura:
H H e AO oH O. O. O NO o o (estrutura 36b)
[0247] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a seguinte estrutura: & EX,
RANA AÇÃO N OH Og a fria (estrutura 37)
[0248] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 25 está ligado a uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, agentes de RNAi).
[0249] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo, um grupo reativo protegi- do, ou uma molécula de carga, e compreende a seguinte estrutura: H 9 A
CAI Y OH “.” ú (estrutura 37a) onde X inclui um grupo reativo, um grupo reativo protegido, ou uma molécula de carga (por exemplo, um agente de RNAi).
[0250] Em algumas modalidades, o ligante da integrina avB6 pode ser sintetizado para incluir um grupo reativo polietileno glicol (PEG)- azida, e compreende a seguinte estrutura: H 9 4 Raso: Y OH
CO NOIS Mo a O (estrutura 37b)
[0251] O grupo reativo revelado em qualquer uma dentre as Estru- tura 1a, Estrutura 1b, Estrutura 2a, Estrutura 2b, Estrutura 5a, Estrutu- ra 5b, Estrutura 6a, Estrutura 6b, Estrutura 7a, Estrutura 7b, Estrutura 8a, Estrutura 8b, Estrutura 9a, Estrutura 9b, Estrutura 10a, Estrutura 10b, Estrutura 11a, Estrutura 11b, Estrutura 12a, Estrutura 12b, Estru- tura 13a, Estrutura 13b, Estrutura 14a, Estrutura 14b, Estrutura 15a, Estrutura 15b, Estrutura 16a, Estrutura 16b, Estrutura 17a, Estrutura 17b, Estrutura 18a, Estrutura 18b, Estrutura 19a, Estrutura 19b, Estru- tura 20a, Estrutura 20b, Estrutura 22a, Estrutura 22b, Estrutura 239, Estrutura 23b, Estrutura 24a, Estrutura 24b, Estrutura 25a, Estrutura 25b, Estrutura 27a, Estrutura 27b, Estrutura 29a, Estrutura 29b, Estru-
tura 30a, Estrutura 30b, Estrutura 31a, Estrutura 31b, Estrutura 32a, Estrutura 32b, Estrutura 33a, Estrutura 33b, Estrutura 34a, Estrutura 34b, Estrutura 35a, Estrutura 35b, Estrutura 36a, Estrutura 36b, Estru- tura 37a, ou Estrutura 37b pode ser usado para ligar o ligante da inte- grina avB6 a uma molécula de interesse, isto é, a uma molécula de carga tal como um agente de RNAi. A molécula de carga pode ser qualquer molécula que se deseja direcionar para uma célula expres- sando a integrina avB6. Ligantes e cadafalsos multidentados da integrina avB6
[0252] Conforme revelado neste pedido, em algumas modalidades, um ou mais ligantes da integrina avB6 podem ser ligados a uma ou mais moléculas de carga. Em algumas modalidades, apenas um ligan- te da integrina avB6 é conjugado a uma molécula de carga (doravante denominado ligante "monodentado" ou "monovalente"). Em algumas modalidades, dois ligantes da integrina avB6 são conjugados a uma molécula de carga (doravante denominado ligante "bidentado" ou "di- valente"). Em algumas modalidades, três ligantes da integrina avB6 são conjugados a uma molécula de carga (doravante denominado |i- gante "tridentado" ou "trivalente"”). Em algumas modalidades, quatro ligantes da integrina avB6 são conjugados a uma molécula de carga (doravante denominado ligante "tetradentado" ou "tetravalente"). Em algumas modalidades, mais de quatr ligantes da integrina avB6 são conjugados a uma molécula de carga.
[0253] Em algumas modalidades, onde apenas um ligante da inte- grina avB6 é conjugado a uma molécula de carga (doravante denomi- nado ligante "monodentado"), o ligante da integrina avB6 pode ser con- jugado diretamente à molécula de carga. Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 revelado neste pedido pode ser conjuga- do a uma molécula de carga via um cadafalso ou outra estrutura ligan- te.
[0254] Em algumas modalidades, os ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido incluem um ou mais cadafalsos. Os cadafalsos, às vezes chamados na literatura de grupos de ligação ou ligantes, po- dem ser usados para facilitar a ligação de uma ou mais moléculas de carga a um ou mais ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido. Cadafalsos úteis compatíveis com os ligantes revelados neste pedido são em geral conhecidos na literatura. Exemplos não limitativos de ca- dafalsos que podem ser usados com os ligantes da integrina avB6 re- velados neste pedido incluem, porém sem limitação, polímeros e poli- aminoácidos (por exemplo, ácido bis-glutâmico, poli-L-lisina, etc.). Em algumas modalidades, os cadafalsos podem incluir ligantes ou grupos cisteína, DBCO-PEG1-24-NHS, propargil-PEG1-24-NHS, e/ou porções multidentadas de DBCO e/ou propargila.
[0255] Em algumas modalidades, o cadafalso usado para ligar um ou mais ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido a uma ou mais moléculas de carga tem a seguinte estrutura:
DS ON * “ o ata
À À (cadafalso 1)
[0256] O uso do cadafalso 1, por exemplo, facilita a conjugação eficiente tanto com os monômeros de ligantes da integrina avB6 quan- to com a uma ou mais moléculas de carga. O cadafalso 1 inclui um éster de p-nitrofenol (também denominado 4-nitrofenol) reativo com amina, uma ligação amida, e três unidades PEG2, assim como alqui- nos terminais. O éster de 4-nitrofenol pode ser conjugado à amina pri- mária em uma molécula de carga, tal como a amina primária em um RNA gatilho formulada com um grupo amina terminal (por exemplo,
NH2-C6), através da formação de amida. O alquino terminal pode ser conjugado com ligantes modificados por azido (tanto peptídios como moléculas pequenas) por meio da química de cliques catalisada por cobre.
[0257] Em algumas modalidades, a molécula de carga é um agen- te de RNAi. Em algumas modalidades, o cadafalso 1 pode ser preso à extremidade do terminal de um agente de RNAi, tal como a extremida- de 5' terminal do filamento sentido de um agente de RNAi. Por exem- plo, a extremidade 5' terminal do filamento sentido de um agente de RNAi pode ser modificada para incluir uma C6 amina (-C6-NH>2) presa à extremidade 5' do nucleotídeo do terminal 5' do agente de RNAi. Um agente de RNAi tendo tal modificação com uma C6 (ou outra modifica- ção que resulte em uma amina terminal) pode ser facilmente conjuga- do ao cadafalso 1, como mostrado pela representação na estrutura a seguir: SOS TNHÃO - O o tt no F. ANTA NY o
SO (Estrutura 380), onde RW indica um agente de RNAi.
[0258] Os grupos alquino da Estrutura 380, acima, podem ser en- tão conjugados aos ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido para formar ligantes da integrina avB6 tridentados.
[0259] Em algumas modalidades, é possível sintetizar um cadafal- so usando DBCO (dibenzociclo-octino), que pode ser representado pela seguinte estrutura:
o o FETO ; Os NH CA o O KAT AO) o o o o “ o” O. Lino
TITS (estrutura 381), onde $ indica a ligação a um grupo reativo ou a uma porção compreendendo molécula de carga.
[0260] Em algumas modalidades, formam-se grupos triazol entre o agente de RNAi e os ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido, como mostrado na estrutura geral a seguir:
PAES avbs ligand—N, o o Ç E A, Sl NH NH JOONORENONEA avbç ligand PFN Ne / avbe ligand (Estrutura 390), onde PRA indica qualquer cadafalso ou grupos de ligação adequados que podem ser usados para ligar um ligante a um agente de RNAi, e ACNINININIA indica um agente de RNAi.
[0261] Em algumas modalidades, um cadafalso pode ser sintetiza- do como um composto de fosforamidita, o que pode possibilitar que um ligante tridentado seja facilmente acoplado à extremidade 5' termi- nal do filamento sentido de um agente de RNAi através da síntese de fosforamidita, como mostrado na estrutura a seguir:
h HNÇ-O N / fe] ff HN “O A r (estrutura 400)
[0262] Depois da síntese para prender o composto de Estrutura 400 à extremidade 5' terminal do filamento sentido do agente de RNAi, os alquinos terminais podem ser então ligados aos ligantes da integri- na avB6 revelados neste pedido.
[0263] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende as Estrutura 1, Estrutura 2, Estrutura 5, Estrutura 5.1, Estrutura 5.2, Estrutura 6, Estrutura 6.1, Estrutura 6.2, Estrutura 6.3, Estrutura 6.4, Estrutura 7, Estrutura 8, Estrutura 9, Estru- tura 10, Estrutura 11, Estrutura 12, Estrutura 13, Estrutura 14, Estrutu- ra 15, Estrutura 16, Estrutura 17, Estrutura 18, Estrutura 19, Estrutura 20, Estrutura 22, Estrutura 23, Estrutura 24, Estrutura 25, Estrutura 27, Estrutura 29, Estrutura 30, Estrutura 31, Estrutura 32, Estrutura 33, Estrutura 34, Estrutura 35, Estrutura 36, Estrutura 37, onde o ligante da integrina avB6 é um ligante tridentado, ligado via um cadafalso.
[0264] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a Estrutura 2 em uma forma triden- tada, e pode ser representado pela seguinte estrutura:
O.
N n Hd OX NH a 9 | ATOM o ax AA o o o
E A A e SAO EA SS o Õ a $ R OH CC i & 2)
É C pH > 2 A b HN- oO (estrutura 700)
[0265] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a Estrutura 6.1 em uma forma triden- tada, e pode ser representado pela seguinte estrutura:
O h Too Ds No 2 H VA HN. r ao Pas MS . a LO
TO
FO (estrutura 701)
[0266] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a Estrutura 6.1 em uma forma triden- tada, e pode ser representado pela seguinte estrutura:
He
HN o / AX O q O, x
H N Foo “ NX 2 NA Ho. C mo Nest q q 5 :
O pu, pn TO cd 1 HO- HN- P
A Fa ua mo, (estrutura 701a)
[0267] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a Estrutura 6.1 em uma forma triden- tada que inclui um ligante glutárico, e pode ser representado pela se- guinte estrutura:
e. Coro E E NX q " AA, o?
E (estrutura 701b)
[0268] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a Estrutura 6.1 em uma forma triden- tada conjugada a um agente de RNAi, e pode ser representado pela seguinte estrutura:
E <E “ E O & X 2 = Fo st TONA, q anti,
A (Estrutura 701c), onde ART indica um agente de RNAi.
[0269] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a Estrutura 6.1 em uma forma triden- tada, e pode ser representado pela seguinte estrutura:
H nv ado” %g 1 o
O 10, o N MA de Hs
Ç DAS o HN, N
P
RIA a O
SO e Ho wo <,
PN *Q (Estrutura 701d), onde indica qualquer cadafalso adequado que possa ser usado para ligar um ligante e uma molécula de carga.
[0270] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido compreende a Estrutura 6.1 em uma forma triden- tada conjugada a um agente de RNAi, e pode ser representado pela seguinte estrutura:
À FE
A A %s
É A DR
RN X Dna e y Ss ) ; = IO = & o e a
O (Estrutura 701e) , onde indica qualquer cadafalso adequado que possa ser usado para ligar um ligante e um agente de RNAi, e N) RV indica um agente de RNAi. Grupos reativos e grupos reativos protegidos.
[0271] Grupos reativos são bastante conhecidos na literatura e proporcionam a formação de ligações covalentes entre duas moléculas ou reagentes. Grupos reativos adequados para uso no escopo das in- venções deste pedido incluem, porém sem limitação: grupos amino, grupos amida, grupos ácido carboxílico, azidas, alquinos, grupos pro- pargila, BCN(biclclo[6,1,0]nonino, DBCO(dibenzociclo-octino) tióis. grupos maleimida, grupos amino-óxi, N-hidroxissuccinimida (NHS) ou outro éster ativado (por exemplo, PNP, TFP, PFP), grupos bromo, al- deídos, carbonatos, tosilatos, tetrazinas, trans-ciclo-octeno (TCO), hi- drazidas, grupos hidroxila, dissulfetos, e grupos dissulfeto de ortopiridi- la.
[0272] A incorporação de grupos reativos pode facilitar a conjuga- ção de um ligante da integrina avB6 revelado neste pedido a uma mo- lécula de carga. Reações de conjugação são bastante conhecidas na literatura e proporcionam a formação de ligações covalentes entre du- as moléculas ou reagentes. Reações de conjugação adequadas para uso no escopo das invenções deste pedido incluem, porém sem limita- ção, reação de acoplamento de amida, reação de adição de Michael, reação de formação de hidrazona e reação de cicloadição da química de cliques.
[0273] Em algumas modalidades, os ligantes vetorizados para a integrina avB6 revelados neste pedido são sintetizados como um éster tetrafluorofenílico (TFP), que pode ser deslocado por um grupo amino reativo para prender uma molécula de carga. Em algumas modalida- des, os ligantes vetorizados para integrina revelados neste pedido são sintetizados como uma azida, que pode ser conjugada a um grupo propargil ou DBCO, por exemplo, via reação de cicloadição da química de cliques, para prender uma molécula de carga.
[0274] Grupos reativos protegidos também são comumente usa- dos na literatura. Um grupo protetor proporciona transformação quími- ca temporária de um grupo reativo em um grupo que não reage nas condições em que o grupo não protegido reage, por exemplo, para proporcionar quimiosseletividade em uma reação química subsequen- te. Grupos reativos protegidos adequados para uso no escopo das in- venções deste pedido incluem, porém sem limitação, grupos BOC (t- butoxicarbonila), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila), grupos carboxi- benzil (CBZ), ésteres benzílicos, e PBF (2,2,4,6,7-pentametildi- hidrobenzofuran-S5-sulfonol). Moléculas de carga (incluindo agentes de RNAi)
[0275] Uma molécula de carga é qualquer molécula que, quando destacada do ligantes da integrina avB6 descritos neste pedido, teria um efeito desejável em uma célula compreendendo um receptor da integrina avB6. Uma molécula de carga pode ser, porém sem limitação, um ingrediente farmacêutico, um produto medicamentoso, um profár- maco, uma substância com benefício terapêutico conhecido, uma mo- lécula pequena, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma imu- noglobulina, um anticorpo monoclonal, um rótulo ou marcador, um lipí- dio, um ácido nucleico ou polinucleotídeo natural ou modificado, um peptídio, um po9límero, um poliamina, uma proteína, um aptâmero, uma toxina, uma vitamina, um PEG, um hapteno, uma digoxigenina, uma biotina, um átomo ou molécula radioativa, ou um fluoróforo. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de carga (por exemplo, as mesmas moléculas de carga ou moléculas de carga diferentes) são ligadas a um ou mais ligantes da integrina avB6 para vetorizar as mo- léculas de carga para uma célula expressando uma integrina avB6.
[0276] Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de carga é um ingrediente farmacêutico ou uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de carga é um composto à base de oligonucleotídeo. Conforme usado neste pedido, um "composto à base de oligonucleotídeo” é uma sequência de nucle- otídeos contendo cerca de 10-50 (por exemplo, 10 a 48, 10 a 46, 10 a 44, 10 a 42, 10 a 40, 10 a 38, 10 a 36, 10 a 34, 10 a 32, 10 a 30, 10 a 28, 10 a 26, 10 a 24, 10 a 22, 10 a 20, 10 a 18, 10 a 16, 10 a 14, 10a 12, 12 a 50, 12 a 48, 12 a 46, 12 a 44, 12 a 42, 12 a 40, 12a38,12a 36, 12 a 34, 12 a 32, 12 a 30, 12 a 28, 12 a 26, 12 a 24, 12a22,12a 20, 12 a 18, 12 a 16, 12 a 14, 14 a 50, 14 a 48, 14 a 46, 14 a 44, 14 a 42, 14 a 40, 14 a 38, 14 a 36, 14 a 34, 14 a 32, 14 a 30, 14 a 28, 14 a 26, 14 a 24, 14 a 22, 14 a 20, 14 a 18, 14 a 16, 16 a 50, 16 a 48, 16 a 46, 16 a 44, 16 a 42, 16 a 40, 16 a 38, 16 a 36, 16 a 34, 16 a 32, 16 a 30, 16 a 28, 16 a 26, 16 a 24, 16 a 22, 16 a 20, 16 a 18, 18 a 50, 18 a 48, 18 a 46, 18 a 44, 18 a 42, 18 a 40, 18 a 38, 18 a 36, 18 a 34, 18 a
32, 18 a 30, 18 a 28, 18 a 26, 18 a 24, 18 a 22, 18 a 20, 20 a 50,20 a 48, 20 a 46, 20 a 44, 20 a 42, 20 a 40, 20 a 38, 20 a 36, 20 a 34,20 a 32, 20 a 30, 20 a 28, 20 a 26, 20 a 24, 20 a 22,22 a 50,22 a 48,22 a 46, 22 a 44, 22 a 42, 22 a 40, 22 a 38, 22 a 36, 22 a 34,22 a 32,22 a 30, 22 a 28, 22 a 26, 22 a 24, 24 a 50, 24 a 48, 24 a 46, 24 a 44, 24 a 42, 24 a 40,24 a 38, 24 a 36, 24 a 34, 24 a 32, 24 a 30, 24 a 28, 24 a 26, 26 a 50, 26 a 48, 26 a 46, 26 a 44, 26 a 42, 26 a 40,26 a 38,26 a 36, 26 a 34, 26 a 32, 26 a 30, 26 a 28, 28 a 50, 28 a 48, 28 a 46,28 a 44, 28 a 42, 28 a 40, 28 a 38, 28 a 36, 28 a 34, 28 a 32, a 28 a 30, 30 a 50, 30 a 48, 30 a 46, 30 a 44, 30 a 42, 30 a 40, 30 a 38, 30 a 36, 30 a 34, 30 a 32, 32 a 50, 32 a 48, 32 a 46, 32 a 44, 32 a 42, 32 a 40,32 a 38, 32 a 36, 32 a 34, 34 a 50, 34 a 48, 34 a 46, 34 a 44, 34 a 42, 34 a 40, 34 a 38, 34 a 36, 36 a 50, 36 a 48, 36 a 46, 36 a 44, 36 a 42, 36 a 40, 36 a 38, 38 a 50, 38 a 48, 38 a 46, 38 a 44, 38 a 42, 38 a 40, 40 a 50, 40 a 48, 40 a 46, 40 a 44, 40 a 42, 42 a 50,42 a 48, 42 a 46, 42 a 44, 44 a 50,44 a 48, 44 a 46,46 a 50,46 a 48, ou 48 a 50) nucleotí- deos ou pares de bases nucleotídicas. Em algumas modalidades, um composto à base de oligonucleotídeo tem uma sequência de nucleo- bases que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência codificadora em um ácido nucleico-alvo expresso ou em um gene-alvo dentro de uma célula. Em algumas modalidades, os compostos à base de oligonucleotídeo, mediante distribuição para uma célula expressan- do um gene, são capazes de inibir a expressão do gene subjacente, e são chamados, neste pedido, de "compostos à base de oligonucleotí- deo inibidores de expressão”. A expressão gênica pode ser inibida in vitro ou in vivo.
[0277] "Compostos à base de oligonucleotídeo" incluem, porém sem limitação: oligonucleotídeos de filamento simples, oligonucleotí- deos antissentido de filamento simples, RNAs interferentes curtos RNAs (siRNAs), RNAs de filamento duplo (dsRNA), micro RNAs (miR-
NAs), RNAs tipo grampo de cabelo curtos (ShRNA), ribozimas, molé- culas de RNA interferente, e substratos “dicer”. Em algumas modalida- des, um composto à base de oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo de filamento simples, tal como um oligonucleotídeo antissentido. Em algumas modalidades, um composto à base de oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo de filamento duplo. Em algumas modalidades, um composto à base de oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo de fila- mento duplo que é um agente de RNAi.
[0278] Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de carga são um "agente de RNAi” que, como definido neste pedido, é uma composição que contém uma molécula de oligonucleotídeo de RNA ou RNA-like (por exemplo, RNA quimicamente modificado) que é capaz de degradar ou inibir a translação de transcritos de RNA men- sageiro (MRNA) de um mMRNA-alvo de maneira específica para a se- quência. Conforme usado neste pedido, os agentes de RNAi podem funcionar através do mecanismo de interferência de RNA (isto é, indu- zindo a transferência de RNA através da interação com o maquinário da via de interferência de RNA (complexo de silenciamento induzido por RNA ou RISC) de células de mamífero), ou por quaisquer meca- nismos ou vias alternativos. Embora se acredite que agentes de RNAi agents, conforme o termo é usado neste pedido, funcionam principal- mente através do mecanismo de interferência de RNA, os agentes de RNAi revelados não são ligados por ou limitados a qualquer via ou mecanismo de ação particular. Os agentes de RNAi revelados neste pedido são constituídos de um filamento sentido e um filamento antis- sentido, e incluem, porém sem limitação: RNAs interferentes curtos (ou pequenos) (siRNAs), RNAs de filamento duplo (dsRNA), micro RNAs (mMIiRNAs), RNAs tipo grampo de cabelo curtos (ShRNA), e substratos “dicer”. O filamento antissentido dos agentes de RNAi descritos neste pedido é pelo menos parcialmente complementar ao mRNA sendo ve-
torizado. Agentes de RNAi podem incluir um ou mais nucleotídeos modificados e/ou uma ou mais ligações não fosfodiéster.
[0279] Tipicamente, os agentes de RNAi podem ser constituídos de pelo menos um filamento sentido (também chamado de filamento passageiro) que inclui uma primeira sequência, e um filamento antis- sentido (também chamado de filamento guia) que inclui uma segunda sequência. O comprimento dos filamentos sentido e antissentido de um agente de RNAi pode ter, cada um, de 16 a 49 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os filamentos sentido e antis- sentido de um agente de RNAi têm independentemente 18 a 26 nucle- otídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os filamentos sen- tido e antissentido têm independentemente 19 a 26 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os filamentos sentido e antis- sentido têm independentemente 21 a 26 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os filamentos sentido e antissentido têm independentemente 21 a 24 nucleotídeos de comprimento. Os filamen- tos sentido e antissentido podem ser do mesmo comprimento ou de comprimentos diferentes. Os agentes de RNAi incluem uma sequência de filamento antissentido que é pelo menos parcialmente complemen- tar a uma sequência no gene-alvo e, mediante distribuição para uma célula expressando o-alvo, um agente de RNAi pode inibir a expressão de um ou mais genes-alvo in vivo ou in vitro.
[0280] Os compostos à base de oligonucleotídeo em geral, e os agentes de RNAi especificamente, podem ser constituídos de nucleo- tídeos modificados e/ou uma ou mais ligações não-fosfodiéster. Con- forme usado neste pedido, um “nucleotídeo modificado” é um nucleotí- deo diferente de um ribonucleotídeo (2'-hidroxil nucleotídeo). Em al- gumas modalidades, pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%) dos nucleotídeos são nucleotídeos modificados. Conforme usado neste pedido, nucleotídeos modificados incluem, porém sem limitação, deso- xirribonucleotídeos, miméticos de nucleotídeo, nucleotídeos abásicos, nucleotídeos 2'-modificados, nucleotídeos com ligações 3' a 3' (inverti- dos), nucleotídeos compreendendo bases não naturais, nucleotídeos ligados por ponte, ácidos nucleicos de peptídios, miméticos de 2',3'- seco nucleotídeo (análogos de nucleobases não bloqueados, nucleotí- deos bloqueados, 3'-O-metóxi (2' internucleosídeo ligados) nucleotí- deos, 2'-F-Arabino nucleotídeos, 5'-Me, 2'-fluoro nucleotídeo, morfolino nucleotídeos, vinil fosfonato desoxiribonucleotídeos, nucleotídeos con- tendo vinil fosfonato, e nucleotídeos contendo fosfonato de ciclopropila, nucleotídeos 2'-modificados (isto é, a nucleotídeo com um grupo dife- rente de um grupo hidroxil na posição 2' do anel de açúcar de cinco membros) incluem, porém sem limitação, 2'-O-metil nucleotídeos, 2'- desóxi-2'-fluoro nucleotídeos, 2'-desoxi nucleotídeos, 2'-metoxietil (2'- O-2-metoxiletil) nucleotídeos, 2'-amino nucleotídeos, e 2'-alquil nucleo- tídeos.
[0281] Além disso, um ou mais nucleotídeos de um composto à base de oligonucleotídeo, tal como um agente de RNAi, podem ser ligados por ligações ou esqueletos não tradicionais (isto é, ligações internucleosídicas modificadas ou esqueletos modificados). Uma liga- ção internucleosídica modificada por ser uma internucleosídica modifi- cada covalente não contendo fosfato. Ligações internucleosídicas ou esqueletos modificados incluem, porém sem limitação, grupos 5'- fosforotioato, fosforotioatos quirais, tiofosfatos fosforoditioatos, fosfotri- ésteres, aminoalquil-fosfotriésteres, alquil fosfonatos (por exemplo, metil fosfonatos ou 3'-alquileno fosfonatos), fosfonatos quirais, fosfina- tos, fosforamidatos (por exemplo, 3'-amino fosforamidato, aminoalquil- fosforamidatos, ou tionofosforamidatos), tionoalquil-fosfonatos, tiono- alquilfosfotriésteres, ligações morfolino, boranofosfatos tendo ligações
3'-5' normais, análogos 2'-5' ligados de boranofosfatos, ou boranofos- fatos com polaridade invertida onde os pares adjacentes de unidades nucleosídicas são ligados 3'-5' a 5'-3' ou 2'-5' a 5'-2'.
[0282] Não é necessário que todas as posições em um dado com- posto sejam modificadas de forma uniforme. Ao contrário, mais de uma modificação pode ser incoporada em um único composto à base de oligonucleotídeo ou ainda em único nucleotídeo do mesmo.
[0283] Em algumas modalidades, a molécula de carga é um agen- te de RNAi para inibir a expressão gênica do alfa ENaC. A molécula de carga pode ser um agente de RNAi descrito no Pedido de Patente In- ternacional Nº POT/US18/40874, cuja íntegra encontra-se aqui incor- porada a título de referência.
[0284] Os filamentos sentido e os filamentos antissentido do agen- te de RNAi podem ser sintetizados e/ou modificados por métodos co- nhecidos no estado da técnica. Por exemplo, uma descrição de agen- tes de RNAi direcionados para a inibição da expressão de alfa-ENaC pode ser encontrada, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional Nº WO 2008/152131, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência. Descrições adicionais relacionadas a agentes de RNAi podem ser encontradas, por exemplo, na descrição de modificações podem ser encontradas, por exemplo, no Pedido de Patente Internaci- onal Nº POT/US2017/0455446 concedido a Arrowhead Pharmaceuti- cals, Inc., cuja íntegra também se encontra aqui incorporada a título de referência. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de carga podem incluir ou consistir em uma porção PEG que pode agir como um modulador da farmacocinética (PK). Em algumas modalida- des, a uma ou mais moléculas de carga podem incluir uma porção PEG com cerca de 20-900 unidades óxido de etileno (CH2-CH2-O) (por exemplo, 20 a 850, 20 a 800, 20 a 750, 20 a 700, 20 a 650, 20 a 600, a 550, 20 a 500, 20 a 450, 20 a 400, 20 a 350, 20 a 300, 20 a 250,
a 200, 20 a 150, 20 a 100, 20 a 75, 20 a 50, 100 a 850, 100 a 800, 100 a 750, 100 a 700, 100 a 650, 100 a 600, 100 a 550, 100 a 500, 100 a 450, 100 a 400, 100 a 350, 100 a 300, 100 a 250, 100 a 200, 100 a 150, 200 a 850, 200 a 800, 200 a 750, 200 a 700, 200 a 650, 200 a 600, 200 a 550, 200 a 500, 200 a 450, 200 a 400, 200 a 350, 200 a 300, 200 a 250, 250 a 900, 250 a 850, 250 a 800, 250 a 750, 250 a 700, 250 a 650, 250 a 600, 250 a 550, 250 a 500, 250 a 450, 250 a 400, 250 a 350, 250 a 300, 300 a 900, 300 a 850, 300 a 800, 300 a 750, 300 a 700, 300 a 650, 300 a 600, 300 a 550, 300 a 500, 300 a 450, 300 a 400, 300 a 350, 350 a 900, 350 a 850, 350 a 800, 350 a 750, 350 a 700, 350 a 650, 350 a 600, 350 a 550, 350 a 500, 350 a 450, 350 a 400, 400 a 900, 400 a 850, 400 a 800, 400 a 750, 400 a 700, 400 a 650, 400 a 600, 400 a 550, 400 a 500, 400 a 450, 450 a 900, 450 a 850, 450 a 800, 450 a 750, 450 a 700, 450 a 650, 450 a 600, 450 a 550, 450 a 500, 500 a 900, 500 a 850, 500 a 800, 500 a 750, 500 a 700, 500 a 650, 500 a 600, 500 a 550, 550 a 900, 550 a 850, 550 a 800, 550 a 750, 550 a 700, 550 a 650, 550 a 600, 600 a 900, 600 a 850, 600 a 800, 600 a 750, 600 a 700, 600 a 650, 650 a 900, 650 a 850, 650 a 800, 650 a 750, 650 a 700, 700 a 900, 700 a 850, 700 a 800, 700 a 750, 750 a 900, 750 a 850, 750 a 800, 800 a 900, 850 a 900, ou 850 a 900 unidades óxido de etileno). Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de carga consistem em uma porção PEG com aproximadamente 455 unidades óxido de etileno (peso molecular de cerca de 20 kilodalton (kDa)). Em algumas modalidades, uma porção PEG tem um peso molecular de cerca de 2 kilodaltons.
Em algumas modalidades, uma porção PEG tem um peso molecular de cerca de 20 kilodaltons.
Em algumas modalidades, uma porção PEG tem um peso molecular de cerca de 40 Kkilodaltons.
As porções PEG descritas neste pedido podem ser lineares ou ramifica- das.
As porções PEG podem ser discretas (monodispersadas) ou não discretas (polidispersadas). Porções PEG para uso como uma molécu- la de carga potencializadora da PK podem ser adquiridas comercial- mente. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de carga incluem uma porção PEG que pode agir como um modulador ou po- tencializador da PK, assim como uma molécula de carga diferente, tal como um princípio ou composto farmaceuticamente ativo.
[0285] Os ligantes da integrina avB6 descritos incluem sais ou sol- vatos dos mesmos. Solvatos de um ligante da integrina avB6 signifi- cam aduções de moléculas de solvente inerte ao ligante da integrina avB6 que se formam devido à força de atração mútua. Solvatos são, por exemplo, mono- ou di-hidratos ou compostos de adição com álco- ois, tal como, por exemplo, com metanol ou etanol.
[0286] Grupos amino livres ou grupos hidroxil livres podem ser apresentados como substituintes de ligantes da integrina avB6 com grupos protetores correspondentes.
[0287] Os ligantes da integrina avB6 também incluem, por exemplo, derivados, isto é, ligantes da integrina avB6 modificados, por exemplo, com grupos alquil ou acila, açúcares ou oligopeptídios, que são cliva- dos seja in vitro ou em um organismo.
[0288] Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 re- velado neste pedido facilita a distribuição de uma molécula de carga para o citosol de uma célula que apresenta uma integrina avB6 em sua superfície, seja através de endocitose mediada por ligante, pinocitoise, ou por outros meios. Em algumas modalidades, um ligante da integrina avB6 revelado neste pedido facilita a distribuição de uma molécula de carga tpara a membrana plasmática de uma célula que apresenta uma integrina avB6. Composições farmacêuticas
[0289] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta composições farmacêuticas que incluem, consistem em, ou consistem essencialmente em, um ou mais dos ligantes da integrina avB6 revela- dos neste pedido.
[0290] Conforme usado neste pedido, uma “composição farmacêu- tica" compreende uma quantidade farmacologicamente eficaz de um princípio ativo farmacêutico (API), e opcionalmente um ou mais excipi- entes farmaceuticamente aceitáveis. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis (excipientes) são substâncias diferentes do princípio ativo farmacêutico (API, produto terapêutico) que são intencionalmente in- cluídas no sistema de distribução de fármaco. Os excipientes não exercem ou não se destinam a exercer um efeito terapêutico na dosa- gem pretendida. Os excipientes podem agir para a) auxiliar no proces- samento do sistema de distribuição de fármaco durante a produção, b) proteger, manter ou melhorar a estabilidade, a biodisponibilidade ou a aceitabilidade do API pelo paciente, c) auxiliar na identificação do pro- duto, e/ou d) melhorar qualquer outro atributo da segurança geral, efi- cácia, da distribuição do API durante o armazenamento ou uso. Um excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser ou não ser uma substância inerte.
[0291] Excipientes incluem, porém sem limitação: melhoradores de absorção, antiaderentes, agentes antiespumantes, antioxidantes, aglu- tinantes, agentes tamponantes, carreadores, agentes de revestimento, cores, melhoradores de distribuição, polímeros de distribuição, dextra- na, dextrose, diluentes, desintegrantes, emulsificantes, redutores, car- gas, sabores, deslizantes, umectantes, lubrificantes, óleos, polímeros, conservantes, solução salina, sais, solventes, açúcares, agentes de suspensão, matrizes de liberação sistemática, adoçantes, agentes es- pessantes, agentes tonificantes, veíulos, agentes resistentes à água, e agentes umectantes.
[0292] As composições farmacêuticas descritas neste pedido po- dem conter outros componentes adicionais comumente encontrados em composições farmacêuticas. Em algumas modalidades, o compo- nente adicional é um material farmaceuticamente ativo. Materiais far- maceuticamente ativos incluem, porém sem limitação: antiprurídicos, adstringentes, anestésicos locais, ou agentes anti-inflamatórios (por exemplo, anti-histamina, difenidramina, etc.), fármaco de moléculas pequenas, anticorpo, fragmento de anticorpo, aptâmeros, e/ou vacina.
[0293] As composições farmacêuticas também podem conter agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, adoçantes, colorantes, aromati- zantes, sais para variação da pressão osmótica, tampões, agentes de revestimento, ou antioxidantes. Elas também podem conter outro agente com um benefício terapêutico conhecido.
[0294] As composições farmacêuticas podem ser administradas de diversas maneiras dependendo de se desejar tratamento local ou sis- têmico e da área a ser tratada. A administração pode ser feita por qualquer via comumente conhecida na literatura, tal como, porém sem limitação, tópica (por exemplo, por um adesivo transdérmico), pulmo- nar (por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, in- clusive por nebulizador, intratraqueal, intranasal), epidérmica, trans- dérmica, oral ou parenteral. Administração parenteral inclui, porém sem limitação, injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutãea, intraperitoneal ou intramuscular; administração subdérmica (por exem- plo, via um dispositivo implantado), intracraniana, intraparenquimatosa, intratecal, e intraventricular. Em algumas modalidades, as composi- ções farmacêuticas descritas neste pedido são administradas por inje- ção subcutânea. As composições farmacêuticas podem ser adminis- tradas por via oral, por exemplo, na forma de comprimidos, comprimi- dos revestidos, drágeas, cápsulas de gelatina dura ou mole, soluções, emulsões ou suspensões. A administração também pode ser feita por via retal, por exemplo, usando supositórios; por via local ou percutânea,
por exemplo, usando pomadas, cremes, géis, ou soluções; ou por via parenteral, por exemplo, usando soluções injetáveis.
[0295] Composições farmacêuticas adequadas para uso inejtável incluem soluções aquosas (onde solúveis em água) estéreis ou dis- persões estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração intra- Venosa, carreadores adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato. Eles devem ser estáveis nas condições de produção e armazenamento e devem ser conservados contra a ação contaminante de micro-organismos tais como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, pro- pileno glicol, e polietileno glicol líquido), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez própria pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exem- plo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, e cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis po- de ser causada pela inclusão na composição de um agente que retar- da a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[0296] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incoporação do composto ativo na quantidade necessária em um sol- vente apropriado com um ingrediente ou uma combinação de ingredi- entes relacionados acima, conforme necessário, seguida por esterili- zação em filtro. Em geral, as dispersões são preparadas pela incorpo- ração do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e outros ingredientes necessários dentre aqueles relacionados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação incluem seca- gem a vácuo e secagem por congelamento, o que produz um pó do princípio ativo mais qualquer ingredientes adicional desejado de uma solução previamente estéril do mesmo.
[0297] Formulações adequadas para administração intra-articular podem estar na forma de uma preparação aquosa estéril de qualquer um dos ligantes descritos neste pedido que podem estar em forma mi- crocristalina, por exemplo, na forma de uma suspensão microcristalina aquosa. Formulações lipossômicas ou sistemas poliméricos biodegra- dáveis também podem ser usados para apresentar qualquer um dos ligantes descritos neste pedido para administração intra-articular e of- tálmica.
[0298] Os compostos ativos podem ser preparados com carreado- res que vão proteger o composto contra eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser usados po- límeros biodegradáveis biocompatíveis, tais como vinil acetato de eti- leno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e áci- do poliláctico. Métodos para preparação de tais formulações ficarão evidentes para os especialistas na técnica. Suspensões lipossômicas também podem ser usadas como carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com métodos co- nhecidos pelos especialistas na técnica, por exemplo, tal como des- crito na Patente US Nº 4.522.811.
[0299] Uma composição farmacêutica pode conter outros compo- nentes adicionais comumentes encontrados em composições farma- cêuticas. Tais componentes adicionais incluem, porém sem limitação: antiprurídicos, adstringentes, anestésicos locais, ou agentes anti- inflamatórios (por exemplo, anti-histamina, difenidramina, etc.). Con- forme usado neste pedido, "quantidade farmacologicamente eficaz”,
“quantidade terapeuticamente eficaz”, ou simplesmente “quantidade eficaz” refere-se àquela quantidade de um agente farmaceuticamente ativo para produzir um resultado farmacológico, terapêutico ou preven- tivo.
[0300] Medicamentos contendo um ligante da integrina avB6 tam- bém são um objeto da presente invenção, assim como processos para a produção de tais medicamentos, tais processos compreendendo co- locar um ou mais compostos contendo um ligante da integrina avB6 e, se desejado, uma ou mais outras substâncias com um benefício tera- pêutico conhecido, em uma forma farmaceuticamente aceitável.
[0301] Os ligantes da integrina avB6 descritos e as composições farmacêuticas compreendendo ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido podem ser acondicionais ou incluídos em um kit, um re- cipiente, uma embalagem, ou um dispensador. Os ligantes da integrina avB6 e as composições farmacêuticas compreendendo os ligantes da integrina avB6 podem ser acondiconados em seringas pré-enchidas ou frascos. Células, Tecidos, e Organismos não Humanos
[0302] Células, tecidos, e organismos não humanos que incluem pelo menos um dos ligantes da integrina avB6 descritos neste pedido são consideradas. A célula, tecido, ou organismo não humano é feito por distribuição do ligante da integrina avB6 para a célula, tecido, ou organismo não humano por qualquer meio disponível na literatura. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero, incluindo, porém sem limitação, uma célula humana. Grupos vetorizadores, grupos de ligação, moduladores da farma- cocinética (PK), e veículos de distribuição
[0303] Em algumas modalidades, um ligante de avB6 é conjugado a um ou mais grupos não nucleotídicos incluindo, porém sem limitação, um grupo de ligação, um modulador da farmacocinética (PK), um po-
límero de distribuição, ou um veículo de distriuição. O grupo não nu- cleotídico pode melhorar a vetorização, a distribuição, ou a ligação da molécula de carga. Exemplos de grupos vetorizadores e grupos de |i- gação estão apresentados na Tabela 6. O grupo não nucleotídico pode ser covalentemente ligado à extremidade 3' e/ou 5' do filamento senti- do e/ou do filamento antissentido. Nas modalidades em que a molécu- la de carga é um agente de RNAi, o agente de RNAi contém um grupo não nucleotídico ligado à extremidade 3' e/ou 5' do filamento sentido. Em algumas modalidades, um grupo não nucleotídico pode ser cova- lentemente ligado à extremidade 5' do filamento sentido de um agente de RNAi. Um ligante da avB6 pode ser ligado direta ou indiretamente à molécula de carga via um ligante/grupo de ligação. Em algumas moda- lidades, um ligante da avB6 é ligado à molécula de carga via uma liga- ção ou ligante lábila, clivável, ou reversível.
[0304] Em algumas modalidades, um grupo não nucleotídico me- lhora as propriedades farmacocinéticas ou de biodistribuição de um agente de RNAi ou conjugado ao qual ele é preso para aumentar a distribuição célula- ou tecido-específica e a absorção célula-especiífica do conjugado. Em algumas modalidades, um grupo não nucleotídico aumenta a endocitose do agente de RNAi.
[0305] Grupos vetorizadores ou porções vetorizadoras melhoram as propriedades farmacocinéticas ou de biodistribuição de uma molé- cula de carga à qual eles são presos para aumentar a distribuição cé- lula-específica (incluindo, em alguns casos, distribuição órgão- específica) e a absorção célula-específica (ou órgão-específica) da molécula de carga. Em algumas modalidades, um grupo vetorizador pode compreender um ligante da avB6 descrito neste pedido. Em al- gumas modalidades, a targeting group compreende a linker. Em algu- mas modalidades, um grupo vetorizador compreende um modulador da farmacocinética. Em algumas modalidades, um ligante da avB6 é ligado a uma molécula de carga por meio de um ligante, tal como um ligante PEG ou um, dois, ou três resíduos abásicos e/ou ribitol (ribose abásica), que em alguns casos podem funcionar como ligantes.
[0306] É possível sintetizar moléculas de carga tendo um grupo reativo, tal como um grupo amino (neste pedido também chamado de amina). Nas modalidades em que a molécula de carga é um agente de RNAi, o grupo reativo pode ser ligado ao terminal 5' e/ou ao terminal 3'. O grupo reativo pode ser usado subsequentemente para prender um ligante da avB6 por métodos típicos na literatura.
[0307] Por exemplo, em algumas modalidades, sintetiza-se um agente de RNAi tendo um grupo NH2-C6 no terminal 5 ' do filamento sentido do agente de RNAi. O grupo amino terminal pode ser subse- quentemente reagido para formar um conjugado com, por exemplo, um grupo que inclui um ligante vetorizado para a integrina avB6. Em algumas modalidades, sintetiza-se um agente de RNAi tendo um ou mais grupos alquino no terminal 5' do filamento sentido do agente de RNAi. Os grupos alquino terminais podem ser subsequentemente rea- gidos para formar um conjugado com, por exemplo, um grupo que in- clui um ligante vetorizado para a integrina avB6.
[0308] Em algumas modalidades, um grupo de ligação é conjuga- do ao ligante da avB6. O grupo de ligação facilita a ligação covalente do ligante da avB6 a uma molécula de carga, a um modulador da far- macocinética, a um polímero de distribuição, ou a veículo de distribui- ção. Exemplos de grupos de ligação, incluem, porém sem limitação: AIKk-SMPT-C6, AIk-SS-C6, DBCO-TEG, Me-AIk-SS-C6, e C6-SS-Alk- Me, grupos reativos tais como aminas primárias e alquinos, grupos al- quila, resíduos abásicos/nucleotídeos, aminoácidos, grupos funcionali- zados com trialquino, ribitol, e/ou grupos PEG.
[0309] Um ligante ou grupo de ligação é uma conexão entre dois átomos que liga um grupo químico (tal como um agente de RNAi) ou segmento de interesse a outro grupo químico (tal como um ligante da avB6, modulador da farmacocinético, ou polímero de distriuição) ou segmento de interesse via um ou mais ligações covalentes. Uma liga- ção lábil contém uma ligação lábila. Uma ligação pode opcionalmente incluir um espaçador que aumenta a distância entre os dois átomos unidos. Um espaçador pode ainda acrescentar flexibilidade e/ou com- primento à ligação. Espaçadores incluem, porém sem limitação, gru- pos alquila, grupos alquenila, grupos alquinila, grupos arila, grupos aralquila, grupos aralquenila, e grupos aralquinila; cada um deles po- dendo conter um ou mais heteroátomos, heterociclos, aminoácidos, nucleotídeos, e sacarídeos. Grupos espaçadores são bastante conhe- cidos na literatura e a lista precedente não se destina a limitar o esco- po da descrição.
[0310] Em algumas modalidades, os ligantes da avB6 são ligados a moléculas de carga sem o uso de um ligante adicional. Em algumas modalidades, o ligante da avB6 é desenhado com um ligante pronta- mente presente para facilitar a ligação a uma molécula de carga. Em algumas modalidades, quando dois ou mais agentes de RNAi estão incluídos em uma composição, os dois ou mais agentes de RNAi po- dem ser ligados aos seus respectivos grupos vetorizadores pelos mesmos ligantes. Em algumas modalidades, quando dois ou mais agentes de RNAi estão incluídos em uma composição, os dois ou mais agentes de RNAi são ligados aos seus respectivos grupos vetorizado- res por ligantes diferentes.
[0311] Exemplos de alguns grupos de ligação estão mostrados na Tabela A. Tabela A. Estruturas representando vários grupos de ligação
OH Cds SS go ToA
U O. (PAZ) quando posicionado na extremidade 3' terminal do oligonucleotídeo SANA S,
SENADO OH (C6-SS-C6) Quando posicionado internamente no oligonucleotídeo: z a , , ligação na direção da extremidade 3' do Igação na direção da extemdade 5: do olgonucleotideo ADOOS ã& SNDNAODNSO o (C6-SS-C6) quando posicionado na extremidade 3' terminal do oligonucleotídeo:
ARO SAN E Do SO Not quando posicionado internamente no oligonucleotídeo: " lira, i, " ligação na direção da extremidade 3' do ligação na direção da extremidade 5 do aligonucientídeo) S. O. AODÔAÔDA NONO as Fo Só FODNo (6-8S-6) E?
O N H X 9 NS Bs a O 1 o: o s E vs o o oe (C6-SS-AIk) or (AIk-SS-C6)
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AODAODAOAO A FOR o TriAlk14 BN o TN K f G Í o / AOSADAODÔAOA Z/ DEEA L AOS to (TriAlk14)s onde $ indica o ponto de ligação a uma molécula de carga.
[0312] Alternativamente, podem ser usados outros grupos de liga- ção conhecidos na literatura.
[0313] As modalidades e os itens apresentados acima são agora ilustrados com os exemplos não limitativos a seguir.
EXEMPLOS
[0314] Os exemplos a seguir não são limitativos e destinam-se a ilustrar certas modalidades reveladas neste pedido. Exemplo 1. Síntese de ligantes da integrina avB6
[0315] Algumas das abreviações usadas nos seguintes detalhes experimentais da síntese dos exemplos estão definidas a seguir: h ou hr = hora(s); min = minuto(s); mol = mole(s); mmol = milimole(s); M = molar; uM = micromolar; g = grama(s); ug = micrograma(s); rt ou RT = temperatura ambiente; L= litro(s); mL = mililitro(s); wt = peso; Et2O = éter dietílico; THF = tetra-hidrofurano; DMSO = dimetil sulfóxido; EtO- Ac = etil acetato; Et3dN ou TEA = trietilamina; i-PR2NEt ou DIPEA ou DIEA = diisopropiletilamina; CH2Cl2 ou DCM = cloreto de metileno; CHCI3 = clorofórmio; CDCI3 = clorofórmio deuterado; CCI4 = tetraclo- reto de carbono; MeOH = metanol; EtOH = etanol; DMF = dimetilfor- mamida; BOC = t-butoxicarbonila; CBZ = benziloxicarbonila; TBS = t butildimetilsilila; TBSCI ou TBDMSCI = cloreto de t-butildimetilsílila; TFA = ácido trifluoroacético; DMAP = 4-dimetilaminopiridina; NaN3 = azida sódica; Na2SO. = sulfato de sódio; NaHCO; = bicarbonato de sódio; NaOH = hidróxido de sódio; MgSO4 = sulfato de magnésio; K2CO3 = carbonato de potássio; KOH = hidróxido de potássio; NH.OH = hidróxido de amônio; NHaCI = cloreto de amônio; SiO2 = sílica; Pd-C = paládio sobre carbono; HCI = cloreto de hidrogênio ou ácido clorídri- co; NMM = N-metilmorfolina; H2 = gás hidrogênio; KF = fluoreto de po- tássio; EDC-HCIl = cloriddato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'- etilcarbodiimida; MTBE = éter metil-ter-butílico; Ar = argônio; N2 = ni- trogênio; RT = tempo de retenção.
[0316] Os nomes químicos das estruturas 1-37 foram gerados au- tomaticamente pelo software ChemDraweê.
Síntese da Estrutura 1b (ácido (148S,17S)-1-azido-14-(5-((4-metilpiridin- 2-il)amino)pentanamido)-17-(4-(naftalen-l-il)fenil)-15-0x0-3,6,9,12- tetraoxa-16-azanonadecan-19-oico). O o SO 1. TFA, i-Pr5SiH SO N CH2Cla N DO 7 Frmeos os
2. Fmoc-OSu OO NaHCO; O 3. coluna 1 2
[0317] Composto 1 (Metil (S)-()1-tritilaziridina-2-carboxilate (4,204 g, 12,24 mmol, 1,0 equiv.) e triisopropilsilano (3,877 g, 5,02 mL, 24,48 mmol, 2 equiv.) foram dissolvidos em DCM (40 mL), a solução foi resfriada para 0ºC, e em seguida TFA (8,5 eq) foi adicionado em gotas. A solução permaneceu por 1 hora a 0ºC. A reação foi monitora- da por TLC, Hexano : Etil Acetato (8 : 2). A solução foi secada para dar uma mistura de precipitado branco e óleo amarelo claro. Hexanos (40 mL) foram adicionados e aquecidos delicadamente com uma pistola de calor até que todo o precipitado branco dissolvesse. A adição de he- xanos resultou em duas camadas, uma camada superior límpida e uma camada de óleo. A camada de hexano foi descartada e a camada de óleo ficou retirada. A adição de hexanos foi repetida e mais uma vez descartada. O óleo foi deixado secar. A aziridina (1,06 g, 10,5 mmol) foi dissolvida em THF / HO (2/1) 60 mL total. Fmoc-OSu (5,312 g, 15,75 mmol, 1,5 eq) e NaHCO; (2,646 g, 31,5 mmol, 3 eq para manter o pH = 8,5) foram adicionados à mistura à temperatura ambiente e deixados reagir por uma noite. A reação foi monitorada por TLC, Hexano: Etil Acetato 8:2. A mistura foi concentrada até que todo o THF fosse removido, e então diluída com etil acetato (350 mL) e H2O (25 mL). As camadas foram separadas, e os orgânicos foram lavados com H2O (40 mL). Os orgânicos foram então lavados com água pH 3-4 (2x 40 mL), em seguida com H2O (40 mL), e em seguida com solução aquosa saturada de NaCl (40 mL). A fase orgânica foi secada sobre Na2SO:, filtrada, e concentrada. O produto foi purificado sobre uma coluna de sílica 10%-20% de etil acetato em hexanos. o SO o POA AAA W HO-PEG,-N; (O A o. A o <T ON e. oÊÉ o BF; ELO no CHCI: Setat 0% O 3 48 hrs RT 2
[0318] Composto 2 (Fmoc-aziridina) (1,46 9, 4,52 mmol) e HO- PEGA4-N3 (1,983 g, 9,04 mmol, 2 eq) foram dissolvidos em DCM. A mistura foi resfriada para O “ºC. Dietil eterato de trifluoreto de boro (12 gotas) foi adicionado em gotas. A mistura foi agitada à temperatura por 48 horas. A reação foi monitorada por TLC, DOM com 5% de MeOH. À reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NHCI (5 mL), diluída com DCM (60 mL) e lavada com H2O (3 x 20 mL), solu- ção aquosa saturada de NaCl (20 mL), secada sobre Na2SO;, filtrada, e concentrada. O produto foi purificado sobre uma coluna de sílica, 40%-60% de etil acetato em hexanos. o FOMNoA NANANa ANa ICAO Ns CO À. Lo. DMF Lo < o N ELN (20% volume) — HaN' o =—— fo] DV '
[0319] O Composto 3 foi dissolvido em uma solução de 20% de trietilamina em DMF. A reação foi monitorada por TLC. O produto foi concentrado. ax H o DADO NO o | JA “< — RN O
AN TO GA 2N Oo 7
[0320] Composto 5 (ter-Butil(4-metilpiridin-2-il)carbamato) (0,501 9, 2,406 mmol, 1,0 equiv.) foi dissolvido em DMF (17 mL). NaH (0,116 mg, 3,01 mmol, 1,25 eq, dispersão a 60 % em óleo mineral) foi adicio- nado à mistura à temperatura ambiente. A mistura foi agitada por 10 minutos, e então etil 5- bromovalerato (0,798 g, 3,82 mmol, 0,604 mL) foi adicionado. Depois de 3 horas a reação foi resfriada bruscamente com etanol (18 mL) e concentrada. O produto foi dissolvido em DCM (50 mL) e lavado com uma solução aquosa saturada de NaCl (50 mL), secado sobre Na2SO:, filtrado e concentrado. O produto foi purificado sobre uma coluna de sílica, gradiente 0-5% de metanol em DCM. L. XT FT NaOH PY
N O N OH 2N Oo 2N o 7 8
[0321] Composto 7 (0,80 g, 2,378 mmol) foi dissolvido em 100 mL de acetona : NaOH 0,1 M (1:1), e a reação foi monitorada por TLC (5% de etil acetato em hexano). Os orgânicos foram concentrados, e a mis- tura foi acidificada para pH 3-4 com ácido cítrico 0,3 M (40 mL). O pro- duto foi extraído com DCM (3 x 75 mL). Os orgânicos foram reunidos, secados sobre Na2SO;, filtrados e concentrados. O produto foi usado sem purificação adicional. CC 8 ou QN OA Na TBTU (1.8 eq), DIPEA (2 eq)
O ME coluna (PoFMAnnoAANs UU im ho, PP .
À
[0322] O Composto 4 foi dissolvido (0,340g, 1,104 mmol) em DMF (10 mL). TBTU (0,531g, 1,655 mmol) e diisopropiletilamina (0,320 mL, 1,839 mmol) foram adicionados à solução. Em seguida foi adicionado o composto 8 (0,295g, 0,9197 mmol). A reação foi monitorada por LC- MS e TLC (DCM com 5% de MeOH). A reação terminou em 2 horas. O produto foi concentrado e dissolvido em etil acetato (150 mL), e lavado com pH 3-4 H2O (2 x 12 mL). Em seguida o produto foi lavado com H2O (2 x 12 mL), com uma solução aquosa saturada de NaHCO; (12 mL), e em seguida com uma solução aquosa saturada de NaCl (12 mL). A fase orgânica foi secada sobre Na2SO;, filtrada e concentrada. O produto foi purificado sobre uma coluna de sílica, hexanos 20% em etil acetato até 100% de etil acetato. pPDoMAnAneMA Ns LA o É i 9 o N As 9 A . A NAN Ns o. AAA o Á 1 o
[0323] O Composto 9 foi dissolvido (0,330g, 0,540 mmol) em 10 mL de MeOH:dioxano [1:1] e solução 1 M de LiOH (10 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, e monitorada por LC- MS e TLC (EtOAc). Os orgânicos foram concentrados, e a mistura foi diluída com H2O (5 mL) e acidificada para pH 4. O produto foi extraído com etil acetato (2 x 50 mL). Os orgânicos foram reunidos, lavados com uma solução aquosa saturada de NaCI (10 mL), secados sobre Na>2SO:, filtrados e concentrados. O produto foi usado sem purificação adicional.
Forma metil éster 8 TE “O . " CO " " B(OH), = : 2. cotuna .s XY Y O me Ho Y O ão
[0324] O Composto 11 (ácido (S)-3-(4-Bromofenil)-3-((ter- butoxicarbonil)amino)-propiônico) (2,09, 5,81 mmol) foi dissolvido em DMF (40 mL). K2CO3 (1,2 g, 8,72 mmol) foi adicionado à mistura. Em seguida iodometano (1,65 g, 11,62 mmol, 0,72 mL) foi adicionado. À reação foi monitorada por TLC (hexano : etil acetato (7 :3)). Depois de terminada, a mistura foi resfriada para O ºC e H2O (20 mL) e MTBE (40 mL) foram adicionados. O produto foi extraído com MTBE (4 x 40 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com NaHCO; aquoso saturado (40 mL) e em seguida com H2O (4 x 40 mL). A mistura foi secada so- bre Na2SO:,, filtrada e concentrada.
[0325] Ao produto seco composto 12 (1,0 g, 2,7915 mmol) foi adi- cionado o composto 13 (ácido 1-naftaleno borônico (0,960 g, 5,583 mmol, 2 eq)). [1,1'-Bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaládio (Il) ou Pd(dppf)Cl2 (0,0817 g, 0,1117 mmol, 0,4 eq) foi adicionado à mistura junto com Na2CO3 (0,888 g, 8,375 mmol, 3 eq). Em seguida, f 1,4- dioxano (5 mL) e H2O (0,2 mL) oram adicionados, e a mistura foi agi- tada a 100 ºC por 4 horas. A reação foi monitorada por TLC (hexano : etil acetato (7 :3)). O produto foi purificado por cromatografia sobre sí- lica, gradiente 0% a 50% de etil acetato em hexanos.
[0326] O Composto 14 (0,200 g, 0,493 mmol) foi dissolvido em DCM (2,5 mL), e em seguida adicionou-se TFA (0,45 mL). A reação foi monitorada por TLC, (DCM : metanol (9 : 1)). Depois de terminada, a mistura reacional foi concentrada. O resíduo foi dissolvido em DCM (4 mL) e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO; (2 x 2 mL) e em seguida com uma solução aquosa saturada de NaCl (2 x 2 mL). A fase orgânica foi secada sobre Na>2SO;, filtrada e concentrada. O produto foi usado sem purificação adicional.
HJN. Ox. Õ o (OA CO ". io A Los TBTU (1.5 eq), DIPEA (2 eq) Do o DMF A + ema 7 Coluna work-up Doo AN: AN o o LA A & A, 9 o o o o ó
[0327] O Composto 10 (0,3224g, 0,54 mmol) foi dissolvido em DMF (7 mL). TBTU (0,236 g, 0,735 mmol) e diisopropiletilamina (0,170 mL, 0,98 mmol) foram adicionados à mistura. Em seguida adicionou-se o composto 15 (0,1496g, 0,49 mmol). A reação foi agitada à tempera- tura ambiente por 2 horas. A reação foi monitorada por LOC-MS. A mis- tura foi concentrada, e o resíduo foi dissolvido em etil acetato (90 mL), e lavado com H2O pH 3-4 (3 x 10 mL). O produto foi lavado com H2O (2x 10 mL), com uma solução aquosa saturada de NAHCO; (10 mL), e em seguida com uma solução aquosa saturada de NaCl (1 x 10 mL). À fase orgânica foi secada sobre Na2SO:,, filtrada e concentrada. O pro- duto foi purificado por cromatografia sobre sílica using DCM, gradiente até 5% de MeOH.
PDA A , AIN PA fr se PA o AR TO esnato CO 7
[0328] O Composto 16 foi dissolvido (0,250g, 0,2828 mmol) em MeOH : dioxano [1:1] (4 mL) e 1 M LiOH (4 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. Os orgânicos foram concentrados, e o resíduo foi diluído com H2O (3 mL) e acidificado para pH 4. O pro- duto foi extraído com etil acetato (3 x 20 mL). Os orgânicos foram reu- nidos e lavados com uma solução aquosa saturada de NaCl (10 mL). O produto foi secado sobre Na2SO.a. O produto foi dissolvido (0,200 g, 0,2299 mmol) em 2 mL de DCM : TFA [25:75] e agitado à temperatura ambiente por 2 horas. Tolueno (4 mL) foi adicionado à mistura. A mis- tura foi concentrada, e em seguida coevaporada com acetonitrila (2 x 4mL). O produto foi purificado por HPLC, gradiente 35% de ACN a 50% em 30 minutos, tampão 0,1% de TFA. => [M+H]+ calculado para C41H51N708: 769,90, encontrado: 770,45; 1H RMN (400 MHz, DMSO) 5 8,64 (d, 1H), 8,07 (d, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,95 (d, 1H), 7,78 (t, 2H), 7,60-7,40 (m, 8H), 6,80 (s, 1H), 6,67 (d, 1H), 5,31 (q, 1H), 4,55 (m, 1H), 3,62 - 3,45 (m, 18H), 3,40 (t, 2H), 3,25 (m, 2H), 2,80 (dd, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,20 (t, 2H), 1,55 (m, 4H). Síntese da Estrutura 2b (ácido (148S,17S)-1-azido-14-(4-((4-metilpiridin- 2-il)amino)butanamido)-17-(4-(naftalen-1-il)fenil)-15-0x0-3,6,9,12- tetraoxa-16-azanonadecan-19-oico). + ” o + 21 Na CADAO NUA: Pago ”
O E CEA 2N ZN
[0329] O Composto 5 (ter-Butil(4-metilpiridin-2-il)carbamato) (0,501 9, 2,406 mmol, 1 equiv.) foi dissolvido em DMF (17 mL). À mistura adi-
cionou-se NaH (0,116 mg, 3,01 mmol, 1,25 eq, dispersão a 60% em óleo). A mistura foi agitada por 10 minutos antes da adição do Com- posto 20 (Etil 4-Bromobutirato (0,745 g, 3,82 mmol, 0,547 mL)) (Sigma 167118). Depois de 3 horas a reação foi resfriada bruscamente com etanol (18 mL) e concentrada. O concentrado foi dissolvido em DCM (50 mL) e lavado com uma solução aquosa saturada de NaCl (1 x 50 mL), secado sobre Na2SO;, filtrado e concentrado. O produto foi purifi- cado sobre uma coluna de sílica, gradiente 0-5% de Metanol em DCM.
[0330] O Composto 21 foi dissolvido (0,80 g, 2,378 mmol) em 100 mL de Acetona : 0,1 M NaOH [1:1]. A reação foi monitorada por TLC (5% de etil acetato em hexano). Os orgânicos foram concentrados, e o re- síduo foi acidificado para pH 3-4 com ácido cítrico 0,3 M (40 mL). O produto foi extraído com DCM (3 x 75 mL). Os orgânicos foram reuni- dos, secados sobre Na2SO:,, filtrados e concentrados. O produto foi usado sem purificação adicional. OO Na paras 10 Cie uma de py pt Co AE 23
[0331] O Composto 22 foi dissolvido (0,340g, 1,104 mmol) em DMF (10 mL). À mistura adicionou-se TBTU (0,531g, 1,655 mmol) e diisopropiletilamina (0,320 mL, 1,839 mmol). Em seguida adicionou-se o Composto 10 (0,295g, 0,9197 mmol). A reação foi monitorada por LC-MS e TLC (DCM com 5% de MeOH). A reação terminou em 2 ho- ras. A mistura foi concentrada, dissolvida em etil acetato (150 mL), e lavada com H2O pH 3-4 (2 x 12 mL). A mistura foi então lavada com H2O (2 x 12 mL), com uma solução aquosa saturada de NaHCO; (12 mL), e em seguida com uma solução aquosa saturada de NaCl (12 mL). A fase orgânica foi secada sobre Na2SO:;, filtrada e concentrada. O produto foi purificado sobre uma coluna de sílica, Hexanos 20% em etil acetato a 100% de etil acetato. + (Poa to e, Ke q EO
[0332] O Composto 23 foi dissolvido (0,330g, 0,540 mmol) em 10 mL de MeOH : Dioxano [1:1] e 1 M LiOH (10 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas e monitorada por LC- MS e TLC (100% de EtOAc). Os orgânicos foram concentrados, e o resíduo foi diluído com H2O (5 mL), e acidificado para pH 4. O produto foi extraído com etil acetato (2 x 50 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com uma solução aquosa saturada de NaCl (1 x 10 mL). A fase orgâà- nica foi secada sobre Na>2SO:,, filtrada e concentrada. O produto foi usado sem purificação adicional. s
E
CO vo penas o qo TBTU (1.560), DIPEA (2 eq) 24 Wwork-up + EA ão o
CEA É OO
[0333] O Composto 24 foi dissolvido (0,3224g, 0,54 mmol) em DMF (7 mL). À mistura adicionou-se TBTU (0,236 g, 0,735 mmol) e diisopropiletilamina (0,170 mL, 0,98 mmol). Adicionou-se então o
Composto 15 (0,1496g, 0,49 mmol). A mistura foi agitada à temperatu- ra ambiente por 2 horas. A reação foi monitorada por LC-MS. A mistu- ra foi concentrada, e o resíduo foi dissolvido em etil acetato (90 mL) e lavado com H2O pH 3-4 (3 x 10 mL). O concentrado foi lavado com H2O (2 x 10 mL), com uma solução aquosa saturada de NaHCO;3 (10 mL), e em seguida com uma solução aquosa saturada de NaCl (10 mL). A fase orgânica foi secada sobre Na2SO:;, filtrada e concentrada. O produto foi purificado sobre uma coluna de sílica, DCM, gradiente até 5% de MeOH. L o. oo i EAD EA á 1 ou RS OD on CO ” ..
[0334] O Composto 25 foi dissolvido (0,250g, 0,2828 mmol) em MeOH : Dioxano [1:1] (4 mL) e 1 M LiOH (4 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, e monitorada por LC-MS. Os or- gânicos foram concentrados, e o resíduo foi diluído com H2O (3 mL) e acidificado para pH 4. O produto foi extraído com etil acetato (3 x 20 mL). Os orgânicos foram reunidos e lavados com uma solução aquosa saturada de NaCl (1 x 10 mL). A fase orgânica foi secada sobre Na2SO, e concentrada. O resíduo foi dissolvido (0,200 g, 0,2299 mmol) em 2 mL de DCM / TFA (25 / 75) e agitado à temperatura ambiente por 2 horas enquanto era monitorado por LC-MS. Tolueno (4 mL) foi adici- onado, e a mistura foi concentrada. Em seguida adicionou-se acetoni- trila (2 x 4 mL), e a mistura foi concentrada. O produto foi purificado por HPLC, gradiente 35% de ACN até 50% em 30 minutos, tampão 0,1% de TFA. [M+H]+ calculado para C40H49N708: 755,87, encon- trado: 756,32; 1H RMN (400 MHz, DMSO) 5 8,64 (t, 1H), 8,17 - 8,10 (m, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,95 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,75 (m, 1H), 7,60- 7,40 (m, 8H), 6,8 (s, 1H), 6,67 (d, 1H), 5,31 (q, 1H), 4,55 (m, 1H), 3,62
- 3,45 (m, 18H), 3,40 (t, 2H), 3,25 (m, 2H), 2,80 (dd, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,26 (t, 2H), 1,80 (m, 2H). Síntese da Estrutura 5b, 5,1b, e 5,2b. Estrutura 5b (ácido 3-(4-(2-(2-(2-azidoetóxi)etóxi)etóxi)-3,5- diclorofenil)-3-(2-(5-((4-metilpiridin-2- il)>amino)pentanamido)acetamido)propanoico) O o j Nah Õ AA OX La do + ga A “A, o : s A
[0335] A uma solução de composto 5 (0,98 g, 4,70 mmol, 1 equiv.) em DMF seca (10 mL) NaH (0,226 g, 5,647 mmol, 1,2 equiv., disper- são a 60% em óleo) foi adicionado aos poucos a 0ºC em uma atmosfe- ra de N2. A mistura reacional foi mantida a 0ºC por 30 minutos seguido pela adição do composto 6 (1,18 mL, 5,647 mmol, 1,2 equiv.) à mesma temperatura. Depois de agitação adicional a 0ºC por 30 minutos a mis- tura foi deixada esquentar até a temperatura ambiente. Depois de agi- tar à temperatura ambiente por 1 hora, a reação foi resfriada brusca- mente com uma solução aquosa saturada de NHCI. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 20 mL) e a camada orgânica foi combi- nada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. O produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária. LC-MS: [M+H]+ 337,20, encontrado 337,39. N x 0 LoHHO nº q oÊÉ o coÊÉ o A o
[0336] A uma solução de composto 7 (1,347 g, 4,00 mmol, 1 equiv.) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) hidróxido de lítio mono-hidratado (0,505 9, 12,01 mmol, 5 equiv.) foi adicionado aos poucos a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à temperatura ambiente por 1 hora, a mistura reacional foi acidificada com HCl (6 N) para pH 4,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 20 mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO., e concentrada. LC-MS: [M+H]+ 309,17, encontrado 309,39. O PS 9 TBTU à AA O Nó N on A nNnçor EP CN NOT Êo ã o as DIPEA Êo js TA q
[0337] A uma solução de composto 8 (1,163 g, 3,77 mmol, 1 equiv.), Composto 45 (568 mg, 4,52 mmol, 1,2 equiv.), e TBTU (1,453 9, 4,52 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (10 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (1,97 mL, 11,31 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reaci- onal foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 3 horas. À reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (20 mL). A camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL), e a fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, andiro, e concentrada. O produto foi separado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase estacionária. LC-MS: calculado [M+H]+ 380,21, en- contrado 380,51. 48 OH o Oo HoN oH A HO o Fx o CI cl NH,OAc ci Cc
OH OH 47 49
[0338] A uma solução de composto 47 (1,0 g, 5,23 mmol, 1 equiv.) e ácido malônico (1,09 g, 10,47 mmol, 2 equiv.) em etanol (10 mL) adi- cionou-se acetato de amônio (0,807 mg, 10,47 mmol, 2,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada ao refluxo por uma noite. O sólido foi filtrado e lavado com etanol frio. O produto foi usado diretamente em etapas adicionais sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 250,00, encontrado 250,16. Qdo LioH HO Queda Do ' 8 A], do i o A 46 Aq so
[0339] A uma solução de composto 46 (1,412 g, 3,72 mmol, 1 equiv.) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) hidróxido de lítio mono-hidratado (0,469 g, 11,16 mmol, 3 equiv.) foi adicionado aos poucos a 0ºC. À mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à temperatura ambiente por 3 horas, a mistura reacional foi aci- dificada com HCI (6 N) para pH 4,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 20 mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. LC-MS: calculado [M+H]+ 366,20, encontrado 366,46. HJN OH HaN O o Ssoch õ — Fr MeOH Fr OH OH 51 4o
[0340] A uma suspensão de composto 49 (0,531 g, 2,12 mmol, 1 equiv.) in anhidrous metanol (10 mL) adicionou-se cloreto de tionila (308 uL, 4,24 mmol, 2,0 equiv.) sobre um banho de gelo. A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por uma noite. O sol- vente foi removido à pressão reduzida e o produto foi usado direta- mente sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 264,01, encontrado 264,20. Dam Pa TA aà n Ee RA so E oH
[0341] A uma solução de composto 50 (150 mg, 0,410 mmol, 1 equiv.), composto 51 (148 mg, 0,492 mmol, 1,2 equiv.), e TBTU (158 mg, 0,492 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra DMF (5 mL) adicionou-se diisopropiletilamina (0,214 mL, 1,23 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 3 ho- ras. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução aquosa sa- turada de NaHCO; (10 mL) e o produto foi extraído com etil acetato (3 x 20 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-4% de metanol em DCM. Qd o. & And Ao do ". o! NePECIs NU Ja AO T As OH o - | PS Ju pg AG ÃO 53
[0342] A uma solução de composto 52 (80 mg, 0,130 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG3-OTs (86 mg, 0,262 mmol, 2 equiv.) em DMF ani- dra (2 mL) adicionou-se K2CO3 (36 mg, 0,262 mmol, 2 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi agitada por 1 hora a 80ºC. O solvente foi remo- vido por um evaporador giratório. O produto foi purificado por Combi- FlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2- 4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 768,28, encontra- do 769. ss no o — " ns o A SE mA *TFA NX pi AO nEOAOAAOA . Estrutura 5b
[0343] A uma solução de composto 53 (58 mg, 0,0755 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio mono-hidratado (10 mg, 0,226 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambi- ente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 2 horas. O pH foi ajustado em 3,0 com HCI (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na>2SO,, e concentrada. TFA (0,25 mL) e DCM (0,75 mL) foi adiciona- do ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 654,21, encontrado 655. Estrutura 5.1b (ácido 3-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)-3,5-diclorofenil)-3-(2-(5-((4-metilpiridin-2- il)amino)pentanamido)acetamido)propanoico) Qd Ox NxPEG;-Tos Qt Ps. Do no fo Em oo *. o Fela A
OH NOXPOS AISO 55
[0344] A uma solução de composto 52 (100 mg, 0,163 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (205 mg, 0,491 mmol, 3 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se K2CO3 (68 mg, 0,491 mmol, 2 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi agitada por 1 hora a 80ºC. O solvente foi removido por um evaporador giratório. O produto foi purificado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-3% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 856,33, en- contrado 857,07. *s o Õ o NEON ONO pi AO RAROS ss eTFA
[0345] A uma solução de composto 55 (119 mg, 0,139 mmol, 1,0 equiv.) em THF (4 mL) e água (4 mL) adicionou-se hidróxido de lítio
(10 mg, 0,417 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCI (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. TFA (2 mL) e DCM (2 mL) foi adicionado ao resíduo e a mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removi- do por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 742,27, en- contrado 743,02. Estrutura 5.2b (ácido 4-((8-azido-octil)óxi)-3,5-diclorofenil)-3-(2-(5- ((4-metilpiridin-2-il)amino)pentanamido)acetamido)propanoico) Qdo Qt vê OA º% nº OA SN À H o 5 CH7);Br Do o o oo r— À o cl Ko ÂÁ e! el OH Bose ORAR 57
[0346] A uma solução de composto 52 (89 mg, 0,14 mmol, 1 equiv.) e 1,8-dibromo-octano (80 uL, 0,436 mmol, 3 equiv.) em acetona (2 mL) adicionou-se K2CO3 (60 mg, 0,436 mmol, 3 equiv.) à temperatura am- biente. A mistura reacional foi agitada por 6 horas a 55 ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; e a ca- mada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;,, e concentrada. LC-MS: calcula- do [M+H]+ 801,23, encontrado 801,98. Out Qt nº OA O Nº EE ds "4 o NaN; À. o o oo ——— oo A cr cl À cr 1º
BOSAONANAO NEODAODAODAODÔO 57 58
[0347] A uma solução de composto 57 (97 mg, 0,114 mmol, 1 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se azida sódica (15 mg, 0,229 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agita-
da por 2 horas a 80ºC. A reação foi resfriada bruscamente com água e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase or- gânica foi combinada, secada sobre Na2SOa, e concentrada. O produ- to foi usado diretamente sem purificação adicional. LC-MS : calculado [M+H]+ 764,32, encontrado 765,07. y à o oo Potro oÊÉ “o LoH Estrutura 5.25 A e el TR er Cc nEODAODSAOSOSA NIOSAIDADADAO 58 eTFA
[0348] A uma solução de composto 58 (78 mg, 0,101 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (7 mg, 0,304 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. TFA (2 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LOC-MS: calculado [M+H]+ 650,25, encontrado 650,83. Síntese da Estrutura 6b, 6,1b, 6,2b, 6,3b, e 6,4b. Estrutura 6b (ácido (S8)-3-(4-(4-(2-(2-(2- azidoetóxi)etóxi)etóxi)naftalen-1-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- il)>amino)butanamido)acetamido)propanoico) 1 És ei o Qua x À suger EA EP Êo º DIPEA Ao A? 45 A 60
[0349] A uma solução de composto 22 (1,1 g, 3,95 mmol, 1 equiv.), Composto 45 (595 mg, 4,74 mmol, 1,2 equiv.), e TBTU (1,52 g, 4,74 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (10 mL) adicionou-se diisopropileti- lamina (2,06 mL, 11,85 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 3 horas. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL). A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL) e a fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO, andiro, e concentrada. O produto foi separado por CombiFlash€6 usando sílica gel como a fa- se estacionária. LC-MS: calculado [M+H]+ 366,20, encontrado 367. Br Br. Br
O OH 61 62 à ss
[0350] A uma solução de composto 61 (2 g, 8,96 mmol, 1 equiv.), e composto 62 (2,13 mL, 17,93 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (10 mL) adicionou-se K2CO3 (2,48 g, 17,93 mmol, 2 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL). A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL) e a fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO, andiro, e concentrada. O produto foi separado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase estacionária. GQ, do LiOH HO Q, Ro, AI es o As 6o À 6a
[0351] A uma solução de composto 60 (1,77 g, 4,84 mmol, 1 equiv.) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) adicionou-se aos poucos hidróxido de lítio mono-hidratado (0,61 g, 14,53 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à temperatura ambiente por 3 horas, a mistura reacional foi acidificada com HCI (6 N) para pH 3,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 20 mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO., e concentrada. LC-MS: calculado [M+H]+ 352,18, encontrado 352. Be HO. 5 -OH à [(CH3)2CHOI;B à 65
[0352] A uma solução de composto 63 (1,88 g, 6,0 mmol, 1,0 equiv.) em THF anidro (20 mL) adicionou-se em gotas n-BuLi em he- xano (3,6 mL, 9,0 mmol, 1,5 equiv.) a -78ºC. A reação foi mantida a - 78ºC por mais 1 hora. Triisopropilborato (2,08 mL, 9,0 mmol, 1,5 equiv.) foi então adicionado à mistura a -78ºC. A reação foi então aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NH.CI (20 mL) e o pH foi ajustado em 3. A fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 20 mL) e a fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO2, e concen- trada. H HO, OH o Ox XY Y O a A 7" Y
OO é No Ra 12 Ô ' VD 65 Ô 66
[0353] O Composto 12 (300 mg, 0,837 mmol, 1,0 equiv.), Compos- to 65 (349 mg, 1,256 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (13 mg, 0,0167 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (355 mg, 1,675mmol, 2,0 equiv.) foram misturados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo de tampa de rosca, e então esvaziado e novamente enchido com nitroênio (este processo foi repetido um total de 3 vezes). Em se-
guida, THF (8 mL) e água (2 mL) foram adicionados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 20 minutos e a reação foi mantida à temperatura ambiente por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL), e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi secada sobre Na2SO., concen- trada, e purificada via CombiFlash& usando sílica gel como a fase es- tacionária e foi eluído com 15% de EtOAc em hexano. LC-MS: calcu- lado [M+H]+ 512,24, encontrado 512,56.
" TS S Ox ". Y Ox O —*e o, o o.
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[0354] O Composto 66 (858 mg, 1,677 mmol, 1,0 equiv.) foi resfri- ado por um banho de gelo. HCl em dioxano (8,4 mL, 33,54 mmol, 20 equiv.) foi acrescentado ao balão. A reação foi aquecida até a tempe- ratura ambiente e agitada por mais 1 hora. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi usado diretamente sem purifi- cação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 412,18, encontrado 412,46. É O ” CC Pasto r. CO a“ à Y : Ô
[0355] A uma solução de composto 64 (500 mg, 1,423 mmol, 1 equiv.), composto 67 (669 mg, 1,494 mmol, 1,05 equiv.), e TBTU (548 mg, 0,492 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (15 mL) adicionou-se diisopropiletilamina (0,744 mL, 4,268 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução aquosa saturada de NaHCO; (10 mL) e o produto foi extraído com etil acetato (3 x 20 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlash&O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. O rendimento foi de 96,23%. LC-MS: calculado [M+H]+ 745,35, encontrado 746,08. Ç == a OQ Sd ou
[0356] A uma solução de composto 68 (1,02 g, 1,369 mmol, 1 equiv.) em etil acetato (10 mL) adicionou-se 10% de Pd/C (0,15 g, 50% de H2O) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e a reação foi monitorada por LC-MS. A rea- ção foi mantida à temperatura ambiente por uma noite. Os sólidos fo- ram filtrados através de Celite& e o solvente foi removido por um eva- porador giratório. O produto foi usado diretamente sem purificação adicional. LC-MS: [M+H]+ 655,31, encontrado 655,87.
[0357] A uma solução de composto 69 (100 mg, 0,152 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG3-OTs (100 mg, 0,305 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se K2CO3 (42 mg, 0,305 mmol, 2 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi agitada por 6 horas a 80ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; e a ca- mada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO., e concentrada. O produto foi separado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase estacionária. LC-MS: calculado [M+H]+ 812,39, encontrado 813,14.
FE . > S 5
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[0358] A uma solução de composto 70 (77 mg, 0,0948 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (7 mg, 0,284 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 2 horas. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. TFA (0,5 mL) e DCM (0,5 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistu- ra foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 698,32, encontrado 698,81. Estrutura 6.1b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- i)>amino)butanamido)acetamido)propanoico)
NA A o Da AO ÇA e imp “e s 1200 7
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[0359] A uma solução de composto 69 (100 mg, 0,152 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (128 mg, 0,305 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se K2CO3 (42 mg, 0,305 mmol, 2 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi agitada por 6 horas a 80ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; e a ca- mada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. LC-MS: calcula- do [M+H]+ 900,40, encontrado 901,46. . o M A N oH Nó AAA ox Ç Or Y Ç Rs Ô
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[0360] A uma solução de composto 72 (59 mg, 0,0656 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (5 mg, 0,197 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. TFA (0,5 mL) e DCM (0,5 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistu- ra foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 786,37, encontrado 786,95. Estrutura 6.2b (ácido (S)-3-(4-(4-((8-azido-octil)óxi)naftalen-1- il)pbhenvn-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- il)amino)butanamido)acetamido)propanoico) ef + II o IRA (S N. e. Y SN CS ANA AA o Ô encher — 1 o À o . . O
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[0361] A uma solução de composto 69 (150 mg, 0,229 mmol, 1 equiv.) e 1,8-dibromo-octano (127 uL, 0,687 mmol, 3 equiv.) em aceto- na (2 mL) adicionou-se K2CO3 (95 mg, 0,687 mmol, 3 equiv.) à tempe- ratura ambiente. A mistura reacional foi agitada por uma noite a 55ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. LC-MS: calculado [M+H]+ 845,34, encontrado 845,91. + + OS 0 Ox N. AA K Ox Ç PIA > OTICL do
[0362] A uma solução de composto 74 (97 mg, 0, 114 mmol, 1 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se azida sódica (15 mg, 0,229 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agita- da por 2 horas a 80ºC. A reação foi resfriada bruscamente com água e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase or- gânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. LC-MS: calculado [M+H]+ 808,43, encontrado 809,00. + o oo " " 76
[0363] A uma solução de composto 75 (92 mg, 0,114 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (8 mg, 0,342 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em
3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. TFA (0,5 mL) e DCM (0,5 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistu- ra foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 694,36, encontrado 694,94. Estrutura — 6.3b (ácido (S)-3-(4-(4-((20-azido-3,6,9,12,15,18- hexaoxaicosy!l)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- il)>amino)butanamido)acetamido)propanoico)
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[0364] A uma solução de composto 69 (100 mg, 0,152 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG7-OTs (154 mg, 0,305 mmol, 2 equiv.)) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (100 mg, 0,305 mmol, 2 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi agitada a 40ºC por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. O pro- duto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase es- tacionária, e o produto foi eluído com 2-3% de metanol em DCM. LC- MS: calculado [M+H]+ 988,50, encontrado 989,14. E o o EIA Y ex CNT Y oH —E Estrutura 6.36
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[0365] A uma solução de composto 21 (112 mg, 0,113 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (8 mg, 0,340 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 874,43, encontrado 875,08. Estrutura 6.4b (ácido (S8S)-3-(4-(4-((35-azido- 3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33- undecaoxapentatriacon- tyl)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- il)>amino)butanamido)acetamido)propanoico) + + RW Ro FA o Ai FP NsPEGRÇOS " Cs;CO; MNA, oH Logo 7
[0366] A uma solução de composto 69 (80 mg, 0,122 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG12-OTs (184 mg, 0,244 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (80 mg, 0,244 mmol, 2 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi agitada a 40ºC for 5 horas. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO;3 (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. O pro- duto foi separado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase es- tacionária e eluído com 2-3% de metanol em DCM. LC- MS: calculado [M+H]+ 1208,63, encontrado 1209,21.
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[0367] A uma solução de composto 82 (100 mg, 0,0972 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (7 mg, 0,292 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foi adicionado ao resíduo e a mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removi- do por um evaporador giratório. LOC-MS: calculado [M+H]+ 1094,56, 1095,05. Síntese da Estrutura 7b (ácido (R)-3-(4-(4-(2-(2-(2- azidoetóxi)etóxi)etóxi)naftalen-1-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- il)>amino)butanamido)acetamido)propanoico). N o N o. ACTOS ua TR as al O K2CO; O Pu “ 85
[0368] A uma solução de composto 84 (1,0 g, 2,90 mmol, 1 equiv.) e carbonato de potássio (0,60 g, 4,36 mmol, 1,5 equiv.) em DMF ani- dra (10 mL) adicionou-se metil iodeto (362 uL, 5,81 mmol, 2,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente 1 hr. LC-MS: calculado [M+H]+ 358,06, encontrado 358,34.
AO PIANO 9 O 9 HCl O S Br Br 85 86
[0369] O Composto 85 (1,0 g, 2,791 mmol, 1,0 equiv.) foi resfriado com um banho de gelo. HCI em dioxano (7,0 mL, 27,91 mmol, 10 equiv.) foi adicionado ao balão. A reação foi aquecida até a temperatu- ra ambiente e agitada por mais 1 hora. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi usado diretamente sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 258,01, encontrado 257,97. PL É e
[0370] A uma solução de composto 64 (790 mg, 2,248 mmol, 1 equiv.), composto 86 (728 mg, 2,473 mmol, 1,10 equiv.), e TBTU (866 mg, 2,698 mmol, 1,20 equiv.) em DMF anidra (15 mL) adicionou-se diisopropiletilamina (1,175 mL, 6,744 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução aquosa saturada de NaHCO; (10 mL) e o produto foi extraído com etil acetato (3 x 20 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 591,17, encontrado 591,49. toa? O
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[0371] Composto 87 (200 mg, 0,338 mmol, 1,0 equiv.), composto 65 (141 mg, 0,507 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (5,3 mg, 0,068 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (143 mg, 0,676 mmol, 2,0 equiv.) foram misturados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente enchido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 ve- zes). Em seguida, THF (8 mL) e água (2 mL) foram acrescentados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 20 minutos e a reação foi mantida à temperatura ambiente por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL), e a fase aquosa foi extra- ída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi secada sobre Na2SO. e concentrada. LOC-MS: calculado [M+H]+ 745,35, encontrado 746,08. no Y N. TA N o. ON RN ( 3 DA << “ (CS N OO O Pac DZ o Ô o 89 88 OD d
[0372] A uma solução de composto 88 (0,247 g, 0,331 mmol, 1 equiv.) em etil acetato (10 mL) adicionou-se 10% de Pd/C (100 mg) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. O catalisador foi removido por filtração atra- vés de Celite& e o produto foi usado diretamente sem purificação adi- cional. LC-MS: calculado [M+H]+ 655,31, encontrado 655,96. + + O O OR Oo
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[0373] A uma solução de composto 89 (50 mg, 0,076 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG3-OTs (50 mg, 0,152 mmol, 2 equiv.) em DMF ani- dra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (50 mg, 0,152 mmol, 2 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi agitada por 72 horas à temperatura ambiente. À reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO2, e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4% de MeOH em DCM. LC- MS: calculado [M+H]+ 812,39, encontrado 813,14. Y o OFR&Z7O H H
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[0374] A uma solução de composto 90 (36 mg, 0,0443 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (3 mg, 0,133 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. TFA (0,5 mL) e DCM (0,5 mL) foi adicionado ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi re- movido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 698,32, encontrado 698,90. Síntese da Estrutura 8b (ácido (S8)-3-(4-(7-(2-(2-(2- azidoetóxi)etóxi)etóxi)naftalen-1-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- il)»>amino)butanamido)acetamido)propanoico).
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[0375] A uma solução de composto 92 (1,0 g, 4,48 mmol, 1 equiv.), e composto 62 (1,06 mL, 8,96 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (10 mL) adicionou-se K2CO3 (1,24 g, 8,96 mmol, 2 equiv.) à temperatura am- biente. A mistura reacional foi agitada a 80ºC por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. O pro- duto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase es- tacionária e foi eluído com 5% de etil acetato em hexano. ç LO n-BuLi Pago LO 94 %
[0376] A uma solução de composto 94 (0,5 g, 1,596 mmol, 1,0 equiv.) em THF anidro (10 mL) adicionou-se em gotas n-BuLi em he- xano (0,96 mL, 2,394 mmol, 1,5 equiv.) a -78ºC. A reação foi mantida a -78ºC por mais 1 hora. Triisopropilborato (0,553 mL, 2,394 mmol, 1,5 equiv.) foi então adicionado à mistura a -78ºC. A reação foi então aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A re- ação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NHCI (20 mL) e o pH foi ajustado em 3. A fase aquosa foi extraída com EtO- Ac (3 x 20 mL) e a fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. O sólido foi triturado com hexano e filtered. O produto foi usado diretamente sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M- H]-277,11, encontrado 277,35.
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[0377] O Composto 96 (100 mg, 0,169 mmol, 1,0 equiv.), compos- to 95 (70 mg, 0,253 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (2,7 mg, 0,0034 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (72 mg, 0,338 mmol, 2,0 equiv.) foram misturados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente enchido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 ve- zes). Em seguida, THF (8 mL) e água (2 mL) foram acrescentados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 20 minutos e a reação foi mantida à temperatura ambiente por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL), e a fase aquosa foi extra- ída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, seca- da sobre Na2SO,, e concentrada. O composto foi separado por Com- biFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3% de metanol em DCM.
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[0378] A uma solução de composto 97 (0,116 g, 0,457 mmol, 1 equiv.) em etil acetato (10 mL) adicionou-se 10% de Pd/C (100 mg) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. O catalisador foi removido por filtração atra- vés de Celite& e o produto foi usado diretamente sem purificação adi- cional. LC-MS: calculado [M+H]+ 655,31, encontrado 655,87. + > CN & OO - O ; . o. ne OO X q No
[0379] A uma solução de composto 98 (87 mg, 0,133 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG3-OTs (87 mg, 0,266 mmol, 2 equiv.) em DMF ani- dra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (87 mg, 0,266 mmol, 2 equiv.) à tem- peratura ambiente. A mistura reacional foi agitada a 40ºC por 6 horas. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs2, e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlash&O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de MeOH em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 812,39, encontrado 813,05. SA Êt CASAR P Con " OO . Ma so . À
[0380] A uma solução de composto 99 (65 mg, 0,0801 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (6 mg, 0,240 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em
3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. TFA (0,5 mL) e DCM (0,5 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistu- ra foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 698,32, encontrado 698,99. Síntese da Estrutura 9b (ácido (14S,17R)-1-azido-14-(4-((4- metilpiridin-2-il)amino)butanamido)- - 17-(4-(naftalen-1-il)fenil)-15- o0X0-3,6,9,12-tetraoxa-16-azanonadecan-19-oico).
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[0381] O Composto 102 (0,19 g, 0,468 mmol, 1,0 equiv.) foi resfri- ado com um banho de gelo. HCl em dioxano (2,35 mL, 9,37 mmol, 20 equiv.) foi adicionado ao balão. A reação foi aquecida até a temperatu- ra ambiente e agitada por mais 1 hora. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi usado diretamente sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 306,14, encontrado 306,51.
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[0382] A uma solução de composto 23 (110 mg, 0,188 mmol, 1 equiv.), composto 103 (71 mg, 0,207 mmol, 1,10 equiv.), e TBTU (72,7 mg, 0,226 mmol, 1,20 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se diisopropiletilamina (0,1 mL, 0,566 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução aquosa saturada de NaHCO; (10 mL) e o produto foi extraído com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 870,43, encontrado 871,12. Y PG ge pI IA LL O A, Le OH
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[0383] A uma solução de composto 104 (110 mg, 0,126 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (9 mg, 0,379 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 756,36, encontrado 756,88. Síntese da Estrutura 10b (ácido (S)-3-(4-(5-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- i)>amino)butanamido)acetamido)propanoico).
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[0384] A uma solução de composto 106 (1,0 g, 4,48 mmol, 1 equiv.), e composto 62 (1,06 mL, 8,96 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (10 mL) adicionou-se Cs2CO3 (2,92 g, 8,96 mmol, 2 equiv.) à tempe- ratura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambien- te por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com água soluti- on (20 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). À fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. O produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 5% de etil acetato em hexano. HO, OH ” n-Buli i" [CH3),CHOJ.B “o 108 ps
[0385] A uma solução de composto 107 (1,188 g, 3,793 mmol, 1,0 equiv.) em THF anidro (10 mL) adicionou-se n-BuLi em hexano (2,27 mL, 5,689 mmol, 1,5 equiv.) em gotas a -78ºC. A reação foi mantida at -78ºC por mais 1 hora. Triisopropilborato (1,31 mL, 5,689 mmol, 1,5 equiv.) foi então adicionado à mistura a -78ºC. A reação foi então aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A re- ação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NHCI (20 mL) e o pH foi ajustado em 3. A fase aquosa foi extraída com EtO- Ac (3 x 20 mL) e a fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. O sólido foi triturado com hexano e filtered. O produto foi usado diretamente sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M-
H]-, 277,11, encontrado 277,26. o.
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[0386] Composto 96 (100 mg, 0,169 mmol, 1,0 equiv.), composto 108 (70 mg, 0,253 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (2,7 mg, 0,0034 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (72 mg, 0,338 mmol, 2,0 equiv.) foram misturados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente enchido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 ve- zes). Em seguida, THF (8 mL) e água (2 mL) foram acrescentados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 20 minutos e a reação foi mantida à temperatura ambiente por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL), e a fase aquosa foi extra- ída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, seca- da sobre Na2SO,, e concentrada. O composto foi separado por Com- biFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 745,35, encontra- do 745,99.
AN SA É A e “ O Ç
[0387] A uma solução de composto 109 (0,135 g, 0,181 mmol, 1 equiv.) em etil acetato (10 mL) adicionou-se 10% de Pd/C (100 mg) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. O catalisador foi removido por filtração atra- vés de Celite& e o produto foi usado diretamente sem purificação adi- cional. LC-MS: calculado [M+H]+ 655,31, encontrado 655,87. O; + pá Oo OF O
TA H DO H Não NA o Ns NA N. o. > no o -l O õ N3PEGsTos O Cs3CO; "a O 110 OOo Os oH NEON A
[0388] A uma solução de composto 110 (50 mg, 0,0764 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (64 mg, 0,152 mmol, 2 equiv.) em DMF ani- dra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (50 mg, 0,152 mmol, 2 equiv.) à tem- peratura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e con- centrada. O produto foi purificado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4% de metanol em DCM. O rendimento é de 62%. LC-MS: calculado [M+H]+ 900,44, encontrado 901,19.
OR O Y o " H Q H CEO Y re CEA oH 2 4N o o CG 1 O
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[0389] A uma solução de composto 111 (43 mg, 0,0478 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (3,4 mg, 0,143 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em
3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 786,37, encontrado 787,04. Síntese da Estrutura 11b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-((S)-1-(4-((4-metilpiridin-2- i)>amino)butanoil)pirrolidina-2-carboxamido)propanoico). Õ OH DA TBTU a x IA > — TÃO A o 114 22 103
[0390] A uma solução de composto 22 (500 mg, 1,698 mmol, 1 equiv.), composto 113 (295 mg, 1,783 mmol, 1,05 equiv.), e TBTU (654 mg, 2,038 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (10 mL) adicionou-se diisopropiletilamina (0,888 mL, 5,096 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução aquosa saturada de NaHCO; (10 mL) e o produto foi extraído com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlash&O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-3% de metanol em DCM. O rendimento é de 98,72%. LC-MS: calculado [M+H]+ 406,23, encontrado 406,07. + + 0270 o. OO O, É TA, —P Ex Te o
TO TER O 114
[0391] A uma solução de composto 114 (0,68 g, 1,676 mmol, 1 equiv.) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) adicionou-se aos poucos hidróxi- do de lítio (0,12 g, 5,030 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à temperatura ambiente por 1 hr, a mistura reacional foi acidificada com HCI (6 N) para pH 3,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concen- trada. O produto foi usado sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 392,21, encontrado 392,39. bi Cr Ha. rx *N A Bs A "” ns PP” a
[0392] A uma solução de composto 115 (300 mg, 0,766 mmol, 1 equiv.), composto 116 (237 mg, 0,804 mmol, 1,05 equiv.), e TBTU (295 mg, 0,919 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (10 mL) adicionou-se diisopropiletilamina (0,400 mL, 2,299 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução aquosa saturada de NaHCO; (10 mL) e o produto foi extraído com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO&O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. O rendimento é de 83%. LC-MS: calculado [M+H]+ 631,21, en- contrado 631,46. w Ho. or 2 “o = TOO
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[0393] Composto 118 (100 mg, 0,158 mmol, 1,0 equiv.), composto 65 (66 mg, 0,237 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (2,5 mg, 0,0032 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (67 mg, 0,316 mmol, 2,0 equiv.) foram misturados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente enchido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 ve- zes). Em seguida, THF (5 mL) e água (1 mL) foram acrescentados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 20 minutos e a reação foi mantida a 40ºC por 1 hora. A reação foi resfriada brusca- mente com água (10 mL), e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:,, e concentrada. O composto foi separado por CombiFlash€O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3% de metanol em DCM. O rendimento foi de 96%. LC-MS: calculado [M+H]+ 785,38, encontra- do 785,69. SN x A = Ad vm i
[0394] A uma solução de composto 119 (0,120 g, 0,153 mmol, 1 equiv.) em etil acetato (10 mL) adicionou-se 10% de Pd/C (100 mg) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. O catalisador foi removido por filtração atra- vés de Celite& e o produto foi usado diretamente sem purificação adi- cional. LC-MS: calculado [M+H]+ 695,34, encontrado 695,66.
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[0395] A uma solução de composto 120 (83 mg, 0,119 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (100 mg, 0,239 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (78 mg, 0,239 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4% de metanol em DCM. O rendimento foi de 79%. LC-MS: calculado 940,47, encontrado 941,16. | Di ". ss í * LA Pr 5 N. Y O. Pr Y N Y OH Ás 1 O = Estrutura 119 O rata O ECON a
[0396] A uma solução de composto 121 (89 mg, 0,0947 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (6,8 mg, 0,284 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl! (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 826,41, encontrado 827,10. Síntese da Estrutura 12b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)benzo[d]oxazol-7-il)fenil)-3-(2-(4-((4- metilpiridin-2-il)amino)butanamido)acetamido)propanoico).
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[0397] A uma solução de composto 123 (1,0 g, 7,40 mmol, 1 equiv.), e composto 62 (1,32 mL, 11,10 mmol, 1,5 equiv.) em DMF anidra (10 mL) adicionou-se Cs2CO3 (3,62 g, 11,10 mmol, 1,5 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL). A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL)ea fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO. andiro, e concen- trada. O produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 5-7% de etil acetato em hexano. 85% de rendimento. o X o. Cc? NBS x? o. TP O 123 124 à à
[0398] A uma solução de composto 124 (1,425 g, 6,326 mmol, 1 equiv) em acetonitrila anidra (20 mL) adicionou-se N- bromossuccinimida (1,216 g, 6,832 mmol, 1,08 equiv.) a 0ºC aos pou- cos. A mistura reacional foi mantida a 0ºC por mais 30 min e em se- guida deixada esquentar até a temperatura ambiente e agitada por uma noite. O solvente foi removido à pressão reduzida e o resíduo foi purificado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária. O produto foi eluído com 4-5% de etil acetato em hexano. 65% de ren- dimento. LC-MS: calculado [M+H]+ 303,99. encontrado 304,08.
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[0399] A mistura de composto 125 (1,339 g, 4,402 mmol, 1 equiv.), bis(pinacolato)diboro (2,236 g, 8,805 mmol, 2 equiv.), acetato de po- tássio (0,864 g, 8,805 mmol, 2 equiv.) e Pd(dppf)Cl2 (161 mg, 0,220 mmol, 0,05 equiv.) em 15 mL de 1,4-dioxano anidro foi agitada a 100ºC em uma atmosfera de nitrogênio por 8 horas. Depois de con- centração, o resíduo foi distribuído entre H2O e DCM, a fase aquosa foi extraída com DCM, e a camada orgânica combinada foi lavada com salmoura, secada sobre Na2SO;,, e concentrada. O produto foi purifi- cado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 15-20% de etil acetato em hexano. LC-MS: calculado [M+H]+ 352,16, encontrado 352,06.
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[0400] Composto 96 (200 mg, 0,338 mmol, 1,0 equiv.), composto 126 (178 mg, 0,507 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (5,3 mg, 0,0068 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (143 mg, 0,676 mmol, 2,0 equiv.) foram misturados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente enchido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 ve- zes). Em seguida, THF (5 mL) e água (1 mL) foram acrescentados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 20 minutos e a reação foi mantida a 40ºC por 1 hora. A reação foi resfriada brusca- mente com NaHCO; saturado (10 mL), e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. O composto foi separado por Combi- FlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2- 3% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 736,33, encontra- do 736,89.
[0401] A uma solução de composto 127 (0,219 g, 0,297 mmol, 1 equiv.) em etil acetato (10 mL) adicionou-se 10% de Pd/C (100 mg) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. O catalisador foi removido por filtração atra- vés de Celite& e o produto foi usado diretamente sem purificação adi- cional. LC-MS: calculado [M+H]+ 646,28, encontrado 646,78. nã. 5 NY A XT Hu Ar e SA É OS Os or NON OA
[0402] A uma solução de composto 128 (73 mg, 0,113 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (94 mg, 0,226 mmol, 2 equiv.) em DMF ani- dra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (74 mg, 0,226 mmol, 2 equiv.) à tem- peratura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs2, e con- centrada. O produto foi purificado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4% de metanol em DCM. O rendimento é de 80%. LC-MS: calculado [M+H]+ 891,42, encontrado 892,00.
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[0403] A uma solução de composto 129 (43 mg, 0,0478 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (3,4 mg, 0,143 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). À fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,., e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 777,35, encontrado 777,94. Síntese da Estrutura 13b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)-5,6,7,8-tetra-hidronaftalen-1-il)fenil)-3-(2-(4- ((4-metilpiridin-2-il)amino)butanamido)acetamido)propanoico). Bapina CO Edmond: Ts
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[0404] A mistura de composto 1 (300 mg, 1,321 mmol, 1 equiv.), bis(pinacolato)diboro (671 mg, 2,642 mmol, 2 equiv.), acetato de po- tássio (389 mg, 3,963 mmol, 2 equiv.) e Pd(dppf)Cl2 (48 mg, 0,066 mmol, 0,05 equiv.) em 10 mL de 1,4-dioxano anidro foi agitada a 80ºC em uma atmosfera de nitrogênio por uma noite. Depois de concentra- ção, o resíduo foi distribuído entre H2O e DCM, a fase aquosa foi ex- traída com DCM, e a camada orgânica combinada foi lavada com sal-
moura, secada sobre Na2SO2., e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluí- do com 10% de etil acetato em hexano. LC-MS: calculado [M-H]- 273,17, encontrado 273,29. + A o. mens P Z o o KPOs Z S ço. É && 2 1 OO
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[0405] Composto 1 (100 mg, 0,169 mmol, 1,0 equiv.), composto 2 (70 mg, 0,253 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (2,7 mg, 0,0034 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (72 mg, 0,338 mmol, 2,0 equiv.) foram mistura- dos em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente enchido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 vezes). Em seguida, THF (5 mL) e água (1 mL) foram acrescentados via uma se- ringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 20 minutos e a rea- ção foi mantida a 40ºC por 3 horas. A reação foi então resfriada para a temperatura ambiente e deixada por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com NaHCO; saturado (10 mL), e a fase aquosa foi ex- traída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, se- cada sobre Na2SO,, e concentrada. O composto foi separado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase estacionáriaand foi eluído com 4-5% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 659,34, en- contrado 659,57. neto Ao a MR o NAN A o - NA O —NPEGTos > “o o
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[0406] A uma solução de composto 1 (30 mg, 0,0455 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (38 mg, 0,0911 mmol, 2 equiv.)) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (30 mg, 0,0911 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4% de metanol em DCM. O rendimento é de 70%. LC-MS: calculado [M+H]+ 904,47, encontrado 904,88.
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[0407] A uma solução de composto 1 (29 mg, 0,0321 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (2,3 mg, 0,0962 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl! (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concen- trada. TFA (4 mL) e DOM (2 mL) foram acrescentados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O sol- vente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 790,41, encontrado 790,64. Síntese da Estrutura 14b (ácido (S)-3-(4'-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)-2'- (trifluorometóxi)-[1,1'-bifenil]-4-11)-3-(2-(4- ((4-metilpiridin-2-il)amino)butanamido)acetamido)propanoico).
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[0408] Composto 1 (150 mg, 0,253 mmol, 1,0 equiv.), composto 2 (118 mg, 0,380 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (4 mg, 0,0051 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (107 mg, 0,507 mmol, 2,0 equiv.) foram mistu- rados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente en- chido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 vezes). Em seguida, THF (5 mL) e água (1 mL) foram acrescentados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 10 min e a reação foi mantida a 40ºC por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL), e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs2, e con- centrada. O composto foi separado por CombiFlash€O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 779,32, encontrado 779,65. + Ada eo
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[0409] A uma solução de composto 1 (0,19 g, 0,244 mmol, 1 equiv.) em etil acetato (10 mL) adicionou-se 10% de Pd/C (100 mg) à tempe- ratura ambiente. A reação foi esvaziada e novamente enchida com hi- drogênio (o processo foi repetido 3 vezes). A mistura reacional foi agi- tada à temperatura ambiente por uma noite. O catalisador foi removido por filtração através de Celite& e o produto foi usado diretamente sem purificação adicional. LOC-MS: calculado [M+H]+ 689,27, encontrado 689,54. e. o H " o H SIL É ao ATX É ' Cs;co; Õ x ? Õ ão or NO ANO
[0410] A uma solução de composto 1 (80 mg, 0,116 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (97 mg, 0,232 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (76 mg, 0,232 mmol, 2 equiv.) à temperatu- ra ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A rea- ção foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO;3 (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). À fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3- 4% de metanol em DCM. O rendimen- to foi de 82%. LC-MS: calculado [M+H]+ 934,41, encontrado 935,04. coa É cer P O 1 O faça aan
[0411] A uma solução de composto 1 (90 mg, 0,0964 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (7 mg, 0,289 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 820,34, encontrado 820,89. Síntese da Estrutura 15b (ácido (S)-3-(3-(5-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- il)>amino)butanamido)acetamido)propanoico). o N OH o Dr. ER Si me CT &: =—->=>— Br K2CO; Br 1
[0412] A uma solução de composto 1 (1,0 g, 2,90 mmol, 1 equiv.) e carbonato de potássio (0,60 g, 4,36 mmol, 1,5 equiv.) em DMF ani- dra (10 mL) adicionou-se metil iodeto (362 uL, 5,81 mmol, 2,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A reação foi então resfriada bruscamente com água (20 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO. andiro, e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlash6O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 15% de etil acetato em he- xano. LC-MS: calculado [M+H]+ 358,06, encontrado 358,18. o N Ox “CI*HaN Os. A 2 He! SS: Br Br 1
[0413] O Composto 1 (858 mg, 1,677 mmol, 1,0 equiv.) foi resfria- do com um banho de gelo. HCl em dioxano (8,4 mL, 33,54 mmol, 20 equiv.) foi adicionado ao balão. A reação foi aquecida até a temperatu- ra ambiente e agitada por mais 1 hora. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi usado diretamente sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 258,01, encontrado 258,08.
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[0414] A uma solução de composto 1 (640 mg, 1,821 mmol, 1 equiv.), composto 2 (590 mg, 2,003 mmol, 1,10 equiv.), e TBTU (702 mg, 2,185 mmol, 1,20 equiv.) em DMF anidra (10 mL) adicionou-se diisopropiletilamina (0,952 mL, 5,464 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução aquosa saturada de NaHCO; (10 mL) e o produto foi extraído com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 591,17, encontrado 591,40. Y HO, OH E o " Fig a o
[0415] Composto 1 (150 mg, 0,253 mmol, 1,0 equiv.), composto 2 (106 mg, 0,380 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (4 mg, 0,0051 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (107 mg, 0,507 mmol, 2,0 equiv.) foram mistu- rados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente en- chido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 vezes). Em seguida, THF (5 mL) e água (1 mL) foram acrescentados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 10 min e a reação foi mantida a 40ºC por 2 horas. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL) , e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs2, e con-
centrada. O composto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 745,35, encontrado 745,99. o. x + Y o H CS AAA O WO ' Ç o no SIX Pr 1 & ; GO o CC AX,
[0416] A uma solução de composto 1 (0,189 g, 0,253 mmol, 1 equiv.) em etil acetato (10 mL) adicionou-se 10% de Pd/C (100 mg) à temperatura ambiente. A reação foi esvaziada e novamente enchida com hidrogênio (este processo foi repetido 3 vezes). A mistura reacio- nal foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. O catalisador foi removido por filtração através de Celite& e o produto foi usado direta- mente sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 655,31, encontrado 655,42. + Y
OO OR O A H q A Ns A ox NANA A, N. ro OQ N3-PEG5-Tos = O 1 O Cs;CO; : O a ss Nega oo
[0417] A uma solução de composto 1 (80 mg, 0,122 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (102 mg, 0,244 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (80 mg, 0,244 mmol, 2 equiv.) à temperatu- ra ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A rea- ção foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO;3 (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). À fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO2, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 1- 2% de metanol em DCM. O rendimen-
to é de 90%. LC-MS: calculado 900,44, encontrado 901,10.
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[0418] A uma solução de composto 1 (100 mg, 0,111 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (8 mg, 0,333 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 786,37, encontrado 786,95. Síntese da Estrutura 16b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-((R)-1-(4-((4-metilpiridin- 2-il)amino)butanoil)pirrolidina-2-carboxamido)propanoico). à + o OFR7Oº O, As e já 1 2
[0419] A uma solução de composto 1 (500 mg, 1,698 mmol, 1 equiv.), composto 2 (295 mg, 1,783 mmol, 1,05 equiv.), e TBTU (654 mg, 2,038 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (10 mL) adicionou-se diisopropiletilamina (0,888 mL, 5,096 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução aquosa saturada de NaHCO; (10 mL) e o produto foi extraído com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-3% de metanol em DCM. O rendimento é de 98,43%. LC-MS: calculado [M+H]+ 406,23, encontrado 406,34. + +
[0420] A uma solução de composto 1 (0,678 g, 1,672 mmol, 1 equiv.) em THF (10 mL) e H2O (10 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (0,12 g, 5,016 mmol, 3 equiv.) aos poucos a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à tempera- tura ambiente por 1 hr, a mistura reacional foi acidificada com HCI (6 N) para pH 3,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO, e concen- trada. O produto foi usado sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 392,21, encontrado 392,39. s CHAN. O PN * d OO ” ; ç Y.
[0421] A uma solução de composto 1 (130 mg, 0,332 mmol, 1 equiv.), composto 2 (125 mg, 0,348 mmol, 1,05 equiv.), e TBTU (128 mg, 0,398 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (5 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,174 mL, 0,996 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução aquosa saturada de NaHCO; (10 mL) e o produto foi extraído com etil acetato
(3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. O rendimento é de 86%. LC-MS: calculado [M+H]+ 695,34, en- contrado 695,93. LEA o LA A % 4 Cs5cO0; , ÕS o o
[0422] A uma solução de composto 1 (80 mg, 0,115 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (96 mg, 0,230 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (75 mg, 0,230 mmol, 2 equiv.) à temperatu- ra ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A rea- ção foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO;3 (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 ML). À fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4-5% de metanol em DCM. O rendimento é de 60%. (* O +; Ou “Es PA Y OH eTFA as ea O
[0423] A uma solução de composto 1 (65 mg, 0,0691 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (5 mg, 0,207 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada.
TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 826,41, encontrado 827,01. Síntese da Estrutura 17b (ácido (S)-3-(4-(7-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)benzo[b]tiophen-4-il)fenil)-3-(2-(4-((4- metilpiridin-2-il)amino)butanamido)acetamido)propanoico). Br o = & 8 Ss Ox O 1
[0424] Uma solução de bromo (1,877 g, 11,745 mmol, 1,05 equiv.) em tetraclorometano seco (20 mL) foi adicionada em gotas durante 1,5 hora a uma solução agitada de composto 1 (1,837 g, 11,186 mmol, 1 equiv.) em tetraclorometano (20 mL) a 0ºC. Depois de mais uma hora a 0ºC, a camada orgânica foi lavada com água e salmoura, secada sobre Na2SO;., e concentrada para dar um resíduo, que foi purificado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase estacionária. O produ- to foi eluído com pure hexano com impurezas. Br Br De MesSBFz3 Co s & % OH 1
[0425] A uma solução de composto 1 (2,70 g, 11,105 mmol, 1,0 equiv.) em diclorometano (20 ml), em uma atmosfera de nitrogênio, a 0ºC, adicionou-se complexo de trifluoreto de boro - dimetil sulfeto (3,5 mL, 33,317 mmol, 3,0 equiv.) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 20 horas. A mistura reacional foi resfriada para 0ºC e resfriada bruscamente com uma solução saturada de NHACI (20 mL). À fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 20 mL) e a fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO., e concentrada. O produto foi separado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 5% de etil acetato em hexano. LC-MS: calculado [M- H]- 226,92, encontrado 227,03. Br Br Br. +. a Ô Cs;CO, Ss SS p OH, 2 ó
[0426] A uma solução de composto 1 (1,838 g, 8,023 mmol, 1 equiv.), e composto 2 (1,906 mL, 16,04 mmol, 2 equiv.) em DMF ani- dra (10 mL) adicionou-se Cs2CO3 (5,228 g, 16,04 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. A reação foi resfriada bruscamente com água (20 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 ML). À fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. O produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-3% de etil acetato em hexano. Br ns HO. 30H à o 1
[0427] A uma solução de composto 1 (2,22 g, 6,954 mmol, 1,0 equiv.) em THF anidro (20 mL) adicionou-se n-BuLi em hexano (4,17 mL, 10,43 mmol, 1,5 equiv.) em gotas a -78ºC. A reação foi mantida at -78ºC por mais 1 hora. Triisopropilborato (2,40 mL, 10,43 mmol, 1,5 equiv.) foi então adicionado à mistura a -78 ºC. A reação foi então aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A re- ação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NH.CI (20 mL) e o pH foi ajustado em 3. A fase aquosa foi extraída com EtO-
Ac (3 x 20 mL) e a fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. O produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4-6% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M-H]- 283,07, encontrado 283,20. ef
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[0428] Composto 1 (400 mg, 0,676 mmol, 1,0 equiv.), composto 2 (288 mg, 1,01 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (10 mg, 0,0135 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (287 mg, 1,352 mmol, 2,0 equiv.) foram mistu- rados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente en- chido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 vezes). Em seguida, THF (8 mL) e água (2 mL) foram acrescentados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 10 min e a reação foi mantida a 40ºC for 2 horas. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) , e a fase aquosa foi extra- ída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, seca- da sobre Na2SO,, e concentrada. O composto foi separado por Com- biFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3- 4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 751,31, encontra- do 751,84.
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[0429] A uma solução de composto 1 (0,50 g, 0,666 mmol, 1 equiv.) em etil acetato (10 mL) adicionou-se 10% de Pd/C (100 mg) à tempe- ratura ambiente. A reação foi esvaziada e novamente enchida com hi- drogênio (este processo foi repetido 3 vezes). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. O catalisador foi remo- vido por filtração através de Celite& e o produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 5% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 661,26, en- contrado 661,73. + + % RW A! Y O. ema SA Y O. ; o Ss 2 O so OL o nO AA O
[0430] A uma solução de composto 1 (130 mg, 0,196 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (164 mg, 0,393 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (128 mg, 0,393 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. O rendimento é de 82%. LC-MS: calculado [M+H]+ 906,40, en- contrado 906,95.
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[0431] A uma solução de composto 1 (147 mg, 0,162 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (12 mg, 0,486 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. TFA (2 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária. LC-MS: cal- culado [M+H]+ 792,33, encontrado 792,89. Síntese da Estrutura 18b (ácido (S)-3-(4-(6-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-2-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- il)>amino)butanamido)acetamido)propanoico). + GAI imans 2º o Ô o KsPOs A o Q ou
[0432] Composto 1 (150 mg, 0,253 mmol, 1,0 equiv.), composto 2 (71,5 mg, 0,380 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (4 mg, 0,0051 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (107 mg, 0,507 mmol, 2,0 equiv.) foram mistu- rados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente en-
chido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 vezes). Em seguida, THF (5 mL) e água (1 mL) foram acrescentados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 10 min e a reação foi mantida a 40ºC por 2 horas. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL), e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs., e con- centrada. O composto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-3% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 655,31, encontrado 655,87. CT uma AÇO | sr O oh O E NA
[0433] A uma solução de composto 1 (160 mg, 0,244 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (204 mg, 0,488 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (160 mg, 0,488 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 60ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlash&O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. O rendimento foi de 30%. LC-MS: calculado [M+H]+ 900,44, en- contrado 901,01.
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[0434] A uma solução de composto 1 (67 mg, 0,0744 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (5 mg, 0,223 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. TFA (2 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e eluído com 10% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 786,37, encon- trado 786,86. Síntese da Estrutura 19b (ácido (S)-3-(3-(6-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-2-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- i)>amino)butanamido)acetamido)propanoico).
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[0435] Composto 1 (150 mg, 0,253 mmol, 1,0 equiv.), composto 2 (71,5 mg, 0,380 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (4 mg, 0,0051 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (107 mg, 0,507 mmol, 2,0 equiv.) foram mistu- rados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente en-
chido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 vezes). Em seguida, THF (5 mL) e água (1 mL) foram acrescentados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 10 min e a reação foi mantida a 40ºC for 2 horas. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL), e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. O composto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-3% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 655,31, encontrado 655,78. + + sta Ox IA Ox â O Cs;CO, 2 Do o
[0436] A uma solução de composto 1 (104 mg, 0,158 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (132 mg, 0,317 mmol, 2 equiv.)) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (103 mg, 0,317 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 60ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlash&O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 900,44, encontrado 901,01. + oo Lion Nego NA AÇO A 1 Estrutura 19b
[0437] A uma solução de composto 1 (125 mg, 0,138 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (10 mg, 0,416 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi separado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase estacionária e eluído com 12% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 786,37, encon- trado 786,86. Síntese da Estrutura 20b (ácido (S)-3-(3-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- il)>amino)butanamido)acetamido)propanoico). Ne ( 2 Fá. 5 CT * à o Br di K3PO, O SS. 1 2
[0438] Composto 1 (150 mg, 0,253 mmol, 1,0 equiv.), composto 2 (102 mg, 0,380 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (4 mg, 0,0051 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (107 mg, 0,507 mmol, 2,0 equiv.) foram mistu- rados em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente en- chido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 vezes). Em seguida, THF (5 mL) e água (1 mL) foram acrescentados via uma seringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 10 min e a reação foi mantida a 40ºC por 2 horas. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL), e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e con-
centrada. O composto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-3% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 655,31, encontrado 655,78. = = een O meg CCO O " DO
[0439] A uma solução de composto 1 (160 mg, 0,244 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (204 mg, 0,488 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (159 mg, 0,488 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 60ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3- 4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 900,44, encontrado 901,01. + Wo u 4 ? 4 TN " og CX " o O Ng AÇO Ng AÇO a Estrutura 206
[0440] A uma solução de composto 1 (125 mg, 0,138 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (10 mg, 0,416 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e eluído com 8-12 % de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 786,37, encon- trado 786,86. Síntese da Estrutura 22b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-((S)-2-(4-((4-metilpiridin- 2-il)amino)butanamido)propanamido)propanoico). x A O, O õ O. o ô 2" AN o composto 1 composto 2
[0441] A uma solução de composto 1 (250 mg, 0,85 mmol), sal de cloridrato de éster metílico de L-alanina (130 mg, 0,93 mmol), e TBTU (327 mg, 1,02 mmol) em DMF (2 mL) adicionou-se DIPEA (329 mg, 444 ul, 2,55 mmol) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a tem- peratura ambiente e agitada por 1 hora. A reação foi resfriada brusca- mente com uma solução saturada de NHaCI (aq) (0,75 mL) e água de- sionizada (1 mL) e em seguida extraída com etil acetato (3 mL). A ca- mada aquosa foi ainda extraída com etil acetato (2 x 3 mL). A fase or- gânica combinada foi lavada com uma solução saturada de NaHCO;3 (aq) (2 mL). A camada orgânica foi secada sobre Na>2SO:, filtrada, e concentrada. A mistura bruta foi separada por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária com 0-5% de metanol em DCM. Rendimento do composto 2: 294 mg (91%). [M+H] calculado para C19H29N3Os5: 380,46, encontrado: 380,33.
CA E AO composto 2 composto 3
[0442] A uma solução de composto 2 (294 mg, 0,77 mmol) em THF (4,5 mL) e água desionizada (3 mL) a 0ºC adicionou-se uma so- lução de hidróxido de lítio (56 mg, 2,32 mmol) em água desionizada (1 mL). A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 40 minutos. A mistura reacional foi acidificada para pH=3 com HCl 6 M (aq). A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica combinada foi secada sobre Na2SO:, filtrada, e concentrada. O Composto 3 foi usado sem purificação adicional. Rendimento de composto 3: 267 mg (94%). [M+H] calculado para C18H27N30O5: 366,43, encontrado: 366,19.
TIO Ã ST ET o
AA CO composto 3 composto 4
[0443] A uma solução de composto 3 (267 mg, 0,73 mmol), com- posto 3a (288 mg, 0,80 mmol), e TBTU (282 mg, 0,88 mmol) em DMF (3 mL) adicionou-se DIPEA (283 mg, 382 uL, 2,49 mmol) a 0ºC. A mis- tura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora. A mistura reacional foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NH.CI (aq) (1,5 mL) e água desionizada (1,5 mL) e em seguida extraída com etil acetato (12 mL). A camada aquosa foi ainda extraída com etil acetato (2 x 12 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com uma solução semi-saturada de NHaCI (aq) (10 mL), uma solução semi-saturada de NaHCO; (aq) (10 mL), e uma solução satu- rada de NaCl (aq) (10 mL). A camada orgânica foi secada sobre Na2SOs,, filtrada, e concentrada. A mistura bruta foi separada por CombiFlash€& usando sílica gel como a fase estacionária com 0-5% de metanol em DCM. Rendimento de composto 4: 342 mg (70%). [M+H]
calculado para C38H44N407: 669,79, encontrado: 669,74. AZ AT o DO e O composto 4 composto 5
[0444] A uma solução de composto 4 (150 mg, 0,22 mmol) e azi- do-PEG5-OTs (187 mg, 0,49 mmol) em DMF anidra (1,2 mL) adicio- nou-se Cs2CO3 (146 mg, 0,49 mmol). A mistura reacional foi agitada a 60ºC por 3 horas. A mistura reacional foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (aq) (10 mL) e água desionizada (5 mL) e em seguida extraída com etil acetato (7,5 mL). A camada aquo- sa foi ainda extraída com etil acetato (2 x 7,5 mL). A fase orgânica combinada foi secada sobre Na2SO;,, filtrada, e concentrada. A mistura bruta foi separada por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase es- tacionária com 0-4% de metanol em DCM. Rendimento de composto 5: 142 mg (69%). [M+H] calculado para C48H63N7011: 915,06, encon- trado: 914,96. ZX . i EA O PA oH úTRRO É
CO MANO NI A DO Nag O OD composto 5 estrutura 22a
[0445] A uma solução de composto 5 (142 mg, 0,16 mmol) em THF (2 mL) e água desionizada (1,5 mL) a 0ºC adicionou-se uma so- lução de hidróxido de lítio (11 mg, 0,47 mmol) em água desionizada (0,5 mL). A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora. A mistura reacional foi acidificada para pH=3 com HCl 6 M (aq). A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 8 mL). A fase or- gânica combinada foi secada sobre Na2SO:, filtrada, e concentrada. Ao resíduo bruto adicionou-se TFA (2,0 mL) e água (100 uL). A mistu- ra reacional foi agitada por 1,5 horas à temperatura ambiente. O sol- vente foi removido à pressão reduzida, e o resíduo foi coevaporado com acetonitrila:tolueno [1:1] (2 x 20 mL). A mistura bruta foi separada por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária com 0- 13% de metanol em DCM. Rendimento de Estrutura 22b: 100 mg (80%). [M+H] calculado para C42H53N709: 800,92, encontrado: 800,81. Síntese da Estrutura 23b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-((S)-3-metil-2-(4-((4- metilpiridin-2-il)amino)butanamido)butanamido)propanoico). oe Do EA Ab PT o composto 1 composto 2
[0446] A uma solução de composto 1 (250 mg, 0,85 mmol), sal de cloridrato de éster metílico de L-valina (157 mg, 0,93 mmol), e TBTU (327 mg, 1,02 mmol) em DMF (2 mL) adicionou-se DIPEA (329 mg, 444 ul, 2,55 mmol) a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a tem- peratura ambiente e agitada por 1 hora. A reação foi resfriada brusca- mente com uma solução saturada de NHaCI (aq) (0,75 mL) e água de- sionizada (1 mL) e em seguida extraída com etil acetato (3 mL). A ca- mada aquosa foi ainda extraída com etil acetato (2 x 3 mL). A fase or- gânica combinada foi lavada com uma solução saturada de NaHCO;3 (aq) (2 mL). A camada orgânica foi secada sobre Na>SO:, filtrada, e concentrada. A mistura bruta foi separada por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária com 0-5% de metanol em DCM.
Rendimento de composto 2: 297 mg (86%). [M+H] calculado para C21H33N305: 408,51, encontrado: 407,87. Aa ã Liou Da " * A Ka THF/H;O Se. Ad o | AN o | AN o composto 2 composto 3
[0447] A uma solução de composto 2 (297 mg, 0,73 mmol) em THF (4,5 mL) e água desionizada (3 mL) a 0ºC adicionou-se uma so- lução de hidróxido de lítio (52 mg, 2,19 mmol) em água desionizada (1 mL). A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 40 minutos. A mistura reacional foi acidificada para pH=3 com HCI 6 M (aq). A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica combinada foi secada sobre Na2SO:;, filtrada, e concentrada. Composto 3 foi usado sem purificação adicional presumindo-se 100% de rendimento. [M+H] calculado para C20H31N305: 394,49, encontra- do: 393,83. "Ha Ox cr Y
Õ A o o do MT x Pl o o
EN AX em, Y ten HM DMF, TBTU
TT CO composto 3 o composto 4
[0448] A uma solução de composto 3 (287 mg, 0,73 mmol), com- posto 3a (287 mg, 0,80 mmol), e TBTU (281 mg, 0,88 mmol) em DMF (3 mL) adicionou-se DIPEA (283 mg, 382 uL, 2,49 mmol) a 0ºC. A mis- tura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora. A mistura reacional foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NH4CI (aq) (2,5 mL) e água desionizada (2,5 mL) e em seguida extraída com etil acetato (12 mL). A camada aquosa foi ainda extraída com etil acetato (2 x 12 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com uma solução semi-saturada de NHaCI (aq) (10 mL), uma solução semi-saturada de NaHCO; (aq) (10 mL), e uma solução satu- rada de NaCl (aq) (10 mL). A camada orgânica foi secada sobre Na>2SO:,, filtrada, e concentrada. A mistura bruta foi separada por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária com 0-5% de metanol em DCM. Rendimento de composto 4: 374 mg (74%). [M+H] calculado para C40H48N407: 697,84, encontrado: 697,46. so Z ee AY sã E AAA a 2 õ &S' nPEGAO AM e 2 Ss e SO composto 4 composto 5
[0449] A uma solução de composto 4 (150 mg, 0,215 mmol) e azi- do-PEG5-OTs (180 mg, 0,43 mmol) em DMF anidra (1,2 mL) adicio- nou-se Cs2CO3 (140 mg, 0,43 mmol). A mistura reacional foi agitada a 60ºC por 3 horas. A mistura reacional foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (aq) (10 mL) e água desionizada (5 mL) e em seguida extraída com etil acetato (7,5 mL). A camada aquo- sa foi ainda extraída com etil acetato (2 x 7,5 mL). A fase orgânica combinada foi secada sobre Na2SO:,, filtrada, e concentrada. A mistura bruta foi separada por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase es- tacionária com 0-4% de metanol em DCM. Rendimento de composto 5: 134 mg (66%). [M+H] calculado para CSOH67N7011: 943,12, encon- trado: 942,96.
HZ TA Ao, AI A a os
UTFA SS *TFA ea O ta O estrutura 236 composto 5
[0450] A uma solução de composto 5 (134 mg, 0,14 mmol) em THF (2 mL) e água desionizada (1,5 mL) a 0ºC adicionou-se uma so- lução de hidróxido de lítio (10 mg, 0,43 mmol) em água desionizada (0,5 mL). A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora. A mistura reacional foi acidificada para pH=3 com HCl 6 M (aq). A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 8 mL). A fase or- gânica combinada foi secada sobre Na2SO:;, filtrada, e concentrada. Ao resíduo bruto adicionou-se TFA (1,9 mL) e água (95 uL). A mistura reacional foi agitada por 1,5 horas à temperatura ambiente. O solvente foi removido à pressão reduzida, e o resíduo foi coevaporado com ace- tonitrila:tolueno [1:1] (2 x 20 mL). A mistura bruta foi separada por CombiFlash€O usando sílica gel como a fase estacionária com 0-10% de metanol em DCM. Rendimento de Estrutura 23b: 36 mg (30,5%). [M+H] calculado para C44H57N709: 828,97, encontrado 828,90. Síntese da Estrutura 24b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-((S)-2-(4-((4-metilpiridin- 2-il)amino)butanamido)-3- fenilpropanamido)propanoico). Qua Ç Bm Sã ” o st o * io Y * pDiPEA ENA ”
[0451] A uma solução de composto 1 (200 mg, 0,679 mmol, 1 equiv.), composto 2 (161 mg, 0,747 mmol, 1,2 equiv.), e TBTU (261 mg, 0,815 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (4 mL) adicionou-se diiso-
propiletilamina (0,355 mL, 2,038 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs2, e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-3 % de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 456,24, encontrado 456,12.
+ + OR 7O OW O 2N 1 o 4N o
[0452] A uma solução de composto 1 (300 mg, 0,658 mmol, 1 equiv.) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (47 mg, 1,975 mmol, 3 equiv.) aos poucos a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à temperatura ambiente por 1 hora, a mistura reacional foi acidificada com HCl (6 N) para pH 3,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concen- trada. O produto foi usado sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 442,23, encontrado 442,08. Tae Pa TO of PY ão ==> ou , : O
[0453] A uma solução de composto 1 (290 mg, 0,656 mmol, 1 equiv.), composto 2 (258 mg, 0,722 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (253 mg, 0,788 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (5 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,343 mL, 1,970 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO2, e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4 % de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 745,35, encontrado 745,63. OR O Ox O SN ie INS o 2N o Ô o A Po o Õ o CO so oH AAA AAA NAS
[0454] A uma solução de composto 1 (113 mg, 0,151 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (126 mg, 0,303 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (99 mg, 0,303 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlash&O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3- 4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 990,49, encontrado 990,87. OF. Oo Cr na o mm RO no o
O O .. O NE AOANg AAIÇAO pe AO 1 Estrutura 24b
[0455] A uma solução de composto 1 (140 mg, 0,141 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (10 mg, 0,424 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e eluído com 6-10 % de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 876,42, encon- trado 876,88. Síntese da Estrutura 25b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-((S)-3-(benzilóxi)-2-(4- ((4-metilpiridin-2-il)amino)butanamido)propanamido)propanoico). ão O Ao E SS amado BEER NA Ao, A 20 Cr H o
[0456] A uma solução de composto 1 (100 mg, 0,339 mmol, 1 equiv.), composto 2 (92 mg, 0,373 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (131 mg, 0,407 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (4 mL) adicionou-se diisopro- piletilamina (0,178 mL, 1,019 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacio- nal foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs,, e concen- trada. O produto foi separado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-4 % de metanol em DCM. LC- MS: calculado [M+H]+ 486,25, encontrado 486,37. y DP + O OxZR&27=O0 Oo OW O o ora Pre Ao 2N 1 o 2N o
[0457] A uma solução de composto 1 (160 mg, 0,329 mmol, 1 equiv.) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (23 mg, 0,988 mmol, 3 equiv.) aos poucos a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à temperatura ambiente por 1 hora, a mistura reacional foi acidificada com HCl (6 N) para pH 3,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concen- trada. O produto foi usado sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 472,24, encontrado 472,32. Aq om OO
[0458] A uma solução de composto 1 (1600 mg, 0,339 mmol, 1 equiv.), composto 2 (133 mg, 0,373 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (130 mg, 0,815 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (3 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,177 mL, 1,018 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs2, e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-3 % de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 775,36, encontrado 775,87.
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[0459] A uma solução de composto 1 (140 mg, 0,180 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (150 mg, 0,361 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (117 mg, 0,361 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3- 4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 1020,50, encontrado 1020,88. + P CTC 2 so O no e. OO
NEON OO NEON ANO 1 Estrutura 25b
[0460] A uma solução de composto 1 (170 mg, 0,166 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (12 mg, 0,499 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl! (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. TFA (4 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e eluído com 6-10% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 906,43, encon- trado 906,95. Síntese da Estrutura 27b (ácido (S)-3-(3-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)-3,5-dimetil- 1H-yrazol-1-il)fenil)-3-(2-(4-((4-
metilpiridin-2-il)amino)butanamido)acetamido)propanoico). o N OH ox Ox XV & ão A &: —,— Er K2COs Br 1
[0461] A uma solução de composto 1 (3,0 g, 8,71 mmol, 1 equiv.) e carbonato de potássio (1,806 g, 13,073 mmol, 1,5 equiv.) em DMF anidra (10 mL) adicionou-se metil iodeto (1,085 mL, 17,431 mmol, 2,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à tem- peratura ambiente por 1 hora. A reação foi então resfriada bruscamen- te com água (20 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, andiro, e concentrada. O produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 15% de etil acetato em hexano. LC-MS: calculado [M+H]+ 358,06, encontrado 358,15. oe oo AR TOO A AU, . Ds Ps ! i oO
[0462] A mistura de composto 1 (200 mg, 0,558 mmol, 1 equiv.), composto 2 (169 mg, 0,837 mmol, 1,5 equiv.), iodeto de cobre (1) (106 mg, 0,558 mmol, 1,0 equiv.), carbonato de potássio (154 mg, 1,116 mmol, 2,0 equiv.) e trans-N,N'-dimetilciclo-hexano-1,2-diamina (88 yuL, 0,558 mmol, 1,0 equiv.) em DMF anidra (5 mL) foi novamente enchida com nitrogênio 3 vezes. A mistura foi agitada at 120ºC por 24 horas. À mistura foi resfriada para room temperature e foi concentrada. O pro- duto foi separado por CombiFlash€& usando sílica gel como a fase es- tacionária e foi eluído com 30-40% de etil acetato em hexano. LC-MS: calculado [M+H]+ 480,24, encontrado 480,43.
TE - "RE nº nº 1
[0463] O Composto 1 (30 mg, 0,0626 mmol, 1,0 equiv.) foi resfria- do com um banho de gelo. HCl em dioxano (0,313 mL, 1,25 mmol, 20 equiv.) foi adicionado ao balão. A reação foi aquecida até a temperatu- ra ambiente e agitada por mais 1 hora. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi usado diretamente sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 380,19, encontrado 380,33. o Aeon O n o i nº N DIPEA nº ANNA a > >
[0464] A uma solução de composto 1 (10 mg, 0,0571 mmol, 1 equiv.), composto 2 (26 mg, 0,0628 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (22 mg, 0,0685 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (1 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,030 mL, 0,171 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (5 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concen- trada. O produto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4 % de metanol em DCM. LC- MS: calculado [M+H]+ 537,26, encontrado 537,41.
Ad A 4 o AIR IR o o o o nº Ny —E— nº ã R
O O
[0465] O Composto 1 (30 mg, 0,0626 mmol, 1,0 equiv.) foi resfria- do com um banho de gelo. HCl em dioxano (0,313 mL, 1,25 mmol, 20 equiv.) foi adicionado ao balão. A reação foi aquecida até a temperatu- ra ambiente e agitada por mais 1 hora. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi usado diretamente sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 437,21, encontrado 437,31. s Y+ PN er º 2 : H ; RR mo a O
[0466] A uma solução de composto 1 (20 mg, 0,0569 mmol, 1 equiv.), composto 2 (26 mg, 0,0626 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (22 mg, 0,0683 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,03 mL, 0,170 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reaci- onal foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 ho- ra. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (5 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs., e concen- trada. O produto foi separado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4-5 % de metanol em DCM. LC- MS: calculado [M+H]+ 713,36, encontrado 713,85.
SS SS VSTO " STO nº Ny mA" "Ny ; mm m
S
[0467] A uma solução de composto 1 (0,033 g, 0,0463 mmol, 1 equiv.) em etil acetato (10 mL) adicionou-se 10% de Pd/C (20 mg) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada com gás hidro- gênio à temperatura ambiente por uma noite. O catalisador foi removi- do por filtração através de Celite& e o produto foi usado diretamente sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 623,31, encontra- do 623,56. + + OR7ZO o oo o u A go CONTI oH NOVA TD
[0468] A uma solução de composto 1 (16 mg, 0,0257 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (22 mg, 0,0514 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (17 mg, 0,0514 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlash&O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 868,45, encontrado 868,96.
Y ORX&7O o o ASSIS e CAST NOIVADO “ NOSSAS o 1 Estrutura 278
[0469] A uma solução de composto 1 (5 mg, 0,0058 mmol, 1,0 equiv.) em THF (1 mL) e água (1 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (1 mg, 0,0346 mmol, 6,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. TFA (1 mL) e DCM (1 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. LC-MS: calculado [M+H]+ 754,38, encontrado 755. Síntese da Estrutura 29b (ácido (S)-3-(4-(3-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-(2-(4-((4-metilpiridin-2- il)>amino)butanamido)acetamido)propanoico). + É ; * ADO
[0470] Composto 1 (100 mg, 0,169 mmol, 1,0 equiv.), composto 2 (68 mg, 0,253 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (3 mg, 0,0034 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (72 mg, 0,338 mmol, 2,0 equiv.) foram mistura- dos em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente enchido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 vezes). Em seguida, THF (5 mL) e água (1 mL) foram acrescentados via uma se-
ringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 10 min e a reação foi mantida a 40ºC por 2 horas. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL), e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e con- centrada. O composto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 655,31, encontrado 656. O Cs;COs O 1 OO meo DO
[0471] A uma solução de composto 1 (100 mg, 0,152 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (127 mg, 0,305 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (100 mg, 0,305 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por 3 horas a 40ºC. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. O produto foi purificado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 900,44, encontrado 901. + O a O E *TFA Brno arraia Larga ag Ela] ' Estrutura 290
[0472] A uma solução de composto 1 (125 mg, 0,138 mmol, 1,0 equiv.) em THF (1 mL) e água (1 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (10 mg, 0,416 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. TFA (3 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório. O produto foi usado diretamen- te sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 786,37, encon- trado 787. Síntese da Estrutura 30b ((S)-N-(1-azido-21-(4-(naftalen-1-il)fenil)- 19,23-dioxo- 3,6,9,12,15-entaoxa-18,22-diazatetracosan-24-il1)-4-((4- metilpiridin-2-il)amino)butanamida). Fan E PS. : OO
[0473] Composto 1 (100 mg, 0,169 mmol, 1,0 equiv.), composto 2 (43 mg, 0,253 mmol, 1,5 equiv.), XPhos Pd G2 (3 mg, 0,0034 mmol, 0,02 equiv.), e K3PO4 (72 mg, 0,338 mmol, 2,0 equiv.) foram mistura- dos em um balão de fundo redondo. O balão foi vedado com um septo com tampa de rosca, e em seguida esvaziado e novamente enchido com nitrogênio (este processo foi repetido um total de 3 vezes). Em seguida, THF (5 mL) e água (1 mL) foram acrescentados via uma se- ringa. A mistura foi borbulhada com nitrogênio por 10 min e a reação foi mantida a 40ºC por 2 horas. A reação foi resfriada bruscamente com água (10 mL), e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs2, e con- centrada. O composto foi separado por CombiFlash€O usando sílica ge! como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 639,31, encontrado 640.
X , X A Ps, ee 2 CO .
[0474] A uma solução de composto 1 (90 mg, 0,140 mmol, 1 equiv.) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (10 mg, 0,422 mmol, 3 equiv.) aos poucos a 0ºC. A mistura reacional foi aque- cida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à temperatura am- biente por 1 hora, a mistura reacional foi acidificada com HCI (6 N) pa- ra pH 3,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. O produto foi usado sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 625,29, encontrado 625,36.
TAN É AAA : OD Laços
[0475] A uma solução de composto 1 (88 mg, 0,140 mmol, 1 equiv.), composto 2 (48 mg, 0,154 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (54 mg, 0,169 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (3 mL) adicionou-se diisopro- piletilamina (0,074 mL, 0,422 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacio- nal foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concen-
trada. O produto foi separado por CombiFlash€ usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4-6% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 913,47, encontrado 913,70. + o&o CoÂA A ! o” |
CONTOU 1 o Ar Y o a OS
CONTOU
[0476] A uma solução de composto 1 (93 mg, 0,101 mmol, 1,0 equiv.) em DCM (2 mL) adicionou-se TFA (3 mL) e a mistura foi agita- da à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária. O produto foi eluído com 10-12% de metanol em diclorometano. LC-MS: calculado [M+H]+ 813,42, encontrado 813,68. Síntese da Estrutura 31b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-((S)-3-hidróxi-2-(4-((4- metilpiridin-2-il)amino)butanamido)propanamido)propanoico).
Y Y Ds. o o oh Oo OH o + ml E ee A
[0477] A uma solução de composto 1 (150 mg, 0,509 mmol, 1 equiv.), composto 2 (87 mg, 0,560 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (196 mg, 0,196 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (3 mL) adicionou-se diisopro- piletilamina (0,074 mL, 0,422 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacio-
nal foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs,, e concen- trada. O produto foi separado por CombiFlash€O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4-6 % de metanol em DCM. LC- MS: calculado [M+H]+ 396,21, encontrado 396,17. + + O. O OH Ox790 5 OH AE LioH CAE 1
[0478] A uma solução de composto 1 (196 mg, 0,495 mmol, 1 equiv.) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (35 mg, 1,486 mmol, 3 equiv.) aos poucos a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à temperatura ambiente por 1 hora, a mistura reacional foi acidificada com HCl (6 N) para pH 3,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concen- trada. O produto foi usado sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 382,19, encontrado 382,13. É "Oo" ; e OQ 2 om
[0479] A uma solução de composto 1 (189 mg, 0,495 mmol, 1 equiv.), composto 2 (195 mg, 0,545 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (190 mg, 0,595 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (5 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,259 mL, 1,486 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO2, e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4-6 % de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 685,32, encontrado 685,58. OR7O OH O. + OH Na, IA O Ns II A Ox Ç no o -l no o N3-PEG5-Tos ; O Cs,CO; O oH EPA ANO
[0480] A uma solução de composto 1 (75 mg, 0,109 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (91 mg, 0,219 mmol, 2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (71 mg, 0,219 mmol, 2 equiv.) à temperatu- ra ambiente. A mistura reacional foi agitada por uma noite a 40 ºC. À reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e con- centrada. O produto foi purificado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4% de metanol em DCM. O rendimento é de 29%. LC-MS: calculado [M+H]+ 930,45, encontrado 930,90. Reto A, K o ANA N oH TO 4 o o TO n o o
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NOAAAA AÇO NOIR NAO 1 Estrutura 315
[0481] A uma solução de composto 1 (30 mg, 0,0323 mmol, 1,0 equiv.) em THF (1 mL) e água (1 mL) adicionou-se hidróxido de lítio
(2,3 mg, 0,0968 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl! (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SOs,, e concen- trada. TFA (2 mL) e DCM (1 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O sol- vente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi separa- do por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária. O produto foi eluído com 12-15% de metanol em diclorometano. LC-MS: calculado [M+H]+ 816,39, encontrado 816,92. Síntese da Estrutura 32b (ácido (S)-4-(((S)-1-(4-(4-((14-azido- 3,6,9,12-tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-2- carboxietil)amino)-3-(4-((4-metilpiridin-2-il)amino)butanamido)-4- oxobutanoico). o ALLE Do = CUL o DIPEA ; . OOo 2 oH
[0482] A uma solução de composto 1 (100 mg, 0,404 mmol, 1 equiv.), composto 2 (160 mg, 0,444 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (155 mg, 0,485 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,211 mL, 1,213 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-3 % de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 551,23, encontrado 551,45.
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[0483] O Composto 1 (0,164 g, 0,297 mmol, 1,0 equiv.) foi resfria- do com um banho de gelo. HCI em dioxano (0,745 mL, 2,978 mmol, 10 equiv.) foi adicionado ao balão. A reação foi aquecida até a temperatu- ra ambiente e agitada por mais 1 hora. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi usado diretamente sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 451,18, encontrado 451,35. o ox TO O e O
[0484] A uma solução de composto 1 (100 mg, 0,404 mmol, 1 equiv.), composto 2 (160 mg, 0,444 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (155 mg, 0,485 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,211 mL, 1,213 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlashê usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-5 % de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 727,33, encontrado 727,53.
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[0485] A uma solução de composto 1 (150 mg, 0,206 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (172 mg, 0,412 mmol, 2 equiv.)) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (134 mg, 0,412 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por uma noite à temperatura ambiente. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concentrada. O produto foi purificado por Combi- Flash usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4% de metanol em DCM. O rendimento é de 29%. LC-MS: calculado [M+H]+ 940,45, encontrado 940,71. N or ou 28 o Õ o ss 2º o Õ o WA ÃO ps 1 Estrutura 320
[0486] A uma solução de composto 1 (30 mg, 0,0344 mmol, 1,0 equiv.) em THF (1 mL) e água (1 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (2,5 mg, 0,103 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO:, e concentrada. TFA (2 mL) e DCM (1 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi separado por
CombiFlash€O usando sílica gel como a fase estacionária. O produto foi eluído com 20% de metanol em diclorometano. LC-MS: calculado [M+H]+ 844,38, encontrado 844,56. Síntese da Estrutura 33b (ácido (S)-3-((S)-6-amino-2-(4-((4- metilpiridin-2-il)amino)butanamido)hexanamido)-3-(4-(4-((14-azido- 3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)pDropanoico).
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A O AO / F Ee Aa e FA =. ee 1 "qd 2
[0487] A uma solução de composto 1 (150 mg, 0,509 mmol, 1 equiv.), composto 2 (166 mg, 0,560 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (196 mg, 0,611 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (3 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,266 mL, 1,528 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO3, e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-5 % de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 537,32, encontrado 537,23. Y ad + mo K O O OR7O É o, Ze 1
[0488] A uma solução de composto 1 (230 mg, 0,428 mmol, 1 equiv.) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (31 mg, 1,285 mmol, 3 equiv.) aos poucos a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à temperatura ambiente por 1 hora, a mistura reacional foi acidificada com HCl (6 N) para pH 3,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concen- trada. O produto foi usado sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 523,31, encontrado 523,55.
MK E É O” NSAAA Y . ÕO 1 FS o mode, E, A o. ER CC *
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[0489] A uma solução de composto 1 (230 mg, 0,440 mmol, 1 equiv.), composto 2 (173 mg, 0,484 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (170 mg, 0,528 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,230 mL, 1,320 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 4-6% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 826,43, encontrado 826,65.
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SA Ç O SA Ú É o o?
[0490] A uma solução de composto 1 (150 mg, 0,181 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (113 mg, 0,272 mmol, 1,5 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (118 mg, 0,363 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada a 40ºC por 3 ho- ras. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (5 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concen- trada. O produto foi purificado por CombiFlash6O usando sílica gel co- mo a fase estacionária e foi eluído com 4% de metanol em DCM. O rendimento é de 66%. LC-MS: calculado [M+H]+ 1071,57, encontrado 1071,89. mA no ace, a EA = . EA & mr eTFA AO aaa? ' Estrutura 33b
[0491] A uma solução de composto 1 (130 mg, 0,121 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (8,7 mg, 0,364 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl! (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;, e concentrada. TFA (3 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi separado por CombiFlash€O usando sílica gel como a fase estacionária. O produto foi eluído com 20% de metanol em diclorometano. LC-MS: calculado [M+H]+ 857,45, encontrado 857,64. Síntese da Estrutura 34b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-((S)-4-metil-2-(4-((4- metilpiridin-2-il)amino)butanamido)pentanamido)propanoico). + + OFRZ7O Os O eêAs " S TB EA 2 a DIPEA 2N o 1 2
[0492] A uma solução de composto 1 (150 mg, 0,509 mmol, 1 equiv.), composto 2 (101 mg, 0,560 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (196 mg, 0,611 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (3 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,266 mL, 1,528 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (5 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concen- trada. O produto foi separado por CombiFlash€O usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-5% de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 422,26, encontrado 422,36. + + O. O [oo] o EA LioH EN 1
[0493] A uma solução de composto 1 (186 mg, 0,441 mmol, 1 equiv.) em THF (3 mL) e H2O (3 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (31 mg, 1,323 mmol, 3 equiv.) aos poucos a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à temperatura ambiente por 1 hora, a mistura reacional foi acidificada com HCI (6 N) para pH 3,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concen- trada. O produto foi usado sem purificação adicional. LC-MS: calculado [M+H]+ 408,24, encontrado 408,23. 1 OH ; se
[0494] A uma solução de composto 1 (168 mg, 0,412 mmol, 1 equiv.), composto 2 (162 mg, 0,453 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (159 mg, 0,494 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se diiso- propiletilamina (0,215 mL, 1,237 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura rea- cional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO3, e con- centrada. O produto foi separado por CombiFlashO usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 2-4 % de metanol em DCM. LC-MS: calculado [M+H]+ 711,37, encontrado 711,69.
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[0495] A uma solução de composto 1 (150 mg, 0,206 mmol, 1 equiv.) e azido-PEG5-OTs (132 mg, 0,317 mmol, 1,5 equiv.) em DMF anidra (2 mL) adicionou-se Cs2CO3 (137 mg, 0,422 mmol, 2 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada a 40ºC por 3 ho- ras. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a camada aquosa foi extraída com etil acetato (3 x mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e con- centrada. O produto foi purificado por CombiFlash& usando sílica gel como a fase estacionária e foi eluído com 3-4% de metanol em DCM. O rendimento é de 82%. LC-MS: calculado [M+H]+ 956,51, encontrado 956,64.
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[0496] A uma solução de composto 1 (160 mg, 0,167 mmol, 1,0 equiv.) em THF (2 mL) e água (2 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (12 mg, 0,502 mmol, 3,0 equiv.) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 1 hora. O pH foi ajustado em 3,0 com HCl (6N) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concentrada. TFA (3 mL) e DCM (2 mL) foram adicionados ao resíduo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por mais 3 horas. O solvente foi removido por um evaporador giratório e o produto foi separado por CombiFlash€O usando sílica gel como a fase estacionária. O produto foi eluído com 8-10% de metanol em diclorometano. LC-MS: calculado [M+H]+ 842,44, encontrado 842,67. Síntese da Estrutura 35b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-((2S,3R)-3-hidróxi-2-(4-((4- metilpiridin-2-il)amino)butanamido)butanamido)propanoico).
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[0497] A um frasco contendo L-treonina-OMe HCI (1,000 g, 5,896 mmol, 1,3 eq) adicionou-se composto 1 (1,335 g, 4,535 mmol, 1 eq), dimetilaminopiridina (0,277 g, 2,268 mmol, 0,5 eq), e CH2Cl2 (13,3 mL). À mistura adicionou-se diisopropilamina (2,054 mL, 11,792 mmol, 2,6 eq) e a solução resultante foi resfriada para 0 ºC. EDC-HCI (1,130 g, 5,896 mmol, 1,3 eq) foi adicionado e a reação foi deixada agitar a 0ºC por 30 minutos antes de ser aquecida até a temperatura ambiente. De- terminou-se por HPLC que a reação havia terminado depois de 16 ho- ras e esta foi transferida para um funil separador, lavada com 66% de NHA.CI saturado (4 x 20 mL) e NHJCI saturado (20 mL). A camada or- gânica foi secada sobre Na2SO, e concentrada para dar um óleo vis- coso (1,7588 g, 94,7%) que foi levado diretamente para a etapa se- guinte. LC-MS: calculado [M+H]+: 410,22, encontrado 410,03 E o ;oH | E o OH SN Ai ho MeOH, qe LioH SN do TC 1a “oo TC s Ex
[0498] O Composto 1 foi dissolvido em MeOH (4,5 mL) e à mistura adicionou-se uma solução 2,0 M de LiOH (9,1 mL). A reação foi agita- da por 1,5 h e concentrada para remover o MeOH. A mistura foi então acidificada para pH = 4 com 20% de KHSO4 e extraída com EtOAc (3 XxX 15 mL). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura (20 mL), secada sobre Na2SO,, e concentrada para obter 3 como um sóli- do (1,5095 g, 88,9% de rendimento). LC-MS: calculado [M-H]-: 394,21, encontrado 394,37. 1H RMN (400 MHz, Cloroform-d) 5 8,26 (d, 1H), 7,27 - 7,24 (m, 1H), 7,23 (s, 1H), 6,95 (ddd, 1H), 4,60 (dd, 1H), 4,39 (qd, 1H), 3,97 - 3,77 (m, 2H), 2,36 (s, 3H), ), 2,41 - 2,23 (m, 2H), 1,98 -
1,84 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,19 (d, 3H). o Y Yo EO Va . OO om
[0499] Um frasco foi carregado com composto 1 (0,200 g, 0,506 mmol, 1 eq), TBTU (0,195 g, 0,607 mmol, 1,2 eq), DMF (2,0 mL) e DI- EA (0,264 mL, 1,517 mmol, 3,0 eq). A reação foi agitada por 2 minutos antes da adição de 2 (0,253 g, 0,708 mmol, 1,4 eq). Depois de termi- nada, a reação foi diluída com NaHCO;3 aquoso saturado (10 mL), e extraída com EtOAc (3 x 5 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (10 mL), secadas sobre Na2SO;, e con- centradas. O material bruto foi purificado por cromatografia em coluna, eluindo com 0-20% de MeOH em CH2Cl2 para obter o produto (150,8 mg, 42,7% de rendimento). LC-MS: calculado [M+H]+: 699,33, encon- trado 699,53 + " fe EA E : EA É
O PO oH $ NOVO Do ONA
[0500] A um frasco contendo composto 1 (0,151 g, 0,216 mmol, 1 eq) adicionou-se Cs2CO3 (0,106 g, 0,324 mmol, 1,5 eq) e DMF (1,9 mL). N3-PEG5-OTs (0,135 g, 0,324 mmol, 1,5 eq) foi adiciondo à mis- tura e a reação foi agitada a 40ºC. Depois de terminada, a reação foi diluída com EtOAc (10 mL), NaHCO; aquoso saturado (5 mL) e água (5 mL). As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída um total de 3 x 10 mL com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram secadas sobre Na2SO, e concentradas. O material bruto foi puri-
ficado por cromatografia em coluna, eluindo com 0-20% de MeOH in CH2Cl2 para obter o produto (103 mg, 50,4% de rendimento). LC-MS: calculado [M+H]+: 944,47, encontrado 944,56 e SD 1 OC monzono: O nf NEON
[0501] A um frasco contendo composto 1 (0,103 g, 0,109 mmol, 1 eq) adicionou-se MeOH (1,5 mL) e 2,0 M LiOH (2,0 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente, e em seguida concentrada para re- mover o MeOH, e acidificada com 20% de KHSO4 para pH = 2. À mis- tura adicionou-se EtOAc (5 mL) e água (4 mL). A camada aquosa foi extraída com EtOAc (3x5 mL). As camadas orgânicas combinadas fo- ram lavadas com salmoura (10 mL), secadas sobre Na2SO3, e concen- tradas para dar o produto (0,0879 g, 86,9%). LC-MS: calculado [M+H]+: 930,45, encontrado 930,56.
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[0502] A um frasco contendo composto 1 (0,0879 g, 0,0945 mmol, 1 eq) adicionou-se CH2Cl2 (0,3 mL) e ácido trifluoroacético (0,64 mL). A solução foi agitada à temperatura ambiente. Depois de terminada (>97% de produto), a reação foi concentrada, co-evaporando com to- lueno (3 mL) e em seguida acetonitrila (2x3 mL). O produto foi obtido com a presença de mais TFA (115,6 mg). Síntese da Estrutura 36b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12-
tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-((2S,3S)-3-metil-2-(4-((4- metilpiridin-2-il)amino)butanamido)pentanamido)propanoico).
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[0503] A um frasco contendo L-isoleucina-OMe HCI (1,000 9, 5,505 mmol, 1,3 eq) adicionou-se composto 1 (1,246 g, 4,234 mmol, 1 eq), dimetilaminopiridina (0,259 g, 2,117 mmol, 0,5 eq), e CH2Ch2 (12,5 mL). À mistura adicionou-se diisopropilamina (2,054 mL, 11,792 mmol, 2,6 eq) e a solução resultante foi resfriada para 0ºC. EDC-HCI (1,055 9, 5,505 mmol, 1,3 eq) foi adicionado e a reação foi deixada agitar a 0ºC por 30 minutos antes de ser aquecida até a temperatura ambiente. De- terminou-se por HPLC que a reação havia terminado depois de 16 ho- ras e esta foi transferida para um funil separador, lavada com 66% de NH.aCI saturado (4 x 20 mL) e NHaCI saturado (1x20 mL). A camada orgânica foi secada sobre Na2SO, e concentrada para dar um óleo viscoso (1,8634 g, molhado com CH2CI2) que foi levado diretamente para a etapa seguinte. LC-MS: calculado [M+H]+: 422,26, encontrado 422,00.
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[0504] O Composto 1 foi dissolvido em MeOH (4,2 mL) e à mistura adicionou-se 2,0 mL de uma solução de LiOH (8,5 mL). A reação foi agitada por 1,5 h e concentrada para remover o MeOH. A mistura foi então acidificada para pH = 4 com 20% de KHSO4 e extraída com EtOAc (3 x 15 mL). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura (20 mL), secada sobre Na2SOa., e concentrada para obter o produto como um óleo viscoso (1,6123 g, 93,4% de rendimento em duas etapas). LOC-MS: calculado [M-H]-: 406,24, encontrado 406,43. 1H RMN (400 MHz, Cloroform-d) 5 8,23 (d, 1H), 7,12 (d, 1H), 6,95 - 6,88 (m, 1H), 4,58 (dd, 1H), 3,99 - 3,83 (m, 2H), 2,35 - 2,34 (s, 3H), 2,30 (hept, 2H), 2,00 - 1,84 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 0,91 (m, 6H). Do E hs: se
[0505] Um frasco foi carregado com composto 1 (0,200 g, 0,491 mmol, 1 eq), TBTU (0,189 g, 0,589 mmol, 1,2 eq), DMF (2,0 mL) e DI- EA (0,256 mL, 1,472 mmol, 3,0 eq). A reação foi agitada por 2 minutos antes da adição de 2 (0,246 g, 0,687 mmol, 1,4 eq). Depois de termi- nada, a reação foi diluída com NaHCO;3 aquoso saturado (10 mL), e extraída com EtOAc (3x5 mL). As camadas orgânicas combinadas fo- ram lavadas com salmoura (10 mL), secadas sobre Na2SO2, e concen- tradas. O material bruto foi purificado por cromatografia em coluna, eluindo com 0-20% de MeOH in CH2Cl> para obter o produto (0,3024 mg, 86,7% de rendimento). LC-MS: calculado [M+H]+: 711,37, encon- trado 711,51. = o » E o x q
[0506] A um frasco contendo composto 1 (0,170 g, 0,238 mmol, 1 eq) adicionou-se Cs2CO3 (0,116 g, 0,358 mmol, 1,5 eq) e DMF (21 mL). N3-PEG5-OTs (0,149 g, 0,358 mmol, 1,5 eq) foi adicionado à mistura, e a reação foi agitada a 40ºC. Depois de terminada, a reação foi diluída com EtOAc (10 mL), NaHCO;3 aquoso saturado (5 mL) e água (5 mL). As camadas foram separadas e a camada aquosa foi ex- traída um total de 3X10 mL com EtOAc. As camadas orgânicas combi- nadas foram secadas sobre Na2SO. e concentradas. O material bruto foi purificado por cromatografia em coluna, eluindo com 0-20% de MeOH in CH2ClI2 para obter o produto (0,1645 g, 72,1% de rendimento). LC-MS: calculado [M+H]+: 956,51, encontrado 956,78.
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[0507] A um frasco contendo composto 1 (0,164 g, 0,172 mmol, 1 eq) adicionou-se MeOH (2,0 mL) e 2,0 M LiOH (3,0 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente e monitorda por HPLC. Foram neces- sários mais LIOH (33 mg, 1,38 mmol, 8 eq), água (5 mL) e MeOH (4 mL) para dissolver o material e induzir a reação. HPLC revelou a for- mação de dois picos novos, que se acreditou serem diastereômeros. Ao atingir >94% de conversão, a reação foi concentrada para remover o MeOH, acidificada com 20% de KHSO4 para pH = 2. À mistura adi- cionou-se EtOAc (5 mL) e água (4 mL). A camada aquosa foi extraída com EtOAc (4x5 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lava- das com salmoura (10 mL), secadas sobre Na2SO,., e concentradas para dar o produto (0,1417 g, 87,4%). LC-MS: calculado [M+H]+: 942,49, encontrado 942,56. + O a Estrutura 360
[0508] A um frasco contendo composto 1 (0,1417 g, 0,1504 mmol, 1 eq) adicionou-se CH2Cl2 (0,5 mL) e trifiuoroacetic acid (1,0 mL). À solução foi agitada à temperatura ambiente. Depois de terminada (>97% de produto), a reação foi concentrada, co-evaporando com to- lueno (3 mL) e em seguida acetonitrila (2x3 mL). O produto foi obtido com a presença de mais TFA (150,3 mg). Dois picos estavam presen- tes durante a reação tanto para o material de partida como para o pro- duto. LOC-MS: calculado [M+H]+: 842,44, encontrado 842,56. verificou- se que ambos os picos do produto tinham a mesma massa, indicando a presença de diastereômeros. Síntese da Estrutura 37b (ácido (S)-3-(4-(4-((14-azido-3,6,9,12- tetraoxatetradecil)óxi)naftalen-1-il)fenil)-3-((R)-3-metil-2-(4-((4- metilpiridin-2-il)amino)butanamido)butanamido)propanoico). O OH + emas E CDTÉÓL 1 2
[0509] A uma solução de composto 1 (150 mg, 0,509 mmol, 1 equiv.), composto 2 (94 mg, 0,560 mmol, 1,1 equiv.), e TBTU (196 mg, 0,611 mmol, 1,2 equiv.) em DMF anidra (3 mL) adicionou-se diisopro- piletilamina (0,266 mL, 1,528 mmol, 3 equiv.) a 0ºC. A mistura reacio- nal foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 1 hora. A reação foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (10 mL) e a fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO;., e concen- trada. O produto foi separado por CombiFlash e foi eluído com 2-3% de metanol em DCM. Rendimento: 205 mg (99%). + + OFZR7O o Po qe AO LioH CARY 1
[0510] A uma solução de composto 1 (207 mg, 0,508 mmol, 1 equiv.) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) adicionou-se hidróxido de lítio (36 mg, 1,523 mmol, 3 equiv.) aos poucos a 0ºC. A mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de agitar à temperatura ambiente por 1 hora, a mistura reacional foi acidificada com HCl (6 N) para pH 3,0. A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 10 mL) e a camada orgânica foi combinada, secada sobre Na2SO,, e concen- trada. O produto foi usado sem purificação adicional. Rendimento: 180 mg (91%).
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[0511] A uma solução de composto 3 (180 mg, 0,46 mmol), com- posto 3a (180 mg, 0,50 mmol), e TBTU (176 mg, 0,55 mmol) em DMF (2,5 mL) adicionou-se DIPEA (177 mg, 239 uL, 1,37 mmol) a 0ºC. À mistura reacional foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora. A mistura reacional foi resfriada bruscamente com uma so- lução saturada de NH4CI (aq) (1,75 mL) e água desionizada (1,75 mL) e em seguida extraída com etil acetato (8 mL). A camada aquosa foi ainda extraída com etil acetato (2 x 8 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com uma solução semi-saturada de NH.CI (aq) (6 mL) e uma solução semi-saturada de NaHCO; (aq) (6 mL). A camada orgâ-
nica foi secada sobre Na2SO:,, filtrada, e concentrada. A mistura bruta foi separada por CombiFlash usando sílica gel como a fase estacioná- ria com 0-5% de metanol em DCM. Rendimento de composto 4: 295 mg (92%). [M+H]+ calculado para C40H48N407: 697,84, encontrado: 697,82.
[0512] A uma solução de composto 4 (200 mg, 0,29 mmol) e azi- do-PEG5-OTs (240 mg, 0,57 mmol) em DMF anidra (2,5 mL) adicio- nou-se Cs2CO3 (187 mg, 0,57 mmol). A mistura reacional foi agitada a 60ºC por 2 horas. A mistura reacional foi resfriada bruscamente com uma solução saturada de NaHCO; (aq) (15 mL) e água desionizada (7,5 mL) e em seguida extraída com etil acetato (10 mL). A camada aquosa foi ainda extraída com etil acetato (2 x 10 mL). A fase orgânica combinada foi secada sobre Na2SO:,, filtrada, e concentrada. A mistura bruta foi separada por CombiFlash usando sílica gel como a fase esta- cionária com 0-5% de metanol em DCM. Rendimento de composto 5: 97 mg (36%). [M+H]+ calculado para CSOH67N7011: 943,15, encon- trado: 942,96.
[0513] A uma solução de composto 5 (94 mg, 0,10 mmol) em THF (1,5 mL) e água desionizada (1 mL) adicionou-se uma solução de hi- dróxido de lítio (7,2 mg, 0,380 mmol) em água desionizada (0,5 mL). À mistura reacional foi agitada por 1 hora e em seguida acidificada para pH=3 com HCl 6 M (aq). A fase aquosa foi extraída com etil acetato (3 x 5 mL). A fase orgânica combinada foi secada sobre Na2SO:,, filtrada, e concentrada. Ao resíduo bruto adicionou-se TFA (1,34 mL) e água (67 UuL). A mistura reacional foi agitada por 1,5 hora à temperatura am- biente. O solvente foi removido à pressão reduzida, e o resíduo foi co- evaporado com acetonitrila:tolueno [1:1] (2 x 20 mL). A mistura bruta foi separada por CombiFlash usando sílica gel como a fase estacioná- ria com 0-10% de metanol em DCM. Rendimento de Estrutura 37b: 44 mg (53%). [M+H]+ calculado para C44H57N7089: 828,97, encontrado:
828,63. Exemplo 2. Síntese de ligantes tridentados da integrina avB6 e conjugação de ligantes da integrina avB6 a moléculas de carga (agentes de RNAi).
[0514] Os ligantes da integrina avB6 podem ser conjugados a um ou mais agentes de RNAi úteis na inibição da expressão de um ou mais genes-alvo. Os ligantes da integrina avB6 facilitam a distribuição dos agentes de RNAi para as células e/ou tecidos-alvo. O Exemplo 1, acima, descrveu a síntese de determinados ligantes da integrina avB6 revelados neste pedido. A seguir estão descritos os procedimentos gerais para a síntese de determinados conjugados ligante da integrina avB6-agente de RNAi que estão ilustrados nos Exemplos ilustrativos apresentados neste pedido.
[0515] A. Síntese de Agentes de RNAi. Os agentes de RNAi po- dem ser sintetizados por métodos geralmente conhecidos na literatura. Para a síntese dos agentes de RNAi ilustrados nos Exemplos apresen- tados neste pedido, os filamentos sentido e antissentido dos agentes de RNAi foram sintetizados de acordo com a tecnologia de fosforamidi- ta em fase sólida usada na síntese de oligonucleotídeos. Dependendo da escala, usou-se um MerMade96EO (Bioautomation), um MerMa- del28 (Bioautomation), ou um OP Pilot 100 (GE Healthcare). As sínte- ses foram realizadas sobre um suporte sólido feito de vidro de poros controlados (CPG, 500 À ou 600ÀÁ, adquirido na Prime Synthesis, As- ton, PA, USA). Todas as fosforamiditas de RNA e de RNA 2'- modificado foram adquitidas na Termo Fisher Scientific (Milwaukee, WI, USA). Especificamente, foram usadas as seguintes 2'-O-metil fosfora- miditas: (5'-O-dimetoxitritil-N6-(benzoil)-2'-O-metil-adenosina-3'-0-(2- cianoetil-N N-diisopropilamino) fosforamidita, = 5'-O-dimetóxi-tritil-N4- (acetil)-2'-O-metil-citidina-3'-O-(2-cianoetil-N N-diisopropil-amino) fosfo- ramidita, (5'-O-dimetoxitritil-N2-(isobutiril)-2'-O-metil-guanosina-3'-0-(2-
cianoetil-N N-diisopropilamino) fosforamidita, e 5'-O-dimetoxitritil-2'-O- metil-uridina-3'-O-(2-cianoetil-N N-diisopropilamino) fosforamidita. As 2'-desóxi-2'-fiuoro-fosforamiditas continham os mesmos grupos prote- tores que as 2'-O-metil RNA amiditas. 5'-dimetoxitritil-2'-O-metil- inosina-3'-O-(2-cianoetil-N N-diisopropilamino) fosforamiditas — foram adquiridas na Glen Research (Virginia) As (3'-O-dimetoxitritil-2'- desoxiribose-5'-O-(2-cyanoetil-N N-diisopropilamino) fosforamiditas abásicas invertidas foram adquiridas na ChemGenes (Wilmington, MA, USA). As seguintes UNA fosforamiditas foram usadas: 5'-(4,4"- Dimetoxitritil)-N6-(benzoil)-2',3'-seco-adenosina, 2'-benzoil-3'-[(2- cianoetil)-(N N-diisopropi!)]-fosforamidite, 5'-(4,4'-Dimetoxitritil)- N-acetil- 2',3'-seco-citosina, 2'-benzoil-3'-[(2-cianoetil)-(N N-diiso-propil)]- fosforamidita, 5'-(4,4'-Dimetoxitritil)- N-isobutiril-2',3'-seco-guanosina, 2'- benzoil-3'-[(2-cianoetil)-(N N-diisopropil)]-fosforamidita, e B5-(44- Dimetóxi-tritil)-2',3'-seco-uridina, 2'-benzoil-3'-[(2-cianoetil)-(N,N- diiso- propil)]-fosforamidita. As TFA aminolink fosforamiditas também foram adquiridas comercialmente (ThermoFisher).
[0516] Em alguns exemplos, os ligantes da integrina avB6 revela- dos neste pedido são conjugados aos agentes de RNAi ligante-se os componentes a um cadafalso que inclui um grupo trialquino. Em al- guns exemplos, o grupo trialquino é adicionado por meio de uma fosfo- ramidita contendo trialquino, que pode ser acrescentada à extremidade 5' terminal do filamento sentido de um agente de RNAi. Quando usa- das junto com os agentes de RNAi apresentados em certos Exemplos deste pedido, as fosforamiditas contendo trialguino foram dissolvidas em diclorometano anidrido ou em acetonitrila anidra (50 mM), ao pas- so que todas as outras amiditas foram dissolvidas em acetonitrila ani- dra (50 mM), e peneiras moleculares (3À) foram adicionadas. 5- Benziltio-1H-tetrazol (BTT, 250 mM em acetonitrila) ou 5-Etiltio-1H- tetrazol (ETT, 250 mM em acetonitrila) foi usado como solução ativa-
dora. Os tempos de acoplamento foram de 10 min (RNA), 90 seg (2' O-Me), e 60 seg (2' F). Para a introdução de ligações fosforotioato, foi empregada uma solução 100 mM de 3-fenil 1,2 4-dithiazolina-5-ona (POS, adquirida na PolyOrg, Inc., Leominster, MA, USA) em acetonitri- la anidra.
[0517] Alternativamente, onde os ligantes da integrina avB6 são conjugados aos agentes de RNAi via um cadafalso trialquino, em vez de usar uma abordagem com fosforamidita, compostos contendo trial- quino podem ser introduzidos após a síntese (vide, por exemplo, se- ção E, abaixo). Quando usados junto com os agentes de RNAi apre- sentados em certos Exemplos dados neste pedido, quando um grupo trialquino foi preso após a síntese à extremidade 5' do filamento senti- do, o nucleotídeo 5' terminal do filamento sentido foi funcionalizado com um nucleotídeo que incluía uma amina primária na extremidade 5' para facilitar a ligação ao cadafalso contendo trialqguino. TFA aminolink fosforamidita foi dissolvida em acetonitrila anidra (50 mM) e peneiras moleculares (3Á) foram adicionadas. 5-Benziltio-1H-tetrazol (BTT, 250 mM em acetonitrila) ou 5-Etiltio-1H-tetrazol (ETT, 250 mM em acetoni- trila) foi usado como solução ativadora. Os tempos de acoplamento foram de 10 min (RNA), 90 seg (2' O-Me), e 60 seg (2' F). Para a intro- dução de ligações fosforotioato, foi empregada uma solução 100 mM de 3-fenil 1,2,4-dithiazolina-5-ona (POS, adquirida na PolyOrg, Inc., Leominster, MA, USA) em acetonitrila anidra.
[0518] B. Clivagem e desproteção do oligômero ligado ao suporte. Depois de finalizada a síntese em fase sólida, o suporte sólido seco foi tratado com uma solução 1:1 volume de 40% em peso de metilamina em água e uma solução de hidróxido de amônio a 28% a 31% (Aldrich) por 1,5 hora a 30ºC. A solução foi evaporada e o resíduo sólido foi re- constituído em água (vide abaixo).
[0519] C. Purificação. Os oligôêômeros brutos foram purificados por
HPLC de troca iônica usando uma coluna TSKgel SuperQ-5PW 13um e o sistema Shimadzu LC-8. O tampão A foi 20 mM de Tris, 5 mM de EDTA, pH 9,0 e continha 20% de acetonitrila e o tampão B foi o mes- mo que tampão A com a adição de 1,5 M de cloreto de sódio. Foram registrados traços de UV a 260 nm. As frações apropriadas foram reu- nidas e então examinadas por HPLC de exclusão por tamanho usando uma coluna GE Healthcare XK 16/40 acondicionada com finos de Sephadex G-25 com um tampão de corrida de 100 mM de bicarbonato de amônio, pH 6,7 e 20% de acetonitrila ou água filtrada.
[0520] D. Combinação. Filamentos complementares foram mistu- rados combinando soluções de RNA equimolares (sentido e antissen- tido) em 1 x PBS (solução salina tamponada com fosfato, 1 x, Corning, Cellgro) para formar os agentes de RNAi. Alguns agentes de RNAi fo- ram liofilizados e armazenados a uma temperatura de -15 a -25 ºC. À concentração dúplice foi determinada medindo-se a absorvência da solução em um espectrômetro UV-Vis em 1 x PBS. A absorvência da solução a 260 nm foi então multiplicada por um fator de conversão e pelo fator de diluição para determinar a concentração dúplice. O fator de conversão usado foi 0,037 mg/(mL:cm), ou, alternativamente para alguns experimentos, o fator de conversão foi calculado a partir de um coeficiente de extinção determinado experimentalmente.
[0521] E. Conjugação do cadafalso de trialquino. Seja antes ou depois da combinação, o filamento sentido funcionalizado com 5' ou 3' de um agente de RNAi pode ser conjugado a cadafalso de trialquino. Estruturas exemplificativas do cadafalso de trialquino que podem ser usadas na formação dos construtos revelados neste pedido incluem as seguintes:
A, o o
LO 3
SAO u 9 dao O SA õ PL ;
[0522] A seguir descrevemos a conjugação do cadafalso de trial- quino ao dúplex combinado: o dúplex funcionalizado com amina foi dissolvido em 90% de DMSO/10% de H2O, a -50-70 mg/mL. 40 eq. de trietilamina foram adicionados, seguidos por 3 eq tri-alquino-PNP. Uma vez terminado, o conjugado foi precipitado duas vezes em um sistema solvente de 1x solução salina tamponada com fosfato/acetonitrila (1:14 ratio), e secado.
[0523] F. Conjugação dos ligantes da integrina avB6. Seja antes ou depois da combinação, o filamento sentido funcionalizado com 5' ou
3' alquino tridentado é conjugado aos ligantes da integrina avB6. O exemplo a seguir descreve a conjugação dos ligantes da integrina avB6 ao dúplex combinado: Soluções de estoque de O0,5M de Tris(3- hidroxipropiltriazolilmetil)amina (THPTA), O0,5M de sulfato de Cu(ll) penta-hidratado (Cu(lI)SO4 - 5 H2O) e solução 2M de ascorbato de sódio foram preparadas em água desionizada. Fêz-se uma solução 75 mg/mL em DMSO de ligante da integrina avB6. Em um tubo de centri- fuga de 1,5 mL contendo o dúplex funcionalizado com trialqguino (3 mg, 75 ul, 40 mg/mL em água desionizada, -15,000 g/mol), foram adicio- nados 25 ul de tampão IM Hepes pH 8,5. Depois de centrifugação, foram adicionados 35 ul. de DMSO e a solução foi centrifugada. O |i- gante da integrina avB6 foi adicionado à reação (6 eq/dúplex, 2 eqg/alquino, -15uL) e a solução foi centrifugada. Com a ajuda de papel de pH, o pH foi verificado e confirmou-se que este era pH -8. Em um tubo de centrífuga de 1,5 mL separado, 50 ul de 0,5SM THPTA foram misturados com 10 ul de O0,5M Cu(lI)|SO4 + 5 H2O, centrifugados, e incubados à temperatura ambiente por 5 minutos. Depois de 5 minutos, uma solução de THPTA/Cu (7,2 uL, 6 eq 5:1 THPTA:Cu) foi adiciona- da ao frasco reacional, e centrifugada. Imediatamente depois disso, 2 M de ascorbato (5 ul, 50 eq ppor dúlex, 16,7 por alquino) foram adici- onados ao frasco reacional e centrifugados. Depois de terminada a reação (tipicamente completa em 0,5-1 h), a reação foi imediatamente purificada por cromatografia de troca aniônica não desnaturante.
[0524] G. Functionalização do grupo tiol em ligante cisteína. Em alguns exemplos, é possível usar um ligante cisteína para facilitar a conjugação dos ligantes da integrina avB6 ao agente de RNAi. Seja antes ou depois da combinação, o filamento sentido funcionalizado com 5' ou 3' alquino-Cys(Stbu)-PEG2 tridentado é funcionalizado com uma porção contendo maleimida, ou pode ser reduzido e deixado co- mo o tiol livre, como mostrado na estrutura a seguir:
eo neta IPA aa "= rt, º
[0525] O exemplo a seguir descreve a modificação do tri-alquino- Cys(Stbu)-PEG2-dúplex com N-etil maleimida: Tri-alqguino-Cys(Stbu)- PEG2-dúplex (35 mg) foi dissolvido em 500 ul de H2O desionizada. Tampão HEPES (1M, pH 8,5, 82 uL), foi adicionado à reação, e a so- lução foi centifugada. Uma solução 1 M de ditiotreitol (DTT, 100 eq, 236 uL) foi adicionada e a solução foi em um agitador vortex por 3 ho- ras. Depois de confirmada a redução do dissulfeto por RP- HPLC des- naturante, o conjugado foi precipitado três vezes em um sistema sol- vente de 1x solução salina tamponada com fosfato/acetonitrila (razão 1:14). A pelota precipitada foi reconstituída em 0,5 mL de HEPES 0,1 M, pH 6,5, e N-etil maleimida (3 mg, 10 eq) foi adicionada à solução, e colocada em um misturador vortex por -15 min. Depois de terminada a reação, o conjugado foi precipitado três vezes em um sistema solvente de 1x solução salina tamponada com fosfato/acetonitrila (razão 1:14), dessalinizado, e secado. Exemplo 3. Atividade de ligação do ligante da integrina avB6.
[0526] Como apresentado na Tabela 1 a seguir, os dados de liga- ção na IC50 foram obtidos para os ligantes da integrina avB6 de Estru- turas 1 e 2: Tabela 1. Atividade de ligação na IC50 | Grupo I1C50 (nM)
EE E
[0527] Estruturas funcionalizadas com azida (isto é, Estruturas 1b e 2b) foram examinadas para IC50 em condições tipicamente usadas e conhecidas no estado da técnica. Como mostrado na Tabela 1, aci- ma, as Estruturas 1 e 2 apresentam ligação seletiva para a integrina avB6. Exemplo 4. Administração intratraqueal in vivo de agentes de RNAi vetorizados para Alfa-ENaC conjugado a ligantes da integri- na avB6 em ratos.
[0528] Agentes de RNAi que incluíam um filamento sentido e um filamento antissentido foram sintetizados de acordo com a tecnologia de fosforamidita em fase sólida de acordo com procedimentos gerais conhecidos na literatura e comumente usados na síntese de oligonu- cleotídeo tal como mostrado no Exemplo 2 deste pedido. Os agentes de RNAi incluíam um filamento antissentido tendo uma sequência de nucleobases pelo menos parcialmente complementar ao gene expres- sando a subunidade alfa do canal de sódio epitelial sensível à amilori- da (comumente denominada alfa-ENaC ou SCNN1A). Os agentes de alfa-ENaC RNAi foram desenhados para serem capazes de degradar ou inibir a translação de transcritos de RNA mensageiro (mMRNA) de alfa-ENaC de maneira específica para sequência, dessa forma inibindo a expressão do gene alfa-ENaC. O agente de RNAi usado neste Exemplo (ADO04835) era constituído de nucleotídeos modificados e mais de uma ligação não-fosfodiéster, e incluía as seguintes sequên- cias de nucleotídeos: Sequência do filamento sentido (5' — 3'): (NH2-C6)sgscugugcaAfCfCfagaacaaauas(invAb) (SEQ ID NO:1) Sequência do filamento antissentido (5' — 3') cPrpusAfsusUfuGfuUfcUfgGfuUufgCfaCfaGfsc (SEQ ID NO: 2), onde (invAb) representa um desoxirribonucleotídeo abásico invertido (ligado 3'-3'); s representa uma ligação fosforotioato; a, c, g, e u repre-
sentam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina, ou uridina, respecti- vamente; Af, Cf, Gf, e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina, ou uridina, respectivamente; cPrpu representa a 5"- ciclopropil fosfonato-2'-O-metil uridina (vide, por exemplo, Tabela A); e (NH2-C6) representa uma C6 amina terminal para facilitar a conjuga- ção do ligante vetorizado conforme desejado (vide, por exemplo, Tabe- la A).
[0529] Como seria claramente entendido pelo especialista na téc- nica, os monômeros nucleotídicos são ligados por ligações fosfodiéster tradicionais exceto onde a inclusão de uma ligação fosforotioato, como mostrado nas sequências de nucleotídeos modificadas reveladas nes- te pedido, substitui a ligação fosfodiéster tipicamente presente em um oligonucleotídeo.
[0530] No dia 1 e no dia 2 do estudo, ratos Sprague-Dawley ma- chos receberam uma dose de 200 microlitros por via intratraqueal por meio de um dispositivo microborrifador (Penn Century, Philadelphia, PA), que incluiu os seguintes grupos de dosagem: (1) 5% de dextrose em água como veículo (DSW); (2) 3,0 mg/kg de um agente de alfa-ENaC RNAi (ADO4835) sem um ligante ("agente de RNAi nu"), formulados em 5% de dextrose em água (d5w); ou (3) 3,0 mg/kg de um agente de alfa-ENaC RNAi (ADO4835) conjugado a um ligante tridentado da integrina avB6 de Estrutura 1, formulado em d5w.
[0531] O mesmo agente de alfa-ENaC RNAi foi usado nos grupos 2 e 3. Para o grupo 3, a amina terminal (NH2-Cs) presente na extremi- dade 5' terminal do mesmo filamento do agente de RNAi foi então con- jugada a um cadafalso que incluía três grupos alquino terminais. Os grupos alquino foram então conjugados ao grupo funcional azida pre- sente na Estrutura 1b, formando assim um ligante tridentado da inte-
grina avB6 de Estrutura 1. Procedimentos gerais de síntese estão des- critos no Exemplo 2, acima.
[0532] Quatro (4) ratos foram medicados por grupo. Os ratos so- freram eutanásia no dia 5 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A abundância de MRNA de alfa-ENaC foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fra- ção do grupo com veículo de controle (média geométrica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 2. Expressão relativa de alfa-ENaC de mRNA normalizada para o controle do Exemplo 4.
(média geométrica) 95% inferior/superior Estrutura 1 [(ligante da integrina avB6 de Es- trutura 1);-agente de RNAi
[0533] Como mostrado na Tabela 2 acima, o ligante da integrina avB6 de Estrutura 1 na forma tridentada conjugado ao agente de alfa- ENaC RNAi (isto é, grupo 3) mostrou nocaute relativo aumentado de alfa-ENaC mRNA (aproximadamente 81% de nocaute), em compara- ção com o agente de RNAi nu (64% de nocaute) sem ligante (isto é, grupo 2) e o veículo de controle, in vivo. Exemplo 5. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integrina avB6.
[0534] Nos exemplos a seguir, vários agentes de RNAi são usados como moléculas de carga para testar a distribuição de uma molécula de carga via uma integrina avB6 para uma célula de interesse. Alguns dos agentes de RNAi usados neste pedido estão descritos no docu- mento US 62/679,549, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a ti-
tulo de referência.
[0535] No dia 1 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguintes grupos de dosagem: Tabela 3. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 5. Grupo | Agente de RNAi e dose 1 Solução salina isotônica (sem agente de RNAi) Dose OP única no dia 1 2 0,5 mg/kg de agente de RNAi de filamento duplo de alfa-ENac | Dose OP única no dia 1 (ADO4835) conjugado com o ligante tridentado da integrina avp6 de estrutura 2, formulado em solução salina isotônica 3 0,5 mg/kg de agente de RNAi de filamento duplo de alfa-ENac | Dose OP única no dia 1 (ADO4835) conjugado com o ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 5.1, formulado em solução salina isotônica 4 0,5 mg/kg de agente de RNAi de filamento duplo de alfa-ENac | Dose OP única no dia 1 (ADO4835) conjugado com o ligante tridentado da integrina avp6 de estrutura 5.2, formulado em solução salina isotônica 0,5 mg/kg de agente de RNAi de filamento duplo de alfa-ENac | Dose OP única no dia 1 (ADO4835) conjugado com o ligante tridentado da integrina aovp6 de estrutura 6, formulado em solução salina isotônica 0,5 mg/kg de agente de RNAi de filamento duplo de alfa-ENac | Dose OP única no dia 1 (ADO4835) conjugado com o ligante tridentado da integrina avp6 de estrutura 6.1, formulado em solução salina isotônica 7 0,5 mg/kg de agente de RNAi de filamento duplo de alfa-ENac | Dose OP única no dia 1 (ADO4835) conjugado com o ligante tridentado da integrina avp6 de estrutura 6.2, formulado em solução salina isotônica
[0536] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, e incluíam um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremi- dade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. Os respectivos ligantes da integrina avB6 foram então conjugados aos agentes de RNAi via um cadafalso triden- tado que incluía um ligante cisteína-n-etil-maleimida. Para os conjuga- dos agente de RNAi-ligante da integrina avB6 do Exemplo 5, o agente de RNAi assim como as estruturas cadafalso/ligante, foram consisten- tes para cada um dos grupos 2- 7. Portanto, a única variável para os grupos 2 a 7 foi o ligante da integrina avB6 específico (cada um na forma tridentada) que foi usado. Os conjugados agente de RNAi- ligante da integrina avB6 do Exemplo 5 tinham as estruturas repre- sentadas a seguir: mo x
C Y canta PIA, " av06 Iganto AL onde NAN representa o agente de RNAi, e "Ligante avb6" repre- senta a estrutura do respectivo ligante. A estrutura do agente de RNAi usados neste Exemplo (ADO04835) estão apresentadas no Exemplo 4, acima.
[0537] Cinco (5) ratos foram medicados em cada grupo (n=5). Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expres- são de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantita- tiva à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e ex- pressa como fração do grupo com veículo de controle (média geomé- trica, intervalo de confiança +/- 95%).
Tabela 4. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 5.
Grupo ID Expressão média rela- | Baixa (erro) | Alta (erro) A neem o [O Grupo 2 (agente de RNAi-Cys-(n-etil-1- | 0,543 0,114 0,145 Mal)-PEG-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 2)
Grupo 3 (agente de RNAi-Cys-(n-etil-1- | 0,541 0,138 0,185 Mal)-PEG;-ligante tridentado da integrina avpB6 Estrutura 5.1) Grupo 4 (agente de RNAI-Cys-(n-etil-1- | 0,522 0,151 0,212 Mal)-PEG;-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 5.2) Grupo 5 (agente de RNAi-Cys-(n-etil-1- | 0,399 0,108 0,148 Mal)-PEG;-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 6) Grupo 6 (agente de RNAi-Cys-(n-etil-1- | 0,351 0,100 0,139 Mal)-PEG;z-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 6.1) Grupo 7 (agente de RNAi-Cys-(n-etil-1- | 0,568 0,061 0,068 Mal)-PEG;-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 6.2)
[0538] Como mostrado na Tabela 4 acima, cada um dos agentes de alfa-ENaC RNAi apresentou uma redução da expressão de MRNA nos ratos em comparação com o controle. Por exemplo, o grupo 6 (ADO04835-tridentada-Estrutura 6.1) mostrou uma redução de aproxi- madamente 65% de (0,351) na expressão média de rENaC mRNA em comparação com o controle; o grupo 2 (ADO4835-tridentada-Estrutura 2) mostrou uma redução de aproximadamente 46% de (0,543) na ex- pressão média de rENaC mRNA em comparação com o controle; e o grupo 4 (ADO04835- tridentada-Estrutura 5.2) mostrou uma redução de aproximadamente 48% de (0,522) na expressão média de rENaC MRNA em comparação com o controle. Exemplo 6. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integrina avB6.
[0539] No dia 1 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguintes grupos de dosagem:
Tabela 5. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 6. Solução salina isotônica (sem agente de RNAi) Dose OP única no dia 1 2 0,5 mg/kg de agente de RNAi de filamento duplo de alfa-ENac | Dose OP única no dia 1 (ADO5347), conjugado a um ligante tridentado da integrina avp6 de estrutura 2 que inclui um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 3 0,5 mg/kg de agente de RNAi de filamento duplo de alfa-ENac | Dose OP única no dia 1 (ADOS453), conjugado a um ligante tridentado da integrina avf6 de estrutura 2 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 4 0,5 mg/kg de agente de RNAi de filamento duplo de alfa-ENac | Dose OP única no dia 1 (ADOS453), conjugado a um ligante tridentado da integrina avp6 de estrutura 6 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 0,5 mg/kg de agente de RNAi de filamento duplo de alfa-ENac | Dose OP única no dia 1 (ADOS453), conjugado a um ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 6.1 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 0,5 mg/kg de agente de RNAi de filamento duplo de alfa-ENac | Dose OP única no dia 1 ((ADO5453), conjugado a um ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 7 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica
[0540] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, e incluíam um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremi- dade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. Os agentes de RNAi usados neste Exemplo eram constituídos de nucleotídeos modificaqdos e mais de uma liga- ção não-fosfodiéster, e incluíam as seguintes sequências de nucleotí- deos: ADO5347: Sequência do filamento sentido (5' — 3'):
(NH2-C6)cscugugcaAfCfCfagaacaaauas(invAb) (SEQ ID NO:3) Sequência do filamento antissentido (5' — 3') cPrpusAfsusUfuGfuUfcUfgGfuUufgCfaCfaGfsc (SEQ ID NO:2), and ADO5453: Sequência do filamento sentido (5' — 3'): (NH2-C6)cscugugcaAfCfCfagaacaaauas(invAb) (SEQ ID NO: 3) Sequência do filamento antissentido (5' — 3') usAfsusUfuGfuUfcUfgGfuU—ufgCfaCfaGfsg (SEQ ID NO:4), onde (invAb) representa um desoxirribonucleotídeo abásico invertido (ligado 3'-3'); s representa uma ligação fosforotioato; a, c, 9, e u repre- sentam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina, ou uridina, respecti- vamente; Af, Cf, Gf, e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina, ou uridina, respectivamente; cPrpu representa uma 5'- ciclopropil fosfonato-2'-O-metil uridina (vide, por exemplo, Tabela A); e (NH2-C6) representa uma C6 amina terminal para facilitar a conjuga- ção do ligante vetorizado conforme desejado (vide, por exemplo, Tabe- la A).
[0541] Para os grupos 2, 3, 4, 5, e 6, os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjugados aos agentes de RNAi via uma estru- tura cadafalso/ligante tridentada que incluía um ligante glutárico (via adiçãoa de ácido glutárico), como representado na estrutura 300a a seguir: avbsligand, ig: v o f | —
R AA avbsliganc N beto: oo NY x “ pao q sega
(Estrutura 300a), onde RV jepresenta o agente de RNAi, e "Li- gante avb6" representa a estrutura do respectivo ligante.
[0542] Para os grupos 7 e 8, os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjugados aos agentes de RNAi via uma estrutura triden- tada cadafalso/ligante tendo a estrutura representada na Estrutura 330a: ae Lara,
EX DARDO, o o, AN. : O same ADI VIOAA avb6 Ligando ê CEA) tmn o
O avos tias NASL e (Estrutura 330a), onde ARO representa o agente de RNAi, e "Li- gante avb6" representa a estrutura do respectivo ligante.
[0543] Quatro (4) ratos foram medicados nos grupos 1, 3,4,6,e7 (n=4); cinco (5) ratos foram medicados nos grupos 5 e 8 (n=5); e três (3) ratos foram medicados no grupo 2 (n=3). Os ratos foram sacrifica- dos no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expressão de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de son- da, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média geométrica, intervalo de con- fiança +/- 95%).
Tabela 6. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 6. Grupo ID Número de | Expressão média | Baixa (erro) Alta (erro) animais (n =) relativa de rENaC mMRNA Grupo 1 (solução salina | 4 0,137 0,159 isotônica) Grupo 2 (0,5 mg/kg de|3 0,468 0,090 0,110 ADO5347-glutárico-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 2) Grupo 3 (0,5 mglkg de |4 0,615 0,066 0,074 ADO5347-glutárico-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 2) Grupo 4 (0,5 mg/kg de|4 0,512 0,119 0,156 ADO5347 glutárico-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 6) Grupo 5 (0,5 mg/kg de|5 0,494 0,101 0,127 ADO5347-glutárico-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 6.1) Grupo 6 (0,5 mglkg de [4 0,743 0,104 0,121 ADO5347-glutárico-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 7)
[0544] Como mostrado na Tabela 6 acima, cada um dos agentes de alfa-ENaC RNAi apresentou uma redução da expressão de MRNA nos ratos em comparação com o controle. Por exemplo, o grupo 5 (ADOS5453-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 6.1) mostrou uma redução de aproximadamente 51% de (0,494) na expressão mé- dia de rENaC mRNA em comparação com o controle, e o grupo 3 (ADO5453-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 2) mostrou uma redução de aproximadamente 38% de (0,615) na expressão mé- dia de rENaC mRNA em comparação com o controle. Além disso, o grupo 5 (que incluía o ligante da integrina avB6 Estrutura 6.1) apresen- tou melhora em relação ao grupo 6 (que incluía o ligante da integrina avB6 Estrutura 7), indicando uma dependência da quiralidade de (s), como verificado na Estrutura 6.1, em relação a (r) como verificado na Estrutura 7, para os ligantes da integrina avB6. Exemplo 7. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integrina avB6.
[0545] No dia 1 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguintes grupos de dosagem: Tabela 7. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 7. Solução salina isotônica (sem agente de RNAi) 2 0,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADOS5347 conjugado | Dose OP única no dia 1 a um ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 2 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura represen- tada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 3 0,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADOS5347 conjugado | Dose OP única no dia 1 a um ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 6.1 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura represen- tada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 4 0,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADOS453 conjugado | Dose OP única no dia 1 a um ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 2 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura represen- tada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 0,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO5453 conjugado | Dose OP única no dia 1 a um ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 9 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura represen- tada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 6 0,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADOS453 conjugado | Dose OP única no dia 1 a um ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 6 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura represen- tada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 7 0,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADOS453 conjugado | Dose OP única no dia 1 a um ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 8 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura represen- tada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica [EB 0,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADOS453 conjugado a um ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 6.1 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura represen- tada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 0,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADOS453 conjugado | Dose OP única no dia 1 a um ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 10 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura represen- tada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 0,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADOS453 conjugado | Dose OP única no dia 1 a um ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 11 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura represen- tada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica nn 0,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADOS453 conjugado | Dose OP única no dia 1 a um ligante tridentado à base de peptídio vetorizado para células epiteliais via a ligação amina (NH2-Cs) na extermidade 5”-terminal do filamento sentido que incluída ainda uma porção PEG de 20 Kkilodalton (kDa), formulado em solução salina isotônica
[0546] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, e incluíam um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremi- dade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleotídeos para os agentes de RNAi usados neste Exemplo estão apresentadas no Exemplo 6, acima. Para os grupos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, e 10, os res- pectivos ligantes da integrina avB6 foram conjugados aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridentada que incluía um li- gante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima. Para o grupo 11, os ligantes vetorizados para células epiteli- ais eram constituídos de peptídios miméticos de RGD que sabidamen- te se ligam a integrina avB6 e incluíam uma porção PEG de 20 kDa como um modulador da farmacocinética (PK).
[0547] Quatro (4) ratos foram medicados em cada grupo (n=4). Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expres- são de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantita-
tiva à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e ex- pressa como fração do grupo com veículo de controle (média geomé- trica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 8. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 7. Grupo ID Expressão média rela- | Baixa (erro) Alta (erro)
E Grupo 2 (0,5 mg/kg de ADO5347-glutárico- | 0,469 0,129 ligante tridentado da integrina avB6 Estru- tura 2) Grupo 3 (0,5 mg/kg de ADO5347-glutárico- | 0,358 0,078 0,100 ligante tridentado da integrina avB6 Estru- tura 6.1) Grupo 4 (0,5 mg/kg de ADO5453-glutárico- | 0,562 0,562 0,102 ligante tridentado da integrina avB6 Estru- tura 2) Grupo 5 (0,5 mg/kg de ADO5453-glutárico- | 0,620 0,620 0,230 ligante tridentado da integrina avB6 Estru- tura 9) Grupo 6 (0,5 mg/kg de ADOS453-glutárico- | 0,559 0,559 0,120 ligante tridentado da integrina avB6 Estru- tura 6) Grupo 7 (0,5 mg/kg de ADOS453-glutárico- | 0,691 0,691 0,081 ligante tridentado da integrina avB6 Estru- tura 8) Grupo 8 (0,5 mg/kg de ADO5S453-glutárico- | 0,454 0,454 0,063 ligante tridentado da integrina avB6 Estru- tura 6.1) Grupo 9 (0,5 mg/kg de ADO5453-glutárico- | 0,454 0,454 0,097 ligante tridentado da integrina avB6 Estru- tura 10) Grupo 10 (05 mg/kg de ADOS453- | 0,577 0,557 0,140 glutárico-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 11) Grupo 11 (0,5 mg/kg de ADOS453-ligante | 0,558 0,057 0,064 tridentado à base de peptídio vetorizado para células epiteliais-PEG de 20 kDa)
[0548] Como mostrado na Tabela 8 acima, cada um dos agentes de alfa-ENaC RNAi apresentou uma redução da expressão de MRNA nos ratos em comparação com o controle. Por exemplo, o grupo 3 (ADO5347 -glutárico-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 6.1) mostrou uma redução de aproximadamente 64% de (0,358) na ex- pressão média de rENaC mRNA em comparação com o controle, e o grupo 8 (ADO5453-glutárico-ligante tridentado da integrina avB6 Estru- tura 6.1) mostrou uma redução de aproximadamente 55% de (0,454) na expressão média de rENaC mRNA em comparação com o controle. Além disso, todos os ligantes da integrina avB6 no Exemplo 7 (isto é, Estrutura 2, Estrutura 6, Estrutura 6.1, Estrutura 8, Estrutura 9, Estrutu- ra 10, e Estrutura 11) apresentaram níveis de nocaute equiparáveis para o ligante tridentado vetorizado para células epiteliais à base de peptídio que incluía ainda uma porção PEG de 20 Kkilodalton relativa- mente volumosa para melhorar o efeito farmacocinético do grupo 11. Exemplo 8. Administração intratraqueal in vivo de agentes de RNAi vetorizados para AlIfa-ENaC conjugado a ligantes da integri- na avB6 em ratos
[0549] No dia 1 e no dia 2 do estudo, ratos Sprague-Dawley ma- chos receberam uma dose de 200 microlitros por via intratraqueal por meio de um dispositivo microborrifador (Penn Century, Philadelphia, PA), que incluiu os seguintes grupos de dosagem: Tabela 9. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 8. 1 Solução salina isotônica (sem agente de RNAi) dose IT no dia 1 e no dia 2 2 1,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante monodentato à base de peptídio vetorizado para células epite- liais via a ligação amina (NHz-Cs) na extremidade 5' terminal do fila- mento sentido que incluía ainda uma porção PEG de 20 kilodalton (KDa), um ligante cisteína, e um ligante peptídico FCFP, formulado em solução salina isotônica 3 0,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 1 que incluía um ligante cisteína (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 331a), formulado em solução salina isotônica 4 1,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 1 que incluía um ligante cisteína (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura
EFE Fa rar O 1,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 1 que incluía um ligante cisteína-n-etil-maleimida (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 330a), formulado em solução salina isotônica 6 1,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante tridentado à base de peptídio vetorizado para células epiteliais via a ligação amina (NH>Cs) na extremidade 5' terminal do filamento sentido que incluía ainda uma porção PEG de 20 kDa e um ligante cisteína, formulado em solução salina isotônica 7 1,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 1 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 330a), formulado em solução salina isotônica
[0550] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, e incluíam um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremi- dade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleotídeos para os agentes de RNAi usados neste Exemplo estão apresentadas no Exemplo 4, acima.
[0551] Para os grupos 3 e 4, o ligante da integrina avB6 de Estru- tura 1 foi conjugado aos agentes de RNAi via uma estrutura tridentada cadafalso e ligante que incluía um ligante cisteína representado na se- guinte Estrutura 331a: an Ligana
S
S ' o as Ligara K á ss o o e É E o N=n + aos Lens PAL (Estrutura 331a), onde NV representa o agente de RNAi, e "Li- gante avb6" representa a estrutura do respectivo ligante.
[0552] Para o grupo 5, os ligantes da integrina avB6 foram conjugados aos agentes de RNAi via uma estrutura tridentada cadafalso e ligante que incluía um ligante cisteína-n-etil-maleimida representado na Estru- tura 330a, mostrado no Exemplo 6, acima. Para o grupo 7, os ligantes da integrina avB6 foram conjugados aos agentes de RNAi via uma es- trutura tridentada cadafalso e ligante que incluía um ligante ácido glu- tárico representado na Estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima. Para os grupos 2 e 6, os ligantes vetorizado para células epiteliais à base de peptídio eram constituídos de peptídios miméticos de RGD e incluíam um porção PEG de 20kDa como um modulador da farmaco- cinética (PK).
[0553] O mesmo agente de alfa-ENaC RNAi foi usado em cada um dos grupos 2 a 7.
[0554] Cinco (5) ratos foram medicados em cada um dos grupos 1, 2, 3, 4, 5, e 6 (n=5), e quatro (4) ratos foram medicados no grupo 7 (n=4). Os ratos foram sacrificados no dia 8 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expressão de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média ge- ométrica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 10. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 8) no Exemplo 8.
Grupo ID Expressão média relati- | Baixa (erro) | Alta (erro) va de rENaC mRNA Grupo 2 (1,5 mg/kg de ADO4835-Cys-FCFP-ligante | 0,354 0,078 0,100 monodentado à base de peptídio-PEG20kDa) Grupo 3 (0,5 mg/kg de ADO4835-Cys-ligante triden- | 0,695 0,215 0,312 tado da integrina avB6 Estrutura 1) Grupo 4 (1,5 mg/kg de ADO04835-Cys-ligante triden- | 0,438 0,077 0,093 tado da integrina avB6 Estrutura 1) Grupo 5 (1,5 mg/kg de ADO4835-Cys-(n-etil-Mal- | 0,349 0,083 0,108 ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 1)
ligante a base de peptídeo tridentado da integrina avB6) Grupo 7 (1,5 mg/kg de ADO4835-glutárico-ligante | 0,648 0,184 0,256 tridentado da integrina avB6 Estrutura 1)
[0555] Como mostrado na Tabela 10 acima, cada um dos agentes de alfa-ENaC RNAi apresentou uma redução da expressão de MRNA nos ratos em comparação com o controle. Por exemplo, o grupo 5 (compreendendo ADO4835-Cys-(n-etil-Mal)-ligante tridentado da inte- grina avB6 Estrutura 1) mostrou uma redução de aproximadamente 65% de (0,358) na expressão média de rENaC mRNA em comparação com o controle, que foi equiparável ao nível de nocaute atingido no grupo 2, que tinha um ligante vetorizado para células epiteliais à base de peptídio que também incluía uma porção PEG de 20 kDa como um modulador da farmacocinética. Exemplo 9. Administração intratraqueal in vivo de agentes de RNAi vetorizados para AlIfa-ENaC conjugado a ligantes da integri- na avB6 em ratos
[0556] No dia 1 e no dia 2 do estudo, ratos Sprague-Dawley ma- chos receberam uma dose de 200 microlitros por via intratraqueal por meio de um dispositivo microborrifador (Penn Century, Philadelphia, PA), que incluiu os seguintes grupos de dosagem: Tabela 11. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 9. 1 Solução salina isotônica (sem agente de RNAi) dose IT no dia 1 e no dia 2 2 1,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante tridentato da integrina avB6 de estrutura 1 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 3 1,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 2 que incluía um ligante glutárico (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 300a), formulado em solução salina isotônica 1,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 enodia2 ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 2 que incluía um ligante cisteína (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 331a), formulado em solução salina isotônica
[0557] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, e incluíam um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremi- dade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleotídeos para os agentes de RNAi usados neste Exemplo estão apresentadas no Exemplo 4, acima. Para os grupos 2 e 3, os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjugados aos agentes de RNAi via uma estru- tura cadafalso/ligante tridentada que incluía um ligante glutárico repre- sentado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima. Para o grupo 6 os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjugados aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridentada que incluía um ligante cisteína representado na estrutura 331a, mos- trado no Exemplo 8, acima.
[0558] O mesmo agente de alfa-ENaC RNAi foi usado em cada um dos grupos 2 a 8. Cinco (5) ratos foram medicados no grupo 1 (n=5), e quatro (4) ratos foram medicados em cada um dos grupos 2 e 3 (n=4). Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A ex- pressão de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média ge- ométrica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 12. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 9. Grupo ID Expressão média relativa | Baixa (erro) Alta (erro) A [eme o o [O Grupo 2 (1,5 mg/kg de ADO4835-glutárico-ligante | 0,545 0,121 0,156 tridentado da integrina avB6 Estrutura 1) Grupo 3 (1,5 mg/kg de ADO4835-glutárico-ligante | 0,483 0,038 0,041 tridentado da integrina avB6 Estrutura 2) Grupo 6 (1,5 mg/kg de ADO4835-Cys-ligante | 0,237 0,125 0,267 tridentado da integrina avB6 Estrutura 2)
[0559] Como mostrado na Tabela 12 acima, cada um dos agentes de alfa-ENaC RNAi apresentou uma redução da expressão de MRNA nos ratos em comparação com o controle. Por exemplo, o grupo 3 (agente de RNAi-glutárico-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutu- ra 2) mostrou uma redução de aproximadamente 52% de (0,483) na expressão média de rENaC mRNA em comparação com o controle, e o grupo 6 (agente de RNAi-Cys-ligante tridentado da integrina avB6 Estrutura 2) mostrou uma redução de aproximadamente 76% de (0,237) na expressão média de rENaC mRNA em comparação com o controle. Exemplo 10. Administração intratraqueal in vivo de agentes de RNAi vetorizados para Alfa-ENaC conjugado a ligantes da integri- na avB6 em ratos.
[0560] No dia 1 e no dia 2 do estudo 2, ratos Sprague-Dawley ma- chos foram medicados com uma dose de 200 microlitros por via intra- traqueal por meio de um dispositivo microborrifador (Penn Century, Philadelphia, PA), que incluíam os seguintes grupos de dosagem:
[0561] Tabela 13. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 10. 2 1,0 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante monodentato à base de peptídio vetorizado para células epiteliais via a ligação amina (NHz-Cs) na extremidade 5' terminal do filamento sentido que incluía ainda uma porção PEG de 20 kDa, um ligante cisteína, e um ligante peptídico FCFP, formulado em solução salina isotônica 3 1,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 1 que incluía um ligante cisteína (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 331a), formulado em solução salina isotônica 4 1,5 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO4835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 2 que incluía um ligante cisteína (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 331a), formulado em solução salina isotônica 1,0 mg/kg de agente de alfa-ENac RNAi ADO04835 conjugado a um | dose IT no dia 1 e no dia 2 ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 2 que incluía um ligante cisteína (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 331a), formulado em solução salina isotônica [é ss mota de soe de ate-ENSe RNA ADOGESS conjugado a um | dose ro dia Temo da?
ligante cisteína (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 331a), formulado em solução salina isotônica ligante tridentado da integrina avB6 de estrutura 2 que incluía um ligante cisteina (isto é, tendo a estrutura representada na estrutura 331a), formulado em solução salina isotônica
[0562] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, e incluíam um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremi- dade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleotídeos para os agentes de RNAi usados neste Exemplo estão apresentadas no Exemplo 4, acima. Para os grupos 3, 4, 5, e 6, os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjugados aos agentes de RNAi via uma es- trutura cadafalso/ligante tridentada que incluía um ligante cisteína re- presentado na estrutura 331a, mostrado no Exemplo 8, acima. Para o grupo 2, os ligantes vetorizados eram constituídos de peptídios mimé- ticos de RGD e incluíam uma porçãp PEG de 20kDa PEG como um modulador da farmacocinética (PK) e um ligante do peptídio FCFP.
[0563] O mesmo agente de alfa-ENaC RNAi foi usado em cada um dos grupos 2 a 7.
[0564] Cinco (5) ratos foram medicados em cada grupo (n=5). Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expres- são de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por POR quantita- tiva à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e ex- pressa como fração do grupo com veículo de controle (média geomé- trica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 14. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 8) no Exemplo 10.
de rENaC mRNA
Grupo 2 (1,0 mg/kg de ADO4835-Cys-PEG20kDa- | 0,531 0,132 0,175 FCFP-ligante à base de peptídio vetorizado para células epiteliais) Grupo 3 (1,5 mg/kg de ADO4835-Cys-ligante | 0,451 0,156 0,238 tridentado da integrina avB6 Estrutura 1) Grupo 4 (1,5 mg/kg de ADO4835-Cys-ligante | 0,418 0,077 0,094 tridentado da integrina avB6 Estrutura 2) Grupo 5 (1,0 mg/kg de ADO48035-Cys-ligante | 0,436 0,043 0,048 tridentado da integrina avB6 Estrutura 2) Grupo 6 (0,5 mg/kg de ADO4835-Cys-ligante | 0,537 0,049 0,054 tridentado da integrina avB6 estrutura 2) Grupo 7 (0,1 mg/kg de ADO4835-Cys-ligante | 0,616 0,069 0,078 tridentado da integrina avB6 Estrutura 2) Como mostrado na Tabela 14 acima, cada um dos agentes de alfa- ENaC RNAi apresentou uma redução da expressão de mMRNA nos ra- tos em comparação com o controle. Notavelmente, o grupo 5 (1,0 mg/kg ADO04835-Cys-ligante tridentado da integrina avB6 estrutura 2) mostrou um nível numericamente superior de inibição da expressão de alfa-ENaC em comparação com o grupo 2 (1,0 mg/kg de ligante vetori- zado para células epiteliais à base do peptídio ADO4835-Cys- PEG20kDa-FCFP-PEG?20), apesar de não incluir uma porção grande de PEG de 20 Kkilodalton como um modulador da farmacocinética (Grupo 5 = aproximadamente 56% de nocaute (0,436); Grupo 2 = aproximadamente 47% de nocaute (0,531)). Exemplo 11. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integrina avB6.
[0565] No dia 1, dia 2 e dia 3 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguintes grupos de dosagem: Tabela 15. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 11. 1 Solução salina isotônica (sem agente de RNAi) dose OP administrada em cada um dos dias 1,2e3 2 0,01 mg/kg de ADO5S453 (“agente de RNAi nu”), formulado em | dose OP administrada em cada um solução salina isotônica dos dias 1,2e3
3 0,05 mg/kg de ADO5453 (“agente de RNAi nu”), formulado em | dose OP administrada em cada um solução salina isotônica dos dias 1,2e3 4 0,15 mg/kg de ADOS453 (“agente de RNAi nu”), formulado em | dose OP administrada em cada um solução salina isotônica dos dias 1,2e3 0,50 mg/kg de ADO5S453 (“agente de RNAi nu”), formulado em | dose OP administrada em cada um solução salina isotônica dos dias 1,2e3 0,01 mg/kg de ADOS453 conjugado a um ligante tridentado da | dose OP administrada em cada um integrina avB6 de Estrutura 6.1, formulado em solução salina | dos dias 1,2e3 isotônica 7 0,05 mg/kg de ADOS453 conjugado a um ligante tridentado da | dose OP administrada em cada um integrina avB6 de Estrutura 6.1, formulado em solução salina | dos dias 1,2e3 isotônica 0,15 mg/kg de ADOS453 conjugado a um ligante tridentado da | dose OP administrada em cada um integrina avB6 de Estrutura 6.1, formulado em solução salina | dos dias 1,2e3 isotônica 0,50 mg/kg de ADOS453 conjugado a um ligante tridentado da | dose OP administrada em cada um integrina avB6 de Estrutura 6.1, formulado em solução salina | dos dias 1,2e3 isotônica
[0566] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, e incluíam um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremi- dade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleotídeos para os agentes de RNAi usados neste Exemplo estão apresentadas no Exemplo 6, acima. Os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjugados aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridentada que incluía um ligante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0567] Cinco (5) ratos foram medicados em cada um dos grupos 1, 3,4, 5,8, e 9 (n=5), e seis (6) ratos foram medicados nos grupos 2, 6, e 7 (n=6). Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneiza- ção. A expressão de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média geométrica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 16. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 11. Grupo ID Expressão média relati- | Baixa (erro) | Alta (erro) va de rENaC mRNA Grupo 2 (0,01 mg/kg de ADO5347 (nu)) 1,016 Grupo 3 (0,05 mg/kg de ADO5347 (nu)) 0,881 0,157 Grupo 4 (0,15 mg/kg de ADOS347 (nu)) 0,638 0,179 Grupo 5 (0,50 mg/kg de ADO5347 (nu)) 0,354 Grupo 6 (0,01 mg/kg de ADOS453-glutárico-ligante — 0,646 0,058 0,063 tridentado da integrina avB6 estrutura 6.1) Grupo 7 (0,5 mg/kg de ADO5453-glutárico-ligante triden- | 0,432 0,044 0,049 tado da integrina avB6 estrutura 6.1) Grupo 8 (0,15 mg/kg de ADOS453-glutárico-ligante | 0,319 0,034 0,038 tridentado da integrina avB6 estrutura 6.1) Grupo 9 (0,50 mg/kg de ADOS5453-glutárico-ligante | 0,254 0,043 0,052 tridentado da integrina avB6 estrutura 6.1)
[0568] Como mostrado na Tabela 16 acima, cada um dos agentes de alfa-ENaC RNAi conjugados ao ligante da integrina avB6 tendo a estrutura 6.1 (na forma tridentada) apresentou uma redução da ex- pressão de mRNA nos ratos em comparação com o controle. Além disso, em cada nível de dosagem, os agentes de alfa-ENaC RNAi con- jugados ao ligante da integrina avB6 tendo a estrutura 6.1 tiveram me- lhor desempenho que os agentes de alfa-ENaC RNAi administrados nus, mostrando um efeito de ligante na distribuição do agente de RNAi, (por exemplo, comparar os grupos 2 e 6; os grupos 3 e 7; os grupos 4 e8;eosgrupos 5 e 9).
Exemplo 12. Atividade da ligação de ligantes da integrina avB6 adicionais.
[0569] Como apresentado na Tabela 17 a seguir, dados de ligação adicionais na IC50 foram obtidos para os ligantes da integrina avB6 de es- truturas 2, 6,1, 7, e 23 usados em determinados Exemplos deste pedido: Tabela 17. Atividade de ligação na IC50.
Grupo 1C50 (nM) avp6 Estrutura 6.1 1,6
[0570] Estruturas funcionalizadas com azida (isto é, estruturas 2b e 6,1b, 7b, e 23b) foram examinadas quanto à IC50 em condições tipi- camente usadas e conhecidas no estado da técnica. Como mostrado na Tabela 17, acima, a estrutura 6.1 apresentou potente atividade de ligação à integrina avB6 (IC50 = 1,6 nM). Exemplo 13. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integrina avB6.
[0571] No dia 1 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguintes grupos de dosagem: Tabela 18. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 13.
de estrutura 1) de estrutura 2) de estrutura 5)
[0572] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, e e aqueles incluindo o dúplex ADO5347 incluíam um grupo reativo ami- na funcionalizada (NH2-C6) na extremidade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleotídeos para o agente de RNAi ADO05347 estão apresentadas no Exemplo 6, acima. Os respectivos ligantes da integri- na avB6 foram conjugados aos agentes de RNAi via uma estrutura ca- dafalso/ligante tridentada que incluía um ligante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0573] Cinco (5) ratos foram medicados em cada grupo (n=5). Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expres-
são de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantita- tiva à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e ex- pressa como fração do grupo com veículo de controle (média geomé- trica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 19. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 13. Grupo ID Expressão média relati- | Baixa (erro) | Alta (erro) va de rENaC mRNA Grupo 5 (0,5 mg/kg de ADO5347 ligante tridentado da | 0,449 0,088 0,109 integrina avB6 de estrutura 1) Grupo 6 (0,5 mg/kg de de ADO5347 ligante tridentado da — 0,487 0,049 0,055 integrina avB6 de estrutura 2) Grupo 7 (0,5 mg/kg de ADO5347 ligante tridentado da | 0,715 0,078 0,087 integrina avB6 de estrutura 5) Exemplo 14. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integrina avB6.
[0574] No dia 1 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguintes grupos de dosagem: Tabela 20. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 14. 7 Solução salina isotônica (sem agente de RNAI) 2 (0,5 mg/kg de ADO5347- ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 2) 3 (0,5 mg/kg de ADO5347- ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 6.1) 4 (0,5 mg/kg de ADO5347- ligante tridentado da integrina avp6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 6.3) (0,5 mg/kg de ADO5347- ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 6.4)
[0575] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, e those including the ADO5347 e ADOS5453 duplex incluíam um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremidade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleotídeos para os agentes de RNAi usados neste Exemplo estão apresentadas no Exemplo 6, acima. Os respecti- vos ligantes da integrina avB6 foram conjugados aos agentes de RNAi via a tri dentada scaffold/linker estrutura that included um ligante glutá- rico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0576] Quatro (4) ratos foram medicados em cada grupo (n=4). Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expres- são de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantita- tiva à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e ex- pressa como fração do grupo com veículo de controle (média geomé- trica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 21. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 14.
Grupo ID Expressão média relati- | Baixa (erro) | Alta (erro) va de rENaC mRNA [SRS Too SEER o en Grupo 2 (0,5 mg/kg de ADO5347-ligante tridentado da | 0,481 0,051 0,058 integrina avB6 de estrutura 2) Grupo 3 (0,5 mg/kg de de ADO5347-ligante tridentado | 0,472 0,071 0,084 da integrina avpB6 de estrutura 6,1) Grupo 4 (0,5 mg/kg de ADO5347-ligante tridentado da | 0,534 0,059 0,066 integrina avB6 de estrutura 6.3) Grupo 5 (0,5 mg/kg de ADO5347-ligante tridentado da | 0,620 0,127 integrina avB6 de estrutura 6.4) Exemplo 15. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agen- tes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integri- na avp6.
[0577] No dia 1 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguintes grupos de dosagem: Tabela 22. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 15.
4 (0,5 mg/kg de ADO5453-ligante tridentado da integrina avp6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 6.1) 9 (0,5 mg/kg de ADOS453-ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 2) n (0,5 mg/kg de ADOS453-ligante tridentado da integrina avpB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 12) 12 (0,5 mg/kg de ADO5453-ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 13)
[0578] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, os agentes de RNAi incluindo um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremidade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleo- tídeos para o agente de RNAi ADO5453 estão apresentadas no Exem- plo 6, acima. Os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjuga- dos aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridenta- da que incluía um ligante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0579] Quatro (4) ratos foram medicados em cada um dos grupos 1-9 e 12 (n=4). Três (3) ratos foram medicados nos grupos 10 e 11 (n=3). Os ratos foram sacrificados no dia 7 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expressão de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média ge- ométrica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 23. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 7) no Exemplo 15. Grupo ID Expressão média relati- | Baixa (erro) | Alta (erro) va de rENaC mRNA Grupo 1 (solução salina isotônica) 1,000 0,058 Grupo 4 (0,5 mg/kg de ADOS453-ligante tridentado da | 0,606 0,217 0,338 integrina avB6 de estrutura 6.1)
EEE NO RN ME Grupo 11 (0,5 mg/kg de ADOS453-ligante tridentado da | 0,703 0,093 0,108 integrina avB6 de estrutura 12) Grupo 12 (0,5 mg/kg de ADOS453-ligante tridentado da | 0,711 0,086 0,098 integrina avB6 de estrutura 13) Exemplo 16. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agen- tes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integri- na avB6.
[0580] No dia 1 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguintes grupos de dosagem: Tabela 24. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 16. 7 Solução salina isotônica (sem agente de RNAI) 2 (0,5 mg/kg de ADOS453-ligante tridentado da integrina | Dose OP única administrada no dia 1 avB6 de estrutura 6.1) 3 (0,5 mg/kg de ADOS453-ligante tridentado da integrina | Dose OP única administrada no dia 1 avp6 de estrutura 14) 4 (0,5 mg/kg de ADOS453-ligante tridentado da integrina | Dose OP única administrada no dia 1 avp6 de estrutura 15)
[0581] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, os agentes de RNAi incluindo um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremidade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleo- tídeos para o agente de RNAi ADO5453 estão apresentadas no Exem- plo 6, acima. Os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjuga- dos aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridenta- da que incluía um ligante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0582] Quatro (4) ratos foram medicados em cada grupo. Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de am- bos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expressão de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média geométrica, in- tervalo de confiança +/- 95%). Tabela 25. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 16. Grupo ID Expressão média relati- | Baixa (erro) | Alta (erro) va de rENaC mRNA Grupo 1 (solução salina isotônica) 1,000 Grupo 2 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da | 0,597 0,163 0,224 integrina avB6 de estrutura 6.1) Grupo 3 (0,5 mg/kg de de ADOS453 ligante tridentado | 0,674 0,115 0,139 da integrina avB6 de estrutura 14) Grupo 4 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da | 0,533 0,047 0,052 integrina avB6 de estrutura 15) Exemplo 17. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agen- tes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integri- na avB6.
[0583] No dia 1 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguintes grupos de dosagem: Tabela 26. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 17. Grupo | Agente de RNAi e dose Regime de dosagem 2 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 6.1) 3 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 16) 4 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 11)
[0584] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, os agentes de RNAi incluindo um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremidade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleo- tídeos para o agente de RNAi ADO5453 estão apresentadas no Exem-
plo 6, acima. Os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjuga- dos aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridenta- da que incluía um ligante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0585] Cinco (5) ratos foram medicados em cada grupo, exceto para o grupo 4, que tinha quatro (4) ratos medicados. Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expressão de alfa- ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média geométrica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 27. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 17.
Grupo ID Expressão média relati- | Baixa (erro) | Alta (erro) va de rENaC mRNA Grupo 1 (solução salina Isotônica) 1,000 Grupo 2 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da | 0,489 0,168 0,257 integrina avpB6 de estrutura 6.1) Grupo 3 (0,5 mg/kg de de ADOS453 ligante tridentado | 0,872 0,104 0,118 da integrina avB6 de estrutura 16) Grupo 4 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da | 0,625 0,126 0,158 integrina avB6 de estrutura 11) Exemplo 18. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integrina avB6.
[0586] No dia 1 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguintes grupos de dosagem: Tabela 28. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 18.
Grupo | Agente de RNAi e dose Regime de dosagem 1 Solução salina isotônica (sem agente de RNAi) Dose OP única administrada no dia 1 2 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 6.1)
3 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 17) 4 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avp6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 15)
[0587] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, os agentes de RNAi incluindo um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremidade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleo- tídeos para o agente de RNAi ADO5453 estão apresentadas no Exem- plo 6, acima. Os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjuga- dos aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridenta- da que incluía um ligante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0588] Quatro (4) ratos foram medicados em cada grupo. Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de am- bos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expressão de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média geométrica, in- tervalo de confiança +/- 95%). Tabela 29. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 18.
Grupo ID Expressão média relati- | Baixa (erro) | Alta (erro) va de rENaC mRNA Grupo 2 (0,5 mg/kg de ADOSA453 ligante tridentado da | 0,622 0,035 0,037 integrina avB6 de estrutura 6.1) Grupo 3 (0,5 mg/kg de de ADO5453 ligante tridentado da | 0,818 0,101 0,116 integrina avB6 de estrutura 17) Grupo 4 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da | 0,628 0,101 0,120 integrina avB6 de estrutura 15) Exemplo 19. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integrina avB6.
[0589] No dia 1 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguintes grupos de dosagem: Tabela 30. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 19. 2 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avpB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 6.1) 3 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 15) 4 (0,5 mg/kg de ADO5S453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 18) (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 19) (0,5 mg/kg de ADOSA453 ligante tridentado da integrina avp6 | Dose OP única administrada no dia 1 de estrutura 20)
[0590] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, os agentes de RNAi incluindo um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremidade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleo- tídeos para o agente de RNAi ADO5453 estão apresentadas no Exem- plo 6, acima. Os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjuga- dos aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridenta- da que incluía um ligante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0591] Quatro (4) ratos foram medicados em cada grupo. Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de am- bos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expressão de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média geométrica, in- tervalo de confiança +/- 95%). Tabela 31. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 19. Grupo ID Expressão média relati- | Baixa (erro) | Alta (erro) va de rENaC mRNA Grupo 2 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da | 0,503 0,074 0,086 integrina avB6 de estrutura 6.1) Grupo 3 (0,5 mg/kg de de ADOS453 ligante tridentado | 0,700 0,079 0,089 da integrina avB6 de estrutura 15) Grupo 4 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da | 0,742 0,137 0,169 integrina avB6 de estrutura 18) Grupo 5 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da | 0,837 0,186 0,239 integrina avB6 de estrutura 19) Grupo 6 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da | 0,589 0,078 0,090 integrina avpB6 de estrutura 20) Exemplo 20. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integrina avB6.
[0592] Nos dias 1 e 2 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguin- tes grupos de dosagem: Tabela 32. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 20. 2 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 6.1) 3 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 22) 4 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 23) (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 24) (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 25) 7 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 15)
[0593] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, os agentes de RNAi incluindo um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremidade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleo- tídeos para o agente de RNAi ADO5453 estão apresentadas no Exem- plo 6, acima. Os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjuga- dos aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridenta- da que incluía um ligante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0594] Quatro (4) ratos foram medicados em cada grupo, except para o grupo 1, which had three (3) rats dosed. Os ratos foram sacrifi- cados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pul- mões seguindo-se coleta e homogeneização. A expressão de alfa- ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média geométrica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 33. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 20.
Grupo ID Expressão média relati- | Baixa (erro) | Alta (erro) va de rENaC mRNA Grupo 2 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado | 0,400 0,057 0,066 da integrina avB6 de estrutura 6,1) Grupo 3 (0,5 mg/kg de de ADO5453 ligante tridenta- | 0,483 0,170 0,263 do da integrina avB6 de estrutura 22) Grupo 4 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado | 0,339 0,042 0,048 da integrina avB6 de estrutura 23) Grupo 5 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado | 0,493 0,125 0,168 da integrina avB6 de estrutura 24) Grupo 6 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado | 0,417 0,089 0,113 da integrina avB6 de estrutura 25) Grupo 7 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado | 0,473 0,052 0,058 da integrina avB6 de estrutura 15) Exemplo 21. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integrina avB6.
[0595] Nos dias 1 e 2 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”)
com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguin- tes grupos de dosagem: Tabela 34. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 21. 2 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avB6 de | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 estrutura 6.1) (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avpB6 de | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 estrutura 27)
[0596] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, os agentes de RNAi incluindo um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremidade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleo- tídeos para o agente de RNAi ADO5453 estão apresentadas no Exem- plo 6, acima. Os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjuga- dos aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridenta- da que incluía um ligante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0597] Cinco (5) ratos foram medicados em cada grupo, except group 2, which had six (6) rats dosed. Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de ambos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expressão de alfa-ENaC (SCNN1A) mMRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média geométrica, intervalo de confiança +/- 95%). Tabela 35. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 21. Grupo ID Expressão média relati- | Baixa Alta va de rENaC mRNA (erro) (erro) Grupo 2 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina | 0,380 0,108 0,151 avB6 de estrutura 6.1) Grupo 4 (0,5 mg/kg de de ADO5453 ligante tridentado da integrina | 0,411 0,051 0,058 avB6 de estrutura 27)
Exemplo 22. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligados da integrina avfB6.
[0598] Nos dias 1 e 2 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguin- tes grupos de dosagem: Tabela 36. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 22. Grupo | Agente de RNAi e dose Regime de dosagem 1 Solução salina isotônica (sem agente de RNAi) Dose OP administrada nos dias 1 e 2 2 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 6.1) 3 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 29) 4 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avp6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 30) (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 31) 6 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avg6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 32) 7 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 33)
[0599] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, os agentes de RNAi incluindo um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremidade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleo- tídeos para o agente de RNAi ADO5453 estão apresentadas no Exem- plo 6, acima. Os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjuga- dos aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridenta- da que incluía um ligante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0600] Quatro (4) ratos foram medicados em cada grupo. Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de am- bos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expressão de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média geométrica, in- tervalo de confiança +/- 95%). Tabela 37. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 22. Grupo ID Expressão média relati- | Baixa (erro) | Alta (erro) va de rENaC mRNA Grupo 2 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da | 0,511 0,132 0,178 integrina avB6 de estrutura 6.1) Grupo 3 (0,5 mg/kg de de ADOS453 ligante tridentado da | 0,455 0,024 0,025 integrina avB6 de estrutura 29) Grupo 4 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da | 0,637 0,047 0,050 integrina avB6 de estrutura 30) Grupo 5 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da | 0,505 0,079 0,093 integrina avB6 de estrutura 31) Grupo 6 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da | 0,534 0,135 0,181 integrina avB6 de estrutura 32) Grupo 7 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da | 0,560 0,145 0,196 integrina avB6 de estrutura 33) Exemplo 23. Administração por aspiração orofaríngea in vivo de agentes de RNAi vetorizado para alfa-ENaC conjugada a ligantes da Integrina avB6 em ratos.
[0601] Nos dias 1 e 2 do estudo, ratos Sprague Dawley machos foram medicados via administração por aspiração orofaríngea (“OP”) com 200 microlitros por meio de uma pipeta, de acordo com os seguin- tes grupos de dosagem: Tabela 38. Grupos de dosagem dos ratos no Exemplo 23. 1 Solução salina isotônica (sem agente de RNAi) 2 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 6.1) 3 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avp6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 29) 4 (0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 34) (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 35)
(0,5 mg/kg de ADO5453 ligante tridentado da integrina avg6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 36) 7 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina avB6 | Dose OP administrada nos dias 1 e 2 de estrutura 37)
[0602] Foram sintetizados os agentes de RNAi tendo sequências de nucleotídeos direcionadas para atingir o gene alfa-ENaC humano, os agentes de RNAi incluindo um grupo reativo amina funcionalizada (NH2-C6) na extremidade 5' terminal do filamento sentido para facilitar a conjugação aos ligantes da integrina avB6. As sequências de nucleo- tídeos para o agente de RNAi ADO5453 estão apresentadas no Exem- plo 6, acima. Os respectivos ligantes da integrina avB6 foram conjuga- dos aos agentes de RNAi via uma estrutura cadafalso/ligante tridenta- da que incluía um ligante glutárico representado na estrutura 300a, mostrado no Exemplo 6, acima.
[0603] Quatro (4) ratos foram medicados em cada grupo. Os ratos foram sacrificados no dia 9 do estudo, e RNA total foi isolado de am- bos os pulmões seguindo-se coleta e homogeneização. A expressão de alfa-ENaC (SCNN1A) mRNA foi quantificada por PCR quantitativa à base de sonda, normalizada para expressão de GAPDH e expressa como fração do grupo com veículo de controle (média geométrica, in- tervalo de confiança +/- 95%). Tabela 39. Expressão relativa média de rENaC mRNA no momento do sacrifício (dia 9) no Exemplo 23. Grupo ID Expressão média relativa de | Baixa (erro) Alta (erro) rENaC mRNA Grupo 1 (solução salina isotônica) 1,000 0,117 Grupo 2 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina | 0,368 0,079 0,100 [arm em ee Grupo 3 (0,5 mg/kg de de ADO5453 ligante tridentado da integri- | 0,429 0,033 0,036 na avpB6 de estrutura 29) Grupo 4 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina | 0,465 0,103 0,132 avp6 de estrutura 34) Grupo 5 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina | 0,449 0,053 0,060 avp6 de estrutura 35) Grupo 6 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina | 0,501 0,043 0,047 avp6 de estrutura 36) Grupo 7 (0,5 mg/kg de ADOS453 ligante tridentado da integrina | 0,443 0,049 0,055 avB6 de estrutura 37)
Outras Modalidades
[0604] Deve ficar entendido que embora a invenção tenha sido descrita junto com sua descrição detalhada, a descrição precedente não se destina a ilustrar nem limitar o escopo da invenção, que é defi- nido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vanta- gens, e modificações estão dentro do escopo das reivindicações que se seguem.

Claims (36)

REIVINDICAÇÕES
1. Ligante da integrina avB6, caracterizado peo fato de que compreende a estrutura: Ps) ” n nº (fórmula |) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde, n é um inteiro de 0 a 7; Jé C-H ou N; Z é OR, N(R)2 ou SR'?; R' é H, C1-C6 alquila opcionalmente substituída, OH, CO- OH, CON(R”)2, ORô, ou R' compreende uma molécula de carga, onde cada Rº é independentemente H ou C1-C6 alquila, e Rº é H ou C1-C6 alquila; R?, RP? e RP? são cada um deles independentemente H, ha- lo, cicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, ou hetero- arileno opcionalmente substituído, ou R?à, RP* e RP? podem compreen- der uma molécula de carga; R*º é H ou alquila opcionalmente substituída; R*' é H ou alquila opcionalmente substituída, ou Rº e R' junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um hetero- ciclo opcionalmente substituído; R'? é H ou alquila opcionalmente substituída; cada R'? é independentemente H, alquila opcionalmente substituída, ou R'? compreende uma molécula de carga; R*º é alquila opcionalmente substituída; e onde pelo menos um dentre R', R?, R'?, RP* e RP? compre-
ende uma molécula de carga.
2. Ligante da integrina avB6, caracterizado pelo fato de que compreende a estrutura: Rua A DE OR13 Cr h Ri o x o R2 (fórmula Il) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde, n é um inteiro de O a 7 (isto é, né 0, 1,2, 3,4,5,6,ou7); J é C-H ou N; R' é H, C1I-C6 alquila, CH(Rº(Rº), OH, COOH, CH2CH2CHaNH2, CONHRS, ORº, ou R* compreende uma molécula de carga, onde R? é H ou C1-C6 alquila, Rº é H, C1-C6 alquila, Rº é H ou C1-C6 alquila, e Rº é H ou C1-C6 alquila; R? é cicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opci- onalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, heteroarileno opcionalmente substituído, ou Rº compreende uma mo- lécula de carga, R'*º é H ou alquila opcionalmente substituída; R' é H ou alquila opcionalmente substituída, ou RU e R' junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um hetero- ciclo opcionalmente substituído; R'? é H ou alquila opcionalmente substituída; R'? é H ou alquila opcionalmente substituída; R** é alquila opcionalmente substituída; onde pelo menos um dentre R* ou R2 compreende uma mo- lécula de carga.
3. Ligante da integrina avB6 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a estrutura:
RR (fórmula) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde, n é um inteiro de 1 a 7 (isto é, n é 1, 2, 3,4, 5,6, ou 7); R” inclui uma ou mais moléculas de carga ; e Rº é uma ou mais poções cíclicas divalentes opcionalmente substituídas tendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 átomos de carbono, tal como cicloalquila (por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ou ciclo-heptila), cicloalquenila (por exemplo, ciclopenteni- la, ciclobutenila, ciclopentenila, ciclo-hexenila, ou ciclo-heptenila), arila (por exemplo, fenila), heteroarila (por exemplo, piridila, pirimidinila, pi- ridazinila, pirrol, pirazol, imidazol, tiofeno, benzotiofeno, thiazol, ben- zothiazol|, furan, oxazol, isoxazol, benzofuran, indol, indazol, benzimi- dazol, oxadiazol, 1,2,3- triazol, 1,2,4-triazol, tetrazol, quinolinila, isoqui- nolinila, ou quinoxalinila),) ou heterociíclila (por exemplo, tetra- hidrofurano, tetra-hidropirano, piperidina, pirrolidina, dioxano, ou dioxo- lano).
4. Ligante da integrina avB6 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a estrutura: RÃ Ro
DOMANIRA Y OH ÓXOS qo SÃZ (fórmulalV) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde, n é um inteiro de 1 a 7 (isto é, né 1,2,3,4,5,6,0u7); e
R3 compreende uma ou mais moléculas de carga.
5. Ligante da integrina avB6 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que n é 3.
6. Ligante da integrina avB6 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que né 4.
7. Ligante da integrina avB6, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: Z. O XxX
Õ À NS prega N OH Oo Ô Oo UO (Estrutura 1a),
H o + H NS NA No OH 2N 1 ÔÕ o SU - (Estrutura 2a), O O.
S AA N OH
N N N H N% o Cc! Cc! x (Estrutura 5a),
RA N
DN NOS OH [EN Ns o
O x (Estrutura 6a), x (Estrutura 7a),
Cr Na 2N O Õ O x OO (Estrutura 8a), -.
O (Estrutura 9a),
TO TI | H ZN O Õ Oo x (Estrutura 10a), ” N N OH O O Õ o x (Estrutura 11a), RA A con " N TC Ros o O. x?
N x (Estrutura 12a),
H Q H
NS NANA OH | H 4N O Õ O x (Estrutura 13a),
H P H « Na a OH | H 4N O Õ O
OK
TT É x (Estrutura 14a), H g H
NANA OH | H 4N o Õ Oo QÇ x (Estrutura 15a), “ x (Estrutura 16a),
H 9 H
RR NAN OH | no Ô o
CO 8 x (Estrutura 17a),
RÃ N
RN NONE OH Ls CN. ÔÕ o x (Estrutura 18a), H o H e NA oH | ns o ” O x (Estrutura 19a), H 9 H « AAA oH LN no o
CO O X (Estrutura 20a), H 9 H | RAÇA A OH CO rn e : o x (Estrutura 22a),
fios, N
NS N N N OH 2N Ho Õ o x (Estrutura 24a),
O
O N
SS N N N OH 2N no Ô o x (Estrutura 25a), H 9 H
SS NA OH | na o > x (Estrutura 27a), H vç H
NS NA OH | E o
O x OO (Estrutura 29a),
A N N RN NO Nox | H 4N o O Oo CO (Estrutura 30a),
OH nd, N " N N N OH 4N H Oo O o x (Estrutura 31a),
OH 3 À
H S A os [EN no Ê o x (Estrutura 32a), NH,
H Q H C Ne, N OH 2N no ô o x (Estrutura 33a),
NÃ, N
RN N N OH 2N PP Ô o x (Estrutura 34a),
OH H ç H SS NA, N OH 2N n. Ô o Do (Estrutura 35a), H " H
OC NA ÇA N OH 4N 4 ó Õ o x (Estrutura 36a), e H ç Ds H * NANA OH
E H z O Õ Oo x (Estrutura 37a), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde X compreen-
de uma molécula de carga.
8. Ligante da integrina avB6, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: nn 2 ” Oo Fe | Oo n *y A N oH Oo Ô O CO (Estrutura 1); oO NDA
O H 9 H * NA, N OH 4N H O Õ O CO (Estrutura 2); =
Ô A À N OH
N N N
H NT
O O Cc! Cl
ONO (Estrutura 5);
Qdo Ss OA OH
H H O O Cc! Cl IN ONA (Estrutura 5.1); =
Õ AA N OH
RW
NON N
N NM
O O Cc! Cl ODDS (Estrutura 5.2);
RA N
SS N NONE OH | 8 H 2 Oo Õ O ADD IAN ÇA O (Estrutura 6); H 7 H Dx A OH | H 4N O Õ O RS ING ONA O (Estrutura 6.1);
ln Ã, N RN dl dA OH | x ns o
Í O BOA DADADO (Estrutura 6.2); o, N * N NO OH | 2 o
Í O PN... CO A (Estrutura 6.3); H ç H Ds NAN OH EN E. o
Q
AVN OO EFRON e Lo AÇO (Estrutura 6.4);
FO VOA O (Estrutura 7); H o H * NAN OH
DA H 2 O Õ O
DX
O OO (Estrutura 8); oO INoDNA
O DN Lt OH hs
TO MEX
O (Estrutura 9);
H 7 H NS Nr À OH | H 4N Oo Õ o EDV INNoA VON O (Estrutura 10);
NOIS Oo Oo ? o HD IAN ONÇA O (Estrutura 11);
ES NO | ZN A o o O,
O
N RDI IN OA O (Estrutura 12); o ZN O Õ o FOOD ONA O (Estrutura 13);
H ". H
SS NAN OH | N no o í O Er
OT É ROS ON O O (Estrutura 14); H Ss H
NA OH | H ZN Oo Õ Oo Oo Fra ra A] (Estrutura 15);
E N t AB SA Mor Dx A o O Õ O FOI Ng ONÇA O (Estrutura 16);
H Ç H Ds NAN OH | H ZN (9) Õ Oo
CS Ss FOI IN OA O (Estrutura 17);
H o H * AN OH | H 4N Oo O o RODIN VAN O (Estrutura 18);
RA N
SS N NOS OH | n& Õ
Q
O Ago o (Estrutura 19); Rn N RN nO OH | H ZN Oo $ O Ô o AGINDO (Estrutura 20); H 9 H - AAA A ” 2N '& ô o FONDO (Estrutura 22);
H 9 H RENA ÇAÇA, N oH Tr n o ODIN AÇO (Estrutura 23); H ? H RENCAÇA ÇA, N oH Tr "8 : o FOI ONÇA OA O (Estrutura 24); H É º H Ss NA, N oH Tr *& o FOZ ONA O O (Estrutura 25);
H S H
A OH [8 6 a: ROSI ÇA VOA (Estrutura 27);
TC NT | H 2N o ÔÕ o PRQ OA A CO (Estrutura 29); Capra tata NM o o P
D OO ? LoungHÀ (Estrutura 30);
OH
H Q H C NA AÇA AN fe 2N no Ô o RODIN ONO (Estrutura 31);
OH Ç g
H a IO e 2N no Õ o UV IDNÇA VOA O (Estrutura 32);
NHo
H FS H RANA A ÇA AN oH CTC na o OVINOS (Estrutura 33); H o H RENA A ÇA N oH Tr no fe) FOI ON ONA O (Estrutura 34); E o!
H H RNA ÇA AN oH TC np : o RODIN O NAO (Estrutura 35); 4 7 H RENA A ÇA o oH CT no : o FO OA O (Estrutura 36); e
H Q — H
CAD OH 2N o ÔÕ o
QL OO O O O (Estrutura 37), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde :; indica o ponto de ligação a uma porção compreendendo uma molécula de car- ga.
9. Ligante da integrina avB6 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a molécula de carga é um princípio ativo ou um profármaco.
10. Ligante da integrina avB6 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a molécula de carga compreende uma molécula pequena, um anticorpo, um fragmen- to de anticorpo, uma imunoglobulina, um anticorpo monocilonal, um rótulo ou marcador, um lipídio, um ácido nucleico natural ou modifica- do, um oligonucleotídeo de ácido nucleico natural ou modificado, um polinucleotídeo de ácido nucleico natural ou modificado, um peptídio, um aptâmero, um polímero, uma poliamina, uma proteína, uma toxina, uma vitamina, um polietileno glicol, um hapteno, uma digoxigenina, uma biotina, um átomo ou molécula radioativa, ou um fluoróforo.
11. Ligante da integrina avB6 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a molécula de carga compreende um agente de RNAi.
12. Ligante da integrina avB6 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ligante polietileno glicol tendo 2-20 unidades óxido de etileno.
13. Estrutura compreendendo o ligante da integrina avB6 como defindo em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, um grupo de ligação, um cadafalso, caracterizada pelo fato de que é ligada à molécula de carga.
14. Estrutura de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zada pelo fato de que a estrutura compreende ligante da integrina avB6 na forma monodentada.
15. Estrutura de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zada pelo fato de que a estrutura compreende ligante da integrina avB6 na forma bidentada.
16. Estrutura de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zada pelo fato de que a estrutura compreende ligante da integrina avB6 na forma tridentada.
17. Estrutura de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zada pelo fato de que a estrutura compreende ligante da integrina avB6 na forma tetradentada.
18. Estrutura de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zada pelo fato de que o patamar é da fórmula: í | o Av, ligante RN TA . cao N HN' o (estrutura 300a) onde NEW representa um agente de RNAi, e "Ligante avb6" re- presenta a estrutura do respectivo ligante e o agente de ligação.
19. Precursor de ligante da integrina avB6, caracterizado pelo fato de que compreende a estrutura: Ru Rº o R Rº 7 7) Oo O R? RP1 RP? (fórmula lb)
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo,
onde,
n é um inteiro de 0 a 7;
J é C-H ou N;
Z é OR, N(R1?)2 ou SR'?;
R' é H, C1-C6 alquila opcionalmente substituída, OH, CO- OH, CON(Rº)2, ORô, ou R' compreende um grupo de ligação conjuga- do a um grupo reativo, onde cada R*º é independentemente H ou C1- C6 alquila, e Rº é H ou C1-C6 alquila;
R?, RP? e RP? são cada um deles independentemente H, ci- cloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substitu- ido, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, ou heteroarileno opcionalmente substituído, ou R?, RPº e RP? podem compreender um grupo de ligação conjugado a um grupo reativo;
R'º é H ou alquila opcionalmente substituída;
R' é H ou alquila opcionalmente substituída, ou RU e R' junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um hetero- ciclo opcionalmente substituído;
R'? é H ou alquila opcionalmente substituída;
cada R'* é independentemente H, alquila opcionalmente substituída, ou R'? compreende um grupo de ligação conjugado a um grupo reativo;
R*º é alquila opcionalmente substituída; e onde pelo menos um dentre R', R2, R'?, RP e RP? compre- ende um grupo de ligação conjugado a um grupo reativo.
20. Precursor de ligante da integrina avB6 de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o grupo de ligação é um ligante PEG.
21. Precursor de ligante da integrina avB6 de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o ligante PEG com- preende 2-20 unidades PEG.
22. Precursor de ligante da integrina avB6 de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo é uma azida.
23. Precursor de ligante da integrina avB6 de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o grupo de ligação conjugado a um grupo reativo é da estrutura: Noto" n em que n é um inteiro de 2a 20 e :j indica o ponto de liga- ção à estrutura de fórmula lb.
24. Precursor de ligante da integrina avB6 caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em:
N3
D
2.
O Qt
N H y OA O Oo Ô O CO (Estrutura 1b), prod seh
O H o H
SS NA A N OH 2N n &. Õ o CO (Estrutura 2b),
Ô O: R, AA N OH
NON N
H HEX CI! Cc!
INN $ (Estrutura 5b),
O RA *N OA OH n no o Cc! Cl
OCA OA ROO (Estrutura 5.1b), el DO
AA N OH
N N N
A O O cl Cl Os E, N3 (Estrutura 5.2b), H Çç H SN NAN oH | N do o
É NI DVO NA (Estrutura 6b),
H ç H « NAN OH | H 4N Oo Õ O NES Os DO ag O (Estrutura 6.1b), H & H
NS NA OH | H 4N Oo Õ O
AMRADADAD O N3 (Estrutura 6.2b), H 9 H « NA OH
TES ZN Oo O Oo DN; ” Lo oO (Estrutura 6.3b), H o H Ho A ço | H ZN O O Oo Mesma Da OO
EMO NAO Longo (Estrutura 6.4b),
CD N OH a 4N Oo o O NV ONNOADO (Estrutura 7b),
RA N OH s x EN 6. o
O x o ND (Estrutura 8b), O OVO DNÇA Na Oo Oo
O ts
N N OH
N Y
CO EX
O (Estrutura 9b), H 6 H
A NA OH | H ZN O Õ Oo NE AP OO (Estrutura 10b),
Z NO N OH H o O Õ o O. O. O NE PIO OQ (Estrutura 11b),
H Q H
SS NA OH | H 4N Oo Õ O
O XI?
N
APOIA ÇA VON AO N5 Oo o (Estrutura 12b), H "" H
SS NA OH | H Z4N Oo Õ Oo
AVI ÇARPIADN ÇA O Nã Oo o (Estrutura 13b), H q H
A OH | N H Oo o
Í O Omar
O É NO IPO AOS (Estrutura 14b),
H nº H
OH SA AAA, mo - o Na AÇO (Estrutura 15b),
O REA = o o Õ O NETTO OO a O (Estrutura 16b), H 9 H
OH NS No A vo
OS Ss
O pI AO A O AO oo (Estrutura 17b), H 9 H
OH
SS NA mo NI DVO NM ONA O (Estrutura 18b),
H 9 H N OoH f * ra 7? O
O Ns AÇO (Estrutura 19b), H ? H
N OH
D A | N rn. o
Q S Oo Ns ÇA O (Estrutura 20b),
H P H « RA ALÇA A OH
H Tr o O o ON O O (Estrutura 22b), NOT fo) o
H Q H ** NA, N OH TO Fo Ô o NE APAE AO O (Estrutura 23b),
" H
OH
N N NA : C * 6 o õ O 24b), o ic (Estrutura
NIVA VNSO
O ç H
OH
N N
AL | a ii o Oo e O o 25b), 9 A (Estrutura nO IDNDPINO o H
OH
K N
N MESA “M
ZN o a 27b), ONÇA (Estrutur;
NI DVIOIDNDONSA O ç H
N N OH * A Y | o v O OO (Estrutura 29b),
INN Nag O
* NO Oo | H 2N ( o e O ? Lou Ns (Estrutura 30b),
OH H q H f * NA, N or
O
LORPORARO SPO OO O N5 o o (Estrutura 31b),
OH o
H À EC VETO oH 2N 2 Õ o NEVIS DNÇA O A O (Estrutura 32b), NHz H q H PR SO N on Ls no O 9 APOIADA DPI ANA o Nó Oo o (Estrutura 33b),
H o H & NA, N OH 2N A o Õ o NVIDIA IN O (Estrutura 34b),
OH
RA N
RN N N OH 2N n& ÔÕ o o. O. o WO CIO O O OO SO (Estrutura 35b), H 7 H CC NA ÇA AN oH 2N it Õ o fo) O. o NE ROO O Os (Estrutura 36b), e
H CD H f j * AN OH | H
ZN O ÔÕ O nO IN ONA O (Estrutura 37b), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
25. Composição caracterizada pelo fato de que compreen- de o ligante da integrina avB6 como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 12 ou a estrutura como definida qualquer uma das rei- vindicações 13 a 18, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
26. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracte- rizada pelo fato de que o ligante da integrina avB6 é conjugado a um composto à base de oligonucleotídeo que é capaz de inibir a expres- são de um gene-alvo em uma célula epitelial.
27. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracte- rizada pelo fato de que o ligante da integrina avB6 é conjugado a um agente de RNAi que é capaz de inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula epitelial.
28. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracte- rizada pelo fato de que o ligante da integrina avB6 é conjugado a um agente de RNAi que é capaz de inibir a expressão de um gene-alvo em uma célula epitelial bronquiolar.
29. Método de distribuição de uma ou mais moléculas de carga para uma célula, caracterizado pelo fato de que o método com- preende administrar à célula um ligante da integrina avB6 como defini- do em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou a estrutura como definida qualquer uma das reivindicações 13 a 18.
30. Método de distribuição de uma ou mais moléculas de carga para uma célula ou tecido de um indivíduo in vivo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo um ligante da integrina avB6 como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 12, a estrutura como definida qualquer uma das reivindica- ções 13 a 18, ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 22.
31. Método de acordo com a reivindicação 29 ou 30, carac- terizado pelo fato de que a célula é selecionada do grupo que consiste em: célula epitelial alveolar tipo | e Il, célula caliciforme, célula epitelial secretora, célula epitelial ciliada, célula epitelial da córnea e da conjun- tiva, célula epitelial dérmica, colangiócito, enterócito, célula epitelial ductal, célula epitelial glandular, e tumores epiteliais (carcinomas).
32. Método de acordo com a reivindicação 29 ou 30, carac- terizado pelo fato de que a uma ou mais moléculas de carga compre- ende um composto à base de oligonucleotídeo.
33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que o composto à base de oligonucleotídeo é um agen- te de RNAi.
34. Método de inibição da expressão de um gene-alvo em uma célula in vivo, caracterizado pelo fato de que o método compre- ende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composi- ção que inclui um composto à base de oligonucleotídeo conjunto a um ligante da integrina avB6 como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 12.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracteriza- do pelo fato de que a célula é selecionada do grupo que consiste em célula epitelial alveolar tipo | e Il, célula caliciforme, célula epitelial se- cretora, célula epitelial ciliada, célula epitelial da córnea e da conjunti- va, célula epitelial dérmica, colangiócito, enterócito, célula epitelial duc- tal, célula epitelial glandular, e tumores epiteliais (carcinomas).
36. Método de acordo com a reivindicação 34 ou 35, carac- terizado pelo fato de que o composto à base de oligonucleotídeo é um agente de RNAi.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3649240A4 (en) 2017-07-06 2021-07-07 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAI ALPHA-ENaC GENE EXPRESSION INHIBITION AGENTS AND METHODS OF USE
US12065458B2 (en) 2018-02-17 2024-08-20 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Trialkyne linking agents and methods of use
CN114058623B (zh) * 2020-08-06 2023-12-12 中国科学院化学研究所 一种核酸适体识别并结合整合素α3亚基及其相关功能
KR20230066400A (ko) * 2020-09-11 2023-05-15 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 인테그린 표적화 리간드 및 그의 용도
KR20230068408A (ko) * 2020-09-11 2023-05-17 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 골격근 전달 플랫폼 및 사용 방법
MX2023002853A (es) * 2020-09-11 2023-03-31 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de arni para inhibir la expresion de dux4, composiciones de dichos agentes, y metodos de uso.
BR112023024615A2 (pt) * 2021-05-28 2024-02-20 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de rnai para inibir expressão de mucina 5ac (muc5ac), composições dos mesmos, e métodos de uso
AU2022368927A1 (en) * 2021-10-22 2024-04-11 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents for inhibiting expression of matrix metalloproteinase 7(mmp7), compositions thereof, and methods of use
AU2023399039A1 (en) * 2022-12-14 2025-05-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ALPHA-V BETA-6(ανβ6) INTEGRIN LIGANDS FOR EXTRAHEPATIC DELIVERY
TW202503060A (zh) * 2023-06-13 2025-01-16 大陸商上海拓界生物醫藥科技有限公司 靶向ＭＭＰ７的ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ綴合物及其醫藥用途
WO2024260259A1 (zh) * 2023-06-19 2024-12-26 广东众生睿创生物科技有限公司 一种整合素配体及其用途
WO2025128462A1 (en) 2023-12-12 2025-06-19 Eli Lilly And Company Novel therapeutic delivery moieties and uses thereof
WO2025130549A1 (zh) * 2023-12-22 2025-06-26 北京炫景瑞医药科技有限公司 一种靶向整合素αvβ6的配体、缀合物、组合物以及它们的用途

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
DE19831710A1 (de) 1998-07-15 2000-01-20 Merck Patent Gmbh Diacylhydrazinderivate
JP2002537287A (ja) 1999-02-20 2002-11-05 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング β−アラニン誘導体
DE19929410A1 (de) 1999-06-26 2000-12-28 Merck Patent Gmbh Inhibitoren des Integrins avß6
DE10028402A1 (de) 2000-06-13 2001-12-20 Merck Patent Gmbh Pyridin-2-yl-aminoalkycarbonylglycyl-beta-alanin und Derivate
DE10112771A1 (de) 2001-03-16 2002-09-26 Merck Patent Gmbh Inhibitoren des Integrins alpha¶v¶beta¶6¶
JP5192234B2 (ja) 2004-08-10 2013-05-08 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 化学修飾オリゴヌクレオチド
GB0520068D0 (en) 2005-10-03 2005-11-09 Cancer Res Technology av peptide ligand
US20080213249A1 (en) 2006-07-07 2008-09-04 The Scripps Research Insitute Use of Retro-Aldol Reaction to Generate Reactive Vinyl Ketone for Attachment to Antibody Molecules by Michael Addition Reaction for Use in Immunostaining and Immunotargeting
EP2064184A1 (en) 2006-09-04 2009-06-03 AstraZeneca AB Multimeric heterocyclic compounds useful as neutrophil elastase inhibitors
AR066984A1 (es) * 2007-06-15 2009-09-23 Novartis Ag Inhibicion de la expresion de la subunidad alfa del canal epitelial de sodio (enac) por medio de arni (arn de interferencia)
JP5497449B2 (ja) 2007-11-28 2014-05-21 富士フイルム株式会社 生体高分子およびポリペプチドの化学修飾方法
CA2721980C (en) * 2008-04-21 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Selective high-affinity poly dentate ligands and methods of making such
CN102596922A (zh) 2009-10-06 2012-07-18 免疫基因公司 有效的缀合物和亲水性连接体
GB0922014D0 (en) 2009-12-17 2010-02-03 Ge Healthcare Ltd Novel integrin binders
US9161948B2 (en) * 2011-05-05 2015-10-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
CA2862319C (en) * 2012-02-17 2021-11-30 Seattle Genetics, Inc. Antibodies to integrin .alpha.v.beta.6 and use of same to treat cancer
JP2014029990A (ja) 2012-06-29 2014-02-13 Sharp Corp 窒化物半導体装置の電極構造およびその製造方法並びに窒化物半導体電界効果トランジスタ
US8858913B2 (en) 2012-08-27 2014-10-14 Preeti Misra Multimeric peptidomimetic fibrosis specific dual-modality probes
EP2913064A1 (en) * 2014-02-26 2015-09-02 celares GmbH Branched drug-linker conjugates for the coupling to biological targeting molecules
CA2945945C (en) 2014-04-15 2023-10-03 The Regents Of The University Of California Bi-terminal pegylated integrin-binding peptides and methods of use thereof
WO2015179823A2 (en) * 2014-05-23 2015-11-26 The California Institute For Biomedical Research Lung localized inhibitors of alpha(v)beta 6
US9803201B2 (en) * 2015-03-17 2017-10-31 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Disulfide-containing alkyne linking agents
US9976141B2 (en) 2015-05-29 2018-05-22 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene expression of Hif2alpha
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